CONSIDERAȚII GENERALE ASUPRA TRANSFUZIEI SANGUINE: [307456]

[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], nutrienți, [anonimizat], etc., [anonimizat] a deșeurilor.

Transfuzia sanguină este un element esențial de asigurare modernă a sănătății. [anonimizat]. [anonimizat], ea poate antrena complicații imediate sau cu întârziere. [anonimizat] a Sănătății prin Departamentul EHT (Departamentul de Tehnologii Esențiale ale Sănătății) este acela de a ajuta toate statele membre să asigure o [anonimizat]. Scopul transfuziei este de furniza pacientului compuși sanguini care să amelioreze statutul lor hematologic. Diverși compuși sanguini pot fi obținuți plecând de la o singură donare de sânge total. Cea mai mare parte a băncilor de sânge (Centre de transfuzie) sunt capabile de a separa eritrocitele de plasmă (CGR), sau de a prepara alte produse precum concentratele de plachete sau crioprecipitatele. Toate aceste produse sunt considerate «produse sanguine labile». [anonimizat]. [anonimizat] a [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat].

Conservarea viabilității și funcției celulare este o componentă esențială a [anonimizat], alături de o privire la viitoarele aplicații și instrumente care vor spori capacitatea noastră de a procesa, păstra și conserva eritrocitele (RBCs), [anonimizat].

În 1935 [anonimizat] o perioadă de 10 zile, [anonimizat] a [anonimizat].

Această perioadă este cu adevărat la originea transfuziei moderne prin 1) fracționarea plasmei, 2) elaborarea unei soluții de conservare a sângelui și 3) introducerea pungilor în plastic care au înlocuit flacoanele de sânge. Un moment de o [anonimizat], doi medici pun la punct «soluția de conservare ACD» [anonimizat], care permite conservarea sângelui total timp de 21 de zile. [anonimizat].

Dezvoltarea soluțiilor de conservare pentru stocarea RBCs în mediu lichid a fost facilitată de înțelegerea evolutivă a fiziologiei RBCs și a modificărilor biochimice și biomecanice care au loc în timpul depozitării hipotermice.

Pe parcursul duratei lor de viață, RBCs circulă supuse unor modificări metabolice și fizice asociate cu procesul de senescență, și sunt îndepărtate de către macrofagele fixe în sistemul reticuloendotelial. RBCs stocate în mediu lichid sunt supuse in vitro unui proces de senescență similar. Cu toate că depozitarea hipotermică încetinește procesele biochimice ale RBCs care au ca rezultat epuizarea stratului de nutrienți și acumularea de reziduri celulare, metabolismul celular nu este complet suprimat la aceste temperaturi. Seria de modificări biochimice și biomecanice care au loc în timpul depozitării la RBCs, reduce supraviețuirea in vivo și îndeplinirea funcției lor și poate fi rezumată prin termenul "leziune de stocare hipotermică".

Deși soluțiile suplimentare au extins stocarea RBCs sau a plachetelor la câteva săptămâni și respectiv 5 zile pentru trombocite, persistă necesitatea de a dezvolta tehnologii care pot permite stocarea produselor pentru o perioadă mult mai mare de timp.

Ne gândim că plachetele sunt simple fragmente celulare, însă acestea au o structură complexă, un aparat metabolic complicat și au o transformare extraordinară de la starea inactivă la cea activă. Expresia și gruparea suprafeței receptorilor glicoproteici plachetari influențează comportamentul lor; de aceea, membrana celulară și arhitectura acesteia trebuie să fie menținută la plachetele conservate, cu păstrarea funcției lor. Un mare număr de brevete și publicații au abordat problema structurii și au confirmat faptul că membrana care poartă receptorul glicoproteic Ib pentru factorul von Willebrand (vWF) este esențială pentru funcția hemostatică și aceasta trebuie să fie proprietatea centrală a plachetelor conservate.

Cercetările biomedicale actuale, conjugate cu biotehnologiile care se conturează, încearcă să rezolve criza de sânge actuală și să amelioreze calitatea produselor pentru transfuzie. Anunțul primei auto-transfuzii umane de eritrocite create plecând de la celule stem deschide noi alternative. Cercetătorii echipei profesorului Luc Douay, din Franța, au anunțat succesul transfuziei de globule roșii cultivate (GRc) utilizând celule stem hematopoietice (CSH), unui pacient, în anul 2011. Această premieră demonstrează că eritrocitele maturate “in vitro” au o durată de viață “in vivo” comparabilă eritrocitelor normale ce permite posibilitatea remedierii crizei mondiale de sânge din băncile de sânge și de asemenea diminuarea riscurilor de transmitere a virusurilor. Pas cu pas, medicina regenerativă bazată pe celule stem, alături de biotehnologiile moderne și creșterea celulelor în bioreactoare va asigura o producție la scară mare.

PARTEA I

CONSIDERAȚII GENERALE ASUPRA TRANSFUZIEI SANGUINE:

DIRECȚII de cercetare prezente ȘI Perspective

CAPITOLUL 1. NOȚIUNI GENERALE DESPRE TRANSFUZIA SANGUINĂ

Istoric

Transfuzia de sânge reprezintă unul din puținele tratamente folosite pentru restaurarea oxigenării țesuturilor atunci când se impune suplimentarea cantității de oxigen. Ea este larg folosită în zilele noastre în cazul pacienților care au suferit pierderi acute de sânge, a celor la care se manifestă o producere inadecvată la nivel de maduvă osoasă sau atunci când apare un fenomen de distrugere sporită a eritrocitelor. Pacienții cu sindroame mielodisplastice, anemie aplastică și/sau hemoglobinopatii sunt reprezentativi în grupul pacienților care depind de transfuzii pe termen lung, la fel și hemofilicii (Novotny, 2007).

În fiecare an în întreaga lume sunt colectate aproximativ 75 milioane unități de sânge iar dintre acestea, doar în Statele Unite sunt transfuzate 13,9 milioane unități (o unitate corespunde la aproximativ 500 ml concentrat globular), în Franța 3,15 milioane de unități iar pentru anul 2030 se prevede un necesar suplimentar de 4 milioane de unități.

La om, prima transfuzie a fost efectuată în anul 1667, când medicul Jean Baptiste Denis în Franța, și Richard Lower în Anglia au raportat separat transfuzii realizate cu succes de la animale, respectiv de la miel la om.

Fig. 1. Prima transfuzie de sange din 1667

(după www 1)

Transfuzia modernă a început în anul 1901 odată cu identificarea grupelor majore de sânge și a devenit ceva mai sigură după 1907 odată cu folosirea tehnicii de aglutinare la testele de compatibilitate.

1. 2. Tipuri de transfuzie sanguină

1.2.1. Tipuri de transfuzie sanguină

Sângele și componentele sanguine sunt produse biologice destinate tratamentului pacienților. El este tratat în centrele de transfuzii în scopul obținerii diverselor componente sanguine: concentratul globular, plasma, plachetele, crioprecipitatul, etc.

Care sunt diferitele tipuri de donare de sânge?

Donarea de sânge total constă în recoltarea unei cantități de sânge, cu toți constituenții săi, direct din vena donatorului în punga de prelevare.

Donarea în afereză este forma de prelevare unde intervin aparate automatizate care recoltează componenta din sânge selecționată și restituie donatorului celelalte constituente ale sângelui.

Cum se derulează o donare de sânge?

O donare de sânge se desfășoară în 4 faze: 1)înscrierea administrativă, 2)interviul medical, 3)prelevarea, 4) timpul de repaus și de refacere.

Donarea de sânge total durează între 8 și 10 minute pentru recoltarea unei pungi de 450ml și a unei eprubete eșantion pentru efectuarea controalelor biologice. Frecvența unei astfel de donări este de 5 ori/an pentru bărbați și de 3 ori/an pentru femei, cu un interval de 8 săptămâni între fiecare donare. Vârsta admisă pentru donatori este între 18 și 65 ani.

Donarea de plachete durează aproximativ 1oră ½ și se realizează prin afereză. Ea se face de 5 ori/an cu un interval de 8 săptămâni între donări. Vârsta admisă pentru acest tip de donare este între 18 și 60 ani.

Donarea de plasmă durează 45 minute și se prelevează 600ml de plasmă și se realizează de asemenea prin afereză. Frecvența de donare este de 20 de ori/an cu un interval de cel puțin 2 săptămâni între donări. Vârsta donatorilor trebuie să fie între 18 și 60 ani.

Durata de conservare a diferitelor componente destinate transfuziei.

Componentele sanguine destinate transfuziei au o durată de conservare diferită:

1)Concentratul globular (masa eritrocitară) : maxim 42 zile la + 4° C, 2)Plachetele: 5 zile la + 20° C, 3)Plasma: 1 an la -25° C

CAPITOLUL 2. ASPECTE MORFOLOGICE, STRUCTURALE ȘI DE FIZIOLOGIE ALE COMPONENTELOR CELULARE DESTINATE TRANSFUZIEI

2.1. Aspecte morfologice, structurale și de fiziologie a eritrocitului uman

Descoperită în secolul al 17-lea de către Swammerdam (1658), hematia a atras de foarte timpuriu atenția cercetătorilor. Ea a fost perfect descrisă de Leeuwenhoek, care a pus în evidență regularitatea formei sale discoidale și a estimat diametrul său la 8μm. Hematia umană rămâne celula cel mai intens studiată datorită ușurinței cu care poate fi obținută și importanței sale fiziologice de a transporta oxigen și dioxid de carbon.

Lipsite de nucleu și organite citoplasmatice, hematiile umane reprezintă un tip particular de celule care provin din celule complete (proeritroblaști) si care, pe măsura maturării și-au simplificat foarte mult structura, adaptându-se la funcția de transport a oxigenului. Între eritrocite și mediul înconjurător se produc, prin intermediul membranei, schimburi active de substanțe. Eritrocitele păstrează un echipament enzimatic propriu, care le permite supraviețuirea și îndeplinirea funcției de transport a oxigenului în sângele periferic timp de 120 zile.

Forma și dimensiuniunile eritrocitelor

Forma eritrocitului uman normal este de disc biconcav cu marginile rotunjite, fiind determinată de proprietățile membranei eritrocitare și a rețelei care stă la baza citoscheletului. Acest aspect reprezintă o perfectă adaptare la funcția respiratorie bazată pe difuziunea gazelor, deoarece sub această formă, eritrocitele au suprafața cea mai mare la volumul cel mai redus. Forma biconcavă este rezultanta unei cooperări de forțe intrinseci și extrinseci.

Date actuale asupra structurii membranei eritrocitare

Membrana eritrocitară este fără îndoială cea mai studiată membrană celulară animală ea fiind ușor de izolat în formă pură, băncile de sânge putând furniza pentru cercetare cantități importante de sânge proaspăt sau conservat, iar numeroasele boli datorate anomaliilor structurale existente la nivelul membranei eritrocitare au determinat necesitatea unei foarte bune cunoașteri a componentelor membranare și a proprietăților lor funcționale. Deși adesea considerată “un simplu sac cu hemoglobină”, structura eritrocitelor, în special după analiza proteomică, se dovedește extrem de complexă și cu multe necunoscute.

Compoziția chimică a eritrocitelor

Eritrocitul este format în proporție de 60% apă, 33-35% hemoglobină și 5-7% alte substanțe. Hemoglobina nu poate depăși 1/3 din greutatea eritrocitară. Reziduul uscat, fără hemoglobină, intră în cea mai mare parte în alcătuirea membranei.

Arhitectura membranei eritrocitare se conformează modelului general de membrană a “mozaicului fluid” a lui Singer, format prin juxtapunerea a două straturi monomoleculare de lipide complexe, unite între ele prin legături hidrofobe-hidrofobe în interiorul cărora sunt localizate numeroase “proteine membranare integrale” care posedă funcții variate, de transportori, receptori sau de enzime. Mai mult, proteinele membranare zise ”periferice” constituie rețeaua vastă a citoscheletului care controlează nu doar talia, forma, flexibilitatea și rezistența membranei eritrocitare dar și interacțiile celulă-celulă și fuziunea membranară. Alterarea acestui complex modifică într-o mare măsură morfologia eritrocitelor și poate provoca de asemenea fragmentarea membranei în micro-vezicule.

Constituienții chimici ai membranei eritrocitare

Din punct de vedere al compoziției chimice, membrana eritrocitară conține 40% lipide, 52% proteine și 8% glucide. Acestea din urmă, denumite glicani, sunt conjugate fie cu proteine (glicoproteine), fie cu lipide (glicolipide).

Proteinele membranare

Analiza proteinelor membranei eritrocitare a fost posibilă după introducerea electroforezei în gel de poliacrilamidă cu SDS. Rezultatele obținute prin electroforeză au condus la introducerea noțiunii de “bandă” pentru a defini aceste proteine. Pentru a le identifica, bandele de proteine au fost numerotate de la 1 la 8 în ordinea descrescătoare a maselor lor moleculare. (Fairbanks et.al., 1971) Nomenclatura proteinelor majore este determinată de mobilitatea lor în electroforeză SDS-PAGE care le separă în funcție de masa lor moleculară. Acest instrument analitic a relevat mai multe proteine distincte, detectate prin colorație cu Coomassie blue, (Figura 2).

Tehnicile de proteomică, care asociază electroforeza în gel de poliacrilamide (PAGE) cu spectrometria de masă a permis mai tarziu caracterizarea a 127 proteine (Low et al., 2002).

Fig. 2. Electroforeză în gel de SDS-poliacrilamidă a proteinelor membranei hematiilor umane vizualizate cu Bleu de Coomassie

(după Marchesi et al., 1976). Benzile sunt numerotate conform nomenclaturii lui Fairbanks et al. (1971).

Tehnicile utilizate în investigarea structurii eritrocitelor nu au încetat să evolueze pentru a permite în prezent abordări proteomice la un nivel global.

Cumulativ, aceste studii de proteomică a eritrocitelor umane au identificat: proteine integrale ale membranei, proteine asociate membranei, proteine GPI-ancorate, proteine extracelulare și proteine ale citoscheletului cărora le pot fi atribuite numeroase funcții: i)de legare (Zhang et al., 2007); ii)de transport (Hunt et al., 2004); iii)de traducere a semnalului (Kakhniashvili et al., 2004); iv)glicoliză (Daniels, 1999) catalitică (Agre, 2006); v)structurală (Weinstein RS, 1969); vi)activitate antioxidantă (Pasini et al., 2006).

Proteinele membranare ale hematiilor au fost clasificate în două categorii: proteine integrate și proteine periferice. Formele integrate în dublul strat lipidic sunt glicoproteine printre care cele mai importante sunt glicoforinele și proteinele benzilor 3 și 4.5.

Fig. 3. Compoziția și funcțiile proteinelor membranei eritrocitare umane

(după Pasini et. al., 2009)

Cu privire la proteinele periferice, acestea constituie “citoscheletul” și cele mai cunoscute sunt spectrina, actina și ankyrina. Figura 4 arată cum se asociază aceste două familii de proteine și cum este organizată ultrastructura moleculară a membranei hematiei.

Glicoproteinele integrate

Glicoproteinele integrate sunt asociate direct lipidelor membranare grație secvențelor de aminoacizi hidrofobe pe care le conțin.

Fig. 4. Organizarea principalelor proteine ale citoscheletului eritrocitar și interacțiile lor cu proteinele din banda 3 și cu glicoforina, două importante proteine membranare intrinseci. Medalionul arată mai în detaliu un complex de joncțiuni cu aranjamentul presupus al spectrinei, benzii 4.1, a aductinei, actinei și tropomiozinei, cât și interacțiunea lor cu filamentele de spectrină

(după Lodish et al., 1997)

Glicoforinele

Cele mai importante oglicoproteine sunt glicoforinele. Glicoforina majoră este glicoforina A (MN- sau α-sialilglicoproteina) care poate fi separată ușor de ceilalți componenți minori, glicoforinele B (SS glicoproteine), C, D și E.

Glicoforina A a cărei structură este ilustrată în Figura 5 este o proteină de 31kDa ale cărei funcții sunt necunoscute la eritrocitul normal deși există 106 molecule/celulă. Ea conține 60% glucide care sunt localizate la capătul N-terminal și în poziție externă în membrană. Glicoforina A este recunoscută ca cea mai sialilată glicoproteină a membranei eritrocitare (51% din proteinele totale).

Ea poartă cea mai mare parte a sarcinilor negative, conținând 25% acid sialic ceea ce reprezintă 80% din cantitatea totală de acid sialic prezent în glicoconjugatele membranei eritrocitului. Ea prezintă 3 domenii bine diferențiate:

– Un segment foarte glicozilat care este compus din aminoacizi hidrofili și care este situat la suprafața celulei. El comportă 15 glicani conjugați O-glicozidic și un singur N-glican. Partea O-glicozidică este esențială în menținerea activității de grup tisular MN purtat de glicoforină, desialilarea ei cu o neuraminidază suprimând această activitate.

– Un segment (rezidurile 71 la 92) care este compus din aminoacizi hidrofobi care traversează dublul strat lipidic al membranei.

– Un segment C-terminal (rezidurile 93 la 131) care se situează în citoplasmă. Acest segment este bogat în resturi de prolină (Schenkel-Brunner, 1995).

Fig. 5. Conformația moleculei de glicoforină A (60% carbohidrați) cu cele 3 domenii. Secvența de aminoacizi și localizarea membranară

(după Bratosin et al., 1998)

În Figura 6 sunt reprezentate 2 structuri oligozaharidice caracteristice glicoforinei A.

Fig. 6. Structura primară a glicanilor din glicoforină legați O-glycozidic (A) și N-glicozidic (B).

(după Bratosin et al., 1998)

Glicoforina A este recunoscută ca o glicoproteină foarte importantă în domeniul imunologiei datorită faptului că ea poartă epitopii specifici de grup tisular: sistemul ABO, antigenele Pr2, T, Tn, Cad și Mg (Schauer et al.,1997).

Determinanții antigeni pentru sistemul MNS sunt localizați pe lanțul peptidic al glicoforinelor A și B. Celelalte glicoforine sunt prezente în mici cantități și nu sunt încă bine caracterizate.

Banda 3. Banda 3 este o proteină care catalizează schimbul de anioni Cl – și HCO3 – facilitând diminuarea cantității de CO2 prezentă în sânge. Această bandă este formată din două domenii proteice distincte din punct de vedere structural și funcțional (Landolt-Marticorena et.al., 1998), așa cum este prezentat în Figura 7.

Fig. 7. Dispunerea proteinei benzii 3 în membrana eritrocitară. A fost reprezentată doar una din cele două polipeptide gemene. Proteina benzii 3 nu se leagă doar la ankyrina citoscheletului, ci și la enzimele glicolitice ale lanțului Embden-Meyerhof și la hemoglobină

(după Lodish et al., 1997)

Domeniul C-terminal (55 kDa) traversează lanțurile lipidice ale membranei și controlează funcția de schimbător anionic. Domeniul amino-terminal (43kDa) este citosolic și interacționează cu ankirina.

Funcția sa este de a ancora la citoschelet banda 3 însoțită de hemoglobină și de complexul enzimatic al lanțului Embden-Meyerhoff care este singurul sistem de producere a energiei generatoare de ATP pentru eritrocite pornind de la glucoză, via acidului fosfoenolpiruvic. Studii recente au demonstrat importanța benzii 3 în menținerea homeostaziei și a formei discocitare a hematiei. Ea conține de asemenea epitopi glucidici ai grupelor ABO și Ii.

Prezența acestor proteine într-un singur macrocomplex demonstrează că aceste proteine pot avea roluri legate, funcționale sau regulatoare. Acest macrocomplex poate funcționa ca o unitate integrată a schimburilor gazoase CO2/O2 (metabolom) în eritrocit. (Bruce et al, 2003)

Fig. 8. Modelul schimburilor gazoase ale membranei eritrocitare. Modelul sugerează că CO2 trece de la celula endotelială la hematie prin proteinele Rh. CAII convertește CO2 și H2O în HCO3- și un proton, apoi HCO3- iese din hematie via banda 3 in schimbul unui ion Cl-. Eliminarea de HCO3- lasă un proton care favorizează o acidificare locală în proximitatea benzii 3 și degajarea oxigenului oxy-hemoglobină prin efectul Bohr. O2 poate atunci să părăsească hematia via canalului Rh de schimb gazos și să treacă în celulele endoteliale. Trecerea substratului prin acest metabolon reduce pierderea substratului prin difuzie din sistem. În microcapilarele pulmonare sistemul va fi inversat. Mișcările de apă implicate în hidratarea/deshidratarea CO2 se fac via aquaporina 1 (AQP1) (Reithmeier, 2001) deși acest compus nu ar fi direct asociat cu macrocomplexul benzii 3.

(după Bruce et al., 2003)

Banda 4.5. Banda 4.5 conține o bandă difuză de proteine care prezintă un singur glican de tip N-acetylactosaminic foarte heterogen legat N-glicozidic și care pare să conțină o structură analoagă celei existente în banda 3. Această proteină este responsabilă de transportul glucozei prin membrană. Legată la Banda 3, Banda 4.5, ea traversează de 14 ori membrana eritrocitară.

Proteinele periferice ale citoscheletului

Așa cum a fost prezentat în Figura 7, citoscheletul la hematii este strâns asociat la suprafața citoplasmatică a membranei și este format din diverse polipeptide care interacționează puternic cu proteinele transmembranare. Citoscheletul este o rețea organizată de proteine care cuprinde componente majore (de exemplu, α-și β-spectrina, actina, proteina 4.1, ankirina) și componente minore (proteina 4.2, dematina (4.9), α-și β-aducina, tropomiozina, tropomodulina etc).

Spectrina. Componenta majoră a citoscheletului este spectrina, o proteină lungă și fibroasă. Doi dimeri ai spectrinei, care compun fiecare dintre lanțurile polipeptidice α și β, se leagă față în față într-un tetramer lung de 200 nm. Benzile mai multor tetrameri sunt legate la nivel de complexe de joncțiuni conținând mici filamente de actină. Proteine ca tropomiozina și aducina se fixează apoi pe spectrină .

Actina. Actina, o altă componentă majoră a citoscheletului, este legată la spectrină prin intermediul benzii 4.1. Ea face parte din complexul de joncțiune și reprezintă una din cele două proteine care asigură continuitatea între citoschelet și membrana plasmatică. Banda 4.1 joacă un rol cheie în menținerea integrității membranei eritrocitare, iar deficitul în această proteină provoacă anemii hemolitice severe.

Ankirina. Ankirina unește de asemenea partea fibroasă a citoscheletului de membrana plasmatică. Ea posedă două domenii: unul se atașează specific și puternic la o zonă particulară a lanțului β aproape de centrul tetramerului spectrinei și o alta se leagă de o regiune a proteinei benzii 3 care plutește în citosol.

În concluzie, forma biconcavă și capacitatea extraordinară de deformare a hematiilor sunt direct legate de prezența rețelei proteice care formează citoscheletul membranar, mai ales că un citoschelet intracitoplasmatic este inexistent.

Lipidele membranare

Majoritatea lipidelor membranei eritrocitare sunt reprezentate de colesterol (16%), fosfolipide (20%) și glicolipide (4%).

Colesterolul. Colesterolul și esterii săi cu acizi grași reprezintă 30 până la 50% din lipidele membranei plasmatice și este repartizat de o parte și de alta a dublului strat lipidic al membranei. Rolul său este de a stabiliza și menține fluiditatea membranei.

Fosfolipidele. Fosfolipidele predominante sunt fosfatidilcolina (28%), fosfatidiletanolamina (26%), sfingomielina (25%), și fosfatidilserina (13%). În cantități reduse se găsește de asemenea acid fosfatidic (2%), fosfatidilinozitol (1%) și lizofosfatidilcolina(1%). Lipidele sunt repartizate asimetric în membrană așa cum se prezintă în Figura 9, mare parte din fosfatidilcolină (65-75%) și din sfingomielină fiind orientate spre exteriorul celulei, în timp ce fosfatidiletanolamina (80-85%) și fosfatidilserina (96%) sunt în citoplasmă. Această asimetrie remarcabilă a repartiției lipidelor complexe dispare total în cursul îmbătrânirii celulei și această modificare profundă – externalizarea de fosfatidilserină în particular – este originea fagocitozei hematiei senescente. Acest mecanism de translocare este catalizat de aminofosfatidil-transferaze, numite și « flipaze », care sunt specifice pentru fosfatidilserină și fosfatidilcolină, repartizate între fosfolipide în stratul bilamelar, cu axele lungi hidrofobe ale acizilor grași integrate în stratul lipidic. Toate sunt localizate în foița externă a stratului lipidic având grupările lor glicanice spre exterior. Ca și glicoproteinele membranare, ele poartă, de asemenea, câteva antigene tisulare prezente în hematii, cum ar fi de exemplu antigenele A, B, H, Pk, P1, Lea.

