CONTRIBUTII LA STUDIUL PREPARARII UNOR COMPLECSI DE INCLUZIUNE CAPSAICINA-CICLODEXTRINA SI INCLUDEREA IN FORME FARMACEUTICE SEMISOLIDE [308551]

CUPRINS

CUPRINS 3

ABREVIERI 6

INTRODUCERE 8

PARTEA GENERALĂ 10

CAPITOLUL 1. STUDIUL LITERATURII DE SPECIALITATE 10

1.1. PREPARATE FARMACEUTICE SEMISOLIDE 10

1.1.1. Clasificarea unguentelor 14

1.1.2. Tincturi 23

1.1.3. Tegumentul – cale de administrare a preparatelor farmaceutice semisolide 25

1.2. CAPSAICINA 26

1.2.1. Capsaicina-principiul activ din ardei. Descriere: 28

1.2.2. Capsaicina, analogi ai capsaicinei. [anonimizat], solubilitate 29

1.2.3. Toxicitatea și proprietăți farmacologice 31

1.2.4. Mecanismul de acțiune al capsaicinei 32

1.2.5. Domeniie de aplicabilitate 34

1.3. CICLODEXTRINE 38

1.3.1. Generalități 38

CONTRIBUȚII ORIGINALE 49

CAPITOLUL 2. STUDII PRELIMINARII ALE SPECIEI CAPSICUM ANNUUM 49

2.1 GENERALITĂȚI 49

2.1.1. Materiale și metode 50

2.1.2. Rezultate si discuții 53

2.2. DETERMINAREA POLIFENOLILOR DIN EXTRACTELE SPECIEI CAPSICUM ANNUUM ȘI EVALUAREA INVITRO A ACTIVITĂȚII ANTIOXIDANTE 60

2.2.1. GENERALITĂȚI 60

2.2.2. MATERIALE ȘI METODE 60

2.2.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII 63

2.3. DETERMINAREA ACTIVITĂȚII ANTIMICROBIENE ȘICITOTOXICE A EXTRACTELOR ALCOOLICE 71

2.3.1. Materiale și metode 71

2.3.2. Rezultate și discuții 76

CAPITOLUL 3. DETERMINAREA CAPSAICINEI DIN CAPSICUM ANNUUM PRIN METODA HPLC 94

3.1. GENERALITĂȚI 94

3.2. MATERIALE ȘI METODE 95

3.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII 96

CAPITOLUL 4. SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA UNUI COMPLEX α-CICLODEXTRINĂ-CAPSAICINA 103

4.1.SINTEZA COMPLEXULUI CAPSAICINĂ-α–CICLODEXTRINĂ ÎN FAZĂ LICHIDĂ 103

4.1.1. Materiale și metode 103

4.2. [anonimizat] A COMPLEXULUI 104

4.2.1. Materiale și metode 104

4.2.2. Rezultate 104

4.3. [anonimizat] A COMPLEXULUI 107

4.3.1. Materiale și metode 107

4.3.2. Rezultate și discuții 108

4.4. DETERMINAREA CAPSAICINEI DIN COMPLEXUL CAPSAICINĂ-α–CICLODEXTRINĂ PRIN HPLC 113

4.4.1. Materiale și metode 113

4.4.2. Rezultate și discuții 113

CAPITOLUL 5. APLICAȚII FARMACEUTICE ALE COMPLEXULUI α-CD/CAPSAICINĂ 117

5.1. ÎNCORPORAREA CAPSAICINEIÎN UNGUENT SIMPLU 117

5.2. STUDII DE CEDARE IN VITRO A PRINCIPIULUI ACTIV 117

5.2.1. Celula de difuzie 117

5.2.2. Determinarea disponibilității in vitro a capsaicinei din formulările farmaceutice 119

5.3. TESTE REOLOGICE 121

5.3.1. Generalități 121

5.3.2. Materiale și metode. 123

5.3.3. Rezultate și discuții 125

6.CONCLUZII GENERALE. PERSPECTIVE VIITOARE DE CERCETARE 130

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE 134

ABREVIERI

DPPH· radicalul 1,1-difenil-2 picrilhidrazil

SRO specii reactive de oxigen

IC50 concentrație ce provoacă inhibiția cu 50% a [anonimizat]-IR spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier

HPLC cromatografie de lichide de înalta performanță

DAD detector cu arie de diode

FDA Food and Drug Administration

UFC unitățiformatoare de colonii

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

CMI concentrație minimă inhibitorie

OMS Organizația Mondială a Sănătății

F.R. X Farmacopeea Română ediția a X-a

α, β, γ – CD α, β, γ – Ciclodextrine

C [anonimizat]-vizibil

PEG Polietilenglicoli

H, L Hidrofilic, Lipofilic

CMC Carboximetilceluloză

MC Metilceluloză

APV Alcool polivinilic

DHC Dihidrocapsaicină

NDHC Nordihidrocapsaicină

HDHC Homodihidrocapsaicină

TRPV Receptorul tranzitoriu potențial vaniloid

DL50 Doza letala medie

Rpm Rotații pe minut

2-HPβCD 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrină

MS Spectrometrie de masă

GAE Echivalenți acid galic

QE Echivalenți quercitină

TEAC Echivalenți trolox

INTRODUCERE

Considerații generale

Capsaicina este un principiu activ natural, componenta majoră pungentă din speciile aparținând genului Capsicum (Fam. Solanaceae).

Capsaicina s-a dovedit a avea o multitudine de efecte farmacologice, fiind utilizată în studii recente publicate în literatură ca agent antineoplazic pe mai multe tipuri de linii celulare inițiate din diferite tipuri de tumori precum cancerul de sân, carcinomul de colon, nazofaringeal, cancerul gastric și pancreatic.

Un inconvenient al utilizării acestei substanțe este reprezentat de slaba solubilitate care reduce biodisponibilitatea acestuia în organismul uman.

Pe de altă parte, se cunoaște faptul că ciclodextrinele sunt substanțe chimice cu masă moleculară mare care formează complecși de incluziune cu diverse medicamente, ajutând astfel la cedarea mai ușoară a medicamentului respectiv.Aceste CD reprezintă agenți transportori hidrofili la exteriori cu o cavitate nepolară care furnizează o matrice hidrofobă la interior.

În literatura de specialitate există numeroase studii de sinteza de complecși de tipul medicament/β-ciclodextrină. Studiile cu α-CD sunt însa destul de limitate, ca și cele cu γ-CD care sunt mai puțin accesibile ca și costuri.

Motivația alegerii temei

Pentru această teză a fost aleasă capsaicina ca principiu activ și α-CD din considerentelemai sus menționate în vederea sintetizării unui complex în fază lichidă capsaicină/α-CD care să fie ulterior inclus în formulări farmaceutice semisolide.

Un alt argument care a stat la baza alegerii acestui produsa fost răspândirea speciei Capsicum annuum, specie care stă la baza obținerii capsaicinei naturale pe teritoriul țării noastre precum și accesibilitatea acesteia.

În vedereaobținerii unor rezultate cât mai bune s-a realizat un studiu multidisciplinar (analiza instrumentală, tehnologie farmaceutică, biochimie, farmacognozie, microbiologie, biologie celulară), fiind aplicatăîn mai multe metodologii care au condus la elaborarea unei forme farmaceutice având ca principiu activ capsaicina.

Obiectivele tezei de doctorat

Metodologia de cercetare a cuprins:

1. Analiza calitativă și cantitativă a compoziției în capsaicina a Capsicum Annuum.

2. Stabilirea părților anatomice ale ardeiului cu conținut maxim de capsaicina.

3. Punerea la punct a unor metode de concentrare și extragere a capsaicinei din materialul biologic cu maximum de randament.

4. Analiza spectrală a principalelor componente implicate în procesul de cerecetare: capsaicina, alfa-ciclodextrina, complexul acestora.

5. Stabilirea prin metode fizico-chimice de analiză a raportului de combinare și a condițiilor cele mai facile pentru obținerea unei cantități cât mai mari de complex.

6. Stabilirea principalelor componente auxiliare folosite pentru aplicarea acestora sub formă de unguent.

7. Urmărirea posibilităților de interacționare a combinației complexe cu baza de unguent și crearea condițiilor optime pentru folosirea acestui unguent pentru scopul propus.

PARTEA GENERALĂ

CAPITOLUL 1. STUDIUL LITERATURII DE SPECIALITATE

1.1. PREPARATE FARMACEUTICE SEMISOLIDE

În ultimul timp, odată cu creșterea numărului de afecțiuni dermatologice la nivelul tuturor segmentelor de vârsta dar și datorită agenților nocivi din mediul înconjurator a crescut și importanța preparatelor topice.Medicamentele cu aplicare topică includ aerosoli, creme, emulsii, geluri, loțiuni, pomezi, paste, pudre, soluții sau suspensii.Aceste forme sunt în general utilizate pentru administrarea locală (și mai puțin pentru efectul sistemic) și se aplică pe piele sau pe mucoase.

Conform FR. X unguentele sunt preparate farmaceutice semisolide destinate aplicării pe piele sau pe mucoase, în scop terapeutic sau de protecție; sunt constituite din excipienți (baze de unguent)în care se pot încorporasubstanțeleactive.

Unguentele au fost oficializate înca din prima ediție a Farmacopeei Romane, din 1863, care înscria 6 exemple de cerate și 8 de unguente.

Preparatele farmaceutice semisolide aplicate pe piele sunt fie destinate îngrijirii pielii,protecției și îngrijirii epidermei fie pentru protecția față de factorii nocivi, sau pentru a servi drept vehicul medicamentelor care urmeaza a fi absorbite în piele și pe mucoase (pentru tratarea afecțiunilor dermatologice) sau, daca este cazul în circulația generală (terapeutice).Farmacopeea Europeana înscrie mai multe categorii de preparate semisolide pentru aplicațiile cutanate: unguente, geluri, creme, paste, cataplasme, plasturi medicinali.

Bazele de unguent constituie grupa principală de substanțe auxiliare din acest capitol.În funcție de gradul de dispersie al substanțelor active și modul de preparare, unguentele pot fi:

-unguente-soluții (Ointments type solutions). Preparate farmaceutice semisolide ce conțin substanțele active dispersate molecular în baza de unguent. Sunt unguente monofazice care se obțin prin dizolvarea directă. Dacă substanța activă eliberată din aceste unguenteare afinitate pentru piele, baza de unguent o cedeaza optim.

-unguente-emulsii (Ointments type emulsions) sunt constituite din două faze nemiscibile, una apoasă și cealaltă uleioasă, ce pot forma ambele tipuri de emulsii. Sunt preparate semisolide tip emulsie H/L sau L/H, cu substanțe active emulsionate în baza de unguent. Acestea sunt unguente bifazice.Conțin emulgatori sau amestecuri de emulgatori ce asigură o distribuție uniformă a substanței active în ambele faze. Emulgatorii care stabilizează emulsiile de tip H/L folosiți sunt: alcooli de lână, esteri ai sorbitanului, monogliceride și alcooli grași. Emulgatorii care stabilizează emulsiile de tip L/H sunt alcoolii grași sulfatați, polisorbați sau esteri ai acizilor grași cu macrogolii (PEG-uri). Când faza apoasă depașește 10% aceste unguente sunt denumite Creme.

– unguente-suspensii (Ointments type suspensions). Preparate farmaceutice semisolide în care faza dispersata este constituită din pulberi insolubile suspendate în baza de unguent. Absorbția substanțelor active depinde atât de mărimea particulelor cât și de solubilitate.Unguentele ce conțin pulberi solide fine dispersate în baza în cantitate mai mare de 25% se numesc Paste.Sunt unguente bifazice.

– Unguente polifazice (Polyphasic ointments) – unguente mixte, cu mai multe faze.Preparate semisolide, care conțin mai multe substanțe medicamentoase, dispersate diferit (dizolvate, emulsionate sau suspendate) în baza de unguent.

Procedeul de topire al bazelor de unguent este necesar numai dacă componentele au p.t. diferite. Sunt facilitate atât procedeele de malaxare cât și cel de emulsionare care are loc la cald. Amestecarea este recomandată până la răcirea preparatului deoarece altfel se risca separarea componentelor. În farmacie aceasta operație se face la mojar, în industrie preferându-se malaxoare la o anumită adâncime pentru a nu permite încorporarea aerului.

În funcție de “așezarea” unei substanțe active în unguent se poate imprima tipul de unguent obținut, principala condiție fiind ca substanțele sa fie repartizate uniform în toata masa preparatului și să se afle într-o stare de dispersie cât mai avansată. O altă condiție esențială în formularea unguentelor este obligativitatea de a verifica eventualele incompatibilități dintre substanțele asociate. Atât baza de unguent cât și substanța medicamentoasă încorporată nu trebuie să afecteze funcțiile fiziologice ale pielii sau condițiile patologice pentru care se tratează. Baza de unguent nu trebuie să interfereze acțiunea substanțelor medicamentoase, ci, dimpotrivă, să le stimuleze.

Unguentele pot fi considerate geluri cu capacitate de deformare plastică, fiind constituite dintr-un schelet lax alcătuit din faza solidă tridimensionalăîn care este reținută prin adsorbție sau mecanic faza lichidă ambele fiind biocoerente. Faza solidă este dispersatăcoloidal în faza fluidă și conține substanțele active (prin dizolvare, emulsionare sau suspendare). Scheletul lax se formează datorită forțelor Van der Waals și a legăturilor de hidrogen secundare care se stabilesc. Structura de gel conferă unguentelor proprietăți tixotrope (ușor deformabile) -această proprietate îi permite structurii gelului, odată distrusă prin acțiune mecanică sau termică, să se refacă după încetarea acesteia, adică gelul să revină mai mult sau mai puțin la starea inițială, ca rezultat al mișcarii browniene.Dacă transformarea reversibilă are loc într-un interval mai mic de o secundă, tixotropia se numește instantanee. Tixotropia optimă îi conferă unui unguent calități de aderare bune,implicit o activitate terapeuticăoptimă.Tot acestei proprietăți descoperite inițial de Freundlich i se datorează faptul că unguentele își mențin consistența și omogenitatea pe parcursul ambalării, depozitării, precum și la aplicare- o proprietate importantă deoarece după exercitarea anumitor forțe mecanice (aplicare, ungere, masare, apasare, forfecare) unguentul se poate aplica în mod corespunzător pe tegument.

Din structura de gel a unguentului putem deduce și proprietățile reologice ale acestuia (elasticitate, deformare, curgere, vâscozitate) care indică variațiile de formă pe care le poate suferi sistemul dispers sub acțiunea forțelor de forfecare interne sau externe, a căror influența este strâns legată de particularitățile de microstructură și conformație moleculară.

Baze de unguent:

Baza de unguent este în general monofazică, mai rar formată dintr-un singur component (vaselina), de cele mai multe ori fiind vorba despre un amestec de excipienți (în general se preferă un număr mic de componente pentru a fi ușor de preparat iar in formularea unguentelor se alege un raport corespunzător între excipienții moi, lichizi și solizi pentru a îndeplini criteriile dorite) de consistența diferită, cu puncte de topire diferite în aceasta putându-se dispersa componente lichide sau solide.

Bazele de unguent au în principal rol de diluant al substanțelor active și trebuie să permită o etalare ușoară a unguentului pe piele, reprezentând o mare proporție din preparat.

Rolul bazelor de unguent:

În primul rând de a aduce substanța activă în forma farmaceutică optimă de unguent care să se poată administra ușor pacientului;

Vehiculează substanțele medicamentoase la locul aplicării;

Ameliorează eficacitatea terapeuticăprin asigurarea cedării, penetrării și absorbției substanței active- vehiculul putând schimba starea fizică și permeabilitatea stratului cornos, astfel, prin efectul ocluziv mărind conținutul în umiditate din piele și putând îmbunătăți penetrarea substanțelor medicamentoase.

Bazele de unguent trebuie să îndeplinească o serie de condiții:

Baza de unguent sa fie constituită dintr-un număr mic de componente, asociind un număr mare de compuși crește și numărul interacțiunilor nedorite, să fie ușor de preparat și să aibă culoare, miros acceptabil și aspect vizual plăcut;

Să fie compatibilă cu pielea, bine tolerată, neiritantă, netoxică și nonalergizantă. Să nu altereze funcțiile fiziologice ale pielii, sau condițiile patologice ale pielii care se tratează iar după îndepartare, pielea să își recapete proprietatea de barieră;

Punctul de topire optim să fie de 40° Cpentru a prezenta o capacitate bună de etalare. Un punct de topire mai ridicat pune problema unui unguent cu o consistență mai mare, scăzând ușurința de aplicare pe tegument și făcând dificilă, chiar dureroasă întinderea pe piele, mai ales dacă aceasta prezintă iritații sau leziuni. La polul opus se găsesc excipienții cu punct de topire inferior temperaturii corpului care pot sa curgă, scăzând astfel eficacitatea unguentului;

Să aibă un pH în limitele celui fiziologic (4,2-5,6);

Să fie stabile în timp și să asigure stabilitatea substanțelor active;

Să fie inerte din punct de vedere fiziologic, farmacologic, chimic – să nu reacționeze cu substanțele active, cu celelalte substanțe auxiliare sau cu recipientele în care sunt condiționate;

Să faciliteze penetrația substanțelor active în țesuturi, iar substanța activă să fie eliberată corespunzător din preparate pentru a ajunge la locul de acțiune. Prin penetrație cutanată se înțelege pătrunderea substanței medicamentoase din baza de unguent în straturile profunde ale epidermului și dermului;

1.1.1. Clasificarea unguentelor

Clasificarea bazelor de unguent se face în funcție de natura acesteia:

I. Unguente cu baze anhidre

1. Baze de unguent hidrofobe (lipofile) se subîmpart în:

– lipogeluri;

– hidrocarburi;

– silicongeluri;

Lipogeluri – constituite din grasimi vegetale de consistență fluidă, moale sau solidă(conțin acizi grași, hidrocarburi, vitamine, fosfatide). Acestea se împart în:

grasimi vegetale de tipul uleiurilor vegetale fixe: ulei de cocos, de ricin, ulei de floarea soarelui, ulei de măsline, ulei de semințe de dovleac, ulei de susan sau de soia sau uleiuri hidrogenate: ulei de cocos hidrogenat, ulei de ricin hidrogenat etc. Acestea se folosesc asociate cu bazele de unguent de consistență ridicată, cărora le micșorează punctul de topire făcându-le mai emoliente și mai ușor de penetrat în piele. Acizii grasi nesaturați au un conținut bogat în gliceride și de aceea, aceste uleiuri se alterează ușor mai ales dacă se asociază cu unguente de tip emulsie care conțin apă. Din această cauză, se preferă folosirea uleiurior sintetice în locul celor naturale. Acestea nu râncezesc și au o afinitate mare pentru piele. Se folosește și proporția de 50% grăsimi hidrogenate cu 10% lanolină și 40% ulei de ricin pentru obținerea unor baze de unguent cu o bună penetrabilitate și capabile să încorporeze 100% apă. Pe langă acestea, ca bazăde unguent se mai poate folosi și untul de cacao, dar are dezavantajul că nu încorporeaza apa și nu o emulsionează. Pe langă bazele grase vegetale, s-au obținut grăsimi și pe cale sintetică, prin procedeul de reesterificarea gliceridelor. Acestea sunt: Migliol (triglicerida a acizilor grași saturați lauric, caprinic, caprilic), Sofisan (prezintă tixotropie scazută), Cetiol (este un bun solvent pentru substanțele medicamentoase liposolubile și poate ușor înlocui parafina, fiind mult mai bine tolerat de piele. Oaltă bază vegetală semisintetică folosită în practica curentăesteEstarinum anhidricum G, care, în prezența apei formează emulsii U/A, putând fi astfel capabil să preia secrețiile pielii lezionate. Se îndepartează ușor de pe piele, doar cu apă.

grăsimi animale: Axungia (Adeps suillus) – grăsime naturală extrasă prin topirea țesutului adipos de pe abdomenul porcului (osânza). Conține α-palmito-dioleina și β-oleo-palmito-stearina dar și trigliceride semisolide ale acizilor stearic, palmitic, oleic, linoleic, trigliceride ce au punctul de topire în jur de 40°C și poate încorpora până la 150% apă. Datorită acestui punct de topire are capacitate de ungere bună, afinitate față de grăsimile din piele și cedează ușor substanța medicamentoasă încorporată. Prezintă dezavantajul râncezirii, astfel încât, pentru a-i mări stabilitatea se poate adăuga Tinctura Benzoe (adeps benzoatus), galat de propil (Adeps suillus benzoinatum), tocoferol sau acid nordhidroguaiaretic.Stearina (acidul stearic)este un amestec de acizi grași (stearic, palmitic, oleic) și se prezintă sub formă de masă cristalină albă, onctuasă cu miros caracteristic. Intră în componența bazelor de unguent împreună cu parafina, mărindu-le astfel consistența.

