Contaminarea culturilor agricole cu fungi filamentoși, ai căror metaboliți secundari [619540]

Introducere

Contaminarea culturilor agricole cu fungi filamentoși, ai căror metaboliți secundari
sunt toxici pentru oameni și animale, este un fapt care ridică probleme financiare și medicale
atât pe plan național, cât și mondial. Acești metaboliți au efecte grave asu pra sănătății
oamenilor și animalelor, putând fi chiar letali. Printre cele mai grave manifestări ale
micotoxicozelor (intoxicații cu micotoxine) se numără imunosupresia, încetinirea ratei de
creștere și carcinomul hepatocelular. Micotoxinele reprezintă o problemă mai accentuată în
țările în curs de dezvoltare unde reglementările privind buna practică a depozitării și
prelucrării produselor furajere nu sunt mereu respectate datorită costurilor ridicate ale
aparaturii și metodelor necesare detecției micotoxi nelor în hrană, dar și a lipsei de coerență și
corectitudine în informarea producătorilor. În momentul actual se utilizează diferite metode
de combatere a micotoxinelor, atât în domeniul agricol prin încercarea de a preveni
contaminarea culturilor, cât și în domeniul medical unde se încearcă combaterea efectelor
acestora în organism.
Aflatoxina B1 este catalogată de către Agenția Internațională a Cercetării pentru
Cancer în grupul substanțelor cancerigene pentru oameni. Inițial inertă, odată ajunsă în
organ ism aflatoxina B1 este metabolizată în ficat, fiind bioactivată de către enzimele citocrom
P450 în compuși cu diferite grade de toxicitate. Cea mai critică transformare este epoxidarea
AFB1 cu formarea compusului AFB1 – epoxid. Acesta din urmă este un compu s puternic
electrofil și se poate lega covalent la regiunile nucleofile din ADN, ARN sau proteine. În
momentul legării la ADN, acesta determină transversii care pot afecta inclusiv gena ce
codifică pentru proteina supresor p53 care intervine în reglarea ci clului celular, fapt ce poate
duce la apariția carcinomului hepatocelular. Totuși compusul AFB1 -epoxid poate fi eliminat
din organism prin conjugare cu glutationul de către glutation -S-transferaza, fapt ce crește
polaritatea compusului facilitând procesul de eliminare.
Contaminarea culturilor agricole cu fungi filamentoși, ai căror metaboliți secundari, și
anume micotoxinele, sunt toxici pentru oameni și animale, este un proces natural care, chiar și
cu cele mai bune practici de prevenție nu poate fi oprit . Se estima încă din 1999 că aproximativ
25% din culturile agricole de pe glob ar fi contaminate cu micotoxine, dar adevăratul procent
ar fi mult mai mare dacă s -ar monitoriza și culturile contaminate cu o cantitate de micotoxină
sub limita admisă de Codex ul propus de Organizația Mondială a Sănătății sau Uniunea

Europeană (Eskola și colab., 2019). Astfel hrănirea animalelor domestice cu o dietă
contaminată ajunge să fie uneori inevitabilă. Din această cauză se încearcă găsirea unor soluții
alternative de co mbatere a efectelor nocive ale micotoxinelor ajunse prin ingestie în organism.
O alternativă viabilă tot mai des abordată este folosirea aditivilor furajeri care să favorizeze
eliminarea micotoxinelor din organismul animalelor, minimalizând efectul lor tox ic. Acest
studiu încearcă să demonstreze eficiența semințelor de struguri (compuși bogați în substanțe
bioactive cu proprietăți benefice organismului) de a contracara efectele toxice ale uneia dintre
cele mai periculoase micotoxine (aflatoxina B1) în organ ismul suinelor. Obținerea unor
rezultate pozitive care să fie în conformitate cu alte studii de specialitate din acest domeniu vor
atesta acest aditiv furajer ca o variantă rapidă și avantajoasă din punct de vedere financiar și
ecologic în a apăra organism ul animalelor domestice de citotoxicitatea indusă de metaboliții
aflatoxinei B1.
În acest studiu s -a urmărit modificarea expresiei genice a genelor cyp1a2 și cyp4a24 din
ficat indusă de o dietă pe bază de aflatoxina B1 și o dietă ce conține aflatoxina B1 și semințe
de struguri față de un grup control. Studiul experimental a fost realizat pe o durată de 30 de zile
și a folosit un număr de 16 purcei ce au fost distribuiți în mod aleatoriu în loturi de câte 4
indivizi pentru a fi hrănite cu patru diete diferi te. Astfel, loturile de purcei au fost denumite: lot
control (purcei hrăniți cu furaj control); lot experimental E1 (purcei hrăniți cu furaj control +
semințe struguri), lot experimental E2 (purcei hrăniți cu furaj control +AFB1) și lot
experimental E3 (pu rcei hrăniți cu furaj control + semințe struguri +AFB1). După terminarea
experimentului, probele de ficat obținute au fost prelucrate în vederea obținerii ARN total, care
după evaluare integrității este supus reacției de revers -transcriere pentru a obține ADN
complementar (ADNc) . Acesta este mai departe amplificat prin tehnica Real -Time PCR pentru
evidențierea nivelului de expresie genică.

Capitolul 1 – Micotoxine
1. Caracteristici generale
Micotoxinele sunt produși secundari toxici ai metabolismului f ungilor filamentoși. Sunt
molecule cu masă moleculară mică care apar în mod natural în natură, dar care afectează grav
sănătatea oamenilor și a vertebratelor care ajung să le digere, putând fi chiar letale (Marin și
colab., 2013).
Termenul de micotoxine es te folosit pentru prima dată în literatura de către Wannop
care descrie în 1961 o nouă boală care se manifestă la curcanii din sudul Angliei. Erau
afectate cu precădere pasările în vârsta de o lună, având o rată de mortalitate foarte ridicată,
iar printre simptomele din stadiile terminale se numărau afecțiuni nervoase și comă. Această
boală nu era provocată de niciun microorganism patogen sau virus cunoscut, astfel a primit
numele de boala curcanului “X”(Turkey “X” disease). La analiza histopatologică a org anelor
acestor curcani, s -a concluzionat că ficatul a fost cel mai afectat organ, unde s -a observat o
creștere în mărime a celulelor parenchimatice și a nucleilor acestora, apariția unor vacuole și
citoplasmă eozinofilă ca fiind principalele schimbări ce a u avut loc la nivelul ficatului. De
asemenea, s -au înregistrat zone cu o rată mare de necroză a celulelor. În acest studiu se pune
pentru prima data problema contaminării hranei destinate animalelor domestice cu micotoxine
(Wannop, 1961). Într -adevăr, stud ii ulterioare au demonstrat faptul că acești curcani erau
hrăniți cu arahide importate din Brazilia și contaminate cu micotoxine produse de Aspergillus
flavus (Bennett și Klich, 2003).
În prezent, se cunosc peste 500 de compuși încadrați în grupul micotoxi nelor, deși
doar câțiva sunt studiați cu atenție deoarece prezintă o amenințare pentru oameni și animale
(Stein și Bulboacă, 2017).
Într-o lucrare amplă asupra micotoxinelor, Bennett și Klich (2003), atrag atenția
asupra faptului că nu toți produșii toxici de metabolism ai fungilor sunt recunoscuți ca
micotoxine. Aici putem încadra antibioticele (care sunt metaboliți secundari toxici pentru
bacterii), dar și fitotoxinele (metaboliți toxici pentru plante). Din categoria micotoxinelor se
exclud, de asemenea, compușii otrăvitori ai ciupercilor. Se acceptă ideea potrivit căreia
mucegaiurile generează micotoxine, iar ciupercile și fungii de dimensiuni macroscopice
produc compuși otrăvitori. Pentru această diferențiere se ia în calcul atât dimensiunea
fungilor, câ t și modul de intoxicare al oamenilor cu acești metaboliți secundari. Ingestia de
micotoxine se realizează aproape exclusiv fără știință individului, pe când otrăvurile

sintetizate de ciuperci pot ajunge în corpul individului printr -o identificare eronată a unei
specii otrăvitoare.
Genurile majore de fungi care provoacă o contaminare frecventă și problematică a
alimentelor cu micotoxine sunt Aspergillus, Fusarium și Penicillium (Alshannaq și Yu, 2017).
Pitt (2003), întâmpină dificultăți în propunerea unui s istem de clasificare al
micotoxinelor deoarece nu există un singur criteriu după care să fie catalogate, acestea având
multiple caracteristici și proprietăți. Spre exemplu, din punct de vedere structural,
micotoxinele au structuri destul de diverse din pun ct de vedere chimic, ceea ce determină o
varietate mare a organelor și țesuturilor țintă în organismul unui individ, unde mecanismele de
acțiune diferă de la o micotoxină la alta.
Micotoxinele produc boli reunite generic sub denumirea de micotoxicoze. Ace stea pot fi
catalogate drept acute sau cronice. Micotoxicozele acute prezintă un răspuns clar și prompt al
organismului la toxină, în timp ce cele cronice apar ca urmare a expunerii organismului la
doze scăzute de toxină pe o perioadă lungă de timp și pot determina boli ireversibile precum
cancer și deficiență imunitară. Diagnosticarea micotoxicozei urmărește relația doză -efect
dintre micotoxină și boală. Pentru a pune acest diagnostic unui om este necesar că simptomele
prezentate să poată fi reproduse în m odele animale expuse micotoxinei suspectate (Bennett și
Klich, 2003).
2. Principale tipuri de micotoxine și efectele lor asupra
animalelor
În general, fiecare specie de fungi produce mai mult de o singură clasă de micotoxine.
Prezența unei micotoxine poate influența acțiunea altei micotoxine, având efecte cumulative.
Totuși, datorită diversității și numărului mare de micotoxine, acestea sunt studiate separat,
punându -se accentul pe mecanismul unic de acțiune al unei singure micotoxine, în defavoarea
studierii acțiunii lor sinergice (Stein și Bulboacă, 2017). Un studiu realizat în trei ani, cu 7049
de probe de porumb, soia, grâu și cereale cole ctate din America, Europa și Asia și testate
pentru prezenta a cinci mari categorii de micotoxine, a concluzionat că în 48% din aceste
probe a fost testată pozitiv coexistența a două sau mai multe micotoxine (Rodrigues și
Naehrer, 2012) Efectele sinergice ale acestor toxine sunt o problemă tot mai evidentă de o
gravitate apreciabilă care trebuie analizată mai amănunțit.
Printre micotoxinele care afectează grav starea de sănătate a oamenilor și animalelor
expuse, amintim: aflatoxinele, ocratoxinele, fumonis inele, zearalenona.

a. Ocratoxine
Aceste toxine sunt produși secundari de metabolism ai genurilor Aspergillus și
Penicillium . Ocratoxinele generate de Aspergillus ochraceus sunt identificate cu precădere în
alimentele cultivate în zonele tropicale, în timp c e Penicillium verrucosum preferă zonele cu
climat temperat. Printre alimente contaminate amintim cerealele, orez, fasole, nuci, alune, dar
și produse animale precum lactatele. S -a observat că principalele surse din care oamenii se
intoxică cu ocratoxinele sunt cafeaua și vinul (Alshannaq și Yu, 2017)
Cea mai periculoasă ocratoxină este ocratoxina A, catalogată de Agenția Internațională a
Cercetării pentru Cancer – IARC (International Agency for Research on Cancer) aparținând
grupului 2B (posibil cancerigenă pentru oameni) (Ostry și colab., 2017). Această încadrare se
bazează pe mai multe studii realizate pe animale care susțin apariția tumorilor hepatocelulare
și renale la șoareci și șobolani. De asemenea, studii din ultimul deceniu au demonstrat
formarea ad ucțiilor OTA -ADN la șoareci, suine și șobolani (Ostry și colab., 2017).
Structural, ocratoxina A este un derivat fenilalanilic clorurat al unui isocumarin substituit.
Structura sa este prezentată în figura 1 . Aceasta interacționează cu enzime care foloses c acest
aminoacid ca substrat, precum complexul proteic Phe -ARNt, putând duce astfel la
perturbarea sintezei proteice (Marin și colab., 2013). La oameni, totuși, proprietățile
carcinogene ale toxinei sunt mai puțin înțelese și nu au fost demonstrate conc ret prin studii
experimentale (Bennett și Klich, 2003).
Studii realizate până în prezent pe animale au concluzionat că ocratoxina A este
nefrotoxică, afectând buna funcționare a rinichilor. Suinele sunt cele mai susceptibile animale
la nefropatia cauzată d e ocratoxina A, unde s -a observat atrofierea tubulilor proximali, fibroză
corticală interstițială și glomeruli sclerozați și, de asemenea, scăderea capacitații de a produce
urina concentrată (Reddy și Bhoola, 2010).

Figura 1. Structura moleculară a ocra toxinei A . (Sursă: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ )

b. Fumonisine
Sunt sintetizate în special de genul Fusarium , cu specii precum Fusarium verticillioides și
Fusarium proliferatum că surse principale de producere a acestor micotoxine (Alshannaq și
Yu, 2017). Aceste specii de fungi au fost raportate în culturile de grâu, orez, soia, smochine,
ceai negru, plante medicinale, totuși cel mai afectat aliment este porumbul (Stein și Bulb oacă,
2017).
Cele mai importante fumonisine, din perspectiva toxică, sunt fumonisina B1 și B2, dintre
acestea cea mai des întâlnită este fumonisina B1, încadrată de Agenția Internațională a
Cercetării pentru Cancer – IARC(International Agency for Research on Cancer) în grupul 2B
(posibil cancerigenă pentru oameni) (Ostry și colab., 2017). Sunt substanțe hidrofile, cu
lanțuri lungi de polihidroxiamine care pot fi dizolvate complet în solvenți organici. Din punct
de vedere structural, se aseamănă cu precursor ii sfingolipidelor, precum se poate observa în
figura 2 . Din această cauză ele perturbă metabolismul sfingolipidelor prin inhibarea ceramid
sintazei, care controlează ciclul de reciclare al sfingozinei (Marin și colab., 2013; Stein și
Bulboacă, 2017).
În studiile pe animale s -a observat că fumonisinele atacă cu precădere rinichii și ficatul.
La animale, fumonisinele determina leucoencefalopatie la cai, edem pulmonar la suine, iar la
șobolani sunt asociate cu efecte hepatotoxice și carcinogene (Bennett și Kl ich, 2003). La
oameni, niciunul dintre aceste aspecte nu a fost corelat cu ingestia de fumonisine (Pitt, 2013).
În 1970, un focar de contaminare a porumbului cu micotoxine a dus la un nivel crescut de
leucoencefalopatie observată la caii din Africa de Sud (Alshannaq și Yu, 2017).