Aceste glicolipide provin prin substituția lipidelor numite ceramide cu glicani, ceramide care rezultă ele însele prin asocierea unui aminoalcool în C-18, sfingosina, și diferiți acizi grași de-a lungul lanțului carbonic în general nesaturat. Urmând structura glicanilor, glicolipidele pot fi separate în două grupe, glicolipide neutre, nesialilate descoperite de către (Gardas & Koscik, 1973) și de către (Koscielak et al., 1976), și gangliozide, structuri sialilate (Hakomori et al., 1968).

În 1993 Hakomori a propus o nouă schemă a ultrastructurii “en patches” a membranelor așa cum este ilustrată în Figura 10. Ceramidele, glicolipidele și fosfolipidele au dobândit recent o mare importanță biologică datorită participării lor determinantă în inducerea apoptozei celulare.

Fig. 10. A: Structura spațială a unui glicosfingolipid. B: Ultrastructura în ”patches” a membranei celulare. Gp: glicoproteine ; Gl: glicolipide. Glicanii glicoconjugatelor sunt colorați în roșu.

(după Hakomori,1993)

Aspecte ale interacțiunii proteine – lipide în forma și integritatea eritrocitelor

Menținerea fluidității membranei eritrocitare și deformabilitatea celulară dând naștere unei forme biconcave caracteristice, este extrem de importantă pentru funcționarea hematiilor deoarece îi permite să treacă prin vasele de sânge. Acest echilibru delicat este menținut prin intermediul interacțiunii dublului strat lipidic membranar cu proteinele citoscheletului.

Înțelegerea acestor interacțiuni și a factorilor de control este crucială, deoarece compoziția în lipide a membranei joacă un rol esențial în fluiditatea membranelor iar fenomenele de peroxidare din membrană au rol într-o serie de boli care afectează eritrocitele (Senol et al., 2007). În acest context, proteomica a acordat un sprijin important prin evidențierea următoarelor proteine: flipaza (Daleke & Lyles, 2000), floppaza (Dekkers et al., 1998; Kuypers, 1998) sau suspectate de a fi implicate, scramblaza 1 și 4 (Zhou et al.,1997) în „mecanismul de flip-flop” care controlează asimetria membranei eritrocitare prin translocarea fosfolipidelor între fețele membranei eritrocitare. Lipidele eritrocitelor joacă de asemenea un rol important în semnalizarea și în interacțiunea intercelulară, precum și în forma și deformabilitatea eritrocitelor.

Plasticitatea este o caracteristică unică a eritrocitelor și se bazează pe ATP ca sursă primară de energie (Devaux et al.,1986), pe extruzia calciului precum și pe o varietate de enzime asociate membranei (Mohandas & Shohet, 1981). Funcționarea corectă a acestor componente este crucială în permiterea modificării instantanee a membranei eritrocitelor, ca răspuns la schimbarea diametrului vaselor de sânge. Așa cum am mai menționat, citoscheletul este o rețea bine organizată de proteine care cuprinde componente majore (ex: α-și β-spectrina, actina, proteina 4.1, ankirina) și componente minore (proteina 4.2, dematina (4.9), α-și β-aducina, tropomiozina, tropomodulina, etc.), care interacționează nu numai între ele, dar și cu alte proteine și lipide ale membranei. În timp ce interacțiile proteină – proteină au fost intens studiate, mult mai puțin sunt cunoscute interacțiunile lipide-proteine. Rețeaua citoscheletului este reglată funcțional de tipul și gradul modificărilor post-translaționale (PTMs). Modificările post-translaționale cunoscute ale citoscheletului includ fosforilarea, metilarea, miristilarea, palmitarea, sau farnesilarea (Cohen & Gascard, 1992). Ca2+ și calmodulinul iau parte de asemenea, în reglarea interacțiunilor proteinelor scheletale (Takakuwa & Mohandas, 1988).

Reamenajarea rețelei citoscheletului, care urmează deformării membranei, este posibilă datorită aranjamentului structural în sine și a schimburilor dinamice între conformațiile extinse și comprimate (Liu & Derick, 1992). Tetramerii spectrinei (α2β2) sunt componente cheie ale rețelei citoscheletului, reglând forma celulară, deformabilitatea membranei, stabilitatea și mobilitatea laterală ale benzii 3. Moleculele de spectrină sunt organizate extrem de spiralat, elicoidal, conferind un grad ridicat de flexibilitate (Vertessy & Steck,1989) și oferindu-le proprietatea de a se extinde și contracta (Altmann et al., 2002). Atașarea rețelei citoscheletului la membrană este mediată de spectrină/ ankirină/ banda 3 și spectrină/ banda 4.1/glicoforina C. Interacțiunea spectrinei la membrană, prin intermediul ankirinei, este modulată de proteina 4.1 (Gimm et al., 2002).Interacțiunea proteinei 4.1 cu glicoforina C, pe de altă parte, este reglată de p55 (un membru al MAGUK (membrane-associated guanylate kinase, family)) (Chishti, 1998). Participarea actinei la complexul joncțional este importantă ca și raportul dintre actina polimerizată la cea depolimerizată, raport ce controlează flexibilitatea membranei, care crește atunci când polimerizarea actinei este inhibată. Un control strict asupra acestui raport este exercitat de patru proteine minore: tropomodulina, tropomiozina, heterodimerii αβ ai adducinei (Joshi et al., 1991; Katagiri et al., 1996) și dematina (proteina 4.9).

Fig. 11. Modelul membranei eritrocitare și a citoscheletului adiacent. Reprezentarea schematizată simplificată a interacțiunilor dintre membrană și citoschelet, reprezentarea nu reproduce întreaga topologie exo-/endoplasmatică

(după Pasini EM et al., 2009)

Complexele tropomodulină – tropomiozină stabilizează filamentele scurte de actină ale eritrocitelor consolidând interacțiunile spectrină-actină, prin fenomenul de capping sau filamentele din extremități (Fowler et al., 1993). Toate proteinele citoscheletului eritrocitelor sunt prezente în izoforme ce rezultă din îmbinări alternative.

Geometria celulară, la rândul său, depinde de raportul suprafață/volum, a cărei reducere duce la pierderea formei discoidale a eritrocitului și la o tendință mai pronunțată de liza (de exemplu, în sferocitoza ereditară). Un raport adecvat arie/volum este necesar pentru menținerea formei unice biconcave a RBCs (Chasis et al.,1993), în cazul în care suprafața în exces limitată (aproximativ 40 μm2) îi permite să treacă prin deformări apreciabile (extensia liniară de până la două ori de la dimensiunile originale), cu o arie a suprafaței constantă (Mohandas et al., 2000).

Al doilea factor care are un impact asupra deformabilității eritrocitelor, vâscozitatea citoplasmatică, este legată de concentrația de hemoglobină, ceea ce crește vâscozitatea eritrocitelor (Gallagher et al., 1998), având consecințe grave pentru supraviețuire. În contrast, proprietățile intrinseci viscoelastice ale membranei eritrocitare în sine care poate fi schimbată, ca urmare a depletiei integrale a proteinelor membranare, sau mutații ale acestora, (ex: banda 3), pare să aibă un efect relativ scăzut asupra supraviețuirii RBCs (Mohandas et al.,1992).

Pe de altă parte, orice modificare a deformabilității membranei, care decurge din anomalii ale proteinelor scheletului, integrale sau de ancorare, și care duc la incapacitatea eritrocitelor de a realiza controlul suprafeței sau volumului celular, (de exemplu, sferocitoza și eliptocitoza ereditară) duce la o scurtare a timpului de supraviețuire a eritrocitelor (Tse & Lux, 2001; Reliene et al., 2002).

Permeabilitatea membranei, transportul de substanțe nutritive și reglarea volumului eritrocitar

Membrana eritrocitară se comportă într-un fel ca o membrană semipermeabilă, permeabilitatea și capacitatea ei de transport fiind supuse legilor difuziunii și osmozei. Când de o parte și de alta a unei membrane există o concentrație diferită de substanțe dizolvate, se produce un flux molecular din partea cu concentrație mare spre partea cu concentrație mai mică. Transportul prin membrană este pasiv, când se desfășoară în sensul gradientului de concentrație, tinzând către egalizarea concentrațiilor celor două compartimente. Pentru unele substanțe, transportul prin membrane se desfășoară invers, în contra gradientului de concentrație (transport în amont), iar printre altele se aplică bariere suplimentare de difuziune. Acest fenomen, numit transport activ sau difuziune favorizată, necesită un consum sporit de energie. În aceste cazuri, membrana eritrocitară este capabilă să distingă ionul de Ca ++ de cel de Na+ , D-glucoza de L-glucoza, precum și diverși aminoacizi între ei. În acest sens trebuie amintite diferențele dintre concentrațiile intra- și extracelulare ale unor electroliți, concentrații intracelulare crescute de K+ , Mg++ , Ca++, fosfat și concentrații scăzute de Na+, Cl-, bicarbonat intracelular.

Sursa principală de energie pentru această formă de transport o constituie ATP-ul, care sub acțiunea ATP-azei (enzimă ce intră în compoziția membranei celulare), pune în libertate energia depozitată.

Membrana eritrocitară este un conglomerat de “situsuri” pentru unele reacții ale metabolismului intermediar și pentru biosintezele moleculare catalizate de proteine unde rolul principal în transportul activ îl au reacțiile enzimatice, la care se adaugă celelalte componente ale membranei.

Transportul moleculelor neutre, ca zaharurile, se face după legile difuziunii diferențiate. Aici se presupune fie o “difuziune favorizată” prin molecule purtătoare, fie o penetrație printr-un număr limitat de pori hidrofili ai membranei. O difuziune simplă a glucozei prin membrană este exclusă; ea nu poate traversa membrana sub formă de fosfat de glucoză, fosforilările având loc în mediul intern al eritrocitului, penetrarea glucozei în eritrocit fiind independentă de insulină. În contrast cu permeabilitatea ușoară a monozaharidelor, pentru dizaharide există o impermeabilitate aproape totală. Acizii aminați pătrund în eritrocit tot printr-un transport favorizat, cu ajutorul unor cărăuși specifici. Nucleotidele nu pot pătrunde prin membrana eritrocitară, in timp ce nucleozidele și bazele azotate purinice pot străbate membrana, în interiorul eritrocitului completandu-se sinteza lor până la nucleotid (Harris et al., 1970; Surgenor, 1974; Williams et al., 1972).

Cel mai important transportator este fără îndoială banda 3, care acționează ca un schimbător de anioni (Fujinaga et al., 1999), prin care anionii bicarbonat și clorură sunt schimbați rapid, în timp ce anionii mai mari (sulfat, fosfat, fosfo-enol-piruvat și superoxid) sunt transportați mult mai lent (Tanner, 1993; Tanner, 1997). Bicarbonatul este produs de către anhidraza carbonică a RBCs, în timp ce produsul său de disociere, protonul (H +), se leagă de hemoglobină și facilitează eliberarea oxigenului la țesuturi (Vince & Reithmeier, 1998).

Volumul eritrocitului este reglat prin intermediul (1) transportului activ de membrană, (2) transportul pasiv prin gradient, și (3) un număr de canale (Gallagher et al., 1998). În timp ce membrana eritrocitară este permeabilă într-o oarecare măsură la apă și anioni, ea este extrem de impermeabilă la cationi, care necesită anumite sisteme specifice de transport. Pentru a menține o concentrație de cationi intracelulară opusă cu cea din plasmă (concentrație scăzută de potasiu și ridicată de sodiu și calciu), eritrocitul se bazează pe două pompe de cationi dependente de adenozină (ATP-aza) (Mercer et al.,1989): Na+-K+-ATP-aza precum și calmodulinul activat Mg2+-dependent de CA2+-ATPaza (Vincenzi, 1989).

Nivelul de calciu trebuie să fie foarte atent controlat în eritrocit, o creștere a concentrației ionilor de calciu reglând o serie de enzime (calpainele de exemplu) și procese (proteoliza de exemplu), care conduc la o deshidratare a eritrocitului și la o degradare a proteinelor. Un studiu de investigare a distribuției activității pompei de Ca2+ a membranei plasmatice în eritrocitele umane normale a dat o primă descriere detaliată a distribuției activității sale Vmax în eritrocitele umane normale, și a furnizat probe suplimentare pentru existența unor diferențe în ratele de pompare a Ca2+ în rândul subpopulațiilor eritrocitare (Lew et al., 2003).

De un mare interes pentru viitor este faptul că eritrocitele mai bătrâne arată o activitate redusă a CA2+ATP-azei, iar rolul diferitelor izoforme în acest context nu a fost până acum investigat. Este interesant de observat că în timp ce glucoza, principala sursă de energie a RBCs, intră în eritrocit prin intermediul transportorilor independenți de energie (Mueckler et al.,1989), membrana RBCs este practic impermeabilă pentru nucleotide cum ar fi ATP și GTP și intermediari glicolitici. (Gati & Paterson, 1989)

Importanța transportului de glucoză pentru eritrocitele umane este adus de proteomică, care a identificat trei transportori ai glucozei (GLUT1, GLUT3 și GLUT4), unde cele două din urmă sunt tipice pentru eritrocitele de mamifere și absente în cele aviare.

Un număr de transportatori pasivi se bazează pe gradientul creat de Na+-K+ ATP-aza, și anume: 2 co-transportatori de clorură (transportatorii Na+-K+-Cl-și K+-Cl-CO-) și un schimbător de Na+-H+ (Parker et al., 1989). În contextul transportului de clorură, un K +-Cl-CO- co- transportor 4 a fost identificat prin proteomică împreună cu alte două canale de clorură suplimentare (canalul de clorură intracelular 1 și canalul de clorură intracelular 3), descrise anterior ca având în principal o localizare nucleară, dar fiind prezente de asemenea și în citoplasmă și membrana plasmatică (Pasini et al., 2006).

Transportatorii de K+Cl-CO sunt activați ca răspuns la umflarea celulei, a concentrației intracelulară de magneziu redusă, scăderea pH-ului și oxidarea tiolului, și sunt considerați a fi mult mai importanți în timpul diferențierii eritrocitelor decât în eritrocitele mature (Yawata et al., 2003).

Acvaporinele, descoperite de Benga (1986) funcționează ca un por selectiv care permite eritrocitului să răspundă la schimbări bruște de osmolaritate (Benga et al., 2006 & 2009). În timp ce doar acvaporina -1 (Agre et al., 2006) a fost detectată prin proteomică, există tot mai multe dovezi că un canal mai lipofilic de transport al apei, există de asemenea în membrana eritrocitară, și anume acvaporina-3 (Roudier et al., 1998). În acest context, date recente sugerează că transportatorul de uree UT-B, a cărui prezență a fost confirmată de analiza proteomică, poate avea, de asemenea, un rol important în transportul apei în membrana eritrocitară ( Yang et al., 2002).

Canalele cunoscute “voltage gated” și canalele Gardos, care sunt reglate de către calpromotină și AMPc, sunt activate de o concentrație intracelulară de CA2+ crescută, și răspunde prin eliminarea ionilor de potasiu. Proteomica a identificat, de asemenea, un canal de potasiu dependent de pH, și anume canalul de potasiu sensibil la quinine, membrul 5 din subfamilia K, care ar putea fi de asemenea implicat în expulzarea ionilor de potasiu. Transportul aminoacizilor poate avea un rol în reglarea osmotică a eritrocitelor și se presupune, pe baza comparațiilor în silico cu alți transportori, că este parțial mediat de proteina membranară de transport XK.

Structura și funcția hemoglobinei

Hemoglobina umană este o cromoproteidă formată dintr-o parte proteică (globina) și o parte prostetică (hemul). Gruparea prostetică, pigmentul colorat, este un nucleu tetrapirolic, o protoporfirină, ce conține fier. Prin capacitatea sa de a se combina reversibil cu oxigenul, hemul constituie partea fiziologic activă din molecula de hemoglobină. Partea proteică – globina- este o proteină cu caracter bazic din grupa histonelor, ce diferă de la o hemoglobină la alta și imprimă specificitatea hemoglobinei respective. În structura globinei intră 574 de aminoacizi grupați în 4 catene polipeptidice, două câte două, identice între ele.

Fiecare lanț polipeptidic are atașată o grupare hem. Aceste grupări hem – patru per moleculă – sunt plasate în interiorul moleculei, în niste pliuri, pe care le realizează catenele polipeptidice în structura lor terțiară. Legarea hemului de globină se face prin intermediul nucleului imidazolic al histidinei din pozițiile 87 și 58 pentru catenele alfa și 93 și 63 pentru catenele beta. Inelul imidazolic din poziția 87 se leagă direct de atomul de fier prin una din legăturile coordinative ale acestuia, iar cel din poziția 58 se leagă, în mod indirect, printr-o legătură de hidrogen realizată prin intermediul moleculei de apă care se găsește legată coordinativ de fier. Această legătură labilă permite, în forma oxigenată a hemoglobinei legarea oxigenului de atomul Fe++. Pe lângă aceste legături între hem și globină se mai stabilesc și alte legături: legături polare între radicalii acid propionic din pozițiile 6 și 7 ale protoporfirinei și grupările aminice din catenele polipeptidice, legături Van der Waals între grupările metilice și vinilice ale hemului și resturile unor aminoacizi din catena polipeptidică respectiva.

Fig. 12. Structura hemoglobinei

(după www 2)

Pentru funcția hemoglobinei este necesară prezența ambelor componente, respectiv hem+globină. Rolul important pe care-l deține hemoglobina ca pigment respirator se datorează proprietății sale de a fixa reversibil oxigenul și de a-l ceda cu ușurință țesuturilor.

Fixarea oxigenului se face de către Fe din hem și în acest proces de oxigenare și reducere a hemoglobinei, fierul rămâne bivalent. Cele patru nuclee de hem din molecula de hemoglobină fixează oxigenul cu viteze diferite, datorită fenomenului cooperativitate dintre moleculele hem. Interacția hem-hem se datorează unei rearanjări a subunităților în cadrul moleculei în timpul fixării sau eliberării oxigenului. Această schimbare reversibilă în structura spațială, în raport cu fixarea și eliberarea oxigenului, realizează o adevărată „mișcare respiratorie” a moleculei de hemoglobină în care legăturile intercatenare de la nivelul subunităților α1 β2 și α2 β1 au un rol esențial. În afară de acest fenomen de cooperativitate dintre subunitățile moleculei, capacitatea hemoglobinei de a fixa și ceda cu ușurință oxigenul este influențată și de diverși constituienți intracelulari, dintre care un rol important îl are 2-3 difosfogliceratul, care este specific legat de deoxihemoglobina la nivelul cavității centrale a moleculei.

Deși locul de legare pe hemoglobină al 2-3-DPG este diferit de cel al oxigenului, între 2-3-DPG și oxigen este o relație reciprocă de excludere. În prezența unor cantități crescute de 2-3-DPG, are loc o descreștere a afinității pentru oxigen și invers, descreșterea 2-3-DPG determină creșterea afinității pentru oxigen. Această interrelație reciprocă este un exemplu de efect alosteric la nivelul hemoglobinei.

În afara rolului fundamental jucat în procesul de respirație, hemoglobina deține și un rol important în menținerea echilibrului acido-bazic. Sistemul tampon realizat de oxihemoglobină/hemoglobină contribuie în mod deosebit la menținerea pH-ului sanguin în anumite limite.

Metabolismul eritrocitar

Pentru a îndeplini în mod eficient funcția sa de fixare, transport și cedare a oxigenului, eritrocitul are nevoie de o cantitate mică dar bine definită de energie, necesară pentru:

a) menținerea fierului heminic sub formă bivalentă (Fe++), singura formă în care poate fixa reversibil molecula de oxigen (O2);

b) o concentrație redusă de sodiu și ridicată de potasiu în interiorul celulei;

c) conservarea formei discoidale biconcave;

d) menținerea, în enzime și hemoglobină, a unui număr suficient de grupări sulfhidrilice (SH) într-o formă activă, redusă.

Substratul folosit de eritrocite pentru a obține energia necesară activității lor este glucoza. În mod normal, consumul de glucoză se cifrează la 0,3-0,4 mg/ora/100 ml de eritrocite. Ca urmare a transformării glucozei în piruvat și în acid lactic în cadrul ciclului metabolic Embden-Meyerhoff, iau naștere două molecule de adenozintrifosfat (ATP), cu legături macroergice, care vor asigura acoperirea necesităților diferitelor sisteme funcționale din eritrocit.

Fig. 13. Schema principalelor căi metabolice ale eritrocitului: glicoliza, 2,3 DPG și calea pentozo- phosphat.

(după www 3)

Aproximativ 30% din cantitatea totală de energie obținută din catabolizarea glucozei este consumată pentru menținerea unei concentrații reduse de sodiu și a unei concentrații ridicate de potasiu în interiorul eritrocitelor, împotriva unui gradient plasmatic invers, caracterizat de o concentrație de ioni de sodiu de 15 ori mai mare și de o concentrație de ioni de potasiu de 20 de ori mai mică. Unele cercetări au arătat că formarea ATP din ADP are loc chiar în membrana eritrocitară, în apropierea locurilor în care sunt amplasate pompele ionice, astfel încât alimentarea cu energie a acestora este mult facilitată. Atât procesul de obținere a energiei din glucoză, cât și modul în care se utilizează energia de mecanismele implicate în menținerea parametrilor eritrocitari, sunt controlate de enzime. Cea mai mare parte a acestora, și anume cea din metabolismul energetic, se găsesc și în alte țesuturi, în timp ce unele, ca, de exemplu methemoglobin-reductază, se află doar în eritrocite, fiind adaptate exclusiv unor roluri îndeplinite de acestea. Cele mai importante enzime care intervin în metabolizarea glucozei, atât în ciclul Embden-Meyerhoff cât și în suntul hexozo-monofosfatilor sunt: Hexokinaza, Triozo-fosfat-izomeraza, Fosfoglicerokinaza (PGK),Piruvat-kinaza, Glucozo-6-fosfat-dehidrogenază

Hemoliza și metabolismul hemoglobinei

Catabolismul eritrocitului, proces fiziologic prin care se realizează îndepărtarea din circulație a eritrocitelor senescente, constă în eliberarea hemoglobinei din hematii în urma distrugerii globulare și în degradarea acesteia până la o serie de produși finali ce sunt eliminați din organism sau reutilizați. Distrugerea eritrocitelor se produce atât în interiorul circulației generale cât și în afara acesteia, in sistemul reticuloendotelial (SRE) din splină, ficat, măduva osoasă.

Metabolismul hemoglobinei

Modalitatea prin care un macrofag identifică un eritrocit drept senescent este doar parțial clarificat, fenomenul fiind probabil legat de modificări care survin în structura de suprafață a eritrocitului său în sarcina electrică a acestuia (Bratosin et al., 1998, review). Procesul de catabolizare a hemoglobinei constă în parcurgerea a două etape principale: 1)transformarea hemului în bilirubină (Br); 2)transportul, metabolismul și excreția bilirubinei.

In condiții patologice, mecanismele distrugerii eritrocitare pot fi grupate în trei categorii: 1)defect la nivelul membranei eritrocitare; 2)defect ce afectează proprietățile de curgere ale eritrocitelor; 3)defect rezultat prin expunere la agresiune mecanică extrinsecă și poate, apoptoză eritrocitară exagerată, ipoteza emisă de noi, ipoteză ce face obiectul unor cercetări personale.

2.2. Aspecte morfologice, structurale și de fiziologie ale plachetelor umane

Plachetele sanguine, numite de asemeni trombocite, sunt elemente figurate cunoscute pentru rolul lor în coagularea sângelui, activându-se în cazul leziunilor vasculare în scopul stopării unei hemoragii. Plachetele sanguine asigură hemostaza primară contribuind la formarea unui trobus (cheag), bogat în plachete, numit și trombus alb (Furie et al., 2008), ele reprezentând actorii esențiali pentru menținerea integrității vasculare și jucând un rol important în procesele de cicatrizare și de reglare a inflamației, angiogenezei (Leslie et al., 2010).

