CONTRIBUȚII LA STUDIUL TAXONOMIC AL LEPIDOPTERELOR DIN [302849]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator științific:

CONF. UNIV. DR. STAICU ANDREA CRISTINA

Absolvent: [anonimizat]

2018

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

SPECIALIZAREA BIOCHIMIE

CONTRIBUȚII LA STUDIUL TAXONOMIC AL LEPIDOPTERELOR DIN

GEOPARCUL DIONOZAURILOR ȚARA HAȚEGULUI

Coordonator științific:

CONF. UNIV. DR. STAICU ANDREA CRISTINA

Absolvent: [anonimizat]

2018

Cuprins

Introducere

Interesul pentru acest studiu are la bază pasiunea pentru acest grup de nevertebrate fascinant prin diversitate și biologie. [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat] a grupării organismelor pe baza asemănărilor de la nivelul moleculei de ADN. Lucrarea este un studiu al lepidopterelor din zona Hațegului prin care am urmărit atingerea următoarelor obiective:

[anonimizat] a [anonimizat], [anonimizat]. Numărul mare de specii ( aproximativ 150.000, majoritatea tropicale; 4.000 de specii în România) asigură fluturilor un loc însemnat în tabloul general al biodiversității: practic, [anonimizat] e un fluture.

Răspândiți pe toate continentele (cu exceptia Antarticii), [anonimizat] (care este „casa" celui mai mare număr de specii), [anonimizat].

Fluturii de zi reprezintă nu doar un grup ecologic (speciile de fluturi caracterizate prin activitate diurnă în stadiul de adult), [anonimizat] – [anonimizat], sub numele de Rhopalocera (fluturi cu antene măciucate).

Deși aceștia reprezintă abia o [anonimizat] 15.000 specii, [anonimizat] 202 specii în România. Evaluarea biodiversității în acest sit a [anonimizat]. Această activitate a permis identificarea multor specii ocrotite la nivel național și european, a condus la formularea unor concluzii privind starea populațiilor, a habitatelor ocupate de acestea, a presiunilor antropice actuale și în perspectivă și a metodelor adecvate de monitorizare. [anonimizat]-economică trebuie să se finalizeze prin adoptarea unui plan de management care să asigure dezvoltarea zonei concomitent cu conservarea sau îmbunătățirea stării de conservare a habitatelor și speciilor.

Biodiversitatea este o componentă a patrimoniului național, alături de bogățiile subsolului și de patrimoniul cultural național. Biodiversitatea este o resursă regenerabilă, fundamentală pentru integritatea sistemului de suport al vieții pe Pământ: fără funcționarea sistemelor ecologice la parametrii corespunzători, existența sistemului socio-uman ar fi imposibilă. Conform documentului final al Convenției de la Rio, biodiversitatea se structurează pe trei niveluriimbricate ierarhic: genetic, taxonomic și ecologic. La nivel genetic, biodiversitatea se manifestă prin fondul de gene deținut de populațiile naturale de viețuitoare.

La nivel taxonomic biodiversitatea se manifestă prin diversitatea speciilor (bogăția în specii, numărul de specii) dintr-o arie dată. La nivel ecologic, biodiversitatea se manifestă prin diversitatea tipurilor de ecosisteme reprezentate în aria analizată, precum și prin gradul de integritate structurală și funtrională a acestora. Pentru a înțelege procesele ecologice dintr-o arie protejată este necesară atât o abordare de tip informațional (analiza desfășurării programelor superioare, proprii și inferioare ale sistemelor ecologice de interes), cât și o abordare spatio-temporală – știut fiind că sistemele ecologice manifestă puternice fluctuații morfo-funcționale atât în timp (cicluri sezoniere, succesiuni ecologice, procese perturbatoare de tip catastrofic ș.a.), cât și în spatiu (eterogenitate spațială, granularitate, structură fractală, etc.). În plus, astăzi nu mai există sisteme ecologice nesupuse presiunii antropice, ceea ce are drept rezultat deformarea parametrilor inițiali.

Numărul enorm de specii descrise, face imposibilă evaluarea integrală a biodiversității -numărul de specii descrise trece de un milion și jumătate, însă se pare ca există mult mai multe specii încă nedescoperite. Ca surogat se poate lucra pe un grup mai restrâns de specii, dacă ne asigurăm că acestea reprezintă o bună aproximare a biodiversității totale. Principalii candidați sunt grupele de vertebrate (pești, herpetofoaună, păsări și mamifere), însă studiul acestora întâmpină dificultăți de ordin practic. Nevertebratele mărunte reprezintă un grup mai accesibil, în măsura în care îndeplinesc câteva condiții: (1) sa fie răspândite în toate mediile de viață, (2) să fie reprezentate prin specii cu diverse moduri de viață, (3) să fie bine cunoscute ca biologie, ecologie si taxonomie, (4) să fie sensibile la modificările subtile din mediul de viață, (5) să fie accesibile studiilor în teren.

Fluturii de zi (Lepidoptera: Rhopalocera) reprezintă un candidat ideal pentru monitorizarea biodiversității pentru că acoperă corespunzător criteriile enunțate mai sus. Pentru Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului, fluturii de zi sunt relativ bine cunoscuți. Biodiversitatatea are valoare pe multiple planuri economic, etno-cultural însă în prezent devine instrument în aprecierea stării capitalului natural al unei zone protejate. Rezultatele cercetărilor efectuate în zonă demostrează că biodiversitatea din Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului este bogată, reprezentativă și de un deosebit interes atât din punct de vedere teoretic cât și practic.

Capitolul 1. Ordinul Lepidoptera

1.1 Istoricul cercetării lepidopterelor

Entomologia reprezintă o ramură a zoologiei care se ocupă cu studiul insectelor. Denumirea provine din cuvintele grecești entomos = segmentat, întretăiat și logos = știință, acest lucru însemnând că este știința care se ocupă cu studiul animalelor cu corpul format dintr-o succesiune de segmente, deci și cu studiul lepidopterelor.

Lepidopterele, pornind de la etimologia cuvântului ( lepis, -idos= solz, și pterón= aripă) înseamnă insecte cu aripile acoperite de solzi, acest termen a fost introdus de Linneeîn 1753.Lepidopterele mai sunt cunoscute uzual și sub denumirea de fluturi.

Lepidoprerele reprezintă un ordin regnul Animalia, Încrengătură Arthropoda, clasa Insecta, Subclasa Pterygota, Infraclasa Neoptera, Supraordinul Endopterygota. Acest ordin cuprinde aproximativ 128 de familii. ( Niculescu și Konig, 1970).

Primele cercetări asupra lepidopterelor s-au facut de către Aristide Cardja (1861-1855). La început, în studiile asupra lepidopterelor, pentru identificarea și clasificarea acestora, se utilizau caracterele morfologice perecum armătura genitală, forma, culoarea și nervațiunea aripilor. Astăzi, odată cu progresul înregistrat de tehnicile de biologie moleculară, problemele pe care taxonomia clasică nu le mai poate rezolva, pot fi elucidate cu ajutorul taxonomiei moleculare. ( Niculescu și Konig, 1970).

1.2 Caractere generale

Până în prezent au fost caracterizate  aproximativ 260.000 de specii de lepidoptere, prevăzute cu solzi  pe aripi (gr. lepis, lepidos = solz), pe corp și pe apendice. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Ordinul cuprinde subordinele: Aglossata, Glossata, Heterobathmiina, Zeugloptera. Din punct de vedere al răspândirii geografice, lepidopterele pot fi întâlnite  de la nivelul mării pânăîn zona alpină (6000 m în Himalaia), din zona ecuatorială, până dincolo de cercul polar. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Dimensiunilor adulților variază între 1 mm și peste 100 mm, la lungimea corpului și de la 2 mm la 320 de mm distanța între vârfurile aripilor (“anvergura”).

Corpul este alcătuit din : cap, torace, și abdomen. Capul este de obicei mic, ortogonat, acoperit cu peri sau solzi (Figura 1)

Figura 1. Morfologia externă a fluturelui (https://infovisual.info/en/biology-animal/butterfly )

Ochii sunt în general bine dezvoltați, de obicei hemisferici. La fluturii vii, culoarea lor este gălbuie, verde, brună, roșie, iar la cei nocturni par fosforescenți, datorită reflectării luminii de catre un strat numit tapetum. Ocelii laterali sunt prezenți la speciile mai multor familii. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Antenele au lungimi diferite, fiind formate din 7 până la 100 de articole. Acestea pot fi nude, cilindrice, pectinate, scvamate (acoperite cu solzi). La unele specii de Adelidae sunt de 5-6 ori mai lungi decât corpul. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Dupa formă, antenele pot fi filiforme, setiforme, măciucate, moniliforme, fusiforme, dințate, pectinate sau plumoase (Figura 2).

Figura 2. Tipuri de antene ale fluturilor (http://wiremea.com/diagram-of-types-of-insects.html)

Aparatul bucal  este o trompă spiralată rezultată prin fuziunea maxilelor, adaptată pentru supt și este prevăzut cu,  glande hipertrofiate (Figura 3).

Figura 3. Aparatul bucal de specia Libythea celtis, familia Nymphalidae

(http://www.bioone.org/doi/abs/10.2108/zsj.29.463)

Mandibulele de obicei lipsesc, maxilele prezintă cardo, stipes, galea mult alungităși lacinia rudimentară sau absentă. Palpii maxilari pot fi formați din 1-6 articole, pot fi reduși sau absenți. Labiul mic, ca o placă transversală, are palpii labiali triarticulați sau reduși. (Teodorescu și Vlad, 2008)                     Lepidopterele primitive din familia Micropterygidae au mandibule funcționale, cu dinți pentru sfărâmarea granulelor de polen cu care se hrănesc.                                          Mandibule nefuncționale, rudimentare, se mai păstrează doar la unele familii.              Aparatul bucal este rudimentar la speciile care nu se hrănesc, trăind pe seama rezervelor acumulate de larve. Cea mai lungă trompă se întâlnește la speciile de Sphingidae, care zboară pe loc în fața florilor cu corolă adâncă și aspiră nectarul.

În fauna României, specia Agrius convolvuli are o trompă lungă de 100 mm. Trompele cele mai lungi se cunosc la speciile Xanthopan (= Macrosila) morgani praedicta, din Madagascar, Amphimoea walkeri, din zona neotropicală (280 mm) și Cocythius cluentius, din America de Sud (250 mm)(Teodorescu și Vlad, 2008).

Toracele este heteronom, protoracele fiind segmentul cel mai redus, inelar, iar mezotoracele, cel mai dezvoltat.

Picioarele homonome, subțiri, servesc mai ales la așezarea pe substrat și în mai mică măsură la mers. Sunt acoperite cu peri sau solzi și la unele specii, tibiile și tarsele poartă spini.  (Teodorescu și Vlad, 2008)           Tarsele pentamere se termină cu două ghiare, simetrice sau asimetrice, de obicei simple, cu un dinte, rareori bifide.

Picioarele sunt atrofiate la femelele unor Psychidae și Heterogynidae. La Nymphalidae, picioarele anterioare sunt reduse la ambele sexe, iar la Riodinidae, numai la masculi.

Aripile sunt homonome, de obicei mari, acoperite pe ambele fețe cu solzi și uneori cu peri. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Solzii măresc soliditatea aripilor și activează circulația hemolimfei în aripi (culorile determină absorbția diferită a razelor solare, diferențele de temperatură inducând mișcări ale hemolimfei).

Pe aripi există și solzi care sunt receptori ai unor analizatori (sensile) sau formațiuni glandulare (androconii). (Teodorescu și Vlad, 2008)

Perii de pe aripi pot fi mici sau mari, situați îndeosebi către baza aripilor. La femelele deOrgyia, Hypogymna, unele Psychidae, pe aripi există numai peri.

Multe specii de lepidoptere sunt bune zburătoare, sfingidele ajungând la o viteză de zbor de 60-80 de Km/oră.(Teodorescu și Vlad, 2008)

Nervațiunea se caracterizează prin prezența unei celule mari în mijlocul aripii, numită celulă medială sau discală, delimitată de nervuri transversale, de la care pornesc nervuri longitudinale către marginea aripilor. (Figura 4)

Figura 4. Nervațiunea arpililor la fulturi (https://www.nature.com/articles/s41598-017-16553-5/figures/1 )

Nervațiunea celor două perechi de aripi este asemănătoare la speciile din subordinul Homoneura, pe când la cele din subordinul Heteroneura aripile posterioare sunt mai mici și cu o nervație mai simplă. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Sistemele de cuplare a aripilor de pe aceeași parte a corpului sunt de 4 tipuri:

1. Sistemul jugo-frenat(Figura 5)cuprinde două formațiuni: o proeminență ca un lob, numită jugum, situată la marginea posterioară a aripii anterioare și 2-6 peri situati la marginea anterioară a aripii posterioare numiți frenulum. Este considerat ca un dispozitivprimitiv, prezent la suprafamiliile Micropterygoidea și Eriocranioidea din care au derivat celelalte sisteme de cuplare. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Figura 5 . Sistemul jugo-frenat(http://cronodon.com/BioTech/Insect_locomotion.html)

2. Cuplajul jugat (Figura 6)prezintă un lob lung, îngust, numit jugum, prevăzut cu peri sau solzi pe margine și întărit de o ramură a nervurii anale. Marginea anterioară a aripii posterioare este cuprinsă între jugum și marginea posterioară a aripii anterioare. Este întâlnit la Hepialoidea, din Subordinul Homoneura sau Jugata. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Figura 6 . Cuplajul jugat (http://images.slideplayer.com/32/9835194/slides/slide_6.jpg)

3. Cuplajul frenat este alcătuit din frenulum, format dintr-un grup de 2-20 peri (la mascul sudați pe toată lungimea lor, la femelă, separați), ce pornesc din porțiunea bazală a marginii costale a aripilor posterioare și se ancorează într-un dispozitiv, numit retinaculum, situat pe fața ventrală a aripilor anterioare. La mascul, retinaculul este reprezentat de un lob chitinos, care prinde frenulum ca un croșet, iar la femelă de un grup de peri sau solzi puternici, situați în vecinătatea marginii celulei discale și orientați oblic, cu vârful către anterior. Acest sistem de cuplare este întâlnit la majoritatea speciilor incluse în Subordinul Heteroneura sau Frenata.(Figura 7)(Teodorescu și Vlad, 2008)

Figura 7 .Cuplajul frenat (http://slideplayer.com/slide/9835194/)

4. Cuplajul amplexiform realizează cuplarea prin aderența celor două aripi, favorizată de lobul humeral proeminent al aripilor posterioare, întărit de una sau câteva nervuri humerale. Este întâlnit la speciile suprafamiliilor Papilionoidea, Hesperioidea  Bombycoidea, din subordinul Heteroneura. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Forma și mărimea aripilor sunt diferite. Ca formă, aripile pot fi lanceolate, triunghiulare,  subtriunghiulare, dreptunghiulare, trapezoidale etc. Pot fi mari în raport cu corpul, late sau mai înguste. (Teodorescu și Vlad, 2008)

La Attacidae(Figura 8), aripile anterioare au apexul proeminent și cu un desen care le face să semene cu un cap de șarpe, fiind numite "fluturi cap de șarpe" sau'' cap de cobră”.

Figura 8.Aripile la specia Attacus atlas (http://bater.ru/park-babochek/prodazha-babochek/vidy-babochek-i-tseny/)

La unele specii, marginea distală a aripilor este ondulată, ușor decupată.

La Pterophoridae (Figura9), aripile au lobi (2, 3, 4 la cele anterioare, 3 la cele posterioare), în repaus strânși în evantai. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Figura 9. Aripile la specia Emmelina monodactyla(Pterophorinae: Pterophorini) (https://en.wikipedia.org/wiki/Pterophoridae)

Fluturii din genul Kallima, din regiunca indo-australiană, au aripile în formă de frunză, cu colorație adecvată, pețiol, desene ce imită nervurile principale și secundare.

