Conținutul lucrării se structurează pe trei capitole, divizate în subcapitole. [310225]

1. [anonimizat], care studiază structura biomoleculelor și rolul pe care acestea îl exercită în organism. Termenul de “biochimie” a fost introdus pentru prima dată în 1903 de Carl Neiberg. [anonimizat], fiind promotorul cercetărilor medicale și a diagnosticului clinic.

[anonimizat] o parte, principalele aspecte teoretice și aspectele practice relevate prin studii clinice asupra rolului biomarkerilor din sânge (biochimici si genetici) [anonimizat], analize de o importanță considerabilă dată fiind problematica anomaliilor congenitale.

[anonimizat].

[anonimizat], precum și informații despre compoziția și importanța laptelui matern. Se continuă cu descrierea sarcinii și a [anonimizat] a principalelor metode citogenetice de diagnostic prenatal.

[anonimizat] a lucrării.

Capitolul al treilea vizează preluarea de date din cadrul unui laborator de analize medicale de ambulator din Brașov (Synevo SRL) în ceea ce privește testele de diagnostic care permit observarea aneuploidiilor cromozomiale și a incidenței acestora. [anonimizat], [anonimizat] a suferit complicații în jurul vârstei maternale de 30 de săptămâni.

2. Biomarkeri în sângele și laptele matern

2.1 Biomarkeri. Caracteristici generale și specifice

Biomarkerul reprezintă o trăsătură biochimică sau o modificare biologică care poate fi măsurabilă în organism și poate conduce la evidențierea progresului unei boli sau a efectului unui tratament. Biomarkerii evidențiază interacțiunea dintre un sistem biologic și un factor extern ce prezintă un risc potențial [1].

[anonimizat], [anonimizat] [2] (Fig.2.1).

Figura 2.1. Panel al biomarkerilor [2]

Biomarkerii de expunere evidențiază informații despre expunerea la un potențial poluant. [anonimizat] o asimilează în urmă expunerii [2].

Biomarkerii de efect indică efectele pe care organismul le percepe în urmă expunerii la un agent toxic din mediul exterior. Sunt reprezentați ca factori de alterare a [anonimizat] [2].

[anonimizat], [anonimizat]-se de obicei din fluidele corporale [2].

Determinarea biomarkerilor de risc este îngreunată de faptul că organismul metabolizează destul de repede stimulul toxic din exterior. Biomarkerii de diagnostic ajută în stabilirea unui diagnostic și a unui tratament adecvat patologiei [2].

Biomarkerii de expunere, de efect și cei funcționali reprezintă biomarkerii de prevenție care sprijină conștientizarea mai facilă asupra expunerii la un agent toxic și luarea unor măsuri potrivite care să stopeze expunerea. Biomarkerii de diagnostic pot fi chiar markeri de terapie [2].

2.2. Sângele

2.2.1. Obținere și caracteristici

Sângele reprezintă un alt fluid al organismului ca sursă de markeri biochimici. Sângele este fluidul care circulă în interiorul arborelui cardiovascular, reprezentând circa 8% din masa corporală [3] (Fig.2.2).

Este format din elemente figurate (eritrocitele, leucocitele și trombocitele) (45%) și plasmă (55%). Plasma sangvină conține în proporție de 90% apă și reziduu uscat, în proporție de 10%, dintre care 1% este reprezentat de substanțe anorganice ( și 9% compuși organice (albumine, globuline, fibrinogen etc) [3].

Figura 2.2. Compoziția sângelui [3]

Pe membrana hematiilor se pot identifica numeroase macromolecule cu rol antigenic numite aglutinogene, în timp ce în plasmă se regăsesc aglutininele (anticorpi). Cele mai întâlnite aglutinogene sunt 0, A și B, iar în rândul aglutininelor întâlnim α, omoloaga aglutinogenului A și β, omoloaga aglutinogenului B. Sunt recunoscute patru grupe de sânge: 0 (I), A (II), B (III) și AB (IV). În ceea ce privește sistemul Rh, în cazul mamei Rh negativ, când tatăl este Rh pozitiv, copiii vor moșteni Rh pozitiv. Prima sarcină poate evolua fără complicații, căci hematiile Rh pozitive nu pot traversa bariera placentară. La o nouă sarcină, însă, aceste aglutinine trec bariera placentară, pătrund în circulația fetală, putând cauza moartea fătului atunci când aglutininele sunt în concentrație prea mare [3].

De asemenea, prin centrifugarea sângelui recoltat in diferite condiții, se pot obține două fracții importante în analizele de laborator – serul sau plasma. Pentru obținerea de ser, sângele trebuie recoltat într-un vacutainer de biochimie, cu gel separator sau fără. După coagulare, care se produce de obicei după 30 de minute, sângele este centrifugat la 3000 rotații pe minut (rpm), timp de 5 minute, obținându-se în acest mod serul uman. Pentru obținerea de plasmă, sângele este recoltat într-un vacutainer cu anticoagulant, amestecul fiind ulterior centrifugat (anticoagulantul inhibă formarea coagulului). Buffy coat-ul este format din trombocite și leucocite în rețeaua de fibrină [3].

2.2.2. Proteinele plasmatice / serice

Proteinele plasmatice reprezintă aproximativ 75% din totalul de reziduu uscat al plasmei, concentrația lor fiind de 7-7,5 g/100 mL. Electroforeza este procesul de separare a componenților unor amestecuri în funcție de proprietățile particulelor, geluri și de condițiile experimentale. Acest proces se desfășoară în curent electric continuu. Prin procesul de electroforeză, proteinele plasmatice se grupează zonal, dependent de sarcinile electrice și masele moleculare, în cinci fracțiuni: albumine, α1 și α2-globuline, β-globuline și γ-globuline (Fig.2.3) [4].

Figura 2.3. Rezultatul migrării electroforetice a fracțiilor proteice [4]

Albuminele sunt molecule mici și pot traversa cu ușurință barierele membranare, fiind implicate în reglarea presiunii osmotice celulare și participă activ la transportul unor molecule mai greu solubile, transformându-le astfel în compuși ce pot fi vehiculați în organism. Sunt foarte solubile în apă (proteine globulare) [4].

Globulinele au formă globulară, sunt proteine mari, solubile în apă. Sunt de trei tipuri: α, β și γ. Din tipul β si γ – globulinelor fac parte imunoglobulinele (anticorpii). Imunoglobulinele se clasifică în cinci clase: imunoglobuline G, M, D, A, E și sunt introduse pentru a explica mecanismele de apărare imună. Toate cele cinci au o structură asemănătoare. Imunoglobulinele pot fi găsite în ser, urină, lichid cefalorahidian, laptele matern, ganglioni, splină sau gălbenuș de ou. Imunoglobulinele sunt glicoproteine constituite din patru lanțuri polipeptidice, două ușoare (low-L) și două grele (heavy-H), unite prin două punți disulfură S-S. Structura generală a imunoglobulinelor presupune trei zone distincte: zona variabilă, zona balama și zona constantă (Fig.2.4) [4].

Figura 2.4. Structura generală a imunoglobulinelor [4]

Zona variabilă reprezintă zona specifică pentru legarea antigenului care le-a indus biosinteza. Este caracteristică fiecărui tip de imunoglobulină, prezentând anumite secvențe de aminoacizi. Zona constantă este cea spre capetele C terminale ale lanțurilor grele, prezentând o formă specifică speciei. Are caracter imun, iar în organismele altor vertebrate se pot sintetiza anticorpi specifici numiți anticorpi secundari. Zona balama conține o cantitate considerabilă de resturi de prolină. Datorită întreruperii zonei de tip α-helix, prezintă o posibilitate mai mare de a fi atacată de enzimele proteolitice. Există cinci clase de imunoglobuline – imunoglobulinele G, M, D, E, A [4].

2.2.3. Imunoglobulinele și importanța diagnostică

Imunoglobulinele G se găsesc în proporția cea mai mare (70-75% din totalul de imunoglobuline). Prezintă o structură monomeră asemănătoare structurii de bază. Pot traversa bariera placentară astfel încât la naștere mama și puiul prezintă concentrații aproximativ egale de imunoglobuline. După naștere, puiul se luptă cu eventualele sisteme antigenice, iar concentrația de imunoglobuline G scade, prezentând o valoare minimă în perioada de 3-5 luni. Se sintetizează în faza cronică, cu un punct maxim pe la 14-21 zile. Există patru subtipuri de Ig G: Ig G1, G2, G3 și G4 [4].

Imunoglobulinele M prezintă o structură pentameră cu 5 structuri de bază, unite între ele prin intermediul unui lanț polipeptidic de tip J (joining). Are o eficiență crescută în faza acută a infecției ce prezintă concentrații maxime între zilele 7-14. După acest interval, concentrația de Ig M scade și în urma unui feedback negativ, concentrația de Ig G se biosintetizează. Din cauza structurii pentamere nu poate traversa bariera placentară [4].

Imunoglobulinele A sunt serice și secretorii. Cele serice prezintă o structură monomeră asemănătoare structurii de bază, dar cu lanțurile ușoare spre interior. Se găsesc în sânge și asigură apărarea sistemică, unică, generală a organismului. Cele secretorii se găsesc la nivelul diferitelor secreții (lacrimale, salivare, mamare, genitale), locuri cu bogat echipament enzimatic, având rol în apărarea imună locală, de fază acută. Prezintă o structură dimeră în care cele două structuri de bază sunt unite atât print-un lanț joining “J” către zonele constante, cât și printr-o componentă secretorie (CS) pentru zonele balama. Se recomandă alăptarea puiului pe o perioadă cât mai lungă, mai ales în perioada de 3-5 luni, când concentrația de Ig G este la nivel minim, întrucât se obține astfel o concentrație de Ig A secretorii din laptele matern care se implică în răspunsul imun, conferind imunitate nou-născutului (Fig.2.5) [4].

Imunoglobulinele D se găsesc în cantități mici și sunt importante pentru generarea memoriei imunologice. Astfel, se pot utiliza vaccinuri care conțin diverse forme atenuante ale virusului, bacteriei sau chiar fragmente ale acestora care se pot administra pacienților sănătoși, dar care prezintă susceptabilitate mare de a contacta ulterior aceste antigene. Prezintă o structură asemănătoare celei de bază, diferența fiind aceea că zona balama este foarte lungă. Datorită prezenței lanțurilor de oligozaharide, este implicat în modularea răspunsului imun și generarea memoriei imunologice datorită celulelor de memorie care vor fi reactivate când apare o noua invazie a antigenelor reale în concentrații mari [4].

Imunoglobulinele E se biosintetizează în cantități la care subiectul prezintă hipersensibilitate față de anumite structuri care se numesc alergeni (praf sau polen). Așadar, intervin în procesele de anafilaxie. Receptorii pentru Ig E se regăsesc la nivel mastocitar (celule la nivel tegumentar sau pulmonar) ce culminează cu liza mastocitelor și eliberarea conținutului bogat în histamine, kinine, citokine. Acest conținut se eliberează la nivel sangvin și determină răspunsuri specifice precum înroșire, usturime, mâncărimi sau uneori chiar moarte [4].

Figura 2.5. Modificările secreției de Ig A, Ig M și Ig G înainte și după naștere [4]

Manifestările clinice ale afecțiunilor alergice de tip Ig E sunt reprezentate de anafilaxie, astm, alergie alimentară sau alergia la înțepături de insecte [5].

Pentru verificarea alergenilor Ig E specifici, se va recolta proba de la pacient à jeun (pe nemâncate), după o pauză alimentară de minimum 8 ore. Se recoltează sânge venos, din care se va utiliza spre analize serul, după o ulterioară centrifugare. Este utilizată metoda imunoenzimatică cu detecție prin fluorescență [6].

2.2.4. Biomarkeri serici

Printre cei mai cunoscuți biomarkeri serici utilizati în diagnosticul prenatal se numără HCG, PAPP-A, AFP și estriolul.

Gonadotropina corionică umană (HCG) este o glicoproteină formată din 237 de aminoacizi, cu o masă moleculară de 25,7 kDa. Este un compus heterodimeric cu două lanțuri, unul α, care reprezintă subunitatea identică cu cea a hormonului luteinizant (LH) și a celui foliculostimulant (FSH) și o subunitate β care îi conferă specificitate de specie. Subunitatea α este formată din 92 de aminoacizi, iar subunitatea β din 145 de aminoacizi. Se regăsește predominant la nivel ovarian, dar și extragonadal în uter și sâni. Rolul său esențial este acela de a confirma prezența sarcinii la 6-10 zile de la implantarea ovulului. Se mai recomandă în estimarea vârstei gestaționale și în iminența de avort [7].

Pentru determinarea nivelului de HCG se utilizează teste de sânge și urină. În cazul probelor de sânge se recoltează specimenul à jeun într-un vacutainer fără anticoagulant, cu sau fără gel separator. Proba se va identifica prin metode imunochimice cu detecție prin imunochemiluminescență sau prin teste de imunofluometrie. Un test HCG pozitiv confirmă implantarea blastocitului, prezența embrinogenezei, boala tromfoblastică gestațională sau tumorile germinale [7].

Proteina plasmatică asociată sarcinii (PAPP-A) este o glicoproteină produsă în placentă, în timpul sarcinii, fiind produsă în cantitate mare de către trofoblast și eliberată în circulația sangvină [8].

Alfa feto-proteina (AFP) este o glicoproteină similară albuminei. Este sintetizată în perioada fetală în ficat și sacul vitelin, conținând doar un singur lanț polipeptidic cu o greutate de 70 kDa. Îndeplinește funcții de transport de transport pentru estrogen și acizi grași, dar imprimă și efect imunosupresiv în timpul sarcinii. Determinarea de AFP constituie un element important, fiind necesar în diagnosticul defectelor de tub neural, a spinei bifide și a determinării omfalocelului [8].

Estriolul (E3) neconjugat reprezintă hormonul estrogen din sângele și urina femeii însărcinate. Provine din precursorul 16 α-hidroxidehidroepiandrosteron sintetizat la nivelul glandelor suprarenale ale fătului. Acest compus este transformat în estriol la nivelul ficatului fătului. Dozarea estriolului este recomandată în cadrul triplului test ce evaluează suferința fetală sau preeclampsia [9].