Grăsimi de sinteză – constituite din amestecuri de monogliceride, digliceride și trigliceride. Produse cu multiple avantaje : incolore, inodore și cu compatibilitate fiziologică corespunzătoare.

Cerurile: pot fi de origine animală sau vegetală și sunt constituite din esteri ai acizilor grași cu alcoolii superiori. Cetaceul (spermancetum) – se obține din cavitatea craniană a speciei de balenă Physeter macrocephalus. Este solubil în eter și alcool fierbinte, insolubil în apă și alcool rece. Se asociază cu uleiuri vegetale cărora le marește vâscozitatea. Chiar dacă nu este emulgator, prezența cetaceului în unguente face posibilă încorporarea apei în masa acestuia. Ceara albași ceara galbenă– solubile în eter, cloroform, benzen, uleiuri grase, insolubil în alcool rece și apă. Are un p.t. cuprins între 60 și 66°C, la temperatura camerei fiind în stare solidă. Datorită p.t. se asociază cu alți excipienți cărora le mărește vâscozitatea.

2. Geluri de hidrocarburi – sunt baze de unguent hidrofobe care asigură proprietățiemoliente și protectoare și care rămân în piele un timp mai îndelungat. În bazele de hirocarburi este practic imposibil de a încorpora apă și soluții apoase. Cele care pot fi totuși încorporate sunt pudrele cu ajutorul parafinei lichide. Îndepartarea bazelor de hidrocarburi din piele este foarte dificilă din cauza structurii sale uleioase.

Vaselinaeste un amestec de hidrocarburi saturate cu 22-35 de atomi de carbon care sunt fie aciclice fie naftenice. Este o masă moale, alb-galbuie, onctuasă, filantă, greu tolerată de piele, neavând afinitate pentru epiderm, cu interval de topire între 38-60°C.Se preferă pentru folosire ca bazăpentru unguentele de acoperire și protective, cu acțiune ocluzivă. Nu este recomandată în tratamentul eczemelor deoarece împiedica drenarea plăgilor, astupă porii și, împiedicând respirația favorizează infecția și supurația. Se folosește ca bază de unguent asociată cu uleiurile hidrogenate.Prin asocierea vaselinei cu colesterolul se formeazăvaselina colesterinată sau Eucerina iar cu lanolina formează unguentul simplu, ambele baze grase care dau cu apa emulsii A/U.

Parafina lichidăeste un amestec de hidrocarburi ce nu se folosește ca atare ci se asociază cu anumite baze de unguent pentru a le scădea consistența. Este comparabilă cu vaselina în ceea ce privește toleranța cutanată.

Parafina solidăeste un amestec de hidrocarburi cu p.t. între 47-65°C și folosită pentru a mări consistența bazelor de unguent.Hidrocarburile sunt recomandate ca baze de unguent pentru unguentele protectoare sau cele cu penetrație slabă (ce conțin acid benzoic, sulf, precipitate de mercur etc).

Silicongelurilese folosesc în unguente datorită proprietăților hidrofobe pe care le dețin, în scop de protecție contra noxelor. Sunt polimeri sintetici constituiți din lanțuri de atomi de siliciu cuplați prin atomii de oxigen, iar celelalte valențe sunt satisfacute de radicali alchilici și arilici. Din această categorie cel mai utilizat este uleiul de silicon, termostabil, inert chimic, lipsit de acțiune fiziologică proprie, foarte compatibil cu pielea și cu excelențe proprietăți de ungere ce imprimă substratului un efect hidrofob apreciabil- previne formarea de spumă. Unguentul se întinde uniform, în pelicule subțiri ce oferă protecție împotriva detergenților, acizilor, bazelor, agenților de curățire sau a altor substanțe cu caracter alergogen.În general siliconii se asociază cu bazele de unguent (grase, emulgatori) pentru a le imprima acestora caracterul hidrofob pronunțat și a putea fi folosit în preparate de protecție. Se îndeparteaza ușor de pe piele, nu produc iritații pe tegument, dar se evită aplicarea lor pe zonele inflamate sau pe mucoasa oftalmică deoarece produc senzația de arsură ale conjunctivei, care durează 1 sau 2 zile după care nu există repercursiuni.

2. Baze de absorbție:

Aici se încadrează bazele de unguent constituite dintr-o fază grasă și una apoasă,la care se adaugă unul sau mai mulți emulgatori, orientat la suprafața fazei interne.În funcție de natura emulgatorului și de proporția fazelor, se disting două baze emulsii A/U și U/A, sau mixte, când se asociază emulgatori de ambele tipuri.

Bazele de unguent de tip A/U Acestebaze de unguent conțin apă sau soluții apoase ce reprezintă faza internă dispersată în faza externă lipofilă, de consistențămoale cu o capacitate de etalare și ungere foarte bună. Cel mai bun exemplu este lanolina hidratată.

Lanolina (Adeps Lanae) se obține din lâna de oaie.În farmacie se gasește sub formă anhidră sau cu un conținut de 25% apă-lanolină hidratată. Se prezintă ca o masă vâscoasă, gălbuie cu miros caracteristic. Este solubilă în solvent organic, insolubilă în apă. Datorită vâscozității se asociază de obicei cu uleiurile grase sau cu cel de parafină pentru a-i spori adezivitatea și capacitatea de ungere.Are indice de iod mic, având puține duble legături și indice de apă mare. Nu se poate aplica ușor singură deoarece este prea aderentă. Lanolina prezintă o foarte bună capacitate de încorporare a apei, (poate încorpora până la 185% apă, cifra care poate fi chiar triplată în prezența acizilor grași cu esterii colesterolului). Prezintă o bună tolerabilitate în piele, cedează substanța active mai repede decât vaselina, cu care se asociază de obicei în preparate (unguent simplu, creme hidrofobe s.a.m.d.),care sunt capabile să încorporeze apa și să formeze baze emulsii de tip A/U.
Prezintă de asemenea și dezavantaje (miros persistent, aderență foarte mare, vâscozitate accentuată, ridică problema alergiilor la oxidare).Intervalul de topire este între 38-44°C, indicele de iod 18-36, reziduu la calcinare ≤0,1%.

Lanolina hidratată- lanolina hidratată provine din lanolina în care s-a încorporat un procent de 25-30% apă. Adaugarea treptată a apei în lanolina topită și în continuă agitare permite o mai bună încorporare a apei.Lanolina hidratată are o capacitate de absorbție a apei mult mai mare decât a lanolinei și este folosită pentru prepararea unguentelor hidrofobe sau a unguentelor emulsie A/U cu faza apoasă în proporție marită. Expunerea acesteia la temperaturi ridicate duc la spararea fazei apoase de cea uleioasă.Adăugarea de antioxidanți și conservanți îmbunătățesc stabilitatea produselor pe bază de lanolină.O bună bază de unguent A/U care poate încorpora până la 200% apă este Eucerina, amestec de vaselină și colesterol în proporție de 1-5%.

Colesterolul (ca și lanolina) este un emulgator de tip A/U care mărește capacitatea bazelor de unguent de a încorpora apa. Este o substanță sidefie, alb-gălbuie, sensibilă la lumină, solubil în eter, cloroform, insolubil în apă.

Spanurile sunt esteri ai acizilor grași cu sorbitanii. La rândul lor, și aceștia au caracter emulgator și se asociază cu bazele de unguent pentru a rezulta emulsii de uz extern A/U.Ca și colesterolul, Spanurile se utilizează în diverse proporții (1-5%) pentru a mări capacitatea de încorporare a apei în diferite baze de unguent.

Tegin sunt produși de esterificare ai acizilor grași cu glicolii (glicerol, polietilenglicol sau etilenglicol).Se utilizează la o concentrație de 1% la emulsiile A/U.

Emulsiile A/U mai sunt numite și creme grase și pot fi degradate de o mulțime de substanțe cu care sunt incompatibile (fenoli, ichtiol ș.a.m.d).

Bazele de unguentde tip U/A

Au o compoziție mult mai vastă fiind mult mai des utilizate.De fapt aceste emulsii au faza externă reprezentată de apă sau soluții apoase iar faza internălipofilă, constituită din grăsimi și conținând emulgatori care în prezența apei dau emulsii U/A, unguentele fiind lavabile.

Aceste baze de unguent emulsionează filmul de grăsime din piele și, putând să strabată acest strat își poate manifesta acțiunea în profunzime. Acest fapt constituie un avantaj în cazul multor substanțe active stabile în mediu apos, precum unele antibiotice sau antiseptice hidrosolubile care își manifestă cel mai bine efectul în unguentele de tip emulsie U/A. Unguentele emulsie de tip U/A sunt preferate în cazul tratamentului leziunilor acute deoarece nu astupă porii pielii, permit schimburile optime, cedează rapid substanța activă, au efect calmant, răcoritor și sunt ușor lavabile.

Emulgatorii cei mai folosiți sunt amestecurile de emulgatori de tip ceară Lanette și cei ionogeni. De fapt la prepararea acestor baze de unguent de tip emulsie U/A se folosesc baze lipofile (parafina, vaselina, alcooli grași superiori) la care se adaugă apă sau soluții medicamentoase apoase și emulgatori ionogeni sau neionogeni.

Cei mai utilizați emulgatori ionogeni sunt:

Săpunurile alcaline de tipul săpunului de trietanolamină;

Sărurile de sodiu ale esterilor acizilor grași superiori cu acidul sulfuric de tipul cetilsulfatului de sodiu care dă emulsii de tip U/A și care, alături de parafină și vaselină intră în compoziția unguentului emulgator. Acțiunea cetilsulfatului de sodiu este de a scădea tensiunea superficială la suprafața de separare a celor două faze. Efectul emulgator al acestuia poate fi îmbunătățit prin adăugarea de alcooli grași sau a unor ceruri emulgatoare precum cera emulsificans – amestec de alcool cetostearilic cu cetrimida în proporție de 9:1. Emulgatorii complecși sunt folosiți la obținerea de emulsii stabile variațiilor de pH, datorită intercalării acestora la suprafața de separare a celor două faze, formându-se o structură de gel stabilă.

Alți emulgatori ionogeni care ajută la stabilizarea emulsiilor U/A sunt ricinoleatul de sodiu și laurilsulfatul de sodiu fiindfolosiți în proporții variabile.

Emulgatorii neionogeni sunt relativ des utilizați în practica curentă și sunt reprezentanți ai esterilor acizilor grași superiori cu alcoolii și polioxietilenglicolilor și acizilor grași superiori ce posedă grupari hidrofile. Câteva exemple de astfel de emulgatori sunt Tween, cu aplicabilitate în practica farmaceutică (Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80), emulgatori solubili în apă, alcool și grăsimi, care, încorporate înbaza de unguent dau emulsii U/A stabile și foarte bine tolerate de piele, indiferent de pH sau alte variații. Alți emulgatori folosiți cu succes în practica farmaceutică sunt Brij și Mirj, care au aceeași calitate, de a da emulsii U/A, unde faza externăeste apa, foarte stabile la variațiile externe. Prezintă o toleranță excepțională pe piele dar are și anumite dezavantaje, de pildă condiționarea acestor unguente în tuburi metalice polisate în interior și în condiții indicate în documentația analitică de normare.Un alt dezavantaj pe care îl prezintă alegerea apei ca fază externă îl constituie mediul prielnic pentru dezvoltarea microorganismelor (în special a ciupercilor), fapt care se previne prin adăugarea unei soluții conservante de fenosept 2‰.

3. Baze de unguent hidrosolubile

Sunt baze de unguent anhidre, miscibile cu apa sau chiar se dizolvă în ea, formând ulterior geluri coloidale.

Bazele de unguent cu PEG sunt foarte folosite în practica dermatologică, în detrimentul grăsimilor datorită avantajelor pe care le reprezintă aceștia. Polimerii inferiori (cu masa moleculară variind între 200 și 500) sunt lichide vâscoase în timp ce, cei cu greutate moleculară cuprinsă între 1000 și 10.000 sunt compuși solizi sau cu consistență ceroasă, cu aspect asemănator cu cel al vaselinei. Sunt preferate grăsimilor deoarece sunt hidrofile, au o bună capacitate de aderență și întindere, sunt inerte fiziologic, mai puțin în ceea ce privește eczemele datorită higroscopicității, se utilizează la pacienții ce prezintă sensibilitate la grăsimi, se usucă pe piele formând un film dar, totuși nu obstrucționează porii, sunt neocluzive, permițând schimburile între piele și exterior; sunt indicate în tratamentul zonelor cu pilozitate, sau pe pielea traumatizată datorită avantajului de a încorpora secrețiile plăgilor și grăbirea vindecării acestora. De aceea, bazele de unguent cu PEG se recomandă în procesele micotice, necrotice sau supurative ale pielii, datorită activității osmotice, când favorizează absorbția secrețiilor. În ele se pot dizlova diverse substanțe precum gudroane, balsam de Tolu sau substanțe care nu sunt solubile în baze grase de tipul anestezinei, acidului salicilic, cloramina, rezorcina.

Aceste baze prezintă și dezavantaje de tipul tendinței de cristalizare, fapt ce se poate remedia prin adăugarea de substanțe tensioactive. De asemenea prezintă anumite incompatibilități cu anumite antibiotice de tipul Penicilinei sau bacitracinei, care sunt inactivate, la fel ca și timololul sau creozotul;

Bazele de unguent cu hidrogeluri sunt macromolecule coloidale care formează un schelet și care reține apa în proporție de 80-90%, care etalează bine pe piele, iar după evaporarea apei produc efectul de răcorire pe piele. Pentru a evita o evaporare rapidă urmată de deshidratare a tegumentului, se adaugă propilenglicol sau glicerol. Sunt preferate ca baze de unguent pentru regiunile cu strat pilos abundent sau pentru unguentele de uz oftalmic.

Aceste baze pot fi:

Naturale (amidon, pectine, carageen, veegum, alginati);

Semisintetice (derivați de metilceluloză, celuloză, CMC);

Sintetice (A.P.V., carbopol, polivinilpirolidonă).

Amidonul intră in compoziția formulei oficinale a glicerolatului de amidon. Pectinele sunt poliuronide bine tolerate de piele, și, deoarece favorizează refacerea țesutului de granulație, sunt recomandate în tratamentul arsurilor de gradul I și II. Alginații se folosesc sub forma de geluri de alginați bine suportate de piele, scăzând timpul de epitelizare și accentuând vindecarea plăgilor și a ulcerațiilor.

Derivații de celuloză și CMC sunt asemănători ca și caracteristici cu gelurile naturale, dar prezintăo stabilitate mai mare la variații de pH. Sunt baze de unguent lavabile hidrofile, bine tolerate de tegumente și compatibile cu majoritatea substanțelor active.

A.P.V este un polimer cu inerție chimică pronunțatăși se preferă încorporarea antibioticelor și hidrocortizonului în gelurile formate de acesta.

Gelurile de bentonită sunt produși preferați pentru tratarea arsurilor și favorizarea epitelizării tisulare, deoarece se pot combina cu cantități mici de uleiuri grase rezultând geluri tixotrope cu caracter onctuos ce pot încorpora cu succes iod, sulfamide, fenoli. Prin volumul mare de apă pe care îl rețin bentonitele se adreseazăzonelor supurative, absorbind secrețiile și reținând bacteriile. Ca toate celelalte tipuri de geluri prezintă o mare tolerabilitate cutanată.

Aerosilul, substanța anorganică ce formează un gel transparent prin combinare cu apa în proporție de 10% la 60°C. Vâscozitatea gelului poate fi sporită prin adăugarea de substanțe tensioactive sau electroliți. În bazele de aerosil se poate adăuga ZnO cu aplicabilitate în practica de receptură.

Unguentele cu siliconi sunt apreciate pentru caracteristica lor hidrofobă care îi recomandă ca și unguente de protecție împotriva acțiunii detergenților, îngrășămintelor chimice, acizi, alcalii, agenți de curățare.

II. Unguente cu baze hidratate:

Conțin diverse baze de unguent, emulgatori complecși și diferite proporții de apă și sunt:

Sisteme emulsionate de consistența semisolidă și le cunoaștem sub numele de creme și conțin o fază grasă, lipofilă (L) și una apoasă, hidrofilă (H), cele două fiind stabilizate cu ajutorul unui complex de emulgatori:

Sisteme H/L sunt cremele hidrofobe care se obțin prin adăugarea apei în baza anhidră și se încorporează (ex: lanolină hidratată);

Sisteme L/H creme hidrofile sau lavabile ce conțin un complex de emulgatori, unul hidrofil și unul lipofil;

Sisteme mixte sau creme amfifile ce conțin faza apoasă și faza uleioasă în proporții aproape egale alături de o cantitate mare de emulgatori și sunt preferate datorită cantității mari de substanța medicamentoasă ce poate fi dispersată.

Sisteme gelificate – sunt geluri mai mult sau mai puțin opace:

Geluri de tensioactivi – se obțin prin creșterea proporției de emulgatori în sistemele bifazice ducând la geluri mai opace sau transparente, de consistență solidă.

Geluri de substanțe macromoleculare organice sau anorganice, reversibile sau ireversibile.

Mediul de dispersie al unui unguent il reprezintă baza de unguent, constituită din unul (lanolina) sau mai multe materii prime în asociație.Aceasta este caracterizată de o consistență moale și vâscozitate adecvată pentru a se putea aplica pe suprafețe cutanate, zone cu păr sau mucoase.

1.1.2. Tincturi

Tincturile sunt preparate farmaceutice lichide obținute prin extracția produselor vegetale.Acestea pot fi soluții alcoolice, hidroalcoolice sau eteroalcoolice. La prepararea tincturilor se folosesc produse vegetale uscate în prealabil, raportul produs vegetal/solvent fiind de 1:10 (m/m). Pentru a putea obține o tinctură corespunzătoare este necesar ca produsul vegetal să fie mărunțit și adus la gradul de diviziune prevazut în monografia respectivă.În principiu pentru tincturi se utilizează în diferite concentrații solvenți precum alcoolul diluat sau concentrat, alcoolul acidulat sau amestec de solvenți.

Pentru obținerea tincturilor metoda de extracție cea mai folosită estemacerarea. Această operație se efectuează la temperatura camerei iar produsul vegetal mărunțit este menținut în contact cu solventul alcoolic un timp variabil, într-un recipient închis pentru a evita evaporarea solventului. Timpul de contact între extract și alcool variază între 4 și 10 zile. Pentru a optimiza randamentul macerării se poate efectua macerarea dublă sau repetată.

Alte tipuri de extracție cu randament foarte bun sunt extracția în aparat Ultra-turax și extracția cu ultrasunete.Aparatul Ultr-turax constă într-un dispozitiv care aspiră amestecul produs/solvent într-o cameră de turbulență permițând mișcări de lovire, forfecare sau ciocnire, și astfel extrăgând principiile active.

La extracția cu ultrasunete amestecul este supus ultrasunetelor care, prin intermediul unei agitări puternice accelerează extracția.

