Contribuții privind studiul microorganismelor cu efect de biodeteriorare a obiectelor de patrimoniu din materiale textile naturale [308731]

Universitatea din București

Facultatea de Biologie

Școala Doctorală de Biologie

Teză de doctorat

Coordonator științific:

Prof. dr. Veronica LAZĂR

Doctorand: [anonimizat]-Clara RĂDULESCU

2017

Contribuții privind studiul microorganismelor cu efect de biodeteriorare a obiectelor de patrimoniu din materiale textile naturale

Conducător doctorat: Prof. Dr. Veronica Lazăr

Doctorand: [anonimizat]-Clara Rădulescu

2017

CUPRINS

LISTĂ DE ABREVIERI

CMC; Carboximetilceluloză

BLAST; Basic Local Alignement Search Tool

FTIR; Fourrier Transformed Infrared spectroscopy

ITS; Internal Transcribed Spacer

LIBS; Laser-induced breakdown spectroscopy

LSU; Large Ribosomal Unit

MEA; Malt Extract Agar

PDA; Potato Dextrose Agar

RFLP; Restriction Fragment Length Polymorphism

SEM; Scanning Electron Microscopy

SDA; Sabouraud Dextrose Agar

SSU; Small Ribosomal Unit

EDTA; Acidul etilendiaminotetraacetic

INTRODUCERE

Patrimoniul Cultural este considerat în prezent un bun al umanității și o resursă de cunoaștere și de dezvoltare pentru om și pentru societate. [anonimizat] o parte de istorie de la începuturile civilizației umane și până în prezent. [anonimizat] a [anonimizat], [anonimizat], sensuri ale istoriei.

Măsurile și activitățile concentrate de conservare a [anonimizat]. La nivel internațional există o bogată legislație prin care se reglementează protejarea și transmiterea nealterată a Patrimoniului Cultural către generațiile viitoare.

Domeniul Patrimoniului Cultural tangibil a cuprins pentru multă vreme acțiuni de protejare și conservare a [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat] a [anonimizat] a procesului de degradare fizică și chimică a acestora.

Treptat și o dată cu formarea unor colecții de artă valoroase interesul s-a [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], piele, textile etc. [anonimizat], [anonimizat]. Structura lor organică sensibilă la condițiile de mediu și la acțiunea microorganismelor constituie obiectul de studiu al multor cercetări în domeniu. Dar probabil cele mai intense preocupări în ultimele decenii au fost canalizate pentru investigarea și conservarea picturilor. Există în prezent o [anonimizat], [anonimizat] a [anonimizat], straturile subpicturale existente.

Materialele textile din fibre naturale au însoțit activitatea umană încă de la începuturile civilizației. În situsurile arheologice sunt descoperite fragmente de structuri textile cu vechime de mii de ani, care reflectă importanța lor pentru oameni.

Datorită proprietăților lor fizico-mecanice și chimice care le crează o structură flexibilă, dublată de o bună rezistență mecanică, ele au avut rol de protecție al corpului uman față de condițiile mediului dar și rol tehnic, fiind folosite pentru activitățile din gospodărie. În aceeași măsură de importate sunt rolurile social, estetic, istoric, religios și cultural pe care materialele textile le-au avut de-alungul istoriei. Ca exemple se pot da veșmintele purtate de nobilime pe parcursul sec. X-XIX, tapiseriile prin care se descriau evenimente istorice importante, veșmintele religioase, pânzele de cânepă sau in care constituie substratul pe care au fost realizate de-a lungul timpului picturile etc.

S-a creat astfel un valoros Patrimoniu Cultural reprezentat de bunurile textile, cu particularități privind metodele de investigare, conservare și restaurare. Bunurile textile din fibre naturale, precum cânepa, inul, bumbacul, lâna și mătasea sunt structuri organice fiind alcătuite din biopolimeri naturali care sunt supuși mecanismelor de degradare fizică, chimică și biologică.

Aceste mecanisme pot să acționeze sinergic intensificând procesul de degradare sau poate avea loc preponderant un anumit tip de degradare, care însă vulnerabilizează structura internă a fibrelor naturale, și crează premisele pentru o degradare ulterioară complexă.

Microorganismele sunt omniprezente în aer, și au capacitatea de a coloniza habitaturi naturale variate privind condițiile de temperatură, umiditate, pH, concentrație de săruri etc. Microfungii sunt organisme cu o mare diversitate de specii, echipate cu un bogat aparat enzimatic, capabil să degradeze substraturi diferite. Dacă în domeniul biotehnologic proprietățile biodegradative ale microfungilor constituie un beneficiu, care se dorește exploatat și chiar îmbunătățit, în domeniul Patrimoniului Cultural, acestea determină procesul de biodeteriorare cu consecințe care pot ajunge până la pierderea sau distrugerea iremediabilă a bunului cultural textil.

De aceea, este necesară cunoașterea biologiei, diversității și mecanismelor de degradare a substraturilor de către microfungi, în vederea dezvoltării metodelor optime de conservare preventivă a colecțiilor textile. De asemenea, conservarea curativă sau procesul de restaurare pot să înglobeze tehnici moderne, innovative, multidisciplinare, de remediere biologică a degradărilor produse în timp prin acțiunea microfungilor.

S-a acordat o atenție sporită în ultimele decenii procesului de biodeteriorare al bunurilor de Patrimoniu Cultural în special pentru monumentele istorice, picturi, bunurile culturale din lemn sau pe suport de hârtie. Comparativ cu aceste studii, doar recent există un interes sporit pentru investigarea biodeteriorării bunurilor textile de Patrimoniu Cultural. Direcțiile de cercetare majore care sunt abordate vizează identificarea microbiotei prezente pe suporturile textile sau în ambient prin tehnici clasice și moleculare, simularea procesului de îmbătrânire fizico-mecanică a materialelor textile asociată cu evaluarea acțiunii microfungilor în condiții normale și îmbătrânite, implementarea unor metodologii de conservare preventivă, pentru a asigura condițiile optime de păstrare a colecțiilor textile.

În România, există colecții valoroase de textile etnografice în diferite muzee din țară, așa cum este Muzeul Național al Țăranului Român. Aceste colecții reflectă tradițiile poporului nostru și sunt o resursă de identitate și valorizare socială și economică. De aceea conservarea lor pe termen lung, cunoașterea proceselor degradative care le pot afecta sunt necesare și constituie motivația alegerii acestui subiect al tezei de doctorat.

În acest context, scopul acestei teze a fost studiul microfungilor cu efect de biodeteriorare a obiectelor textile de Patrimoniu Cultural din cadrul Muzeului Național al Țăranului Român, București, care deține o valoroasă colecție de bunuri textile etnografice.

I. PARTEA TEORETICĂ

CAP. 1 ASPECTE NORMATIVE LA NIVEL NAȚIONAL ȘI INTERNAȚIONAL PRIVIND PROTECȚIA PATRIMONIULUI CULTURAL

Definit ca o „resursă neregenerabilă” (OJ C 183), Patrimoniul Cultural prin componentele sale patrimoniul tangibil, sau material, patrimoniul intangibil, sau imaterial la care se alătură ca urmare a momentului de dezvoltare tehnologică actual, componenta digitală, face obiectul mai multor politici culturale europene și mondiale, cât și a unor norme naționale specifice. Aceste documente vizează înțelegerea structurii Patrimoniului Cultural într-un context contemporan și elaborarea principiilor pentru salvgardare și valorificare.

Interesul pentru stabilirea unor măsuri coordonate pentru protejarea Patrimoniului Cultural au aparut la sfârșitul secolului XIX, când s-au elaborat principiile pentru protejarea clădirilor istorice. Pe parcursul secolului următor, și în special odată cu înființarea UNESCO (Organizația Națiunilor Unite pentru Educație, Știință și Cultură) în 16 noiembrie 1945, a avut loc o intensificare a eforturilor pentru identificarea, studierea și protejarea Patrimoniului Cultural. S-au adoptat o serie de convenții internaționale care au constituit punctul de plecare pentru acțiunile ulterioare întreprinse și la nivel național.

În România s-au ratificat convențiile internaționale și s-a inițiat armonizarea cadrului legislativ pentru activitatea desfășurată în domeniul Patrimoniului Cultural cu cel existent la nivel european.

Patrimoniu Cultural a devenit pe parcursul timpului un domeniu care cuprinde o mare diversitate de forme și expresii culturale întotdeauna puse în corelație cu sensul și identitatea societății și a omului.

Domeniul patrimoniului tangibil include obiecte și bunuri, clădiri și monumente istorice, colecții muzeale, dar recent se referă și la zone rurale, peisaje, locuri cu semnificație istorică. Patrimoniul intagibil este reprezentat de tradiții, forme de expresie orală, meșteșuguri locale etc..

Toate aceste elemente fac obiectul elaborării politicilor culturale și a metodologiilor de conservare și restaurare.

1.1 Cadrul legislativ internațional privind protecția Patrimoniului Cultural

Politicile culturale elaborate la nivel european stabilesc principii de acțiune pentru protecția durabilă a Patrimoniului Cultural și natural și pentru protejarea sa în condiții speciale, precum în situația unui conflict armat (Convention for the Protection of Cultural Property in the Event of Armed Conflict).

Au fost elaborate convenții europene pentru salvgardarea patrimoniului imaterial și promovarea diversității expresiilor culturale (COM /2005/ 678; Convention for the safeguarding of the intangible Cultural Heritage). Un interes aparte este acordat patrimoniului arheologic, subacvatic și peisagistic (ETS no. 143; Europe’s living landscapes: Cultural heritage as a force for rural development, UNTC 45694).

În ultimul deceniu atenția acordată comunităților rurale, cu tradițiile, arhitectura caselor și portul lor popular a crescut foarte mult.

Comunitățile rurale sunt considerate nuclee ale identității naționale, și o resursă cu o mare diversitate culturală. Documentele internaționale elaborate susțin și încurajează conservarea și valorificarea lor și devoltarea lor din punctul de vedere al potențialului turistic.

În politicile europene actuale Patrimoniului Cultural i se atribuie o semnificație renascentistă întrucât el reflectă oamenii și valorile umane de-a lungul istoriei (CETS 199). Iar pentru societate ca întreg, Patrimoniul Cultural sub toate formele sale „constituie o sursă comună de rememorare, înțelegere, identitate, coeziune și creativitate” (CETS 199).

Se consideră că prin dezvoltarea mijloacelor de conservare și valorificare sustenabilă se realizează implicit dezvoltarea societății umane și creșterea calității vieții, întrucât efectele protejării pe termen lung a Patrimoniul Cultural aduc beneficii la nivel cultural, social, economic și ecologic.

Există un îndemn lansat la nivel european privind conservarea durabilă a Patrimoniului Cultural, el fiind considerat o sursă „neregenerabilă, unică, de neînlocuit și neinterșanjabilă” (OJ C 183).

În Comunicatul Comisiei Europene către celelalte foruri europene, se definește o viziune integrată asupra Patrimoniului Cultural prin care se promovează diversitatea culturală, dialogul intercultural și creativitatea (COM/2014/ 477).

În normativele și politicile europene de dată recentă, Patrimoniului Cultural i se atribuie și o importantă funcție socială, întrucât prin intermediul activităților dezvoltate de organizațiile culturale se poate promova coeziunea și integrarea socială. De asemenea, se menționează și rolul educațional prin activitățile desfășurate în cadrul unui muzeu, prin aplicarea noilor tehnologii digitale: „The heritge sector is already reinventing itself to meet new challenges. Conservation is increasingley geared toward preserving and enhancing a whole cultural landscape rather than an isolated site, and also becoming more people-centred. Old approaches sought to protect heritage by isolating it from daily life. New approaches focus on making it fully part of the local community. Sites are given a second life and meaning that speak to contemporary needs and concerns” (COM/2014/477).

Printre măsurile preconizate pentru conservarea și promovarea acestei resurse se află identificarea și stabilirea unor modele de politici pe termen lung care să fie centrate pe societate și cetățean. Aceste măsuri prevăzute în normativele europene încurajează formarea rețelelor și parteneriatelor inter și transdisciplinare, și colaborarea între domeniile public și privat la nivele diferite de guvernare. Toate aceste acțiuni sunt menite să conducă la îmbunătățirea capitalului uman, și la formarea și dezvoltarea unor aptitudini pentru cunoașterea și valorificarea elementelor tradiționale (OJ C 183).

În ultimul deceniu, peisajul rural este revalorizat întrucât el „furnizează un depozit vital al moștenirii culturale europene sub forma trăsăturilor istorice, arheologice, clădirilor tradiționale, așezărilor distincte și tradițiilor locale” (Europe’s living landscapes: Cultural heritage as a force for rural development). Iar toate aceste elemente aduc „diversitatea, frumusețea și un sens al locului care definește zona rurală europeană” (Europe’s living landscapes: Cultural heritage as a force for rural development).

Se are în vedere și evaluarea impactului socio-economic al zonelor rurale prin posbilitatea de a atrage investiții și a oferi noi locuri de muncă.

Pentru conservarea patrimoniului zonelor rurale au fost definite câteva criterii cheie care sunt considerate importante în elaborarea politicilor din acest domeniu precum: (1) criteriul istoric, (2) componenta naturală, (3) impactul pozitiv asupra dezvoltării comunităților rurale, (4) susținerea turismului local, (5) tipul de agricultură realizat la nivel local, de exemplu agrigultura de tip intensiv duce la alterarea patrimoniului natural, (6) gradul de organizare și coordonare administrativă a activităților de conservare, (7) implementarea unor concepte moderne, precum conceptul „rezultatelor de tip win-win-win”, în care sunt urmate scheme multi-obiectiv pentru dezvoltarea fermelor agricole, prin care se asigură protejarea biodiversității, a patrimoniului cultural și a resurselor naturale, (8) menținerea echilibrului ecologic.

În cadrul comunitățile rurale s-a dezvoltat de-a lungul timpului un patrimoniu cultural intangibil inestimabil. Acesta face obiectul a două convenții internaționale importante: Convention sur la protection et la promotion de la diversité des expressions culturelles (COM /2005/ 678) și Convention for the safeguarding of the intangible cultural heritage. Ambele convenții stau sub semnul UNESCO.

În cadrul celei de-a doua convenții Patrimoniul Cultural intangibil este definit ca un catalizator al comunicării și solidarității interumane. Convenția are ca obiective salvgardarea și respectarea patrimoniului intangibil prin creșterea responsabilității privind importanța sa la niveluri diferite – regional, național, internațional.

Formele Patrimoniului Cultural intagibil se transmit de la o generație la alta, și sunt recreate constant prin interacția cu natura și istoria. Ele cuprind un ansamblu de „practici, reprezentări, expresii, cunoștiințe și aptitudini, precum și instrumente, obiecte, artefacte și spații culturale asociate cu ele” și ele conferă „un sens al identității și continuității” (Convention for the safeguarding of the intangible Cultural Heritage).

Printre măsurile prevăzute pentru salvgardarea patrimoniului intangibil se află: (1) adoptarea de programe și politici pentru promovarea funcției sale sociale, (2) stabilirea unei structuri administrative publice responsabile cu elaborarea și aplicarea politicilor de conservare, (3) susținerea studiilor și cercetărilor care să furnizeze metodologii optime pentru salvarea patrimoniului intangibil aflat în pericol, (4) facilitarea accesului la patrimoniul intangibil și (5) creșterea vizibilității în spații culturale diverse.

O măsură europeană importantă propusă prin această convenție este stabilirea Listei reprezentative a patrimoniului cultural intangibil al umanității (Convention for the safeguarding of the intangible Cultural Heritage).

În Convenția UNESCO semnată la Paris la 20 octombrie 2005 se afirmă că „diversitatea culturală este una din caracteristicile inerente ale umanității” și se recunoaște rolul pozitiv al „sistemelor de cunoaștere” tradiționale pentru o dezvoltare durabilă (COM /2005/ 678).

Definită ca „multiplicitatea de forme” (COM /2005/ 678) prin care comunitățile își găsesc expresia, diversitatea culturală este guvernată de opt principii: 1) Principiul respectării drepturilor omului și al libertăților fundamentale; 2) Principiul suveranității; 3) Principiul demnității egale și al respectului pentru toate culturile; 4) Principiul solidarității și al cooperării internaționale; 5) Principiul complementarității aspectelor economice și culturale ale dezvoltăriii; 6) Principiul dezvoltării durabile; 7) Principiul accesului echitabil și 8) Principiul deschiderii și echilibrului (COM /2005/ 678).

Aceste principii împreună cu măsurile destinate promovării și protejării expresiilor culturale constituie structura suport prevăzută în cadrul Convenției UNESCO menționată pentru salvgardarea Patrimoniului Cultural generat prin diversitatea culturală.

Un alt aspect al normativelor internaționale în domeniul Patrimoniului Cultural îl reprezintă elaborarea de politici culturale care conțin prevederi pentru salvgardarea și conservarea patrimoniului cultural și natural în cazul riscurilor generate de modificarea climei, catastrofe naturale precum foc, inundații, cutremure sau în cazul unui conflict armat.

Rapoartele privind modificarea climei au determinat elaborarea unei politici internaționale care definește prioritățile privind evaluarea impactului modificărilor climatice asupra Patrimoniului Cultural mondial. Astfel, UNESCO a adoptat în 2008 documentul intitulat Policy document on the impacts of climate change on World Heritage Properties care face parte dintr-un pachet de trei documente normative destinate evaluării, monitorizării și dezvoltării instrumentelor necesare contracarării efectelor negative asupra Patrimoniului Cultural, generate de modificările climatice. Celelalte documente sunt reprezentate de raportul Predicting and managing the effects of climate change on World Heritage și de materialul strategic Strategy to assist states parties to the Convention to implement appropriate management responses aprobate la a-30-a sesiune UNESCO care a avut loc la Vilnius în anul 2006.

În documentul final, adoptat în 2008, se prezintă faptul că încă este necesară acumularea de cunoștiințe privind înțelegerea impactului modificărilor climatice asupra bunurilor Patrimoniului Cultural și evaluarea gradului de vulnerabilitate pentru stabilirea unor măsuri de management prioritare.

Evaluarea acestui impact se va realiza prin acțiuni precum: (1) stabilirea parteneriatelor cu profesioniști din diferite domenii care dețin expertiza necesară; (2) evaluarea impactului modificărilor climatice în concordanță cu specificitatea fiecărui tip de zonă; (3) includerea domeniului Patrimoniu Cultural în alte tipuri de studii care analizează impactul modificărilor climatice; (4) atragerea interesului și intensificarea responsabilității publice privind impactul modificărilor climatice.

În Convenția UNESCO sunt definite trei direcții de cercetare: I. factorii crescuți de risc; II. analize de tip cost-beneficiu; III. evaluarea impactului altor tipuri de factori de stres, precum poluarea, despădurirea, braconajul, și a modului cum se corelează cu impactul modificărilor climatice (Policy document on the Impacts of Climat Change on World Heritage Properties).

Protecția Patrimoniului Cultural în condițiile unui conflict armat este legiferată prin Convenția de la Haga adoptată în 1954. Convenția prevede ca statele semnatare să ia toate măsurile pentru ca pe durata conflictului armat să nu se aducă prejudicii Patrimoniului Cultural, acesta fiind un bun al umanității.

Înțelegerea structurii Patrimoniului Cultural a evoluat treptat de-alungul timpului. Dacă preponderent se referea la patrimoniul arhitectural, acum include formele tangibil, intangibil și digital (OJ C 183).

Redefinirea conceptului de Patrimoniu Cultural cu valențele aduse de contemporaneitate, cât și elaborarea unor politici culturale pentru a gestiona provocările aduse de dezvoltarea societății moderne, precum încălzirea globală, reprezintă caracterisicile convențiilor europene și internaționale elaborate începând din anii 2000.

La nivel internațional Patrimoniul Cultural este considerat un domeniu cu valoare semnificativă pentru societate ca întreg, astfel încât managementul său sustenabil trebuie să facă parte din strategiile secolului XXI (OJ C 183).

1.2 Cadrul legislativ național privind protecția Patrimoniului Cultural

România prezintă un bogat Patrimoniu Cultural astfel că a ratificat prin legi specifice mai multe Convenții europene: Convenția privind bunurile culturale furate sau exportate ilegal, adoptată la Roma în 1995, Convenția europeană pentru protecția patrimoniului arheologic, semnată la Valetta în 1992, Convenția pentru protecția patrimoniului arhitectural al Europei, semnată la Granada în 1985, Convenția europeană a peisajului aprobată la Florența în 2000. România este de asemenea semnatara Convenției de la Haga (1954) pentru protejarea patrimoniului cultural în caz de conflict armat.

În domeniul restaurării și conservării sunt aprobate trei Hotărâri de Guvern: (1) Normele de conservare și restaurare a bunurilor culturale mobile clasate; (2) Normele privind autorizarea laboratoarelor și atelierelor de conservare și restaurare; (3) Normele de acreditare a conservatorilor și restauratorilor (HG 216/211; Hotărâre 1546/2003, Ordin nr. 2008/2001).

Normele de conservare și restaurare (Hotărâre nr. 1546/2003) definesc trei concepte de bază care pot fi identificate cu etapele principale ale unui proces de protejare a unui bun cultural, și anume conservarea preventivă, conservarea curativă și restaurarea. De asemenea sunt prezentate criteriile tehnice pentru alegerea și pregătirea spațiilor de depozitare precum stabilitatea microclimatică, cu umiditate relativă cuprinsă între 50-65 %, și temperatură de maximă 22 0C, reglarea nivelului de iluminare în corelație cu structura obiectelor de patrimoniu, absența altor factori de stres ambiental precum poluarea, pulberi sau gaze nocive, siguranța privind potențiale incendii și inundații.

Orice acțiune de conservare-restaurare se realizează cu respectarea „cerințelor conservării științifice” (Hotărâre 1546/2003). Restaurarea unui bun cultural mobil cuprinde inițial o amplă analiză multidisciplinară, fizică, chimică și biologică, prin aplicarea unor metode nedistructive sau microdistructive urmate de elaborarea „metodologiei de restaurare”. Acțiunile întreprinse în timpul efectuării lucrărilor de restaurare formează „documentația de restaurare” care cuprinde fișa de evidență, fișa de conservare, documentația restaurărilor anterioare, documentația de investigație, documentația foto, metodologia de restaurare, procesul-verbal al comisiei de restaurare și jurnalul de restaurare (Hotărâre 1546/2003).

Cel mai important document normativ românesc este Legea nr 182/200 privind protejarea patrimoniului cultural național mobil care conține capitole specifice pentru cercetarea, inventarierea și clasarea patrimoniului mobil, pentru păstrarea, depozitarea și asigurarea securități bunurilor culturale mobile, pentru conservarea și restaurarea lor, pentru circulația bunurilor de patrimoniu mobil, și pentru înființarea instituțiilor specializate care să organizeze toate aspectele privind patrimoniul cultural mobil, de la cercetare și investigare până la finanțare și punerea în valoare a acestuia (Legea nr. 182/2000).

Cadrul legislativ național cuprinde de asemenea acte normative pentru protejarea patrimoniului cultural imaterial, a monumentelor istorice și a siturilor arheologice și pentru organizarea muzeelor și a colecțiilor (Legea 26/2008; Legea 422/2001, Legea 378/2001, Legea 311/2003, Ordinul Minsterului Culturii nr. 2035/2000).

Patrimoniul natural, cuprinzând rezervațiile și parcurile naționale este coordonat și protejat de asemenea printr-o normă legală specifică (Hotărârea nr. 230/2003).

În România are loc o rapidă adaptare la inițiativele culturale europene, de exemplu prin participarea la evenimentele anuale precum Noaptea Muzeelor, Noaptea Cercetătorilor, Orașul Cultural European etc.

1.3 Aspecte de etică, principii și standarde de lucru în conservarea si restaurarea Patrimoniului Cultural

Activitatea desfășurată în cadrul muzeelor respectă o deontologie profesională specifică descrisă în diferite coduri de etică elaborate de muzeele cu tradiție din lume sau de organizații de cultură internaționale (Bounia, 2014).

Cel mai recunoscut cod de de etică este cel elaborat de ICOM (International Council of Museums) (http://icom.museum/the-vision/code-of-ethics/). El stă la baza alcătuirii altor ghiduri și coduri naționale ca de exemplu „Codul de etică pentru muzeele din marea Britanie” (https://www.museumsassociation.org/ethics/code-of-ethics).

Codul ICOM este structurat în mai multe capitole, care sunt considerate principii care trebuie sa guverneze activitatea unui muzeu. Aceste principii sunt:

1. Rolul muzeelor este de a păstra, transpune și promova moștenirea culturală și naturală a umanității;

2. Rolul muzeelor constă în păstrarea și conservarea colecțiilor în beneficiul dezvoltării societății;

3. Muzeele au un rol educațional important;

4. Muzeele participă la elaborarea politicilor culturale;

5. Rolul socio-economic al muzeelor provine din posibilitatea de a genera noi resurse pentru alte tipuri de servicii publice;

6. Muzeele au rol de liant între comunitățile de la care provin colecțiile și cele pe care le deservesc;

7. Rolul de a consolida și promova o atitudine și conduită profesională.

Cercetarea obiectelor de colecție este realizată în corelație cu misiunea și obiectivele muzeului. Tipul de metode utilizate la investigarea unui bun cultural, alături de rezultatele obținute și materialele științifice elaborate devin parte însoțitoare a istoriei de conservare a bunului cultural respectiv.

Activitățile de conservare și restaurare sunt definite ca tratamente sau măsuri aplicate direct sau indirect unui bun cultural sau ansamblu de bunuri culturale, și care au ca scop protejarea sa și transmiterea cunoștiințelor referitoare la valoarea sa culturală.

Măsurile de conservare și restaurare se realizează conform unei metodologii de lucru care cuprinde câteva etape principale (https://ceroart.revues.org/3764?file=1):

– 1) evaluarea criteriilor diferite, istorice, tehnice, științifice, etc. atunci când se inițiază un proces de restaurare,

2) efectuarea dignosticului de examinare ca etapa preliminară a oricărei intervenții, prin care se identifică starea prezentă a bunului cultural;

3) stabilirea tipului cel mai potrivit de intervenție:

(a) conservare preventivă, prin aplicarea unor acțiuni cu caracter indirect care permit evitarea sau amânarea deteriorării obiectului de patrimoniu;

(b) conservarea curativă sau de remediere care reprezintă o acțiune directă menită să stabilizeze structura obiectului de patrimoniu;

(c) restaurarea, care însumează acțiuni complexe, cu scopul valorizării, înțelegerii și utilizării bunului de patrimoniu cultural.

4) documentarea tuturor activitățile întreprinse în cadrul unui proces de conservare-restaurare. Datele colectate indiferent de forma lor, scrisă sau vizuală, la care se atașează justificarea deciziilor de restaurare, devin parte integrantă a istoriei bunului de patrimoniu din colecție.

De asemenea, în procesul de conservare-restaurare trebuie să se ia în considerare ca materialele folosite să nu afecteze și să fie compatibile cu bunul cultural și să nu prezinte riscuri nejustificate pentru mediu și oameni (https://ceroart.revues.org/3764?file=1).

Ca urmare a complexității acțiunilor de conservare și restaurare a unui bun cultural, abordarea metodologică trebuie să fie interdisciplinară.

Cu scopul de a conferi un cadru științific standardizat intervențiilor de conservare și restaurare, în structura Comitetului European de Standardizare – CEN (Comité Européen de Normalisation) s-a înființat un grup tehnic de lucru, CT 346, a cărui misiune constă în elaborarea unor standarde pentru caracterizarea materialelor, proceselor, metodelor și documentelor folosite în domeniul Patrimoniului Cultural.

Astfel, Comitetul tehnic a elaborat până în prezent 20 de standarde și are în lucru alte opt standarde. Printre standardele publicate se regăsesc cele care stabilesc condițiile pentru iluminare, umiditate și temperatură, determinarea absorbției apei prin capilaritate, a unghiului de contact, determinări de colorimetrie și standarde care definesc termeni generali și criteriile pentru realizarea expozițiilor

(http://standards.cen.eu/dyn/www/f?p=204:7:0::::FSP_ORG_ID:411453&cs=11079A55D70F8377E3942E1C6704C7664).

CAP. 2 DEGRADAREA FIZICO-CHIMICĂ ȘI BIOLOGICĂ A MATERIALELOR TEXTILE ȘI METODE DE PROTECȚIE A PATRIMONIULUI CULTURAL TEXTIL

2.1 Studii privind conservarea și restaurarea bunurilor textile de Patrimoniu Cultural

2.1.1. Clase de obiecte textile de Patrimoniu Cultural

O clasificare generală a bunurilor textile de patrimoniu se poate realiza în funcție de perioada în care respectivele materiale au fost produse și utilizate. Pot fi definite două clase de textile de patrimoniu: Clasa textilelor arheologice și Clasa textilelor istorice.

Textilele arheologice sunt datate în perioada preistorică, din Mezolitic, Epoca Bronzului, Epoca Fierului până în primul mileniu d.Ch.

Textilele istorice sunt datate din perioada premedievală, sec X – XI d.Ch până în sec. XX și sunt întâlnite într-o mare varietate de obiecte de patrimoniu, de la picturi, până la veșminte religioase sau cu aplicații tehnice, precum velele pentru corăbii, etc.

Un mare număr de textile arheologice au fost descoperite în partea de nord a Europei și datează din perioada Epocii Bronzului și a Epocii Fierului (Berghe și colab., 2009).

Fragmentele de textile arheologice descoperite sunt reprezentate de fibrele de in, cânepă, urzică sau fibre de origine animală (fibra de lână). Aceste textile arheologice conferă date privind modalitatea de prelucrare timpurie a fibrelor textile și modul de evoluție în timp a tehnologiei textile, iar articolele mari și complete descoperite sunt valoroase pentru înțelegerea meșteșugurilor și îmbrăcăminții preistorice.

Textilele din perioada preistorică se regăsesc de cele mai multe ori sub o formă mineralizată, de impresiuni în argilă denumite „pseudomorfe”. Datate în Paleoliticul Superior ele constituie printre primele dovezi ale folosirii fibrelor textile. Formele impregnate arată structuri similare unei frânghii sau unei plase de pescuit(Bender Jørgensen și Grömer, 2012).

Tehnica țesutului apare la sfârșitul mileniului VI, î.Ch. și tot atunci apare și o nouă fibră: inul (Bender Jørgensen și Grömer, 2012).

Caracterizarea textilelor arheologice cuprinde câteva etape principale: 1. descrierea inițială a stării de conservare a obiectului: intact, deteriorat, carbonizat, mineralizat, sub formă de impresiune; 2. descrierea dimensiunii sale, a culorii, și identificarea petelor, a pigmentării, și colorării; 3. analiza parametrilor tehnici pentru fibre, fire, țesături – se stabilește tipul și starea fibrelor, precum și modalitatea de prelucrare (pieptănare, cardare), desimea firelor în urzeală și bătătură, sensul torsiunii firului etc. La țesătură se identifică tipul de legătură, modelul ornamentelor, aspectul marginilor, prezența tratamentelor de finisare (Bender Jørgensen și Grömer, 2012).

Investigarea mai detaliată a textilelor arheologice și istorice implică aplicarea metodelor analitice precum microscopia digitală, care are avantajul că folosește un echipament mobil, conferă mărire și iluminare bune și permite măsurarea unghiului de răsucire pentru fire. Tehnicile avansate pentru investigare sunt microscopia electronică cu baleiaj (SEM), tomografia computerizată (CT-scanning), aplicarea graficii 3D.

Ca tehnici nondistructive pentru studiul textilelor de patrimoniu sunt ESEM (Environmental Scanning Electron Microscopy) și microspectroscopia FTIR. Analiza coloranților din fibrele textile se face prin spectrometrie în UV-VIS, TLC (Thin Layer Chromatography), HPLC-PDA (High Performace Chromatography – Photodiade Array detection), UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography), SEM-EDS (Scanning Electron Microscopy – X-Ray Energy Dispersive Spectrometry) (Vittiglio și colab., 2004).

Pentru stabilirea vârstei textilelor se folosește datarea cu radiocarbon folosindu-se cantități mici de probe iar pentru determinarea regiunii de proveniență a textilelor se folosește datarea cu izotopi de stronțiu. Identificarea speciilor de plante din care s-au obținut fibrele textile din structura bunurilor textile culturale se realizează în prezent cu ajutorul metodelor biologiei moleculare și geneticii (Li și colab., 2011; Yang și Watt, 2005).

Prin descoperirea textilelor arheologice s-au obținut primele date cu privire la utilizarea fibrelor textile și a modului de dezvoltare a cunoștiințelor pentru prelucrarea lor: „Although sparse, these finds represents the firs glimpses of textiles in Europe, reminding us that items made of perishable materials like fibres were an important part of material culture of early Europeans” (Yang și Watt, 2005).

Istoria utilizării plantelor textile poate aduce informații valoroase pentru studiul textilelor arheologice și istorice. Tradițiile folosite de-alungul timpului pentru cultivarea și prelucrarea plantelor din care se obțin fibre textile determină caracteristici diferite privind parametrii structurali ai elementelor textile: fibre, fire și țesături. Zonele geografice de cultivare sunt de asemenea importante, regăsindu-se linii genetice diferite în cadrul aceleiași specii de plante.

Există mai multe studii privind cultura plantelor pentru obținerea fibrelor textile. Rammo evidențiază utilizarea constantă a plantelor pentru fibre de-alungul perioadei Epocii Fierului târzii, și până în Epoca Medievală și Post Medievală în Estonia (Rammo, 2014). Lâna ca fibră de orgine animală, nu prezintă aceeași istorie îndelungată de utilizare, precum fibrele vegetale.

Cele mai vechi dovezi ale utilizării plantelor pentru a constitui structuri de tip textil sunt date de textile arheologice datate în Mezolitic (9000-4900 i.Ch.) și constau din bucăți de pânză pentru pescuit.

Prima utilizare a inului (Linum usitatissimum) apare în sec. V d.Ch. Cele mai multe textile arheologice în Estonia apar începând cu sec. XI, o cauză fiind înlocuirea ritualului incinerării folosit în Estonia premedievală cu ritualul îngropării. Textilele arheologice identificate în 44 de locuri în Estonia au fost analizate prin stereomicroscopie și microscopie optică. S-au analizat diferiți parametrii tehnici, precum desimea firelor, sensul torsiunii firului, grosimea firelor, tipul de legătură în țesătură. Textilele arheologice studiate au fost clasate ca și cămăși, giulgiu sau eșarfe, acoperitoare de cap, învelitori pentru diferite obiecte și saci (Rammo, 2014).

2.1.2 Caracterizarea bunurilor textile de Patrimoniului Cultural

Studiile privind caracterizarea textilelor arheologice și istorice abordează următoarele subiecte: identificarea tipului de materie primă folosit, determinarea coloranților din fibră și stabilirea vârstei obiectului textil.

Identificarea materiei prime

Identificarea tipului de fibre din textilele istorice și arheologice deține o importanță fundamentală pentru clasificarea obiectului, stabilirea orginii, datarea lui cât și pentru considerații de natură tehnologică, pentru stabilirea tehnicii de obținere a fibrei, firului și a țesăturii.

Diferite studii prezintă utilizarea metodelor precum: microscopia electronică, ICP (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry), ATR/FTIR (Attenuated Total Reflection /Fourier Transform Spectroscopy), AAS (Atomic Absorption Spectroscopy) și cromatografia lichidă (HPLC) pentru determinarea materiei prime, a prezenței și activității microorganismelor și pentru determinarea coloranților din obiectele textile (Cybulska și colab., 2008; Margariti și colab., 2011; Sánchez-Piñero și Bolivar, 2004).

Identificarea materiei prime se poate face într-un prim pas, prin testul arderii, fibrele de origine animală producând prin ardere un miros caracteristic față de cele vegetale, acestea din urmă generând o cenușă fină ca o pulbere. Această metodă organoleptică deține însă un mare dezavantaj de a fi complet distructivă.

Microscopia electronică permite vizualizarea la scară mărită a morfologiei suprafeței fibrelor și diferențierea netă dintre fibrele vegetale de cele animale, cât și identificarea unor contaminanți aflați pe suprafața lor. Spectroscopia FTIR permite identificarea structurii chimice, prin stabilirea tipului de legături existente. Prin cuplarea echipamentului FTIR cu o prismă ATR (Attenuated total reflextion) se poate analiza suprafața probei textile micro-invaziv, până la o adâncime de 0,25 µm, iar dificultățile care pot apărea pot fi generate de prezența pe suprafațe fibrelor a prafului, mordanților, altor compuși de degradare, sau a unor particule metalice. Spectrometria de absorbție atomică (AAS) este necesară pentru identificarea compoziției metalelor și a concentrației lor în probe, și se dovedește foarte utilă pentru stabilirea compoziției metalice a firelor metalice istorice care intră în alcătuirea broderiilor istorice și veșmintelor militare (Lehmann și colab., 2005).

Determinarea coloranților din fibrele textile istorice

Identificarea coloranților din fibre textile impune în primul rând dezvoltarea metodei optime de extracție a acestora, fără alterarea structurii chimice a compușilor care trebuie identificați. Într-un studiu privind identificarea coloranților din textile s-a folosit tehnica RPLC/ESI/MS (Reversed phase liquid chormatography/ Electrospray ionization/Mass spectrometry) cu ajutorul căreia s-au detectat 11 coloranți din 3 surse biologice diferite. Coloranții au fost identificați într-o probă textilă istorică, reprezentată de un fir de mătase de culoare roșie, dintr-un manuscris datat din sec. XVII (Petroviciu și colab., 2010). Substanțele chimice identificate au fost: acidul carminic, acidul elagic, alizarina și purpurina. Alizarina și purpurina au indicat vopsirea cu roibă (Rubia sp.), acidul carminic este un compus major al insectelor din familia Dactylopiidae (Dactylopius coccus Costa), iar acidul elagic provine din utilizarea elementelor vegetale din arbori care aparțin genului Quercus.

Concluziile desprinse de autorii studiului au fost că utilizarea cromotagrafiei lichide cuplate cu spectrometrie de masă simplă sau în tandem (LC-MS, LC-MS/MS) pentru identificarea coloranților din textilele istorice a depins de mai mulți factori precum: a) disponibilitatea compușilor standard necesari pentru construirea bazei de date; b) caracteristicile cromatografului folosit; c) o cunoaștere profundă a surselor biologice folosite la vopsirea textilelor istorice; d) obținerea unor modele experimentale standard (Petroviciu și colab., 2010).

Un alt studiu a prezentat identificarea coloranților din materiale textile preistorice, datate în Epoca Fierului timpurie (mileniul I i.Ch.), tot cu ajutorul tehnicilor cromatografice folosind detectori diferiți (Surowiec și colab., 2006).

În țările scandinave (Danemarca, Norvegia, Suedia) au fost descoperite un număr mare de textile preistorice, în special în zonele mlăștinoase, unde cantitatea scăzută de oxigen, sau chiar absența oxigenului, pH-ul acid și prezența unui compus specific mușchilor din genul Sphagnum, care prezintă activitate antimicrobiană au dus la conservarea textilelor. Aceste textile preistorice sunt vopsite, indicând existența timpurie a unor cunoștiințe privind vopsirea și practicarea acestei tehnologii încă din epoca preistorică (Berghe și colab., 2009). O primă etapă în identificarea coloranților din textilele preistorice de turbărie a fost stabilirea celui mai potrivit protocol pentru extracția colorantului pentru anliza HPLC. Investigațiile au fost efectuate mai întâi pe referințe și apoi pe un set limitat de probe arheologice. Autorii au identificat o serie de factori care influențează extracția și identificarea coloranților din textilele preistorice, precum procesele intervenite înaninte și după excavarea textilelor, interacțiile dintre textile și alte obiecte aflate în contact cu ele, stadiul lor de degradare sau al materialelor cu care intră în contact. La aceste elemente se adugă cantitatea mică de colorant existent (Berghe și colab., 2009).

O altă metodă minim invazivă folosită este PIXE (Proton-induced X-ray emission). PIXE permite identificarea coloranților, pigmenților și a impurităților anorganice din obiecte cu compoziție organică precum hârtia și textilele istorice (Vodopivec și colab., 2005).

Necesitatea aplicării unor metode noninvazive a dus la dezvoltarea unei metode derivată din tehnica Raman, care permite investigarea la o profunzime de cca. zeci de µm sub stratul superficial al pigmenților prezenți în picturi. Tehnica denumită SORS (Spatially Offset Raman Spectroscopy) permite analiza noninvazivă a unor medii stratificate și identificarea semnalelor Raman individuale ale straturilor pigmentare componente (Conti și colab., 2014).

O altă tehnică utlizată pentru investigarea coloranților și a textilelor istorice este TOF-SIMS (Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry) o metodă minim invazivă și care furnizează mult mai rapid rezulate decât alte metode analitice precum cromatografia lichidă și spectrofotometria (Lee și colab., 2008).

Descompunerea coloranților asociată cu vârsta materialelor textile a fost analizată prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă (GC-MS) (Colombini și colab., 2007).

Stabilirea vârstei pentru textilele istorice

Stabilirea vârstei pentru textilele istorice s-a realizat cu carbon radioactiv utilizând spectrometria de masă accelerată-AMS (Accelerated Mass Spectrometry). Într-un studiu de datare cronologică cu 14C a două robe religioase s-a stabilt că o robă aparține perioadei vieții Sf. Francis din Assisi (sec. XII-XIII), iar cealaltă robă aparține sec. XIV (Fedi și colab., 2008).

2.1.3 Aspecte ale restaurării și conservării textile

Depunerile de praf sau alte substanțe acumulate de-alungul timpului pe suprafața bunurilor textile, pot acționa ca un catalizator al deteriorării lor și de accea curățarea constituie una din etapele principale și de regulă primul pas în metodologia de conservare-restaurare.