Figura 2. Structura moleculară a fumonisinei B1. (Sursă: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ )

c. Zearalenone
Sunt toxine sintetizate de genul Fusarium , care este un contaminant al culturilor de
cerealelor din întreaga lume. Structura sa moleculară este asemănătoarea ce cea a 17β –
estradiol și induce efecte estrogene în animale. Este considerat un micoestrogen sau estrogen
cu altă sursă de provenință în a fara steroizilor. Structura moleculară este prezentată în figura
3. O activitate estrogenică ridicată s -a observat pentru forma sa redusă – zearalenol (Bennett
și Klich, 2003). Agenția Internațională a Cercetării pentru Cancer – IARC(International
Agency f or Research on Cancer) clasifică această substanță în grupul 3 (nu este clasificabil în
ceea ce privește carcinogenitatea sa la oameni) (Ostry și colab., 2017). Structura moleculară a
acestei toxine este prezentată în figura3.
La bovine, ingestia susținut ă de ZEA este asociată cu hiperestrogenism, scăderea
producției de lapte sau chiar infertilitatea (Alshannaq și Yu, 2017). Datorită legării acestei
structuri la receptorul pentru estrogen din animale, diferite alterații ale sistemului
reproducător au fost semnalate la șoareci, șobolani, suine, hamster și iepuri (Stein și
Bulboacă, 2017).

Figura 3. Structura moleculară a zearalenonei. (Sursă: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ )

d. Aflatoxine
Aflatoxinele (A F) sunt metaboliți secundari ai fungilor din genul Aspergillus , în special
speciile A. flavus, A. parasiticus, A. nomius, A. bombycis și A. pseudotamari . Dintre acestea
A. flavus și A. parasiticus sunt cele mai întâlnite, fiind contaminanți comuni ai indus triei
agricole, apărând cu precădere în mărfurile alimentare uscate precum culturile de cereale,
nuci, mirodenii și în semințele plantelor oleaginoase (Bennett și Klich, 2003;Marchese și
colab., 2018).
Agenția Internațională a Cercetării pentru Cancer – IARC(International Agency for
Research on Cancer) include aflatoxinele B1 (AFB1), aflatoxina B2(AFB2), aflatoxina G1
(AFG1), aflatoxina G2 (AFG2) și aflatoxina M1 (AFM1) în grupul 1 al substanțelor
cancerigene (Ostry și colab., 2017). Această încadrare s -a realizat după ce multe studii
realizate pe animale au demonstrat efectele toxice ale acestor substanțe .
Aflatoxinele provoacă boala numită aflatoxicoză. Apare cu precădere în țările în curs de
dezvoltare unde reglementările privind prelucrarea culturilor agricole sunt greu de respectat și
condițiile de depozitare ale acestora favorizează contaminarea cu Aspergillus . Aceasta poate
avea caracter acut sau cronic. Aflatoxinele au efecte hepatotoxice, mutagene, imunosupresive
și cancerigene, ficatul fiind orga nul principal în care acționează. Pot conduce la apariția
carcinomului hepatocelular, cu precădere la indivizii care suferă de hepatita B (Alshannaq și
Yu, 2017).
Pentru oameni, aflatoxicoza acută este caracterizată de simptome precum vomă, durere
abdomina lă, edem pulmonar și cerebral, comă, convulsii sau deces (Alshannaq și Yu, 2017).

Alfatoxicoza cronică este asociată cu efecte teratogene, cu simptome precum rată scăzută a
creșterii și afecțiunii ale procesului de digestie (Sarma și colab., 2017).
În 2015 , OMS estima că persoanele din Regiunea Pacificului de Vest sunt cele mai
afectate de expunerea la aflatoxine, cu un procent de 70% din totalul persoanelor care suferă
complicații din cauza acestor toxine, provenind din această regiune ( https://www.who.int/news –
room/detail/03 -12-2015 -who-s-first-ever-global -estimates -of-foodborne -diseases -find-children -under -5-
account -for-almost -one-third -of-deaths ).
Pentru animale, forma sub care se manifestă aflatoxicoza depinde de specie, vârstă,
sex și nutrienții pe care îi primesc din mâncare. Boala are efecte grave asupra ficatului, dar se
observă și o scădere a producției de lapte sau ouă. Printre simptomele care apar se numără
disfuncții gastrointestinale, anemie, rată scăzută a reproducerii, icter și scăderea apetitului
(Sarma și colab., 2017).
Speciile de fungi producatoare de aflatoxine preferă clima caldă și umedă. Cinar și
Onbașı (2019) identifică mai mulți factori favorizanți pentru dezvoltarea genului Aspergillus
în diferite culturi, precum o temperatur ă de creștere optimă între 29 – 35°C, cu producția
maximă de aflatoxină înregistrându -se la 24 °C și umiditate relativă sub 70%. De asemenea,
pentru a evita contaminarea stocurilor agricole după culegere cei mai importanți parametri
care trebuie optimizați sunt umezeala relativă a aerului și cantitatea de apă care se găsește în
substratul produsului, din această cauză este necesară uscarea produsului agricol imediat după
culegere și controlarea riguroasă a infiltrațiilor de apă în perioada de stocare. Totod ată apariția
fungilor mai poate fi facilitată în această etapă și de prezența insectelor sau rozătoarelor
(Santini și Ritieni, 2013).
S-au descoperit peste 20 de tipuri de aflatoxine, dintre care cele mai studiate sunt
aflatoxinele B1, B2, G1, G2, M1 și M2 (Ismail și colab., 2018). Aflatoxinele majore B1, B2,
G1, G2 au fost denumite astfel după fluorescența pe care o emit în lumină UV(albastră/ blue
sau verde/ green ) și după mobilitatea cromatografică relativă în tehnica cromatografi ei în strat
subțire (Bennett și Klich, 2003). Structura moleculară a acestor compuși este prezentată în
figura 4 .

Figura 4. Structurile moleculare ale aflatoxinelor B1, B2, G1, G2. (Sursă: https://pub chem.ncbi.nlm.nih.gov/ )

Aflatoxinele M1 și M2 se găsesc în laptele animalelor contaminate. AFM1 este forma
hidroxilată în poziția 4 a AFB1, iar AFM2 este 4 -hidroxi AFB2 ce apare ca urmare a
transformărilor metabolice (Ismail și colab., 2018). Oamenii sunt expuși la aflatoxine
preponderent prin ingestie directă a produselor cerealelor și a altor produse agricole
contaminate sau a produselor animale ce conțin urme de metaboliți, în special AFM1, precum
produsele lactate ( Figura 5) .
Ajunse în organism, afla toxinele sunt absorbite în tractul gastointestinal, ajung în
sânge și sunt distribuite la diferite organe, în special în ficat unde se desfășoară procesele de
metabolizare a xenobioticelor (Bbosa și colab., 2013).

Figura 5. Modalități de contaminare a o amenilor și animalelor domestice cu aflatoxina B1 și M1.

Din punct de vedere chimic, aflatoxinele sunt difuranocumarine și se împart în două
mari grupe ce includ difurocomarociclopentene (AFB1, AFB2, AFM1, AFM2 și aflatoxicol)
și difurocomarolactone (AFG1 , AFG2, AFGM1, AFSM2, AFB3) (Bbosa și colab., 2013).
Toate aflatoxinele sunt substanțe lipolitice putând fi absorbite cu ușurință prin
membrana celulelor aflate în tractul gastrointestinal și respirator. Din aceste celule,
aflatoxinele ajung în sânge de un de sunt expuse întregului organism (Sarma și colab., 2017).
Punctul de topire al aflatoxinelor este foarte ridicat, cu valori ce se încadrează între
237°C pentru AFG2 și 320 °C pentru AFP1 (Carvajal -Moreno, 2015).
Structura moleculară a AFB1 și AFG1 poate f i modificată prin reacții de hidrogenare
catalizate de agenți reducători și oxidativi cu formare a AFB2 și AFG2 (Carvajal -Moreno,
2015).
AFB1 este formată prin unirea unui inel ciclopentan cu inelul lactonă din structura
cumarinei. Printre proprietățile ch imice ale AFB1 amintim solubilitatea redusă în apă,

insolubilitate în compuși organici nepolari, dar solubil în cei polari. Este un compus stabil din
punct de vedere termic, rezistând la temperaturi de peste 100 °C, fapt ce ridică probleme mari
pentru indus tria alimentară deoarece compusul este rezistent la procesele de prelucrare a
hranei (Manikandan și Nagini, 2017).
Aflatoxina B1 este un compus inert, din punct de vedere chimic, considerat a fi un
procarcinogen. Caracterul toxic apare în momentul în care AFB1 este metabolizată, în ficat,
de către diferite izoenzime ale familiei de proteine citocrom P450. În funcție de enzima care
catalizează reacția, bioactivarea se desfășoară pe mai multe căi metabolice din care rezultă
compuși toxici activi, cu diferite grade de toxicitate (Rushing și Selim, 2019). Totodată,
AFB1 favorizează producerea speciilor reactive de oxigen, care conduc la peroxidarea
lipidelor și alterarea ADN sau a proteinelor și a membranei celulare. Aceste evenimente induc
apariția stresului ox idativ în celulă, reprezentând unul din mecanismele prin care AFB1 poate
distruge celulele (Grosu și colab., 2019). Speciile reactive de oxigen interacționează cu
fosfolipidele din membrana celulară ducând la peroxidarea lipidică a acizilor grași
polinesat urați și duc la schimbarea permeabilității și fluidității membranei determinând
degradarea integrității celulare. Celula prezintă enzime cu rol în prevenirea stresului oxidativ
precum superoxid dismutaza(SOD), glutation peroxidaza (GPx) sau catalaza (CAT). SOD
transformă superoxidul în peroxid de hidrogen, urmând ca acesta să fie convertit în apă și
oxigen de către CAT (Barrera, 2012). În același timp peroxidarea lipidică împiedică
mecanismele de reparare ale ADN și crește predispoziția mutațiilor, determin ând apariția
aducțiilor aldehidă -ADN la codonul 249 al proteinei p53 eveniment ce este întâlnit în peste
60% din cazurile de carcinom hepatocelular asociat cu intoxicarea cu AFB1 (Engin și Engin,
2019).
Într-un studiu realizat pe 24 de suine hrănite cu afl atoxina B1 timp de 30 de zile, s -a
demonstrat că această toxină a dus la creșterea speciilor reactive de oxigen, în același timp
scăzând concentrația unor enzime precum SOD, GPx sau CAT, importante în sistemul de
apărare apărare al organismului împotriva s tresului oxidativ. Totodată concentrația
substanțelor reactive ale acidului tiobarbituric (TBARS), marker al peroxidării lipidice, a fost
crescută în urmă consumului de AFB1. Alte rezultate semnificative ale studiului au arătat o
reducere semnificativă a g reutății corporale fapt datorat schimbărilor pe care le provoacă
AFB1 asupra abilitații de absorbție a substanțelor în intestin și prin scăderea sintetizării IGF -1
care stimulează creșterea celulară, activitatea scăzută a enzimelor digestive și perturbarea
gluconeogenezei sau sintezei acizilor grași. Intoxicația cu AFB1 a avut efecte negative și

asupra sintezei proteice și a determinat o creștere în nivelul plasmatic al enzimelor care indică
o leziune hepatică (AST, ALT, ALP, LDH). AFB1 a crescut nivelul de IFN-gamma, IL -1β,
TNF -α, IL -6 și Il -8 în ficat și colon, dar le -a scăzut în duoden (Tăranu și colab., 2019). Un alt
studiu care atestă inducere de specii reactive de oxigen și degradarea țesutului hepatic de către
AFB1 a fost făcut pe 300 de găini. AFB1 a scăzut concentrația totală de proteine din ser, a
albuminei și a globinelor și a crescut activitatea enzimelor hepatice AST, ALT, CGT și ALT.
De asemenea, AFB1 a indus creșterea nivelului de malonaldehidă (MDA) și a scăzut
activitatea enzimatică a enzimel or implicate în procesele antioxidante (SOD, CAT, GPx)
(Rajput și colab., 2017). De asemenea, rezultare asemănătoare s -au observat la șobolani unde
un studiu realizat in vivo pe femele de șobolani hrănite timp de 10 zile cu o dietă pe bază de
AFB1 a înregi strat o creștere a nivelului de peroxidare lipidică în ficatul animalelor, în timp
ce activitatea enzimeleor hepatice antioxidante(SOD, CAT, GPx) a scăzut. Totodată s -a
observat o creștere a nivelului de TNF -α, oxid nitric(NO) și IL -1α care sugerează că AF B1
afectează funcția macrofagelor ducând la dezvoltarea leziunilor hepatice (Abdel -Wahhab și
colab., 2006).
În 1980, Lutz și colaboratorii au realizat un experiment în care s -a urmărit pentru
prima oară expresia in vivo a legării covalente a aflatoxinei B1 și M1 la ADN din celulele
hepatice de la șobolani, șoareci și suine. Eficiența de legare covalentă a fost descrisă prin
unitatea indexului de legare covalentă ( Covalent Binding Index – CBI) exprimat pentru
cantitatea d e ADN legată per doză. Dintre cele trei specii, în suine s -a observat cel mai crescut
CBI al AFB1, chiar și la 48 de ore de la administrarea aflatoxinei. Între șobolani și șoareci
există o susceptibilitate diferită asupra efectelor hepatocarcinogene ale AF B1, fapt ce reiese
din CBI al AFB1 la ADN hepatic de cinci ori mai mare al șobolanului decât comparativ cu
acest parametru la șoareci, după un timp de 6 -8 ore de la administrare. Comparativ cu alte
studii în care administrarea toxinei se realiza prin injec ție intraperitoneală și metoda de
administrare orală folosită în acest experiment, nu s -au înregistrat diferențe ale CBI pentru
ADN din celulele hepatice, fapt ce atestă că ficatul este organul principal de metabolizarea a
aflatoxinelor.
Un alt studiu a a nalizat efectele produse de aflatoxinele din dietă asupra expresiei
genelor pentru apoptoză în celulele hepatice la suine. Au fost folosite loturi de 90 de suine
care au fost hrănite cu concentrații mici și crescute de AFB1, precum și un grup control, timp
de 7, 28 și 70 de zile. Rezultatele au concluzionat că AFB1 este un factor care afectează
expresia diferențială a genelor implicate în apoptoza celulelor hepatice. După cea mai lunga

