Contaminarea cu Micotoxine a Unor Produse Cerealiere

BIBLIOGRAFIE

[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], Tehnici de cultură și protecție a cerealelor și leguminoaselor, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] – 2006

Baicu T., Seșan T., Fitopatologie agricolă, [NUME_REDACTAT], București – 2007

[NUME_REDACTAT], Elemente de toxicologie alimentară. Contaminanți chimici, [NUME_REDACTAT] din Oradea – 2009

Coman I., [NUME_REDACTAT], Miron L., [NUME_REDACTAT], Elemente de standardizare în micologie și micotoxicologie, [NUME_REDACTAT] – 2007

Coman I., Popescu O., Micotoxine și micotoxicoze, [NUME_REDACTAT], București – 1985

[NUME_REDACTAT], Gh. Popescu, Securitatea și calitatea produselor vegetale, siguranța vieții, [NUME_REDACTAT], Timișoara – 2009

Jean – [NUME_REDACTAT], Mycotoxins, IRNA, France – 2002

[NUME_REDACTAT], Ghid de laborator, Metode de analiză pentru produse alimentare, [NUME_REDACTAT], Iași – 2006

[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] Suciu, V. Florian, Effect of ear Fusarium infection on the maize yield and mycotoxin content, 11th [NUME_REDACTAT] seminar – fusarium – mycotoxins, taxonomy, pathogenicity and host resistace, 20-23 september, Radzikow, Poland, pag 287 – 2010

[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], Miceti si micotoxine, [NUME_REDACTAT] – 2007

Străjeru S., Murariu D., Popa M., Plăcintă D., Conservarea și utilizarea resurselor genetice vegetale, Suceava – 2001

Scuteanu E., Danielescu N., Popescu O., [NUME_REDACTAT]., Toxicologie și toxicoze, [NUME_REDACTAT] și Pedagogică, București – 2004

Tănase C, (2001), Micologie, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Cuza, Iași – 2001

Tofană CLEMANSA TOFAN, Igiena și securitatea produselor alimentare, [NUME_REDACTAT] – 2011

*** Direcția generală pentru siguranța și igiena alimentară și nutriție – 2011

***www.agrifoodresearch.com

*** www.bercamihai.ro

***www.food-info.net/ro/qa/mycotoxins.htm

*** www.mycotoxins.org

***www.foodmate.net

INTRODUCERE

PARTEA I – STUDIU BIBLIOGRAFIC

CAPITOLUL I

CONTAMINAREA CU MICOTOXINE A ALIMENTELOR

I.1. Noțiuni generale despre contaminarea chimică

I.2. Tipuri de contaminanți chimici

I.3. Principalele tipuri de micotoxine

I.4. Prezența micotoxinelor în diverse produse alimentare

CAPITOLUL II

FACTORI CARE INFLUENȚEAZĂ PRODUCEREA MICOTOXINELOR

II.1. Influența factorilor extrinseci asupra apariției micotoxinelor

II.2. Influența factorilor intrinseci asupra apariției micotoxinelor

CAPITOLUL III

METODE DE LIMITARE ȘI REDUCERE A CONȚINUTULUI ÎN MICOTOXINE A UNOR PRODUSE ALIMENTARE DE ORIGINE VEGETALĂ

III.1. Strategii preventive: limitarea contaminanților

III.2. Strategii curative: decontaminarea

PARTEA A II-A – EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL IV

SCOPUL LUCRĂRII

CAPITOLUL V

MATERIALUL TESTAT

CAPITOLUL VI

METODE UTILIZATE ÎN DETERMINĂRI

VI.1.Pregătirea preliminară a probelor

VI.2.Metode calitative

VI.3.Metode cantitative

CAPITOLUL VII

REZULTATELE DETERMINĂRILOR PRACTICE

BIBLIOGRAFIE

CUPRINS

TOC \t "Lic 2, 1,Lic1, 2"

INTRODUCERE PAGEREF _Toc \h 4

PARTEA I – STUDIU BIBLIOGRAFIC PAGEREF _Toc1 \h 5

CAPITOLUL I PAGEREF _Toc2 \h 6

CONTAMINAREA CU MICOTOXINE A ALIMENTELOR PAGEREF _Toc3 \h 6

I.1. Noțiuni generale despre contaminarea chimică PAGEREF _Toc4 \h 6

I.2. Tipuri de contaminanți chimici PAGEREF _Toc5 \h 7

I.3. Principalele tipuri de micotoxine PAGEREF _Toc6 \h 9

I.4. Prezența micotoxinelor în diverse produse alimentare PAGEREF _Toc7 \h 13

CAPITOLUL II PAGEREF _Toc8 \h 18

FACTORI CARE INFLUENȚEAZĂ PRODUCEREA MICOTOXINELOR PAGEREF _Toc9 \h 18

II.1. Influența factorilor extrinseci asupra apariției micotoxinelor PAGEREF _Toc10 \h 18

II.2. Influența factorilor intrinseci asupra apariției micotoxinelor PAGEREF _Toc11 \h 20

CAPITOLUL III PAGEREF _Toc12 \h 22

METODE DE LIMITARE ȘI REDUCERE A CONȚINUTULUI ÎN MICOTOXINE A UNOR PRODUSE ALIMENTARE DE ORIGINE VEGETALĂ PAGEREF _Toc13 \h 22

III.1. Strategii preventive: limitarea contaminanților PAGEREF _Toc14 \h 22

III.2. Strategii curative: decontaminarea PAGEREF _Toc15 \h 24

PARTEA A II-A – EXPERIMENTALĂ PAGEREF _Toc16 \h 28

CAPITOLUL IV PAGEREF _Toc17 \h 28

SCOPUL LUCRĂRII PAGEREF _Toc18 \h 28

CAPITOLUL V PAGEREF _Toc19 \h 29

MATERIALUL TESTAT PAGEREF _Toc20 \h 29

CAPITOLUL VI PAGEREF _Toc21 \h 30

METODE UTILIZATE ÎN DETERMINĂRI PAGEREF _Toc22 \h 30

VI.1.Pregătirea preliminară a probelor PAGEREF _Toc23 \h 31

VI.2.Metode calitative PAGEREF _Toc24 \h 31

VI.3.Metode cantitative PAGEREF _Toc25 \h 40

CAPITOLUL VII PAGEREF _Toc26 \h 42

REZULTATELE DETERMINĂRILOR PRACTICE PAGEREF _Toc27 \h 42

Înmulțirea, creșterea și activitatea de degradare a micromicetelor parazite și saprofite sunt favorizate de condițiile de depozitare în care trăiesc, cum ar fi: PAGEREF _Toc28 \h 43

substratul nutritiv unde se dezvoltă masa de semințe; PAGEREF _Toc29 \h 43

temperatura și lumina; PAGEREF _Toc30 \h 43

umiditatea relativă din atmosfera depozitului și dintre spațiile intergranulare; PAGEREF _Toc31 \h 43

ventilația aerului și compoziția atmosferei de depozit (Stăjeru S., și colab.). PAGEREF _Toc32 \h 43

Analiza microbiologică este indispensabilă atât pentru a asigura produsului o calitate și o conservabilitate mai bună, cât și pentru a garanta calitatea igienică și siguranța consumatorilor. PAGEREF _Toc33 \h 43

CONCLUZII PAGEREF _Toc34 \h 53

Experimentul urmărit ȋn prezenta lucrare conduce către următoarele concluzii: PAGEREF _Toc35 \h 53

Din punct de vedere cantitativ: PAGEREF _Toc36 \h 53

Nici una din variantele testate nu a depășit valoarea CMA pentru suma de aflatoxine; PAGEREF _Toc37 \h 53

Umiditatea probelor testate influențează gradul de contaminare cu aflatoxine; PAGEREF _Toc38 \h 53

Aparatura avută la dispoziție nu permite aprecieri asupra tipului concret de aflatoxine și ponderea lor, comparația privește suma de aflatoxine determinate experimental. PAGEREF _Toc39 \h 53

BIBLIOGRAFIE PAGEREF _Toc40 \h 54

INTRODUCERE

Micotoxicozele sunt boli ale omului și animalelor produse de micotoxine care ajung în organism odată cu ingerarea alimentelor respectiv a furajelor.

Micotoxinele sunt metaboliți toxici ai miceților dezvoltați pe diferite substraturi, în special alimente si furaje, capabili să producă îmbolnavirea celor care le consumă. Ele se găsesc în sporii și talul miceților sau ca produși de secreție ai acestora în substraturile pe care le dezvoltă.

Micotoxicozele, spre deosebire de micoze care sunt boli determinate de prezența fungilor în organismul afectat, reprezintă entități morbide produse de toxinele fungilor numite micotoxine, care sunt agenți abiotici ajunși în organismul uman sau animal odată cu alimentele sau furajele. Ele nu presupun prezența fungului în organismul afectat și uneori, nici în substratul pe care au fost elaborate micotoxinele.

Numeroase produse alimentare sau furaje de origine vegetală, cum sunt făina de grâu, secară sau de porumb, șroturile de arahide, diferite fructe pe care s-au dezvoltat fungi toxigeni, în urma prelucrărilor suferite nu mai conțin decât micotoxine care au rezistat acestor procese, în timp ce fungii care le-au produs au fost distruși.

În cazul unor produse alimentare de origine animală, cum sunt carnea și laptele animalelor de fermă, contaminarea lor cu micotoxine se face prin hrănirea lor cu furaje mucegăite în care s-au elaborat micotoxinele.

PARTEA I – STUDIU BIBLIOGRAFIC

CAPITOLUL I

CONTAMINAREA CU MICOTOXINE A ALIMENTELOR

I.1. Noțiuni generale despre contaminarea chimică

Contaminanți chimici reprezintă orice substanță care nu a fost adăugată în mod intenționat într-un anumit produs alimentar, dar care poate fi prezent în acesta ca rezultat al uneia sau mai multor activități. Sunt incluse substanțe chimice provenite din mediu, reziduuri de medicamente de uz veterinar, metale grele sau alte reziduuri care ajung în alimente intenționat sau accidental, în timpul proceselor pe care le implică agricultura (practici agricole de pesticide etc.), sau creșterea animalelor (steroizi, hormoni, etc.), și a pășunilor, prelucrarea alimentelor, transportul sau ambalarea ([NUME_REDACTAT], 2012; [NUME_REDACTAT] pentru Siguranța și igiena alimentară și nutriție,2011).

Dacă un agent contaminant generează un risc sau nu, depinde de mulți factori, inclusiv de absorbția și toxicitatea substanței, cantitatea în care contaminantul se găsește în aliment,cantitatea de alimente contaminată consumat și durata expunerii alimentelor și este mai puțin evident dar nu mai puțin semnificativă din punct de vedere sanitar ([NUME_REDACTAT],2012).

Procesul de poluare chimică a alimentelor exercită efecte, atât asupra alimentului, cât și asupra sănătății celui care consumă aceste produse, influențând starea de sănătate a populației, deși acest fenomen, uneori, nu este aparent la o cercetare superficială. În realitate, prețul biologic plătit de consumator prin consumul de alimente poluate, este considerabil și afectează „a la longue” organismul. Apariția fenomenelor de intoxicare este explicabilă prin concentrațiile mici de poluanți care, însă, acționează printr-un efect cronic, cu sau fără acumularea toxicului. (Orbân A. și colab.,2007).

Alimentele sunt contaminate în cea mai mare parte prin intermediul factorilor de mediu apă, aer, sol dar care au la rândul lor surse proprii specifice de poluare în special pentru anumite elemente.

