Controlul Luminos al Celulelor Biologice. Evaluare Electro Optica

[NUME_REDACTAT], Y. A., J. A. Jackson, J. Zhu, J. O'Connell, X. Wang, and X. Xu. 2004. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. J [NUME_REDACTAT] 292:195-205.

Ammann, D. 1986. Ion selective microelectrodes. SpringerVerlag 60:105-115.

Anderson, W.M., Delinck, D.L., Benninger, L., Wood, J.M., Smiley, S.T., Chen, L.B. 1993. Cytotoxic effect of thiacarbocyanine dyes on human colon carcinoma cells and inhibition of bovine heart mitochondrial NADH-ubiquinone reductase activity via a rotenone-type mechanism by two of the dyes. [NUME_REDACTAT] 45:691-696.

Andrews, B. J., G. A. Proteau, L. G. Beatty, and P. D. Sadowski. 1985. The FLP recombinase of the 2 micron circle DNA of yeast: interaction with its target sequences. Cell 40:795-803.

Antkowiak, M., M. L. Torres-Mapa, E. C. Witts, G. B. Miles, K. Dholakia, and F. J. Gunn-Moore. 2013. Fast targeted gene transfection and optogenetic modification of single neurons using femtosecond laser irradiation. [NUME_REDACTAT] 3:3281.

Arndt, S., J. Seebach, K. Psathaki, H. J. Galla, and J. Wegener. 2004. Bioelectrical impedance assay to monitor changes in cell shape during apoptosis. [NUME_REDACTAT] 19:583-94.

Axelrod, D. 2001. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic 2:764-74.

Bamberg,  E.,  Tittor, J., Oesterhelt, D. 1993. Light-driven proton or chloride pumping by halorhodopsin. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] USA 90:639-643.

Banghart, M., K. Borges, E. Isacoff, D. Trauner, and R. H. Kramer. 2004. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. [NUME_REDACTAT] 7:1381-6.

Bos, M. A., and J. M. Kleijn. 1995. Determination of the orientation distribution of adsorbed fluorophores using TIRF. I. Theory. Biophys J 68:2566-72.

Boyden, E. S., F. Zhang, E. Bamberg, G. Nagel, and K. Deisseroth. 2005. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. [NUME_REDACTAT] 8:1263-8.

Bradbury, S., and Evennett, P. 1996. Fluorescence microscop. [NUME_REDACTAT] in [NUME_REDACTAT]. BIOS [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT].

Bradley, J., R. Luo, T. S. Otis, and D. A. DiGregorio. 2009. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. J Neurosci 29:9197-209.

Breigina, M. A., A. V. Smirnova, N. P. Matveeva, and I. P. Ermakov. 2009. Membrane potential changes during pollen germination and tube growth. Cell and [NUME_REDACTAT] 6:573-582.

Buchschacher, J.R., and L. Garry. 2004. Safety considerations associated with development and clinical application of lentiviral vector systems for gene transfer. [NUME_REDACTAT] 5:19-35.

Bugaj, L. J., A. T. Choksi, C. K. Mesuda, R. S. Kane, and D. V. Schaffer. 2013. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. [NUME_REDACTAT] 10:249-52.

Butler, J. 2012. Optogenetics: shining a light on the brain. [NUME_REDACTAT] 2:10.1093.

Chen, L. B. 1989. Fluorescent labeling of mitochondria. [NUME_REDACTAT] Biol 29:103-123.

Chudakov, D. M., M. V. Matz, S. Lukyanov, and K. A. Lukyanov. 2010. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. [NUME_REDACTAT] 90:1103-1163.

Clarke, R. J., and H. J. Apell. 1989. A stopped-flow kinetic study of the interaction of potential-sensitive oxonol dyes with lipid vesicles. [NUME_REDACTAT] 34:225-237.

Cohen, L. B., and B. M. Salzberg. 1978. Optical measurement of membrane potential. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 83:35-88.

Conway, E. J. 1957. Membrane echilibrium in skeletal muscle and the active transport of sodium. Metabolic aspects of transport across cell membrane. University of [NUME_REDACTAT] Madison 73-114.

Craig, N. L. 1988. The mechanism of conservative site-specific recombination. [NUME_REDACTAT] Genet 22:77-105.

Daghestani, H. N., and Day, B. W. 2010. Theory and applications of surface plasmon resonance, resonant mirror, resonant waveguide grating, and dual polarization interferometry biosensors. Sensors 10: 9630-9646.

Debets, M. F., S. S. van Berkel, J. Dommerholt, A. T. Dirks, F. P. Rutjes, and F. L. van Delft. 2010. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. [NUME_REDACTAT] Res 44:805-815.

Deisseroth, K. 2011. Optogenetics. [NUME_REDACTAT] 8:26-9.

Dhakal, K., L. Gu, B. Black, and S. K. Mohanty. 2013. Fiber-optic two-photon optogenetic stimulation. [NUME_REDACTAT] 38:1927-1929.

Dhawale, A. K., A. Hagiwara, U. S. Bhalla, V. N. Murthy, and D. F. Albeanu. 2010. Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse. [NUME_REDACTAT] 13:1404-1412.

Dostálek, J., and W. Knoll. 2008. Biosensors based on surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy. Biointerphases 3:FD12-22.

Ehret, R., W. Baumann, M. Brischwein, A. Schwinde, and B. Wolf. 1998. On-line control of cellular adhesion with impedance measurements using interdigitated electrode structures. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 36:365-370.

Elzenga, J., and E. [NUME_REDACTAT]. 1997. Characterization of a [NUME_REDACTAT] Channel in the [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT] of Pea. [NUME_REDACTAT] 113:1419-1426.

Epps, D.E., Wolfe, M.L., and V Groppi. 1994. Characterization of the steady-state and dynamic fluorescence properties of the potential-sensitive dye bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol (Dibac4(3)) in model systems and cells. [NUME_REDACTAT] Lipids 69:137-15.

Ernst, O. P., and T. P. Sakmar. 2012. Structural biology: Ion channel in the spotlight. Nature 482:318-319.

Ernster, L. 1984. Bioenergetics. [NUME_REDACTAT] Biochemistry, 9: 332-340.

Farah, N., I. Reutsky, and S. Shoham. 2007. Patterned optical activation of retinal ganglion cells. [NUME_REDACTAT] IEEE [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 2007:6368-6370.

Farrelly, E., M. C. Amaral, L. Marshall, and S. G. Huang. 2001. A high-throughput assay for mitochondrial membrane potential in permeabilized yeast cells. [NUME_REDACTAT] 293:269-276.

Feldbauer, K., D. Zimmermann, V. Pintschovius, J. Spitz, C. Bamann, and E. Bamberg. 2009. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] U S A 106:12317-12322.

Felle, H., and A. Bertl. 1986. Light-induced cytoplasmic pH changes and their interrelation to the activity of the electrogenic proton pump in Riccia fluitans. [NUME_REDACTAT] Ada 848: 176-182.

Fenno, L., O. Yizhar, and K. Deisseroth. 2011. The development and application of optogenetics. [NUME_REDACTAT] Neurosci 34:389-412.

Fish, K. N. 2009. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 12:Unit12-18.

Gheorghiu, M., S. David, C. Polonschii, A. Olaru, S. Gaspar, O. Bajenaru, B. O. Popescu, and E. Gheorghiu. 2014. Label free sensing platform for amyloid fibrils effect on living cells. [NUME_REDACTAT] 52:89-97.

Giaever, I., and C. R. Keese. 1984. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] U S A 81:3761-3764.

Gradinaru, V., M. Mogri, K. R. Thompson, J. M. Henderson, and K. Deisseroth. 2009. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science 324:354-349.

Gradinaru, V., F. Zhang, C. Ramakrishnan, J. Mattis, R. Prakash, I. Diester, I. Goshen, K. R. Thompson, and K. Deisseroth. 2010. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell 141:154-165.

Grinvald, A. 1985. Real-time optical mapping of neuronal activity: from single growth cones to the intact mammalian brain. [NUME_REDACTAT] Neurosci 8:263-305.

Grossman, N., V. Poher, M. S. Grubb, G. T. Kennedy, K. Nikolic, B. McGovern, R. [NUME_REDACTAT], Z. Gong, E. M. Drakakis, M. A. Neil, M. D. Dawson, J. Burrone, and P. Degenaar. 1088. Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array. J [NUME_REDACTAT] 7:16004.

Hemmes, G. G. 2005. Spectroscopy for the biological sciences, [NUME_REDACTAT] & Sons, Hoboken NJ 36-46.

Hiep M., Endo H., Kerman T., Chikae K., Kim M., Yamamura D-K, Takamura S., Tamiya Y., and Eiichi. 2007. A localized surface plasmon resonance based immunosensor for the detection of casein in milk. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]  4: 331. 

Hille, B. 1973. Potassium channels in myelinated nerve. Selective permeability to small cations. J [NUME_REDACTAT] 61:669-686.

Hodgkin, A. L. 1968. The local electric changes associated with repetitive action in a non-medullated axon. J Physiol 107:165-181.

Huang H., Liu Z., X. Yang. 2006. Application of electrochemical impedance spectroscopy for monitoring allergen-antibody reactions using gold nanoparticle-based biomolecular immobilization method. [NUME_REDACTAT].  356:208-14.

Huber, D., L. Petreanu, N. Ghitani, S. Ranade, T. Hromadka, Z. Mainen, and K. Svoboda. 2008. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature 451:61-64.

Ishihara, Y., and N. Shimamoto. 2006. Involvement of endonuclease G in nucleosomal DNA fragmentation under sustained endogenous oxidative stress. J [NUME_REDACTAT] 281:6726-6733.

Jia, Z., V. Valiunas, Z. Lu, H. Bien, H. Liu, H. Z. Wang, B. Rosati, P. R. Brink, I. S. Cohen, and E. Entcheva. 2011. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery. [NUME_REDACTAT] Electrophysiol 4:753-760.

Kandel, E.R., Schwartz, J.H., and T.M., Jessell. 2000. Principles of [NUME_REDACTAT] 4: 6.

Kenneth N. F. 2009. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (TIRF) [NUME_REDACTAT] Protocols in Cytometry 10.1002/0471142956

Khuri, R. N., J. J. Hajjar, and S. K. Agulian. 1972. Measurement of intracellular potassium with liquid ion-exchange microelectrodes. J [NUME_REDACTAT] 32:419-422.

Knopfel, T., M. Z. Lin, A. Levskaya, L. Tian, J. Y. Lin, and E. S. Boyden. 2010. Toward the second generation of optogenetic tools. J Neurosci 30:14998-5004.

Lagali, P.S, Balya, D., Awatramani, G.B., Münch, T.A., Kim, D.S., Busskamp, V., Cepko, C.L., Roska, B. 2008. Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneration. [NUME_REDACTAT]. 11:667-75.

Liedberg, B., Nylander, O., Lunström, C., Ingemar. 1983. Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing. Sensors and Actuators 299:0250-6874.

Lim, D. H., J. Ledue, M. H. Mohajerani, M. P. Vanni, and T. H. Murphy. 2013. Optogenetic approaches for functional mouse brain mapping. [NUME_REDACTAT] 7:54.

Lima, S. Q., and G. Miesenbock. 2005. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell 121:141-52.

Lin, J. Y., M. Z. Lin, P. Steinbach, and R. Y. Tsien. 2009. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J 96:1803-1814.

Lisdat, F., and D. Schafer. 2008. The use of electrochemical impedance spectroscopy for biosensing. [NUME_REDACTAT] Chem 391:1555-1567.

Ljubica, V., Danijela, K.,  Jovan, V. 2000. Chemical aspect of the influence of cobalt ions on ATPase activity. Journal of the [NUME_REDACTAT] Society 7: 507-515.

Lundby, A., W. Akemann, and T. Knopfel. 2008. Biophysical characterization of the fluorescent protein voltage probe VSFP2.3 based on the voltage-sensing domain of Ci-VSP. [NUME_REDACTAT] J 39:1625-1635.

Maguire, A.M., High, K.A., Auricchio, A., Wright, J.F., Pierce, E.A., Testa, F., Mingozzi, F., Bennicelli, J.L., Ying, G.S., Rossi, S., Fulton, A., Marshall, K.A., Banfi, S., Chung, D.C., Morgan, J.I., Hauck, B., Zelenaia, O., Zhu, X., Raffini, L., Coppieters, F., [NUME_REDACTAT], E., Shindler, K.S., Volpe, N.J., Surace, E.M., Acerra, C., Lyubarsky, A., Redmond, T.M., Stone, E., Sun J., McDonnell, J.W., Leroy, B.P., Simonelli, F., Bennett, J. 2009. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 374:1597-605.

Mattheyses, A. L., S. M. Simon, and J. Z. Rappoport. 2010. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J [NUME_REDACTAT] 123:3621-3628.

McGovern, B., R. B. Palmini, N. Grossman, E. Drakakis, V. Poher, M. A. Neil, and P. Degenaar. 2010. A [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]-LED Array for [NUME_REDACTAT] Stimulation. IEEE [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 4:469-476.

Morimoto, T., K. Sakamoto, H. Sade, S. Ohya, K. Muraki, and Y. Imaizumi. 2007. Voltage-sensitive oxonol dyes are novel large-conductance Ca2+-activated K+ channel activators selective for beta1 and beta4 but not for beta2 subunits. [NUME_REDACTAT] 71:1075-1088.

Nagel, G., T. Szellas, W. Huhn, S. Kateriya, N. Adeishvili, P. Berthold, D. Ollig, P. Hegemann, and E. Bamberg. 2003. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] U S A 100:13940-13945.

Nagel, G., M. Brauner, J. F. Liewald, N. Adeishvili, E. Bamberg, and A. Gottschalk. 2005. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. [NUME_REDACTAT] 15:2279-2284.

Nguyen, D. D., X. Huang, D. W. Greve, and M. M. Domach. 2004. Fibroblast growth and H-7 protein kinase inhibitor response monitored in microimpedance sensor arrays. [NUME_REDACTAT] 87:138-144.

Novacu V. 1966. Electrodinamica, Editura didactică și pedagogică- Buccurești, 105-108

Novo, D., N. G. Perlmutter, R. H. Hunt, and H. M. Shapiro. 1999. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry 35:55-63.

Phillips K. S., and Cheng Q 2007. Recent advances in surface plasmon resonance based techniques for bioanalysis. [NUME_REDACTAT] Chem 381:1831-1840.

Prakash, R., O. Yizhar, B. Grewe, C. Ramakrishnan, N. Wang, I. Goshen, A. M. Packer, D. S. Peterka, R. Yuste, M. J. Schnitzer, and K. Deisseroth. 2012. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. [NUME_REDACTAT] 9:1171-1179.

Purves, D., Augustine, G. J., Fitzpatric, D.F., Hall W. C., Lamantia, A-S., Mcnamera, J. O., and Williams, S. M. 2004. [NUME_REDACTAT] Associates, 156-158.

Revsbech, N. P., B. Thamdrup, T. Dalsgaard, and D. E. Canfield. 2011. Construction of STOX oxygen sensors and their application for determination of O2 concentrations in oxygen minimum zones. [NUME_REDACTAT] 486:325-341.

Ritter, E., K. Stehfest, A. Berndt, P. Hegemann, and F. J. Bartl. 2008. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. J [NUME_REDACTAT] 283:35033-41.