Un singur megacariocit produce aproximativ între 1 000 și 1 500 trombocite. Timpul necesar megacariocitului imatur de a se umple cu proteinele citoscheletului și cu granulele pe care fiecare trombocit le va purta este de aproximativ 5 zile. În fiecare zi, aproximativ 1011 trombocite sunt produse pentru a păstra nivelul constant în sânge, care, în condiții fiziologice variază între 1.5 până la 3.0 × 10−5/mL de sânge circulant, cu o durata de viață de maxim 7 zile.

Plachetele sanguine în repaus se prezintă sub formă discoidală de 1,5-4 µm în diametru și 0,5-2 µm grosime, în timpul activării adoptând o formă sferică și emițând prelungiri membranare de tip filipode sau lamelipode ( Figura 14).

Fig. 14. Forma tipică discoidală (A) și modificată prin stimulare (B) a plachetelor sanguine

(după Lhermusier et al., 2010)

Schematic ele sunt constituite din 3 compartimente celulare: 1)sistemul membranar, 2)organitele și 3)citoscheletul (Figura 15).

Fig. 15. Reprezentarea schematică a structurii trombocitelor și a principalilor receptori membranari.

(după www 5)

Trombocitele au un inel de microtubuli contractili care intră în structura citoscheletului situat la periferie și care conține actina și miozina. În interiorul trombocitelor sunt prezente un număr de structuri intracelulare care conțin glicogen, lizozomi și două tipuri de granule cunoscute sub denumirea de granule dense care conțin ADP, ATP, serotonina și calciu și granule, care conțin factori de coagulare. Acestea sunt echipate cu o membrană extensiv invaginată, creând un sistem canalicular, în contact cu mediul fluidic extracelular. În mod normal, în starea de repaus, trombocitele sunt nontrombogenice și necesită un declanșator înainte ca acestea să devină un jucător activ în hemostază.

Asimetria membranei plasmatice plachetare și rolul externalizării de PS în coagulare.

Membrana plachetară prezintă structura clasică, cu 2 straturi lipidice, extern și intern, cu compoziții diferite, prezentând o distribuție asimetrică a fosfolipidelor între cele 2 straturi. Fosfatidilcolina (PC) și sfingolipidele (SM) predomină pe fața externă, în timp ce fosfatidiletanolamina (PE) și fosfatidilserina (PS) predominând pe fața internă. Membrana plasmatică conține o mare cantitate de glicoproteine ancorate în dublul strat lipidic sau care traversează membrana. S-a demonstrată că trombocitele consumă energie pentru crearea și menținerea acestei energii, sugerând existența unor proteine specifice care sunt responsabile de transferul lipidelor de pe fața internă la exteriorul celulei (mișcare de flip-flop) (Devaux et al., 1984). În fapt, proteinele asigură trecerea anumitor lipide de pe fața externă pe fața internă (flipaze), în timp ce altele asigură mișcarea inversă (flopaze), așa cum se prezintă în Figura 16.

Fig. 16. Prezentarea schematică a diferitelor proteine membranare implicate în asimetria de membrane

(după Heemskerk et al., 2002)

Această asimetrie poate fi pierdută în timpul unor evenimente precum apoptoza sau activarea plachetară. În cursul activării, există o pierdere a asimetriei dependentă de Ca2+, având ca efect principal expunerea de PS pe fața externă, existând o proteină sau mai multe proteine (scramblaze) care au ca funcție de a elimina, de o manieră mai mult sau mai puțin reversibilă asimetria membranară, asigurând mișcări aleatorii între cele două straturi. Recent, proteina TMEM 16F a fost identificată ca jucând un rol major în expunerea Ca2+ dependentă a PS pe fața externă, în timpul activării trombocitare (Suzuki et al., 2010). Transformarea fibrinogenului solubil într-o rețea insolubilă de fibrină constituie etapa cheie în coagulare, ea necesitând acțiunea enzimatică a trombinei care derivă din clivajul protrombinei inactive de către complexul protrombinase compus din proteaza Xa, cofactorul Va, ioni de Ca2+ și de fosfolipide anionice. După stimularea trombocitului de către anumiți agenți care induc o creștere importantă de Ca2+ în citoplasma, (trombină plus colagen în special), se produce o remodelare membranară rapidă cu translocarea de aminofosfolipide (PS) pe stratul exoplasmic, inmugurirea membranei și emisia de microparticule, ceea ce le permite formarea de trombina la nivelul leziunii vasculare. Redistribuirea de PS pe fața externă a membranei plasmice și prodecerea de microparticule apare de asemeni în apoptoză și joacă în acest ultim caz un rol în recunoașterea și eliminarea celulelor moarte de către sistemul reticulo-endotelial. Căile de semnalizare declanșate în cursul apoptozei implică fenomene în cascadă care conduc, pe termen scurt sau mediu, la activarea caspazelor, a reacțiilor mitocondriale specifice, expunerea de PS și apoi degradarea AND-ului. Translocarea membranară de PS în timpul apoptozei ar putea rezulta din căi de semnalizare diferite de cele implicate în externalizarea de PS procoagulante. (Kozian et al., 2005) Alături de membrana plasmatică, plachetele prezintă și alte sisteme membranare:

– sistemul canalicular deschis (SCO), conectat la suprafață, corespunde invaginarilor profunde ale membranei, traversând citoplasma și jucând un rol în endocitoza moleculelor de origine plasmatică și în exocitoză atunci când granulele plachetare sunt secretate, și facilitând totodată emiterea de filipode cu etalarea unui mare număr de glycoproteine accesibile în activarea plachetară;

– sistemul tubular dens (STD), sistem neconectat la suprafața celulară, corespunzând reticulului endoplasmic neted din megacariocit, și care conține enzimele metabolismului lipidic (peroxidaza plaquetara, ATP-aza calciu și magneziu dependența pentru reglarea calciului intracelular).

Organitele plachetare din citoplasmă sunt reprezentate de mitocondrii, granule de glicogen, lizozomi conținând enzime (arilsulfatază, fosfatază acidă, catepsină G) precum și multe tipuri de granule care constituie principalul rezervor intracelular de proteine care este eliberat în cursul activării plachetare. Secreția plachetelor este un mecanism care amplifică activarea acestora și sfârșește prin eliberarea de mediatori care interacționează cu endoteliul și celulele sanguine.

Granulele dense (2 până la 10 /celulă) sunt granule mici (150 nm diametru) conținând concentrații mari de ADP, ATP, pirofosfat, serotonină și calciu.

Granulele mult mai abundente (20 până la 200 / celulă) formează o populație mai heterogenă decât granulele dense, cu o talie mai mare, (300 până la 500 nm diametru) conținând proteine adezive precum fibrinogen, vWF, fibronectină, vitronectină și trombospondină. Sunt stocați de asemeni factori de creștere precum PDGF (Platelet Derived Growth Factor), EGF (Epidermal Growth Factor), ECGF (Endothelial Cell Growth Factor), VEGF (Vascular Epidermal Growth Factor), IGF1 (Insulin Growth Factor 1) și TGF(Tissue Growth Factor ). Sunt semnalate de asemeni proteine de coagulare precum factorii V, XI, XIII și VIII, kinogen de masă moleculară mare, plasminogen, la proteina S și factorul 4 plachetar (PF4).

Lizozomii sunt cunoscuți pentru funcția lor de degradare intracelulară sunt totodată organite secretoare în linia hematopoietică, care conțin hidrolaze acide, catepsinele D și E, proelastaze și colagenaze. Secreția lor survine numai în cazul unei stimulări maxime a plachetelor, hidrolazele contribuind la distrugerea plachetelor și eliminarea trombilor.

Mitocondriile sunt în jur de 10/ placheta sanguină și furnizează energia indispensabilă funcțiilor de secreție și agregare.

CAPITOLUL 3. IMPLICAREA FENOMENULUI DE APOPTOZĂ ÎN CONSERVAREA HEMATIILOR ȘI PLACHETELOR

3.1. Noțiuni generale de apoptoză

În 1972 Kerr a introdus și dezvoltat conceptul de moarte celulară programată sau apoptoză, făcând astfel o diferență între cele două tipuri de moarte celulară. Termenul de apoptoză provine din cuvântul grec apoptosis (apo: departe de, care marchează un sfârșit și ptosis: cădere) folosit pentru a defini căderea frunzelor sau petalelor.

O definiție a morții celulare este de asemenea greu de dat, independent de tehnicile de determinare și măsură. Se acceptă astăzi subdivizarea morții celulare în trei categorii: moarte celulară "de Tip I sau apoptoză", "de Tip II sau autofagie" și "de Tip III sau necroză", care diferă prin morfologie, mecanism și incidență (Thompson et al., 2004). Fenomenul de moarte celulară poate să fie sau nu controlat fiziologic. În cazul în care aceasta este controlată fiziologic, ea poate fi caspaz-independentă (autofagie) sau predominant apoptotică.

Moartea celulelor dintr-un organism pluricelular este un fenomen fiziologic și joacă un rol important în embriologie și organogeneză, asigurând homeostazia organismului. Această moarte fiziologică este un proces determinat genetic și este cunoscută sub numele de apoptoză sau moarte celulară programată (PCD).

Apoptoza este o moarte silențioasă, curată, cu menținerea integrității membranei celulare, fără eliminarea în mediul extracelular a conținutului celular și în consecință, fără declanșarea unei reacții inflamatorii.

Contrar apoptozei care este un fenomen celular individual, necroza afectează ansamblul unui țesut supus unei agresiuni de mare intensitate (ischemie, arsură, traumatisme), este exploziv și acompaniat întotdeauna de o reacție inflamatorie. Cele două fenomene sunt foarte diferite și în consecință ușor de recunoscut. (Figura 20)

Moartea prin apoptoză poate să se producă în toate celulele unui organism pluricelular dar și în eucariotele unicelulare superioare, permițând eliminarea celulelor nedorite, precum celule lezate, aflate în exces, recunoscute ca “non-self “sau senescente.

Caracteristicile celulelor apoptotice

Schimbările morfologice și biochimice sunt aceleași pentru toate celulele care mor prin apoptoză, această uniformitate permițând o mai bună înțelegere a căilor intracelulare de activare a apoptozei care pot fi sintetizate astfel:

diminuarea taliei celulelor;

condensarea citoplasmei și a cromatinei;

înmugurirea membranei plasmatice datorate distrugerii citoscheletului sub acțiunea proteazelor specifice și formarea de corpi apoptotici conținând organite celulare și care vor fi fagocitați de către macrofage și celule dendritice (Desagher et al., 2000;

organite intracelulare intacte mult timp (mitocondria fiind funcțională mult timp);

modificarea structurii glicanilor din glicoconjugatele membranare, respectiv desializarea acestora (pierderea acidului sialic terminal);

pierderea asimetriei de membrană și externalizarea de fosfatidilserină (trecerea acestora de pe fața citoplasmatică a membranei la exteriorul membranei);

activarea de proteaze specifice apoptozei, cistein-proteaze, respectiv caspaze și calpaine ce vor determina proteoliza a numeroase proteine celulare;

eliberarea de citocrom C și AIF (Apoptosis Inducing Factor) mitocondrial în citoplasmă;

activarea endonucleazelor ce vor fragmenta ADN-ul mai întâi în fragmente mari de 300 kilobaze (kb) și de 50 kb și apoi în fragmente mai mici de 180 pb;

creșterea concentrației Ca2+ citoplasmatic.

Toate aceste schimbări sunt în contrast cu cele care se produc în necroză și care este caracterizată de următoarele modificări:

umflarea celulelor (mărirea taliei celulare);

organitele intracelulare sunt rapid alterate;

nucleul este mult timp intact;

distrugerea celulară se face prin explozie însoțită de un fenomen inflamatoriu.

Apoptoza este, în concluzie, un mecanism predeterminat și constituie o formă de moarte celulară programată, contrar necrozei care este o formă de moarte pasivă, întotdeauna patologică, declanșată de o agresiune.

Fig. 17. Schema de discriminare între apoptoză și necroză pe baza criteriilor morfologice.

(după un document Boehringer Mannhein)

Procesul de moarte celulară prin apoptoza include 3 etape:

Prima etapă – faza de inițiere care corespunde integrării semnalelor pro-apoptotice (ex.: leziuni celulare induse de agenți citotoxici, etc.) sau pierderii semnalelor anti-apoptotice;

A doua etapă – faza efectoare care implică activarea mașinăriei apoptotice, pe lângă mitocondrie, 3 familii de proteine, respectiv familia Bcl-2, familia de caspaze, molecula Apaf-1 (Apoptosis Inducing Factor).

A treia etapă – faza de degradare care corespunde degradării unor proteine celulare esențiale care conduce la modificările morfologice caracteristice, respectiv fragmentarea ADN-ului și modificările membranare.

Căile de derulare a apoptozei

Calea extrinsecă de derulare a apoptozei derulată prin intermediul „death receptors”

Marea majoritate a celulelor exprimă la nivelul membranei plasmatice receptorii "morții” iar interacția lor cu liganzii specifici activează programul de moarte celulară. Acești receptori aparțin superfamiliei de receptori TNF: 1) receptorul TNF-1, TNF-2; 2) Fas; 3) TRAMP (TNF-receptor-related apoptosis-mediated protein); 4) TRAIL 1 si TRAIL 2 (TNF-related apoptosis-inducing ligand), etc. Căile de semnalizare care induc apoptoza prin care acești receptori sunt asemănătoare. Legarea liganzilor de receptorii specifici induce oligomerizarea receptorilor urmată de recrutarea proteinelor adaptoare la domeniul DD din structura receptorilor. La rândul lor, proteinele adaptoare leagă o caspază ce determină activarea apoptozei. Calea de moarte Fas servește ca un paradigm pentru mașinăria de moarte în cazul celulelor eucariote și este similară cu semnalizarea indusă de receptorii TRAIL și TNF.

b) Calea intrinsecă de derulare a apoptozei- implicarea mitocondriei

În stadiul incipient al apoptozei, mitocondriile suferă două schimbări majore. În primul rând, membrana exterioară mitocondrială devine permeabilă pentru proteine ducând la eliberarea de proteine solubile inter-membranare: citocromul C și factorul de inducere al apoptozei AIF, ducând la activarea caspazelor și a DNazelor. Membrana mitocondrială externă devine permeabilă pentru proteine, în timp ce membrana interioară continuă să mențină proteinele din matricea mitocondrială. În consecință, numai proteinele din spațiul intermembranar solubile sunt eliberate de o manieră masivă și nespecifică (Patterson et al., 2000). În cele mai multe cazuri, celulele manifestă o scădere a potențialului de membrană internă mitocondrială (ΔΨm), fenomen care precede de multe ori degradarea ADN-ului (Zamzami et al., 1995). În controlul stării de permeabilitate tranzitorie a porilor mitocondriali, proteinele Bcl-2 au un rol cheie. Bcl-2 aparține unei familii de proteine care pot inhiba (Bcl-2, Bcl-xl,) sau induce apoptoza (Bax, Bcl-xs Bik, Bad) și este localizată la nivelul membranei externe mitocondriale, a reticulului endoplasmic și al membranei nucleare. Echilibrul între exprimarea proteinelor aparținând familiei Bcl-2 și Bax reprezintă un mecanism cheie în menținerea în viață a celulelor.

Scăderea ΔΨm este un eveniment ireversibil al procesului apoptotic, reglat de către membrii familiei Bcl2/Bax.

Activitatea proteinei Bcl-2 este modulată de proteinele pro-apoptotice ale acestei familii. Hiperexpresia proteinei previne diminuarea potențialului membranar mitocondrial (m) ce precede apoptoza indusă de glucocorticoizi, oxidanți, ceramide, dar nu și apoptoza indusă de caspaza-1. Bcl-2 inhibă eliberarea de AIF (Apoptosis Inducing Factor) dar nu interferă cu formarea de AIF intra-mitocondrial. S-a demonstrat că acumularea de Bcl-2 la nivelul membranei nucleare a celulelor nu protejează împotriva condensării cromatinei și nici a fragmentării ADN-ului induse de AIF, demonstrându-se astfel că Bcl-2 nu interferă cu activitatea factorului AIF.

Inducera apoptozei determină și eliberarea nucleazei citosolice CAD (Caspase-Activated DNAase). În mod normal ea este cuplată cu ICAD (Inhibitory of CAD) iar sub influența semnalului pro-apoptotic este eliberată prin clivaj de către caspaza-3. CAD migrează către nucleu și induce fragmentarea internucleosomală a ADN-ului. În citosol, citocromul C, în prezență de ATP și proteină Apaf-1 activează caspaza-9 care la rândul său activează o cascadă de caspaze. Proteina Apaf-1 este o proteină adaptatoare care, în prezență de citocrom C recrutează molecule de procaspaza-9. Complexul multimeric format de citocrom C, Apaf-1 și procaspaza-9, în prezență de ATP, formează apoptozomul.

În afară de angajarea receptorilor morții celulare, numeroase alte semnale sunt capabile să inducă apoptoza. Dereglarea acestor căi joacă un rol important în fiziopatologia numeroaselor maladii umane, precum cancerul. Dereglările genetice ce determină alterări ale morții celulare fiziologice contribuie la expansiunea clonală a celulelor maligne.

Un alt exemplu îl reprezintă proteina p53 supresoare de tumori. Când ADN-ul suferă leziuni, proteina p53 inhibă trecerea celulelor de la faza G1 la faza S a ciclului celular, ceea ce permite enzimelor de reparare a ADN-ului să intervină. Dacă leziunile sunt prea mari, p53 favorizează moartea celulară prin apoptoză (prin diminuarea expresiei genei bcl-2), ceea ce evită replicarea ADN-ului cu erori și proliferarea celulelor anormale. Când proteina p53 este inactivată (prin expunerea celulelor la UV_____________________________________), nu mai este posibilă eliminarea prin apoptoză a celulelor cu leziuni ale ADN-ului, ceea ce favorizează apariția celulelor maligne.

Moleculele implicate în apoptoză

a) Caspazele

Enzimele implicate în clivajul proteinelor intracelulare sunt denumite caspaze (Cistein ASPartat proteAze) și reprezintă o familie de proteaze ce clivează ținta lor după un acid aspartic, de partea carboxi-terminală. Ele joacă un rol esențial în apoptoză dar și în reacțiile inflamatorii, în diferențierea celulară.

Caspazele sunt sintetizate sub formă de pro-enzime inactive (zymogene) și devin active ca răspuns la acțiunea stimulilor apoptotici. Din punct de vedere biochimic, pro-caspaza (32-56 kDa) are următoarea structură: 1) un prodomeniu N-terminal; 2) o subunitate mare (17-21 kDa); 3) o subunitate mică (10-13 kDa); 4) o regiune scurtă de legătură, între subunitatea mică și cea mare; 5) prodomeniul N-terminal ce poate avea o lungime variabilă și este implicat în reglarea activării caspazelor.

Activarea caspazelor se face prin clivaj proteolitic după un acid aspartic de partea C-terminală. Forma activă a enzimei este un tetramer format din 2 subunități mari și 2 mici.

Activitatea enzimelor este modulată prin: 1) nivelul lor de transcripție; 2) localizarea lor subcelulară; 3) modificări post-transcripționale – fosforilare; 4) interacția lor cu familia de proteaze IAP (Inhibitor of Apoptosis Proteins) sau cu familia bcl-2; 5) competiția lor cu analogi inactivi de FLIPS (viral FLICE inhibitory proteins).

Toate caspazele prezintă două caracteristici importante: a) sunt cistein-proteaze ce conțin un pentapeptid conservat QACXG, având o cisteină în situl activ; b) au o mare afinitate pentru clivajul peptidelor legate printr-un C- terminal la un rezidu aspartat. Caspazele recunosc un sit ce cuprinde un aspartat în P1 și un reziduu anionic de aspartat în P4 (sit de tip DXXD). Prezența unor reziduri de aspartat în structura caspazelor reprezintă o caracteristică structurală importantă care permite clivarea pro-enzimelor inactive la nivelul acestor reziduri cu obținere de enzime active. Unele caspaze se autoclivează iar altele sunt clivate de către alte cistein- proteaze. Activarea secvențială a caspazelor a condus la conceptul de cascadă a caspazelor prezentat în Figura 23.

Caspazele de inițiere (procaspazele -2, -8, -9, -10) precum și caspazele ”inflamatorii” (procaspazele -1, -4, -4, -5, -11, -13 și care cu puține excepții nu sunt implicate în apoptoză) conțin un prodomeniu mare, de aproximativ 100 aminoacizi..

Caspazele efectoare (procaspazele 3, -6, -7) au un prodomeniu mic, de aproximativ 20 aminoacizi. Prodomeniul mare conține motive distincte, printre care și domeniile efectoare ale morții (DED) prezente în structura pro-caspazelor -8 și -10 dar și domeniile de recrutare ale caspazelor (CARD) ce se găsesc în structura procaspazelor -1, -2, -4, -5 și -9 și care sunt importante pentru activarea acestora.

Există două căi intracelulare de activare a caspazelor: legarea ligandului de un receptor al morții sau eliberarea factorilor apoptotici mitocondriali.

Procaspazele se găsesc în compartimentele intracelulare precum mitocondrii, reticul endoplasmic, nucleu, citosol, iar localizarea subcelulară a proenzimei este adesea diferită de cea a desfășurării acțiunii caspazelor. Mai multe caspaze, după ce au fost activate, sunt transferate în alte compartimente celulare unde vor cliva proteine specifice. Rolul caspazelor nu este restrâns doar la apoptoză. S-a arătat că unele caspaze (-1, -4, -5, -11) contribuie la maturarea citochinelor (interleuchina 1b) în cursul procesului inflamator. Lucrări recente sugerează faptul că ele nu ar fi indispensabile, în toate cazurile, la declanșarea apoptozei.

Dintre proteinele clivate de către caspaze în timpul apoptozei putem aminti: proteine structurale, proteine de semnalizare, factori reglatori ai transcripției și translației, factori implicați în repararea ADN și clivaj, factori reglatori ai ARN, factori reglatori ai interacției celulă-celulă, factori reglatori ai citochinelor proinflamatorii sau factori reglatori ai apoptozei, etc. Detecția de activare a caspazelor reprezintă criteriul care face distincția între apoptoză și necroză. Până în prezent, nici o activare a caspazei nu a fost pusă în evidență în procesul de necroză.

b) Calpainele

Aceste proteaze reprezintă o altă famile de enzime (cistein proteaze dependente de Ca2+) care se găsesc în marea majoritate a celulelor mamifere, împreună cu inhibitorul lor proteic, calpastatin. (www.calpain.org. CaMPDB- Calpain for Modulatory Proteolysis). Calpainele și calpastatinul reprezintă un sistem reglator intracelular. Cu toate că structura și propritățile enzimatice au fost bine caracterizate, funcțiile fiziologice ale calpainei rămân încă neclare. Activitatea calpainelor este reglată de concentrația intracelulară de Ca2+ si de calpastatin, de asemenea o proteină endogenă ubiquitară.

Există două izoforme de calpaină: calpaină m și și fiecare izoformă este formată din două subunități: subunitate mică ce cuprinde două domenii și una mare cu patru domenii. La ambele izoforme, subunitatea mică este identică. Calpaina este activată la o concentrație mare de Ca2+ ( 10-3 M) iar cea m la o concentrație mai mică. Concentrația necesară de Ca2+ pentru activarea calpainelor, este în general de 3-5 ori mai mare decât concentrația fiziologică intracelulară. Calpainele m sunt calpaine de clasă II iar cele sunt de clasă I. Semnificația fiziologică a co-existenței într-o celulă a celor două tipuri de clase de calpaine este necunoscută.

3.2. Implicarea fenomenului de apoptoză în durata de viață a hematiilor si plachetelor sanguine

Toate celulele animale nemaligne au o durată definită de viață. Apoptoza, sau moartea celulară programată este acum apreciată ca principalul mecanism fiziologic care reglează durata de viață a celulei și servește la eliminarea controlată a celulelor nedorite. Apoptoza a fost mult timp atribuită exclusiv celulelor nucleate. Această dogmă a fost atât de puternică încât a luat mai mult de 20 de ani pentru a recunoaște apoptoza în citoplasma celulelor anucleate.

3.2.1. Îmbătrânirea hematiilor – un fenomen de apoptoză

Zilnic, aproximativ 360 milliarde hematii (3-4 milioane/secunda) sunt scoase din circulație în absența oricărui fenomen inflamatoriu, cu asigurarea homeostaziei organismului.

Asemănarea între fenotipul de senescență eritrocitară și cel al unei celule in apoptoză, a condus la emiterea ipotezei că senescența eritrocitară poate fi un fenomen de apoptoză chiar și pentru cazul particular al eritrocitelor umane, celule lipsite de mitocondrii și nucleu.