Alimentele de origine animală se contaminează de obicei prin consumul de produse vegetale contaminate, furaje, produse de uz veterinar folosite la tratamente sau la tehnologiile de creștere industrială a acestora. ([NUME_REDACTAT], 2012).

Calitatea și siguranța alimentelor se bazează pe eforturile tuturor celor implicați în lanțul complex care include producția agricolă, procesarea, transportul și consumul. [NUME_REDACTAT] Europene și [NUME_REDACTAT] a Sănătății – siguranța alimentelor este o responsabilitate a tuturor, începând de la originea lor până în momentul în care ajung pe masă.

Pentru a menține calitatea și siguranta alimentelor de-a lungul lanțului amintit, este nevoie atât de proceduri care să asigure faptul că alimentele sunt integre, precum și de proceduri de monitorizare care să asigure ducerea la capăt a operațiunilor în bune condiții. ([NUME_REDACTAT], Elemente de toxicologie alimentară,Contaminanți chimici, [NUME_REDACTAT] din Oradea-2009).

I.2. Tipuri de contaminanți chimici

Alimentele constituie sursa energetică și constructivă de bază a organismului uman. Pentru a-și putea îndeplini funcția, alimentele trebuie să fie satisfăcătoare din punt de vedere calitativ, adică să aibe calități nutriționale și să fie salubre. ([NUME_REDACTAT], 2010).

În prezent, marea diversitate de alimente disponibile, compoziția chimică complexă a acestora, riscurile de îmbolnavire prin intermediul alimentelor ingerate, schimbarea mediului în care omul își desfășoară activitatea, au determinat revizuirea concepției despre alimentație, accentuarea caracterului ei rațional și de factor preventiv în sănătate.

Factorii care influențează calitatea produselor alimentare pot fi interni, cum sunt compoziția chimică a produsului, structura anatomică și gradul de integritate, proprietățile biologice, proprietățile fizice sau externi solicitările mecanice în timpul manipulării produselor, compoziția aerului atmosferic, temperatura aerului, umiditatea aerului, lumina și alte radiații, ambalajul, microorganismele, modul de depozitare. ([NUME_REDACTAT], 2012).

De-a lungul lanțului alimentar sunt implementate diverse proceduri și mecanisme de control, care asigură ca, alimentele ce ajung pe masa consumatorului să fie comestibile, riscul contaminării să fie minim.

Riscul ca, alimentele să fie contaminate cu substanțe chimice sau microorganisme există pe tot parcursul lanțului alimentar. În general, siguranța alimentelor este amenințată de factori care se împart în două categorii :

contaminarea biologică: bacterii, fungi, viruși sau paraziți – la un astfel de tip de contaminare alimentele prezintă, în cele mai multe cazuri, semne ușor de identificat;

contaminarea chimică: care include contaminarea cu substanțe chimice provenite din mediu, reziduuri de medicamente de uz veterinat, metale grele sau alte reziduuri care ajung în alimente neintenționat, accidental, în timpul proceselor pe care le impune agricultura sau creșterea animalelor și a păsărilor, prelucrarea alimentelor, transportul sau ambalarea. ([NUME_REDACTAT], 2012).

Clasificarea contaminanților chimici posibil de a fi regăsiți ȋn alimente se poate face din mai multe puncte de vedere. Dacă ținem cont de sursa acestora se pot lua ȋn considerare următoarele tipuri de astfel de substanțe. ([NUME_REDACTAT], Elemente de toxicologie alimentară. Contaminanți chimici, [NUME_REDACTAT] din Oradea-2009):

A – Substanțe existente și adăugate cu potențial toxic în alimente

Substanțe toxice naturale în materii prime vegetale

Nitriți și nitrați

B – Substanțe toxice de poluare și contaminare chimică

Poluanți din mediu

Biometale cu potențial toxic

Metale toxice

Dioxine și PCB

Nitriți și nitrați

[NUME_REDACTAT] procesele tehnologice: obținere materii prime, prelucrare, depozitare

[NUME_REDACTAT] și nitrați

Medicamente (de uz veterinar)

Compuși N nitrozo

Hidrocarburi policiclice aromatice

Acrilamida

3-monoclorpropan-1,2 diol

Contaminanți toxici din materiale aflate ȋn contact cu alimentele: detergenți, ambalaje

Micotoxine

I.3. Principalele tipuri de micotoxine

Micotoxinele sunt metaboliți produși de miceți dezvoltați pe un substrat, capabile să producă îmbolnăvirea celor ce consumă produsul respectiv: oameni, animale, plante, microbi. Aceste toxine se găsesc ca produși de secreție pe substratul pe care se dezvoltă mucegaiul.

Sunt cunoscute peste 300 de micotoxine dar prin impactul pe care ȋl au asupra sănătății animalelor și oamenilor, ȋn jur de 10 compuși sunt studiați și urmăriți ȋn mod deosebit.

În același timp micotoxinele sunt foarte diverse ca și tip chimic datorită numărului mare de ciuperci care le produc și ȋn acest sens se pot distinge clase majore și clase minore de micotoxine ([NUME_REDACTAT], 2011) ȋncadrarea în clase fiind diferită ȋntre diferiți autori.

Micotoxine majore:

[NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT]

Micotoxine minore:

[NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] ciclopiazonic

[NUME_REDACTAT] penicilinic

Există și mucegaiuri utile ȋn industria alimentară cum ar fi:

Penicillinum roqueforti și Aspergillius camemberti utilizate pentru obținerea unor sortimente de brânzeturi

Penicillinium expansum care se utilizează pentru obținerea unor sortimente de salamuri crud-uscate.

Aflatoxinele sunt secretate de Aspergillus flavus, dar și de un număr mare de alte mucegaiuri printre care: A.ochraceus, Penicillium puberulum, diferiți penicili și chiar Rizopus sp. Principalul producător rămâne însă A. flavus, care are spori galbeni-verzi și este lipsit de ascospori. Se dezvoltă bine pe semințe oleagenoase și pe produsele secundare rezultate de la fabricarea uleiului (șrot, tărâțe), în special pe arahide, dar și pe cereale. Este depistat și pe produse de origine animală: brânzeturi fermentate, preparate din carne. Alți metaboliți cu acțiune metabolică elaborați de Aspergillus flavus sunt: asperthecina, flavacolul și acidul aspergillic. Acești compuși își manifestă acțiunea toxică asupra altor microorganisme.

Aceștia sunt raspândiți abundent în sol, aer, alimente stocate, materii organice, corpuri vii, etc. Interesul deosebit al biotehnologiei pentru genul de fungii amintit, este reprezentat de produsele metabolismului lor, anume: metabolitii primari (acizi organici, enzime, etc) și secundari, printre care mulți sunt micotoxine.

Din puncte de vedere istoric, date despre acest gen de fungi apar încă din 1729 și continuă cu noi descoperiri până în 1983, când se utilizează deja frecvent în biotehnologii. Există patru fracțiuni de aflatoxine majore și o serie de fracțiuni minore, toate derivați ai furofuranului cu nucleu cumarinic, identificate după fluorescența în lumină ultravioletă. Printre cele aproximativ 20 de substanțe incluse în categoria aflatoxinelor, în alimente se regăsesc cu precădere 4, anume: aflatoxinele B1, B2, G1 și G2. Principalele fracțiuni cunoscute sunt: B1, B2, G1, G2, M1, M2, M2a și P1. Toxicitatea maximă o prezintă aflatoxina B1, urmată de G1, B2 și G2. Fracțiunea P1 s-a dovedit a fi lipsită de toxicitate în teste pe embrioni de găină, și de asemenea fracțiunile B2 și G2.

Aflatoxinele sunt toxigene, carcinogene (cele mai puternice carcinogene naturale cunoscute), mutagene și teratogene. Aflatoxinele, compuși cu structura cumarinică, au fost notate ințial în ordinea descrescatoare a activității biologice și toxicității, după cum urmează; aflatoxina B1, aflatoxinele G1, G2, aflatoxina B2 (produse în speță de Aspergillus parasiticus, extrem de toxigen, urmat de Aspergillus flavus), etc. Ele sunt grupate în trei categorii: aflatoxine majore, aflatoxine monohidroxilate și aflatoxine dihidroxilate.

Aflatoxinele prezintă fluorescența în UV. De altfel, primii patru compuși izolați au fost denumiți în funcție de culoarea fluorescenței la 254 nm și 366 nm, albastră sau verde, respectiv B (blue) și G (green).

Aflatoxinele pot fi distruse de acizi și baze tari, de hipoclorați, de permanganatul de potasiu, de apa oxigenată, de clor, de ozon, etc.

Incidența apariției aflatoxinelor este sporită în țările în curs de dezvoltare din Africa și Asia, care nu au implementate sistemele de control calitativ al alimentelor. Producția maximă de aflatoxine are loc la temperaturi ridicate, acumularea aflatoxinelor este specifică țărilor cu climă caldă.

Ochratoxinele au fost identificate în numeroase produse alimentare de origine vegetală: porumb, grâu, orz, ovăz, orez, soia, sorg, leguminoase, cafea și pește sărat, în concentrații de până la 28.000 mg/Kg. Toxicitatea ochratoxinei este cuprinsă între 0,2 și 0,34 mg/Kg. Ochratoxinele sunt produse de miceți din genurile: Aspergillus și Penicillium.

Patulina mai este cunoscută și sub denumirea de clavacină și se acumulează în cereale și în numeroase fructe și legume: mere, pere, piersici, caise, cireșe, struguri, banane, tomate, ele putând trece și în produsele de prelucrare, în special în sucurile de fructe. În cantitate mare se formează în merele depozitate (de la 20 la 17.700 mg/Kg). Patulina este foarte toxică pentru animale și plante, având asupra acestora o acțiune mutagenă, teratogenă și carcinogenă. Este produsă de miceți din genul: Penicillium (P. urticae, P. expansum).

Sterigmatocistinele fac parte din metaboliții furofuranici. Efectele toxice sunt asemănătoare cu ale aflatoxinei B1, producând necroze miocardice, alterare celulară, reducerea cromatinei din nucleu și o progresivă degenerare celulară însoțită de o fragmentare a nucleilor. Este produsă de miceți din genul: Aspergillus și Penicillium. A fost pusă în evidență în diferite cereale mucegăite: făină, pâine, carne și brânzeturi.

Tricotecenele sunt metaboliți ai mai multor genuri de fungi imperfecți: Fusarium, Trichothecium, Mychotecium, Cephalosporium și Stahybotrys. Rolul cel mai important îi revine lui Fusarium sp. care afectează cel mai mult cerealele și semințele de leguminoase. Aceste micotoxine, în țările din zona temperată, prezintă un pericol mai mare decât aflatoxinele. Temperatura optimă de producere a toxinelor este cuprinsă între 1,5 și 8°C. Ele sunt termostabile, rezistând 18 ore la 110°C și, ca urmare, își manifestă efectul și după operațiile de coacere și fierbere.

Tricotecenele în concentrații de până la 5.000 mg/Kg au fost găsite în porumbul și orzul din mai multe țări. În intoxicațiile acute, tricotecenele provoacă vomismente, slăbiciune, diaree, tahicardie, hipotensiune și colaps.

Toxina T-2 este principalul tricotecen care se formează pe porumbul mucegăit, dar poate fi identificată și pe alte cereale, pe care s-a dezvoltat Fusarium tricinctum. Porumbul care se maturizează târziu sau are un conținut mare de apă este predispus la primul îngheț alterării de către fusarii și acumulării de toxine. Toxina T-2 provoacă dizenterie mortală la mamifere și are un efect de reducere a coagulabilității sângelui. Se manifestă prin vomismente, gastroenterită cu dizenterie, scădere în greutate și moarte.