Rubistein, I. 1995. Phisycal electrochemistry: Principles, Methodes and Applications. M. Dekker 667-687

Rost, F., and Oldfield, R. 2000. Fluorescence microscopy., Photography with a Microscope, [NUME_REDACTAT] Press 324-327. 

Salvioli, S., A. Ardizzoni, C. Franceschi, and A. Cossarizza. 1997. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Lett 411:77-82.

Sauer, B. 1994. Site-specific recombination: developments and applications. [NUME_REDACTAT] Biotechnol 5:521-527.

Scaduto, R. C., Jr., and L. W. Grotyohann. 1999. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J 76:469-477.

Schasfoort, R.B.M., and A.J. Tudos. 2008. Handbook of surface plasmon resonance. 978: 12-19.

Schobert, B., and J. K. Lanyi. 1982. Halorhodopsin is a light-driven chloride pump. J [NUME_REDACTAT] 257:10306-13.

Senecoff, J. F., R. C. Bruckner, and M. M. Cox. 1985. The FLP recombinase of the yeast 2-micron plasmid: characterization of its recombination site. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] U S A 82:7270-4.

Spring, K.R., and Davidson, M.W. 2008. Introduction to [NUME_REDACTAT]. Nikon MicroscopyU 20-24.

Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., and Zheng, W., 2004. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 2 :363–372.

Tengberg, A, Hovdenes, J, Andersson, H, Brocandel, O, Diaz, R, Hebert, D, Arnerich, T, Huber, C, Kortzinger, A, Khripounoff, Alexis, Rey, F, Ronning, C, Schimanski, J, Sommer, S, and Stangelmayer, A. 2006. Evaluation of a lifetime-based optode to measure oxygen in aquatic systems. Limnology and Oceanography methods 4: 7-17. 

Trebacz, K. 1989. Light-triggered action potentials in plants. [NUME_REDACTAT]. Bot. Pol. 58: 141-156.

Turro, N.S., Ramamurthy, V., Scaiano J.C. 2009. Principles of [NUME_REDACTAT] – An introduction. [NUME_REDACTAT] Books 78-80.

Valeur, B., Berberan, Santos M.N 2003. [NUME_REDACTAT] Principle and Applications 146-149.

Verkman, A. S., and M. P. Frosch. 1985. Temperature-jump studies of merocyanine 540 relaxation kinetics in lipid bilayer membranes. Biochemistry 24:7117-22.

Webb, D. J., and C. M. Brown. 2013. Epi-fluorescence microscopy. [NUME_REDACTAT] Biol 931:29-59.

Wegener, J., C. R. Keese, and I. Giaever. 2000. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. [NUME_REDACTAT] Res 259:158-66.

Wykes, R. C., J. H. Heeroma, L. Mantoan, K. Zheng, D. C. MacDonald, K. Deisseroth, K. S. Hashemi, M. C. Walker, S. Schorge, and D. M. Kullmann. 1012. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. [NUME_REDACTAT] Med 4:161ra152.

Xiao, C., B. Lachance, G. Sunahara, and J. H. Luong. 2002. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. [NUME_REDACTAT] 74:5748-53.

Xiao, C., B. Lachance, G. Sunahara, and J. H. Luong. 2002. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. [NUME_REDACTAT] 74:1333-9.

Xiao, C., and J. H. Luong. 2003. On-line monitoring of cell growth and cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). [NUME_REDACTAT] 19:1000-5.

Yeon, J. H., and J. K. Park. 2005. Cytotoxicity test based on electrochemical impedance measurement of HepG2 cultured in microfabricated cell chip. [NUME_REDACTAT] 341:308-15.

Zemelman, B. V., G. A. Lee, M. Ng, and G. Miesenbock. 2002. Selective photostimulation of genetically chARGed neurons. Neuron 33:15-22.

Zhang, F., L. P. Wang, M. Brauner, J. F. Liewald, K. Kay, N. Watzke, P. G. Wood, E. Bamberg, G. Nagel, A. Gottschalk, and K. Deisseroth. 2007. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature 446:633-9.

Cuprins

1. Noțiuni generale despre optogeneticã

1.1. Scurt istoric

1.2 Componente folosite în optogeneticã

1.3. Metode de transfecție utilizate în optogeneticã

1.4. Aplicațiile optogeneticii

1.5. Variația potențialului de membrană sub acțiunea stimulilor luminoși

1.5.1. [NUME_REDACTAT]- Hodgkin- Katz (GHK)

2. Materiale și metode

2.1. Materiale: Tipuri de clone celulare

2.1.1. HEK 293F-FLPN

2.1.2. HEK 293- G5

2.2. Metode de transfecție

2.3. Metode de evaluare

2.3.1. Patch- clamp

2.3.2. Spectroscopia de impedanță electrică

2.3.3. Microscopia de fluorescență

2.3.4. Epifluorescența

2.3.5. TIRFM

2.3.6. SPR

2.4. Markeri fluorescenți pentru evaluarea potențialului de membrană

3. Rezultate și discuții

3.1. Modelare teoretică a potențialului membranar

3.2. Studiul celulelor G5 și FLPN prin tehnica patch-clamp

3.3. Studiul celulelor FLPN și G5 prin spectroscopia de impedanță electrică

3.4. Rezultatele obținute prin microscopia de fluorescență

4. Concluzii

5. [NUME_REDACTAT] luminos al celulelor biologice: evaluare electro-opticã

Cuprins

1. Noțiuni generale despre optogeneticã

1.1. Scurt istoric

1.2 Componente folosite în optogeneticã

1.3. Metode de transfecție utilizate în optogeneticã

1.4. Aplicațiile optogeneticii

1.5. Variația potențialului de membrană sub acțiunea stimulilor luminoși

1.5.1. [NUME_REDACTAT]- Hodgkin- Katz (GHK)

2. Materiale și metode

2.1. Materiale: Tipuri de clone celulare

2.1.1. HEK 293F-FLPN

2.1.2. HEK 293- G5

2.2. Metode de transfecție

2.3. Metode de evaluare

2.3.1. Patch- clamp

2.3.2. Spectroscopia de impedanță electrică

2.3.3. Microscopia de fluorescență

2.3.4. Epifluorescența

2.3.5. TIRFM

2.3.6. SPR

2.4. Markeri fluorescenți pentru evaluarea potențialului de membrană

3. Rezultate și discuții

3.1. Modelare teoretică a potențialului membranar

3.2. Studiul celulelor G5 și FLPN prin tehnica patch-clamp

3.3. Studiul celulelor FLPN și G5 prin spectroscopia de impedanță electrică

3.4. Rezultatele obținute prin microscopia de fluorescență

4. Concluzii

5. [NUME_REDACTAT] generale despre optogeneticã

Optogenetica reprezintã o metodã neinvazivã de modulare a activității celulare, folositã cu predilecție în neuroștiințe, ce combinã tehnicile opticii cu cele ale geneticii pentru a controla evenimente bine definite ce au loc la nivelul țesuturilor și a celulelor vii (Deisseroth, 2011).

Un punct de inflexiune a fost reprezentat de momentul descoperirii opsinelor, gene ce codificã proteine care rãspund la luminã de o anumitã lungime de undã inducand fie curenți de depolarizare ca în cazul canalelor de rodopsinã de tip 2 (ChR2), fie curenți de hiperpolarizare precum în cazul halorodopsinei (NphR) (Fenno și Deisseroth, 2010). Stimularea luminoasã a celulelor excitabile electric este superioarã activãrii clasice cu ajutorul microelectrozilor datoritã rezoluției spațiale crescute și rezoluției temporale de ordinul milisecundelor (Butler, 2012).

Inițial, optogenetica a fost folositã în studiul maladiilor neuropsihiatrice, disfuncțiilor vederii (Lagali et al., 2008), cartografierii regiunilor creierului (Antkowiak, 2013), însã, la ora actuală folosirea tehnicii a fost extrapolatã și pentru studiul excitabilitãții miocardice (Jia el al., 2011), a cãilor metabolice (Bugaj et al., 2013) și a altor tipuri celulare.

Scurt istoric

Primele descoperiri în domeniul optogeneticii îi aparțin lui [NUME_REDACTAT]; în 1999 acesta a folosit luminã pentru a controla modelele activitãții electrice la diferite tipuri de neuroni. Crick a sugerat faptul cã lumina ar putea fi utilizatã ca un element de control, lãsand neafectate celulele din jurul regiunii de interes.

Cea mai recentã metodã ce are la bazã inserția geneticã fost raportatã în 2002, de cãtre [NUME_REDACTAT] și Gero Miesenböck. Aceștia au folosit molecule de rodopsinã de la Drosophila pentru a controla activitatea neuronilor mamalieni (Zemelman si Miesenböck, 2002). Începând cu anul 2004 grupul condus de Kramer și Isacoff a descoperit comutatorii organici care pot interacționa cu canalele ionice introduse genetic (Banghart et al., 2004). Cu toate acestea, provocãrile tehnice ale sistemului au dus la încheierea proiectului. În 2005, laboratorul condus de [NUME_REDACTAT], din cadrul Departamentului de Bioinginerie de la Stanford a publicat prima demonstrație a unui sistem optogenetic cu o singurã componentã folosind canalul de rodopsina ChR2. Acesta a fost caracterizat în 2003 de cãtre grupul cercetãtorului [NUME_REDACTAT] (Nagel et al., 2003).

Descoperirea ChR2 de la alga unicelularã Chlamydomonas reinhardtii (λmax= 470 nm) și a halorodopsinei, NphR, de la archaeea Natronomonas pharaonis (λmax= 580 nm) a reprezentat un moment important în dezvoltarea domeniului optogeneticii. ChR2, NphR și variantele derivate pot fi exprimate cu ușurința la nivelul celulelor, acestea fiind componente de bazã în cercetare (Boyden, 2011). Împreună, aceste canale au fost folosite pentru evidențierea activării și inactivării neuronilor (Figura 1). ChR2, unul dintre canalele cel mai bine caracterizate și folosite, are o cineticã rapidã și rãspunde la luminã verde-albastrã. Acesta este bine exprimat la nivelul membranei plasmatice neuronale și este desensibilizat de pulsuri sau luminã continuã, ceea ce conduce la rãspunsuri anormale atunci când membrana este depolariatã de astfel de stimuli (Boyden et al., 2005; Lin et al., 2009). Atunci când celulele mamaliene transfectate sunt activate de luminã albastrã (λmax= 470 nm), ChR2 rãspunde ca un canal cationic de curent invers (inward), depolarizând celulele. În schimb stimularea cu luminã galbenã a NphR duce la inactivarea celulelor ce răspund prin hiperpolarizare (Zhang el al., 2007).

Figura 1. A. Reprezentare schematicã a acțiunii canalelor de rodopsinã și halorodopsinã asupra celulelor neurale. B. Activarea potențialelor de acțiune la neuronii hipocampici de cãtre ChR2 (luminã albastrã) și inactivarea de cãtre NphR (luminã galbenã) (Dupã Zhang et al., 2007)

1.2 Componente folosite în optogeneticã

În scopul determinãrii unor parametri sau a unor procese moleculare se folosesc diferite componente pentru realizarea funcției de control și monitorizare: efectori și raportori. Prima generație de elemente cheie cu un puternic impact în neuroștiințe a fost reprezentată de raportorii de calciu modificați genetic, proteine fluorescente sau activatori neurali. În prezent se folosesc raportori dependenți de voltaj, silențiatori neuronali și proteine fluorescente.

Raportorii sunt reprezentați de biosenzori modificați derivați din fuziunea proteinelor fluorescente ([NUME_REDACTAT], FP) care convertesc semnalele fiziologice în schimbări în caracteristicile fluorescenței (Chudakov et al., 2010) – de exemplu: intensitate, lungime de undă de emisie. Proteinele sensibile la voltaj ([NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 2, VSFP2) reprezintă un exemplu de proteină fluorescentă raportoare ce conține un domeniu sensibil la voltaj (VSP) ce raportează schimbările potențalului membranar printr-un semnal al transferului de energie al rezonanței fluorescente (FRET) (Lundby, 2008). Efectorii constituie elemente modificate genetice care răspund la stimulare luminoasă (Lima și Miesenbock, 2005). Aceștia sunt reprezentați de canale ionice activate de lumină și de pompe ionice (Gradinaru et al., 2010) (Figura 2), folosite pentru a manipula în mod direct circuitele neuronale.

Un alt element important ce conferă rezoluție spațială crescută de ordinul micrometrilor este reprezentat de dioda ce emite lumină (LED) care a fost folosită în studiul creierului și a retinei (Huber et al., 2008). LED-urile sunt dispozitive eficiente, ieftine, având o rezoluție temporalã crescutã (McGovern et al., 2010). O altã variantã folositã este micro-LED-ul. Acesta genereazã profile de iluminare mai întunecate în câmpul de excitare. Micro-LED-ul a fost folosit atât in vivo cât și in vitro pentru foto-excitarea ganglionilor retinali transfectați cu ChR2 (Farah et al., 2007; Grossman et al., 2010) sau pentru a decodifica mecanismele responsabile de miros la nivelul bulbului olfactiv (Dhawale et al., 2010). O alternativă la utilizarea LED-urilor este folosirea fibrelor optice luminoase. Aceste dispozitive sunt suficiente pentru stimularea luminoasă a suprafeței de interes având o rezoluție crescută. Pentru investigarea țesuturilor dense este preferată tehnica de excitarea cu doi fotoni din cauza transmitanței crescută (Gradinaru et al., 2010).

Alte dispozitive folosite cu succes în studiul optogeneticii sunt reprezentate de optrode. Acestea sunt senzori optici de înaltă rezoluție folosiți pentru detecția substanțelor de interes cu ajutorul unui traductor chimic (Tengberg el al., 2006). Datorită costurilor mici de achiziție și rezistenței pe termen lung, optrodele sunt utilizate ca alternativă la senzorii electrochimici. Modalitățile de măsurare pe care le folosesc aceste dispozitive sunt diverse, cele mai întâlnite sunt măsurătorile bazate pe reflectivitate, absorbție, sau lumiscență (fluorescență sau fosforescență). Sunt raportate utilizări ale optrodelor în studii cantitative, în special privind cantitatea de oxigen din țesuturi, sau din din sisteme acvatice (Tengberg el al., 2006; Revsbech et al., 2011). Deasemenea, sunt folosite și pentru observarea funcționalității canalelor ionice. În anul 2010, echipa condusă de Gradinaru a folosit optrodele pentru confirmarea activării la stimuli luminoși a celulelor transfectate stabil cu ChR2 (Gradinaru et al., 2010).

Alt element ce poate măsura potențialele în contact direct cu receptorul din biosenzor îl constituie microelectrodul. Acesta este folosit în studiile de electrofiziologie pentru înregistrarea semnalelor provenite de la neuroni și pentru stimularea electrică a țesutului de interes (Cogan, 2008). Microelectrozii pot fi solizi sau lichizi. Microelectrozii solizi sunt constituiți prin depunerea unui strat metalic conductor (platină sau aur) pe un suport de sticlă având un vârf subțire, în timp ce microelectrozii lichizi sunt alcătuiți dintr-o pipetă de sticlă de dimensiuni micronice, umplută cu o soluție de clorură de potasiu. Un fir conductor este cufundat în soluția de electrolit, pentru a prelua potențialul electric (Cogan, 2008). Microelectrozii lichizi sunt folosiți pentru măsurarea directă a activității intracelulare sau extracelulare a ionului de interes (Khuri et al., 1972), pentru determinarea potențialului membranar sau a condițiilor termodinamice necesare transportului ionic (Ammann, 1986).

