Coordonator științific : Lect. Dr. Doru Gabor Absolvent: Șahin Sevcan București 2020 UNIVERSITATEA BUCUREȘTI FACULTATEA DE BIOLOGIE SPECIALIZAREA… [628486]

UNIVERSITATEA BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator științific : Lect. Dr. Doru Gabor

Absolvent: [anonimizat]
2020

UNIVERSITATEA BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA BIOLOGIE

Mecanisme apoptotice generate de
citotoxicitatea directã (NK) si indirectã (Tc)

Coordonator științific : Lect. Dr. Doru Gabor

Absolvent: [anonimizat]
2020

3

Cuprins :
Introducere………………………………………………………………………………………pag. 7
Cap. I…………………………………………………………………………………………pag. 8
1.1.Limfocitul T ……………………………………………………………………………….. pag.8
1.1.1. Morfologie……………………………………………………………………………pag. 8
1.1.2 .Ontogeneză…………… ……………………………………………………………pag. 8
A. Etapa pretimic ă…………………………………………………………….pag.6
B. Etapa timic ă……………………………………………………………… …pag. 9
C. Etapa de maturare………………………………………………………..pag. 10
1.2. Celulele Nk………………………………………………………………………………..pag. 10
1.2.1. Morfologie……………………………………………………………………………pag. 10
1.2.2. Funcție………………………… ……………………………………………………..pag. 11
1.2.3. Receptorii celulelor Nk…………………………………………………………pag. 12
1.2.3.a. Receptori inhibitori………………………………………………. ………pag. 12
1.2.3.b. Receptori activatori ……………………………………………………..pag.1 3
1.2.4. Modul de acțiune al celulelor Nk…………………………………………..pag.1 4
1.3.Distrucția celulelor țintă…………………………………………………………….pag.1 5
1.3.1 Perforina …………………………………… ……………………………………..pag. 15
1.3.1.a. Structura…………………………………………………………………….pag. 16
1.3.1.b. Rolul perforinei……………………………………………………………pag. 17
1.3.2. Distrucția prin apoptoză ………………………………………………………pag. 18
1.3.2.1.Granzimele și implicarea lor în apoptoză…………………………pag.

4 1.3.2.1.a. Tipuri de granzime ………………………………….. ………….pag.
1.3.2.1.b. Rolul granzimelor…………………………………………………pag.
1.3.2.2. Receptorii apoptotici. si proteinele activate de ei……………..pag.
1.3.2.2.1. Sistemul Fas – FasL……………………………… …………….pag.
1.3.2.2.2. Sistemul TNFR – TNF………………………………………….pag.
1.3.2.2.3. Proteinele adaptoare …………………………………………..pag.
a. TRADD…………………………………………………………………….pag.
b. FADD………………………………………………………………………pag.
c. RIP………………………………………………………….. ……………..pag.

d. RAIDD…………………………………………………………………….pag.
e. TRAF……………………………………………………………………..pag.
1.3.2.2.4. Caspazele – efectori ai apoptozei … ……………………..pag.
a. Structura………………………………………………………………….pag.
b. Activarea caspazelor…………………………………………………pag.
c. Substratele caspazelor…………………… …………………………pag.
PARP………………………………………………………………….pag.
DNA -PK………………………………………………………………pag.
Laminine……………………………………………………………..pag.
Fodrina………………………………………………………………..pag.
d. Rolul caspazelor în apoptoză………………………………………pag.
1.4.Efectele nucleare …………………………………………………………………….pag.
1.4.1. Inactivarea enzimelor implicate în repararea ADN -ului………… …pag.
1.4.2. Inactivarea enzimelor implicate în repararea celulara……………..pag.

5 1.4.3. Distrugerea proteinelor nucleare structurale………………………….pag.
1.4.4. Fragmentarea ADN -ului…………………………………………… …………pag.
1.5.Modificari biochimice……………………………………………………………….pag.
1.5.1. Translocația fosfatidilserinei ……………………………………………….p g.
1.5.2. Fragmentarea ADN -ului……….. ……………………………………………pag.
1.6.Modificari morfologice…………………………………………………………….pag.