Zearalenonele reprezintă contaminanți frecvenți ai produselor cerealiere. În porumb, orz și grâu concentrația micotoxinei poate înregistra valori de 50 mg/Kg.

Zearalenona F2 este elaborată de Fusarium roseum, dar și de alte fusarii și miceți. S-au izolat fracțiunile F3, F1 și F5, dar cu acțiune toxică mai redusă. Sunt sintetizate la temperaturi scăzute, de 12°C, ridicarea temperaturii la 25°C sporește producerea de micotoxine. Se acumulează în special pe porumbul depozitat, cu umiditate ridicată (peste 14%).

Zearalenonele sunt lactone ale acidului rezorcilic. În doze reduse au un efect stimulant asupra sporului de greutate, fiind chiar utilizate în acest scop. În doze mari au acțiune estrogenă, producând avorturi la femelele gestante și sterilitate.

Rubratoxinele sunt substanțe toxice elaborate de Penicillium rubrum și P. purpurogenum și se prezintă sub două forme: A și B. Ele provoacă o stare hemoragică și sunt hepatotoxice. Rubratoxina B are și o oarecare acțiune carcinogenă, acționând sinergic cu aflatoxina B1. În mod obișnuit produsele pot fi contaminate concomitent cu A. flavus și cu P. rubrum, efectele conjugându-se.

Dozele subletale produc oprirea creșterii și apariția unor malformații congenitale la animalele de experiență. Sub acțiunea rubratoxinelor s-au constatat dezagregări ale poliribozomilor, ceea ce determină o alterare a sintezei proteinelor.

Citreoviridina este o substanță cu efecte neurotoxice, sintetizată de Penicillium citreoviridae, care se dezvoltă cu predilecție pe orez, la temperaturi joase, de 12-18°C. Ea este responsabilă de apariția unor simptome asemănătoare bolii beri-beri. Toate aceste micotoxine sunt hepatotoxine puternice. Simptomele intoxicației cu P. islandicum diferă de cantitatea de orez mucegăit ingerată.

I.4. Prezența micotoxinelor în diverse produse alimentare

Un mare număr de produse alimentare poate fi contaminat cu micotoxine. Contaminarea bunurilor alimentare, animale sau de origine animală este, de obicei, consecința unei absorbții digestive de către animal a micotoxinelor prezente în furaje. Micotoxinele absorbite persistă după absorbție în carne și organe sub formă mai mult sau mai puțin metabolozată sau se elimină prin diferite secreții și excreții, cum sunt laptele și urina, sau odată cu unele produse cum sunt ouăle.

Micotoxinele în cereale – cerealele pot favoriza în anumite condiții de temperatură și umiditate creșterea mucegaiurilor și producerea de micotoxine. Înmulțirea miceților pe timpul depozitării cerealelor este favorizată în condițiile unei umidități de 80 – 85% și a unei temperaturi de peste 26°C. Prezența aflatoxinelor s-a pus în evidență în pâine și produse de panificație, în crupele de porumb și în diferite tipuri de pâine dietetică.

În boabele de grâu, secară și orz, predomină ochratoxina A, ditrinina, sterigmatocistina. Prin măcinarea cerealelor, ochratoxina A trece, în mare măsură, în produsele de măciniș. Cantitatea cea mai mică de ochratoxină este prezentă în făina perlată, unde se determină 10 – 30% din conținutul inițial, iar în tărâțe se înregistrează concentrații mult mai mari. Făina poate fi contaminată cu fungi producători de micotoxine ca: Penicillium, Aspergillus, Mucor și Fusarium, în timpul depozitării, în special în condiții de umiditate ridicată a aerului putându-se forma substanțe toxice ca rezultat al metabolismului acestora. În produsele făinoase s-au determinat diferite tipuri de Aspergillus, Penicillium, Mucor și Cladosporium. Micotoxinele trec în produsele de măciniș și, ca urmare, pot fi determinate în pâine, paste făinoase, etc. Prin procesul de fermentare a aluatului, ca urmare a reacțiilor de acidifiere și oxidare care au loc, se reduce doar într-o proporție mică cantitatea inițială de aflatoxine. Coacerea nu influențează conținutul în aflatoxine, în schimb excesul de bromați în aluat (substanțe oxidante) poate determina o reducere importantă a aflatoxinelor.

Pâinea mucegăită poate conține diferite micotoxine. Pe pâine se pot dezvolta și Aspergillus ochraceus și diferite specii de Penicillium.

Porumbul, în multe zone de pe glob, se recoltează la o umiditate ridicată, ceea ce favorizează mucegăirea. S-a stabilit că Aspergillus flavus se poate dezvolta pe porumb încă din câmp, cu formare de aflatoxine; în afară de aflatoxine, în porumb s-a evidențiat și zearalenona.

Orzul și ovăzul au o cantitate mică de micotoxine, evidențiindu-se A. flavus, producător de aflatoxine și P. verrucosum, producător a ochratoxinei. Prin fierbere sub presiune se inactivează peste 81% din aflatoxine, deci autoclavarea orezului reprezintă o metodă eficientă de inactivare a aflatoxinelor.

Micotoxinele în semințele oleaginoase și în ulei – semințele oleaginoase și în special arahidele sunt ușor atacate de mucegaiuri, inclusiv de Aspergillus flavus, cu formare de aflatoxine. Micotoxinele produse de mucegaiuri se dezvoltă în tot bobul. Invadarea semințelor de către mucegai se face cu ocazia recoltării, dar mai ales pe timpul depozitării. Umiditatea și temperatura ridicată pe timpul depozitării facilitează dezvoltarea mucegaiului și producerea de micotoxine. Uscarea imediat după recoltare a arahidelor este cea mai bună metodă de a preveni contaminarea cu aflatoxine.

Micotoxinele în legume și fructe – fructele și legumele mucegăite pot prezenta diferite micotoxine. În morcovi s-au evidențiat aflatoxine produse de Aspergillus parasiticus și A. flavus, de tipul B1 și G1, care trec apoi în suc. De asemenea, și pe fructe uscate (caise, smochine, ananas) se pot forma aflatoxine. În gemuri s-a evidențiat patulina.

Micotoxinele în cafea și cacao – în cafeaua verde mucegăită s-au identificat Aspergillus ochraceus și ca urmare, ochratoxina A. Mai rar s-au izolat miceți din genul Aspergillus (A. flavus) producător de sterigmatocistine. Prin prăjire, o mare parte din micotoxine (70-80%) se distrug.

Micotoxinele în băuturi fermentate – s-au evidențiat aflatoxine în cidru; nu s-au pus însă în evidență în vin. Aflatoxinele B1, B2, G1 și G2 se pot forma în timpul malțificării necorespunzătoare a orzului, ca urmare a mucegăirii acestuia. În bere trec aproximativ 5 – 10% din aflatoxinele existente în malț.

Micotoxinele în carne și preparate de carne – ca urmare a ingerării de furaje mucegăite, aflatoxinele pot fi detectate în carnea animalelor de măcelărie. În rinichi se acumulează în special ochratoxine. Acestea, prin prăjirea cărnii la 150 – 160°C, timp de 6 – 12 minute, se reduc cu 14-35%, în timp ce în țesutul gras concentrația nu se schimbă.

Preparatele de carne pot fi contaminate cu diverse mucegaiuri din genurile: Penicillium, Aspergillus și Fusarium. În salamurile fermentate – uscate s-au pus în evidență un mare număr de tulpini de Penicillium producătoare de micotoxine (tremortină, citrinină, patulină, etc.) și mai multe tulpini de Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus, A. versicolor, producătoare de aflatoxine.

Micotoxinele în lapte și produse lactate – când se administrează vacilor furaje cu conținut mare în aflatoxine, apare în lapte un metabolit al aflatoxinei B1, cunoscut la început sub denumirea de „milktoxin” și denumit în prezent aflatoxina M1. Se formează și un derivat al aflatoxinei B2, aflatoxina M2, care prezintă însă o mai mică importanță. Metabolizarea aflatoxinelor ingerate este foarte rapidă.

În lapte și produsele din lapte s-au identificat cu precădere aflatoxinele M1 si M2, apărute prin biotransformarea în rumenul ierbivorelor a altor tipuri de aflatoxine ([NUME_REDACTAT], 2002, Mycotoxins, INRA, France).

Administrarea furajelor care conțin 50 mg/Kg aflatoxină B1 determină detectarea aflatoxinei M1 în lapte chiar din primele zile. Cantitatea de toxine crește în primele patru zile, după care rămâne stabilă. Cantitatea de aflatoxină M1 care se formează în lapte reprezintă 1 – 3% din aflatoxina ingerată cu furajul. În laptele recoltat în perioada de iarnă, cantitatea este de 1,5 ori mai mare decât primăvara.

Laptele praf depozitat în condiții necorespunzătoare poate fi contaminat cu miceți din genul Aspergillus, Penicillium și Cladosporium, care pot produce micotoxine cu acțiune nefrotoxică și hepatotoxică.

În cazul brânzeturilor se poate înregistra prezența micotoxinelor datorită atât mucegaiurilor din mediul ambiant, cât și celor utilizate în tehnologia de fabricare a brânzeturilor. Brânzeturile de tipul Tilsit, Edam, Romadur și Camembert sunt cele mai susceptibile de a conține aflatoxine. Aspergillus flavus și A. parasiticus se dezvoltă bine pe brânza Tilsit la temperatura de 18 – 30°C și la o umiditate relativă a aerului mai mare de 79%.

S-a stabilit că A. flavus produce pe brânza Tilsit aflatoxină B1 în cantitate de 2.000 mg/Kg și aflatoxină B2 în cantitate de 200 mg/Kg.

Aflatoxinele pot fi prezente și în brânzeturile topite, în cantități și mai mici, întrucât în timpul proceselor tehnologice, temperatura de topire (80 – 138°C), sărurile de topire și ph-ul reduc cantitatea de aflatoxine din brânzeturi. Este posibilă însă o contaminare ulterioară a acestora și mucegăirea lor. Cercetări recente arată că Penicillium camemberti și P. roqueforti, utilizați la fabricarea unor sortimente de brânză sunt capabile să producă substanțe toxice (patulină, citrinină și acid penicilic).

CAPITOLUL II

FACTORI CARE INFLUENȚEAZĂ PRODUCEREA MICOTOXINELOR

II.1. Influența factorilor extrinseci asupra apariției micotoxinelor

Temperatura influențează specia de mucegai și produsele lor de metabolism.

Procesele metabolice se desfășoară în limite stricte de temperatură, specifice fiecărui microorganism, putând favoriza sau din contră inhiba dezvoltarea acestora, iar în anumite cazuri poate chiar determina distrugerea lor. Efectul temperaturii se manifestă asupra:

stării de agregare a apei, în funcție de care se mărește sau se micșorează disponibilitatea apei;

vitezei reacțiilor enzimatice;

plasticității membranei celulare și citoplasmei;

macromoleculele pe care le pot denatura;

Pentru fiecare specie de mucegai există o temperatură optimă de dezvoltare. Această valoare se numește temperatura optimă de dezvoltare. Deasupra și sub temperatura optimă, dezvoltarea mucegaiurilor slăbește, și când atinge un anumit punct, superior sau inferior, încetează de a se mai dezvolta chiar dacă mediul nutritiv ramâne același. În afara acestor limite termice mucegaiul nu este distrus ci se găsește într-o stare de viață foarte lentă, favorabilă conservării.