2.3. Laptele

2.3.1 Compoziția laptelui uman

Laptele poate fi considerat un sistem complex, o emulsie de lipide care în faza apoasă se organizeaza ca micele de cazeină, fosfați, citrați de calciu, lactoză și vitamine hidrosolubile. Laptele matern reprezintă nutriția perfectă pentru sugari, ca rezultat a milioanelor de ani de evoluție, adaptându-se perfect la cerințele copilului. Laptele matern conține proteine complexe, lipide si carbohidrați, concentrația lor modificându-se dramatic pe perioada lactației, reflectând nevoile copilului [10].

După vârsta de 8 luni se recomandă introducerea alimentelor cu un conținut în fier destul de bogat. Laptele uman conține aproximativ 88% apă, ceea ce înseamnă că nou-născutul nu va avea nevoie de cantitate suplimentară de apă, deoarece o primește prin alăptare. Din punct de vedere al compoziției, laptele uman conține 0,8-1,0% proteine, 3-6% lipide, 7-7,5% carbohidrați și 0,3% minerale [10].

Printre cele mai cunoscute proteine se numără cazeina, α-lactoalbumina, lactoferina, lizozimul sau imunoglobulina A. Proteinele din lapte sunt de tip cazeinic, aglomerate în micelii. În aceste micelii de cazeină sunt legate substanțe minerale precum fosforul organic sub formă de fosfoproteine în procent de 24%, fosforul mineral sub formă de fosfați de calciu în procent de 30% sau calciu organic și calciu mineral, regăsit 45%. La micelii mai pot adera fier, zinc sau cupru. Proteinele din lapte sunt reprezentate de lactoglobulină, lactoalbumină, imunoglobuline sau lactoferină. Se pot evidenția și fracții de natură non-proteică precum creatinină, uree, acid uric, amoniac, taurină, derivați ai glucidelor sau ai fosfolipidelor. Proteinele sunt de bună calitate, având un conținut bogat de aminoacizi. Cele de tip cazeinic intervin în coagularea laptelui prin formarea cheagului, dar și la formarea cazeinei prin precipitare cu acid clorhidric, în timp ce lizozimul și lactoferina, proteice serice, au rol bacteriostatic. Proteinele serice sunt superioare din punct de vedere calitativ celor cazeinice, raportul cazeinic:seric fiind de 2:4 [11].

Din punct de vedere al grăsimilor, aceasta este dată în lapte de conținutul ridicat de acid palmitic și acid oleic, concentrați în pozițiile 2, respectiv 1-3 din trigliceride. Laptele de la sfârșit, “hindmilk”, poate conține o cantitate dublă de grăsimi față de laptele praf. Lipidele, care reprezintă 40-55% din energia totală, se găsesc sub formă de emulsie. Predominant se pot găsi diacilgliceride, monoacilgliceride, trigliceride libere, fosfolipide și colesterol. Acizii grași polinesaturați cu lanț lung, molecule constituite din 20 de atomi de carbon și 2 legături duble, constituie 2% din totalul de acizi grași prezenți în lapte. Se semnalează prezența și a substanțelor minerale (calciu, fosfor, magneziu). Ele pot să fie legate de molecula proteică, fie pot sa fie în formă liberă în masa laptelui. Raportul Ca:P influențează coagulabilitatea laptelui, căci în procesul de pasteurizare are loc precipitarea sărurilor de calciu, iar raportul inițial se restabilește prin adaos de clorură de calciu (CaCl2) [11].

În ceea ce privește enzimele din lapte, se discută de prezența lactoperoxidazei, catalazei, superoxid-dismutazei, a proteazei alcaline și acide. Lactoperoxidaza este solubilă în lactoser (partea lichidă din lapte rămasă după închegare), având acțiune antibacteriană. Proteaza alcalină și cea acidă intervin în degradarea preferențială a cazeinei. Superoxid-dismutaza produce apă oxigenată din superoxid, împiedicând oxidarea acizilor grași nesaturați. Alături de acest echipament alcătuit din proteine, grăsimi, minerale și vitamine, se adaugă hormonii, printre care amintim prolactina, prostaglandinele, gonadotropina sau tirotropina. Prolactina are efect mamotrop, lactotrop și libidinal la mamifere. De asemenea, laptele conține și pigmenți printre care se numără riboflavina, lactocromul și carotenul. Riboflavina conferă culoarea crem-verzuie, carotenul culoarea galben-portocalie, în timp ce lactocromul o culoare albăstruie-verzuie [12].

2.3.2. Tipurile de lapte

Se cunosc trei tipuri de lapte. În primele zile precedente nașterii apare colostrul. Este un lichid de culoare gălbuie, ce conține o mare cantitate de proteine și minerale și mai puține glucide și grăsimi decât laptele. Este foarte bogat în imunoglobuline de tip A, care îi oferă nou născutului protecție față de agresiunile germenilor patogeni enterici [13].

Începând cu ziua a șasea de la naștere, apare laptele de tranziție. Nu este atât de nutritiv ca și colostrul, dar pregătește sistemul digestiv al nou-născutului pentru a digera mai bine laptele matur [13].

Laptele de tranziție are o cantitate mare de lactoză, fosfor și o cantitate mai mică de proteine și minerale. De altfel, laptele de tranziție ajută copilul să recupereze greutatea pierdută după naștere. La aproximativ 10-30 zile după naștere apare laptele matur. Acesta este format din două părți: laptele de început, care potolește setea bebelușului și partea a doua, bogată în nutrienți, care hrănește copilul [13].

În plus față de furnizarea unei surse de nutriție, laptele matern conține o multitudine de componente biologic active. Aceste molecule posedă roluri variate printre care rolul de a conduce la dezvoltarea sistemului imunitar, dar se implică și în microbiota intestinală. Dezvoltarea microbiotei este determinată de oligozaharidele din laptele uman, a căror sinteză este determinată de genotipul matern. Demonstrarea bioactivității laptelui matern a arătat că expresia genică în tractul gastrointestinal neonatal este influențată de alăptare, cu o expresie diferențiată între copiii hrăniți cu formule și sugarii hrăniți la sân în genele care reglează proliferarea celulelor intestinale, diferențierea și funcția de barieră [13].

Cantitativ, oligozaharidele ocupă a treia poziție, după lactoză și lipide, din punct de vedere al mărimii solutului. Fiecare oligozaharid se compune prin combinația variabilă a glucozei, galactozei, acidului sialic, fucozei si N-acetilglucozaminei cu multiple legături între particule. Cantitatea de oligozaharide din laptele uman variază în funcție de durata lactației, ritmul diurn și materialul genetic al mamei. Ele se comportă ca fibre solubile în lapte, iar structural sunt capabile să se comporte ca liganzi în competiție ce protejează fătul în timpul hrănirii de patogenii, acționând ca probiotic. De asemenea, intervin și în dezvoltarea craniană a fătului. Laptele matern conține factori bioactivi capabili să inhibe inflamația, precum și creșterea producției de anticorpi specifici, incluzând compușii PAF-acetilhidrolază, antioxidanții si interleukinele 1, 6, 8 și 10. Laptele matern conține, de asemenea, factori cu potențialul de a media diferențierea și creșterea celulelor B, incluzând concentrații mari de moleculă 1 de adeziune intracelulară și moleculă de adeziune vasculară 1 [13].

2.3.3. Intoleranța la lactoză

În ceea ce privește problematica intoleranței la lactoză, ea este cunoscută drept o afecțiune pediatrică destul de frecventă. Intoleranța la lactoză reprezintă incapacitatea de a metaboliza principalul dizaharid regăsit în lapte, lactoza, dar și din alte produse lactate. Este cauză a deficitului de lactază, enzimă care metabolizează lactoza în intestinul subțire [14].

Prevalența intoleranței la lactoză variază de la un nivel scăzut în nord-estul Europei până la cele mai multe cazuri constatate în Asia. Intoleranța la lactoză diferă de alergia la lapte, deși au simptome similare, însă afecțiuni digestive foarte diferite. Alergia la lapte se poate traduce printr-o reacție asupra proteinelor regăsite în lapte decât la lactoză [14].

Oamenii pot fi genetic predispuși în a nu produce lactaza, fie această incapacitate se datorează în urma intervențiilor în intestinul subțire sau a infecțiilor. La copii, lactoza este fermentată și metabolizată de bacteriile din colon, producându-le gaze și acizi grași cu catenă scurtă. Ca prime simptome, se pot recunoaște scaunele moi și emisia de gaze, diareea apoasă, balonarea, durerile abdominale, regurgitările, febra și erupțiile cutanate [15].

Pentru depistarea intoleranței la lactoză, i se va administra copilului un lichid, pe care orală, ce conține lactoză (2 grame de lactoză/kg corp), măsurându-se nivelul glicemiei de trei ori, în momentul administrării, la o oră și la două ore după ingestie. Dacă nivelul glicemiei se situează în parametrii normali, dar copilul prezintă simptomele specifice, se poate constata că organismului copilului nu a reușit metabolizarea lactozei. Se mai poate realiza testul hidrogenului în aerul expirat. Este un test neinvaziv, mai rar folosit în pediatrie, în care copilului i se va administra, oral, un lichid ce conține lactoză, verificându-se nivelul hidrogenului din aerul expirat la intervale de 30 de minute, timp de trei ore. Dacă lactoza nu este metabolizată, fermentează la nivelul intestinului, eliminându-se o cantitate mai mare de hidrogen [16].

2.3.4. Mastita

De asemenea, o nouă problematică în rândul femeilor o reprezintă refuzul sugarilor de a se hrăni de la sânii inflamați cu mastită. Mastita se dezvoltă frecvent în timpul alăptatului în decursul primelor trei luni postpartum și este recomandat să se prevină pe cât posibil pentru a nu agresa țesutul mamar [17].

Mastita alterează compoziția biochimică a laptelui matern prin creșterea permeabilității sânului. Creșterea conținutului de sodiu și clor și scăderea concentrației de lactoză reprezintă schimbări specifice în timpul mastitei. Totuși, laptele ar putea deveni mai sărat tocmai prin creșterea concentrației de sodiu. Gustul laptelui din mastită a fost evaluat în mod obiectiv, căci senzația gustativă este produsă când substanțele din alimente interacționează cu receptorii aflați pe membrana gustativă, și anume mugurii gustativi, identificându-se cinci gusturi de bază: acru, amar, sărat, dulce și savoarea (umami) [18].

Figura 2.6. Gusturile de bază [15]

Pentru a rezolva această problematică, s-a creat un sistem bazat pe un senzor care detectează nu componentele din alimente, ci intensitatea fiecărui gust prin înregistrarea unor picuri corespunzătoare, folosind o membrană polimerică. Studiul compară laptele donat de la mame sănătoase cu laptele de la mame diagnosticate cu mastită, identificându-se astfel diferențele în ceea ce privește nutrienții. Sunt incluse în studiu mame care au născut la termen, criteriul eligibil fiind acela de a nu fi suferit complicații în timpul nașterii. Femeile care fumează și consumă alcool nu au fost incluse în studiu. Au fost supuse testării femei cu vârste cuprinse între 29 și 36 de ani, iar laptele donat a fost transportat la laboratorul de cercetare, unde a fost depozitat la -80 grade Celsius [19].

Cele cinci gusturi de bază sunt determinate de anumiți componenți. Gustul sărat este determinat de ionii de sodiu, gustul acru este produs de acizi ce conțin protoni. Gustul dulce este determinat, de obicei, de zaharide, în timp ce savoarea este dată de aminoacizi liberi precum glutamatul sau 5'- guanina monofosfat (5'-GMP). Ureea este asociată cu gustul amar, iar alți componenți care ar putea determina acest gust nu au fost încă identificați [20].

S-au testat glutamatul și 5'-GMP pentru savoare, sodiul pentru sărat, ureea pentru amar, lactoza pentru dulce și pH-ul pentru acru. Aminoacizii liberi (glutamatul și ureea) au fost cuantificați folosind cromatografia clasică, 5'-GMP și zaharurile prin cromatografie lichidă, sodiul prin spectofotometrie, iar pH-ul cu ajutorul unui pH-metru cu electrod confecționat din sticlă [20].

Tranziția de la colostru la laptele matur se realizează cu modificări ale gustului laptelui. Astfel, s-a înregistrat scăderea nivelului de gust sărat și a savorii (umami) și creșterea nivelului de gust acru și amar (tabelul 2.1).

Tabel 2.1. Intensitatea celor cinci gusturi de bază [20]

Pentru determinarea compușilor ce analizează gusturile de bază s-au utilizat anumite echipamente. S-a constatat că în urma determinărilor specifice, sodiul, glutamatul și 5'-GMP au înregistrat creșteri considerabile în laptele provenind de la sânii inflamați cu mastită (tabelul 2.2).

Tabel 2.2. Concentrație compuși analizați pentru gusturile de bază [20]

2.3.5. Biomakeri din lapte și importanța diagnostică

Este bine cunoscut că laptele matern reprezintă modalitatea de hrănire optimă a nou-născuților și a sugarilor, însă poate fi folosit și în scop profilactic și terapeutic, atât pentru sugari, cât și pentru adulți. Un grup de cercetători de la Universitatea din Gothenburg, Suedia, a investigat activitatea antimicrobiană a laptelui uman. S-a dovedit faptul că este benefic în eradicarea celulelor canceroase in vitro, proprietate atribuită alfa-lactalbuminei [21].

Alfa-lactalbumina, împreună cu acidul oleic, formează compusul HAMLET (Human Alpha-lactalbumin Made Lethal to Tumour cells). Acest proces chimic are loc după tratarea laptelui uman în cazeină la un pH scăzut, deoarece pH-ul normal se situează între 5,0-6,5. Testele de laborator au demonstrat că acest compus a suprimat dezvoltarea a 40 de tipuri de celule canceroase [22].

Din acest motiv, HAMLET a fost utilizat la pacienți ce sufereau de cancer de vezică urinară, în urina excretată putând fi vizibile celule canceroase apoptotice, ceea ce a readus speranța pentru dezvoltarea unor noi planuri de tratament [15]. HAMLET a mai fost utilizat pentru administrarea intratumorală. S-a observat inducerea apoptozei celulelor tumorale și reducerea volumului tumorii existente. Totuși, nu a determinat apoptoza țesutului cerebral in vivo [23].