Cap. II Materiale si metode …………………………………………………..pag.
2.1. Obținerea limfocitelor……………………………………………………………….pag.
2.1.1. Izolarea limfocitelor din sânge periferic (centrifugare în gradient de
densitat e)…………………………………………………………………………………………pag.
2.1.2. Determinarea concentrației suspensiei celulare și a viabilitații celulelor
izolate…………………………………………………. ………………………………………….pag.
2.1.3. Separarea celulelor prin aderarea la coloana de fibre de
nailon………………………………………………………………………………………………pag.
2.1.4. Eliminarea m onocitelor…………………………………………………………pag.
2.1.5. Separarea celulelor Nk…………………………………………………………pag.
2.1.6. Testul de citotoxicitate …………………………………….. …………………..pag.

Cap. III Rezultate. Discuții. Concluzii………………………………pag.
3.1. Rezultate…………………………………………………………………………………pag.
3.1.1.Apoptoza cu modulator……… ………………………………………………..pag.
3.1.2.Apoptoza prin intermediul perforinelor……………………………………pag.
3.2. Discuții………………………………………………………………………………. …..pag.

6 3.3. Concluzii…………………………………………………………………………………pag.
Bibliografie……………………………………………………………………pag.

7 INTRODUCERE
Lucrarea își propune evaluarea efectelor apototice induse de celulele NK si Tc activate cu
diverși modulatori. În categoria acestor modulatori am utilizat lectina ob ținută din vâsc ( Viscum
album). Deși această lectină are un efect toxic , în anumite condiții ea stimulea ză celulele
citotoxice pentru a acționa asupra țintelor (celule modificate). Extractele proteice de Viscum
album conțin o lectină care are specificitate pentru β – Galactoză. Lectina este formată din 2
lanțuri proteice A și B. Lanțul A are proprietă ți toxic e, deoarece inhibă sinteza proteică blocând
factorul de elongație EF2. Lanțul B are proprietatea de a fixa β – Galactoz a din glicoproteinele
membranare.
Lectina din Viscum album este incriminată ca având un efect de stimulare a celulelor
sistemul ui imun. Extractele de Viscum album sunt folosite în terapia neconvențională a
cancerului. Efectul pe celulele tumorale este însă un efect de citoliză (apoptotic direct).
S-au imaginat în acest sens mai multe modele de abordare:
– un model care presupune activarea celulelor Tc ( CD8+);
– un model care presupune activarea celulelor NK.
Rezultatele indică un efect de stimulare a distrucției celulelor țintă în urma stimul ării
celulelor efector cu lectina din vâsc.
Distrucția este determinată de efectul apop totic exercitat de celulele efector asupra
țintelor prin mecanisme specifice și nespecifice.
Scopul lucr ării a fost de evaluare a efectului apoptotic idus de lectina din Viscum album
asupra celulelor țintă și a celulelor efectot NK și Tc. Acest efect s -a determinat prin evaluarea
viabilit ății culturilor celulare în mediu la care se adaug ă diverse concentra ții de extract total de
Viscum album , în vederea calcul ării ulterioare a concentra ției g/Kg/corp necesa ră
administr ării în tratamentele neconven ționale ale terapiei neoplazice cu lectin ă purificat ă sau
eventual cu lan țul proteic B.