1.3. Metode de transfecție utilizate în optogeneticã

Pentru exprimarea în celulele țintă a moleculelor efectoare sau raportoare se folosesc metode de transfecție. Acestea se bazeazã pe construirea vectorilor și a promotorilor specifici pentru expresia rodopsinelor microbiene. Au fost utilizate de-a lungul timpului diferite virusuri, cei preferați fiind Lentivirusurile și [NUME_REDACTAT]-Asociate (AAV) deoarece acestea încorporeazã ADN-ul propriu în genomul celulei gazdã, multiplicându-l (Buchschacher, 2004). Opsinele sunt fuzionate cu promotorul specific al celulei pentru a realiza un virus recombinant. Utilizarea virusurilor este rapidã, eficientã și are implicații biomedicale.

Au fost realizate și animale transgenice (șoareci, musculițe, peștele-zebrã), însã acestea se realizeazã într-un timp îndelungat dar s-au dovedit a fi o gazdã idealã pentru realizarea diferitelor experimente (Butler, 2012).

Figura 2. Proteine raportoare și efectoare heterologe folosite în studiul proceselor moleculare ale populațiilor de celule. Raportarea optică și controlul sunt exemplificate de proteine fluorescente sensibile la voltaj (VSFP2, stânga), canale ionice dependente de lumină (ChR2, dreapta sus) și pompe ionice (NpHR, drepta jos). Potențialele de acțiune sunt reprezentate în roșu. Lumina induce activarea ChR2 și inhibarea NphR (Figurã adaptatã dupã Knopfel et al., 2010).

Figura 3. Ilustrarea circuitelor de analiză, de monitorizare și control. Lumina poate fi generată prin iluminare simplă și poate fi colectată pentru a analiza informațiile. Combinația metodelor poate fi utilizată pentru a investiga comportamentul diferitelor populații de neuroni (Figurã adaptatã dupã Knopfel et al., 2010).

1.4. Aplicațiile optogeneticii

Optogenetica este o tehnicã preferatã în cercetare deoarece se poate obține stimularea luminoasă a celulelor cu mare precizie, într-o manieră reversibilă. Dintre aplicațiile optogeneticii, de mare interes sunt:

Culturi celulare. Analiza rețelelor neurale.

Culturile celulare și rețelele neurale pot fi obținute prin creșterea neuronilor pe substraturi micro sau nano-metrice. Celulele pot fi stimulate sau silențiate cu ajutorul unei raze de lumină. Rezultatele obținute din astfel de experimente pot fi folosite pentru realizarea modelelor teoretice ale rețelelor neurale (Zhang et al., 2007).

Maparea regiunilor din creier

După succesul controlului neuronilor cu ajutorul ChR2 multe laboratoare au lucrat susținut pentru cartografierea regiunilor creierului la animalele vii. Studiile indică faptul că folosirea optogeneticii oferă posibilitatea reliefării detaliilor fine care nu ar fi fost ușor de evidențiat prin metodele tradiționale electrice sau optice. Rezultatele au fost obținute prin stimularea neuronilor responsabili de mișcarea mustăților la șobolani cu ajutorul fibrelor optice sau în urma evidențierii mișcării animalelor după stimularea cortexului motor (Huber et al., 2008). În anul 2013, la universitatea din [NUME_REDACTAT] a fost demarat proiectul de cartografiere a creierului cu ajutorul unui stimulator optogenetic cu doi fotoni și a nanotehnologiei. Stimulatorul utilizează pulsuri de lumină pentru a controla activitatea neuronilor într-un mod neinvaziv. Tehnica presupune introducerea ChR2 la nivelul celulelor gazdă și excitarea celulelor prin intermediul unei raze de lumină din spectrul infraroșu. Acest tip de lumină este superior luminii albastre și verzi folosite anterior în experimentele de optogenetică (Dhakal et al., 2013). O altă abordare a cartografierii creierului o constituie circuitul de cartografiere bazat pe ChR2 (ChR2 assisted circuit mapping, CRACM). Metoda combină fotostimularea diferitelor puncte din proba de interes împreună cu înregistrări postsinaptice. Asemănător cu tehnica de fotostimulare cu ajutorul laserului ([NUME_REDACTAT] Photostimulation, LSPS) ce folosește glutamatul pentru a cartografia rețelele neurale expuse la stimulul excitatoriu, CRACM utilizează stimularea luminoasă pentru a conecta diferite regiuni (Lim et al., 2013).

Terapie genică

Instrumentele optogeneticii fac posibilă implementarea terapiei genice în scopul determinării mecanismelor și a tratamentului unor boli. Experimentul ce viza încercarea de a trata neuropatia optică congenitală Lebers a fost un succes datorită transfecției prin intermediul AAV la nivelul retinei umane pentru a înlocui izomeraza retinală (Maguire et al., 2009). [NUME_REDACTAT] este o boală cu transmitere mitocondrială ce constă în degenerarea celulelor ganglionare. Acest sindrom afectează în mod deosebit tinerii adulți, determinând pierderea vederii centrale. Experimentele realizate de echipa condusã de Wykes pe neuronii neocorticali ai șoarecilor susțin faptul cã transfecția cu NphR și Kv1.1 cu ajutorul lentivirusurilor duce la scăderea crizelor epileptice. Terapia genicã a neuronilor neocorticali ai șoarecilor previne apariția crizelor epileptice acute, tratând cu succes focarul epileptic deja stabilit (Wykes et al., 2012).

Recuperarea vederii

Experimente realizate pe fotoreceptorii deficienți de la șoareci a arătat faptul că lumina evocă potențiale de acțiune la nivelul cortexului vizual după transfecția în retină a neuronilor bipolari de centru ON cu ChR2. Acest experiment indică faptul că animalele și-au recăpătat fotosensibilitatea receptorilor care se transmite prin intermediul nervului optic. Traiectoriile mișcării animalelor în lumină și în întuneric au arătat o activitate mult crescută a animalelor în condiții de lumină (Huber et al., 2008). Se consideră că o astfel de abordare ar fi potrivită și pentru persoanele oarbe sau pentru suferinzii de degenerare oculară (Lagali et al., 2008).

[NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] afara tratamentului medicamentos, boala Parkinson poate fi tratată cu ajutorul Stimulării adânci a creierului ([NUME_REDACTAT] Stimulation- DBS). Metoda rezidă în aplicarea stereotactică a unui set de electrozi metalici la nivelul nucleului subtalamic. Prin intermediul electrozilor este indus un câmp electric oscilatoriu pentru a stimula neuronii. Deși aparent superior medicației, acest tratament induce prin stimularea extracelulară nu doar depolarizarea dorită, dar și hiperpolarizarea celulelor cu efecte adverse nedorite. În plus, dezavantajul implantării unui material străin pentru perioade lungi de timp, necesitatea înlocuirii periodice a bateriilor de stimulare, posibilitatea defectării echipamentului sau a interacției cu alte dispozitive electromagnetice, de exemplu cele bazate pe rezonanța magnetică (IRM) demonstrează utilitatea unor proceduri alternative de stimulare. Astfel, o altă abordare constă în transfecția virusurilor cu ChR2 și inocularea acestora la nivelul nucleului subtalamic. Acestă metodă este superioară celei dintâi menționate având un potențial substanțial în descoperirea cauzei bolii cât și a tratamentului potrivit (Gradinaru et al., 2009).

Variația potențialului de membrană sub acțiunea stimulilor luminoși

Potențialul de membrană apare drept consecință a acțiunii a doi parametri fiziologici: distribuția asimetrică a ionilor pe cele două fețe ale membranei celulare și permeabilitatea selectivă a membranei pentru acești ioni. Gradienții pentru Na+ și K+ sunt generați și menținuți de către ATP-aza Na+/ K+ (Figura 4), o proteină prezentă în membrana tuturor celulelor de origine animală. Aceasta folosește energia eliberată în urma hidrolizei unei molecule de ATP pentru a transporta 3 ioni de sodiu la extrior și a introduce în celulă 2 ioni de potasiu (Ljubica et al., 2000).

Figura 4. Pompa de sodiu și potasiu transportă două specii ionice prin membrană, folosind energia obținută în urma hidrolizei unei molecule de ATP. Aceasta introduce în celulă 2 ioni de potasiu și eliberează la exteriorul celulei 3 ioni de sodiu ([NUME_REDACTAT] et al., 2000)

Pompa de sodiu și potasiu dezvoltă și apoi întreține un gradient direcționat către mediul extracelular pentru K+, iar pentru Na+ un gradient orientat către mediul intracelular, sensul acestora fiind caracteristic tuturor celulelor animale. Al doilea parametru, permeabilitatea selectivă a membranei pentru aceste specii ionice are la bază selectivitatea canalelor ionice membranare. Prin combinarea gradienților ionici transmembranari și a permeabilității diferite pentru diverse specii ionice se obține baza generării diferenței de potențial transmembranar (Ljubica et al., 2000).

Pentru ilustrarea caracteristicii de permeabilitate a membranei se folosește exemplul a două specii ionice printr-o membrană permeabilă și selectivă pentru o singură specie ionică. Compartimentul A (partea intracelulară a celulei ipotetice) conține 100 mM KCl și 10 mM NaCl. Compartimentul B (mediul extracelular) conține 10 mM KCl și 100 mM NaCl. Astfel, avem un gradient de concentrație de K+ orientat către exterior, un gradient de Na+ orientat către interior (Ljubica et al., 2000).

Premisa inițială este aceea că membrana care separă cele două compartimente este permeabilă doar pentru ionii de K+. Pe măsura ce acesta difuzează din celulă conform gradientului său de concentrație, în interior răman sarcini reziduale negative (în cazul de față Cl-), al căror surplus local pe fața interioară a membranei reprezintă o forța care atrage sarcini pozitive mobile de pe fața externă înapoi în celulă; în acest caz singurii ioni mobili capabili să traverseze membrana sunt ionii de K+. Cât timp forța determinată de gradientul de concentrație de K+ orientat către exterior este mai mare decât forța electrică orientată în sens opus acestuia, există un eflux net al potasiului din celulă. Totuși, cu cât mai mult potasiu iese din celulă, cu atât crește cantitatea de sarcină negativă reziduală la interior și prin urmare și forța electrostatică ce introduce ionii de K+ înapoi în celulă, ajungându-se treptat la o stare de echilibru între forța electrică și cea chimică. Fluxul net de ioni de potasiu la echilibru este egal cu zero. Ecuația care descrie starea de echilibru între cele două forțe electrice și chimice este ecuația lui Nernst (Hille, 1973):

VK+ = – ln

Unde VK+ este potențialul electric de echilibru reprezentat în ecuație de raportul concentrațiilor K+ intra și extracelulare, R este constanta gazelor ideale și este egală cu 8,31 J/K x mol, T reprezintă temperatura absolută în grade Kelvin, F este constanta lui Faraday cu o valoare de 96 500 Coulombi/mol, iar z este valența ionului în discuție, în cazul de față +1.

[NUME_REDACTAT]- Hodgkin- Katz (GHK)

Membranele biologice sunt departe de modelul ideal; acestea prezintă permeabilitate pentru majoritatea ionilor anorganici din fluidele organismului. Pentru cele mai multe dintre celule, principalii ioni care exercită o influență asupra acestui fenomen bioelectric sunt ionii de Na+, K+ și Cl-. Ionii de Ca2+ contribuie în cazul câtorva țesuturi, în special țesutul muscular și miocardic (Hille, 1973). De aceea, ecuația Nernst, care reprezintă o situație ideală poate fi modificată pentru a reprezenta cazul în care membrana prezintă permeabilitate pentru cei trei ioni majoritari.

Cea mai folosită teorie pentru a descrie permeabilitatea ionilor si selectivitatea membranelor este cea propusă de Goldman (1943), Hodgkin și Katz (1949). În cazul acestui model membrana este văzută ca o regiune omogenă permeabilă pentru diferite particule. Nu se face referire la conceptul de pori. Deoarece particulele sunt încărcate electric, fluxul din interiorul membranei este determinat de gradientul de concentrație și de existența unui câmp electric. Cele mai importante ipoteze sunt că ionii trec nestingheriți prin membrană, fără a interacționa unii cu alții iar cea de-a doua se referă la câmpul electric constant. Aceste două presupuneri duc la expresia celor două ecuații, de voltaj și de curent. Ecuația de curent permite calcularea permeabilității absolute a ionilor cu condiția ca potențialul membranar și concentrațiile să fie cunoscute. A doua ecuație a modelului GHK, numită ecuația de voltaj permite calcularea potențialului de membrană (Em) în momentul în care nu există flux de ioni (Hille, 1973).

unde Em reprezintă diferența de potențial transmembranar iar Pi este permeabilitatea membranară (măsurată în cm/s) pentru ionul indicat.

Tabelul 1. Distribuția principalelor specii ionice intra și extracelulare, de la nivelul neuronilor (Hille, 1973)

Modificarea permeabilității membranei pentru diverse specii ionice determină transportul de sarcină electrică în sau dinspre interiorul celulei, cauzând variații ale valorii potențialului membranar. Aceste modificări poartă denumirea de potențiale locale, ce se pot manifesta în două moduri: prin depolarizare sau hiperpolarizare. Depolarizarea induce o deplasare a potențialului membranar spre valori mai pozitive, proces ce se realizează fie prin pătrunderea de sarcini pozitive în celulă, fie printr-un eflux de sarcini negative. Hiperpolarizare duce la deplasarea potențialului de membrană spre valori mai negative decât cele inițiale; aceasta se realizează printr-un influx de sarcini negative) (Hille, 1973) sau eflux de sarcini pozitive.

Tabelul 2. Distribuția principalelor specii ionice intra și extracelulare, de la nivelul mușchiului de broască, axon de calmar și celulă tipică mamaliană ([NUME_REDACTAT], 1973)

ChR2 și NphR sunt canale intens studiate fiind componente de bazã în cercetare (Boyden, 2011). ChR2 este un canal ionic, cu 7 alfa helixuri transmembranare (Feldbauer et al., 2009), permeabil pentru ioni monovalenți precum Na+, K+, H+ și ioni divalenți, Ca2+ (Figura 5). În anul 2012, Ernst și Sakmar au descoperit regiuni negative situate între helixurile 1, 2, 3 și 7 întrerupte de două trio-uri de aminoacizi, care formează porțile S1 și S2 (Ernst și Sakmar, 2012).

Figura 5. ChR2 este alcătuit din 7 helixuri transmembranare ce delimitează un por central, având în componența sa o grupare retinal și două porți S1 și S2 (Ernst și Sakmar, 2012).

Acest canal, exprimat în celule HEK293, reacționează în urma iluminării cu lumină albastră printr-o depolarizare rapidă și puternică (Nagel et al., 2005). Se obține un curent rectificat spre interior datorat deschiderii rapide a canalelor și o închidere rapidă la condiții de întuneric. Aceste modificări reprezintă o consecință a diferitelor etape ale fotociclului ChR2 ce constau în izomerizarea retinalului, schimbări conformaționale ca urmare a legăturilor de hidrogen formate de acizii carboxilici și alterării scheletului proteic (Ritter et al., 2008).