La unele specii de Attacidae, Uraniidae, Papilionidae, Nymphalidae, aripile posterioare, au una sau mai multe prelungiri lungi.

Se întâlnesc la femelele unor Lymantriidae, Geometridae, Psychidae, unele specii de Megalopygidae, Heterogynidae sau la ambele sexe ale unor Tineoidea antarctice. Speciile familiei Aegeriidae (Sesiidae) au pe aripi porțiuni mari, transparente, lipsite de solzi, prin forma și culoarea corpului, a aripilor, ele imitând unele himenoptere.

Culorile aripilor (fizice, chimice sau mixte) sunt de o mare varietate. Există pete (circulare, ocelare, triunghiulare, inelare, dreptunghiulare, conice, semilunare, de forma unor litere, cifre, semne de punctuație), benzi longitudinale, oblice sau transversale, late sau înguste drepte sau în zig-zag. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Monocromia este întâlnită la puține specii.

Pete ocelare se întâlnesc la specii de Attacidae, Satyridae, unele Nymphalidae, Papilionidae, Lycaenidae etc.

Abdomenul este cilindric, fusiform, turtit dorso-ventral sau lateral, acoperit cu peri sau solzi,  lipsit de cerci. Este alcătuit din 9-10 segmente la femele și 8 la masculi, ultimele două la masculi și trei la femele, intrând în componența armăturii genitale (Figura 10). (Teodorescu și Vlad, 2008)

Figura 10. Armătura genitală a fluturilor (https://zookeys.pensoft.net/article/20179/ )

Majoritatea femelelor au două orificii genitale, unul pentru acuplare, celălalt pentru montă. Aparatul stridulant poate fi situat pe cap, torace, aripi, picioare sau abdomen. Sunetul este produs prin frecarea unei zone, numită arcuș, de una care vibrează, numită tambur. La unele Arctiidae, Noctuidae, ambele componente se pot afla pe aripi.(Teodorescu și Vlad, 2008)

La unele specii de Noctuidae, masculii produc sunete prin frecarea picioarelor, de aripile anterioare pe care se află tamburul, sau de aripile posterioare.

La Arctiidae, sunetul se poate produce și prin vibrația marginilor stigmelor metatoracice, amplificată de o proeminență laterală a segmentului respectiv.

La masculii de Lymantria monacha, Stilpnotia salicis, sunetul este produs prin frecarea unui repliu striat al pleurei și sternitului segmentul III abdominal, de fața opusă, fin rugoasă a unei mici cavități. (Teodorescu și Vlad, 2008)

La Acherontia atropos, sunetul emis este produs la aspirarea aerului prin orificiul îngust dintre epifaringe și planșeul faringian.

Stridulația are rol de semnal sexual sau defensiv.

Organele timpanale, care permit recepționarea semnalelor sonore sunt dispuse pe torace sau pe abdomen. Se realizează o comunicare intra și interspecifică, fiind percepute sunete emise de indivizi din aceeași specie sau din specii diferite. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Dimorfismul sexual frecvent întâlnit la fluturi se referă la lungimea și grosimea corpului, forma și dimensiunile antenelor, culoare, cuplajul și mărimea aripilor, mărimea picioarelor, prezența androconiilor etc.

La speciile de Morpho, speciile familiilor Lycaenidae, Lymantriidae, Psychidae, unele Geometridae, dimorfismul este așa de pronunțat, încât cele două sexe par specii diferite.

Există și un dimorfism sezonier, formele generației de primăvară fiind diferite ca anvergură, culoare, desen, de cele ale generației de vară. (Teodorescu și Vlad, 2008)

La unele specii, îndeosebi tropicale, de Papilio, Troides se constată un polimorfism, îndeosebi la femele (forme cu culori diferite, uneori mimând specii înrudite sau din alte familii).             Uneori există polimorfism la ambele sexe și mult mai rar se întâlnește polimorfism numai la masculi. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Ritmul de activitate a adulților poate fi diurn, crepuscular sau nocturn.

Reproducerea este amfigonă, dezvoltarea holometabolă. Marea majoritate a speciilor sunt ovipare, cazurile de ovoviviparitate sau viviparitate fiind rare. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Ouăle sunt sferice, hemisferice, ovoidale, lenticulare, dreptunghiulare, fusiforme, piriforme, tronconice, netede sau cu ornamentație variată, formată din coaste, puncte, noduli, tuberculi, rețele.

Culoarea ouălor este albă, galbenă, portocalie, albăstruie, verzuie, brună, roșcată în concordanță cu substratul. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Dimensiunile ouălor variază între 0,2 mm lungime la Nepticulidae și 3 mm la Dendrolimus pini. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Ouăle sunt depuse separat sau în grupe, fiind acoperite cu peri de pe abdomenul femelei sau lipite de substrat printr-o secreție a glandelor genitale anexe. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Substratul pe care sunt depuse ouăle este diferit: frunzele plantelor, ramurile subțiri, scoarța ramurilor groase sau a trunchiurilor arborilor, crăpăturile scoarței, corola sau ovarul florilor, sub epiderma frunzelor, pe suprafața coconului femelei. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Larvele sunt de tip eruciform (gr. erruca = omidă), cu corpul cilindric, uneori mult alungit, subtire, fusiform, scurt, oval sau turtit dorso-ventral, asemănător unui limax.

Tegumentul larvelor prezintă peri microscopici (la larvele endofite sau care răsucesc frunzele), peri mai lungi, moi, mătăsoși sau rigizi, rari sau deși, tuberculi setigeri, granule, coarne etc. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Culoarea larvelor poate fi verde, cenușie, gălbuie, roz, albicioasă, cu dungi longitudinale sau oblice, cu puncte sau pete de diferite forme, mărimi și culori.

Capul larvei este ortognat, cu antene alcătuite de obicei din 3-4 articole (1-2 la larvele miniere), câte 6 stemate pe fiecare latură, aparat bucal masticator, cu mandibule sclerificate, puternice. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Picioarele toracice articulate, utilizate mai ales pentru apucarea hranei sunt scurte, formate de obicei din 5 articole. Tarsul este terminat cu o ghiară curbată.

Abdomenul este format din 10 segmente, cu 2-5 perechi de apendice locomotorii, nearticulate, membranoase, retractile, numite pedes spurii (= picioare false). Acestea sunt alcătuite din 3 părți: regiune subcoxală, coxă și talpă retractilă, prevăzută cu cârlige numite hamuli, dispuse în coroană, ca o potcoavă sau în cercuri. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Poziția picioarelor false. La majoritatea speciilor, cele 5 perechi de pedes spurii se găsesc pe segmentele abdominale III-VI și X. La Geometridae sunt numai două perechi posterioare. La Limacodidae, în loc de pedes spurii se află niște ventuze iar la Eriocraniidae, picioarele abdominale lipsesc.

Larvele unor specii își construiesc căsuțe portabile în care se retrag, scoțând doar capul și toracele pentru a se hrăni și a se deplasa. La Psychidae, căsuțele sunt acoperite cu resturi vegetale, nisip, pietricele, fragmente de cochilii de moluște. La Eupistidae, căsuțele sunt formate din porțiuni decupate din frunzele, florile sau fructele cu care se hrănesc sau din mătase împregnată cu o substanță secretată de larve. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Larvele acvatice de Nymphula, Palustra, Cataclysta, utilizează pentru respirație oxigenul solvit (respirație cutanată sau branhială), aerul din aerenchimul plantelor acvatice sau aerul de la suprafața apei. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Durata dezvoltării larvare, caracteristică pentru specie, depinde și de temperatură, umiditate, valoarea nutritivă a hranei consumate; la cele mai multe specii este cuprinsă între 20 și 60 de zile. Numărul năpârlirilor larvare variază între 2 și 7, de obicei fiind 4-5. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Figura 11 . Stadiile ale dezvoltării Lepidopterelor ( https://www.twentsewelle.nl/content/1367/nl/de-vlinderfabriek )

Crisalida, stadiu imobil, cu forme, culori și dimensiuni diferite, poate fi liberă, la Micropterygidae și Eriocraniidae, semiliberă, la care unele segmente abdominale și apendicele sunt imobile sau obtectă. Tegumentul crisalidei poate fi neted, aproape glabru sau cu peri microscopici sau lungi, numeroși, dispuși în smocuri. Durata stadiului de crisalidă variază de la 3-5 zile, la generațiile de vară ale unor specii, la 250-280 de zile, la Saturnia pyri.

La multe specii, larva se transformă din crisalidă într-un cocon mătăsos realizat din secreția propriilor glande sericigene. Coconul poate fi rar sau dens, fixat între frunze sau ramuri subțiri, ascuns în pământ, nisip, frunzar, sub pietre, în crăpăturile scoarței sau sub scoarță, etc. Culoarea coconului poate fi albă, galbenă, brună, mai rar verde. (Teodorescu și Vlad, 2008)

La lepidoptere este prezentă diapauza estivală, hiemală sau ambele tipuri. Diapauza hiemală are loc în stadiul de ou, larvă, crisalidă sau adult.(Figura 11) După numărul de generații pe an, speciile de lepidoptere pot fi monovoltine, bivoltine, polivoltine, sau cu o generație la doi sau mai mulți ani. (Teodorescu și Vlad, 2008). Unele specii execută migrații, pe distanțe mai lungi sau mai scurte.Migrațiile adulților pot fi individuale sau în grupuri ce ajung uneori la un număr foarte mare de exemplare, de același sex sau din ambele sexe, din aceeași specie sau din specii diferite. Sunt parcurse distanțe mari, străbătând continente, deșerturi, oceane. Unele ajung din Africa până în țările scandinave, dincolo de cercul polar, sau din America de Sud, până în Antile, Mexic, SUA, Canada. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Migrațille larvelor sunt mai puțin cunoscute decât cele ale adulților. La speciile familiei Thaumetopoeidae (omizile procesionare), larvele se deplasează în șiruri, pentru hrănire, la alte specii, deplasările sunt mai neorganizate. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Adaptările legate de apărare, la adulți și larve, sunt variate: mimetismul, homocromia, imitația, autohemorea, împroșcarea cu lichide toxice, producerea unor substanțe repelente, de către glande speciale toracice, existența unor peri urticanți, hemolimfa toxică, imobilizarea reflexă, tanatoza, colorația de avertizare, emiterea unor sunete de avertizare, atitudini și mișcări de amenințare, colorația de dezagregare, cu pierderea unității de contur, prezența unor pete ocelare, care sperie sau distrag atenția de la organele vitale, construirea de căsuțe larvare protectoare, viață endofită (larve miniere, xilofage, galigene), rularea frunzelor, țeserea de către larve a unui cocon protector pentru crisalidă etc. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Regimul trofic diferă la larve și adulți.

Hrana adulților este alcătuită îndeosebi din nectarul florilor, dar și din polen, seva arborilor, sucul fructelor zemoase și dulci, miere, dejecțiile dulci ale afidelor și coccidelor, urină, lichide din cadavre sau dejecții, secreții lacrimale sau sânge ce se scurge din rănile mamiferelor, transpirația omului. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Hrana larvelor este mai variată: majoritatea sunt fitofage, hrănindu-se cu părțile epigee și hipogee ale plantelor. Cele mai multe sunt exofage, atacând plantele din exterior, dar există și unele endofage, care atacă organele plantelor din interior.

Unele consumă produse vegetale depozitate: porumb, grâu, făină, mălai, griș, fructe uscate, paste făinoase, ceaiuri etc. Există și larve care se hrănesc pe seama unor plante ce conțin substanțe toxice (Solanum, Datura, Atropa, Euphorbia, Nicotiana, Nerium etc.), pe care au posibilitatea să le descompună în produși netoxici sau să le izoleze în propriul corp. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Unele larve fitofage sunt galigene (cecidogene), determinând formarea unor gale pe diferite organe ale plantelor.

Larvele de Cossidae, Aegeriidae sunt xilofage, făcând galerii în tulpinile, ramurile, rădăcinile pomilor fructiferi și arborilor forestieri.

La unele specii, larvele sunt micetofage sau lichenofage.

Larvele necrofage consumă nevertebrate din colecții, penele, puful păsărilor, blana mamiferelor, obiecte din lână.

Galleria mellonella, Achroia grisella atacă fagurii de albine, consumând ceară.

Există și specii coprofage, care se hrănesc cu excremente de mamifere.

Unele larve de Lycaenidae, Gelechiidae, Pyralidae etc. sunt prădătoare, hrănindu-se cu Fulgoridae, Jassidae, Aphididae, Coccidae, cu larve de furnici, cu diptere sau cu larvele altor lepidoptere. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Sunt și specii termitofile sau mirmecofile. Uncle specii de Lycaenide își depun ouăle pe flori, cu care larvele se hrănesc până în stadiul III, apoi sunt luate de lucrătoarele de Myrmica și duse în furnicar unde consumă ouăle și larvele gazdelor lor, fiind tolerate datorită secrețiilor unor glande speciale. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Larvele unor specii de Pyralidae sunt parazite pe larve de lepidoptere Attacidae.

Controlul populațiilor de lepidoptere este realizat de virusuri, bacterii, ciuperci, protozoare, nematode, artropode, dar mai ales de insecte parazitoide (himenoptere, diptere) și prădătoare (Odonata, Mantodea, Coleoptera, Heteroptera, Hymenoptera, Diptera ctc.), vertebrate, plante insectivore. (Teodorescu și Vlad, 2008)

În aprecierea importanței lepidopterelor nu trebuie avută în vedere numai diferența dintre numărul speciilor dăunătoare ca larve (circa 200) și al celor utile (10), ci și aportul adulților ca polenizatori, faptul că în toate stadiile sunt componente ale lanțurilor trofice, integrate unui echilibru ecologic. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Larvele produc de obicei daune, atacând toate categoriile de plante cultivate (Capinera, 2001), arborii forestieri (Doane et al., 1981, Teodorescu, Simionescu 1987, 1989, 1991, 1994, 1997, 1999, Teodorescu et al, 1990, 2001), produsele depozitate, obiectele din lână, blănurile, fagurii din stupi etc. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Specia domesticită Bombyx mori este folosită pentru obținerea mătăsii naturale, fiind hrănită cu frunze de dud. Se cresc de peste 5.000 de ani, fiind selecționate peste 3.000 de rase. În diferite țări se mai cresc specii de Phylosamia, Anthaeraea, Theophila, Michelia.

Speciile Sitotroga cerealella, Ephestia kuehniella servesc drept gazde pentru creșterea în condiții dirijate a unor parazitoizi sau prădători utilizați în controlul biologic al dăunătorilor.