Temperatura optimă pentru creșterea mucegaiurilor este cuprinsă între 25-30ºC iar limita maximă este de 40-45ºC. Există totuși mucegaiuri care se pot dezvolta fără probleme la temperaturi de 55ºC Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, dar și mucegaiuri care sunt capabile să se dezvolte la temperaturi de 0ºC, Penicillium cyclopium. În unele situații există o apropiere între temperatura minimă necesară pentru creșterea mucegaiului și cea la care are loc producerea de micotoxine. Avem însă unele excepții când temperatura de dezvoltare a mucegaiului este cuprinsă între 6°-45ºC cu un optim la 37ºC iar producția de micotoxine are loc într-un interval de temperatură cuprins între 11°-36ºC cu un maxim la 30ºC.

Umiditatea – cantitatea de apă existentă în mediul ambiant și în substraturi este unul din factorii importanți pentru dezvoltarea mucegaiurilor și pentru producția de micotoxine.

În atmosferă există o umezeală relativă de 70-90% și prin păstrarea alimentelor, în timp, în funcție de temperatură și compoziția produsului are loc o absorbție a vaporilor de apă din aer, instalându-se o stare de echilibru, cu creșterea cantității de apă liberă și a indicelui de activitate a apei. Este știut faptul că mucegaiurile apar după o creștere accidentală a umidității.

Tensiunea superficială – microorganismele sunt influențate de tensiunea superficială a mediului în care se găsesc. Substanțele care coboară tensiunea superficială întârzie sau împiedică dezvoltarea mucegaiurilor, aceste substanțe pot să aibă, de asemenea, influență asupra morfologiei și sporulării.

Presiunea osmotică – poate să provoace modificări bruște ale structurii celulare (plasmoliza, turgescența). Mucegaiurile sunt microorganisme de tip osmofil adică ele se pot dezvolta pe medii cu presiune osmotică mare și de aceea ele pot altera produsele alimentare care conțin o cantitate mare de zahăr (miere, dulceață, etc.). Ele se pot dezvolta pe produse care conțin max. 70% zahăr.

Lumina – acțiunea luminii depinde de specia microorganismelor. În general se poate spune că lumina este dăunătoare mucegaiurilor. Acțiunea vătămătoare a luminii este invers proporțională cu lungimea de undă a radiațiilor luminoase. Cele mai distructive ȋn vizibil sunt radiațiile violete, iar din spectrul invizibil, radiațiile ultraviolete. Acțiunea dăunătoare a razelor ultraviolete depinde de intensitatea și durata lor de acțiune asupra mucegaiurilor, acestea putând fi împiedicate sau oprite din activitatea lor, ori complet distruse.

Când acțiunea luminii se exercită asupra unei culturi și nu numai asupra unui singur microorganism, se deosebește alături de acțiunea directă, și acțiunea indirectă asupra mediului de cultură. Astfel, în mediile de cultură care au fost expuse la lumină solară sau la radiațiile UV, s-a găsit întotdeauna apă oxigenată, rezultată din oxidarea apei, oxidare produsă de raze, care constituie un toxic pentru microorganism.

Integritatea fizică a boabelor și învelișului produselor vegetale – factorul acesta asigură calitatea produselor în timpul conservării și face mai dificil atacul mucegaiurilor.

In mod natural produsele cerealiere sunt protejate de mediul exterior, de către tegumente care sunt o barieră foarte eficace împotriva atacului microorganismelor. Aceast aspect se reduce după recoltare, deoarece ȋnvelișul protector poate fi lezat sau chiar distrus. Structura internă reprezentată de pereții celulozici, diminuează înmulțirea și deci proliferarea germenilor în masa produselor alimentare.

II.2. Influența factorilor intrinseci asupra apariției micotoxinelor

Natura substratului – este acceptat faptul că substratul optim este cel de tip glucidic. Mucegaiurile nu au restricții din punct de nutrițional, ele hrănindu-se cu micro și macro elementele care există în substratul unde se dezvoltă. De exemplu aflatoxina este secretată mai ales pe amidon, iar zearenona preferă substratul celulozic.

Acțiunea pH-ului asupra creșterii microorganismelor se manifestă ȋn trei direcții legate de mediu, permeabilitatea membranei și activitatea metabolică. Ph-ul acid, prezența ionilor de magneziu favorizează formarea de compuși insolubili iar la pH bazic, zincul, calciul și ionii ferici sunt complexați. Sub această formă acești ioni indispensabili ca și cofactori ai enzimelor sunt dificil de folosit.

Nutrienți minerali – microorganismele, au nevoie pentru dezvoltare de apă, o sursă de energie, de azot, de săruri minerale și eventual de oxigen și/sau factori de creștere. Produsele alimentare conțin în general toți nutrienții necesari dezvoltării microorganismelor, dar diferențele de compoziție observate au un efect selectiv asupra florei microbiene.

Potențialul de oxido-reducere (O2/CO2) – acțiunea oxigenului asupra metabolismului microbian se poate manifesta mai ales prin modificarea potențialului de oxido-reducere. Majoritatea mucegaiurilor sunt aerobe și din acest motiv au nevoie de O2 pentru a crește și pentru reacțiile lor metabolice. Barrios si col. (1996) au arătat că inocularea bacteriilor lactice cu trei zile înaintea inoculării lui Aspergillus parasiticus provoacă o diminuare a creșterii și producției de micotoxine. Acest fenomen are un efect de competiție pentru substrat și pH.

Efectul microflorei acționează asupra acumulării toxinelor. În termen ecologic, există o competiție pentru substraturi: doar sursele foarte competitive și care posedă un vast spectru de substraturi metabolizabile se dezvoltă. Insectele intervin indirect în producția de micotoxine, ele fiind vectorii sporilor. În plus, insectele pătrund în zonele interioare ale grânelor prin distrugerile pe care le produc. Astfel contaminarea după recoltare a unor produse cum sunt alunelor și porumbului cu Aspergillus flavus este corelată cu un atac al insectele care pot fi prezente în spațiile de depozitare creând o contaminare importantă și în consecință constituie o cauză a prezenței micotoxinelor.

CAPITOLUL III

METODE DE LIMITARE ȘI REDUCERE A CONȚINUTULUI ÎN MICOTOXINE A UNOR PRODUSE ALIMENTARE DE ORIGINE VEGETALĂ

III.1. Strategii preventive: limitarea contaminanților

Sistemul HACCP, o metodă pentru protecția igienico – sanitară a alimentelor, reprezintă unul dintre procedee care pot să garanteze calitatea igienico – sanitară ȋn domeniul alimentar și care a întrunit sufragiile majorități organismelor internaționale în domeniu. Sistemul HACCP face posibilă prevenirea contaminărilor și/sau reducerea la un nivel acceptabil a potențialelor riscuri inerente procesului productive sau produsului finit.

Este greșit să se considere că sistemul HACCP reprezintă o metodă care determină eliminarea în totalitate a riscurilor pentru obținerea de alimente sigure, el poate să reducă riscurile până la un nivel acceptabil. Sistemul se bazează pe dezvoltarea unei strategii de prevenire, de control, de bune practice industriale și control al calității la toate etapele producției. Presupune punerea în evidență a punctelor de risc, ca și a punctelor critice, punerea la punct a soluțiilor finale de luptă, ca și dezvoltarea metodelor de verificare.

Echipa HACCP au drept scop studierea prezenței micotoxinelor care sunt periculoase pentru sănătatea umană. În același timp trebuie să fim conștienți de faptul că micotoxinele nu pot fi ȋndepărtate complet din alimentele contaminate nu se poate realiza complet ȋn prezent, măsurile trebuie să se refere la minimizarea prezenței lor prin diverse metode cum sunt bunele practice agricole, funcție de cultură, climat și practice agricole locale.

Astfel rotirea culturilor constituie în general un mod eficace de a reduce riscul contaminării în funcție de sursa fungică și specia cultivată. Pe cât este posibil, culturile trebuie să fie planificate pentru a evita condițiile climatice care prelungesc coacerea în câmp înainte de recoltare.

Trebuie să se evite pe cât posibil stresul plantelor. Există numeroși factori de stres: seceta, frigul, carențele în nutrienți și reacțiile nedorite între materialele folosite pentru cultură. Referitor la măsurile luate pentru a evita stresul plantelor, de exemplu irigațiiile, trebuie să se reducă la minim riscul ulterior de infestare fungică prin evitarea irigării prin stropire în timpul dezvoltării organelor florale. Irigarea este o metodă valabilă pentru reducerea stresului cauzat plantelor în anumite condiții de creștere. Un aport optim de nutrienți este esențial pentru a evita o „slăbiciune" a plantei, susceptibilă favorizării unei infestări cu mucegaiuri. Trebuie să se asigure un aport în nutrienți specifici plantei.

Evaluarea calității cerealelor înaintea recoltării, ținând cont de limitele unei eșantionări reprezentative și o analiză rapidă pe teren.

Separarea, dacă este posibilă, a cerealelor pe baza exigențelor calității pieței – de exemplu – pentru producția de pâine sau hrană pentru animale – și calitatea culturii vechi – umedă, curată sau uscată.

Recoltarea să se facă pe cât posibil atunci când conținutul de apă al plantei să fie adecvat. Întârzierea recoltării cerealelor deja contaminate cu mucegaiuri poate provoca o creștere sensibilă a conținutului de micotoxine în cultură. Trebuie să se țină cont de posibilitatea uscării în cazul în care cultura nu poate fi recoltată în condiții optime de conținut de apă. Trebuie să se evite pe cât posibil sfărâmarea mecanică a cerealelor și contactul cu solul în timpul recoltării. Cerealele cu boabe zbârcite și mici pot prezenta mai multe micotoxine decât cele cu dimensiune normală.

Trebuie să se determine conținutul de apă al culturii înaintea recoltării sau imediat după recoltare. Cerealele trebuie să fie uscate astfel încât conținutul în apă să fie inferior celui care va permite dezvoltarea mucegaiurilor în timpul depozitării. O activitate a apei inferioară valorii de 0,65 corespunde în general unui conținut în apă mai mic de 15%. Trebuie să se stabilească valori precise ale conținutului de apă, ținând cont de condițiile locale de depozitare. Este o necesitate pentru prevenirea dezvoltării unui anumit număr de specii fungice care se pot găsi în cereale înaintea uscării.

Dacă cerealele umede trebuie să fie depozitate fară să fie uscate, mucegaiurile se vor dezvolta în câteva zile și vor provoca reîncălzirea lor. Pentru mărfurile ambalate trebuie să se asigure că, sacii sunt curați și uscați și sunt așezați pe paleți sau au intercalat între ei un strat impermeabil.

Măsurarea temperaturii cerealelor depozitate la intervale determinate în timpul depozitării.

O creștere a temperaturii poate indica o dezvoltare microbiană și/sau o infestare cu insecte.

Scăderea temperaturii cerealelor rămase și aerarea este o metodă eficientă pentru a împiedica dezvoltarea mucegaiurilor

Evitarea pătrunderii insectelor, pasărilor și rozătoarelor în timpul transportului.

Totuși, aplicarea practicilor agricole nu este suficientă pentru a împiedica contaminarea. Strategiile de decontaminare sunt dezvoltate pentru a face față acestei probleme.