Stabilitatea, conservarea și depozitarea tincturilor și extractelor variază în funcție atât de solvent cât și de natura extractului. Soluțiile extractive apoase sunt mai puțin stabile, necesitând adăugarea de conservanți antimicrobieni, pe când soluțiile extractive alcoolice sun mai stabile, stabilitatea acestora variind între 1 și 2 ani, iar după o eventuală reanalizare, dacă se respectă condițiile din monografia respectivă, produsul mai poate fi folosit încă 6 luni.

Tincturile sunt lichide colorate, limpezi cu mirosul și gustul caracteristice produsului vegetal și al solventului folosit. Dacă în timp tincturile prezintă sediment, se poate folosi lichidul decantat, numai cu condiția ca acesta să corespundă prevederilor din monografia respectivă.

1.1.3. Tegumentul – cale de administrare a preparatelor farmaceutice semisolide

Pielea, cel mai greu și extensibil organeste cel mai expus agresiunii și factorilor externi.Pielea se pretează în cea mai mare proporție tratamentelor topice dar pot trece și transcutan, fiind absorbite în circulația sistemică.

Principiile farmacologice generale care stau la baza folosirii medicamentelor aplicate pe piele sunt similare cu cele utilizate administrării pe altecăi. La persoanele adulte, pielea cântarește 3-4 kg, mai mult decât creierul care are între 1100g și 1300g, având o suprafață de circa 2 m2. Fiecare cm pătrat de piele conține 6 milioane de celule și peste 15 glande sebacee, peste 20 de vase de sânge și aproximativ 60.000 de melanocite.

Pielea are o capacitate deosebită de regenerare și multiple funcții biologice:de protecție (barieră), comunicare tactilă, reglator termic, producerea colecalciferolului, aspect estetic sau de păstrare a apei în organism.

Farmacocinetica pielii se prezintă altfel la persoanele în vârsta la care stratul corneum este mai uscat. Datorită atrofierii epidermului și dermului funcțiile biologice sunt mult reduse, absorbția prin piele a medicamentelor fiind mai mică la persoanele de vârsta a III-a comparativ cu tinerii. Odată cu scăderea activității glandelor sebacee și a apei tisulare, scade și eficacitatea substanțelor hidrofilice.Același efect îl are și scăderea microcirculației locale.

Locul de aplicare și acțiune al unguentelor îl reprezintă pielea, cu care trebuie sa fie compatibile, neiritante, nealergizante și bine tolerate. Trebuie de asemenea să aibă un pH asemanator cu cel fiziologic al pielii (4,2 -5,6).

Efectele modificării absorbției percutanate și a permeabilității dermului prezintă importanța deosebită atât în segmentul dermatologic și tratamentul local al pielii, cât și la aplicarea percutană a preparatelor cu efect sistemic.

1.2. CAPSAICINA

Capsaicina este ingredientul principal din ardeiul iute (Capsicum annuum sau Ardeiul de Cayenne) și responsabilă de efectul înțepător pe care îl generează.Ardeiul este originar din America Centrală și de Sud, și, prin intermediul colonizatorilor englezi a ajuns și în Europa la sfârșitulsecolului al XV-lea, răspândindu-se inițial ca o plantă ornamentală. Ulterior s-a folosit ca și planta condimentară (figura 1.1). După colonizare fiecare stat i-a dat denumirea proprie: englezii l-au numit Red Pepper, Chilli Pepper, Cayenne Pepper, italienii l-au denumit Peperone, Peperoncino, Paprika, Pepe rosso sau Diavoletto.Spaniolii l-au denumit Pimienta de Cayena, Pimienta picante, Halapenos sau Cayena inglesa, francezii l-au botezat Poivre de Cayenne sau Poivre rouge, nemții l-au denumit Roter Pfeffer, Cayenne-Pfeffer, Chili-Pfeffer, Beißbeere.

Popularitatea ardilor iuți a început să crească datorită ușurinței de cultivare, gustului înțepător și aspectului atractiv.

Din punct de vedere taxonomic aparține clasei Equisetopsida, subclasei Magnoliidae, supraordinul Asteranae, ordinul Solanales, familia Solanaceae, genul Capsicum. A nu se confunda chilli pepper cu black pepper (piperul negru) care aparține altei clase (Piperaceae). Ardeii sunt folosiți în gastronomie fie proaspeți, fie uscați (paprika, pudra de chilli sau cayenne) în funcție de bucătăria tradițională.

Ardeiul este o plantă perenă, anuală care se cultivă prin răsad în zonele de clima temperată și care poate să ajungă până la 75 cm în înălțime. Forma fructelor, care au valoare condimentară și ornamentală este diferită (pătrată, rotundă, conică cu baza largă, turtită, alungită).

Figura 1.1. Specii ornamentale de Capsicum annum

Primele notificări apărute în legătură cu ardeiul au fost făcute în anul 1493, ulterior proprietățile sale condimentare, ornamentale și chiar vindecatoare au devenit cunoscute în întreaga lume.

Compoziția chimică a ardeilor variază odată cu maturitatea ardeiului iute, ardeii grași conținând apă în proporție de 26%, pe când cei uscați pot conține până la 10,8% apă, substanțe azotoase aproximativ 1,2%la cei grași și 15,86% la cei uscați, celuloză 0,5% respectiv 20,9%, substanțe extractive fără azot 2,9% respectiv 24%, precum șivitaminele complexului B: B1 0,03mg/100 g ardei gras, B2 0,02mg/100g, iar vitamina C se poate găsi în cantitate de 75 mg/100mg de ardei gras iar în ardeii roșii uscați cantitatea de vitamina C poate fi de 7 ori mai mare decât într-o lămâie. În ardeii uscați întregi cantitatea de vitamina C poate fi de 100 până la 300mg/100g. De asemenea, în ardeii genului Capsicum raportul între ionii de Mg și cei de Ca este 2:1, raportul putând ajunge și la 10:1 la anumite specii, lucru pe care la alte legume nu îl găsim.

1.2.1. Capsaicina-principiul activ din ardei. Descriere:

Capsaicina este ingredientul activ din ardeiul iute, localizată în special în semințele și nervurile fructului matur, și care, se răspândește ulterior înîntreg fructul. Formula molecularăa acesteia este C18H27NO3, cu denumirea IUPAC trans-8-metil-N-vanilil-6-nonenamidă, un alcaloid natural, sub formă de pulbere cristalină albă sau incoloră, inodoră, cu caracter hidrofob, puternic înțepatoare și foarte volatilă. Datorită faptului ca proprietățile fizice și solubilitatea sunt aceleași cu ale capsaicinoidelor, mult timp s-a considerat că aceasta ar fi o singură substanță, până când, în 1958, Kosuge și colaboratorii au stabilit, prin intermediul metodelor cromatografice, atât capsaicina cât și dihidrocapsaicina, în raport de 2,1:1. Până în prezent s-au descoperit circa 20 de tipuri de capsaicinoide naturale, și numărul nu este cel final. Dintre acestea, literatura de specialitate menționează: Dihidrocapsaicina DHC ((CH2)6CHMe2), Nordihidrocapsaicina NDHC ((CH2)5CHMe2), Homodihidrocapsaicina HDHC ((CH2)7CHMe2), HomocapsaicinaHC(trans-(CH2)5CH=CHCHMe2),Norcapsaicina(trans-(CH2)3CH=CHCHMe2), Bishomocapsaicina (trans-(CH2)6CH=CHCHMe2 ș.a.m.d..

Figura1.2. Structura capsaicinei

Se consideră că, atât capsaicina, cât și analogii săi, denumiți și capsaicinoizi sunt substanțe produse de către plantă, ca o barieră naturală împotriva animalelor ierbivore cât și a ciupercilor.

În diverse țări, se produce și capsaicina sintetică (N-vanililamida acidului pelargonic), un tip de capsaicină mai ieftină de produs și comercializat, și care respectă calitațile substanței originale, de la proprietățile fizice, până la senzația de înțepatură și iritație, și se folosește în medicină cu denumirea de nonivamidă.

1.2.2. Capsaicina, analogi ai capsaicinei. Proprietăți fizice, chimice, solubilitate

După cum am precizat, capsaicina este o substanță sub formă de cristale albe sau incolore, fărămiros și cu un gust extrem de arzător. Este o substanță extrem de iritantă pentru ochi, tegumente sau tractul respirator. Intervalul de topire este între 64-66,3°C, temperatura de fierbere între 210-220°C (0,01 Torr), temperatura de sublimare 115°C, masa molară 305,41g/mol. Spectrul UV: λmax =227nm (ε=7000), 281 nm (ε=2500).Capsaicina este insolubilă în apa rece și eter de petrol, foarte slab solubilă în apă caldă, HCl concentrat sau sulfura de carbon. Capsaicina este foarte solubilă în solvenți organici și soluții alcaline . Are uncaracter slab acid fenolic, conținând grupări hidroxilice și meroxilice și poate fi considerată ca vanilamida acidului decilenic.

Datorită grupării OH din formula sa, capsaicina intră în reacții de bromurare, alchilare sau hidrogenare catalitică a dublelor legături.

Culoarea roșie pe care o au anumite varietăți de ardei, printre care și a celor folosiți la prepararea boielei se datorează capsantinei, din grupa carotenoidelor, cu formula moleculară C40H58O3.

Gustul înțepator al capsaicinei poate fi atenuat prin încalzirea într-o soluție de NaOH 2%, dar dispărut complet prin oxidarea cu KMnO4 sau K2Cr2O7.

Într-o soluție de H2SO4 în exces și în prezența paraformaldehidei sau a unei cantități mici de zaharoză, cristalele de capsaicina devin violet. Colorațiile sunt variate, de exemplu expunerea în alcool în prezența FeCl3 duce la o colorație verde-albastruie, în prezența VOCl3 capsaicina devine verzuie sau în soluție de NaNO2, în prezența Na2WO4 prinde colorație galbenă. Aceste colorații sunt folosite în scop analitic.

Spectrul IR al capsaicinei expune o bandă de absorbție la 970 cm-1 datorită grupului trans-C=C, metodă folosită pentru a diferenția capsaicina de dihidrocapsaicină, în cazul unui amestec între cei doi analogi.

Dihidrocapsaicina este un analog al capsaicinei, cu solubilitatea și proprietățile chimice aproape identice ale acesteia. Se prezintă sub forma unor cristale albe, mate cu un gust la fel de înțepător. Intervalul de topire este între 65,6-65,8°C.Proprietățile fizice, chimice și solubilitatea sunt aproximativ identice cu cele ale capsaicinei.

Alți analogi cu proprietăți fizice și chimice asemănătoare capsaicinei sunt Nordihidrocapsaicina și Vanililamida acidului pelargonic care se prezintă sub forma de cristale albe, inodore, cu un gust puternic înțepător. Cel de-al doilea compus intră în reacții de acilare cu anhidrida acidului succinic datorită grupării OH pe care o prezintă sau de alchilare cu acidul bromoacetic sau β-propionic, ducând la compuși cu un gust înțepător mai puțin pregnant și cu proprietăți farmacologice mult mai valoroase.

În afara de aceștia, alți analogi ai capsaicinei care merită amintiți sunt vanililamida acidului 10-undecilenic și vanililamida acidului oleic, care se prezintă sub forma de pulberi albe sau cristale inodore, cu proprietăți fizice, chimice și farmacologice corespunzătoare clasei de care aparțin. Palvanilul și N-palmitoil-vanilamida sunt capsaicinoide care se găsesc în procente mici în genul Capsicum, dar, spre deosebire de capsaicina sunt lipsite de senzația de înțepatură și nu produc bronhoconstricție la doze analgezice.Restul capsaicinoidelor nu sunt menționate deoarece fie nu prezintă proprietăți farmacologice bine stabilite, fie sunt dificil de izolat.

Pe langă compușii organici menționați anterior, găsim în diverse specii de ardei iute diverși compuși precum: gingerol, zingiberena, care este prezentă și în uleiul de cimbru în procent de 35%, respectiv piperina, care este răspunzătoare de gustul specific al piperului.

a.

b.

Figura 1.3. Metabolițisecundari din ardei:

a- gingerol; b-zingiberena

1.2.3. Toxicitatea și proprietăți farmacologice

Acești compuși acționează asupra receptorilor durerii și accentuează producerea salivei necesare digestiei și declanșează în creier formarea neuropeptidelor-endorfine și encefaline.

Capsaicina este un compus iritant pentru mamifere în general și este răspunzatoare de senzația de arsura produsă oricarui țesut cu care intră în contact. Este foarte iritantă pentru ochi putând produce leziuni ale corneei, pentru piele ducând de la roseață până la arsura și pentru tractul respirator superior, inițial instalându-se o tuse profundă, urmată de reacție alergică și chiar șoc anafilactic. Datorită faptului ca doza maximă tolerată a capsaicinei în aer este de 0,004mg/Litru pentru 2 minute de expunere face ca manipularea și prepararea capsaicinei să fie mult îngreunate. Doză letală la șoareci este de 190mg/kg la administrarea per os si 0,56mg/kg la administrarea intravenoasă și se manifestă prin hipotermie și soc anafilactic.Capsaicina nu prezintă proprietăți narcotice.Se metabolizează la nivelul ficatului prin intermediul citocromului P450 și conduce la produși hidroxilați aromatici și alifatici. Capsaicina naturală și cea sintetica sunt asemănătoare ca și toxicitate, în timp ce vanililamidele au o toxicitate mult mai mică, ea intensificându-se odată cu creșterea lanțului de atomi de C. Atât capsaicina cât și vanililamidele acizilor grași prezintă activitate antioxidantă, astfel încât, adaugate în uleiuri vegetale le crește stabilitatea în fața termooxidării și râncezelii. Capsaicina și analogii săi au o acțiune bacteriostatică pronunțată asupra unor anumite bacterii, însă nu au proprietăți antifungice, fiind rapid descompuse de către fungi.

1.2.4. Mecanismul de acțiune al capsaicinei

Sistemul nervos somatosenzorial este răspunzător de adaptarea organsimului la traumatisme, boli iatrogenice sau metabolice. Orice modificare în acest sens, fie ea și periferică poate aduce cele mai substanțiale schimbări, deoarece fibrele nervoase senzoriale sunt foarte vulnerabile chiar și la traumatisme superficiale și influențează sănătatea și integritatea celulelor corpului și axonilor proximali. Datorită faptului ca inervația cutanată depinde de foarte mulți factori, ea este eterogenă la adulții tineri sănătoși, și din ce în ce mai eterogenă odată cu apariția bolilor metabolice, distrugerea sistemului nervos senzorial sau îmbătrânirea, datorită cumulării factorilor înconjurători cu celor interni.

Inervația sistemului senzorial nervos poate fi evidențiată atât prin teste funcționale, de tipul QST (senzorul de testare cantitativă) sau LEP (potențiale evidențiate prin metoda laser) cât și prin teste clinice. Testele funcționale se bazează pe răspunsul la stimuli termici, când proba este expusă răcirii sau încălzirii bruște și termoreceptorii cutanați se activează. Metodele clinice se bazează pe cuantificarea inervației cutanate prin efectuarea biopsiei pe o probă de 3mm în diametru, o procedură ușoară și non-invazivă.Folosind metode matematice, s-au calculat numărul de fibre nervoase ce traversează joncțiunea dermal-epidermică și s-a obținut densitatea intra-epidermică a fibrelor nervoase. S-a constatat că alterarea densității fibrelor se corelează cu severitatea durerilor neuropate sau a altor sindroame. Pe acest mecanism se bazează capsaicina care, produce pierderea localizată a terminațiilor nociceptive a fibrelor nervoase din derma și epiderma.

Capsaicina și alte vanililamide sunt folosite în prezent datorită efectelor analgezice, antiinflamatoare și antioxidante, acționând țintit asupra biosintezei prostagalandinelor și a receptorului TRPV1, având un rol important în atenuarea durerii și inflamației.

Administrarea capsaicinei topice induce reducerea nociceptorilor cutanați și respectiv inervația. Reducerea inervației cutanate implică o modificare adusă mitocondriei. Capsaicina esteun agonist exogen selectiv și foarte potent pentru receptorul potențial vaniloid tranzitoriu (TRPV1), un receptor transmembranar reprezentat printr-un canal cationic neselectiv ce poate fi activat de o varietate de stimuli fizici și chimici, atât endogeni cât și exogeni.Acești stimuli sunt t°>43°C (109°F), pH acid, capsaicina, alil-izotiocianat (compusul iute din muștar și wassabi), voltajul ridicat sau diverse lipide.Receptorii TRPV1 se găsesc în principal în neuronii nociceptivi din sistemul nervos periferic, dar și în alte țesuturi, inclusiv SNC, diverse arii corticale și subcorticale. Se presupune ca TRPV1 este de fapt un tetramer, care, în momentul în care este activat de stimuli se deschide tranzitoriu și se inițiază o depolarizare mediată de influxul de ioni de Ca2+ si Na+. În terminațiile nervoase nociceptive, unde recpetorul TRPV1 este cel mai evidențiat, din depolarizarea indusă de capsaicina rezultă potențiale de acțiune care sunt transmise către cordul spinal și creier, și se traduc ca o senzație de căldura, arsură, înțepătură sau senzație de prurit. Canalul TRPV1 este foarte permeabil pentru ionii de Ca2+ (raportul permeabilității Ca:Na fiind de 25:1), și poate produce o creștere dramatică a calciului intracelular, inclusiv în reticulul endoplasmatic, unde TRPV1 este de asemenea, prezent. Aceastăcreștere a Ca2+ intracelular poate activa enzimele dependente de calciu, precum proteazele sau poate induce depolimerizarea componentelor citoscheletale precum microtubulii. Mitocondriile nu sunt distribuite întamplător de-a lungul neuronului senzorial, ci mai degrabă acolo unde consumul de energie este crescut, de exemplu însituurile unde are loc transducția senzorială. Un număr mare de mitocondrii se găsește în terminațiile periferice ale nociceptorilor. Modificarea funcției nociceptorului cauzată de expunerea la capsaicinăeste un semnal amplu de creștere a calciului intracelular, căteodată suficient pentru a încărca capacitatea mitocondriei de sechestrare a acestuia. Astfel, este posibil ca, administrarea cutanată a capsaicinei să furnizeze concentrații mari de capsaicină capabile să permită mecanisme farmacodinamice secundare pentru a contribui la efecte pe termen lung asupra nociceptorilor.

În ceea ce privește cele mai noi ipoteze, receptorul TRPV1 prezent și la păsări, nu este activat la acestea de către capsaicina, ca urmare, ele nu sunt împiedicate de nici un factor pentru a le ingera și de a excreta semințele lor de la distanțe mari.

TRPV1 poate fi considerat ca fiind o entitate moleculară, care, activată farmacologic de către expunerea prelungită sau repetată la agoniști contribuie cu succes la instalarea efectului analgezic.

În ceea ce privește formularea unui produs destinat analgeziei care sa conțină capsaicina, trebuie să se țină cont de doi factori: în primul rând ameliorarea durerii persistente și în al doilea rând gradul de tolerabilitate. Trebuie luat în calcul faptul că, pentru fiecare fibră nervoasă cutanată nociceptivă existăun punct critic la care expunerea prelungită la capsaicina poate duce la degenerarea ireversibilă a acestora. Aducând un număr suficient de mare de nociceptori cutanați hiperactivi din aria dureroasă la punctul lor critic poate cauza defuncționalizarea acestora și poate genera dureri perceptibile.

1.2.5. Domeniie de aplicabilitate

Capsaicina și respectiv analogii săi prezintă o serie de proprietăți farmacologice, fiind utilizați pe scară largă în medicină. Preparate ce conțin astfel de substanțe sunt utilizate în tratamentul astmului, enurezis, tract respirator, aparat urinar sau bolile inflamatorii intestinale. De asemenea, se utilizează în diversele boli în care sindromul durerii este prezent precum osteoartrită, artrita reumatoidă,nevralgie postherpetică, neuropatia diebetică sau nevromul postmastectomic. În afară de utilizările medicale, se mai utilizează în cosmetică, în preparatele pentru stimularea creșterii părului, reducerea mătreții, în pastele de dinți pentru eliminarea mirosurilor neplăcute, în produsele pentru înlăturarea dăunătorilor casei (insecte, rozătoare) sau datorită faptului că este iritant ocular se folosește în spray-urile lacrimogene pentru auto-aparare.