8 CAPITOLUL I

1.1 LIMFOCITUL T

Limfocitul T este asemănător cu limfocitul B, de care nu poate fi diferențiat prin
tehnicile de microscopie optică. Limfocitele T au fost prima dată identificate prin testul de
rozetare cu eritrocite de oaie, care cuplează prin intermediul receptorului membranar CD2
aceste limfocite. Ace astă caracteristică poate servi la identificarea lor comparativ cu limfocitele
B.
Populația de limfocite T se împarte în două subpopulații majore: limfocitele T helper
sau CD4+CD8- care joacă un rol primordial în reglarea răspunsului imun specific (limfoci tele
T helper activate au rolul de a secreta citokine care favorizează dezvoltarea diferitelor tipuri de
răspuns imun) și limfocitele T citotoxice/supresoare sau CD8+CD4- ce prezintă un rol
important în citotoxicitatea mediată celular antigen specifică.
Limfocitul T își are originea în celula stem pluripotentă localizată în măduva osoasă la
adult și în ficatul și splina fetală. Dezvoltarea limfocitelor T este un proces foarte complex și
se realizează pentru majoritatea acestor celule cu ajutorul timusului, de unde și numele de
limfocite T sau timo -dependente.
1.1.1. Morfologie
Limfocitele T reprezintă 25 -35% din populația leucocitară. Dimensiunile sale variază
între 6 -12 m. Nucleul mare, unic , este bogat în heterocromatină. Citoplasma este redusă, slab
bazofilă și conține granulații azurofile și enzime lizozomale. Pe suprafața membranară există
un număr redus de microvili.
1.1.2. Ontogeneză
Dezvoltarea limfocitului T are loc în trei etape succesive:
A. Etapa pretimică
Are loc în măduva osoasă hematogenă. Din celula stem pluripotentă , se diferențiază
celula progenitor (pro -TI) care prezintă markerul CD7, primul marker de diferențiere în linia

9 celulară T. În acest stadiu , celula nu este încă angajată pe linia limfocitară T, având capacitatea
de a evolua spre oricare din liniile celulare hematopoetice.

B. Etapa timică
Celulele pro -T migrează din măduvă în cortexul extern al timusului unde are loc
proliferarea și formarea de limfoblaști. După faza proliferativă celulele devin timocite cu
aspectul limfocitelor de repaus care urmează fazele de maturare imunologică. În micromediul
din timus , contactul cu celulele epiteliale timice și substanțele de tip hormonal (timopoetina,
timozina și tisplenina precum și citokinele de tipul IL -7) definitivează maturarea timică prin
achiziționarea markerilo r de suprafață specifici limfocitului T.
Din celula pro -TI CD7+ se va diferenția în celula pro -TII care achiziționează markerii
CD2, CD5 și CD3 intracitoplasmatic. Celula pro -TII se diferențiază în celula pre -T (prin
rearanjamentul lanțurilor ,  și  ale receptorului de antigen) care prezintă moleculele
membranare CD1, CD2, CD5, CD7 și molecula CD3 intracitoplasmatică. Rearanjamentul
nefuncțional al lanțurilor  ale receptorului de antigen induce moartea prin apoptoză a celulelor
ajunse în acest stadiu. Dacă rearanjamentul este funcțional, lanțurile  se asamblează cu
lanțurile  sub forma complexului receptor TCR -CD3 pe suprafața celulară. Timocitele pre -T
urmea ză în acest caz o nouă etapă de diferențiere spre maturare și migrează în medulara
timusului unde se transformă în celule T dublu negative CD4-CD8-. Molecula CD3 exprimată
membranar se asociază cu receptorul de antigen rezultând astfel complexul receptor f uncțional.
Celulele T dublu negative care interacționează efectiv cu moleculele MHC sunt
selectate pozitiv și se formează celulele T dublu pozitive care prezintă pe suprafață molecule
CD4 și CD8, alături de complexul receptor TCR -CD3. În acest stadiu este exprimat markerul
CD5.
Celulele T dublu pozitive sunt ținta unui proces selectiv care stabilește repertoriul
specificităților receptorului de antigen. Celulele specifice pentru moleculele MHC complexate
cu peptide non -self vor suferi o transformare spre fe notipul de celule T simplu pozitive, care
exprimă fie CD4, fie CD8.
Intratimic au loc două selecții în cursul cărora sunt eliminați precursorii
necorespunzători. Inițial are loc selecția pozitivă în cadrul căreia sunt eliminate celulele care
nu pot recunoa ște moleculele MHC proprii. În cursul celei de -a doua selecții , vor fi îndepărtate