III.2. Strategii curative: decontaminarea

În conformitate cu reglementările FAO/OMS, procesele de decontaminare în vederea reducerii impactului toxicologic și economic al prezenței micotoxinelor în alimente, urmăresc:

să distrugă, să inactiveze sau să îndepărteze micotoxinele;

să nu producă sau să nu conducă la apariția unor reziduuri toxice, mutagene sau carcinogene în produsele supuse tratamentului decontaminant;

să nu modifice proprietățile senzoriale ale alimentului;

să asigure distrugerea sporilor fungici și a miceliilor care, în condiții favorabile ar putea biosintetiza;

micotoxine;

să fie accesibile tehnic și economic.

Reducerea aportului de micotoxine pentru organismul uman și animal, prin ingerare de alimente contaminate se poate realiza prin:

limitarea conținutului de micotoxine în furaje și produse alimentare;

inactivarea (reducerea toxicității) acestora în organismul uman sau animal.

Diminuarea prezenței micotoxinelor în produsele alimentare se poate realiza prin metode fizice sau chimice.

În cazul cerealelor și semințelor oleaginoase se pot aplica metodele fizice: separarea boabelor afectate, spălarea, măcinarea, extracția cu solvenți.

Separarea boabelor afectate – poate realiza manual, mecanic sau prin alte mijloace.

Spălarea boabelor – ca lichide de spălare pot fi utilizate apa distilată sau soluții de carbonat de sodiu. Spre exemplu, spălarea semințelor de orz, de trei ori, cu apă distilată, reduce conținutul în dioxinivelanol cu 65 – 69%. Îndepărtarea manuală a zonei din fruct afectată de mucegai, asociată cu spălarea cu apă distilată a fructelor, conduce la scăderea nivelului patulinei de la 2.335 la 55 ng/g.

Măcinarea – este o metodă prin care se poate reduce conținutul cerealelor în micotoxine. Distribuția toxinelor în diferite zone ale bobului permite obținerea, în timpul măcinării, a unor fracțiuni ce au conținut mai redus de micotoxine.

Extracția cu solvenți – au capacitatea de a dizolva și extrage micotoxinele din produse alimentare (arahide, semințe de bumbac): acetonă, soluție 90% în apă; etanol 95%; izopropanol, soluție 80% în apă; hexan – metanol; metanol-apă; acetonitril-apă; hexan-etanol-apă; acetonă-hexan-apă etc. Inconvenientul acestei metode constă, pe lângă costurile ridicate, în extracția simultană a unor componente din aliment, cu scăderea valorii biologice a acestuia.

Adsorbția pe substraturi solide – cărbunele activ și bentonita au fost experimentate în scopul reducerii conținutului în micotoxine al unor produse alimentare. Astfel, cărbunele activ, în concentrație de 3-5 g/l reduce semnificativ conținutul în patulină al sucului de mere.

Inactivare termică – este o metodă aplicabilă pentru reducerea contaminării cu micotoxine. Majoritatea micotoxinelor sunt relativ stabile la temperaturile la care sunt supuse în timpul procesului culinar convențional (80-121°C).

Iradierea alimentelor – tratamentul cu radiații ionizante (X, gama), aplicat inițial pentru decontaminarea fungică a produselor alimentare în depozite a fost extins și pentru degradarea micotoxinelor prezente în alimente. Inactivarea micotoxinelor prin gamairadiere este influențată de doza de radiații, tipul de aliment și natura micotoxinei.

Metode chimice de reducere

Utilizarea acizilor sau bazelor – Aflatoxinele B1 și G1 sunt transformate în mediu acid în semiacetali solubili în apă; tratamentul cu acid clorhidric (pH =2), timp de 24 h scade conținutul în AFB1 cu 20% ; după tratamentul cu acid clorhidric sau acid sulfuric 1%, AFB1 și AFB2 sunt distruse în procente de 13, respectiv 18%, baze organice sau anorganice. Efectul distructiv al altor baze (hidroxid de sodiu, hidroxid de potasiu, hidroxid de calciu) asupra micotoxinelor este mai redus decât cel produs de amoniac.

Utilizarea agenților oxidanți – peroxidul de hidrogen și ozonul au fost experimentați în scopul reducerii conținutului în micotoxine al alimentelor. Legăturile duble din structura unor aflatoxine (AFB1, AFG1, AFM1) sunt distruse sub acțiunea ozonului, în timp ce aflatoxinele AFB2, AFG2 și AFM2 sunt stabile în condiții identice de tratament. S-a raportat distrugerea totală a aflatoxinelor și G1 prin tratarea cu ozon de concentratie 2%; aflatoxinele B2 și G2 necesită concentrații de ozon de 20% pentru a obține aceleași rezultate. De asemenea, expunerea timp de 15 secunde la concentrații de ozon de 10% reduce concentrația de acid ciclopiazonic, aflatoxină, ochratoxină, patulină și zearalenonă la valori nedetectabile. În plus, tratamentul cu ozon reduce mutagenitatea aflatoxinelor.

Utilizarea agenților reducători – Bisulfitul de sodiu este un compus mult utilizat ca aditiv pentru numeroase alimente și băuturi datorită proprietăților antioxidante, de inhibare a alterării enzimatice și acțiunii bacteriostatice. Numeroase studii experimentale au demonstrat capacitatea sa de a micșora toxicitatea unor micotoxine, mai ales, a aflatoxinelor B1 și G1.

Utilizarea agenților de clorinare – soluțiile apoase de clor sunt utilizate în mod curent în industria alimentară pentru dezinfecția echipamentelor, dar și pentru spălarea unor materii prime (fructe, pește, carne) înaine de procesare. Clorul gazos și hipocloritul de sodiu distrug aflatoxinele; concentrații de clor de 10% în aer distrug până la 90% din aflatoxinele prezente în arahide.

Alături de aceste categorii de agenți chimici experimentați și chiar utilizați pentru detoxifierea produselor alimentare, numeroase alte substanțe active sunt folosite pentru distrugerea micotoxinelor: aldehida formică, permanganatul de potasiu, boratul de sodiu, metanolul (soluție 75%).

Utilizarea acestora în procesarea alimentelor este restricționată datorită problemelor de siguranță alimentară, în aliment ar putea să se acumuleze reziduuri nocive pentru organismul uman. S-a studiat capacitatea de reducere a conținutului de patulină în sucul de mere prin adăugare de tiamină, piridoxină și pantotenat de calciu.

Cercetările realizate au evidențiat că unele uleiuri esențiale, mai ales cele de scorțișoară și cuișoare au capacitatea de a limita producerea de micotoxine de către Fusarium, Penicillium verucosum, Aspergillus ochraceus, în funcție de condițiile de mediu. Butilhidroxi-toluenul, propil-parabenul, uleiul de scorțișoară și resveratrolul au redus cu până la 90% acumularea de dioxinivelanol și nivelanol în cereale (grâu).

Alternativa la utilizarea metodelor fizice și chimice de îmbunătățire a siguranței alimentelor prin reducerea conținutului de micotoxine este aplicarea metodelor biologice și microbiologice, succesele obținute în ultimii ani în biologia moleculară, ingineria genetică și genomica microbiană au permis abordarea cercetărilor privind potențialul catabolic al unor compuși de metabolism microbian.

Astfel, diferite culturi de fungi și-au dovedit capacitatea de a detoxifia aflatoxinele și ochratoxina în proporție de până la 100%.

PARTEA A II-A – EXPERIMENTALĂ

CAPITOLUL IV

SCOPUL LUCRĂRII

Micotoxinele prezintă un real pericol atât pentru animale cât și pentru om, și este obligatoriu ca manipularea probelor să se facă cu grijă și să se lucreze în condiții care să împiedice contaminarea materialelor și a atmosferei.

Rezultatul consumului de către animale a furajelor contaminate, care conțin de regulă mai multe micotoxine, este dat de riscul major ca, micotoxinele să ajungă în produsele alimentare de origine animală – ouă, lapte, carne.

În plus, anumite mucegaiuri care produc aceste substanțe sunt ele însuși toxice: este exemplul lui Aspergillus flavus și Aspergillus parasiticus pentru care s-au diagnosticat trei tipuri de simptome la om: infecție, alergie și toxicoză.

Scopul prezentei lucrări constă în:

stabilirea unei corelații cu privire la umiditatea semințelor conservate și evoluția activității microflorei de depozit;

stabilirea influenței tipului de substrat mediu CGA (cartof – dextroză – agar), mediu Sabourand (extract de drojdie – dextroză – cloramfenicol – agar), asupra evoluției agenților patogeni fungici;

condițiile specifice de depozitare pentru conservare pe mediu sunt: T= +4⁰C (± 1⁰C), umiditatea relativă a aerului = 30 – 40%, iar porcentul de umiditate al semințelor între 5 – 8% (Străjeru S.,și colab.2001).

În acest context, se impune nesesitatea dezvoltării capacității de determinare a conținutului de micotoxine pe întreg lanțul alimentar: plantă-animal-produse alimentare de origine animală.

În aceste sens se vor utiliza:

medii de cultură specifice: CGA, Sabourand;

termostat;

microscop.

CAPITOLUL V

MATERIALUL TESTAT

Materialul testat constă în:

probe de grâu Triticum aestivum Ssp. Vulgare, soi din varietatea Erythrospermum, Crișana;

probe de grâu Triticum aestivum ssp. vulgare, soi din varietatea Erythrospermum, Alex – Lovrin 50.

Primul soi de grâu Crișana a fost creat la SCDA Oradea. Este un soi semidardiv spre tardiv are o rezistență medie la condițiile de iernare și o rezistență bună la cădere, secetă și arșiță.

Soiul este sensibil la făinare mijlociu de rezistent la septorioza frunzelor, tolerant la o concentrație mai mare cu ioni de aluminiu.

Se încadrează în grupa soiurilor cu însușiri pentru panificație foarte bune.

Al doi-lea tip de soi Alex – Lovrin 50 a fost creat la SCA Lovrin. Acesta este un soi semitimpuriu, zonat în câmpia din vestul și sudul țării. ([NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], 2006, Tehnici de cultură și protecție a cerealelor și leguminoaselor, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT])

Probele pentru determinări au fost prelevate în luna iulie 2013.

În figura V.1 sunt prezentate probele testate.

Figura V.1 – Material testat: grâu

CAPITOLUL VI

METODE UTILIZATE ÎN DETERMINĂRI

VI.1.Pregătirea preliminară a probelor

Materialul biologic ales este reprezentat de populații locale și soiuri ce aparțin la o specie de cereale ( Triticum aestivum), cu două soiuri: Crișana și Alex – Lovrin 50.

În cadrul fiecărui soi s-au constituit 3 probe de 100 semințe din fiecare soi: semințele au fost conservate timp de 5 zile la temperatura de + 27,5⁰C (pentru Triticum aestivum) pentru ambele soiuri.

Majoritatea probelor de semințe provin din aceeași categorie biologică (populații locale).

Pentru probele de semințe studiate s-au folosit metodele clasice de analiză metoda pe mediu CGA (cartof – dextroză – agar) și metoda Sabourand (extract de drojdie – dextroză – cloramfenicol – agar).

Pentru a face posibil acest studiu de evaluare a micromicetelor prezente pe cariopsele de cereale precum și pentru probele analizate s-au aplicat următoarele metode:

Analiza macroscopică a seminței;

Metoda mediului CGA (cartof – dextroxă – agar);

[NUME_REDACTAT] (extract de drojdie – dextroză – cloramfenicol – agar).

VI.2.Metode calitative

Există trei tipuri de metode analitice pentru evidențierea micotoxinelor și evaluarea lor aproximativ calitativă:

Metode de screening rapid;

Metode de screening cromatografic și biologic;

Teste de confirmare.