Una din problemele pe care le ridică curățarea textilelor istorice este ireversibilitaea procesului și ca și celelalate tipuri de operații efectuate în restaurare trebuie să considere compoziția materialelor și starea lor de conservare. Nu se pot generaliza metodele de conservare pentru un număr mare de textile istorice, este necesară o analiză individuală și procedură diferită pentru fiecare obiect în parte care necesită curățare.

Curățarea prin metode fizico-chimice a unor fire metalice a adus dezavantajul pierderii patinei caracteristice cât și a unei pelicule protectoare formată la suprafață. În același timp s-a observat și alterarea altor de tipuri de fibre organice componente ale obiectului textil. Ca substanțe folosite în curățarea chimică au fost detergenții non-ionici și agenții chelatori precum sărurile sodice de EDTA (Abdel-Kareem și Harith, 2008).

În același studiu este prezentat avantajul utilizării laserului în procesele de curățare a firelor metalice de cupru din broderia a unui material textil archeologic, deoarece s-a putut controla îndepărtarea strat cu strat a depunerilor de pe suprafața metalică (Abdel-Kareem și Harith, 2008).

Curățarea cu laser a presupus utilizarea radiației de Nd (neodim) la lungimea de 532 nm, și energie de 50 mJ/puls, parametrii care nu au afectat miezul celulozic a fibrelor. Substanțele folosite pentru curățarea umedă au fost apa distilată, produsul synperonic N (soluție apoasă de nonilfenol etoxilat), IMS (detergent de uz general) și ETDA.

Evaluarea gradului de curățare realizată cu tehnici de microscopie și spectroscopie LIBS a arătat că utilizarea laserului compartiv cu o curățare umedă este o metodă mai eficientă pentru curățarea firelor de cupru (Abdel-Kareem și Harith, 2008).

Prezența metaboliților secundari, precum oxalații de calciu, pe un suport de hârtie cu conținut cunoscut de compuși organici și anorganici, a fost studiată cu ajutorul speciei Aspergillus terreus. Prezența acestor oxalați pe hârtie poate duce la modificarea locală a pH-ului către valori acide, favorizând alte procese de deteriorare. Aspergillus terreus produce metaboliți secundari, acizi și enzime celulozolitice și prezența sa este asociată cu biodeteriorarea suporturilor de hârtie din librării (Pinzari și colab., 2010).

Autorii au folosit mostre de hârtie obținute din fibră de cânepă, in și lemn de esență moale, iar ca probă martor au folosit hârtie Whatman obținută din fibre de bumbac. Probele au fost inoculate cu o suspensie de A. terreus în mediu Sabouraud lichid 5% și apoi incubate la 27 0C și 100 % umiditate timp de 7 zile. După incubare s-a observat formarea oxalaților de calciu, monohidrați și dihidrați, pe hârtia din celuloză de diferite orgini vegetale (Pinzari și colab., 2010).

O altă metodă de curățare și decontaminare a bunurilor textile de patrimoniu este iradierea cu raze gamma de 60Co. Acest tip de iradiere este folosită frecvent pentru sterilizarea dispozitivelor medicale. Cel mai important parametru care trebuie stabilit pentru decontaminarea obiectelor din substrat organic, așa cum sunt și materialele textile, este doza absorbită, care trebuie pe de o parte să fie eficientă în procesul de decontaminare, dar în același timp, să nu determine depolimerizarea macromoleculelor organice din structura fibrelor naturale (Katušin-Ražem și colab., 2009)

O perspectivă cu aplicații importante este propusă de Cybulska pentru reconstituirea structurii textilelor arheologice prin utilizarea graficii 3D. Metodologia propusă cuprinde o etapă preliminară de documentare a obiectului textil arheologic prin determinarea materiei prime, a coloranților, determinarea parametrilor structurali ai fibrelor, firelor și și țesăturii, și în final stabilirea tehnicii prin care a fost obținut produsul textil finit. Etapa de documentare tehnică este însoțită de documentarea fotografică pentru tot obiectul istoric și pentru componentele sale. La finalul acestor pași se poate realiza reconstrucția virtuală a obiectului (Cybulska, 2010).

Existența unui anumit tip de microclimat în spațiile de depozitare sau de expoziție poate favoriza dezvoltarea unor specii de microorganism, baterii și fungi. Sunt cunoscute efectele procesului de biodeteriorare pe care acestea îl determină, și care duc până la degradrarea structurii chimice a fibrelor textile (Allsopp, 2007; Capodicasa și colab., 2010; Cappitelli și colab., 2010; Eggins și Oxley, 1980).

Pornind de la prevederile unui standard național în domeniu, UNI 10829, o echipă de cercetători italieni a analizat condiții termo-higrometrice și calitatea aerului pe o perioadă de 5 ani în muzee. Ei au demostrat că acestea se pot modifica considerabil pe parcursul unui an, și au recomandat monitorizarea constantă a condițiilor climatice din interiorul și exteriorul spațiilor expoziționale (La Gennusa și colab., 2005).

În procesul de restaurare a materialelor textile istorice s-a studiat folosirea unor polimeri, de tipul mono și poliacrilaților cu rolul de a consolida textilele istorice deteriorate. Avantajele utilizării polimerilor au constat în creșterea rezistenței textilelor istorice la agenții chmici și biologici (Cocca și colab., 2006; Princi și colab., 2005; Princi și colab., 2006).

2.2 Biodeteriorarea bunurilor textile de Patrimoniu Cultural

In ultimele decenii se recunoaște impactul biodeteriorării realizate de microorganisme asupra bunurilor culturale de patrimoniu (López-Miras și colab., 2013; Michaelsen și colab., 2009; Piñar și colab., 2004; Piñar și colab., 2013; Piñar și colab., 2015b; Piñar și colab., 2015c; Pinzari și colab., 2010; Pinzari și colab., 2011; Rakotonirainy și colab., 2007; Schabereiter-Gurtner și colab., 2001b; Sterflinger și colab., 2010; Urzi și colab., 2000).

Pe de o parte se recunoaște caracterul ubicuitar al microorganismelor, și în același timp acțiunea lor defavorabilă în situația unor accidente ocazionale, precum inundarea spațiilor muzeale, sau în cazul nerespectării unor condiții de temperatură și umiditate specifice (Capodicasa și colab., 2010; Pinheiro și colab., 2013).

Prezența și dezvoltarea microorganismelor pe suporturi variate este influențată de factori precum umiditatea atmosferică, conținutul de apă al materialului, dat de valoarea indicelui aw (activitatea apei), compoziția chimică a substratului, pH-ul, lumina (Cappitelli și colab., 2010; Michaelsen și colab., 2006; Piñar și colab., 2013) sau de formarea unor microclimate în spațiile de depozitare (Micheluz și colab., 2014; Montanari și colab., 2012).

Încercări privind aplicarea unor metode privind prevenirea contaminării și deteriorării fungice a obiectelor arhivate, datează de sute de ani (Michaelsen și colab., 2009).

Biocontaminarea fungică este investigată pe întreaga gamă de bunuri de patrimoniu, cuprinzând:

– materiale organice preum hârtia, lemnul, textilele, pielea, pergamentul, colecțiile botanice, etc. (Michaelsen și colab., 2009; Montanari și colab., 2012; Piñar și colab., 2011; Piñar și colab., 2015a; Piñar și colab., 2015b; Piñar și colab., 2015c; Pinheiro și colab., 2013; Pinzari și colab., 2010; Pinzari și colab., 2011; Rakotonirainy și colab., 2007; Pangallo și colab., 2010),

– materiale anorganice precum piatra, marmura, sticla, metalul, pigmenții (Gurtner și colab., 2000; Jroudi și colab., 2015; López-Miras și colab., 2012; López-Miras și colab., 2013; Piñar și colab., 2001; Piñar și colab., 2004; Piñar și colab., 2013; Portillo și colab., 2008; Schabereiter-Gurtner și colab., 2001a; Schabereiter-Gurtner și colab., 2001b; Sert și Sterflinger, 2010).

Biodeteriorarea este un fenomen complex, care cuprinde procese de natură fizică, chimică, biochimică și biologică.

O primă etapă în investigarea acestui fenomen este identificarea speciilor microbiene prezente pe suprafața bunurilor de patrimoniu. Pentru realizarea acestei etape este necesară aplicarea unor metode optime, minim invazive pentru izolarea microorganismelor.

În unele cercetări s-a realizat reproducerea artificială a contaminării microbiene, pentru înțelegerea mecanismelor care stau la baza biodeteriorării. Astfel, s-au inoculat tulpini de bacterii și fungi pe pânze pictate folosind materialele tradiționale și îmbătrânite artificial, aceste picturi fiind denumite mock paintings (Capodicasa și colab., 2010; López-Miras și colab., 2013). Aceast tip de cercetare s-a realizat și pentru bunurile de patrimoniu pe suport de hârtie (Michaelsen și colab., 2006) sau pentru materiale folosite în restaurare, precum adezvii (Capodicasa și colab., 2010).

Una din tehnicile de analiză folosite pentru analiza efectului indus de dezvoltarea tulpinilor microbiene inoculate in vitro pe materiale textile este spectroscopia în infraroșu (FTIR) (López-Miras și colab., 2013).

Microorganismele pot produce și elimina în atmosferă compuși organici volatili (COV) si prin analiza lor, se poate stabili gradul de încărcare microbiană a aerului din muzee și din praful depus pe suprafețele din muzeu (Cappitelli și colab., 2010; López-Miras și colab., 2012; Micheluz și colab., 2014; Piñar și colab., 2015c).

Aplicarea tehnicilor moleculare pentru studiul microorganismelor biodeteriogene a fost inițiată acum aproximativ două decenii. Dezvoltarea metodologiei și rezultatele obținute au adus în atenție diferite aspecte ale acestui demers științific. S-a observat că se obțin rezultate complementare prin cultivarea probelor prin tehnci clasice și moleculare, majoritatea cercetătorilor preferând azi o metodologie care să cuprindă ambele tipuri de tehnici.

Prelevarea probelor este o etapă distinctă și importantă, și care poate genera o imagine reală sau falsă asupra gradului de contaminare, întrucât pot exista hife prezente dar neactive (Michaelsen și colab., 2009; Michaelsen și colab., 2006). S-au observat diferențe privind coloniile rezultate prin prelevarea cu tampoane sterile uscate și tampoane sterile umede, imersate în mediu bulion (Michaelsen și colab., 2009). O alternativă a metodelor de cultivare folosite pentru identificarea unor specii de fungi este hibridizarea in situ folosind probe LNA (locked nucleic acid) (Montone, 2009).

Etapele analizei moleculare în sistematica fungilor sunt definite astfel (Hyde și colab., 2013; Lindahl și colab., 2013):

a) stabilirea ipotezei ce va fi testată;

b) stabilirea unei baze de date a tulpinilor microfungice de interes și prelevarea microfungilor;

c) selectarea genei marker, a primerilor și stabilirea protocolului de laborator;

d) controlul calității secvenței genice;

e) analiza filogenetică.

Folosirea complementară a tehnicilor clasice și moleculare pentru identificaarea microbiotei care biodeteriorează bunurile textile de Patrimoniu Cultural, suplinește anumite limitări date de utilizare strictă a tehnicilor clasice. Acestea din urmă nu asigură întotdeauna izolarea microorganismelor de pe diferite tipuri de substraturi (Cappitelli și colab., 2010; Michaelsen și colab., 2010; Schabereiter-Gurtneret și colab., 2001b).

În prezent mulți autori folosesc o strategie moleculară dublă: identificarea comunităților microbiene cu ajutorul metodelor dependente de cultivare și concomitent folosirea unor metode independente de cultivare (López-Miras și colab., 2012; López-Miras și colab., 2013; Montanari și colab., 2012).

Această strategie moleculară dublă este folosită de López-Miras și colab., care au investigat procesul de biodeteriorare al unei picturi în ulei pe pânză (Cristo de la Paciencia, sec. XVII-XVIII), aflată în mânăstirea San Antón (Granada, Spania). Autorii au prelevat probe cu tampoane uscate și prin raclare cu cuțit steril, de pe fața și reversul picturii, din aer și direct de pe zonele contaminate. O parte din probe a fost cultivată, pentru obținerea de cuturi pure, iar o altă a fost supusă direct extracției ADN. Studiul a relevat că analiza prin ambele tipuri de metode oferă informații complementare care au oferit o imagine mai bună privind fenomenul biodeteriorării (López-Miras și colab., 2012).

2.2.1 Agenți biodeteriogeni ai bunurilor textile de Patrimoniu Cultural

Allsopp și colab. au definit patru tipuri ale procesului de biodeteriorare (Allsopp și colab., 2004):

Biodeteriorarea fizică, care se produce atunci când materialele prezintă deteriorări mecanice ca urmare a dezvoltării directe a organismelor, fără însă ca acestea să consume materialele respective.

Biodeteriorarea estetică, care apare ca urmare a prezenței diferitelor organisme, în stare vie sau moartă, a excrețiilor cât și a produselor de metabolism la suprafața unui material. Materialul își păstrează funcționalitatea structurală însă se modifică aspectul său general.

Biodeteriorarea (bio)chimică ca urmare a procesului de asimilație se produce atunci când organismele utilizează materialul drept hrană. Această formă este cea mai intens studiată.

Biodeteriorarea (bio)chimică ca urmare a unui proces de dezasimilație, care constă în prezența pe suprafața materialului a produșilor secundari de metabolism care pot desfigura sau deteriora materialul.

Speciile de microfungi pot induce în principal apariția ultimelor trei tipuri de procese biodeteriogene.

Speciile de microfungi identificate prin tehnici moleculare, izolate de pe suprafața unei picturi în ulei pe pânză, au aparținut următoarelor genuri (López-Miras și colab., 2012):

– Penicillium, Eurotium, Emericella (ordinul Eurotiales);

– Candida și Pichia (ordinul Saccharomycetales);

-Ulocladium și Alternaria (ordinul Pleosporales).

Pe manuscrise vechi au fost identificate specii din genurile Aspergillus (A. versicolor, A. nidulans), Emericella (teleomorfa lui A. nidulans), Mucor, Trichoderma, Cladosporium (C. cladosporioides, C. herbarum), Penicillium (P. pinophilum), și speciile Botryotinia fuckeliana, Epicoccum nigrum, Debaryomyces hansenii, Rhyzopus oryzae (Michaelsen și., 2009).

Pe un manuscris din secolul XIII, Michaelsen și colab., au identificat speciile Aspergillus terreus, Aureobasidium pullulans, Penicillium pinophilum, Aspergillus versicolor, Eorotium halophilicum., Aspergillus penicilloides, Wallemia sebi, Rhodotorula aurantiaca ((Michaelsen și colab., 2010).

Pe piele și pânză, materiale constituente ale legăturilor unor cărți vechi și pe hârtia din manuscrise s-a identificat specia Eurotium halophilicum care este o specie xerofilă, cu toleranță ridicată la stresul dat de absența apei (Montanari și colab., 2012; Piñar și colab., 2015b). Alte genuri identificate pe bunuri textile au fost Acremonium, Nectria, Phialophora și Devrisia toate genuri cu activitate celulozolitică.

Într-un studiu privind contaminarea microfungică a bunurilor culturale textile din fibre naturale din câteva muzee, dintre care și Muzeul Etnografic Sloven, și instituții religioase din Slovenia s-au identificat genurile Penicillium, Aspergillus și Cladosporium ca genuri predominante în biodeteriorarea textilelor de Patrimoniu Cultural. Aspergillus și Penicillium sunt genuri xerofilice și pot degrada substraturile celulozice și keratinice chiar și în condiții de umiditate scăzută (Kavkler și colab., 2015b; Błyskal, 2009)

În deteriorarea picturilor din Japonia au fost identificate genurile Alternaria, Cladosporium, Fusarium, Aspergillus, Trichoderma și Penicillium (Inoue și Koyano, 1991).

Într-un studiu privind microbiota de pe suprafețe și din aer, din muzee și arhive în Polonia, cele mai frecvente specii întâlnite au aparținut genurilor Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Alternaria, Mucor, Rhizopus, Trichoderma. Dintre acestea specia Aspergillus fumigatus a fost diagnosticată cu potențial toxicologic (Gutarowska și colab., 2012).

Tot de pe substraturi celulozice din componența documentelor istorice din arhive și biblioteci cel mai frecvent izolate au fost specii ale genurilor Cladosporium, Penicillium și Aspergillus, urmate de genurile Alternaria, Botrytis, Chaetomium, Chromelosporium, Epicoccum, Phlebiopsys and Toxicocladosporium (Mesquita și colab. 2009). În studiul realizat privind biodeteriorarea documentelor de arhivă, Cladosporium cladosporioides și Penicillium chrysogenum au fost singurele speciile prezente pe toate tipurile de suporturi celulozice (Mesquita și colab. 2009).

Într-un studiu privind biodeteriorarea bunurilor culturale textile din fibre naturale din Muzeul Egiptean și Muzeul Coptic din Egipt, s-a observat aceeași predominanță a genurilor Aspergillus (14 specii) și Penicillium (10 specii) (Abdel-Karem, 2010). Autorul a identificat și specii ale genurilor Chaetomium, Alternaria, și Trichoderma. Ca specii predominate au fost Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum și Penicillium citrinum (Abdel-Karem, 2010).

2.2.2 Metabolismul microbian/microfungic

Procesul de biodeteriorare microfungică este realizat prin intermediul aparatului enzimatic, format din enzime extracelulare și intracelulare sintetizate în momentul colonizării unui substrat. Pentru degradarea substratului celulozic enzimele sintetizate de fungi aparțin sistemul celulazic, alcătuit din trei tipuri de enzime principale: endoglucanaze, celobiohidrolaze și β-glucozidaze. Mecanismele de reglare genetică a genelor care intervin în sinteza acestor enzime sunt complexe, iar expresia lor este regalată la nivel transcripțional și pare a fi condiționată de compoziția nutritivă a substratului colonizat și degradat (Gielkens și colab.,1990).

Microfungii au nutriție heterotrofă și preferă mediile bogate în substanțe organice. Ca surse de carbon pot folosi glucidele, alcoolii și acizii organici iar ca surse de azot folosesc proteinele și uneori săruri de amoniu și nitrați (Popa și colab, 2001). Condițiile de dezvoltare optimă sunt reprezentate de umiditate ridicată și pH-ul de 5-6. Au capacitatea de a se dezvolta la intervale diferite de temperatură, prezintă un optim de dezvoltare la 22-320C, dar prezintă creștere și la 5-100C sau 30-400C. În urma metabolismului complex pe care îl dețin sintetizează a gamă largă de substanțe precum polizaharide, lipide, acizi organici, pigmenți, substanțe antibiotice (Popa și colab, 2001) .

Evoluția unei culturi microfungice cuprinde cele 3 etapele principale: faza inițială de lag, în care are loc germinarea sporilor sau regenerarea hifelor rupte; faza de creștere liniară, caracterizată prin dezvoltarea coloniei circulare apărute pe mediul de cultură; faza de învechire, caracterizată prin încetinirea vitezei de creștere (Popa și colab, 2001).

Preluarea substanțelor din mediu se realizează atât prin transport pasiv sau activ, iar reacțiile decurg cu un consum minim de energie. Înțelegerea metabolismului microfungic este importantă pentru dezvoltarea unor metode biologice de remediere a biodeteriorării bunurilor textile de Patrimoniu.

Există două căi principale metabolice și anume:

1. Calea reacțiilor catabolice, care conduce la biodegradarea substratului, și se produce cu eliberarea de energie (reacții exergonice);

2. Calea reacțiilor anabolice, prin care se realizează biosinteza diferitelor substanțe, și care implică un consum energetic (reacții endergonice).

Substanțele nutritive rezultate în urma biodegradării substratului sunt transportate din mediu în interiorul celulei prin mecanisme celulare fundamentale precum difuzia pasivă și transportul mediat de transportori. Acesta din urmă este reprezentat de mai multe tipuri: difuzia facilitată, transportul activ și translocarea de grup. Structura celulară care mediază aceste mecanisme este reprezentată de membrana plasmatică cu rol de barieră osmotică, și permite transportul selectiv al substanțelor din exterior spre interiorul celulei. Membrana plasmatică are rolul de a menține echilibrul ionic la suprafața celulei și în celulă de a asigura o concentrație ridicată de macromolecule și ioni (Lazăr, 2003).

Procesul de difuzie pasivă a substanțelor care traversează membrana plasmatică se realizează fără consum energetic. Acest proces se produce ca urmare a gradientului de concentrație care există la limita dintre membrană și mediul exterior. Substanțele transportate prin acest mecanism sunt H2O, CO2, O2, acizi grași și substanțe liposolubile.

În procesul de transport activ, mediat de transportori intervine o proteină cu funcție de transportor (carrier). Proteina carrier prezintă un situs specific pentru legarea substanței transportată, pe care astfel o transportă transmembranar în citosol. Acest mecanism de transport se poate produce mediat de gradientul de concentrație, și atunci nu se consumă energie, și acesta este cazul difuziei facilitate. Dar se poate produce și împotriva unui gradient de concentrație, și atunci reacțiile se produc prin consum energetic și definesc mecanismul de transport activ. Prin translocarea de grup, are loc simultan modificarea chimică, ireversibilă a moleculei transportate, proces care facilitează transportul transmembranar și protejează substanța față de mecanismele celulare de degradare.

Biodeteriorarea substratului organic reprezentat de fibrele naturale se realizează în principal prin procese catabolice, prin care celulele de microfungi degradează nutrienții și își asigură energia necesară pentru funcționarea celorlalte căi metabolice și altor activități fiziologice (Moore și colab., 2011).

Căile catabolice au loc în 3 faze succesive:

1. Faza de descompunere enzimatică a macromoleculelor în unități de bază: proteinele sunt descompuse în aminoacizi, lipidele în acizi grași și glicerol, glucidele sunt degradate până la di și monoglucide. Enzimele care intervin în această etapă sunt preponderent exoenzime.

2. Degradarea incompletă a substanțelor rezultate în prima etapă. Se obține CO2 și H2O, dar și o clasă de compuși care au rol esențial în metabolismul celular, cunoscuți ca intermediari metabolici ai căilor metabolice centrale.

3. În faza a treia, are loc fie degradarea finală a compușilor la CO2 și H2O prin intermediul ciclului Krebs care reprezintă calea majoră de desfășurare și eliberare de energie pentru microorganismle aerobe. Fie se produce procesul de fermentație (alcoolică, lactică, butirică, propionică etc.), în cazul organismelor anaerobe sau supuse deprivării de O2 molecular (Lazăr, 2003; Lazăr, 2004).

CAP.3 COLECȚIA DE TEXTILE ETNOGRAFICE A MUZEULUI NAȚIONAL AL ȚĂRANULUI ROMÂN

3.1 Descrierea colecției

Colecția de textile etnografice a Muzeului Național al Țăranului Român are o însemnătate deosebită atât prin numărul mare de piese care o alcătuiesc, cât și prin faptul că acestea reflectă toate zonele etnografice ale României. Diversitatea tipologică a pieselor textile și diversitatea materialelor din care au fost confecționate oferă posibilitatea conturării unei imagini clare privind amploarea folosirii în trecut a cânepii și inului pe întregul teritoriu al României și constituie o sursă pentru studiul caracteristicilor structurale și microbiologice ale diferitelor tipuri de țesături din fire de in și cânepă.

Cele trei colecții din cadrul muzeului în care sunt grupate piesele textile etnografice, în funcție de tipologie sunt colecțiile Port popular, Scoarțe și Textile de interior.

În colecția Port popular sunt incluse cămăși femeiești și bărbătești, poale de cămăși, pantaloni, haine din blană și dimie, piese de vestimentație care acoperă poalele femeiești – catrințe, fote, vâlnice – , acoperitori de cap pentru femei și bărbați, podoabe și accesorii, piese de recuzită și piese de încălțăminte.

Colecția de Textile de interior cuprinde obiecte de patrimoniu cu funcție mai ales utilitară folosite în același timp și ca decor al locuinței și ca recuzită rituală așa cum sunt ștergarele (cele mai numeroase piese din colecție) și, pe lângă acestea, așternuturi, fețe de pernă, fețe de masă, foi de culme, năframe, saci și valuri de pânză.

Cea de-a treia colecție Colecția Scoarțe, grupează țesături groase care acoperă pereții locuinței țărănești și lavițele – scoarțe, păretare, lăicere, covoare de culme, grindare –, țesături destinate să acopere patul – velințe, pături, țoluri, cergi, cuverturi, lepedee și țesături de uz gospodăresc (Giurescu și Roșu, 2004).

Cele trei colecții care însumează în total un număr de 29844 piese de patrimoniu, 3322 de piese au în compoziție fibre de in și cânepă, astfel: Textile de interior – 2203 piese, Port popular – 578 piese și Scoarțe – 541 piese (fig.1).

Fig. 1. Segmentarea colecției de referință.

Cele 2203 piese, reprezentând un procent de 28% din întreaga colecție de Textile de interior, prezintă o tipologie diversă, ștergarele fiind cel mai bine reprezentat tip categorial (31% din totalul pieselor selectate), urmat de fețele de pernă, așternuturi, fețe de masă, batiste, broderii și în mai mică măsură țesături de uz gospodăresc (saci, storuri, învelitori, valuri de pânză).

Între cele 578 de obiecte selecționate din colecția Port Popular se regăsesc atât piese de bază ale costumului popular (cămăși, pantaloni, poale) cât și piese complementare (acoperitori de cap, brâie, piese de deasupra) și obiecte de recuzită, cu rol ceremonial, cum sunt năframele de mire și traistele.

Din colecția Scoarțe, în care sunt încadrate textilele groase, realizate în majoritate din lână, unde cânepa și inul se regăsesc în majoritatea cazurilor în urzeala țesăturilor, au fost selecționate pentru studiu piese care acoperă pereții și lavițele locuinței țărănești (scoarțe, păretare, lăicere, covoare de culme, grindare), piese care acoperă patul (velințe, pături, țoluri, cergi, cuverturi, lepedee), fețe de pernă, fețe de masă și țesături de uz gospodăresc.

Bunurile textile care conțin fibre de cânepă și in se impart în opt categorii principale: piese de costum, piese de recuzită, ștergare, piese care acoperă pereții, piese care acoperă patul, fețe de pernă și fețe de masă, broderii și piese de uz gospodăresc (fig. 2).

Fig. 2. Segmentarea colecției de referință după criteriul tipologic.

Alcătuind una dintre cele mai vaste, bogate și unitare categorii de țesături populare românești, cele 1013 ștergare, reprezintă 31% din piesele selecționate. Fețele de pernă și fețele de masă sunt și ele foarte bine reprezentate, 895 de piese, reprezentând 27 % din total. Pe locurile următoare se situează piesele de costum, 392 de piese, reprezentând 12% și textilele care acoperă pereții (11%).

În cadrul pieselor de bază ale costumului popular ponderea cea mai mare o au cămășile (256 piese), urmate de poale (31 piese) și pantaloni (27 piese). Cele mai numerose sunt cămășile femeiești, dominante și în totalul pieselor colecției Port Popular. Din aceeași colecție, piesele complementare ale costumului popular reprezentate de acoperitori de cap (cepse care au ca material suport pânza de cânepă), brâie și piese de deasupra la costumul femeiesc sunt în număr de 78.

În cadrul celor 229 de piese destinate să acopere patul, reprezentând 7% din totalul pieselor selecționate se regăsesc atât piese realizate în întregime din pânză de cânepă (lepedee, fețe de saltea, învelitori) cât și piese din lână cu urzelă de cânepă (velințe, pături, cuverturi).

Cele 186 de piese de recuzită, sunt batiste, năframe de mire și traiste. În mai mică măsură sunt reprezentate broderiile (3%) și piesele de uz gospodăresc (2%) grupând saci, țesături, valuri de pânză și storuri.

Criteriul geografic a urmărit segmentarea colecției de referință în funcție de regiunea istorică de proveniență a pieselor selecționate (fig.3). 1566 dintre acestea, reprezentând 47% din total, provin din Transilvania fiind în cea mai mare parte ștergare.

În decorarea interiorului locuințelor transilvănene țesăturile din cânepă, bumbac și in au ponderea cea mai mare spre deosebire de Moldova, Dobrogea, Muntenia și Oltenia unde centrul de greutate în decorarea interiorului cade asupra țesăturilor din lână, de aceea textilele de interior realizate din in și cânepă sunt în aceste zone mai slab reprezentate.

Din Maramureș provin 601 piese, reprezentând 18% din obiectele selecționate, în această zonă cânepa și inul fiind folosite în trecut atât pentru realizarea textilelor de interior (lepedee, fețe de pernă și fețe de masă, ștergare) cât și pentru piesele de port. 336 de piese, reprezentând 10%, sunt din Moldova. Pe locurile următoare se situează Bucovina (207 piese) și Banatul (198 piese) cu un procent de 6% și Crisana (151 piese reprezentând 5%). Mai slab reprezentate sunt Oltenia (110 piese reprezentând 4%), Muntenia (105 piese reprezentând 3%), Basarabia și Dobrogea.

Fig. 3. Segmentarea colecției de referință după criteriul geografic.

Din punct de vedere al compoziției numai o mică parte dintre piesele de patrimoniu sunt realizate dintr-un singur tip de fibră: 248 de piese lucrate numai din cânepă, reprezentând un procent de 7% și 110 piese numai din in reprezentând 3% din total. Marea majoritate sunt însă realizate din cânepă sau in în combinație cu lâna, bumbacul sau părul de capră (fig. 4 și fig. 5).

Fig. 4. Segmentarea colecției de referință după criteriul amestecului de fibre.

Piesele realizate numai din in sunt în totalitate textile de interior: ștergare de perete și batiste care provin din Moldova și Muntenia (Gheorghiu și Mateoniu, 2012).

Țesăturile realizate numai din cânepă provin în mare majoritate din Transilvania și Moldova, și doar câteva din Crișana și Banat. Ca tipologie ele sunt piese utilizate în organizarea interiorului locuinței țărănești, care acoperă patul și pereții, având atât rol funcțional cât și decorativ: lepedee, lăicere, păretare, velințe, ștergare. Pe lângă acestea mai sunt saci pentru transportul diferitelor produse și piese de port popular (pantaloni și cămăși) (Gheorghiu și Mateoniu, 2012).

Cea mai des întâlnită combinație a inului este cea cu bumbacul. Ștergarele din pânză de in, decorate fie prin alesătură în război, fie brodate cu fir de bumbac numără 501 piese. La acestea se adaugă 55 de cămăși femeiești și bărbătești, care împreună cu ștergarele reprezintă 91% dintre obiectele realizate din in în combinație cu bumbac.

Inul în combinație cu cânepa este prezent la textilele de interior (ștergare din pânză de cânepă decorate cu alesătură sau broderie din bumbac) și la cămășile cu poale (unde stanul este realizat din in, iar poalele din pânză de cânepă), 40 de piese, reprezentând 7% din total. Pentru alte 12 piese selecționate, pânza a fost realizată cu urzeală din bumbac și băteală din in, iar pentru decor a fost folosită lâna.

Fig. 5. Repartizarea pieselor realizate din cânepă în combinație cu alte tipuri de fibre.

Cânepa se regăsește atât în urzeala cât și în băteala țesăturilor, alături de bumbac și de lână folosite pentru mai ales pentru decor. Cămășile realizate din pânză țesută cu urzela din cânepă și băteala din bumbac sau pentru care bumbacul a fost folosit doar pentru decor, traistele și ștergarele din țesătură cu urzeala din cânepă și băteala din cânepă și bumbac constituie cea mai numeroasă categorie, reprezentând 67% din totalul pieselor realizate din combinații de cânepă cu bumbac (Roșu, 2011).

Atunci când o regăsim în combinație cu lâna, cânepa este folosită aproape exclusiv pentru urzeală, firele din cânepă, mai rezistente și mai groase, constituind suportul pentru țeserea scoarțelor, păretarelor, lăicerelor, velințelor și a fețelor de pernă din zona Olteniei, Munteniei și Moldovei. Fețele de pernă au adesea dosul țesut numai din cânepă, iar decorul de pe față ales cu lână.

O categorie aparte o constituie acoperitorile de cap, cepsele, în care pânza din cânepă este folosită ca suport, decorul fiind realizat cu lână și uneori cu mărgele și paiete.

Pentru decorarea țesăturilor din cânepă, în combinație cu lâna a mai fost folosit și bumbacul. Există de asemenea câteva piese groase, țesute din păr de capră pe urzeală din cânepă.

3.2 Noțiuni privind structura diferitelor tipuri de fibre naturale celulozice și keratinice

3.2.1 Fibrele de cânepă și in

Fibrele de cânepă și in sunt cunoscute în industria textilă sub denumirea de fibre liberiene. Denumirea provine de la țesutul liber din tulpina plantelor de cânepă și in, în care se regăsesc fascicule de fibre.

Din punct de vedere tehnic, există trei clase de fibre liberiene (Dodu, 2002):

Fibre moi sau fine, din care face parte și fibra de in. Aceste fibre sunt folosite pentru obținerea țesăturilor fine;

Fibre aspre, în care este inclusă cânepa. Aceste fibre au o mai mare rigidiate, datorită conținutului ridicat de lignină și sunt folosite pentru obținerea de țesături mai groase (fig. 6);

Fire foare aspre, puternic lignificate și cu o rigidiate crescută. Astfel de fibre sunt fibrele de manisa, sisal și cocos. Din ele se obțin textile tehnice precum sforile, curele de transmisie etc.

Fig. 6. Fibra de cânepă (20x). Se observă internodiile groase specifice fibrei de cânepă.

Fibrele liberiene au structură pluricelulară, și se formează în timpul perioadei de vegetație, fiind sub forma unor fascicole în tulpina plantelor.

În fig. 7 este prezentată o secțiune transversală printr-o tulpină liberiană. Se observă delimitarea celor trei zone caracteristice: A- coaja, B-zona lemnoasă, C- măduva. Coaja, la rândul ei, este formată din coaja primară (a) și țesutul liberian (b), în care se află fibrele textile (Dodu, 2002).

Țesuturile vegetale care intră în structura cojii primare sunt epiderma (1), colenchimul (2), parenchimul cojii primare (3) și endoderma (4). Epiderma are rol protector și favorizează schimburile de gaze și apă. Colenchimul este constituit din celuloză și are rol în a asigura rezistența mecanică și stabilitatea tulpinii. Țesutul parenchimatic are funcție de asimilare, prezentând celule cu pereți celulari subțiri. Endodermul separă coaja primară (a) de țesutul liberian (b).

În țesutul liberian se găsesc celule parenchimatice (5), care conțin fascicolele de fibre primare (fp), așa cum este la tulpina de in. La planta de cânepă, se identifică o structură suplimentară reprezentată de parenchimul secundar (6), în care se află alte fascicole fibroase numite fibre secundare (fs) (Dodu, 2002).

Aceste fibre secundare au o calitate tehnică inferioară față de cele primare. Partea liberiană este separată de partea lemnoasă (B), prin cambiu, un țesut cu rol de regenerare celulară. Țesutul lemnos (xilemul) (B) este format din vase conducătoare de apă și celule lignificate, care formează parenchimul lemnos (8). În partea centrală, se află celulule mari cu pereții subțiri, care dispar la sfârșitul perioadei de vegetație, formând măduva sau lumenul (c).

Fibra tehnică liberiană este formată din următoarele componente (fig. 8): lamela mediană, care conține hemiceluloză, lignină, substanțe pectice, ceruri, pigmenți, taninuri; peretele primar (1) și peretele secundar (2), lumenul și peretele terțiar (3) (Dodu, 2002).

Fig. 8. Aspect transversal al cimentării fascicolului de in:

1 – perete primar; 2 – perete secundar; 3 – lumen; 4 – perete terțiar;
5 – lamelă mediană. (după Dodu, 2002).

Caracteristicile fizico-mecanice și chimice ale fibrelor liberiene, cât și în general ale fibrelor textile naturale, vegetale sau animale sunt rezultanta caracteristicilor celulelor din stuctura lor, precum forma, dimensiunea, regiunea tulpinii din care sunt extrase, clasele de substanțe din care sunt formate, cât și metodele folosite pentru separarea fibrelor de tulpini (Dodu, 2002). S-au observat diferențe între fibrele liberiene care prezintă o cantitate mai mare de lignină în lamela mediană, întrucât lignina conferă rigiditate fibrei, ceea ce condcue la creșterea rezistenței dar și la dificultăți în prelucrarea tehnologică.

3.2.2 Fibra de lână

Fibra de lână este constituită din trei straturi diferite:

Stratul cuticular sau solzos,

Stratul cortical sau cortexul,

Stratul medular sau măduva.

Modul în care variază proporțiile celor trei straturi se corelează cu calitatea și sorturile diferite de lână. Astfel, prezența stratului cortical în procente de circa 90%, determină formarea unei fibre de lână de calitate superioară. Pe măsură ce scade procentul cortexului în fibra de lână se obțin calități inferioare ale acesteia (Dodu, 2002).

Componenta chimică preponderentă în toate cele trei straturi este reprezentată de cheratină.

La nivelul stratului cuticular, exterior, de protecție, se regăsesc celule aplatizate, lamelare, de formă poligonală, și dispuse unele peste altele spre vârful fibrei. Aceste celule dau forma caracteristică, solzoasă a fibrei de lână (fig. 9). Aceste structuri solzoase constituie criterii de diferențiere între sorturile de lână care provin de la aceeași specie, dar și între fibrele de lână care provin de la specii diferite. De exemplu, la lâna fină (merinos), solzii sunt mari și 1–2 solzi se pot dispune pe întreaga circumferință a fibrei, în timp ce la lâna groasă (țurcană), solzii sunt mici, cu formă neregulată și mai numeroși (Dodu, 2002).

Elementele structurale ale stratului cuticular sunt: epicuticula, exocuticula si endocuticula.

Fig. 9. Imagine electronomicroscopică a fibrei de lână. Se observă stratul cuticular format din celule aplatizate, cu orientare spre vârful fibrei.

Epicuticula are rol de protecție, conferă caracter hidrofob, și are natură proteică. Exocuticula aflată sub epicuticulă are o structură microfibrilară. Ea conține numeroase legături disulfidice. Endocuticula este caracterizată printr-un conținut scăzut de sulf. Între stratul cuticular și cortex se află membrana intercelulară, cu o structură amorfă și o grosime de 0,3 m (Dodu, 2002).

Cea mai importantă componentă din structura fibrei de lână este stratul cortical. Caracteristicile celulelor constituente conferă proprietățile fizico-mecanice și chimice ale lânii. Ele sunt de formă poliedrică, cu vârfurile ascuțite și cu dimensiuni de 80–110 m în lungime și 1,2 până la 2,6 m, în grosime. Există două tipuri de celule care conferă proprietățile de bază ale cortexului și anume celulele paracorticale și ortocorticale (Dodu, 2002).

Paracortexul este bogat în sulf, fiind format din celule de formă hexagonală în care se regăsesc aminoacizi cu caracter bazic. Conținutul de aminoacizi din cheratina componentelor constituente ale fibrei de lână este variabil. Astfel, în tabelul 1 este prezentată distribuția procentuală a diferitelor tipuri de aminoacizi în straturile cortical și cuticular (Dodu, 2002).

Tabelul 1. Compoziția de aminoacizi a componentelor morfologice ale lânii (%) (după Dodu, 2002)

În stratul medular se regăsesc celule de dimensiuni mari și pereți subțiri, prezența lui în proporție mai mare conferind o rezistență scăzută fibrelor de lână.

3.3 Elemente de tehnologie textilă tradițională

În gospodăria tradițională românească se prelucrau până la începutul secolului XX

fibrele textile liberiene, cânepa și inul și fibrele de lână. Din aceste fibre se produceau toate materialele textile necesare pentru îmbrăcăminte, casă și desfășurarea muncilor zilnice (Pamfile, 1910).

Fibra de in era folosită pentru confecționarea cămășilor bărbătești (Maramureș), a poalelor cămășilor de femeie (Apuseni, Moldova), la țeserea lepedeelor, ștergarelor, a șervetelor de uz gospodăresc sau decorativ (Zaharia, 2008).

O pierdere a tradițiilor meșteșugărești de producere și prelucrare a materialelor textile în gospodăriile sătești a intervenit în a doua jumătate a secolului trecut și ca urmare a apariției fibrelor chimice (Zaharia, 2008).

Obținerea fibrelor textile se realiza, în cadrul gospodăriei țărănești, prin operații care necesitau timp, pricepere și răbdare, de corectitudinea realizării acestor operații depinzând calitatea finală a fibrelor, rezistența, culoarea și finețea acestora (Marinescu, 1975; Suciu, 2011).

Prelucrarea fibrelor de cânepă cuprindeau câteva etape principale (Suciu, 2011):

1. Însămânțarea cânepii, primăvara după topirea zăpezii;

2. Recoltarea cânepii în luna august, la atingerea maturității. Plantele erau smulse, unite în mănunchiuri și apoi lăsate să se usuce.

2. Urma operația de topire (fig. 10), când snopii se puneau în apă timp de două săptămâni. Apoi se limpezeau și se puneau la uscat în fiecare gospodărie, pe lângă garduri.

Fig.10 Topitul cânepii

(Arhiva fotografică a Muzeului Țăranului Român).

Operația de topire a plantelor liberiene este de fapt un proces de descompunere a substanțelor pectice sub acțiunea exoenzimelor sintetizate de bacterii și ciuperci.

Mecanismul procesului de descompunere a substanțelor pectice din fibrele liberiene este următorul (Dodu, 2002 ):

are loc transformarea protopectinei în pectină sub acțiunea protopectinazelelor;

pectazele transformă pectina în acid pectic și zaharuri;

acidul pectic este în final descompus până la alcool metilic, acetonă etc.

protopectina în pectină, iar altele,

Zaharurile rezultate în urma procesului enzimatic sunt folosite de bacterii și fungi pentru nevoile lor nutritive. În timpul nutriției, bacteriile descompun zaharurile în acizi, dioxid de carbon, hidrogen și apă. Reacțiile de descompunere a zaharurilor sunt exoterme și produsul principal de fermentație este acidul butiric, întreg procesul încadrându-se în categoria fermentațiilor butirice (Dodu, 2002).