Studii de patch-clamp indică faptul că în urma unei scurte iluminări cu laserul de lumină albastră, la lungimea de undă de 473 nm, apar intermediarii M-like care indică deprotonarea retinalului. ChR2 leagă o bază Schiff la nivelul helixului 7. Iluminarea induce un curent rectificat spre interior la nivelul ChR2, dependent de voltajul aplicat (Figura 6). Se observă în timp desensibilizarea canalului expus la lumină, curentul scăzând exponențial cu rata de deschidere a ChR2 (Feldbauer et al., 2009).

Figura 6. Curenții induși la iluminarea cu un laser de lumină albastră (473 nm) înregistrați prin patch-clamp A. Curenți inverși induși de iluminare și desensibilizarea în timp. B. Curbe I-V pe baza măsurătorilor realizate în A ([NUME_REDACTAT] et al., 2009).

Recuperarea după desensibilizare este accelerată de H+ extracelulari și de potențialul membranar negativ iar închiderea canalului este datorat H+ intracelulari (Feldbauer et al., 2009).

Conductanța precisã a ChR2 nu a fost încã determinatã, însã experimente indicã valori cuprinse în intervalul 50 fS, 0,25-2,4 pS pânã la 10 pS. Au fost realizate studii ale proprietãților unui singur canal prin tehnica patch-clamp, însã curentul obținut a fost cu mult mai mic decât era de așteptat (10-13 A la -100 mV) (Nagel et al., 2003). O altã abordare de mãsurare a constat în determinarea fluctuațiilor foto-curentului macroscopic sub acțiunea factorilor externi. La concentrații de 200 mM Na+ conductanța obținutã a fost de 40 fS, corespunzãtoare unui curent de 3,5 x 10-15 A (la -60 mV) (Feldbauer et al., 2009). Într-o soluție conținând Ca2+ 80 mM se observă în cazul foto-activării ChR2 curenți mari, bifazici, induși de intrarea Ca2+ în citosol. La pH 7,6 ChR2 este permeabil pentru cationii de N-metil-D-Glutamină (NMG+), observându-se curenți mici spre interior (Nagel et al., 2003).

Cele mai multe studii au fost realizate pe ovocite de Xenopus, însă pentru a evidenția conductanța ChR2, acesta a fost exprimat la nivelul celulelor HEK 293 (Figura 7) și celule embrionare renale de hamster (Baby hamster kidney cells, BHK). În aceste celule ChR2 produce în momentul iluminării o conductanța cationică amplă urmată de desensibilizare. Studiile de patch-clamp în configurație whole-cell indică faptul că această conductanță este pasivă, deoarece potențialul de reversie pentru concentrațiile de ioni asimetrici a fost determinat ca fiind 0. Aceste rezultate au arătat în cazul Na+ un curent rectiliniu, spre rectificat spre interior (Nagel et al., 2003).

Figura 7. Curenții obținuți în cazul celulelor HEK 293 transfectate cu ChR2. Au fost obținuți curenți la -100, -50, 0, +50 și +100 mV (Figura adaptată după Nagel et al., 2003)

Un alt canal ionic investigat este halorodopsina ce absoarbe în jurul valorilor de 568 și 588 nm. Funcția sa a fost identificată ca fiind aceea a unei pompe de Cl-  (Schobert și Lanyi, 1982). În urma fotoizomerizării all-trans retinalului la izomerul 13-cis se formează o serie de intermediari. Halorodopsina poate produce în urma diferitelor reacții compuși denumiți H410. Acesta se formează din intermediarul H520 ce conține în configurația 13-cis o baza Schiff deprotonată. Iluminarea compușilor H410 cu lumină verde continuă duce la inhibarea pompei de Cl-. Experimentele cu BLM (membrane lipidice negre) au arătat că iluminarea cu lumină albă (combinație de albastră și verde) a indus fotocurenți dependenți de Cl- (Bamberg et al., 1993). În timpul iluminarii s-a observat faptul că interiorul celulelor era acid, cu valori negative ale potențialului membranar, datorat intrării de Cl- în celulă. Acest transport generează un gradient de concentrație pentru Cl-. Potențialul membranar crește cu 10-40 mV iar pH variază într-un interval restrâns, resimțindu-se o diferență între 0-1 unități de pH. Potențialul de repaus pornește de la valori cuprinse între -100 ÷ -110 mV, având un interior celular negativ (Ernster, 1984).

La pH fiziologic, principalul efect al iluminării îl constituie creșterea valorilor potențialului membranar. Un alt efect observat a fost creșterea greutății celulelor ca urmare a intrării apei în celulă (Ernster, 1984).

Materiale și metode

Au fost folosite linii celulare HEK 293 ([NUME_REDACTAT] Kindney) FLPN și G5 la nivelul cãrora a fost evidențiată variația potențialului de membrană la aplicarea stimulilor luminoși prin intermediul tehnicii patch-clamp. Procesele celulare precum aderarea celularã, creșterea pe suprafața de contact și realizarea joncțiunilor celulare au fost monitorizate direct prin microscopia de fluorescență și spectroscopia de impedanțã electricã.

Materiale: Tipuri de clone celulare

Celulele au fost furnizate în cadrul unui acord de colaborare între [NUME_REDACTAT] de Biodinamică și [NUME_REDACTAT] de Sănătate NIH-NEI, laboratorul [NUME_REDACTAT].

2.1.1. HEK 293F-FLPN

Linia celularã de la nivelul cãreia au fost realizate derivații, care a fost folositã pe post de control a fost HEK 293F-FLPN In. Aceasta este o linie comercialã furnizatã de [NUME_REDACTAT] Invitrogen care se caracterizeazã printr-o modificare geneticã bazatã pe inserția secvenței FRT ([NUME_REDACTAT] Target) pe unul din cromozomi. Menținerea secvenței este asiguratã prin cultivarea celulelor pe un mediu de selecție cu zeocinã. Prin folosirea sistemului de recombinare al ADN de la Saccharomyces cerevisiae (Flp) și a unui situs FRT specific (Craig, 1988; Sauer, 1994) este facilitatã integrarea stabilã și permanentã a genelor de interes la nivelul situsului genomului mamalian. Situsul FRT minimal este alcãtuit din 34 de perechi de baze dintre care 13 reprezintã secvențe inversate despãrțite de un spațiator de 8 perechi de baze, unde se gãsește situsul de restricție Xba I. Recombinaza FRT se leagã la secvențele inversate, însã clivarea are loc în regiunea spațiatorului (Andrews et al., 1985; Senecoff et al., 1985). În momentul integrãrii unei proteine la nivelul situsului FRT aceasta va fi exprimatã într-un mod stabil și în cantitãți suficiente pentru detecție, în același timp pierzându-se rezistența la zeocinã. Aceastã pierdere este urmatã de câștigarea rezistenței la higromicinã și pierderea expresiei de beta-galactozidazã.

2.1.2. HEK 293- G5

Aceastã linie celularã pornește de la una din clonele de HEK 293-FLPN și are o triplã inserție la situsul FRT. Exprimă echimolar canalul de calciu Cav 1.2 pe cel de potasiu ROM K1 și o cantitate redusã de canale rodopsină marcate cu proteina fluorescentă verde ([NUME_REDACTAT] Protein, YFP). Suplimentar, s-a crescut expresia de canale de rodopsină prin intermediul unei strategii de selecție diferite. Strategia costã în generarea într-o manierã clasicã (electroporare) a liniilor de celule la nivelul cãrora a fost introdusã proteina de interes (ChRh2-YFP) în tandem cu o casetã de selecție ce conține gena de rezistențã la gentamicinã (G418). Linia celularã HEK-G5 a fost selectată în a doua zi după electroporare, folosind 300 μg/ml G418 și 100 μg/ml higromicină, menținând astfel constructul la nivelul celulelor.

Celulele HEK FLPN In au fost cultivate în flascuri tratate cu poly-L-Lizina, în mediu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) îmbogațit cu 10% FBS ([NUME_REDACTAT] Serum, Biochrome), 1% penicilinã/streptomicinã (Biochrome), 100 μg/ml Higromicinã și pãstrate în incubator la 37°C și 5% CO2. Celulele HEK G5 au fost cultivate în mediu DMEM (Dulbec’s modified Eagle’s Medium), 10 % FBS ([NUME_REDACTAT] Serum), 200 uL/100 mL Higromicinã și Geneticinã. Atunci când celulele au atins o confluențã de 70-80 % au fost realizate pasaje folosind 0.05% Tripsin-EDTA (Gibco).

Metode de transfecție

Transfecția reprezintã transferul de material strãin într-o celulã țintã, cu ajutorul unui vector avand ca scop obținerea unor populații de celule omogene (clone celulare). Folosirea vectorilor virali faciliteazã transferul, infecția propagându-se rapid în cultura de celule.

Celulele HEK FLPN și G5 au fost obținute prin transfectarea liniei parentale de celule embrionare umane HEK-293 cu ajutorul unui vector viral prin electroporare. În cazul celulelor FLPN a fost folosit kit-ul furnizat de [NUME_REDACTAT] Invitrogen. Linia celularã FLPN conține un situs FRT și gena lacZ-Zeocin, genã rezultatã din fuziunea plasmidului lacZeo cu pFRT care se aflã controlul promotorului SV40 (Figura 8).

Figura 8. Componența vectorului viral pentru transfecția celulelor FLPN ([NUME_REDACTAT] Tehnologies)

Celulele HEK G5 au fost realizate prin transfectarea liniei celulare FLPN cu canale ionice dependente de voltaj Cav1.2 și ROM K1 și un număr suplimentar de canale de rodopsină. Vectorul necesar pentru tranfecție conține un triplu situs FRT, gena de rezistența la neomicinã și ChR2-YFP însoțit de prezența a 22 de aminoacizi necesari pentru detecția fluorescentã a constructului.

Metode de evaluare

Patch- clamp

Tehnica de patch-clamp permite studiul proprietaților funcționale ale canalelor ionice și a fost descoperitã în anul 1976 de cãtre [NUME_REDACTAT] și [NUME_REDACTAT], descoperire pentru care cei doi cercetători au primit premiul Nobel pentru Fiziologie și Medicinã în anul 1991. Metoda și-a găsit aplicare în studiul canalelor implicate în excitabilitatea electricã, studiul proprietãților electrofiziologice ale membranelor biologice, inclusiv pentru canalele cu conductanța micã.

Metoda are la bazã folosirea unei pipete de sticlã conținând o soluție salinã de concentrație similarã cu cea a mediului intracelular și realizarea unui contact foarte strâns cu o suprafața micã a membranei celulei (patch) (Kandel et al., 2000).

Principalele configurații de înregistrare, așa cum au fost descrise de [NUME_REDACTAT] sunt cell-attached, whole-cell, outside-out și inside-out (Figura 9).

Configurația de pornire se numește cell-attached. Micropipeta de sticlã se aduce în proximitatea membranei celulare și se realizeazã un contact strâns de rezistențã mare. În acest fel daca la nivelul patch-ului existã canale deschise, diferitele specii ionice se vor deplasa în sau dinspre pipetã, astfel încât curentul existent, deși mic, poate fi mãsurat cu ajutorul unui amplificator electronic ultrasensibil. Configurația cell-attached este o configurație de tip single-channel în care se pãstreazã celula intactã.

În cazul în care fragmentul de membranã din pipetã este rupt prin aplicarea de presiune negativã mare, soluția din interiorul pipetei intrã în contact cu soluția citoplasmaticã, acesta nouã configurație purtând numele de whole-cell. Aceastã configurație permite înregistrarea de potențiale electrice și de curenți la nivelul întregii membrane celulare. Metoda prezintã de asemenea avantajul schimbului de substanțe între soluția citoplasmaticã și cea din pipetã care permite controlul potențialului transmembranar de cãtre experimentator.

Configurațiile outside-out și inside-out permit controlul atât la nivel chimic cât și electric al mediului fragmentului de membranã, dar și al canalelor ionice aflate în acest mediu. Outside și inside se referã la partea extra, respectiv intracelularã a membranei, iar out la soluția extracelularã aflatã în baie. Prin retragerea pipetei din whole cell se formează un nou patch, cu fața externă a membranei expusă la exterior, numit outside-out, configurație ideală pentru studii farmacologice ale compușilor ce acționează din exterior (Purves et al., 2004).

Figura 9: Configurații de realizare a tehnicii patch-clamp (Dupã Purves et al., 2004)

Mod de lucru

În cazul experimentelor de patch-clamp am folosit tehnica de whole-cell atât pentru celulele FLPN cât și HEK G5. Amplificatorul folosit a fost de tip AxoPATCH 200B cu software pCLAMP ([NUME_REDACTAT], Sunnyvale, CA,USA), iar software-ul utilizat pentru achiziționarea datelor a fost cel de Clampex 8.1 ([NUME_REDACTAT] Incorporated, USA). Pipetele de patch-clamp au fost obținute din capilare din borosilicat (GC150F-10, [NUME_REDACTAT]) și dupã ce au fost șlefuite au avut o rezistențã cuprinsã între 3,5 și 5,5 MΩ. Potențialul transmembranar a fost fixat la valoarea de -80 mV. Protocolul folosit a fost cel de rampe de voltaj. Au fost realizate rampe duble, pe o duratã de 400 de ms, rampe ce au fost aplicate de la -80 la +60 apoi revenind la valoarea de -80 mV. Protocolul folosit a inclus 4x 10 rampe fãrã luminã urmate de 3 cicluri a câte 3 rampe cu luminã emisã de un LED cu luminã albastrã la 470 nm. Datele achiziționate au fost analizate folosind programele Clampfit 8.1 ([NUME_REDACTAT] Incorporated, USA) și OriginPro 8 ([NUME_REDACTAT] Corporation, 2007). Pentru analiza statisticã a fost folosit testul t Student.

[NUME_REDACTAT] Ringer extracelularã a conținut (în mM): 130- NaCl, 5,4- CsCl2, 1-MgCl2, 2- CaCl2, 10-HEPES, 10-GLC, 0,5- NaH2PO4.

Soluția intracelularã pentru pipete a conținut (în mM): 140- CsCl2, 5- EGTA, 10- HEPES.

Mediul folosit pentru celulele HEK FLPN a conținut DMEM (Dulbec’s modified Eagle’s Medium) îmbogãțit cu 10 % FBS ([NUME_REDACTAT] Serum), 1 % Pen/Strep și 1% Zeocinã. Mediul pentru G5 a conținut DMEM (Dulbec’s modified Eagle’s Medium), 10 % FBS ([NUME_REDACTAT] Serum), 200 uL/100 mL Higromicinã și Geneticinã.

Spectroscopia de impedanță electrică

În ultimii douăzeci de ani spectroscopia de impedanță electrică a fost folosită cu succes pentru studiul neinvaziv al comportamentului în timp real al celulelor și pentru determinarea proprietăților kinetice ale acestora (Wegener et al., 2000; Xiao et al., 2002; Xiao and Luong, 2003; Solly et al., 2004; Abassi et al., 2004; Nguyen et al., 2004; Ehret et al., 1997, 1998; Arndt et al., 2004; Yeon și Park, 2005). Pionierii acestei metode au fost cercetătorii Giaever și Keese, care au realizat primul biosenzor pentru monitorizarea celulelor în anul 1984 (Giaever și Keese, 1984).