10 celulele care recunosc antigene proprii organismului și care ar putea declanșa reacții de
autoimunitate.
C. Etapa de maturare
Limfocitele T migrează din medulara timusului s pre periferie și populează țesuturile
limfoide periferice unde supraveghează orice invazie antigenică. În prezența antigenului ,
limfocitele T de repaus proliferează, se transformă în limfoblaști și în final , se diferențiază în
limfocite T efectoare și limf ocite T de memorie.

1.2 CELULELE NK

Celulele NK (Natural killer) sunt celule mari , granulare care alcătuiesc, pe lângă
celulele B și T, o a treia populație de tip limfocitar. Sunt generate în măduva osoasă dintr -un
precursor comun cu limfocitele T , în prezența IL -2 și IL -15. Celulele NK reprezintă circa 15%
din totalul limfocitelor san guine . Celulele NK au fost în ultimii ani obiectul unor studii intense
care au urmărit elucidarea modului lor de funcționare. Deși există încă numeroase semne de
întrebare, descoperirile recente au marcat pași importanți în înțelegerea mecanismului citoto xic
al NK . In mod convențional se consideră că limfocitele apără organismul de agenții infecțioși
și de celule cu citodiferențiere aberantă prin identificarea structurilor nonself prin intermediul
receptorilor specifici. Celulele NK acționează printr -un m ecanism diferit non -receptor de
antigen și non -MHC restrictat.
1.2.1. Morfologie
Sunt celule mari (diametru de 16 -20 μm) cu nucleul zimțat. Citoplasma conține
granulații mari azurofile, înconjurate de membrană, care conțin mediatori citotoxici (perforină,
granzime, TNF). Aceste granulații mari citoplasmatice diferențiază celulele NK de limfocitele
B și T și le conferă denumirea de limfocite mari granulare (LGL, large granular lymphocytes).

11 Markeri imunologici :
• CD56 ( N -CAM )
• CD16 (receptorul FcγRIII pentru IgG )
• CD2
• CD8
• Receptori de tip imunoglobulinic ( killer inhibitory receptor – KIR )
• Receptori de tip lectinic (CD94 – NKG2 )
• Molecule de adeziune: ICAM -1 ( CD54 ) și LFA -1 ( CD11a/CD18 )

1.2.2. Funcție
Celulele NK prezintă cito toxicitate spontană față de celulele infectate cu virus și
celulele tumorale. Nu prezintă specificitate antigenică prin absența unui receptor specific de
antigen și nici memorie imunologică. Nu prezintă capacitate fagocitară sau restricție MHC.
Celulele NK pot fi activate de diferite citokine (în principal IL -2) care determină
proliferarea și creșterea capacității citotoxice, devenind limfocite killer activate de citokine
(lymphokine activated killer cells –LAK) . Celulele NK se activează rapid și la 2 -3 zile după
infecție ating activitate maximă, după care diminuează rapid. În urma studiilor efectuate , s-a
identificat o altă populație de limfocite cu activitate citotoxică specifică tumorilor umane, care
s-a izolat în tumorile solide; aceste celule sunt de numite limfocite tumoral e (tumor -infiltrating
lymphocyte – TIL) și au fenotip predominant NK.
La suprafața celulelor NK există două tipuri de receptori specifici acestei populații:
receptori de tip imunoglobulinic și receptori din familia lectinelor C. Au rol de a recunoaște
moleculele complexului major de histocompatibilitate clasa I și mediază activarea sau
inhibarea limfocitului NK.
Celulele NK mediază citotoxicitatea celulară anticorp dependentă (ADCC – antibody
dependent cell citotoxicity). Celula NK prezintă receptori pentru fragmentul Fc al IgG, iar
celula țintă prezintă pe suprafață antig enul de care se fixează IgG, IgG fiind puntea de legatură
între celula citotoxică și celula țintă. După stabilirea contactului cu celula țintă, celula NK
eliberează perforină și granzime care distrug celula țintă.