3. După operația de topire se realiza operația de melițare cu ajutorul meliței (fig.11). Melițarea permitea îndepărtarea părții lemnoase de pe tulpinile de cânepă sau in astfel încât fibrele să se poată extrage cu ușurință.

4.Urma operația de pieptănare în urma căreia se obțineau fibre de diferite calități: fibra lungă

care constituia fuiorul, fibra pentru urzeală, mai scurtă și aspră și câlții.

5. Fibra din fuior se torcea subțire și se folosea pentru obținerea cămășilor bărbătești. Fibra mai groasă se folosea, ca fir de urzeală, sau pentru obținerea sacilor și pantalonilor de vară.

6. Pentru obținerea unor fire mai moi sau pentru albirea lor, se realiza curățarea fie a firelor de cânepă fie a țesăturii, prin două metode: fierberea în leșie, care este o soluție bazică obținută din cenușă vegetală sau prin expunerea la soare, alternată cu udarea materialelor (Suciu, 2011; Marinescu, 1975).

Fig. 11. Melițarea cânepii

(Arhiva fotografică a Muzeului Țăranului Român).

7. Ultima etapă o reprezenta țeserea pânzei în războiul tradițional (fig.12)

Firele și pânza de cânepă se puteau și vopsi și în general se foloseau elemente vegetale (frunze, fructe, coji) din care se obțineau coloranți naturali. În Transilvania singurele culori ale fibrelor de cânepă vopsite tradițional au fost galbenul și negrul (Zaharia, 2008).

Ansamblul de instrumentele necesare pentru prelucrarea și confecționarea tradițională a țesăturilor erau: dăracul cu piepteni, furca și fusul, vârtelnița, sucala, uneori mașina de tors, războiul vertical sau orizontal, și erau realizate din esențe lemnoase moi .

Războaiele de țesut tradiționale românești erau executate în general din lemn foarte uscat de stejar, prun, salcam sau alte esențe tari, ca cel ilustrat în fotografiile de mai jos de la Muzeul Țăranului Român din București.

Fig. 12. Război tradițional românesc. Stânga: imagine generală. Dreapta: detaliu spată și ițe

(Muzeul Țăranului Român).

Conform schiței (fig.13), un război de țesut este alcătuit din următoarele componente principale: cadru, sul de urzeală, ițe cu cocleți, vătala cu spata, suveica, sulul de țesătura și pedale.

Operațiile care au avut un efect revoluționar privind obținerea de materiale textile au fost răsucirea fibrelor (torsul) și țeserea firelor (http://www.ecomunitate.ro/blog /studiu_ privind_prelucrarea_materialelor_textile_in_gospodaria_taranului_din_candesti;Mâlcomete, 1975).

Țesutul a fost pentru multă vreme unul din meșteșugurile importante care se realizau în gospodărie. Țeserea obiectelor pentru uzul casnic și a hainelor se efectua de regulă iarna, și participau și femeile și bărbații (Suciu, 2011).

Fig. 13. Structura unui război tradițional românesc.

Acest meșteșug necesita cunoștiințe tehnice din partea celui care îl practica. Operațiile preliminare ale țeserii în războiul tradițional erau urzirea firelor și năvădirea. Țeserea cuprindea etapele: formarea rostului între firele de urzeală, inserarea suveicii cu firul de bătătură, tasarea țesăturii cu ajutorul spatei, tensionarea firelor de urzeală prin mecanismele de tensionare, eliberarea țesăturii obținute. Aceste operații se repetau pănă la realizarea în întregime a țesăturii.

PARTEA A-II-A. CONTRIBUȚII ORIGINALE PRIVIND AGENȚII MICROFUNGICI CU POTENȚIAL BIODETERIOGEN IZOLAȚI DIN MUZEUL NAȚIONAL AL ȚĂRANULUI ROMÂN

Biodeteriorarea este unul din principalii factorii care pot induce modificări ireversibile în structura fibrelor naturale din bunurile textile de Patrimoniu Cultural. Microorganismele, și în special microfungii sunt implicate în biodegradarea substraturilor biopolimerice celulozice și keratinice. Efectul lor este cu atât mai degradativ cu cât în ambient există condiții de temperatură și umiditate și surse nutritive favorabile dezvoltării lor.

SCOPUL ȘI OBIECTIVELE LUCRĂRII

În România, cercetarea efectului biodeteriorării asupra bunurilor textile de Patrimoniu Cultural este încă la început deși în numeroase muzee din țară, case memoriale etc. există colecții valoroase de textile culturale, și în special textilele etnografice din regiuni diferite ale țării. Astfel, scopul acestei teze a fost studiul microfungilor cu efect de biodeteriorare a obiectelor textile de Patrimoniu Cultural din cadrul Muzeului Național al Țăranului Român, București, care deține o valoroasă colecție de bunuri textile etnografice. Obiectivele prin care s-a realizat acest scop au fost:

Obiectivul 1: Izolarea, caracterizarea fenotipică și a potențialului biodegradativ a tulpinilor de microfungi izolate de pe suprafața unor bunuri textile de Patrimoniu Cultural și din aerul din incintele Muzeului Național al Țăranului Român. S-au efectuat patru runde de prelevări: în octombrie 2015, februarie 2016, mai 2016 și iunie 2016. In fiecare rundă odată cu prelevările micologice s-au monitorizat și temperatura și umiditatea relativă a aerului.

Obiectivul 2: Studiul microfungilor izolați din ambientul MNȚR și bunuri culturale textile, printr-un ansamblu de metode moleculare, cu ajutorul cărora să se realizeze identificarea la nivel de specie, și să se analizeze comparativ secvențele specie-specifice, ca și diversitatea genotipică intraspecifică a tulpinilor identificate.

Obiectivul 3: Reproducerea în condiții controlate de laborator a procesului de biodeteriorare microfungică al unor tipuri de materiale textile din fibre naturale, similare cu bunurile culturale textile din colecția etnografică a MNȚR, de către tulpini selectate și evaluarea efectului de biodeteriorare prin metode fizico-mecanice, spectroscopice, microscopice și electronomicroscopice.

CAP.4 IZOLAREA ȘI CARACTERIZAREA FENOTIPICĂ A MICROBIOTEI FUNGICE MUZEALE

Procesul biodeteriorării este inițiat de microorganisme în anumite condiții fizico-chimice și ecologice – prezența unor surse nutritive accesibile metabolismului microbian. În cazul bunurilor culturale, gradul și metodele de conservare folosite de-a lungul timpului pot acționa suplimentar ca factori favorizanți ai colonizării microbiene/microfungice.

În această lucrare investigarea procesului de biodeteriorare a bunurilor textile de Patrimoniu Cultural din cadrul MNȚR s-a realizat prin studiul tulpinilor de microfungi izolate din aer și de pe suprafața unor bunuri etnografice din fibre naturale (cânepă, in, bumbac, lână). Este de presupus că aeromicrobiota din muzeu poate să joace un rol major în gradul de colonizare al suprafețelor textile. În condițiile unor valori ale temperaturii și umidității propice dezvoltării microfungice, gradul de contaminare a bunurilor textile poate crește considerabil. Astfel, determinarea gradului de încărcare microfungică a aeromicrobiotei din muzeu este importantă atât pentru elaborarea metodelor optime de conservare preventivă și curativă cât și pentru înțelegerea riscului pentru sănătate pentru personalul din muzeu.

Obiectivul acestui capitol a fost izolarea, caracterizarea fenotipică și a potențialului biodegradativ a tulpinilor de microfungi izolate de pe suprafața unor bunuri textile de Patrimoniu Cultural și din aerul din incintele Muzeului Național al Țăranului Român. S-au efectuat patru runde de prelevări: în octombrie 2015, februarie 2016, mai 2016 și iunie 2016. In fiecare rundă odată cu prelevările micologice s-au monitorizat și temperatura și umiditatea relativă a aerului.

Pentru realizarea obiectivului propus s-au efectuat următoarele etape:

1. Prelevarea prin tehnici specifice a microbiotei fungice de pe suprafața unor bunuri textile etnografice și din ambientul muzeal.

2. Obținerea de culturi pure din tulpinile de microfungi prelevate.

3. Definirea caracteristicilor fenotipice ale tulpinilor izolate și identificarea genurilor predominante pe bunurile textile și în aeromicrobiotă.

4. Stabilirea și aplicarea unei metodologii pentru determinarea potențialului biodeteriogen al microfungilor prin testarea calitativă și cantitativă a activității enzimatice celulazice.

4.1 Materiale și metode

Medii de cultură

– Sabouraud Dextrose Agar (Biolife, 4020052), mediu deshidratat având compoziția: petonă din cazeină 5 g/L, petonă din carne 5g/L, glucoză 40 g/L, agar 15 g/L. Se suspendă 65 g pulbere în 1000 mL apă rece distilată, se încălzește până la fierbere sub agitare. Se sterilizează prin autoclavare la 1210C timp de 15 min, pH 5.6. ± 0,2.

– Mediu cu cartof : Potato Dextrose Agar (Merck, 110130), mediu deshidratat având compoziția: infuzie din cartof 4g/L, D-glucoză 20g/L, agar 15g/L. Se suspendă 39 g pulbere la 1000 mL apă ultrapură. Sterilizare la 1210C timp de 15 min. pH 5.4 – 5,8.

– Mediu cu cartof : Potato Glucose Agar (Merck, 146726), mediu în plăci de 90 mm sterile, având compoziția: extract din cartof 4 g/L, glucoză 20g/L, agar 17g/L. pH 5.4 – 5,8.

– Mediu Sabouraud cu dextroză – Sabouraud Dextrose Agar (SDA) (Biomérieux, 43555), mediu în plăci de 90 mm, sterile, având compoziția: peptonă din cazeină 5 g, peptonă din carne (bovină sau porcină) 5 g, dextroză 40 g, agar 15 g, apă purificată până la un 1 L, pH 5.6.

– Mediu Sabouraud cu cloramfenicol – Gélose Sabouraud Glucosée Chloramphénicol (SDC) (Biomérieux, 43596), mediu în plăci de 90 mm, sterile, având compoziția: peptonă din cazeină 5 g, peptonă din carne (bovină sau porcină) 5 g, glucoză 40 g, cloramfenicol 0,05 g, agar 15 g, apă purificată până la 1 L, pH 5.6.

– Mediu Sabouraud bulion – Sabouraud liquid broth (SAB B-T) (Biomérieux, 42108), mediu lichid în tuburi de 9 ml, sterile, având compoziția: peptonă din cazeină (bovină) 5g, peptonă din carne (bovină sau procină) 5g, dextroză 20 g, apă purificată până la 1 L., pH 5,7.

– Mediu Sabouraud geloză – Sabouraud 2 agar (SAB2-T) (Biomérieux, 42037), mediu în plăci de 90 mm, sterile, având compoziția: peptone din cazeină (bovină) 5g, peptonă din gelatină (bovină sau porcină) 5 g, dextroză 20 g, agar 15 g, apă purificată până la 1 L, pH 6,1.

– Mediu Sabouraud geloză – Sabouraud 2 agar (SAB2-D) (Biomérieux, 51020), mediu deshidratat cu compoziția: cazeină din peptonă (bovină) 5g/L, peptonă din gelatină (bovină sau porcină) 5 g, dextroză 20 g, agar 15 g, apă purificată până la 1 L, pH 6,2.

– Agar cu extract de malț (Malt Extract Agar) (Sanimed, 20189), mediu în plăci de 90 mm sterile, având compoziția: extract de malț 30g/L, peptonă micologică 5g/L, maltoză 12,75 g/L, dextrină 2,75 g/L, agar 15g/L, pH 5,0 ± 0,2.

– Mediu Czapek-Dox (Czapek-Dox Agar) (Sanimed, 22739), mediu în plăci de 90 mm, sterile, având compoziția: zaharoză 30g/L, azotat de sodiu 2,00 g/L, fosfat bipotasic 1,00 g/L, sulfat de magneziu 0,50 g/L, clorură de potasiu 0,50 g/L, sulfat feros 0,01 g/L, agar bacteriologic 15g/L, pH 7,3 ± 0,2.

– Mediu cu extract de drojdie – ReadyTube™ 100 Yeast Extract Agar ISO (Merck, 146352), mediu steril în flacoane de 100 ml, cu următoarea compoziție: triptonă 6g/L, extract de drojdie 3g/L, agar 15g/L, pH 7,2 ± 0,2. Mediul a fost încălzit pe baie de apă la 1000C și apoi turnat în plăci Petri sterile.

– Agar pentru microbiologie (Sigma-Aldrich, 05039), pulbere, pH 6-7,5 după autoclavare.

– Mediu cu carboximetilceluloză 0,2%: Carboximetilceluloză (Sigma-Aldrich, 21902) 2g, azotat de sodiu (Consors, 14.37.0) 2g, fosfat monopotasic (Consors, 14.76.0) 0,7g, fosfat dipotasic (Consors, 14.76.11) 0,3g, clorură de potasiu (Consors, 14.77.0) 0,5g, sulfat de magneziu hepathidratat (Consors, 14.70.0) 0,5g, sulfat feros (Consors, 14.28.0) 0,01g, apă purificată până la 1000 ml. Mediul se sterilizează la 1210C timp de 15 minute.

– Mediu cu celuloză 0,2%: Celuloză (Sigma-Aldrich, 435236) 2g, azotat de sodiu (Consors, 14.37.0) 2g, fosfat monopotasic (Consors, 14.76.0) 0,7g, fosfat dipotasic (Consors, 14.76.11 ) 0,3g, clorură de potasiu (Consors, 14.77.0) 0,5g, sulfat de magneziu hepathidratat (Consors, 14.70.0) 0,5g, sulfat feros (Consors, 14.28.0) 0,01g, apă purificată până la 1000 ml. Mediul se sterilizează la 1210C timp de 15 minute.

Reactivi

– Carboximetilceluloză sub formă de săruri de sodiu (Sigma-Aldrich, 21902-250g), vâscozitate medie, pH 6.5-8.0 (10 mg/mL in H2O), grad de substituție 0.60-0.90.

– D-(+)-Celobioză, 22150 (Flucka).

– Celuloză microcristalină, pulbere (cotton linters) (Sigma-Aldrich, 435236-250g), dimensiunea particulelor 51 µ, pH 5-7 (11wt %), cu regiuni amorfe hidrolizate evidențiind microfibrile cristaline.

– Roșu de Congo (Sigma-Aldrich, Congo Red C6767-100g), pulbere, masa moleculară 696,66 g/mol.

– Clorură de sodiu (Consors, 31.56.0), masa moleculară 58,44 g/mol.

– Soluție de albastru-cotton lactofenol (Sigma-Aldrich, 61335-100 ml), densitate 1,16 g/ml la 200C, având compoziția pentru 100 ml soluție apoasă: albastru cotton 50 mg, fenol 25 g, L(+)-acid lactic 25g, glicerol 50g.

– Acid 3,5-dinitrosalicilic (D0550-10g, Sigma-Aldrich).

Materiale

Hârtie de filtru calitativă Whatman nr.1., 125 mm diametru. Număr de catalog Z24, 009-5 (Aldrich).

4.1.1 Metodă pentru monitorizarea parametrilor fizici ai ambientului muzeal

Temperatura și umiditatea relativă a aerului au fost monitorizate în depozite și în sălile de expoziții permanente cu ajutorul termohigrometrului digital Mannix, model SAM 990DW (Cole-Palmer) și înregistrate în Fișa pentru temperatură și umiditate anexată lucrării (Anexa A1).

În depozitele MNȚR în care sunt păstrate colecțiile etnografice de Patrimoniu Cultural, au fost efectuate măsurători ale temperaturii și umidității atmosferice în trei puncte de prelevare:

1. La intrarea în camera depozit;

2. Între rafturile sistemului de depozitare;

3. În zona din spate a camerei depozit.

Depozitele în care s-a monitorizat temperatura și umiditatea au fost:

– Camera 105, în care sunt păstrate scoarțele românești;

– Camera 106, în care sunt păstrate textilele de interior;

– Camera 202, în care se află bunurile textile de port subțire;

– Camera 202, în care se află bunurile textile de port gros;

– Camera 204, cu bunuri textile de port gros;

– Camera 205, cu bunuri textile de port gros;

– Camera 206, în care sunt depozitate diverse bunuri de patrimoniu, textile și non textile, cu valoare etnografică.

În sălile cu expoziții permanente ale MNȚR, deschise publicului larg, au fost făcute măsurători ale temperaturii și umidității atmosferice în fiecare componentă a spațiului muzeal expozițional, astfel:

1) Parter, în sălile: Fast, Frumusețe, Reculegere, Moaște, Ferestre, Pomul cu cruci, Troiță, Icoane (prima încăpere), Școala satului.

2) Etaj 1, în sălile: Triumf (partea stângă a sălii), Locuirea, Casă în casă, Hrană, Triumf (partea dreaptă a sălii), Sală costume, Moara, Laolaltă.

4.1.2 Metode pentru prelevarea speciilor de microfungi din ambientul muzeal

4.1.2.1 Metodă pentru prelevarea speciilor de fungi de pe suprafața bunurilor textile de Patrimoniu Cultural

Prelevarea probelor microfungice de pe suprafața bunurilor textile de Patrimoniu Cultural a fost realizată sub coordonarea și supravegherea specialiștilor din cadrul Muzeului Național al Țăranului Român și respectând normele și principiile care ghidează activitatea de conservare și restaurare desfășurată în muzeu.

Pentru prelevarea microbiotei au fost selectate diferite bunuri culturale textile etnografice, luându-se în considerare criterii precum: tipul de fibră din compoziția materialului, gradul de conservare a bunului cultural, eventuale pete sau murdărie prezente.

La prelevarea microbiotei s-au folosit tampoane sterile și medii de cultură solide și lichide.

Lista bunurilor textile de Patrimoniu Cultural de pe suprafața cărora s-au izolat tulpini microfungice este redată în tabelul 2, iar imagini din timpul prelevărilor sunt redate în fig. 14.

Fig.14. Aspecte din timpul prelevării microbiotei de pe suprafața bunurilor culturale. Stânga: T 13018 Cămașă femeiască cu poale; dreapta sus: Ti7467 Val de ștergere; dreapta jos: T 6814 Cămașă femeiască

Tabel 2. Bunuri culturale textile de pe suprafața cărora au fost efectuate prelevări ale microbiotei microfungice.

4.1.2.2 Metodă pentru prelevarea speciilor de fungi din aeromicrobiota muzeală

Încărcătura microfungică din aer s-a prelevat din camerele depozit ale colecțiilor de bunuri textile etnografice și din sălile cu expoziții permanente.

În depozite încărcătura microfungică s-a prelevat în trei puncte astfel:

1. La intrarea în camera depozit;

2. Între rafturile sistemului de depozitare (fig. 15);

3. În zona din spate a camerei depozit.

Camerele depozit de unde s-au efectuat prelevări ale aeromicrobiotei sunt prezentate în tabelul 3.

Tabel 3. Camerele depozit de unde s-a efectuat prelevarea aeromicrobiotei.

A doua zonă a MNȚR, de unde s-a realizat prelevarea aeromicrobiotei a fost cea a sălilor cu expoziții permanente, deschise publicului larg. Sălile expoziționale sunt dispuse pe două nivele, parter și etajul 1.

Prelevarea încărcăturii microfungice din aer s-a efectuat în următoarele săli: Fast, Frumusețe, Reculegere, Moaște, Ferestre, Pomul cu cruci, Troiță, Icoane, Școala Satului, săli situate la parter. La etajul superior au fost efectuate prelevări ale aeromicrobiotei în sălile: Triumf, Locuirea, Casă în casă, Hrană, Sală costume, Moara, Laolaltă.

Fig. 15. Camera 105 ”Scoarțe”. Sistemul de depozitare cu rafturi. Zonă de prelevare a aeromicrobiotei (Imagine MNȚR).

Prelevările aeromicrobiotei microfungice au fost realizate prin metoda dinamică cu ajutorul unui prelevator portabil de particule SAMPL´AIRTM (Biomérieux) (fig. 16.). Acesta realizează aspirarea unui volum de aer prestabilit, pentru o anumită durată de timp. Aerul aspirat parcurge porii capacului metalic și se impregnează în mediul de cultură al unei plăci Petri cu diametrul de 90 mm.

Pentru prelevările aeromicrobiotei efectuate în depozite și în sălile cu expoziții permanente s-au folosit următoarele condiții de prelevare dinamică:

– volumul de aer aspirat 100 L/ min pentru prelevările efectuate în rundele 1 si 2,

– volumul de aer aspirat 200mL/ 2 min pentru prelevările efectuate în rundele 3 si 4.

Între prelevările succesive efectuate capacul prelevatorului a fost igienizat cu soluție etanolică 70%.

Fig. 16. Prelevatorul portabil folosit pentru prelevarea aeromicrobiotei.

4.1.3 Etapele identificării tulpinilor fungice izolate de pe suprafața bunurilor textile și din aeromicrobiota muzeală

4.1.3.1 Examinarea caracterelor de cultură și colonie

Vasele Petri cu probele prelevate de pe suprafața bunurilor textile de patrimoniu și din aeromicrobiotă au fost transportate în laborator și incubate la 280C±20C timp de 14-21 de zile. Ulterior, fiecare colonie de microfungi dezvoltată pe o placă Petri s-a transferat individual pe o nouă placă cu mediu de cultură și incubată în aceleași condiții. Tulpinile microfungice în cultură pură obținute au fost păstrate la frigider la 40C, pentru caracterizarea fenotipică.

Caracteristicile de creștere și utilizarea diferitelor surse de hrană au fost analizate prin cultivarea tulpinilor izolate pe patru medii de creștere: mediu cu cartof, mediu Czapek-Dox, mediu cu extract de malț și mediu cu extract de drojdie. S-au efectuat observații macroscopice ale dezvoltării coloniilor acestor izolate la intervalele de 3, 10 și 14 zile până la atingerea fazei de platou.

Examinarea suprafeței coloniilor a fost realizată cu ajutorul stereomicroscopului Stereo Discovery.V8 (Carl Zeiss), prevăzut cu cameră video digitală color pentru microscopie AxioCam ICc1 și softul AxioVision (Carl Zeiss) pentru achiziția și analiza imaginilor.

4.1.3.2 Examenul microscopic al microfungilor pe preparate proaspete

Caracteristicile structurilor reproductive ale tulpinilor de microfungi izolate au fost evidențiate pe preparate proaspete, prin colorație cu albastru-cotton lactofenol. Observațiile microscopice au fost realizate la microscopul optic de cercetare AxioImager A2 (Carl Zeiss), prevăzut cu camera profesională digitală color pentru microscopie AxioCam MRc și soft pentru achiziția și analiza imaginilor ZEN Imaging 2012 (Carl Zeiss).

Etapele parcurse pentru observarea structurilor vegetative și reproductive microfungice au fost:

1. Tulpinile au fost crescute pe mediu cu cartof sau mediu Czapek-Dox timp de 14 zile, până la formarea structurilor miceliene;

2. Cu ajutorul ansei s-a prelevat o mică porțiune dintr-o colonie izolată de mucegai și s-a plasat pe o lamă de microscop, într-o picătură de albastru-cotton lactofenol;

3. Peste lamă s-a așezat o lamelă și s-a tasat ușor pentru a etala mai bine structurile miceliene;

4. S-au efectuat observații microscopice cu obiectivele de 10x, 20x și 40x;

5. S-au captat imaginile care au redat cu claritate structurile specifice genului și speciei.

4.1.3.3 Evaluarea calitativă și cantitativă a proprietăților biodegradative ale tulpinilor microfungice izolate

A. Metoda calitativă de evidențiere a capacității de biodegradare a celulozei

Roșu de Congo are proprietatea de a interacționa cu polizaharidele care conțin lanțuri de unități D-glucopiranozil (β-1,4) linkate, cu β-(1,3)-D-glucani și posibil cu galactomani hemicelulozici (Teather șiWood, 1982). Testul cu Roșu de Congo este un test fenotipic pentru identificarea rapidă a activității celulozolitice.

Pentru a stabili metoda optimă de evaluare calitativă a capacității de degradare a celulozei, s-au testat două tipuri de medii: un mediu cu celuloză microcristalină 0,2% și un mediu cu carboximetilceluloză (CMC) 0,2%.

Mod de lucru:

1. S-au obținut culturi proaspete ale tulpinilor izolate în cultură pură pe mediu solid.

2. Cu ajutorul ansei s-a preluat o porțiune dintr-o colonie proaspătă, și s-a inoculat într-un mediu cu carboximetilceluloză 0,2% sau celuloză microcristalină 0,2%. S-au incubat plăcile la 28 ± 2 0C timp de 72 de ore.

3. După incubare plăcile s-au inundat cu Roșu de Congo 0,1% și s-a lăsat un timp de reacție de 30 de minute.

4. Pentru realizarea defixării, s-a folosit soluție NaCl 1M, timp de 60 de minute.

5. S-au observat plăcile Petri pe care era prezentă o zonă de hidroliză în jurul coloniilor. S-a măsurat și s-a calculat diamentrul zonei de hidroliză cu relația (1):

H=D-d/2, (1)

H= diametrul zonei de hidroliză în jurul coloniei microfungice;

D= diametrul total al zonei de hidroliză și al coloniei microfungice;

d= diametrul coloniei,

B. Metoda cantitativă de evidențiere a capacității de biodegradare a celulozei

Celuloza este un homopolimer al glucozei și reprezintă cel mai abundent polizaharid întâlnit în biomasa vegetală. Celuloza este insolubilă, cristalină, însă foarte rezistentă la hidroliza enzimatică. Un sistem celulazic care conduce prin hidroliză la rupererea legăturilor intramoleculare și degradarea celulozei până la glucoză constă în trei componente enzimatice majore:

I. endo-β-glucanază;

II. exo-β-glucanază;

III. β-glucozidază.

Pentru identificarea unei metode de determinare cantitativă a activității sistemului celulazic microfungic s-a dezvoltat o metodologie, folosind preparatul enzimatic comercial Cellulosoft, care conține celulaze de la Trichoderma viridae.

Mod de lucru:

1. Obținerea curbei etalon

Pentru a determina cantitatea de glucoză eliberată de un volum de enzimă, primul pas l-a constituit obținerea unei curbe etalon, construită din concentrații cu cantități cunoscute și crescătoare de glucoză. S-au folosit 10 concentrații diferite de glucoză de la 0,1% la 1% (fig. 17). Peste soluțiile de glucoză s-a adăugat apă deionizată până la un volum final de 2,2 ml conform tabelului 4.

Pentru obținerea curbei etalon în testarea enzimatică s-au urmat pașii:

1) în 10 recipiente s-au adăugat volumele stabilite de soluție de glucoză și apă deionizată;

2) în fiecare recipient s-a adaugă 3 ml de reactiv DNS;

3) s-a termostatat la temperatura de fierbere, timp de 15 min;

4) recipienții s-au lăsat să se răcească la temperatura camerei;

5) s-a determinat absorbanța soluțiilor la lungimea de undă de 640 nm.

Tabelul 4. Soluțiile de glucoză folosite la obținerea curbei etalon.

Fig. 17. Soluții de glucoză cu concentrații între 0,1% – 1%, folosite la obținerea curbei etalon

în testarea cantitativă a activității sistemului celulazic.

I. Determinarea activității endoglucanazei celulazice

Principiu

Metoda determinării activității endoglucanazei a constat în cuantificarea cantității de zaharuri reducătoare eliberate de un volum de enzimă per unitatea de timp din hârtia de filtru Whatman 1.

Mod de lucru

1. 500 mg de hârtie filtru Whatman nr. 1 a fost tăiată mărunt și imersată în soluție tampon Na2HPO4 0,2 N – acid citric 0,1 N, pH 4,8;

2. S-a adăugat 1 ml din preparatul enzimatic Cellulosoft;

3. Amestecul a fost incubat la temperatura de 500C, timp de 1 oră;

4. După incubare s-a adaugat 3 ml de reactiv DNS;

5. Enzima este inactivată prin incubarea în baie de apă la temperatura de fierbere timp de 15 minute;

6. După menținerea în baia de apă, proba a fost răcită la temperatura camerei și apoi s-a determinat absorbanța la lungimea de undă de 640 nm;

7. Proba martor s-a obținut prin respectarea aceluiași protocol ca și pentru proba de analizat, însă fără realizarea pasului 3, incubarea la temperatura de 500C.

II Determinarea activității enzimatice a exoglucanazei celulazice

Principiu

Metoda se bazează pe dozarea grupărilor reducătoare eliberate de enzimă din substrat, de data aceasta, carboximetilceluloza (CMC), cu reactiv dinitrosalicilic.

Mod de lucru

1. 1 ml de soluție de carboximetilceluloză 1 % a fost imersat într-un ml de soluție tampon Na2HPO4 0,2 N – acid citric 0,1 0,1 N pH 6,4;

2. S-au adăugat 0,2 ml (200 μl) din preparatul enzimatic Cellulosoft;

3. S-a incubat la temperatura de 500 C, timp de 10 min;

4. după incubare s-au adăgat 3 ml de reactiv DNS și s-a imersat în baie de apă, la temperatura de 1000C, timp de 15 minute;

5. Proba a fost răcită la temperatura camerei, și s-a determinat absorbanța la lungimea de undă de 640 nm;

6. Proba martor s-a obținut prin respectarea aceluiași protocol ca și pentru proba de analizat, însă fără realizarea pasului 3.

II.3 Determinarea activității celobiazei (beta-glicozidază)

Principiu:

Metoda se bazează pe dozarea cantității de glucoză rezultată din acțiunea celobiazei (β – glucozidazei) asupra substratului reprezentat de celobioză.

Mod de lucru:

1. 1 ml de soluție celobioză 0,1 % a fost adăgat la 1 ml de soluție tampon Na2HPO4 0,2 N – acid citric 0,1 N;

2. S-au adăugat 0,2 ml (200 μl) din preparatul enzimatic Cellulosoft;

3. S-a incubat la temperatura de 500C, timp de 20 de minute amestecul de reacție obținut;

4. După incubare s-au adăugat 3 ml de reactiv DNS;

5. S-a realizat inactivarea enzimei și stoparea reacției prin fierberea amestecului pe baie de apă, la temperatura de 1000C, timp de15 minute;

6. Proba a fost lăsată să se răcească la temperatura camerei și s-a determinat absorbanța la 7. 7. Proba martor s-a obținut prin respectarea aceluiași protocol ca și pentru proba de analizat, însă fără realizarea pasului 3.

4.2 Rezultate și discuții

4.2.1 Rezultatele monitorizării parametrilor fizici ai ambientului muzeal

Au fost monitorizate valorile temperaturii și umidității relative în depozitele cu colecții textile de Patrimoniu Cultural și în sălile de expoziții permanente deschise publicului, din cadrul MNȚR. Monitorizarea s-a efectuat pe parcursul a 4 runde de prelevare, desfășurate între octombrie 2015 și iunie 2016, cuprinzând toate anotimpurile specifice climatului temperat din țara noastră.

În depozite prelevările parametrilor fizici ambientali s-au realizat în trei puncte: la intrarea în depozit, între rafturile sistemului de depozitare și în spatele camerei. Rezultatele obținute arată că pentru temperatură nu există diferențe între valorile înregistrate în cele trei puncte. Pentru umididate, în anumite camere s-au înregistrat mici variații ale umidității relative de 1% – 2% (tabelul 5 și tabelul 6).

Tabelul 5. Valori ale temperaturii (0C) înregistrate pe parcursul celor patru runde de prelevare în depozitele cu textile de Patrimoniu.

*p1- punct de prelevare la intrarea în camera depozit; p2-punct de prelevare între rândurile sistemului de depozitare; p3-punct de prelevare în spatele camerei depozit.

Tabelul 6. Valori ale umidității relative (%) înregistrate pe parcursul celor patru runde de prelevare în depozitele cu textile de Patrimoniu.

*p1- punct de prelevare la intrarea în camera depozit; p2-punct de prelevare între rândurile sistemului de depozitare; p3-punct de prelevare în spatele camerei depozit.

În depozite temperatura înregistrată (0C) s-a situat în jurul valorii de 20 0C pentru primele trei runde de monitorizare, realizate în lunile octombrie, ianuarie și mai. Depășirea acestei valori s-a observat doar în luna iunie, când au fost înregistrate în toate camerele depozit în jur de 25 0C (fig. 18).

Umiditatea relativă a aerului în depozite (%) a prezentat o diferență semnificativă a valorilor înregistrate în runda a-2-a, față de rundele 1, 3 și 4. Runda a-2-a de prelevare s-a realizat în luna ianuarie, iar umiditatea înregistrată din depozite a avut valori situate între 20% – 30 %. În celelalate perioade umiditatea relativă s-a situat între 40 % și 50 % (fig. 19).

Luna ianuarie în care s-a efectuat a doua rundă de prelevare s-au înregistrat cele mai mici valori ale temperaturii și umidității relative în depozite, iar în runda a-4-a, desfășurată în iunie s-au obținut cele mai mari valori ale temperaturii și umidității relative din depozite.

Temperatura din sălile expoziționale a înregistrat valori cuprinse între 20 0C și 250, pe parcursul celor patru runde, din octombrie până în iunie. O variație a temperaturii, de 10C – 3 0C s-a observat între sălile de la parter și cele de la etajul 1, acestea din urmă prezentând valori mai mici ale temperaturii (fig. 20).

Fig. 18. Evoluția temperaturii (0C) pe parcursul celor patru runde de prelevare în camerele depozit.

Fig. 19. Evoluția umidității relative (%) pe parcursul celor patru runde de prelevare în camerele depozit.

În sălile cu expoziții s-a observat o mai clară diferență a valorilor umidității relative, între rundele de prelevare. Astfel, cele mai scăzute valori au fost înregistrate în runda a doua (ianuarie), similar cu depozitele, cu valori între 20 % – 30%. În prima rundă, desfășurată în octombrie, umidatea a fost între 30 % și 40 %. Valorile cele mai ridicate de umiditate, peste 50% au fost observate în luna iunie, în care s-a realizat a patra rundă de prelevare (fig. 21).

Fig. 20. Evoluția temperaturii (0C) pe parcursul celor patru runde de prelevare în sălile expoziționale.

Fig. 21. Evoluția umidității relative (%) pe parcursul celor patru runde de prelevare în salile expoziționale.

Cele mai scăzute valori ale umidității atât în săli cât și în depozite au fost înregistrate în runda a -2-a, efectuată în ianuarie, iar cele mai mari valori ale umidității pentru cele două tipuri de încăperi au fost înregistrate în luna iunie (runda a patra). Temperatura în depozite și săli a prezentat o mai mare omogenitate a valorilor în depozite și săli fiind cuprinsă în intervalul 20-25 0C.

În Codul ICOM pentru muzee se precizează că măsurile de conservare preventivă sunt un element esențial al activităților desfășurate în muzeu și că este importantă menținerea unui climat în care colecțiile să fie protejate, fie că sunt expuse permanent, temporar sau depozitate (http://icom.museum/the-vision/code-of-ethics/).

În Normele naționale de conservare și restaurare a bunurilor culturale mobile clasate se prevede ca un spațiu muzeal corespunzător să aibă o stabilitate microclimatică, în care umiditatea relativă trebuie să fie situată între 50% – 65 %, iar temperatura să fie corelată cu aceasta și să nu depășească 22 0C (Hotărâre nr. 1546/2003).

Importanța condițiilor climatice în muzee, pentru conservarea preventivă este subliniată și de Kramer și colab. Autorii au elaborat un algoritm de monitorizare și control a temperaturii și umidității relative din muzee și clădiri istorice, prin integrarea cerințelor ASHRAE pentru muzee și a condițiilor de confort termic pentru personal și vizitatori (Kramer și colab., 2017). ASHRAE (American Society of Heating and Air-Conditioning Engineers) a definit mai multe clase pentru climatul din muzee și clădiri culturale, care variază între un control strict, clasa AA, până la un control limitat (clasa D) (Kramer și colab., 2017).

Într-un alt studiu, aceiași autori arată relația dintre condițiile climatice din muzee și gradul de conservare a energiei întregului muzeu. Conceptul modern privind climatul din muzee, este că acesta cu cât este mai stabil, fără fluctuații zilnice sau sezoniere cu atât asigură o protecție de durată colecțiilor. Un astfel de concept a pus însă presiunea utilizării sistemelor de condiționare HVAC, așa cum este în Muzeul Herimatage din Amsterdam, care menține constant fără a exista influențe din ambientul extern, temperatura de 210C și umiditatea relativă de 50% (Kramer și colab., 2016; Leijonhufvud și Henning, 2014). Deși este universal cunoscut că degradarea mecanică apare la fluctuații ale umidității, relaxarea temperaturii și umidității poate conduce la economia energetică a clădirii, fără a conduce implicit la degradarea colecțiilor.

Degradarea biologică, cauzată de fungi apare la nivele ridicate ale umidității, dar acestea se pot dezvolta și în intervale diferite ale temperaturii (Kramer și colab., 2016; Martinez-Molina și colab., 2016). Favorizarea dezvoltării fungice la umiditate ridicată, peste 70%, asociată cu o temperatură ridicată și aer static este remarcată și de Pavlogeorgatos, care consideră umiditatea, poluarea atmosferică, temperatura, lumina și nivelul de zgomot ca principalii factori care duc la deteriorarea colecțiilor de Patrimoniu Cultural (Pavlogeorgatos, 2003).

Monitorizarea temperaturii și umidității este integrată alături de alți factori ambientali, în evaluarea riscului Patrimoniului Cultural la factorii de mediu (Andretta și colab., 2017). În urma datelor obținute după monitorizarea timp de un an a parametrilor termo-higrometrici într-o arhivă cu documente istorice datând din sec. 12, din Izmir, s-a evaluat riscul de degradare chimică, mecanică și biologică și s-au formulat măsuri de conservare preventivă în mai bune condiții a manuscriselor (Sahin și colab., 2017).

Temperatura și umiditatea relativă a aerului au fost folosiste pentru elaborarea unor modele de predicție a creșterii fungice în interiorul clădirilor precum: sistemul izoplet, modelul higrotermal sau indexul fungal (Vereecken și Roels, 2012).

Diferite instrumente de măsurare a temperaturii sau umidității au fost dezvoltate pentru clădiri istorice și muzee (Goli și colab. 2017). Utilizarea unui anumit echipament și metodele de măsurare a umidității relative sunt reglementate și printr-un standard european care conține recomandări pentru efectuarea în mod acurat a măsurătorilor condițiilor ambientale și a schimbului de umiditate între aer și bunurile culturale (EN 16242:2012).

Într-un alt standard elaborat de Comitetul tehnic CT346 din domeniul Patrimoniului Cultural, se consideră că obiectivul măsurilor de conservare preventivă este de a preveni fluctuațiile pe termen scurt atât pentru temperatură cât și pentru umiditate (EN 15757:2010).

Monitorizarea în regim continuu a condițiilor ambientale furnizează specialiștilor, – muzeografi, conservatori, curatori, restauratori, o cunoaștere precisă a condițiilor microclimatice în care operele de artă sunt păstrate (Corgnati și Fillippi, 2010).

Metodologia aplicată pentru obținerea datelor privind condițiile de temperatură și umiditate, cât și măsurile necesare de adoptat, trebuie adaptate tipului de climat general al zonei geografice unde este amplasat muzeul sau clădirea istorică (Silva și Henriques, 2014; Sciurpia și colab., 2015; Ferdyn-Grygierek, 2016; Krupinska și colab., 2013) și o bună monitorizare a ambientului din interiorul muzeelor ține cont și de condițiile ambientul extern (Andretta și colab., 2016).

Intr-un studiu privind efectul umidității și temperaturii asupra unui obiect cultural reprezentat de o mătase datând din perioada persană, Sharif a demonstrat că scăderea temperaturii medii permite un un nivel mai bun de conservare al acestui obiect (Sharif și Esmaeili, 2017).

4.2.2 Rezultatele determinărilor microbiologice din aeromicrobiotă

S-a stabilit densitatea de microfungi din aeromicrobiota sălilor expoziționale și depozitelor, după cele patru runde de prelevare desfășurate în lunile octombrie, ianuarie, mai și iunie. Relația de calcul folosită pentru stabilirea unităților formatoare de colonii (UFC) într-un metru cub de aer este relația (2).

N=nx1000/V (2)

Unde:

N, numărul de germeni (UFC) /m3 de aer

n, numărul de colonii dezvoltate pe suprafața mediului de cultură

1000, pentru raportarea la m3

V, volumul de aer aspirat (exprimat în dm3)

Valorile generale ale UFC obținute în depozite sunt cuprinse în intervalul 5-210 UFC/m3 iar pentru sălile de expoziții s-au obținut valori ale UFC cuprinse între 10–135 UFC/m3. S-au putut observa diferențe între valorile UFC obținute între punctele diferite de prelevare din depozite (intrarea în cameră, zona dintre rafturi și spatele camerei), pentru prelevările efectuate în ianuarie și mai și o omogenitate mai mare a valorilor UFC pentru prelevarea efectuată în luna iunie (runda a-4-a) (tabelul 7).

Tabel 7. Valorile încărcăturii microfungice din aer din camerele depozit (UFC/m3).

*în prima rundă s-a prelevat aeromicrobiota doar din primul punct de prelevare p1

În depozite, cea mai mare încărcătură microfungică s-a obținut în runda 1 (octombrie 2015), urmată de runda 3 de prelevare (mai 2016) (fig. 22). În aceste perioade, temperatura și umiditatea au avut valori similare, astfel temperatura a avut valori între între 18-200C iar umiditatea relativă a fost în jurul valorii de 40%. Valorile încărcăturii microfungice măsurată pe holul din fața camerelor depozit a depășit cu mult valorile UFC din depozite, fiind 260 UFC/m3 în runda 1, respectiv 185 0C în runda 3. Acest fapt demonstrează că există un impact semnificativ privind contaminarea microfungică determinată de microfungii din aeromicrobiotă și că depozitarea colecțiilor textile într-un spațiu strict controlat asigură o scădere a riscului biologic.