Spectroscopia de impedanță electrică reprezintă o metodă neinvazivă, de monitorizare în timp real a proceselor celulare. Acestea includ schimbări morfologice, adeziune celulară și alte procese legate de citoskeletul celular (Yeon și Park, 2005). Impedanța reprezintă o mărime complexă alcătuită din componente rezistive și capacitive ce oferă informații despre permeabilitatea membranei celulare și capacitanța membranară. Impedanța electrică este o mărime analogă rezistenței din curent continuu. Atunci când celulele sunt cultivate pe electrozi, aceștia funcționează drept dielectrici, crescând valoarea impedanței. Pe măsură ce celulele cresc și acoperă suprafața electrodului, curentul este împiedicat să treacă, corelat cu numărul de celule, morfologia și adeziunea acestora (Giaever și Keese, 1984).

Metoda a fost folosită în mod intens pentru elucidarea mecanismelor de coroziune, pentru caracterizarea transportului la nivelul membranelor, pentru caracterizarea interfețelor și a modificărilor ce au loc la suprafață precum și în cazul imobilizării biomoleculelor (Huang et al., 2006). Deși raportări ale folosirii impedanței electrice se cunosc încă din anii 1980, totuși utilizările acestei metode s-au extins mult în ultimii ani (Lisdat și Schäfer, 2008).

Pentru fitarea datelor rezultate în urma măsurătorilor se folosește un circuit echivalent (Figura 10) ce reprezintă diferitele proprietăți fizico-chimice ale sistemului de analizat (Rubinstein, 1995).

Pentru a caracteriza materialul biologic de interes este aplicat un curent de un anumit voltaj prin intermediul unei perechi de electrozi; curentul trece prin toate componentele sistemului – electrodul de lucru, materialul biologic, soluția și contra-electrodul. Impedanța măsurată reprezintă suma tuturor contribuțiilor componentelor individuale (Lisdat și Schäfer, 2008).

Figura 10. Datele obținute în urma experimentelor sunt fitate în baza unui circuit echivalent al impedanței. Circuitul conține o rezistență pentru bulk (Rb), un condensator (C1) în serie cu o rezistență (R1) pentru joncțiunile gap și un element constant de fază (CPE) pentru celule ([NUME_REDACTAT] et al., 2014).

Impedanța reprezintă un număr complex (Figura 11), astfel că valoarea poate fi descrisă prin intermediul amplitudinii curentului și a fazei (φ). Alternativ, componentele impedanței pot fi obținute din partea reală ZR și a celei imaginare ZI cu ajutorul formulelor (Lisdat și Schäfer, 2008):

Φ = ArcTan (ZI*/ ZR*)

Figura 11. Impedanța este un număr complex, fiind caracterizată de valori imaginare și reale corespunzătoare componentelor reactive și rezistive din sistem ([NUME_REDACTAT] și Schäfer, 2008)

Mod de lucru

Celulele HEK FLPN și G5 au fost cultivate la concentrația de 9 x 105 cel/mL în cipuri duble având inserate un electrod de tip ITO (indium tin oxide). După ce au atins confluența 100%, de monostrat, celulele au fost măsurate folosind un spectrometru ce înregistrează la o valoare aleasă valorile impedanței în timpul iluminarii. Frecvența a fost setată la valoarea de 10 kHz și 1 kHz. Spectrometrul a fost sincronizat cu un aparat de măsură Agilent 4294 A ([NUME_REDACTAT] Analyzer), cu ajutorul căruia au fost realizate spectre (într-un domeniu larg de frecvențe) atât înainte cât și după iluminare. Pentru iluminarea celulelor s-a folosit un LED de lumină albastră, λ= 470 nm. Protocolul a constat în cicluri de iluminare repetată timp de 1 secundă, 3 și 5 secunde, urmate de 50 de secunde pauză. Pentru analiza datelor s-au folosit programele Z-View ([NUME_REDACTAT]), OriginPro 8 ([NUME_REDACTAT] Corporation, 2007) și Mathematica 8.0 (Wolfram).

Microscopia de fluorescență

Fluorescența reprezintă lumina generată la tranziția stării de singlet S1 a electronului de la starea S0.  Atomii sau moleculele pot fi excitați fie prin absorbție de unde electromagnetice de o anumita lungime de undă fie prin ciocniri cu alte particule ca de exemplu electroni. De obicei lungimea de undă a fotonului emis este mai mare, astfel având energie mai mică față de energia absorbită (Turro et al., 2009).

Microscopia de fluorescență reprezintã o ramură a microscopiei care studiază fluorescența compușilor organici și anorganici concomitent cu absorbția și reflexia (Bradbury și Evennett, 1996) oferite de microscopia clasică. Fluorescența este o metodã sensibilã de determinare și vizualizare a moleculelor fie în mod direct, datorită autofluorescenței, fie indirect prin intermediul fluoroforilor, cu formarea complexelor fluorescente (Valeur și [NUME_REDACTAT], 2003). Proba va fi supusă iluminării cu o anumită lungime de undă, radiația luminoasă fiind absorbită de fluorofori. De-a lungul timpului s-au folosit fluorofori, molecule care absorb lumină de anumită lungime de undă care re-emit la altă lungime de undă (Turro et al., 2009). Cea mai importantă caracteristică a acestora este timpul de viață. Fluroflorul își poate pierde capacitatea de a emite fluorescența printr-un fenomen de stingere numit photobleaching, fenomen care poate fi redus fie prin utilizarea unor fluoroflori mai puternici sau prin reducerea intensității luminii (Rost și Oldfield, 2000) sau excitarea indirectă ca în cazul microscopiei în reflexie totală internă.

Un microscop folosit în acest scop este format din: sursă de lumină, de regula o lampă cu xenon sau lampă cu vapori de mercur, oglindă dicroică, un filtru de excitație și un filtru de emisie. Microscopia de fluorescență este utilizată mai ales în biologie, ea fiind etalonul pentru alte tipuri de microscopie: microscopia cu laser confocal și TIRF (total internal reflection fluorescence). (Rost și Oldfield, 2000). Microscopia de fluorescență poate fi utilizatã pentru investigarea structurilor și dinamicilor sistemelor vii la nivel molecular și supramolecular. Polimeri, surfactanți, suprafețe solide, membrane biologice, proteine, acizi nucleici, celule vii sunt doar câteva exemple de sisteme care au fost investigate prin intermediul microscopiei de fluorescențã și cãrora le-au fost determinate parametrii precum polaritate, fluiditate, mobilitate moleculară, potențial electric (Valeur și [NUME_REDACTAT], 2003).

[NUME_REDACTAT] reprezintă o metodă de analiză a microscopiei de fluorescență care oferă imagini cu rezoluții superioare (Webb și Brown, 2013). Lumina de excitație este emisă prin obiectiv spre proba în care este prezent fluoroforul. Acesta emite lumină cu o altă lungime de undă, ce va fi captată de detector prin același obiectiv prin care s-a emis lumina de excitație. Lumina de excitație ajunge în totalitate la suprafața specimenului iar lumina reflectată ajunge la nivelul obiectivului (Spring și Davidson, 2008).

Una dintre principalele aplicații ale epifluorescenței este reprezentată de imunofluorescența. Aceasta constă în evidențierea reacției antigen- anticorp primar- anticorp secundar conjugat cu un fluorofor (Spring și Davidson, 2008).

Una din limitările epifluorescenței constă în pierderea fluorescenței fluoroforilor, care poate fi corectată prin introducerea raportorilor proteici. Însă, celulele sunt mai expuse la procesul de fototoxicitate, mai ales la iluminare cu lumină de lungime de undă mică (Spring și Davidson, 2008). Deoarece imaginile obținute prin intermediul epifluorescenței tradiționale sau a microscopiei confocale nu oferă suficiente detalii despre procesele celulare ce au loc în interiorul sau în apropierea membranei plasmatice au fost dezvoltate tehnici mai sensibile (Mattheyses et al., 2010). Un exemplu în acest sens îl constituie microscopia fluorescentă bazată pe reflexia internă totală (TIRFM). Aceasta folosește unda evanescentă pentru a ilumina selectiv și pentru a excita fluoroforii într-o regiune restransă la interfața apă-sticlă. Câmpul electromagnetic evanescent scade exponențial în intensitate cu distanța parcursă de la nivelul interfeței, astfel că este obținută o adâncime a undei de aproximativ 100 nm în proba de analizat. Câmpul evanescent este produs prin iluminarea cu lumină p-polarizată, la un anumit unghi de incidență, numit unghi critic (θc), la nivelul interfeței, generând un câmp evanescent (Axelrod, 2001). Polarizarea luminii se referă la proprietatea undelor luminoase de a vibra atunci când unda dispune de anumite planuri favorizate. Componența câmpului electric este paralelă la planul unei suprafețe reflectoare ( Novacu, 1966).

TIRFM

Microscopia fluorescentă bazată pe reflexia internă totală (TIRFM) reprezintă o tehnică optică folosită cu succes în evidențierea proceselor celulare membranare precum exocitoza veziculelor membranare, pentru cuantificarea rolului proteinelor în procesul de endocitoză, pentru observarea contactelor celulă–substrat (Kenneth, 2009). TIRF poate furniza informații despre orientarea moleculelor marcate fluorescent sau fosforescent, aflate pe substraturi transparente. Prima mențiune despre utilizarea acestei tehnici datează din anul 1984 când Thompson a încercat detectarea straturilor de fosfolipide marcate fluorescent (Bos și Klejin, 1995). În momentul în care proba este iluminată cu lumină p-polarizată, la un anumit unghi critic (θc) este obținut un câmp evanescent la nivelul interfeței (Figura 12). Câmpul evanescent conduce la excitarea selectivă a fluoroforilor din regiunea restrânsă a interfeței.

Valoarea unghiului critic este dată de legea lui Snell:

θ = sin -1 (n1/n2)

unde n1și n2 sunt indicii de refracție relativi ai solidului, respectiv al lichidului, respectând condiția n1< n2. Pentru unghiuri de incidență θ mai mici decât θc o mare parte din lumină se propagă prin interfață cu un unghi de refracție dat de legea lui Snell iar cealaltă parte este reflectată intern înapoi la solid. În situația θ > θc toată lumina se întoarce la solid.

Figura 12. Ilustrarea principiului metodei tehnicii TIRF. Raza incidentă lovește suprafața de contact cu un unghi θ > θc, rază care este reflectată la nivelul interfeței generând un câmp evanescent. Doar fluoroforii din preajma acestui câmp sunt excitați (Mattheyses et al., 2010)

Reflexia internă a luminii se poate realiza prin două metode: cu ajutorul prismelor optice sau prin intermediul obiectivelor TIRF (Mattheyses et al., 2010).

Cele mai folosite prisme sunt cele hemisferice și cele trapezoide. Acestea sunt disponibile la prețuri accesibile, se pot folosi și la unghiuri de incidență mai mari și produc un câmp evanescent fără zgomot. Însă, nu sunt atât de mult folosite din cauza restricționării accesului la probă și a puținelor obiective compatibile. În acestă configurație laserul este introdus prin baza microscopului, fiind direcționat vertical. Spotul TIRF focusat nu trebuie să fie mai amplu decât câmpul optic; cu cât mai mare spotul, cu atât mai difuză va fi fluorescența (Axelrod, 2001).

Obiectivele TIRF sunt folosite frecvent pentru producerea reflexiei totale interne deoarece sunt ușor de utilizat și asigură flexibilitate în operare. În cazul folosirii obiectivelor TIRF lumina de excitație trebuie să fie direcționată către interfața probă-substrat la un unghi de incidență mare. Acesta poate fi controlat fie cu ajutorul unui micrometru sau prin intermediul unui soft. Pentru a obține o iluminare uniformă a probei, raza laser trebuie focusată în planul focal din spatele obiectivului (numit [NUME_REDACTAT] Plane, BFP). Un factor important în alegerea obiectivelor îl constituie apertura numerică (NA) (Axelrod, 2001). Aceasta dictează unghiul maxim la care lumina de excitație poate emerge prin obiectiv. Apertura numerică a obiectivului trebuie să fie mai mare decât indicele de refracție al probei pentru a obține o iluminare favorabilă. Cele mai folosite obiective sunt 1,45 NA și 1,49 NA, disponibile la magnificarea de 60x, 100x și 150x. Aceste obiective se folosesc cu ulei de imersie și lamele standard (Mattheyses et al., 2010).

Mod de lucru

Celulele HEK FLPN și G5 au fost analizate pentru a evidenția efectele iluminării la nivelul interfeței celulă-substrat. Setup-ul utilizat este prevăzut cu un microscop de fluorescență Zeiss, AxioObserver Z1 având obiectivele de 100x și 60x cu NA 1,46 și un laser cuplat prin fibră optică. Modulul automat de baleiere a unghiului împreună cu o cameră ultrasesnsibilă [NUME_REDACTAT] întregesc sistemul de analiză.

SPR

Rezonanța plasmonilor de suprafață ([NUME_REDACTAT] Resonance, SPR) s-a dezvoltat într-o metodă versatilă de analiză a interacțiilor biomoleculare (Phillips și Cheng, 2007) datorită sensibilității mari pentru proprietățile de interfață. Prin înglobarea unui strat metalic cu proprietăți plasmonice (ex. Au sau Ag de grosimi nanometrice) la interfața la care are loc reflexia totală a unei lumini p-polarizate. Excitarea plasmonilor de suprafață are loc atunci când lumina p-polarizată lovește interfața conductivă dintre două medii cu indici de refracție diferiți (n1> n2). Condiția cuplajului rezonant este îndeplinită în momentul în care frecvența fotonilor incidenți este aceeași cu cea a electronilor de suprafață care oscilează. Plasmonii reprezintă oscilații ale densității de electroni la suprafața de separare dintre un metal și un dielectric. Conform modelului lui Drude, dispersia (β) este corelată cu frecvența angulară (ω), așa cum este descrisă de relația:

β = ω/c (2)

unde c este viteza luminii în vacuum, sunt permitivitățile relative ale metalului și ale materialului dielectric. Partea reală a ecuației (2) oferă informații despre lungimea de undă a plasmonilor, în timp ce partea imaginară despre lungimea de propagare a plasmonilor la nivelul interfeței, responsabilă de generarea câmpului evanescent. Câmpul electromagnetic evanescent scade exponențial în intensitate cu distanța parcursă de la nivelul interfeței, astfel că este obținută o adâncime a undei de aproximativ 100 nm în proba de analizat.

Detectarea undei evanescente la interfață este un eveniment important în SPR. Relația ce stă la baza detecției este următoarea:

E= E0e- ky2yexp( jωt-jkxx)

Unde E este câmpul electric, E0 amplitudinea câmpului electric, ω frecvența unghiulară, k vectorul de undă și j =. Această ecuație poate fi folosită pentru a calcula adâncimea de penetrare a câmpului evanescent (Schasfoort și Tudos).