Laptele uman donat în centre specializate poate contribui la recolonizarea tractului digestiv al persoanelor care au urmat tratamente anticanceroase, protejând în acest fel mucoasa. Poate fi benefic adulților diagnosticați cu cancer. Cantitățile mici de lapte uman pot contribui la reglarea nivelului de IgA a persoanelor care au urmat radioterapia și chimioterapia. Deficitul de IgA atinge cote alarmante mai ales după transplantul hepatic, rata de mortalitate apărând la 120 zile posttransplant. În cadrul unui studiu, unor pacienți cu deficit de IgA li s-a administrat oral lapte matern, timp de 10 zile posttransplant. S-a constatat că nivelul de IgA crescuse considerabil, nefiind nevoie de intervenția unor administrări pe cale parenterală [24].

Prezența celulelor stem în laptele matern a fost descoperită de dr. Cregan în anul 2007. Celulele stem prezintă un marker, nestina, specific acestor celule. Nestina este o proteină care codifică genele NES. Se găsește cu precădere pe cromozomul 1 uman, având rol în creșterea radială a axonului. Celulele stem mamare, pluripotente, sunt responsabile în terapiile pentru pacienții care suferă de leziuni la nivelul sistemului nervos central, fie în boli regenerative de tipul diabetului sau a bolii Parkinson [25].

2.4. Sarcina

2.4.1. Caracteristici generale

Perioada sarcinii este divizată în trei stadii de dezvoltare: stadiul tual, stadiul embrionar și stadiul fetal. Stadiul tual cuprinde perioada de două săptămâni din momentul implantării, stadiul embrionar cuprinde săptămânile 3-7, în timp ce stadiul fetal cuprinde săptămânile 8-38. În mod normal, o sarcină este formată din 40 de săptămâni, divizată în trei trimestre: trimestrul I, trimestrul II și trimestrul III. Trimestrul I este considerat trimestrul cu riscul cel mai mare de moarte intrauterină, în trimestrul II dezvoltarea fetusului fiind mult mai ușor de monitorizat, în timp ce în trimestrul III se apreciază viabilitatea fetusului. Trimestrul I cuprinde săptămânile 0-13, trimestrul II săptămânile 14-27, iar trimestrul III [26].

Printre analizele de biochimie realizate în trimestrul I se numără hemoleucograma, determinarea glicemiei pentru a exclude riscul de diabet, profilul lipidic, calcemia, determinarea proteinelor serice (albumină, fibrinogen), acid uric, creatinină și uree, determinarea concentrației bilirubinei, ionograma, dar și profilul de coagulare [26].

Profilul de coagulare este necesar în condițiile în care există tendința de hipercoagulare a sângelui numita trombofilie, ce pot influenta evoluția normala a sarcinii, conducând la accidente variate ce pot culmina cu moartea intrauterină. În profilul de coagulare se urmărește concentrația proteinelor C și S, concentrațiile de AT III (antitrombina III), a homocisteinei, a D-dimerilor precum și prezența factorilor ereditari (mutații la nivelul factorilorV, II, MTHFR, PAI) [26].

În cadrul trimestrului I se efectuează dublul test, realizat între săptămânile 11-13, test care oferă informații despre anomaliile cromozomiale cele mai întâlnite: sindromul Down (trisomie 21) și sindromul Edwards (trisomia 18). Sindromul Down determină afectări precum malformații digestive, defecte septale cardiace și caracteristici fizice specifice, sindromul Edwards fiind o condiție mult mai severă, fatală până la vârsta de un an, caracterizată prin malformații ale sistemului nervos central și dismorfii cranio-faciale [26].

În cadrul dublului test se determină PAPP-A și β-HCG (care detectează cantitatea de hormon din sânge) și translucența nucală. Translucența nucală reprezintă grosimea maximă a spațiului subcutanat din zona cervicală a fătului. Translucența nucală a fost descrisă pentru prima dată de Benacerraf în anul 1980 la fetușii diagnosticați cu sindrom Down. Ea poate crește în urma anomaliilor de activitate cardiacă, în anemia fetală sau în disfuncția formării țesutului limfatic. Translucența nucală nu poate servi drept diagnostic, ci este considerat doar un marker unic pentru o posibilă anomalie [26].

Dublul test mai cuprinde și calcularea de MoM (multiplul de mediană) pentru PAPP-A și β-HCG prin împărțirea valorii obținute la mediana corespunzătoare vârstei gestaționale, calcularea MoM raportată la translucența nucală (NT) și vizualizarea osului nazal, căci o lipsă sau dimensiunile reduse indică o posibilitate de sindrom Down, deși nu se cunoaște mecanismul [26].

Mai există varianta efectuării a dry testului de trimestru I, care este un test de mare eficiență, de depistare a anomaliilor cromozomiale, fiind luate în considerare vârsta mamei și anumiți hormoni care se găsesc în sânge. Față de dry test, dublul test are o eficiență mult mai redusă. Se mai poate realiza testul de screening NIPT (non invasive prenatal tests), în țara noastră fiind cunoscute testul Panorama și testul Harmony. Testul Panorama se poate efectua începând cu săptămâna a 9-a, cuprinde o testare de sânge prin care se identifică ADN-ul fetusului și depistează cazurile de trisomii sau a celor de triploidii în care există trei seturi de cromozomi de același tip. În cazul testului Harmony se oferă informații despre posibilele aneuploidii ale cromozomilor 21, 18, 13, X și Y, tot printr-un test de sânge deloc invaziv pentru mamă și fetus [27].

Trimestrul II cuprinde săptămânile 13-27 ale sarcinii, iar în acest caz se va repeta hemoleucograma pentru urmărirea concentrației de hemoglobină care nu trebuie să scadă sub 11 g/dL, astfel vor fi administrate suplimente de fier și vitamine. Se va putea efectua ecografia care indică sexul fătului, iar în cazuri în care triplul test este pozitiv, se va efectua amniocenteza, o procedură invazivă care permite detectarea anomaliilor de tub neural. Defectul de tub neural, cunoscut și sub numele de spină bifidă, reprezintă defectul congenital al coloanei vertebrale în lipsa sudurii complete a vertebrelor. Riscul pierderii sarcinii prin această metodă invazivă este scăzut, doar de 0,5%. De asemenea, în consecința rezultatului pozitiv se poate efectua și biopsia de vilozități coriale, care presupune recoltarea unui fragment de placentă, fiind de asemenea o metodă invazivă. În cadrul trimestrului II se va efectua triplu test, dar și dry test, identic cu cel din trimestrul I. Triplu test reprezintă o continuare a dublului test din trimestru I, însă cu mici diferențe. Triplu test urmărește determinarea concentrației AFP, estriolului și a β-HCG, test care va evalua riscul dezvoltării unui defect de tub neural [27].

În anumite situații se detectează, alături de AFP, estriol și β-HCG, și inhibina A, o glicoproteină dimerică sintetizată de ovar și placentă, cu două subunități: α și β. Toate aceste patru analize formează cvadruplu test. În mod normal, concentrațiile de AFP și estriol cresc, iar concentrațiile de β-HCG și inhibina A scad. La o detectare de sindrom Down, concentrațiile de AFP și estriol scad, în timp ce concentrațiile de β-HCG și inhibina A cresc de aproximativ două ori peste normal. De asemenea, în săptămâna 22 de sarcină se va efectua ecografia Doppler, se va repeta hemoleucograma, analizele de biochimie. Se vor face dozări specifice de IgG și IgM pentru toxoplasma gondi mai ales pentru femeile ce trăiesc în același loc cu patrupede. Se va realiza ecografia morfologică 3D/4D, unde vor fi vizualizate pe ecranul ecografului sistemul nervos, bătăile inimii, organele abdominale cu scopul depistării altor anomalii [27].

Începând cu trimestrul III, consultațiile vor fi mai dese, la două săptămâni începând cu săptămâna 31 de sarcină și o dată pe săptămână începând cu săptămâna 36 de sarcină. Se va repeta hemoleucograma, avându-se grijă ca nivelul de hemoglobină să nu scadă sub 10,5 g/dL, se va recolta secreție vaginală pentru depistarea unei posibile infecții neonatale determinată de prezența streptococului de grup B (β-hemolitic), dar se va realiza și o urocultură. Dacă urocultura apare pozitivă, se va administra tratament cu antibiotic intravenos în timpul travaliului. Vizita din cadrul săptămânii 28 va include repetarea uroculturii pentru determinarea nivelului de glucoză și a proteinelor din urină [27].

Pentru screening-ul diabetului gestațional se va efectua TTGO, numit și test de toleranță la glucoză pe cale orală. TTGO este un test standard și se folosește când glicemia bazală (FPG) este neconcludentă. Pregătirea pacientei începe cu trei zile înainte prin dietă, cel puțin 150 g hidrați de carbon și prin efort fizic moderat. Se va face repaus alimentar cel puțin opt ore înainte, dar nu mai mult de 16 ore. Se va recolta glicemia bazală pe vacutainer cu anticoagulant, se prinde o linie venoasă, se vor dizolva 75 grame glucoză pulbure, de concentrație 25%, în 200-300 mL apă și se ingeră în maxim 5 minute. În caz contrar, se va reface testul. Se poate adăuga în apă zeamă de lămâie. La două ore de la ingerare, se va mai recolta o glicemie. La două ore, un pacient sănătos prezintă o valoare mai mică de 140 mg/dL. Dacă valorile sunt mai mici sau egale cu 140 mg/dL, dar mai mici de 200 mg/dL, indică prezența unui prediabet. Dacă valorile depășesc 200 mg/dL se indică prezența diabetului zaharat clinic manifest sau a diabetului gestațional în cazul femeilor însărcinate. Dacă pacienta prezintă intoleranță la glucoză, testul nu este indicat [27].

La vizita de 32 de săptămâni se va realiza ecografia 3D/4D în cadrul căruia se va aprecia lungimea femurului și circumferința craniană și se vor analiza aPTT, timpul de protrombină și fibrinogenul. La vizita de 36 de săptămâni se va aprecia data probabilă a nașterii, gradul de maturitate al placentei, se va măsura ritmul cardiac și greutatea fătului, cantitatea de lichid amniotic și se va măsura obligatoriu tensiunea arterială a mamei [27].

2.4.2. Inserția placentară

În ciuda acestor testări trimestriale, încă se discută dacă există riscul ca inserția placentară și Rh-ul femeii însărcinate să influențeze biomarkerii serici de trimestru II, AFP, estriolului și a β-HCG. Un grup de medici români din cadrul Spitalului Universitar de Urgență Elias, București au inclus în studiu seruri recoltate de la 1709 de femei însărcinate aflate la prima sarcină, cu o vârstă gestațională cuprinsă între 15-22 de săptămâni. Criteriul de selecție diferențial l-a constituit diabetul gestațional. Pentru determinarea Rh-ului s-a folosit tehnica de hemaglutinare, în timp ce determinarea AFP, β-HCG și a estriolului s-a realizat din ser prin tehnica chemiluminescenței utilizând Immulite One și kituri produse de Siemens Healthcare. MoM a fost calculat cu ajutorul programului Prisca 4.0, corecția MoM producându-se în funcție de greutatea mamei [28].

Din lotul de 1709 de femei, la 39 dintre ele a apărut o restricție de creștere intrauterină, la 6 restricția fiind corelată cu hipertensiunea arterială și la 9 dintre participante a fost identificat oligohidramnios, adică o cantitate scăzută de lichid amniotic, principala cauză fiind ruperea membranelor. În cazul celor 1655, sarcina a avut o evoluție normală, fără o patologie asociată. Din cele 1655 de femei însărcinate, la 97 dintre ele nu s-a determinat Rh-ul. Așadar, s-a constatat că din 1558 de femei doar 200 au Rh negativ și 1358 Rh pozitiv. Din lotul de 1655, 25 dintre ele au placentă previa, moment în care placenta se extinde în partea inferioară a uterului și acoperă deschiderea colului uterin și doar 1630 o placentă inserată normal. Concluzia studiului a fost că nu există diferențe semnificative între valorile biomarkerilor de trimestru II în urma comparației femeilor cu placentă previa și placentă inserată normal, cum și între comparația dintre femeile cu Rh pozitiv și cele cu Rh negativ (tabelul 2.3) [28].

Tabel 2.3. Modificările biomarkerilor serici de trimestru II în urma comparației dintre placenta inserată normal și placenta previa [28]

2.5. Importanța testelor genetice din cadrul sarcinii

Testele genetice sunt de înaltă specificitate, folosesc biologia moleculară, nu sunt influențate de alte boli [29].

Principalele tipuri de țesuturi utilizate în citogenetică sunt sânge prelevat prin puncție venoasă, lichidul amniotic obținut prin amniocenteză după săptămâna 15 de sarcină, trofoblast, vilozități coriale recoltate în săptămânile 11-12 de amenoree, țesut conjunctiv ce vizează fibroblaștii obținuți prin biopsie embrionară. Se consideră că analiza citogenetică efectuată pe lichid amniotic are o acuratețe ce se apropie de 100% pentru depistarea anomaliilor cromozomiale fetale [29].

Este esențial să se determine dacă o pacientă prezintă un set cromozomial ce diferă de pattern-ul standard al celor 23 de cromozomi. Anomaliile citogenetice sunt de două tipuri: de tip numeric și de tip structural. Cariotipul uman este format din 46 de cromozomi, organizați în câte 23 perechi, fiecare celulă conținând 22 perechi de autozomi, precum și o pereche de cromozomi sexuali, unul de proveniență maternă, iar celălalt de origine paternă [30].

În testarea defectelor cromozomiale sunt implicate teste genetice precum bandările, cariotiparea, metoda moleculară (array CGH) sau tehnica rapidă FISH cu rol în depistarea aneuploidiilor cromozomilor 18, 13, 21. Toate aceste tehnici se recomandă în cazurile în care vârsta maternală depășește 38 de ani, se evidențiază un risc crescut după efectuarea dublului sau a triplului test, în situația în care există o naștere anterioară a unui copil cu anomalii cromozomiale, când ecografia fetală este anormală sau când există istoric familial pozitiv cu predispoziție pentru anomalii cromozomiale [30].