Fig. 22. Încărcătura microfungică prelevată din aer din depozitele MNȚR pe parcursul celor 4 runde de prelevare.

Valorile UFC/m3 obținute în sălile cu expoziții deschise publicului au fost în general mai mari decât cele din depozite, deși valoarea maximă a încărcăturii microbiene, de 210 UFC/m3 a fost observată într-una din camerele depozit. În urma prelevărilor efectuate în luna iunie s-au obținut cele mai mari valori ale UFC/m3 din sălile cu expoziții permanente, urmate de valorile UFC obținute în luna mai. În aceste runde, temperatura s-a situat între 20 – 25 0C, iar umiditatea relativă a avut cele mai mari valori, raportat la cele 4 runde de prelevare și s-a situat între 45-55% (fig. 23).

Dintre toate tipurile de medii folosite pentru prelevarea aeromicrobiotei (mediul cu cartof, SDA, SDAch), mediul cu cartof a permis obținerea celei mai mari diversități de fungi, cât și obținerea la prima rundă de realizare a culturilor pure a caracteristicilor fenotipice de cultură și colonie.

Fig. 23. Încărcătura microfungică prelevată din aer din sălile expoziționale din cadrul MNȚR

pe parcursul rundelor de prelevare.

Adams și colab. au realizat un studiu pentru a identifica criteriile ecologice și procesele care au un impact asupra structurii microbiomului din ambientul clădirilor civile. El arată diversitatea factorilor care influențează obținerea datelor, precum metodele și materialele folosite în prelevare, astfel că o statistică general valabilă pentru construcții diferite din regiuni diferite devine dificil de realizat (Adams și colab., 2015)

Alți autori au studiat contaminarea microbiană din aer și de pe suprafețe din mai multe muzee, arhive și biblioteci din Polonia și au identificat o densitate a microfungilor în aer variind între 80 UFC/m3 în două muzee, 490 și 560 UFC/m3 în arhive și biblioteci, până la o valoare maximă de 103/m3 într-un muzeu cu specific militar. Autorii au izolat 32 de specii de fungi, dintre care 4 specii de levuri, iar speciile de microfungi cel mai frecvent izolate din aer au fost: Aspergillus puulaaensis, Cladosporium cladosporioides, Penicillium crustosum, Rhizopus oryzae (Skóra și colab., 2015).

În trei arhive din Argentina s-au identificat densități diferite ale microfungilor în aer deși existau condiții termo-higrometrice similare: 120 UFC/m3, 1271 UFC/m3 și 7667 UFC/m3. Temperatura s-a situat în jurul valorii de 19 0C iar umiditatea relativă a fost de 50 % în toate cele trei arhive (Borrego și colab. 2012). În același studiu, încărcătura microfungică din aer din interiorul a două depozite ale Arhivei Naționale din Cuba a fost de 60 UFC/m3 respectiv 260 UFC/m3. Temperatura în aceste două depozite a fost de 24 0C și 280C, iar umiditatea de 52% și 65%. Genurile de microfungi predominante au fost Aspergillus și Penicillium. Alte specii izolate au aparținut genurilor Cladosporium, Curvularia, Alternaria, Fusarium, Scopulariopsis, Syncephalastrum (Borrego și colab. 2012).

Încărcătura microfungică ridicată, măsurată în zona din apropierea a două manuscrise vechi contaminate a arătat că microfungii din aer pot constitui un factor de risc pentru bunurile culturale (Polo și colab., 2017). Aeromicrobiota prelevată în două anotimpuri diferite, cu fluctuații ale parametrilor termo-higrometrici, a indicat prezența speciilor din genurile Aspergillus, Candida și Eurotium (Polo și colab., 2017).

S-a arătat că microfungii pot consitui un indicator pentru aprecierea calității aerului în clădiri. Ei expulzează spori, pot produce micotoxine sau compuși organici volatili care depreciază aerul și constituie risc pentru lucrătorii din spațiile afectate (Cabral, 2010; Nielsen, 2003).

Studiul calității aerului în Muzeul de Științe Naturale din La Plata, Argentina, prin două metode diferite, dinamică și statică, a dus la evidențierea unui grad ridicat de contaminare de 4401 spori/m3 și a 32135 particule inerte suspendate/m3 (Mallo și colab., 2017).

Într-un studiu privind aeromicrobiota din arhive, Cladosporium a prezentat cea mai mare densitate în aer, de 1227 UFC/m3 (Foladi și colab., 2013). Încărcătura microfungică din aerul depozitului Muzeului Național al Muzicii din Cuba, a evidențiat o densitate microfungică de 825 UFC/m3, atunci când prelevarea s-a realizat în luna iunie la temperatura de 280C și umiditatea de 78% și de 129 UFC/m3, atunci când prelevarea s-a efectuat în februarie, când temperatura a fost de 210C și umiditatea de 61% (Garcia, 2016). Genurile predominante identificate au fost Aspergillus, Penicillium și Cladosporium. Genul Cladosporium a fost mai frecvent în februarie, iar genul Aspergillus în iunie. De asemenea în ambele luni a fost identificat un procent de 12% de levuri (Garcia, 2016).

4.2.3 Rezultatele privind examinarea caracterelor de cultură și colonie

Prelevarea microfungilor din aeromicrobiotă și de pe suprafața bunurilor culturale s-a realizat în vase Petri de 90 mm cu mediu solid. În prima rundă de prelevare s-a folosit mediu cu cartof și mediu SDA realizate în laborator din medii deshidratate. În runda a doua s-a folosit mediu preparat în plăci sterile, SDA cu cloramfenicol (Biomerieux), iar în rundele 3 și 4 s-a folosit mediu SDA preparat în plăci sterile, fără antibiotic (Biomerieux).

După efectuarea prelevărilor, plăcile însămânțate au fost transportate în laborator unde au fost incubate la 280C, timp de 14 – 21 de zile (fig. 24). S-a observat că mediul cu cartof folosit în prima rundă a prelevat o varietate mai mare de fungi, inclusiv levuri și a permis formarea caracterelor de cultură de la prima incubare.

Din plăcile Petri cu consorțiul de microfungi prelevate, s-a izolat fiecare colonie în parte pe un nou mediu. Ca medii de izolare în cultură pură s-au folosit mediu gata preparat în plăci SDA (Biomerieux) și mediu cu cartof, PDA gata preparat în plăci sterile (Merck).

Aceași observație a putut fi obținută și în etapa de izolare, mediul cu cartof permițând o mai bună evidențiere a caracterelor de cultură și colonie. În același timp poate fi luată în considerare temperatura de incubare folosită în laborator pentru obținerea culturilor pure, aceasta fiind mult mai mare decât temperatura ambientului muzeal din care s-au efectuat prelevările. Pentru speciile aparținând genului Penicillium, numai al doilea pasaj, pe mediu PDA (Merck), după o prima izolare pe SDA a permis evidențierea caracterelor de cultură.

Fig. 24. Vase Petri cu aeromicrobiota microfungică colectată din sălile depozit și sălile expoziționale.

Rând 1, de la stânga la dreapta: vas Petri cu microfungi prelevați în runda 1, aspect avers și revers;

Rand 2, de la stânga la dreapta: vase Petri cu microfungi prelevați în rundele 3 și 4.

S-a observat o predominanță a speciilor de microfungi aparținând genului Penicillium, atât pentru tulpinile izolate din aeromicrobiotă, cât și de pe bunurile textile. Aspergillus niger a fost de asemenea izolat frecvent din aeromicrobiotă. În runda a-4-a în depozite s-au obținut un număr ridicat de izolate cu miceliu considerat steril. Cercetările moleculare efectuate aspura acestor izolate au arătat că ele aparțin unor specii de Basidiomicete.

În urma celor 4 runde în care s-au efectuat prelevări din aeromicrobiota MNȚR și de pe suprafața bunurilor textile etnografice s-au izolat 150 de tulpini de fungi. Dintre acestea 60 de tulpini au fost selectate pentru studiul caracteristicilor fenotipice. Redarea imaginilor caracteristicilor fenotipice pentru unele din aceste tulpini este realizată în Anexa 2a.

Cu ajutorul atlaselor și determinatoarelor cunoscute (Barnett și Hunter, 1993) au fost stabilite caracteristicile de gen ale microfungilor. Astfel, tulpinile izolate în runda 1 au aparținut genurilor Penicillium, Cladosporium și Aspergillus. Atât din aer, cât și de pe bunuri textile din cânepă sau piele au fost izolate și levuri. Foarte frecvent în aeromicrobiota din depozite și săli s-au regăsit tulpini de Basidiomicete. De pe suprafața unei mănuși de unică folosință folosită la manevrarea bunurilor textile de Patrimoniu s-au izolat doar specii aparținând genului Penicillium.

În urma etapei de izolare în cultură pură a probelor prelevate din aeromicrobiotă și de pe suprafața bunurilor culturale textile în toate rundele, tulpinile obținute au aparținut predominant genului Penicillium, urmat de genul Aspergillus, Cladosporium, Alternaria, Trichoderma și de asemenea s-au izolat specii de Basidiomicete (fig. 25-29).

Genurile Penicillium, Aspergillus, Cladosporium și Alternaria au fost frecvent raportate de mulți autori, fiind izolate din aeromicrobiota muzeelor, arhivelor, bibliotecilor sau altor clădiri culturale, precum bisericile sau alte lăcașe cu caracter religios (Skóra și colab., 2015; Borrego și colab. 2012; Garcia, 2016; Piñar și colab. 2013; Kavkler și colab., 2015b; Błyskal, 2009; Gutarowska și colab., 2012; Mesquita și colab. 2009; Micheluz și colab. 2015; Abdel-Karem, 2010).

Penicillium și Aspergillus sunt fungi saprotrofi, care produc un număr foarte mare de conidii. În gospodării, se pot dezvolata pe diferite alimente de origine vegetală. Speciile din genul Aspergillus pot constitui un risc pentru sănătatea umană: A.flavus produce aflatoxină; A.fumigatus este un patogen uman extrem de periculos, care produce afecțiuni associate aparatului respirator, precum aspergiloza pulmonară (Paulussen și colab., 2017; Coman și colab., 2012); alte specii sunt responsabile pentru apariția micozelor sau sinteza de micotoxine (ochratoxină) (Visagie și colab., 2014a). Speciile de Penicillium sunt de asemenea asociate cu biodeteriorarea unor alimente, produc micotoxine (patulina produsă de P.expansum), compuși organici volatili (P.brevicompactum) dar și peniciline (P.citrinum, P.rubens, P.chrysogenum) (Visagie și colab., 2014a; Visagie și colab., 2016; Lazăr și colab., 2004).

Două specii ale acestor genuri, A.versicolor și P.chrysogenum au fost propuse ca indicatori biologici ai sindromului caselor bolnave, fiind frecvent izolate din case care au fost deteriorate de apă (Andersen și colab., 2011).

Caracteristicile macroscopice ale speciilor de Penicillium cultivate pe mediu PDA au arătat colonii cu aspect catifelat sau granular, crescute concentric, de culoare verde, verde-albăstrui, galben-verzui. Partea reversă este colorată în galben închis-portocaliu, până la maron-roșiatic (fig. 25).

Fig. 25. Imagini macroscopice ale unor tulpini izolate aparținând genului Penicillium pe mediu PDA.

Rand 1: tulpina T9, izolată de pe bunuri textile; Stânga: placă Petri cu colonii pulverulente, catifelate, de culoare alb-crem până la galben verzui. Dreapta: partea reversă a plăcii-miceliu galben-portocaliu.

Rând 2: tulpina T42 izolată din aeromicrobiota sălilor expoziționale; Stânga: placă Petri cu colonii granulare, catifelate, de culoare verde-albăstrui și cu centrul alb-verzui, mediul de cultură s-a colorat în galben intens. Dreapta: partea reversă a plăcii -miceliu crem-gălbui.

Rând 3: tulpina T5 izolată de pe bunuri textile. Stânga: placă Petri cu colonii concentrice, pulverulente, de culoare gri-verzui, cu zone alb-verzui, și care au colorat mediul de cultură în oranj pal. Dreapta: partea reversă a plăcii-miceliu portocaliu intens până la maroniu.

Caracteristicile macroscopice ale speciilor de Aspergillus au fost observate pe mediu PDA și Czapek-Dox. Coloniile au prezentat un aspect granular pronunțat, format de capul conidial al conidioforilor, cu spori negrii, galben-verzui, bej sau bej-verzui. Partea reversă este albă, galbenă sau cafenie (fig. 26).

Fig. 26. Imagini macroscopice ale unor tulpini izolate pe mediu PDA aparținând genului Aspergillus.

Rând 1: tulpina TN 10 izolată de pe suprafața bunurilor textile. Stânga: placă Petri cu colonii granulare, neregulate, de culoare galben-verzui. Dreapta: partea reversă a plăcii – miceliu galben-bej cu margini verzui.

Rând 2: tulpina T34, izolată din aeromicrobiota depozitelor. Stânga: placă Petri cu colonii granulare, neregulate, de culoare bej-crem și margini albe. Dreapta: partea reversă a plăcii: miceliu crem gălbui.

Cladosporium este un gen care cuprinde specii cosmopolite, saprotrofe, fitopatogene. Speciile de Cladosporium au fost izolate de pe diferite substraturi, inclusiv aer, sol, textile, sau din leziuni provocate de alți fitopatogeni, ei fiind colonizatori secundari. C.cladosporoides a fost raportat și ca patogen la om, fiind implicat în afecțiuni pulmonare sau cutanate (Bensch și colab, 2012; Ogórek și colab., 2012)

Studiile moleculare au arătat o mare diversitate genotipică a speciilor existente în natură, atât în ambientul din interiorul clădirilor, sau pe resturi vegetale sau chiar în nișe ecologice extreme, cu concentrații ridicate de săruri (Bensch și colab, 2012).

Caracteristicile de cultură pe mediu PDA observate la tulpinile izolate din ambientul muzeal au fost: miceliu dens, cu colonii de 60-72 mm în diametru după14 zile, de culoare oliv-gri, cu margini negre, iar partea reversă de culoare albastru închis-negru. Coloniile au suprafața pulverulentă, cu marginile catifelate. Culturile nu prezintă exudate proeminente și prezintă o sporulare abundentă (Bensch și colab., 2010) (fig. 27).

C. cladosporoides alături de C. herbarum și speciile de Alternaria sunt cei mai frecvenți aeroalergeni și au fost izolați din tipuri diferite de incinte, de la birouri, până la muzee, arhive și din atmosfera exterioară clădirilor (Ogórek și colab., 2012).

Fig. 27. Imagini macroscopice ale unei tulpini izolate, aparținând genului Cladosporium. Tulpina T 10 izolată de pe suprafața bunurilor textile: stânga – placă Petri cu colonii umbonate, pulverulente, pigmentate în gri-negru, dezvoltate pe mediu PDA; dreapta – partea reversă a plăcii – miceliu pigmentat.

S-a observat că gradul cel mai mare de sporulare pentru Cladosporium și Alternaria este situat între lunile iunie și septembrie, Cladosporium sp. prezentând o densitate de spori în aer de câteva mii /m3, iar Alternaria sp. de câteva sute de spori /m3. Dar, deși densitatea de spori de Cladosporium sp. este mai mare, sporii de Alternaria sp. sunt considerați cu un potențial alergen mult mai mare (Ogórek și colab., 2012).

Speciile aparținând genului Alternaria sunt saprotrofe, endofite și patogene și se regăsesc pe o diversitate de substraturi vegetale (semințe, plante, produse agricole), animale, sol, și în atmosferă. Sunt frecvent fitopatogene atât în timpul dezvoltării plantelor, dar și după obținerea recoltelor. La om prezintă un ridicat risc alergen și produc infecții micotice la pacienții imunocompromiși (Woudenberg și colab., 2013).

Caracteristicile macroscopice ale coloniilor de Alternaria obținute pe mediu PDA au fost: miceliu pâslos de culoare alb-gri cu zone negre, care acoperă întreaga suprafață a mediului; miceliul este imersat sau parțial superficial. Partea reversă este maron închis spre negru (fig. 28).

Fig. 28. Imagini macroscopice ale unei tulpini izolate, aparținând genului Alternaria. Tulpina T 14 izolată din aeromicrobiota depozitelor. Stânga: placă Petri cu miceliu pâslos alb-gri până la maroniu, dezvoltat pe mediu PDA. Dreapta: partea reversă a plăcii- miceliu de culoare maroniu-neagră.

Genul Trichoderma cuprinde specii care se regăsesc în toate tipurile de zone geografice. Habitatul specific este solul și lemnul aflat în descompunere. Este un parazit pentru fungii aparținând Basidiomicetelor. Au fost izolate de pe scoici, nevertebrate marine și termite (Błaszczyk și colab., 2014; Hui, 2013).

Caracteristicile macroscopice ale coloniilor de Trichoderma obținute pe mediu PDA au fost: creștere rapidă, adesea concentrică și producere abundentă de spori conidiali. Coloniile au prezintat aspect zaharat, cu pigmentare de culoare galben-verzui, cu partea reversă galben-cafeniu (fig. 29).

Fig. 29. Imagini macroscopice ale unei tulpini izolate, aparținând genului Trichoderma: Tulpina T 26 izolată din aeromicrobiota depozitelor. Stânga: placă Petri cu colonii zaharate, galben-verzui dezvoltate pe mediu PDA. Dreapta: parte reversă a plăcii, miceliu crem-gălbui.

4.2.4 Rezultatele privind caracterizarea fenotipică a izolatelor microfungice prin tehnica colorației cu albastru-cotton lactofenol

Observații privind tipul de cap conidial, fie asemănător genului Aspergillus, fie genului Penicillium sunt importante pentru încadrarea în aceste genuri a tulpinilor izolate (Samson și colab., 2014).

Caracteristicile microscopice ale tulpinilor de Penicillium izolate au arătat hife septate, inclusiv hifa conidioforilor, având aspectul caracteristic de pensulă (lat. penicillus=pensulă). La partea apicală hifa conidioforului este ramificată, ramificațiile au prezentat metule, terminate cu 2-5 fialide. Pe fialide, în urma diviziunii mitotice sunt formate lanțuri de condispori, sferici, haploizi (Lazar și colab., 2004 ). Condioforii observați au fost monoverticilați sau biverticilați, cu fialide ampuliforme sau alungite, și conidii netede, globulare sau subglobulare (Visagie și colab., 2014b) (fig. 30, rândul 1).

La speciile de Aspergillus, caracteristicile microscopice au arătat hifa conidioforului neseptată, cu capul conidioforului columnar, uniseriată sau biseriată, prezentând vezicule sferice, subsferice sau alungite, pe suprafața cărora s-au format metule sau fialide care au prezentat lanțuri de conidiospori de formă globulară sau clavată (fig. 30, rândul 2).

Fig. 30. Caracteristicile microscopice ale unor tulpini izolate din aeromicrobiotă și textile etnografice

Rândul 1: Genul Penicillium: tulpinile T1 (40x) și T 23 (100x). Se observă conidiofori septați, monoverticilați, cu metule și fialide pe care sunt formate lanțuri de conidiospori.

Rândul 2: Genul Aspergillus: tulpinile T49 (40X) și T 34 (10x). Se observă conidifori lungi, neseptați, uniseriați, care se termină cu vezicule subglobulare (T49-stânga) sau clavate (T34-dreapta), pe care se formează conidiospori.

Caracteristicile microscopice observate la tulpinile izolate aparținând genului Cladosporium au fost: conidii netede, cu suprafața ornamentată, solitare sau în lanțuri scurte; cu un singur sept (fig. 31). Conidioforii de 350 μm în lungime sau mai scurți, prezintă diferite grade de umflare intercalară sau aplicală, cu dispoziție circulară sau laterală. Condiiforii se umflă la partea apicală, iar conidiile se formează în imediata proximitate, la suprafața porțiunii umflate. Conidiile sunt elipsoidale sau de forma lămâii, cu pereți netezi (Bensch și colab., 2012; Bensch și colab., 2010; Ogórek și colab., 2012)

Fig. 31. Caracteristicile microscopice ale unei tulpini izolate, aparținând genului Cladosporium (40x și 100X). Se observă conidii netede, solitare sau în lanțuri scurte, cu un singur sept (stânga). Conidiile au formă elipsoidală, cu suprafața ornamentată (dreapta).

4.2.5 Rezultatele privind determinarea calitativă a capacității de degradare a celulozei

Capacitatea de a degrada celuloza a tulpinilor de microfungi izolate din ambientul muzeal a fost evaluată cu ajutorul testului cu Roșu de Congo. Acest colorant are capacitatea de a interacționa cu polizaharidele care conțin lanțuri de unități D-glucopiranozil (β-1,4) linkate, cu β-(1,3)-D-glucani și posibil cu galactomani hemicelulozici și a fost aplicat pentru prima dată pentru caracterizarea bacteriilor celulozolitice din rumenul bovin (Teather șiWood, 1982). Este un test frecvent aplicat pentru analiza calitativă a activității enzimatice pentru bacteriile si fungii izolați din sol (Liang și colab. 2014; Hendricks și colab., 1995; Avellaneda-Torres și colab., 2014) sau pentru selectarea unor tulpini de fungi sau bacterii capabile să producă celulaze cu o mai mare eficiență pentru aplicații biotehnologice (Florencio și colab., 2012; Dantur și colab., 2015; Ghio și colab., 2012).

Alți autori folosesc o metodă calitativă prin care speciile de fungi sunt cultivate în mediu minimal iar ca unică sursă de carbon este folosită hârtia de filtruWhatman 1 sau celuloza 1% (Borrego și colab., 2012; Veroso și Boreggo, 2014).

În cadrul acestei lucrări, s-au efectuat două tipuri de testări, conform metodologiei prezentate la punctul 4.1.3.3.1. S-au folosit două surse de carbon: celuloză microcristalină 0,2% și carboximetilceluloză 0,2%. După incubare și aplicarea soluției de Roșu de Congo s-a urmărit apariția zonele de hidroliză, de culoare mai deschisă, în jurul coloniilor, reprezentând celuloza degradată de către enzimele extracelulare sintetizate de tulpinile de microfungi.

S-a observat că în cazul testului în care s-a folosit celuloză microcristalină, rezoluția testului este destul de scăzută, distincția dintre zona de hidroliză și zona intens colorată de Roșu de Congo fiind greu de realizat. Astfel, în etapa următoare toate tulpinile testate au fost evaluate calitativ folosind CMC 0,2%, în mediul de cultură.

Din cele 60 de tulpini de microfungi testate, doar 6 % (4 tulpini) nu au prezentat activitate celulozolitică, majoritatea a demonstrat o bună capacitate de a degrada celuloza, formând halouri în jurul coloniilor de diferite diametre, de la 1 mm până la 30 mm (fig. 32).

Fig. 32. Distribuția tulpinilor de microfungi în funcție de diametrul zonei de hidroliză.

În figura 33 este prezentat rezultatul evaluării calitative a activității celulazice pentru două tulpini de microfungi cultivate în mediu cu carboximetilceluloză 0,2%, ca unică sursă de carbon. Se observă apariția zonei de hidroliză de culoare galben-portocalie în jurul coloniei formată ca urmarea a degradării celulozei. Restul mediului din plăcile Petri este colorat în roșu ca urmare a legării colorantului Roșu de Congo de celuloza nedegradată.

Fig. 33. Determinarea calitativă a activității celulazice prin testul cu Roșu de Congo.

Stânga: tulpina T47, izolată din aeromicrobiotă; dreapta: tulpinaT1 izolată de pe bunuri textile.

4.2.6 Rezultatele privind determinarea cantitativă a capacității de degradare a celulozei

Determinarea cantitativă a activității celulazice s-a realizat prin metoda spectrofotometrică folosind reactivul DNS, care conține: acid 3,5 dinitrosalicilic, fenol, sulfit de sodiu, tartrat de sodiu și potasiu și hidroxid de sodiu. Acidul 3,5 dinitrosalicilic are capacitatea de a reacționa cu zaharurile reducătoare determinând apariția unei reacții colorimetrice a cărei intensitate este direct proporțională cu cantitatea de zaharuri eliberate în mediu ca urmare a acțiunii celulazelor asupra substratului. Aplicarea DNS a fost descoperită de Sumner iar optimizarea testului a fost realizată de Miller (Miller, 1959).

Sistemul celulazic este studiat la nivel genetic pentru înțelegerea mecanismelor moleculare care stau la baza sintezei enzimelor responsabile cu degradarea celulozei (Amore și colab., 2013; Ali și colab., 2014; Li colab., 2015).

Pentru a testa cantitativ activitatea celulazică a componentelor din sistemul celulazic: I. endo-β-glucanaza; II. exo-β-glucanaza; III. β-glucozidaza, s-au aplicat trei metode folosind ca substraturi diferite pentru acțiunea enzimelor: hârtia de filtru Whatman 1 pentru testarea activității endo-β-glucanazei, carboximetilceluloza pentru testarea activității exo-β-glucanazei și celobioza pentru testarea activității β-glucozidazei. S-a respectat modul de lucru prezentat la 4.1.33.2.

În cadrul metodologiei s-a folosit preparatul celulazic Cellulosoft, care conține celulaze de la Trichoderma viridae.

Pentru calcularea activității enzimatice a preparatului celulazic s-au folosit expresiile (3), (4), (5):

Rezultatele obținute arată că preparatul enzimatic a prezentat o bună activitatea celulazică pentru toate cele trei tipuri de enzime întâlnite în sistemul celulazic. Activitatatea endoglucanazei a fost de 1,56 UFP, iar exoglucanaza și celobiohidrolaza au acvtivități enzimatice similare de 0,268 U (tabelul 8).

Tabel 8. Valorile obținute pentru probele și martorii folosiți la determinarea activității sistemului celulazic.

4.3 Concluzii

În cadrul acestui capitol s-au prezentat metodele și rezultatele privind prelevarea, izolarea, caracterizarea fenotipică și a potențialului biodegradativ ale tulpinilor de microfungi izolate din aeromicrobiota Muzeului Național al Țăranului Român și de pe suprafața unor bunuri textile etnografice din fibre naturale, cânepă, in bumbac și lână.

Rezultatele obținute au permis următoarele concluzii:

1. S-au izolat 150 de tulpini de microfungi din aeromicrobiotă și de pe bunurile textile, din care 60 de tulpini au fost analizate privind caracteristicile macroscopice de cultură, caracteristicile microscopice ale structurilor vegetative și ale aparatului conidial, capacitatea de a degrada celuloza și de a sintetiza enzime ale sistemului celulazic.

2. Tulpinile izolate în acest studiu au aparținut predominant genului Penicillium (43 tulpini din totalul de 60 caracterizate). Alte tulpini izolate au aparținut genurilor Aspergillus, Cladosporium și Alternaria. Acest rezultat confirmă rezultatele obținute de diferiți autori privind tulpinile de microfungi prezente în aeromicrobiota din muzee sau clădiri civile sau pe suprafața bunurilor de Patrimoniu Cultural cu structură organică (textile, hârtie).

3. Temperatura înregistrată în cele patru runde de monitorizare s-a situat în intervalul 20-250C. Umiditatea a prezentat variații între rundele de monitoriare, în special în sălile cu expoziții permanente. În luna ianuarie, au fost înregistrate valori de 20 % , iar în luna iunie umiditatea a înregistrat valori de peste 50%. Valorile temperaturii și umidității se încadrează în intervalul recomandat de normele specifice din domeniul Patrimoniului Cultural.

4. 94% din tulpinile de microfungi testate au prezentat activitate celulazică, conform rezultatelor obținute la determinarea calitativă.

5. Metodologia folosită pentru determinarea cantitativă a activității celulazice a permis evidențierea potențialului biodegradativ prin acțiunea celor trei enzime: I. endo-β-glucanaza; II. exo-β-glucanaza; III. β-glucozidaza.

CAP. 5 CARACTERIZAREA GENOTIPICĂ A MICROBIOTEI FUNGICE MUZEALE

Aplicarea tehnicilor moleculare pentru studiul contaminării microbiene a materialelor din structura bunurilor de patrimoniu poate fi considerată o extensie a tehnicilor moleculare folosite pentru identificarea genetică a comunităților microbiene prezente pe diferite tipuri de substraturi, ca de exemplu cele de uz medical (Diba et al., 2014; Dendis et al., 2002; Ettenauer et al., 2012; Flórez et al., 2007; Iori et al, 2015; Krupa, 1999; Martin și Rygiewicz, 2005; Montenegro et al., 2009; Moreira et al., 2001; Pinto et al., 2012; Prahba et al., 2013; Schroeder et al., 2001; Sun et al., 2013; Viaud et al., 2000; Hoshino, 2012).

În ultimii ani studiul speciilor biodeteriogene ale bunurilor de patrimoniu cultural cuprinde componenta moleculară dată de aplicarea tehnicilor moleculare de identificare și caracterizare, alături de aplicarea tehnicile clasice de cultivare și analiză morfologică (López-Miras et al., 2012; Michaelsen et al., 2006; Michaelsen et al., 2009; Montanari et al., 2012; Piñar et al., 2001; Piñar et al., 2004; Piñar et al., 2011; Piñar et al., 2015; Piñar et al., 2015b; Rakotonirainy et al., 2007; Schabereiter-Gurtner et al., 2001b).

Astfel, obiectivul acestui capitol a fost studiul microfungilor izolați din ambientul MNȚR și bunuri culturale textile, printr-un ansamblu de metode moleculare, cu ajutorul cărora să se realizeze identificarea la nivel de specie, și să se analizeze comparativ secvențele specie-specifice, ca și diversitatea genotipică intraspecifică a tulpinilor identificate. Acest obiectiv a fost realizat prin următoarele etape:

1. Stabilirea și aplicarea metodologiei pentru identificarea moleculară a tulpinilor microfungice izolate de pe suprafața bunurilor culturale textile și din aeromicrobiota Muzeului Național al Țăranului Român;

2. Stabilirea, aplicarea și optimizarea unei metode de extracție a ADN-ului microfungic;

3. Amplificarea prin tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction) a secvenței marker ITS pentru clasificarea taxonomică a microfungilor cu ajutorul bazei de date Genebank;

4. Identificarea unor gene de interes, selectate din literatura de specialitate și amplificarea lor prin PCR-simplex sau multiplex;

3. Evidențierea unui polimorfism genetic intraspecific cu ajutorul tehnicilor moleculare derivate, precum RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).

5.1 Materiale și metode

Medii de cultură

– Sabouraud Dextrose Agar (Biolife, 4020052), mediu deshidratat având compoziția: petonă din cazeină 5 g/L, petonă din carne 5g/L, glucoză 40 g/L, agar 15 g/L. Se suspendă 65 g pulbere în 1000 mL apă rece distilată, se încălzește până la fierbere sub agitare. Se sterilizează prin autoclavare la 1210C timp de 15 min, pH 5.6. ± 0,2.

– Bulion Czapek-Dox: Czapek-Dox broth (Sigma-Aldrich, C1551), mediu deshidratat cu următoarea compoziție: zaharoză 30 g/L, azotat de sodiu 3 g/L, sulfat de magneziu 0,5 g/L, clorură de potasiu 0,5 g/L, fosfat dipotasic 1g/L, sulfat feros 0,01 g/L, pH 7,3 ± 0,2. Se sterilizează prin autoclavare la 121 0C, timp de 15 min.

– Agaroză I – 17852, 500 g, Molecular Biology Grade (Thermo Scientific)

Kituri

– Kit 1 pentru extracția ADN: REDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kit (Sigma-Aldrich, XNAP)

– Kit 2 pentru extracția ADN: FastDNATM SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, 6560-200)

– Kit 3 pentru extracția ADN: DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)

Secvențe genice

– Secvență primer ITS1 forward 5´- TCC GTA GGT GAA CCT GCG G -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 71336503), 19 baze, masa moleculară 5844,8, Tm=59,5 0C, conținut GC=63,2%.

– Secveță primer ITS4 reverse 5´- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 71336504), 20 baze, masa moleculară 6034, Tm= 52,1 0C, conținut GC=45,0%.

– Secvență primer VER 496 5´- ATG TCG GAT AAT CAC CGT TTA GAT GGC -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698418), 27 baze, masa moleculară 8314,8, Tm=58,7 0C, conținut GC=44,4%.

– Secvență primer VER 1391 5´- CGA AAA GCG CCA CCA TCC ACC CCA ATG -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698419), 27 baze, masa moleculară 8152,3, Tm= 65,8 0C, conținut GC=59,3%.

– Secvență primer APA 450 5´- TAT CTC CCC CCG GGC ATC TCC CGG -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698420), 24 baze, masa moleculară 7201,7, Tm= 68,2 0C, conținut GC=70,8%.

– Secvență primer APA 1482 5´- CCG TCA GAC AGC CAC TGG ACA CGG -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698421), 24 baze, masa moleculară 7332,8 , Tm= 65,5 0C, conținut GC=66,7%.

– Secvență primer AFLR 620 5´- CGC GCT CCC AGT CCC CTT GAT T -3´(Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698422), 22 baze, masa moleculară 6598,3 , Tm= 64,1 0C, conținut GC=63,6%.

– Secvență primer AFLR 1249, 5´- CGC GCT CCC AGT CCC CTT GAT T -3´(Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698422), 20 baze, masa moleculară 6053, Tm= 56,8 0C, conținut GC=55,0%.

– Secvență primer OCRA 1, 5´- CTT CCT TAG GGG TGG CAC AGC -3´(Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698424), 21 baze, masa moleculară 6438,2, Tm= 60,4 0C, conținut GC=61,9%.

– Secvență primer OCRA 2, 5´- GTT GCT TTT CAG CGT CGG CC -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698425), 20 baze, masa moleculară 6091, Tm= 60,0 0C, conținut GC=60,0%.

– Secvență primer CbH-fw 5´- TCG AYG CSA ACT GGC GCT GG -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698426), 20 baze, masa moleculară 6146,5, Tm= 64,3 0C, conținut GC=67,5%.

– Secvență primer CbH-rv 5´- TTG GCY TCC CAG AYA TCC ATC TC -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698427), 23 baze, masa moleculară 6910,5, Tm= 58,5 0C, conținut GC=52,2%.

– Secvență primer Tub-2 Fw 5´- CTG TCC AAC CCC TCT TAC GGC GAC CTG AAC -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698428), 30 baze, masa moleculară 9074,9, Tm= 66,4 0C, conținut GC=60,0%.

– Secvență primer Tub-2 Rv 5´- ACC CTC ACC AGT ATA CCA ATG CAA GAA AGC -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698429), 30 baze, masa moleculară 9122, Tm= 61,9 0C, conținut GC=46,7%.

– Secvență primer tri5 Fw 5´- CAT CAA TCC AAC AGT TTC AC -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698430), 20 baze, masa moleculară 6005, Tm= 49,4 0C, conținut GC=49,4 %.

– Secvență primer tri5 Rv 5´- GCA ACC TTC AAA GAC TAT TG -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698431), 20 baze, masa moleculară 6085, Tm= 49,2 0C, conținut GC=40,0%.

– Secvență primer chs1 Fw 5´- ATC TCA CCA CAA GCA CCG CCA CAC A -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698432), 25 baze, masa moleculară 7493,9, Tm= 64,8 0C, conținut GC=56,0%.

– Secvență primer chs1 Rv 5´- GGA AGA AGA TCG TTG TGT GCG TGG T -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698433), 25 baze, masa moleculară 7833,1, Tm= 61,3 0C, conținut GC=52,0%.

– Secvență primer IDH1 5´- CAA TGT GTC GTA CTG TGC CC -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698434), 25 baze, masa moleculară 6084, Tm= 56,2 0C, conținut GC=55,0%.

– Secvență primer IDH2 5´- ACC TTC AGT CGC TGT TCC TC -3´ (Integrated DNA Technologies, ref. no. 72698434), 20 baze, masa moleculară 5994,9, Tm= 56,9 0C, conținut GC=55,0%.

– Enzima de restricție EcoRI (Promega, R6011), concentrație 12u/µl, 5000u și componetele reacției de restricție: Buffer H (900 mM Trisc HCl, 500 mM NaCl, 100 mM MgCl2); albumină serică bovină acetilată (acetylated BSA)

Reactivi

Bromură de etidiu E 1385, 5 ml, 500 µg/ml (Sigma Aldrich)

5.1.1 Metoda pentru extracția ADN total

Pentru realizarea extracției de ADN genomic din microfungi, au fost obținute culturi proaspete prin cultivarea tulpinilor timp de 5 zile, pe mediu lichid și incubate la 28 0C ± 2 0C într-un incubator static sau într-un incubator cu agitare, la 50 rpm.

Pentru stabilirea metodei optime de extracție a ADN, au fost testate trei kituri, identificate în literatura de specialitate ca fiind folosite pentru extracția ADN din fungi. Cele trei kituri au fost aplicate în trei variante:

aplicarea kitului conform protocolului atașat kitului;

pregătirea inițială a materialului biologic prin omogenizare într-un omogenizator FastPrep-24TM 5G (MP Biomedicals, SUA) la viteza de 6,0 m/sec, timp de 40 secunde și ulterior aplicarea protocolului de lucru din kitul de extracție;

pregătirea inițială a materialului biologic prin mojararea miceliului în azot lichid, urmată de omogenizare în omogenizator și ulterior aplicarea protocolului de lucru din kitul de extracție;

După efectuarea extracției, 5µl din ADN-ul genomic extras au fost migrate prin metoda electroforezei în gel de agaroză 1,2%, în sistem submers pe placă orizontală, pentru analiza calității și integrității ADN-ului extras.

Analiza calității și integrității ADN extras

Reactivi și aparatură: a) tampon de electroforeză: TBE 0,5X – TRIS, acid boric, EDTA. S-a preparat ca soluție concentrată 5X care apoi a fost diluată la TBE 0,5X înainte de folosire; b) soluție de bromură de etidiu c) agaroză; d) tanc de electroforeză orizontală pentru separarea de acizi nucleici; e) sursă de curent; f) transiluminator UV.

Pentru analiza calității și integrității ADN extras s-au efectuat următoarele etape:

1) Pregătirea gelului de agaroză. Cantitățile folosite pentru obținerea gelului sunt prezentate în tabelul 9 și tabelul 10.

– S-au cântărit 2 g agaroză și s-au adăugat într-un pahar Erlenmeyer, peste care s-au adăugat 200 ml tampon TBE 0,5X pentru a obține o concentrație finală în gelul de agaroză de 1%. Paharul s-a încălzit la fierbere, până la dizolvarea totală a agarozei;

– Soluția obținută s-a lăsat la răcit până la o temperatură de 50-60 oC. Pe parcursul perioadei de răcire s-au adăugat 9 µl bromură de etidiu pentru a permite vizualizarea ulterioară a moleculelor de ADN. Bromura de etidiu se intercalează între bazele azotate ale acizilor nucleici și prin excitarea cu lumina UV, emite radiație în domeniul vizibil si permite vizualizarea moleculelor de ADN;

– S-a izolat tăvița aparatului de electroforeză cu bandă adezivă și s-au montat pieptenii, având grijă ca dinții acestuia să nu atingă baza taviței. Gelul lichid (50oC) s-a turnat în tăvița aparatului. S-a lăsat să se solidifice complet, circa 30-40 de minute la temperatura camerei;

– S-au îndepărtat banda adezivă și pieptenii cu mare atenție, iar gelul solidificat complet s-a introdus în aparatul de electroforeză.

2) Încărcarea probelor și efectuarea migrării electroforetice

– Probele reprezentate de extractele de ADN genomic s-au încărcat în godeuri cu ajutorul unei micropipete;

– După încărcarea tuturor probelor de ADN și a markerului de masa moleculară de 1Kb s-a pus capacul aparatului și s-a conectat la sursa de curent fixată la o tensiune constantă;

– Perioada de migrare a fost de 30-40 de minute.

Tabel 9. Compoziția pentru obținerea gelului de agaroză.

Tabel 10. Compoziția pentru obținerea soluției de TBE 0,5X.

Compoziția soluției stoc TBE 5X a fost:

Tris ………………..54 g/L

Acid boric…………27,5 g/L

EDTANa2……….0,744 g/L

Apă distilată…….1000 ml

3) Vizualizarea moleculelor de ADN din gel

– pentru vizualizarea moleculelor de ADN, s-a așezat gelul într-un transiluminator UV (Dual Intensity Ultraviolet Transilumintor, UVP, USA) la lungimea de unda λ = 302 nm.

– s-a efectuat captarea imaginii cu ajutorul aparatului digital PowerShot SX710 HS (Canon).

5.1.2 Metoda pentru amplificarea regiunii Internal Transcribed Spacer (PCR-ITS)

Pentru caracterizarea moleculară a tulpinilor microfungice izolate s-a selectat markerul genetic ITS. ITS (Internal Transcribed Spacer) reprezintă secvența marker cel mai frecvent folosită în micologie pentru identificarea taxonomică la nivel de gen și specie. Este localizată în ADN nuclear, are o dimensiune de 400-650 perechi de baze (pb) și constă din două regiuni variabile ITS1 și ITS4, care flanchează gena 5.8S, înalt conservată (Nilsson și colab., 2012)

ADN-ul genomic extras din microfungi a fost amplificat cu primerii specifici ITS 1 și ITS 4 (White și colab., 1990) (tabel 11).

Tabel 11. Primerii folosiți în reacția PCR-ITS.