12 Pe lângă rolul lor în mecanismul de citot oxicitate, celulele NK mai îndeplinesc și alte
funcții. Astfel, în urma activării lor , celulele NK secretă diferite citokine, care includ IFNγ,
TNF și GM -CSF.

1.2.3. Receptorii celulelor Nk
Celulele NK prezintă la suprafață numeroase structuri macro -molec ulare cu rol receptor
(NK-R – natural killer cell receptor). Aceste structuri sunt de două tipuri, unele cu domenii
imunoglobulinice și celelalte cu domenii lectinice de tip C. Ambele tipuri structurale posedă
atât funcție inhibitorie cât și funcție activ atorie.
1.2.3.a. Receptori inhibitori .
NK-R aparținând superfamiliei imunoglobulinelor denumite și KIR (killer cell
inhibitory receptor – receptor inhibitor al celulelor killer) prezintă specificitate pentru anumite
alele ale moleculelor MHC clasa I, care reprezintă ligandul lor natural. S -au identificat până
în prezent receptori NK imunoglobulinici pentru toate moleculele HLA de tip C (notați p58,
care posedă două domenii imunoglobulinice), pentru Bw4 (p70 cu trei domenii
imunoglobulinice) și A3 și A11 (homodimerul p140 cu trei domenii imunog lobulinice).
Cuplarea acestor receptori cu molecule MHC clasa I implică probabil secvențe specifice
ale peptidului conjugat și structurile α –helicoidale adiacente acestui peptid. În porțiunea lor
citoplasmatică , acești receptori prezintă o secvență -motiv ITIM (immunoreceptor tyrosine –
based inhibitory motif) prin care își exercită rolul lor inhibitor asupra funcției citotoxice.
Al doilea grup de receptori NK -R este cel aparținând lectinelor tip C. Spre deosebire de
receptorii de tip imunoglobulinic, aceșt i receptori au o specificitate mai largă pentru moleculele
MHC clasa I. Descoperit inițial la șoarece, s -a dovedit ulterior prezența pe suprafața celulelor
NK umane a unui heterodimer CD94 -NKG2, ambele molecule aparținând familiei lectinelor
C.
CD94 cuple ază prin domeniile sale de recunoaștere a carbohidraților (CRD –
carbohydrate recognition domain) numeroase alele HLA -A, HLA -B și HLA -C, toate aceste
alele prezentând o secvență polipeptidică asemănătoare din cadrul helixului α1 (pozițiile 77 -83
din secvenț ă). Transducerea intracelulară a semnalului inhibitor este realizată de anumiți
membrii ai familiei de lectine NKG2 (NKG2A) prin motivul ITIM. După toate aparențele ,