perioada de expunere, de 70 de zile, 15 gene implicate în apoptoză au fo st exprimate
diferențial, iar patru dintre acestea au fost exprimate și după doar 7 zile de administrare a
toxinei (Rustemeyer și colab., 2011).
3. Pagube și modalități de prevenție
a. Pagube – focare, culturi contaminate și pierderi economice
Micotoxinele sunt omniprezente în culturile agricole, fiind dificil de eliminat prin
procesele de prelucrare a produselor agricole. Aceste substanțe ajung în hrana animalelor
domestice, iar de aici în produsele alimentare de origine animală obținute pentru consumul
omului. Expunerea la micotoxine, indiferent de modalitate, fie prin ingestie, inhalare sau
contact cu pielea, ridică grave probleme de sănătate, atât pentru om cât și pentru animale (Pitt,
2013). Din acest motiv micotoxinele reprezintă un domeniu de interes global, afectând
negativ atât economia cât și sănătatea indiviziilor de pretutindeni.
Date experimentale obținute din studiul a peste 7000 de probe de porumb, boabe de soia și
grâu, testate pentru prezența a uneia dintre cinci micotoxine care afectează sănătatea
animalelor – aflatoxine, zearalenone, deoxynivalenol, fumonisine și ocratoxina A – a
concluzionat că 81% din probe erau contaminate cu cel puțin o micotoxină, în timp ce
porumbul a prezentat o susceptibilitate mai mare pentru dezvoltar ea fungilor decât celelalte
două cereale (Rodrigues și Naehrer, 2012).
Expunerea la micotoxine diferă în funcție de regiune și condițiile de trai existente în zona
respectivă. Astfel, regiunile cele mai afectate de această problemă sunt cele în care metode le
de depozitare și manipulare a hranei sunt deficitare, unde există cazuri de subnutriție și puține
reglementări pentru a proteja populația de expunere (Bennett și Klich, 2003).
Focare de contaminare a culturilor agricole cu micotoxine au fost raportate d e-a lungul
anilor în țări din Asia sau Africa. În 1967, 26 de persoane au suferit de aflatoxicoză acută,
dintre care trei au murit, după ce au consumat orez contaminat cu până la 200 µg aflatoxina
B1/kg în Taiwan. (Aidoo, 2018). În India s -au înregistrat a tât contaminări cu aflatoxine a
culturilor de porumb, în 1974, care a dus la decesul a 100 de oameni, dar și cu fumonisine, în
1995, datorită contaminării culturilor de porumb și cereale (Cinar și Onbașı, 2019). Unul
dintre cele mai grave și de amploare ca zuri de aflatoxicoză s -a înregistrat în Kenya în 2004,
după contaminarea în masă a culturilor de porumb, unde s -a descoperit un nivel de aflatoxina
B1 de 220 de ori mai ridicat decât limitele acceptate în această țară. Acest lucru a dus la
moartea a 125 de persoane care au consumat porumb contaminat (Aidoo, 2018).

Contaminarea cu micotoxine poate apărea înainte de recoltă sau după recoltă în timpul
procesării, al împachetării, distribuirii sau depozitării produselor alimentare (Alshannaq și Yu,
2017).
Un st udiu realizat pe o perioadă de 4 ani, din 2012 până în 2015 inclusiv, în România,
a analizat contaminarea post -recoltare a cerealelor cu micotoxine în funcție de evenimentele
meteorologice, poziționarea geografică și condițiile agroclimatice ale țării (Ga giu și colab.,
2018) S -au descoperit contaminări peste nivelul acceptat cu aflatoxine în 2012 și 2013, în
zonele cu climat mai uscat precum Câmpia de sud și Dobrogea. Acești ani au fost marcați de
puține precipitații și secete abundente cu temperaturi cres cute în perioada verii. Condițiile
climatice au afectat cu precădere culturile de porumb care au înregistrat atât pierderi la nivelul
producției, dar și o creștere a contaminării cu fungi din genul Aspergillus , și implicit cu
aflatoxine (Gagiu și colab., 2 018). În 2013, stocuri agricole de porumb contaminate cu
aflatoxine au fost folosite pentru hrana animalelor domestice, fapt ce a rezultat în
contaminarea produselor lactate, în special a laptelui de vacă, cu aflatoxina M1 și a determinat
firme producătoar e să retragă de pe piața cantități uriașe de produse de tip iaurt și smântâna și
să blocheze în depozit un total de 75 de tone de produse lactate. Acest episod a dus la pierderi
în valoare de sute de mii de euro la nivelul companiilor mari, iar urmările sa le s-a resimțit pe
întreaga piața din România, afectând de asemenea, și producători locali
(https:/ /www.digi24.ro/stiri/actualitate/evenimente/danone -retrage -596-tone-de-produse -tip-iaurt-de-pe-
rafturile -magazinelor -romanesti -57513 ).
Gagiu și colaboratorii (2018), atestă că în condițiile actuale, în care schimbările climatice
reprezintă un adevăr pe car e-l trăim și îl resimțit cu toții, creșterea temperaturii, chiar și numai
cu 2°C și fenomene extreme de secetă și umiditate ridicată pe perioade lungi de timp vor duce
la crearea condițiilor ideale pentru dezvoltarea fungilor din genul Aspergillus în cultu rile de
porumb și nu numai, în zona Europei de sud -est.
b. Metode de detecție și prevenție
Pentru a elimina riscurile unor efecte negative cauzate de micotoxine asupra sănătății
oamenilor și animalelor se încearcă contracararea acestora prin diferite metode , în diferite
stadii ale procesului prin care micotoxinele ajung din cultura contaminată în organism. Santini
și Ritieni, (2013), identifică trei momente cheie în care se poate contracara acțiunea unei
micotoxine:
1. Prevenirea unei contaminări a culturii agr icole;
2. Detecția stocurilor agricole contaminate;

3. Inhibarea absorbției micotoxinei în tractul digestiv.
Cea mai bună cale de combatere a micotoxinelelor este considerată prevenția contaminării
culturilor. Astfel, prin respectarea recomandărilor de cultivare și stocare a recoltelor se pot
minimaliza riscurile dezvoltării fungilor și implicit a metaboliților acestora. Totuși, cum
fenomenele naturale sunt imprevizibile, iar eroarea umană este un fapt real, chiar și cele mai
bune precauții vor avea un factor de risc. În prezent se încearcă combaterea lor prin metode de
inginerie genetică, dar cum contaminarea culturilor este un proces considerat natural, apariția
micotoxinelor este de multe ori inevitabilă (Bennett și Klich, 2003).
Un articol publicat în 2018 de către Organizația Mondială a Sănătății (OMS)
(https://www.who.int/foodsafety/FSDigest_Aflatoxins_EN.pdf ) susține că principalele surse de
contaminare directa a oamenilor cu aflato xine sunt semințele, nucile și produsele derivate din
acestea. Se subliniază faptul că existența metodelor avansate și eficiente de a detecta
aflatoxinele din culturi, folosite la ora actuală, nu sunt puse în balanță cu lipsurile financiare
pe care le expe rimentează anumite zone, cu precădere cele rurale. Cele mai utilizate tehnici de
detectare includ cromatografia în strat subțire (TLC), cromatografie lichidă de înaltă
performanta (HPLC), spectrometrie de masa (MS), precum și combinații ale acestor tehnici că
de exemplu HPLC -MS ( High -Performance Liquid Chromatography -Mass -Spectrometry ), dar
și metode imunologice precum ELISA ( Enzyme -Like Immunosorbent Assay ) care detectează
aflatoxinele folosind godeuri speciale tapetate cu anticorpi specifici. Aceasta din urmă este o
metodă cantitativă, cantitatea de micotoxină fiind direct proporțională cu intensitatea culorii
diluțiilor, dată de reacții enzimatice (Zheng și colab., 2006). De asemenea, o metodă destul de
des utilizată este cea a coloanei de imunoafinitate /cromatografie de afinitate. În 2005,
Chiavaro și colaboratorii au realizat un experiment în care au comparat două metode de
detecție a aflatoxinelor B1 și M1 în ficatul suinelor. Autorii au comparat rezultatele obținute
prin metoda clasică de detecție, cr omatografia lichidă de înaltă performanță, cu metoda bazată
pe imunoafinitate (Immunoaffinity clean -up) și identificarea prin fluorescență a aflatoxinelor.
Testul a avut ca material biologic ficat de la 50 de suine din diferite ferme din nordul Italiei.
În urma rezultatelor obținute prin cele două metode s -a ajuns la concluzia că acestea prezintă
o corelație statistică semnificativă, astfel se demonstrează că metoda bazată pe identificarea
aflatoxinelor prin coloane de imunoafinitate poate înlocui HPLC în a naliza rapidă a datelor în
laboratoarele de control sau pentru producătorii de produse alimentare.
Datorită faptului că o mare parte din culturile agricole sunt contaminate cu fungi după ce
sunt recoltate, din cauza unor practici neadecvate de depozitare, se caută diferite metode de

blocare și eliminare a micotoxinelor. Dintre acestea, rezultate promițătoare au avut expunerea
la raze UV, uscarea rapidă prin scăderea concentrației de apă din produs la mai puțin de 20%
sau metoda de plutire prin care micotox inele sunt eliminate datorită densității mai mici a
produsului contaminat care se va ridica la suprafață în momentul în care este introdus într -o
soluție alături de alte produse necontaminate, putând fi astfel eliminat prin utilizarea unui
vacuum (Zhu și c olab., 2016).
Cu toate acestea, în anumite zonele rurale unde volumul producției este mic și nu există
suport financiar pentru testarea gradului de contaminare, calitatea produsului poate fi
compromisă fără a se cunoaste acest lucru, fapt ce atrage după si ne o posibila contaminare a
animalelor domestice și/sau a oamenilor din acea regiune
(https://www.who.int/foodsafety/FSDigest_Aflatoxins_EN.pdf ). Din această cauză sunt necesare și
alte modalități rapide, ieftine și precise de a preveni efectele nocive ale aflatoxinelor odată
ajunse în organism.
Câteva alternative la aceste metode care sunt laborioase și nu au avut întotdeauna efectele
scontate, sunt utilizarea diferitor agenți de biodegradare precum probioticele sau prebioticele
reprezentate de carbohidrați (Tăranu și colab., 2019). De asemenea, un interes din ce în ce mai
ridicat este îndreptat spre folosirea aditivilor furajeri pe post de abso rbanți pentru a bloca
biotransformarea substanțelor toxice în organismul animalelor (Gambacorta și colab., 2016).
Zhu și colaboratorii (2016) definesc câteva criterii pe care ar trebui să le respecte un inhibitor
bun al micotoxinelor. Printre trăsăturile i ndicate de aceștia, se regăsesc: o bună abilitate de a
se lega la diferite micotoxine, cu precădere cele cu caracter hidrofob mai pronunțat, o abilitate
de absorbție mare pentru a facilita absorbția unei cantități mari de toxină, o capacitate redusă
de leg are nespecifică cu alte substanțe precum nutrienții din hrană și, de asemenea, să aibă
asemănări profunde cu hrana animalelor pentru a putea fi tolerată și a nu induce un răspuns
imun în organism.
În 1993, un experiment condus de Schell și colaboratorii a analizat efectele unei diete ce
conține aflatoxină B1 simplă sau în combinație cu bentonitul de sodiu (clei) asupra funcție
ficatului la suine. S -au urmărit efectele cleiului asupra combaterii toxicității aflatoxinei B1.
Rezultatele au arătat o creștere a activității fosfatazei alcaline și a γ -glutamiltransferazei
pentru grupul hrănit cu aflatoxină, ceea ce indică deteriorarea țesutului hepatic. S -a constatat
că pentru eșantionul care a fost hrănit cu aflatoxină și clei, activitățile enzimelor erau mai
reduse față de grupul precedent. Acest lucru sugerează proprietatea cleiului de a limita
absorbția aflatoxinei B1 în tractul gastrointestinal (Schell și colab., 1993). De asemenea,