2.5.1. Cariotipul și bandările

Un cariotip constituțional pentru diagnostic citogenetic postnatal este realizat uzual din sânge, cultivat pe o perioadă de 72 de ore, în timp ce un cariotip fetal poate fi realizat pornind de la celule din lichidul amniotic (amniocite) cultivate în condiții speciale (în incubator cu ) pe termen lung de 10-14 zile sau din vilozități coriale mult mai devreme. În cazul avorturilor spontane sau al nou-născuților se realizează folosind fibroblaștii din biopsia de tegument, organ sau țesut fetal. De asemenea, se poate obține cariotipul din sânge fetal prin recoltare din cordonul ombilical sau prin puncție intracardiacă la avorturile tardive [31].

Prin anumite procedee tehnice ce presupun denaturare termică și enzimatică, urmate de etapa de colorare, cromozomii din preparatele microscopice obținute după fixare pot fi evidențiați colorat neomogen cu benzi care alternează, mai intens colorate sau mai puțin intens colorate, într-un model caracteristic și constant pentru fiecare pereche. Tehnica de bandare permite recunoașterea exactă a perechilor de omologi, identificarea aneuploidiilor și identificarea modificărilor structurale cromozomiale [31].

În funcție de gradul de condensare a cromozomilor (în metafază sau prometafază), numărul benzilor variază și definește rezoluția analizei citogenetice. Un cariotip standard prezintă 350-550 benzi/set. Pentru a desemna o anumită bandă, se menționează în ordine numărul cromozomului, simbolul brațului, numărul regiunii și numărul benzii din regiune. De exemplu, lq25 indică cromozomul 1, regiunea 2, banda 5 [31].

Există două tipuri de benzi: benzi utilizate pentru identificarea longitudinală a cromozomilor și benzi utilizate pentru evidențierea unor regiuni cromozomiale. Din cadrul benzilor utilizate pentru identificarea longitudinală fac parte benzile Q, G și R, iar din cadrul benzilor utilizate pentru evidențierea regiunilor cromozomiale fac parte benzile T, C și NOR [32].

Benzile G (benzi fluorescente) se obțin după tratamentul preparatului cu tripsină și colorare ulterioara cu Giemsa, moment în care se evidențiază regiunile heterocromatice bogate în adenină și timină și secvențe LINES [32].

Fig. 2.7. Cromozomi bandați G [32]

Benzile Q (benzi fluorescente, luminoase, transversale, pozitive) alternează cu interbenzi întunecate (negative). Se obțin în urma tratării cu quinacrină, fluorocrom ce se fixează pe regiunile bogate în adenină și timină. Lamele se examinează în lumină fluorescentă. Porțiunea distală a cromozomului Y prezintă fluorescență intensă prin corpusculul F [32].

Figura 2.8. Cromozomi bandați Q [32]

Benzile R (reverse bands) se obțin în urma denaturării termice a ADN-ului și tratarea preparatelor cu o soluție salină și colorare cu Giemsa, corespunzând regiunilor bogate în citozină și guanină [32].

Figura 2.9. Benzile G (stânga) și benzile R (dreapta) [32]

Benzile T reprezintă un subset de benzi R obținute prin denaturare termică marcată (telomerele sunt rezistente la căldură) și colorare cu acridin-oranj, fiind o tehnică foarte laborioasă [32].

Benzile C se obțin prin încălzirea în soluții alcaline (hidroxid de bariu) și colorare cu Giemsa. Se evidențiază heterocromatina constitutivă (ADN satelit), în special de la nivelul centromerelor tuturor cromozomilor (când brațele rămân necolorate), dar și de la nivelul constricțiilor secundare de pe brațul lung (q) al cromozomilor 1, 9, 16 și brațul lung al cromozomului Y [32].

Figura 2.10. Cromozomi bandați C [32]

Benzile NOR se obțin prin colorare cu nitrat de argint, evidențiindu-se regiunile organizatoare nucleolare (NOR – nucleolar organizer regions), localizate pe brațele scurte ale cromozomilor acrocentrici (perechile 13-15, 21-22) [32].

Figura 2.11. Cromozomi bandați NOR [32]

2.5.2. Tehnici genetice de diagnostic prenatal

Ecografia fetală este o analiză ce poate fi efectuată de rutină la toate pacientele însărcinate, metoda fiind foarte utilă pentru evaluarea dezvoltării produsului de concepție. Dacă în trimestrul I se permite evaluarea vârstei gestaționale, în cazul trimestrului II de sarcină se permite screening-ul anomaliilor structurale cromozomiale, iar în cadrul trimestrului III permite evidențierea acumulării de lichid amniotic [33].

Biopsia de vilozități coriale reprezintă altă metodă din practica medicală care se efectuează în săptămânile 10-12. Tehnica presupune aspirarea cu un cateter transcervical sau transvaginal din care se pot utiliza fragmente de trofoblaști a căror utilizare va fi exclusiv pentru teste citogenetice prin metode de PCR sau PCR-RFLP. Rezultatul testului va fi disponibil în 48 de ore de la recoltare. Metoda prezintă, însă, avantaje și dezavantaje: pe de o parte, reprezintă o metodă de diagnostic precoce, iar pe de altă parte, poate exista riscul contaminării cu celulele materne, riscul abortiv în 1-2% din cazuri sau chiar risc hemoragic și infecțios [33].

ADN-ul fetal liber circulant în sângele matern se regăsește în cantitate mare, izolarea fiind posibilă din săptămâna 10. Tehnica se realizează prin metoda PCR, fiind foarte utilă în cazul antecedentelor de boli genetice prin cromozomul X. ADN-ul fetal este izolat, amplificat și analizat prin platforma Illumina HiSeq. Este noninvazivă și prezintă o sensibilitate de 99%, însă costuri relativ ridicate [33].

2.5.3. Tehnica FISH și array CGH

Tehnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) analizează cromozomii cu ajutorul unor colorații fluorescente in situ a unor fragmente de ADN pe lamă, obținute artificial (sonde) care devin marcate cu fluorofor pe baza principiului complementarității. Dacă fragmentul de analizat se regăsește în genom, va apărea un semnal fluorescent în urma hibridizării, detectat în lumină UV, în timp ce lipsa fragmentului va duce la absența semnalului fluorescent [34].

Marcarea sondelor se poate realiza direct cu un fluorofor sau indirect prin atașarea unor haptene (care pot fi detectate cu un anticorp monoclonal marcat, pe baza reacțiilor Ag-Ac). Sondele utilizate se pot găsi sub formă de kit-uri sau pot fi preparate în laborator, cele mai frecvent utilizate fiind cele centromerice, care marchează zonele pericentromerice, sonde locus specifice care pot marca doar zona de interes și sonde pentru painting cromozomial care marchează cromozomul în întregime [34].

Etapele tehnicii FISH sunt:

Prelevarea materialului biologic

Pregătirea preparatului pe lamă și etalarea celulelor recoltate

Denaturarea termică a moleculelor de ADN prin separarea celor două catene

Hibridizarea ADN-ului cu ajutorul sondelor la 37° Celsius în atmosferă umedă

Eliminarea sondelor prin spălare cu soluții tampon

Detecția semnalelor specifice cu un microscop cu lumină UV

Interpretarea și elaborarea de diagnostic [34].

Tehnica FISH se poate regăsi sub mai multe forme: FISH standard, M-FISH (Multicolor FISH), CM-FISH (Centromeric Multicolor Fish), TM-FISH (Telomeric Multicolor FISH) și SKY-FISH (Spectral FISH). Avantajele tehnicii FISH sunt numeroase: este o tehnică rapidă spre deosebire de cele prin bandare, permite diagnostic precis și oferă posibilități asupra diagnosticului. Costurile sunt destul de ridicate mai ales prin prisma kitului de sonde, necesită un soft special de analiză și interpretare și nu se aplică de rutină [34].

Principiul aCGH este asemănător cu cel al CGH convențional (Fig. 2.12). Microrețelele sunt alcătuite din câteva mii de sonde diferite (fiecare specifică unei secvențe de ADN), nemarcate, fixate pe o lamă de sticlă sau pe un chip de silicon, în mici puncte („spots”) cu coordonate precise, dispuse în rânduri ordonate, sub forma unei rețele cu densitate înaltă (chip ADN). Pentru realizarea analizei este extras ADN genomic atât de la pacient (din limfocite, fibroblaste sau alte țesuturi) cât și dintr-o probă de referință (aceeași linie celulară ca a pacientului dar provenită de la unul sau mai mulți indivizi normali). Cele două probe de ADN sunt fragmentate (cu ultrasunete sau prin digestie cu o enzimă de restricție), marcate cu fluorocromi diferiți (Cy3 – verde pentru proba test, Cy5 – roșu pentru proba martor), amestecate în cantități egale, denaturate și co-hibridizate pe microrețea [34].

După spălare, microrețelele sunt scanate cu un microarray scanner, iar imaginile obținute sunt analizate folosind un program ce cuantifică intensitățile de emisie ale fluorocromilor roșu și verde pentru fiecare spot din rețea și calculează raportul lor [34].

Tipurile de rețele folosite sunt de două tipuri: rețele „țintite” și rețele ce acoperă întregul genom. Rețelele „țintite” (targeted) conțin fragmente specifice de genom – precum cele din regiunile subtelomerice sau cele în care se produc frecvent microdeleții/ microduplicații implicate în producerea unor sindroame plurimalformative. Rețelele genomice („whole genome” sau „tiling path” – cu clone suprapuse) permit acoperirea întregului genom cu o rezoluție care depinde de distanța dintre sonde [35].

Rețelele „whole genome” cu densități foarte mari sunt folosite în cercetare și au dus la definirea a noi sindroame și la caracterizarea în diverse anomalii cromozomiale sau mutații genice, dar nu au aplicabilitate clinică datorită identificării a numeroase CNV (Copy Number Variations) [35].

Figura 2.12. Principiul tehnicii CGH [35]

Sondele pot fi de tip BAC (Bacterial Artificial Chromosome – cromozomi artificiali bacterieni), ADN complementar, oligonucleotide sau SNP (Single Nucleotide Polymorphism – polimorfism al unui singur nucleotid). Testarea clinică prin aCGH, indiferent de tipul de sonde sau de rețea utilizată, impune următorul algoritm. Dacă este detectată o anomalie patogenică cunoscută, ea va fi validată prin altă metodă (FISH sau Q-PCR) și raportată [36].

Secvențierea ADN-ului presupune următoarele etape:

Liza membranelor celulare, în această etapă utilizându-se o soluție cu rol de detergent care ajută la procesul de lizare, urmată de o etapă de centrifugare în care se sedimentează nucleii și mitocondriile

Liza membranelor nucleare și digestia ARN-ului, etapă în care are loc liza membranelor nucleare și mitocondriale

Precipitarea proteinelor, urmată de etapa de centrifugare, rezultând un sediment și un supernatant în care se găsește ADN-ul

Precipitarea ADN-ului cu o soluție de izopropanol, etapă în care ADN-ul devine vizibil sub formă de lanțuri fine, albe

Spălarea ADN-ului cu soluție de etanol 70%

Rehidratarea ADN-ului timp de 12-24 de ore la temperatura camerei sau la frigider la 4 grade Celsius [36].

Pentru a se determina concentrația de ADN, proba se măsoară spectrofotometric, concentrația de ADN depinzând mai ales de calitatea probei din care s-a realizat extragerea (sânge integral), fiind importantă lipsa coagulilor, cât și stabilitatea probei, căci o probă mai veche de sânge poate duce la o cantitate mai scăzută de ADN [36].

Metoda array CGH permite detecție globală, cu o rezoluție înaltă asupra duplicațiilor genomice. Nu necesită celule în diviziune, cu un timp de obținere a rezultatelor mai scurt, utilizând și probe recoltate prin biopsii, autopsii sau de la produși de avort. Aplicarea testului pe sânge periferic poate detecta mozaicisme care nu se pot detecta prin cariotipare care analizează doar limfocitele crescute in vitro după stimulare cu fitohemaglutinină. Este necesară o cantitate mică de probă biologică. Dezvantajele metodei includ imposibilitatea detectării de translocații sau inversii cromozomiale, costurile sunt mult mai ridicate decât în cazul unei cariotipări, iar în cazul identificării de CNV este necesară atestarea rearanjărilor genomice prin FISH sau qPCR [37].

Metoda array CGH își are aplicabilitatea în depistarea retardului mental și a anomaliilor congenitale multiple, în analiza celulelor fetale cu o sensibilitate și specificitate mai mare sau în diverse patologii de cancer, situație în care anomaliile genice apar frecvent prin mecanismul supresor al creșterii tumorale [38].

PARTEA SPECIALĂ

3. Analiza nivelului de cunoștințe al studenților Facultății de Medicină privind perioada de sarcină și biomarkerii specifici din sânge și lapte

3.1. Scopul studiului

Prezentul studiu și-a propus analizarea nivelului de cunoștințe privind biomarkerii specifici din sânge și din lapte, cât și despre unele aspecte legate de perioada de sarcină, la un grup de studenți din domeniul medical.

3.2. Designul studiului

Studiul realizat este de tip chestionar, realizat după consultarea literaturii de specialitate. Chestionarul administrat este compus din o serie de 38 de întrebări care cuprind, pe lângă datele socio-demografice caracteristice loturilor studiate, și întrebări cu privire la caracteristici biochimice, la principalii biomarkeri serici, investigații și teste prenatale, dar și la posibile ingestii de metale grele care ar putea afecta dezvoltarea normală a produsului de concepție.

Pretestarea chestionarului s-a realizat pe un grup de 3 persoane.

Loturile participante la studiu au fost alese din cadrul Facultății de Medicină din Universitatea Transilvania din Brașov, de la două programe de studii – Laborator clinic (LC) anul III și Medicină (MD) anul III.

Completarea chestionarului (Anexa 1) s-a realizat online (https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLScHJm6ueljTxrINUnh_6Z5sOrpq8lG33P2lGuyWEAIakJOxyg/viewform?usp=sf_link), fiind completat de 30 persoane/lot (Fig.3.1).