Reactivi pentru reacția PCR

Nucleotide (dNTPs) dATP, dGTP, dCTP, dTTP; 10 mM; Thermo Scientific

Primeri 10 pM/µl fiecare; IDT

ADN polimerază Taq DNA polymerase, 5 U/µl; Thermo Scientific

Tampon de reacție (10x) 160 mM (NH4)2SO4, 670 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 °C), 15 mM MgCl2, 0.1 % Tween 20; Thermo Scientific

MgCl2 25 mM, Thermo Scientific

S-a realizat inițial un amestec din toate componentele mai puțin matrița ADN. 16 µl din amestecul de reacție PCR a fost distribuit în tuburi Eppendorf de 0,2 ml. Ulterior s-au adugat câte 4 µl din matrița ADN. În fiecare experiment PCR s-a inclus câte un control negativ, reprezentat de amestecul de reacție fără ADN (tabelul 12).

Tabel 12. Componentele reacției PCR-ITS.

Amplificarea PCR s-a realizat utilizând echipamentul PCR Corbett Research (SUA) și echipamentul Mastercycler, Nexus gradient, Eppendorf (Germania) urmând protocolul de amplificare din tabelul 13.

Tabelul 13. Programul de amplificare pentru PCR-ITS.

Vizualizarea ampliconilor PCR-ITS s-a realizat prin migrarea electroforetică în gel de agaroză 1,2% sau 1%, în sistem submers pe placă orizontală cu marker de masă moleculară 1Kb (Thermo-Fischer) sau marker de masă moleculară 100 pb (Thermo-Fischer).

5.1.3 Secvențierea fragmentelor ITS și identificarea moleculară cu ajutorul bazei de date GeneBank

Pentru identificarea taxonomică, ampliconii PCR-ITS au fost secvențiați la Dexter Laboratory. Obținerea secvențelor de baze azotate s-a realizat cu ajutorul ambilor primeri ITS1 și ITS4.

Secvențele obținute au fost comparate cu secvențele existente în baza de date GenBank ®, cu ajutorul programului BLASTN 2.6.1+ (Altschul și colab., 1990). Din lista de tulpini din baza de date a fost selectată prima tulpină care a prezentat cea mai mare omologie cu secvența ITS analizată.

5.1.4 Polimorfismul genetic al secvenței ITS prin tehnica RFLP

Cu ajutorul tehnici RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymophism) s-au comparat profilele de restricție rezultate în urma digestiei produsului de amplificare PCR-ITS. Tehnica se realizează cu ajutorul endonucleazelor de restricție, care au specificitate pentru situsuri în secvența de ADN, determinând legarea de secvența respectivă și clivarea ei. Există trei categorii de sisteme de restricție notate I, II și III, clasificate astfel în funcție de zona unde efectuează clivarea secvenței ADN, fie situs-nespecific sau la distanță de secvența de recunoaștere, pentru sistemele I și III, fie la nivelul situsurilor de recunoaștere, pentru sistemul II.

În cadrul experimentărilor a fost folosită enzima de restricție EcoRI.

Etapele identificării polimorfismului genetic al secvenței ITS prin tehnica RFLP au fost:

Extracția ADN genomic din tulpini de microfungi selectate;

Verficarea integrității ADN prin electroforeză în gel de agaroză 1%;

Amplificarea regiunii ITS, cu primerii ITS1 și ITS4;

Verficarea integrității ampliconilor ITS prin electroforeză în gel de agaroză 1%;

Realizarea amestecului reacției de restricție și distribuirea sa în tuburi Eppendorf de 0,2 ml (tabelul 14);

Adăugarea a 2 µl din ampliconul ITS și centrifugarea rapidă a tuburilor;

Incubarea probelor pe baie de apă la 370C, timp de 2 ½ h;

Oprirea restricției enzimatice și verificarea prezenței fragmentelor de restricție prin electroforeză în gel de agaroză 1%.

Table 14. Componentele reacției PCR -RFLP.

După obținerea profilelor de restricție experimental, cu ajutorul produsului bioinformatic NebCutter s-au obținut profilele in silico folosind secvențele de baze azotate, obținute în urma secvențierii regiunii ITS.

5.1.5 Identificarea genelor de interes

Caracterizarea genotipică a tulpinilor izolate din ambientul muzeal s-a realizat prin testarea prezenței unor gene importante pentru funcționarea metabolică a fungilor sau privind potențialul biodeteriogen.

Astfel s-au selectat un număr de 7 gene care intervin în sinteza unor metaboliți secundari cu potential toxicologic, precum aflatoxin și ochratxină, sau în sinteza unor constituenți celulari esențiali, precum tubulina sau chitina.

Lista genelor și a perechilor de primeri folosiți este redată în tabelul 15.

Identificarea prezenței genelor în genomul microfungilor s-a realizat urmând etapele:

– extracția ADN genomic și stabilirea integrității prin electroforeză în gel de agaroză;

– amplificarea genelor de interes folosind perechile de primeri din tabelul 14, prin PCR multiplex sau PCR simplex;

– verificarea prezenței produșilor de reacție PCR prin electroforeză în gel de agaroză și vizualizarea la transiluminatorul cu radiație UV.

Tabelul 15. Gene și primeri folosiți în reacțiile PCR.

5.2 Rezultate și discuții

5.2.1 Rezultatele privind extracția ADN total

Primul pas pentru realizarea extracției ADN genomic l-a constituit obținerea culturilor microfungice proaspete. În acest sens s-au folosit culturile pure obținute în etapa de izolare în capitolul anterior și menținute pe mediu PDA la 4 0C. Acestea au fost trecute pe mediul lichid Czapek-Dox sau Sabouraud bulion.

După creșterea microfungilor în tuburi Falcon de 50 ml (fig. 34), în condiții de incubare statică, s-a stabilit folosirea unor pahare Erlenmayer de 250 ml și incubare sub agitare la 50 rpm. Această metodă a asigurat obținerea unui miceliu mai bogat și ușor de manipulat pentru etapa de extracție.

Folosirea pentru extracția ADN a miceliului crescut în mediu lichid este una din modalitățile de pregătire a miceliului selectată dintr-o gamă variată de metode precizate în literatura de specialitate precum: recoltarea directă a miceliului de pe suprafața culturii pe mediu solid (Abass, 2014; López-Miras et al., 2012; Melo et al., 2006; Michaelsen et al., 2006; Plaza et al., 2004; Mishra et al., 2014), culturi în mediu lichid, urmate de filtrare și uscare (Mishra et al., 2008; Pinto et al., 2012), extracția din spori (Weiland,1997; Williams et al., 2001; Lee și Taylor, 1990) obținerea culturii într-un mediu tampon (Pinheiro, 2013).

Realizarea extracției ADN microfungic direct din probele de bunuri culturale textile nu a fost considerată întrucât bunurile textile de Patrimoniu Cultural din MNȚR analizate nu erau într-un stadiu avansat de degradare (Jroudi et al., 2015; López-Miras et al., 2012, Michaelsen et al., 2006; Piñar et al., 2013; Piñar et al., 2015b; Rakotonirainy et al., 2007; Schabereiter-Gurtner et al., 2001a; Schabereiter-Gurtner et al., 2001b; Pangallo et al., 2010). De asemenea, această metodă ar fi presupus etape suplimentare de îndepărtare a structurilor celulozice provenind de la fibrele de in, cânepă sau lână (Rakotonirainy, 2007).

Obținerea miceliului pentru extracție, prin cultivarea tulpinilor microfungice în mediu lichid a îndepărtat posbilitatea ca substanțele din mediul cu agar să intervină în etapele ulterioare de amplificare a ADN fungic (Motková și Vytřasová, 2011).

Fig. 34. Cultură microfungică în mediu lichid în tub Falcon.

Particularități ale extracției ADN din microfungii izolați

Extracția ADN din microfungii izolați a prezentat anumite particularități, una dintre ele fiind dificultatea distrugerii peretelui celular (Kim et al., 2007; Melo et al., 2006, Mishra et al., 2008; Moťková și Vytřasová, 2011; Williams et al., 2001; Płaza et al., 2004; Griffiths et al., 2006).

Diferiți autori au folosit metode variate pentru liza peretelui celular fungal:

1. Mecanică, cu ajutorul bilelor de sticlă sau a produsului Dicalit (Diba, 2014; Piñar et al., 2013; Piñar et al., 2015c; Scott, 2001; Mishra, 2014; Mirhendi, 2007);

2. Enzimatică (Ettenauer et al., 2012; Schabereiter-Gurtner et al., 2001a; López-Miras et al., 2012; López-Miras et al., 2013; Schabereiter-Gurtner et al., 2001b; Montanari et al., 2012; Piñar et al., 2001; Aljanabi și Martinez, 1997; Dentinger et al., 2010; Griffiths, 2006);

3. Chimică, folosind diferite tampoane de extracție (Liu et al., 2000; Cenis, 1992; Martin și Rygiewicz, 2005; Niu et al., 2008; Pinto et al., 2012; Lee și Taylor, 1990);

4. Fizică, cu ajutorul microundelor (Pallez, 2014; Tendulkar, 2003; Griffiths, 2006;),

5. Mojararea în azot lihid (Kim et al., 2007; Moťková, 2011; Abass, 2013; Zolan și Pukkila, 1986; Prabha et al., 2013);

6. Termică (Krupa, 1999);

7. Liofilizarea (Raeder și Broda, 1985);

8. O combinație a unora din aceste metode (López-Miras et al., 2012; Sert și Sterflinger, 2010);

9. Kituri comerciale aplicate direct sau în combinație cu alte metode (Michaelsen et al., 2006; Capodicasa et al., 2010; Dentinger at al., 2010; Moťková et al., 2011; Ettenauer et al., 2012; Ettenauer al., 2014; Jroundi et al., 2015Piñar, 2015; Piñar, 2011; Piñar et al., 2015b, Fredricks et al., 2005; Duncan, 2012; Michaelsen et al., 2010; Michaelsen et al., 2009; Montanari et al., 2012; Pinheiro et al., 2013).

În această lucrare, pentru realizarea etapei de liză celulară și extracție a ADN din microfungii izolați s-au folosit trei kituri comeciale, aplicate conform protocoalelor însoțitoare sau precedate de distrugerea mecanică și cu ajutorul azotului lichid (tabelul 16).

Tabel 16. Metode testate pentru extracția AND genomic din microfungi.

Justificarea alegerii kiturilor comerciale a fost data de: eficiența extracției așa cum a fost raportată de diferiți autori; evitarea folosirii unor subbtanțe toxice, ca de exemplu 2- mercaptoetanolul; posbilitatea îndepărtării eficiente a inhibitorii reacțiilor ulterioare în care ADN fungic extras este folosit, precum polizaharidele, proteinele, sărurile minerale (Plaza et al., 2004; Melo et al., 2006); posibilitatea realizării unor număr mai mare de extracții în timp scurt.

Analiza eficienței metodelor de extracție a ADN genomic din microfungi aplicate, s-a realizat în funcție de anumiți parametri: calitatea și integritatea ADN extras, amplificabilitatea ADN extras (Ettenauer et al., 2012).

Rezultatele obținute au arătat următoare aspecte:

– Kitul 1, REDExtract-N-AmpTM Plant PCR Kit (Sigma-Aldrich, XNAP) a extras rapid, într-un singur pas ADN microfungic iar ADN-ul a generat prin amplificarea regiunii ITS, produși PCR robuști.

– Kitul 2, FastDNATM SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, 6560-200) a realizat extracția ADN doar după introducerea etapei de mojarare a miceliului în azot lichid.

– Kitul 3, DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN), în mod similar cu kitul 2, a realizat extracția ADN doar după introducerea etapei de mojarare a miceliului în azot lichid.

Rezultatele obținute arată că pentru realizarea extracției de ADN din celula fungală este nevoie de adoptarea unei strategii experimentale care să permite distrugerea eficientă a peretelui celular alcătuit din glucan, chitină și chitosan (Maheshwari, 2005). Omogenizarea simplă, care constă în aplicarea unei forte de impact multidirecționale, de natură fizică nu este suficientă pentru a reuși spargerea peretelui polizaharidic. De asemenea utilizarea doar a azotului lichid, urmată de aplicarea unui protocol nu a fost suficientă pentru a elibera conținutul nuclear.

Folosirea combinată a mojarării miceliului fungal în azot lichid, urmată de omogenizarea extrasului în echipamentul FastPrep-24TM și ulterior realizarea etapelor de de separare a ADN folosind soluțiile din kitul 2 sau kitul 3 au permis extracția eficientă a ADN genomic din microfungii izolați din ambientul muzeal (fig. 35).

Fig. 35. ADN genomic extras din microfungi prin aplicarea combinată

a azotului lichid, mojarare și protocolul de extracție din kitul FastDNATM SPIN Kit for Soil.

Prin electroforeză în gel de agaroză s-a verificat integritatea ADN-ul genomic extras din microfungi cu ajutorul kitului FastDNATM SPIN Kit for Soil (fig. 35). S-a observat prezența unui ADN genomic nefragmentat (de ex. liniile 4, 9, 13, 30), a unui ADN partial degradat (de ex. liniile 1, 2, 3, 22, 23) și ADN genomic degradat aproape în totalitate (de ex. linia 26).

ADN-ul extras prin metodele precizate a fost mai departe utilizat pentru amplificarea secvenței marker ITS.

5.2.2 Rezultatele amplificării regiunii ITS

Identificarea moleculară și realizarea filogeniei moleculare la fungi sunt realizate preponderent prin studiul secvențelor genice reprezentate de ITS (Internal Transcribed Spacer), LSU (Large Ribosomal Unit) (Pinheiro, 2013) și SSU (Small Ribosomal Unit) (Plaza și colab., 2004; Capodicasa și colab., 2010).

Regiunea nucleară ITS prezintă avantaje pentru analiza moleculară datorită numărului mare de copii per genom și variabilității crescute care permite decelarea la nivel de specie sau subspecie (Mirhendi și colab., 2007; Nilsson și colab., 2008; Bridge și Arora, 1998).

Primerii pentru amplificarea regiunii ITS utilizați sunt cei cel mai adesea reprezentați de primerii dezvoltați de White și colaboratorii în 1990 – ITS1 și ITS4 (White și colab., 1990; Abass, 2013; Jroudi și colab., 2015; Michaelsen și colab., 2009; Montanari și colab., 2012; Piñar și colab., 2013; Piñar și colab., 2015c; Diba și colab., 2014; Ettenauer, 2012; López-Miras, 2012), primerii ITS1f/ITS2r și ITS3f/ITS4r pentru amplificarea unor fragmente mai mici, de aproximativ 300pb, corespunzătoare regiunii ITS1 sau ITS2 (Michaelsen, 2006) și primerii ITS4 și ITS5 (Krupa, 1999; Rakotonirainy, 2007).

ADN-ul genomic extras în etapa anterioară a fost amplificat folosind condițiile reacției PCR și componentele de reacție precizate la punctul 5.1.2. Vizualizarea produșilor de reacție PCR s-a realizat prin electroforeză orizontală în gel de agaroză 1%.

Benzile obținute (fig. 36 și fig. 37) sunt robuste, având dimensiunea de 500-600 pb.

5.2.3 Rezultate privind identificarea moleculară a tulpinilor fungice cu ajutorul bazei de date GeneBank

Secvența ITS (Internal Transcribed Spacer) este localizată în regiunea 18S-5.8S-26S, fiind constitită din trei părți: ITS1, care separă gena pentru unitatea mica ribozomală de gena pentru 5,8S, ITS2 care este dispusă între 5,8S și unitatea mare ribozomală, și exonul 5,8 S înalt conservat. Cele două secvențe ITS1 și ITS2 sunt clivate în timpul maturării ARN ribozomal (Poczai și Hyvönen, 2010; Gardes și Bruns, 1993) (fig. 38).

Regiunea ITS a fost propusă ca marker filogenetic standard pentru identificarea taxonomică la fungi (Schoch și colab., 2012). Avantajele oferite de această secvență sunt: ușurința amplificării PCR, capacitatea de a discrimina între specii și de a permite diferențierea intraspecifică. Unitatea mare ribozomală (LSU) este considerat al doilea tip de marker cu rezoluție filogenetică silimară secvenței ITS, ambele fiind superioare markerilor reprezentați de gene codificatoare de proteine (Schoch și colab., 2012).

Fig. 38. Reprezentarea grafică a regiunii Internal Transcribed Spacer: (a) localizarea cromozomală a ADNr; (b) repetiții în tandem a blocurilor de gene (18S-5.8S-26S) separate prin regiunea spacer intergenică IGS; TIS reprezintă situsul de inițiere a transcrierii (după Poczai și Hyvönen, 2010).

Cu toate aceste avantaje, este însă necesară urmarea unor etape pentru stabilirea autenticității și gradului de încredere privind stabilirea apartenenței tulpinii analizate la o anumită specie, pe baza secvențelor ITS noi obținute (Nisson și colab., 2014).

În această lucrare ampliconii PCR-ITS obținuți au fost secvențiați iar secvențele, prezentate în Anexa 2b, au fost comparate cu secvențele existe în baza de date GenBank NCBI, cu ajutorul programului BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) pentru stabilirea speciilor de microfungi izolate.

În tabelul 17 sunt prezentate speciile izolate de pe suprafața bunurilor culturale textile, iar în tabelul 18 sunt prezentate speciile de microfungi izolate din aeromicrobiota muzeală.

S-a observat că atât în microbiota de pe suprafața bunurilor textile cât și în microbiota din aer, genul predominat cu cele mai multe specii izolate este reprezentat de Penicillium sp., cu un număr de 43 de izolate din totalul de 60 de tulpini de microfungi, caracterizate genotipic (fig. 39).

Diversitatea genurilor și a speciilor în aeromicrobiotă este mult mai mare decât cea întâlnită pe suprafața bunurilor culturale textile. În acest caz, speciile predominante identificate au fost: Penicillium oxalicum și Penicillium chrysogenum. Un număr egal de tulpini izolate au aparținut speciilor P. crustosum, P. citrinum și P. polonicum. O specie aparte identificată a fost Epicoccum nigrum. Cladopsorium cladosporoides a fost de asemenea identificată doar pe suprafața bunurilor culturale textile, nu și în aeromicrobiota muzeală.

Fig. 39. Distribuția genurilor de microfungi identificate în cadrul Muzeului Țăranului Român de pe suprafața bunurilor textile de Patrimoniu Cultural și din aeromicrobiotă.

Tabel 17. Specii de microfungi izolate de pe suprafața bunurilor culturale textile identificate în baza de date GenBank.

În aeromicrobiotă s-au identificat predominant, similar ca în cazul bunurilor textile specii ale genului Penicillium. Față de speciile de Penicillium identificate pe suprafața bunurior textile, microbiota muzeală din aer a conținut alte 9 specii:

– P. hirsutum

– P. glabrum

– P. rubens

– P. commune

– P. brasilianum

– P. freii

– P.roseopurpureum

– P. verrucosum

– P.brevicompactum

De asemenea în aeromicrobiotă s-au identificat patru specii ale genului Aspergillus: Aspergillus pseudoglaucus, Aspergillus clavatus, Aspergillus jensenii și A. fumigatus. O particularitate a aeromicrobiotei a fost identificarea a trei specii de Basidiomicete: Bjerkandera adusta, Ganoderma carnosum și Beauveria bassiana (tabelul 18) .

Alte specii identificate în aeromicrobiotă au apărținut genurilor Alternaria, Cladosporium, Trichoderma și Talaromyces.

Tabel 18. Specii de microfungi izolate din aeromicrobiota MNȚR și identificate folosind baza de date GenBank.

Rezultatele obținute prin secvențierea markerului genetic ITS au arătat o mare variabilitate a speciilor de Penicillium izolate din aer și de pe suprafața bunurilor culturale textile. Astfel, cele 43 de tulpini microfungice identificate cu ajutorul programului BLAST reprezintă 14 specii diferite. Speciile predominante au fost reprezentate de P. crysogenum (12 tulpini), P. oxalicum (5 tulpini), P. rubens (5 tulpini) și P. polonicum (4 tulpini) (fig. 40).

Rezultatele obținute confirmă rezultatele obținute de către alți autori. Astfel, Kavkler și colab. într-un studiu privind contaminarea microfungică a bunurilor culturale textile din fibre naturale din câteva muzee, dintre care și Muzeul Etnografic Sloven, și instituții religioase din Slovenia au identificat genurile Penicillium, Aspergillus și Cladosporium ca genuri predominante în biodeteriorarea textilelor de Patrimoniu Cultural. Penicillium chrysogenum, la fel ca și în rezultatele acestui studiu a fost specia cel mai frecvent izolată, atât de pe substraturi celulozice cât și keratinice. Alte specii similare identificate de autori au fost Penicillium crustosum, Aspergillus clavatus, Penicillium chrysogenum și Aspergillus jenseni.

În biserici și mânâstiri, acolo unde temperaturile sunt foarte joase speciile genului Penicillium au fost în principal izolate. Aspergillus și Penicillium sunt genuri xerofilice și pot degrada substraturile celulozice și keratinice chiar și în condiții de umiditate scăzută (Kavkler și colab., 2015b; Błyskal, 2009)

Fig. 40. Distribuția speciilor de Penicillium izolate din cadrul Muzeului Țăranului Român.

În deteriorarea picturilor din Japonia au fost implicate specii aparținând genurilor Alternaria, Cladosporium, Fusarium, Aspergillus, Trichoderma și Penicillium (Inoue și Koyano, 1991).

Într-un studiu privind microbiota de pe suprafețe și din aer, din muzee și arhive în Polonia, cele mai frecvente specii isolate au aparținut genurilor Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Alternaria, Mucor, Rhizopus, Trichoderma. Dintre acestea specia Aspergillus fumigatus a fost identificată cu potențial toxicologic ridicat (Gutarowska și colab., 2012).

De asemenea, speciile genului Penicillium au fost identificate în cazul obiectelor culturale afectate de microorganisme în urma producerii unor evenimente climatice cu impact devastator. Sato și colab au investigat bunurile culturale, cu structură celulozică, sever biodeteriorate în urma producerii inundațiilor determinate de tsunami, care a urmat cutremurului din Japonia la 11 martie 2011. Printre obiectele afectate, cele pe baza de hârtie au fost sever biodeteriorate de specii de Penicillium. Aceste specii au prezentat o mare toleranță la concentrații ridicate de NaCl (Sato și colab., 2014).

Tot de pe substraturi celulozice din componența documenetelor istorice din arhive și biblioteci cele mai frecvent izolate au fost specii ale genurilor Cladosporium, Penicillium și Aspergillus alături de genuri mai puțin frecvente precum Alternaria, Botrytis, Chaetomium, Chromelosporium, Epicoccum, Phlebiopsys și Toxicocladosporium (Mesquita și colab. 2009). În studiul realizat privind biodeteriorarea documentelor de arhivă Cladosporium cladosporioides și Penicillium chrysogenum au fost singurele specii prezente pe toate tipurile de suporturi celulozice (Mesquita și colab. 2009).

Două specii ale genului Aspergillus, A. penicillioides și A. glaucus au fost utilizate ca specii indicator ale gradului de contaminare a aerului într-un muzeu unde s-a identificat biodeteriorarea unor picturi (Abe, 2010).

Studiind aeromicrobiota din diferite arhive în Italia, Micehluz și colab. au identificat speciile A. creber, A .protuberus, P. chrysogenum și P. brevicompactum ca cele mai frecvente. Alte specii identificate au fost C. cladosporioides, Penicillium glabrum, Alternaria sp. (Micheluz și colab. 2015).

Într-un studiu privind biodeteriorarea bunurilor culturale textile din fibre naturale din Muzeul Egiptean și Muzeul Coptic în Egipt, s-a observat aceeași predominanță a genurilor Aspergillus (14 specii) și Penicillium (10 specii) (Abdel-Karem, 2010). Autorul a identificat și specii ale genurilor Chaetomium, Alternaria, și Trichoderma. Ca specii predominate au fost Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum, și Penicillium citrinum (Abdel-Karem, 2010).

În studiul efectuat în această lucrare un rezultat particular obținut, neraportat în alte cercetări, este identificarea a trei genuri diferite de Basidiomicete: Bjerkandera adusta, Ganoderma carnosum și Beauveria bassiana. Bjerkandera adusta determină putreiagaiul alb la copacii vii, dar este unul din cei mai importanți fungi asociați cu tusea cronică (Liu și coab., 2014). Ganoderma carnosum crește de asemena pe esențe lemnoase, respectiv pe conifere. Beauveria bassiana este cunoscută ca un entomopatogen care trăiește predominat în sol, și este studiată pentru a fi aplicată în controlul biologic al insectelor.

Micheluz și colab. 2015 au identificat în aeromicrobiota și pe manuscrisele din arhive basidiomicetele Schyzophyllum commune și Gloeophillum abietinum (Micheluz și colab. 2015).

Prezența acestor specii de Basidiomicete poate sa fie pusă în legătură cu faptul că în cadrul MNȚR există foarte multe bunuri de patrimoniu din lemn, dintre care o Troiță și o Casă tradițională românească.

5.2.4 Rezultate privind polimorfismul genetic prin tehnica RFLP

RFLP este una dintre tehnicile frecvent aplicate pentru identificarea și caracterizarea fungilor (Abbas, 2013; Dendis și colab., 2002; Diba și colab., 2014; Krupa, 1999; Mirhendi și colab., 2006; Viaud și colab., 2000)

16 tulpini de microfungi au fost supuse restricției enzimatice cu enzima EcoRI (tabelul 19). Situsul de restricție al enzimei este 5´…G↓AATT C…3´. Tulpinile T 12, T39, T 25, T 29, T 46 T 26 și T 43 au fost identificate în etapa anterioară prin secvențierea markerului genetic ITS și compararea secvenței obținute cu secvențele din baza de date GenBank. Pentru tulpinile TN1 – TN9 s-au obținut produșii de amplificare PCR-ITS, fără secvențiere. Identificarea taxonomică a acestor tulpini s-a realizat pe baza caracteristicilor fenotipice, macroscopice și microscopice.

Tabel. 19 Specii de microfungi caracterizate prin ITS-RFLP.

După efectuarea reacției de restricție enzimatică a ampliconilor ITS, conform etapelor precizate la 5.1.4, vizualizarea produșilor ITS-RFLP s-a realizat prin electroforeză în gel de agaroză 1%. În fig. 41 și tabelul 20 sunt prezentate rezultatele obținute. În fig. 41 se observă obținerea fragmentelor de restricție enzimatică pentru tulpinile de pe liniile 3, 8-11, și 15. Pe gelul de agaroză 1% au fost observate fragmente singulare cu dimensiuni mai mici decât dimensiunea ampliconului ITS (tabelul 12). Liniile 4, 6, 12, 14 au prezentat în gelul de agaroză benzi la dimensiunea de 500 -600 pb reprezentând ampliconii ITS netăiați de enzima EcoRI.

Fig. 41. Vizualizarea în gel de agaroză 1% a fragmentelor de restricție enzimatică cu enzima EcoRI.

Linia 3: Bjerkandera adusta; liniile 8-11: Penicillium oxalicum, Penicillium sp., Penicillium sp., Alternaria alternata,; linia 15: P. brasilianum.

Tabel. 20 Rezultatele restricției enzimatice ITS-RFLP cu enzima EcoRI.

Cu ajutorul progamului Nebcutter (Vincze și colab., 2003) s-au generat in silico profilele de restricție enzimatică ale enzimei EcoRI pentru două seturi de tulpini:

– Setul 1: tulpini care nu au prezentat profile de restricție enzimatică: T 25, T46, T43.

– Setul 2: tulpini secvențiate nesupuse digestiei enimatice: T14 (Alternaria alternata) T60 (P. brasilianum).

Pentru tulpinile din setul I, în programul Nebcutter nu au fost evidențiate situsuri de restricție specifice enzimei EcoRI (G↓AATT C) confirmând rezultatele obținute.

La digestia secvențelor celor două specii, A. alternata și P. brasilianum a căror secvență de baze azotate a regiunii ITS a fost obținută anterior prin secvențiere, programul Nebcutter a identificat un situs de restricție pentru enzima EcoRI. Fragmentele obținute in silico sunt prezentate în tabelul 21 și fig. 42.

Tabel 21. Rezultatele restricției enzimatice ITS-RFLP in silico cu enzima EcoRI.

Fig. 42. Fragmente obținute în urma restricției enzimatice in silico. A. alternata (stânga) și P. brasilianum (dreapta).

5.2.5 Rezultatele pivind identificarea genelor de interes

Prezența a 7 tipuri diferite de gene a fost testată folosind pentru reacția de amplificare PCR, primerii prezentați la punctul 5.1.5. Genele selectate (apa-2, ver-1, aflR, tri5, tub2, chs1, pat, cbh) care intervin în sintetiza unor compuși cu importanță toxicologică la om sau plante, precum aflatoxina, ochratoxina sau patulina sau intervin în sinteza unor compuși esențiali pentru funcționarea celulară precum tubulina sau chitina.

Au fost testate 53 de tulpini de microfungi izolate din ambientul muzeal. Identificarea genelor a fost precedată de etapa de extracție a ADN genomic realizată așa cum s-a menționat la punctul 5.2.1.

Rezultatele obținute au arătat prezența genei tub2 pentru un număr de 36 de tulpini. Prezența celorlalte gene nu a fost identificată. Condițiile reacției PCR pentru amplificarea genei pentru ß – tubulină 2 sunt prezentate în a tabelele 22 și 23.

Tabel 22. Componentele reacției PCR pentru amplificarea tub2.

Vizualizarea produșilor de amplificare s-a realizat prin electroforeză orizontală în gel de agaroză 1%. În fig. 43 este prezentată imaginea migrării electroforetice a ampliconilor PCR. Se observă benzi caracteristice genei pentru tubulină 2, cu dimensiunea de 650 pb.

Tabel 23. Programul de amplificare pentru gena tub2.

Fig. 43. Ampliconi PCR obținuți după amplificarea ADN genomic cu primeri specifici pentru gena tub2.

Tubulinele sunt componente de bază ale microtubulilor, structuri intracelulare implicate în procese esențiale, precum diviziunea celulară, motilitatea ciliară sau flagelară, mecanisme de transport intracelular. Sinteza lor este determinată de 6 familii de gene: alpha-; beta-; gamma-; delta-; epsilon- și zeta-tubulină. Tubulinele alpha-; beta-; gamma sunt prezente în toate organismele eucariote. Tubulinele α și ß formează heterodimeri care constituie unitățile structurale de bază în alcătuirea microtubulilor. Genele pentru tubulinele d-, e-, și g-tubulină au fost identificate doar la animale și unele protiste (Zhao și colab., 2014).

Gena pentru β-tubulină este înalt conservată, deținând o omologie de 60 la 90% între specii. La fungi această genă este extrem de importantă, intervenind și în rezistența la anumite fungicide (Iqbal și Bakeer, 2013).

Gena pentru β-tubulină este studiată pentru a constitui al doilea marker genetic, alături de secvența ITS în taxonomia moleculară în cadrul Regnului Fungi (Einax și Voight, 2003; Harris și colab., 1989; Zhao și colab., 2014; Stielow și colab., 2015)

Rezultatele obținute au arătat un procent de 67% din totalul de tulpini microfungice, ca fiind pozitiv pentru prezența genei pentru tub2, folosind primerii și condițiile de amplificare menționate. Speciile care au prezentat gena pentru tub2 au aparținut genurilor Penicillium și Aspergillus. Pentru G.carnosum s-a obținut o bandă foarte slabă, situată în regiuna 650 pb. La fel și pentru Bjerkandera adusta. Pentru B.bassiana și câteva tulpini aparținând genului Penicillium nu s-au obținut benzi specifice pentru tub2 (Tabelul 16).

Tabel 16. Tulpinile microfungice analizate privind prezența genei tub2.

* ”+” genă prezentă identificată prin bandă specifică în gelul de migrare electroforetică

”-” genă absentă, nicio bandă specifică în gelul de migrare electroforetică

5.3 Concluzii

În cadrul acestui capitol s-a definit și s-a aplicat o metodologie pentru caracterizarea prin tehnici moleculare a tulpinilor de microfungi izolate de pe suprafața bunurilor textile din fibre naturale și din aeromicrobiota Muzeului Național al Țăranului Român (București).

Metodologia a cuprins etapele de extracție a ADN genomic, identificarea moleculară prin amplificarea markerului filogenetic ITS, identificarea unor gene de interes și stabilirea polimorfismului intraspecific prin PCR-RFLP.

Rezultatele obținute au arătat următoarele aspecte:

– genurile predominante în microbiota bunurilor textile din fibre naturale și aeromicrobiotă au fost reprezentate de genurile Penicillium și Aspergillus, rezultat care confirmă datele obținute de alți autori;

– genul Penicillium a prezentat o mare variabilitate de specii, cele 43 de tulpini identificate grupându-se în 14 specii;

– Dintre speciile de Penicillium, P. chrysogenum a fost specia cel mai frecvent întâlnită, aspect identificat și de alți autori, privind microfungii biodeteriogeni asociați Patrimoniului Cultural textil;

– S-au identificat trei genuri diferite de Basidiomicete, aspect particular al acestei cercetări: Ganoderma carnosum, Beauveria bassiana și Bjerkandera adusta.

– Alte specii predominante, identificate prin amplificarea markerului ITS au aparținut genurilor Aspergillus și Cladosporium. Genurile de Ascomicete, cu o singură specie indentificată au fost Alternaria (A.alternata) și Trichoderma (T.citrinoviridae).

– 36 de tulpini din 53 testate au prezentat bandă caracteristică pentru prezența genei tub2 care intervine în sinteza ß-tubulinei, componentă estențială a microtubulilor;

– Tehnica PCR-RFLP poate fi aplicată pentru determinarea polimorfismului intraspecific și pentru identificarea taxonomică cu mare acuratețe a microfungilor, cu ajutorul programului bioinformatic Nebcutter;

Abordarea experimentală a temei acestei lucrări, mai precis identificarea prin tehnici moleculare a microfungilor biodeteriogeni completează caracterizarea fenotipică și furnizează informații suplimentare ce ar putea fi folosite în viitor pentru procesul de intervenție în conservarea preventivă și curativă.

CAP. 6 STUDIUL CAPACITĂȚII DE BIODETERIORARE ACCELERATĂ IN VITRO A SUPORTURILOR TEXTILE NATURALE DE CĂTRE TULPINI MICROFUNGICE SELECTATE

Bunurile textile de patrimoniu din fibre naturale sunt susceptibile la acțiunea factorilor externi, de natură, fizică, chimică și biolgică. Textilele etnografice așa cum sunt cele studiate în această lucrare, pot suferi modificări structurale semnificative ca urmare a acțiunii microfungilor dacă, înainte de a intra în colecția muzeului au fost păstrate în condiții necorespunzătoare de temperatură și umiditate. Dezvoltarea unor metode optime pentru remedierea efectelor induse de biodeteriorare are la bază cunoașterea în profunzime a mecanismelor biologice, biochimice și fizice, ale procesului de biodeteriorare microfungică a fibrelor naturale.

Astfel, obiectivul experimentelor realizate în cadrul acestui capitol a fost de a reproduce în condiții controlate de laborator, procesul de biodeteriorare microfungică al unor tipuri de materiale textile din fibre naturale, similare cu bunurile culturale textile din colecția etnografică a Muzeului Național al Țăranului Român, de către tulpini microfungice selectate. Rezultatele obținute au evidențiat aspecte importante privind intensitatea dezvoltării unor izolate microfungice pe structuri textile naturale celulozice și keratinice cât și diferențe în dezvoltarea microfungilor pe variante tehnologice diferite. Obiectivul a fost realizat prin efectuarea următoarelor etape:

1. Stabilirea și obținerea tipurilor de materiale textile din fibre naturale și obținerea variantelor tehnologice pentru materiale textile din cânepă 100% și in 100%, destinate biodeteriorării in vitro.

2. Stabilirea condițiilor de testare și realizarea în condiții de laborator a testului de biodeteriorare folosind specii microfungice cu activitate celulozolitică determinată anterior, izolate din aeromicrobiota muzeală și bunuri culturale textile.

3. Evalurea gradului de biodeteriorare a structurilor textile celulozice și keratinice supuse testului artificial prin observații macroscopice și microscopice și prin metode fizico-mecanice, spectroscopice și electronomicroscopice.

6.1 Materiale si metode

Nouă tipuri de materiale textile din fibre naturale au fost inoculate cu suspensii celulare de la 3 specii microfungice identificate și caracterizate în etapele anterioare ale cercetării. Testul de biodeteriorare artificială a fost realizat timp de patru săptămâni, iar ulterior țesăturile au fost evaluate prin analize fizico-mecanice, de analiză instrumentală (FTIR și SEM) și prin microscopie optică.

6.1.1 Medii de cultură și reactivi

-Mediu cu cartof : Potato Glucose Agar (Merck, 146726), mediu în plăci de 90 mm sterile, având compoziția: extract din cartof 4 g/L, glucoză 20g/L, agar 17g/L. pH 5.4 – 5,8.

-Mediu Czapek-Dox (Czapek-Dox Agar) (Sanimed, 22739), mediu în plăci de 90 mm, sterile, având compoziția: zaharoză 30g/L, azotat de sodiu 2,00 g/L, fosfat dipotasic 1,00 g/L, sulfat de magneziu 0,50 g/L, clorură de potasiu 0,50 g/L, sulfat feros 0,01 g/L, agar bacteriologic 15g/L, pH 7,3 ± 0,2.

-Mediu Czapek-Dox fără zaharoză: azotat de sodiu 2,00 g/L, fosfat dipotasic 1,00 g/L, sulfat de magneziu 0,50 g/L, clorură de potasiu 0,50 g/L, sulfat feros 0,01 g/L, agar bacteriologic 15g/L, apă ultrapură până la 1000 ml. Mediul s-a sterilizat la 121 0C, timp de 15 min.

-Soluția stoc de săruri minerale: azotat de sodiu 2,00 g/L, fosfat monopotasic 0,7 g/L, fosfat dipotasic 0,3g/L, clorură de potasiu 0,5 g/L, sulfat de magneziu heptahidrat 0,5 g/L, sulfat feros heptahidrat 0,01 g/L, apă ultrapură până la 1000 ml

-Soluția stoc cu agent de umectare: azotat de sodiu 2,00 g/L, fosfat monopotasic 0,7 g/L, fosfat dipotasic 0,3g/L, clorură de potasiu 0,5 g/L, sulfat de magneziu heptahidrat 0,5 g/L, sulfat feros heptahidrat 0,01 g/L, dodecil sulfat de sodiu 0,1 g/L apă ultrapură până la 1000 ml.

6.1.2 Tulpini microfungice selectate pentru testul de biodeteriorare accelerată

Trei tulpini microfungice au fost selectate pentru efectuarea testului de biodeteriorare artificială:

1) Tulpina T1 reprezentând specia Penicillium crustosum conform rezultatelor obținute prin analize moleculare în capitolul 5. Tulpina a fost prelevată și izolată de pe suprafața bunului cultural “Capăt de pernă”, ce are în compoziție in și bumbac.

2) Tulpina T17 reprezentând specia Penicillium glabrum, conform rezultatelor obținute prin analize moleculare în capitolul 5. Tulpina a fost prelevată și izolată din aeromicrobiota din sala depozit 203.

3) Tulpina T42, reprezentând specia Penicillium chrysogenum, conform rezultatelor obținute prin analize moleculare în capitolul 5. Tulpina a fost prelevată și izolată din aeromicrobiota sălii expoziționale ”Școala satului”.

Toate cele trei tulpini au prezentat zonă de hidroliză evidențiată prin testul cu Roșu de Congo indicând sinteza enzimelor cu activitate celulazică conform rezultatelor obținute în capitolul 4 (fig. 44).

a b c

Fig. 44. Zona de hidroliză formată ca urmare a degradării celulozei pentru tulpinile microfungice utilizate în testul de biodeteriorare artificială: a) P.crustosum, b) P.glabrum, c) P.chrysogenum.

6.1.3 Materiale textile naturale supuse testului de biodeteriorare accelerată

Colecția etnografică a Muzeului Național al Țăranului Român cuprinde bunuri culturale textile care au în compoziție fibre naturale, și care au fost prelucrate și obținute în gospdăriile românești tradiționale de-alungul ultimelor trei secole.

Fibrele celulozice precum cânepa, inul și bumbacul reprezintă o parte semnificativă a bunurilor textile din colecția de patrimoniu a muzeului. De aceea, testul de biodeteriorare artificială s-a realizat pe structuri textile naturale, predominant celulozice. S-au testat țesături cu compoziție din fibre de in 100%, fibre de cânepă 100%, fibre de bumbac 100% și fibre de lână 100%.

Materialele textile din fibră de cânepă și in au fost supuse suplimentar unor etape de curățare, cu tehnici folosite în gospodăria tradițională țărănească. Aceste variante tehnologice au fost incluse în testul de biodeteriorare artificială pentru a vedea măsura în care tipul de prelucrare a materialului textil din fibră naturală poate influența gradul de biodeteriorare microfungică.

Materialele textile din fibre de in sau cânepă curățate de componentele non-celulozice au de regulă nuanțe mai deschise, un grad de moliciune mai mare, putând fi astfel folosite pentru confecționarea de articole pentru îmbrăcăminte și articole pentru casă, precum ștergare, fețe de perne etc. Însă această curățare expune fibra celulozică condițiilor mediului ambiant, și o face mai accesibilă acțiunii enzimelor extracelulare sintetizate de microfungi.

Cele nouă tipuri de materiale textile supuse testului de biodeteriorare artificială au fost:

1. Țestură crudă din fibră de cânepă 100%.

2. Țesătură din fibră de cânepă 100% curățată prin expunere la soare.

3. Țesătură din fibră de cânepă 100% curățată cu leșie.

4. Țesătură crudă din fibră de in 100%.

5. Țesătură din fibră de in 100% curățată prin expunere la soare.

6. Țesătură din fibră de in 100 % curățată cu leșie.

7. Țestură din fibră de in 100%, curățată chimic.

8. Țesătură crudă din bumbac 100%.

9. Țesătură din lână 100%.

(1). Țesătura crudă din fibră de cânepă 100%.