hidroxitoluen butilatul dietetic este un antioxidant care a fost folosit pe po st de absorbant al
aflatoxinei B1 în studii realizate pe curcani, unde s -a demonstrat că reduce formarea aducțiilor
aflatoxina B1 -ADN prin inhibarea epoxidării aflatoxinei B1 de către CYP1A5 (Santini și
Ritieni, 2013).
Sunt căutați aditivi furajeri care s ă poată lega mai multe tipuri de micotoxine deoarece,
substanțele care s -a demonstrat că sunt bune absorbante de micotoxine – în special cleiurile – nu
leagă decât un anumit tip de micotoxine (Avantaggiato și colab., 2014).
Substanțe bioactive întâlnite în p roduse precum ceai, turmeric, usturoi, varză, ceapă sau
semințe de struguri au capacitatea de a proteja organismul împotriva efectelor nocive ale
micotoxinelor (Galvano și colab., 2001). Lu și colaboratorii (2017) au folosit polifenoli din
ceai oxidați în timpul procesului de fermentare pentru a combate absorbția AFB1 la nivel
gastrointestianl la șobolani. Acest studiu a demonstrat că polifenolii oxidați din ceai au format
un complex cu aproximativ 85% din cantitatea totală de AFB1 regăsită în organismul
animalelor, facilitând excreția micotoxinei înainte de a fi biotransformată în ficat . De
asemenea, în extractul de ceai negru se găsește un conținut crescut de flavonoide cu rol
antioxidant (Choudhary și Verma, 2005) . Aceste substanțe au reușit să amelioreze efectele
negative pe care o dietă cu AFB1 timp de 30 de zile le -a avut asupra parametrilor antioxidanți
ai celulelor hepatice la șoareci. Extractul apos de ceai negru a crescut activitatea enzimelor
antioxidante: superoxid dismutaza(SOD), glutation peroxi daza (GPx) sau catalaza (CAT) și a
scăzut nivelul de peroxidare lipidică în ficatul șoarecilor hrăniți cu o dietă combinată cu
AFB1 si extract apos de ceai negru (Choudhary și Verma, 2005) . Totodată un studiu realizat
pe șobolani, a investigat rolurile ant ioxidante pe care le au extractul de ceai negru și
curcumina, compus întâlnit în turmeric cu proprietăți antioxidante, anti -inflamatorii și
antimutagenice, în hepatotoxicitatea indusă de AFB1 (Alm -Eldeen și colab., 2015). Atât
extractul de ceai negru, cât ș i curcumina au reușit să scadă nivelul de substanțe reactive ale
acidului tiobarbituric (TBARS) și al peroxidului de hidrogen(H 2O2), indicatori ai peroxidării
lipidice, să crească activitățile SOD, CAT, GPx și a glutation – S- transferazei, dar și să scădă
activitățile enzimelor care indică o leziune hepatică(AST, ALT, ALP). Acești parametri au
prezentat îmbunătățiri deosebite pentru animalele hrănite cu o dietă ce conținea pe lângă
AFB1, atât extract de ceai negru și cât și curcumină combinate comparativ cu animalele
hrănite cu o dietă pe bază de AFB1. (Alm -Eldeen și colab., 2015) . În concordanță cu acest
studiu, Gowda și colaboratorii (2009) atestă efectele antioxidante ale curcuminei din turmeric
asupra ficatului, într -un experiment realizat pe găini hrăni te cu o dietă ce conține AFB1 și

curcuminoide din pudră de turmenic timp de trei săptămâni. Acești compuși au inhibat
generarea de specii reactive de oxiden, cu precăderea a anionului superoxid și de asemenea,
au inhibat biotransformarea AFB1 în aflatoxico l. Un alt studiu ce analizează îmbunătățirea
parametrilor antioxidanți ai celulelor hepatice afectate de aflatoxicoză, urmărește efectele
benefice pe care le au extractele de usturoi, varză și ceapă la șobolani tratați timp de 15 zile cu
o dietă ce conține AFB1. Datorită compoziției bogate în compușilor organosulfurici cu
proprietăți antioxidante, dar care sunt și precursori ai glutationului care este conjugat cu forma
epoxidată a AFB1 facilitând astfel eliminarea mai ușoară a acesteia din organism, dietele
combinate cu AFB1 și extractele acestor plante au avut efecte pozitive asupra scăderii
nivelului de specii reactive de oxigen și a îmbunătățirii activității enzimelor antioxidante în
comparație cu grupul hrănit cu o dietă bazată doar pe AFB1 ( Abdel -Wahhab și Aly, 2003).
Efecte benefice asupra combaterii hepatotoxicității induse de AFB1 în animale prin
îmbunătățirea activității antioxidante a celulelor hepatice s -au mai observat la folosirea
extractului de ghimbir (Vipin și colab., 2017) și a extractelor din alge precum Laurencia
obtusa și Caulerpa prolifera (Abdel -Wahhab și colab., 2006) .
Semințele de struguri sunt o sursă nutrițională tot mai folosită în încercările de a combate
efectele nocive ale micotoxinelor, fiind utilizați în numeroase studii pe animal e datorită sursei
bogate de elemente bioactive cu diferite roluri în organism ( Avantaggiato și colab., 2014;
Gambacorta și colab., 2016 ; Rajput și colab., 2017 ; Grosu și colab., 2019 ; Tăranu și colab.,
2019) . Printre compuși se regăsesc polifenoli, acizi grași polinesaturați, lipide, glucide, acizi
grași, precum și fibre (Grosu și colab., 2019). Polifenolii sunt substanțe cu mare potențial în
contracararea toxinelor datorită proprietăților antioxidante, antim icrobienei, antimutagene și
anti-inflamatorii (Jara -Palacios și colab., 2015).
OMS recomandă atât implicarea autorităților naționale, cât și a consumatorului în
combaterea aflatoxinelor. Autoritățile trebuie să se facă responsabile de punerea la dispoziți e
de teste pentru controlul calității culturilor, promovarea metodelor optime de stocare, punerea
în vigoare a unor reglementari stricte pentru asigurarea unor produse sigure pentru consum și
mai ales informarea și educarea corecta a consumatorului și a pr oducătorului despre aceasta
problemă. Pe de altă parte consumatorul are responsabilitatea achiziționării unor produse
agricole cât mai proaspete și plăcute la vedere, având grijă să fie depozitate și consumate
conform instrucțiunilor. De asemenea, se recom andă o dieta variată, pentru a se minimaliza
expunerea la un aliment contaminat pentru un timp îndelungat
(https://www.who.int/foodsafety/FSDigest_Aflatoxins_EN.pdf ).

Capitolul 2 – Markeri biologici
1. Caracteristici generale
Prin termenul de biomarker se înțelege o modalitate de măsură a unei stări biologice
normale sau patologice în organism. Un biomarker poate fi reprezentat de o moleculă, o
enzimă, o genă, produsul unei gene, un horm on, mai exact orice unitate biologică care poate fi
cuantificată (Huss, 2015).
Biomarkerii sunt o unealtă importantă în descoperirea precoce a unor simptome
caracteristice anumitor boli neurodegenerative, metabolice, cardiovasculare sau oncologice, și
posibilitatea administrării unui tratament timpuriu (Gupta, 2014). Pentru un diagnostic corect,
testele efectuate trebuie să poată fi reproduse, astfel un biomarker sigur, de încredere trebuie
să fie prioritar (Mayeux, 2004).
Biomarkerii sunt folositi pentr u o gamă largă de aplicații precum crearea și testarea
unor noi medicamnte, monitorizarea anumitor boli, în studii clinice și în cercetare, în
domeniul farmaceutic și toxicologic.
Toxicologia este un domeniu vast care studiază efectele unui grup amplu și d ivers de
substanțe toxice, asupra organismelor vii. Aceste substanțe variază de la pesticide,
îngrășăminte, metale, până la micotoxine și droguri. Prezența și efectele acestor compuși
asupra organismului pot fi analizate cu ajutorul biomarkerilor. În toxic ologie, una dintre cele
mai mari probleme ridicate de utilizarea unor biomarkeri metabolici sau biochimici o ridică
diferențele care apar între specii. Din acest motiv este important să se cunoască în detaliu
informații biologice, chimice și ecologice esen țiale legate de subiect (Gupta, 2014).
În domeniul toxicologiei biomarkerii sunt clasificați în trei mari categorii (Santonen și
colab., 2015;Pavanello și Lotti, 2014;Krishna și colab., 2014):
1. Biomarkeri de expunere – sunt utilizați pentru a determina conc entrația unei
substanțe sau a unui metabolit în organul sau țesutul țintă într -o perioadă de timp; se
pot obține informații cu privire la expunerea unui individ la un anumit xenobiotic chiar
dacă acesta nu a intrat în contact direct cu substanță respectivă ; un avantaj pe care îl
prezintă acest tip de biomarker este că poate măsura exact doza internă de expunere;
Ca exemple de biomarkeri de expunere putem menționa: metale grele precum plumbul
sau mercurul în sânge, dar și aducții de ADN sau proteine;
2. Biomarkeri de efect – măsoară efectele cantitative și calitative care apar la nivel
molecular că urmare a expunerii individului la factorul de risc; printre exemple se

numără aberațiile cromozomiale, micronucleii, mutații specifice în gene precum cele
care codifică pentru proteina p53, modificări epigenetice sau scurtări ale telomerilor;
3. Biomarkeri ai susceptibilității – identifică indivizi su sceptibili la compusul
xenobiotic analizat într -o populație; acești biomarkeri pot explica mecanismul prin
care substanța xenobiotică induce modificări la nivel molecular și intensitatea
răspunsului dat de către organism;
Ca exemplu amintim variații genet ice asupra enzimelor metabolice, cu precădere
enzimele din grupul citocrom P450.

Figura 6. Etapele unui proces toxic în organism și categoriile de biomarkeri care pot fi monotorizați de -a
lungul procesului (adaptat după Sogorb și colab., 2014) .

Așa cu m se observă în schema din figura 6, biomarkerii sunt utilizați în scopul
determinării unui diagnostic corect și a constituirii unei scheme de tratament corespunzătoare.
În stabilirea unui tratament bazat pe rezultatele obținute într -un studiu în care s -au utilizat
biomarkeri trebuie să se țină cont de relația doză -efect și de particularitățile biologice și
toxicologice.
Sogorb și colaboratorii (2014) determină următoarele caracteristici ale unui biomarker
ideal:
– Caracter noninvaziv;
– Relevanță – Sensibilitate, specificitate, să fie implicat direct în procesul toxic;
– Posibilitate de prelucrare;
– Posibilitate de analizare;
– Măsurare a unei schimbări reversibile.

Pe lângă aceste lucruri un biomarker trebuie să fie considerat valid. Pentru a fi valid,
se iau în considerare două criterii: validarea și calificarea biomarkerului respectiv (Sogorb și
colab., 2014).
Validarea presupune proce sul prin care se aleg caracteristicile testului și modalitățile
de măsurare a performanțelor sale, în scopul determinării condițiilor în care testul va oferi
date corecte și va putea fi reprodus (Davis și colab., 2013). Calificarea unui biomarker este o
măsura a dovezilor obținute care să suporte folosirea sau scopul biomarkerului. Printre aceste
dovezi se numără evidențierea relației și rolului biomarkerului în procesul biologic și
interpretarea sa în rezultatele clinice. Când un biomarker este declarat va lid se consideră că
acesta îndeplinește ambele criterii menționate mai sus (Krishna și colab., 2014).
Ca în orice proces clinic, utilizarea biomarkerilor poate ridica probleme de
variabilitate înregistrate între indivizi sau grupuri. Problemele pot avea m ai multe cauze: pot
apărea erori de măsurare sau de manevrare precum și posibilitatea contaminării cu alte
substanțe. Trebuie să ia în calcul proprietățile individuale ale biomarkerului și diferitele
caracteristici ale individului: vârstă, sex, dietă etc. (Mayeux, 2004).
În experimentele conduse pe animale se ține cont de cei 3R. Această noțiune a fost
propusă pentru prima dată de Russel și Burch în 1995 și presupune respectarea a trei
parametri (Krishna și colab., 2014):
✔ Reducerea numărului de animale pe care se experimentează prin implementarea unor
strategii care să permită obținerea unui număr mare de informații de la un număr mic
de subiecți;
✔ Rafinamentul tehnicilor utilizate pe animale în scopul minimalizării suferinței
individului;
✔ Înlocui rea studiilor clasice pe animale în favoarea celor in vitro când este posibilă
obținerea rezultatelor similare.
2. Proteinele citocrom P450
Proteinele reunite sub denumirea de citocrom P450 (CYP) reprezintă o superfamilie de
57 de proteine ce conțin gruparea hem. Acestea se găsesc în plante, animale, fungi și bacterii.
În mamifere sunt întâlnite cu precădere în celulele din ficat și intestinul subțire (Manikandan
și Nagini, 2017), iar intracelular se regăsesc în reticulul endoplasmatic (Lehman -McKeeman,
2013). Nomenclatura proteinelor CYP este stabilită de Comitetul de Nomenclatura al
proteinelor CYP. Termenul CYP este urmat de un număr care desemnează familia din care

face parte proteina, iar subfamilia este specificată printr -o literă mare. Aceasta este urma tă de
un alt număr ce reprezintă izoenzimele. Repartizarea în aceeași familie se face pe baza
prezenței unei identități de aminoacizi mai mare de 40%, în timp ce o similaritate a secvenței
de aminoacizi mai mare de 55% plasează proteina în aceeași subfamil ie (Danielson, 2005).
Aceste enzime au rol în detoxifierea substanțelor exogene și biosinteza compușilor endogeni
precum hormoni steroizi, acizi biliari și colesterol (Sansen, și colab., 2007). Proteinele
citocrom P450 au un maxim de absorbție la lungimi d e undă de 450 nm când se află în formă
redusă (fierul din componența hemului se află în formă feroasă -Fe2+) și în prezență de
monoxid de carbon (Manikandan și Nagini, 2017).
Enzimele sunt considerate monooxigenaze, iar reacția de bază catalizată de acestea
poate fi scrisă sub următoarea formă (Lehman -McKeeman, 2013):
Substrat(RH) + O 2 + NADPH + H+ → produs(ROH) + H 2O + NADP+
Cu toate că se cunosc peste 50 de familii care aparțin proteinelor citocrom P450, doar
familiile 1 -4 au repreze ntanți importanți în metabolismul xenobioticelor (Manikandan &
Nagini, 2017). Enzimele din familia CYP2 catalizează reacții de N -demetilare a substratelor
reprezentate de anumite medicamente. Un exemplu este CYP2B6 care acționează asupra
tamoxifenului sau a bupropionului. Un alt reprezentant important al aceste familii este
CYP2E1 care activează substanțe hepatotoxice precum alcoolul, benzenul sau cloroformul și
joacă un rol important în dezvoltarea bolilor hepatice determinate de alcool (Apte și
Krishnamur thy, 2011). Totodată, CYP2A13 catalizează activarea AFB1 la compusul toxic
AFB1 exo -8,9-epoxid în plămânii oamenilor (Deng și colab., 2018). Familia proteinelor
CYP4 datează de acum aproximativ 1,25 miliarde de ani, existând evidențe a unei evoluții
între specii (Lundell, 2002). Un exemplu îl reprezintă enzima CYP4A21 care, la suine,
catalizează hidroxilarea acizilor biliari, având un rol important în biosinteza acestora, suinele
fiind singura specie la care îndeplinește această funcție. În general, enzimel e din familia
CYP4 catalizează hidroxilarea în poziție ω și ω -1 a acizilor grași. La suine enzima CYP4A24
hidroxilează acizii grași de dimensiune medie precum asupra acidului lauric și palmitic. Se
considera că resturile de aminoacizii care determină hidro xilarea acidului lauric sunt Tyr114,
Glu309, Val380 din centrul catalitic activ al enzimei (Lundell, 2002). De asemenea, sinteza
proteinelor CYP4A este asociată cu proliferarea peroxizomilor fiind un răspuns secundar la
menținerea homeostaziei lipidice în ficat (Gibson, 1992). Datorită faptului că reglarea
expresiei genelor din familia CYP4A este modulată de proliferatori ai peroxizomilor, membrii
acestei familii de proteine pot fi biomarkeri pentru anumite xenobiotice (Danielson, 2005).