Figura 3.1. Chestionar online

Administrarea chestionarului s-a realizat în perioada mai- iunie 2019, iar sistematizarea și prelucrarea statistică a datelor obținute din partea lotului s-a desfășurat pe o perioadă cuprinsă între iunie – iulie 2019.

Generarea bazei de date inițiale s-a realizat automat la adresa

https://docs.google.com/spreadsheets/d/1gnufVJUd77jMjwOFZgBy5uyoCswY32i0SxaST0h0Quw/edit#gid=83508770. Sistematizarea datelor s-a realizat în programul Excel, unde au fost generate graficele corespunzătoare.

3.3. Rezultate și discuții

În cadrul studiului ce își propune evaluarea cunoștințelor studenților de la Facultatea de Medicină Brașov, având ca loturi de studiu câte 30 de studenți din anul III de la două dintre programele de studiu ale facultății, Laborator clinic (LC3) și Medicină (MD3), s-a realizat analiza statistică privind genul participanților (Figura 3.2.)

Figura 3.2. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind genul participanților

Analizând distribuția pe genuri ale celor două loturi (Fig.3.2), a rezultat un procent de 76,67 % în cazul Laboratorului Clinic, în timp ce pentru Medicină doar un procent de 66,67% în cazul femeilor. Laboratorul Clinic a înregistrat un procentaj de 23,33% în cazul bărbaților, în timp ce 33,33% băieți au completat de la Medicină.

Următorul aspect care a fost luat în discuție prezintă distribuția celor două loturi de studiu în ceea ce privește mediul de proveniență al acestora.

Figura 3.3. Distribuția răspunsurilor loturilor de studiu privind mediul de proveniență al participanților

Analizând Fig.3.3 s-a observat că studenții participanți au domiciliul stabil preponderent în mediul urban – 76,67% pentru Laborator Clinic și 70% pentru Medicină.

Electroforeza este procesul de separare a componenților unor amestecuri în funcție de proprietățile particulelor (sarcinile electrice și masele moleculare), de geluri și de condițiile experimentale. Dependent de acești factori, se obțin cinci fracțiuni: albumine, α1-globuline, α2-globuline, β-globuline și γ-globuline [4]. Loturile de studiu au fost chestionate privind fracțiile proteice obținute în urma electroforezei, iar rezultatele obținute au fost sistematizate în Fig. 3.4.

Figura 3.4. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind fracțiile proteice care se obțin în urma electroforezei

Procentele pentru răspunsurile oferite de loturile de studiu au fost aproape similare, cu valori între 83,3% până la 96,67%, indiferent de specializarea de care aparțin, ceea ce sugerează faptul că ambele loturi cunosc suficient de bine electroforeza și ceea ce implică acest proces.

Imunoglobulinele se pot clasifica în cinci clase de imunoglobuline, fiind importante pentru a explica mecanismele de apărare imună [4]. Loturile de studio au fost chestionate privind numărul de tipuri de imunoglobuline (Fig.3.5).

Figura 3.5. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind tipurile de imunoglobuline existente

Se observă că toți studenții de la MD au ales în totalitate varianta de cinci tipuri de imunoglobuline (100%), în timp ce studenții de la LC au considerat că există cinci tipuri într-un procent de 86,67%, trei tipuri – 10% și două tipuri – 3,33%. Niciun participant la studiu nu a considerat că există un singur tip.

Imunoglobulinele se clasifică în cinci clase: imunoglobuline G, M, D, A, E. Toate cele cinci au o structură asemănătoare. Imunoglobulinele pot fi identificate în ser, urină, lichid cefalorahidian, laptele matern, ganglioni, splină sau gălbenuș de ou [4]. Loturile de studiu au fost solicitate să indice exemple de clase de imunoglobuline, iar răspunsurile sunt sistematizate în Fig.3.6.

Figura 3.7. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind tipurile de imunoglobuline

În acest caz (Fig.3.6), procentele sunt similare, luând valori între 83,33% si 100%, procente mai mari înregistrându-se în cazul grupului de la LC.

Selectarea caracteristicilor imunoglobulinei G (Ig G) a fost subiectul uneia dintre întrebările adresate participanților la studiu (Fig.3.7).

Figura 3.7. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind caracteristicile Ig G

Imunoglobulinele G (IgG) se găsesc în proporția cea mai mare, cei din cadrul LC considerând în proporție de 56,67%, în timp ce cei de la MD având rezultate mai satisfăcătoare cu un procent de 93,33%.

Transferul placentar de imunoglobuline reprezintă un proces activ care include receptorul FcRn, fiind particular intens la finalul primului trimestru de sarcină. Transferul imunoglobulinic reflectă experiența imunologică a mamei care permite trecerea pasivă către făt încă din primele luni de viață. Protecția neonatală conferită de transferul placentar de imunoglobuline e optimizat de nașterea la termen, de imunogenitatea antigenică și de o placentă sănătoasă [39]. Ele pot traversa bariera placentară astfel încât la naștere mama și puiul prezintă concentrații aproximativ egale de imunoglobuline.

În acest caz, procentul a fost distribuit în mod egal, 96,67%. Se sintetizează în faza cronică, cu un punct maxim pe la 14-21 zile și există sub forma a patru subtipuri [4]. În acest caz, diferențele de procentaj sunt de doar 13,33% între participanții studiului. O mică parte din aceștia au considerat că apar în faza acută (între 6,67% – 20%), că prezintă o structură pentameră (între 3,33% -13,33%) sau că intervin în procese de anafilaxie (10% doar din partea celor de la MD). Există studii care atestă faptul că nivelurile scăzute de Ig G sunt în strânsă relație cu sindromul nefrotic primar (PNS) manifestat în rândul copiilor. Totuși, mecanismul nu este încă foarte bine cunoscut. Pentru această asociere, s-a recoltat sânge periferic de la copii cu PNS apropiați ca vârstă, fenotipul și funcția moleculară a limfocitelor B și T helper fiind examinate prin flowcitometrie (citometrie de flux). A rezultat faptul că pe lângă stimularea CD40 in vitro, expresia ARN-ului mesager (ARNm) în monocite este scăzut și că imunoglobulina G (IgG) este parțial disfuncțională ca și celulele T helper în sindrom nefrotic primar [40].

Studenții participanți la studiu au fost chestionați privind compoziția laptelui matern, iar rezultatele au fost sistematizate în Fig.3.8.

Figura 3.8. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind compoziția laptelui matern

Laptele poate fi considerat un sistem complex, caracterizat ca o emulsie de lipide care în faza apoasă poate genera micele de cazeină, lactoză și vitamine hidrosolubile. Laptele matern conține proteine complexe (0,8-1%), lipide (3-6%) și minerale (0,8%) [4]. Se poate observa că studenții celor două loturi de studiu au ales prioritar proteinele complexe, lipidele și mineralele, în procente de până la 100% în cazul celor de la MD (Fig.3.8). Totuși, o parte din studenți au considerat adevărate și variante precum apa, fierul sau zincul, dar nu considerate adevărate conform studiilor ultimilor ani.

Un studiu realizat în Coreea de Sud a dorit să demonstreze prezența acizilor grași în laptele uman corelat cu alimentația mamelor ca necesar de sursă energetică. S-au obținut 238 de probe de lapte uman de la mame voluntare care au donat lapte matern, concentrația de acizi grași fiind analizată prin spectrometrie IS. Concentrația de acizi grași a fost pusă și pe seama vârstei maternale, a indicelui de masă corporală, suplimente luate în cadrul sarcinii și vârsta nou-născuților. Concluzia cercetătorilor a fost aceea că laptele matern colectat din Coreea de Sud conține concentrații ridicate de DHA (acid docosahexaenoic) și PUFA (acizi grași polinesaturați) comparat cu probe din țările vestice, PUFA fiind în concentrații considerabile care să susțină dezvoltarea cognitivă și vederea în parametrii normali [41].

Laptele conține și pigmenți printre care se numără riboflavina, lactocromul și carotenul. Riboflavina conferă culoarea crem-verzuie, carotenul conferă o culoare galben-portocalie, în timp ce lactocromul o culoare albăstruie-verzuie (Fig.3.9) [9].

Figura 3.9. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind pigmenții din lapte

Analizând nivelul de cunoștințe privind informații (Fig.3.9), s-a observat că 56,67% dintre cei de la LC au considerat că riboflavina este pigment al laptelui în comparație cu 80% de la MD. Totuși, pentru lactocrom diferența de 3,34% între cele două specializări a fost nesemnificativă, în timp ce pentru caroten, studenții de la MD au considerat că și acest pigment face parte din compoziția laptelui. Există și câteva răspunsuri care includ ca variante clorofila, regăsită doar în plante, sau bilirubina (16,7%). Un studiu irlandez [42] a dorit să coreleze eficacitatea spectrofotometriei cu infraroșu în ceea ce privește culoarea laptelui. Studiu a fost efectuat pe lapte de vacă, colectat de la 529 de vaci. După colectarea laptelui, probele au fost stocate la 4 grade Celsius, utilizându-se ulterior un aparat care identifică culoarea, Chroma Meter CR 400, ce folosește drept standard culoarea albă. Datele spectrale obținute au fost transformate în absorbanță lineară folosind logaritmul drept formulă de calcul. S-a concluzionat faptul că laptele își conferă diverse grade de colorație nu doar din prisma pigmenților existenți în colorații mari, precum carotenul, ci și prin concentrațiile de acizi grași existenți la nivelul miceliilor de cazeină care au culoare albă.

În primele zile precedente nașterii apare colostrul, un lichid de culoare gălbuie ce conține o mare cantitate de proteine și minerale și mai puține glucide și grăsimi decât laptele. Este foarte bogat în imunoglobuline de tip A, care îi oferă nou născutului protecție față de agresiunile germenilor patogeni enterici [10].

Figura 3.10. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind colostrul

În acest caz (Fig.3.10), opiniile studenților participanți la studiu sunt diferite. În ceea ce privește conținutul bogat de Ig A, cei de la MD au ales această variantă în proporție de 73,33%, în timp ce LC doar 26,67%. Conținutul scăzut de grăsimi și glucide a fost apreciat mai degrabă de cei de la LC, 46,67%, urmând MD cu un procent de 40%. Protecția oferită nou-născutului față de agresiunile germenilor patogeni a fost considerată adevărată mai degrabă de LC (66,67%), spre deosebire de MD (53,33%). Este cunoscut faptul că acest "prim lapte" are caracter terapeutic în tratarea diverselor afecțiuni gastrointestinale ale nou-născuților. Conține cantități ridicate de peptide antimicrobiene, modulând astfel răspunsul imun și echilibrând microbiota intestinală. Diverse studii efectuate in vitro și in vivo pe oameni și animale sugerează indică eficacitatea colostrului provenind de la ambele specii, neexistând reacții adverse ale administrării acestuia. Așadar, suplimentele pe bază de colostrum ar putea juca un rol esențial și complementar asupra afecțiunilor gastrointestinale ale nou-născuților [43].

În ultimele decenii, s-a pus problema situațiilor în care se impune întreruperea alăptării, principalele motive fiind pe fondul când mama suferă de mastită sau când este infectată cu virus HIV (Fig.3.11).

Figura 3.11. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind situațiile în care se impune întreruperea alăptării

Conform ultimelor studii realizate [44]., întreruperea alăptării se impune în momentele în care mama suferă de mastită și când este infectată cu virus HIV (Fig.3.11). O posibilă atașare grea a nou-născutului la sân poate cauza dureri atât pentru mama, dar și pentru copil prin imposibilitatea hrănirii adecvate. Orice fel de rană poate contribui negativ la infectarea nou-născutului cu virusul în cauză. Când mama suferă de mastită, afecțiune dureroasă a sânului, lotul participant a considerat în proporție de 90% această variantă, în timp ce pentru cazul infectării cu HIV, LC a raportat un procent de 83,33%, iar MD de 100%. O nouă problematică revine prin ducerea la termen a sarcinilor de la mame care au avut sau care au cancer de sân. Ideea conceperii după eradicarea bolii reprezintă încă o temă de dezbatere, prin concepția mondială de a stopa tratamentul local (radioterapie) pentru a se permite conceperea [44].

Laptele uman este considerat un gold standard în alăptarea nou-născutului. Beneficiile alăptării extind proprietățile laptelui însuși, căci reprezintă un complex de factori nutriționali, de mediu, socio-economici, psihologici și genetici pe baza relației dintre nou-născut și mama (Fig.3.12) [45].

Figura 3.12. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind beneficiile alăptării

Alăptarea constituie o sursă de anticorpi, poate să reducă riscul de obezitate în timpul copilăriei și poate reduce riscul pentru astm bronșic Analizând aceste beneficii (Fig.3.12), studenții de la LC au considerat adevărată varianta că reprezintă o sursă de anticorpi în proporție de 100%, în timp ce cei de la MD au fost aproape, cu doar 96,67%. În ceea ce privește reducerea riscului de obezitate, diferența de răspunsuri a ajuns la 30 de procente, cu 53,33% pentru LC si 83,33% pentru MD. Pentru ultima variantă, cea care ajută în reducerea riscului pentru astm bronșic, studenții de la LC au considerat în proporție de 56,67% și MD în proporție de 73,33%.

Senzația gustativă este produsă când substanțele din alimente interacționează cu receptorii aflați pe membrana gustativă, și anume mugurii gustativi, identificându-se cinci gusturi de bază: acru, amar, sărat, dulce și savoarea (umami) (Fig3.13) [15].

Figura 3.13. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind gusturile de bază

Așadar, analizând datele prezentate (Fig.3.13), procentele pentru variantele de răspuns ale loturilor de studiu sunt asemănătoare, de la 86,67% până la 96,67%, cu excepția umami unde s-au înregistrat 46,67% pentru LC și 83,33% pentru MD. Mastita se dezvoltă frecvent în timpul alăptatului în decursul primelor trei luni postpartum și este recomandat să se prevină pe cât posibil pentru a nu agresa țesutul mamar. Mastita alterează compoziția biochimică a laptelui matern prin creșterea permeabilității sânului. Creșterea conținutului de sodiu și clor și scăderea concentrației de lactoză reprezintă schimbări specifice în timpul mastitei. Totuși, laptele ar putea deveni mai sărat tocmai prin creșterea concentrației de sodiu. Pentru a rezolva această problematică, s-a creat un sistem bazat pe un senzor care detectează nu componentele din alimente, ci intensitatea fiecărui gust prin înregistrarea unor picuri corespunzătoare, folosind o membrană polimerică. Studiul compară laptele donat de la mame sănătoase cu laptele de la mame diagnosticate cu mastită, identificându-se astfel diferențele în ceea ce privește nutrienții [46].