Argumentele care au stat la baza emiterii ipotezei că eritrocitele mor printr-un fenomen de apoptoză au fost următoarele:

1. Durata de viață determinată. Eritrocitele umane sunt programate să supraviețuiască în circulația sanguină pentru 120 zile înainte de a fi fagocitate de macrofagele sistemului reticulohistiocitar.

2. Diminuarea progresivă a taliei prin emisia de vezicule/modificări morfologice ale hematiei. Diminuarea progresivă a taliei celulare este legată de emisia de vezicule și începe încă din măduva hematopoietică, din faza de proeritroblast, fiind un fenomen însoțit de modificări morfologice așa cum se observă din Tabelul 1 și Figurile 24, 25, trecând de la forma discocitară (A) la forme echinocitare (B, C și D) ale hematiilor îmbătrânite și în final, la forme sferocitare (E și F) de hematii senescente, singurele care vor fi capturate de către macrofage și singurele care vor fi fagocitate.

Tabelul 1. Diminuarea taliei eritrocitelor în timpul evoluției de la pro-eritroblast la hematia senescentă

Ansamblul acestor fenomene este legat de un atac destructiv al spectrinei din citoscheletul hematiilor, care a fost ilustrat extrem de clar prin Western blotting cu ajutorul anticorpilor anti-spectrină de (Berg et al., 2001).

Fig. 18. Transformarea indusă de fenomenul de îmbătrânire asupra eritrocitului A-discocit; B-D echinocit;E – sferochinocit cu spiculi; A-D sunt forme reversibile; E și F sferochinocite fagocitate de macrofage

(după Weed et al., 1974)

Fig. 19. Analiza prin microscopie de scanare (SEM) a morfologiei normale (A) și în apoptoză (B) indusă cu Ca2+ a hematiilor umane. Săgețile indică veziculizarea membranei și formarea de microvezicule (corpi apoptotici)

(după Bratosin et al.,1997)

3) Alterarea citoscheletului prin acțiunea unor proteaze sau calpaine care conduc la modificări de morfologie celulară.

Conținutul în proteine al membranei eritrocitare rămâne constant sau cu o ușoară descreștere odată cu îmbătrânirea celulară, care poate fi explicată fie prin ipoteza eliminării de vezicule proteice pure și/sau prin proteoliză. În 1992, Inaba et al. demonstrează că deamidarea restului Asn 502 este responsabil în cazul hematiilor umane, de conversia proteinei 4.1. b la 4.1. a, fiind un excelent marker pentru celulele bătrâne (Inaba et al., 1992), conducând la schimbări conformaționale ale proteinei și la formarea unui complex stabil cu complexul spectrină-actină și prin aceasta, ancorarea la citoschelet. Legarea ei de asemenea la glicoforină, banda 3, calmodulin, și miozina lămurește semnificația biologică deosebită a acesteia.

În 1975, M.M.B. Kay, pentru prima dată a demonstrat acumularea de produși de degradare a benzii 3 la eritrocitele bătrâne, localizându-i prin "immunoblotting" și sugerând pentru unul dintre acești produși a fi un "antigen celular de senescență" (SCA) (Kay et al., 1975) cu o masă moleculară de aproximativ 62 kd. SCA a fost izolat și identificat, fiind probabil generat prin modificarea unei proteine preexistente. Astfel, SCA este imunologic asemănător benzii 3 și deci poate fi derivat din aceasta.

În 1992, M. Beppu sugerează că determinantul antigenic al benzii 3 este localizat în lanțul glucidic sialilat poli-N-acetillactozaminic (Beppu et al., 1992) și în concluzie nu poate fi un neo-antigen format prin modificări chimice, ci cel mult prin alterări topologice ale moleculelor în membrană.

4) Desialilarea și capturarea hematiilor de către macrofage. Membranele hematiilor sunt bogate în glicoconjugate (glicoproteine și glicolipide), precum glicoforina A, glicoproteină care reprezintă 52 % din proteinele membranare totale și care conține 25% acid sialic sau 80% din totalul de acid sialic din membrană. Asemenea tuturor celulelor nucleate în apoptoză, sub acțiunea neuraminidazelor membranare, glicoconjugatele membranare sunt desialiate progresiv (Bratosin et al., 1995) ceea ce conduce la apariția de resturi de galactoză și in consecinta la eliminarea lor din sângele circulant prin capturarea acestora de către macrofage (Halbhuber et al., 1972, Bratosin et al., 1998). Această desialilare poate fi de asemenea, rezultatul pierderii glicoproteinelor și/sau glicolipidelor prin formarea de vezicule.

5) Pierderea asimetriei de membrană a dublului strat lipidic și externalizarea de fosfatidilserină.

Membrana eritrocitară a hematiilor respectă modelul general de organizare unde marea majoritate a fosfatidilserinei se află în poziție intra-citoplasmatică. În cursul îmbătrânirii hematiei, aceasta este externalizată la suprafața celulei fiind responsabilă de fagocitarea hematiilor (Schroit et al., 1985, McEvoy et al., 1986, Bratosin et al., 1998). Externalizarea fosfatidilserinei conduce de asemeni la aderarea hematiei la peretele celulelor endoteliale. Șocul osmotic (Lang et al., 2004), stresul oxidativ, eliminarea de Cl- extracelular sau diminuarea cantității de energie, conduc la creșterea unei conductibilități non selectivă a cationilor Ca2+ (Brand et al., 2003, Duranton et al., 2003) ceea ce activează un canal membranar permeabil pentru Ca2+ și la activarea unei scramblaze care expune fosfatidilserina la suprafața membranei eritrocitare. Influxul ionilor de Ca2+ în citosolul hematiei este bine cunoscut în urma experimentelor realizate de Aiken et al. 1992 și de Romero & Romero, 1999. Apoptoza eritrocitară este stimulată și de un ceramid format în celule prin activarea PAF – dependent de o sfingomielinază, scramblaza fiind sensibilă la ionii de calciu prin acest ceramid (Lang et al., 2004).

Alte studii au evidențiat de asemeni moartea eritrocitelor dependente de Ca2+ cu externalizarea de fosfatidilserină (Bratosin et al., 2001) sau inducerea acesteia de către diferite metale sau medicamente (Lang et al., 2015).

6) Activarea caspazelor -3 si -8. Studii realizate de echipa condusă de Mandal au demonstrat că stresul oxidativ activează caspaza -3 in vitro (Mandal et al., 2002) și că intervine in vitro prin degradarea benzii 3 (Mandal et al., 2003). În 2009, Bratosin și colaboratorii au demonstrat existența caspazelor -8 și -3 active în eritrocitele izolate din sângele circulant pe un suport cu Annexina V imobilizată. Astfel, a fost evidențiată pentru prima dată prezența de caspaze active în fracția de eritrocite circulante care exprimau reziduri de fosfatidilserină la suprafață (Bratosin et al., 2009).

Pe scurt, demonstrarea existenței unui fenomen de apoptoză în eliminarea hematiilor senescente și a evidențierii caspazelor în eritrocit este următoarea:

1999 – Bratosin et al. raportează că moartea programată a eritrocitelor umane (PCD) indusă printr-un influx de Ca2+ este blocată cu inhibitori de proteaze (Ac-YVAD-CHO, Ac-DEVD-cmk, Z-VAD-fmk), considerați specifici pentru caspaze și leupeptina și E-64, inhibitori specifici pentru calpaine, demonstrând pentru prima dată că fagocitoza eritrocitelor senescente are loc la sfârșitul unui fenomen de apoptoză ( Bratosin et al., 1999).

2001 – Doi ani mai târziu, Bratosin et al. și Berg et al., raportează simultan că moartea programată a eritrocitelor poate fi indusă cu un influx de Ca2+ și prevenită cu inhibitori de caspaze și calpaină, evidențiind tot pentru prima dată existența de caspaze sub forma lor inactivă de procaspaze. (Bratosin et al., 2001, Berg et al., 2001) În editorialul revistei Cell Death and Diferentiation unde au apărut cele 2 articole, Daugas et al., propun ca acest fenomen de apoptoză eritrocitară să fie numit ‘‘erythroptosis’’ (Daugas et al., 2001).

2002- S-a evidențiat că sub influența unui stres oxidativ mediat de t-butilhidroperoxid, procaspaza-3 prezentă în eritrocitele umane mature poate fi activată, ceea ce conduce la externalizarea de fosfatidilserină și la eritrofagocitoză (Mandal et al., 2002).

2005- S-a raportat că Fas-ligarea induce activarea caspazei -8 în RBCs (Mandal et al., 2005).

2007- Activarea caspazelor-8 și -3 ca și clusterizarea benzii 3 a fost observată de asemenea in vitro de către Pietraforte și colaboratorii săi în apoptoza eritrocitelor umane indusă de peroxinitriți (Pietraforte et al., 2007). Makherjee et al. au raportat faptul că 9-O-acetilat GD3 induce un program de moarte celulară și activarea in vitro a caspazei -3, iar grupul lui Kriebardis raportează pentru prima dată caspaze active și clivarea benzii 3 în RBCs stocate (Kriebardis et al., 2007).

2009 – Bratosin et al. au evidențiat pentru prima dată prezența de caspaze active in vivo în eritrocitele circulante (Bratosin et al., 2009).

Din 1999 și până astăzi conceptul de apoptoză eritrocitară a fost acceptat și numeroase grupuri de cercetare încearcă să contribuie la elucidarea acestui tip particular de apoptoză, într-o celulă lipsită de organitele esențiale derulării acestui fenomen, respectiv absența mitocondriei și a nucleului. Grupul lui Lang F. a publicat între 2005 și până în prezent peste 250 de articole, numind această apoptoză a hematiilor „ eryptosis”, fără ca mecanismul de derulare să fie complect elucidat.

Fig. 21. Analiza prin microscopie confocală a eritrocitelor umane senescente după dubla colorare pentru activitatea caspazei-8 (A) și -3 (B) folosind CaspGLOWTM (colorație verde) și pentru externalizare de fosfatidilserină folosind Annexin-V-PE (colorație roșie). B1: Forma discocitară. A2, A3, și B3: Forme modificate. A1 și B2: imagini care arată în mod clar locația citosolică a caspazei-8 și -3. Bar: 10 μm.

(după Bratosin et al., 2009)

7) Activarea calpainelor

Fără a dispune de componentele esențiale ale cascadei mitocondriale de activare a caspazelor, respectiv Apaf-1, citocromul c și caspaza -9 (Berg et al., 2001), intervenția calpainelor în moartea hematiilor a fost pusă în evidență prin inhibarea lor specifică cu ajutorul peptidelor naturale (leupeptina) sau de sinteză (E-64) de către Bratosin et al. (Bratosin et al., 2001). În cursul îmbătrânirii, concentrația de Ca2+ crește progresiv având loc autoactivarea procalpainei inactive în calpaina activă și inactivarea activitatea calpastatinului (inhibitorul natural de calpaina) pentru ca în final calpaina să atace citoscheletul, antrenând modificările morfologice ale hematiei.

8) Eliminarea de corpi apoptotici și fagocitarea de către macrofage

Pe parcursul duratei de viață de 120 zile, volumul eritrocitar scade cu timpul, însoțit de o creștere a densității celulare în special în prima parte a vieții și de o diminuare a conținutului în hemoglobină în cea de-a doua (Werre et al., 2004). Aceste modificări sunt asociate cu o pierdere de colesterol, de fosfolipide și cu o diminuare liniară a suprafeței celulelor cu 20 %, toate ducând la o pierdere de membrană în timpul îmbătrânirii. Această pierdere ar putea fi ușor explicată prin formarea de microvezicule de către eritrocitele de toate vârstele, împreună cu vezicule derivate din eritrocite mai bătrâne, care conțin mai multă hemoglobină.

Generația de vezicule îmbogățite în hemoglobina denaturată este o parte integrantă a procesului de îmbătrânire al eritrocitelor. Aceste vezicule sunt, de asemenea, capturate de celulele Kupffer, caz în care expunerea phosphatidilserinei joacă un rol important. Mai mult, antigenele de senescență SA sunt prezente pe aceste vezicule. Astfel, veziculele și eritrocitele senescente pot fi capturate și fagocitate prin aceleași semnale (Bosman et al., 2008).

Printre receptorii care intervin la nivelul macrofagelor pentru recunoașterea membranei eritrocitare în timpul senescenței, sunt de remarcat: receptorii de fosphatidilserină. Macrofagele interacționează în mod specific cu fosphatidilserina, fie direct, prin intermediul receptorilor (CD36, receptorul LDL, sau "scavenger"), sau indirect, prin intermediul moleculelor de legale secretate de macrofage (MFG-E8).

Pentru unii autori, cum ar fi (Kay et al., 1975), în crearea unui "antigen celular de senescență (SCA) sunt implicate proteine modificate ale benzii 3, în particular prin proteoliză (în cele mai multe cazuri indusă de calciu), antrenând de asemenea o schimbare conformațională care induce fixarea de IgG auto-imune și o fagocitoză mediată prin receptorii Fc. (Kay et al., 2004).

Pentru alții, recunoașterea este de natură glucidică, precum: i) glicani ai glicoforinei pentru (Henrich et al., 1983), formând "senescent factor glycopeptide (SFG), ii) legătura α-galactosil pentru (Galili et al., 1983), iii) glicani poli-N- acetillactosaminic ai benzii 3 pentru (Beppu et al., 1992). Hematiile sunt capturate de către macrofage, grație unei β-galactolectine prezentă în membranele de macrofage. Această captură este inhibată competitiv de către β-galactozidaze, cum ar fi lactoza (Bratosin et al., 1995). Rezidurile de acid sialic se comportă ca niște semnale de anti-recunoaștere, în timp ce reziduurile de β-galactoză demascate prin desialilare sunt semne de recunoaștere și de captare a hematiilor de către macrophage.

Stresul oxidativ poate contribui la formarea de neo-antigene, dar, de asemenea, poate provoca o acumulare de "lipoproteine de joasă densitate (LDL) oxidate. Lipoproteinele modificate prin oxidare pot fi apoi recunoscute de către "scavenger receptors" din membranele macrofagelor antrenând fagocitarea, independent de opsonizarea eritrocitelor (Braumont et al., 2005). Activarea complementului, probabil că nu este implicată. CD47, cunoscut de asemenea sub numele de IAP (Integrin-associated membrane protein), controlează procesul de adeziune (McDonald et al., 2004) la fel ca un semnal de antifagocitoză (Bessus et al., 2005). CD47 a fost implicat în calitate de ligand pentru receptorul SHPS -1 (Jiang et al., 1999, Seiffert et al., 1999).

Creșterea concentrației plasmatice de glucoză, în diabetul zaharat, duce la glicozilarea non-enzimatică (glicare) a diferitelor proteine extra-și intracelulare. Acești compuși ce rezultă din condensarea non-enzimatică a monozaharidului, care reacționează sub forma sa aldehidică cu grupările -NH2 libere ale proteinelor, conducând la un derivat aminat (bază Schiff), care, în conformitate cu "reorganizarea Amadori", se transformă într-o amidă stabilă, care formează « Advanced Glycation End Products ». (Schmidt et al., 1992) au identificat doi receptori pentru produsele de glicare avansate (AGE), exprimate pe suprafața macrofagelor și celulelor endoteliale la care se leagă (AGE).

Eritrocitele de subiecți cu diabet zaharat au o aderență anormală la celulele endoteliale umane în cultură (Wautier et al., 1999). Unul dintre acești receptori este de tip lactoferină și altul are greutatea moleculară de 35 kDa, se leagă de proteinele glicate și celule roșii ale subiecților cu diabet zaharat. Această moleculă de 35 kDa a fost purificată, caracterizată și clonată. Ea este considerată receptor pentru AGE și denumită RAGE. Receptorii aparțin superfamiliei imunoglobulinelor. Așa cum a fost recent explicat, captura, este urmată de fagocitarea celulelor apoptotice din sângele circulant, a hematiilor în particular (Ando et al., 1999, Vlassara et al., 1987). (Ando K., 1999) precum și cea a proteinelor plasmatice în "apoptoza moleculară".

În ceea ce privește rolul anticorpilor în eritrofagocitoză, în timpul senescenței, în membrana hematiilor apar multe schimbări și cel puțin două mecanisme par să coexiste pentru a permite recunoașterea și internalizarea eritrocitelor senescente de către macrofage, unul care corespunde căii clasice dependente de imunoglobuline (Beaumont et al., 2005), iar celălalt unei căi alternative independentă de imunoglobuline (Bratosin et al., 2002). În urma tuturor studiilor întreprinse, se poate afirma că eritrocitele au capacitatea de a se autodistruge la sfârșitul duratei de viață specifice sau ca răspuns la anumiți factori de mediu. Acest lucru indică faptul că supraviețuirea, durata de viață și moartea eritrocitelor sunt reglate la fel ca și în cazul altor celule, printr-un fenomen de apoptoză.

În studiile realizate pe modele de apoptoză in vitro, în absența fagocitelor, celulele apoptotice evoluează la necroză secundară.

Concluzia propusă în prezent plasează hematia la faza terminală a unui proces apoptotic al cărui scop este de a-i da naștere, și care face din eritrocit un produs post-apoptotic. Această evoluție a eritroblastului la eritrocit presupune două etape: prima, nucleată, numită eritroblastică și a doua, anucleată, denumită eritrocitară (Figura 28).

1 – Faza nucleată marchează trecerea de la eritroblastul imatur la eritroblastul matur și se caracterizează prin activarea caspazelor -3, -6 și -7 prin intermediul Fas ligand. Aceasta este inhibată de oncogena anti-apoptotică Bcl-XL, a cărei activare de către eritropoietină, protejează eritroblaștii de apoptoză.

2 – Faza anucleată este legată de activarea caspazelor și este dependentă de DNAza II macrofagică. Ea include expulzarea organitelor citoplasmatice din eritroblaști. Încă din anul 1971, Bessis și Danon au descoperit, un mecanism de apoptoză prin aplicarea microscopiei electronice, descriind în detaliu enuclearea eritroblaștilor și distrugerea mitocondriilor, reticulului endoplasmatic și citoscheletului. (Bessis et al., 1971 & 1973, Danon et al., 1971) Danon et al. în 1971 și Testa în 2004, au demonstrat că nucleele expulzate sunt inconjurate de membrana plasmatică a eritroblastului ceea ce conferea acestora un caracter electronegativ inferior comparativ cu cel al eritroblastului imatur. Aceasta poate fi considerată prima observație referitoare la corpii apoptotici și că ea semnala desializarea caracteristică a membranei celulelor din apoptoză. Mecanismul de eliminare și de fagocitoză a nucleului a fost raportat de către (Yoshida et al., 2005).

Putem considera că hematia matură se află în faza terminală de execuție a unui proces apoptotic (Testa et al., 2004), concluzie împărtășită de (Morioka et al., 1998, Bossman et al., 2008), proces început în faza terminală de diferențiere a liniei roșii.

Așa cum este prezentat în Figura 28 treptat, citoplasma este eliberată de incluziunile sale pentru a deveni un fel de „mumie”, conform editorialulului lui Daugas et al., 2001) care propune utilizarea termenului de erythroptosis pentru moartea programată a hematiilor.

Ulterior, (Lang et al., 2005) au renumit fenomenul de „erythroptosis” în "eryptosis", din motive personale de asumare a acestui nou concept în biologie. În ciuda progreselor din ultimii ani din domeniul mecanismelor celulare și moleculare ale morții programate a RBCs, acesta rămâne încă incomplet descifrat.

3.2.2. Alterările RBCs în timpul prelevării și conservării hematiilor în centrele de transfuzii

Transfuzia de RBCs are rolul de a îmbunătăți transportul de oxigen către țesuturi. În ciuda datelor fiziologice extinse, indicațiile care să pledeze pentru necesitatea realizării unei transfuzii sunt încă controversate. Transfuziile de RBCs se administrează cel mai adesea la pacienții care au suferit intervenții chirurgicale sau se află la terapie intensivă (Vincent et al., 2002, Rao et al., 2002, English et al., 2002, Shapiro et al., 2003).

Înainte de a fi transfuzate, eritrocitele pot fi stocate în condiții controlate pentru o perioadă de până la 42 zile, însă în timpul stocării apar numeroase modificări. Se apreciază că RBCs stocate sunt alterate fundamental în timpul procesării și depozitării, într-un mod care afectează atât eficiența transportului de oxigen dar și prin alte riscuri suplimentare de perturbare a sistemelor imunitar și de coagulare. În mod generic schimbările morfologice și fiziologice ale RBCs rezultate din depozitare au fost denumite „leziuni de stocare” (storage lesion), ele alterând funcția biologică a eritrocitelor (Tinmouth et al., 2006).

În condițiile actuale ale transfuziei sanguine, mai mult de 30% din ele sunt eliminate din circulație în decursul a 24 ore și 75% după 48 ore de la transfuzie (Mollison et al., 1984 & 1985, Luten et al., 2008), ceea ce ridică problema eficienței actului transfuzional și al consecințelor negative induse la pacienții politransfuzați. Consecințele clinice ale acestui fenomen au fost prima dată raportate în 1970 (Figura 29).

Deși identificate de mult timp, până în prezent, natura leziunilor de stocare (storage lesions) nu a putut fi pe deplin înțeleasă (Beutler et al., 2000). O ipoteză majoră sugerează existența unui fenomen de senescență eritrocitară accelerată, rezultând într-o recunoaștere a acestora ca „non-self” și o eliminare rapidă din circulație (Messana et al., 2000).

Fig. 23. Interacția dintre RBCs și beneficiarii transfuziei, ca o consecință a primirii hematiilor alterate prin procesare și stocare. Figura ilustreaza faptul că leziunile de stocare se suprapun căilor de transport a oxigenului, reologiei și fiziologiei hematiilor, precum și modularea imună. MOF: insuficiența multiplă de organe, NO: oxid nitric

(după Doctor & Spinella, 2012)

În timpul stocării, adenozin-trifosfatul (ATP) scade, dând naștere la modificări ale formei eritrocitelor, la scăderea conținutului în lipide al membranei și la o rigiditate celulară (Dern et al., 1967, Rumsby et al., 1977, Latham et al., 1982, Greenwalt et al., 1984, Dern et al., 1967).

Fig. 24. Distribuția formelor morfologice în timpul conservării hematiilor la 4°C.

(după Rumsby,1977)

Multe cercetări prezintă schimbările care apar prin stocarea RBCs (Spinella et al., 2007, Marik et al., 1993, Napolitano et al., 2004, Raghavan et al., 2005, Tinmouth et al., 2006). celulele metabolizează glucoza din soluția de conservant, apare producția de lactat, începe să scadă pH-ul, să crească concentrația de potasiu, hemoglobina liberă și fierul sunt eliberate din celulele roșii hemolizate iar lipidele membranare sunt magazinate sub formă de vezicule (Latham et al., 1982, Beutler et al., 1988, Greenwalt et al., 1990, Siliman et al., 1994). Ele limitează pasajul prin microcirculație, apare o creștere a agregării RBCs și a adeziunii la endoteliu (Bennett-Guerrero et al., 2007, Luk et al., 2003, Hovav et al., 1999, Yedgar et al., 1999).

Concentrația 2,3-DPG scade o dată cu timpul de stocare (Bennett-Guerrero et al., 2007), ceea ce scade afinitatea pentru oxigen (Apstein et al., 1985). Fosfatul organic care se leagă de deoxihemoglobină și facilitează livrarea de oxigen și 2,3-difosfoglicerat (DPG) devin nedetectabile după o săptămână de stocare a eritrocitelor iar după transfuzia de celule sărăcite în DPG. Aceste observații au pus accent pe ideea că eritrocitele stocate ar putea să nu livreze suficient oxigen la pacienții bolnavi critic. Impactul clinic al pierderii de DPG a fost însă dificil de evidențiat, poate și din cauza faptului că este regenerat in vivo și aproape restabilit în prima zi de la transfuzie (Valeri et al., 1969).

Câteva studii sugerează faptul că leziunile de stocare pot fi responsabile de complicațiile asociate transfuziilor, ca imunosupresia și sindromul de "insuficiență multiplă de organ" (Purdy et al., 1997, Offner et al., 2002).

RBCs stocate afectează de asemenea sistemul imun inducând alterări ale citokinelor, inclusiv creșterea IL-6, IL-8, fosfolipaza A2 și anionii superoxid cu scăderea concentrațiilor de TNF-α (Karam et al., 2009, Zallen et al., 2000).

Geneza microparticulelor RBCs în timpul stocării (Figura 30) poate fi asociată cu influența transfuziei asupra sistemelor imunitar și de coagulare ale donorului (Xiong et al., 2011).