13 receptorii NK de tip lectinic sunt o formă ancestrală de receptori NK comparativ cu NK -R de
tip imunoglobulinic, apăruți mai recent pe scara filogenetică, cu specificitate mai strictă pentru
alelele MHC.
Spre deosebire de limfocitele T care recunosc specific prin intermediul TCR
moleculele MHC în partea superioară a helixului α1 și α2 care c onțin situsul de legare a
antigenului, se consideră că receptorii NK interacționează cu partea laterală a helixului, în
special cu α1 și nu cu situsul de legare a antigenului, într -o manieră asemănătoare interacțiunii
dintre moleculele MHC clasa II și supe rantigene. Existența unor numeroase structuri receptoare
de tip NK nu implică prezența simultană a tuturor acestora pe suprafața unei singure celule. În
realitate , s-a dovedit că anumite clone de celule NK posedă receptori caracteristici.
Mecanismul de tr ansmitere intracelulară .
Ambele tipuri de receptori conțin în domeniul citoplasmatic motivul ITIM. În urma
cuplării cu ligandul – moleculele MHC, NK -R suferă o modificare conformațională care se
soldează cu fosforilarea tirozinelor din secvența ITIM. Mot ivul ITIM astfel activat recrutează
fosfataze ce prezintă domenii SH2, cea mai importantă fiind protein tirozin fosfataza SHP -1
caracterizată prin două secvențe tandem SH2. Fosfataza SHP -1 defosforilează substraturile sale
și împiedică activarea NK concomi tent cu capacitatea sa citolitică.
1.2.3.b. Receptori activatori
Pe lângă receptorii inhibitori, celulele NK prezintă receptori cu funcție activatorie
aparținând superfamiliei imunoglobulinelor și respectiv a lectinelor C. Receptorii
imunoglobulinici activatori prezintă o structură extracelurară foarte asemănătoare rec eptorilor
inhibitori, dar diferă de aceștia prin segmentele transmembranare și intracitoplasmatice. S -a
dovedit existența unor receptori cu două domenii imunoglobulinice și cu structură extracelulară
foarte asamănătoare cu p58, notați p50. Segmentul lor in tracelular este foarte scurt. Din această
cauză transducția semnalului se face prin intermediul unui homodimer DAP12 (Lanier, 1998)
care se asociază fizic cu receptorul și prezintă un motiv activator ITAM (immunoreceptor
tyrosine -based activation motif). H eterodimeri lectinici precum CD94 -NKG2C sunt de
asemenea implicați în activarea celulelor NK.

14 1.2.4. Modul de acțiune al celulelor Nk
Deși s -au făcut pași mari în descoperirea structurilor receptoare ale NK și a modului de
transducere a semnalului, nu s e cunoaște încă exact modul în care cele două tipuri de receptori
cooperează pentru distrugerea celulelor periculoase și conservarea integrității celorlalte celule.
Cel puțin patru ipoteze încearcă să explice acțiunea concertată a celor două forme de recep tori.
O primă ipotez ă susține că receptorii inhibitori recunosc moleculele MHC self, în timp
ce receptorii activatori detectează structurile MHC mimetice produse de anumite virusuri, cum
este virusul citomegalic. Majoritatea adenovirusurilor au dezvoltat o tactică defensivă
împotriva recunoașterii de către limfocitul T, care constă în inhibarea expresiei moleculelor
MHC la suprafața celulelor gazdă. În felul acesta , peptidele nonself virale nu sunt detectate de
limfocitul T citotoxic (care necesită prezent area antigenică în asociere cu MHC clasa I), dar
face celula gazdă vulnerabilă la atacul celulei NK, care nu este inhibată de receptorii ei în
absența ligandului MHC. Pentru a înlătura acest inconvenient , virusul citomegalic a elaborat o
proteină cu struct ură asemănătoare MHC clasa I, care cuplează β2 -microglobulina și mimează
structuri MHC self la suprafața celulei gazdă. Asemenea molecule mimetice ar putea cupla
receptorii activatori ai NK și declanșa activitatea litică a limfocitului.
O altă ipoteză sug erează că cele două tipuri de receptori recunosc aceleași molecule self
și acționează sinergic pentru a împiedica liza celulei “cercetate”. Receptorii activatori stimulați
recrutează prin secvențele lor ITAM -protein tirozin kinaze din familia Src (ZAP -70, Syk) care
determină fosforilarea secvențelor ITIM și exercitarea rolului lor inhibitor. Omologia
secvențială înaltă dintre segmentele extracelulare ale receptorilor activatori și inhibitori vine în
sprijinul acestei teorii.
O a treia posibilitate este ca diferitele clone de celule NK să prezinte receptori activatori
pentru anumite molecule MHC, diferite de moleculele MHC care cuplează receptorii inhibitori
ai acelei celule. Absența selectivă a unei molecule MHC specifică pentru un receptor inhibitor
permit e activarea celulei NK prin receptorii activatori, care recunosc alte molecule MHC ale
celulei țintă.
O ultimă ipoteză arată că receptorii activatori și inhibitori ar putea fi răspunzători de
procese diferite din cadrul fiziologiei limfocitului NK. Recept orii inhibitori ar putea fi implicați
în funcția efectorie citotoxică, împiedicând doar liza celulelor care au la suprafață moleculele