O serie de specii de lepidoptere au fost utilizate în controlul biologic al unor plante spontane. (Teodorescu și Vlad, 2008)

Capitolul 2.Caracterizarea fizico-geografică a Geoparcului Dinozaurilor Țara Hațegului

2.1 Poziție geografică

Geoparcul se învecinează la sud cu Parcul Național Retezat și la nord și nord – est cu Parcul Natural Grădiștea Muncelului – Cioclovina.Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului are o suprafață de 102.392ha și cuprinde integral unitățile administrativ-teritoriale: Densuș, General Berthelot, Totești, Răchitova, Sântămăria Orlea, Sarmizegetusa, Hațeg și parțial unitățile administrativ-teritoriale Baru Mare, Sălașu de Sus, Pui, Râu de Mori.Țara Hațegului este așezată pe drumul principal care lega încă din antichitate și apoi în Evul Mediu, Transilvania de Banat, cu vămile de la Bretea, Hațeg și Poarta de Fier și de asemenea având o strânsă legătură cu părțile Olteniei, prin pasul Vulcanului. (Figura 12) Țara Hațegului este una dintre cele mai însemnate și cunoscute vetre de civilizație și prefacere neîntreruptă din întreg spațiul românesc Depresiunea Hațeg este situată în partea de vest a țării, între grupele muntoase Retezat – Godeanu, Parâng și Poiana Ruscă. Este o zonã cu o poziție geostrategică importantă, ce face legătura între zona intracarpaticã cu celelalte teritorii. Astfel, prin Poarta de Fier a Transilvaniei (cotă 699 m) se trece în culoarul Bistra – Timiș spre Caransebeș, iar prin pasul Merișor (Șaua Baniță, cotă 700 m) către Depresiunea Petrosanilor. Pe valea Streiului se face legătura cu zona nordicã a Mureșului. (http://www.hateggeoparc.ro/tara-hategului)

Figura 12. Harta Geoparcului Dinozaurilor Țara Hațegului (http://www.hateggeoparc.ro/tara-hategului/acces/)

Peste Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului se suprapune Parcul Natural Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului, declarat Parc Natural prin H.G. nr. 2151/30.11.2004, care cuprinde în total 8 rezervații naturale, situl Natura 2000 ROSCI0236 Strei – Hațeg și, parțial, situl Natura 2000 ROSCI0292 Coridorul Rusca Montană – Țarcu – Retezat. Parcul Natural Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului are, de asemenea, statutul de geoparc internațional și este membru în Rețeaua Globală a Geoparcurilor, susținută de UNESCO. Statutul de geoparc internațional este evaluat, la fiecare patru ani, de experți internaționali UNESCO, iar pe baza raportului de evaluare poate fi reconfirmat sau retras. Parcul Natural Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului a devenit geoparc global în anul 2005, fiind evaluat și revalidat în anii 2008, 2010, 2014 și urmează o nouă evaluare în 2018. ( http://www.hateggeoparc.ro/tara-hategului)

2.2 Căi de acces

Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului este situat la intersecția drumului european E 64, ce vine din Ungaria, pe ruta Arad – Deva – Simeria și a drumului european E 79, ce vine din Bulgaria, pe ruta Craiova – Târgu Jiu. Axele importante din zonă sunt: Hațeg – Sarmizegetusa – Caransebeș, DN 68, Hațeg – Petroșani, DN 66, Hațeg – Deva și Hațeg – Hunedoara. Drumul european E79 constituie și ruta de acces dinspre Sibiu, Sebeș, Simeria. Aceeași rută este accesibilă acum, pe tronsonul Sibiu – Simeria în lungul autostrăzii A3. Accesul feroviar se poate realiza pe magistrala 200 București – Timișoara. Stația de oprire este Subcetate, comuna Sîntămăria Orlea. Cele mai apropiate aeroporturi sunt Aeroportul Sibiu, la 134 km.Timișoara, la 175 km, și aeroportul Cluj, aflat la 210 km. Porțile de acces în Geoparc sunt la Hațeg, intrarea dinspre Simeria (Sebeș, Deva), la Sarmizegetusa, intrarea dinspre Timișoara, via Caransebeș, la Baru Mare, intrarea dinspre Petroșani – Târgu Jiu și la Silvasu de Jos, intrarea dinspre Hunedoara – Deva. Toate aceste zone de intrare sunt marcate cu panouri specifice. (http://www.hateggeoparc.ro/tara-hategului/acces)

2.3 Relief

Țara Hațegului este o depresiune siuată la poalele munților Retezat. Relieful este caracterizat de câmpii, dealuri; unele chiar înalte printere acestea se numără Vârful Poieni.

Retezatul este unul dintre cele mai frumoase masive ale Carpaților. Îl caracterizează înălțimile relativ mari, peisajul foarte divers și, mai ales, salba de lacuri montane. El oferă turismului alpin tot ceea ce el presupune. În limitele sale, pot fi admirate atât zone împădurite, cât și peisaje degajate, pe văi ori înălțimi. Retezatul a fost comparat cu Munții Höhe Tauern din Austria. Cea mai frumoasă vedere a Munților Retezat se realizează dinspre nord, adică dinspre Hațeg. Râu de Mori se află situat la punctul de cea mai joasă altitudine a zonei muntoase (485 m). Cele mai înalte vârfuri ale masivului depășesc 2500 m (Peleaga – 2509; Păpușa – 2500 m). Circa 1/4 din ei depășesc 2000 m, iar 2/3 cote de peste 1600 m. (Grigorescu și colab., 2014)

2.4 Geologie

Țara Hațegului este din punct de vedere geologic un punct de atracție care are la bază oasele de dinozauri și ouă ale acestora. După cercetările efectuate până în prezent se cunoaște faptul că acum 70 de milioane de ani această zonă era o insulă în Ocenul Thetys cu vegetație bogată caracterizată de ferigi uriașe și palmieri. Datorită suprafeței mici și resurselor limitate de viață, dinozaurii sufereau de nanism insular. Sepciile de dinozauri întalnite la acea vreme erau Balaurul Bondoc,Magyarosaurus dacus,Zalmoxis robustus. Siturile arheologice sunt la Sâmpetru pe Valea Dinozaurilor și în comuna General Bethelot. În ziua de azi se desfășoară săpături în comunele din jur și an de an se fac descoperiri noi de oase sau cuiburi cu ouă de dinozauri. (Grigorescu și colab., 2014)

2.5 Pedologie

Pentru arealul depresionar, caracteristice sunt luvisolurile (luvosoluri, preluvosoluri), hidrisolurile (gleisoluri și stagnosoluri), protisolurile (aluviosoluri), în timp ce cambisolurile sunt prezente în dealurile și lunciile din nord-estul depresiunii (eutricambisoluri) și în spațiul montan din jur-împrejurul acesteia, de regulă până la altitudinea 1500 m, în unele cazuri până la 1700 m (districambisoluri). Din clasa spodisolurilor, prepodzolurile se dezvoltă începând de la 950-1000 m, până la 1800 m (în Retezat și Țarcu) sau 2000 m (în Godeanu), iar podzolurile de la 1400-1600 m până la 2200 m. Pe creste este prezent un alt tip de sol neevoluat: litosolul.

(Grigorescu și colab., 2014)

2.6 Hidrologie

Din punct de vedere hidrologic Țara Hategului reunește râuri, lacuri artificiale și glaciare. Râurile din Țara Hategului sunt Râul Galbena ce traversează teritoriul și orașul Hateg, Râul Mare ce face parte din categoria râurilor de munte, pe cursul căruia a fost construit un lanț de lacuri artificiale ce pornește cu barajul de la Gura Apelor (Figura 13), contruit pe concasament natural, legate de acesta se mai găsec alte 4 lacuri de acumulare. Lacurile Retezatului, în majoritate de origine glaciară, sunt în număr de circa 100. Aproape 40 sunt mai importante. Printre acestea, se fac remarcate: Bucura (2041 m), cel mai întins lac din Carpați și cel mai vizitat, Zănoaga (1997 m), cel mai adânc lac alpin, Custura Mare (2270 m), cel mai înalt din Carpați, Galeșul (2040 m), Slăveiul (1970 m), Tăul Negru (2025 m). Urme de ghețari mai pot fi admirate pe anumite văi: Lăpușnicului, Râu Bărbat, Bucura.(http://www.anpm.ro/documents/21661/2534773/PN+GDTH_Planul+de+management_Proiect+pentru++++aprobare_2015.pdf/d03e0940-fe7a-4e24-813a-57b553ce4762 )

Figura 13. Barajul Gura Apelor (http://www.informatii-romania.ro/listing/barajul-gura-apelor/)

2.7 Climă

Țării Hațegului îi este specifică clima temperat continentală, având etajare pe verticală și caracterizată prin precipitații neuniforme, vânt ce bate din partea nord-vestică și o temperatură medie în luna ianuarie cuprinsă între valorile -2 și -10 grade C, iar în luna iulie între 10 și 20 grade C.(http://www.anpm.ro/documents/21661/2534773/PN+GDTH_Planul+de+management_Proiect+pentru++++aprobare_2015.pdf/d03e0940-fe7a-4e24-813a-57b553ce4762).

2.8 Vegetație

Țara Hațegului face parte din complexele teritoriale de vegetație potențială F și G, păduri mezofile de foioase și respectiv păduri xeroterme de foioase. Vegetația geoparcului este reprezentată prin:

1.păduri de brad și fag Abies albă, Fagus sylvatica cu Pulmonaria rubra 2.păduri de fag Fagus sylvatica cu Symphytum cordatum 3.păduri de fag cu carpen Fagus sylvatica, Carpinus betulus 4.păduri de gorun cu carpen Quercus petraea, Carpinus betulus cu Lathyrus hallersteinii (F40) 5.păduri de stejar Quercus robur cu Carex brizoides 6.păduri de gorun și cer Quercus petraea, Q. cerris cu Lychnis coronaria 7.păduri de gorun, cer și gârniță Quercus petraea, Q. cerris, Q. frainetto cu Lathyrus niger 8.păduri de cer și gârniță Quercus cerris, Q. frainetto cu Crocus flavus (G16)

În situl ROSCI0236 – Strei –Hațeg au fost identificate:

6240 Pajiști stepice subpanonice;

8310 Peșteri în care accesul publicului este interzis;

91Y0 Păduri dacice de stejar și carpen;

9110 Păduri de fag de tip Luzulo Fagetum;

9170 Păduri de stejar cu carpen de tip Galio-Carpinetum.

Pentru GDTH sunt predominante marile unități de vegetație potențială F (Păduri mezofile decidue de foioase și Foioase-rășinoase) – în zonele mai înalte – și G (Păduri xerotertne decidue de foiase și foioase-rășinoase) -în zonele cu altitudini mai scăzute. Din punct de vedere floristic Parcul Natural Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului prezintă o diversitate foarte ridicată, 2.342 de specii (subspecii și varietăți de criptogame vasculare, ceea ce reprezintă 62% din totalul criptogamelor vasculare prezente la nivel național, 3.759 după Ciocârlan, 2000. Aceste specii, subspecii și varietăți aparțin unui număr de 99 de familii. (Anexa1) Dintre comunitățile vegetale cele mai des întâlnite sunt următoarele: Molinion caeruleae, Alno-Padion, Alnion incanae, Salicion albae, Luzulo-Fagetum, Symphyto-Fagion, Asperulo-Fagetum, Vaccinio-Piceetea, Stipo-Festucetalia pallentis, Galio-Carpinetum, Alysso-Sedion albi, Erythronio-Carpiniori. În estimarea diversității specifice relevante s-au luat în calcul doar habiatele naturale astfel că majoritatea speciilor ruderale au fost ignorate, luarea în calcul și a acestora ar fi crescut procentul de la 62 la 65%. Din cele 2.342 de specii, subspecii și varietăți 48, iar 2% se regăsesc pe Lista Roșie a plantelor, elaborată de Negrean și Dihoru, 2009. În cadrul Parcului Natural Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului sunt incluse rezervații botanice naturale cuprinzând o varietate mare de tipuri de vegetație. Dintre aceste tipuri amintim: vegetația de tinov, vegetația de pajiște, molidișuri, făgete, quercete, fânețe. Vegetația potențială este acea vegetație care ar acoperi uscatul în lipsa activității umane: este vorba despre vegetația naturală care corespunde potențialului ecologic actual al teritoriului. Stabilirea vegetației potențiale presupune o analiză ecologică detaliată atât a teritoriului, cât și a comunităților vegetale. (http://www.anpm.ro/documents/21661/2534773/PN+GDTH_Planul+de+management_Proiect+pentru++++aprobare_2015.pdf/d03e0940-fe7a-4e24-813a-57b553ce4762 )

2.9 Habitatele

Sunt bine reprezentate apele interioare (C), zonele mlăștinoase (D), pajiștile (E), tufărișurile (F), pădurile (G), există și stâncării (clasa H), precum și zone cultivate (I) sau construite (J), ultimele două adesea încă într-o stare tradițională, nemodernizată, ceea ce favorizează păstrarea unei biodiversități ridicate. (Anexa 2) Dintre cele zece clase de habitate EUNIS, din GDTH nu lipsesc decât primele două, care cuprind habitatele marine (A) și litoralul marin (B).

2.10 Fauna

Din punct de vedere faunistic speciile de interes conservativ sunt aproximativ 93. (Anexa 3) Fauna de vertebrate cuprinde 7 specii aparținând clasei Mammalia, limitate ca răspândire la această zonă a țării: Crocidura leucodon (Ord. Insectivoră), Myotis nattereri și Myotis daubentoni (Ord. Chiroptera), Spalax microphtalamus ssp. Mezosegiensis, Microtus agrestis și Pitymys subterraneus ssp.subterraneus (Ord. Rodentia), Capreolus capreolus transsylvanicus (Ord. Artiodactyla). Specia Myotis nattereri se află și pe Lista Roșie Europeană. O singură specie din clasa Reptilia se poate întâlni pe teritoriul României numai în această parte a țării: Lacerta agilis ssp. erythronotus (Ord. Squamata). Din clasa Amphibia, fiecare din cele două ordine componente are câte un reprezentant cu arie de răspândire limitată la această parte a Transilvaniei: Triturus cristatus ssp. cristatus (Ord. Urodela) și Rana arvalis ssp. vorterstorffi (Ord. Anura).

În ceea ce privește avifauna Țării Hațegului, o importanță deosebită o are specia Ciconia ciconia (barza albă), relativ numeroasă în zonă, care se află înscrisă pe lista “Acordului pentru conservarea păsărilor de apă african-eurasiatice” adoptat la Haga în data de 16 iunie 1995, semnat și de România și publicat în M.O. al României Partea I Nr.236/30-V-2000 și de asemenea este înscrisă și în Directiva 79/409/EEC din 2 aprilie 1979 a Consiliului Europei pentru conservarea păsărilor sălbatice.

Pe listele acesteia mai sunt înscrise și alte 4 specii de păsări periclitate pe plan european, care se întâlnesc și în Țara Hațegului: Glaucidium passerinum, Ficedula parva, Lanius collurio, Lanius minor. O altă specie reprezentativă pentru această regiune este Delichon urbica (lăstunul de casă). Datorită cadrului natural geografic deosebit în care se găsește Țara Hațegului (dispusă la poalele masivului Retezat și incluzând o mică parte din porțiunea nordică a acestuia), se poate vorbi și de o varietate de specii de plante și animale aparținând zonelor biogeografice alpină și continentală. Zona găzduiește o comunitate complexă de mamifere, de la ierbivore mari Rupicapra rupicapra, Cervus elaphus, Capreolus capreolus și carnivore mari Ursus arctos, Canis lupus, Lynx lynx, până la mamifere mici, mai ales rozătoare și carnivore mici. De asemenea, cel puțin 15 specii de lilieci – chiroptere – au fost identificate. Printre acestea se găsesc și : Rhinolophus ferrum-equinum, amenințat la nivel global, IUCN, Vespertilio murinus, Pipistrelus pygmaeus.(http://www.anpm.ro/documents/ 21661/2534773/PN+GDTH_Planul+de+management_Proiect+pentru++++aprobare_2015.pdf/d03e0940-fe7a-4e24-813a-57b553ce4762 )

Capitolul 3. Taxonomia clasică și taxonomia moleculară

Taxonomia (din greaa antică (gr. taxis), adică "aranjament", și -nomos, adică "lege") este știința clasificării, de a defini și a numi grupuri de organisme biologice pe baza unor caracteristici comune. (Brundin, 1972) Organismele sunt grupate împreună în taxoni (singular: taxon) și aceste grupuri primesc un rang taxonomic; grupurile de un rang dat pot fi agregate pentru a forma un super-grup de rang superior, creând astfel o ierarhie taxonomică. Cel mai înalt rang în taxonomie este domeniul, apoi în ordine ierarhică urmează regnul, filumul (diviziunea este uneori utilizată în botanică în locul filumului), clasa, ordinul, familia, genul, specia și subspecia. (Brundin, 1972) Botanistul suedez Carl Linnee este considerat părintele taxonomiei, deoarece a dezvoltat un sistem pentru clasificarea organismelor și a introdus nomenclatura binară pentru numirea organismelor. (Stevens, Gardens, & Louis, 2002)

Definiția exactă a taxonomiei variază de la sursă la sursă, însă nucleul disciplinei rămâne: concepția, denumirea și clasificarea grupurilor de organisme. În schimb în opinia lui Simpson (1961) sitematica ”este studiul științific al tipurilor și diversității organismelor, al relațiilor dintre ele. ”

Este știința diversității organismelor.