Cel mai des se folosește configurația Kretschmann, în care o peliculă fină de metal, în general aur sau argint, acoperă suprafața de sticlă. La un anumit unghi, lumina incidentă trece prin sticlă, ajunge la stratul de metal conducând la formarea câmpului evanescent și la cuplajul rezonant cu plasmonii pe fața exterioară a filmului metalic (Figura 13) (Daghestani și Day, 2010). Acesta va duce la scăderea până la o valoare minimă (dip) a intensității luminii reflectate.

Figura 13. Reprezentare schematică a configurației Kretschmann. Reflexia totală internă induce câmpul evanescent atât la nivelul metalului (Au), cât și la nivelul dielectricului (structura biologică). Lumina este apoi reflectată și este preluată de un detector ([NUME_REDACTAT] și Day, 2010).

Dintre aplicațiile SPR-ului cele mai întâlnite sunt masurătorile reflectivității în scopul determinării absorbției moleculelor precum ADN ( Liedberg et al., 1983), proteine, polimeri, a nanoparticulelor, detecția unor compuși chimici (Hiep et al., 2007), observarea proceselor celulare ca aderarea celulelor pe suprafața de contact (Gheorghiu et al., 2014).

 Markeri fluorescenți pentru evaluarea potențialului de membrană

Indicatorii fluorescenți reprezintă un mijloc neinvaziv și versatil de măsurare a diferiților parametri celulari. Printre caracteristicile importante ale fluoroforilor se numără nivelul de detectabilitate, modul de încărcare, randamentul cuantic, procesul de stingere al fluorescenței și lungimea de undă de excitare și emisie de lumină (Johnson, 1998). Eficiența cu care un fluorofor absoarbe sau emite lumină este dată de randamentul cuantic. Acesta este reprezentat de raportul dintre numărul de fotoni emiși și numărul de fotoni absorbiți. Mediul extern, în care se află un compus biochimic, poate influența în mod hotărâtor randamentul cuantic (Hemmes, 2005). Stingerea sau mărirea fluorescenței unui fluorofor poate fi explicată prin transferul energiei dintre această moleculă și elementele din soluție (Hemmes, 2005).

Fluoroforii sunt clasificați ca fiind lenți (ce respectă ecuația lui Nerst) (Figura 14) sau rapizi (electrocromici). Între aceste două grupuri sunt diferențe mari, privitoare la viteza raportării potențialului membranar și a caracteristicilor celulare (Johnson, 1998).

Fluoroforii rapizi de tip aminonaftetenilpiridină, di-4-ANEPPS și di-8-ANEPPS raportează schimbări ale potențialului membranar în intervale de milisecunde în timp ce fluoroforii lenți în secunde sau minute. Fluoroforii rapizi sunt indicatori eficienți pentru măsurarea răspunsurilor rapide determinate de activitatea neuronilor sau a altor celule excitabile, generând semnale liniare cu potențialul membranar raportat (Johnson, 1998). Indicatorii ANEP realizați de [NUME_REDACTAT] și echipa sa sunt considerați a fi fluorofori sensibili funcționali pentru o gamă largă de țesuturi și celule. Aceștia sunt excitați la 440 nm și emit lumină la 550 nm și 620 nm, permițând astfel corelarea schimbărilor fluorescenței cu modificarea potențialului membranar. Folosind această metodă a fost posibilă decelarea între potențialul membranar al celulelor de neuroblastom de semnalul neuritelor și al somei (Johnson, 1998).

Un studiu realizat de Breygina, în 2009, a arătat faptul că fluoroforul DiBAC4(3) poate fi folosit cu succes pentru a determina valoarea medie a potențialului de membrană iar fluoroforul Di-4-ANEPPS pentru a cartografia distribuția potențialului (Breygina et al., 2009).

Fluoroforii rapizi RH, dialchil-amino-fenil-polienil-piridinium, reprezintă o clasă de markeri importanți pentru realizarea studiilor de imagistică de rezonanță magnetică (fMRI) a neuronilor. Cei mai folosiți sunt RH 237, RH 414, RH421 și RH 795 (Grinvald, 1985). 

O altă categorie de fluorofori rapizi sunt senzorii de potențial membranar de tip FRET (Fluorescence resonance energy transfer). Aceștia sunt mult mai sensibili decât fluoroforii electrocromici. Studii indică faptul că depolarizarea induce modificări mai mari de 50 % per 100 mV în timp de milisecunde la celule HEK 293 măsurate prin tehnica de whole- cell patch clamp (Bradley et al., 2009).

Principalele clase de indicatori lenți folosiți sunt carbocianinele, oxonolii și derivații de rodamină (Figura 11). Carbocianinele având cozi scurte de 7 atomi, indo- (Dil), Tio- (DiS), și oxa- (DiO) au fost primii fluorofori utilizați. Aceștia generează modificări moleculare la nivelul probei, acumulându-se la nivelul membranelor hiperpolarizate pentru a fi apoi translocați în bistratul lipidic. Fluorescența indicatorilor depinde de potențialul membranar dar și de concentrația folosită. Fluoroforii lenți se folosesc în special pentru celule neexcitabile pentru determinarea potențialului membranar determinat de procese oxidative, permeabilitatea canalelor ionice sau substanțe chimice. DiOC6(3) este unul dintre cei mai folosiți fluorofori pentru măsurarea potențialului membranar la drojdii, cuantificarea activității mitocondriale (Farrelly et al., 2001) și stresului oxidativ (Ishihara și Shimamoto, 2006), urmat de DiOC5(3). Prin masurătorile de citometrie în flux acești fluorofori au oferit informații cantitative despre potențialul membranar la bacterii, depinzând de dimensiunea celulelor (Novo et al., 1999). În schimb, DiSC3(5) este toxic pentru celule, o carcateristică a acestuia fiind inhibarea respirației celulare (Anderson et al., 1993).

Figura 14. Principalele clase de fluorofori lenți- carbocianine, rodamine și oxonoli ([NUME_REDACTAT], 1998)

Fluoroforii interacționează cu organitele, în special mitocondriile și reticulul endoplasmatic. Interiorul puternic negativ al mitocondriei influențează activitatea unor fluorofori precum Rodamina 123, [NUME_REDACTAT] sau MitoFluor Green, JC-1 (iodid de 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina), posibil prin interacția cu lipidul abundent în membrana mitocondrială internă, cardiolipina (Salvioli et al., 1997). Acesta din urmă virează de la verde – la concentrații mici, spre roșu, la nivelul membranei mitocondriale ca urmare a formării agregatelor J. JC-1 este excitat la lungimea de undă de 488 nm și emite în intervalul 515-545, respectiv 575-625 nm. Este folosit cu predilecție pentru detectarea depolarizării mitocondriale în celulele apoptotice, a potențialului mitocondrial și în plus la determinarea procentului de mitocondrii într-o populație celulară ce răspunde la un stimul aplicat (Salvioli et al., 1997).

Rodamina 123 este un alt marker mitocondrial folosit pentru determinarea activității mitocondriale și a potențialului membranar. Este un fluorofor foarte selectiv care se folosește la stabilirea potențialului dependent de activitatea mitocondrială prin stabilirea concentrației extracelulare de K+ la valori asemănătoare cu cele intracelulare (~137 mM), ducând astfel la depolarizarea membranei plasmatice (Chen, 1989).

Esterii metil și etil ai tetrametilrodaminei (TMRM și TMRE) sunt utilizați pentru determinarea potențialului membranar prin tehnica imaginilor cantitative. Aceasta constă în examinarea imaginilor pentru a extrage caracteristici cuantificabile despre starea unui subiect. Activitatea fluoroforilor TMRM și TMRE depinde exclusiv de schimbările petrecute la nivelul potențialului membranar și nu de alte procese precum, agregarea fluoroforului sau interacții cu alte organite. Acești fluorofori pot fi utilizați în concentrații mici, înlăturând astfel riscul de formare de agregate; pătrund prin membrană și au o fluorescență puternică, respectând ecuația lui Nernst. TMRE este folosit și pentru determinarea viabilității celulare (Jayaraman, 2008). Totuși, asemănător rodaminei 123, acumularea acestor fluorofori la nivelul membranei determină scăderea fluorescenței (Scaduto și Grotyohann, 1999).

Oxonolii anionici bis-isoxazoloni posedă cel mai mare shift spectral, având punctul isosbestic la 603 nm. Partiționarea dependentă de voltaj dintre apă și membrană depinde mai mult de absorbție, decât de fluorescență. Oxonol IV răspunde mai rapid la schimbări ale potențialului decât oxonol V (Clarke și Apell).

Acizii oxonolici bis-barbiturici, cunoscuți sub numele DiBAC, formează o familie de fluorofori ce au maximul de absorbție la 490 nm (DiBAC4 (3)), 530 nm (DiSBAC2(3)) și 590 nm (DiBAC4(5)), cu virajul culorii spre roșu (Epps et al., 1994). Acești fluorofori pătrund în celulele depolarizate prin legarea de proteine intracelulare sau membrane, ducând la creșterea fluorescenței. În schimb hiperpolarizarea celulelor duce la scăderea fluorescenței. Spre deosebire de fluoroforii carbocianinici, cei anionici sunt sensibli în special la variația potențialului membranar plasmatic. Fluoroforul DiBAC4 (aza-dibenzocicloctina) este recunoscut ca fiind unul dintre cei mai prolifici fluorofori ciclooctinici (Debets et al., 2010) pentru determinarea potențialului membranar. În plus, markerii oxonolici pot influența activitatea unor canale ionice și a unor receptori, ducând la inhibarea lor (Marimoto et al., 2007).

Desi merocianina 540 este unul dintre primii fluorofori ai potențialului membranar, acesta nu mai este folosit deoarece poseda citotoxicitate crescută (Verkman și Frosch, 1985).

Rezultate și discuții

În contextul actual atenția studiilor de cercetare este focalizată pe dezvoltarea unor metode sensibile care să permită evaluarea în timp real a proceselor celulare ca urmare a aplicării unor stimuli de interes în domeniul medical. Acest studiu își concentrează atenția asupra dezvoltării unei platforme de analiză electro-optică, neinvazivă și în timp real a raspunsului celular la diverși stimuli.

3.1. Modelare teoretică a potențialului membranar

Pentru a înțelege dinamica complexă a potențialului de membrană a celulelor inginerite cu canale de rodopsină și de K dependente de voltaj sub acțiunea stimulului luminos am simulat variația potențialului membranar (Figura 15) aferent deschiderii canalelor în condiții de iluminare. Am folosit concentrațiile și permeativitățile ionice specifice unei celule generice așa cum au fost prezentate în tabelul 3. Iluminarea celulelor induce deschiderea canalelor de rodopsină, asimilate unor canale de Na, ceea ce determină intrarea ionilor de Na în celulă și implicit depolarizarea membranară. Acestea se mențin deschise pe toată durata aplicării stimulului luminos. La atingerea valorii potențialului de -30 mV sunt activate canalele de K dependente de voltaj. Acest lucru se reflectă prin creșterea valorilor permeativităților canalelor de K.

Tabelul 3. Distribuția principalelor specii ionice intra și extracelulare, de la nivelul unei celule tipice mamaliane ([NUME_REDACTAT], 1973)

Figura 15. Modelarea valorilor potențialul membranar obținut la aplicarea stimulului luminos asupra celulelor

Acestă dinamică de răspuns este de așteptat și în cazul analizelor de patch-clamp și impedanță pe celule inginerite.

Studiul celulelor G5 și FLPN prin tehnica patch-clamp

         Pentru a caracteriza canalul ChR2 și pentru a observa modificarea potențialului membranar sub acțiunea stimulilor luminoși am realizat experimente de patch-clamp pe celulele HEK FLPN și HEK G5. Protocoalele utilizate au fost cele de voltage clamp și current clamp. În cazul protocolului de voltage clamp potențialul membranar a fost setat la valoarea de -80 mV.

Linia celulară HEK FLPN a fost folosită drept control. În urma analizei a unui numar de 10 celule HEK FLPN am obținut o medie a potențialului de membrană în condiții de repaus de -52 mV. În figura 16 este reprezentat răspunsul unei celule FLPN. Deoarece aceste celule nu exprima canale de rodopsina, răspunsul obținut în timpul iluminarii este descris de o linie dreaptă.

Figura 16. Exemplu de înregistrare realizată pe o celulă HEK FLPN folosind protocolul de voltage clamp

Celulele G5 au fost iluminate la intervale de 10s cu ajutorul unui LED cu lumină albastră, la lungimea de undã de 470 nm, folosindu-se un protocol de voltage-clamp. În cazul acestor celule (n=5) se poate observa un răspuns bifazic al amplitudinii curentului, astfel că după un peak inițial de ~ -280 pA, valoarea curentului a crescut la -100 pA (Figura 17). Răspunsul bifazic este constituit din componenta tranzientă și cea susținută. De la o iluminare la alta se poate observa o scădere a amplitudinii curentului în cazul celulelor G5, asociată cu desensibilizarea canalelor de rodopsină.

Figura 17. Exemplu de înregistrare whole-cell pe o celulă HEK G5. Variația în timp a curentului înregistrat la un potențial de -80 mV, înainte și după aplicarea stimulului luminos, indicată prin bara orizontală.

Analiza statistică a arătat faptul că iluminarea a determinat o scădere rapidă a curenților cu o valoare medie de -178 ± 30 pA (I componenta tranzientă) față de curentul aflat la 0 pA în condiții de control înainte de aplicarea stimulului (n=5). Curenții au atins valoarea medie de ~ -70 ± 13 pA în a doua parte a răspunsului (I sust- componenta susținută a curentului) (Figura 18). Diferenta statistică între componenta tranzientă și cea susținută este dată de valoarea p < 0.05 obținut din testul t-Student.

Figura 18. Valorile curenților specifici pentru HEK G5 în condițiile aplicării stimulului luminos. Barele de eroare reprezintă SEM.

Prin aplicarea unui protocol de rampe duble între -80 și +60 mV, am putut obține informații referitoare la amplitudinea curentului indus de aplicarea stimulului luminos. Am folosit și inhibitor, pentru a obține doar răspunsul canalului ChR2 și pentru a inhiba celelalte canale endogene. În cadrul acestui protocol, potențialul membranar a fost fixat la valoarea de -80 mV, iar rampele duble de curent au fost aplicate de la -80 mV la +60 mV, durata rampei fiind de 400 ms. Modul de lucru a inclus 4 cicluri a câte 10 rampe fără stimul luminos, urmate de 3 cicluri a câte 3 rampe în prezența stimului luminos. În figura 19 sunt exemplificate înregistrări realizate pe celulele FLPN și HEK G5 folosind protocolul de rampe de voltaj.

Celulele FLPN nu au răspuns la stimulul luminos, valoarea curentului înregistrându-se în jurul valorii de 0 mV. La o valoare de pozitivă de – 80 mV a voltajului, în cazul celulelor G5, amplitudinea curentului măsurat a fost de ~ -125 pA în condițiile aplicării stimulului luminos față de cea a curentului măsurat în condiții de control de 0 mV.

Studiile de electrofiziologie au indicat faptul că potențialul de reversie pentru ChR2 este 0 (Nagel et al., 2003). Curba I-V (Figura 20) prezintă valorile obținute înainte și după aplicarea stimulului luminos în celulele G5. Curentul rezultat în urma iluminării este semnificativ diferit față de curentul obținut în condiții de control. În momentul aplicării stimulului luminos valoarea curentului a scăzut la ~ -120 pA, iar valoarea în condiții de control a fost ~ 0 pA.