Teste de screening rapid

Testul de câmp întunecat

Testul de câmp întunecat este o metodă de teren, simplă din punct de vedere tehnic, putând fi aplicată și la nivelul silozurilor, de persoane cu pregătire medie. Se folosește pentru detectarea și determinarea semicantitativă a aflatoxinelor din boabele de porumb, grâu, ovăz, sorg, soia, orez, arahide. Principiul acestei metode se bazează pe proprietatea aflatoxinelor de a emite fluorescență în lumină UV de 254-366 nm. Pentru a putea pune în practică acest test avem nevoie de o lampă generatoare de UV cu lungimea de undă de 254-366 nm și o cameră obscură fixă sau portabilă. Limita minimă de detecție este de 10 ppb.

Metodologia de lucru: Se cântăresc 100 g boabe din proba medie de examinat, se aleg boabele sparte de cele întregi, cântărindu-se separat. Boabele întregi se decojesc și se evidențiaza embrionul. Boabele pregătite se așează cu embrionul în sus pe un platou, se introduc în camera obscură a cabinetului UV și se examinează. Se separă boabele fluorescente de cele nefluorescente. Fluorescența galbenă-verzuie indică prezența aflatoxinelor, acesta este vizibilă când în substrat există minimum 10 ppb. Acest test are numai o valoare orientativă, motiv pentru care probele pozitive trebuie examinate prin cromatografie. Testul nu poate fi folosit pentru determinări la probele alimentare, altele decât boabele, și nici la probele recoltate de la bolnavi (Coman I și Popescu O., 1985).

Testele de minicoloană

Testele de minicoloană sunt procedee rapide de screening pentru micotoxine, se folosesc la nivelul depozitelor pentru examinarea boabelor de cereale și oleaginoase pentru detectarea și determinarea semicantitativă a aflatoxinelor și ochratoxinei A, având o sensibilitate de 4 ppb respectiv 8 ppb.

Minicoloana pentru determinarea aflatoxinelor este un tub de sticlă nefluorescentă cu lungimea de 150 mm și cu diametrul de 8 mm, în care se introduce ca umplutură florisil (100-200 mesh) cu înălțimea de 15 mm la partea inferioară și alta de 15 mm cu oxid de aluminiu neutru la partea superioară.

Minicoloana pentru determinarea ochratoxinei A este construită dintr-un tub de aceeași dimensiune umplut pe o înălțime de 60 mm cu florisil.

Reactivi:

solvenți de extracție: metanol – apă 8:2 (v/v);

soluție de spălare: sulfat de zinc (150 g), apă distilată până la 1.000 ml;

soluție hexan – acetonă 8:2 (v/v);

benzen chimic pur, alcool metilic 80%, acid sulfuric 0,25 N.

Tehnica de lucru:

La boabele de cereale măcinate fin, se adaugă solventul de extracție după care se agită între 2 – 5 minute, prelungindu-se timpul de extracție în cazul semințelor oleaginoase între 5 – 10 minute. Proporția de 1:2 între greutatea probei și volumul solventului de extracție trebuie respectată. Se filtrează prin hârtia de filtru și se rețin 15 ml într-o eprubetă cu dop rodat. Se adaugă 15 ml soluție de spălare după care se agită. Amestecul se filtrează printr-un disc de fibră de sticlă, reținându-se 15 ml filtrat.

Trei mililitri benzen se introduc, se închide eprubeta și se agită din nou, după care se lasă în repaus pentru separarea straturilor. Din stratul superior benzenic se recoltează 1 ml cu pipeta și se transferă la partea superioară a minicoloanei pentru aflatoxină. Se racordează partea inferioară la o pompă de vacuum. După ce benzenul a fost aspirat se adaugă la partea superioară a coloanei 5 ml soluție hexan-acetonă și se aspiră din nou timp de 2 minute. Minicoloana se examinează în lumină UV de 366 nm. Prezența unui inel cu fluorescență albastră, discretă, la interfața dintre florisil și alumină indică prezența în probă a aproximativ 4 ppb aflatoxină. Atunci când intensitatea fluorescenței inelului este mai mare, extractul benzenic se diluează până fluorescența devine discretă. Ținând seama de factorul de diluție se calculează concentrația reală a aflatoxinei în proba examinată.

În cazul determinării ochratoxinei A, se adaugă 1 ml din soluția benzenică rămasă pe minicoloana corespunzătoare acestui tip de micotoxină, care fusese în prealabil racordată la vacuum. Se adaugă 3 ml alcool metilic, după ce benzenul a fost aspirat, la partea superioară a coloanei și se continuă vacuumarea timp de 15 – 20 secunde. Sursa de vacuum se îndepărtează și se adaugă 0,3 ml acid sulfuric 0,25 N după care se examinează minicoloana la lumină UV de 366 nm.

Apariția unei benzi albastre fluorescente discrete la aproximativ 1 cm de limita superioară a stratului de florisil arată o concentrație de aproximativ 8 ppb ochratoxină A la probele de porumb, orez sau arahide și de aproximativ 16 ppb la probele de orz, grâu, sorg sau secară.

Pentru o probă timpul mediu de lucru este de aproximativ 15 minute pentru screeningul ambelor micotoxine (Coman I.,și colab., 2007).

Testele de tip card

Avantajele acestor metode sunt ușurința în execuție, expeditivitatea și investițiile mici în aparatură.

Probele pozitive, fiind teste calitative, trebuiesc analizate în continuare prin proceduri cantitative, care sunt mult mai costisitoare.

Metode de screening cromatografic

Sunt metode de înaltă eficacitate, de precizie și de confirmare.

Executarea acestor procedee implică laboratoare cu dotări tehnico-materiale superioare și personal bine instruit.

Cromatografia în general și cromatografia în strat subțire în special este o metodă foarte utilă de analiză micotoxicologică în scopul identificării precise cu micotoxine standard de referință și rapide a micotoxinelor în probele de analizat (alimente, furaje, extracte de miceți potențial toxigeni etc.).

Există multe metode de screening cromatografic pentru micotoxine, însă pentru diagnosticul micotoxicologic sunt de preferat metodele care permit separarea și identificarea simultană a micotoxinelor în probele de analizat.

Principiul metodei

Principiul metodei constă în izolarea micotoxinelor prezente în substrat prin extracție cu solvenți organici, după care se face separarea pe plăci cromatografice și identificarea lor pe baza culorii fluorescenței și a valorii Rf – ului, în lumina UV cu lungimea de undă de 254 – 366 nm.

Metodele fizice, chimice sau fizico-chimice se folosesc pentru confirmare. Sunt de preferat primele pentru că sunt mai simple și expeditive (Coman I. și colab.,2007).

Pregătirea probelor

Se cântăresc probele la balanța analitică. Se va folosi apa dublu distilată sau deionizată, iar reactivii folosiți trebuie să fie în termenul de valabilitate.

Aparatura și reactivii folosiți

Aparatura:

Cameră obscură pentru vizualizare în UV cu lungimea de undă de 254 – 366 nm

Balanță tehnică

[NUME_REDACTAT] magnetic

Tanc pentru cromatografie sau cameră cromatografică cu capac de etanșeizare

[NUME_REDACTAT]

Baie de apă

Micropipete automate de 20 µl și vârfuri mobile din material plastic

Microseringă de 5 µl

Cilindri gradați de 50 ml, 100 ml, 250 ml

[NUME_REDACTAT] de filtru

Plăci cromatografice

Pâlnii de separare

Tampoane din material textil

Reactivi necesari: acetonă, metanol, alcool absolut, cloramină, apă oxigenată, sulfat de sodiu anhidru, hipoclorit de calciu, amidon, ALL-Dec FORTE (Coman și colab. I., 2007).

Micotoxine standard

Aflatoxina B1 0,25 – 0,50 µg / ml benzen

Aflatoxina B2 0,25 – 0,50 µg / ml benzen

Aflatoxina G1 0,25 – 0,50 µg / ml benzen

Aflatoxina G2 0,25 – 0,50 µg / ml benzen

Amestec de aflatoxine 0,5 – 1,0 µg / ml benzen, ochratoxina A 10 µg / ml benzen, sterigmatocistina 10 µg / ml benzen, zearalenonă 0,1 – 1,0 µg / ml benzen, citrinină 0,5 – 1,0 µg / ml cloroform.

Micotoxinele etalon dizolvate în solvenți specifici vor fi menținute la frigider la o temperatură de 4ºC.

Sistem de solvenți pentru extracția micotoxinelor:

Cloroform : apă, 85 : 15 (v / v)

Clorură de metilen : apă, 85 : 15 (v / v)

Acetonă : apă, 85 : 15 (v / v)

Alcool metilic : apă, 85 : 15 (v / v)

Sistem de solvenți de developare toluen : acetat de etil : acid formic, cu o proporție de 6 : 3 : 1 (v / v / v)

Solvenți pentru degresare: eter de petrol

Solvenți de etalare: benzen, acetonitril, cloroform, clorură de metilen, acetat de etil sau benzen – acetonitril, 98 : 2 (v/v)

Amestec de diazotare:

– soluția 1 : 0,5 g benzidină se introduc într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 20 ml apă, 1,5 ml acid clorhidric concentrat, după care se aduce la semn cu apă bidistilată.

– soluția 2 : 10 g azotit de sodiu se introduc într-un balon cotat de 100 ml și se aduce la semn cu apă bidistilată.

Cele două soluții se amestecă în momentul folosirii în proporție de 1 : 1 (v / v). La început amestecul este de culoare portocalie închis, însă după câteva minute devine galben pal.

Soluție paraanisaldehidă: metanol – acid acetic glacial – acid sulfuric concentrat – p – anisaldehidă 85 : 10 : 5 : 0,5 (v / v / v / v).

Soluție etanolică de clorură ferică 1%

Soluție apoasă de KOH 20% (Coman I. și colab., 2007).

Tehnica de lucru

Degresarea, extracția și purificarea probei

Din proba măcinată se introduc într-un pahar Berzelius sau Erlenmeyer de 500 ml, 100 g din probă, la care se adaugă o cantitate dublu de sovent de degresare și se pune 30 de minute pe un agitator magnetic, după care se decantează, se îndepărtează solventul. Se adaugă peste proba degresată 200 ml solvent de extracție, se lasă la întuneric 6 ore când extracția se face la rece, agitând conținutul balonului. Se adaugă 10 g sulfat de sodiu anhidru, după care se filtrează prin hârtia de filtru. Se evaporă la sec extractul obținut într-un rotavapor sau pe o baie de apă termoreglabilă cu temperatura de 60 – 65ºC (Coman I. și colab., 2007).

Pregătirea plăcii și a tancului cromatografic

Vasul (tancul) de developare trebuie pregătit înaintea cromatoplăcii, deoarece în interiorul acestuia trebuie să se realizeze o atmosferă saturată în vapori cel puțin 30 de minute înaintea introducerii plăcii. Pentru aceasta, partea interioară a tancului se căptușește cu hârtie de filtru, care se îmbibă cu solvenți de developare, după care se introduce amestecul de solvenți, care asigură migrarea fracțiilor fluorescente într-o cantitate al cărui nivel nu trebuie să depășească 0,5 cm înălțime. Tancul se acoperă cu capacul de etanșeizare după care se lasă în repaus pe o suprafață plană (Coman I. și colab., 2007).