Analgezic în diverse afecțiuni

La această proprietate un rol major îl are receptorul TRPV1, care, prin intermediul imunocitochimiei, cu ajutorul ARN a fost descoperit întâi în celulele din creierul șobolanului, ulterior în cortexul, hipocampusul și hipotalamusul acestuia. Această descoperire a fost urmatăde numeroase investigații, detectând expresia TRPV1 în girusul zimțat, talamus, cerebel, nucleii cohleari, creasta zimțată și în nucleul nervului trigemen (Cristino și colaboratorii, 2006).

Capsaicina este un agonist al receptorului TRPV1, iar acesta este activat prin fosforilarea de către proteinkinaze, proteinkinaza II calmodulin-dependență și prin clivajul fosfatidil inositolului 4,5-bifosfat de către fosfolipaza C. Astfel, TRPV1 activat de către capsaicină intră într-o perioada refractară mai lungă și astfel, un neuron excitat anterior este rezistent la stimuli variind de la presiune mecanică până la durere endogenă/exogenă sau agenți proinflamatori.Dupa excitare, TRPV1 eliberează neuropeptide senzoriale dependente de concentrația de capsaicina folosită, dar apoi previne restaurarea neuropeptidelor prin blocarea axoplasmică a substanței P și a somatostatinei în neuronii senzoriali. Acest mecanism se consideră ca fiind primul în instalarea analgezieidar, ulterior s-a demonstrat că efectul analgezic oferit de capsaicină se datorează unei cascade de evenimente rezultate din defuncționalizarea fibrelor nociceptive, defuncționalizarea incluzând pierderea potențialului membranar, depleția neuropeptidelor și retracția reversibilă a fibrelor terminale dermice și epidermice (datorită depleției neuropeptidelor are loc ameliorarea durerii).

Capsaicina produce deteriorarea terminațiilor nervoase senzoriale, iar la aplicarea topică repetată a capsaicinei apare de asemenea degenerarea fibrelor nervoase cutanate cu scăderea senzației dureroase.S-au făcut numeroase studii clinice având ca subiect efectul analgezic al capsaicinei la oameni.Astfel s-a dovedit clinic controlarea durerii neuropate din nevralgia post-herpetică, polineuropatia diabetică, neuropatia post-traumatică saunevralgia post-chirurgicală. În afară de capsaicină, care produce efecte analgezice notabile, mai putem trece în revistă un analog al acesteia, palvanilul (N-palmitol-vanilamida), fără efect înțepător pronunțat și fără efect bronhoconstrictor dar cu potență analgezică mai mare.

Ca și efecte adverse raportate, cele mai comune au fost durerea și eritemul. Aceste efecte adverse au fost bine tolerate și ușor de manageriat, folosind agenți de răcire aplicați local, opioide cu acțiune rapidă sau spălarea cu soluții saline conținând 2% clorhidrat de lidocaină.

Analgezic în afecțiunile aparatului urinar

Durerile cronice pelvine, des diagnosticate la populația masculină sub denumirea de prostatită cronică prezintă incidența mare la populația din vestul Europei și are efecte negative asupra calității vieții pacienților deoarece prostatita cronică prezintă simptome genitourinare, dureri localizate la nivelul spatelui, abdomenului, anusului, penisului, afectarea ejaculării. Studiul a presupus administrarea unei soluții de 5ml capsaicina cu concentrația 10-5 M aplicată topic pe pielea corpului perineal, cu ajutorul unui burete, făcându-se compresie de către fiecare subiect timp de 5 minute. S-a constatat o îmbunătățire a simptomelor după prima săptămână și s-a luat în calcul utilizarea capsaicinei ca o noua strategie în tratamentul durerii din sindromul cronic pelvin.

Receptorii TRPV1 sunt dens distribuiți în tractul urinar și, de aceea, modularea acestuia poate reduce simptomele vezicii neurogenice, de exemplu. S-a demonstrat că, aplicarea intravezicală a soluției de capsaicină induce contracția detrusorului și reduce volumul vezicii de trei ori, pentru a se reface reflexul de micțiune la subiecții umani. Acești receptori joacă un rol important în patologia hiperactivității detrusorului și pot fi folosiți ca o alternativă la anti-colinergicele standard, dar capsaicina intodusă intravezical este iritantă, astfel încât, momentan utilizarea acesteia este restrânsă.

Proprietăți anticancerigene

În ultimele decenii cercetătorii au scos în evidența proprietățile anticancerigene ale capsaicinei.S-au raportat efecte precum proliferarea celulelor sau întreruperea fazei G2/M și pierderea potențialului membranar mitocondrial și ulterior apoptoza celulei canceroase.În 2011, Pramanik și colaboratoriiau raportat apoptoza produsă de capsaicină asupra celulelor canceroase din pancreas.

Oschina și colaboratorii au demonstrat că, capsaicina oprește proliferarea și induce apoptoza celulelor maligne din cancerul de prostată. De asemenea, Mori și colaboratorii (2006) au studiat efectele capsaicinei asupra cancerului de prostată și au demonstrat că, capsaicina inhibă factorul nuclear kappa (NF-k) și activarea factorului alfa de necroză tumorală. Astfel de efecte au fost demonstrate și în cancerul de sân, cancerul gastric, leucemie, cancerul de colon, cancerul pulmonar sau în carcinomul hepatocelular.

Markerul PSA (Prostate Specific Antigen) este o proteină care semnalizează adenocarcinomul de prostată la bărbați, o proteină acumulată în cantități mari în cancerul de prostată. PSA a fost de asemenea redus de capsaicină în celulele canceroase.

Reducerea greutății corporale

Studiile efectuate pe subiecți umani în 1995 respectiv în 1998 au arătat creșterea termogenezei și oxidarea lipidică pronunțată, precum și scăderea apetitului în dietele bogate în grăsimi amestecate cu un procent de capsaicină. La studiile efectuate pe șoareci s-a observat reducerea lipogenezei hepatice și îmbunătățirea transportului lipidelor în ser. Aceste studii au dezvăluit influența capsaicinei asupra grăsimii corporale.

La aplicarea topică pe șoarecii obezi s-a demonstrat creșterea expresiei adipokinelor cu reducerea acumulării de grăsime în stratul adipos. Bolile asociate obezității precum diabetul zaharat de tip II produc dereglări în metabolismele glucidic și lipidic.Un supliment de 0,015% capsaicină adăugat la dieta bogată în grăsimi are rol atât în scăderea glicemiei cât și a trigliceridelor plasmatice. Capsaicina inclusă în regimul alimentar reduce obezitatea prin accelerarea oxidării acizilor grași în țesuturile adipoase sau ficat.

Efecte asupra sistemului cardiovascular

Receptorii TRPV1 se regăsesc și în structurile cardiovasculare, lângă pericard și în celulele endoteliale vasculare. TRPV1 este implicat și în perceperea durerilor din infarctul miocardic, fiind strâns legat de efectele cardioprotectoare. TRPV1 este distribuit de asemenea de-a lungul sistemului vascular și este implicat în autoreglarea vasculară, având efect atât vasoconstrictor cât și vasodilatator, depinzând de starea fiziologica. TRPV1 are efect vasoconstrictor când activarea lui rezultă din eliberarea substanței P și legarea acesteia de neurokinina 1 iar efectul vasodilatator rezultă atât din mecanismele vasculare cât și din cele neuronale. Ambele mecanisme mediază creșterea intracelulară de Ca. În plus, capsaicina s-a dovedit a fi un bun antiagregant plachetar, efect independent de activarea TRPV1.

Efecte gastrointestinale

TRPV1 se găsește de asemenea exprimat în celulele epiteliului gastric și stimulează secreția de gastrina.Efectele gastrointestinale produse de capsaicină sunt doză-dependente.Activarea TRPV1 eliberează enzimele COX1 cu efect protector gastric. S-au raportat de asemenea cazuri în care, capsaicina ingerată a crescut suprafața de absorbție a intestinului subțire la șobolan. La șobolanii cărora li s-a administrat capsaicină a crescut absorbția de Zn ingerat.

Efecte dermatologice

S-a demonstrat recent prezența TRPV1 în keratinocitele umane iar activarea acestuia în epiderma a indus eliberarea de mediatori pro-inflamatori. De asemenea, s-a observat o îmbunătățire semnificativă a psoriazisului la pacienții tratați topic cu capsaicină, dupa 21 de zile.

Efecte asupra colului uterin

Capsaicina activează și apoi desensibilizează receptorul TRPV1 aflat în uterul și cervixul oamenilor și al rozătoarelor, reducând astfel transmiterea durerii. Studiul a fost făcut pe loturi de șoareci validate pentru a examina efectele capsaicinei în timpul travaliului și a avut ca obiectiv examinarea dacă, după o singură aplicare intravaginală la femele a unui gel conținând capsaicină scurtează durata până la expulzarea fătului.

Femelele au suferit aplicații intravaginale cu lidocaină urmată de capsaicina 0,1% în ziua a 15- a de gestație. S-au comparat cele două cazuri și s-a demonstrat că, capsaicina reduce durerea din travaliu și accentuează tendința de expulzare a fătului.

1.3. CICLODEXTRINE

1.3.1. Generalități

Ciclodextrinele și derivații acestora sunt produși foarte folosiți atât în industria farmaceutică cât și în industria chimică, alimentară, agronomie sau ingineria mediului. În industria farmaceutică astfel de produși sunt folosiți în tehnicile de eliberare a medicamentului, cu particularitate în eliberarea peptidelor și a proteinelor. Au de asemenea un rol important în designul altor sisteme de cedare precum nanoparticulele, microcapsulele, microsferele sau lipozomii.

În ultimul timp CD au fost intens studiate primind o atenție considerabilă în domeniul farmaceutic.

Ciclodextrinele sunt folosite ca și excipienți sau agenți de complexare pentru a crește solubilitatea compusilor în soluții apoase, pentru creșterea biodisponibilității si stabilității acestora. În plus, în domeniul farmaceutic ciclodextrinele se folosesc pentru reducerea sau prevenirea iritării gastrointestinale sau oculare, pentru mascarea sau reducerea mirosului sau a gustului neplăcut, pentru prevenirea interacțiunilor între substanțele active sau între substanțele active si excipienți, sau pentru a transforma medicamentele în forma lichidă sau uleioasă în pulberi microcristaline sau amorfe.

Definiții și structură

Ciclodextrinele sunt o familie de compuși formați din amidon prin conversie enzimatică.De fapt, sunt molecule de zahăr legate într-o formațiune inelară (oligozaharide ciclice). Datorită conformației de scaun a unităților glucopiranozice, CD sunt modelate mai degrabă ca un trunchi de con decât ca o formațiune ciclică.

Figura 1.5. Formarea complexului medicament (D) – ciclodextrină (CD)

Aceste oligozaharide ciclice conțin cel puțin 6 unități glucopiranozice atașate prin legături glicozidice α-(1,4). CD α,β și γ sunt constituite din 6,7 respectiv 8 unități glucopiranozice, fiind diferite astfel atât dimensiunea ciclului cât și solubilitatea acestora.

CD nu se pot forma cu mai puțin de 6 unități glucopiranozice datorită interacțiilor sterice în timp ce omologii acestora cu 9 sau mai multe unități sunt foarte dificil de purificat.

Funcțiilehidroxilsunt orientatespre exteriorulconuluicugrupelehidroxil primareale resturilorde zahărladeschidereaîngustăaconuluișigrupările hidroxilsecundareladeschiderea largă a acestuia.Unitatea centrală a conului este formată din atomi de carbon și oxigen eterici ale resturilor de glucoză, conferindu-i un caracter lipofil.

Această cavitate s-a estimat ca fiind similară unei soluții apoase de etanol. Ciclodextrinele naturale, în special β-ciclodextrinele au solubilitate slabă în apă, acest lucru însemnând că, solubilitatea complecșilor rezultați din interațiunea substanțelor lipofile cu aceste ciclodextrine poate fi și ea limitată rezultând precipitarea ciclodextrinelor în apă sau în alte sisteme apoase. Solubilitatea CD naturale este mai mică decât cea a CD aciclice. Acest lucru se datorează legăturilor de hidrogen intermoleculare relativ puternice din starea cristalizată.

CD cu partea interioară a cavității lipofilă și cu partea exterioară hidrofilă sunt capabile să interacționeze cu o varietate mare de molecule gazdă, formând astfel complecși de incluziune non-covalenți.

Unde n = 6α-Ciclodextrina

n = 7 β-Ciclodextrina

n = 8 γ-Ciclodextrina

Figura 1.6. Structura chimică a ciclodextrinelor

Cavitatea interioară a α-CD este prea mică pentru unele medicamente iar γ-CD este foarte costisitoare. În general δ-CD are abilitate mult mai slabă de a forma complecși decât restul CD.

Cea mai folosită CD este β-CD atât datorită biodisponibilității sale cât și a dimensiunii cavității sale adecvate încorporării celei mai variate game de substanțe active. Dar solubilitatea sa limitată precum și efectele nefrotoxice i-au îngrădit folosirea, în special în produsele parenterale.

Ciclodextrinele cele mai utilizate în formularea medicamentelor de pe piața farmaceutică sunt α-Ciclodextrina, β-Ciclodextrina (βCD), 2-Hidroxipropil-β-ciclodextrina, γ-Ciclodextrina și 2-Hidroxipropil-γ-ciclodextrina.Spre deosebire de γ-ciclodextrină, α si β ciclodextrinele naturale nu pot fi hidrolizate de către salivă sau amilaze pancreatice.Totuși, cele douăpot fi fermentate de către flora intestinală. Ambele ciclodextrine variază între 1000 și 2000 Daltoni, au caracter hidrofilic și au un număr semnificativ de atomi de H donori și acceptori, astfel încât nu se absorb în tractul gastrointestinal în forma lor intactă. Ciclodextrinele cu caracter hidrofilic sunt considerate nontoxice la doze mici și moderate. S-a demonstrat căderivații metilați ai ciclodextrinelor sunt toxici la administrarea lor parenterală.

Statutul de reglementare al ciclodextrinelor este în evoluție. α si β-ciclodextrinele sunt enumerate în Farmacopei precum cea din SUA, Farmacopeea Europeana și cea Japoneza. Γ-ciclodextrina va fi în curând inclusă în Farmacopeea SUA și ulterior în cea Europeana. Recent, monografia 2-HP-β-CD a fost inclusă în Farmacopeea Europeana (ediția a 4-a (suplimentul 4.6.)și în ediția a 5-a).Alți derivați ai CD ca β-CD și γ-CD sunt acceptați pe listele FDA ca aditivi alimentari.

Toxicologia CD

Toate studiile de toxicitate au demonstrat că,la administrarea orală a CD, acestea sunt practic nontoxice datorită lipsei absorbției în tractul GI.Studiile au arătat ca γ-CD si 2-HP-β-CD sunt cele mai sigure la administrarea parenterală. Nu același lucru se poate spune despre α și β CD care nu sunt adecvate pentru acest tip de administrare.

Proprietățile principale ale α-CD sunt: relativ iritante după administratrea i.m., se leagă de anumite lipide, prezintă iritație oculară, se absorb în procent de 2-3% dupa administrarea orală la șobolani, nu sunt metabolizate în tractul intestinal superior, scindate numai de către flora intestinală din cecum și colon. Se excretă în procent de 7-14% sub formă de metaboliți in fecale și urină, majoritatea se excretă nemetabolizate pe cale renală după administrarea i.v., t1/2 = 25 de minute la șobolani. DL50>10.000 mg/kg la șobolani, DL50 i.v. la șobolani în intervalul 500-750 mg/kg.

β-CD este mai puțin iritantă decât α-CD după administrarea i.m., se leagă de colesterol. O cantitate mică (1-2%) se absoarbe în tractul intestinal superior după administrarea orală. Sunt metabolizate de către bacteriile din cecum și colon. La momentul actual sunt cele mai utilizate în industria farmaceutică. Administrarea unor doze mari pot fi nocive și nu sunt recomandate, deoarece fermentarea acestora în colon pot produce gaz și diaree. DL50 la administrarea orală la șobolan este >5.000mg/kg, DL50 i.v. variază între 450 și 790 mg/kg.

γ-CD are avantajul de a fi cea mai puțin iritantă CD după administrarea i.m. În tractul GI superior se degradează rapid și complet la glucoză datorită enzimelor intestinale (chiar și la o doza mare de 10-20g/kg), nu este metabolizată după administrarea i.v., cea mai puțin toxică CD și de aceea este preferată ca aditiv alimentar. Prezintă bune abilități de complexare. Derivații săi au solubilitate limitată, având tendințade agregare in soluțiile apoase,soluția devenind opalescentă. DL50 orală la șobolani este de 8000 mg/kg, DL50 i.v. 4000mg/kg.

Factorii care influențează formarea complexului

În soluțiile apoase, ciclodextrinele sunt capabile să formeze complecși cu multe medicamente, prin prinderea unei molecule de substanțe active în interiorul cavității sale. În timpul formării complexului nu au loc nici ruperi nici formări de legături covalente, iar moleculele de medicament din interiorul complexului intră rapid în echilibru cu moleculele libere din soluție. Proprietățile fizico-chimice ale medicamentului în stare liberă sunt diferite față de moleculele de medicament cuprinse în cavitatea CD, cum și proprietățile CD libere sunt diferite față de cele din complex.

Aceste schimbări includ solubilitatea, schimbări în ceea ce privește reactivitatea chimică, absorbanța în UV-VIS, fluorescența, HPLC, măsurări potențiometrice, în stabilitatea chimicăși a efectelor asupra permeabilității medicamentului prin membranele artificiale.

Tipul de CD folosită influențează de asemenea formarea complexului. Pentru complexare, dimensiunea cavității CD trebuie sa fie adecvată pentru a găzdui o moleculă de o anumită dimensiune. Complexarea este superioară cand CD și medicamentul au sarcină opusă și poate scădea când ambele poartă aceeași sarcină.

Schimbările de temperatură pot afecta formarea complexului medicament/CD. În majoritatea cazurilor,creșterea temperaturii scade constanta de stabilitate a complexului, având ca efect reducerea forțelor de interacțiune din complex, cum sunt forțele van der Waals sau forțele hidrofobice.

Un alt factor de care depinde formarea complexului medicament/CD este metoda de preparare, care poate consta în măcinare, frământare, dispersie solidă, evaporarea solventului, co-precipitarea, uscarea prin pulverizare sau liofilizarea. S-a constatat că eficacitatea metodei de preparare depinde atât de natura medicamentului cât și de structura CD. Metodele de complexare cu cel mai bun randament au fost până în prezent uscarea prin pulverizare și liofilizarea.

Când se adaugă în cantități mici polimeri solubili în apă sau agenți de cuplare a ionilor, crește constanta aparentă de stabilitate a complexului, și implicit crește solubilitatea CD. Adăugarea acestor agenți îmbunătățesc atât proprietățile biologice și farmaceutice ale complexului medicament/CD. Adăugarea de co-solvenți poate crește atât solubilitatea cât și stabilitatea CD, cum este, de exemplu, adăugarea de 10% propilenglicol în formulările orale de itraconazol și 40% HP-β-CD. La diluare, prezența propilenglicolului a crescut absorbția și biodisponibilitatea medicamentului în tractul GI.

Cel mai comun model de complex medicament/CD este complexul 1:1, în care, o moleculă de medicament formează un complex cu o moleculă de ciclodextrină și poate fi reprezentat prin formula:

K1:1

D + CD ↔ D/CD

Gradul de substituție (DS): reprezintă media grupărilor hidroxil substituite per unitate glucopiranozică a inelului ciclodextrinic. Dacă numărul grupărilor hidroxil reactive pe mol de unitate glucopiranozică este 3, numărul maxim de substituenți posibili pentru α, β si γ-CD sunt 18, 21 respectiv 24.