Fig. 25. Evidențierea fenomenului de veziculizare a hematiilor conservate pentru 42 de zile în SAGM prin microscopie electronică de scanare (SEM)

(după Bratosin et al., in press)

Leziunea oxidativă care apare în timpul stocării duce la formarea de microparticule pe membrana RBCs și la eliberarea de lipide bioactive din membrană (Kriebardis et al., 2008). Aceste microvezicule conțin antigene CD47 asociate cu inhibarea magrofagelor (0). Alte date sugerează că valorile crescute de fosfolipide procoagulante apar datorită stocării RBCs (Cardo et al., 2008). Aceste lipide bioactive, precum lizofosfatidilcolina, au de asemenea acțiune proinflamatorie și sunt asociate cu un risc crescut de leziuni pulmonare acute (Siliman et al., 1994).

Disfuncția sistemului imun, secundară transfuziei, a fost denumită TRIM (Transfusion Related Immune Modulation sau Modulare Imuna Asociata cu Transfuzia) (Blajchman et al., 2002, Blumberg et al., 2005). Interesant este faptul că transfuzia RBCs stocate o perioadă mare de timp a fost asociată cu leziunile pulmonare acute asociate cu transfuzia (TRALI, Transfusion Related Acute Lung Injury) via mecanismelor proinflamatoare (Siliman et al., 2004).

Eficiența transfuziei RBCs în funcție de durata lor de stocare

În timp ce transfuzia RBCs crește hematocritul (Hct) și astfel crește și conținutul de oxigen, acest fapt nu înseamnă neapărat că transportul de oxigen către țesuturi este de asemenea crescut. Scopul transfuziei nu este de a crește conținutul în oxigen ci de a îmbunătăți transportul de oxigen la țesuturi.

În general, modelele animale au demonstrat efecte adverse ale stocării asupra transportului de oxigen (d'Almeida et al., 2001, Bommel et al., 2001, Fitzgerald et al., 1997). În timpul depozitării RBCs se produc modificări funcționale ale acestora care alterează funcția biologică și abilitatea de a transporta oxigen (Tinmouth et al., 2006). La oameni, s-a măsurat transportul și consumul oxigenului înainte și după transfuzia RBCs la pacienții bolnavi critic și s-a raportat o lipsă a beneficiilor raportată direct cu transfuzia RBCs. Deși este dificil a se determina eficiența transfuziei RBCs și sunt multe obstacole în măsurarea aportului de oxigen la nivel tisular sau celular, sunt multe studii care sugerează că transfuzia RBCs stocat poate avea efecte adverse asupra fluxului microcirculator și a utilizării oxigenului. Multe leziuni de stocare apar în cazul sângelui stocat o perioadă mare de timp. Când RBCs bătrâne (21-42 zile de stocare), au fost comparate cu RBCs proaspete (0-4 zile de stocare), s-au observat creșteri ale răspunsului inflamator, leziuni oxidative și risc de hipercoagulare (Bennett-Guerrero et al., 2007, Zallen et al., 2007, Cardo et al., 2008, Sweeney et al., 2009, Biffl et al., 2001).

Pe lângă rolul lor de a transporta oxigen, RBCs joacă un rol fundamental în reglarea dependentă de oxigen a tonusului vascular prin exportarea de semnale vasodilatatoare care reglează fluxul sanguin regional. Această funcție cheie a RBCs este modificată prin procesare și stocare, rezultând astfel RBCs alterate (Bennett-Guerrero et al., 2007, Raat et al., 2005).

Transportul de oxigen este legat de fluxul de oxigen din sânge. În mod specific, abilitatea de a crește conținutul de oxigen este cumva limitat (variind linear cu concentrația de Hb și saturația de oxigen), în timp ce fluxul sanguin poate fi crescut sau scăzut cu mai multe ordine de mărime. De fapt, în cele mai multe circumstanțe, în principal, volumul și distribuția fluxului sanguin sunt cele care variază pentru a menține dinamica dintre transportul de oxigen și cerințele metabolice.

Experimentele clasice au demonstrat că saturarea cu O2 a Hb este cuplată cu fluxul sanguin pentru a menține starea fiziologică in vivo (Frandsen et al., 2001, Ross et al., 1962). Aceste studii demonstrează că RBCs funcționează ca senzori și de oxigen și transductori de răspunsuri vasoconstrictoare și vasodilatatoare.

Controlul transportului NO și biodisponibilitatea sunt fundamentale pentru autoreglarea fluxului sanguin și acționează prin afectarea reflexului hipoxid de vasodilatație (HVD) în circularie. De fapt, datorită limitării substratului (O2), producția de NO de către eNOS este atenuată de hipoxie (Kantrow et al., 1997, Leone et al., 1991, Rengasamy et al., 1996). Mai mult, inhibitorii NOS nu blochează schimbările acute în fluxul sanguin care este cuplat cu desaturația Hb (Frandsen et al., 2001). Se pare că NO este transportat de către RBCs pentru a realiza HVH la un anumit timp și loc, la distanța de situsul original al sintezei NO (grupările NO dislocate de RBCs provin din eNOS (Jia et al., 1996) și poate, alte isoforme NOS (Mamone et al., 1999) sau nitriți (Angelo et al., 2006). RBCs sunt astfel elemente de control vascular (Figura 31).

Aceste date sugerează că vasoactivitatea derivată de la RBCs alterate contribuie la patofiziologia umană. În mod specific alterările metabolismului NO din RBCs s-a observat în insuficiență cardiacă congestivă (Datta et al., 2004), diabet (James et al., 2004), hipertensiune pulmonară (McMahon et al., 2002 & 2005) și siclemie celulară (Pawloski et al., 2005, Hammerman et al., 1999), toate aceste boli fiind caracterizate prin inflamație, stres oxidativ și control vascular disfuncțional.

RBCs sunt alterate progresiv prin procesarea și stocarea în vederea transfuziei, iar intervalul dintre donarea RBCs și administrare pare să fie un factor de risc independent pentru morbiditatea și mortalitatea asociată transfuziei. S-a demonstrat recent că în sângele care a fost colectat, procesat și depozitat în cadrul industriei băncilor de sânge prin proceduri strandard, nivelurile de SNO-Hb din sânge și activitatea vasodilatatoare dependentă de RBCS sunt profund deprimate și aceste defecte pot fi reversate prin repletia RBCs SNO (Bennett-Guerrero et al., 2007, Reynolds et al., 2007).

În concluzie, capturarea, sechestrarea, procesarea și transportul grupărilor NO prin RBCs, care sunt cuplate cu alosteritatea Hb, leagă fluxul sanguin regional de indicii biochimici ai insuficienței perfuzării (cerința metabolică). Ciclul respirator poate fi văzut ca fi fiind alcătuit din trei gaze NO, O2 și CO2, care sunt legate covalent la Hb. Astfel RBCs reglează activ fluxul sanguin regional (și astfel transportul de oxigen) prin cuplarea oxigenului detectat de Hb cu formarea și eliberarea SNO vasodilatator.

Înțelegerea acestor fenomene din cadrul procesării și stocării sângelui sunt necesare ameliorării leziunilor de stocare.

3.3. Apoptoza plachetară și leziunile plachetelor din timpul conservării acestora în centrele de transfuzii.

Toate celulele animale nemaligne au o durată definită de viață. Apoptoza, sau moartea celulară programată, este acum apreciată ca principalul mecanism fiziologic care reglează durata de viață a celulei și servește la eliminarea controlată a celulelor nedorite. Apoptoza a fost mult timp atribuită exclusiv celulelor nucleate.

Această dogmă a fost atât de puternică încât a luat mai mult de 20 de ani pentru a recunoaște apoptoza în citoplasma celulelor anucleate (Schulze-Osthoff et al., 1994, Hacobson et al., 1994, Martin et al., 1996, Castedo et al., 1996).

Apoptoza în plachetele anucleate a fost raportată în 1997 de către Vanags et al. (Vangas et al., 1997) iar în ultimii ani apoptoza plachetară a fost descrisă în multe publicații experimentale (Vangas et al., 1997, Wolf et al., 1999, Brown et al., 2000, Li et al., 2000, Kuter et al., 2002, Shcherbina et al., 1999, Plechette et al., 2001, Pereira et al., 2002, Piquet et al., 2002, Vesin et al., 2002), editoriale și review-uri (Snyder et al., 2000, Kuter et al., 2000, Seghatchian et al., 2001).

Recent, s-a demonstrat că apoptoza în celule megacariocite și megacarioblastice este cauza producerii plachetelor (Zunino et al., 2001, de Botton et al., 2002).

3.3.1. Apoptoza plachetară

Din cercetările ultimilor ani s-a constatat faptul că nucleul în sine nu este necesar pentru apoptoză, și că stimulii apoptotici pot induce modificări morfologice și biochimice tipice apoptozei (Vangas et al., 1997, Wolf et al., 1999, Brown et al., 2000, Li et al., 2000, Kuter et al., 2000, Shcherbina et al., 1999, Plenchette et al., 2001, Pereira et al., 2002, Vesin et al., 2002, Piquet et al., 2002, Snyder et al., 2002, Seghatchian et al., 2001), ceea ce a furnizat suport conceptului de “mașinărie apoptotică citoplasmică extranucleară”, care nu are nevoie de participarea nucleului. Deși plachetelor le lipsește un nucleu și ADN-ul nuclear, ele conțin mitocondrii și ADN mitocondrial, ARNm stabil metabolic și sunt capabile de sinteza proteinelor.

În prezent, sunt descrise cinci modele unde apoptoza plachetară a fost demonstrată, inclusiv trei modele in vitro experimentale și două în vivo pe modele animale:

(1) apoptoza plachetelor a fost indusă cu ionomicina, ionofori de calciu și A23187 care induc apoptoza în celulele nucleate și prin agonisti fiziologici trombinici ai plachetelor, colagen, trombina plus colagen și tromboxan mimetic A2 U 46619.

(2) apoptoza a fost provocată în plachete stocate în „cultură” unde plachetele spălate au fost îmbătrânite prin incubare timp de 18-24 ore la 37°C într-o cultură de mediu sau plasmă în tuburi închise.

(3) apoptoza a fost indusă prin îmbătrânirea plachetelor in vitro în timpul depozitării concentratelor de leucodepletie plachetara (PC), în condiții standard conforme condițiilor din băncile de sânge la 22°C.

(4) apoptoza a fost asociată cu îmbătrânirea plachetelor in vivo la câini cu trombopoieza suprimată prin injectare cu estradiol.

(5) apoptoza plachetară a fost raportată la șoareci cu trombocitopenie cauzată de infecția cu malarie și indusă prin injectarea de TNF sau anticorpi anti-plachetari.

Modificări apoptotice în morfologia plachetelor

Morfologia plachetelor apoptotice, asemănătoare cu cea a celulelor apoptotice nucleate, a fost observată atunci când plachetele au fost stimulate în suspensie celulară cu trombina, ionofori de calciu, acid arahidonic, U 46619 și ester forbol sau aderența trombogenică la colagen de tip I, III și IV. Aceste modificări morfologice au inclus contracția plachetară, condensarea citoplasmei, vezicularizarea plasmei membranare și extinderea filopodiei.

Modificări similare ale morfologiei plachetelor au fost găsite atunci când plachetele au fost depozitate în cultură (Brown et al., 2000) sau la concentrate plachetare (PC) în centrele de transfuzii (White et al., 1988, Bode et al., 1991). Inițial, aceste modificări au fost descrise ca ''activare plachetară'' și numai începând cu 1997 unii cercetători (Vangas et al., 1997) au început să ia în considerare aceste modificări morfologice ca apoptotice.

Markeri ai apoptozei plachetelor

Un număr de markeri ai apoptozei celulelor nucleate au fost de asemenea recunoscuți în plachete, inclusiv markeri ai căilor extrinseci și intrinseci, și executori ai apoptozei, ceea ce a permis ca plachetele anucleate să poată fi folosite ca un model fiziologic al apoptozei nuclear-independente pentru apoptoza citoplasmatică.

Fig. 26. Schimbările morfologice asociate cu apoptoza plachetară. Trombocitele umane pălate (3,0 108 / ml) au fost resuspendate în tampon Tyrode în prezența (AB) sau absența (C) de albumină serică bovină (BSA, 5 mg / ml), apoi incubate cu dimetilsulfoxid [DMSO] sau ABT-737 (1 M) pentru timpii indicați. În unele experimente, trombocitele au fost preincubate cu Q-VD-Oph (50 M) sau Y 27632 (30 M) înainte de tratamentul cu ABT-737. La momentul de timp indicat, trombocitele au fost fie (AB) fixate în suspensie cu paraformaldehidă (2% final) și procesate pentru microscopie electronică de baleiaj, sau (C) lizate pentru analiza Western blot folosind un anticorp policlonal anti-ROCK1, așa cum este descris suplimentar în metode. Imaginile sunt reprezentative pentru 3 experimente independente. Când experimentele descrise în caseta A s-au efectuat în absența BSA, modificarea morfologică ABT-737 indusă descrisă aici, la 45 de minute a fost observată după tratament de 15 minute, o diferență atribuită legării ABT-737 BSA.

(după Simone M. et al, 2011)

Rezultate controversate s-au obținut când s-a facut analiza ARNm și a nivelului de proteine al acestor markeri apoptotici. Li și colaboratorii (Li et al., 2000) au constatat că plachetele exprimă ARNm pentru ligandul morții TRAIL, receptorii morții TNFR1, DR3, DR4 și DR5, și proteine ​​adaptor TRADD și RIP. În schimb, receptorul Fas și Fas ligand nu au fost detectați în plachete, iar anticorpii anti-Fas nu au avut efect asupra plachetelor. Deși ARNm pentru receptorii agonistici TRAIL, DR4 și DR5 a fost găsit în plachete (Li et al., 2000, Plenchette et al., 2001), folosind citometria în flux, nu s-au identificat aceste proteine ​​la suprafața plachetelor fie înainte, fie după depozitarea lor până la 11 zile în centrele de transfuzii.

Analizele de citometrie în flux de asemenea nu au evidențiat receptorii Fas și ligandul TRAIL pe membrana plasmatică a PC stocate (Plenchette et al., 2001). În orice caz, studiul expunerii receptorilor antagoniști DcR1 și DcR2 receptori capcană pentru TRAIL de pe suprafața plachetelor au arătat o ușoară expunere a DcR2 au putut fi observate chiar și în prima zi a PCs proaspete și apoi a crescut progresiv în timpul depozitării plachetelor. În schimb, expunerea DcR1 nu ar putea fi detectată după 11 zile de depozitare (Plenchette et al., 2001). Expresia DcR2 pe suprafața plachetelor poate furniza un mecanism de feedback negativ care constrânge apoptoza plachetară la PC-uri stocate induse de liganzii morții.

În celulele nucleate normale nedeteriorate, mitocondriile au un potențial mitocondrial transmembranar (ΔΨm) și o activitate de reducere mare, iar scăderea ΔΨm este caracteristică apoptozei timpurii. Plachetele conțin mitocondrii care asigură energia metabolică a plachetelor. Ca și în alte celule, ΔΨm în plachete poate fi măsurată prin coloranți cationici lipofili pentru celule permeabile JC-1 și DiOC6, demonstrându-se depolarizarea ΔΨm în PC-uri începând din zilele 13-14 de stocare. Pereira et al. (Pereira et al., 2002) au raportat o scădere a ΔΨm în plachetele circulante în timpul îmbătrânirii plachetelor in vivo la un model canin suprimând trombopoieza.

Citocromul c și Apaf-1 au fost găsiți prin imunoblot în intregul lizat de plachete proaspete neactivate (Wolf et al., 1999). Adaosul de citocrom c și de ATP în extractele plachetare citoplasmatice repetă evenimente apoptotice din extractele plachetare ca în extractele citosolice din celule nucleate, inclusiv activarea secvențială a procaspazelor 9 și 3, și proteoliza substraturilor de caspază.

Eliberarea citocromului c mitocondrial s-a observat în citoplasmă, în plachete fermentate în cultură timp de 18 ore la 37°C (Brown et al., 2000) dar nu și în plachete tratate cu ionofor de calciu. Datele cu privire la eliberarea citocromului c din PC-uri stocate sunt controversate. Kuter (Kuter et al., 2002) a raportat că nivelul citocromului c citoplasmatic a crescut în timpul depozitării de PC-uri, în timp ce Plenchette et al.(Plenchette et al., 2001) au găsit citocromului c localizat numai în particule plachetare fracționare și nu eliberate în citosol până la 11 de zile de depozitare.

Cercetările au arătat că plachetele au exprimat ARNm pentru o serie de membri ai familiei Bcl-2, inclusiv inductori (Bak, Bax, Bad) și inhibitori (Bcl-XL, Bfl-1, MCL 1) ai apoptozei dar ei nu au evidențiat proteine pro-apoptotice Bik și proteine antiapoptotice Bcl-2 și Bcl-W (Li et al., 2000, Kuter et al., 2002).

Plenchette și colaboratorii (Plenchette et al., 2001) au demonstrat că proteinele pro-apoptotice Bax și Bid, și Bcl-2 omologul Bcl-XL, au fost exprimate în PC-uri vechi de o zi și expresia lor a rămas neschimbată în timpul depozitării PC-uri până la 11 zile, în timp ce proteinele Bcl-2 nu au fost exprimate. În domeniul proteinelor pro-apoptotice BH3-doar domeniul proteinei Bim a fost detectat în lizate plachetare și în fracțiunile citosolice și particule.

În ceea ce privește caspazele, ARNm al diferitelor caspaze a fost analizat în PC-uri proaspete. S-a arătat că ARNm pentru procaspazele 1, 2, 3, 4, 6, 8 și 9 sunt exprimate în plachete la niveluri relativ ridicate, întrucât ARNm pentru procaspazele 5, 7 și 10 nu a fost detectat (Li et al., 2000, Kuter et al., 2002). Nu s-a observat o creștere semnificativă în nivelul de exprimare al procaspazelor 2, 3, 7, 8, 9 și 10 din extractele plachetare și nici în cele citosolice și în fracțiunile particulelor subcelulare până la 11 de zile de stocare. Cu toate acestea, supraexpunerea procaspazei 3 a fost prezentă în toată perioada de stocare, de la 1-11 zile în comparație cu celelalte procaspaze. (Plenchette et al., 2001) S-a demonstrat de asemenea, activarea caspazei 3 în zilele 13-14 de la depozitare, măsurată prin citometrie în flux. Dimetilsulfoxid (DMSO), utilizat ca crioprotector pentru depozitarea PC-uri în azot lichid, la concentrații scăzute de 0,25-1% induc activarea caspazei 3 în a-5-a zi de depozitare. De asemenea, Wolf și colaboratorii (Wolf et al., 1999) nu au observat activarea caspazei 3 după tratamentul plachetar cu trombină sau trombină și colagen, în timp ce alți cercetători au arătat activarea caspazei 3 indusă de trombină plus colagen (Shcherbina et al., 1999).

Calpainele sunt cistein proteinaze dependente de calciu care funcționează în apoptoza celulelor nucleate prin clivarea proteinelor citoscheletice și a proteinelor pro-apoptotice Bax promovând expunerea PS. Calpainele sunt abundente în plachete, în formă inactivă care reprezintă 2% din proteinele plachetare. În plachete tratate cu calciu ionofor, trombina și/sau colagen, calpainele sunt activate și declanșează evenimente apoptotice, inclusiv externalizare PS, activarea caspazei și scindarea substraturilor apoptotice, gelsolina și delta protein kinaza C (Wolf et al., 1999).

Se pare că atât calpainele cât și caspazele pot efectua apoptoza plachetară. Semnificația căii dependente de calpaină a fost demonstrată pentru apoptoza plachetară prin modelul cu ionofori de calciu dar nu s-a testat pe PC-uri stocate.

Rolul căii apoptozei mediate de caspaze a fost demonstrat prin utilizarea de inhibitori ai caspazei în modelul cu ionofor de calciu ce stimulează plachete, PC-uri stocate și pe modelul in vivo de șoarece. În PC-uri stocate, incubarea plachetelor cu ZVAD-fmk inhibă activarea caspazei 3, masurată prin formarea de subunități de caspază 3 și scindarea gelsolinei.

Externalizarea de PS a fost demonstrată pentru plachetele activate cu ionofor de calciu, trombină, colagen și ADP (Leytin et al., 2003) și a fost demonstrată, de asemenea, în PC-uri stocate (Li et al., 2000) precum și în plachete îmbătrânite în cultură. Incapacitatea pachetelor de a menține o distribuție asimetrică pentru PS este o dovadă puternică a apoptozei plachetare.

3.3.2. Leziunile plachetelor generate de conservarea acestora în centrele de transfuzii. (Platelet Storage Lesion, PSL)

PSL poate fi definit ca suma tuturor modificărilor dăunătoare structurii și funcției plachetare apărute începând cu momentul în care sângele este prelevat de la donator până la momentul în care trombocitele sunt transfuzate destinatarului (Thon et al., 2007).

Mecanismele responsabile pentru PSL sunt multifactoriale și nu sunt clar înțelese. Mai mulți factori, printre care metodele de colectare, prelucrare, stocare și manipulare după colectare pot avea ca rezultat PSL (Seghatchian et al., 1997). Aceste leziuni sunt asociate cu scăderea recuperării in vivo a trombocitelor, supraviețuirea și activitatea hemostatică după transfuzie (Holme et al., 1998).

Trombocitele sunt activate după expunerea la suprafețe străine, traumatisme, pH scăzut, agonisti (trombina, ADP) și tensiunea de forfecare. La activare, trombocitele își pierd morfologia lor discoidală și devin mai sferice, cu multiple pseudopode. Modificările conformationale în complexul GPIIb/IIIa expune site-urile pentru proteinele adezive (fibrinogen, vWF), rezultând în agregate plachetare. Activarea stimulează în continuare eliberarea de conținuturi granulare și exprimarea proteinelor de membrană sechestrate pe suprafața exterioară. Prezența acestor conținuturi în mediul de stocare poate duce la diferite reacții de transfuzie (Wenzel et al., 2011).

Expresia fosfolipidelor încărcate negativ (fosfatidil serina și fosfatidil etanolamina) crește la exteriorul trombocitelor activate, oferind o suprafață pentru complexul protrombinază (X-Va), contribuind astfel la activitatea procoagulantă. Expunerea la stresul de forfecare, la fel ca și în centrifugare, în timpul separării componentelor și agitarea în timpul stocării nu numai că activează trombocitele, dar poate provoca, de asemenea, liza lor și activarea calpainei (Fisk et al., 2007). Liza plachetară duce la descărcarea și acumularea lactat dehidrogenazei citosolice (LDH) și a conținutului granular. Activarea calpainei duce la degradarea proteinelor citoscheletului, precum actina sau talina, actina generând microveziculizarea trombocitelor (Fisk et al., 2007). Formarea microveziculelor duce la scăderea volumului plachetar mediu (MPV) și contribuie la activitatea procoagulantă. Epuizarea cantității de adenozintrifosfat (ATP) apare atunci când ATP este necesar pentru fiecare aspect al funcției plachetare și este generat prin intermediul căilor oxidative și glicolitice. Glicoliza este up-reglată în condițiile în care oxigenul este scăzut. Lactatul produs prin glicoliză este tamponat în principal de bicarbonatul din plasmă. Producția progresivă de lactat și epuizarea bicarbonatului din timpul stocării duce la scăderea dăunătoare a pH-ului ducând la daune ale trombocitelor. Apoptoza plachetară apare simultan în timpul depozitării ulterioare, contribuie la pierderea funcției mitocondriale, deteriorarea citoscheletului și exprimarea la suprafață a fosfatidilserinei. În plus, consumul de substanțe nutritive de către trombocite și leucocitele contaminante și acumularea de produse metabolice finale, cum ar fi resturile celulare, factorii de coagulare activați, enzimele proteolitice și citokinele din plasmă, de asemenea, pot afecta negativ integritatea funcțională a trombocitelor. (Shrivastava et al., 2009)

S-au efectuat numeroase teste in vivo și in vitro pentru a evalua PSL. Corectarea creșterii numărului de trombocite după studiile de transfuzie și timpul de sângerare sunt de obicei utilizate pentru evaluarea eficacității produsului și îmbunătățirea hemostazei. Acestea însă nu reflectă adevărata imagine, datorită variabilelor necontrolabile ale pacientului. O altă abordare alternativă pentru a măsura eficacitatea produsului transfuzat este de a măsura recuperarea in vivo și supraviețuirea trombocitelor proaspete sau stocate, radiomarcate sau biotinilate pe voluntari sănătoși. Cu toate acestea, studiile in vivo sunt costisitoare, consumatoare de timp și complex de efectuat.