Pregătirea plăcii cromatografice începe odată cu activarea acesteia prin introducerea ei în etuvă la temperatura de 110 – 115ºC. După 30 de minute pe placă se marchează discret linia de start, la aproximativ 2 cm de la marginea inferioară a plăcii, unde vor fi etalate extractele brute și micotoxinele standard. De la linia de start se trasează în plan vertical cu ajutorul unui obiect ascuțit (bisturiu), la o distanță de aproximativ 0,8 cm una de cealaltă respectiv de marginile plăcii, liniile care vor marca pozițiile individuale de migrare ale solventului de irigare, care antrenează și substanțele dizolvate, inclusiv micotoxinele.

Se introduc câte 500 µl soluție de etalare în baloanele în care s-a realizat evaporarea solventului de extracție. În mijlocul fiecărui culoar de irigare, la linia de start, se spotează cu o micropipetă micotoxinele standard, în alternață cu extractele produselor în următoarea configurație descrisă de (Coman I. și colab., 2007)

În prima poziție se etalează 5 µl aflatoxină B1 și 5 µl soluție etalon de sterigmatocistină

În poziția a doua se aplică 5 µl soluție etalon de aflatoxină B2 și 5 µl soluție etalon de zearalenonă

În poziția trei se aplică 10 µl soluție din prima probă

În poziția nr. patru se spotează 5 µl soluție etalon de aflatoxină G1 și 5 µl soluție etalon de zearalenonă

În poziția a cincia se aplică 5 µl soluție etalon de aflatoxină G2

În mijlocul culoarului al șaselea se spotează 10 µl din proba a doua

În poziția a șaptea se spotează 5 µl din amestecul celor patru aflatoxine (B1, B2, G1, G2)

În poziția a opta se etalează 5 µl soluție de citrinină

În poziția a noua se spotează 10 µl din proba a treia

În poziția a zecea se spotează 10 µl din proba a patra

În poziția a unsprezecea se spotează 5 µl din amestecul de aflatoxine, sterigmatocistină, zearalenonă

În poziția a douăsprezecea se etalează 5 µl de citrinină.

Se marchează cu un creion fiecare culoar al plăcii cromatografice, în partea superioară a acesteia, cu abrevierea micotoxinelor și numărul probei.

Placa pregătită se introduce în tancul cromatografic astfel încât, marginea inferioară a plăcii, unde a fost etalat materialul de examinat, să coboare în solventul de irigare până la înălțimea de 0,5 – 0,6 cm. Aceasta se menține în tanc până când frontul solventului de irigare ajunge la 1 – 2 cm de limita ei superioară. Placa se scoate din tanc, se usucă excesul solventului în curent de aer cald timp de câteva minute, notându-se cu vârful creionului limita până la care a migrat solventul de irigare.

Pentru a fi examinată placa se introduce în camera obscură la lumină UV cu lungimea de undă de 254 – 366 nm (Coman I., și colab., 2007).

Identificarea micotoxinelor

Plăcile cromatografice sunt analizate în lumină UV și se notează cu vârful unui creion zona centrală a spoturilor, care au aceeași fluorescență cu micotoxinele standard, precum și zonele centrale ale acestora, deoarece identificarea micotoxinelor se face prin coroborarea culorii fluorescenței spotului în lumină UV cu valoarea Rf-ului. Raportul zonelor de fluorescență se calculează cu ajutorul relației:

Rf = d1 / d2 , în care:

d1 – distanța de migrare în mm a micotoxinei de la linia de start până la nivelul spotului (central zonei de fluorescență)

d2 – distanța dintre linia de start și linia până la care a migrat solventul de irigare (mm).

Teste de confirmare

Nesiguranța testelor de screening poate fi redusă prin testele de confirmare. Atât testele se screening cât și cele de confirmare sunt calitative, însă cu roluri diferite, primele permit descoperirea probelor presupuse pozitive, iar testele de confirmare separă pe cele adevărat pozitive de cele fals pozitive.

Testele de confirmare se pot face prin metode fizice, chimice sau fizico-chimice fie în situ pe placa cromatografică fie în afara acesteia. Mai uzuale sunt primele, deoarece sunt expeditive și simple.

Testul de confirmare urmărește descoperirea unei sau a unor proprietăți fizico-chimice a unei substanțe presupusă a fi micotoxină identică sau identice cu ale micotoxinei standard corespunzătoare. Identificarea micotoxinelor se face pe baza culorii fluorescenței spoturilor din proba de analizat pe baza valorii Rf-ului în funcție de rezultatul metodei standardului intern. [NUME_REDACTAT]-ului sunt doar orientative și trebuie determinate de fiecare dată când se analizează o probă, utilizând micotoxinele standard de referință pe aceeași placă cromatografică. Când se analizează o probă alături de micotoxina standard de referință și în probă se descoperă mai multe spoturi apropiate, cu florescență și Rf-uri asemănătoare, este dificil de identificat o anumită micotoxină.

Testele fizice de confirmare urmăresc evidențierea unor proprietăți fizice comune spotului presupus a fi micotoxina căutată și a spotului micotoxinei standard corespunzătoare.

Testele chimice implică separarea extractelor de probă pe plăci cromatografice cu strat subțire urmată de derivatizarea in situ a spoturilor fluorescente cu anumiți reactivi care modifică culoarea fluorescenței inițiale.

Testele fizico-chimice sunt mai complexe și presupun o dotare specială a laboratorului. Cele mai utilizate metode sunt cromatografia în fază de gaz-lichid și spectroscopia de masă.

Confirmarea micotoxinelor prin teste de derivatizare

În aceleași condiții de lucru aceeași micotoxină are o anumită fluorescență în lumină UV de 254 – 366 nm și o anumită valoare Rf. Dacă se analizează o probă alături de micotoxina standard iar în probă se descoperă mai multe spoturi apropiate cu fluorescență și Rf-uri asemănătoare este dificil de identificat o anume micotoxină. Pentru aceasta derivatizarea poate fi un test de clarificare. În acest sens placa cromatografică, după ce a fost vizualizată în camera obscură, unde zonele incerte au fost identificate cu un marker, este retrasă, iar suprafața ei se pulverizează cu o soluție de derivatizare. Placa se introduce după pulverizare în etuvă, timp de 2 – 3 minute, la o temperatură de 60ºC. Aceasta va fi examinată din nou în lumină UV iar dacă fluorescența are modificări asemănătoare celor din etaloane poate fi confirmată prezența micotoxinei în proba analizată (Coman I. și colab., 2007).

Tehnica standardului intern

La linia de start a plăcii cromatografice se spotează un volum precis din proba cu rezultate incerte, în două puncte apropiate (1 și 2) și un volum precis de soluție standard de aflatoxină B1 (a cărei prezentă este suspectată), cu concentrația cunoscută, în două puncte separate, din care unul într-un punct în care a fost spotată proba de analizat (2), iar celălalt într-un punct separat apropiat (3).

Dacă aflatoxină B1 este prezentă în proba de analizat, atunci se va obține un spot cu o fluorescență corespunzătoare micotoxinei din punctul 1, iar în punctul 2 un spot mai mare sau mai strălucitor, corespunzător sumării cantităților celor 2 aflatoxine din proba de analizat și din proba standard , iar în punctul 3 un spot corespunzător ca intensitate și culoare aflatoxinei B1 standard.

Atunci când micotoxina căutată în probă nu este aflatoxina B1 în punctul 1 se obține o fluorescență asemănătoare aflatoxinei B1, dar cu Rf diferit, iar în punctul 2 două spoturi separate unul corespunzător aflatoxinei standard, iar celălalt unei substanțe fluorescente oarecare prezentate în probă, iar în punctul 3 un spot identic cu al aflatoxinei standard (Coman I. și colab., 2007).

VI.3.Metode cantitative

Determinarea micotoxinelor din produsele alimentare și furajere folosind metode rapide, moderne, test care nu necesită aparatură și echipamente costisitoare. Aceste metode au însă inconvenientul că în cazul în care rezultatele sunt pozitive, acestea trebuiesc confirmate prin examene mult mai complicate și cu aparatură performantă.

CSS și GC sunt înlocuite treptat cu metode mai dificile, mai complexe, cu aparatură mai precisă, mai sigure precum HPLC și LC/MS (Coman I. și colab., 2007).

HPLC este o metodă foarte utilizată pentru detectarea micotoxinelor, este o metodă sigură, necesită timp, aparatură scumpă și personal calificat.

Cromatografia în strat subțire permite separarea și identificarea micotoxinelor prezente în substraturile alimentare (Coman I. și colab., 2007).

Testul imunoenzimatic ELISA este superior cromatografiei în strat, deoarece permite evaluarea cantitativă a micotoxinelor din substraturi până la nivel de ppt, necesită consum mic de materiale, este expeditivă, poate fi automatizată.

Sunt mai multe variante tehnice de realizare a testului imunoenzimatic ce are la bază utilizarea anticorpilor specifici pentru micotoxina incriminată și interpretarea rezultatelor pe baza unei reacții de culoare detectabilă cu ochiul liber sau cu un fotometru (Baicu T., Șesan T. 2007, citat de Coman I. 2007).

Etapele testului ELISA sunt descrise de Baicu T., Șesan T. (2007) și citate de Coman I. și col. (2007) astfel:

etapa I – se adaugă standardele sau probele de analizat în sistemul de lucru

etapa a II a – se introduce conjugatul enzimatic

etapa a III a – se adaugă anticorpul specific

etapa a IV a – începe reacția cu stabilirea unor echilibre dinamice între standarde sau probă și conjugatul enzimatic în postură legată sau nelegată

etapa a V a – se îndepărtează reactivii aflați în exces prin trei spălări succesive

etapa a VI a – îndepărtarea totală a reactivilor

etapa a VII a – se adaugă substratul specific, care în prezența enzimei produce un element colorat

etapa a VIII a – se adaugă soluția de stopare, culoarea apărută este măsurată cu ajutorul unui fotometru

etapa a IX a – se tratează curba standard de etalonare și se interpretează rezultatele, concentrația micotoxinelor fiind exprimată în ppb.

Principiul metodei constă în interacțiunea dintre anticorpii anti-IG care căptușesc godeurile plăcii și antigenii din proba suspectă.

CAPITOLUL VII

REZULTATELE DETERMINĂRILOR PRACTICE

Analiza calitativă

Materialul biologic ales și care a fost prezentat la Cap V a fost supus determinărilor calitative după cum se prezintă mai jos.

În cadrul fiecărui soi s-au constituit 3 probe de 100 semințe din fiecare soi: semințele au fost conservate timp de 5 zile la temperatura de + 27,5⁰C pentru ambele soiuri, în etuvă (figura VII.1)

Figura VII.1 – Conservarea semințelor timp de 7 și 14 zile

Înmulțirea, creșterea și activitatea de degradare a micromicetelor parazite și saprofite sunt favorizate de condițiile de depozitare în care trăiesc, cum ar fi:

substratul nutritiv unde se dezvoltă masa de semințe;

temperatura și lumina;

umiditatea relativă din atmosfera depozitului și dintre spațiile intergranulare;

ventilația aerului și compoziția atmosferei de depozit (Stăjeru S., și colab.).

Analiza microbiologică este indispensabilă atât pentru a asigura produsului o calitate și o conservabilitate mai bună, cât și pentru a garanta calitatea igienică și siguranța consumatorilor.

Pentru tehnicile de analiză microbiologică, cantitative și calitative s-au cumpărat cereale destinate consumului uman și animal.

Probele au fost evaluate calitativ pentru a studia gradul de contaminare cu mucegaiuri.