15 MHC corespunzătoare calitativ și cantitativ, în timp ce receptorii activatori ar putea controla
dezvoltarea ontogenetică și proliferarea limfocitelor NK.
Oricare ar fi modul în care funcționează celulele NK, ele prezintă câteva particularități
fiziologice în cadrul celulelor limfocitare care le apropie de imunitatea î nnăscută. Limfocitele
NK de repaus se găsesc într -o stare preactivată: echipamentul lor enzimatic de atac este pregătit
să intervină în orice moment și nu necesită, ca în cazul limfocitelor B și T, o diferențiere finală
spre stadiul efector. Nu prezintă memorie imunologică.

1.3 DISTRUGEREA CELULELOR ȚINTĂ

Faza efectorie a imunității mediate celular constă în atacul asupra celulelor țintă și
distrugerea lor. Procesul de distrugere a celulelor țintă este organizat într -o secvență bine
orchestrată, pentru a limita , amploarea și durata lui la min imul necesar, evitând pe cât posibil
distrucția structurilor adiacente sau perpetuarea fenomenului după ce cauza declanșării acestuia
a fost eliminată. Acest proces de distrucție se adresează unor agresiuni diverse, infecțioase sau
tumorale și unei varietă ți largi de tipuri celulare. Din această cauză implică câteva mecanisme
care acționează redundant pentru a se obține rezultatul final scontat, distrugerea celulei fiind
considerată periculoasă. Două mecanisme principale sunt implicate în distrucția celular ă:
formarea de pori membranari prin perforine și distrucția prin apoptoză.
1.3.1. Perforina
Perforina este sintetizată de limfocitele citotoxice si stocată în granulele citoplasmatice
ale acestor celule. Acest mediator citolitic își poartă nume le datorită faptului că poate "perfora"
membranele țintă prin formarea unor pori transmembranari. Porii formați de perforină distrug
integritatea membranei si mediază citoliza celulei țintă prin mecanism osmotic. Practic, celula
ciuruită de canalele transm embranare perforinice, se "dezumflă" ca un balon în mediul
extracelular.

16 1.3.1.a. Structura funcțională a perforinei
Molecula de perforină matură este o enzimă constituită dintr -un lanț polipeptidic de 66 –
70 kDa (534 AA). Glicozilarea posttranslațională variabilă la nivelul celor două situsuri de N –
glicozilare produce mici variații ale masei moleculare. Sintetizate în reticulul endoplasmatic
rugos, moleculele perforinice sunt preluate de aparatul Golgi unde au loc modificările post –
translaționale si apoi împachetate în granule citoplasmatice lizozom -like. În urma conjugării
cu celula țintă, granulele citoplasmatice purtătoare de perforină se reorientează către locul de
contact și eliberează conținutul lor în spațiul intercelular.
Monomer ii de perforină cuplează și străpung membrana țintă, apoi polimerizează și
formează agregate de diferite mărimi. Resturile lipidice de fosforilcolină de pe fața externă a
membranei celulei țintă funcționează ca receptori pentru perforină, asigură cuplarea perforinei
și penetrarea ei în membrană. Organizarea monomerilor într -un por cu diametru progresiv
crescător prin recrutarea de noi monomeri se datorează orientării acestor monomeri cu
aminoacizii hidrofili către interior în timp ce aminoacizii hidrofobi se leagă de catenele laterale
ale lipidelor membranare. Formarea unui por funcțional necesită asocierea a minimum 3 -4
monomeri de perforină dar numărul acestora poate crește până la 10 -20. Monomerii de
perforină pătrund în membrană și se supraadaugă progre siv formând un canal funcțional. În
final, se produce perturbarea permeabilității membranei și liza osmotică a celulei țintă.
Porii formați de perforină sunt asemănători celor formați de complexul de atac
membranar al complementului (componentele C 5b, C 6, C7, C8 și C 9). Perforina are o omologie
secvențială de aproximativ 20% cu componentele complementului C 6-C9, care corespunde unei
regiuni de 270 aminoacizi situată în zona centrală a moleculei. Se crede că această moleculă ar
fi regiunea funcțională a perf orinei cu o conformație amfipatică care asigură orientarea
caracteristică și organizarea în pori. Această regiune este probabil responsabilă de similitudinea
structurală și funcțională dintre perforină și componentele complementului. Regiunea N –
terminală j oacă un rol important în interacțiunea cu membrana și/sau polimerizarea moleculelor
perforinice, fapt demonstrat de absența aproape totală a activității litice a perforinelor
sintetizate prin inginerie genetică cărora le lipsea această regiune.
Funcția lit ică a perforinei depinde inevitabil de prezența Ca2+. Una din posibilele
explicații ar fi aceea că ionul de Ca2+ modifică conformația perforinei. Inițial perforina este o
moleculă hidrofilă capabilă să difuzeze în mediul extracelular. Ulterior ea își modif ică și
expune situsurile hidrofobe, necesare cuplării cu lipidele membanare.