Biomarkerii serici constituie elemente importante în diagnosticul din sarcină prin confirmarea implantării blastocitului, a estimării vârstei gestaționale, a iminenței de avort ori în diagnosticarea unor posibile defecte de tub neural sau de spină bifidă, care pun în pericol viața fetusului (Fig.3.14) [49].

Figura 3.14. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind principalii biomarkeri serici din sarcină

Observând datele din grafic (Fig.3.14), se ilustrează principalii biomarkeri serici din sarcină HCG (Gonadotropina corionică umană), PAPP-A (Proteina plasmatică asociată sarcinii), AFP (Alfa feto-proteina) și E3 (Estriolul) neconjugat. Procentele demonstrează că studenții participanți la studiu recunosc acești biomarkeri și importanța lor diagnostică în sarcină, cu valori între 53,33% și 90%. Estriolul neconjugat este puternic legat de preeclampsie, fiind martor cheie în determinarea acesteia. Preeclampsia este o boală multisistemică ce afectează 4-5% dintre sarcini, reprezentând una dintre principalele cauze ale morbidității și mortalității materne. Este caracterizată prin apariția hipertensiunii cu presiune arterială sistolică ≥ 140 mmHg, proteinurie > 0,3 g la 24 de ore, trombocitopenie insuficiență renală, când concentrația creatininei serice >1,1 mg/dl sau chiar edem pulmonar [49]. Inhibina A a fost raportată ca un marker precoce în predicția preeclampsiei. Un grup de cercetători americani au prelevat probe de sânge în sarcină la 7-13 săptămâni de la 90 de femei gravide, 30 care au dezvoltat ulterior preeclampsie și 60 de martori, constatând că nivelul inhibinei A era de 5 ori mai mare la femeile cu preeclampsie [47].

Biomarkerii serici constituie elemente importante în diagnosticul din sarcină prin confirmarea implantării blastocitului, a estimării vârstei gestaționale, a iminenței de avort (Fig.3.15) [7, 8, 9].

Figura 3.15. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind biomarkerii serici din sarcină

Analizând aceste date (Fig.3.15), gonadotropina corionică umană (HCG) este un compus heterodimeric ce se găsește la nivel ovarian, dar și extragonadal. Proteina plasmatică asociată sarcinii (PAPP-A) este produsă în cantitate mare de către trofoblast. Alfa feto-proteina (AFP) îndeplinește funcții de transport de transport pentru estrogen și acizi grași, iar estriolul (E3) provine din precursorul 16 α-hidroxidehidroepiandrosteron [7, 8, 9]. Un procent de 33,33% a fost ales de către cei de LC pentru varianta compusului heterodimeric, în timp ce MD doar 76,67%. Localizarea la nivel ovarian și extragonadal a fost apreciată în proporție de 40% și 60%. În situația în care PAPP-A se sintetizează de trofoblast, LC și MD au ales 66,67. În cazul situației în care AFP îndeplinește funcții de transport, discrepența dintre răspunsuri este destul de evidentă, de aproximativ 43,33 de procente, dar și în cazul estriolului, discrepanța este de 20%. De asemenea, opiniile sunt diferite, căci o parte dintre studenți consideră că HCG se poate determina din urină și LCR, corect fiind doar din urină, că PAPP-A se elimină în uter (și nu în sânge) sau că HCG este format din 238 de aminoacizi, corect fiind 237 de aminoacizi.

Perioada sarcinii este divizată în trei stadii de dezvoltare: stadiul tual, stadiul embrionar și stadiul fetal. Stadiul tual cuprinde perioada de două săptămâni din momentul implantării blastocitului, stadiul embrionar cuprinde săptămânile 3-7 de sarcină, în timp ce stadiul fetal cuprinde săptămânile 8-38 de sarcină. Această clasificare a constituit subiectul unui alt item al chestionarului (Fig.3.16) [26].

Figura 3.16. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind stadiile de dezvoltare ale sarcinii

În mod normal, o sarcină este formată din 40 de săptămâni de dezvoltare, divizată în trei trimestre: trimestrul I, trimestrul II și trimestrul III. Stadiile de dezvoltare ale sarcinii (Fig.3.16) se referă nu la cele trei trimestre de sarcină, ci la stadiul de dezvoltare al fătului în sine. În acest caz, există stadiul tual, stadiul embrionar și stadiul fetal, stadii care divizează sarcina pe cele trei trimestre aferente [26]. S-a observat că majoritatea studenților implicați în studiu au considerat varianta de trei stadii corectă, LC cu 93,33%, în timp ce MD a răspuns corect în proporție de 100%. Există răspunsuri și pentru opțiunile de două stadii (3,33%) sau de patru stadii (3,33%).

O serie de teste uzuale se efectuează tuturor femeilor gravide în prima parte a sarcinii (trimestrul I) pentru evaluarea stării de sănătate, care se recomandă în funcție de istoricul medical sau de factorii genetici (Fig.3.17).

Figura 3.17. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind investigațiile indicate în primul trimestru de sarcină

Printre analizele de biochimie realizate în trimestrul I (Fig.3.17) se numără hemoleucograma, determinarea glicemiei pentru a exclude riscul de diabet gestațional, profilul lipidic, calcemia, determinarea proteinelor serice precum albumină, fibrinogen, acid uric, creatinină și uree, determinarea concentrației bilirubinei, ionograma, dar și profilul de coagulare. Pentru acest tip de analize biochimice, răspunsurile asimilate sunt relativ asemănătoare, cu procente cuprinse între 80-100%. Totuși, un test indicat și în chestionar este Dublul Test, test care se realizează încă din primul trimestru și care oferă informații despre anomaliile cromozomiale cele mai întâlnite: sindromul Down (trisomie 21) și sindromul Edwards (trisomia 18) [26].

Pentru screeningul diabetului gestațional sau a posibilității de a face acest tip de diabet se va efectua TTGO, numit și test de toleranță la glucoză pe cale orală. TTGO este un test standard și se folosește când glicemia bazală (FPG) este neconcludentă (Fig.3.18) [48].

Figura 3.18. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind testul de toleranță la glucoză pe cale orală

Analizând datele prezente (Fig.3.18) se observă reprezentarea a două coloane, una pentru definirea acronimului TTGO și o coloană în care se explică rolul acestei testări în timpul sarcinii. În ceea ce privește definirea testării în cauză, procentele sunt apropiate: 90% pentru LC și 80% pentru MD. Pentru explicarea rolului testului, s-a înregistrat un procent 93,33% în cazul ambelor specializări participante la studiu. În cadrul statisticii au existat și alte răspunsuri, neconcludente, căci defineau incorect rolul testului. În ultimii ani, prezența diabetului gestațional (diabetes mellitus) în rândul femeilor gravide a crescut considerabil, conform studiilor și a evidenței efectuate în America. Metabolismul glucozei în sarcină este ușor modificat, căci pentru femeile cu un metabolism normal, concentrațiile de glucoză din primul trimestru de sarcină sunt mult scăzute prin medierea estrogenului care induce creșterea nivelului de insulin din organism. Din momentul formării placentei, glucoza e capabilă să treacă prin aceasta cu ajutorul difuziei facilitate. De altfel, relația dintre glucoza maternă și cea fetală este complexă, căci nivelurile de glucoză fetală sunt raportate în mod direct la nivelul de glucoză maternă [48].

Testul Panorama se poate efectua începând cu săptămâna a 9-a, fiind un test ce se efectuează din sânge prin care se identifică ADN-ul fetusului și depistează cazurile de trisomii (Fig.3.19).

Figura 3.19. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind testul Panorama

Așadar, testul Panorma (Fig.3.19) a fost considerat test de diagnostic prenatal de doar 83,33% din cei de la LC și de 100% de cei de la MD. Efectuarea începând cu săptămâna a 9-a de sarcină a fost apreciată de 73,33% dintre cei de la LC și la o diferență mică de doar 80% de cei de la MD. Totuși, identificarea ADN-ului fetal prin acest test a fost recunoscut de 80% dintre cei chestionați de la ambele specializări. Testul, însă, nu este un test citogenetic, nu se poate efectua începând cu săptămâna 12 de sarcină, fiind un test minim invaziv și nu identifică sexul copilului, ci doar cazurile de trisomii posibile. În timpul sarcinii, fragmente de ADN fetal, care conțin numărul cromozomilor fetali, traversează placenta, ajungând în circulația sangvină de origine maternă. Testul Panorama se efectuează dintr-o probă de sânge matern din care se vor analiza fragmentele ADN de origine fetală cu scopul de a identifica anomaliile cromozomiale prezentate anterior. Fiind un test de screening prenatal neinvaziv, se elimină riscul atât pentru mamă, cât și pentru făt [49].

Trisomiile se caracterizează prin prezența a trei exemplare ale aceluiași cromozom, în cazul sarcinilor sunt letale, putând duce și la avorturi spontane precoce [50, 51].

Figura 3.20. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind trisomiile viabile

Cei din cadrul MD au răspuns în proporție de 100% pentru trisomia 21, 18 și 13 și doar în proporție de 90% pentru trisomiile gonosomale de tipul XXX , XXY sau XYY (Fig.3.20). În cazul celor de la LC, 13,33% dintre aceștia consideră că și trisomiile 8 și 16 fac parte din categoria trisomiilor viabile, în timp ce pentru variantele de trisomii 21, 18, gonosomale și 13 procentele variază între 60%-96,7%. Sindromul Down (trisomia 21) este greu de detectat în celulele șoarecilor, cu toate acestea, cercetătorii au găsit gena în trei cromozomi de șoareci, Mmu16, Mmu17 and Mmu10. Pentru a exploata cel mai bine modelele cromozomiale și pentru a interpreta rezultatele obținute, înainte de a se propune studii clinice, este necesară o înțelegere a conținutului de gene trisomice de pe șoareci în raport cu trisomia 21 umană [52].

Principalele tipuri de țesuturi utilizate în citogenetică sunt sânge prelevat prin puncție venoasă, lichidul amniotic obținut prin amniocenteză după săptămâna 15 de sarcină, trofoblast sau vilozități coriale recoltate în săptămânile 11-12 de amenoree (Fig.3.21).

Figura 3.21. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind probele biologice folosite în teste citologice

Se consideră că analiza citogenetică efectuată pe lichid amniotic are o acuratețe ce se apropie de 100% pentru depistarea anomaliilor cromozomiale fetale. În ceea ce privește probele biologice care se folosesc în citogenetică (Fig.3.21), pentru variantele corecte, atât cei de la LC, cât și cei de la MD au considerat corecte aceste variante de la 53,3% până la 100%. Laptele matern, saliva și lichidul spermatic nu reprezintă probe biologice din care se pot extrage informații genetice. Analiza citogenetică în perioada prenatală constituie o analiză cheie pentru obținerea de celule fetale. Indicațiile analizei este corelată atât cu vârsta maternală, cât și cu antecedentele de boli cromozomiale din familie. Totuși, analiza cunoaște și niște limite, printre care amintim afecțiunile monogenice sau poligenice sau malformațiile unice precum malformația de cord sau anomalii ale membrelor [53].

În testarea defectelor cromozomiale sunt implicate teste genetice precum bandările, cariotiparea, metoda moleculară (array CGH) sau tehnica rapidă FISH cu rol în depistarea aneuploidiilor cromozomilor 18, 13, 21 (Fig.3.22).

Figura 3.22. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind recomandările în efectuarea de cariotip, FISH sau tehnici de bandare

Toate aceste tehnici (Fig.3.22) se recomandă în cazurile în care vârsta maternală depășește 38 de ani, în situația în care există o naștere anterioară a unui copil cu anomalii cromozomiale, când ecografia fetală este anormală sau când există istoric familial pozitiv cu predispoziție pentru anomalii cromozomiale. Încurajator este faptul că studenții ambelor specializări au considerat aceste variante corecte într-un procent ridicat, de până la 100%, cu mențiunea că 50% de la ambele specializări au considerat că istoricul familial negativ constituie o recomandare, dar și că poate fi realizată după ecografia din primele săptămâni de sarcină. În ceea ce privește situația vârstei maternale peste 38 de ani, se cunoaște faptul că accidentele de disjuncție cromozomială în cursul meiozei feminine sunt în creștere. Riscul de trisomie 21 în funcție de vârsta maternală ajunge chiar la 1/30 pentru naștere și 1/23 pentru trimestrul II pentru 45 de ani, în timp ce la 38 de ani ajunge la 1/180 la naștere și la 1/150 pentru trimestrul II [53].

Tehnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) analizează cromozomii cu ajutorul unor colorații fluorescente in situ a unor fragmente de ADN pe lamă, obținute artificial (sonde) care se vor marca cu fluorofor (Fig.3.23).

Figura 3.23. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind etapele tehnicii FISH

Prelevare – denaturare termică ADN – etalare celule pe lamă – hibridizare ADN – eliminare sonde cu soluții tampon – detecție semnale specifice – elaborare diagnostic

Prelevare – denaturare termică ADN – hibridizare ADN – etalare celule pe lamă – eliminare sonde cu soluții tampon – detecție semnale specifice – elaborare diagnostic

Prelevare – etalare celule pe lamă – denaturare termică ADN – hibridizare ADN- eliminare sonde cu soluții tampon – detecție semnale specifice – elaborare diagnostic

Prelevare – hibridizare ADN – denaturare termică ADN – etalare celule pe lamă – detecție semnale specifice – eliminare sonde cu soluții tampon – elaborare diagnostic

Etapele tehnicii în sine (Fig.3.23) presupun prelevarea materialului biologic, pregătirea preparatului pe lamă și etalarea celulelor recoltate, denaturarea termică a moleculelor de ADN prin separarea celor două catene, hibridizarea ADN-ului cu ajutorul sondelor la 37° Celsius în atmosferă umedă, eliminarea sondelor prin spălare cu soluții tampon, detecția semnalelor specifice cu un microscop cu lumină UV și interpretarea și elaborarea de diagnostic (varianta C din Fig.3.23) [35]. Exceptând situațiile în care s-au ales și celelalte variante de răspuns, majoritatea subiecților au ales varianta C, 60% cei de la LC și 86,67% cei de la MD. Tehnica FISH nu necesită obligatoriu prezența ADN-ului sub forma condensată, devenind de-a lungul anilor o tehnică de cuantificare a materialului genetic [54].