Pentru aprecierea aspectului coloniilor dezvoltate prin cultivarea boabelor de cereale pe medii selective (Mediul CGA și Saubourand, (figura VII.2)), în condiții de aerobioză la temperatura de 27,5˚C, s-a efectuat evaluarea calitativă.

Figura VII.2 – Mediile de cultură

Mediile de cultură au fost fluidificate repartizate în plăci Petri (figura VII.3). După solidificarea mediului se adaugă în fiecare placă cu o pensetă sterilă boabe de grâu. Plăcile sunt termostatate la 27,5°C timp de 5 zile.

Figura VII.3 – Mediile de cultură fluidificate repartizate în plăci [NUME_REDACTAT] de mucegai dezvoltate după 5 zile (figura VII.4,5) în plăcile Petri sunt izolate și analizate microscopic.

Figura VII.4 – Coloniile de mucegai dezvoltate la soiul Crișana după 5 zile

Figura VII.5 – Coloniile de mucegai dezvoltate la soiul Lovrin după 5 zile

După termostatare s-a observat că gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai este diferit, dar ridicat la ambele soiuri testate ( tabel VII. 1).

Astfel din 3 probe de grâu a câte 100 semințe, din soiul Crișana analizat, 70% au fost contaminate cu mucegai, și din 3 probe de grâu, soiul Lovrin, 90% au fost contaminate cu mucegai.

Tabel VII. 1

Gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai

Identificarea microscopică s-a realizat cu ajutorul preparatelor umede.

Principalele etape pentru executarea unui preparat umed:

pregătirea lamei și lamelei – lama curată și degresată se sterilizează trecând ambele fețe prin flacăra becului de gaz. Lamela se șterge cu hârtie de filtru;

realizarea suspensiei de celule pe lamă – se depune o picătură de apă sterilă pe lama de sticlă sterilizată, în zona centrală. Pentru recoltarea celulelor aflate în medii lichide se folosește ansa sau pipetă sterilă, iar pentru recoltarea microorganismelor aflate pe medii dense (solide sau solidificate) se folosește firul metalic.

realizarea preparatului între lamă și lamelă – după obținerea suspensiei de celule, lamela curată se sprijină și se deplasează pe lamă la un unghi de 45°, până când devine tangentă la picătură, apoi se lasă să cadă peste aceasta. Lichidul în exces se absoarbe pe marginile lamelei cu hârtie de filtru.

Un preparat bun nu trebuie să prezinte bule de aer, acestea putănd determina aglomerări de celule și îngreună studiul preparatului microscopic.

După analiza microscopică a coloniile de mucegai dezvoltate pe mediul de cultură după perioada de termostatare s-a observat prezența următoarelor specii de mucegai (figura VII. 6):

Penicillium sp.

Penicillium notatum

Trichoderma sp.

Fusarium sp.

Aspergillus flavus.

Thricothecium sp.

Figura VII.6. Analiza microscopică a coloniile de mucegai dezvoltate pe medii de cultură

Toate aceste specii de ciuperci saprofite și parazite au apărut la probele Triticum aestivum – Crișana și primele cinci dintre ele la probele de Triticum aestivum – Lovrin analizate. Pe aceeași sămânță sunt prezente mai multe microorganisme fungice care au atacat învelișulire exterioare ale seminței sau au produs infecții în interior la nivelul embrionului, fără ca acestea să determine diminuarea accentuală a facultății germinative a semințelor.

Distribuția speciilor de mucegai pe cele două tipuri de probe testate este prezentată ȋn graficele din figura VII.8. și VII.9, separat pentru cele două soiuri de grâu ce au fost supuse testării.

Figura VII.8. Principalele specii de mucegai prezente pe grâu, soiul [NUME_REDACTAT] VII.9. Principalele specii de mucegai prezente pe grâu, soiul [NUME_REDACTAT] observă faptul că incidența speciilor de mucegai este foarte diferită, la soiul Crișana situându-se ȋntre 6 și 40% iar la soiul Lovrin ȋntre 4 și 60%. În probele de grâu, soiul Crișana procentul cel mai mare l-a avut Aspergillus flavus (40%) ca și în probele din soiul Lovrin unde acest mucegai a fost majoritar (60%).

În graficul din figura VII.10 este prezentată comparativ incidența tuturor mucegaiurilor identificate ȋn cele două specii de grâu testate.

Figura VII.10. Incidența mucegaiurilor in speciile de grâu

Speciile de mucegaiuri Penicillium sp. (20% și 23%) și Trichoderma sp. (7% și 9%) sunt singurele a căror incidență este asemănătoare ȋn cele două specii de grâu testate.

Analiza cantitativă

În continuare am analizat în soiul Lovrin, concentrația de aflatoxină.

Pentru determinarea concentrației de aflatoxină, s-a utilizat un lot de 1.000 gr boabe grâu, soiul Lovrin, la care, punctul de pornire a fost determinarea umidității medii, 14,44% (cinci repetiții) cu aparatul [NUME_REDACTAT].

Din lotul de 1.000 gr boabe, s-au luat trei probe a câte 100 gr boabe grâu.

Proba 1 – umiditatea de 12,5%, (umiditatea de calculare a utilului de inregistrare standard în Romania) s-a realizat prin uscare, îndepartare a 1,94% conținut de apă.

Proba 2 – umiditatea de 15% s-a obținut prin adăugare 0,56 gr apă potabilă.

Proba 3 – umiditatea de 17% s-a obținut prin adăugare apă potabilă 2,56 gr.

Cele trei probe cu umidității diferite au fost depozitate în termostat patru zile, în atmosferă controlată de 27,5◦C, simulând o depozitare tampoon în perioada de recoltare a unor loturi de grâu recoltate la umidități diferite.

După cele patru zile, se trece la însămânțarea soluției apoase rezultate în urma spălării cerealelor din cele trei probe, pe mediu de cultura [NUME_REDACTAT] (figura VII.11).

Figura VII.11 – Mediu de cultura [NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] sunt introduse în termostat la temperatura de 27,5ºC, timp de 5 zile. Probele însămânțate în mediul de cultură, a verificat prezența sau absența, ciupercilor filamentoase, care produc aflatoxina. Filamentele fungice au fost studiate cu ajutorul microscopului optic, după colorarea cu albastru de metilen.

Speciile identificate au fost Aspergillus flavus.

După identificarea microscopică a prezenței fungilor care produc aflatoxina, s-au luat trei probe, din același lot, a câte 100 gr. boabe grâu, cu umidității diferite: 12,5%, 15%, 17%, care au fost depozitate în termostat 14 zile, în atmosferă controlată de 27,5ºC.

După 7 zile, evaluarea aflatoxinei, s-a făcut cantitativ, conform instrucțiunilor de lucru cu privire la determinarea aflatoxinei cu aparatul RIDA QUICK SCAN (figura VII.12).

Figura VII.12 – Aparatul RIDA QUICK SCAN

Concentrația determinată experimental pentru cele trei probe testate, ca și total aflatoxine, este menționată ȋn tabelelul VII. 2.

Tabel VII. 2

Concentrația de aflatoxină în probele de grâu

Ordinul 97/2005 prevede pentru cereale și produsele procesate din acestea pentru consum uman direct sau folosite ca și ingrediente alimentare, valori maxim admise diferite ȋn funcție de tipul de aflatoxină vizat. Astfel pentru aflatoxina B1 valoarea CMA este 2,0 ppb iar pentru suma aflatoxinelor B1 + B2 + G1 + G2 = 4,0 ppb. Prezența aflatoxinei M1 nu este admisă. În figura VII.13 sunt prezentate tipurile de aflatoxine avute ȋn vedere.

Graficul din figura VII.14 evidențiază faptul că două dintre probe se găsesc sub maximul impus de legislație pentru suma aflatoxinelor ȋn timp ce una dintre probe atinge această limită. Se observă faptul că proba care are cea mai mare umiditate prezintă și cea mai mare concentrație de aflatoxine.

Figura VII.13 – Aflatoxinele B1, B2, M1, M2, G1, G2

www.foodmate.net

Figura VII.14. Concentrația de aflatoxină în probele de grâu, soiul Lovrin

CONCLUZII

Experimentul urmărit ȋn prezenta lucrare conduce către următoarele concluzii:

Din punct de vedere calitativ:

După termostatare s-a observat faptul că gradul de contaminare a cerealelor cu mucegaiuri este relativ mare fiind identificat un număr maxim de șase mucegaiuri;

Dintre aceste mucegaiuri unele sunt producătoare de micotoxine, cum sunt cele din genul Aspergillus și Penicillium;

Incidența mucegaiurilor este diferită net ȋntre speciile de grâu testate;

Mucegaiul din genul Aspergillus flavus este predominant ȋn probele de grâu testate dar la nivele de contaminare diferite;

Se poate afirma faptul că soiul Lovrin este mai predispus la contaminare cu mucegaiuri ȋn general și cu cele producătoare de micotoxine ȋn special, decât soiul Crișana.

Din punct de vedere cantitativ:

Nici una din variantele testate nu a depășit valoarea CMA pentru suma de aflatoxine;

Umiditatea probelor testate influențează gradul de contaminare cu aflatoxine;

Aparatura avută la dispoziție nu permite aprecieri asupra tipului concret de aflatoxine și ponderea lor, comparația privește suma de aflatoxine determinate experimental.

BIBLIOGRAFIE

[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], Tehnici de cultură și protecție a cerealelor și leguminoaselor, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] – 2006

Baicu T., Seșan T., Fitopatologie agricolă, [NUME_REDACTAT], București – 2007

[NUME_REDACTAT], Elemente de toxicologie alimentară. Contaminanți chimici, [NUME_REDACTAT] din Oradea – 2009

Coman I., [NUME_REDACTAT], Miron L., [NUME_REDACTAT], Elemente de standardizare în micologie și micotoxicologie, [NUME_REDACTAT] – 2007

Coman I., Popescu O., Micotoxine și micotoxicoze, [NUME_REDACTAT], București – 1985

[NUME_REDACTAT], Gh. Popescu, Securitatea și calitatea produselor vegetale, siguranța vieții, [NUME_REDACTAT], Timișoara – 2009

Jean – [NUME_REDACTAT], Mycotoxins, IRNA, France – 2002

[NUME_REDACTAT], Ghid de laborator, Metode de analiză pentru produse alimentare, [NUME_REDACTAT], Iași – 2006

[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] Suciu, V. Florian, Effect of ear Fusarium infection on the maize yield and mycotoxin content, 11th [NUME_REDACTAT] seminar – fusarium – mycotoxins, taxonomy, pathogenicity and host resistace, 20-23 september, Radzikow, Poland, pag 287 – 2010

[NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT], Miceti si micotoxine, [NUME_REDACTAT] – 2007

Străjeru S., Murariu D., Popa M., Plăcintă D., Conservarea și utilizarea resurselor genetice vegetale, Suceava – 2001

Scuteanu E., Danielescu N., Popescu O., [NUME_REDACTAT]., Toxicologie și toxicoze, [NUME_REDACTAT] și Pedagogică, București – 2004

Tănase C, (2001), Micologie, [NUME_REDACTAT] [NUME_REDACTAT] Cuza, Iași – 2001

Tofană CLEMANSA TOFAN, Igiena și securitatea produselor alimentare, [NUME_REDACTAT] – 2011

*** Direcția generală pentru siguranța și igiena alimentară și nutriție – 2011

***www.agrifoodresearch.com

*** www.bercamihai.ro

***www.food-info.net/ro/qa/mycotoxins.htm

*** www.mycotoxins.org

***www.foodmate.net