Figura 19. Exemplu de înregistrare realizată pe o celulă HEK FLPN (A) și G5 (B) folosind protocolul de rampe de voltaj

Figura 20. Variația curenților curbei I-V înainte și după aplicarea stimulului luminos în celulele G5. Curentul rezultat în urma iluminării este semnificativ diferit față de curentul obținut în condiții de control.

În continuare, pentru a obține informații suplimentare despre potențialul membranar am realizat protocoale de current-clamp. Celulele FLPN și G5 au fost iluminate timp de 5s, la intervale de 30s. În cazul celulelor FLPN nu a fost obținut un răspuns (Figura 21), dar celulele G5 au răspuns prin variații bifazice ale curenților (Figura 22). În cazul celulelor G5 se poate observa o scădere a amplitudinii curentului, asociată cu desensibilizarea canalului de rodopsină.

Figura 21. Răspuns tipic al celulelor FLPN în cazul aplicării protocolului de current-clamp.

Figura 22. Răspunsul bifazic obținut la celulele G5 în cazul protocolului de current clamp. Variația în timp a voltajului înregistrat la un potențial de -80 mV, înainte și după aplicarea stimulului luminos, este indicată prin bara orizontală.

Analiza statistică a arătat faptul că stimulul luminos a determinat o scădere a voltajului între componentele tranziente corespunzătoare celor trei iluminări. Au fost observate diferențe semnificative între prima și a doua componentă tranzientă, ale primei și a doua iluminări (p= 0,01) și între prima și a treia componentă tranzientă (p= 0,02) (Figura 23).

Figura 23. Valorile voltajului specific pentru componentele tranziente corespunzătoare celulelor HEK G5 în condițiile aplicării stimulului luminos. Barele de eroare reprezintă SEM.

Studiul celulelor FLPN și G5 prin spectroscopia de impedanță electrică

Celulele FLPN și G5 au fost analizate prin intermediul EIS pentru a obține informații privind dinamica proceselor celulare și în contextul unei monitorizări continue. Celulele au fost cultivate pe electrozi, iar măsurătorile au fost efectuate în momentul atingerii confluenței de monostrat. Înregistrările au fost realizate în domeniul de frecvențe 40 Hz -100 KHz prin intermediul unui analizor de impedanță și a unui spectrometru. Spectrometrul a fost sincronizat cu un aparat de măsură Agilent 4294 A ([NUME_REDACTAT] Analyzer), cu ajutorul căruia au fost realizate spectre (în domeniul larg de frecvențe) atât înainte cât și după iluminare. Cu ajutorul analizorului de impedanță am monitorizat peste noapte răspunsul celulelor G5. Acestea au crescut, corespunzător unor valori crescute ale impedanței. Pentru analiza datelor au fost folosite 4 spectre (Figura 24).

Figura 24. A. Monitorizarea celulelor G5 peste noapte a indicat creșterea celulelor pe suprafața de contact, corespunzătoare unor valori crescute ale impedanței. B. Evoluția în timp a creșterii celulelor G5 pe suprafața de contact.

Înainte de iluminare am realizat spectre într-un domeniu larg de frecvențe pentru a le putea compara cu valorile obținute în urma iluminării. Pentru iluminarea celulelor s-a folosit un LED de lumină albastră, λ= 470 nm. Protocolul a constat în cicluri de iluminare repetată timp de 1 secundă, 3 și 5 secunde, urmate de 50 de secunde pauză la frecvențele de 1 kHz și 10 kHz. S-a observat o scădere a părții reale a valorilor corespunzătoare spectrelor după iluminare atât la 1 kHz (Figura 25) cât și la 10 kHz (Figura 26), comparativ cu cele obținute înainte de iluminare. Nu au fost observate modificări ale părții imaginare a impedanței pe toată durata iluminării.

Figura 25. Reprezentarea părții reale a impedanței înainte și după iluminare, la 1s, 3s și 5s la frecvența de 1 kHz. S-a observat o scădere a valorilor corespunzătoare spectrelor după iluminare, comparativ cu cele obținute înainte de iluminare.

Figura 26. Reprezentarea părții reale a impedanței înainte și după iluminare, la 1s, 3s și 5s la frecvența de 10 kHz. S-a observat o scădere a valorilor corespunzătoare spectrelor după iluminare, comparativ cu cele obținute înainte de iluminare.

Iluminarea a determinat o scădere a valorilor impedanței, monitorizate cu viteză mare (20 ms între măsurători) la o singură frecvență, proporțional cu durata pulsului. Au fost analizate pulsurile de lumină în cazul iluminării de 1s, 3s respectiv 5s (Figurile 27 și 28). S-a observat că primul puls are o amplitudine mai mare decât următoarele, deoarece canalele par să se inactiveze la pulsuri repetate.

Figura 27. Reprezentarea pulsurilor 1, 5 și 10 pentru iluminarea de 1s respectiv 3s. Se observă recuperarea curenților și desensibilizarea canalelor de rodopsină asociată cu scăderea amplitudinii curentului.

Figura 28. Reprezentarea pulsurilor 1, 5 și 10 pentru iluminarea de 5s. Se observă recuperarea curenților și desensibilizarea canalelor de rodopsină asociată cu scăderea amplitudinii curentului.

Pentru analiza datelor am selectat primul puls de la fiecare iluminare, 1s, 3s și 5s. S-a observat o scădere mai mare a amplitudinii la 5s comparativ cu 3 si 1s (Figura 29). Frecvența a fost setată la valoarea de 1 kHz. Se poate observa și o recuperare a valorilor impedanței doar pentru pulsurile de 1s. Pentru creșterea duratei pulsului se observă un trend descrescător pronunțat.

Figura 29. Reprezentarea grafică a primului puls de la iluminarea de 1s, 3s și 5s. Se poate observa o scădere a amplitudinii cu creșterea timpului de iluminare.

Comparativ cu valorile obținute la frecvența de 1kHz, cele de la 10 kHz au fost semnificativ mai mici (Figura 30).

Figura 30. Reprezentarea grafică a primului puls de la iluminarea de 1s, 3s și 5s la frecvența de 10 kHz. Se poate observa o scădere a amplitudinii cu creșterea timpului de iluminare.

3.4. Rezultatele obținute prin microscopia de fluorescență

Pentru a caracteriza schimbările celulare ce au loc la nivelul aderenței, morfologiei și parametrilor electrici am folosit tehnica de microscopie de fluoresecență în refelxie totală, microscopia de constrast diferențial de interferență și epifluorescența. Și în cadrul acestor experimente celulele FLPN și G5 au fost iluminate cu același protocol prezentat anterior. Celulele au fost cultivate în monostrat apoi au fost folosite în setul de experimente de microscopie. Figura 31 prezintă celulele în monostrat, imagine obținută prin constrast diferențial de interferență.

Figura 31. Monostratul celular obținut prin constrast diferențial de interferență.

Celulele G5 conțin și proteina fluorescentă galbenă pentru a facilita detecția canalelor de rodopsină (Figura 32).

Figura 32. Imagine microscopie de fluorescență ce înfățișează expresia de proteină fluorescentă galbenă

Imaginile obținute cu ajutorul TIRFM au arătat faptul că celulele au o bună atașare de substrat și își întind prelungiri pe suprafața de contact (Figura 33).

Figura 33. Atașarea de substrat a celulelor G5 înainte de aplicarea stimulului luminos timp de 5s

Celulele G5 au fost iluminate urmând același protocol prezentat anterior. Răspunsul acestora la iluminare evidențiat prin TIRFM a constat în retragerea prelungirilor, pierderea volumului celular, pierderea aderenței de substrat și migrarea (Figura 34).

Figura 34. Pierderea aderenței de substrat la celulele G5 în urma iluminării celulelor

[NUME_REDACTAT] contextul actual studiile de cercetare sunt focalizate pe dezvoltarea unor metode sensibile care să permită evaluarea în timp real a proceselor celulare ca urmare a aplicării unor stimuli de interes. Acest studiu își concentrează atenția asupra dezvoltării unei platforme de analiză electro-optică, neinvazivă și în timp real a răspunsului celular la diverși stimuli.

Pentru a caracteriza canalul ChR2 și pentru a observa modificarea potențialului membranar sub acțiunea stimulilor luminoși am realizat experimente de patch-clamp pe celulele HEK FLPN și HEK G5. Rezultatele obținute în experimentele de electrofiziologie au evidențiat o nivel bun al expresiei canalului de rodopsină, caracterizat prin răspunsuri specifice și reproductibile. Linia celulară HEK FLPN a fost folosită drept control. În urma analizei a unui numar de 10 celule HEK FLPN am obținut o medie a potențialului de membrană în condiții de repaus de -52 mV. În cazul celulelor G5 iluminarea a evidențiat un răspuns bifazic, constituit dintr-o componentă tranzientă și una susținută. De la o iluminare la alta s-a observat o scădere a amplitudinii curentului în cazul celulelor G5, asociată cu desensibilizarea canalelor de rodopsină. Curbele IV realizate pe celulele G5 au indicat faptul că potențialul de reversie pentru ChR2 este în jurul valorii 0.

În plus, rezultatele obținute din experimentele de spectroscopie de impedanță electrică au pus în evidență schimbări ale impedanței monostratului celular, la frecvența de 1 kHz și 10 kHz. Rezultatele obținute la frecvența de 10 kHz au fost semnificativ mai mici decât cele obținute la 1 kHz. Modificările impedanței monostratului celular pot fi asociate și cu variații periodice ale potențialului membranar sub acțiunea stimulului luminos. Monitorizarea peste noapte a celulelor G5 a indicat creșterea celulelor pe suprafața de contact, corespunzătoare unor valori crescute ale impedanței. În momentul iluminării celulelor la 1s, 3s și 5s au fost puse în evidență scăderi ale valorilor impedanței asociate cu desprinderea celulelor de pe suprafața de contact. Rezultatele au indicat faptul că primul puls are o amplitudine mai mare decât următoarele, deoarece canalele par să se inactiveze la pulsuri repetate. Pentru creșterea duratei pulsului se observă un trend descrescător pronunțat.

Complementar, experimentele de microscopie de fluorescență prin reflexie totală internă au confirmat modificările privind aderența celulă-celulă și celulă-substrat, determinate de pulsurile de lumină. Imaginile obținute cu ajutorul TIRFM au arătat faptul că celulele au o bună atașare de substrat și își întind prelungiri pe suprafața de contact. A fost pusă în evidență și proteina fluorescentă galbenă a celulelor G5 pentru a facilita detecția canalelor de rodopsină. Răspunsul celulelor G5 la iluminare, evidențiat prin TIRFM a constat în retragerea prelungirilor, pierderea volumului celular, pierderea aderenței de substrat și migrarea.

În concluzie, rezultatele obținute indică faptul că aceste celule pot fi integrate într-o nouă platformă electro-optică utilă pentru studiul neinvaziv și în timp real al proceselor celulare dinamice.

[NUME_REDACTAT], Y. A., J. A. Jackson, J. Zhu, J. O'Connell, X. Wang, and X. Xu. 2004. Label-free, real-time monitoring of IgE-mediated mast cell activation on microelectronic cell sensor arrays. J [NUME_REDACTAT] 292:195-205.

Ammann, D. 1986. Ion selective microelectrodes. SpringerVerlag 60:105-115.

Anderson, W.M., Delinck, D.L., Benninger, L., Wood, J.M., Smiley, S.T., Chen, L.B. 1993. Cytotoxic effect of thiacarbocyanine dyes on human colon carcinoma cells and inhibition of bovine heart mitochondrial NADH-ubiquinone reductase activity via a rotenone-type mechanism by two of the dyes. [NUME_REDACTAT] 45:691-696.

Andrews, B. J., G. A. Proteau, L. G. Beatty, and P. D. Sadowski. 1985. The FLP recombinase of the 2 micron circle DNA of yeast: interaction with its target sequences. Cell 40:795-803.

Antkowiak, M., M. L. Torres-Mapa, E. C. Witts, G. B. Miles, K. Dholakia, and F. J. Gunn-Moore. 2013. Fast targeted gene transfection and optogenetic modification of single neurons using femtosecond laser irradiation. [NUME_REDACTAT] 3:3281.

Arndt, S., J. Seebach, K. Psathaki, H. J. Galla, and J. Wegener. 2004. Bioelectrical impedance assay to monitor changes in cell shape during apoptosis. [NUME_REDACTAT] 19:583-94.

Axelrod, D. 2001. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic 2:764-74.

Bamberg,  E.,  Tittor, J., Oesterhelt, D. 1993. Light-driven proton or chloride pumping by halorhodopsin. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] USA 90:639-643.

Banghart, M., K. Borges, E. Isacoff, D. Trauner, and R. H. Kramer. 2004. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. [NUME_REDACTAT] 7:1381-6.

Bos, M. A., and J. M. Kleijn. 1995. Determination of the orientation distribution of adsorbed fluorophores using TIRF. I. Theory. Biophys J 68:2566-72.

Boyden, E. S., F. Zhang, E. Bamberg, G. Nagel, and K. Deisseroth. 2005. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. [NUME_REDACTAT] 8:1263-8.

Bradbury, S., and Evennett, P. 1996. Fluorescence microscop. [NUME_REDACTAT] in [NUME_REDACTAT]. BIOS [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT].

Bradley, J., R. Luo, T. S. Otis, and D. A. DiGregorio. 2009. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. J Neurosci 29:9197-209.

Breigina, M. A., A. V. Smirnova, N. P. Matveeva, and I. P. Ermakov. 2009. Membrane potential changes during pollen germination and tube growth. Cell and [NUME_REDACTAT] 6:573-582.

Buchschacher, J.R., and L. Garry. 2004. Safety considerations associated with development and clinical application of lentiviral vector systems for gene transfer. [NUME_REDACTAT] 5:19-35.

Bugaj, L. J., A. T. Choksi, C. K. Mesuda, R. S. Kane, and D. V. Schaffer. 2013. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. [NUME_REDACTAT] 10:249-52.

Butler, J. 2012. Optogenetics: shining a light on the brain. [NUME_REDACTAT] 2:10.1093.

Chen, L. B. 1989. Fluorescent labeling of mitochondria. [NUME_REDACTAT] Biol 29:103-123.

Chudakov, D. M., M. V. Matz, S. Lukyanov, and K. A. Lukyanov. 2010. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. [NUME_REDACTAT] 90:1103-1163.

Clarke, R. J., and H. J. Apell. 1989. A stopped-flow kinetic study of the interaction of potential-sensitive oxonol dyes with lipid vesicles. [NUME_REDACTAT] 34:225-237.

Cohen, L. B., and B. M. Salzberg. 1978. Optical measurement of membrane potential. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 83:35-88.

Conway, E. J. 1957. Membrane echilibrium in skeletal muscle and the active transport of sodium. Metabolic aspects of transport across cell membrane. University of [NUME_REDACTAT] Madison 73-114.

Craig, N. L. 1988. The mechanism of conservative site-specific recombination. [NUME_REDACTAT] Genet 22:77-105.

Daghestani, H. N., and Day, B. W. 2010. Theory and applications of surface plasmon resonance, resonant mirror, resonant waveguide grating, and dual polarization interferometry biosensors. Sensors 10: 9630-9646.