Unii compușii xenob iotice metabolizați de aceste enzime sunt bioactivați în substanțe
carcinogene. Din această cauză, modificările care apar în expresia genelor care codifică
pentru enzimele citocrom P450 sunt biomarkeri (de efect sau susceptibiliate) urmăriți și
analizați î n diverse studii (Lee și Yang, 2008). Alterarea expresiei genice în celulele hepatice
ale genelor care codifică pentru izoenzimele citocrom P450 pot fi biomarkeri pentru toxicitate
determinată de contaminarea cu aflatoxine (Carvajal -Moreno, 2015).
3. Metaboli smul aflatoxinelor
Procesul de metabolizare al aflatoxinelor pătrunse în organism se desfășoară cu
precădere în ficat. Acesta decurge în două faze distincte. Faza I presupune bioactivarea
aflatoxinelor, etapă ce are la bază transformarea aflatoxinei, cata lizata de diferite enzime
citocrom P450, în produși mai toxici. Faza a II -a reprezintă procesul de detoxifiere. Acesta
este controlat de enzima glutation -S-transferază a căror funcție este de a cupla glutationul
redus cu un substrat hidrofob având un atom de carbon, azot sau sulf electrofil. Astfel,
molecula rezultată va avea o solubilitate mai mare putând fi eliminată mai ușor din celulă.
Totodată, roluri importante în această etapă îl au și enzimele microsomal epoxid reductaza și
alfatoxin -aldehid reducta za (Deng și colab., 2018).
Enzimele citocrom P450 sunt induse prin factori de transcripție. Proteinele din familia
CYP1 sunt modulate de receptorul aril hidrocarbonat (AhR – aryl hydrocarbon receptor) care
este un factor de transcripție dependent de ligand (Guengerich, 2013). Alți factori care induc
transcrierea genelor care codifică pentru diferite proteine citocrom P450 sunt: receptorul
constitutiv andragon (CAR – constitutiv andragon receptor) pentru subfamilia CYP2B,
receptorul pregnan X (PXR – pregnane X receptor) pentru subfamilia CYP3A și receptorul
activat de proliferare peroxizomică α (PPAR -α- peroxisome proliferator -activated receptor α)
pentru subfamilia CYP4A (Guengerich, 2013).
AhR poate fi activat de diverși compuși endogeni, dar și exogeni cu structuri și
proprietăți fizico -chimice diferite. Printre liganzii pentru AhR amintim PAH, hidrocarburi
aromatice halogenate (HAH), unele medicamente, cafeina, aflatoxina B1 , eicosanoidele.
(Manikandan și Nagini, 2017). Toti liganzi cu afinitatea mare pentru AhR descoperiți până în
prezent au structuri plane (Mary și colab., 2015).
Acest factor de transcripție face parte din familia basic -helix -loop-helix (bHLH) /Per –
ARNT -Sim(PAS). Este locali zat în citosol, unde se găsește în complex cu mai multe proteine
chaperon e. Acestea sunt: două proteine HSP 90 (HSP – heat shock protein ) cu masă

moleculară de 90 kDa, o proteină p23 și o proteină AIP ( AhR interacting protein ), numită și
proteina 2 asociat ă virusului hepatitei B (XAP2) . În momentul activării acestuia de către
ligand, proteinele chaperone se desprind, iar AhR este translocat în nucleu unde dimerizează
cu translocatorul nuclear AhR(ARNT – AhR nuclear translocator ). Complexul nou format are
o afinitate mare pentru ADN (Kawajiri și Fujii -Kuriyama, 2017), leagându -se la un enhancer
sensibil la dioxină (DRE – dioxin -responsive enhancer ) și inducând transcripția genelor din
familia CYP1 (Danielson, 2005). Schema acestui mecanism este reprezentată î n figura 7 .
Studii recente au demonstrat că AhR joacă un rol reglator important în diverse procese
imune, de homeostazie și dezvoltare normală a organismului (proliferare, adeziune celulara,
diferențierea celulelor). AhR conectează semnale din mediul exter n cu procesele celulare care
decurg în organism (Kawajiri și Fujii -Kuriyama, 2017).
Conform lui Bonati și colab., 2017, calea de semnalizare a receptorului Ah poate fi
împărțita în trei etape:
1. Legarea ligandului care determină activarea proteinei;
2. Transl ocarea formei activate transcripțional în nucleu și cuplarea cu ARNT;
3. Legarea complexului ligand:AhR:ARNT la ADN.
AhR prezintă mai multe domenii funcționale distincte: un domeniu b ( basic ) prin care
se atașează la ADN, un domeniu helix -loop-helix care asigură interacția cu alte proteine și
domeniile PSA -A și PSA -B care facilitează legarea la alte proteine care dețin domenii
asemănătoare precum ARNT. De asemenea, domeniul PSA -B constituie domeniul de legare
al ligandului (LBD) (Schulte și colab., 2 017).
Un inhibitor al AhR este factorul de transcripție AHRR (AhR repressor) a cărei
expresie este activată de AhR. În acest mod se stabileste o bucla de feed-back negativ. Acest
factor nou sintetizat este translocat în nucleu unde se cuplează cu ARNT, iar cele două
molecule ale dimerului format funcționează ca și corepresori ai genei țintă inhibând expresia
acesteia. Situl de legare este elementul receptiv xenobiotic (XRE – xenobiotic responsive
element ) (Kawajiri și Fujii -Kuriyama, 2017).

Figura 7. Reglarea transcripției genice a genelor cyp1a de către factorul de transcripție AhR (adaptat după
Lamas și colab., 2018).

a. Biotransformarea aflatoxinei B1
Proteinele citocrom P450 sunt principalele enzime implicate în metabolizarea
xenobioticelo r. S-a demonstrat că există mai multe enzime din această familie cu rol în
metabolizarea aflatoxinelor. Dintre acestea, în ficat, cele mai active sunt CYP1A2 și
CYP3A4, în funcție de diferite concentrații ale aflatoxinei. Astfel CYP1A2 funcționează la
conc entrații mici ale toxinei, în timp ce CYP3A4 acționează la concentrații ridicate. Acest
fapt se datorează kineticii diferite după care funcționeze enzimele. CYP1A2 urmărește o
kinetică de tipul Michaelis -Menten, iar CYP3A4 o kinetică de tip Hill (Deng și c olab., 2018).
După efectuarea diferitelor studii s -a arătat că la oameni și animale, concentrația de aflatoxine
care ajunge în ficat rămâne scăzută, indiferent de gradul de expunere la care este supus
individul. Din aceasta cauză, principala enzimă care es te responsabilă de metabolizarea
aflatoxinelor în ficat este CYP1A2 (Mary și colab., 2015).

Aflatoxina B1(AFB1) este substrat pentru enzimele citocrom P450 putând parcurge
diferite transformări. Hidroxilarea AFB1 are loc la C4 sau C22 din structura toxi nei. În urma
acestei reacții se formează compușii AFM1 sau AFQ1 (Deng și colab., 2018). AFM1 este
mult mai puțin mutagen comparativ cu AFB1, deoarece nu reprezintă substrat pentru reacții
de epoxidare și este considerat mai degrabă un produs de detoxifiere (Marchese și colab.,
2018). Hidratarea legăturii duble dintre atomii C2 -C3 duce la apariția compusului semiacetat
AFB2a. Demetilarea creează compusul relativ nontoxic AFP1, iar epoxidarea legăturii duble
C2-C3 formează cel mai reactiv metabolit al aflato xinei B1, AFB1 -8,9-epoxid. În citoplasmă
AFB1 este ketoredusă la aflatoxicol, un compus de asemenea, toxic (Deng și colab., 2018;
Dhanasekaran și colab., 2011). În plus, acest compus poate fi reconvertit enzimatic în AFB1,
ducând la extindere efectelor tox ice ale AFB1 (Rushing și Selim, 2019). Transformările
aflatoxinei B1 sunt prezente în figura 8 .

Figura 8 Biotransformarea aflatoxinei B1 mediată de enzimele citocrom P450 în timpul fazei I a
procesul de metabolizare al xenobioticelor.

Au fost identific ați doi stereoizomeri ai AFB1 -8,9-epoxid: AFB1 exo -8,9-epoxid
(AFBO) și AFB1 endo -8,9-epoxid și conjugatele lor corespunzătoare cu glutationul redus. În
urma studiilor s -a ajuns la concluzia că stereoizomerul AFB1 exo -epoxid are un potențial
mutagen mult m ai ridicat și se leagă mai eficient la ADN față de stereoizomerul endo -epoxid
(Stewart și colab., 1996). În urma unui studiu realizat pe genele umane CYP1A2 și CYP3A4
exprimate în Escherichia coli , și utilizate apoi într -un sistem de oxidare reconstituit, s-a
observat faptul că izoenzima CYP1A2 formează atât forma exo – cât și pe cea endo -epoxid,
fiind mai puțin eficientă decât CYP3A4, întrucât acesta formează doar AFB1 exo -epoxid care
este forma biologic activă (Ueng și colab., 1995), deși la concentrații m ici CYP1A2 produce o
cantitate mai mare de AFB1 exo -epoxid decât CYP3A4 (Rushing și Selim, 2019). AFBO,
fiind un compus foarte reactiv, poate interveni în mai multe procese. Pot apărea hidrolize
nonenzimatice din care să rezulte AFB1 -8,9-dihidrodiol (Wacoo și colab., 2014).
Rearanjamentul bazelor transformă acest compus aflatoxin -dialdehidă (Guengerich, 2008).
Acest compus se poate lega covalent la albumina serică din circulație, formând aducți de
lizină. Albumina serică reprezintă cea mai întâlnita protein ă din serul mamiferelor și are rol de
a transporta diferite proteine și hormoni prin plasmă. Analize ale nivelului aducțiilor formați
în ser sunt folosite pentru a identifica posibile cazuri de carcinom hepatocelular. S -a observat
o corelație între expuner ea la AFB1 din hrană și aducții AF -lizină formați în ser. Aducții AF –
lizină au un timp de înjumătățire mai lung în sânge (2 -3luni), spre deosebire de aducții AF –
ADN (2 -3 zile) (Li și colab., 2019).
O altă cale pe care o poate urma AFBO este legarea coval entă la regiunile nucleofile
din ADN sau ARN, fiind un compus puternic electrofil. Acest eveniment provoacă
citotoxicitate acută sau cronică. Pot apărea mutații la nivelul ADN care pot conduce la
dezvoltarea tumorilor. Fiind un compus instabil, AFBO are af initate de legare mare pentru
guanina din ADN, formând aflatoxină -N7-guanină. S -a dovedit prin studii că aflatoxină -N7-
guanină este capabil de a crea mutații transversii purină (guanină) – pirimidină (timină) în
ADN (Fedeles și Essigmann , 2018), afectând gena proteinei supresor p53 care intervine în
reglarea ciclului celular. S -a observat că este predominant afectată o parte a genei care
codifică pentru zona de legarea a ADN în centrul catalitic activ al proteinei p53. Compusul
determină transversia guaninei în timină în poziția a 3 -a codonului 249 (Bbosa și colab.,
2013;Carvajal -Moreno, 2015). Astfel codonul 249 se transformă din AGG(Arg) în AGT(Ser)
(Wacoo și colab., 2014).

b. Detoxifierea aflatoxinei B1
În faza a II -a proceselor metabolice compușii rezultați în prima fază sunt conjugați cu
molecule polare endogene pentru a le crește solubilitatea și a facilita procesul de eliminare a
acestora. Schema acestei etape este reprezentă în figura 9 . În această etapă, AFBO poate fi
conjugat cu glut ationul (GSH), reacție ce este catalizată de glutation S – transferaza (Roze și
colab., 2013).
Glutation -S-transferazele sunt un grup de enzime citosolice și microsomale care
catalizează conjugarea glutationului redus cu compuși electrofili. Această reacți e deschide
calea acidului mercapturic care conduce la eliminarea mai multor substanțe xenobiotice
(Stewart și colab., 1996). GHS este un antioxidant care protejează celula de speciile reactive
de oxigen.
În procesul de detoxifiere, glutation – S- transferaz a joacă un rol important în prevenția
legării AFBO la ADN sau diverse proteine din celulă. Enzima catalizează o reacție care
conjugă AFBO cu glutationul, în urma reacției rezultând conjugatul aflatoxin -glutation. AF –
mercapturat. Produsul rezultat este tra nsportat în afara celulei cu ajutorul unei proteine ATP –
dependentă multidrug -resistance . Glutation -S-transferaza acționează ca un antioxidant și are
multe roluri în menținerea funcționalității și structurii membranei, precum și în reducerea
factorilor ce provoacă stresul oxidativ și a speciilor reactive de oxigen (Bbosa și colab., 2013).
AF-aldehidă este transformată de aflatoxin -aldehid reductaza în aflatoxin -dialcol, care
este excretat prin urină (Peles și colab., 2019). După mai multe transformări su ferite acesta
este eliminat prin urină sub formă aflatoxin -glucuronidă (Wacoo și colab., 2014).