Simpson consideră că: ”Sistematica este cea mai elementară și cea mai cuprinzătoare parte a zoologiei .” (Cea mai elementară pentru că animalele nu pot fi discutate sau tratate științific până ce nu s-a atins un grad al cunoașterii taxonomice; cea mai cuprinzătoare pentru că: pune laolaltă, folosește, concentrează și implementează tot ceea ce se cunoaște despre animale din punct de vedere morfologic, fiziologic sau ecologic).

Există unele dezacorduri cu privire la faptul că nomenclatura biologică este considerată o parte a taxonomiei sau o parte a sistematicii.

Sistematica reprezintă studiul identificării, taxonomiei și nomenclaturii organismelor, inclusiv clasificarea organismelor cu privire la relațiile lor naturale și studiul variației și evoluției taxonomice. (Brundin, 1972)

Un set întreg de termeni, inclusiv taxonomia, biologia sistematică, sistematica, biosistematica, clasificarea științifică, clasificarea biologică și filogenia au uneori semnificații suprapuse – uneori aceleași, câteodată ușor diferite, dar întotdeauna legate și intersectate. Cel mai larg sens al taxonomiei este folosit aici. Termenul însuși a fost introdus în 1813 de către de Candolle, în Théorie élémentaire de la botanique. (John & Srivastava, 1999)

În timp ce unele descrieri ale istoriei taxonomice atestă încercări ale taxonomiei în civilizațiile antice, o încercare cu adevărat științifică de a clasifica organismele, nu a avut loc decât în ​​secolul al XVIII-lea. Lucrările anterioare au fost în primul rând descriptive și axate pe plante care erau utile în agricultură sau medicină. Există o serie de etape în această gândire științifică. La începuturi taxonomia s-a bazat pe criterii arbitrare, așa-numitele sisteme artificiale, inclusiv sistemul de clasificare sexuală al lui Linnee. Mai târziu, sistemele de clasificare s-au bazat pe o analiză mai completă a caracterelor taxonomice, numite sisteme naturale, cum ar fi cele propuse de Jussieu (1789), de Candolle (1813) și de Bentham și Hooker (1862-1863). Acestea au fost pre-evolutive în gândire. Lucrarea lui Charles Darwin "Despre originea speciilor" (1859) a introdus un alt mod de a aborda analiza caracterelor și clasificarea pe baza relațiilor evolutive. Această abordare a fost preluată și de Eichler (1883) și Engler (1886-1892). Apariția geneticii moleculare și dezvoltarea metodelor statistice a permis apariția în epoca modernă a sistemelor filogenetice de clasificare, susținute de taxonomii caldiști. (Stevens și colab., 2002).

Cladismul presupune organizarea și ierahizarea speciilor în acord cu momentul descendenței comune; acestea diferențiază omologiile de analogii, consideră omologiile recente și oferă informații fologenetice mai concludente și este mai deschisă analizei științifice. Obiectivul principal al cladismului este acela de a formula ipoteze pe baza realțiilor genealogice dintre grupuri de organisme monofiletice. În prezent majoritatea sistematicienilor practică analiza cladistică sau cladismul. Această revoluție în sistematică a fost marcată de apariția lucrărilor entomologului german Willi Hennig:”Basic outline of a theory of phylogenetic systematics și Pocket book of zoology,, apărute în anii ’50. Caracterele folosite pentru construirea cladogramelor sunt furnizate de morfologia comparată, citologia comparată și biochimia comparată. Definiția unui taxon este încapsulată prin descrierea sau diagnosticul său sau prin ambele componente. Nu există reguli stabilite care să reglementeze definirea taxonilor, dar denumirea și publicarea noilor taxoni sunt reglementate de seturi de reguli. În zoologie, nomenclatura pentru rangurile mai frecvent utilizate (superfamilie la subspecii) este reglementată de Codul Internațional de Nomenclatură Zoologică (Codul ICZN). În domeniile botanică și micologie, atribuirea denumirilor este reglementată de Codul internațional de nomenclatură pentru alge, fungi și plante (ICN).

Descrierea inițială a unui taxon implică cinci cerințe principale:

Taxonul trebuie să primească un nume pe baza celor 26 de litere ale alfabetului latin (un binomial pentru specii noi sau uninomial pentru alte rânduri).

Numele trebuie să fie unic (adică nu este omonim).

Descrierea trebuie să se bazeze pe cel puțin un eșantion de tip care poartă numele.

Aceasta ar trebui să includă declarații cu privire la atributele corespunzătoare fie pentru a descrie (defini) taxonul, fie pentru a-l diferenția de alți taxoni (diagnosticul, Codul ICZN, articolul 13.1.1, ICN, articolul 38). Ambele coduri separă în mod deliberat definirea conținutului unui taxon (circumscripția sa) de definirea numelui acestuia.

Aceste prime patru cerințe trebuie să fie publicate într-o lucrare care poate fi obținută în numeroase exemplare identice, ca o înregistrare științifică permanentă. (John & Srivastava, 1999)

Cu toate acestea, adesea sunt incluse mai multe informații, cum ar fi poziția geografică a taxonului, notele ecologice, chimia, comportamentul etc. Modul în care cercetătorii ajung la taxonul lor variază: în funcție de datele disponibile și de resurse, metodele variază de la simple cantitative sau calitative compararea caracteristicilor izbitoare, elaborarea de analize computerizate cu cantități mari de date de secvență ADN. (John & Srivastava, 1999)

Odată cu progresele științei, taxonomia clasică introdusă de Carl Linnee bazată pe caractere morfologice s-a trecut la taxonomia moleculară care are la bază identificarea taxonilor pe baza secvențelor nucleotidice.

Taxonomia moleculară este ramura taxonomiei care analizează diferențele moleculare genetice, ereditare, predominant în secvențele ADN, pentru a obține informații despre relațiile evolutive ale organismului. Din aceste analize, este posibil să se determine procesele prin care s-a realizat diversificarea speciilor. Rezultatul unei analize filogenetice moleculare este exprimat într-un arbore filogenetic. (Page & Holmes, 1998) Filogenia moleculară este un aspect al sistematicii moleculare, un termen mai larg care include și utilizarea datelor moleculare în taxonomie și biogeografie. Filogenia moleculară și evoluția moleculară prezintă o corelație între ele. Evoluția moleculară poate fi definită ca procesul de schimbări selective (mutații) la nivel molecular (gene, proteine, etc.) în diverse ramuri ale arborelui vieții (evoluție). Filogenia moleculară face deducții ale relațiilor evolutive care apar din cauza evoluției moleculare și conduc la construirea unui arbore filogenetic. Figura afișată ilustrează arborele filogenetic al vieții ca fiind unul dintre primii arbori detaliați, conform informațiilor cunoscute în anii 1870 de Haeckel. (Page & Holmes, 1998)(Figura 14).

Figura 14. Arborele filogenetic al lumii animale propus de Ernst Hackel (http://www.flickr.com/photos/apsmuseum/2783553519/ )

Cadrele teoretice pentru sistematica moleculară au fost publicate în anii '60 în lucrările lui Emile Zuckerkandl, Emanuel Margoliash, Linus Pauling și Walter M. Fitch. Aplicațiile sistematice moleculare au fost introduse de Charles G. Sibley celebru ornitolog, Herbert C. Dessauer herpetolog și Morris Goodman mamolog, urmate de Allan C. Wilson, Robert K. Selander și John C. Avise. (Page & Holmes, 1998) Electroforeza proteică a fost introdusă în jurul anului 1956. Deși rezultatele nu au fost cantitative și nu au îmbunătățit clasificarea morfologică, ele au sugerat necesitatea revizuirii substanțiale a clasificării păsărilor. În perioada 1974-1986, hibridizarea ADN-ADN a fost principala tehnică utilizată pentru măsurarea diferenței genetice. (Hillis, Moritz, & Mable, 1996)

Încercările timpurii ale sistematicii moleculare au fost denumite chemotaxonomie și au folosit proteine, enzime, glucide și alte molecule care au fost separate și caracterizate folosind tehnici precum cromatografia.

Acestea au fost înlocuite în ultima vreme în mare măsură prin secvențierea ADN-ului, care produce secvențele exacte de nucleotide sau baze fie pe segmentele ADN sau ARN extrase folosind diferite tehnici.

În general, acestea sunt considerate superioare pentru studiile evolutive, deoarece acțiunile evoluției sunt în cele din urmă reflectate în secvențele genetice. În prezent, este încă un proces lung și costisitor de a secvența întregul ADN al unui organism. Cu toate acestea, este destul de fezabil să se determine secvența unei zone definite a unui anumit cromozom. Analizele sistematice moleculare tipice necesită secvențierea a aproximativ 1000 de perechi de baze. În orice loc într-o astfel de secvență, bazele găsite într-o poziție dată variind între organisme. Secvența specială găsită într-un organism dat este denumită haplotipul său. În principiu, deoarece există patru tipuri de bază, cu 1000 de perechi de baze, am putea avea 41000 de haplotipuri distincte.

Cu toate acestea, pentru organismele dintr-o anumită specie sau într-un grup de specii înrudite, s-a constatat empiric că doar o mică parte a siturilor prezintă variație și majoritatea variațiilor care se găsesc sunt corelate, astfel încât numărul de haplotipuri distincte care se găsesc este relativ mic.

Fiecare organism viu conține acid dezoxiribonucleic (ADN), acid ribonucleic (ARN) și proteine. În general, organismele strâns înrudite au un grad ridicat de asemănare în structura acestor macromolecule, în timp ce moleculele organismelor aflate la distanțe mari au adesea un model de disimilaritate. Imortant din punct de vedere al mutațiilor este faptul că genomul organismului nu suferă mutații în totalitate, unele regiuni pot suferi mutații cu o rata constatntă pe când altele sunt înalt conservate.

Este de așteptat ca secvențele conservate, cum ar fi cele de la ADN-ul mitocondrial (ADNmt), acumuleze mutații în timp. ADNmt (mitocondrial) evoluează rapid, de aceea se recurge la compararea secvențelor de ADNmt pentru a analiza filogenia speciilor relativ strâns înrudite sau chiar a populațiilor aceleiași specii.

Dacă două specii s-au desprins relativ recent dintr-un strămoș comun, secvențele regiunilor omoloage de ADN vor fi probabil identice în lungime. Dimpotrivă, speciile mai puțin înrudite, pot avea secvențe ADN omoloage care se deosebesc nu doar prin bazele existente în anumite situsuri dar și prin lungimea lor totală. Mitocondriile se transmit de la părinți la descendenți prin citoplasma ovulului și pot fi folosite pentru marcarea liniilor materne. Utilizând ADNmt, este implicată o cantitate relativ mică de ADN, care se modifică cu o rată relativ constantă.

ADN care codifică ARNr se modifică relativ puțin, așa încât compararea acestor secvențe de ADN este utilă pentru investigarea relațiilor dintre taxonii care s-au desprins acum sute de milioane de ani. ARNr este o moleculă veche care și-a păstrat funcția la aproape toate organismele și care s-a modificat puțin. Această capacitate redusă de modificare se numește conservare evolutivă și demonstrează că mecanismul sintezei de proteine al celulei suportă puține modificări și încă reține funcția sa vitală. Studiile ARNr au demonstrat că toate organismele vii au un strămoș comun și că există trei linii evolutive majore, denumite domenii, considerate a fi grupările taxonomice cele mai cuprinzătoare. Conservarea evolutivă a acestei molecule demonstrează că organismele strâns înrudite, este posibil să aibă aceleași ARN-uri. Organismele puțin înrudite ar fi de așteptat să prezinte ARN-uri ribozomale mai puțin asemănătoare. Filogeniile moleculare utilizează astfel de date pentru a construi un "arbore filogentic" care să arate evoluția probabilă a diferitelor organisme. Odată cu apariția secvențierii Sanger în 1977, a devenit posibilă izolarea și identificarea diverselor gene pentru studiul evoluției la diferiți indivizi. Se poate folosi, de asemenea, secvențierea pentru a obține transcriptomul unui organism, permițând identificarea relațiilor filogenetice.(Hillis și colab., 1996)

Abordarea cea mai comună este compararea secvențelor omoloage pentru gene folosind tehnici de aliniere a secvențelor pentru a identifica similitudinea.

O altă aplicație a filogeniei moleculare este ADN barcoding, în care indivizii unor specii sunt identificați utilizând secvențe mici de ADN mitocondrial sau ADN plastidial. Aseastă metodă are aplicații în domeniul foarte limitat al geneticii umane, cum ar fi utilizarea tot mai populară a testelor genetice pentru a determina paternitatea copilului, în ramura nou apărută a criminalisticii. (Hillis și colab., 1996)

Sistematica moleculară este o abordare esențial cladistă care presupune că o clasificare trebuie să corespundă descendenței filogenetice și că toți taxonii buni, trebuie să fie monofiletici. S-a afirmat anterior ca aceasta este o limitare în încercarea de a realiza arbori, care implică bifurcarea și reconectarea porțiunilor arborelui filogenetic.