Țesătura crudă din fibră de cânepă 100% (fig. 45) a fost obținută prin metode tradiționale și caracterizată din punct de vedere fizico-mecanic. Valorile obținute pentru țesătură și fir sunt prezentate în tabelele 17 și 18. Ambele fire obținute, cel folosit în urzeală și cel folosit în bătătură sunt fire groase. Firul de urzeală se caracterizează prin rezistență superioară și torsionare puternică.

(2). Țesătura din fibră de cânepă 100% curățată prin expunere la soare.

Pentru obținerea unor fire și țesături albite și pretabil a fi folosite pentru confecționarea articolelor de îmbrăcăminte, se folosea leșia, o soluție alcalină obținută prin fierberea cenușei vegetale, expunerea la soare a țesăturii, sau o combinație a acestor două metode (Suciu, 2011).Țesătura albită la soare s-a obținut prin expunerea directă la soare a țesăturii crude din cânepă 100% timp de 30 de zile. Periodic s-a realizat udarea ei și apoi reexpunerea la soare. Mai departe această țesătură a fost folosită în testul de biodeteriorare

(3). Țesătura din fibră de cânepă 100% curățată cu leșie.

Țesătura crudă din fibră de cânepă 100% a fost curățată cu leșie, pentru a obține o țesătură tip tradițional și s-a caracterizat din punct de vedere fizico-mecanic (tabel 19).

(4). Țesătura crudă din fibră de in 100%.

Caracteristicile fizico-mecanice ale țesăturii crude din in 100% (fig. 46) și ale firului și sunt prezentate în tabelele 20 și 21.

(5). Țesătura din fibră de in 100% curățată prin expunerea la soare.

Țesătura din fibră de in 100% curățată la soare s-a obținut prin expunerea directă la soare, pe parcursul a 30 de zile, cu udarea periodică și reeexpunere a țesăturii crude. de in 100%. Caracteristicile fizico-mecanice ale și firului și țesăturii sunt prezentate în tabelele 22 și 23.

(6). Țesătura din fibră de in 100 % curațată cu leșie.

Caracteristicile fizico-mecanice ale acestei țesături sunt redate în tabelele 24 și 25.

(7) Țesătura din fibră de in 100% curațată chimic.

Țesătura curățată prin metode moderne a fost obținută prin tratarrea țesăturii crudă de in cu apă oxigenată și sodă calcinată. Parametrii tehnologici ai firului și țesăturii sunt redați în tabelele 26 și 27.

(8). Țesătura crudă din bumbac 100%.

Țesătura din bumbac 100% folosită în testul de biodeteriorare este o țesătură crudă, descleiată, nefinisată, fără agenți de înălbire optică, cu masa de 110 ± 5 g/m2, cu 32 fire/cm în urzeală și 33fire/cm în bătătură (fig. 47) .

Fig. 47. Țesătura de bumbac folosită în testul de biodeteriorare (mărire 32X)

9). Țesătura din lână 100%.

Parametrii fizico-mecanici ai țesăturii (fig. 48) și firului din lână 100% sunt prezentați în tabelele 28 și 29.

Fig. 48. Țesătura din fibră de lână 100% (16x).

6.1.4 Metoda de testare a capacității de biodeteriorare accelerată in vitro

Testul de biodeteriorare in vitro a materialelor textile s-a realizat conform modului de lucru prevăzut în standardul SR EN 14119: 2004 Încercări pe textile. Evaluarea acțiunii ciupercilor microscopice-Metoda A1: testul de creștere a ciupercilor pe mediu de agar incomplet, și metoda B1: testul de creștere a ciupercilor pe un mediu de agar complet.

Testul a constat în expunerea eșantioanelor textile la acțiunea unei suspensii de celule fungice timp de 28 de zile în condiții controlate în incubator, la 300C. Periodic, la intervale de 3, 7, 14, 21 și 28 de zile s-a evaluat vizual și microscopic, dacă a fost cazul, și s-a notat cu note de la 1 la 5, intensitatea creșterii fungilor filamentoși pe suprafața materialului textil testat. Criteriile de acordare a unei anumite note conform cu standardul menționat sunt prezentate în tabelul 30. La sfârșitul perioadei de expunere, s-au evaluat modificările induse de microfungi la nivel structural și morfologic prin efectuarea de caracterizări fizico-mecanice, de spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourrier (FTIR) și prin microscopie electronică și optică.

Mediile de cultură folosite au fost: mediul Czapek-Dox fără zaharoză, pentru testul de creștere pe mediu incomplet și mediul Czapek-Dox cu zaharoză pentru testul de creștere pe mediu complet. Utilizarea celor două tipuri de medii, fără zaharoză și cu zaharoză, conferă o imagine completă asupra riscului ca un agent microbian să determine un efect biodeteriogen asupra unui tip de material textil. Testarea în condițiile absenței zaharozei, ca sursă de carbon, simulează posibilitatea din mediul real, când există o sursă de contaminare microfungică, dar nu există condiții nutritive suficiente pentru dezvoltarea sa. În schimb, testarea pe mediul de cultură cu zaharoză simulează varianta de biodeteriorare accelerată, agresivă, atunci când există și sursă de contaminare cu microfungi și condiții nutritive favorabile dezvoltării microfungice.

Cele nouă tipuri de materiale textile din fibre naturale, prezentate anterior, au fost supuse procesului de biodeteriorare accelerată. Fiecare material s-a inoculat cu patru tipuri de suspensii celulare:

inoculare cu un sigur tip de suspensie celulară obținută de la fiecare din cele trei tulpini de microfungi selectate;

inoculare mixtă, din amestecul celor trei specii de microfungi folosite în test.

Pentru fiecare eșantion textil și fiecare tip de suspensie celulară s-au testat mediul cu glucoză și mediul fără glucoză.

Tabel 30. Evaluarea intensității dezvoltării microfungice pe epruvetele textile

6.1.4.1 Pregătirea eșantioanelor textile

Pentru fiecare tip de material suspus testării, fiecare tip de suspensie celulară și fiecare mediu de cultură s-au eșantionat câte 4 epruvete textile pe direcția urzelii, de dimensiunea 80 mm x 30 mm și câte 4 epruvete textile martor. Numărul total al eșantioanelor supuse testului accelerat de biodeteriorare a fost de 288.

Înainte de efectuarea testului toate eșantioanele au fost sterilizate prin căldură umedă în autoclavă, la 121 0C timp de 1 oră. Pentru testare, eșantioanele textile au fost dispuse pe linia de mijloc a plăcilor Petri de 90 mm cu mediu de cultură solid.

După perioada de testare de 28 de zile, eșantioanele biodeteriorate au fost mai întâi sterilizate prin căldură umedă în autoclavă, la temperatura de 133 0C timp de 30 de minute. Ulterior, au fost imersate în soluție etanolică 70 % (v/v) timp de o oră. După imersare au fost clătite în apă curgătoare de la robinet și uscate la temepratura camerei pe hârtie de filtru. Aceleași etape pregătitoare înainte și după testare au fost efectuate și pentru eșantioanele martor.

6.1.4.2 Obținerea suspensiilor celulare de testat

Testul de biodeteriorare in vitro s-a efectuat cu patru tipuri de suspensii celulare: trei suspensii celulare reprezentând fiecare tulpină microfugică descrisă la secțiunea de 6.1.2., și o suspensie celulară mixtă, reprezentând un amestec al celor trei tulpini de testat.

Obținerea suspensiilor celulare s-a realizat după modul de lucru descris în standardul SR EN 14119:2004. Etapele efectuate au fost:

– s-a obținut cultura proaspătă prin cultivare pe mediu cu cartof în plăci Petri de 90 mm, timp de 14 zile la 30 0C;

– în fiecare placă Petri s-a adaugat un volum de 10 ml de soluție de săruri minerale cu agent de umectare;

– s-a raclat ușor suprafața culturii fungice cu ajutorul ansei sterile, și s-a filtrat suspensia celulară, printr-un tifon steril;

– s-a centrifugat și s-a aruncat supernatantul;

– s-a resuspendat peleta în 20 ml soluție stoc de săruri minerale și s-a centrifugat din nou;

– după centrifugare, s-a resuspendat în 40 ml soluție stoc;

– s-a ajustat densitatea celulară la 106 celule/ml prin folosirea tehnicii hemacitometrului.

Aceste operații au fost repetate pentru toate cele trei specii. Pentru obținerea inoculului mixt, s-au amestecat volume egale din cele trei suspensii celulare. Inocularea eșantioanelor textile s-a realizat în trei puncte: în stânga eșantionului, în centrul eșantionului textil și în dreapta eșantionului cu un câte un volum de 50 µl de suspensie celulară test.

Măsurarea densității celulare cu ajutorul hemacitometrului

Pentru măsurarea densității celulare din suspesiile celulare ale celor 3 specii fungice folosite pentru testul de biodeteriorarea artificială s-a folosit lama de citire Bürker-Türk (Marienfeld) cu următoarele dimensiuni: adâncime 0,1 mm, suprafața pătratului mic 0,0025 mm2, suprafața pătratului mare 0,04 mm2. Pentru stabilirea densității celulare s-au efectuat următoarele etape:

– lama și lamela s-au curățat cu soluție alcoolică 70%;

– s-a preluat un volum de 20 µl de suspensie celulară și s-a pipetetat între lamă și lamelă până la acoperirea grilei de citire;

– la obiectivul 40x s-au numărat celulele din fiecare pătrat de 0,0025 mm2;

– s-au facut citiri din cele 4 careuri din colțurile grilei de citire, fiecare conținând 16 pătrate de 0,0025 mm2 și s-a facut media citirilor;

– numărul mediu de celule s-a multiplicat cu 104 pentru a exprima valorea în celule/ml suspensie celulară.

6.1.4.3 Metoda pentru evaluarea biodeteriorării prin analiza fizico-mecanică a materialelor textile testate

Eșantioanele textile biodeteriorate și decontaminate așa cum s-a precizat la punctul 6.1.4.1 au fost analizate din punct de vedere fizico-mecanic privind forța maximă de rupere și alungirea la forța maximă de rupere. Această analiză s-a realizat conform standardului SR EN ISO 13934-1. S-a folosit un aparat denumit dinamometru, prevăzut cu o clemă staționară și o clemă mobilă, care se deplasează cu o viteză constantă. Eșantionul de material textil este tensionat între cele două cleme, la o anumită distanță și clema mobila efectuează o mișcare constantă și liniară conform vitezei de deplasare stabilite în standard. Aparatul măsoară forța maximă de rupere, reprezentată de forța înregistrată atunci când epruveta textilă se aduce la rupere, și alungirea la forța maximă de rupere. Înainte de testarea propriu-zisă toate eșantioanele textile sunt menținute în condiții standard de temperatură și umiditate (200C și 65% umiditate relativă) conform standardului SR EN 139:2005.

Parametrii de lucru pentru testarea eșantioanelor biodeteriorate au fost:

– distanța între cleme: 50 mm

– viteza de alungire: 100 mm/min

Au fost analizate din punct de vedere fizico-mecanic câte 2 eșantioane biodeteriorate din fiecare probă textilă.

6.1.4.4 Metoda pentru evaluarea biodeteriorării prin spectrometrie în IR (FTIR).

Spectrometria în infraroșu este o analiză structurală care conferă informații cu privire la tipurile de legături chimice și grupări funcționale prezente într-o substanță chimică, ca urmare a modurilor diferite de vibrație pe care le prezintă prin absorbția radiației IR. Eșantioanele biodeteriorate au fost analizate în comparație cu eșantioanele martor, pentru identificarea modificărilor privind legăturile chimice, apărute în structura fibrelor naturale, ca urmare a activității metabolice a microfungilor dezvoltați pe suprafața materialelor textile.

Investigația spectroscopică s-a realizat la spectrofotometrul în infraroșu cu transformată Fourrier FTS Excalibur 3000 (Digilab, SUA), în modul de transmitanță (T%), într-un interval de numere de undă de la 4000 cm-1 la 400 cm-1.

6.1.4.5 Metoda pentru evaluarea biodeteriorării prin microscopie electronică de baleiaj și microscopie optică

Pentru identificarea modificărilor morfologice ale structurilor textile expuse biodeteriorării artificiale, eșantioanele biodeteriorare și cele martor au fost analizate prin microscopie electronică de baleiaj (SEM- Scanning electron microscopy) și prin microscopie optică. Imaginile electronomicroscopice au fost obținute la microscopul electronic Quanta 200 (FEI, Olanda) iar imaginile de microscopie optică au fost obținute cu ajutorul stereomicroscopului Stereo Discovery.V8 (Carl Zeiss, Germania) și microscopului optic de cercetare AxioImager A2 (Carl Zeiss, Germania).

6.2 Rezultate și discuții

6.2.1 Rezultatele obținute la testul de biodeteriorare accelerată in vitro

Kavkler și colab. au realizat câteva studii privind acțiunea speciilor de fungi izolate de pe suprafața bunurilor culturale textile din muzeele din Slovenia, asupra materialelor textile contemporane din lână, bumbac și in. O parte din aceste materiale textile contemporane a fost îmbătrânită artificial prin expunere la temperature și umiditate (Kavkler și colab., 2015; Kavkler și Demšar, 2012a; Kavkler și Demšar, 2012b). Rezultatele lor au arătat că microfungii induc modificări în structura polimerilor naturali precum depolimerizări, oxidări și hidroliză. Materialele textile din fibre naturale supuse îmbâtrânirii artificiale au fost mai intens biodeteriorate de fungi selectați. În studiile realizate, autorii au identificat diferențe clare între speciile de fungi izolate din mediul muzeal, privind potențialul biodeteriogen.

Imaginile tuturor eșantioanelor biodeteriorate obținute în această lucrare sunt redate în Anexele A3a.-A3d., iar notele acordate pentru intensitatea dezvoltării microfungilor pe suprafața lor se regăsesc în Anexele A.4a-A.4e.

Pentru reprezentările grafice s-au folosit următoarele notații:

CC – țesătura crudă din cânepă % 100%

CS – țesătura din cânepă expusă la soare

CL – țesătura din cânepă curățată cu leșie

IC – țesătura crudă din in 100%

IS – țesătura din in expusă la soare

IL – țesătura din in curățată cu leșie

IX – țesătura din in curățată chimic

B – țesătura din bumbac 100%

L – țesătura din lână 100

Caracteristicile procesului de biodeterioare indus de cele patru tipuri de suspensii celulare, observate la sfârșitul perioadei de 28 de zile au fost:

– Pe mediul cu sursă de carbon (glucoză), tulpinile P.crustosum și P.chrysogenum, urmate de suspensia mixtă au avut dezvoltarea cea mai extinsă pe suprafața tuturor materialelor textile (fig. 49, fig. 51);

Fig.49. Dinamica de creștere a tulpinii P.crustosum pe materialele testate, pe mediu cu glucoză.

Fig. 50. Dinamica de creștere a tulpinii P.crustosum pe materialele testate, pe mediu fără glucoză.

– Pe mediul fără sursă de carbon, suspensia celulară mixtă și tulpina P.chrysogenum au prezentat cea mai mare dezvoltare a miceliului la toate materialele textile testate. Creșterea tulpinii P.chrysogenum pe mediul fără glucoză s-a observat și în cazul țesăturii de cânepă crudă, care a prezentat în general valori mici ale notelor intensității de creștere a microfungilor pentru ambele tipuri de medii (fig. 52);

Fig.51. Dinamica de creștere a tulpinii P.chrysogenum pe materialele testate, pe mediu cu glucoză.

Fig. 52. Dinamica de creștere a tulpinii P.chrysogenum pe materialele testate, pe mediu fără glucoză.

– Tulpina P.glabrum a avut cea mai mică intensitate a creșterii pe ambele tipuri de medii, cu glucoză și fără glucoză. Diferența de intensitate a creșterii a apărut doar prin cultivarea pe mediul cu glucoză pentră țesătura din bumbac, in curățat chimic și lână (fig. 53-54);

– Țesătura din lână a fost colonizată rapid de toate tulpinile, acestea prezentând colonii bine sporulate după 7 zile de testare, pe mediul cu sursă de carbon (fig. 57). Acest rezultat a arătat prezența unui metabolism proteolitic al tulpinilor microfungice. Însă, acest comportament enzimatic nu s-a mai regăsit în cazul testării pe mediul fără sursă de carbon, ceea ce a indicat faptul că metabolismul proteolitic este mai degrabă unul de tip secundar.

Experimenul a arătat că în absența sursei de carbon, ce poate fi ușor metabolizată până la mono și dizaharide, tulpinile microfungice s-au adaptat structurii complexe a fibrelor de cânepă și in, alcătuită din componente celulozice dar și non-celulozice, putând determina acoperirea eșantioanelor testate de cânepă crudă și in crud în totalitate, la sfârșitul perioadei de testare. În cazul testării pe mediul cu sursă de carbon, microfungii s-au dezvoltat predominant pe mediul de cultură, întrucât acesta constituia o sursă rapidă de hrană.

Fig.53. Dinamica de creștere a tulpinii P.glabrum pe materialele testate, pe mediu cu glucoză.

Fig.54. Dinamica de creștere a tulpinii P.glabrum pe materialele testate, pe mediu fără glucoză.

– Suspensia celulară mixtă nu a determinat implicit un efect de tip cumulativ al tuturor celor trei tulpini fungice componente. Dezvoltarea sa pe suprafața tuturor materialelor textile testate a prezentat caracteristicile de creștere ale tulpinii P.glabrum pe mediul cu sursă de carbon și similaritate cu tulpina P.chrysogenum pe mediul fără glucoză (fig. 55 – 56);

Fig.55. Dinamica de creștere a suspensiei mixte ale celor trei tipuri de tulpini microfungice pe materialele testate, pe mediu cu glucoză.

Fig.56. Dinamica de creștere a suspensiei mixte ale celor trei tipuri de tulpini microfungice pe materialele testate, pe mediu fără glucoză .

Fig. 57. Biodeteriorarea țesăturii din lână de către suspensiile test, după 7 zile de incubare (de la stînga la dreapta, rîndul 1, rândul 2: tulpina P.crustosum, tulpina P.glabrum, P.chrysogenum, suspensia mixtă).

Procesul de biodeteriorare a fiecărui tip de material testat a prezentat următoarele particularități:

1. Țesătura crudă din cânepă a fost colonizată în procent de 100% doar în condițiile testării pe mediu fără sursă de carbon (fig. 58);

2. Situația menționată la punctul anterior a fost similară și pentru țesătura din cânepă expusă la soare (fig. 59);

Fig. 58. Dinamica de creștere comparativă pe suprafața țesăturii din cânepă crudă a tulpinilor P.crustosum, P.glabrum, P.chrysogenum și suspensia mixtă, pe mediile cu sursă de carbon (Glu+) și fără sursă de carbon (Glu-)

Fig. 59. Dinamica de creștere comparativă pe suprafața țesăturii din cânepă expusă la soare a tulpinilor tulpinilor P.crustosum, P.glabrum, P.chrysogenum și suspensia mixtă, pe mediile cu sursă de carbon (Glu+) și fără sursă de carbon (Glu-).

3. Țesătura din cânepă curățată cu leșie a prezentat suplimentar față de celelalate două tipuri de țesături din cânepă testate, colonizarea și în cazul testării pe mediu cu sursă de carbon pentru tulpinile P.chrysogenum, P.crustosum și suspensia mixtă;

4. Seria de țesături din in se poate grupa în trei tipuri de biodeteriorare:

Tipul 1, în care este cuprinsă țesătura crudă de in, care a prezentat cel mai redus grad de dezvoltare a tulpinilor microfungice. Doar tulpina P.chrysogenum, pe mediul fără glucoză a determinat o acoperire aproape completă a eșantionului testat (fig. 60, fig. 64 – 65).

Tipul 2, în care sunt cuprinse țesăturile din in curățate la soare și cu leșie, care prezintă un grad mai mare de biodeteriorare determinat de suspenisa mixtă și tulpina P.chrysogenum pe mediul fără glucoză și de tulpinile P.crustosum și P.chrysogenum pe medul cu glucoză (fig. 61).

Fig. 60. Dinamica de creștere comparativă pe suprafața țesăturii crude din in a tulpinilor P.crustosum, P.glabrum, P.chrysogenum și suspensia mixtă, pe mediile cu sursă de carbon (Glu+) și fără sursă de carbon (Glu-).

Fig. 61. Dinamica de creștere comparativă pe suprafața țesăturii din in expusă la soare a tulpinilor P.crustosum, P.glabrum, P.chrysogenum și suspensia mixtă, pe mediile cu sursă de carbon (Glu+) și fără sursă de carbon (Glu-).

Tipul 3, caracteristic inului curățat chimic care prezintă un intens grad de colonizare realizat pe ambele medii de cultură de către tulpinile P.crustosum, P. chrysogenum, și suspensia mixtă. Tulpina P.glabrum a colonizat întreaga suprafață doar pe mediul cu sursă de carbon (fig.62).

Fig. 62. Dinamica de creștere comparativă pe suprafața țesăturii din in curățată chimic a P.crustosum, P.glabrum, P.chrysogenum și suspensia mixtă, pe mediile cu sursă de carbon (Glu+) și fără sursă de carbon (Glu-).

5. Țesătura din bumbac a fost colonizată în proporție de 100% pe ambele medii de cultură, suspensia mixtă prezentând cele mai mari valori ale intensității de creștere la sfârșitul testului;

6. Țesătura din lână a fost colonizată predominant doar pe mediul cu sursă de carbon. Doar tulpina P. crustosum a prezentat o dezvoltare mai intensă și pe mediul fără glucoză (Fig. 63)

Fig. 63. Dinamica de creștere comparativă pe suprafața țesăturii din lână a tulpinilor P.crustosum, P.glabrum, P.chrysogenum și suspensia mixtă, pe mediile cu sursă de carbon (Glu+) și fără sursă de carbon (Glu-).

Fig. 64. Dezvoltarea tulpinii P.crustosum pe mediu fără sursă de carbon pe suprafața țesăturilor

crude din cânepă și in (stânga și dreapta)

Fig. 65. Dezvoltarea tulpinii P.chrysogenum pe mediu fără sursă de carbon pe suprafața țesăturilor crude din cânepă și in (stânga și dreapta)

Rezultatele obținute în studiul de biodeteriorare accelerată in vitro au permis diferențierea a două comportamente bio-ecologice ale microfungilor utilizați:

O dezvoltare strict extensivă a miceliului fungal, care se caracterizează prin acoperirea întregii suprafețe de material textil, însa miceliul este slab dezvoltat, foarte puțin sporulat, predominant steril. El determină preponderent o biodeteriorare estetică și funcțională a suportului textil. Acest tip de dezvoltare s-a întâlnit pentru materialele textile din cânepă, bumbac, lână însămânțate cu tulpini microfungice în absența sursei de carbon.

Dezvoltarea intensivă a miceliului fungal, când tulpina s-a dezvoltat foarte bine, formând colonii bine sporulate. Tulpina fie a acoperit o suprafață mică, fie a acoperit întreaga suprafață de material textil, dar intensitatea dezvoltării în ambele situații a fost mare. Acest tip de colonizare poate induce pe lângă o biodeteriorarea estetică și una bio-chimică, mucegaiul degradând structural și profund substratul textil. Acest tip de dezvoltare s-a întâlnit în cazul țesăturilor din bumbac, lână, și in curățat chimic pe mediul cu sursă de carbon (Glu+), și la seria de țesături din in pe mediu fără sursă de carbon (Glu-) colonizate de suspensia mixtă și de tulpina P. chrysogenum.

Aceste două comportamente metabolice diferite se regăsesc și în rezultatele obținute la evauarea forței maxime de rupere și analiza FTIR.

6.2.2 Rezultatele obținute la evaluarea biodeteriorării prin analiza fizico-mecanică a materialelor textile testate

Prin determinarea forței maxime de rupere s-a putut evalua degradarea efectivă, la nivel structural a fibrelor naturale biodeteriorate. Modificarea semnificativă a forței de rupere a eșantionului textil biodeteriorat indică o degradare morfologică și chimică a structurii polimerice a fibrelor naturale.

Forța maximă de rupere și alungirea la forța maximă au fost determinate pentru:

– seria de țesături din cânepă biodeteriorate de tulpina P.crustosum,

– seria de țesături de in expuse la acțiunea tulpinilor P.crustosum, P.glabrum și a suspensiei celulare mixte,

– țesătura de lână expusă la acțiunea tulpinilor P.crustosum, P.glabrum și a suspensiei celulare mixte.

Rezultatele obținute se corelează pozitiv cu tipurile de intensitate a dezvoltării microfungilor pe suprafața eșantioanelor textile, definite în subcapitolul 6.2.1. Astfel s-a constatat că tulpina P.crustosum care la testul de biodeteriorare a determinat o creștere extensivă pe suprafața eșatioanelor din cânepă pe mediul de cultură fără zaharoză (la cânepa crudă) și redusă echivalentă notei 3 pe mediul cu zaharoză, nu induce modificări evidente ale forței de rupere pentru seria țesăturilor de cânepă (fig.66).

La seria țesăturilor din in s-au obținut modificări mici ale forței de rupere. Cea mai semnificativă reducere a forței de rupere a fost determinată de tulpina P.crustosum țesăturii de lână pe mediul cu glucoză aspect care s-a observat macroscopic ca urmare a creșterii de tip intensiv .

Fig. 66. Forța de rupere a eșatioanelor biodeteriorate de către tulpina P.crustosum, pe mediu cu zaharoză (Glu+) și fără zaharoză (Glu-).

Așa cum s-a observat în capitolul 6.2.1 suspensia celulară mixtă a determinat o colonizare intensivă a eșantioanelor textile testate pe mediul fără sursă de carbon, colonizare datorată cel mai probabil acțiunii tulpinii P.chrysogenum. Ca urmare a dezvoltării miceliene apar modificări semnficative ale forței de rupere pentru seria de țesături de in. Țesătura de lână este semnificativ degradată în condițiile creșterii pe mediu cu zaharoză (fig. 67).

Fig. 67. Forța de rupere a eșatioanelor biodeteriorate de către suspensia celulară mixtă, pe mediu cu zaharoză (Glu+) și fără zaharoză (Glu-)

Diferențele intensității de dezvoltare miceliană pe mediile cu sursă de carbon și fără sursă de carbon pentru suspensia celulară mixtă reflectate prin valorile forței de rupere sunt redate în figurile 68-72. S-au observat diferențe ale valorii forței de rupere pentru țesătura de in crud colonizată de P.glabrum , creșterea pe mediul fără glucoză inducând o deteriorarea mai intensă și o pierdere mai mare a forței de rupere (fig. 68). De asemenea suspensia mixtă a determinat o pierdere semnificativă a forței de rupere în cazul dezvoltării pe mediul fără glucoză pentru țesăturile din in expus la soare, in curățat cu leșie și in curățat chimic (fig. , fig. 70, fig. 71)

Degradarea la nivel structural a fibrelor de in a fost evidentă și vizual pentru câteva eșantioane din seria țesăturilor de in și lână, acestea prezentând porțiuni complet distruse după efectuarea biodeteriorări accelerate in vitro (fig. 73.)

6.2.3 Rezultatele obținute la evaluarea biodeteriorării prin FTIR

Spectrometria in infraroșu este utilizată în ultimii ani pentru identificarea fibrelor naturale în cazul textilelor istorice și arheologice (Kavkler și colab., 2011; Odlyha și colab., 2007; Žemaitytė și colab. 2006) întrucât este o metodă non-invazivă și care furnizeză date importate privind structura materialelor.

Au fost conduse numeroase studii de spectrometrie în IR privind elucidarea structurii moleculare a biopolimerilor naturali precum celuloza și lignina componentele principale alături de hemiceluloză ale fibrelor de cânepă și in (Boeriu și colab., 2004; Fan și colab., 2012; Garside și Wyeth, 2006; Titok și colab., 2010).

În cadrul studiului efectuat în acest capitol, au fost investigate prin spectrometrie în infraroșu cu transformată Fourrier (FTIR), modificărișle privind prezența și poziția benzilor de transmisie apărute în țesăturile de cânepă, in și lână, ca urmare a acțiunii biodeteriogene a tulpinilor microfungice.

Două tipuri de modificări au fost urmărite:

1. Diferențe privind intensitatea benzilor de transmisie în IR față de eșantioanele martor nebiodeteriorate,

2. Apariția unor benzi noi sau absența unor benzi la anumite numere de undă față de țesăturile martor.

Au fost analizate prin FTIR:

1) Eșantioanele din seria de țesături de cânepă biodeteriorate de tulpina P.crustosum;

2) Eșantioanele din țesăturile din de in expuse la acțiunea tulpinilor P.crustosum, P.glabrum și a suspensiei celulare mixte;

3) Eșantioanele din țesătura de lână expusă la acțiunea tulpinilor P.crustosum, P.glabrum și a suspensiei celulare mixte.

Componenta principală a fibrelor de in și cânepă este celuloza care este un biopolimer format prin legături de hidrogen între atomii de carbon 1 și 4 ai unităților structurale β-D-glucoză. Lignina este consituită din 3 unități structurale denumite p-hidroxifenil (H), guaiacil (G) and siringil (S), care au la bază trei tipuri de alcooli aromatici: alcoolul para cumarilic, alcoolul coniferilic și alcoolul sinapic. Constituenții secundari ai fibrelor liberiene, in și cânepă sunt reprezentați de ceruri, minerale, pectină și substanțe hidrosolubile (Asandei și Grigoriu, 1983; Fan și colab., 2012; Batra, 2007)

Analiza FTIR a materialelor din cânepă biodeteriorate a relevat prezența unor benzi specifice celulozei, hemicelulozei și ligninei. Reprezentarea spectrelor de transmisie în IR este redată în figurile 74 și 75 iar atribuirea benzilor caracteristice este prezentată în tabelul 31.

Deși fibrele lignocelulozice prezintă heterogenitate (Dorado și colab., 2011), la analiza FTIR a eșantioanelor din cânepă martor și biodeteriorate s-a putut observa existența unui patern al benzilor spectrale, format din următoarele regiuni de absorbție mai intensă în IR:

regiune situată între 3800 cm-1-3600 cm-1

regiunea situată între 3000 cm-1-2800 cm-1

regiunea situată între 2400 cm-1-2200 cm-1

regiunea 1650 cm-1 -1600 cm-1

regiunea situată între 900 cm-1 – 800 cm-1

Eșantioanele biodeteriorate prezintă următoarele modificări raportat la spectrul FTIR al țesăturii de cânepă crudă martor (fig. 73 și fig. 74):

– Intensificarea absorbției în regiunea 3800 cm-1-3600 cm-1 pentru probele de cânepă notate 25 și 29, reprezentând cânepa crudă biodeteriorată de tulpina P.crustosum pe mediu cu glucoză și cânepa curățată la soare biodeteriorată de P.crustosum pe mediul fără glucoză. Aceste diferențe în absorbția IR sunt date de modificări ale vibrațiilor de valență ν(O-H) ale grupărilor hidroxil libere din celuloză sau lignină.

– Reducerea semnificativă a absorbției în prima regiune, 3800 cm-1- 3600 cm-1 pentru probele 26 și 31 reprezentând cânepa crudă biodeteriorată de tulpina P.crustosum pe mediu fără glucoză și respectiv țesătura de cânepă expusă la soare, biodeteriorată de tulpina P.crustosum pe mediu cu glucoză;

– Intensificarea absorbției pentru toate probele biodeteriorate în regiunea 2400 cm-1 – 2200 cm-1 comparativ cu țesătura crudă de cânepă netestată. Această modificare a putut fi determinată de expunerea la soare sau de tratarea cu leșie a țesăturii crude din cânepă;

– Reducerea intensității sau chiar absența benzii de absorbție pentru toate probele biodeteriorate în regiunea 900 cm-1- 800 cm-1 comparativ cu țesătura crudă de cânepă martor, indicând modificări în structura cristalină a celulozei și reducerea absorbției specifice vibrațiilor C-H în afara planului în pozițiile 2,5 și 6 ale unității guiacil din lignină.

– Țesăturile din cânepă, varianta expusă la soare și varianta tratată cu leșie prezintă o modificare a benzii de absorbție de la 2905 cm-1. Această bandă este caracteristică vibrațiilor de întindere ν(C-H) specifice ligninei din grupările CH2 și CH3 (Boeriu și colab., 2004), ceea ce arată un process de îndepărtare a ligninei din fibrele lignocelulozice.

Fig. 74. Spectrele FTIR pentru țesătura crudă de cânepă (CC), pentru eșantioanele biodeteriorate de P.crustosum pe mediu Glu+ și Glu- (probele 25și 26) și pentru probele de țesătură din cânepă expuse la soare și biodeteriorate de P.crustosum pe mediu Glu+ și Glu- (probele 31și 29).

Fig. 75. Spectrele FTIR pentru pentru probele de țesătură din cânepă curățată cu leșie (CL) și biodeteriorate de Ti1273 pe mediu Glu+ și Glu- (probele 53 și 55).

Tabelul 31. Atribuirea benzilor caracteristice din spectrele FTIR ale eșantioanelor de cânepă.

Biodeteriorarea determinată de acțiunea micorfungilor test a fost evidentă în cazul țesăturii din in expusă la soare și a țesăturii din in curățată chimic, comparative cu proba de in crud (fig. 76) Aceste două tratamente aplicate inițial au determinat o primă modificare a spectrelor FTIR față de martorul de țesătură crudă de in, iar acțiunea suplimentară biodeteriogenă a adus modificări ulterioare substanțiale în spectrele de transmisie. Astfel, eșantionul din țesătura de in expusă la soare și biodeteriorat prin acțiunea suspensiei celulare mixte, a prezentat absența completă a benzii din regiunea 3800 cm-1-3600 cm-1 reprezentată de vibrațiile de întindere ale legăturilor de hidrogen ν(O-H) din celuloză și hemiceluloză (Célino și colab. 2013).

Eșantioanele de țesătură din in curățat chimic expuse la acțiunea tulpinii P.glabrum pe mediu cu sursă de carbon și a suspensiei celulare mixte pe mediu fără sursă de carbon nu au prezentat absorbție în regiunile 3800 cm-1-3600 cm-1 și 900 cm-1-800 cm-1, indicând degradarea intensă a legăturilor glucozidice din lanțul macromolecular al celulozei (fig. 77-78).

Fig. 76. Spectrul FTIR al țesăturii crude de in.

Fig. 77. Spectrul FTIR al țesăturii de in curățată chimic biodeteriorată de tulpina P.glabrum pe mediu cu sursă de carbon.

Fig. 78. Spectrul FTIR al țesăturii de in curățată chimic biodeteriorată de suspensia celulară mixtă pe mediu fără sursă de carbon

Eșantioanele de lână biodeteriorate prezintă o intensificare a benzilor de absorbție la 3400 cm-1 și 800 cm-1 față de țesătura de lână martor (fig. 79.)

Fig. 79. Spectrele FTIR pentru țesătura din lână martor (L) și pentru eșantioanele biodeteriorate de către tulpinile P.crustosum pe mediu Glu+ și Glu- (probele 32 și 30), P.glabrum pe mediu Glu+ și Glu- (probele 3 și 4) și suspensia celulară mixtă (probele 33 și 34).

6.2.4 Rezultatele obținute la evaluarea biodeteriorării prin microscopie electronică de baleiaj și microscopie optică

Aspectul morfologic determinat de dezvoltarea microfungilor pe suprafața materialelor textile din fibre naturale a fost evidențiat prin microscopie electronică de baleiaj (SEM) și microscopie optică. Imaginile microscopice au arătat modul de rupere al fibrelor și firelor naturale ca urmare a acțiunii enzimelor extracelulare microbiene (fig. 84 și 85). Ruperea fibrelor și firelor evidentă la nivel fizic, macroscopic este precedată de rupturi transversale și longitudinale ale fibrelor (Kavkler și Demšar, 2012a). Imaginile electronomicroscopice arată degradarea suprafeței fibrelor dar și hifele microfungice distruse prin etapa de sterilizare realizată după biodeteriorarea artificială (fig. 80 – 83) (Seves și colab., 2000).

6.3 Concluzii

În cadrul acestui capitol s-a realizat un amplu studiu privind biodeteteriorarea materialelor textile din fibre naturale, precum fibrele liberiene (cânepa și inul), bumbacul și lâna, de către tulpini microfungice care au fost izolate din spațiul muzeal al Muzeului Național al Țăranului Român (București). Gradul de dezvoltare al fungilor filamentoși și efectele produse la nivel morfologic și structural au fost evaluate macroscopic, prin analize fizico-mecanice, spectrofotometric, și prin microscopie electronică și optică.

Evaluarea gradului de dezvoltare pe suporturile organice a tulpinilor microfungice a evidențiat două tipologii bio-chimice dependente de compoziția fibroasă a materialelor textile, de prelucrările și finisările la care au fost supuse acestea, de caracteristica nutritivă a mediului în care se produce atacul microfungic și de tulpina care produce biodeteriorarea.

Cele două comportamente metabolice identificate în urma efectuării studiului au fost:

Dezvoltarea extensivă a tulpinii microfungice. Procesul de biodeteriorare determinat de creșterea de tip extensiv s-a caracterizat la nivel macroscopic prin prezența miceliului fungal pe întreaga zonă biodeteriorată, însă acesta a fost slab format, constituit din miceliu steril sau hife fără structuri reproductive formate, uneori vizibil doar la microscop. Acest miceliu a determinat o biodeteriorare estetică și constituie sursă de contaminare latentă pentru alte materiale textile sau chiar pentru același material textil. La nivel structural, analizele fizico-mecanice au arătat că dezvoltarea de tip extensiv nu presupune o modificare majoră a calității materialului textil, însă rezultatele furnizate prin spectrometria în IR au arătat prezența unor modificări ale benzilor de absorbție comparativ cu țesăturile martor. Aceste modificări pot fi puse și pe seama gradului mare de heterogenitate a fibrelor naturale, însă modificările în lanțul biopolimeric induse de acțiunea microfungilor pot fragiliza și deschide calea către o degradare semnificativă.

Dezvoltarea intensivă a tulpinii microfungice. Procesul de biodeteriorare determinat de dezvoltarea intensivă a constat în prezența miceliului fungal foarte bine sporulat, fie localizat într-o anumită porțiune a materialului textil, fie dispus pe întreaga suprafață a eșntionului. În acest caz s-au putut observat chiar și caracteristicile de colonie a speciei microfungice utilizate în test. Au apărut modificări fizico-mecanice semnificative ale eșantioanelor textile biodeteriorate, relevate și de alterări la nivel molecular, de exemplu prin disparița benzilor de absorbție FTIR ale celulozei.

Rezultatele obținute în acest studiu au arătat că procesul de biodeteriorare in vitro efectuat pe țesăturile din in, diferite prin tipul de finisare aplicat, este diferit, și în strânsă corelație cu tipul de prelucrare. Astfel, cu cât țesătura de in a fost mai intens curățată de componentele non-celulozice, așa cum a fost cazul inului curățat chimic, cu atât biodeteriorarea microfungică a fost mai intensă. Chiar și tulpina Penicillium glabrum care a avut cel mai redus efect biodeteriogen dintre cele 4 tipuri de inoculi testați, a avut o dezvoltare intensivă pe țesătura de in curățată chimic pe mediul cu sursă de carbon. La modul general, rezultatele obținute au arătat că intensitatea biodeteriorării este în strânsă corelație cu gradul de ”deschidere moleculară” a lanțurilor biopolimerilor constituenți ai fibrelor naturale care pot astfel furniza o sursă nutritivă rapidă, accesibilă enzimelor extracelulare sintetizate de microfungi.

Cele trei tulpini utilizate în studiul de biodeteriorare, P. crustosum, P. glabrum și P. chrysogenum au prezentat un metabolism principal celulozic și un metabolism secundar proteolitic. În absența sursei de carbon, însă metabolsimul proteolitic a fost redus. Dezvoltarea tulpinilor pe țesătura din lână, în absența gucozei a fost de tip extensiv.

Tulpinile de Penicillium utilizate, deși aparțin aceluiași gen, au avut un evident efect biodeteriogen variat. Cel mai intens efect a fost determinat de P. chrysogenum, urmat de P. crustosum. Comparativ cu acestea două P. glabrum a avut un efect biodegradadiv redus, în special pe seria de țesături din cânepă. P. glabrum s-a dezvoltat mai bine atunci când în mediul de cultură a existat sussă de carbon. Efectul biodeteriogen al suspensiei celulare mixte a prezentat particularități ale speciilor componente și nu un efect cumulativ. Astfel, pe anumite tipuri de țesături a determinat un efect similar speciei P. glabrum, iar în cazul altor țesături și în special la testarea pe mediul fără sursă de carbon a prezentat tipul de dezvoltare întâlnit la P. chysogenum.

Strategiile de conservare a bunurilor culturale textile pot lua în considerare următoarele aspecte derive din acest studiu:

– observarea periodică a suprafeței bunurilor culturale textile, la nivel macroscopic dar și microscopic pentru identifcarea structurilor miceliene, hife sau/și structuri reproducătoare, condii și conidiofori;

– elaborarea unor metode nondestructive pentru îndepărtarea miceliului steril, în cazul biodeteriorării estetice generate de microfungi cu dezvoltare extensivă;

– folosirea unor materiale biocompatibile cu structura bunurilor culturale din fibre naturale, care să permite reconstrucția unei zone afectată de dezvoltarea microfungică intensivă, materiale care să conducă la susținerea în întregime a elementelor și structurii textile biodeteriorate.

CONCLUZII GENERALE

Studiul efectuat privind tulpinile de microfungi cu efect de biodeteriorare a bunurilor textile de Patrimoniu a condus la formularea următoarelor concluzii generale:

1. Speciile care colonizează aeromicrobiota și bunurile culturale textile, prezintă o mare diversitate și ele aparțin preponderent genurilor Penicillium, Aspergillus, Cladosporium. Speciile microfungice identificate au prezentat capacitatea de a rezista la temperaturi relativ mici de 200C, temperatura medie înregistrată în muzeu. Printre speciile de fungi izolate s-au regăsit și specii aparținând Basidiomicetelor.