Pentru a evalua viabilitatea trombocitelor sunt efectuate teste biochimice, cum ar fi scăderea pH-ului, pO2, acumularea LDH, consumul de glucoză și epuizarea ATP. Îmbătrânirea a fost de asemenea cuantificată prin teste in vitro care măsoară modificarea morfologiei trombocitelor. Fenomenul turbionar, scăderea MPV, raportarea procentului de formulare discoidală și scorul morfologic Kunicki, au fost folosite pentru măsurarea modificărilor în morfologia discoidală. Gradul de schimbare a formei, ca răspuns la un agonist și creșterea răspunsului la șoc hipotonic oferă o măsură mult mai obiectivă a modificărilor morfologice.

În timpul procesării și stocării au fost obervați markeri de activare plachetară cum ar fi eliberarea de conținuturi granulare specifice în plasmă (β thromboglobulina, factorul plachetar 4 și RANTES), modificări ale expresiei GP pe suprafața trombocitelor (GPIB, GPIIb și GPIIIa), exprimarea proteinelor membranare granulare sechestrate (P-selectine -CD62P, CD63 si CD40L) și externalizarea fosfatidilserinei (determinata prin legarea anexinei V) (Vassallo et al., 2009). Tormey și Stack au observat diminuarea capacității secretorii a plachetelor în timpul prelucrării și depozitării folosind testul de eliberare cu citochine (RANTES) (Tormey et al., 2014).

Deși testele in vitro sunt mai economice și mai rapide, nici unul dintre aceste teste nu pot prezice cu exactitate recuperarea in vivo a plachetelor transfuzate (Murphy et al., 2004). Mai mult, majoritatea acestor teste sunt aplicate de obicei în scopuri de cercetare și doar câteva teste, cum ar fi pH-ul, volumul plachetar, numărul de trombocite și conținutul de leucocite au fost utilizate pentru monitorizarea zilnică de control al calității (Vassallo et al., 2009).

3.4. Probleme actuale ale transfuziei sanguine

Probleme de securitate transfuzională

În prezent, problemele actuale ale transfuziei sanguine nu mai sunt legate de securitatea actului transfuzional. Securitatea transfuzională este asigurată printr-o perfectă stăpânire a tuturor etapelor, de la donator la primitor, pe întreaga perioadă a preparării produselor sanguine, iar securitatea imunologică este asigurată prin cercetarea celei mai bune compatibilități a grupelor sanguine. Reglementările actuale prevăd un control biologic al donatorului, pentru toate tipurile de donare, donatorul nu trebuie să fie anemic, realizându-se o formulă sanguină completă și o determinare a nivelului de hemoglobină.

Pentru donarea de plasmă, se dozează proteinele, pentru donarea de plachete se face o numărătoare a acestora iar pentru donarea în afereză a globulelor roșii se dozează feritina plasmatică la prima donare pentru evaluarea rezervelor de fier ale organismului. Dacă nivelul este sub 20 ng/ml, donarea este contraindicată.

Examenele biologice efectuate obligatoriu pentru fiecare donare de sânge includ determinarea grupelor sanguine ABO și Rhesus D (RH1). În practică, celelalte antigene ale sistemului Rhesus (C,c,E, e) și antigenul Kell sunt determinate pentru primele două donări de sânge, pentru fiecare donator, ele fiind de asemeni determinate la primitori. Aceste teste permit evitarea “allo-imunizării”, adică formării de anticorpi dirijați contra antigenelor de grup sanguine. Se determină de asemenea anticorpii anti-A și anti-B ai căror prezență la donator depinde de grupa sa sanguină precum și determinarea anticorpilor dirijați contra altor antigene de grup sanguine.

Pentru asigurarea securității infecțioase a donării de sânge se efectuează depistarea virusului HIV pentru SIDA (test anticorpi și detecția genomului viral), a virusului hepatitei B (test antigene HBs si testul anticorpilor anti – HBc) și C (test anticorpi și detecția genomului viral) și a virusurilor HTLV-I/II (test anticorpi). Obligatoriu are loc depistarea sifilisului, a agentului paludismului* și maladiei de Chagas* .

Pentru ultimile 2 teste marcate cu *, controalele biologice nu se efectuează sistematic ci doar în cazul în care donatorul a locuit sau a vizitat țări unde ar fi putut contacta respectivii agenți infecțioși. Alte examene pot fi efectuate în funcție de tipul de donare și de nevoile primitorului, precum determinarea altor grupe sanguine (Duffy, Kidd, MNS, etc.) sau depistarea anticorpilor anti-citomegalovirus (CMV).

3.4.2. Probleme legate de calitatea componentelor conservate pentru transfuzii; Direcții de cercetare actuale pentru ameliorarea condițiilor de prelevare și stocare a hematiilor și plachetelor

3.4.2.1.Calitatea actuală a concentratului de globule roșii (CGR) și direcțiile de cercetare pentru ameliorarea condițiilor de prelevare și conservare în centrele de transfuzii

La ora actuală, necesarul mondial de sânge este de 7,5 milioane de litri pe an. În fiecare secundă se efectuează cel puțin o transfuzie ce se impune imediat ce o persoană a pierdut mai mult de 40% din volumul total sanguin.

Deoarece aprovizionarea cu sânge în centrele de transfuzie este din ce în ce mai dificilă, se încearcă o ameliorare a condițiilor de prelevare și stocare a sângelui. În prezent, aceste condiții sunt departe de a fi mulțumitoare. O altă metodă de soluționare a acestei probleme este tentativa de a produce un sânge artificial, tentativă destul de dificilă și puțin promițătoare datorită complexității sângelui.

În condițiile actuale de prelevare și de conservare a sângelui, 30-70% din hematiile transfuzate dispar din circulație între una și trei zile. Situația este deosebit de gravă în cazul politransfuzaților, deoarece încărcarea masivă cu Fe generează o imunodepresie și implicit o predispoziție la infecții repetate, crescând cu mult costul spitalizărilor. În acest sens, introducerea de noi teste sensibile și rapide de control a calității sângelui destinat transfuziilor se impune pe de o parte, în paralel cu ameliorarea condițiilor de conservare în centrele de transfuzie.

Mari antreprize farmaceutice producătoare de medii de conservare a sângelui, cum ar fi Baxter (Suedia), care au lansat actualele medii de conservare (SAGM) și care sunt utilizate în toate țările, inclusiv în România, au brevetat și încep comercializarea unui nou mediu “ERITROSOL“, cu mici modificări față de cele utilizate, dar cu un pH neutru, abandonând pH-ul acid de 5,6 cât au în prezent marea majoritatea mediilor. Cu toate acestea, rămân enorm de multe lucruri de modificat la mediile de conservare a sângelui pentru a deveni optime și a putea prelungi viabilitatea hematiilor conservate.

Înțelegerea leziunilor de stocare a eritrocitelor, așa cum a fost ea prezentată în Capitolul 3.2.2 este încă incompletă, iar recent, Hogman și colaboratorii au sugerat că atenția cercetătorilor ar trebui să fie focusată pe conservarea funcționalității eritrocitelor în timpul stocării (Hogman et al., 2006). În acest sens, introducerea de noi teste sensibile și rapide de control a calității sângelui destinat transfuziilor s-a impus cu necesitate, la fel ca și ameliorarea condițiilor de prelevare și conservare a sângelui în centrele de transfuzie.

Producția de eritrocite umane ex vivo din celule stem hematopoietice cu funcții îmbunătățite și capacitate îmbunătățită la stocare poate fi luată în considerație ca o alternativă la sângele recoltat, însă se pare că deși primele eritrocite au fost obținute în laborator, producerea acestora în cantități mari va dura încă foarte mult timp, această tehnologie putând fi aplicată în viitorul foarte apropiat doar în cazul grupelor rare de sânge. (Douay et al., 2007).

Figura 33. Eritrocite obținute ex vivo din celule stem hematopoietice. Colorație pentru viabilitate cu Calcein-AM

(după Douay et al., 2005)

3.4.2.2. Calitatea actuală a concentratului plachetar (PC) și direcțiile actuale de cercetare pentru ameliorarea condițiilor de prelevare și conservare în centrele de transfuzii

Trombocitele sunt celule unice din sânge care joacă un rol esențial în medierea hemostaziei și trombozei. De-a lungul anilor, cererea de trombocite este în continuă creștere datorită utilizării lor la pacienții cu defecte ale funcției plachetare sau cu trombocitopenie. Disponibilitatea de trombocite pentru transfuzie este restricționată de valabilitatea semnificativ scurtă a aestora din cauza riscului de contaminare bacteriană și deteriorarea lor legată de stocarea în centrele de transfuzii, fenomen cunoscut sub numele de leziune de stocare a trombocitelor (PSL). (Thon et al., 2007)

În prezent, există unele probleme în ceea ce privește siguranța și calitatea plachetelor, folosite pentru transfuzii. Acestea includ reacții adverse legate de transfuziile leucocitelor, contaminare bacterială, contaminări virale, un termen de valabilitate de 5 zile și o scădere a viabilității și a funcției hemostatice a plachetelor în timpul standard de stocare, având în vedere că stocarea se realizează la temperatura camerei.

Alte aspecte care rămân în centrul investigațiilor sunt: dezvoltarea de noi soluții aditive pentru a păstra sau pentru a elimina leziunile de conservare, dezvoltarea de metode practice pentru a reflecta funcțiile plachetelor și viabilitatea in vivo, și eventuale fragmentări celulare datorate leziunilor induse.

În zilele noastre există câteva dezavantaje în stocarea plachetelor, la temperatura camerei. Viața lor este limitată la numai 5 zile, ceea ce conduce la un procent ridicat de expirare. Mai mult de atât, pe timpul stocării descrește durata de viață a plachetelor, aproximativ 30% fiind pierdute după cele 5 zile. Durata de viață a trombocitelor poate fi în strânsă corelație cu cea a activității metabolice și starea de funcționalitate a mitocondriilor. În condiții optime de depozitare, la 20-22°C rata de îmbătrânire este de aproximativ 0.4 din rata de îmbătrânire in vivo la 37°C, acest fapt fiind similar cu raportul dintre ratele metabolice la aceste două temperaturi.

Se estimează că 80% din producția de ATP în trombocite este furnizată de fosforilarea oxidativă. Mitocondriile, în alte tipuri de celule, s-au dovedit a avea o rată completă de 2-3 săptămâni. Deoarece trombocitele nu au niciun mijloc de sinteză de enzime și structuri mitocondriale noi, acest lucru sugerează că durata de viață a trombocitelor in vivo poate fi limitată de funcția adecvată mitocondrială pentru menținerea homeostaziei normale a celulelor. Astfel, se poate ca durata de viață să fie mai lungă in vitro la temperatura de 22°C în comparație cu cea in vivo la 37°C. Conservarea structurii plachetare, compoziția și funcția în timpul preparării și depozitării este unul dintre obiectivele principale ale practicii transfuziei.

Progresele tehnice sub formă de introducere a separatoarelor automate celulare, procedurile de centrifugare optimizate, containerele de depozitare îmbunătățite, deleucocitarea și soluțiile aditivi pentru trombocite (PAS) au facilitat în mare măsură colectarea și depozitarea trombocitelor. În ciuda acestor progrese, PSL este încă o problemă îngrijoratoare. Până în prezent eforturile de optimizare și îmbunătățire a viabilității trombocitelor depozitate s-au concentrat în mare măsură pe menținerea pH-ului prin producția de tampon de lactat și îmbunătățirea schimbului gazos. Schimbul gazos, la rândul său depinde de conținutul de trombocite, difuzia gazului prin recipientul de plastic și agitare. Containere din a doua generație utilizate în prezent pentru depozitarea plachetelor (fabricate din clorură de poliolefină sau polivinil (PVC) plastifiat cu compuși cum ar fi trietilhexil trimetilat și butiril trihexil citrat) au de două ori permeabilitatea oxigenului comparativ cu pungile din prima generație (PVC cu dietilhexil ftalat).

Utilizarea tot mai mare de PC-uri deleucocitate a contribuit și mai mult în sporirea siguranței plachetare în timp ce leucocitele contaminante nu concurează doar cu trombocitele pentru nutrienți, dar si citochinele (IL-6, TNF-a, și IL-p) generate în urma fragmentării și activarea acestora a fost, de asemenea, asociată cu diverse reacții de transfuzie, cum ar fi reacții febrile de transfuzie nonhemolitice, leziuni pulmonare acute legate de transfuzie. (Heddle et al., 1994) Deleucocitarea scade aloimunizarea și transmiterea virusurilor leucotropice. Kaur et al., au studiat nivelurile de citochine generate în timpul depozitării și corelarea acestora cu conținutul de leucocite. Creșterea semnificativă a nivelului de citochine a fost observată în grupul non-leuco filtrat comparativ cu lotul filtrat Leuco. (Kaur et al., 2015)

Dezvoltarea de soluții de stocare sintetice, cunoscute sub numele de PAS, pentru a stoca trombocite, este un pas mai departe în ameliorea PSL și îmbunătățirea calității trombocitelor. În plus, utilizarea PAS minimizează efectele adverse mediate de plasmă cum ar fi reacțiile alergice și TRALI, permițând utilizarea tehnicilor fotochimice de reducere a agenților patogeni și posibila îmbunătățire în depozitarea plachetelor prin ingineria manipulării mediului de stocare (Andreu et al., 2007). Reducerea reacțiilor adverse a fost raportată atunci când s-au comparat trombocitele PAS conservate cu unitățile conservate în plasmă (Cohn et al., 2014). Chandra și colab. au observat că morfologia și funcția plachetară s-au dovedit a fi mai bine conservate în soluție aditivă, în ziua a șaptea, comparativ cu trombocitele stocate fără aditiv de soluție. (Chandra et al., 2011)

Cererea plachetară a crescut în ultimii zece ani, deoarece acestea nu sunt folosite doar pentru a controla sau preveni sângerarea, ci și ca o sursă de factori de creștere în repararea țesuturilor, vindecarea rănilor și întinerirea pielii. Studiile au demonstrat rezultate promițătoare de utilizare a terapiei plachetare topice în diferite condiții clinice (Bashir et al., 2015, San Sebastian et al., 2014, Godse, 2014). Prin urmare, păstrarea funcționalității plachetelor cât mai mult timp posibil este de o importanță primordială, deoarece acestea pot contribui la prelungirea perioadei de valabilitate și astfel la un mai bun management de stocare.

CAPITOLUL 4. VALORIFICAREA BIOTEHNOLOGICĂ A PRODUSELOR DE TRANSFUZIE

4.1. Plasma bogată în plachete (PRP)

4.1.1. Definiția și compoziția PRP

În ultimii 10 ani, cercetările științifice s-au intensificat mult asupra utilizării plasmei bogate în plachete (PRP, platelet-rich plasma) în domeniul biomedical. Dezvoltată pentru prima dată în 1970 și folosită în Italia în 1987 în cadrul unei operații pe cord deschis, terapia cu PRP a început să câștige popularitate la mijlocul anilor 1990.

Plasma bogată în plachete este un volum de plasmă autologă care are o concentrație de plachete crescută față de valoarea normală. Dacă numărul normal de plachete în sânge este între 150.000 și 350.000/μl, iar media este de aproximativ 200.000/μl, PRP are o concentrație de 1.000.000 plachete/μl. (Robert et al., 2001)

Plachetele sunt celule sanguine anucleate, cu o formă discoidală, care au o varietate de funcții precum hemostazia (coagularea), inflamarea, apararea antimicrobiană, angiogeneza și de vindecare a rănilor (Blair et al., 2009). Deși rolul principal al plachetelor este de coagulare, s-a descoperit că plachetele adăpostesc peste 1100 de proteine, inclusiv factori de creștere, mesageri ai sistemului imunitar, enzime și alți compuși bioactivi care sunt implicați în diferite aspecte ale reparării tisulare (Blair et al., 2009).

Posibilitatea de a folosi plachete autologe pentru a furniza concentrații crescute de factori de creștere furnizate la nivel local presupune motivul pentru crearea și utilizarea preparatelor PRP în vindecarea țesutului conjunctiv (Lopez-Vidriero et al., 2010). Plasma, partea fluida a sângelui, este un lichid care conține numeroși ioni, molecule anorganice și organice și multe proteine găsite și în plachete (Blair et al., 2009). Proteinele din plasmă sunt componente esențiale în mecanismul de vindecare a țesuturilor conjunctive (Ando et al., 1993). Plasma diferă de ser prin faptul că aceasta conține fibrinogen și factori de coagulare. Astfel, când plasma este expusă la trombină (fie prin adăugarea de trombină exogenă sau prin venirea în contact cu tromboplastină tisulară – de asemenea cunoscută ca factor tisular), cascada de coagulare este inițiată și are loc activarea plachetelor. Formarea cheagului de fibrină oferă astfel un ”scaffold” provizoriu pentru migrarea celulară, dar și un rezervor de factori de creștere (Haase et al., 2003).

Deoarece PRP este obținut din sângele autolog, acesta este sigur și liber de boli transmisibile, precum HIV și hepatită. O dată cu PRP, aportul crescut de plachete oferă un număr crescut de factori de creștere la zona chirurgicală. În fapt, PRP este o combinație de 7 factori de creștere nativi, ceea ce deosebește PRP de factorii de creștere recombinanți. Celulele umane precum plachetele nu îi pot sintetiza.

PRP conține aceeași cantitate de molecule de adeziune celulară precum un cheag de sânge normal (200 μg- 400 μg/ml), cheagul fiind compus din fibrină, fibronectină și vitronectină, care sunt molecule de adeziune celulară necesare în migrarea celulară și epitelizarea rănilor. Astfel, PRP nu este un liant de fibrină. Cei mai studiați factori de creștere întâlniți în PRP care au roluri importante în repararea tisulară sunt: factorul de creștere insulin-like I (IGF-I), factorul de creștere vasculară endoteliala (VEGF), factorul de creștere epitelială și factorul de creștere a fibroblastelor de bază (FGFb) (Alsousou et al., 2009, Mazzucco et al., 2010).

Majoritatea factorilor de creștere sunt proteine plachetare, atât sintetizate cât și absorbite, și astfel, cantitatea lor nu depinde de concentrația de plachete.

IGF-I: Această proteină circulă în plasmă sub forma unui complex cu proteine de legare determinând biodisponibilitatea și reglarea interacției între IGF-I și receptorul său (Clemmons et al., 1989, Yakar et al., 2010). IGF-I este implicat în migrarea keratinocitelor și vindecarea rănii (Ando et al., 1993, Haase et al., 2003), stimulează formarea matricei oaselor și homeostazia (Govoni et al., 2011) prin promovarea proliferării preosteoblastelor (Bikle et al., 1994, Meinel et al., 2003) și este implicat în miogeneza musculaturii striate (Florini et al., 1996).

TGF-β1: Rolul familiei de proteine TGF-β în vindecarea rănilor a fost recent analizat (Douglas et al., 2010) evidențiindu-se diferite efecte în funcție de țesut sau tipul celular (Marx et al., 2001). Eliberarea și bioactivarea TGF-β latent, contribuie la răspunsuri celulare reparatorii timpurii, precum migrarea celulară, neovascularizarea și angiogeneza în zona plăgii (Yang et al., 1990), induce diferențierea osteogenică a celulelor mezenchimale ale măduvei osoase și intervine în diferențierea osteoblastică (Zhao et al., 2010).

PDGF: Acesta este un factor de creștere mitogen și chemotactic pentru toate celulele cu origine mezenchimală, având un rol important în repararea țesutului articular, inclusiv cartilaj și menisc (Schmidt et al., 2006, Tumia et al., 2009), la nivel de os, influențându-i metabolismul și acționând în mecanismele de reparare (Canalis et al., 1992, Hock et al., 1994) inclusiv în stabilizarea noilor vase de sânge (Caplan et al., 2011).

HGF: Acest factor de creștere reglează creșterea celulară, migrarea și morfogeneza (Nakamura et al., 1991) și joacă un rol important în vindecarea rănilor prin intereacția epitelial-mezenchimală (Matsumoto et al., 1997). Efectul antifibrotic al HGF a fost demonstrat în multe țesuturi, el reglând fenotipul miofibroblastelor, permițând contracția inițială a plăgii și făcând miofibroblastele să dispară treptat (Shukla et al., 2009).

VEGF: Acest factor de creștere este un mediator cheie în vindecarea rănilor (Bao et al., 2009) și principalul inductor al angiogenezei, stimulând chemotaxia și proliferarea celulelor endoteliale (Ferrera et al., 2001). De asemenea, VEGF este implicat în reglarea homeostaziei multor organe, precum creierul, inima, rinichii sau ficatul (Luo et al., 2011).

Factorul de creștere epitelial (EGF): Această proteină promovează chemotaxia și mitogeneza în celulele epiteliale și mezenchimale (Kurten et al., 2005). El are un rol important în piele, cornee, tractul gastrointestinal și sistemul nervos (Schults et al., 1991 & 1992 & 1993, Wong et al., 2004, Xian et al., 2004, Berlanga-Acosta et al., 2009).

Factorul de creștere a fibroblastelor de bază (FGFb): Acest factor, denumit și factorul de creștere fibroblastic 2 (FGF2) este un inductor al proliferării celulare, angiogenezei și diferențierii (Klagsburn et al., 1989, Yun et al., 2010). Rolul său în procesul de reparare a fost observat în cazul mai multor țesuturi, printre care os (Tabata et al., 1999, Song et al., 2011, Kempen et al., 2010), tendon (Chang et al., 1998, Thomopoulos et al., 2010) și țesut periodontal (Shimabukuro et al., 2008, Shirakata et al., 2010, Murakami et al., 2000).

În concluzie, factorii de creștere stimulează proliferarea celulară (mitoza), migrarea celulară (chemotaxia), diferențierea (efectul morfogenic), angiogeneza. PRP are si un efect bacteriostatic, observat împotriva Staphylococcus aureus și Escherichia coli (Bielecki et al., 2007). PRP acționează și ca mediator antiinflamator prin blocarea proteinei chemotactice monocitare-1, eliberată de monocite, și producerea de lipoxin A4. HGF din PRP inhibă NF-kB, un factor nuclear implicat în răspunsul inflamator prin activarea inhibitorului său (ikB).

Obținerea PRP

Procesul de bază în obținerea produsului PRP este separarea selectivă a componentelor lichide și solide ale sângelui total printr-o tehnică numită plasmafereză (Weibrich et al., 2005). Pe baza principiului descris de legea lui Stoke, viteza de sedimentare a particulelor într-un mediu lichid, ca răspuns la forțele gravitaționale, va fi aproximativ proporțională cu diametrul lor. Astfel, plachetele (diametrul=2m) se vor separa proporțional mai lent decât eritrocitele (aproximativ 7m diametru) sau celulele albe din sânge (diametru de 7-15m) atunci când sunt supuse la o forță gravitațională. Acest fenomen permite plachetelor să rămână suspendate selectiv în componenta lichidă (plasma) din sânge, în timp ce celelalte particule solide (eritrocitele și celulele albe) se depun mai repede și astfel devin separate de plachete prin gravitație.

Pentru obținerea de PRP, sângele este colectat în prezența unui anticoagulant, care se leagă de calciu și previne inițierea cascadei formării cheagului prin prevenirea conversiei protrombinei la trombină (Marx, 2001).

După colectare, sângele este centrifugat o data sau de 2 ori, în funcție de caracterul final dorit al produsului (Figura 33).

Centrifugarea inițială (“soft spin”) separă plasma și plachetele de eritrocite și celulele albe ale sângelui. Supernatantul (plasma cu plachete și o fracție mică de celule albe, “buffy coat”) poate fi supus unei a doua centrifugări mai lungi (“hard spin”), care separă plachetele de plasmă, obținându-se diferite fracții PRP (Dohan Ehrenfest et al., 2009).

Figura 33. Etapele obținerii produsului PRP (www 6)

4.1.3. Aplicații ale PRP

Produsele PRP pot fi introduse într-o grefă osoasă, pulverizate pe suprafața țesuturilor moi, aplicate deasupra unei grefe sau folosite ca o membrană biologică. Cu toate acestea, coagularea PRP trebuie efectuată numai în momentul utilizării.