Tehnica FISH a devenit o metodă de elecție în situații precum cele de diagnostic prenatal, aplicându-se fie după determinarea cariotipului prin metode de bandare G sau R, fie de primă intenție în cazul în care se cunoaște exact ce fragment se dorește a fi marcat (Fig.3.24) [54].

Figura 3.24. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind avantajele tehnicii FISH

Avantajele tehnicii FISH (Fig.3.24) sunt numeroase: este o tehnică rapidă spre deosebire de cele prin bandare, permite diagnostic precis și oferă posibilități asupra diagnosticului. Costurile, însă, sunt destul de ridicate mai ales prin prisma kitului de sonde, necesită un soft special de analiză și interpretare și nu se aplică de rutină [35]. Un procent de 86,67% și respectiv 90% au considerat că tehnica este implicată în vizualizarea anomaliilor cromozomiale, între 53,33%-80% au considerat că este o tehnică rapidă și respectiv, 63,33% de la LC și 80% de la MD că este necesar un soft special de analiză. În realitate, costurile sunt foarte ridicate tocmai prin prisma sondelor, singura posibilitate în care costurile pot fi mult reduse fiind aceea în care laboratorul își prepară sondele, așadar nici nu se poate aplica de rutină [54].

Tehnicile de bandare au cunoscut o recunoaștere crescândă și o dezvoltare propice în ultimii ani, putând fi capabile de identifica peste 850 de benzi în setul haploid.

Figura 3.25. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind tipurile de benzi utilizate în bandare

Există două tipuri de benzi utilizate (Fig.3.25): benzi pentru identificarea longitudinală a cromozomilor și benzi pentru evidențierea unor regiuni cromozomiale. Din cadrul benzilor utilizate pentru identificarea longitudinală fac parte benzile Q, G și R, iar în cadrul benzilor utilizate pentru evidențierea regiunilor cromozomiale fac parte benzile T, C și NOR (Fig.3.25). În acest caz, se prezintă că doar 66,67% din studenții de la LC au ales această variantă, în timp ce de la MD 93,33%. Benzile longitudinale Q, G, R au fost alese în proporție de 26,67% de către studenții de la LC și de 30% dintre cei de la MD.

Loturile de studiu au fost chestionate privind posibilitățile de expunere la metale grele, iar rezultatele s-au sistematizat în Fig.3.26.

Figura 3.26. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind posibilitățile de expunere la metale grele

În zilele noastre, omul este supus la înalte nivele toxice de metale grele provenite din surse multiple, de la gaze naturale și petrol până la vopsele sau fumul de țigară [55]. De asemenea, expunerea la metale grele se poate realiza prin expunere profesională (cei care lucrează în mediu ce utilizează chimicale) sau prin absorbție la nivelul firului de păr, ipoteză susținută de studiul lui Hiroshi Yasuda et al din 2005, care a remarcat că în părul copiilor se găsesc concentrații importante de cadmiu, plumb și aluminiu [56]. Totuși, o parte din metalele grele sunt prezente și pe fructe sau legume prin prisma pesticidelor, iar o simplă spălare cu apă nu le îndepărtează complet (Fig.3.26) [57]. Mai există și situația în care ingestia este provocată în mod intenționat, amintind de suicid [58]. Majoritatea răspunsurilor au fost corecte, studenții ambelor loturi considerând corecte toate cele patru variante.

Cantitatea zilnică de fructe și legume ingerate reprezintă fracția majoră pentru o posibilă expunere la metale grele, în special la cadmiu și arsenic. În ceea ce privește problematica expunerii la metale grele, există studii din străinătate care atestă că există alimente care intervin în procesul de detoxifiere și în lupta împotriva depunerii acestor metale grele în organe [59]. S-a chestionat nivelul de cunoștințe ale loturilor privind acest aspect, prelucrarea datelor fiind indicate în Fig.3.27.

Figura 3.27. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind alimente ce combat expunerea la metale grele

Cele mai antioxidante alimente adjuvante în acest proces sunt reprezentate de afinele de pădure, coriandru, spirulina (care extrage metalele grele depuse în ficat) și alge roșii [60]. Așadar, studenții ambelor loturi de studiu au considerat cele patru alimente drept variante corecte în cel mai mare procent, între 60%-96,67%, procentaj ce s-a înregistrat mai ales în cadrul celor de la MD (Fig.3.27). Cele mai noi metode de descoperire s-au realizat pe boabele de orez.

Un alt studiu realizat în România, de data aceasta, și-a propus să examineze cantitatea de metale grele din fructe și legume obținute de la vânzători locali din Baia Mare. Cele mai mari concentrații de metale grele au fost cele de zinc, în timp ce în cantități mai mici de cadmiu. Rezultatele au fost obținute prin calcularea unei rate de ingerare zilnice (DIR) și a unui coeficient de hazard (THQ). S-a dovedit că ingerarea de alimente precum pătrunjel sau varză poate dăuna organismului, conținând dozele cele mai ridicate de metale grele [59].

Chiar și în era modernă, expunerea la metale grele încă reprezintă un subiect de discuție din cauza poluării excesive. Deși metalele grele se pot găsi în fructe sau legume, nici apa nu este exclusă din subiect [61].

Figura 3.28. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind simptomele cauzate de prezența metalelor grele în organism

Prezența în organism chiar a anumitor metale grele poate induce oboseală, dureri dentare sau chiar scăderea memoriei (Fig.3.28), lucru apreciat de către cele două loturi de studiu, cu un procent cuprins între 86,67-96,67% pentru oboseală, 66,76-76,67% pentru durerile dentare și un procent de 76,67% pentru scăderea memoriei. O parte din subiecții participanți au mai considerat adevărate și căderea părului sau tulburările renale. Se cunoaște problematica prezenței metalelor grele în organism și simptomele pe care le cauzează. În acest sens, a fost elaborat în Franța de către un medic român un aparat, Oligoscan, care permite determinarea cantitativă a intoxicațiilor tisulare cu metale grele și efectul pe care îl generează pe metabolismul general al organismului [62].

Toxicitatea metalelor grele sugerează o situație medicală puțin întâlnită, dar totuși semnificativă clinic. Dacă nu este descoperită la timp și tratată corespunzător, poate conduce la morbiditate și mortalitate semnificative, atât pentru mamă, cât și pentru făt [58].

Figura 3.29. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind materialele biologice din care se pot realiza dozări de metale

Deși firul de păr constituie o probă biologică elocventă prin care se pot determina detecția de metale, există și alte probe mult mai fidele, printre care se numără laptele matern, sângele, lichidul amniotic, unghiile sau urina (Fig.3.29), din care se detectează cantitatea de metale excretată [64]. În cazul laptelui matern, un procent de 86,67% a fost alocat de către ambele loturi de studiu. Încurajator este că majoritatea răspunsurilor au luat valori între 63,33%-83,33% în cazul ambelor specializări. Un studiu realizat în Spania (Las Palmas de Gran Canaria) a dorit să determine prezența a 22 de metale grele în lichidul amniotic prelevat de la mame. S-au obținut probele necesare de la 65 de femei însărcinate, detecția fiind realizată cu ajutorul ICP-MS. S-au obținut că cele mai periculoase doze de metale grele au fost de cadmiu, crom, nichel, mercur și plumb, metale care au trecut bariera placentară și s-au acumulat în acea zonă. Contactul direct al metalelor cu produsul de concepție în perioada intrauterine ar putea cauza simptome asupra acestuia și a dezvoltării în parametrii normali [63].

Este cunoscut faptul că intoxicația cronică cu mercur afectează, în special, rinichii sau tractul gastrointestinal, intoxicația fiind întâlnită mai ales în cadrul minerilor [64].

Figura 3.30. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind efectele adverse provocate de mercur

Mercurul poate induce efecte precum fatigabilitate, anemie, parestezii și afecțiuni cardio-vasculare sau hipertensiune cu disfuncție renală [62]. Majoritatea răspunsurilor date au fost corecte (Fig.3.30), ambele loturi afirmând că mercurul produce aceste efecte adverse, procente cuprinse între 46,67%-83,33%. Mercurul se poate regăsi atât în urină, cât și în sânge. În urină se prezintă sub forma anorganică, în timp ce în sânge se leagă de membrana eritrocitară. Metoda de detecție folosită este ICP-MS, aceeași care se recomandă și în cazul detecției de metale grele din lichidul amniotic. Dacă este depășită o concentrație de 800 μg/L, poate fi letală persoanei în cauză, căci doza acceptată ca limită normal fiind de doar sub 1 μg/L pentru urină și sânge [64].

În cazul sarcinilor, plumbul este transportat transplacentar, fiind implicat în intoxicația congenitală ce poate avea următoarele consecințe grave: avortul spontan, prematuritate sau greutate mică la naștere a produsului de concepție [65].

Figura 3.31. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind simptomele expunerii cu plumb la copii

Plumbul poate determina în cazul copiilor retard mental, hiperactivitate, învățare dificilă sau tulburări de comportament (Fig.3.31) [68]. Un procent de 93,33% a aparținut celor de LC, în timp ce la MD diferența a fost de doar 3,33 procente. Tulburările de comportament și hiperactivitate au fost alese în proporție de 86,67% de LC și 93,33% de MD, respectiv 63,33% pentru LC și 73,33% pentru MD. Deficitul de fier poate crește toxicitatea plumbului, așadar toți copiii care au o concentrație a plumbului în sânge peste 20 μg/dL trebuie investigați pentru deficitul de fier prin dozarea feritinei [66].

Plumbul poate determina, în principiu, anemie cu reticulocitoză și punctații bazofile, iar o posibilă creștere a excreției urinare indică o expunere excesivă, independent de manifestările clinice [67].

Figura 3.32. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind simptomele precoce în intoxicația cu plumb

Plumbul este cel mai larg utilizat metal, fiind implicat în numeroase aplicații comerciale și industriale. Primele simptome care apar după inhalarea particulelor de plumb sunt reprezentate de apatie, greață, mialgii și convulsii (Fig.3.32). Conform datelor, se prezintă situația celor două loturi de studiu, majoritatea răspunsurilor alese în procent ridicat fiind reprezentate de apatie (80% și 86,67%), greață (83,33% și 66,67%), mialgii în procent de 50% și convulsii (50%, respectiv 46,67%).

În formă organică, cadmiul este întâlnit în alimente, apă și aer, iar aportul normal de cadmiu prin dietă variază între 2 și 200 μg/zi. Ingestia cronică de cadmiu conduce la leziuni renale caracterizate prin disfuncție tubulară, proteinurie și alterarea capacității de concentrare a urinii [67].

Figura 3.33. Distribuția răspunsurilor lotului de studiu privind Simptomele intoxicației cu cadmiu

Efectele toxice ale cadmiului depind de calea de expunere, de inhalarea unor particule de cadmiu care pot produce hipertensiune, febră, cefalee (Fig.3.33) [67]. În acest caz, pentru hipertensiune au optat 60% dintre cei de la LC și 90% dintre cei de la MD. Încurajator este faptul că niciun student de la MD nu a ales hipotensiunea ca opțiune, în timp ce la LC doar 10%. Un procent de 53,33%, reprezentat de răspunsurile celor de la LC, au considerat că febra face parte din simptomele intoxicației cu cadmiu, în timp ce colegii de la MD au considerat în proporție de 66,67%. De asemenea, cefaleea și dispneea au fost recunoscute în procente importante: 76,67% la LC3 și 86,67% la MD3.

4. Testări prenatale. Testul NIFTY

4.1. Generalități

Testările prenatale au progresat de la cariotipul realizat uzual până la secvențierea exonilor fetali, teste clasate ca invazive, până la teste ce utilizează metode noi și inovative, non-invazive [68]. De asemenea, consultația genetică prenatală joacă un rol important prin explicarea procedurilor ulterioare și prin consiliere a cuplurilor, în funcție de rezultatul testului prenatal [69].

Printre procedurile de teste prenatale non-invazive se numără și testarea NIFTY. Testul utilizează ca matrice ADN-ul fetal liber din plasma femeilor însărcinate pentru a identifica posibile aneuploidii fetale care implică defecte ale cromozomilor somatici 13, 18, 21, dar și al cromozomilor sexuali X și Y. Aceste anomalii cromozomiale autozomale si gonozomale sunt singurele anomalii viabile.

NIFTY mai oferă opțiuni și pentru testarea trisomiilor 9, 16 și 22 (care pot fi viabile in mozaicism) si a unor anomalii structurale: sindromului Van der Woude, delețiile Prader-Willi sau Angelman, Jacobsen și DiGeorge [70].

Este cunoscut faptul că ADN-ul fetal circulant reprezintă aproximativ 3-13% din ADN-ul matern, care derivă în cantități mari în placentă și dispare la câteva ore de la nașterea nou-născutului. În anul 1997, Lo et al. a demonstrat prezența ADN-ului fetal în plasma de origine maternă care este un amestec himeric de ADN matern și fetal [70].

Testul NIFTY (Non-Invasive Fetal Trisomy Test) examinează sângele periferic matern prin utilizarea tehnologiei de secvențiere de ultimă generație NGS (Next Generation Sequencing), care permite detectarea aneuploidiilor fetale 21 (sindrom Down), 18 (sindrom Edwards) și 13 (sindrom Patau) după săptămâna a 10-a de sarcină, cu o acuratețe de 99,12% și este valabilă și în cazul sarcinilor gemelare. De asemenea, testul oferă și alte variante de testare, care includ trisomiile 9, 16 și 22 sau identificarea sexului genetic, cu o acuratețe de 98% [70].