Gradul mediu de substituție molară (MS): media numărului de moli ai agentului de substituție. Această valoare poate fi mai mare de 3 pentru fiecare unitate glucopiranozică a CD substituite, sau mai mare de 18, 21 și 24 pentru α, β respectiv γ-CD.

Gradul de polimerizare (DP): este raportul DS/MS. Dacă nu are loc formarea de situsuri adiționale în timpul substituției, MS si DS sunt egale, iar raportul lor este 1.

Gradul de substituție (DS) joacă un rol important în formarea unui echilibru între solubilitatea în apă a CD și capacitatea de a forma complecși. Creșterea gradului de substituție la un nivel optim îmbunătățește solubilitatea CD în apă.

Efectele CD asupra biodisponibilității medicamentelor

CD îmbunătățesc biodisponibilitatea medicamentelor insolubile prin creșterea solubilității, dezagregării și/sau permeabilității acestora.CD cresc permeabilitatea medicamentelor insolubile la suprafața pielii, mucoaselor sau a corneei, fără să distrugă stratul lipidic. În astfel de cazuri este important să se folosească o cantitate suficientă de CD pentru a solubiliza medicamentul în soluția apoasă, deoarece adaosul unui exces poate duce la scăderea absorbțieimedicamentului.Spre deosebire de detergenți, CD solubilizează membranele fără a le rupe, astfel încât sunt preferate față de alte substanțe pentru a forma compuși, deoarece efectele lor sunt reversibile. Watanabe și colaboratorii au raportat restabilirea barierei mucoasei rectale după aproximativ 24 de ore de la administrarea a 30mg DM-β-Cd. Chiar și la doze mari efectele CD sunt reversibile și similare cu cele ale agenților osmotici folosiți în formulările parenterale.

De asemenea, adăugarea polimerilor poate mări permeabilitatea medicamentelor în soluție. Carboximetilceluloza adăugată în pasta de dinți alături de complexul triclosan/β-CD a îmbunătățit proprietățile acesteia. CD au crescut biodisponibilitatea itraconazolului atât din formele orale cât și din cele parenterale.

CD sunt de asemenea folosite pentru a ameliora iritațiile cauzate de anumite medicamente. Datorită formării comlexului cu CD se poate reduce toxicitatea medicamentului, făcându-l mai potent la doze reduse. Acest lucru a fost pus în practică în cazul gancicloirului, pentru tratamentul citomegalovirusului. Complexarea cu CD i-a crescut potența la doze mici, reducându-i ulterior toxicitatea.

La un studiu pe pacienți tratați cu piroxicam/β-CD (Flamexin) s-a demonstrat incidența scăzută a efectelor gastrointestinale comparativ cu medicamentul administrat în stare liberă. Complexarea cu CD reduce de asemenea iritațiile oculare prin limitarea contactului între medicament și stratul precorneal.

Efecte asupra stabilitații medicamentelor

CD îmbunătățesc stabilitatea medicamentelor la reacții precum deshidratarea, hidroliza, oxidarea sau descompunerea la lumină, mărind astfel termenul lor de valabilitate. Prin încapsulare, moleculele de medicament labile se izolează de diverse procese de degradare, crescându-le astfel stabilitatea. Efectul complexării asupra stabilității medicamentelor poate fi reprezentat prin următoarea ecuație:

Unde k0 este constanta ratei de degradare a medicamentului necomplexat, kobs este constanta ratei de degradare observată în prezența CD, kc este constanta ratei de degradare a medicamentului în prezența CD, Kc este constanta de stabilitate pentru complex, iar [CD] este concentrația CD.

CD măresc permeabilitatea prin mucoase și conferă o absorbție uniformă pentru medicamentele puțin solubile și cu absorbție neregulată. De exemplu, complexarea cu α-CD a albendazolului îi crește atât activitatea antihelmintică a acestuia cât și concentrația plasmatică a metabolitului activ.

Aplicațiile ciclodextrinelor în domeniul farmaceutic

Fiecare moleculă de medicament este practic înconjurată individual de o moleculă de ciclodextrină, putând spune asftel ca o moleculă de substanță activă este încapsulată din punct de vedere microscopic. Această încapsulare duce la îmbunătățirea proprietăților fizice și chimice ale moleculei oaspete.

Stabilizarea substanțelor medicamentoase sensibile la lumină și acțiunea oxigenului

Modificarea reactivității chimice a moleculei oaspete

Fixarea substanțelor volatile

Îmbunătățirea solubilității substanțelor medicamentoase

Transformarea substanțelor lichide în pulberi

Protejarea medicamentului împotriva degradării de către microorganisme

Mascarea mirosului, gustului nedorit, pigmenților sau culorii inestetice a substanțelor medicamentoase

Aceste caracteristici ale ciclodextrinelor le fac potrivite pentru utilizarea lor în diverse domenii precum cel farmaceutic, chimia analitică, agricultură, industria alimentară sau articole cosmetice. În domeniul cosmetic ciclodextrinele sunt utilizate mai ales pentru compușii foarte volatili, deodorantele de cameră sau detergenți a căror cedare controlată depinde de formarea compușilor de incluziune.

Ciclodextrinele au fost luate în calcul și în administrarea pulmonară și anume în afecțiuni ca astmul bronșic, BPOC, ș.a.m.d. Plămânii au o suprafață de absorbție mare, sunt bine irigați și au activitate enzimatică relativ scăzută, toate acestea fiind avantaje în absorbția medicamentelor. Totuși, absorbția pulmonară a medicamentelor poate fi limitată de solubilitatea scăzută a medicamentului.

Particulele insolubile sunt îndepartate din plămân de către clearance-ul mucociliar către căile respiratorii superioare, și de către macrofage în alveole. Aici intervin CD care cresc solubilitatea, stabilitatea și dizolvarea medicamentelor insolubile sau instabile chimic. În plus, prin formarea complexului medicament/CD un medicament poate fi transformat din forma lichidă în forma solidă, doua medicamente incompatibile pot fi mixate într-o pulbere uscată, atât gusurile cât și mirosurile neplăcute pot fi mascate, iar iritația locală de la nivelul plămânilor poate fi mult redusă.

Utilizarea CD

Studiile avansate ale medicamentelor moderne au arătat că eficacitatea multor medicamente a fost îngreunata de diverse obstacole, precum insolubilitatea în apă. Mai mult decât atât, utilizarea lor este restrânsă din cauza instabilității chimice sau fizice, sau a iritațiilor locale provocate. CD pot atenua multe dintre aceste lucruri nedorite. La nivel mondial sunt circa 30 CD folosite, conținând substanțe farmaceutice active în aproximativ 14 tipuri de formulări, incluzând diverse tipuri de tablete (convenționale, masticabile sau sublinguale), capsule orale, soluții parenterale, supozitoare, sprayuri nazale, picături oftalmice sau produse cosmetice.

În produsele parenterale CD sunt folosite pentru a înlocui solvenții organici, pentru a îmbunătăți biodisponibilitatea orală, pentru a reduce iritațiile gastrointestinale și pentru a crește biodisponibilitatea pe cale dermică.

CD se comportă ca încapsulanți moleculari, protejand medicamentele de factorii externi, marindu-le termenul de valabilitate, la produsele cosmetice volatile le împiedică evaporarea și oxidarea, iar la alimentele intens procesate împiedică pierderea gustului, lucru care s-ar datora procedeelor de congelare, decongelare sau cuptorului cu microunde. În Japonia, folosirea CD a fost autorizată de mai bine de două decenii pentru a conserva mai bine alimentele și pentru a masca mirosul uleiului de pește.

Figura 1.7.Cavitatea tridimensională a β-ciclodextrinelor

Abilitatea CD de a forma complecși cu o varietate mare de compuși organici ajută la modificarea solubilității aparente a moleculei, creșterea stabilității compusului în prezența luminii, căldurii sau agenților oxidanți și scăderea volatilității substanței.

Aceste proprietăți cresc importanța folosirii CD în industria alimentară, farmaceutică, agricultură sau în tehnicile cromatografice. În ultimul timp CD au devenit mult mai accesibile ca preț, s-au imbunătățit tehnicile de purificare ale lor și derivaților acestora. Datorită structurii lor arhitecturale unice și proprietăților de complexare, CD au devenit o parte importantă în tehnologie, biocataliză, încapsulare sau eliberare controlată în multe aplicații farmaceutice.

CONTRIBUȚII ORIGINALE

CAPITOLUL 2. STUDII PRELIMINARII ALE SPECIEI CAPSICUM ANNUUM

2.1 GENERALITĂȚI

Scopul acestui studiu a fost investigarea extracției accelerate asistată de ultrasunete și a pulberii uscate. Au fost determinate procentele de apă, materie uscată și pulbere. Analiza FT-IR a confirmat prezența unei clase importante de metaboliți secundari în extracte, și prin intermediul GC-MS s-a identificat un număr considerabil de compuși farmaceutici importanți, inclusiv capsaicina.

Capsaicina (figura 2.1) este un metabolit secundar găsit în diverse specii de ardei iute incluzând Capsicum annum, responsabilă pentru senzația de iuțeală pe care o generează la contactul cu mucoasa bucală. Deși efectele salebenefice au fost observate încă din cele mai vechi timpuri, doar cercetările moderne i-au oferit locul pe care îl merită, clasând-o printre substanțele cupotențial de vindecare mare.

Capsaicina are caracter slab acid datorită grupărilor fenolice, este ușor solubilă în alcool, eter și benzen, greu solubilă în apă și eter de petrol.

Figura 2.1.Structuracapsaicinei

Cercetările asupra capsaicinei și a efectelor sale asupra organismului arată că această substanță este foarte benefică în tratamentul durerilor cauzate de bolile reumatice cronice.

Alt rol al capsaicinei este acela de a stimula sistemul imunitar, ajutând la distrugerea bacteriilor și la inactivarea substanțelor toxice rezultate din deteriorarea celulelor și a reacțiilor alergice.

Cele mai folosite metode pentru a identifica compușii conținuți în diverse specii sunt tehnicile cuplate.

Tehnicile cromatografice s-au dezvoltat în mod rapid și s-au îmbunatațit constant fiind utilizate în toate ramurile de cercetare: de la analiza medicamentelor în fluidele biologice până la analiza metaboliților secundari în extractele din plante.

2.1.1. Materiale și metode

Analiza preliminară

S-au determinat parametri precum procentul de apă, materie uscată și cenușă pentru a determina calitatea produsului cercetat. Acestea oferă informații cu privire la posibilitatea de a menține pulberea de Capsicum annuum pentru o anumită perioadă de timp.

Determinarea procentului de apă, materie uscată și cenușă

Au fost cântărite 3-5 g de material uscat și au fost plasateîntr-un cuptor Termodry DO, încălzit inițial de la 20°Cpână la 40°C, iarapoi, treptat, de la 60°Cla105°Cînprima oră, după care,probeleau fost uscatelao temperaturăconstantă timp de3 ore.

Figura 2.2. Material vegetal înainte și după mojarare

Materialul vegetal uscat rezultata fost introdusîn creuzet șia fostarsla500°Cîntr-un cuptorPyrothermtimp de 4-5 ore.

Extracția asistată de ultrasunete a Capsicum annuum

Pentru a realizaextractele, a fost extras1gdeprobăsub formă de pulberecuobaieBandelinSonorextimp de o oră, folosind ca solvenți de extracțieetanolșiapăînraportde 1:20(m /v). Extractele(figura 2.3) au fost supuse analizeiFT-IR șireziduurilespreanalizăGC-MS.

Figura2.3.Extracte ultrasonicate: 1- Capsicum annum (varietatea roșie, extract etanolic ); 2- Capsicum annum (varietatea roșie, extract apos); 3- Capsicum annum fără semințe și nervuri (varietatea roșie, extract etanolic ); 4- Capsicum annum fără semințe și nervuri (varietatea roșie,extract apos); 5- Capsicum annum (varietatea verde, extract etanolic ); 6- Capsicum annum (varietatea verde, extract apos);

Analiza FTIR

SpectrelepentruextracteledeCapsicumannuumau fost înregistrate peunspectrofotometruAvatar Nicolet cu pastila de KBr, în intervalul4000-400cm-1.

Analiza GC-MS

A fost utilizat un cromatograf de gaz Agilent GC System – 5975CVL-MSD cucoloană capilarănonpolarăAgilent1909, 433(5% -fenilmetilsiloxan, 30,0 cm ×0,25mm×0,25µm).

Gaz purtător: He(99,99%), flux1ml/ min. Temperatura cuptorului a fostsetatăla 70°C timp de2 minuteșiapoiprogramatla270°C,laoratăde20°C/min.Temperatura injectoruluia fost280°C. Mod deinjectare: splitless. Volumulinjectat: 4µl.

Parametriide funcționare: detectorde masă-potențial de ionizarede 70V; Temperaturainterfeței-200°C; Achizițiadespectrea fostîntre 5-80m/z.

2.1.2. Rezultate si discuții

Determinarea procentului de apă, materie uscată și cenușă

Măsurătorileau fost efectuatede trei oripentrufiecareprobă în parte, iar rezultatele(mediaa treideterminări) suntprezentate în Tabelul1.1.Rezultateleau fost consideratevalabileatunci cânddiferențadintreceletreimăsurătoricalculate nua fostmaimare de 0,5%.

Tabel 1.1.Procentul de apă, materie uscată si cenușă din Capsicum annum

Cantitatea de apădin țesuteste variabilă, în funcție deo varietate de factori, cum ar fi condițiilede mediu, etapa de dezvoltarela momentulrecoltării, regiunea, etc.Din rezultatele obținutes-a constatat căproduselepot fi uscateși păstratepentruoperioadădecel puțin2 ani.

Extracția accelerată asistată de ultrasunete

Spre deosebire deextracția cu microundecarenecesităoanumită temperaturălacareanumițimetaboliți sepotdegrada, ei putândfilabilitermic, extracțiaasistată de ultrasunete poate fiefectuatălatemperaturăambiantă.

Timpul necesareste de pânălao oră; prinaceastămetodăpotfiprocesate simultan cantitățimarideprobă, motiv pentru careacestprocedeu a început săfieutilizatlascară industrială.

Caracterizarea FT-IRa extractelor speciei Capsicum annuum

Toatespectrelearatăbenzi de absorbție cu intensitatea înintervalul3355-3345cm-1 pentruvibrațiile de întindere caracteristicegrupărilor H, OHșiNHdin aminoacizi.

La toate probele au fost observate benzi cu intensitate mare la 2924-2930 cm-1datorate νintinderedin -CH (dingruparea -CH3 sau -CH2) prezente în structura acizilor carboxilici. Prezența polifenolilorpoate fi confirmată prin FT-IR prin apariția benzilor de absorbție caracteristice ale grupărilorC-O si–OH în domeniul 1250 – 1500 cm-1 .

Toate probele au arătat o bandă caracteristică în jurul lungimii de undă de 1720 – 1745 cm-1 (ν-C=O).Două vibrații au fost de asemenea observate, una situată în intervalul 1220- 1260 cm-1(νC-O asym) și cealaltă între 1005-1045 cm-1 (νC-O asym). Un peak cu intensitate medie s-a observat la 1454 cm-1fiind caracteristic vibrației de îndoire a grupării C-H.

Conform lui Goodacre, cea mai importantă clasă de metaboliți secundari din planta, polifenolii pot fi recunoscuți cu ajutorul spectroscopieiFT-IR prin prezența unei benzi intense în regiunea 1180-1260 cm-1datoriăa vibrațiilor de întindere (C-C-O)și prin prezența unei benzi cu intensitate mică de îndoire în afara planului (C-H) . Toate spectrele au un aspect similar indiferent de probă analizată. În figurile 3-4 sunt aratate două dintre spectrele obținute pentruCapsicum annumvarietatea roșie și verde.

Figura2.4. FT-IR spectrul pentruCapsicum annumfara seminte si nervuri (varietatea roșie)

Figura 2.5.Spectrul FT-IR pentruCapsicum annum (varietatea verde)

Analiza GC-MS

Gaz-cromatogramele obținute pentru extractele de Capsicum annumprezintă numeroase peak-urifără o separare netă între ele care nu ar putea fi atribuite fără cuplarea cu spectrometria de masă. Cea mai simplă metodă de analiză a extractelor din plante se face prin metoda scanării complete sau prin TIC (Total Ion Count).În acest caz este posibil ca peak-urile cu rezoluție mică din cromatograma să nu fie separate corect.

Atribuirea peak-urilor cromatografice a fost realizată prin compararea spectrelor de masă a unor compuși de referință cu structura cunoscută stocați în baza de date (biblioteci spectrale) sau prin compararea cu cele raportate în literatura de specialitate .Se poate observa că aceasta specie este bogată în metaboliti secundari, similar cu alte plante medicinale.Dintre metaboliții secundari identificați înCapsicum annumși care au un spectru larg de activități biologice pot fi amintiți :acidul palmitic(acidul hexadecanoic), acidul stearic (acidul octadecanoic), acidul 9Z, 12Z-octadecadienoic si linolenic(acidul docosanoic), acizi grași nesaturați. Acești compuși au fost testați pentru activiațile lor antimicrobiene, antiinflamatoare, antioxidanta, anti-cancerigenași hepatoprotectoare.

Dintre aceștia acidul octadecanoic (acidul stearic) a fost testat și s-a dovedit ca scade fracția de colesterolulLDL din organism (figura 2.6).

Figura2.6. Gaz-cromatogramaCapsicum annum (varietatea rosie)

Figura 2.7.Gaz-cromatogramaCapsicum annum (varietatea verde)

Aceasta analiza a permis identificarea, cu o probabilitatea destul de ridicata, a unui numar crescut de compusi.

Figura 2.8.Spectrul de masa al capsaicinei din pulpa deCapsicum annum

Figura 2.9.Spectrul de masă al acidului octadecanoic din pulpa deCapsicum annum

2.2. DETERMINAREA POLIFENOLILOR DIN EXTRACTELE SPECIEI CAPSICUM ANNUUM ȘI EVALUAREA INVITRO A ACTIVITĂȚII ANTIOXIDANTE

2.2.1. GENERALITĂȚI

Planteleconțin o multitudine de substanțe capabile să neutralizeze speciile reactive de oxigen aflate în exces în organism: polifenoli, flavonoide, vitamine și terpenoide.Acestea sunt denumite în mod generic antioxidanți naturali și efectele lor în ceea ce privește prevenția și tratamentul bolilor cauzate de speciile reactive de oxigen fiind intens studiate.

Polifenolii prezintă aceste proprietăți datorită caracterului reducător al grupării fenolice.În mod frecvent cercetătoriis-au reîntors către studiul antioxidanților naturali și, în acest fel numeroase fitoextracte au fost analizate în vederea stabilirii activității lor antioxidante.

Cromatografia de lichide de înalta performanță cuplată reprezintă o tehnică de separare potrivită pentru analiza unor amestecuri complexe, așa cum sunt extractele din plante,, metoda fiind aplicată cu succes în determinarea cantitativă a mai multor clase de compuși.

Scopul acestui studiu a fost determinarea profilului farmacologic al extractelor de Capsicum annuumîn funcție de conținutul lor polifenolic precum și determinarea in vitro aactivității lorantioxidante.

2.2.2. MATERIALE ȘI METODE

Material vegetal

Din flora cultivată au fost selecționate ardei aparținând specie Capsicum annuumdinCraiova,Dolj, Româniași au fost uscate la temperatura camerei timp de 20 de zile la temperatură și umiditate constantă.

Prepararea extractelor

1g de material uscat fin pulverizat (cântărit la balanța analitică cu acuratețe de0.0001 g) a fost supus extracției accelerate asistată de ultrasunete timp de 1 oră la temperatura camerei folosind o baieBandelin Sonorex.În procesul de extracție s-au folosit ca solvențiapa și etanolul în raport de 1:20 (m/v).