4.1.3.1. Utilizarea PRP în chirurgia dentară

Factorii de creștere proveniți din PRP sunt utilizați în terapia regenerativă prostetică și periodontală din stomatologie. În primele 20 de zile s-a observat o proliferare microvasculară crescută urmată de o activitate crescută a osteoblastelor și formarea de osteoide în următoarele 3-6 săptămâni, îmbunătățind calitatea și cantitatea țesutului osos nou format. Utilizarea PRP în chirurgia orală pare să scadă necesitatea grefelor osoase autologe colectate de la sit-uri extra-orale, evitând incizii cutanate și reducerea gradului de incizii a mucoaselor. Utilizarea unor procente mici de PRP (5-10%), împreună cu 15-20% de os autolog iar restul constând dintr-un material aloplastic, pare a produce tesut osos în 4 luni de la operația de chirurgie regenerativă, oferind astfel o cantitate suficientă de os viabil pentru a asigura stabilitatea primară pentru plasarea implantului.

4.1.3.2. Utilizarea PRP în arsuri

S-a demonstrat că plasma îmbogățită cu plachete stimulează angiogeneza, promovând dezvoltarea vasculara și proliferarea fibroblastică. În plus, PRP funcționează ca hemostatic prin formarea unui cheag de fibrină. De asemenea, aplicarea PRP îmbunătățește vindecarea rănilor țesuturile moi și tari. Plachetele joacă un rol cheie în hemostază și vindecarea rănilor după leziunile tisulare (Eppley et al., 2004). Imediat după o traumă, ele activează fibrinogenul și formează un cheag de fibrină, acționând astfel hemostatic și ca un material de etanșare a țesutului, jucând un rol important în următoarele etape ale refacerii tisulare. Aceste efecte ale activării plachetelor se datorează celor peste 30 de factori de creștere (Eppley et al., 2006). Plachetele sunt chemotactice și induc proliferarea fibroblastelor, a celulelor endoteliale și progenitoare (Pierce et al., 1991), reglând procesul de vindecare a rănilor.

Ca efect imediat, PRP asigură mai rapid homeostazia și adeziunea tisulara prin formarea unui cheag de fibrină, similar unui lipici de fibrină. Datorită cantității mari de factori de creștere eliberați datorită numărului mare de plachete adăugate la locul leziunii, PRP crește răspunsul fiziologic la traumă. Macrofagele sunt atrase prin chemotaxie la locul leziunii și încep să secrete factori de creștere adiționali, precum TNF-a și FGFb.

Adepții terapiei PRP susțin ca printre beneficiile acesteia se numără regenerarea tisulară crescută și o rată scăzută de infecție, durere și pierdere de sânge (Marquez-de-Aracena et al., 2007).

4.1.3.3. Efectele PRP asupra cartilajului

Utilizarea PRP pentru repararea cartilajului sau terapia intra-articulară este relativ nouă și există puține date în literatură pentru a susține sau infirma utilizarea acestuia. Tratamentul in vitro al condrocitelor cu L-PRP27 (thrombin-clotted leukocyte-PRP) a determinat o creștere a proliferării celulare, a ratei de sinteză și acumularea de glicozaminoglicani și colagen de tip II (COL2) comparativ cu martorii (Akeda et al., 2006). Într-un studiu de proteomică, condrocitele umane OA au fost înlăturate de la pacienții cu artroplastie totală de șold iar tratamentul PRP a indus expresia proteinelor implicate în diferențierea condrocitelor (Spreafico et al., 2009).

Toate aceste date demonstrează potențialul terapeutic al PRP în mediul articular, cu efecte anabolice asupra cartilajului, MSC și liniei sinoviale.

În studiile preclinice pe animale, PRP a încetinit progresia osteoartritei, însă sunt rezultate mixte după utilizarea PRP pentru a facilita repararea defectelor condrale sau osteocondrale. Studiile clinice indică faptul că o combinație de PRP cu celulele stromale derivate din măduva osoasă oferă un ajutor în repararea defectelor condrale. Un beneficiu clinic al PRP a fost demonstrat, de asemenea după 1 an de la injectarea intra-articulară în cazul pacienților suferind de dureri de genunchi. Deși cele mai multe studii susțin utilizarea clinică a PRP pentru tratamentul leziunilor cartilajului și durerilor articulare, schemele de clasificare îmbunătățite pentru PRP și o testare mai cuprinzătoare și raportarea cu privire la conținutul de preparare PRP ar ajuta în dezvoltarea protocoalelor de tratament.

4.1.3.4. Aplicațiile PRP în ortopedie

Disponibilitatea imediată a PRP și natura sa autologă permit aplicații clinice fară riscuri asociate cu produsele din sânge străin. Având în vedere aceste caracteristici favorabile și proprietățile sale hemostatice, PRP a fost folosit în mai multe studii clinice pentru gestionarea patologiilor de ligament și tendon, (Taylor et al., 2011, Paoloni et al., 2011, Vavken et al., 2011) vindecarea osului, (Bibbo et al., 2010) cartilajului, (Hildner et al., 2011) sau leziunilor musculare scheletice, (Andia et al., 2010, Mei-Dan et al., 2010) precum și rănile traumatice acute (Foster et al., 2009, Lopez-Vidriero et al., 2010).

Pacienții cu ruptură a tendonului lui Achile tratați cu PRP s-au recuperat mai repede decât cei din grupul de pacienți control, care au fost operați fără adăugarea de PRP. La 24 de luni de la operație, pacienții din grupul cu PRP, nu au prezentat complicații ale operației și au avut o arie mică de secțiune la evaluarea cu ultrasunete, comparativ cu grupul control.

Tratamentul cu PRP a fost utilizat de asemenea și în cazul operațiilor la umăr. Utilizarea injecției cu PRP cu o componentă de trombină autologă pentru a suplimenta artroscopic repararea tendonului rotatorilor a demonstrat rezultate promițătoare exprimate prin scăderea durerii și îmbunătățirea scorului funcțional la 24 de luni de la intervenția chirurgicală (Randelli et al., 2008).

Mulți factori de creștere asociați cu PRP sunt implicați în căile de semnalizare care promovează vindecarea, migrarea, proliferarea și diferențierea celulelor stem mezenchimale stromale, inhibarea proliferării macrofagelor, precum și producerea câtorva interleukine. PRP a fost utilizat în managementul tendinopatiilor în diferite locații. Tendinopatia cronică radială a cotului sau cotul tenismenului sunt în mod normal tratate prin injecții cu corticosteroizi, care au rezultate incerte pe termen lung (Anitua et al., 2009). Terapia PRP este momentan investigată ca o modalitate alternativă de tratament (Foster et al., 2009, Taylor et al., 2011, Andia et al., 2010, Paoloni et al., 2011, Mishra et al., 2009). Într-un studiu clinic, pacienții care au primit tratamentul cu PRP au prezentat o îmbunătățire cu 60% a scorului de durere, comparativ cu scorul de 16% al grupului control, în fazele timpurii ale studiului. Evaluarea a continuat iar grupul cu PRP a prezentat o îmbunătățire de 95% la 25 de luni de la tratament. (Mishra et al., 2006).

Leziunile musculare apar în urma unei lovituri, tensiune sau tăieturi. Similar cu vindecarea tendonului, pași cruciali în vindecarea musculară implică răspunsul inițial inflamator, proliferarea celulară, remodelarea tisulară și regenerarea ramurilor nervoase intramusculare. Într-un studiu CCS recent atleții cu inflamații ale mușchilor abductor au primit fie injecții cu ser condiționat autolog (ACS, un echivalent al PRP) fie o combinație de Actovegin® (Nycomed, Zürich, Suedia) si Traumeel® (Heel Inc., Baden-Baden, Germania) pentru grupul control (Wright-Carpenter et al., 2004). S-au observat îmbunătățiri în timpul de recuperare și regresie a edemului prin analiza RMN, în cazul grupului ACS.

Terapiile PRP reprezintă astfel un instrument nou și interesant în arsenalul terapeutic al chirurgiei ortopedice și al medicinei sportive. Cu toate acestea, schemele de tratament trebuie definite mai bine deoarece multe dintre întrebările privind mecanismele PRP de acțiune rămân momentan fără răspuns.

În prezent PRP face obiectul unor cercetări intense de utilizare în tehnologii de obținere a unor biomateriale și bioproduse cu aplicații de laborator sau clinice.

PARTEA II

CONTRIBUȚIA PERSONALĂ

CAPITOLUL 5. SCOPUL SI OBIECTIVELE CERCETARILOR

De aproape 100 de ani, sângele a devenit un medicament biologic, iar recentele cercetări de biotehnologii îl consideră un biomaterial prețios, încercând o valorificare a produselor conservate ajunse la termenul de expirare, mai ales în situația unei crize majore de sânge pe plan mondial.

În contextul stiintific international al preocuparilor de asigurare a unei securitati si eficiente crescute a transfuziei, asa cum rezulta din obiectivele actuale ale Organizatiei Mondiale a Sanatatii prin Departamentul EHT (Departamentul de Tehnologii Esentiale ale Sanatatii), cercetarile noastre au vizat 3 obiective majore, respectiv :

a) cercetari fundamentale care au vizat :

intelegerea mai buna a mecanismelor celulare si moleculare care se deruleaza in timpul conservarii sangelui in centrele de transfuzii si care conduc la aparitia printr-o imbatranire accelerata la bine cunoscutele « leziuni de stocare », prin abordarea cercetarilor noastre conform conceptului recent de apoptoza celulara (eritroapoptoza sau apoptoza plachetara)

b) cercetari cu caracter aplicativ pentru:

ameliorarea calitatii componentelor sanguine destinate transfuziei (concentrat de globule rosii si de plachete), considerate «produse sanguine labile» ;

valorificarea plasmei si plachetelor sanguine stocate in centrele de transfuzii si ajunse la limita maxima de conservare.

Cercetările noastre originale s-au axat pe:

Influenta pH-ului extracelular si a compozitiei mediilor de conservare asupra fenomenului de apoptoza celulara a hematiilor si plachetelor sanguine cu consecinte asupra calitatii produselor stocate;

Încercări de ameliorare a stocării sângelui prin modularea sau blocarea fenomenului de apoptoză, respectiv prin modularea stresului oxidativ cu extracte de Crataegus pentagyna.

Încercări de ameliorare a conservarii sângelui prin iradierea RBCs cu laser in timpul conservarii acestora in mediul SAGM

Cercetări privind influenta conditiilor ecologice din Antarctica asupra viabilitatii eritrocitelor; Posibile implicatii in conservarea sangelui. Aceste cercetari originale par a fi o prioritate absoluta pe plan international in domeniul Adaptologiei la conditii extreme de mediu.

Încercări de valorificare superioară a produselor de transfuzie după expirarea termenului de stocare, respectiv prin:

Utilizarea hematiilor umane pentru determinarea in vitro a toxicitatii/

biocompatibilitatii unor nanoparticule/materiale sintetizate pentru uz medical

b) Obținerea unui produs PRP reconstituit din componente sanguine (plasma și

plachete) ajunse la sfârșitul perioadei de conservare, pentru aplicatii biomedicale

Întreaga tematică abordată s-a bazat in cea mai mare parte pe analiza prin citometrie in flux, metoda reproductiva, rapida si statistica, utilizand noi teste de apreciere a viabilitatii eritrocitare , conform articolului « Nouveaux critères d’évaluation de la viabilité des hématies destinées à la transfusion », Transfus. Clin. Biol., 14, 393-401, 2007 si propuse pentru aprecierea calitatii hematiilor conservate in centrele de transfuzii, dar si pe metode de analiza prin imagine, respectiv microscopie optica si electronica de scanare (SEM), insotite de unele metode biochimice, metode moderne si de mare finete utilizate in analiza structurii si functiilor celulare, conform cu necesitatile cercetarilor derulate

Rezultatele obtinute si prezentate in continuare sunt structurate pe X capitole, la care se adaugă, referintele biografice si lista publicatiilor stiintifice rezultate in urma acestor cercetari (1 brevet national OSIM in calitate de prim autor, 1 articol ISI si x articole BDI, dintre care y articole ca autor principal).

CAPITOLUL 6. MATERIAL, METODE ȘI APARATURA UTILIZATE ÎN REALIZAREA CERCETĂRILOR PROPRII

Ansamblul cercetărilor din cadrul prezentei teze de doctorat s-a derulat utilizând următoarele materiale și metode generale de analiză prin citometrie în flux și tehnici complementare și de biochimie.

6.1. Materiale, aparatură și produse biologice

6.1.1. Produse chimice

Kitul determinare a apoptozei cu Anexina-V-FITC și tamponul de legare HEPES au fost furnizate de Pharmingen (San Diego, USA), Calceina-AM au fost obținuta de la Sigma Aldrich (Saint Louis, Mo, USA), iar Cell viabilitz kit kitul Live/ Dead, de la Molecular Probes. DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) a fost obținut de la Cambrex Bio Science (Verviers, Belgia), iar serul fetal bovin (SFB), penicilina, streptomicina, amfotericina B și L-glutamina au fost furnizate de către GIBCO (Carlsbad, UȘA). Alginatul de sodiu (alginic acid sodium salt from brown algae) au fost procurate de la Sigma-Aldrich (St.Louis, USA).Plăcile de cultură utilizate, cu 6 sau 12 godeuri au fost procurate de la Nalge Nunc International, Naperville, USA, iar tuburile de polistiren FacScan de tip FALCON 352052, Becton Dickinson, de la Nova Intermed. Pungile de conservare a componentelor sanguine si mediile respective au fost furnizate de Laboratoarele Farmaceutice MacoPharma.

6.1.2. Aparatura de laborator

În toate experimentele derulate s-a folosit următoarea aparatură:

hotă cu flux laminar BioQUELL Clasa II-model ABS1500,

incubator cu CO2 UNITHERM 50,

baie de apă NUVE BATH NB20,

centrifugă SIGMA 2-16K.

numărător automat de celule Countess Invitrogen.

citometru FACScan Becton Dickinson dotat cu soft CellQuest Pro pentru achiziția și analiza rezultatelor

citometru BD LSR II, cu soft de achiziție și analiza Diva 6,

microscop optic Zeiss (Axio ObserverD1) prevăzut cu un sistem de prelucrare a imaginii Zeiss, Axio Cam MRc

microscop electronic cu scanare HITACHI SU 1510.

freezer pentru crioconservare (-86șC) SANYO MD

6.1.3. Produse biologice

Sângele uman folosit în experiente a fost obținut de la donatori sănătoși și furnizat de Centrul de Transfuzii al Armatei sau Centrul de Hematologie București. În ambele cazuri sângele a fost prelucrat la maximum 1 h după colectare.

Eritrocitele umane au fost sedimentate prin centrifugare (1000 g, 4°C, 5 min) pentru eliminarea plasmei leucocitelor și plachetelor sanguine prin aspirare împreună cu o mică cantitate de hematii. Sedimentul eritrocitar a fost ulterior spălat de 3 ori cu o soluție tampon fosfat salin Dulbecco pH 7.4 (PBS: NaCl, KCl, Na2HPO4 and KH2PO4) și supus analizelor.

– Fibroblastele utilizate în experimentele derulate au fost fibroblaste de șoarece NCTC clona L929 obținute din țesut conjuctiv de șoarece.

6.2. Metode aplicate în realizarea părții experimentale

6.2.1. Prepararea pungilor de conservare a hematiilor

Prepararea pungilor s-a realizat conform protocoalelor aplicate în Centrele de prelevare și conservare a sângelui pentru transfuzii. Sângele a fost prelevat prin puncționarea clasică în următoarele condiții: 450 ml de sânge au fost recoltați în 63 ml de soluție anticoagulantă CPD (Citrat- Fosfat- Dextroză) de pH 5, 5 cu următoarea compoziție:

Acid citric 3, 25 g

Citrat de sodiu 26, 30 g

Glucoză 25, 50 g

Fosfat monosodic 2, 51 g

Apă distilată apirogenă q.s.p. 1.000 ml

După caz, sângele a fost de asemeni prelevat pe heparină.

După 24 ore la , suspensiile eritrocitare au fost centrifugate și concentratul globular obținut, deleucocitat prin trecerea printr-un filtru Leucoflex LST (Brevet MacoPharma), a fost introdus la un hematocrit de 60% într-o soluție de conservare SAGM (Sodium Adenina Glucoza Manitol) de pH 5,1± 0,3 cu următoarea compoziție:

Pungile au fost apoi păstrate la timp de maxim 6 săptămâni.

6.2.2. Prepararea pungilor de conservare a hematiilor cu extracte vegetale antioxidante

Pentru experientele referitoare la tentativa de ameliorare a calității și condițiilor de stocare a hematiilor în Centrele de transfuzii, sângele a fost prelevat prin puncționarea clasică în următoarele condiții: 450 ml de sânge au fost recoltați în 63 ml de soluție anticoagulantă CPD (Citrat- Fosfat- Dextroza) de pH 5,5 cu următoarea compoziție:

După 24 ore la , suspensiile eritrocitare au fost centrifugate și concentratul globular obținut, deleucocitat prin trecerea printr-un filtru Leucoflex LST (Brevet MacoPharma), a fost introdus la un hematocrit de 60% într-o soluție de conservare SAGM (Sodium Adenina Glucoza Manitol) de pH 5,1± 0,3 cu următoarea compoziție:

Pungile au fost apoi repartizate în alte pungi fabricate special de Laboratoarele MacoPharma, mai mici, conținând și conservate la timp de maxim 6 săptămâni.

6.2.3. Prepararea pungilor de conservare a hematiilor pentru studiul acțiunii radiațiilor laser asupra viabilității hematiilor stocate în mediul SAGM

Studiul efectului exercitat de radiații laser asupra hematiilor conservate în mediu SAGM s-a efectuat pe hematii provenind de la 3 donatori, conservate în mini- pungi special confecționate de către Macopharma, conform schemei din Figura ……, conținând eritrocite obținute prin centrifugarea și deleucocitarea sângelui total și păstrate în mediu SAGM (20 grame /mini-punga), la 4°C pentru o perioadă de până la patru săptămâni. Mini-pungile au fost iradiate la doze variind pentru λ = 465 nm între 0.1 la 1 J x cm3 și pentru λ = 660 nm de la 0.2 la 1.8 J x cm 3, la 11, 14 și 21 de zile de la începutul conservării sângelui.

La 12 ore de la iradiere, eritrocitele au fost analizate prin citometrie în flux și tehnici complementare.

Figura ……. Schema preparării eșantioanelor de sânge destinate iradierii

sursa

6.2.4. Evaluarea in vitro a toxicității- biocompatibilității pe bază de apoptoză eritrocitară a unor materiale pentru dispozitive medicale și nanoparticule (nanomateriale)

Pentru studiile noastre de toxicitate a nanoparticulelor au fost testate șase tipuri de nanoparticule, furnizate prin amabilitatea Dr. Ion Morjan, de la Institutul Național de Fizică Laserilor, Plasmei și Radiației (INFLPR), care au fost notate de la P1 la P6, având compoziții diferite și prelucrate pentru aplicații biomedicale (Tabel….)

Tabel ….. Tipurile si caracterizarea compoziției celor 6 tipuri de nanoparticule

Plăcile de cultură utilizate, cu 6 sau 12 godeuri au fost procurate de la Nalge Nunc International, Naperville, USA. Hota cu flux laminar utilizată pentru lucrul steril a fost o hotă Herracell iar incubatorul cu CO2, Hereus.

Sângele uman folosit în experiențe a fost obținut de la donatori sănătoși și furnizat de Centrul de Transfuzie al Municipiului București, colectat pe heparină. Hematiile umane de grup O, Rh pozitiv au fost obținute prin spălarea de 3 ori a sângelui recoltat pe heparină cu SF, pH 7,2.

În vederea testării citotoxicității eșantioanelor de nanoparticule s-a preparat o suspensie de hematii de 107 RBCs / ml de PBS, pH 7,2. Pentru fiecare probă s-a realizat o diluție serială a suspensiei de nanoparticule, ex: P1.1-P1.6, P1 pornind de la diluția stoc a fiecarei probe și diluată 1/2. În fiecare godeu cu diluțiile probelor de testat s-au adăugat câte 500 μl ml suspensie hematii 1×107 celule/ml, după cum se observă în Figura…..

Figura …… Plăcile de cultură conținând probele cu nanoparticule și suspensia de eritrocite umane.

Plăcuțele au fost incubate pentru 3 și 24 ore la temperatura camerei, în aceleași condiții fiind realizată o probă Martor de hematii. Înainte de analiză prin citometrie în flux, celulele au fost analizate prin microscopie optică. Analiza prin citometrie în flux s-a realizat cu un citometru FACScan, utilizând programul CellQuest Pro. Celulele au fost suspendate într-o soluție tampon PBS pH 7,4 și analizate prin citometrie în flux, câte 10.000 de celule pentru fiecare tip de analiză. Toate analizele au fost realizate în triplicat.

6.2.5. Obținerea unor extracte cu proprietăți antioxidante din Crataegus pentagyna pentru suplimentarea mediilor de conservare a produselor sanguine

Obținerea extractelor s-a realizat din fructe și ramuri de Crataegus pentagyna (paducel), fructe iubite de păsări și folosite în ceaiuri medicinale, recoltate toamna (15 octombrie) din diferite puncte, respectiv: Ciucurova, Ciucurova –punctul Oala, situate la 1km între ele, județul Tulcea și Cuza Vodă, județ Constanța.

Figura….. Fructe și ramuri de Crataegus pentagyna (păducel) (https://en.wikipedia.org/wiki/Crataegus_pentagyna)

Metoda de extracție utilizată a fost metoda metanolică, respectiv 2,5g material în 100 ml de methanol. 20 ml din fiecare extract a fost adus la sec și reluat în 5 ml ser fiziologic (SF) și filtrate pe filtru de seringă “Millex-GP-Syringe Filter Unit 0,22 μm”

Caracterizarea biochimică a probelor este conținută în Tabelul……

Tabelul …..

6.2.6. Conservarea concentratului de hematii (CGR) în mediu SAGM suplimentat cu extracțe de Crataegus pentagyna (păducel) în mini-pungi MacoPharma

Conservarea CGR în mediu SAGM suplimentat cu extractele de Crataegus pentagyna (păducel) s-a derulat în sistem de minipungi MacoPharma preparate din același material cu cel al pungilor mari clasice de conservare a sângelui. Hematocritul a fost de 50% iar mediul de conservare SAGM a fost suplimentat în proporție de 50% (vol/vol) și de 70% (vol/vol), conform Figurii …..

Figura….. Schema conservării CGR în mediu SAGM suplimentat cu extracte de Crataegus pentagyna (păducel) în mini-pungi MacoPharma

sursa

Minipungile au fost conservate la 4°C pentru 3 săptămâni, hematiile fiind comparate față de hematiile conservate doar în mediu PAGSM prin citometrie în flux.

6.3. Metode de analiză

6.3.1. Metode biochimice de analiză

6.3.1.1. Dozarea ATP-ului

Măsurarea cantității de ATP s-a facut cu ajutorul kitului colorimetric de dozare SIGMA. Principiul metodei se bazează pe utilizarea enzimei fosfokinazei fosfoglicerice (PGK) care catalizează următoarea reacție:

ATP+ 3-Fosfoglicerat ADP +1,3 Difosfoglicerat

Enzima gliceraldehid fosfat dehidrogenază (GAPD), prezentă de asemenea în amestecul de reacție va cataliza următoarea reacție chimică:

1-3-Difosfoglicerat + NADH Gliceraldehide-3-P+ NAD+P

Prin determinarea diminuării absorbanței la 340nm care are loc prin oxidarea ADH de către NAD, se obține măsura cantității de ATP prezentă la început. Cantitatea de ATP a fost exprimată în µmol ATP/dL de sediment eritrocitar.

6.3.1.2. Dozarea hemoglobinei

Dozarea hemoglobinei eliberate prin hemoliza hematiilor în pungile de conservare s-a realizat prin spectrometrie la 410 nm (banda Soret).

Acest procedeu este simplu și rapid, putând înlocui metoda lungă, dificilă și puțin sensibilă, cunoscută ca metodă Drabkin. Procentajul de hemoliză este dat de următoarea formulă:

100 – hematocrit x hemoglobina din mediu

hemoglobina totală din eșantion

6.3.2 Analiza prin citometrie în flux. Noțiuni generale de citometrie în flux

Citometria de flux este o metodă precisă și complexă de analiză a celulelor în stare izolată, antrenate într-un flux lichid. Ea reunește tehnologii din dinamica fluidelor, laserelor, ale opticii, electronicii și informaticii.