Recenta descoperire a transferului de orizontal de gene între organisme oferă un impediment semnificativ în sistematica moleculară, indicând faptul că diferite gene în cadrul aceluiași organism pot avea filogenie diferite. (Hillis și colab., 1996)

Alte probleme precum cele de atragere, saturație și de eșantionare a taxonilor pe termen lung, demonstrează: că pot fi obținute rezultate evidente diferite prin aplicarea diferitelor modele la aceluiași set de date. (Hillis și colab., 1996)

UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmatic) este o abordare simplă în care arborele este întotdeauna înrădăcinat. Algoritmul presupune un ceas molecular constant pentru secvențele din arbore. Acest lucru este asociat cu o limitare în faptul că, dacă există rate de substituție inegale, rezultatul poate fi un arbore incorect. (Hillis și colab., 1996)

Capitolul 4. Materiale și metode

4.1 Materiale

Echipamentul necesar

1. echipament de protecție standard;

2. hartă 1:10000 sau 1:25000;

3. binoclu;

4. carnet de teren/reportofon;

5. transect marcat;

6. fileu entomologic;

7. ghid de teren pentru identificarea fluturilor de zi.(Szekely, 2008)

4.2 Metode

4.2.1 Recoltarea materialului biologic

Studiile de taxonomie moleculară pot demonstra, în cazul speciilor cu caractere morfologice ce par identice, diferențe și chiar pot rezolva multe probleme de taxonomie a unor specii greu de încadrat.(Hillis și colab., 1996) Obținerea unor date originale și de acuratețea necesită prelevarea unui număr mare de probe biologice de pe un terioriu,ținând cont de variabilitatea populațiilor unei specii, înregistrată în diferite zone ale arealului datorită complexului de factori ai acestora.(Hillis și colab., 1996)

Colectarea materialului s-a realizat cu ajutorul fileului entomologic din mătase, aripile sunt detașate de corp și păstrate în plicuri din hârtie de calc. După colectarea materialului biologic se întocmește fișa de observație pentru fiecare specie. Fișa de observație cuprinde coodonatele GPS, situl , locația, mediul de viață, tipul de habitat și detalii privind temperatura, umiditatea, viteza vântului. Alături de fișa de observație(Figura 15)sunt atașate fotografii ale individului recoltat.(Dinca și colab., 2011)

Figură 15. Model fișa de observație a fluturilor de zi(https://sites.google.com/site/monitorizareafluturilor/butterflies-of-romania)

Fotografiile trebuie să fie clare și să cuprindă caracterele fluturelui înainte de recoltare, de obicei aparatele de fotografiat sunt profesionale și cu o capacitate de rezoluție mare. (Dinca și colab., 2011)

Exemplareleau fost recoltate cu cu ajutorul unui fileu entomologic confecționat din mătase pentru a nu deteriora aripile flutrilor.(Figura 16)

Figura 16. Echipament de teren pentru studii de entomologie ( https://lymanmuseum.wordpress.com/2012/04/30/whats-in-your-field-bag/)

După ce sunt prinși, aripile fluturilor sunt păstrate în plicuri din hârtie de calc, iar restul corpului este păstrat în tuburi din plastic ce conțin etanol 96 sau alcool etilic absolut. Tuburile din plastic sunt numerotate pentru face mai eficientă păstarea și prelucrarea materialului. Păstrarea aripilor se realizează pentru a se efectua o analiză miscroscopică amănunțită, deoarece în general identificarea diferitelor specii de fluturi și clasificarea acestora se bazează pe forma și colorația acestora.(Dinca și colab., 2011)

Transportul tuburilor ce conțin materialul biologic se face în cutii frigorifice sau pungi frigorifice pentru a evita în orice fel deteriorarea materialului biologic.(Hillis și colab., 1996). Tuburile cu material biologic se păstrează într-un mediu cu temperaturi joase în frigider sau acoperite cu azot lichid.

În cazul probelor din care urmează să fie extras ADN, acestea nu se pun în azot lichid pentru a nu denatura materialul genetic. (Hillis și colab., 1996)

4.2.2 Analiza microscopică a materialului biologic

Materialul biologic prelevat de pe teren, reprezentat de părți ale lepidopterelor precum aripi și corp a fost analizat morfologic pentru o identificare cât mai corectă a speciilor. (Dinca și colab., 2011)

Analiza presupune examinarea aripilor și a armăturii genitale. Spre deosebire de analiza aripilor, care necesită doar fotografierea lor, analiza armăturii genitale este precedată de macerarea într-o soluție de hidroxid de potasiu de concentrație 10 %, curățarea și examinarea acestora la un stereomicroscop. După examinare, armătura genitală este păstrată în tuburi cu glicerină. (Dinca și colab., 2011)

Imaginile de microscopie sunt folosite pentru cazurile în care există silmilitudini la nivelul armăturii, iar cu ajutorul unui soft AxionVison sunt efectuate măsurători ale lungimi aripilor, anvergurii acestora sau distanțelor dintre două formațiuni de interes.(Dinca și colab., 2011).

Acest soft permite totodată inevstigarea relației dintre structură și tipul de material folosit. Soft-ul este util deoarece oferă o calitate bună a imaginii, există posibilitatea procesării imagini prin alegerea părții de analizat și de asemenea ajută la analiza și interpretarea imaginii. (Software, 2009).

4.2.3 Identificarea speciilor prin metode moleculare

Etape de lucru:

1. Recoltarea materialului biologic

2. Extracția ADN-ului

3. Amplificarea fragmentelor ADN

4. ADN Barcoding

5. Analiza datelor obținute

6. Înregistrarea datelor în băncile de gene.

(Hillis, Moritz and Mable, 1996)

4.2.4 Extracția ADN

Extracția ADN, cunoscută și ca izolarea ADN reprezintă eliberarea ADN-ului din celulă folosind atât metode fizice cât și chimice.(Doyle, 1991)

Prima izolare de ADN a fost realizată în anul 1869 de către Freidrich Miescher.(Doyle, 1991)

În acest moment extracția ADN reprezintă o procedură destul de comună în biologia moleculară. În prezent se folosesc kituri de extracție ADN pentru ca aceasta să se desfășoare în condiții optime, iar ADN-ul obținut să fie de puritate înaltă. (Doyle, 1991)

Extracția ADN cuprinde cinci etape, 3 dintre acestea sunt obligatorii, iar două sunt opționale. (Doyle, 1991)

În prima etapă sunt colectate celulele din care urmează a fi extras ADN-ul apoi urmează liza celulară, etapă în care membrana celulară este distrusă și este eliberată citoplasma. Liza celulară este realizată cu detergeți, de tipul SDS. După liza celulară, se adaugă soluție salină concentrată pentru a îndepărta lipidele și fragmentele de ARN. Pentru separarea ADN este necesară centrifugarea. Odată separat, ADN este supus purificării cu etanol concentrat sau isopropanol, la final peletul ADN este resuspendat în tamponul de extracție sau în apă ultra pură. (Doyle, 1991)

Protocoalele de extracție variază în funcție de tipul de probă din care trebuie extras ADN.Pentru studiile de taxonomie a fluturilor s-a folosit ADN mitocondrial și mai precis complexul citocrom oxidaza I ( CO I), deoarece ADNmt este util în separerea speciilor strâns înrudite sau chiar a populațiilor aceleași specii.

Condiția esențială pentu ca ADN extras să poată fi utilizat în reacția PCR,este ca rapotul absorbanțelor la 260 nm și 280 nm să nu fie mai mic de 1,8; dacă acesta este mai mic de 1,8 înseamnă ca proba de ADN extrasă este contaminată cu proteine. (Doyle, 1991)

Întegritatea ADN-ului trebuie verificată prin elecroforeză pe gel de agaroză, iar prin comparație cu un marker de masă moleculară se poate afla lungimea fragmentului de ADN izolat. (Doyle, 1991)

Un protocol de extracție fiber glass a fost utilizat pentru a extrage ADN dintr-un singur picior sau jumătate picior de fiecare specimen. Reacțiile PCR și secvențierea ADN-ului a fost efectuată conform procedurilor standard pentru Lepidoptera. (Dinca și colab., 2011) Metodele simple, precum extrația cu proteinază K este de obicei întâlnită în cazul probelor proaspete, dar oferă o calitate slabăa extracției. (Ivanova and Hebert, 2006) CCDB este o o metodă automatizată și prietenoasă de extragere a ADN-ului,de înaltă calitate. Performața kitului de reacție este ridicată și totodată este cu 75% mai ieftin decât unle kituri de pe piață. Kitul pezintă mod de lucru atât mod de lucru manual cât și automatizat pentru mai mult de 50000 de specii de vertebrate și nevertebrate.(Ivanova and Hebert, 2006) Reactivii și soluțiile utilizate sunt: – EDTA – ELMINază – Etanol 98% – Guanidin tiocianat – Apă ultra pură – Tween-20 – Proteinază K – Clorură de sodiu – SDS – Hidorxid de sodiu – Triton X-100 – Trizma bază – Trizma HCl

Modul de lucru manual pentru protocolul de extracție fibre galss cuprinde 15 pași ce trebuie urmați pentru ca extracția să aibe loc cu un randament mare.

1. Pe o placă amestecăm 5 ml de tampon de liză și 0,5 ml de Proiteinază K ce constituie amestecul de liză, se transferă 50 µldin amestecul de liză în fiecare din cele 96 de Eppendorfuri din placă

2. Adaugăm o cantitate mică de țesut în fiecare din cele 96 de Eppendorfuri bine sterilizate și se acoperă cu capacele. 3. Se incubează timp de minim 6 ore peste noapte pentru a avea loc digestia la 56 C. 4. Se centrifughează 15 secunde la 1500 G. 5. Se adaugă 100 µl de Binding Mix utilizând pipeta automată. Se agită energic 10- 15 secunde și se centrifughează scurt 20 de secunde la 1000 G. 6. Se transferă 150 µl din supernatant în placi GF. 7. Se centrifughează timp de 5 min la 5000 G pentru ca ADN-ul să se lege de membrana GF.

8. Primul pas de spălare: se adaugă 180 µyl de tampon și se centrifughează 5 minute la 5000 G. 9. Al doilea pas de spălare: se adaugă 750 µl de tampon și se centrifughează 5 minute la 5000 G. 10. Se recentrifughează la 6000 G. 11. Se incubează placa de reacție la 56 C timp de 30 de minute. 12. Se adaugă apă ultra pură și se incubează la temperatura camerei.

13. Se centrifughează la 5000 G 5 minute pentru a resuspenda ADN-ul.

14. Acoperim placa cu folie de aluminu și stocată temporar la 4 C până la -20 C pe termen lung. 15. Se utilizează 1-5 µl de ADN pentru reacția PCR.(Ivanova and Hebert, 2006)

4.2.5 Reacția PCR

Reracția PCR ( Polimer Chain Reaction ) este o tehnică utilizată în biologia moleculară pentru a amplifica o copie sau mai multe fragmente ADN. Tehnica a fost dezvoltată în 1983 de Kary Mullis un angajat al Cetus Corporation, care a câștigat în anul 1993 premniul Nobel pentru chimie, tehnica fiind una mai redusă ca și costuri și totodată o alternativă bună pentru obținerea de repliconi ai unor fragmente ADN.

Astfel tehnica PCR a început să fie des utilizată în biologia moleculară pentru studii taxonomice, investigații criminalistice sau studii biomedicale. (Bartlett and Stirling, 2003) PCR amplifică regiuni specifice ale fragmentelor ADN, cuprinse între 0,1 și 10 kpb, de asemena există tehnici care permit amplificarea fragmentelor mai mari de 40 kpb. (Kidd and Ruano, 1995) Componentele de bază și reactivii unei reacții PCR clasice sunt următoarele: 1. matrița ADN care conține regiunea țintă a ADN-ului pentru amplificare

2. ADN polimerază, o enzimă care polimerizează lanțurile ADN noi și care e rezistentă la căldură Taq polimeraza este cea mai utilizată ADN polimerază, deoarece este foarte probabil să rămână intactă în timpul procesului de denaturare a ADN-ului la temperatură ridicată.

3. doi primeri ADN care sunt complementari cu capetele 3' ale fiecăreia dintre catenele țintă, atât sens cât și anti-sens; ADN polimerază se poate lega numai la acestea pentru a alungi ADN dublu catenar. În lipsa primerilor nu există un situs de inițiere dublu-catenar la care polimeraza să se poată lega); primerii specifici care sunt complementari regiunii țintă a ADN-ului sunt selectați în prealabil și sunt adesea făcuți la comandă într-un laborator sau achiziționați de la furnizori autorizați.

Pentru racția PCR a în studiul lui Dinca s-a folosit fragment de 658 bp de la subunuitae acitocrom c oxidază I (COI) a fost vizată pentru amplificare utilizând primerii LepF (5`- ATTCAACCAATCATAAAGATATGG-3`) și LepR (5`-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3`).

În probele care nu au produs o PCR produsul cu primerii LepF și LepR a fost reamplificat cu primerii LepF și Enh_LepR (5`-CTCCWCCAGCAGGATCAAAA-3`) care amplifică un fragment de 609bp din COI. Dacă această abordare a eșuat, s-au folosit apoi două combinații de primeri care amplifică fragmente mai scurte de suprapunere: LepF + MH-MR1 (5`-CCTGTTCCAGCTCCATTTTC-3`) (amplicon 307bp) și MH-MF1 (5`-GCTTTCCCACGAATAAATAATA-3`) + LepR (amplificare de 407 bp). Secvențele au fost obținute utilizând un secvențiator ABI 3730xl urmând recomandările producătorului. (Dinca și colab., 2011)

4. dNTP ( deoxinucleotide trifosfat) acestea reprezintă elementelede construcție din care ADN polimeraza sintetizează o nouă porțiune ADN. 5. soluție tampon care asigură un mediu chimic adecvat pentru activitatea optimă și stabilitatea ADN polimerazei.

6. cationi bivalenți- în mod obișnuit se folosesc ioni de magneziu (Mg) sau mangan (Mn); Mg2 + este cel mai des întâlnit, dar Mn2 + poate fi utilizat pentru mutagenizarea ADN mediată de PCR, deoarece o concentrație mai mare de Mn2 + mărește rata de eroare în timpul sintezei ADN.

7. ionii monovalenți- de obicei se utilizează ionii de potasiu (K). (Kidd and Ruano, 1995).

Reacția se desfășoară în mod obișnuit într-un volum de 10-200 µl în tuburi mici de reacție (volume 0,2-0,5 ml) într-un termobloc. Aparatul PCR încălzește și răcește tuburile de reacție pentru a atinge temperaturile necesare în fiecare etapă a reacției. Aparatele moderne utilizează efectul Peltier, care permite atât încălzirea, cât și răcirea blocului care ține tuburile PCR pur și simplu prin inversarea curentului electric. (Cheng et al., 1994)

Tablourile de reacție cu pereți subțiri permit o conductivitate termică favorabilă pentru a permite o echilibrare termică rapidă.(Mullis și Faloona, 1987). Majoritatea aparatelor PCR au capace încălzite pentru a preveni condensarea în partea superioară a tubului de reacție, spre deosebire de aparatele mai vechi care nu au un capac încălzit și necesită și un strat de ulei pe partea superioară a amestecului de reacție sau o minge de ceară în interiorul tubului. (Mullis și Faloona, 1987). Reacția PCR constă într-o serie de 20-40 de schimbări de temperatură repetate, numite cicluri, fiecare ciclu constând în mod obișnuit din două sau trei trepte de temperatură. (Mullis și Faloona, 1987).

Ciclul de reacție este adesea precedat de o singură treaptă de temperatură la o temperatură foarte ridicată (> 90 ° C (194 ° F)), urmată de menținerea acesteia spre sfârșitul reacției pentru extinderea produsului final. (Cheng et al., 1994) Temperaturile utilizate și durata de timp în care sunt aplicate în fiecare ciclu depind de o varietate de parametri precum enzima folosită pentru sinteza ADN, concentrația ionilor bivalenți și concentrația dNTP în reacție și temperatura de anlelare (Tm) a primerilor. (Kidd and Ruano, 1995) Etapele comune majorității metodelor PCR sunt următoarele: 1. Inițializare: Această etapă este necesară numai pentru ADN polimerazele care necesită activarea cu ajutorul căldurii prin PCR pornirea la cald. Aceasta presupune încălzirea camerei de reacție la o temperatură de 94-96 ° C (201-205 ° F) sau 98 ° C (208 ° F), iar dacă se utilizează polimeraze extrem de termostabile, este menținută timp de 1-10 minute. (Kidd and Ruano, 1995)

2. Denaturare: Această etapă este primul eveniment obișnuit din ciclul PCR și constă în încălzirea camerei de reacție la 94-98 ° C (201-208 ° F) timp de 20-30 secunde. Acest lucru determină topirea sau denaturarea ADN a șablonului reprezentat de ADN dublu catenar prin ruperea legăturilor de hidrogen dintre bazele complementare, producând două molecule ADN monocatenare. (Kidd and Ruano, 1995)

3. Anelarea: În această etapă, temperatura de reacție este redusă la 50-65 ° C (122-149 ° F) timp de 20-40 secunde, permițând legarea primerilor la fiecare dintre șabloanele ADN monocatenare. Doi primeri diferiți sunt în mod obișnuit incluși în amestecul de reacție: unul pentru fiecare dintre cele două monocatene care conțin regiunea țintă. Primerii sunt ei înșiși secvențe monocatenare, dar sunt mult mai scurte decât lungimea regiunii țintă, complementare fiind numai secvențele foarte scurte de la capătul 3 'al fiecărei catene. (Kidd and Ruano, 1995)

Este esențial să se determine o temperatură adecvată pentru etapa de anelare, deoarece eficiența și specificitatea sunt puternic afectate de temperatura de anelare. Această temperatură trebuie să fie suficient de scăzută pentru a permite hibridizarea primerului cu catena, dar suficient de mare pentru ca hibridizarea să fie specifică.