Pentru testele HPLC s-au folosit numai extracte alcoolice.

Analiza HPLC

Pentru determinarea polifenolilor s-a folosit un sistem de cromatografie lichidă Thermo-Surveyor HPLC cu următoarele caracteristici:

Pompă cuaternară Finnigan Surveyor Plus LCPMPP cu degazare;

autosampler – Finnigan Surveyor Plus ASP termostat Peltier;

Detector Surveyor "Diode Array" PDA5P;

Coloană5µmHypersil HyPurity 250 x 4.6 mm, 5µm;

Software Chrom Quest 4.2 pentru controlul dispozitivului, pentru datele de achiziție și de procesare.

Metoda folosită a fost publicatăîn literatura de specialitate, iar parametri operaționali au rămas nemodificați pentru a putea doza un număr mare de polifenoli.

– s-a folosit o coloană Hypersil Gold C185 µm (250 mm x 4.6 mm) la temperatura de 20oC;

– faza mobilă: 0,5% acetic acid în apă (A), acetonitril (B) în gradient de eluție (începând de la90% A -10 % B timp de 20 minute, 60%A – 40% B în urmatoarele 40 minute. Procentul soluției A a fost redus și menținut la 55% în urmatoarele 10 minute, crescând apoi gradual la 90% și menținut la această valoare în ultimele 5 minute ale analizei pentru a reechilibra coloana.

– debitul: 1 mL/min și volumul de injecție: 5 µL;

– detecția UV-VIS, =278 nm;

Activitatea antioxidantă

1. Conținutul total de polifenoli

Conținutul total de polifenoli a fost determinat folosind metoda Folin-Ciocalteu. Curba de calibrare (ecuația de calibrare:y=0.010x, R² = 0.998) a fost reprezentată grafic folosind o soluție stoc de acid galic (1000 mg/L în apă) and iar rezultatele au fost exprimate în mg/L echivalentacid galic (GAE) al extractelor preparate. Intervalul de concentrații ale standardelor a fost între 0-250 mg/L acid galic.Rezultatele au fost citite spectrofotometric la 765 nm.

Au fost luați 200 μL din extractele obținute peste care s-au adăugat2.5 mL reactiv Folin – Ciocalteu diluat 1:10. După 4 minute, s-au adăugat peste fiecare probă câte 2 mL carbonat de sodiu (75 g/L) si fiecare probă a fost lasată ulterior la temperatura camerei timp de 2 ore (23°C).

Intensitateaculoriicomplexuluialbastruformat cucompușiiantioxidanțieste direct proporțională cuconcentrațiilede compușipolifenolici conținuți.

2. Conținutul total de flavonoide

Conținutul total de flavonoide a fost determinat cu ajutorul unei soluții de AlCl3 10 %(Roy et al., 2010), prin determinarea maximului de absorbție al al soluțiilor colorate obținute, bazate pe curba de calibrare. Din fiecare extract etanolic au fost luați 0.5 mL si amestecați cu 1.5 mL etanol, 0,1 mL acetat de potasiu, 0,1 mL 10% AlCl3, și 2,8 mL apă bidistilată. Amestecurile astfel obținute au fost ținute la temperatura camerei timp de 30 de minute, apoi s-a măsurat absorbanța la 415 nm. Curba de calibrare (R² = 0.998) a fost trasată folosind soluția standard de quercetină (cu concentrațiiîntre 0-100 mg/L quercitină). Conținutul total de flavonoide a fost exprimat în mg/quercitină echivalent (QE) în extractele preparate.

3. Activitatea antioxidantă totală

Activitatea antioxidantă totală a fost determinată folosind radicalul DPPH∙(2,2-difenil-1- picril hidrazil). Conform procedurii lui Oliveira et al., 2008 schimbarea colorației de la albastru la galben a fost măsurată la 517 nm. Astfel, 0.05 mL de probă a fost amestecată cu 2.9 mL 0,004% soluție metanolica DPPH.Probele au fost lăsate timp de 30 de minute la temperatura camerei.S-a citit absorbanța față de martor la 517 nm.

Curba de calibrarea fost trasatăcutroloxîn intervalul0-2,5mm /Ltrolox(y =-0,434x+1244, radicalul R=0.997). Activitatea antioxidantăa fost exprimatăînechivalentTrolox, TEAC.

Substanțe și reactivi

Substanțele chimiceșireactiviiau fostprocuratede laSigma-Aldrich, MercksauFlukașiau fost de o puritate c gradanalitic.

2.2.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Analiza HPLC

Au fost identificați și analizați unsprezeceaciziderivațide la acidulhidroxicinamicșicinciflavonoideînextracteledeardeiroșu și verde(tabele 2.1-2.4).

Cea mai mare cantitate a fost gasită pentru acidul elagic (27 mg/Lla ardeiul roșu, 204 mg /Lîn pasta de ardei roșu fără semințe și nervuri și 20 mg / Lla ardeiul verde uscat). Acidul galic a fost găsit în cantități mai mari în ardeiul verde uscat, comparativ cu varietatea roșie.

Din analizacromatogramelor obținute pentrucele patruextracte(figurile2.10-2.14) se poate observacăcel mai mare conținutde polifenolia fostgăsit înardeiul roșu, acest conținut scăzând semnificativ după eliminarea semințelor și al nervurilor.

Figura 2.10. CromatogramapentruCapsicum annuum (varietatea roșie)

Tabel 2.1.Polifenolii determinați în Capsicum Annuumvarietatea roșie

Figura2.11. Cromatogramaobținută pentru Capsicum annuum

(varietatea roșie, fără semințe și nervuri)

Tabel 2.2.Polifenolii determinati pentru Capsicum annuum

(varietatea roșie, fără semințe și nervuri)

Figura 2.12.Cromatogramapentru Capsicum annuum (varietatea verde)

Tabel 2.3. Polifenolii determinați pentru Capsicum annuum (varietatea verde)

Figura 2.13. Cromatogramaobținută pentru Capsicum annuum

(varietatea verde, fără semințe și nervuri)

Tabel 2.4.Polifenolii determinați pentru Capsicum annuum

(varietatea verde, fără semințe și nervuri)

Activitatea antioxidantă

Au fost determinate atât conținutul total de fenoli și flavonoide, cât și capacitatea antioxidantă pentru cele patru extracte prezentate în tabelul 2.5. Conținutul total de polifenoli și flavonoide este extrem de ridicat, chiar și comparație cu alte specii de plante medicinale recunoscute pentru activitatea lor antioxidantă,. La această specie cantitatea compușilor fenolici variază odată cu culoarea, cercetările nostre demonstrând o acumulare semnificativă în ardeiul verde uscat.

Table 2.5.Proprietățile antioxidante ale extractelor deCapsicum annuum

Testul DPPH este o metodă simplă și rapidă, utilizată pe scară largă ca fiind o metodă bună de estimat totalul capacității antioxidante a amestecurilor complexe.În această categorie intră și extractele din plante. 1,1-difenil-2 hidrazil picril este un radical stabil de culoare violetă, care, după reducere devine galben. Schimbareadecolorațiea putut fi măsuratăspectrofotometric.

În ceea ce privește proprietățile reducătoare, organele vegetative aparținând specie Capsicum annuumstudiate pot fi ordonate după cum urmează: ardeiuscatverde>ardeiverde pastă>ardeiroșu întreg>ardei roșu pulpa.

2.3. DETERMINAREA ACTIVITĂȚII ANTIMICROBIENE ȘICITOTOXICE A EXTRACTELOR ALCOOLICE

Obiective:

Determinarea calitativă și cantitativă a proprietăților antimicrobiene prin metoda difuzimetrică și prin metoda diluțiilor succesive binare în mediu lichid.

Evidențierea cantitativă a gradului de aderență la substratul inert al microorganismelor după tratarea cu extracte vegetale.

Determinarea citotoxicității extractelor vegetale față de celulele eucariote.

2.3.1. Materiale și metode

Tulpini microbiene: s-au utilizat tulpini microbiene de referință ce aparțin unor specii bacteriene Gram – pozitive (Staphylococcus aureus ATCC 29213, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus subtilis ATCC 6633) și Gram – negative (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 8730).

Extracte utilizate:

1 –Capsicum roșu uscat întreg 1:20 (m:v) alcool

2 – Capsicum roșu uscat întreg 1:20 (m:v) apă

3 – Capsicum roșu uscat fără semințe și nerv 1:20 (m:v) alcool

4 – Capsicum roșu uscat fără semințe și nerv 1:20 (m:v) apă

5 – Capsicum verde crud 1:20 alcool

6 – Capsicum verde crud 1:20 apă

7 – 1 alcool 1:20

8 – 2 alcool 1:20

9 – α CD alcool 1:20

10 – capsaicin alcool 1:20

11 -1 apă 1:20

12 – 2 apă 1:20

13 – α CD apă 1:20

14 – capsaicin apă 1:20

Determinarea calitativă a activității antimicrobiene a extractelor de capsaicină

Determinarea calitativă a activității antimicrobienea fost efectuată folosind metoda difuzimetrică. Au fost pregătite cutii Petri cu 20 ml mediu solid PCA (Plate Count Agar), acestea au fost însămânțate “în pânză” cu suspensii 0,5 McFarland (1,5 x 108 UFC/ml).

Suspensiile microbiene au fost realizate din culturi tinere, de 18-24h, cultivate anterior procedurii, pe mediu solid PCA. După înocularea plăcilor, pe suprafața lor au fost repartizați câte 5 µl de extract, respectiv solvenți, direct pe mediul de cultură sau pe un disc de hârtie de filtru de 6 mm diametru sterilizat în prealabil.

După însămânțare, plăcile de PCA au fost lăsate la temperatura camerei timp de 10 – 20 de minute pentru a se asigura difuzia, apoi au fost incubate timp de 24 de ore la 37șC, cu capacul în jos. Citirea rezultatelor s-a realizat prin măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție generate, cu ajutorul unei rigle gradate. Dacă tulpina este sensibilă la extractele testate, creșterea microbiană va fi inhibată în jurul discului, suprafața fiind denumită zonă de inhibiție a creșterii.

Determinarea cantitativă a activității antimicrobiene

Determinarea cantitativă a activității antimicrobiene a fost efectuată prin metoda microdiluțiilor binare succesive în mediu lichid, ce a permis determinarea concentrației minime inhibitorii (CMI). Pentru determinarea CMI au fost utilizate plăci cu 96 de godeuri, iar dinsoluțiile stoc au fost efectuate 10 diluții binare în mediu TSB (Tryptic Soy Broth) într-un volum total de 200 µl. Apoi, în fiecare godeu au fost inoculate în raport 1:5 față de mediul de cultură, suspensiile bacteriene (densitate 0,5 McFarland), plăcile astfel pregătite fiind incubate 24 h la 37oC.

Suspensiile bacteriene au fost realizate din tulpini tinere, de 18-24h, dezvoltate anterior procedurii, pe mediu de cultură PCA. La sfârșitul perioadei de incubare s-au analizat rezultatele obținute prin măsurarea absorbanței la 600 nm (Apollo LB 911 ELISA reader).

c)Determinarea citotoxicității

Materiale si metode

În acest scop au fost însămânțate monostraturi de celule HACAT (o linie de keratinocite aneuploide modificate din pielea unei persoane adulte) pe o placăcu 24 de godeuriși s-au tratattimp de 24hcu10 µl deextractalcoolic(1:20). MorfologiacelulelorHaCaTfost examinatășifotografiată lamicroscopinversat.

Rezultate si discuții

Control

Capsicum annuum (varietatea roșie)

Capsicum annuum (varietatea roșie, fără semințe și nervuri )

Capsicum annuum (varietatea verde)

Capsaicina

Figura 2.14.Imagini tipice de microscopie inversată ale celulelorHaCaTtratate timp de 24de orecu10 µl cuextractealcoolice(1:20) (x200).

Concluzii

Înconcluzie, rezultateleacestui studiurelevăcăextractelealcooliceCapsicum annuumprezintă proprietățiantioxidantesemnificative.Mai mult decât atât, activitatea antibacterianăa extractelortestate a fostsemnificativ mai mareîn comparațiecu standardul de capsaicinăutilizat camartor pozitivfață de tulpinile de Enterococcus faecalis, E.colișiBacillussubtilisșisimilară cucapsaicinapentrutulpina deStaphylococcus aureus. Rezultatele citotoxicității in vitroau arătat o bună biocompatibilitate pentru extractele testate, nealterând morfologia celulelor HaCaT.

Luate împreună, datorită acestor proprietăți biologice extractele pot fi utilizate în diferite aplicații biomedicale, ca agenți antireumatici, agenți antiinflamatori sau antimicrobieni.

2.3.2. Rezultate și discuții

Determinarea calitativă a proprietăților antimicrobiene prin metoda difuzimetrică

Tulpinile microbiene testate au prezentat sensibilitate exclusiv la acțiunea extractelor alcoolice (Fig. 1-4).Extractul 1 (Capsicum roșu uscat întreg) a fost cel mai activ asupra tututror tulpinilor testate, cu excepția B. subtilis, față de care extractul 10 (capsaicină) a fost cel mai eficient.

Figura 2.15. Metoda calitativă de testare a sensibilității tulpinii Bacillus subtilis

la acțiunea extractelor de capsaicină

Figura 2.16. Metoda calitativă de testare a sensibilității tulpinii Enterococcus faecalis la acțiunea extractelor de Capsicum annuum și capsaicină

Figura 2.17. Metoda calitativă de testare a sensibilității tulpinii Staphylococcus aureus la acțiunea extractelor deCapsicum annuum și capsaicină

Figura 2.18. Metoda calitativă de testare a sensibilității tulpinii Pseudomonas aeruginosa la acțiunea extractelor deCapsicum annuum și capsaicină

Figura 2.19. Metoda calitativă de testare a sensibilității tulpinii Escherichia coli la acțiunea extractelor deCapsicum annuum și capsaicină

Determinarea cantitativă a proprietăților antimicrobiene prin metoda diluțiilor succesive binare în mediu lichid

Determinarea cantitativăa activității antimicrobiene a extractelor alcoolice care s-au dovedit active la testarea calitativă a revelat activități diferite, în funcție de tulpina microbiană și extractul testat (Fig. 5-8).

Toate extractele alcoolice s-au dovedit eficiente față de tulpina B. subtilis, cea mai intensă activitate fiind obținută pentru C7 și C4.

Figura 2.20. Reprezentarea grafică a nivelului de inhibiție a creșterii B. subtilis în prezența diferitelor concentrații binare (D1-1mg/ml) ale extractelor testate

C1 –Capsicum roșu uscat întreg 1:20 (m:v) alcool

C2 – Capsicum roșu uscat fără semințe și nerv 1:20 (m:v) alcool

C3 –Capsicum verde crud 1:20 alcool

C4 – 1 alcool 1:20

C5 – 2 alcool 1:20

C6 – α CD alcool 1:20

C7 – capsaicin alcool 1:20

C8 –alcool

Toate extractele alcoolice s-au dovedit ineficiente față de tulpina de S. aureus concentrațiile obținute fiind mai mari decât cea a DMSO.

Figura 2.21. Reprezentarea grafică a nivelului de inhibiție a creșterii S. aureus în prezența diferitelor concentrații ale extractelor testate (D1-1mg/ml). C1- Capsicum roșu uscat întreg 1:20 (m:v) alcool; C2- Capsicum roșu uscat fără semințe și nervuri 1:20 (m:v) alcool; C3- Capsicum verde crud 1:20 alcool; C4-1 alcool 1:20; C5-2 alcool 1:20; C6- αCD alcool 1:20;C7 – capsaicin alcool 1:20; C8 – alcool.

În cazul tulpinii de Enterococcus faecalis, toate extractele exceptând C7 au fost active la cele mai mari concentrații testate.

Figura 2.22. Reprezentarea grafică a nivelului de inhibiție a creșterii Enterococcus faecalis în prezența diferitelor concentrații ale extractelor testate (D1- 1mg/ml). C1 – Capsicum roșu uscat întreg 1:20 (m:v) alcool; C2 – Capsicum roșu uscat fără semințe și nerv 1:20 (m:v) alcool; C3 – Capsicum verde crud 1:20 alcool; C4 – 1 alcool 1:20; C5 – 2 alcool 1:20; C6 – α CD alcool 1:20; C7 – capsaicin alcool 1:20; C8 –alcool.

Extractele C3, C4, C5 , C6 si C8 au prezentat activitate față de tulpina de E. coli

Figura 2.23.Reprezentarea grafică a nivelului de inhibiție a creșterii E. coli în prezența diferitelor concentrații ale extractelor testate (D1- 1mg/ml). C1 – Capsicum roșu uscat întreg 1:20 (m:v) alcool; C2 – Capsicum roșu uscat fără semințe și nerv 1:20 (m:v) alcool; C3 – Capsicum verde crud 1:20 alcool; C4 – 1 alcool 1:20; C5 – 2 alcool 1:20; C6 – α CD alcool 1:20; C7 – capsaicin alcool 1:20; C8 –alcool.

Extractele C4, C5, C7 și C8 au manifestat activitate față de tulpina de P. aeruginosa.

Figura 2.24. Reprezentarea grafică a nivelului de inhibiție a creșterii P. aeruginosa în prezența diferitelor concentrații ale extractelor testate (D1- 1mg/ml). C1 – Capsicum roșu uscat întreg 1:20 (m:v) alcool; C2 – Capsicum roșu uscat fără semințe și nerv 1:20 (m:v) alcool; C3 – Capsicum verde crud 1:20 alcool; C4 – 1 alcool 1:20; C5 – 2 alcool 1:20; C6 – α CD alcool 1:20; C7 – capsaicin alcool 1:20; C8 –alcool.

Analiza comparativa a valorilor CMI obținute pentru toate extractele alcoolice față de cele 5 tulpini microbiene a relevat faptul că extractul C4 s-a dovedit cel mai activ, cu valori CMI foarte mici, față de 3 dintre cele 5 tulpini testate urmate de C7 si C8 cu valori CMI reduse față de 2 din cele 5 tulpini testate (Tabelul 2.6).

Tabelul 2.6.Reprezentarea valorilor cocentrațiilor minime inhibitorii exercitate de extracte

Toate extractele testate au prezentat o bună biocompatibilitate, după cum s-a observat și la analiza microscopică, celuleleHACATfiind ferm atașate, cuomorfologiesimilară cu cea observatăîncondiții standardde creștere(Fig. 6). Colorația dublă cu IP si Hoechst a evidențiat de asemenea faptul că celulele HACAT și-au păstratviabilitatea în prezența extractelor testate.

Control –celule HACAT

Celule HACAT tratate pentru 24 de ore cu extract de Capsicum annuum (varietatea roșie)

Celule HACAT tratate pentru 24 de ore cu extract de Capsicum annuum (varietatea roșie, fără semințe și nervuri)

Celule HACAT tratate pentru 24 de ore cu extract de Capsicum annuum (varietatea verde)

Celule HACAT tratate pentru 24 de ore cucapsaicina

Fig. 6.Imagini tipice de microscopie inversată ale celulelorHaCaTtratate timp de 24de orecu10 µl de extractealcoolice(1:20) (x200).

Fig. 7.Imagini de microscopie de fluorescență ale celulelor HACAT tratate pentru 24 de ore cu extracte alcoolice și colorate cu iodurăde propidiu (IP) (pentru evidențierea celulelor moarte colorate în roșu) și cu Hoechst (H) (pentru vizualizarea celulelor vii, colorate în albastru).