Debets, M. F., S. S. van Berkel, J. Dommerholt, A. T. Dirks, F. P. Rutjes, and F. L. van Delft. 2010. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. [NUME_REDACTAT] Res 44:805-815.

Deisseroth, K. 2011. Optogenetics. [NUME_REDACTAT] 8:26-9.

Dhakal, K., L. Gu, B. Black, and S. K. Mohanty. 2013. Fiber-optic two-photon optogenetic stimulation. [NUME_REDACTAT] 38:1927-1929.

Dhawale, A. K., A. Hagiwara, U. S. Bhalla, V. N. Murthy, and D. F. Albeanu. 2010. Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse. [NUME_REDACTAT] 13:1404-1412.

Dostálek, J., and W. Knoll. 2008. Biosensors based on surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy. Biointerphases 3:FD12-22.

Ehret, R., W. Baumann, M. Brischwein, A. Schwinde, and B. Wolf. 1998. On-line control of cellular adhesion with impedance measurements using interdigitated electrode structures. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 36:365-370.

Elzenga, J., and E. [NUME_REDACTAT]. 1997. Characterization of a [NUME_REDACTAT] Channel in the [NUME_REDACTAT] of [NUME_REDACTAT] of Pea. [NUME_REDACTAT] 113:1419-1426.

Epps, D.E., Wolfe, M.L., and V Groppi. 1994. Characterization of the steady-state and dynamic fluorescence properties of the potential-sensitive dye bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol (Dibac4(3)) in model systems and cells. [NUME_REDACTAT] Lipids 69:137-15.

Ernst, O. P., and T. P. Sakmar. 2012. Structural biology: Ion channel in the spotlight. Nature 482:318-319.

Ernster, L. 1984. Bioenergetics. [NUME_REDACTAT] Biochemistry, 9: 332-340.

Farah, N., I. Reutsky, and S. Shoham. 2007. Patterned optical activation of retinal ganglion cells. [NUME_REDACTAT] IEEE [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 2007:6368-6370.

Farrelly, E., M. C. Amaral, L. Marshall, and S. G. Huang. 2001. A high-throughput assay for mitochondrial membrane potential in permeabilized yeast cells. [NUME_REDACTAT] 293:269-276.

Feldbauer, K., D. Zimmermann, V. Pintschovius, J. Spitz, C. Bamann, and E. Bamberg. 2009. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] U S A 106:12317-12322.

Felle, H., and A. Bertl. 1986. Light-induced cytoplasmic pH changes and their interrelation to the activity of the electrogenic proton pump in Riccia fluitans. [NUME_REDACTAT] Ada 848: 176-182.

Fenno, L., O. Yizhar, and K. Deisseroth. 2011. The development and application of optogenetics. [NUME_REDACTAT] Neurosci 34:389-412.

Fish, K. N. 2009. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 12:Unit12-18.

Gheorghiu, M., S. David, C. Polonschii, A. Olaru, S. Gaspar, O. Bajenaru, B. O. Popescu, and E. Gheorghiu. 2014. Label free sensing platform for amyloid fibrils effect on living cells. [NUME_REDACTAT] 52:89-97.

Giaever, I., and C. R. Keese. 1984. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] U S A 81:3761-3764.

Gradinaru, V., M. Mogri, K. R. Thompson, J. M. Henderson, and K. Deisseroth. 2009. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science 324:354-349.

Gradinaru, V., F. Zhang, C. Ramakrishnan, J. Mattis, R. Prakash, I. Diester, I. Goshen, K. R. Thompson, and K. Deisseroth. 2010. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell 141:154-165.

Grinvald, A. 1985. Real-time optical mapping of neuronal activity: from single growth cones to the intact mammalian brain. [NUME_REDACTAT] Neurosci 8:263-305.

Grossman, N., V. Poher, M. S. Grubb, G. T. Kennedy, K. Nikolic, B. McGovern, R. [NUME_REDACTAT], Z. Gong, E. M. Drakakis, M. A. Neil, M. D. Dawson, J. Burrone, and P. Degenaar. 1088. Multi-site optical excitation using ChR2 and micro-LED array. J [NUME_REDACTAT] 7:16004.

Hemmes, G. G. 2005. Spectroscopy for the biological sciences, [NUME_REDACTAT] & Sons, Hoboken NJ 36-46.

Hiep M., Endo H., Kerman T., Chikae K., Kim M., Yamamura D-K, Takamura S., Tamiya Y., and Eiichi. 2007. A localized surface plasmon resonance based immunosensor for the detection of casein in milk. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]  4: 331. 

Hille, B. 1973. Potassium channels in myelinated nerve. Selective permeability to small cations. J [NUME_REDACTAT] 61:669-686.

Hodgkin, A. L. 1968. The local electric changes associated with repetitive action in a non-medullated axon. J Physiol 107:165-181.

Huang H., Liu Z., X. Yang. 2006. Application of electrochemical impedance spectroscopy for monitoring allergen-antibody reactions using gold nanoparticle-based biomolecular immobilization method. [NUME_REDACTAT].  356:208-14.

Huber, D., L. Petreanu, N. Ghitani, S. Ranade, T. Hromadka, Z. Mainen, and K. Svoboda. 2008. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature 451:61-64.

Ishihara, Y., and N. Shimamoto. 2006. Involvement of endonuclease G in nucleosomal DNA fragmentation under sustained endogenous oxidative stress. J [NUME_REDACTAT] 281:6726-6733.

Jia, Z., V. Valiunas, Z. Lu, H. Bien, H. Liu, H. Z. Wang, B. Rosati, P. R. Brink, I. S. Cohen, and E. Entcheva. 2011. Stimulating cardiac muscle by light: cardiac optogenetics by cell delivery. [NUME_REDACTAT] Electrophysiol 4:753-760.

Kandel, E.R., Schwartz, J.H., and T.M., Jessell. 2000. Principles of [NUME_REDACTAT] 4: 6.

Kenneth N. F. 2009. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] (TIRF) [NUME_REDACTAT] Protocols in Cytometry 10.1002/0471142956

Khuri, R. N., J. J. Hajjar, and S. K. Agulian. 1972. Measurement of intracellular potassium with liquid ion-exchange microelectrodes. J [NUME_REDACTAT] 32:419-422.

Knopfel, T., M. Z. Lin, A. Levskaya, L. Tian, J. Y. Lin, and E. S. Boyden. 2010. Toward the second generation of optogenetic tools. J Neurosci 30:14998-5004.

Lagali, P.S, Balya, D., Awatramani, G.B., Münch, T.A., Kim, D.S., Busskamp, V., Cepko, C.L., Roska, B. 2008. Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneration. [NUME_REDACTAT]. 11:667-75.

Liedberg, B., Nylander, O., Lunström, C., Ingemar. 1983. Surface plasmon resonance for gas detection and biosensing. Sensors and Actuators 299:0250-6874.

Lim, D. H., J. Ledue, M. H. Mohajerani, M. P. Vanni, and T. H. Murphy. 2013. Optogenetic approaches for functional mouse brain mapping. [NUME_REDACTAT] 7:54.

Lima, S. Q., and G. Miesenbock. 2005. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell 121:141-52.

Lin, J. Y., M. Z. Lin, P. Steinbach, and R. Y. Tsien. 2009. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J 96:1803-1814.

Lisdat, F., and D. Schafer. 2008. The use of electrochemical impedance spectroscopy for biosensing. [NUME_REDACTAT] Chem 391:1555-1567.

Ljubica, V., Danijela, K.,  Jovan, V. 2000. Chemical aspect of the influence of cobalt ions on ATPase activity. Journal of the [NUME_REDACTAT] Society 7: 507-515.

Lundby, A., W. Akemann, and T. Knopfel. 2008. Biophysical characterization of the fluorescent protein voltage probe VSFP2.3 based on the voltage-sensing domain of Ci-VSP. [NUME_REDACTAT] J 39:1625-1635.

Maguire, A.M., High, K.A., Auricchio, A., Wright, J.F., Pierce, E.A., Testa, F., Mingozzi, F., Bennicelli, J.L., Ying, G.S., Rossi, S., Fulton, A., Marshall, K.A., Banfi, S., Chung, D.C., Morgan, J.I., Hauck, B., Zelenaia, O., Zhu, X., Raffini, L., Coppieters, F., [NUME_REDACTAT], E., Shindler, K.S., Volpe, N.J., Surace, E.M., Acerra, C., Lyubarsky, A., Redmond, T.M., Stone, E., Sun J., McDonnell, J.W., Leroy, B.P., Simonelli, F., Bennett, J. 2009. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 374:1597-605.

Mattheyses, A. L., S. M. Simon, and J. Z. Rappoport. 2010. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J [NUME_REDACTAT] 123:3621-3628.

McGovern, B., R. B. Palmini, N. Grossman, E. Drakakis, V. Poher, M. A. Neil, and P. Degenaar. 2010. A [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT]-LED Array for [NUME_REDACTAT] Stimulation. IEEE [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 4:469-476.

Morimoto, T., K. Sakamoto, H. Sade, S. Ohya, K. Muraki, and Y. Imaizumi. 2007. Voltage-sensitive oxonol dyes are novel large-conductance Ca2+-activated K+ channel activators selective for beta1 and beta4 but not for beta2 subunits. [NUME_REDACTAT] 71:1075-1088.

Nagel, G., T. Szellas, W. Huhn, S. Kateriya, N. Adeishvili, P. Berthold, D. Ollig, P. Hegemann, and E. Bamberg. 2003. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] U S A 100:13940-13945.

Nagel, G., M. Brauner, J. F. Liewald, N. Adeishvili, E. Bamberg, and A. Gottschalk. 2005. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. [NUME_REDACTAT] 15:2279-2284.

Nguyen, D. D., X. Huang, D. W. Greve, and M. M. Domach. 2004. Fibroblast growth and H-7 protein kinase inhibitor response monitored in microimpedance sensor arrays. [NUME_REDACTAT] 87:138-144.

Novacu V. 1966. Electrodinamica, Editura didactică și pedagogică- Buccurești, 105-108

Novo, D., N. G. Perlmutter, R. H. Hunt, and H. M. Shapiro. 1999. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry 35:55-63.

Phillips K. S., and Cheng Q 2007. Recent advances in surface plasmon resonance based techniques for bioanalysis. [NUME_REDACTAT] Chem 381:1831-1840.

Prakash, R., O. Yizhar, B. Grewe, C. Ramakrishnan, N. Wang, I. Goshen, A. M. Packer, D. S. Peterka, R. Yuste, M. J. Schnitzer, and K. Deisseroth. 2012. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. [NUME_REDACTAT] 9:1171-1179.

Purves, D., Augustine, G. J., Fitzpatric, D.F., Hall W. C., Lamantia, A-S., Mcnamera, J. O., and Williams, S. M. 2004. [NUME_REDACTAT] Associates, 156-158.

Revsbech, N. P., B. Thamdrup, T. Dalsgaard, and D. E. Canfield. 2011. Construction of STOX oxygen sensors and their application for determination of O2 concentrations in oxygen minimum zones. [NUME_REDACTAT] 486:325-341.

Ritter, E., K. Stehfest, A. Berndt, P. Hegemann, and F. J. Bartl. 2008. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. J [NUME_REDACTAT] 283:35033-41.

Rubistein, I. 1995. Phisycal electrochemistry: Principles, Methodes and Applications. M. Dekker 667-687

Rost, F., and Oldfield, R. 2000. Fluorescence microscopy., Photography with a Microscope, [NUME_REDACTAT] Press 324-327. 

Salvioli, S., A. Ardizzoni, C. Franceschi, and A. Cossarizza. 1997. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Lett 411:77-82.

Sauer, B. 1994. Site-specific recombination: developments and applications. [NUME_REDACTAT] Biotechnol 5:521-527.

Scaduto, R. C., Jr., and L. W. Grotyohann. 1999. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J 76:469-477.

Schasfoort, R.B.M., and A.J. Tudos. 2008. Handbook of surface plasmon resonance. 978: 12-19.

Schobert, B., and J. K. Lanyi. 1982. Halorhodopsin is a light-driven chloride pump. J [NUME_REDACTAT] 257:10306-13.

Senecoff, J. F., R. C. Bruckner, and M. M. Cox. 1985. The FLP recombinase of the yeast 2-micron plasmid: characterization of its recombination site. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] U S A 82:7270-4.

Spring, K.R., and Davidson, M.W. 2008. Introduction to [NUME_REDACTAT]. Nikon MicroscopyU 20-24.

Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., and Zheng, W., 2004. [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] 2 :363–372.

Tengberg, A, Hovdenes, J, Andersson, H, Brocandel, O, Diaz, R, Hebert, D, Arnerich, T, Huber, C, Kortzinger, A, Khripounoff, Alexis, Rey, F, Ronning, C, Schimanski, J, Sommer, S, and Stangelmayer, A. 2006. Evaluation of a lifetime-based optode to measure oxygen in aquatic systems. Limnology and Oceanography methods 4: 7-17. 

Trebacz, K. 1989. Light-triggered action potentials in plants. [NUME_REDACTAT]. Bot. Pol. 58: 141-156.

Turro, N.S., Ramamurthy, V., Scaiano J.C. 2009. Principles of [NUME_REDACTAT] – An introduction. [NUME_REDACTAT] Books 78-80.

Valeur, B., Berberan, Santos M.N 2003. [NUME_REDACTAT] Principle and Applications 146-149.

Verkman, A. S., and M. P. Frosch. 1985. Temperature-jump studies of merocyanine 540 relaxation kinetics in lipid bilayer membranes. Biochemistry 24:7117-22.

Webb, D. J., and C. M. Brown. 2013. Epi-fluorescence microscopy. [NUME_REDACTAT] Biol 931:29-59.

Wegener, J., C. R. Keese, and I. Giaever. 2000. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. [NUME_REDACTAT] Res 259:158-66.

Wykes, R. C., J. H. Heeroma, L. Mantoan, K. Zheng, D. C. MacDonald, K. Deisseroth, K. S. Hashemi, M. C. Walker, S. Schorge, and D. M. Kullmann. 1012. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. [NUME_REDACTAT] Med 4:161ra152.

Xiao, C., B. Lachance, G. Sunahara, and J. H. Luong. 2002. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. [NUME_REDACTAT] 74:5748-53.

Xiao, C., B. Lachance, G. Sunahara, and J. H. Luong. 2002. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. [NUME_REDACTAT] 74:1333-9.

Xiao, C., and J. H. Luong. 2003. On-line monitoring of cell growth and cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing (ECIS). [NUME_REDACTAT] 19:1000-5.

Yeon, J. H., and J. K. Park. 2005. Cytotoxicity test based on electrochemical impedance measurement of HepG2 cultured in microfabricated cell chip. [NUME_REDACTAT] 341:308-15.

Zemelman, B. V., G. A. Lee, M. Ng, and G. Miesenbock. 2002. Selective photostimulation of genetically chARGed neurons. Neuron 33:15-22.

Zhang, F., L. P. Wang, M. Brauner, J. F. Liewald, K. Kay, N. Watzke, P. G. Wood, E. Bamberg, G. Nagel, A. Gottschalk, and K. Deisseroth. 2007. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature 446:633-9.