Dacă temperatura este prea mică, acesta se poate lega imperfect. Dacă este prea mare, acesta poate să nu se leagă deloc. O temperatură tipică de anelare este de aproximativ 3-5 ° C sub Tm a primerilor utilizați. (Kidd and Ruano, 1995)

Legăturile stabile de hidrogen dintre bazele complementare se formează numai atunci când secvența de primer se potrivește cu secvența șablonului. În timpul acestei etape, polimeraza se leagă la complexul primer- matriță și începe formarea ADN-ului. 4. Elongarea: Temperatura din această etapă depinde de ADN polimeraza utilizată, temperatura optimă a activității polimerazei ADN termostabilă Taq (Thermus aquaticus) este aproximativ între 75-80 ° C (187-176 ° F), deși obișnuit se folosește temperatura de 72 ° C (162 ° F) cu această enzimă. (Rychlik, Spencer and Rhoads, 1991)

În această etapă, ADN polimeraza sintetizează o nouă catenă de ADN complementară la matrița ADNprin adăugarea de dNTP-uri libere din amestecul de reacție, în direcția 5'-la-3 ', condensarea grupării 5'-fosfat din dNTP-urile cu gruparea 3'-hidroxi la capătul catenei de ADN. Timpul necesar pentru elongare depinde atât de ADN polimeraza folosită, cât și de lungimea regiunii țintă a ADN-ului pentru amplificare. (Kidd and Ruano, 1995) Ca regulă generală, la temperatura lor optimă, cele mai multe ADN polimeraze polimerizează o mie de baze pe minut. În condiții optime la fiecare etapă de elongare, numărul de secvențe țintă ADN este dublat. (Kidd and Ruano, 1995)

Procesele de denaturare, anelare și alungire constituie un singur ciclu. Sunt necesare mai multe cicluri pentru a amplifica ținta ADN la milioane de exemplare. Formula folosită pentru calcularea numărului de copii ADN formate după un număr dat de cicluri este 2n, unde n este numărul de cicluri. Astfel, o reacție setată pentru 30 cicluri are ca rezultat 230 sau 1073741824, de copii ale regiunii țintă originare, de ADN dublu catenar. (Kidd and Ruano, 1995) 5. Elongație finală: Această etapă este opțională, dar este efectuată la o temperatură de 70-74 ° C (intervalul de temperatură necesar activității optime a majorității polimerazelor utilizate în PCR) timp de 5-15 minute după ultimul ciclu PCR pentru a se asigura că orice ADN monocatenar rămas este complet elongat.(Kidd and Ruano, 1995)

6. Etapa finală: Treapta finală răcește camera de reacție la 4-15 ° C (39-59 ° F) pentru o perioadă nedeterminată și poate fi utilizată pentru stocarea pe termen scurt a produselor PCR.

Tehnica PCR prezintă o serie de avantaje. Este destul de simplu de înțeles și de utilizat și produce rezultate rapide. Tehnica este foarte sensibilă, având potențialul de a produce milioane până la miliarde de exemplare ale unui produs specific pentru secvențiere, clonare și analiză. qRT-PCR are aceleași avantaje ca PCR, prezentând suplimentar avantajul cuantificării produsului sintetizat.(Kidd and Ruano, 1995)

Prin urmare, se folosește pentru a analiza modificările nivelurilor de exprimare a genelor din tumori, microorganisme sau alte stări de boală.

Tehnica PCR este un instrument de cercetare foarte puternic și practic. Secvențierea etiologiilor necunoscute ale multor boli este explicată prin PCR. Tehnica poate ajuta la identificarea secvenței unor virusuri necunoscute anterior legate de cele deja cunoscute și, astfel, ne oferă o mai bună înțelegere a bolii însăși. Dacă procedura va fi simplificată în continuare și vor fi dezvoltate sisteme sensibile de detectare non-radiometrică, PCR va ocupa un loc principal în laboratorul clinic în anii următori. (Kidd and Ruano, 1995)

4.2.6 ADN Barcoding

ADN barcoding este o metodă taxonomică care utilizează un marker genetic scurt în ADN-ul organismului pentru a-l identifica ca aparținând unei anumite specii. Această metodă diferă de filogenia moleculară prin faptul că scopul principal nu este de a determina modele de relație, ci de a identifica un eșantion necunoscut, în termenii unei clasificări preexistente. (Hebert și colab., 2003) Codurile de bare ADN sunt uneori utilizate pentru a identifica speciile necunoscute sau pentru a evalua dacă speciile ar trebui combinate sau separate, utilitatea ADN barcoding în aceste scopuri fiind încă în dezbatere . (Hebert și colab., 2003)

Cea mai frecvent utilizată regiune de coduri de bare ADN pentru eucariote este un segment de aproximativ 600 de perechi de baze ale genei mitocondrialepentru citocrom oxidaza I (COI sau COX1). Aceastadiferă în cazul fungilor și plantelor și de aceea se utilizează o parte a Spacerului Intern Transcripționat 2 (ITS2) dintre genele pentru ARNr. (Hebert și colab., 2003)

Printre aplicațiile metodei ADN barcoding se pot aminti identificarea frunzelor plantelor chiar și atunci când nu sunt disponibile florile sau fructele, identificarea polenului colectat de pe corpurile animalelor polenizatoare, identificarea larvelor insectelor (care pot avea mai puține caractere de identificare decât adulții și sunt adesea mai puțin cunoscute) analiza dietei unui animal pe baza conținutului de stomac sau a fecalelor și identificarea produselor în comerț (de exemplu, suplimente pe bază de plante, lemn sau piei și alte părți de animale).(Hebert și colab., 2003)

Alegerea locusului pentru ADN barcoding

Locusul dorit pentru ADN barcoding trebuie să fie standardizat (astfel încât să se poată dezvolta bazele de date mari ale secvențelor pentru acel locus), prezente în majoritatea taxonilor de interes și care pot fi secvențiate fără primeri PCR specifici, suficient de scurți să fie secvențializate cu ușurință prin intremediul tehnologiei actuale și suficient de mari să ofere o variație mare între specii. (Hebert și colab., 2003) Deși au fost sugerați mai mulți loci, comisiile au selectat un set comun de regiuni standardizate:

Pentru animale și multe alte eucariote, gena mitocondrială a COI;

Pentru plantegenele cromoplastice rbcL și matK.Acestea oferă o rezoluție slabă pentru plantele terestre și de aceea s-a făcut un apel pentru evaluarea regiunilor care ar putea completa rbcL și matK;

Pentru fungi, regiunea internă de transcriere a STI. (Hebert și colab., 2003)

ADN-ul motocondrial

ADN barcoding se bazează pe un concept relativ simplu. Toate celulele eucariote conțin mitocondrii, iar ADN-ul mitocondrial animal (ADNmt) are o rată de mutație relativ ridicată, având ca rezultat generarea diversității în cadrul populației și între populații, pe perioade relativ scurte de evoluție (mii de generații).

În mod obișnuit, la animale, un singur genom mitocondrial este transmis puilor de către fiecare femelă, iar mărimea genetică efectivă a populației este proporțională cu numărul de femele reproducătoare. Acest lucru contrastează cu genomul nuclear, care este de aproximativ 100 000 de ori mai mare, la care masculii și femelele contribuie cu câte doi genomi, mărimea efectivă fiind, proporțională cu dublul dimensiunii totale a populației. Această reducere a mărimii efective a populației conduce la o sortare mai rapidă a liniilor genelor mitocondriale în cadrul populației și între populații în timp, datorită variației fecundației în rândul indivizilor (principiul coalescenței). (Hebert și colab., 2003) Efectul combinat al ratelor mai mari de mutație și al sortării mai rapide a variațiilor duce, de obicei, la divergența secvențelor ADNmt între specii și la o variație relativ mică în cadrul speciilor. (Hebert și colab., 2003) A fost propusă o regiune de 658 bp (regiunea Folmer) a genei mitocondriale de la subunitate citocrom oxidaza I (COI sau COX1) cu un "cod de bare".(Hebert și colab., 2003) Bacteriile dăunătoare care induc simbioți ai incompatibilității citoplasmatice în care un individ poartă două sau mai multe secvențe pentru ADNmt, pot afecta tiparele de diversitate a ADN-ului mitocondrial în cadrul speciei, deși acestea nu conduc în mod necesar la eșecul metodei ADN barcoding. (Hebert și colab., 2003)

Ocazional transferul orizontal de gene sau alte fenomene evolutive de reticulare dintr-o linie, pot duce la rezultate înșelătoare (adică este posibil ca două specii diferite să împartă ADNmt). În particular, ADN-ul mtitocodrial pare să fie în mod special predispus la introgresia interspecifică, probabil datorită diferenței dintre sexe în alegerea partenerului și dispersare. În plus, unele specii pot purta linii divergente de ADNmt segregând în cadrul populațiilor, adesea datorită structurii geografice istorice, unde aceste linii divergente nu reflectă limitele speciilor. (Hebert și colab., 2003)

Începând cu iunie 2017, baza de date Barcode of Life Systems a inclus aproape 5.500.000 de secvențe de coduri de bare de la peste 265.000 de specii de animale, plante și ciuperci.(Hebert și colab., 2003)

Protocol ADN Barcoding

Prima sarcină a codului de bare ADN este asocierea secvențelor ADNmt cu numele de specii. Aceste secvențe, prelevate de indivizi corect identificați, alături de informațiileclasice de morfologie, sunt apoi încorporate în bibliotecă de referință –BOLD(Barcode of Life Data System). Campaniile cărora le-a fost încredințat scopul de a popula BOLD (Barcode of Life Data System) au analizat: inventare regionale la scară largă, folosind exemplare proaspăt capturate sau colecții ale muzeelor. (Kress și Erickson, 2012)

Campaniile alternative se concentrează pe furnizarea de nume taxonomice "exacte" pentru secvențe, de exemplu, Codul de bare Lepidoptera: Sphingidae. Acestă abordare nu reprezintă cu adevărat o dihotomie, toate au același scop și de multe ori sunt combinate. Metodele moleculare din acest capitol se concentrează asupra generării secvențelor pentru bibliotecile de gene, ele pot fi utilizate de către cei care folosesc biblioteca de gene ca o cheie de identificare pentru compararea secvențelor din biblioteca de gene pentru a identifica invivizi noi colectați de pe teren și apartenența acestorala un taxon. (Kress și Erickson,2012) Această viziune a codului de bare ADN necesită în continuare procesul prelungit al descrierii speciilor prin metode tradiționale și a creșterii bibliotecii de gene prin generarea de coduri de bare pentru speciile deja cunoscute.

O altă opțiune pentru codarea de bare ADN este de a implica acuratețea bibliotecii de referință prin adăugarea constantă de rezulate obținute . Prin combinarea codurilor de bare ADN, a caracterelor morfologice și ecologice s-au obținut coduri noi de bare care au îmbunătățit biblioteca de referință și taxonomia unor specii. Informațiile din bibliotecă sunt vitale pentru succesul codificăriicu bare De fapt, conexiunea secvențelor (transferuldigital al datelor și analiza facilă) cu alte date (imagini, colectare datele și taxonomia istorică) face ca aceste coduri de bare sa fie comunicatori valoroși ai biodiversității.(Kress și Erickson, 2012).

Rezultale ADN barcoding pentru studiul taxonomic al lepidopterelor au fost întroduse în banca de gene, GeneBank HQ003941 la HQ005268; FJ938179 la FJ938196 și EU667423 la EU667425. (Dinca și colab., 2011)

Materiale:

Colecția de specimene: 99,9% alcool etilic (alcooli comerciali). Se păstrează într-un recipient neinflamabil.

Țesut: ELIMINase® (Decon Labs Inc. ™), KimWipes (Kimberly-Clark Corporation), Forceps (Instrumente de științe fine), Microplăci (Eppendorf), Fascicule (ABgene).

Extractia ADN, tampon de liza:

1.0,5 M EDTA pH 8,0: 186,1 g EDTA (Fisher Scientifi c®), ~ 20,0 g NaOH (Fisher Scientifi c ®), realizat până la 1000 ml cu ddH2O. Se amestecă viguros pe agitatorulmagnetic cu încălzitor. sare disodică a EDTA nu va intra în soluție până ce pH din soluție nu este ajustat la ~ 8,0 prin adăugarea de NaOH. Urmează o scurtă clătire granulelor de NaOH cu ddH2O într-un vas separat înainte de a le dizolva.

2. Tris-HCI 1 M pH 8,0: 26,5 g bază Trizma® (Sigma®),44,4 g Trizma® HCI (Sigma®), realizată până la 500 ml cu ddH20.

3. Proteinază K 20 mg / ml: Se adaugă 5 ml de ddH2O într-un ambalaj de 100 mg

din proteinază K (Promega®). Se depozitează în alicote de 0,5 ml la -20 ° C.

4. Tris-HCI 0,1 M pH 6,4: 6,06 g bază Trizma® realizată până la 500 ml cu ddH2O. Corectați pH-ul cu HCI până la 6,4-6,5.

5. NaCI 1 M: 29,22 g NaCI (Fisher Scientifi c®) realizat până la 500 ml cu ddH20.

6. Tris-HCI 1 M pH 7,4: 9,7 g bază Trizma®, 66,1 g Trizma® HCI, realizat până la 500 ml cu ddH20.

7. Amestec de liză de insecte: 16,5 g de GuSCN (Sigma®), 12 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0, 6 ml de Tris-HCI 1 M pH 8,0, 1 ml Triton X-100 (Sigma®), 10 ml Tween-20 (Fluka®), realizată până la capăt volum de 200 ml cu ddH20.

8. Fascicule. (Kress și Erickson, 2012)

High-Toughput extractia ADN

1. Placă de filtru AcroPrep ™ 96 de 1 ml cu mediu de fibră de sticlă de 3,0 μm

peste 0,2 μm Membrană bio-inertă, carcasă naturală (PALL®).

2. Filtru de sigilare Axyseal ™ (Axygen Scientifi c®).

3. PP MASTERBLOCK®, 96-godeu, 2 ml (Greiner Bio-One®).

4. Tampon de legare: 354,6 g GuSCN, 20 ml EDTA 0,5 MpH 8,0, 50 ml Tris-HCI 0,1 M pH 6,4, 20 ml TritonX-100, realizat până la un volum fin de 500 ml cu ddH20.

Se amestecă viguros pe agitator magnetic cu încălzitor. Dacă se recristalizează

apare, pre-încălzită la 56 ° C pentru a se dizolva înainte de utilizare.

5. Tampon de spălare pentru proteine: 26 ml de tampon de legare, 70 ml de EtOH

96%, realizată până la 100 ml cu ddH2O. Stabil la temperatura camerei

timp de o săptămână, eliminați dacă apare o cristalizare.

6. Tampon de spălare: 300 ml EtOH 96%, 23,75 ml NaCI 1 M, 4,75 ml de Tris-HCI 1 M, pH 7,4, 0,475 ml, 0,5 M EDTA, pH8,0, realizat până la 475 ml cu ddH2O. Se amestecă bine, se depozitează la -20 ° C.