Concluzii

Înconcluzie, rezultateleacestui studiurelevăcăextractelealcooliceCapsicum annuumprezintă proprietățiantioxidantesemnificative. Mai mult decât atât, activitatea antibacterianăa extractelortestate a fostsemnificativ mai mareîn comparațiecustandardulde capsaicinăutilizat camartor pozitivfață de tulpinile de Enterococcus faecalis, E.colișiB.subtilisșisimilară cucapsaicinapentrutulpina deS. aureus. Rezultatele citotoxicității in vitroau arătat o bună biocompatibilitate pentru extractele testate, nealterând morfologia celulelor HACAT. Datorită acestorproprietățibiologiceextractele pot fi utilizate în diferite aplicații biomedicale, ca agenți antireumatici, agenți antiinflamatori sau antimicrobieni.

CAPITOLUL 3. DETERMINAREA CAPSAICINEI DIN CAPSICUM ANNUUM PRIN METODA HPLC

3.1. GENERALITĂȚI

Capsaicina a fost utilizată din cele mai vechi timpuri de către oameni ca și condiment sau medicament, și a fost subiectul unor numeroase lucrări de specialitate,.

Din punct de vedere structural, este un alcaloid gras, solubil în alcool și solvenți organici (Figura3.1),și foarte puțin solubil în apă.

Figura 3.1.Structura capsaicinei

Aplicațiile topice ale capsaicinei ca extract alcoolic din ardeiul iute au fost inițial folosite în tratamentul arsurilor. Activitatea farmacologică a capsaicinei și a receptorilor ei primari au fost analizați pe scară largă, capsaicina fiind un agonist exogen extrem de selectiv și potent pentru receptorul TRPV1, un canal transmembranar ion-receptor care oferă răspunsuri integrate în funcție de temperatură, pH și lipidele endogene.

Optimizarea formulării farmaceutice a capsaicinei din produsele utilizate în aplicațiile topice sau din alte analgezice dar cu puține efecte adverse este limitată de concentrația de substanță activă din produs datorită efectului pungent pe care aceasta îl are.

Cremele, loțiunile și plasturii care conțin pînă la 0.1%capsaicină pot fi aplicate pe o perioadă cumprinsă între 2 și 6 săptămâni în tratamentul durerilor neuropatice și musculo-scheletale cauzate de osteoartrită, în tratamentul nevralgiilor postherpetice și în neuropatia diabetică dureroasă.

Alte utilizări farmaceutice ale capsaicinei includ: stimularea sistemului imunitar, scăderea în greutate, în tratamentul diverselor afecțiuni respiratorii, efect vasodilatator, în scăderea colesterolului sau prevenția cancerului.

Cromatografia lichidă de înaltă performanță este o metodă aplicată cu succes prin cuplarea cu spectroscopia UV sau cu spectrometria de masă (MS) în vederea cuantificării metaboliților secundari .

În ultimii ani conținutul în capsaicină din diverse specii de ardei aparținând genului Capsicum a fost determinat prin diverse metode HPLC. Astfel, Thapa și colaboratorii (2009) a determinat capsaicina din 16 tipuri de ardei prin HPLC cuplat cu detecșie UV, după aplicarea în prealabil a unei proceduri de extracție în fază solidă .

3.2. MATERIALE ȘI METODE

Material vegetal

Materialul brut a fost cules din flora cultivată. Fructele deCapsicum annuumau fost identificate și notate cu două vouchere. După culegere, probele au fost curățate și spălate cu apă bidistilată iar părțile afectate au fost îndepărtate. O parte din material a fost uscat la aer într-o cameră întunecată, cu umiditate și temperatură constantă. După uscare, probele au fost măcinate într-o râșniță metalică din oțel inoxidabil astfel încât să fie evitate procesele oxidative.

Extracția capsaicinei din materialul uscat și din materialul crud

Pentru o extracție cantitativă a capsaicinei s-a folosit un gram de probă (ardei roșu uscat și ardei verde uscat și crud) și a fost supusă ulterior extracției cu ultrasunete folosind etanolul ca solvent.Raportul extractiv a fost de 1:20 (m/v).Extracția a fost realizată la o temperatură de 60°C timp de o oră.Materialul vegetal crud a fost transformat în pastă cu ajutorul unui dezintegrator.

Echipament

Echipamentul folosit a fost un sistem Thermo-Surveyor HPLC cu următoarele caracteristici:

Pompă cuaternară Finnigan Surveyor Plus LCPMPP cu degazare;

autosampler – Finnigan Surveyor Plus ASP termostat Peltier;

Detector Surveyor "Diode Array" PDA5P;

ColoanăHypersil HyPurity 250 x 4.6 mm, 5µm;

Software Chrom Quest 4.2 pentru controlul dispozitivului, pentru datele de achiziție și de procesare.

Procedura experimentală

Parametri operaționali aimetodei stabilite sunt: temperatura: 25°C; eluția izocratică; faza mobilă a fost constituită din: apă: acetonitril 50:50; debitul fazei mobile – 1 mL/min; volumul injectat – 5 µL; detecție UV-VIS la=205 nm, =228 nm,=278 nm;

Toate substanțele folosite au fost de puritate analitică.

3.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Deși sinteza unor compuși similari structural cu capsaicină (capsaicinoide și capsinoide)dar care nu au gust arzător a fost dezvoltată, totuși proprietățile curative ale acestor compuși nu au putut fi stabilite.

Material vegetal

Prepararea și extracția probelor are un rol crucial în obținerea de rezultate reproductibile.Culegerea fructelor a fost făcută în a 7-a zi de dezvoltare când capsaicina a atins concentrația maximă.

Metodă

Pentru a stabilitimpul de retențieșilungimea de undăpentruidentificareașicuantificareacapsaicinei, am trasat cromatogramapentruo soluție standard(la oconcentrațiede 75mg/l) (Figura 3.2).

Timpul de retențiealcapsaicinei de până la 15minute constituieunavantaj, deoarece ne oferă un timpscurtde analiză.

Figura3.2. Cromatograma obținută pentru soluția standard de capsaicină

În spectrul compusului pur (75 mg / L) s-au observat trei peak-uri la =204 nm, =227 nm,=280 nm (figure 3.3).

Figure 3.3.Spectrul UV-VIS al capsaicinei pure

Curba de calibrareutilizată pentru determinareacapsaicineidin extractele vegetaleeste prezentată în figura3.4.Metodautilizatăareopreciziefoartebună(redresareavariazăîntre96-103%) iar curba de calibrareareobună liniaritate.

Figura 3.4.Curba de calibrare obținută la determinarea HPLC a capsaicinei

Dupătrasarea curbeide calibrare, extracteleobținuteau fost supuse analizeiHPLC.

Figura3.5.Cromatogramaextractului de ardei rosu(fără semințe, cu nervuri)

Figura3.6.Spectrele UV-VIS suprapuse ale compusului pur și ale extractului de capsaicină

Figura 3.7.Cromatogramaextractelorde ardeiverde(material crud)

Figura 3.8.Cromatogramaextractuluide ardeiverde(materialul uscat)

Figura3.9.Cromatogramaextractelorde ardei roșu(pulpa cusemințe șinervuri)

RezultateledeterminariiHPLCale capsaicineidinardeiulroșu șiverdesunt prezentate în tabelul3.1.

Table 3.1.Conținutul de capsaicinădin Capsicum annuum

Cel mai mare conținut a fost găsit în ardeiul verde uscat (85.262 mg /L) urmat de ardeiul roșu căruia i s-au înlăturat anterior semințele și nervurile (75.457 mg / L).Rezultatele sunt în concordanță cu cele din literatura de specialitate.De exemplu Musfiroh și colaboratoriiau găsit aceleași rezultate surprinzătoare, capsaicina se găsește în cantitate mai mare în ardeii verzi decât în cei roșii, de la aceeași specie (Capsicum frutescens).Extracția asistată de ultrasunete a ajutat la extracția unor cantități mari de compuși, așa cum s-a scris și în literatura de specialitate.

CAPITOLUL 4. SINTEZA ȘI CARACTERIZAREA UNUI COMPLEX α-CICLODEXTRINĂ-CAPSAICINA

4.1.SINTEZA COMPLEXULUI CAPSAICINĂ-α–CICLODEXTRINĂ ÎN FAZĂ LICHIDĂ

4.1.1. Materiale și metode

Sinteza complexului α-ciclodextrină-capsaicină în soluție a fost realizată în felul următor:Inițial s-au calculatmasele moleculare ale ciclodextrinei și respectiv capsaicinei:

MαCD = 972g/mol;

Mcapsaicina = 305g/mol;

Am dizolvat 9,72mg α-CD în 10 mL soluție apoasă (apa a fost ușor încălzită în prealabil pentru a facilita solubilizarea).

S-au cântărit 3,05mg capsaicină și s-au preparat 10 mL soluție apă-alcool etilic (v:v=7:3). La soluția de medicament s-a adăugatun exces de capsaicină, cantitatea totală adăugată de capsaicină fiind de aproximativ ~ 5mg. După adiția excesului de capsaicină s-au complexat 0,305mg capsaicină/mL.

4.1.2. Rezultate și discuții

Diverse metode pot fi aplicate pentru a prepara complecși medicament / ciclodextrină, inclusiv metoda soluție, metoda co-precipitare, metoda de neutralizare, metoda suspensie, metoda frământare, sau metoda de măcinare. În cele mai multe cazuri prezența apeieste esențială pentru formarea complexului de succes. În soluție, complecșii medicament-ciclodextrină se prepară de obicei prin adăugarea unui exces de cantitate de medicament la o soluție apoasă de ciclodextrină. Suspensia formată este adusă la temperatura dorită și apoi filtrată sau centrifugată pentru a forma complecșii. Pentru prepararea complecșilor solizi, apasau respectiv solventul utilizat este îndepărtată din faza lichidă a soluției de medicament/ciclodextrină prin evaporare (la etuvă) sau sublimare (liofilizare).

Din mai multe motive, cum ar fi izotonicitatea parenteralăeste important să se includă cât mai puțină ciclodextrină într-o formulare farmaceutică. Diferite metode au fost aplicate pentru a spori eficacitatea de complexare, printre care enumerăm adăugarea de polimeri, ionizarea medicamentului cu formarea de sare, adăugarea de acizi hidroxi carboxilici la mediul de complexare, adăugarea de acizi volatili sau baze, adăugarea de săruri organiceprecum și adăugarea de co-solvenți.

4.2. CARACTERIZAREA FT-IR A COMPLEXULUI

4.2.1. Materiale și metode

Analiza s-a realizat pe un spectrofotometru Avatar Nicolet cu pastilare KBr, spectrele fiind înregistrate în intervalul 500-3000 cm-1. S-au înregistrat spectrele atât pentru capsaicină pură cât și pentru complexul obținut.

4.2.2. Rezultate

Spectrofotometria FT-IR nu poate oferi rezultate cantitative în această situație ci doar informații preliminare calitative. S-a constatat prezența în spectrul pur al capsaicinei al unor picuri datorate vibrației de întindere -C=O (1636 cm-1). Același pic poate fi observant și în spectrul complexului, la aproximativ aceeași lungime de undă (1636 cm-1), așa cum este ilustrat în figura 4.1.

Literatura de specialitate mai menționează alte câteva benzi caracteristice capsaicinei (N-H întindere – 3310 cm-1, vibrația de întindere a legăturii aromatice C-C la lungimea de undă de 1596 cm-1 și vibrația de îndoire C-Hdin afara planului la 806 cm-1 care însă nu sunt ușor vizibile datorită cantității reduse de capsaicină complexată.

Figura 4.1. Spectrul FT-IR al extractului de Capsicum annum

Lungimea de undă la care apare vibrația de întindere a grupării carbonilice din structura capsaicinei rămîne practic neschimbată, acest fapt datorându-se lipsei legăturilor coordinative din complex, acesta fiind un complex de incluziune, in care 1 moleculă de capsaicină este inclusă în α ciclodextrină.

A

B

C

Figura 4.2.a)Suprapunerea spectrului capsaicinei pure (roșu) cu cel al complexului α CD-capsaicină (albastru);b) Spectrul capsaicinei; c) Structura capsaicinei

În figura 4.3este ilustrat cu scop comparativ și spectrul α-CD simple (necomplexată)

Figura 4.3. Spectrul FT-IR pentru α-CD

4.3. CARACTERIZAREA PRIN SPECTROMETRIE UV-VIS ȘI PRIN SPECTROMETRIE DE FLUORESCENȚA A COMPLEXULUI

4.3.1. Materiale și metode

Pentru caracterizarea complexului prin spectrometrie UV-VIS și spectrometrie de fluorescență s-au folosit următoarele aparate:

Fluorescența:Jasco FP-6300 spectrofluorometer,

Absorbție: Jasco V-560 UV-VIS spectrophotometer

4.3.2. Rezultate și discuții

Proprietățile fizico-chimice ale moleculei de capsaicină libere sunt diferite de cele legate de ciclodextrină.De asemenea, proprietățile fizico-chimice ale moleculelor ciclodextrinelor suntdiferite de cele din complexul α ciclodextrină-capsaicină. Teoretic, orice metodologie care poate fi folosită pentru a observa aceste schimbări în proprietățile fizico-chimice aditive poate fi utilizată pentru a determina stoichiometria complecșilor formați și valorile numerice ale constantele lor de stabilitate.

Aceste proprietăți includ modificări ale solubilitatea, schimbări ale reactivității chimice, modificări ale spectrelor UV/VIS, modificări ale spectrelor de fluorescență sau RMN, sau chiar modificări ale retenției de medicament (de exemplu în cromatografia de lichide), modificări ale valorilor pKa, masurători potentiometrice, modificări ale stabilității și ale permeabilității capsaicinei prin membraneleartificial. Higuchi și Connorsau clasificat complecșii pe baza efectului lor asupra solubilității substratului.

Astfel, există situații în care solubilitatea substratului (capsaicina) crește cu creșterea concentrației ligandului în soluție (ciclodextrina):

În această situație constanta de stabilitate (K1:1) a complexului poate fi calculată din panta și solubilitatea intrinsecă a medicamentului în faza apoasă /alcoolică (solubilitatea capsaicinei atunci când ciclodextrina nu este prezentă).

Valoarea K1:1 este cel mai adesea cuprinsă între 50 și 2000 M-1 cu o valoare medie de 129 pentru α-ciclodextrină.

O altă stoichiometrie comună de ordin superior pentru alți complecși medicament/ciclodextrină este de 1: 2 când are loc o complexare consecutivă (o moleculă suplimentară de ciclodextrină formează un complex cu complexul 1:1 existent):

unde:

− ciclodextrina;

Valoarea K1:2 este în mod frecvent între 10 și 500 M-1, sau în mod semnificativ mai mică decât valoarea K1:1.

S-a constatat ca maximul de fluorescenta al capsaicinei în absența α-CD este la 316 nm (soluția de capsaicină fiind folosită ca blank. Pentru complex însă, maximul este deplasat spre stânga la 279 nm.

Rezultatele obținute sunt prezentate în Tabelul 4.1.

4.1. Valorile obținute la trasarea curbei de fitare a complexului în UV-VIS și fluorescență

Imax = intensitatea maximă de fluorescență a capsaicinei

Amax = absorbția maximă a capsaicinei în UV

Cu ajutorul relației de mai jos s-a calculat raportul molar CD : capsaicina.

unde:

I0 este intensitatea capsaicinei în absența CD;

k este constanta de echibibru pentru complexul CD : capsaicină = 1:1;

I1 este intensitatea complexului;

[CD] este concentrația molară a CD;

În figura 4.4. s-a constatat că s-a obținut pentru raportul molar CD : capsaicină = 1:1 un coeficient de corelație de 0,993, ceea ce ne confirmă faptul ca un mol de CD se leagă de un mol de capsaicină.

A)

B)

Figura 4.4. A) Spectrul de fluorescență pentru capsaicină; B) Curba de fitare obținută pentru complexul capsaicină-ciclodextrină

Având în vedere că în ecuația de fitare capsaicină:ciclodextrină s-a obținut o constantă de echilibru de 86 M-1 rezultatul este concordant cu literatura de specialitate pentru un raport de combinare ciclodextrină:capsaicină de 1 : 1.

Figura 4.5. A) Spectrul UV-VIS pentru capsaicina; B) Curba de fitare obținută pentru complexul capsaicină-ciclodextrină

4.4. DETERMINAREA CAPSAICINEI DIN COMPLEXUL CAPSAICINĂ–α–CICLODEXTRINĂ PRIN HPLC

4.4.1. Materiale și metode

Determinarea capsaicinei din complexul sintetizat s-a realizat și prin cromatografie de lichide de înaltă performanță.

S-a utilizat pentru aceasta un cromatograf HPLC Finnigan Surveyor cu pompă cuternarășiautosampler, cu undetector DAD PDA5P cu celulă în flux de 5 cm. Coloana folosită a avut următoarele caracteristici: 250 x 4.6 mm, 5µm.

S-a lucrat la o temperatura de l250C, pentru faza mobilă (apă: acetonitril 50:50) alegându-se un regim de eluție isocratic. Debitul a fost de 1 mL/minut iar volumul de injecție de 5 L. Detecția s-a făcut la =204 nm.

4.4.2. Rezultate și discuții

Inițial s-a pregătit o soluție standard de 75 mg/L din care s-au făcut 4 diluții: 15 mg/L, 30 mg/L, 45 mg/L și respective 60 mg/L.

S-a trasat mai apoi curba de calibrare (y=954.3x+5339, r2=0.9867). În figurile 4.6.și 4.7.sunt redate cromatogramele pentru capsaicina pură (soluția standard de 75 mg/L, spectrul UV-VIS al acesteia, din care a fost aleasă lungimea de undă de 204 nm pentru cuantificare și respectiv curba de calibrare.

Figura 4.6.Spectrul obținut pentru soluția standard de capsaicină

Figura 4.7. Spectrul pentru compusul pur cu concentrația de 75 mg/L

Figura 4.8. Curba de calibrare a capsaicinei

Acuratețea metodei analitice, calculată pentru fiecare concentrație din curba de calibrare (n=5) este prezentată în tabelul de mai jos:

Tabel 4.2.Acuratețea metodei analitice de determinarecantitativă a capsaicinei din complex

0,1 mL soluție complex au fost utilizați în vederea stabilirii cantității de capsaicină legată de ciclodextrină. Interpolând aria piculului obținut pentru capsaicina dozată din complex, s-a constatat că o cantitate de 0,289 mg capsaicină s-au complexat, cu un randament de 94, 75%.

Analiza a confirmat suplimentar determinărilor efectuate prin spectrometria UV-VIS și spectrometria de fluorescență că raportul de complexare dintre capsaicină și ciclodextrină este de 1:1.. În figura 4.9.este schițată formarea complexului de incluziune ciclodextrină-capsaicină.

Figura 4.9.Formarea complexului de incluziune ciclodextrină-capsaicină

CAPITOLUL 5. APLICAȚII FARMACEUTICE ALE COMPLEXULUI α-CD/CAPSAICINĂ

5.1. ÎNCORPORAREA CAPSAICINEIÎN UNGUENT SIMPLU

Pentru încorporarea capsaicinei în unguentul simplu s-a folosit următoarea Rp:

Soluție α-CD / capsaicină 2ml (2g);

Lanolină3g;

Vaselină5g;

Lanolina a fost produsă de Stella Lanolines Belgia, lot. 02209 și vaselina de Sasolwax Germania, lot. 18103.

Inițial am încălzit pe baia de apă la 70°C lanolina și vaselina, triturând apoi până la răcire pentru obținerea unui unguent simplu omogen.

Ulterior am încorporat soluția de complex în unguent, obținând un unguent de tip emulsie A/U.

Cei 2 ml de soluție de complex conțin 0,605mg capsaicină, adicăun procent de 0,097% capsaicină.

5.2. STUDII DE CEDARE IN VITRO A PRINCIPIULUI ACTIV

5.2.1. Celula de difuzie

Testarea celulei de difuzie in vitro a ratei de transfer de-a lungul membranei s-a făcut folosind o tehnologie utilizată pentru studiul cineticii transferului prin piele și stabilirea uniformității preparatelor topice pentru fiecare lot în parte.