Efectuarea testului NIFTY se impune în situațiile în care vârsta maternală este avansată (peste 35 ani), când există semne ecografice evidente pentru anomalii cromozomiale, când se identifică risc crescut de anomalii în urma screening-ului de trimestru I sau II, când unul dintre părinți prezintă translocații robertsoniene care predispune la anomalii fetale, când pacientele au contraindicație de efectuare de test invaziv (placenta previa, iminența de avort sau infecții cu HIV) sau pacientele supuse fertilizării in vitro (FIV) [71].

Se utilizează ca specie biologică sângele venos, recoltat pe vacutainer Streck-Cell-Free BCT, care oferă avantajul stabilității probei până la 14 zile, metoda utilizată fiind de secvențiere de ultimă generație (NGS) și de analiză bioinformatică [71].

4.2. Scopul studiului

Studiul își propune analizarea incidenței de aneuploidii cromozomiale evaluate prin testarea ADN-ului fetal din sângele matern și evidențierea rolului pe care testările prenatale le joacă pe parcursul sarcinii, urmărindu-se în acest mod evoluția particulară a unei paciente care și-a monitorizat sarcina de la implantarea blastocitului până la momentul nașterii.

4.3. Designul studiului

Lotul de studiu a fost constituit din 51 de paciente, ce reprezintă pacientele evaluate prin testul Nifty pe o perioadă de un an (01.01.2018-31.12.2018) la laboratorul de analize medicale Synevo România. Informațiile au fost preluate din baza de date a laboratorului.

Ca în cazul primului studiu, sistematizarea datelor preluate din baza de date s-a realizat în programul Excel cu generare ulterioară de grafice, în perioada iulie 2019 – august 2019.

4.4. Rezultate și discuții

Figura 4.1. Frecvența vârstei maternale

Analizând datele prezente (Fig.4.1), se poate observa distribuția pe vârste a pacientelor cu vârste cuprinse între 25 și 44 de ani. Dintr-un total de 51 de cazuri, rata cea mai mare înregistrată a fost în cazul vârstei de 35-39 de ani, care reprezintă una din recomandările de efectuare a testului NIFTY. Testul NIFTY realizat în cazul acestor paciente a fost realizat pentru identificarea trisomiilor 13, 18 și 21. Pentru 50 de paciente din totalul de 51 de cazuri, rezultatele au fost negative, în timp ce pentru o pacientă, rezultatul testului a indicat negativ în cazul trisomiilor 13 și 18, în timp ce pentru trisomie 21 rezultatul a indicat o frecvență de 1/25, recomandarea fiind de a se efectua amniocenteză și cariotipare fetală din lichid amniotic.

Figura 4.2. Genul fătului

Analizând datele, se prezintă distribuția pe genuri – fată, băiat (Fig.4.2) rezultate în urma testului NIFTY realizat în cadrul Synevo Brașov. Se poate observa că din totalul de 51 de paciente, s-au obținut 31 de cazuri de fată, 19 cazuri de băiat și un caz neclar, căci a fost detectat cromozomul Y, cu limitele de detecție: >0,0048 posibil gen masculin, <0,0048 posibil gen feminin. Așadar, se observă că numărul de cazuri este mai ridicat în cazul genului feminin decât în cazul genului masculin. Este cunoscut faptul că genele umane sunt împărțite în 23 de cromozomi, 46 de cromozomi în total. Se moștenește unul din fiecare pereche de cromozomi, unul de la mamă și unul de la tată [71].

De asemenea, testul NIFTY poate să mai evalueze și sindroame de microdeleție precum 5p sau 1p36, adică o deleție pe brațul scurt al cromozomului. În cazul unui rezultat "risc înalt" (pozitiv) relevă faptul că există o probabilitate crescută. Cu toate acestea, NIFTY nu reprezintă un test diagnostic, iar o prealabilă confirmare se va face cariotipare din lichid amniotic [70].

Figura 4.3. Distribuția cazurilor în funcție de vârsta maternală

Conform datelor prezentate (Fig.4.3), se poate observa distribuția cazurilor în funcție de vârsta maternală, dar și a genurilor feților. Se observă că există 4 intervale de vârstă pentru lotul format din 51 de paciente: 25-29 ani, 30-34 ani, 35-39 ani și 40-44 ani. Pentru gen s-au arondat trei culori: lila pentru fete, albastru pentru băieți și gri pentru cazurile neclare. În cazul intervalului de 25-29 de ani s-au înregistrat 11 cazuri, dintre care 8 fete și 3 băieți. Categoria a doua de vârstă, ce cuprinde 30-34 de ani, a înregistrat drept cazuri 6 fete și 7 băieți. Categoria cea mai indicată pentru efectuarea testului NIFTY, și anume categoria de 35-39 de ani, unde numărul de cazuri a ajuns la 17, cu 10 fete și 7 băieți. Pentru ultima categorie, cu vârste cuprinse între 40-44 de ani, s-au înregistrat 10 cazuri: 7 fete, 2 băieți și un caz neclar care a fost explicat și în figura 4.2, căci la pacienta în cauză se detectase cromozomul Y.

De asemenea, o alternativă a testului NIFTY o reprezintă NIPT, un test de screening non-invaziv care cercetează ADN-ul extracelular din sângele matern. Acest tip de test cuprinde testele VERAgene și VERACITY. Fiind test de screening, se recomandă când vârsta maternală depășește 35 de ani, când se evidențiază un risc crescut de anomalii cromozomiale depistate în urma dublului test sau a triplului test, când ecografia fetală este anormală, când a existat o naștere anterioară a unui copil cu anomalii cromozomiale sau când există istoric familial pozitiv. Ambele test folosesc drept probă sângele venos, recoltat pe vacutainer Streck-Cell-Free BCT [72].

Testul VERAgene reprezintă un test prenatal non-invaziv (NIPT) de nouă generație, dezvoltat în laborator pentru a oferi screening în ceea ce privește trisomiile 13, 18, 21, aneuploidiile cromozomilor X, Y, microdelețiile și identificarea riscului fetal pentru 50 de boli monogenice. VERAgene vizează 500 de mutații pentru depistarea a 50 de boli monogenice [72].

Testul VERACITY reprezintă o altă alternativă de test prenatal non-invaziv de nouă generație care permite detectarea aneuploidiilor cromozomiale fetale și a microdelețiilor aplicabile atât pentru sarcinile unice, cât și pentru cele gemelare, folosind o tehnologie brevetată bazată pe diagnosticarea moleculară [72].

Studiul de caz

Un diagnostic prenatal care să identifice posibile aneuploidii reprezintă o etapă esențială în perioada sarcinii, însă e important de urmărit evoluția celorlalte teste biochimice care pot indica, în unele cazuri, anumite afecțiuni sau patologii precum diabetul gestațional sau eclampsia.

În acest caz, s-a avut în evidență evoluția particulară a unei paciente însărcinate care și-a efectuat toate testele din perioada sarcinii în cadrul Laboratorului de analize medicale Synevo Brașov.

Pacienta P.R., de 40 ani, primipară în vârstă, cu sarcina realizată prin fertilizare in vitro,

a fost investigată din primul moment al evidențierii sarcinii conform recomandărilor de specialitate. Printre primele investigațiile care se indică spre a fi realizate în perioada sarcinii se regăsesc testele de biochimie uzuale precum acid uric seric, creatinină serică, transaminazele TGO și TGP, bilirubina totală și direct, uree serică, teste de hematologie cu hemogramă și formulă leucocitară sau teste de imunochimie, cu dozări de proteina C reactivă, precum si testele serologice Ag HBs, Anti HIV 1+2, Anti HCV, rezultatele fiind negative (Tabelul 4.1).

Tabel 4.1. Analizele de biochimie, hematoligie și imunochimie ale pacientei

Pacientei i s-au recoltat probe pentru teste ce permit decelarea anticorpilor de tip IgG și IgM în cazul virusului herpes simplex de tip 1 și tip 2, teste care s-au realizat prin electrochemiluminescență (ECLIA) sau ELISA. Investigațiile au fost realizate din ser (Tabelul 4.2).

Tabel 4.2. Decelare anticorpi IgG și IgM în cazul virusului herpes simplex

Conform buletinului de analize, s-au identificat anticorpi de tip IgG pentru virusul herpes simplex de tip 1 (HSV1) și tip 2 (HSV2) prin ECLIA, rezultatul fiind pozitiv pentru virusul herpes simplex de tip 1 (HSV1). Pentru dozările de IgM din ser s-a utilizat tehnica ELISA, rezultatele fiind negative în acest caz.

Un set de analize foarte important reprezentat de profilul TORCH (panelul TORCH). TORCH este acronimul pentru toxoplasmoză (T), alte infecții (O) de tipul sifilisului sau virusul varicelo-zosterian, rubeolă (R), citomegaloviroză (C) și infecția cu virus herpes simplex (HSV). Testul identifică și decelează prezența de anticorpi îndreptați împotriva agenților care declanșează aceste infecții. Pentru femeia gravidă, aceste infecții pot avea urmări grave, putând duce la avort, la risc de malformații (sindromul TORCH) sau chiar la moartea produsului de concepție (Tabelul 4.3) [73].

Tabel 4.3. Profilul TORCH

Conform buletinului de analize, în cazul pacientei se pot observa rezultate pozitive în cazul virusului rubeolic – anticorpi IgG, cu o valoare >500 UI/mL și în cazul citomegalovirus- anticorpi IgG, cu o valoare de 375 UI/mL, rezultatele obținute reflectând un profil TORCH corespunzător trecerii prin infecțiile respective, cu valori pozitive ale anticorpilor IgG corespunzători și care nu reprezintă un risc pentru sarcină.

De asemenea, pacienta a efectuat pe parcursul sarcinii si testele diagnostic precum NIFTY sau Triplu Test, rezultatele fiind negative și excluzând, astfel, riscul aneuploidiilor cromozomiale.

De menționat este că s-a monitorizat dezvoltarea sarcinii prin teste de laborator specifice, toate analizele fiind în parametrii normali la începutul sarcinii. S-au avut, însă, în vedere, dozările de transaminaze (TGO, TGP) și proteinuria, care au înregistrat valori în creștere, valori ce au fost corelate cu dozările de GGT (gama-glutamiltranspeptidaza) și fostatază în creștere (Fig.4.4). Această condiție poartă numele de hiperemezis gravidarium sau sarcină toxică, condiție care s-a exemplificat și în cazul pacientei.

Figura 4.4. Evoluția în timp a enzimelor hepatice

În cazul pacientei, deși analizele de rutină, dar și cele de diagnostic prenatal, au fost în parametrii normali, aceasta s-a confruntat cu eclampsie, afecțiune care se declanșează în momentul în care presiunea intrauterină este prea mare sau când cantități mari de proteine în urină. Pentru pacientă, proteinele urinare au înregistrat valori de la 0,17 la 0,92, în timp ce proteinele urinare pe 24 de ore au crescut de la 0,34 la 2,208 (Fig.4.5)

Figura 4.4. Distribuția proteinelor urinare și a proteinelor urinare pe 24h pe o perioadă de o lună (iulie-august 2018)

Este cunoscut faptul că preeclampsia reprezintă debutul eclampsiei, fiind o cauză de mortalitate maternă ce include naștere prematură sau defecte de creștere intrauterine, anual înregistrându-se 50.000 de decese. Cerințele minime pentru identificarea preeclampsiei presupun tensiune arterială peste 140/90 mmHg și proteinurie peste 200 mg/24 ore [74].

Preeclampsia este considerată drept o afecțiune patologică, care presupune, pe de o parte, inserție anormală – placentă previa, și pe de altă parte, un proces de spiralare incomplet al arterelor materne care conduce la ischemie, caz în care trofoblastul migrează la nivelul acestora prin influența citokinelor, a presiunii oxigenului sau a celulelor natural killer (NK). Astfel, are loc apariția unui dezechilibru între factorii antiangiogenici și factorii proangiogenici [75].

Factorii proangiogenici sunt reprezentați de factorul de creștere al endoteliului vascular (FCEV) și de factorul de creștere a trombocitelor (FCT). Acești factori au rol în angioneza placentară, care asigură integritatea celulelor endoteliale de origine maternă [76].

Pe de altă parte, factorii antiangiogenici sunt reprezentați de receptori FCEV1 și FCEV2, FCEV1 Eng purtând denumirea științifică de kinază-tirozină, iar FCEV2 fiind cunoscut sub denumirea de receptor al inserției kinază [77].

Preeclampsia poate avea efecte asupra produsului de concepție, ducând în multe dintre cazuri la moarte fetală intrauterine, la restricția creșterii produsului de concepție, la afecțiuni hematologice fetale când se poate ajunge la trombocitopenie neonatală ca mecanism al hipoxiei și proliferării megacariocitelor. Preeclampsia mai poate induse displazie bronhopulmonară, caracterizată printr-o concentrație scăzută de flux sangvin în placenta sau chiar origini fetale care se relevă și în viața adultă [78].

Acronimul HELLP descrie un sindrom ce se caracterizează prin hemoliză, nivel crescut al enzimelor hepatice și trombocitopenie. În sindromul HELLP, analizele de hematologie pot fi fie normale, fie ușor scăzute, haptoglobina putând fi capabilă de a confirma hemoliza în acest caz. Ca în cazul preeclampsiei, transaminazele pot fi mult crescute, în timp ce proteinuria nu mai este atât de relevantă ca în cazul diagnosticului de preeclampsie. Cea mai fidelă testare rămâne cea a D-dimerilor, un test pozitiv pentru pacientele cu preeclampsie, fiind indicator predictiv pentru cele care pot dezvolta sindrom HELLP [79].

În cazul preeclampsiei, singura metodă de tratament este nașterea. Revenind la cazul pacientei prezentate, evoluția a fost nefavorabilă, fiind diagnosticată cu eclampsie manifestă (valori înalte de HTA și tulburări cerebrale) cu necesitatea intervenirii prin cezariană și pierderea

nou-născutului (prematuritate grad 4, 30 săptămâni). Valorile patologice ale biomarkerilor evaluați (TGO, TGP, GGT, fosfataza alcalină, proteinuria) s-au normalizat după 4 săptămâni.