2. Tulpinile microfungice izolate au prezentat capacitatea de a degrada celuloza, și trei tulpini din genul Penicillium au indus efecte de biodeteriorare, la nivel morfologic și structural, unor materiale textile din fibre naturale (cânepă, in, bumbac, lână).

3. Tulpinile microfungice izolate au prezentat gena tub2, cu rol esențial în realizarea proceselor celulare și au prezentat profile de restricție specie-specifice.

4. Studiul prezent reprezintă prima abordare realizată în România, de identificare prin tehnici clasice combinate cu tehnici moleculare a tulpinilor microfungice prezente în aeromicrobiotă și pe suprafața bunurilor textile dintr-o colecție etnografică de Patrimoniu Cultural.

5. Prezentul studiu reprezintă prima descriere, la nivel european, a diferențelor privind efectul de biodeteriorare realizat de tulpini de microfungi pe variante tehnologice diferite ale unui anumit tip de fibră naturală.

6. Studiul demonstrează necesitatea monitorizării procesului de biodeteriorare și pe alte colecții de Patrimoniu Cultural, cu evidențierea caracteristicilor și corelațiilor cu parametrii ambientali și starea de conservare pentru elaborarea strategiilor optmizate de conservare preventivă.

LUCRĂRI PUBLICATE PE PARCURSUL ELABORĂRII TEZEI

Articole

1. Hortensia Clara Rădulescu, Irina Gheorghe, Gratiela Gradisteanu Pircalabioru, Adriana Ispas, Cristina Popescu, Georgeta Roșu, Mariana Carmen Chifiriuc, Veronica Lazăr. 2018. Molecular characterization based on Internal Transcribed Spacer (ITS) marker sequence of fungal strains isolated from heritage ethnographic textiles. Roumanian Biotechnological Letters. Acceptat pt.publicare în 2018. IF 0,363.

2. Monica Dinu, Clara Hortensia Radulescu, Gheorghe Nicula, Roxana Radvan, Ioana Maria Cortea. 2015. Characterization of contemporary bast textiles and investigation of induced ageing effects for complex Cultural Heritage restoration of textile artifacts. Industria Textila 66 (6): 353-359. ISSN 1222—5347.

http://www.revistaindustriatextila.ro/images/Textila_nr_6__2015.pdf IF 0.57

3. Hortensia Clara Radulescu, Georgeta Roșu, Cristina Popescu, Adriana Ispas, Pyerina Carmen Ghituleasa, Veronica Lazăr. 2017. A microbial survey of the museal airborne fungal biodeteriogens. Ge-conservación 1 (11): 86-94. ISSN 1989-8568.

http://www.ge-iic.com/ojs/index.php/revista/article/view/457 BDI

Alte lucrări

1. Carmen Gaidau, Mihaela Niculescu, A.Georgiana Vesa, Clara Radulescu, Stefana Jurcoane, Petruta Cornea, Florentina Israel-Roming, L. Florentina Pascu. 2016. Cercetări privind realizarea și eco-etichetarea articolelor din blană ovine biodegradabile. Industria textilă 67 (1): 39-45. . ISSN 1222—5347.

http://www.revistaindustriatextila.ro/images/Textila_no_1_2016.pdf IF 0.57

2. Holger Fischer, Hortensia Clara Radulescu and Sven Wartenberg, 2016. Development of advanced compatible materials for the restoration of cultural heritage assets (Mythos): first results. Proc. Rom. Acad., Series B, 18 (1): 43-49. ISSN 1454-8267

http://www.acad.ro/sectii2002/proceedingsChemistry/doc2016-1/art06Fischer.pdf BDI

3. H. Fischer, H.Wiese, C. Radulescu, P. Rödel. 2015. Development of advanced compatible materials for the restoration of cultural heritage assets (mythos): Artificial ageing of bast fibres. Vlakna a textil (Fibres and Textiles) 1: 13-16. ISSN 1335-0617. http://vat.ft.tul.cz/Archive/VaT_2015_1.pdf BDI

4. Clara Radulescu, Mircea Vinatoru, Jamie Beddow, Veronica Lazar, Laurentiu Dinca, Eadaoin Joyce, Carmen Ghituleasa, Timothy Mason. 2014. Fabrics acquiring antimicrobial properties by sonochemical nanoparticles embeding, Industria Textila 65 (5): 247-253. ISSN 1222-5347

http://www.certex.ro/Certex/IndustriaTextila/Textila_nr_5_2014%20web.pdf IF 0.57

Articole și rezumate în volume ale manifestărilor științifice

În străinătate

1. A. Ispas, C. Popescu, G. Roșu, H. C. Rădulescu, H. Fischer, P. Roedel, M. Dinu, R. Radvan. 2016. Conservation and Valorization of Heritage Ethnographic Textiles. In: Ioannides M. et al. (eds) Digital Heritage. Progress in Cultural Heritage: Documentation, Preservation, and Protection. EuroMed 2016. Lecture Notes in Computer Science, vol 10059. Springer, Cham, pp. 151–159 DOI: 10.1007/978-3-319-48974-2_17.

Co-autor. Conferință internațională cu cotație ISI

2. Rădulescu, H.C., Lazăr, V., Roșu, G., Popescu, C., Ispas, A., Ghițuleasa, P.C. A microbial survey of the museal airborne fungal biodeteriogens. 5th International Conference “Youth in Conservation of Cultural Heritage” YOCUCU 2016, 21-23 September 2016, Madrid, Spain. Book of Abstracts, p.200. ISBN: 978-84-617-4237-0.

Autor principal. Prezentare orală. Conferință internațională.

3.Rădulescu, H.C., Lazăr, V., Roșu, G., Popescu, C., Ispas, A., Ghițuleasa, P.C. Molecular and classical analyses for fungal identification from textile heritage objects. International Conference of biodeterioration and protection of cultural heritage, Lodz, Poland, 8-9 September 2016. Book of Abstracts. p.62 ISBN 978-83-63929-05-3.

Autor principal. Prezentare orală. Conferință internațională.

4. Fischer, H.; Wiese, H.; Rădulescu, C.; Rödel, P.: Development of Advanced Compatible Materials for the Restoration of Cultural Heritage Assets (MYTHOS): Artificial Ageing of Bast Fibres. In Team of Authors (eds.): 20th international conference STRUTEX (Proceedings). p. 123 – 126. Technical University of Liberec, Liberec, CZ 2014. ISBN 978-80-7494-139-9.

Co-autor. Conferință internațională

În țară

1. Hortensia Clara Rădulescu, Irina Gheorghe, Adriana Ispas, Cristina Popescu, Georgeta Roșu, Mariana Carmen Chifiriuc, Veronica Lazăr. Caracterizarea microfungilor izolați din ambientul muzeal și bunuri culturale textile etnografice. În: Volum de rezumate. Sesiunea de comunicări științifice a studenților Facultății de Biologie 02 iunie 2017, Ed. Ars Docendi 2017 ISSN 2559-396X. p.80

2. P. Rödel, C.Radulescu, H. Fischer. Development of advanced compatible materials for the restoration of cultural heritage assetss (Mythos): Fibre DNA analysis. Proceedings ale Conferinței Internaționale TexTeh VII „Creating the future of textiles”, 22-23 octombrie, 2015, București, Romania. Vol. 7: 229-235. ISSN 2068-9101

Co-autor. Conferință internațională.

3. Carmen Gaidau, Mihaela Niculescu, Demetra Simion, Clara Radulescu, Adriana Subțirică, Andreea Vesa, Viorica Tamaș. Eco-efficient treatment of medical wool on sheepskins with plant extracts. Proceedings ale Conferinței Internaționale TexTeh VII „Creating the future of textiles”, 22-23 octombrie, 2015, București, Romania. Vol. 7: 331-340. ISSN 2068-9101

Co-autor. Conferință internațională.

4. Hortensia Clara Rădulescu, Roxana Radvan, Monica Simileanu, Georgeta Roșu, Adriana Ispas, Cristina Popescu, Holger Fischer, Philipp Roedel, Laura Chiriac,Gheorghe Nicula, Carmen Ghițuleasa. Preservation of the European Cultural Heritage of the historical textile artifacts from museum collections. Proceedings 15th World Textile Conference AUTEX 2015, June 10-12, 2015, Bucharest, Romania. ID 182, p.1-16. ISBN: 978-606-685-276-0.

Autor principal. Prezentare orală. Conferință internațională.

5. H. Fischer, C. Radulescu, S. Wartenberg, Development of advanced compatible materials for the restoration of cultural heritage assets (Mythos): first results, Conferința Internațională Tex Teh VI – The Future of Textiles, 17-18 octombrie 2013, București, România. Proceedings. p. 157-164. ISSN 2068-9101

Co-autor. Conferință internațională.

BIBLIOGRAFIE

1. Andersen B., Frisvad J.C., Søndergaard I., Rasmussen Ib.S., Larsen L.S. 2011. Association between fungal species and water-damaged building materials. Applied and Environmental Microbiology 77: 4180-4188.

2. Anderson Strand E. 2014. Experimental Textile archaeology – a link to the past? Workshop Traditional Textile Craft – An Intangible Cultural Heritage? The Jordan Museum, Amman, http://conferences.saxo.ku.dk/traditionaltextilecraft/keynote_speakers/presentations/Eva_Andersson_Strand_.pdf

3. Abe K. 2010. Assessment of the environmental conditions in a museum storehouse by use of a fungal index. International Biodeterioration & Biodegradation 64 (1): 32-40.

4. Abdel-Kareem O. 2010. Fungal deterioration of historical textiles and approaches for their control in Egypt. e-Preservation Science 7: 40-47

Abdel-Kareem, O., Harith, M. A. 2008. Evaluating the use of laser radiation in cleaning of copper embroidery threads on archaeological Egyptian textiles. Applied Surface Science 254: 5854-5860.

5. Abidi N., Hequet E., Cabrales L. 2012. Capitol 5 Application of Fourrier transform infrared spectroscopy to study cotton fibres. În Fourier Transform-Materials Analysis, Salih S.M. (Ed.). InTech, 89-114.

6. Abass, M. H., 2013. A PCR ITS-RFLP method for identifying fungal contamination of date palm (Phoenix dactylifera L.) tissue cultures. African Journal of Biotechnology12(32: 5054-5059.

7. Abraham R.E., Wong C.S., Puri M. 2016. Enrichment of cellulosic waste hemp (Cannabis sativa) hurd into non-toxic microfibers. Materials 9 (7):562.

8. Adams R.I., Bateman A.C., Bik, H.M., Meadow J.F. 2015. Microbiota of the indoor environment: a meta-analysis. Microbiome 3:49.

9. Ali N., Athar M.A., Khan Y.H., Muhammad Idrees M., Dawood Ahmad D. 2014. Regulation and improvement of cellulase production: Recent advances. Natural Resources 5:857-863.

10. Aljanabi, S.M., Martinez, I., 1997. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acid Research 25 (22): 4692-4693.

11. Allsopp, D., Seal, K., Gaylarde, C. 2004. Introduction to biodeterioration. Second Ed. Cambridge University Press, Cambridge, 237 pag.

12. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.

13. Amer, O.E., Mahmoud, M.A., El-Samawaty, A.-R. M.A., Sayed, S.R.M., 2011. Non-liquid nitrogen-based-method for isolation of DNA from filamentous fungi. African Journal of Biotechnolgy 10 (65): 14337-14341.

14. Amore A., Giacobbe S., Faraco V. 2013. Regulation of cellulase and hemicellulose gene expression in Fungi. Current Genomics, 14: 230-249.

15. Andretta M., Coppola F., Modelli A., Santopuoli N., Seccia L. 2017. Proposal for a new environmental risk assessment methodology in cultural heritage protection. Journal of Cultural Heritage 23: 22-32.

16. Andretta M., Coppola F., Seccia L. 2016. Investigation on the interaction between the outdoor environment and the indoor microclimate of a historical library. Journal of Cultural Heritage 17: 75-86.

17. Asandei N., Grigoriu A., Chimia și structura fibrelor. Editura Academiei Republicii Socialiste România, București, 1983

18. Avellaneda-Torres L.M., Pulido C.P.G., Rojas E.T. 2014. Assessment of cellulolytic microorganisms in soils of Nevados Park, Colombia. Brazilian Journal of Microbiology 45 (4): 1211-1220

19. Bakri M.K.B., Jayamani E. 2016. Comparative study of functional groups in naturals fibers: Fourrier transform infrared analysis (FTIR). International Conference on futuristic trends in engineering, sciences, humanities and technology (FTESHT-16), Gwalior, 167- 174.

20. Batra S.K. 2007. Capitolul 8. Other long vegetable fibres: abaca, banana, sisal, henequen, flax, ramie, hemp, sunn and coir. În: Handook of fiber chemistry. 3rd edition, Lewin M. (Ed.), Taylor and Francis, 453-520.

21. Bender Jørgensen L., Grömer, K. 2012. The Archaeology of textiles-Recent advances and new methods. Portal. The yearbook of the Croation Conservation Institut (Godišnjak Hrvatskog restauratorskog zavoda), Zagreb. No. 3: 45-68.

22. Bensch K., J.Z. Groenewald, J. Dijksterhuis, M. Starink-Willemse, B. Andersen, B.A. Summerell, H.-D. Shin, F.M. Dugan, H.-J.Schroers, U. Braun, P.W. Crous. 2010. Species and ecological diversity within the Cladosporium cladosporioides complex (Davidiellaceae, Capnodiales). Studies in Mycology 67: 1–94.

23. Bensch K., Braun U., Groenewald J.Z., Crous P.W. 2012. The genus Cladosporium. Studies in Mycology 72: 1–401.

24. Barnett H.L., Hunter B.B. 1998. Illustrated genera of Imperfect Fungi. Fourth Ed. The American Phytopahtological Society, St.Paul, Minnesota, 218 p.

25. Berghe, I. V., Gleba, M., Mannering, U. 2009. Towards the identification of dyestuffs in Early Iron Age Scandinavian peat bog textiles. Journal of Archaelogical Science 36: 1910-1921.

26. Blyskal B. 2009. Fungi utilizing keratinous substrates. International Biodeterioration & Biodegradation 63 (6): 631-653.

27. Błaszczyk L., Siwulski M., Sobieralski K., Lisiecka J., Jędryczka M. 2014. Trichoderma spp. – application and prospects for use in organic farming and industry. Journal of Plant Protection Research 54 (4): 309-317.

28. Boeriu C.G., Bravo D., Gosselink R.J.A., van Dam J.E.G. 2004.Characterisation of structure-dependent functional properties of lignin with infrared spectroscopy. Industrial crops and products 20: 205-218.

29. Borrego S., Lavin P., Perdomo I., de Sarvi S.G., Guiamet P. 2012. Determination of indoor air quality in archives and biodeterioration of the documentary heritage. În ISRN Microbiology 2012, ID articol 680598, 10 pag. doi:10.5402/2012/680598.

30. Bounia A. 2014. Codes of ethics and museum research. Journal of Conservation and Museum Studies 12 (1): 1-7.

31. Bridge, P.D., Arora, D.K, 1998. Interpretation of PCR methods for species definition. În: Application of PCR in mycology. P.D. Bridge, D.K. Arora, C.A. Reddy și R.P. Elander (Ed.), Cab International, 63-84.

32. Cabral J.P.S. 2010. Can we use indoor fungi as bioindicators of indoor air quality? Historical perspectives and open questions. Science of the total environment 408 (20): 4285-4295.

33. Cappitelli, F., Pasquariello, G., Tarsitani, G., Sorlini, C. 2010. Scripta manent? Assessing microbial risk to paper heritage. Trends in Microbiology 18 (12): 538-542.

34. Capodicasa, S., Fedi, S., Porcelli, A.M., Zannoni, D., 2010. The microbial community dwelling on a biodeteriorated 16th century painting. International Biodeterioration & Biodegradation 64 (8): 727-733.

35. Cenis, J.L., 1992. Rapid extraction of fungal DNA for PCR amplification. Nucleic Acid Research 20 (9): 2380

36. Cocca, M., D`Arienzo, L., D`Orazio, L., Gentile, G., Mancarella, C., Martuscelli, E., Polcaro, C. 2006. Water dispersed polymers for textile conservation: a molecular, thermal, structural, mechanical and optical characterization. Journal of Cultural Heritage 7: 236-243.

37. Colombini, P. M., Andreotti, A., Baraldi, C., Degano, I., Lucejko, J. J. 2007. Colour fading in textiles: A model study on the decomposition of natural dyes. Microchemical Journal 85: 174-182.

38. Coman I., Constantin M., Rogut O., Gogu M. 2012. Etiologia și terapia infecțiilor fungice. Editura Performantica, Iași, 254 p.

39. Conti, C., Colombo, C., Realini, M., Zerbi, G., Matousek, P., 2014. Subsurface Raman analysis of thin painted layers. Applied Spectroscopy OA. 68 (6): 686-691.

40. Corgnati S.P., Fillippi M. 2010. Assessment of thermo-hygrometric quality in museums: Method and in-field application to the “Duccio di Buoninsegna” exhibition at Santa Maria della Scala (Siena, Italy). Journal of Cultural Heritage 11 (3): 345-349.

41. Cruse M., Telerant R., Gallagher Th., Lee Th., Taylor J.W. 2002. Cryptic species in Stachybotrys chartarum. Mycologia 94 (5): 814-822.

42. Cybulska M., Maik, J. 2014. Herringbone twill fabrics in Early Medieval Poland: Imports or local production? În: A Stitch in Time: Essays in Honour of Lise Bender Jørgensen. Sophie Bergerbrant și Sølvi Helene Fossøy (Eds). Gotarc series A. Gothenburg archaeological studies. Reprocentralen, Humanities Department, Gothenburg University, Gothenburg, 317-329.

43. Cybulska M., Kuberski S., Maik J., Orlińska-Mianowska E. 2013. Figural embroidery from Tum Collegiate Church – analysis, reconstruction and identification. În: NESAT XI. North European Symposium for Archaeological Textiles XI, Johanna Banck-Burgess și Carla Nübold (Eds.), Verlag Marie Leidorf, Rahden/Westf. 185-191.

44. Cybulska, M. 2010. Reconstruction of archaeological textiles. Fibres & Textiles in Eastern Europe 18 (3): 100-105.

45. Cybulska, M., Jedraszek-Bomba, A., Kuberski, S., Wrzosek, H. 2008. Methods of chemical and physicochemical analysis in the identification of archaeological and hystorical textiles. Fibres & Textiles in Eastern Europe 16 (5): 67-73.

46. Dai D., Fan M. 2010. Characteristic and performance of elementary hemp fibre. Materials science and applications 1:336-342.

47. Dantur K.I., Enrique R., Björn Welin B., P Castagnaro A.P. 2015. Isolation of cellulolytic bacteria from the intestine of Diatraea saccharalis larvae and evaluation of their capacity to degrade sugarcane biomass. AMB Express 5:15. DOI 10.1186/s13568-015-0101-z

48. De Hoog, G.S., Zalar, P., Urzi, C., De Leo, F., Yurlova, N.A., Sterflinger, K., 1999. Relationships of dothideaceous black yeasts and meristematic fungi based on 5.8S and ITS rDNA sequence comparaison. Studies in Mycology 43: 31-37.

49. Dendis, M., Horváth, R., Michálek, J., Růžička, F., Grijalva, M., Bartoš, M., Benedik, J., 2002. PCR-RFLP detection and species identification of fungal pathogens in patients with febrile neutropenia. Clinical Microbiology and Infection 9: 1191-1202.

50. Dentinger, B.T.M., Margaritescu, S., Moncalvo, J.-M., 2010. Rapid and reliable high-throughput methods of DNA extraction for use in barcoding and molecular systematics of mushrooms. Molecular Ecology Resources 10: 628-633.

51. Diba, K., Mirhendi, H., Kordbacheh, P., Rezaie, S., 2014. Development of RFLP-PCR method for the identification of medically important Aspergillus species using single restriction enzyme MwoI. Brazilian Journal of Microbiology 45 (2): 503-507.

52. Dorado J., Almendros G., Field J.A., Sierra-Alvarez R. 2001. Infrared spectroscopy analysis of hemp (Cannabis sativa) after selective delignification by Bjerkandera sp. at different nitrogen levels. Enzyme and Microbial Technology 28: 550-559.

53. Dodu A. (Coord.) 2002. Manualul inginerului textilist, Editura Agir, București, 1563 pag.

54. Duncan, S. M., 2007. Fungal Diversity and Cellulytic Activity in the Historic Huts, Ross Island, Antarctica. Teză de doctorat, Universitatea Waikato, Noua Zeelandă http://researchcommons.waikato.ac.nz/handle/10289/2563

55. Eiland M. L. III, 2003. Carpets of the Ming Dynasty? East and West 53:1/4 December: 179-208.

56. Eiland M. L. III, 1993. The past re-made: the case of oriental carpets. Antiquity 67: 859-863.

57. Eiland M. 2002. Woven treasures of Bamberg. Minerva, The International Review of Ancient Art and Archaeology 13 (5): 17-21.

58. Einax E., Voigt K., 2003. Oligonucleotide primers for the universal amplification of ß-tubulin genes facilitate phylogenetic analysis in the regnum Fungi. Organsims, diversity and Evolution 3: 185-194.

59. Eggins, H.O.W., Oxley, T.A. 1980. Biodeterioration and Biodegradation. International Biodeterioratin Bulletin 16 (2): 53-56.

60. Ettenauer, J., Piñar, G., Sterflinger, K., Gonzalez-Muñoz, M.T., Jroundi, F., 2011. Molecular monitoring of the microbial dynamics occurring on historical limestone buildings during and after the in situ application of different bio-consolidation treatments.

Science of the Total Environment 409: 5337–5352.

61. Ettenauer, J.D., Piñar, G., Lopandic, K., Spangl, B., Ellersdorfer, G., Voitl, C., Sterflinger, K., 2012. Microbes on building materials — Evaluation of DNA extraction protocols as common basis for molecular analysis. Science of the Total Environment 439: 44–53.

62. Ettenauer, J., Piñar, G., Tafer, H., Sterflinger, K., 2014. Quantification of fungal abundance on cultural heritage using real time PCR targeting the β-actin gene. Frontiers in Microbiology 5, articol 262: 1-8.

63. Fan M., Dai D., Huang B. 2012. Capitolul 3. Fourrier Transform Spectroscopy for natural fibres. În: Fourier Transform-Materials Analysis, Salih S.M. (Ed.). InTech, 45-69.

64. Fedi, M.E., Cartocci, A., Taccetti, F., Mando, P.A. 2008. AMS radiocarbon dating of mediveal textile relics: The frocks and the pillow of St. Francis of Assisi. Nuclear instruments and methods in Physics research B 266: 2251-2254.

65. Ferdyn-Grygierek J. 2016. Monitoring of indoor air parameters in large museum exhibition halls with and without air-conditioning systems. Building and Environment 107:113-126.

66. Florencio C., Couri S., Sanchez Farinas C. 2012 Correlation between agar plate screening and solid-state

fermentation for the prediction of cellulase production by Trichoderma strains. Enzyme Research Vol. 2012, Article ID 793708, 7 p.

67. Flórez A.B., Álvarez-Martỉna P., López-Dỉaz, T.M., Mayo B., 2007. Morphotypic and molecular identification of filamentous fungi from Spanish blue-veined Cabrales cheese, and typing of Penicillium roqueforti and Geotrichum candidum isolates. International Dairy Journal 17: 350–357.

68. Foladi S., Hedayati M.T., Shokoi T., Mayahi S. 2013. Study on fungi in archives of offices, with a particular focus on Stachybotrys chartarum. Journal of Medical Mycology 23 (4): 242-246.

Fredricks, D.N, Smith, C., Meier, A., 2005. Comparison of six DNA extraction methods for recovery of fungal DNA as assessed by quantitative PCR. Journal of Clinical Microbiology 43 (10): 5122–5128.

69. Gardes, M. and Bruns, T. D. 1993. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes: application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecology 2:113-118.

70. Garcia, R.C.J. 2016. Evaluación aeromicrobiológica del depósito del Centro de Documentación del Museo Nacional de la Música de Cuba. Ge-conservación 9: 117-126.

71. Garside P., Wyeth P. 2006. Identification of cellulosic fibres by FTIR spectroscopy: differentiation of flax and hemp by polarized ATR FTIR. Studies in Conservation 51 (3): 205-211.

72. Gielkens, M.M.C., Dekkers, E., Visser, J., de Graaf, L.H., 1990. Two cellobiohydrolase-encoding genes from Asspergillus niger require D-xylose and the xylanolytic transciptional activator XlnR for their expression. Applied and Environmental Microbiology 65 (10): 4340-4345.

73. Gheorghiu M., Mateoniu M. (Coord.) 2012. Muzeul Țăranului Român. Ghidul expoziției permanente. Editura Litera, București, 2012.

74. Ghio S., Di Lorenzo G.S., Lia V., Talia P., Cataldi A., Grasso D., Campos E. 2012. Isolation of Paenibacillus sp. and Variovorax sp. strains from decaying woods and characterization of their potential for cellulose deconstruction. Int J Biochem Mol Biol 3(4):352-364.

75. Giurescu D., Roșu G. (Coord.). 2004. Ghidul Muzeului Țăranului Român. Editura MȚR, București, 208 pag.

76. Gleba M. 2011. Textiles studies: sources and methods. Kubaba 2: 2-26.

77. Griffiths, L. J., Anyim, M., Doffman, S. R., Wilks, M., Millarand, M. R., Agrawal, S. G., 2006. Comparison of DNA extraction methods for Aspergillus fumigatus using real-time PCR. Journal of Medical Microbiology 55: 1187–1191.

78. Goli G., Cocchi L., Marco T., Fioravanti M. 2017. Test of a device for the active control of environmental humidity in museum display cases. International Journal of Conservation Science 8 (1): 43-50.

79. Gontia-Mishra, I., Tripathi, N., Tiwari, S., 2014. A simp,e and rapid DNA extraction protocol for filamentous fungi efficient for molecular studies. Indian Journal of Biotechnology 13: 536-539.

80. Gurtner, C., Heyrman, J., Piñar, G., Lubitz, W., Swings, J., Rölleke, S., 2000. Comparative analyses of the bacterial diversity on two different biodeteriorated wall paintings by DGGE and 16S rDNA sequence analysis. International Biodeterioration & Biodegradation 46: 229-239.

81. Gutarowska B., Skora J., Zduniak K., Rembisz D. 2012. Analysis of the sensitivity of microorganisms contaminating museums and archives to silver nanoparticles. International Biodeterioration & Biodegradation 68: 7-17.

82. Harris G.S., Keath E.J., Medoff J. 1989. Characterization of alpha and beta tubulin genes in the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. Journal of General Microbiology 135: 1817-1832.

83. Hendricks C.W., Doyle J.D., Hugley B. A new solid medium for enumerating cellulose-utilizing bacteria in soil. Applied and Environmental Microbiology, 61 (5): p. 2016–2019.

84. Hong, S.-B., Shin, H.-D., Frisvad, J.C., Samson, R.A., 2005. Polyphasic taxonomy of Aspergillus fumigatus and related species. Mycologia 97 (6): 1316-1329.

85. Hoshino, Y. T. 2012. Molecular Analyses of Soil Fungal Community – Methods and Applications, în Soil Health and Land Use Management (Ed. Maria C. Hernandez Soriano), InTech: 279-304.

86. Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J., 2010. Accuracy, precision and method detection limits of quantitative PCR for airborne bacteria and fungi. Applied and Environmental Microbiology 76 (21): 7004-7012.

87. Hui, T.S. 2013. Morphological characterization and sequence analysis of 5.8s-its region of Trichoderma species. A project report submitted to the Department of Biological Science Faculty of Science Universiti Tunku Abdul Rahman in partial fulfillment of the requirements for the degree of Bachelor of Science (Hons) Biotechnology. eprints.utar.edu.my/844/1/BT-2013-09ADB03477-1.pdf

88. Hyde, K.D., Udayanga, D., Manamgoda D.S., Tedersoo, L., Larsson, E., Abarenkov, K., Bertrand, Y.J.K., Oxelman, B., Hartmann ,M., Kauserud, H., Ryberg, M., Kristiansson, E., Nilsson, R.H. 2013. Incorporating molecular data in fungal systematics: a guide for aspiring researchers. Current Research in Environmental & Applied Mycology 3 (1): 1-32 Doi 10.5943/cream/3/1/1

89. Iori, A., Scala, V., Cesare, D., Pinzari, F., D’Egidio, M.G., Fanelli, C., Fabbri, A. A.,Reverberi, M., Serranti, S., 2015. Hyperspectral and molecular analysis of Stagonospora nodorum blotch disease in durum wheat. Eur J Plant Pathol 4: 689-702.

90. Inoue M., Koyano M. 1991. Fungal contamination of oil paintings in Japan. International Biodeterioration 28: 23-35.

91. Iqbal Z., Bakeer W. 2013. Isolation, cloning and sequence analysis of β-tubulin gene from Bolinea lutea F23523, a potential strobilurin producing fungus. Int. J. Agric. Biol., 15: 1008‒1012.

92. Jroundi F., Gonzalez-Muñoz, M.T., Sterflinger K., Piñar G., 2015. Molecular tools for monitoring the ecological sustainability of a stone bio-consolidation treatment at the Royal Chapel, Granada. PLoS ONE 10(7): e0132465. doi:10.1371/journal.pone.0132465

93. Kavkler K., Cimerman N.G., Zalar P., Demšar A. 2015. Deterioration of contemporary and artificially aged cotton by selected fungal species. Polymer degradation and stability 113: 1-9.

94. Kavkler K., Cimerman N.G., Zalar P., Demšar A. 2015b. Fungal contamination of textile objects preserved in Slovene museums and religious institutions. International Biodeterioration & Biodegradation 97: 51-59.

95. Kavkler K., Demšar A. 2012a. Impact of fungi on contemporary and accelerated aged wool fibres. Polymer degradation and stability 87: 786-792.

96. Kavkler K., Demšar A. 2012b. Application of FTIR and Raman spectroscopy to qualitative analysis of structural changes in cellulosic fibres. Tekstilec 55 (1): 19-31.

97. Kavkler K., Cimerman N.G., Zalar P., Demšar A. 2011. FTIR spectroscopy of biodegraded historical textiles. Polymer degradation and stability 96: 574-580.

98. Katušin-Ražem, B., Ražem, D., Braun, M. 2009. Irradiation treatment for the protection and conservation of cultural heritage artefacts in Croatia. Radiation Physics and Chemistry 78: 729-731.

99. Kim Y., Nandakumar M.P., Marten M.R., 2007. Proteomics of filamentous fungi. Trends in Biotechnology 25 (9): 395-400.

100. Krakova L., Chovanova K., Puškarova A., Bučkova M., Pangallo D. 2012. A novel PCR-based approach for the detection and classification of potential cellulolytic fungal strains isolated from museum items and surrounding indoor environment. Letters in Applied Microbiology 54: 433-440.

101.Kramer R., van Schijndel J., Schellen H. 2017. Dynamic setpoint control for museum indoor climate conditioning integrating collection and comfort requirements: development and energy impact for Europe. Building and Environment 118:14-31.

102. Kramer R., van Schijndel J., Schellen H. 2016. Impact of ASHRAE’s museum climate classes on energy consumption and indoor climate fluctuations: Full-scale measurements in museum Hermitage Amsterdam 130: 286-294.

103. Krupa, P., 1999. Identification by PCR-RFLP of a Fungus isolated from mycorrhizal roots of a distinguishable birch growing in areas disturbed by industry. Polish Journal of Environmental Studies 8 (3): 161-163

104. Krupinska B., Van Grieken R., De Wael K. 2013. Air quality monitoring in a museum for preventive conservation: results of a three-year study in the Plantin-Moretus Museum in Antwerp, Belgium. Microchemical Journal 110: 350-360.

105. Kouymjian D. 2014. The Berlin Dragon-Phoenix Carpet and its probable Armenian origin. În: Armenian Rugs and Textiles. An Overview of Examples from Four Centuries, Exhibition catalogue of rugs from public and private collections in the Republic of Armenia, the USA, France, Switzerland and Austria, Armenian Rugs Society, Viena, 16-31.

106.La Gennusa M., Rizzo G., Scaccianoce G., Nicoletti, F. 2005. Control of indoor environments in heritage buildings: experimental measurements in an old Italian museum and proposal of a methodology. Journal of Cultural Heritage 6: 147-155

107. Lazăr V., Herlea V., Cernat R., Bulai D., Balotescu M.C., Moraru A. 2004. Microbiologie generală. Manual de lucrări practice. Editura Universtății București, 320 pag.

108. Lazăr V. 2003. Microbial Adherence, Romanian Academy Press, Bucharest, 225 pag. ISBN:973-27-09928.

109. Lee, S.B., Taylor, J.W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores. În PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press, cap. 34: 282-287.

110. Lee, Y., Lee, J., Kim, Y., Choi, S., Ham, W. S., Kim, K.-J. 2008. Investigation of natural dyes and ancient textiles from Korea using TOF-SIMS. Applied Surface Science 255: 1033-1036.

111. Lehmann, E. H., Vontobel, P., Deschler-Erb, E., Soares, M. 2005. Non-invasive studies of objects from cultural heritage. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 542: 68-75.

112. Leijonhufvud G., Henning A. 2014. Rethinking indoor climate control in historic buildings: The importance of negotiated priorities and discursive hegemony at a Swedish museum. Energy Research & Social Science 4: 117-123.

113. Li, C., Lister, D. L., Li, H., Xu, Y., Cui, Y., Bower, M. A., Jones, M. K., Zhou, H. 2011. Ancient DNA analysis of desiccated wheat grains excavated from a Bronze Age cemetery in Xinjiang. Journal of Archaelogical Science 38: 115e-119.

114. Liang Y.L., Zhang Z., Wu M., Wu Y., Feng J-X. 2014. Isolation, screening, and identification of cellulolytic bacteria from natural reserves in the subtropical region of china and optimization of cellulase Production by Paenibacillus terrae ME27-1. BioMed Research International Vol. 2014, Article ID 512497, 1-13. http://dx.doi.org/10.1155/2014/512497

115. Lindahl, B.L., Nilsson, R.H., Leho Tedersoo, L., Kessy Abarenkov, K., Carlsen, T., Kjøller, R., Kõljalg, U., Taina Pennanen, T., Søren Rosendahl, S., Jan Stenlid, J., Kauserud, H., 2013. Fungal community analysis by high-throughput sequencing of amplified markers – a user’s guide. New Phytologist 199: 288–299.

116. Liu B., Ichinose T., He M., Kobayashi F., Maki T., Yoshida S., Yoshida Y., Arashidani K., Takano H., Nishikawa M., Sun G., Shibamoto T. 2014. Lung inflammation by fungus, Bjerkandera adusta isolated from Asian sand dust (ASD) aerosol and enhancement of ovalbumin-induced lung eosinophilia by ASD and the fungus in mice. Allergy, Asthma and Clinical Immunology 10: 10. doi:10.1186/1710-1492-10-10.

117. Liu, D., Coloe, S., Baird, R., Pedersen, J., 2000. Rapid mini-preparation of fungal DNA for PCR. Journal of Clinical Microbiology 38 (1): 471.

118. López-Miras, M., Piñar, G., Romero-Noguera, J., Bolỉvar-Galiano, F.C., Ettenauer, J., Sterflinger, K., Martỉn-Sánchez, I., 2012 Microbial communities adhering to the obverse and reverse sides of an oil painting on canvas: identification and evaluation of their biodegradative potential. Aerobiologia (Bologna) 29(2): 301–314.

119. López-Miras, M., Piñar, G., Romero-Noguera, J., Bolỉvar-Galiano, F.C., Ettenauer, J., Sterflinger, K., Martỉn-Sánchez, I., 2012 Microbial communities adhering to the obverse and reverse sides of an oil painting on canvas: identification and evaluation of their biodegradative potential. Aerobiologia (Bologna) 29(2): 301–314.

120. López-Miras, MdM., Martỉn-Sánchez, I., Yebra-Rodrỉguez, Á., Romero-Noguera, J., Bolỉvar-Galiano, F., Ettenauer, J.D., Sterflinger, K., Piñar, G., 2013. Contribution of the microbial communities detected on an oil painting on canvas to its biodeterioration. PLoS ONE 8(11): e80198. doi:10.1371/journal.pone.0080198

121. Mâlcomete O. 1995. Fibre textile. Ed. Fundației. „Gh. Zane“, Iași, 250 pag.

122. Magnuson JK, Lasure LL (2002) Fungal diversity in soils as assessed by direct culture and molecular techniques. Paper presented at the 102nd General Meeting of the American Society for Microbiology, Salt Lake City, 19–23 May 2002

123. Maheshwari R., 2005. Fungi. Experimental methods in Biology. Mycology series. Bennett J.W (Ed.). Taylor and Francis Group, 240 pag.

124. Mallo A.C., Eliades L.A., Nitiu D.S., Saparrat M.C.N. 2017. Fungal monitoring of the indoor air of the Museo de La Plata Herbarium, Argentina. Revista Iberoamericana de Micologia 34 (2): 99-105.

125. Margariti, C., Protopapas, S., Orphanou, V. 2011. Recent Analyses of the Excavated Textile Find from Grave 35 HTR73, Kerameikos Cemetery, Athens, Greece. Journal of Archaelogical Science 38 (3): 522-527.

126. Martin, K.J., Rygiewicz, P.T., 2005. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region environmental DNA extracts. BMC Microbiology 5:28-38.

127. Marinescu M. 1975. Arta populară românească. Țesături decorative. Editura Dacia, Cluj-Napoca, 172 pag.

128. Martínez-Molina A., Tort-Ausina I., Cho S., Vivancos J-L. 2016. Energy efficiency and thermal comfort in historic buildings: a review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 61: 70-85.

129. Melo, S.C.O., Pungartnik, C., Cascardo, J.C.M., Brendel, M., 2006. Rapid and efficient protocol for DNA extraction and molecular identification of the basidiomycete Crinipellis perniciosa. Genetics and Molecular Research 5 (4):851-855.

130. Michaelsen, A., Pinzari, F., Ripka, K., Lubitz, W., Piñar, G., 2006. Application of molecular techniques for identification of fungal communities colonising paper material. International Biodeterioration & Biodegradation 58: 133–141.

131. Michaelsen, A., Pinar, G., Montanari, M., Pinzari, F., 2009. Biodeterioration and restoration of a 16th-century book using a combination of conventional and molecular techniques: A case study. International Biodeterioration & Biodegradation 63 (2): 161-168.

132. Michaelsen, A., Piñar, G., Pinzari, F., 2010. Molecular and microscopical investigation of the microflora inhabiting a deteriorated italian manuscript dated from the thirteenth century. Microbial Ecology 60: 69–80.

133. Micheluz A., Manente S., Tigini V., Prigione V., Pinzari F., Ravagnan G., Varese G.C. 2015. The extreme environment of a library: Xerophilic fungi inhabiting indoor niches. International Biodeterioration & Biodegradation 99:1-7.

134. Micheluz, A., Manente, S., Prigione, V., Tigini, V., Pinzari, F., Varese, G.C., Ravagnan, G., 2014. Fungal contamination specifically related to the use of compactus shelvings: the case study of a venetian library. Art`14, 11th International Conference on non-destructive analysis and microanalysis for the diagnostics and conservation of cultural and environmental heritage. Conference paper.

135. Miller L.G. 1959. Use of dinitrosalicylic acid for determination of reduction sugar. Analytical Chemistry 31 (3): 426-428.

136. Mirhendi, H., Makimura, K., Khoramizadeh, M., Yamaguchi, H., 2006. A one-enzyme PCR-RFLP assay for the identification of six medically important Candida species. Japan Journal of Medical Mycology 47: 225-229.

137. Mirhendi, H., Diba, K., Kordbacheh, P., Jalalizand, N., Makimura, K., 2007. Identification of pathogenic Aspergillus species by a PCR-restriction enzyme method. Journal of Medical Microbiology 56: 1568-1570.

138. Mishra, A.K., Sharma, K., Misra, R.S., 2008. Rapid and efficient method for the extraction of fungal oomycetes genomic DNA. Genes, Genomes and Genomics 2 (1): 57-59.

139. Montenegro, G., Puch, S.S., Jewtuchowicz, V.M., Pinoni, M.V., Relloso, S., Temporitti, E., Iovannitti, C.A., Mujica, M.T., 2009. Phenotypic and genotypic characterization of Aspergillus lentulus and Aspergillus fumigatus isolates in a patient with probable invasive aspergillosis. Journal of Medical Microbiology 58:391-395.

140. Montone, K.T., Feldman, M.N., 2009. In situ detection of Aspergillus 18S ribosomal RNA sequences using a terminally biotinylated locked nucleic acid (LNA) probe. Diagn. Mol. Pathology. 18 (4): 239-42.

141. Moore D., Robson G.D., Trinci A.P.J. 2011. 21st Century Guidebook to Fungi. Cambridge University Press, Cambridge, 627 pag.

142. Moreira, S.R., Schwan, R.F., De Carvalho, E.P., Wheals, A.E., 2001. Isolation and identification of yeasts and filamentous fungi from yoghurts in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology 32: 117-122.

143. Montanari, M., Melloni, V., Pinzari, F., Innocenti, G., 2012. Fungal biodeterioration of historical library materials stored in Compactus movable shelves. International Biodeterioration & Biodegradation 75: 83-88.

144. Moslem M.A., Mashraqi, A., Abd-Elsalam K.A., Bahkali A.H., Elnagaer M.A. 2010. Molecular detection of ochratoxigenic Aspergillus species isolated from coffee beans in Saudi Arabia. Genetics and Molecular Research 9 (4): 2292-2299.

145. Motková, P., Vytřasová, J., 2011. Comparaison of methods for isolating fungal DNA. Czek.J.Food.Sci. 29 (Special issue): S76-S85.