Procedura folosește o celula de difuzie care separăun compartiment donor de unul receptor printr-o membrană specifică. Această testare permite aflarea ratei de eliberare a unui ingredient farmaceutic activ din forma semisolidă, în cazul nostru, un unguent simplu conținând ca ingredient activ capsaicină, penetrând o membrană similară cu pielea în soluție. Procedeul difuziei reproduce procedeul de aplicare pe piele deoarece capsaicina pătrunde prin piele în organism, având efecte locale sau sistemice. Este ideală pentru controlul calității preparatelor topice și transdermice, și de asemenea pentru preparate semisolide oftalmice, cosmetice, produse pentru îngrijirea pielii sau pesticide.

Cu ajutorul celulei de difuzie s-a putut observa profilul farmacocinetic al capsaicinei difuzat prin membrane artificiale, folosind testele in vitro.Astfel, am putut determina procentul capsaicinei difuzată prin membrane, variația vitezei de difuzie precum și distribuția capsaicinei în cele trei compartimente.

Am folosit o pompă peristaltică pentru vehicularea soluției de capsaicină.S-a folosit principiul de pompare, denumit peristaltism, aspirând soluția și propulsând-o departe de pompă. Pompa peristaltică este un dispozitiv de contorizare precisă, dozând de fiecare dată aceeași cantitate de soluție (figura 5.1).

S-a folosit un debit de 1,5 mL soluție/min și o agitare de 300 rpm. Temperatura a fost setată la 37°C, soluția fiind inițial încălzită la această temperatură.

Figura 5.1. Schema instalației utilizate la determinări

Prelevarile s-au facut la intervale de timp de 30 min, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h.

5.2.2. Determinarea disponibilității in vitro a capsaicinei din formulările farmaceutice

Pentru dozarea capsaicinei din probele prelevate s-a trasat spectrul de absorbție în UV al acesteia, constatându-se un peak la 280 nm, așa cum este prezentat în figura 5.2 pentru cea mai diluată soluție din curba de calibrare.

Figura 5.2. Spectrul UV-Vis al capsaicinei

Tabelul 5.1 și figura 5.3.redauprocentele cumulative obținute de capsaicină cedată din unguentul studiat prin membrana artificial.

Tabel 5.1.Cantitatea cedată (%) de capsaicină din formulările farmaceutice semisolide

Figura 5.3.Procentul de capsaicină cedat din unguente

Din analiza datelor obținute s-a constatat că pe o durată de 6 h, are loc o cedare a principiului activ inclus în transportor cu 59%, formularea complexului de incluziune ajutând la mărirea cantității de capsaicină care difuzează prin membrană. Procentul poate fi ajustat prin modificarea tipului de membrană utilizată, propunându-ne o astfel de abordare în următoarele studii.Conform lui Thomson, prezența ciclodextrinelor în unguent înbunătățește calitățile unguentului.

5.3. TESTE REOLOGICE

5.3.1. Generalități

Reologia descrie deformarea corpurilor sub acțiunea diverselor tensiuni aplicate și reprezintă caracterizarea materialelor cu proprietăți intermediare între cel al solidelor ideal elastice și cel al lichidelor ideal vâscoase. În acest context, prin corpuri înțelegem solide, lichide sau gaze. Solidele ideale se deformează elastic,energia necesara deformării fiind complet recuperată în momentul în care tensiunile sunt eliminate. Fluidele ideale se deformează ireveribil (curg). Energia necesară deformării este disipată în interiorul fluidului sub formă de căldură și nu poate fi recuperată prin simpla îndepartare a tensiunilor. Majoritatea lichidelor prezintă un comportament reologic care le situează între lichide și solide, lichidele in acest sens având proprietați de la elasticla vâscos, stare pe care o putem denumi “vâscoelastică”. Instrumentele care masoară proprietățile vâsco-elastice ale semisolidelor și lichidelor se numesc Reometre.

Rezistența unui fluid împotriva oricărei schimbări ireversibile de poziție a elementelor sale de volum se numește vâscozitate. În timp ce solidele și lichidele reacționează diferit atunci când sunt deformate de tensiuni, proprietățile reologice între lichide și gaze fiind asemănătoare. În cazul lichidelor și al gazelor vâscozitatea este invers proporțională cu temperatura. Vâscozitatea lichidelor și semisolidelor este și o consecință a mișcării browniene. Unguentele, cremele, loțiunile, pasteleși gelurile ocupă o ramură vastă a industriei farmaceutice, de aceea, se pune accent pe proprietățile de vâscozitate și reologie, care ajută la monitorizarea controlului calității, consistenței și respectarea Farmacopeei în timpul formulării acestora.Vâscozitatea fluidelor Newtoniene nu se modifică odată cu creșterea vitezei de forfecare și a timpului.Un astfel de fluid este apa. Cele mai bune exemple de fluide non-Newtoniene sunt unguentele.

Vâscozitatea scade odată cu creșterea ratei de forfecare, și revine la valoarea inițială odată cu încetarea acesteia. Consistența este o caracteristică importantă a unguentelor, și se referă în special la capacitatea de întindere, curgerea unguentelor sau adeziunea pe piele. Vâscozitatea este noțiunea cea mai apropiată de termenul de consistență, astfel încât, determinările reologice sunt cele mai elocvente.

η este vâscozitatea dinamică a unui fluid și este dependentă de S, T, p,y, t,E, unde:

unde S face referire la proprietățile fizico-chimice ale substanței, T = temperatura, p = presiunea, y = rata de forfecare, t = durata masurării, E = câmpul electric. Reprezentările grafice ale ecuațiilor reologice de stare sunt numite reograme.

La aceste determinări se iau în calcul două tipuri de tensiuni: tensiuni normale – de alungire și de compresie, și tensiuni de forfecare (tangențiale de suprafață. În S.I. unitatea de măsură caracteristică celor două este pascalul (Pa) [1 Pa = 1N.m-2 = 10 dyne.cm-1).

5.3.2. Materiale și metode.

Substanțele folosite au fost Capsaicina (Merck), α-Ciclodextrină (Fluka Chemie AG), Vaselina (Sasolwax Germania, lot 18103) respectiv Lanolina (Stella Lanolines Belgia, lot. 02209).Capsaicina a ridicat probleme la încorporarea în unguent din cauza solubilității scăzute aacesteia în bază. Solubilitatea ei și procentul de incorporare în unguent au putut fi crescute cu ajutorul alcoolilor (etilic).

Ca aparatură de laborator s-au folosit mojare farmaceutice, pahare Berzelius, balanța electronică, pipete, seringi de 20 ml, lingurite din plastic, termometru, vâscozimetru Thermo Scientific HAAKE (figura 5.4). Unguentele obținute au fost condiționate în cutii de polietilenă, închise etanș, ferite de lumină și căldură, la cel mult 25°C.la prepararea unguentului am folosit metoda manuală și anume pulverizarea substanței active, obținerea soluției și încorporarea acesteia în unguentul simplu, sub formă de unguent de tip emulsie A/U.

Procedura folosește un vâscozimetru HAAKE Viscotester 550, pentru a determina proprietățile reologice respectiv vâscozitatea unguentului cu capsaicina de tip A/U temperatura fiind menținută constantă cu ajutorul unei băi de apă cu recirculare, model ERWEKA PM30.

Conform literaturii de specialitate, determinarea acestui parametru s-a facut în condiții bine determinate, respectiv la temeperatura de 35°C (temperatura tegumentului),iar intervalul de timp fiind de 5 minute între măsurători.

Figura 5.4. Vâscozimetru HAAKE Viscotester 550

5.3.3. Rezultate și discuții

Figura 5.5.Unguent tip A/U cu Capsaicină

Figura 5.6.Baza de unguent

În figura 5.5. se poate observa că, la viteze de forfecare cuprinse între240 și 470 s-1 unguentulcu capsaicină se comportă ca un semisolidcu proprietăți foarte asemanatoare unuitixotrop, în aceste condiții având vâscozitatea ~0,1 mPas.La viteza de forfecare sub 240 s-1 unguentul se îndepartează de comportamentul unui tixotrop, abaterile fiind pozitive, în valori absolute, cresc până la o diferență de maxim 0,1 mPas. La viteze de forfecare foarte mici (aproape de valoarea 0) graficul evidențiază că amestecul nostru se îndepartează mult de semisolidul ideal.

În ceea ce privește figura 5.6. , la viteza de forfecare cuprinsă între 240 si 470 s-1 ,baza de unguent este evidențiată avandun comportament apropiat de tixotrop. Cu cât viteza de forfecare scade sub 240 s-1, baza de unguent are vascozități apropiate de 0,1 mPas. La valori minime ale vitezei de forfecare, valorile vascozității sunt net diferite față de cele caracteristice tixotropului.

Comparand cele două grafice putem concluziona că: la valori ale vitezei de forfecare de peste 240 s-1 capsaicina din unguentul A/U a produs o îndepartare de proprietăți de tixotrop ale bazei de unguent. Același lucru se poate constata și la viteze de forfecare sub 240 s-1 dar de data aceasta în sens invers. Pe baza acestor concluzii putem afirma ca unguentul A/U are o mai mare stabilitate.

În condiții normale de aplicare a unguentului A/U pe tegument putem spune că acesta prezintă o mai mare stabilitate a compoziției.

În următoarea etapă amrealizat o nouă bază de unguent, de data aceasta mai amplă decât baza formată din lanolină și vaselină, pentru a putea încorpora tincturile alcoolice. Am încorporat atât tinctura din ardei roșu fără semințe și nervuri, cât și pe cea din ardei verde iute crud.

Rp/Alcool cetilic 3,5g

Ceară galbenă 8g

Lanolină 12g

Parafină 10g

Ulei de parafină 25g

Span 60 1,5g

Apă 40g

TincturăCapsicum Annuum1,5g

Figura 5.7 Baza de unguent 2

Figura 5.8 Unguent A/U cu tinctură de ardei roșu fără semințe și nervuri

Figura 5.9 Unguent A/U cu tinctură de ardei iute verde crud

Plecând de la faptul că mișcarea de rotație a aparatului reprezintă o energie, și deci consum le lucru mecanic, putem interpreta prin aproximare ca suprafața din grafic aflată sub curba obținută reprezintă energia consumată pentru ruperea legaturilor van der waals din amestecul supus analizei. Ținând cont că programul are două etape (creștere și scădere de turație)putem aprecia că: o parte din legăturile van der waalsse refac la sfârșitul experimentului, dar o bună parte din ele rămân rupte pentru un timp relativ definit. În timp, fără frecările produse de rotație, legăturile se refac pe considerentul de vecinătate chimică a legăturilor dintre atomi.

Materialul supus analizei aflat în repaus încearcă astfel să își aducă energia internă la un minimum de echilibru.

Toate acestea ne arată că, în practică, amestecul folosit în experiment îndeplinește condițiile reologice de aplicare pe suprafața pielii (menșine constant legătura cu suprafața). Privind graficele obținute putem observa că acestea sunt apropiate ca formă (deci și ca proprietăți pentru baza de unguent 1 (lanolină+ vaselină). Baza de unguent 1 are un comportament diferit pentru partea de început a programului, dar amestecurile au obținut în final caracteristici reologice constante și corespunzătoare domeniului de aplicabilitate. În timpul experimentului s-a constatat o creștere de temperatură a amestecului, deși acesta avea loc în condiții de termostatare pe baia de apă.

Diferența de temperatură înregistrată în timpul experimentului se regăsește în grafic, fiind o mărime a suprafeței existente sub curbă, și, se poate cuantifica prin diferența punctelor de început și sfârșit a experienței. Am înregistrat creșteri de temperatură de 4o C, ceea ce arată că, în principiu, atât baza cât și amestecurile folosite se caracterizeazăprin legături van der waals puternice și stabile. Ca o concluzie, putem spune că produsele folosite în experiment au avut un comportament constant și previzibil.

În ceea ce privește baza de unguent, am ales o a doua mult mai complexă, deoarece a prezentat caracteristici reologice previzibile, încadrându-se în normele farmacologice.Cu baza de unguent 2 am făcut două asocieri cu substanțe active din punct de vedere farmacologic: încorporarea în baza de unguent a tincturii de ardei roșu fără semințe și nervuri și a ardeiului verde crud. Cu amestecurile respective am efectuat determinări reologice în aceleași condiții ca și cu baza și am obținut graficele 5.8 și 5.9. Am folosit viteze între 2 și 200 rpm, în două etape cu viteză crescătoare și descrescătoare.

Referitor la discuția datelor din aceste grafice putem face următoarele aprecieri: în graficul 5.80, valorile vâscozității în prima fază a experimentului cu viteză crescătoare, aceasta a scăzut de la 9,3 mPas la 0,049 mPas. În faza a 2-a a experimentului (cu viteză descrescătoare) vâscozitatea a avut vakori de la 0,041 mPas la 0,0449 mPas. Atât din datele din tabel cât și din grafic putem evalua că amestecul s-a comportatdin punct de vedere reologic constant iar valorile finale obținute îl încadrează din punct de vedere farmacologic ca un produs bun de aplicat. La fel ca și la experimentul cu cu baza de unguent s-a constatat o creștere a temperaturii amestecului cu cca 3oC , explicată ca un efect al forțelor de frecare. Această creștere a temperaturii este dată de diferența dintre energiile interne ale amestecului în cele două faze ale experimentului- înainte și după. În graficul 5.9 se poate constata că vâscozitatea a scăzut valoric de la 2,13 mPas la 0,016 mPas pentru partea crescătoare a turației și a avut valori de la 0,014 mPas la 0,042 mPas pentru partea descrescătoare a turației. Ca o apreciere generală, putem constata că și în acest caz amestecul a avut comportament previzibil, dar la valori mai mici ale vâscozității față de amestecul precedent, însemnând în practică o stabilitate mai mică în timp, datorită conținutului mare de apă și clorofilă, care i-a influențatnegativ această proprietate.Prin acest comportament- tinctura ardei verde crud in baza de unguent 2, s-a constatat și aici o creștere a temperaturii tot cu 3oC. Având în vedere ca cele două amestecuri se încadrează în normele farmacologice, deși există mici diferențe de comportament, la folosirea acestora în practica medicală se vor avea în vedere condițiile concrete în care urmează să fie folosit: locul pe suprafața pielii și alte condiții de susținere.

6.CONCLUZII GENERALE. PERSPECTIVE VIITOARE DE CERCETARE

Cercetările efectuate în cadrul tezei de doctorat au avut ca scop realizarea unui studiu interdisciplinar prin care s-a dezvoltat sinteza unor complecși de incluziune capsaicină-α ciclodextrină urmată de includerea acestora în forme farmaceutice semisolide.

A fost aleasă capsaicina ca principiu activ deoarece aceasta este un produs natural bogat în proprietăți farmaceutice care poate fi inclus în diverse preparate farmaceutice în vederea potențării efectelor pe care aceasta le are.

Primul capitol este dedicat studiului literaturii de specialitate și este divizat în trei subcapitole distincte în care sunt descrise atât noțiuni cu caracter general cât și ultimele cercetări publicate în literatura de specialitate asupra preparatelor farmaceutice semisolide (subcapitolul 1.1), capsaicinei (subcapitolul 2.2) și ciclodextrinelor (subcapitolul 3.3);

Cea de-a doua parte a tezei cuprinde contribuțiile originale aduse în acest domeniu și este structurată în patru capitole distincte.

În capitolul dois-a pornit de la efectuarea unor studii preliminare asupra speciei Capsicum annum. Astfel, s-a determinat procentul de apă, materie uscată și cenușă din pulberea plantei. Analiza FT-IR efectuată a confirmat prezența unor clase importante de metaboliți secundari care au fost ulterior identificați prin GC-MS. Dintre compușii identificați, un număr important s-a dovedit a avea proprietăți farmaceutice, incluzând capsaicina.

Subcapitolul 2.2. este dedicat exclusiv determinării profilului polifenolic al extractelor ultrasonicate de Capsicum annumprin HPLC. Utilizând o metodă simpă de cuantificare, s-a reușit dozarea a unsprezece acizi derivați de la acidul hidroxicinamic și cinci flavonoide.S-a constatat prezența în concentrație relativ crescută comparativ cu alte specii a acidului elagic în toate probele analizate. Încadrul aceluiași subcapitol s-aefectuat și un studiu paralel prin care s-a determinattotalul polifenolic (Metoda Folin-Ciocâlteu), totalul flavonoidicși activitatea antioxidantă. Rezultatele acestui studiu au relevat faptul că extractele alcoolice de Capsicum annuum prezintă proprietăți antioxidante semnificative, cea mai mare activitate antioxidantă fiind obținută pentru extractul de ardei verde (723.795 mg/L GAE, 3.315 mg/L echivalenți trolox și 327.394 mg/L QE).În plus, activitatea antibacteriană a extractelor testate a fost semnificativ mai mare în comparație cu standardul capsaicină utilizat ca martor pozitiv față de Enterococcus faecalis, E. coli și Bacillus subtilis, acestea având activitate similară cu capsaicina pentru tulpina Staphylococcus aureus. Rezultatele testelor in vitro de citotoxicitate au arătat că extractele testate au o bună biocompatibilitate și nu au modificat morfologia celulelor HACAT. Luate împreună, aceste proprietăți biologice indică faptul că aceste extracte pot fi utilizate în diferite aplicații biomedicale, ca agenți anti-reumatici, antiinflamatori și antimicrobieni.

În capitolul 3a fost realizat un studiu prin care două varietăți de Capsicum annuum L. au fost analizate în ceea ce privește conținutul lor în capsaicină utilizând o metodă simplă RP-HPLC. Extracția capsaicinei a fost accelerată prin ultrasonicare. Cel mai mare conținut a fost găsit în ardeiul verde uscat (85,262 mg/L), urmat de ardeiul roșu uscat de la care au fost îndepărtate semințele și nervurile (75,457 mg /L).

În capitolul patru s-a trecut la sinteza unui complex de incluziune alfa ciclodextrină-capsaicină, pentru care atât ecuația de fitare obținută prin spectrofotometrie UV-Vis cât și prin fluorescență a arătat un raport de complexare de 1:1. Determinarea HPLC a confirmat atât calitativ cât și cantitativ prezența capsaicinei în complex, obținându-se un randament bun de incorporare a acesteia.

Din analiza datelor obținute în capitolul 5, în care s-a studiats-a constatat că pe o durată de 6 h, are loc o cedare a principiului activ inclus în transportor cu 59%, formularea complexului de incluziune ajutînd la mărirea cantității de capsaicină care difuzează prin membrană. Procentul poate fi ajustat prin modificarea tipului de membrană utilizată, propunându-ne o astfel de abordare în următoarele studii.

In subcapitolul 5.3 s-au realizat teste reologice asupra bazei de unguent in care a fost inclusa capsaicina simpla si asupra bazei de unguent in care a fost inclus complexul capsaicina-α-CD. La valori ale vitezei de forfecare de peste 240 s-1 capsaicina din unguentul A/U a produs o îndepartare de proprietăți de tixotrop ale bazei de unguent. Același lucru se poate constata și la viteze de forfecare sub 240 s-1 dar de data aceasta în sens invers. Pe baza acestor concluzii putem afirma ca unguentul A/U are o mai mare stabilitate.

PERSPECTIVE DE CERCETARE VIITOARE

Întrucât subiectul tezei este extrem de amplu, studiile desfășurate de noi cu rezultate fructuoase permite o extindere a cercetărilor viitoare asupra altor aspecte legate de tematica aleasă, încă neefectuate:

– elaborarea unor noi metode de sinteză ciclodextrine-capsaicină;

– includerea complecșilor în mai multe formulări farmaceutice și studiul comparativ al acestora;

-realizarea unui studiu comparativ al biodisponibilității capsaicinei inclusă simplă în unguent sau inclusă sub formă complexată;

– efectuarea unor studii in vivo care să ateste proprietățile farmacologice ale unguentelor formulate;

REFERINȚE BIBLIOGRAFICE