Figura 9. Formarea aducțiilor aflatoxină -ADN și aflatoxină -lizină. Detoxifierea compușilor aflatoxina B1 exo –
8,9-epoxid catalizată de glutation -S-transferaza (GST) și a aflatoxină -dialdehidă catalizată de aflatoxin -aldehid
reductaza(AFAR) (adaptat după Phillips și colab., 2019).

Din studii realizate pe pasările domestice a reieșit faptul că curcanii sunt cei mai
sensibili la contaminarea cu AFB1, în timp ce găinile sunt relativ rezistente la această toxină,
iar prepelițele sunt considerate intermediar rezistente. Se bănuiește că s ensibilitatea curcanilor
la AFB1 își are originea în eficiența ridicată a procesului de bioactivare a toxinei de către
enzimele citocrom P450 din ficat și disfuncționalitatea clasei de glutation -S-transferaze care
este incapabilă să conjuge AFBO pentru a fi eliminat din organism (Monson și colab., 2014).
Un studiu realizat în 1995, a urmărit hrănirea unui eșantion de curcani și găini cu o dietă
conținând 400mg/kg AFB1. Rezultatele au arătat că la curcani a fost înregistrată o scădere a
ritmului de creștere , spre deosebire de găini care nu au prezentat niciun efect advers la aceasta
dietă (Sumit și colab., 2010).

Capitolul 3 – Materiale și metode
În contextul costurilor date de furajul utilizat în procesul de creștere al porcilor și de
înțelegere a un or modalități de diminuarea și eliminare a efectelor negative date de micotoxinele
prezente în furajul destinat hrănirii animalelor, scopul studiului a fost urmărirea combaterii
efectelor toxice determinate de aflatoxina B1 la suine, utilizând semințe de s truguri ca aditiv
furajer, prin estimarea expresiei genice a genelor cyp1a2 și cyp4a24.
1. Design experimental
Experimentul a fost realizat in vivo pe un număr de 16 purcei, ce au fost distribuiți în 4
loturi a câte 4 indivizi. Aditivul furajer folosit a fost reprezentat semințele de struguri, iar ca
micotoxină s -a folosit aflatoxina B1 (AFB1).
Loturile de purcei au fost denumite: lot control (purcei hrăniți cu furaj control); lot
experimental E1 (purcei hrăniți cu furaj control + semințe struguri ), lot experi mental E2 (purcei
hrăniți cu furaj control +AFB1 ) și lot experimental E3 (purcei hrăniți cu furaj control + semințe
struguri +AFB1 ).
După 30 de zile de la hrănirea purceilor cu rețeta furajeră corespunzătoare, aceștia au
fost sacrificați în condiții sanita re corespunzătoare și respectând normele de etică aflate în
vigoare, în cadrul IBNA Balotești, România.
2. Recoltare probe ficat de la suine
După sacrificare s -au recoltat probe de ficat pentru determinările de biologie
moleculară, mai exact fragmente mici din mijlocul lobului drept, și cât mai departe de zona
periportală. Imediat după recoltare, fragmentele au fost imersate în câte 2 mL soluți e
stabilizatoare RNA later (Qiagen).
3. Izolare ARN din probe
Cu ajutorul RNeasy Mini Kit (Qiagen) s-a realizat purificarea ARN total din cantități
mici de țesut. Tehnologia combină rigurozitatea lizei cu guanidin izotiocianat cu viteza și
capacitatea de ret enție a membranei de silica.
Prin intermediul RNeasy Kit se poate purifica ARN total pornind de la o cantitate de
probă în intervalul de 0,5 -30 g grame de țesut animal. Probele sunt întâi lizate, iar apoi
omogenizate. Pentru stabilizarea probelor este adău gat etanol. Proba este apoi încărcată în
coloane ce conțin o membrană de silica. ARN se leagă de membrană, iar contaminații sunt
eluați.

Ribonucleazele sunt enzime foarte stabile și active. Deoarece acestea sunt greu de inactivat și
pot produce degradarea ARN într -un timp foarte scurt, în laborator se decontaminează
obiectele care urmează a fi folosite cu RNaseZAP. De asemenea, se folosesc mănuși pentru a
nu contamina probele cu RNaze aflate pe suprafața pielii. Mănușile se schimbă frecvent,
utilizând -se RNaseZAP pentru spălare pe mâini după fiecare acțiune în afara hotei. Alicoturile
cu probe și ARN purificat se mențin constant pe gheață.
În această etapă s -au folosit următoarele tipuri de tampon:
Buffer RLT – tampon pentru lizarea țesutului înaintea izo lării ARN (conține o concentrație
mare de guanidin izotiocianat ce permite legarea ARN la sferele de silice din coloană).
Buffer RW1 – tampon ce contine o sare de guanidina și etanol; folosit ca un tampon de
spălare pentru eluția unor biomolecule precum gl ucide, proteine, lipide etc, care nu se leagă
specific de membrana de silica, în același timp moleculele de ARN > 200 pb rămân legate de
coloană.
Buffer RDD – tampon ce conține săruri utile pentru digestia ADN din coloană și asigură
păstrarea ARN legat de membrana de silica.
Buffer RPE – tampon de spălare ușoară, ce are funcția de a elimina resturile de săruri rămase
în coloană datorită tamponului folosit anterior.
ARN purificat este stocat la temperaturi de -80șC , în apa RNAse -free, unde se poate
păstra intact timp de 1 an.
Purificarea ARN din țesut – mod de lucru:
● În tampon RLT este adăugat 2 -mercaptoetanol/ ditiotreitol(DTT);
● Se adaugă 4 volume de etanol în tampon RPE.
Pentru probe de țesut nu se folosește o cantitate mai mare de 30 mg.
– Se adaugă tampon RLT pentru degra darea țesutului; se omogenizează puternic pentru
liză; centrifugare 3 minute la viteză maximă de 10000g; precipitatul se utilizează în
pasul următor;
– Se adaugă etanol 70% și se omogenizează bine prin pipetare; proba nu se
centrifughează;

– Se transfera 700 µL într -o coloana RNeasy Mini spin ce a fost în prealabil montată
într-un tub de colectare de 2 ml; centrifugare 15 s la >8000g; se aruncă soluția care a
trecut prin coloană;
– Digestie cu deoxiribonuclează (pas opțional):
● Se adaugă tampon RW1 peste coloana RNeasy; se centrifughează 14 s
la >8000 g; se aruncă lichidul eluat prin coloană;
● Se adaugă DNaze I din soluția stoc în tamponul RDD; se mixează ușor;
centrifugare scurtă;
● Mixul de incubare DNaze I se adugă direct în coloana RNeasy; se
incubează la temper atura camerei pentru 15 minute;
● Se adaugă tampon RW1 peste coloana și se centrifughează 15 s la
>8000g; se aruncă volumul de lichid eluat prin coloană.
– Se adaugă tampon RPE în coloană; se centrifughează 15 s la >8000g; se aruncă
volumul de lichid eluat prin coloană;
– Se repeta pasul anterior;
– Se transferă coloana RNeasy într -un tub nou de 1,5 ml; se adaugă apă RNaze -free în
coloană; se centrifughează 1 minut la >8000g pentru eluția ARN;
– Se repetă pasul anterior.
Curățare ARN de impurități:
– Se adaugă 4 volume de etanol (96 -100%) în tamponul RPE;
– Proba se aduce la un volum de 100 µL cu apă RNase -free; se adaugă tampon RLT și
se omogenizează bine;
– Se adaugă etanol (96 -100%) în ARN diluat și se amestecă cu ajutorul pipetei; nu se
centrifughează;
– Se transferă 700 µL într -o coloană RNeasy plasată într -un tub de 2 mL; se
centrifughează 15 s la >8000 g; se aruncă volumul de lichid eluat prin coloană;
– Se adaugă tampon RPE; se centrifughează 15s la >8000g; se aruncă volumul de lichid
eluat prin coloană;
– Se repetă cu centrifugare 2 minute ;

– Se transferă coloana într -un nou tub de colectare de 2 ml și se centrifughează 1 minut;
– Se transferă coloana într -un tub de colectare de 1.5 ml; se adaugă apă RNase -free; se
centrifughează 1 minut; >8000g pentru eluția ARN.
Ulterior extractiei se determina concentrația și puritatea ARN obținut la spectofotometru
NANODROP 8000 (Thermo).
4. Evaluarea integrit ății ARN extras
RIN (RNA Integrity Number) este un parametru adimensional care oferă informații
despre gradul de fragmentare al moleculei. Valoarea RIN este rezultatul raportului dintre
peak -ul de 28S și cel de 18S. Valorile se înscriu în intervalul 1 -10, 10 reprezentând o
integritate excepțională (Mueller și colab., 2016).
Toți reactivii și mixul de reacție se păstrează la temperatura de 4șC. Aceștia trebuie
lăsați la temperatura camerei 30 minute înainte de utilizare. Coloranții și mixurile de coloranți
trebuie protejați de expunerea la lumina (aceștia se descompun în prezența luminii ceea ce
scade intensitatea semnalului). Vârful pipetei se introduce până în fundul godeului din chip;
pipetând pe pereții godeului poate conduce la rezultate invalide. Se fo losesc măsuri de
precauție sporite când se manevrează ARN (electrozii se decontaminează cu soluție
RNaseZAP).
Prepararea reactivilor de lucru:
● Colorantul se mixează întotdeauna înainte de folosire. Chip -ul trebuie încărcat în cel
mult 5 minute pentru a e vita evaporarea reactivilor (volume mici) ceea ce poate
conduce la rezultate invalide.
● Prepararea ARN ladder (la începerea unui nou kit): acesta se încălzește 2 minute la
70 °C pentru denaturare și se răcește imediat pe gheață; se alicoteaza și se stochea ză
la -70 °C.
● Prepararea mixului gel -colorant : după ce reactivii au fost ținuți 30 minute la
temperatura camerei, fiind protejați de lumină în acest timp, se vortexează soluția de
colorare concentrată RNA 6000 Nano dye (albastru) 10 secunde. Se adaugă 1 μ l din
această soluție la alicoturile de 65 μl de gel filtrate; se vortexează puternic. Gelul
obținut se păstrează la întuneric. Tubul se centrifughează 10 minute la 14000 rpm.
Urmeaza etapa de incărcare a mixului gel -colorant în ARN Nano chip : astfel, se
plasează chip -ul în stația de primare. Aceste două dispozitive sunt reprezentate în figura 10 .

Stația de primare permite aplicarea unei presiuni corespunzătoare asupra gelului pentru al
distribui uniform pe toate canalele chipului. Se pipetează 9 μL din mix ul preparat anterior în
godeul G. Timer -ul se setează la 30 de minute și se verifică pistonul să fie poziționat la 1 mL,
apoi se închide stația de primare. Se apasă pistonul seringii aplicând o forța constanta până
când acesta este ținut de clip. Se așteap tă exact 30 de secunde și apoi, cu ajutorul
mecanismului de eliberare, se eliberează pistonul. Se așteaptă 5 secunde, după care se ridică
pistonul până în poziția de 1 mL, se deschide stația de primare. Se piperează 9 μL din mixul
gel-colorant în fiecare d in godeurile marcate cu G.
Încărcarea marker -ului ARN 6000 Nano Marker : se pipetează 5 μL din ARN 6000
Nano Marker în godeul marcat cu o scăriță (Figura 10) și în toate celelalte 12 godeuri.
Încărcare ladder : înainte de utilizare alicoturile se păstreaz ă pe gheață. Se încarcă 1 μL
în godeul corespunzător.
Încărcarea probelor : înainte de încărcarea în chip probele se denaturează prin încălzire 2
minute la 70 °C pentru a evita apariția structurilor secundare. Se pipetează 1 μL în cele 12
godeuri destinate probelor.
Chip -ul se plasează orizontal în adaptorul vortexului și se vortexează 1 minut la 2400 rpm.
Chip -ul este plasat în bioanalizorul Agilent 2100 în vederea obținerii valorilor RIN.
După citirea rezultatelor, chip -ul folosit este îndepărtat și se r ealizeaza decontaminarea
electrozilor cu apă Rnase -free.
Valorile RIN obținute sunt cu o valoare mai mare decât 7 se supun protocolului de revers –
transcriere și ulterior celui de Real -Time PCR.