7. Microplacă.(Kress și Erickson, 2012)

Arhiva de specimene extractia ADN

1. DNeasy 96 Kit de sânge și țesut singur (Qiagen):Tampoanele AL, AW1, AW2 și AE sunt incluse în kit.

2. EtOH 96%.

3. Tuburi de microcentrifugă Fisherbrand Premium Flat 1.5 ml (Fisher Scientific).(Kress și Erickson, 2012)

Amplificare PCR

1. ELIMINase ®.

2. KimWipes.

3. D – (+) – trehaloză deshidratată (Sigma-Aldrich).

4. Tampon 10 x PCR furnizat cu enzima (Invitrogen).

5. 50 mM MgCI2 (Invitrogen).

6. 10 mM amestec dNTP (New England Biolabs).

7. 100 μm Grund lichid: Se dizolvă primerul deshidratat (IntegratTehnologii ADN) în ($ × 10) μl ultrapure ddH 2 O. $ este diferităpentru fiecare primer și este numărul măsurat în "nmol"care poate fi găsită pe tubul pe care este grundul deshidratatsosesc. A se păstra la -20 ° C.

8. Polimeraza Taq (Invitrogen).

9. Microplăci.

10. Fascicule.(Kress și Erickson, 2012)

High- Toughput verificare PCR

1. 2% Agarose E-gel® 96 gel (Invitrogen).

2. Mama E-Base ™ (Invitrogen).

Specimen unic verificare PCR

1. Tampon 50 X TAE: Se dizolvă 242 g Tris (hidroximetil) aminometanîn 500 ml ddH20, se adaugă 57,1 ml acid acetic glacialși 100 ml EDTA 0,5 M și se completează până la 1000 ml cu mai multddH20.

2. Agaroza ultrapure (Fisher Scientifi c).

3. Parazitii (Fisher Scientifi c).

4. 6 x Colorant de încărcare (Fermentas, Thermo Fisher Scientifi c).

5. Scară de ADN cu 100 bp (Invitrogen).

6. GelRed 10.000 × în apă (Biotium). (Kress și Erickson, 2012)

Ciclu de sevcențiere

1. ELIMINase ®.

2. KimWipes.

3. Microplacă.

4. Dye terminator mix v3.1 (Applied Biosystems).

5. 5 x tampon de secvență ABI (Applied Biosystems).

6. D – (+) – trehaloză deshidratată.

7. Primer. (Kress și Erickson, 2012)

Purificarea secvențierii

1. Sephadex ® G-50 (Sigma-Aldrich).

2. MultiScreen ® Column Loader (Millipore).

3. Acroprep™ 96 Filter plate with 0.45- μ m GHP membrane

(PALL).

4. MicroAmp ® Optical 96-well Reaction Plate (Applied

BioSystems ® , Cat. No. N801-0560).

5. 0.1 mM EDTA pH 8.0 (Fisher Scientifi c).

6. Septa (Applied Biosystems). (Kress și Erickson, 2012)

BOLD ( Barcode of Life Data System)

1. BOLD ( Barcode of Life Data System) este baza de date recomandată pentru a gestiona codurile de bare ADN.

2. Pentru a crea un cont de utilizator pe BOLD,se accesează pagina principală http://www.boldsystems.org.

3. În MANAGEMENT & ANALYSISalegi Solicitați o cont nou de utilizator.

4. Completați detaliile personale necesare, inventați și reconfigurați parola și Submit Request. Veți primi un e-mail cu numele de utilizator și parola.

5. Pentru a crea un nou proiect, conectați-vă și sub Opțiuni de proiect în coloana din stânga faceți clic pe Creare proiect nou.

6. Titlul proiectului ar trebui să aibă un rol semnificativ în facilitarea rechemării mai târziu (de exemplu, "Moliile Peninsulei Olimpice").

7. Codul proiectului este o scurtă formă a titlului (3-5 litere, de exemplu, "LOP") și formează baza ID-urilor de proces (a se vedea nota 2).

8. Selectați subunitatea COI-5P-Cytochrome Oxidase 1 5 ¢ Regiunea ca Marcator primar.

9. În partea de jos a formularului puteți asocia utilizatorii proiectului și selectați tipul de acces pe care îl vor avea.

10. Salvați noul proiect .

11. Fiecare proiect poate deține inițial 999 de înregistrări. Dacă veți prezenta mai mult de 999 exemplare, repetați pașii 1-5 de mai sus creați proiecte suplimentare.

(Kress și Erickson, 2012)

Capitolul 5. Soft-uri de prelucrare a datelor

5.1 Sequencher 4.5

Softul Sequencher 4.5 este utilizat pentru analiza datelor ce poate efectua operații precum asamblare, aliniere, secvențiere ARN, construcție de arbori filogenetici, etc.

În studiul său de ADN Barcoding folosește Sequencher 4.5 pentru a edita și asambla datele obținute în urma secvențierii.(https://www.genecodes.com/analyses/assembly )

Sequencher și-a construit reputația pe algoritmii de asamblare a secvențelor de ADN prioritare, care au stabilit standardul în laboratoarele de cercetare din întreaga lume de peste 25 de ani. Niciun alt program nu oferă un set atât de cuprinzător de funcții, care să se potrivească aproape oricăror proiecte și să obțină rapid rezultate.

Sequencher are mai mulți algoritmi diferiți de asamblare, precum și diferite moduri de asamblare, oferind flexibilitatea de a lucra cu oricare din datele secvenței de acest gen.

Trei algoritmi de asamblare diferite pentru datele Sanger, oferă control complet asupra modului în care sunt asamblate datele ADN. Primul algoritm este reglat pentru date în modul în care este scos din secvențiere, al doilea algoritm permite controlul și numărul de interogări consecutive ce permit asamblarea datelor și un al treilea care se ocupă de decalaje mari (orice peste 10 baze ) cu ușurință.(https://www.genecodes.com/analyses/assembly )

Parametrii asamblării pot fi ajustați pentru a obține cea mai bună potrivire posibilă cu datele obținute. Este ușor de reglat rapid procentajul de potrivire, suprapunerea minimă și personalizarea plasării în spațiului cu toți cei trei algoritmi de asamblare. Setările personalizate sunt salvate automat pentru următorul proiect. Pentru partajarea setărilor cu colegii sau reutilizarea pentru diferite proiecte se pot crea șabloane de proiect pentru a economisi timp.

De cele mai multe ori veți folosi asamblarea automată, selectați secvențele, faceți clic pe buton și Sequencher face restul. Pentru mai multe secvențe mai greu de asamblat sau unde doriți un control absolut, asamblați interactiv vă va oferi informații detaliate despre fiecare aspect al adunărilor potențiale candidate. Dacă comparați secvențe cu o secvență de referință, asamblarea la referință este un algoritm ce utilizează puterea secvenței Sequencher's Sequence Reference.(https://www.genecodes.com/analyses/assembly )

Gene Codes recunoaște că laboratoarele funcționează în moduri diferite, unele laboratoare se concentrează pe o singură genă, cromozom sau organism. Alte laboratoare pot lucra la mai multe proiecte în același timp sau la mai multe eșantioane de organisme înrudite, în vederea comparării rezultatelor. Modul de asamblare în funcție de nume permite cercetătorilor un control fără precedent și o capacitate de transfer la asamblarea cantităților mari de date de probă din diferite surse simultan. (https://www.genecodes.com/analyses/assembly)

5.2 Codoncode Aligner 3.0

CodonCode Aligner este un program de asamblare a secvențelor, de editare a codonilor și de detectare a mutațiilor, disponibil pentru Windows și Mac OS X. Aligner este compatibil cu Phred-Phrap și sprijină pe deplin scorurile de calitate a secvențelor, oferind în același timp o interfață de utilizare familiară și ușor de înțeles. CodonCode Aligner este un program ușor de utilizat pentru asamblarea secvențelor, editarea contigilor și detectarea mutațiilor. Caracteristicile includ:

Ansamblu de secvențe multiple și algoritmi de aliniere a secvențelor

Editarea manuală și automată a secvențelor

Secvențe de referință și tabele diferențiale

Detectarea sensibilă a mutației

Metode avansate pentru analiza indel heterozygos

Instrumente de automatizare: asamblați după nume și scripting(http://www.codoncode.com/index.htm)

5.3 MEGA 4

MEGA este un instrument integrat pentru efectuarea alinierii automate și a secvențelor manuale, deduce arborii filogenetici, baze de date miniere bazate pe web, ratele de estimare a evoluției moleculare și testarea ipotezelor evolutive. (https://www.megasoftware.net/mega4/overview.html)

Versiunile MEGA lansate recent (3 și 4) extind funcțiile MEGA prin adăugarea de caracteristici de aliniere a datelor de secvență și de asamblare, împreună cu alte progrese. În versiunea 3, achiziția de secvențe de date este integrată efectiv cu analizele evolutive astfel analizea se face mult mai ușor decât într-un mediu de calcul integrat. Versiunea 4 include o facilitate unică de generare a legendelor, scrisă în figura legendă, pentru a furniza descrieri în limba dorită ale modelelor și metodelor utilizate în analize. Această facilitate urmărește să promoveze o mai bună înțelegere a ipotezelor care stau la baza analizelor și a rezultatelor generate. O altă caracteristică nouă este metoda MCL (Maximum Composite Likelihood) pentru estimarea distanțelor evolutive între toate perechile de secvențe simultan,cu și fără încorporarea variației ratei între situsuri și a eterogenităților modelului de substituție în rândul familiilor. (https://www.megasoftware.net/mega4/overview.html)

Rezultate și discuții

Ecologia diversificată face ca fluturii de zi să fie buni indicatori ai stării mediului: alături de specii ubicviste avantajate de impactul antropic asupra vegetației cum sunt binecunoscutele albilițe-de-rapiță, amiralul, sau urzicarul, există specii mai pretențioase: unele sunt dependente de anumite habitate amenințate care au fost identificate în Rezervația Poiana Narciselor de la Nucșoara- fluturele-bălțat-de-mlaștină, Euphydrias aurinia și albăstrița-de-mlaștină, Maculinea teleius, altele au nevoie de habitate naturale întinse (aici intră numeroase specii de pădure, precum Apatura iris și A. ilia, amirali-albi Limenitis populi și L. camilla, Lopinga achine etc.), printre fluturii de zi se numără și specii limitate la pajiști montane sau alpine (majoritatea fluturilor-harap, genul Erebia) sau altele care prosperă în fânețele intreținute prin cosirea anuală a ierbii (aici intră unele dintre cele mai abundente specii din Țara Hațegului, cum sunt fluturele-tablă-de-șah, Melanargia galathea, fluturele-ochiu-boului Maniola jurtina și fluturele-brun-de-pajiște Aphantopus hyperanthus).

Țara Hațegului este o zonă deosebit de reprezentativă pentru biodiversitatea României. Situată la jonctiunea dintre două regiuni biogeografice europene (alpină și continentală, care împreună ocupă 76% din suprafata României), zona este caracterizată prin bogăția de specii și habitate păstrate într-o stare bună de conservare.

Fluturii de zi reprezintă un bun exemplu pentru bogăția în specii a zonei. În Țara Hategului au fost identificate 75% dintre speciile semnalate în România, adică aproximativ 150 din cele 202 de specii din România. Practic, nu lipsesc decât unele specii rare al căror areal se limitează în țara noastră la zonele stepice din sud-estul țării, la zona alpină de pe crestele celor mai înalți munți, sau la habitate cu totul speciale, cum ar fi turbăriile.

Din cele 150 de specii identificate și ierarhizate, 119 specii sunt fluturi de zi.

În urma inventarierii s-a obținut o estimare a numărului de specii din acestă arie protejată care servește la evaluarea dinamicii sezoniere și multianuale a mărimii populațiilor, precum și la efectuarea de comparații între situri, tipuri de habitate.

Valoarea de conservare conform Listei Roșii și Directivei Habitate oferă argumente suplimentare pentru aprecierea valorii de conservare a diverselor situri sau habitate:

Statutul de conservare a speciilor de fluturilor din Țara Hațegului este preluat din Lista Roșie:

EX ( Extinct) Taxon dispărut;

CR ( Critical endangered) Taxon periclitat critic;

CN ( Endangered) Taxon periclitat;

VU ( Vulnerable) Taxon vulnerabil;

NT ( Near thretened) Taxon potențial amenințat;

LC ( Least concern) Taxon fără interes pentru Lista Roșie;

DD (Data deficient) Taxon pentru care informația este deficitară.

Tabel 1. Lista speciilor de fluturi de zi semanlați din Țara Hațegului

Speciile de lepidoptere identificate, aparțin familiilor Hesperidae, Lycaenidae, Nymphalidae, Papilionidae și Pieridae

Familia Nymphalidae predomină prin numărul de sepcii cu un procent de 45% fiind apoi precedată de Lycaenidae 29%, Pieridae 12% , Hesperidae 11% și Papilionidae 3%.

(Figura 17)

Figura 17. Ponderea familiilor de lepidoptere din Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului.

Din totalul speciilor identificate, aproximativ 75% sunt autohtone, 7 specii sunt protejate, regăsindu-se pe Lista Roșie (Heteropterus morpheus, Maculinea teleius, Euphydryas aurinia, Pyronia tithonus, Zerynthia polyxena, Leptidea morsei, Pieris mannii ) și o specie a cărui statut nu a fost încă determinat (Melitaea didyma).

Tabel 2. Inventarul speciilor după statutul de conservare

Din cele 119 (Tabel 2) specii predomină speciile care nu reprezintă un interes pentru Lista Roșie, 69 de specii, 1 specie a cărui taxon este periclitat critic, 9 specii cu taxon periclitat, 20 de specii a căror taxon este vulnerabil, 1 specie cu taxon a cărui informație este deficitară și 1 specie a cărei statut este necunoscut. (Figura 18)

Figura 18. Statutul de conservare a speciilor de lepidoptere din Geoparcul Dinozaurilor Țata Hațegului

În momentul începerii studiului unul dintre obiective a fost realizarea unui inventar al speciilor de fluturi din Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului cu scopul evaluării biodiversității din această zonă, iar în urma informațiilor adunate de pe teren s-a ajuns la un inventar de 119 specii de fluturi de zi, iar ulterior s-au mai adăugat specii până la 145, al căror statut este încă în cercetare.

Toate acestea au dus în final la elaborarea unui soft de identificare a fluturilor din Țara Hațegului, care din lipsa fondurilor nu a ajuns să fie utilizat, rămânând la stadiul de testare în varianta alfa. (Figura 19)

Figura 19. Soft de identificare a fluturilor de zi din Țara Hațegului ( original )

Odată cu perfecționarea metodelor biochimice și cu progresul realizat de biologia moleculară, identificarea pe baza caracterelor morfologice clasice a început să fie utilizată doar ca parte a identificării rapide utilizată în teren, folosind determinatoare și chei taxonomice sau soft-uri pentru identificarea diferitelor specii de fluturi. Însă de multe ori identificarea nu este sigură și necesită o analiză moleculară a ADN-ului.

De cele mai multe ori datorită costurilor reactivilor și materialelor necesare metodelor moleculare această parte este trecută cu vederea. Astfel am ajuns să cerecetez mai mult metodele ce stau la baza taxonomiei moleculare pentru identificarea problemelor filogenetice ale Lepidopterelor. În anul 2011 Vlad Dincă a aplicat metode moleculare pentru rezolvarea problemelor taxonomice ale fluturilor din România, majoritatea întâlnindu-se și pe teritoriul Geoparcului Dinozaurilor Țara Hațegului.