17 1.3.1.b. Rolul perforinei
Numeroase studii in vitro au demonstrat că perforina din granulele citoplasmatice ale
celulelor citotoxice poate liza o varietate extrem de largă de celu le țintă. Pe de altă parte
perforina s -a dovedit incapabilă să determine în mod direct fragmentarea ADN -ului celulei
țintă, evidențiată în citoliza mediată de limfocitele citotoxice, ceea ce sugerează intervenția
altor mecanisme citolitice în acest fenomen . Perforina poate acționa în două feluri: ca efector
litic direct sau ca o “conductă” pentru alți mediatori ai citolizei.
Prin mecanism direct, perforina produce liza osmotică a celulei țintă. Studiile efectuate
pe celule non -citotoxice transfectate cu gen a pentru perforină singură poate exercita activitate
citolitică și distruge anumite celule țintă.
Perforina singură nu poate induce toate aspectele morfologice și biochimice asociate cu
citoliza mediată de limfocitele citotoxice, fiind vorba în special de modificările apoptotice
survenite în acest proces. Granzimele, enzimele răspunzătoare de aceste fenomene apoptotice,
sunt favorizate în acțiunea lor de prezența porilor perforinici. Perforina acționează în două
modalități pentru a ajuta pătrunderea granzim elor în celula țintă. Pe de o parte porii perforinici
perturbă homeostazia mediului intracelular, stimulează procesul de reparare celulară și
favorizează preluarea prin endocitoză a altor molecule eliberate de limfocitul citotoxic. Pe de
altă parte porii p erforinici, cu un diametru de până la 20 nm, pot funcționa ca o cale directă de
pătrundere în celula țintă a celorlalte molecule litice.
Indiferent de rolul predominant direct sau indirect al perforinei se pune problema dacă
această proteină este indispensabilă pentru funcționarea limfocitelor citotoxice. Studiile
efectuate au demonstrat că absența perforinei scade drastic clearance -ul unor infecții virale ca
și eliminarea anumitor celule tumorale. Mecanismele apoptotice mediate de Fas permit însă
citoliza celulelor Fas+. Din această cauză mecanismul citolitic perforindependent și cel Fas –
dependent, în aparență redundante, se acoperă doar parțial, perforina intervenind în mod
singular asupra celulelor Fas – care nu cuplează FasL (ligandul Fas). În co ncluzie se poate spune
că perforina joacă un rol crucial în majoritatea cazurilor de citoliză mediată de limfocitele
citotoxice.