Figura 10. Chip și stație de primare oferite de Agilent. (sursă: www.agilent.com )

5. Reacția de revers -transcriere
ARN total extras anterior este convertit în ADN complementar prin reacția de revers –
transcriere. Pentru aceasta etapa s -a folosit iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Kit-ul iScript
oferă trei tuburi care conțin toți reactivii necesari reactiei de revers -transcriere. Acestea sunt:
mixul de reacție iScript, iScript reverstranscriptaza, apă nuclease -free. Kit -ul se pă strează la –
20 °C.
iScript prezintă o reverstranscriptază modificată și optimizată pentru sinteza de ADN
complementar (ADNc) dintr -o varietate mare de ARN. Enzima este incubată cu un inhibitor
de RNaze. Acest amestec este optim pentru ținte < 1kb în lungi me.
Probele de ARN prelucrate sunt păstrate pe gheață toată durata procedurii.
Se realizează mixul de reactive:
– Apă nuclease -free;
– 5x iScript Reaction mix ;
– iScript reverstranscriptază;
– proba de ARN.
Se vortexează și se centrifughează scurt (spin).
Pe ap aratul de PCR probele se rulează în felul următor:
● 5 minute la 25°C – pentru activarea enzimei;
● 20 minute la 46°C – enzima este activ ă;
● 1 minut la 95 °C – denaturarea structurilor secundare ale ARN monocatenar (ARNmc)
și denaturarea hibrizilor ARN -ADN;
● Opțional: păstrare la 4°C – pentru stabilizare.
Concentrația și puritatea probelor de ADNc obținute au fost determinate utilizând
spectofotometrul NanoDrop 8000 (Thermo).
6. Reacție PCR în gradient de temperatură pentru optimizarea
temperaturii de hibridizare p rimeri
Temperatura de hibridizare a primerilor se optimizează printr -o reacție de PCR în
gradient de temperatură, prin care aceeași probă de ADNc este amplificată prin PCR la 8
temperaturi diferite de anelare a primerilor cuprinse între 49 – 65°C. Ulterior , se realizează

electroforeza în gel de agaroză a produșilor de amplificare obținuți pentru alegerea temperaturii
optime de anelare a primerilor, respectiv temperatura la care s -a obținut o amplificare specifică,
respectiv o singură bandă electroforetică c orespunzătoare dimensiunii specifice pentru
fragmentul obținut (Georgescu și Costache, 2009).
Primerii utilizați în acest studiu au fost desemnați pe bază de complementaritate cu
secvențe de ARN mesager specifice de la Sus scrofa utilizând baza de date GenBank .
Secvențele lor se regăsesc în tabelul 1 .
Tabel 1 : Denumirea, secvențele specifice pentru perech ile de primeri utilizati în acest studiu (F – primer
forward; R – primer reverse) și lungimea teoretică în perechi de baze (pb) a ampliconilor rezultați în urma
reacției PCR în gradient de temperatură.

Denumire primer Secvență primer Lungime amplicon
TBP F: GATGGACGTTCGGTTTAGG
R: AGCAGCACAGTACGAGCAA 124 pb

RPL4 F: CAAGAGTAACTACAACCTTC
R: GAACTCTACGATGAATCTTC 122 pb

B2M F: CCGCCCCAGATTGAAATTGA
R: GCTTATCGAGAGTCACGTGC 172 pb

CYP1A2 F: CTCTTCCGACACACCTCCTT
R: AATCTCTCTGGCCGGAACTC 173 pb

CYP4A24 F: CTCTATCCGCCAGTACCAGG
R: ATGGGTCAAACTCCTCTGGG 157 pb

Reactivi necesari
– Proba de ADN;
– Reactivi PCR:
● Amestec dNTP;
● MgC l2;

● Tampon 5x;
● ADN polimeraza: Taq polimeraza;
● Apă Nuclease -free;
● Primer Forward;
● Primer Reverse.
Mod de lucru:
– Se pipetează ADN matriță în tuburi pentru reacția PCR;
– Se realizează separat mixul pentru PCR în care se adaugă toți reactivii PCR vortexați
înainte de utilizare (cu excepția polimerazei care nu se vortexează);
– Se pipetează mixul obținut peste ADN;
– Se vortexează și se centrifughează ușor;
– Tuburile se așază în aparat PCR și se setează următorul program:
i. 3 minute la 95 °C – hot start – 1 ciclu;
ii. 30 secunde la 95°C. – denaturare;
iii. 30 secunde la 50 -60 °C. –hibridizare;
iv. 1 minut la 7 2°C. – extindere;
v. 5 minute la 72 °C. – extensie finală;
vi. Menținere la 4 °C.
Etapele 2 -4 se repetă timp de 35 de cicluri.
7. Electroforeza ADN în gel de agaroză
Prin electroforeză se separă moleculele de ADN în funcție de masa lor moleculară. Se
aplică un cure nt electric continuu, iar ADN reprezentat de fragmentele de PCR vor migra
către catod datorită grupărilor fosfat prezente în structura moleculei.
Prepararea gelului: se dizolvă agaroză în tamponul de elctroforeză TAE 1x prin încălzire
până la fierbere. Se adaugă bromură de etidiu și se omogenizează în soluția de agaroză. Se
toarnă soluția în tăvița de gel, se adaugă un pieptene și se lasă la solidificat.

Încărcarea probelor: gelul se scufundă în tancul de electroforeză în tampon TAE 1x. Se
încarcă markerul de masă moleculară. Probele se amestecă cu tamponul de încărcare (tampon
ce contine albastru de brom fenol) și se încarcă în gel.
Vizualizare rezultate: gelul este scos din tampon și expus la UV într -un transiluminator.
Benzile pot fi vizualizate datorită bromurii de etidiu incorporate în gel, care absoarbe în UV și
emite în spectrul VIS.
În urma analizei gelurilor de agaroză după etapa de migrare a ampliconilor selectați s -a ales
ca temperatură optimă de hibridizare a primerilor, temperatura de 58 0C.
8. Evaluarea expresiei genice prin Real -Time PCR
Tehnica Real -Time PCR realizează conconitent amplificarea și cuantificarea acumulării
unei secvențe de ADN țintă. Acest lucru este posibil prin utilizarea unor molecule
fluorescente cu ajutorul cărora concentra ția ampliconilor este corelată cu intesitatea
semnalului luminos. Coloranții fluorescenți intercalanți, de tipul SYBR Green , au proprietatea
de a menține un nivel scăzut de fluorescență când sunt liberi în soluție, însă odată
întrepătrunși la nivelul unei duble catene ADN, datorită unor modificări structurale,
intensitatea fluorescenței lor crește de până la 200 de ori. Astfel odată cu creșterea numărului
de ampliconi formați va crește și intensitatea semnalului luminos (Georgescu și colab., 2016).
Experim entul s -a realizat folosind kitul iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Mixul
conține toate elementele unei reacții PCR normale, mai puțin primerii și ADN matrița.
Compusul fluorescent intercalant este SYBR Green. Mixul trebuie ferit de expunerea la
lumină pe perioada utilizării.
Se combină ADNc obținut în urma reverstranscrierii, iQ SYBR Green Supermix, primer
forward, primer reverse ( Tabel 1 ) și apa nuclease -free. Amestecul este încărcat în plăci cu 96
de godeuri. Placa este sigilată cu folie transparentă și se așază pe termoblocul sistemului de
detecție iCycler v 3.1 Multicolor Real -Time PCR (Bio -Rad) . Programul după care a fost
ralizată reacția de amplificare este următorul:
● 1 ciclu de 5 minute la 95 °C;
● 45 de cicluri:
o 30 secunde la 95°C;
o 30 secunde la 55/56 °C;
o 45 secunde la 72°C.

● 85 cicluri cu 55°C cu o creștere a temperaturii de 0,5°C/ ciclu pentru 10 secunde.
9. Prelucrarea datelor și analiza statistică
După terminarea reacției de Real -Time PCR valorile Ct obținute pe ntru fiecare individ au
fost prelucrate cu ajutorul programului Excel conform metodei 2 -ΔΔCt (Livak și Schmittgen,
2001) astfel:
● s-a calculat valoarea medie Ct a genelor de referință (TBP, RPL4 și B2M);
● toate valorile Ct obținute pentru genele de interes a u fost normalizate la valorile Ct
obținute pentru genele de referință;
● s-a calculat valoarea medie a Ct -urilor normalizate obținute pentru indivizii din lotul
control;
● s-a determinat diferența dintre valoarea Ct a indivizilor supuși la diferite rețete fura jere
și valoarea pentru grupul control;
● s-a realizat media triplicatelor ( average ) obținute pentru fiecare individ în parte
conform pasului anterior și a mediilor valorilor tuturor indivizilor din cadrul unui lot
experimental, respectiv deviația standard ( stdev );
● s-au reprezentat grafic rezultatele obținute (medie și deviație standard);
● pentru evidențierea semnificației statistice s -a realizat testul Student T – test, iar
semnificația statistică a fost interpretată în funcție de valoarea p, astfel: NS – P > 0,05;
*- P ≤ 0,05.

Capitolul 4 – Rezultate și discuții
În ultimii ani, domeniul științific și tehnologic au cunoscut un adevărat progres, odată
cu o mai bună înțelegere a mecanismelor moleculare care stau la baza proceselor biologice, au
crescut eforturile de a combate intoxicațiile cu micotoxine. Totuși, cum contaminarea culturilor
agricole cu fungi din genul Aspergillus este un proces natural, focare de aflatoxicoză continuă
să apară, ridicând adevărate probleme de sănătate pentru animalele domestice și ducând la
pierderi economice importante. Pentru eradica rea efectelor nocive ale aflatoxinelor în
organismul animalelor s -a recurs la diferite metode de contracarare printre care utilizarea
probioticelor sau prebioticelor ca factori de mitigație (Tăranu, și colab., 2019). Scopul studiului
de față este de a eval ua in vivo potențialul unei strategii nutriționale, care utilizează semințe de
struguri ca agenți de combatere a efectele nocive ale aflatoxinei B1 în ficatul suinelor prin
urmărirea expresiei genice a genelor cyp1a2 și cyp4a24 . La momentul actual nu se cu nosc studii
in vivo sau in vitro care să evalueze efectele aflatoxinei B1 (AFB1) asupra expresiei genice a
genei cyp4a24 la suine și posibilele capacități de neutralizare ale acestor efecte de către
semințele de struguri.
În urma etapei de extracție ARN t otal și a evaluării integrității acestuia, valorile obținute
de concentrație și integritate ( Tabel 2 ) au permis continuarea cu etapa de revers -transcriere și
obținere ADN complementar, necesar etapelor următoare pentru evaluarea expresiei genice a
țintelor de interes. Pentru proba numărul 13, din cauza unei valori RIN destul de mici, respectiv
6.6, extracția a fost repetată, obținându -se la a doua extracție o valoarea RIN de 7.1.

Tabel 2 . Concentrația ARN (ng /uL) extras și valorile RIN corespunzătoare.

Grup Individ Conc . ARN (ng
/uL) RIN
Control 1 639 7.4
2 1398 8.2
3 1465 7.7
4 2625 7.9
E1 5 1840 7.2
6 1625 7.6
7 2960 7.6
8 2461 7.8
E2 9 946 7.6
10 1022 7.6
11 1464 7.4
12 1538 7.2
E3 13 1038 6.6
14 1442 8.2
15 1930 7.6
16 2498 7.8

După etapa de revers -transcriere, s -a realizat o reacție PCR în gradient de temperatură
pentru determinarea temperaturii optime de hibridizare a primerilor. Ampliconii rezultați au
fost supuși electroforezei în gel de agaroză, etapă din care s -a concluzion at că temperatură
optimă de hibridizare a primerilor este de 58șC.

Expresia genei cyp1a2 pentru probele de ficat obținute, nu prezintă o modificare
semnificativă în niciunul dintre cele trei loturi experimentale (E1, E2 sau E3) față de grupul
control ( p > 0,05). Valorile 2- ΔΔ CT obținute indică o scădere in expresia genică a cyp1a2 pentru
toate grupurile experimentale in comparație cu grupul control. Dieta in care au fost introduse
doar semințe de struguri (E1) a înregistrat cea mai mică scădere a expresie i genei cyp1a2 față
de grupul control, in timp ce dieta constituită din semințe de strugure + AFB1 (E3) arată o
scădere la jumătate a expresiei genice a genei cyp1a2 față de grupul control. Aceste date sunt
reprezentate grafic în figura 11 .

Figura 11 Reprezentarea valorilor 2- ΔΔ CT pentru nivelul de expresie genica pentru gena cyp1a2 în ficat de la
purcei ce au fost hrăniți cu diferite rețete furajere . Valorile din grafice sunt reprezentate ca media aritmetică ±
deviația standard ( standard d eviation – SD) pentru patru animale /eșantion. Semnificația statistică a diferenței în
expresie a genelor a fost realizată cu testul Student (T Test) (NS p ≥ 0,05; *p ≤ 0,05). Cele patru eșantioane folosite
sunt: Control – hrănit cu furaj control; E1 repre zentat de grupul hrănit cu furaj control + semințe de strugure; E2
reprezentat de grupul hrănit cu furaj control + aflatoxina B1; E3 reprezentat de grupul hrănit cu furaj control +
semințe de strugure + aflatoxina B1.

O diferență semnificativă din punct de vedere statistic s -a înregistrat pentru gena
cyp4a24 în cazul grupului experimental cu o dietă ce conține doar aflatoxina B1 (E2) față de
grupul control ( p ≤ 0,05). În acest caz se observă o creștere semnificativă a e xpresiei genei
cyp4a24 . Pentru această genă nu s -au înregistrat însă, diferențe semnificative de expresie în
grupul hrănit doar cu semințe de strugure (E1) sau cel în care semințele de strugure au fost
amestecate cu cantități de aflatoxina B1 (E3) față de grupul control ( p > 0,05). Valorile 2- ΔΔ CT
indică o scăderea in expresia genică a genei cyp4a24 pentru grupurile care au avut o dietă bazată
pe semințe de strugure (E1) sau o dietă cu semințe de strugure + AFB1(E3) față de grupul
control. Grupul experim ental hrănit cu o dietă cu semințe de strugure (E1) prezintă cea mai

scăzută expresie genică a genei cyp4a24 dintre toate cele trei loturi experimentale comparativ
cu grupul control. Aceste date sunt reprezentate grafic în figura 12 .