146. Nielsen K.F. 2003. Mycotoxin production by indoor molds. Fungal Genetics and Biology 39 (2): 103-117.

147. Nilsson RH, Tedersoo L., Abarenkov K., Ryberg M., Kristiansson E., Hartmann M., Schoch C.L., Nylander J.A.A., Bergsten J., Porter T.M., Jumpponen A., Vaishampayan P., Ovaskainen O., Hallenberg N., Bengtsson-Palme J., Eriksson K.M., Larsson K.-H., Larsson E., Kõljalg U. 2012 Five simple guidelines for establishing basic authenticity and reliability of newly generated fungal ITS sequences. MycoKeys 4: 37–63. doi: 10.3897/mycokeys.4.3606.app

148. Nilsson, R.H., Kristiansson, E., Ryberg, M., Nils Hallenberg, N., Larsson, K.-H., 2008. Intraspecific ITS variability in the Kingdom Fungi as expressed in the International Sequence Databases and its implications for molecular species identification. Evolutionary Bioinformatics 4: 193–201.

149. Niu, C., Kebede, H., Auld, D.L., Woodward, J.E., Burow, G., Wright, R.J., 2008. A safe inexpensive method to isolate high quality plant and fungal DNA in an open laboratory environment. African Journal of Biotechnology 7 (16):2818-2822.

150. Nosch M.-L. 2014. Linen Textiles and Flax in Classical Greece: Provenance and Trade. În: Textile Trade and Distribution in Antiquity. Herausgegeben von Kerstin Droß-Krüpe (Ed.), Colecția Philippika vol. 73, Harrassowitz Verlag, Wiesbaden, 17-42.

151. Odlyha M., Theodorakopoulos Ch., Campana R. 2007. Autex Research Journal 7 (1): 9-18.

152. Ogórek R., Lejman A., Pusz W., Miłuch A., Miodyńska P. 2012. Characteristics and taxonomy of Cladosporium fungi. Mikologia Lekarska 19 (2): 80-85.

153. Pangallo, D., Chovanova, K., Alena Makova, A., 2010. Identification of animal skin of historical parchments by polymerase chain reaction (PCR)-based methods. Journal of Archaeological Science 37: 1202–1206

154. Pallez, M., Pasquali, M., Bohn, T., Hoffmann, L., Beyer, M., 2014. Validation of a quick PCR method suitable for direct sequencing: identification of Fusarium fungal species and chemotypes for preventive approaches in food safety. Food Technology and Biotechnology 52 (3): 351–358.

155. Pamfile T. 1910 Industria casnică la români. Trecutul și starea ei de astăzi: contribuțiuni de artă și tehnică populară. Seria: Din vieața poporului roman. Culegeri și studii, VIII, Tipografia Cooperativa, București,

156. Paulussen C., Hallsworth J.E., Alvarez-Perez S., Nierman W.C., Hamill Ph.G., Blain D., Rediers H., Lievens B. 2017. Microbial Biotechnology 10 (2): 296-322.

157. Pavlogeorgatos G. 2003. Environmental parameters in museums. Building and Environment 38: 1457-1462.

158. Petroviciu, I., Albu, F., Medvedovici, A. 2010. LC/MS and LC/MS/MS based protocol for identification of dyes in historic textiles. Microchemical Journal 95: 247-257.

159. Pinzari, F., Zotti, M., De Mico, A., Calvini, P. 2010. Biodegradation of inorganic components in paper documents: formation of calcium oxalate crystals as a consequence of Aspergillus terreus Thom growth. International Biodeterioration & Biodegradation 64: 499-505.

160.Piñar, G., Gurtner, C., Lubitz, W., Rölleke, S., 2001. Identification of Archaea in objects of art by denaturing gradient gel electrophoresis analysis and shotgun cloning. Methods in Enzymology, 336: 366-356.

161. Piñar, Guadalupe și Lubitz, Werner (2004): Molecular Techniques: Application to the analysis of microbial communities colonizing art works and to the monitoring of changes. Case study: Wall paintings of the castle of Herberstein. . In: M. Drdácký (ed.). , European Research on Cultural Heritage. State-of-the-Art Studies. 2, 421-432; Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague; ISBN ISBN 80-86246-23-X.

162. Piñar, G., Pinzari, F., Sterflinger, K. 2011. Modern technologies as basis for the preservation of parchment. In: Ana Maria López Montes, Francisco Collado Montero, Victor Medina Flórez, Teresa Espejo Arias, Ana García Bueno (Eds.)., 18th International Meeting on Heritage Conservation. , 848; Edited by Universidad de Granada. Depósito Legal: GR 4206-2011 pp:250-253., Granada; ISBN 978-84-338-5339-4

163. Piñar, G., Garcia-Valles, M., Domingo Gimeno-Torrente , D., Jose Luis Fernandez-Turiel, J.L, Ettenauer, J., Sterflinger, K., 2013a. Microscopic, chemical, and molecular-biological investigation of the decayed medieval stained window glasses of two Catalonian churches. International Biodeterioration & Biodegradation 84: 388–400

164. Piñar, G., Piombino-Mascali, D., Maixner, F., Zink, A., Sterflinger, K., 2013b. Microbial survey of the mummies from the Capuchin Catacombs of Palermo, Italy: biodeterioration risk and contamination of the indoor air. FEMS Microbiol Ecol 86(2):341-56

165. Piñar, G., Sterflinger, K., Pinzari, F., 2015a. Unmasking the measles-like parchment discoloration: molecular and microanalytical approach. Environmental Microbiology

17(2):427-43

166. Piñar, G., Tafer, H., Katja Sterflinger, K., Pinzari, F., 2015b. Amid the possible causes of a very famous foxing: molecular and microscopic insight into Leonardo da Vinci’s self-portrait. Environmental Microbiology Reports 7(6):849-59.

167. Piñar, G., Sterflinger, K., Ettenauer, J., Quandt, A., Pinzari, F., 2015c. A Combined approach to assess the microbial contamination of the Archimedes Palimpsest. Microb Ecol.; 69: 118–134.

168. Pinheiro, A.C., Oliveira, B.P., Veríssimo, C., Brandão, J.C., Rosado, L., Jurado, V., Macedo, M.F., 2013. Identification of a fungal community on gilded wood carved heritage. Journal of Cultural Heritage 14: 76-81.

169. Pinto, F.C.J., Braga de Lima, D., Agustini, B.C., Dallagassa, C.B., Shimabukuro, M.F., Chimelli, M., Brand, D., Fadel-Picheth, C.M.T., Bordin Bonfim, T.M., 2012. Morphological and molecular identification of filamentous fungi isolated from cosmetic powders. Braz. Arch. Biol. Technol. 55 (6): 897-901.

170. Pinzari, F., Montanari, M., Michaelsen, A., Piñar, G., 2010. Analytical protocols for the assessment of biological damage in historical documents. Coalition 19: 6-13.

171. Pinzari, F., Troiano, F., Piñar, G., Sterflinger, K., and Montanari, M., 2011. The Contribution of microbiological research in the field of book, paper and parchment conservation. În: Patricia Engel, Joseph Schirò, René Larsen, Elissaveta Moussakova și István Kecskeméti (ed.) New Approaches to Book and Paper Conservation ‑ Restoration,Verlag Berger, Horn, Viena: 575-594.

172. Płaza, G.A., Upchurch, R, Brigmon, R. L., Whitman, W.B., Ulfig, K., 2004. Rapid DNA Extraction for screening soil filamentous fungi using PCR amplification. Polish Journal of Environmental Studies 13 (3): 315-318.

173. Poczai P., Hyvönen J. 2010. Nuclear ribosomal spacer regions in plant phylogenetics: problems and prospects. Mol Biol Rep 37:1897–1912. DOI 10.1007/s11033-009-9630-3

174. Polo A., Cappitelli F., Villa F., Pinzari F. 2017. Biological invasionin the indoor environment: the spread of Eurotium halophilicum on library materials. International Biodeterioration & Biodegradation 118: 34-44.

175. Popa A., Popa D., Dragomir F. 2001. Microbiologie (Elemente de microbiologie agricolă). Editura Europa, Craiova, 323 pag.

176. Portillo, M.C., Gonzalez, J.M., Saiz-Jimenez, C., 2008. Metabolically active microbial communities of yellow and grey colonizations on the walls of Altamira Cave, Spain. Journal of Applied Microbiology 104: 681–691.

177. Prabha, T.R., Revathi, K., Vinod, M.S., Shanthakumar, S.P., Bernard, P., 2013. A simple method for total genomic DNA extraction from water moulds. Current Science 104 (3): 345-347.

178. Princi, E., Vicini, S., Proietti, N., Capitani, D. 2005. Grafting polymerization on cellulose based textiles: A 13C solid state NMR characterization. European Polymer Journal 41: 1196-1203.

180. Princi, E.; Vicini, S.; Pedemonte, E.; Gentile, G.; Cocca, M.; Martuscelli, E. 2006. Synthesis and mechanical characterization of cellulose based textiles grafted with acrylic monomers. European Polymer Journal 42: 51-60

181. Raeder J, Broda P. 2008. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett ers in Applied Microbiology 1(1):17 – 20

182. Rakotonirainy, M.S., Heude, E., Lavédrine, B., 2007. Isolation and attempts of biomolecular characterization of fungal strains associated to foxing on a 19th century book. Journal of Cultural Heritage 8: 126-133

183. Rammo, R.2014. Tradition and transition: the technology and usage of plant-fibre textiles in Estonian rural areas in the 11th-17th centuries, MASF 3: 102-115.

184. Roșu G. 2011. Costumul tradițional din România. Editura Alcor Edimpres, 168 pag.

185. Ryder M.L. 1992. Wool fibers in cloth remains throw light on fleece evolution. Circaea 9 (1): 7-9.

186. Sahin C. D., Coșkun T., Arsan Z. D., Akkurt G. G. 2017. Investigation of indoor microclimate of historic libraries for preventive conservation of manuscripts. Case study: Tire Necip Pașa Library, Izmir-Turkey.

187. Samson R.A., C.M. Visagie, J. Houbraken, S.-B. Hong, V. Hubka, C.H.W. Klaassen, G. Perrone, K.A. Seifert, A. Susca, J.B. Tanney, J. Varga, S. Kocsub, G. Szigeti, T. Yaguchi, and J.C. Frisvad. 2014. Phylogeny, identification and nomenclature of the genus Aspergillus. Studies In Mycology 78: 141–173.

188. Sánchez-Piñero, F., Bolivar, C. F. 2004. Indirect effects of a non-target species, Pyrrhalta luteola (Chrysomelidae) on the biodeterioration of Brussels tapestries. International Biodeterioration & Biodegradation 54: 297-302.

189. Sato Y., Aoki M., Kigawa R.2014. Microbial deterioration of tsunami-affected paper-based objects: A case study. International Biodeterioration & Biodegradation 88:142-149.

190. Schabereiter-Gurtner, C., Piñar, G., Lubitz, W., Rölleke, S., 2001a. An advanced molecular strategy to identify bacterial communities on art objects. Journal of Microbiological Methods 45: 77–87.

191. Schabereiter-Gurtner, C., Piñar, G., Lubitz, W., Rölleke, S., 2001b. Analysis of fungal communities on historical church window glass by denaturing gradient gel electrophoresis and phylogenetic18S rDNA sequence analysis. Journal of Microbiological Methods 47: 345–354.

192. Sharif S., Esmaeili V. 2017. Effects of temperature and relative humidity on permanence of Buyid silk. Journal of Cultural Heritage, In Press.

193. Schoch C.L., Seifert K.A., Huhndorf S.; Robert V.; Spouge J.L.; Levesque C.A.; Chen W, Fungal Barcoding Consortium. 2012. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Janzen D.H. (Ed.), 109: 6241–6246.

194. Schroeder, S., Kim, S.H., Cheung, W.T., Sterflinger, K., Breuil, C., 2001. Phylogenetic relationship of Ophiostoma piliferum to other sapstain fungi based on the nuclear rRNA gene. FEMS Microbiology Letters 195 :163-167.

195. Scott, J.A., 2001. Studies on indoor fungi. Teză de doctorat, Universitatea din Toronto, Canada.

196. Sert, H.B., Sterflinger, K., 2010. A new Coniosporium species from historical marble monuments, Mycological Progress 9:353–359.

197. Seves A.M., Romano M., Maifreni T., Seves A., Scicolone G., Sora S., Ciferri O., 2000. A laboratory investigation of the microbial degradation of cultural heritage. În: Of Microbes and Art. The Role of microbial communities in the degradation and protection of cultural heritage. Ciferri O., Tiano P., Mastromei G. (Editori), Springer Science și Business Media New York, 121-133.

198. Sciurpia F., Carletti C., Cellai G., Pierangioli. 2015. Environmental monitoring and microclimatic control strategies in “La Specola” museum of Florence. Energy an Buildings 95:190-201.

199. Silva H.E., Henriques F.M.A. 2014. Microclimatic analysis of historic buildings: a new methodology for temperate climates. Building and Environment 82: 381-387.

200. Skóra J., Gutarowska B., Pielech-Przybylska K., Stępień Ł., Pietrzak K., Piotrowska M., Pietrowski P. 2015. Assessment of microbiological contamination in the work environments of museums, archives and libraries. Aerobiologia 31: 389-401.

201. Sterflinger, K., 2010. Fungi: Their role in deterioration of cultural heritage. Fungal Biology Reviews 24: 47-55.

202. Stielow J.B., Lévesque C.A., Seifert K.A., Meyer W., Irinyi L., Smits D., Renfurm R., Verkley G.J.M., Groenewald M., Chaduli D., Lomascolo A., Welti S., Lesage-Meessen L., Favel A., Al-Hatmi A.M.S., Damm U., Yilmaz N., Houbraken J., Lombard L., Quaedvlieg W., Binder M., Vaas L.A.I., Vu D., Yurkov A., Begerow D., Roehl O., Guerreiro M., Fonseca A., Samerpitak K., van Diepeningen A.D., Dolatabadi S., Moreno L.F., Casaregola S., Mallet S., Jacques N., Roscini L., Egidi E., Bizet C., Garcia-Hermoso D., Martín M.P., Deng S., Groenewald J.Z., Boekhout T., de Beer Z.W., Barnes I., Duong T.A., Wingfield M.J., de Hoog G.S., Crous P.W., Lewis C.T., Hambleton S., Moussa T.A.A., Al-Zahrani H.S., Almaghrabi O.A., Louis-Seize G., Assabgui R., McCormick W., Omer G., Dukik K., Cardinali G., Eberhardt U., de Vries M., Robert V. 2015. One fungus, which genes? Development and assessmnent of universal primers for potential secondary fungal DNA barcodes. Persoonia 35: 242-263.

203. Suciu V. 2011. Cojocna Mărturii etnografice de pe plaiuri someșene. Editura ”Tradiții Clujene”, 338 pag.

204. Surowiec, I., Quye, A., Troyanowicz, M. 2006. Liquid chromatography determination of natural dyes in extracts from historical Scottish textiles excavated from peat bogs. Journal of Chromatography A 1112: 209-217.

205. Teather R.M., Wood P.J. 1982. Use of Congo Red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Applied and Environmental Microbiology 43 (4): 777-780.

206. Titok V., Leontiev V., Yurenkova S., Nikitinskaya T., Barannikova T., 2010. Infrared spectroscopy of fiber flax. Journal of Natural Fibers 7: 61-69.

207. Takamatsu, S., 1998. PCR applications în fungal phylogeny. În: Application of PCR in mycology. P.D. Bridge, D.K. Arora, C.A. Reddy și R.P. Elander (Ed.), Cab International,

208. Tendulkar, R.S., Gupta, A., Chattoo, B.B., 2003. A simple protocol for isolation of fungal DNA. Biotechnology Letters 25: 1941-1944.

209. Urzi, C., De Leo, F., De Hoog, S., Sterflinger, K., 2000. Recent advances in the molecular biology and ecophysiology of meristematic stone-inhabiting fungi. În Orio Ciferri, Piero Tiano, Giorgio Mastromei (Ed.) Proceedings of the International Conference on Microbiology and Conservation (ICMC), On Microbes and Art: The role of microbial communities on the degradation and protection of the Cultural Heritage, 17-19 Iunie, 1999, Florența, Italia, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 3-19.

210. Veloso A.M., Alonso S.B. 2014. Caracterización de hongos aislados de mapas conservados en el Archivo Nacional de la República de Cuba. Ge-conservación 6: 1989-8568.

211. Vereecken E., Roels S. 2012. Review of mould prediction models and their influence on mould risk evaluation. Building and Environment 51: 296-310.

212. Viaud, M., Pasquier, A.,  Brygoo, Y., 2000. Diversity of soil fungi studied by PCR–RFLP of ITS. Mycological Research 104 (9): 1027-1032.

213. Vincze T., Posfai, J., Roberts, R.J. 2003. NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 31: 3688-3691.

214. Visagie C.M., Renaud J.B., Burgess K.M.N., Malloch D.W., Clark D., Ketch L., Urb M., Louis-Seize G., Assabgui R., Sumarah M.W., Seifert K.A. 2016. Fifteen species of Pennicillium. Persoonia 36: 247-280.

215. Visagie C.M., Hirooka Y., Tanney J.B., Whitfield E., Mwange K., Meijer M., Amend A.S., Seifert K.A., Samson R.A. 2014a. Aspergillus, Penicillium and Talaromyces isolated from house dust samples collected around the world. Studies in Mycology 78: 63-139.

216. Visagie C.M., Houbraken J., Frisvad J.C., Hong S.-B., Klaassen C.H.W., Perrone G., Seifert K.A., Varga J., Yaguchi T., Samson R.A. 2014b. Identification and nomenclature of the genus Pennicillium. Studies in Mycology 78: 343-371.

217. Vittiglio, G., Bichlmeier, S., Klinger, P., Heckel, J., Fuzhong, J., Vincze, L., Janssens, K., Engström, P., Rindby, A., Dietrich, K., Jembrich-Simbürger, D., Schreiner, M., Denis, D., Lakdar, A., Lamotte, A. 2004. A compact l-XRF spectrometer for (in situ) analyses of cultural heritage and forensic materials. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 213: 693-698.

218. Vodopivec, J.; Budnar, M.; Pelicon, P. 2005. Application of the PIXE method to organic objects. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B 239: 85-93.

219. White, T.J., T. Bruns, S. Lee, and J.W. Taylor. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. În Innis, M.A., D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, and T.J. White (Ed.): PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, eds.. Academic Press, Inc., New York, 315-322.

220. Weiland, J. J., 1997. Rapid procedure for the extraction of DNA from fungal spores and mycelia. Fungal Genetics Newsletter 44: 60-63.

221. Welsh, J., McClelland, M., 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acid Research 18 (24): 7213-7218.

222. Williams, R.H., Ward, E., McCartney, H.A., 2001. Methods for integrating air sampling and DNA analysis for detection of airborne fungal spores. Applied and Environmental Microbiology 67 (6):2453-2459.

223. Woudenberg J.H.C., J.Z. Groenewald, M. Binde, and P.W. Crous. 2013. Alternaria redefined. Studies in Mycology 75: 171–212.

224. Zhao Z., Liu H., Luo Y., Zhou S., An L., Wang C., Jin Q., Zhou M., Xu J.-R. 2014. Molecular evolution and functional divergence of tubulin superfamily in the fungal tree of life. Scientific Reports 4: 6746. DOI: 10.1038/srep06746.

225. Zaharia F. 2008. Textilele tradiționale din Transilvania: tehnologie și estetică, Editura Accent Print, Suceava, 130 pag.

226. Žemaitytė R., Jonaitienė V., Milašius R., Stanys S., Ulozaitė R. 2006. Analysis and identification of fibre constitution of archaelogical textiles. Materials Science (Medžiagotyra) 12 (3): 258-261.

227. Zolan E.M., Pukkila P.J., 1986. Inheritance of DNA Methylation in Coprinus cinereus. Molecular and Cellular Biology 6 (1): 195-200.

228. Samson R.A., Visagie C.M., Houbraken J., Hong S.-B., Hubka V., Klaassen C.H.W., Perrone G., Seifert K.A, Susca A., Tanney J.B., Varga J., Kocsubé S., Szigeti G., Yaguchi T., Frisvad J.C. 2014. Study in Mycology 78: 141-173.

229. Stockton J. 2004. Embroidery for Clothing – Anglo-Saxon http://axemoor.net/pdf/1_Embroidery_for_Clothing.pdf (accesat 28 iunie 2016)

230. Yang, C. S., 2004. Quantitative PCR for the detection and quantitation of environemental microorganisms: basics and applications. 8 pag. www.EMLabPK.com

231. Yang, D. Y., Watt, K. 2005. Contamination controls when preparing archaeological remains for ancient DNA analysis. Journal of Archaelogical Science 32: 331-336.

Legislație

232. SR EN ISO 13934-1:2002 Materiale textile. Proprietăți de tracțiune ale țesăturilor – Partea 1: Determinarea forței maxime și a alungirii la forța maximă prin metoda pe bandă

233. SR EN 139:2005 Materiale textile. Atmosfere standard de condiționare și de încercare

234. SR EN 14119: 2004 Încercări pe textile. Evaluarea acțiunii ciupercilor microscopiceCOM /2014/ 477.

235. Comunicare a Comisiei către Parlamentul European, Consiliu, Comitetul economic și social European și Comitetul Regiunilor. Spre o abordare integrată a Patrimoniului Cultural european, Bruxelles, 22.07.2014.OJ C 183/14.06.2014. Concluziile Consiliului din 21 mai 2014 privind Patrimoniul Cultural ca resursă strategică pentru o Europă durabilă, pag. 36-38.

236. CETS 199. Council of Europe Framework Convention on the value of Cultural Heritage for society, Faro, 27.10. 2005.

237. COM /2005/ 678. Proposal for a Council Decision on the conclusion of the UNESCO Convention sur la protection et la promotion de la diversite des expressions culturelles, 2005, Bruxelles, 21.12.2005.

ETS no. 143 European Convention on the protection of the Archaeological Heritage (revizuită), Valetta, 16.01.1992.

238. Document strategic. Europe’s living landscapes: Cultural heritage as a force for rural development, iulie 2010, http://www.europae-archaeologiae-consilium.org/strategic-documents

239. UNTC 45694. Convention on the protection of the underwater Cultural Heritage, Paris 02.11.2001, Volume 2707, pag. 255-258.

240. Convention for the safeguarding of the intangible Cultural Heritage, adoptată de UNESCO, Paris 17 octombrie 2003.

241. Convention for the Protection of Cultural Property in the Event of Armed Conflict with Regulations for the Execution of the Convention, adoptată de UNESCO, Haga, 14 mai 1954.

242. Policy document on the Impacts of Climat Change on World Heritage Properties, 2008. Document WHC-07/16.GA/10 adopted by the 16th General Assembly of States Parties to the World Heritage Convention (October 2007).

243. Code of Ethics for Museum. Ethical principles for all who work for or govern museums in the UK, 2015. https://www.museumsassociation.org/ethics/code-of-ethics

244. ICOM Code of Ethics for Museums, 2017. http://icom.museum/the-vision/code-of-ethics/ , ISBN 978-92-9012-420-7

245. European Recommendation for the conservation and restoration of Cultural heritage, 2009. Approved by the General Assembly of E.C.C.O., Bruxelles, 17 March 2008. https://ceroart.revues.org/3764?file=1

246. Hotărârea de Guvern nr. 216/2014 pentru aprobarea Normelor privind autorizarea laboratoarelor și atelierelor de conservare și restaurare.

247. Lege nr. 26/2008 privind protejarea patrimoniului cultural imaterial.

248. Hotărâre nr. 1546/2003 pentru aprobarea Normelor de conservare și restaurare a bunurilor culturale mobile clasate.

250. Legea nr. 311/2003 a muzeelor și a colecțiilor publice.

251. Legea nr. 422/2001 privind protejarea monumentelor istorice.

252. Ordin nr. 2008/2001 pentru aprobarea Normelor de acreditare a conservatorilor și restauratorilor.

253. Legea 378/2001 pentru aprobarea Ordonaței Guvernului nr. 43/2000 privind protecția patrimoniului arheologic și declararea unor situri arheologice ca zone de interes național.

254. Ordinul Minsterului Culturii nr. 2035/2000 pentru aprobarea Normelor metodologice privind evidența, gestiunea și inventarierea bunurilor culturale deținute de muzee, colecții publice, case memoriale, centre de cultură și alte unități de profil.

255. Legea nr. 182/2000 privind protejarea patrimoniului național mobil, republicată 2008, Republicată în Monitorul Oficial, Partea I nr. 828 din 09/12/2008.

256. Hotărârea nr. 230/2003 privind delimitarea rezervațiilor biosferei, parcurilor naționale și parcurilor naturale și constituirea administrațiilor acestora

257. EN 16242:2012 Conservation of cultural heritage – Procedures and instruments for measuring humidity in the air and moisture exchanges between air and cultural property

258. EN 15757:2010 Conservation of cultural heritage – Procedures and instruments for measuring humidity in the air and moisture exchanges between air and cultural property

Linkuri

259.http://standards.cen.eu/dyn/www/f?p=204:7:0::::FSP_ORG_ID:411453&cs=11079A55D70F8377E3942E1C6704C7664

260.http://www.first-nature.com/fungi/ganoderma-carnosum.php

261.Fedorovici, M. 2012. Studiu privind prelucrarea materialelor textile in gospodăria țăranului din Cândești. http://www.ecomunitate.ro/blog/studiu_privind_prelucrarea_materialelor_textile_in_gospodaria_taranului_din_candesti

ANEXE

Anexa A1. Fișa pentru monitorizarea temperaturii și umidității în spațiul muzeal al MNȚR

Fișă pentru măsurarea temperaturii și umidității în sălile expoziționale și depozite

Anexa A2a. Fișa tulpinilor izolate. Caracterizarea fenotipică.

Legenda imaginilor:

Rândul 1- Imagine stânga: Placă Petri cu aspectul macroscopic al coloniei dezvoltată pe mediu PDA; Imagine dreapta: Placă Petri-revers.

Rândul 2 – Imagine microscopică a tulpinii, obținută prin tehnica colorației cu albastru lactofenol.

Tulpina T6: Epicoccum nigrum

Tulpina T7: P.oxalicum

Tulpina T11: P.polonicum

Tulpina T15: P.hirsutum

Tulpina T21: Talaromyces rugulosus

Tulpina T23: P.rubens

Tulpina T27: P.verrucosum

Tulpina T31: A.pseudoglaucus

Tulpina T38: P.freii

Tulpina T39: B.adusta

Tulpina T48: A jensenii

Tulpina T49: A. fumigatus

Tulpina T55: P.roseopurpureum

Tulpina T57: B.bassiana

Anexa A2b. Fișa tulpinilor izolate. Caracterizarea genotipică.

T1

GGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAGATCGGGGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAAT

T2

TCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC

T3

GGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGTTAAGATTGATGGTGTTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGGAAGCGGGGGGCGAGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTCAAGTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCGTTTGTGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCAGATGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGC

T4

GGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGTTAAGATTGATGGTGTTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGGAAGCGGGGGGCGAGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTCAAGTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCGTTTGTGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCAGATGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCCCG

T5

GGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGAGATAATTAAAGGTTGGGGGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACTAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGCGGGGGGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTAATTTCGTTATAGGTCTCAGACTGCAACTTCAGACAGCGTTCAGGGGGGCCGTCGGCGGGCGCGGGGCCCGCCGAGGCAACATAGGTCGGGCAACACGGGTGGGAGGT

T6

GTGTAAAAATGTACTTTTGGACGTCGTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGAGATGTACTGCGCTCCGAAATCAATACGCCGGCTGCCAATTGTTTTAAGGCGAGTCTACACGCAGAGGCGAGACAAACACCCAACACCAAGCAGAGCTTGAAGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCATGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAACTATTATGTTTTTTCAGACGCTGATTGCAACTGCAAAGGGTTTGAATGTTGTCCAATCGGCGGGCGGACCCGCCGAGGAAACGAAGGTACTCAAAAGACATGGGTAAGAGGTAGCAGACCGAAGTCTACAAACTCTAGGTAATGATCCTTCCGCAGTCACCT

T7

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGTTAAGATTGATGGTGTTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGGAAGCGGGGGGCGAGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTCAAGTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCGTTTGTGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCAGATGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGC

T8

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGTTAAGATTGATGGTGTTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGGAAGCGGGGGGCGAGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTCAAGTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCGTTTGTGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCAGATGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAA

T9

CGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGC

T10

TTCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAATGGGGTTGTTTTACGGCGTAGCCTCCCGAACACCCTTTAGCGAATAGTTTCCACAACGCTTAGGGGACAGAAGACCCAGCCGGTCGATTTGAGGCACGCGGCGGACCGCGTTGCCCAATACCAAGCGAGGCTTGAGTGGTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTAATTTATTAATTAAGTTACTCAGACTGCAAAGTTACGCAAGAGTTGAAGTGTCCACCCGGAGCCCCCGCCCGAAGCAGGTCGCCCCGGAGCAACAGAGTCGACAACAAAGGTtATGAACATCCCGGTGGT

T11

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGGGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTGAGCCCCCCGGCGGCCAGTAAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGT

T12

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCG

T13

AGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCTGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACACAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTACTTGACTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACCGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTCGCCCCCCGCTTCCCGGGGGGCGGGCCC

T14

TGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCG

T15

GGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGTGTGAGCCCCCCGGCGGCCAGTAAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGtGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAG

T16

GGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAATGGGGTTGTTTTACGGCGTAGCCTCCCGAACACCCTTTAGCGAATAGTTTCCACAACGCTTAGGGGACAGAAGACCCAGCCGGTCGATTTGAGGCACGCGGCGGACCGCGTTGCCCAATACCAAGCGAGGCTTGAGTGGTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTAATTTATTAATTAAGTTTACTCAGACTGCAAAGTTACGCAAGAGTTTGAAGTGTCCACCCGGAGCCCCCGCCCGAAGGCAGGGTCGCCCCGGAGGCAACAGAGTCGGACAACAAAGGGTTATGAACATCCCGGTGGTTAGACCCGGGGTCACTTGTAATGATCCCTCCGCA

T17

AGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATTGTACCTTGTTGCTTCGGTGCGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCTTCTGCCCCCGGGTCCGCGCGCACCGGAGACACTATTGAACTCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCATAAACTAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCCGTCCCCCCGGGGACGGGTCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGAGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACAACCAATCATCCTTTTTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACT

T18

TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCC

T19

GGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAA

T20

TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAGATCGGGGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGT

T21

GGTAACCCTACCTGATCCGAGGTCAACCGAAGGTAGACGGGCCCCGAAGGGTCGCCTGGAGGAAGACCAGCGCCGACGAGTCCGTCCCGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCCGACGCGGCGCCGCCACTGCCTTTGGGGCGTGTCCCCGGGGGGACAACACCCAACACCCAGCCGGGCTGGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAATGATTTAATCATAGACTCAGACTCACTATTCAGACAGGGTTCCAGGGCGCTTCGGCGGGCGCGGACCCGGGGGCAGAAGCCCCCCGGCGACCGGGGCCAGGCCCCAGTGGGCCCGCCGAGGCAACGCGGTCATGGTAAACACGGGTGGGA

T22

TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAATGGGGTTGTTTTACGGCGTAGCCTCCCGAACACCCTTTAGCGAATAGTTTCCACAACGCTTAGGGGACAGAAGACCCAGCCGGTCGATTTGAGGCACGCGGCGGACCGCGTTGCCCAATACCAAGCGAGGCTTGAGTGGTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTAATTTATTAATTAAGTTTACTCAGACTGCAAAGTTACGCAAGAGTTTGAAGTGTCCACCCGGAGCCCCCGCCCGAAGGCAGGGTCGCCCCGGAGGCAACAGAGTCGGACAACAAAGGGTTATGAACATCCCGGTGGTTAGACCGGGGTCACTTGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTA

T23

TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCC

T24

GAGGTCAACCTGGAAAAAAGTTTGGTTGATCGGCAGGCGCCGGCCAGTCCTACAAAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTTGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAAGGAGGACGGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTAATCTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCTAAGGTGTCTTCGGCGAGCGCGGACCCGGGGACAGACGTCCCCCGGCAGCCAAAAGGCAGGCTCGCCGAAGCAACAAGTAAAATAACACGTGAGTG

T25

GGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAGATCGGGGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAAGTTGGACCCAG

T26

TTACCAATCTGTTGCCTCGGCGGGATTCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCAGCCCCGGATCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCAAACTCTTTTTTCTCTCCGTCGCGGCCTACGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTCGGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGG

T27

GGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGTGTGAGCCCCCCGGCGGCCAGTAAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGtGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAG

T28

GCGGGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGG

T29

CGGGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGGGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTGAGCCCCCCGGCGGCCAGTAAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCC

T30

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAA

T31

GAGTCCCAGGTaCAGCCTGGTGAAAAAGATTGGTTGCGACGGCTAcGaCTGCCAGCTGGACCTACGGGAGCGGGTGACaAAGCCCCATACGaCTCGAGGACCAGACATGGTGCCGCCACTGCCTTTTGGGCCCGTCCCCGTTACCAGGGACGGAAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAATTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAATTATTGTTTAACTAAAAAACTCAAGACTGCAAACTTCAGACAGTGTTCaAAATGTTAGTCTTCGGCGGGCCGTGGCCACGCCGAAGCAACAGGGTACAGATAGACACGGATGGGAGGTGGACCCaAGAAGGCCGCACTCCGTAATGATCCCTTtCCGCAGTcCA

T32

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAGATCGGGGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCG

T33

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAGATTGATTTGGGTGTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGATGAACGGGGGGCGAAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGCTAATCTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCAATGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCGCGCCGAAGCAACAAGGTACAATAAACACGGGTGGGAGGT

T34

TGATCCGAGGTCACCTTAGAAAGATTGGGTTGGTGTCGACAGGCGCCGGCCGGCCCTACAAGAGCGGGTGACaAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCGGGAAACCGGGGACGGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTATGATAATCAACTCAGACTGCAAAACTTCAGAACAGAGTTCATGTTGTGGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCGGAGGCCTCCCCGGCGGCCGTCCGAAGAC

T35

CTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACGGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGACCCGGGGGCGTGAGCCCCCCGGCGGCCAGTAAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGTAAAATAAACACGGTGGGAGTTGGACCCAAAGGCCTCACTCGGTATGAT

T36

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGGGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTGAGCCCCCCGGCGGCCAGTAAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGTAAAATAAACACGGGTGGGAGTGGACCCAAAGGCCCTCACTCGGTATGATCTCGCAGTCACTACGAGATCATAGGA

T37

TACCTGATCCGAGGTCACCTGAAAAAAGGATGATTGGTTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACTCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGACCCGTCCCCGGGGGGACGGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTTATTTAGTTTATGCTCAGACTGCAATCTTCAGACAGAGTTCAATAGTGTCTCCGGTGCGCGCGGACCCGGGGGCAGAAGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCGCACCGAAGCAACAAGTACAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAAGGCCCTCACTCAGTAATGATCCTCCGCA

T38

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACGGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGACCCGGGGGCGTGAGCCCCCCGGCGGCCAGTAAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTGGACCCAAAGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGT

T39

GGGTAGTCCTAACTGATTTGAGCTCAGAGTTCAGAAATTATGTCCGAAGACGGTTAGAAGCGCGAACACTAAGATACCCTCCACAGCAGCGCAGATAATTATCACGCTGAAGCGGCTGGTAACGTTCGCACTAATGCATTTCAGAGGAGCCGACTACGAGAGCCGGCACGACCTCCAAGTCCAAGCCTTCATCAATAAAGCTGAAGGTTGAGAATTCCATGAGACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATACCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGAGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATATAATTGCGTAATAGCAAAGTATGACATTCT

T40

CGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCC

T41

TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTT

T42

TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGAT

T43

CGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCC

T44

TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCC

T45

TCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTT

T46

GGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATC

T47

GCGGGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCG

T48

TGATCCGAGGTCaAgCaCTGtAAGAAAATGGTTGGAGACGTCGGCTGGCGCCCGGCCGGCCCTAAcTaCGAGCGGGTGACAcAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACACGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTACAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCAGTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGACTGATTTTATATTCAGACTCAGACTGCATCACTCTCAGGCATGAAGTTCAGTAGTCCCCGGGCGG

T49

AGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTCTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTTTCGACGGCCGCCGGGGAGGCCTTGCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCAACATGAACGCTGTTCTGAAAGTATGCAGTCTGAGTTGATTATCGTAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCCGTCCCCCTCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGC

T50

TACCTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAAAATAAAGTTGGGTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCAGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGAGGGGGACGGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTACGATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCAGGGCCTCCCCGGCGGCCGTCGA

T51

CTACCTGATCCGAGGTCACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAGATCGGGGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGTAAAATAAACACGGTGGAGTGACCCAGAGCCCTCACTCNGTTAATGATCCTTAC

T52

TTcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGGGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTGAGCCCCCCGGCGGCCAGTAAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGTAAAATAAACACGGGTGGGAGTGGACCCAAAGGCCCTCACTCGTATGATCC

T53

TTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTCTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTTTCGACGGCCGCCGGGGAGGCCTTGCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCAACATGAACGCTGTTCTGAAAGTATGCAGTCTGAGTTGATTATCGTAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCCGTCCCCCTCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCTGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGAC

T54

GTTTTATGGATTGGGCTGTCGCTGGCCGCAAGGCATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTCAACTTCTGTGCACTATCGCATGTAAGGTTGGCTTTGTGACGGAGGCTGGCTTCGCGGCTGGTCGTCGTTGTATCGCTGCCTTGaCGTGTTTCTTACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTCTTTATTTGCGGATAACGCAACTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGaCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTCTCATGGAATTCTCAACCTTGCAGTTTTGTTACTGCAAGGCTTGGACTTGGAGGTCGTGTCGGCTCTCGCGAGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGTGCGGACGTTACCGGTCGCTTCAGCGTGATAATTAATCTGCGCTGCCGTCGACTGGTATGTGAAAGTACGCGCTTCTAAACCGTCCCTCACCGGACACTACATGAAACTCTG

T55

TTCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGAAAAAATAGATTGAGGGGGGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCCAGCGCGGGGGGGCGGGGCCCAACACGACAAGCCGTGCTTGAGGGCAgGCAATGACGCTtCGGACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTAACTAATTTAGCTAGTTTCTCAGACTGCAACTTCAGACAGCGTTCACAGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGAAGCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACA

T56

GCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAAAATAAAGTTGGGTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCAGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGAGGGGGACGGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTACGATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCAAGGCCTCCCCGGCGGCCGTCGAAACGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTT

T57

AAGTTGGGTGTTTtACGGCGTGGCCGCGTCGGGGTTCCGGTGCGAGCTGTATTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACCTCCCCAAGGGGAGGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATGCTGGAATACAGGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGGCCGCTGGTCCAGTCCGCGTT

T58

GGGTATcCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTACAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTAAGCCCCCCGGCGGCCAGTTAAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTAAAATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGT

T59

GGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCaACCTGGATAAAAATTTGGGTTGATCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAATCGGAGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAATAATTTATATTTTCACTCAGACTTCAATCTTCAGACAGAGTTCGAGGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGTGAGCCCCCCGGCGGCCAGTAAAGGC

T60

TACCTGATCCGAGGTCAACCTGGATAGATTGATTTGGGTGTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGATGAACGGGGGGCGAAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTAACTGATTTAGCTAATCTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCAATGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGATG

Anexa 3a. Fișa eșantioanelor textile biodeteriorate de tulpina P. crustosum

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepă crudă de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepă crudă de către tulpina P. crustosum

(de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată la soare de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată la soare de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată cu leșie de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curațată cu leșie de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in crud de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in crud de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat la soare de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat la soare de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat cu leșie de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat cu leșie de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat chimic de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat chimic de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din bumbac de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din bumbac de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din lână de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din lână de către tulpina P. crustosum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Anexa 3b. Fișa eșantioanelor textile biodeteriorate de tulpina P. glabrum

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepă crudă de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepă crudă de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată la soare de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată la soare de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată cu leșie de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curațată cu leșie de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in crud de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in crud de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat la soare de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat la soare de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat cu leșie de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat cu leșie de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat chimic de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat chimic de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din bumbac de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din bumbac de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din lână de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din lână de către tulpina P. glabrum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Anexa A3c. Fișa eșantioanelor textile biodeteriorate de tulpina P.chrysogenum

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepă crudă de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepă crudă de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată la soare de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată la soare de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată cu leșie de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curațată cu leșie de către P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in crud de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in crud de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat la soare de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat la soare de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat cu leșie de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat cu leșie de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat chimic de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat chimic de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din bumbac de către P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din bumbac de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu

Biodeteriorarea eșantioanelor din lână de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din lână de către tulpina P.chrysogenum (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Anexa A3d Biodeteriorarea materialelor textile realizată de suspenia celulară mixtă.

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepă crudă de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepă crudă de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată la soare de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată la soare de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curățată cu leșie de către suspensia celulară mixtă (de lstânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din cânepa curațată cu leșie de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in crud de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in crud de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat la soare de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat la soare de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat cu leșie de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat cu leșie de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat chimic de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din in curățat chimic de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din bumbac de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din bumbac de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

Biodeteriorarea eșantioanelor din lână de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu+

Biodeteriorarea eșantioanelor din lână de către suspensia celulară mixtă (de la stânga la dreapta 3 zile, 7 zile, 14 zile, 21 de zile, 28 de zile ), pe mediu Glu-

A4a. Fișele notelor la testul de biodeteriorare – 3 zile

A4b. Fișele notelor la testul de biodeteriorare – 7 zile

A4c. Fișele notelor la testul de biodeteriorare – 14 zile

A4d. Fișele notelor la testul de biodeteriorare – 21 de zile

A4e Fișele notelor la testul de biodeteriorare – 28 de zile