Identificările bazate pe secvențierea fargmentelor ADN au potențialul de a rezolva această problemă. Cu toate că analiza ADN mitocondrial (mtDNA) a fost utilizată în studii moleculare pe animale de mai bine de trei decenii, doar recent a fost aplicată pe o regiune genetică scurtată a genei mtDNA (50 segmente de subunitate mitocondrială citocrom oxidazei I – COI) a fost propus ca un punct de plecare pentru identificarea celor mai multe specii de animale. (Dincă și colab., 2011)

Studiul lui Dincă despre fluturii din România a arătat că ADN Barcoding furnizează o anumită identificare (Figura 20) pentru 90% din speciile din această regiune. Restul de 10% reprezintă cazuri de parafilie, polifilie sau coduri de bare partajate între perechi de specii strâns legate. Această rată de succes se numără printre cele mai mari raportate pentru fluturi, mai ales că, spre deosebire de alte studii, aceasta nu include cazuri de parafilie. Rezultatele obținute pot fi considerate o estimare fiabilă pentru Europa temperată datorită unei eșantionări condensate și a unor comparații detaliate bazate pe morfologie. Un număr mic de specii din studiu (6,7%) au secvențe de coduri de bare care au prezentat parafilie sau polifilie. (Dincă și colab., 2011)

Figura 20. Rezulatele statistice ale ADN barcoding a) performanța bazată pe distanțele gentice b) performantele bazate pe culsterle taxonilor (Dinca și colab., 2011)

Deoarece aceste modele de variație a secvenței pot fi produse de mai multe tipuri de specii sau de alte procese cum ar fi introgresia, ele nu sunt rare în natură. În plus, analiza detaliată a acestor cazuri poate oferi o mai bună înțelegere a istoricului evolutiv al speciilor implicate.

În cazul Lepidoptera au fost raportate cazuri de ADNmt parazit cauzate de introgresie, dar ele pot reflecta și sortarea incompletă a liniei în evenimentele recente de specie (toate cazurile întâlnite ce implică perechi de specii divergente recent). Este de subliniat că acele cazuri de parafilie și polifilie nu împiedică identificarea speciilor dacă nu împărtășesc haplotipurile. De exemplu, cazuri de parafilie la fluturi din Asia Centrală au fost tratate ca succese de identificare, deoarece speciile implicate nu au fost niciodată găsite ca împărțind haplotipurile. Același model a fost observat în studiu – toate cele șase cazuri (patru parafilie, două polifilie) au prezentat ramuri foarte scurte, reflectând nivele scăzute ale distanțelor minime interspecifice (între 0,15% și 0,58%). Pe baza datelor actuale, toate haplotipurile sunt caracteristice doar la nivel de specie, astfel încât indivizii pot fi atribuiți taxonului corect. (Dincă și colab., 2011)

Codificarea barelor ADN se comportă bine în ceea ce privește identificarea celor mai multe specii de fluturi din România (Figura 21). Această rezoluție se extinde la mai multe specii care, în afară de codificarea de bare ADN, pot fi adesea identificate în mod fiabil numai prin examenul genital (Figura 22),de exemplu, Melitaea athalia, Melitaea aurelia și Melitaea britomartis sau Leptidea sinapisși Leptidea reali. (Figura 23)

Figura 21. Codul de bare ADN poate distinge Leptidea sinapis și L. reali, identificate numai pe baza morfometriei genitaliilor. Planul de scatter bivariat folosind lungimea falusului (PL) și lungimea sacului (SL) ca personaje discriminative, lățimea vinculumul (Dincă și colab., 2011)

Figura 22. Vedere laterală a genitaliilor a) Leptidea sinapis și b) L. reali (Dincă și colab., 2011)

Figura 23. Morfologia aripilor la Leptidea sinapis și L. reali (Dincă și colab., 2011)

Codurile de bare ADN disting mai mulți taxoni foarte asemănători, adesea imposibil de identificat pe baza morfologiei adultului, chiar și cu examenul genitaliilor. Astfel de cazuri includ Aricia agestis și Aricia artaxerxes (sunt necesare date despre localitatea de colectare, dar nu întotdeauna suficiente) sau Colias hyale și Colias alfacariensis. (Dincă și colab.,2011)

Membrii a trei perechi de specii au arătat cazuri de partajare a codurilor de bare; unul dintre aceste cazuri implică o pereche de specii (H. semele – H. Volgensis) cu statut taxonomic neclar, H. volgensis este considerat o specie bună, studiile detaliate ale armăturii genitale au dat rezultate neconcludente, iar celelalte două cazuri (Pieris napi-Pieris bryoniae, Colias crocea-Colias erate) implică perechi de specii în care numai specimene tipice pot fi distinse eficient din punct de vedere morfologic. (Dincă și colab., 2011)

Patru perechi de specii strâns legate prezintă parafilii și numai două dintre aceste perechi pot fi separate în mod eficient prin examinarea modelului aripilor (Apatura ilia-Apatura metis și Coenonympha tullia-Coenonympha rhodopensis), iar alte perechi necesită examinarea organelor genitale (Hipparchia fagi-H. Syriaca, Carcharodus flocciferus și Carcharodus orientalis) (Figura 24).

Figura 24. Carcharodus flocciferus parafiletic C. orientalis. identificările pe baza rezultatelor combinate ale organelor genitale. (a) Scatterul grafic al warp relativ 1 și warp relativ 2.Imaginea din stânga sus ilustrează reperele (cercurile deschise) și semireperele)folosit pentru a descrie forma de cutie. (b) Arborele codurilor de bare COI dintre Carcharodus orientalis și C. flocciferus cu valorile de bootstrap mai mari de 50% sunt indicate. (Dincă și colab., 2011)

Astfel au fost analizate amănunțit cazurile ale taxonilor cu morfologie externă și internă foarte asemănătoare pentru a testa relația dintre codurile de bare ADN și identificările bazate pe morfologie. De exemplu, în cazul C. flocciferus (Figura 25) și C. orientalis (Figura 26), morfometria liniară și geometrică a organelor genitale masculine au fost necesare pentru testarea succesului de identificare a codului de bare ADN. (Dincă și colab., 2011)

Figura 25. Morfologia externă la Carcharodus flocciferus (http://jasius.hu/lepidopterology/carflo.html)

Figura 26. Morfologia externă la Carcharodus orientalis (http://jasius.hu/lepidopterology/carflo.html)

Perechea de specii Polyommatus bellargus-Polyommatus coridon este unul dintre cele două cazuri de poliflie prezente în setul de date. Proba bazală de la P. bellargus poate reprezenta haplotipul ancestral care a devenit mai rar după apariția de introgresiei genetice. Cea de-a doua pereche de specii implicate în polifilie este Erebia ligea-Erebia euryale, care prezintă mai multe clustere pentru fiecare specie. Modelul complex care rezultă sugerează fie o sortare incompletă a liniei, fie o introgresie între cele două specii. (Dincă și colab., 2011)

Acest studiu a arătat ca există și cazuri de linii divergente în aproximativ 2% din cazuri.Toate cazurile de divergență necesită investigații amănunțite la nivel de morfologie și marcare nucleară. Astfel de analize sunt obligatorii, deoarece secvențele divergente ar putea corespunde unor linii complet interferabile ale aceleiași specii care reflectă polimorfisme ancestrale sau diversitate dobândită prin introgresiune, bazate numai pe datele ADN mitocondiral pentru a defini speciile au fost dovedite prin utilizarea markerilor amplificați de lungime a fragmentelor de polimorfism în cazul speciilor din genul Maculinea, unele dintre cele mai rare, o semnalare fiind în aria protejată Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului.

Examinarea preliminară la nivelul aripilor (Figura 27) și genitaliilor nu a evidențiat un caz de divergență. Pentru acest gen divergența are atât importanță biologică cât și geografică, în România se regăsec câteva exemplare în Transilavina și nordul Moldovei fiind situate la 200 km ca distanță, astfel divergența obținută în urma ADN barcoding este de aropximativ 0,46%. (Figura 28) (Dinca și colab., 2011).

Figura 27. Morfologia externă de la Maculinea nausithous (http://pronatura-ms.blogspot.com/2011/01/maculinea-teleius.htm)

Figura 28. Specii din genul Maculinea pe cale de dispariție ce prezintă divergență; a) distribuția în România b) arborele filogentic în urma rezulatelor ADN barcoging (Dincă și colab., 2011)

Concluzii

Geoparcul Dinozaurilor Țara Hațegului este o arie protejată din România unde se întâlnesc 75% din fluturii autohtoni.

Speciile de lepidoptere identificate, aparțin familiilor Hesperidae, Lycaenidae, Nymphalidae, Papilionidae și Pieridae. Familia Nymphalidae predomină prin numărul de specii cu un procent de 45% fiind apoi precedată de Lycaenidae 29%, Pieridae 12% , Hesperidae 11% și Papilionidae 3%. Statutul de conservare a celor 119 de specii identificate este următorul: specii nu reprezintă un interes pentru Lista Roșie 69 de specii, 1 specie a cărui taxon este periclitat critic, 9 specii cu taxon periclitat, 20 de specii a căror taxon este vulnerabil, o specie cu taxon a cărui informație este deficitară și o specie a cărei statut este necunoscut. Lista Roșie cupinde specii precum Heteropterus morpheus, Maculinea teleius, Euphydryas aurinia, Pyronia tithonus, Zerynthia polyxena, Leptidea morsei, Pieris mannii.

În identificarea taxonomică a acestora se folosesc metode taxonomice clasice bazate pe caracterele morfologice ale fluturilor precum forma aripilor, nervațiunea aripilor, culoarea aripilor sau armătura genitală, dar odată cu avântul metodelor moleculare a apărut taxonomia moleculară ce ajută la rezolvarea problemelor taxomonice pe care analiza caracterelor morfologice nu le poate desluși. Cea mai utilizată metodă folosită pentru rezolvarea problemelor taxonomice este ADN Barcoding care folosește ADNmt din complexul citocrom oxidazei I, prescurtat COI. ADN Barcoding presupene extracția ADN din picior de fluture, reacție PCR, secvențiere și analiza datelor cu softuri de specialitate Sequencher 4.5, CodonCode Aligne sau MEGA, ce aliniază secvențele de nucleotide și construiesc arbori filogenetici. Pe măsură ce ADN barcoding se bazează pe un fragment genetic unic pentru a identifica speciile, am anlizat și eficacitatea celor două abordări utilizate în mod obișnuit pentru identificarea fluturilor: morfologia aripilor și armăturii genitale.

Acest studiu a elaborat o bază de date cuprinzătoare de referință pentru bare de ADN pentru fluturii din România. Ca rezultat, orice tip de fluture din această țară poate fi identificat prin codificare cu ADN a unei specii sau, în puține cazuri, unei perechi de specii, indiferent de stadiul de viață sau de calitatea specimenelor și fără a necesita cunoștințe taxonomice. Subliniem importanța unui cadru taxonomic solid pentru biblioteca de coduri de bare ADN și avantajele unei strategii de codificare a codului de bare ADN orientată spre regiune, care accelerează aplicabilitatea metodei ca fiind una de identificare sigură.

Anexe

Anexa 1. Lista speciilor de plante existente în cadrul Geoparcul Dinozaurilor „Țara Hațegului”care se regăsesc pe Lista Roșie a Plantelor vasculare

Anexa 2. Clasele de habitate din GDTH

Anexa 3 Specii din fauna GDTH de interes conservativ

Bibliografie

Bartlett, J. M. S., & Stirling, D. (2003). A short history of the polymerase chain reaction. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). https://doi.org/10.1385/1-59259-384-4:3

Brundin, L. (1972) ‘Evolution, Causal Biology, and Classification’, Zoologica Scripta. doi: 10.1111/j.1463-6409.1972.tb00670.x.

Cheng, S., Fockler, C., Barnes, W. M., & Higuchi, R. (1994). Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

Dinca, V., Zakharov, E. V., Hebert, P. D. N., & Vila, R. (2011). Complete DNA barcode reference library for a country’s butterfly fauna reveals high performance for temperate Europe. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. https://doi.org/10.1098/rspb.2010.1089

Doyle, J. J. (1991). Molecular techniques in taxonomy. NATO ASI Molecular Systematics. https://doi.org/10.1007/978-3-642-83962-7

Grigorescu D., Csiki-Sava Z., Melinte-Dobrinescu M. C. (2014). Geodiversitatea Tarii Hategului, Editura Universității din Bicurești, Buburești, pag 41-73.

Hebert, P. D. N., Cywinska, A., Ball, S. L., & deWaard, J. R. (2003). Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 270(1512), 313-321. https://doi.org/10.1098/rspb.2002.2218

Hillis, D. M., Moritz, C., & Mable, B. K. (1996). Molecular Systematics. Molecular Systematics. https://doi.org/10.1006/mpev.2000.0880

Ivanova, B. N., & Hebert, P. (2006). CCDB.

John, O. P. and Srivastava, S. (1999) ‘The Big Five trait taxonomy: History, measurement, and theoretical perspectives’, Handbook of personality: Theory and research. doi: citeulike-article-id:3488537.â

Kidd, K. K., & Ruano, G. (1995). Optimizing PCR. Pcr.

Kress, W. J., & Erickson, D. L. (2012). DNA Barcodes. Methods ans Protocols. Methods in Molecular Biology (Vol. 858). https://doi.org/10.1007/978-1-61779-591-6

Mullis, K. B., & Faloona, F. A. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed chain reaction. Methods in Enzymology Science, 155(4839), 335–350.

Niculescu( Eugen V.), Konig (Frederic), 1970, Lepidoptera- partea generală. Fauna R.S.R., Insecta XI, 10, Editura Academiei R.S.R., București, pag 7-45.

Page, R. D. M. and Holmes, E. C. (1998) ‘Inferring Molecular Phylogeny’, in Molecular Evolution: A Phylogenetic Approach.

Rychlik, W., Spencer, W. J., & Rhoads, R. E. (1991). Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Research. https://doi.org/10.1093/nar/19.3.698-a

Szekely Levente 2008,The butterflies of Romania – Fluturii de zi din Romania, Editura Brastar- Print, Brasov

Software, A. I. (2009). Takeoff Guide. Change, (June). Retrieved from http://www.zeiss.com/C12567BE00472A5C/EmbedTitelIntern/AxioVisionTakeOffGuide/$File/AxioVision472_TakeoffGuide_e.pdf

Stevens, P. F., Gardens, M. B. and Louis, S. (2002) ‘History of Taxonomy’, Biology and Philosophy. doi: 10.1038/npg.els.0003093.

Teodorescu Irina, Vlad Antonie Iuliana, 2008 – Entomologie, Editura Geea, București, pag 233-244.

http://www.bioone.org/doi/abs/10.2108/zsj.29.463

https://www.twentsewelle.nl/content/1367/nl/de-vlinderfabriek

http://www.hateggeoparc.ro/tara-hategului/acces/

http://www.informatii-romania.ro/listing/barajul-gura-apelor/

http://cronodon.com/BioTech/Insect_locomotion.html

http://images.slideplayer.com/32/9835194/slides/slide_6.jpg

http://slideplayer.com/slide/9835194/

http://www.hateggeoparc.ro/geosituri/

http://wiremea.com/diagram-of-types-of-insects.html

https://infovisual.info/en/biology-animal/butterfly

https://zookeys.pensoft.net/article/20179/

https://www.nature.com/articles/s41598-017-16553-5/figures/1

https://www.genecodes.com/analyses/assembly

http://www.codoncode.com/index.htm

https://www.megasoftware.net/mega4/overview.html

http://bater.ru/park-babochek/prodazha-babochek/vidy-babochek-i-tseny/

https://en.wikipedia.org/wiki/Pterophoridae

http://www.anpm.ro/documents/21661/2534773/PN+GDTH_Planul+de+management_Proiect+pentru++++aprobare_2015.pdf/d03e0940-fe7a-4e24-813a-57b553ce4762

https://sites.google.com/site/monitorizareafluturilor/butterflies-of-romania

What’s in your field bag?

http://pronatura-ms.blogspot.com/2011/01/maculinea-teleius.html

http://jasius.hu/lepidopterology/carflo.html