Figura 12 Reprezenta rea valorilor 2- ΔΔ CT pentru nivelul de expresie genică pentru gena cyp4a24 în ficat de la
purcei ce au fost hrăniți cu diferite rețete furajere . Valorile din grafice sunt reprezentate ca media aritmetică ±
deviație standard ( standard deviation – SD) pentru patru animale/eșantion. Semnificația statistică a diferenței în
expresie a genelor a fost realizată cu testul Student (T Test) (NS p ≥ 0,05; * p ≤ 0,05). Cele patru eșantioane folosite
sunt: Control – hrănit cu furaj control; E1 reprezentat de grupul hrănit cu furaj control + semințe de strugure; E2
reprezentat de grupul hrănit cu furaj control + aflatoxina B1; E3 reprezentat de grupul hrănit cu furaj control +
semințe de strugure + aflatoxina B1.
Expresia celor două gene, cyp1a2 și cyp4a24 , determinată în urma valorii 2- ΔΔ CT
obținute după analiza Real -Time PCR a probelor recoltate din ficat pentru cele patru
eșantioane, este reprezentată în tabelul 3 ca medie (valoarea 2- ΔΔ CT) ± deviația standard,
alături de rezultatele testului Student (T Test) față de grupul control.
Tabel 3 Valorile 2- ΔΔ CT pentru cele două gene examinate ( cyp1a2 si cyp4a24 ). Valorile sunt reprezentate ca medie
aritmetică ± deviație standard ( standard deviation – SD) pentru patru animale/eșantion. Testul Student (T Test) a fost
folosit pentru a evalua semnificația statistică celor două gene în ficat pentru cele patru eșantioane folosite (NS –
nesemnificativ p ≥ 0,05; *p ≤ 0,05). Cele patru eșantioane folosite s unt: Control – hrănit cu furaj control; E1
reprezentat de grupul hrănit cu furaj control + semințe de strugure; E2 reprezentat de grupul hrănit cu furaj control +
aflatoxina B1; E3 reprezentat de grupul hrănit cu furaj control + semințe de strugure + afl atoxina B1

În urma rezultatelor obținute se poate observa faptul că efectele aflatoxinei B1 asupra
expresiei celor două gene sunt contradictorii. În timp ce expresia genică a genei cyp1a2 a scăzut

în urma unei diete cu aflatoxina B1, expresia genică a genei cyp4a24 a înregistrat o creștere
semnificativă pentru aceeași dietă comparativ cu expresia acestor gene la suinele care au făcut
parte din grupul control. Se remarcă însă faptul că introducerea semințelor de strugure în dieta
cu aflatoxină B1 a avut ca efect reducerea expresiei ambelor gene.
Enzima CYP1A2, codificată de gena cyp1a2 , este una dintre principalele enzime care
catalizează transformarea AFB1 în metabolitul extrem de toxic AFBO (AFB1 -exo-8,9-epoxid)
capabil să inducă mutații prin formarea aducților cu ADN. În studiul de față s -a remarcat o
scădere a expresiei genice a genei cyp1a2 în urma dietei contaminată cu AFB1. Acest rezultat
este în conformitate cu alte două studii in vivo în care s -au evidențiat scăderi ale niv elului de
activitate enzimatică al enzimei CYP1A2 în țesutul hepatic în urma unei diete cu AFB1, atât la
suine (Meissonnier și colab., 2007), cât și la iepuri (Guerre și colab., 1996). De asemenea, o
altă micotoxină, fumonisina B1, a determinat scăderi uș oare ale CYP1A2 în ficatul șobolanilor
(Spotti și colab., 2000). Se sugerează că această scădere este datorată degradării oxidative a
sistemului microsomal în urma peroxidării lipidice indusă de AFB1 (Meissonnier și colab.,
2007). Totodată, în studiul rea lizat de Guerre și colaboratorii (1996), s -a înregistrat o activitate
crescută a hem oxigenazei și a NADPH -citocrom c reductazei, enzime ce catabolizează
proteinele care conțin hem cum este cazul enzimelor din familia citocrom P450, pentru grupul
de iepuri tratat cu AFB1. Această ipoteză nu poate fi însă susținută în studiul prezent și pentru
enzima CYP4A24, la care expresia genică a genei omoloage a crescut semnificativ față de
grupul control la o dietă cu AFB1.
În contrast cu aceste rezultate sunt mai mul te studii în care concentrația enzimei
CYP1A2 a crescut în urma expunerii la AFB1. Un nivel ridicat de ARNm al genei cyp1a2 a
fost înregistrat în microzomii hepatici de găină în urma unei diete cu AFB1 (Zhang și colab.,
2016). Alte studii in vitro pe cultu ri de hepatocite umane (Ayed -Boussema și colab., 2012) și
pe o linie celulară hepatocarcinonegică de șobolan (Mary, și colab., 2015) consemnează o
creștere a expresiei ARNm al proteinei CYP1A2 după tratament cu AFB1. Ambele studii
înregistrează, de aseme nea, un nivel crescut al ARNm pentru factorul de transcripție care
reglează expresia genică a genei cyp1a2, factorul nuclear de transcripție dependent de ligand
AhR (receptorul aril hidrocarbonat) care poate fi activat de AFB1 (Lee și Yang, 2008).
Enzimel e din subfamilia CYP4A catalizează hidroxilarea în poziție ω și ω -1 a acizilor
grași. La suine, izoforma CYP4A24 a fost izolată din ficat, în 2002, într -un experiment care
atestă afinitățile acestei enzime pentru hidroxilarea în poziție ω și ω -1 a acidului lauric, dar și a
acidului palmitic, acizi grași de lungime medie (Lundell, 2002). Diferite studii au demonstrat

că sinteza proteinei CYP4A poate fi indusă de diverse xenobiotice, fiind totodată asociată cu
proliferarea peroxizomilor, ca răspuns secundar a l încercării menținerii homeostaziei lipidice
în țesutul hepatic (Gibson, 1992).
În studiul experimental de față, expresia genică a genei cyp4a24 a crescut semnificativ
din punct de vedere statistic față de grupul control. Acest fapt poate fi pus pe seama capacității
aflatoxinei B1 de a determina activarea transcrierii acestei gene și sinteza proteinelor omoloage.
Eveniment ce este în acord cu un alt studiu pe șobolani, în care (Martinez -Larrañaga și colab.,
1996) atestă o creștere a activității enzimei CYP 4A1 (datorită creșterii cantității de acid lauric
ω-hidroxilat) în ficat pentru grupuri experimentale injectate intraperitoneal cu fumonisina B1,
o micotoxină care, printre altele, este asociata cu edemul pulmonar la suine. În contrast, (Chen
și Hardwick, 1993) au determinat o scădere a concentrației proteinelor CYP4A într -o tumoră
hepatică indusă de aflatoxina B1 la șobolani. Totuși, în același țesut cancerigen au fost
înregistrate concentrații crescute de enzime active din subfamilia CYP4F.
Un posibil m ecanism prin care aflatoxina B1 ar putea determina o expresie genică
ridicată a acestei gene este prin activarea factorului său de transcripție. Asemănător genei
cyp1a2 , expresia genică a genelor cyp4a este indusă de un factor de transcripție: PPAR -α
(rece ptorul activat de proliferare peroxizomică α) (Apte și Krishnamurthy, 2011). Stimularea
hepatocitelor cu PPAR -α determină atât proliferarea peroxizomilor, cât și inducerea
transcripției genelor cyp4a (Novilla și colab., 2019).
Rozătoarele sunt printre cele mai susceptibile specii la proliferarea peroxizomilor
(Novilla și colab., 2019), fapt ce a determinat un interes crescut pentru mecanismul de acțiune
și inducere al enzimelor din subfamilia CYP4A asociate cu acest fenomen. Modelul teoretizat
prin care ace ste două evenimente, activarea transcrierii genelor cyp4a și proliferarea
peroxizomilor, sunt legate între ele prin formarea speciilor reactive de oxigen, precum peroxidul
de hidrogen (H 2O2) implicat în formarea carcinomului hepatocelular, în urma unei act ivități
metabolice crescute (Martinez -Larrañaga și colab., 1996; Lehman -McKeeman, 2013). Stresul
oxidativ este un element important al toxicității celulare (Lehman -McKeeman, 2013).
Diferiți compuși antifungici produși de bacterii ale genului Streptomyces pot inhiba
enzimele CYP4A. Cicloheximida este un fungicid natural care inhibă sinteza proteică a
proteinelor CYP4A (Gibson, 1992). Natamicina, un compus anti -fungal, protejează celulele
hepatice ale șobolanilor prin inhibarea enzimelor CYP4A și reduce proli ferarea peroxizomică,
dar poate avea efecte toxice prin metabolizarea de către alte enzime CYP (Martínez și colab.,
2013).

În studiul de față expresia genică a genelor cyp1a2 și cyp4a24 a fost redusă la adăugarea
semințelor de struguri în dietă, față de gr upul control. Semințele de struguri, conțin diverși
compuși bioactivi, printre care și polifenoli. Polifenolii sunt unul dintre cele mai importante
grupuri de antioxidanți care combat speciile reactive de oxigen și care activează calea de
semnalizare celul ară implicată în ameliorarea stresului oxidativ. Printre polifenolii
predominanți întâlniți în semințele de struguri se numără flavonoidele (Grosu și colab., 2019).
O posibilă explicație pentru care dieta cu semințe de struguri a scăzut expresia genică a
genei cyp1a2 o oferă un studiu în care Bruno și Njar (2007) identifică flavonoidele, precum
cele întâlnite în semințele de struguri, ca posibili inhibitori ai AhR, blocând astfel transcrierea
genei cyp1a2 . Similar, curcumina, un compus polifenolic întâlnit în turmeric, a făcut obiectul
câtorva studii în care s -au demonstrat proprietățile sale de a combate efectele nocive ale
aflatoxinei B1(Zhang și colab., 2016; Muhammad și colab., 2018; Muhammad și colab., 2018) .
Într-un studiu in vivo pe găini, adăugarea curcuminei în dieta contaminata cu AFB1 a reușit să
reducă nivelul de expresie al genei cyp1a2 din țesutul hepatic (Muhammad și colab., 2018).
Totodată, efectele antioxidante ale polifenolilor din compoziția semințelor de struguri
sunt o modalitate de comb atere a stresul oxidativ determinat de AFB1. Se crede că mecanismul
molecular prin care substanțele active din semințele de struguri protejează celula de stresul
oxidativ este prin activarea de către polifenoli a Nrf2 (factorul nuclear eritroid 2 – legat d e
factorul 2), factor de transcripție implicat în sistemele redox, care reglează expresia genică a
enzimelor aferente fazei II de detoxifiere a substanțelor xenobiotice (superoxid dismutază,
glutation peroxidază și catalază) (Tăranu și colab., 2019). Aceas ta ipoteză a fost demonstrată
de Rajput și colaboratorii (2017), care într -un studiu realizat pe găini hrănite cu o dietă cu AFB1
și extract de proantocianidine din semințele de struguri – GSPE ( Grape Seed Proanthocyanidins
Extract ). Proantocianidinele din extract reușesc să crească concentrația enzimelor antioxidante
din ficat și să scadă concentrația malonaldehidei,marker pentru peroxidarea lipidică, față de
dieta cu AFB1 care a avut rezultate contrarii (Rajput și colab., 2017). Aceeași autori
demonstreaz ă că mecanismul prin care GSPE acționează este într -adevăr activarea Nrf2 și
menținerea stabilității redox și creșterea rezistentei împotriva stresului oxidativ (Rajput și
colab., 2019). De asemenea, tot pe găini, Muhammad și colaboratorii (2018) au demons trat
proprietatea curcuminei de a activa Nrf2 și a combate procesul inflamator determinat de AFB1
(Muhammad și colab., 2018).
Un alt mecanism prin care semințele de struguri pot reduce expresia genică a celor
două gene este prin absorbția AFB1 datorită niv elului ridicat de fibre și astfel împiedicarea

absorbției toxinei la nivel gastrointestinal. Acest fapt este atestat de Gambacorta și
colaboratorii (2016) care într -un experiment in vivo pe suine demonstrează că dintre patru
diete cu produse secundare rezu ltate din agricultură (coaja de migdale, păstăi de mazăre și
două tipuri de pulpă de struguri) și doi agenți comerciali de legare a substanțelor toxice
(bentonită modificată organic și perete celular de drojdie – S.cerevisiae ), pulpa de strugure a
avut cel e mai impresionante rezultate în reducerea absorbției gastrointestinale a micotoxinelor
fiind statistic semnificativă în absorbția a AFB1 în proporție de 67% (Gambacorta și colab.,
2016). Un alt studiu realizat in vitro pe medii lichide a determinat o absorbție puternica a
AFB1 de către resturile de struguri (Avantaggiato și colab., 2014).

Concluzii

Studiul de față a arătat că o dietă cu aflatoxină B1 determină o creștere a expresiei
genice a genei cyp4a24 și, poate în mod surprinzător, o scădere a expresiei genice a genei
cyp1a2 în ficatul suinelor față de grupul control. Aceste două evenimente pot fi însă corelate

prin inducerea în hepatocite a st resului oxidativ de către aflatoxina B1. Introducerea în dietă a
unei cantități de semințe de struguri a reușit sa reducă atât expresia genică a genei cyp1a2 , cât
și a genei cyp4a24 față de grupul control. Mecanismele prin care compușii regăsiți în
semințe le de struguri determină scăderea expresiei acestor gene pot fi: (1) prin activarea Nrf2
care induce expresia genică a enzimelor aferente etapei de detoxifiere a substanțelor
xenobiotice; (2) prin absorbția aflatoxinei B1, împiedicând astfel absorbția sa gastrointestinal
sau (3) prin inhibarea factorilor de transcripție a acestor gene. De asemenea, nu este exclusă o
acțiune sinergică a acestor trei mecanisme. Cu toate acestea, deși studiul prezent
demonstrează că folosirea semințelor de struguri pentru a r educe potențialele efecte negative
ale intoxicației cu aflatoxina B1 a suinelor, prin reducerea transcrierii unor gene implicate in
inducerea citotoxicității, este o variantă avantajoasă atât din punct de vedere economic, cât și
ecologic, sunt în continuar e necesare mai multe studii care să urmărească în amănunt
mecanismul molecular de acțiune al compușilor bioactivi din semințele de struguri, precum și
să aibă în vedere o gamă mai largă de parametri ce pot fi influențați de compușii toxici
rezultați în urm a bioactivării aflatoxinei B1 care trebuie analizați.
În concluzie, micotoxinele sunt substanțe care pot ajunge cu ușurință în organismul
oamenilor și animalelor domestice unde sunt biotransformate în compuși toxici care atacă
integritatea celulară determ inând alterări grave ale sănătății. Combaterea micotozicozelor este
un subiect de interes global care determină căutarea unor metode cât mai eficiente pentru
eliminarea toxinele fără a pune în pericol sănătatea individului.