Principiul de bază al tuturor citometrelor de flux este de cuantificare a luminii de difuzie și de fluorescență, emise de către celule în timpul trecerii prin fața unui fascicol laser utilizat ca sursă de lumină de excitație.

Citometria de flux permite:

O analizare directă a celulelor în stare vie, fără a le traumatiza și chiar în mediul lor de cultură, cu unele măsuri de precauție ce trebuie cunoscute de cercetător.

O măsură multiparametrică asupra fiecarei celule analizate, ceea ce permite o caracterizare complexă a stării celulare și totodată identificarea și studierea diferitelor sub-populații existente în același eșantion analizat.

O analiză statistică corectă și complexă a populației celulare studiate, grație capacității rapide de trecere a unui număr mare de celule (5-10.000 celule sau mai mult, în funcție de interesul experimentatorului și de procentajul celular existent în eșantionul analizat).

O evaluare a heterogenității celulelor analizate, grație posibilităților sale de analiză cantitativă a fiecărui parametru studiat.

Citometria de flux utilizează mai multe tipuri de laser, cele mai comune fiind cele cu ioni de argon, heliu-neon, kripton.

Viteza de analiză poate atinge 5000 celule pe secundă și permite analiza multiparametrică și înregistrarea simultană pentru fiecare celulă. Fiind o tehnică ce face apel la numeroase concepte, ea a beneficiat din acest motiv de progresele realizate în domenii foarte diverse. O prezentare schematică a alcătuirii și funcționării unui citometru este prezentată în Figura ….

Celulele de analizat sunt dispersate într-un mediu de cultură sub formă de suspensie și supuse unei presiuni care le face să progreseze și să fie injectate într-un flux de lichid ce le antrenează.Volumul minim al probei este de 100 l iar concentrația suspensiei celulare trebuie să fie cuprinsă între 5×104 și 107 celule/ml.

Parametrii celulari măsurabili prin citometria de flux sunt de natură intrinsecă sau extrinsecă. Parametrii intrinseci sunt esențiali de natură morfologică precum talia, refringentă celulară, granulozitatea, densitatea, etc. și stau la baza analizei citometrice. Din contră, analiza unor parametri extrinseci necesită utilizarea unor produși fluorescenți (fluorocromi sau sonde cuplate la molecule fluorescente) și constituie analiza citofluorimetrică.

Figura ….Schema alcătuirii și funcționării unui citometru.

(dupa: www.biotech.uiuc.edu)

Toți acești parametri celulari sunt obținuți grație difuziunii luminii laser provocată de trecerea celulei prin fața fascicolului laser. Această lumină difuzată poate fi recuperată în ax, și atunci ea traduce talia celulară, sau la 90, pentru conținutul în granule intracitoplasmatice.

Lumina difuzată în ax este recuperată de către o celulă fotoelectrică, în timp ce lumina difuzată la 90 și fluorescentele sunt separate datorită unei rețele optice, pentru a fi trimise spre diferiți fotomultiplicatori. Aceștia transformă proporțional fotonii în fotoelectroni, care odată ce sunt amplificați sunt transformați în semnale analogice digitale de către sistemul electronic. Sistemul informatic al aparatului tratează aceste semnale și permite interpretarea lor conform programelor de analiză utilizate.

Pentru anumite celule, molecule precum hemoglobina, clorofilele, carotenoizii, etc, sunt direct analizabile « in situ » prin citofluorimetrie, deși sunt de natură intrinsecă. Acești pigmenți, alături de nucleotide sau molecule de natură flavinică, conferă celulelor un anumit nivel de autofluorescență.

Marcarea celulelor cu fluorocromi permite accesul la două categorii de informații :

1) Parametri structurali ce corespund în general la macromolecule sau la un ansamblu de constituanți (ADN, proteine ale citoscheletului, etc.) sau la molecule constitutive de talie mai mică dar prezente în concentrații semnificative (antigene membranare, colesterol, resturi de fosfatidilserină, etc.)

2) Parametri funcționali care reflectă modificări rapide în celulele vii, incluzând activități enzimatice, (peroxidaze, dehidrogenaze, proteaze, etc.), mișcări ionice (Ca, pH, etc.) sau permeabilitatea membranară.

Alegerea fluorocromului de utilizat trebuie să țină seama de tipul de laser din dotarea aparatului, de lungimea de undă de excitație, de emisie și mai ales de aplicabilitatea acestuia.

În analiza citofluorimetrică termenii “fluorocromi” și coloranți fluorescenți sunt folosiți indiferent, desemnând molecule fluorescente a căror specificitate este puțin crescută și/sau foarte dependente de condițiile de folosire. În schimb, termenul “sondă fluorescentă” este limitat la fluorocromii sau liganzii deveniți fluorescenți și care prezintă o specificitate de recunoaștere ridicată. (epitopi antigenici, secvențe nucleotidice, etc.)

Este dificil de a concepe și separa astăzi citometria de flux de aportul informatic care gestionează în timp real datele experimentale multiparametrice pentru fiecare celulă și permite stocarea și analizarea lor statistică ulterioară.

Numărul mare de celule analizate, între 5-10.000 celule/eșantion și viteza foarte mare de achiziție a probelor fac ca timpul între două evenimente să fie foarte scurt, dar și aleatoriu, lăsând puțin timp ordinatorului pentru calcul. Este obligatoriu deci de a înregistra datele obținute în timpul achiziției eșantionului și de a le interpreta ulterior, ceea ce constituie un avantaj, deoarece se pot efectua interpretări diferite și compara eșantioane analizate în timp.

Stocarea datelor se face sub forma de fișiere ce sunt inregistrate pe diferite suporturi fizice, precum: disc dur, CD, etc. În citometria de flux, aparent o metodă extrem de simplă, programul de achiziție a datelor de analiză, parțial transpus în limbaj de citometrie, nu poate fi încredințat decât unui specialist. Interpretarea datelor nu poate fi nici ea făcută mașinal, conform programelor de analiză existente, Lysis, Cellquest, etc., deoarece ea depinde de scopul cercetătorului și posibilitățile informatice de care dispune.

În mare, diferitele tipuri de prezentare a datelor obținute sunt prezentate sub formă de citograme mono, bi, sau tridimensionale.

1) Citogramele monodimensionale sunt cunoscute și sub numele de histograme, unde sunt prezentați parametri individuali precum FSC (Forward Scater) sau lumina difuzată în ax, SSC (Side Scater) sau lumina difuzată la 90, sau fluorescența emisă de un anumit fluorocrom. Abscisa corespunde intensității semnalului luminos care se eșalonează pe mai multe canale, iar ordonata corespunde numărului de celule analizate în fiecare canal. Această reprezentare permite analiza heterogenității într-o populație studiată si permite accesul la măsurători statistice precum: procentaje, medii, valoare mediană, deviație standard.

2) Citogramele biparametrice ale unei populații sunt cunoscute și sub numele de « dot-plot ». În acest caz, fiecare punct reprezintă o celulă, pe abscisă fiind reprezentată talia celulară (FSC) iar pe ordonata, refringentă sau granulozitatea celulară (SSC). Această reprezentare permite o discriminare mai ușoară a diferitelor sub-populații celulare dintr-un eșantion, o sub-populație celulară fiind definită printr-un « nor » de puncte ce au caracteristici apropiate pentru cei doi parametri reprezentați. Aceleași reprezentări biparametrice pot fi folosite pentru analizele de fluorescență, FL1/ FL-2, sau FL-1/FL-3, ceea ce permite obținerea cu ușurință de procentaje prin « tehnica cadranelor » sau a celor « 4 regiuni »

3) Reprezentările tridimensionale adaugă analizelor biparametrice, pe axul Z, numărul de celule corespunzător.

Grație informaticii putem obține fluorescență pentru o anumită sub-populație celulară sau să reperăm într-un dot-plot FSC/SSC caracteristicile celulare ale unei sub-populații celulare ce prezintă o anumită fluorescență FL-1, spre exemplu.

Citometria de flux este folosită în prezent pentru o gamă largă de aplicații precum: analiza antigenelor celulare membranare sau intracelulare, analiza acizilor nucleici, analiza funcțiilor celulare, studierea ciclului celular, detectarea și caracterizarea apoptozei și necrozei celulare, analiza organitelor celulare, analiza potențialului membranar mitochondrial, analiza fluxurilor ionice (Ca,Na,K,etc.), analiza pH-ului intracelular, etc.

6.3.2.1 Estimarea modificărilor de morfologie celulară prin măsurarea absorbției și difuziei luminii (FSC/SSC) prin citometrie în flux

Estimarea modificărilor de morfologie celulară prin măsurarea absorției și difuziei luminii sau analiza directă în sistem FSC/SSC (light scatter measurements) este o analiză biparametrică deosebit de simplă și sensibilă. Analizele biparametrice ale unei populații sunt cunoscute și sub numele de « dot-plot ». În acest caz, fiecare punct reprezintă o celulă, pe abscisă fiind reprezentată talia celulară (FSC) iar pe ordonată, refringența sau granulozitatea celulară (SSC). Lumina difuzată sub un unghi ascuțit sau în ax ( FSC) permite distingerea unei celule de agregate sau resturi celulare și aprecierea viabilității celulare deoarece celulele moarte difuzează mai slab lumina în această direcție. Această reprezentare biparametrică permite o discriminare mai ușoară a diferitelor sub-populații celulare dintr-un eșantion, o sub-populație celulară fiind definită printr-un «nor» de puncte ce au caracteristici apropriate pentru cei doi parametri reprezentați.

Protocolul de lucru: 100 µl de suspensie celulară (105 celule) au fost transferați într-un tub de analiză pentru FACS și s-au adăugat 900 µl PBS. Celulele au fost analizate direct , în sistem linear FSC/SSC. Toate studiile au fost realizate de cel puțin 3 ori și analizate în triplicat de fiecare dată.

6.3.2.2. Studiul fenomenului de apoptoză celulară. Determinarea gradului de externalizare a fosfatidilserinei

O primă schimbare ce se produce la o celulă angajată în fenomenul de apoptoză este modificarea asimetriei de membrană, respectiv translocarea fosfatidilserinei (PS) dinspre fața citoplasmatică spre exteriorul membranei plasmatice. Acest proces poate fi evidențiat folosind Annexina-V, o proteină care se leagă strict specific și cu mare afinitate de PS în prezența ionilor de Ca2+. Astfel, Annexina-V marcată cu un produs fluorescent precum FITC, PE sau biotina, permite identificarea celulelor apoptotice cu PS expuse la suprafața celulei, conform schemei din figura……

Figura …. Schema de discriminare între cele două tipuri de moarte celulară, apoptoză/necroză pentru o celulă eucariotă.

sursa

Pe acest fenomen se bazează diferențierea celulelor necrotice care vor fi colorate atât cu Annexina-V cât și cu Iodură de Propidiu (PI), fluorocrom care pătrunde în celulă și se fixează de nucleu, în timp ce celulele apoptotice vor fi marcate doar cu Annexina-V.

Marcarea simultană cu Annexina-V și PI oferă astfel posibilitatea discriminării între celulele aflate în apoptoză și cele în necroză sau în fazele târzii de apoptoză care conduc la moartea celulei. Discriminarea apoptozei/necroză se face prin citometrie în flux, așa cum se observă în figura următoare.

Pentru hematiile umane, lipsite de nucleu, se utilizează doar anexină, modalitatea de reprezentare a datelor fiind, în acest caz, histograma în sistem Fl1 sau analiza prin tehnica cadranelor în sistem FL1 (Annexina V-FITC versus autofluorescența celulară în FL2).

Protocolul de lucru: 100µl de suspensie celulară (2 x 105 celule) resuspendați în 1X tampon de legare HEPES calcic (10 mM HEPES/NaOH, NaCl, CaCl2, pH 7.4) au fost incubați cu 5 µl annexină-V-FITC și 10 µl PI, timp de 30 minute la temperatura camerei, în condiții de obscuritate. Înainte de analiză s-au adăugat 400 µl de 1X tampon de legare, iar suspensia a fost analizată prin citometrie în flux, în sistem biparametric FL1 (fluorescența verde FITC )/FL2 (autofluorescența în roșu ) prin tehnica cadranelor. Toate studiile au fost realizate de cel puțin 3 ori și analizate în triplicat de fiecare dată.

Figura ….Analiza prin tehnica cadranelor pentru identificarea simultană a celulelor viabile, în apoptoză și necroză, prin dubla colorare cu annexin-V-FITC (FL1)/ iodură de propidiu (FL2)

(după Bratosin et al., 2007)

6.3.2.3. Determinarea viabilității eritrocitare prin măsurarea activității esterazelor intracelulare cu Calcein-AM (test de toxicitate sau viabilitate celulară)

Estimarea viabilității prin citometrie în flux se poate face prin măsurarea absorbției și difuziei luminii cu ajutorul unor coloranți fluorescenți și non-fluorescenți. Coloranții fluorescenți sau fluorocromii au proprietatea de a absorbi energia fotonică a fascicolului incident și de a o transforma, emițând la o lungime de undă superioară cu un maxim de emisie inferior celui de absorbție. Ei sunt markeri mult mai specifici pentru anumiți constituenți celulari și sunt atât de excludere cât și supravitali. Aceștia sunt ușor de folosit, dar trebuie reținut că ei furnizează informații asupra integrității membranare și că, pentru o celulă apreciată ca vie, nu înseamnă obligatoriu că ea și-a păstrat și capacitatea de proliferare.

Dificultatea majoră de determinare a viabilității eritrocitelor constă în faptul că, față de celulele eucariote unde determinarea acesteia se face cu metode bazate pe coloranți vitali care se leagă de organite intracelulare (nucleu, mitocondrii), hematiile umane sunt lipsite atât de nucleu cât și de mitocondrii ceea ce face dificilă determinarea viabilității eritrocitelor cu metodologia existentă. Din necesitate, în anul 2005, Bratosin et al., a pus la punct o metodă rapidă și sensibilă bazată pe utilizarea Calcein-AM prin citometrie în flux pentru determinarea viabilității hematiilor. (Figura ….)

Figura ….. Formula chimică a Calcein – AM (acetoximetil ester de fluoresceină)

sursa

Calcein-AM este un substrat nonfluorescent care traversează membrana celulelor viabile și va fi hidrolizată de către esterazele citosolice în calceină, produs verde fluorescent, ce va fi reținut în celulele cu membrană intactă. Pierderea de calceină, este similară cu pierderea viabilității celulare si este determinată prin citometrie în flux, conform histogramei următoare:

Figura ….. Determinarea viabilității celulare cu Calceina-AM conform cu metoda descrisă de Bratosin et al., 2005.

Calcein-AM este cel mai bun indicator de viabilitate celulară datorită reținerii lui superioare în celulă și relativei sale insensibilități a fluorescenței emise la pH-uri situate în limitele fiziologice.

Protocolul de lucru: Viabilitatea celulară s-a determinat conform protocolului elaborat de Bratosin et al., (2005(a)). A fost preparată o soluție stock de Calcein-AM în DMSO (1mg în 100 µl DMSO) care s-a conservat la -20°C și apoi s-a preparat extemporaneu o soluție de lucru 100 µM în tampon PBS, pH 7,4. Celulele (4 x 105 în 200 µl tampon PBS) au fost incubate cu 10 µl de soluție de lucru Calceina-AM (concentrația finală a calceinei 5 µM), timp de 45 minute, la întuneric. Înaintea analizei prin citometrie în flux s-a adăugat 0,5 ml de tampon PBS. Achiziția și analiza celulelor s-a realizat în sistem linear pentru FSS/SSC și în sistem logaritmic pentru FL1. Toate analizele s-au realizat în triplicat.

6.3.2.4. Dozarea radicalilor liberi prin citometrie de flux

În interiorul unei celule, speciile reactive de oxigen (Reactive Oxygen Species, ROS) sunt extrem de periculoase, ele atacând proteinele sau lipoproteinele, producând degradarea acestora. Într-o mare măsură ROS sunt factori declanșatori de apoptoză și de moarte celulară.

În general măsurarea ROS este extrem de dificilă pentru că ei au o durată de viață scurtă iar metodele curente folosite sunt complicate, insuficient de sensibile, putând furniza rezultate eronate atunci când populația celulară studiată este heterogenă.

Citometria în flux oferă și de această dată numeroase avantaje printre care abilitatea de a examina cantitativ caracteristicile unui mare număr de celule individuale, a unor subpopulații, fără a se limita la măsurarea mediei populației totale. Ea a fost utilizată pentru a măsura stresul oxidativ în numeroase tipuri celulare.

În citometria de flux analizele sunt realizate în cea mai mare parte a cazurilor marcând celulele cu coloranți fluorescenți. În cazul măsurării reacțiilor de oxido-reducere, coloranții sunt non fluorescenți. Substratele utilizate pentru măsurarea activității oxidative sunt numite fluorogene deoarece ele capătă această proprietate după unul sau mai multe clivaje enzimatice, în funcție de activitatea oxidativă.

Cele mai utilizate sunt: 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) sau 2,7-diclorodihydrofluorescein diacetat (H2DCF-DA).

DCFH-DA este un produs non-fluorescent clivat într-o primă etapă de esterazele celulare tot într-un produs non-fluorescent (DCFH) care apoi este oxidat de speciile reactive de oxigen (ROS) sau de către peroxidaze într-un produs fluorescent verde (DCF) ce poate fi măsurat prin citometrie în flux.

Figura …. – Mecanismul de dezacetilare a DCFH-DA, molecula permeabilă față de membrana și precursor non-fluorescent al DCF, produs fluorescent și impermeabil față de membrane.

Protocolul de lucru: S-a preparat o soluție stoc 100 mM de H2DCFH-DA (50 mg H2DCFH-DA în 1ml DMSO) care a fost conservată la -20°C. În momentul analizei s-a preparat o soluție de lucru 500 µM H2DCFH-DA în H2O distilată (1µl solutie stock în 199 µl H2O distilată) și o suspensie celulară (er5tr6c5te) de aprox. 106 celule/ml . Suspensia obținută a fost incubată cu 20 µl soluție de lucru 500 µM H2DCFH-DA pentru o oră la 37°C, în condiții de obscuritate (concentrație finală: 10 µM). S-a preparat de asemeni, în condițiile descrise mai sus un eșantion care a servit de martor pozitiv, producerea de ROS fiind indusă cu H2O2 și care a fost în continuare centrifugat 5 minute la 2000 rpm pentru îndepărtarea supernatantului. S-a adăugat 1ml H2O2 2 mM în PBS (1µl H2O2 30% în 4410µl PBS) și s-a incubat o oră la 37°C în condiții de obscuritate. S-a analizat la FACS, servind drept martor pozitiv pentru analiză, probele fiind analizate direct prin citometrie în flux pentru fluorescența verde în FL1.

6.3.2.7. Determinarea pH-ului intracelular

Determinarea pH-ului intracelular s-a realizat după un protocol pus la punct de Franck și colaboratorii (Franck et al., 1996) pentru studiul pH-ului intracelular la celulele nucleate, având următorul principiu: BCECF-AM (,7’-bis-(2-carboxyéthyl)-5,6 carboxyfluorescéine acétoxyméthyl ester) este clivat de esterazele intracelulare, intensitatea de fluorescență fiind pH dependentă. Compensarea variabilității de încorporare a fluorocromului și de activare a esterazelor, se calculează raportul R de fluorescență la 520nm (verde) și la 620nm (roșie). Pentru măsurarea pH-ului intracelular, se stabilește o curbă etalon, incubând celulele în tampoane fosfat de pH diferite în prezența de nigericină care permit egalizarea pH-ului mediului interior și exterior. pH-ul celular s-a determinat fǎcându-se referințǎ la curba etalon obținutǎ.

Protocolul de lucru: S-a prepart o soluție de nigericinǎ 1mM în etanol absolut (5mg/ 6,89 ml) ce se poate conserva mai multe sǎptǎmâni la 4°C. S-a preparat o soluție stoc de 2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5 (si-6) carboxy-fluoresceine acetoxymethyl ester (BCECF-AM) 1mM în DMSO (1mg/1,136 ml) care s-a conservat la în mediu anhidru și ferit de luminǎ, și

s-au preparat tampoanele fosfat A și B necesare obținerii tampoanelor de diferite pH-uri pentru etalonare (prin amestecarea diferitelor volume).

* Tampon A: KH2PO4 (18,37g/l) + NaCl 20mM (1,17g/l)

* Tampon B: K2HPO4 (19,16g/l) + NaCl 20mM (1,17g/l)

Ulterior s-a preparat seria de tampoane cu pH prestabilit conform tabelului:

107 RBCs/ml în PBS au fost incubate cu 10µl BCECF-AM 1mM pentru 30-60 minute, la (10 µM concentrație finalǎ BCECF).

S-a preparat o curbǎ etalon pentru fiecare serie de analize astfel: 100µl celule prealabil incubate cu BCECF sunt adǎugate peste 10µl nigericinǎ diluatǎ extemporaneu (1µM final) și 900µl tampon fosfat la pH-ul dorit (de la pH 6,0 la pH 7,4). Suspensia celularǎ a fost incubată la pentru 10 minute și apoi plasată imediat pe gheatǎ, colorația fiind stabilǎ pentru 2 ore. S-a analizat citofluorimetric 20 000 celule, pentru fluorescența verde FL1 (BCECF), mod liniar și FL2 pentru fluorescența roșie (BCECF), de asemeni în mod liniar.

Un exemplu de curbă etalon care se prepară la fiecare determinare de pH intracelular este prezentată în Figura…….

Figura…..Exemplu de curbă etalon pentru calculul pH-ului intracelular

6.4. Metode de analiză pe bază de microscopie

6.4.1 Analiza prin microscopie optică

Principiul de funcționare al microscopiei optice constă în iluminarea preparatului cu o sursă luminoasă, moleculele de observat interacționând cu lumina în mai multe moduri: a) prin absorbția unei anumite lungimi de undă a luminii (microscopie în lumină directă); b) prin defazarea diferitelor raze luminoase (microscopie în contrast de fază); c) prin emiterea unei lumini de o altă lungime de undă decât cea de origine (microscopie de fluorescență).

Microscopia optică are ca principal avantaj obținerea unei imagini a obiectului investigat, fără să fie nevoie de prelucrări sau procesări secundare, ceea ce conferă metodei un caracter non-invaziv dar și faptul că reprezintă o tehnologie cu costuri scăzute față de celelalte metode. Ea însă poate investiga numai obiecte care reflectă suficient de bine în spectrul vizibil, sau care au un indice de refracție suficient de ridicat.

Protocolul de lucru: Pentru vizualizare, 100 µl de suspensie celulară (106 celule) de analizat s-au transferat într-o plăcuță de cultură cu godeuri și s-au diluat prin adăugarea a 900 µl PBS. Celulele s-au vizualizat în suspensie.

6.4.2. Analiza prin microscopie electronică SEM

Microscopia electronică poate fi împărțită in două categorii: de transmisie, în cazul specimenelor bidimensionale (cu grosimi mai mici sau comparabile cu drumul liber mediu al electronilor accelerați- zeci de nm) sau de investigare a suprafeței în cazul celor tridimensionale (când dimensiunile depășesc drumul liber mediu pe toate axele).

Ea permite obținerea unor detalii de analiză ce contribuie la o mai bună corelare a rezultatelor obținute prin citometrie în flux sau microscopie optică.

Dacă fascicolul de electroni bombardează preparatul, o parte din aceștia îl traversează iar restul este reemis ca electroni secundari pe partea expusă a preparatului, aceștia fiind cei care vor servi la construirea imaginii. Rezultatul este o reprezentare a suprafeței obiectului analizat.

Protocolul de lucru: Eritrocitele au fost fixate pentru 4h cu o soluție de 1.25% glutaraldehidă în tampon cacodilat de sodiu 0.1 M pH 7,2 după care suspensiile au fost spălate de trei ori (centrifugare 3 minute la 3000g) cu apă distilată și filtrate pe filtre Anodisc de 0.2 µm (Bratosin D. et al., 2011). După uscare eșantionul a fost vizualizat direct cu microscopul electronic de scanare HITACHI SU-1510.

CAPITOLUL 7. CERCETĂRI PRIVIND INFLUENȚA PH-ULUI EXTRACELULAR ȘI A COMPOZIȚIEI MEDIILOR DE CONSERVARE ASUPRA FENOMENULUI DE APOPTOZĂ CELULARĂ A HEMATIILOR ȘI PLACHETELOR SANGUINE CU CONSECINȚE ASUPRA CALITĂȚII PRODUSELOR STOCATE

Transfuzia eritrocitelor (RBCs) și trombocitelor, este un tratament decisiv, pentru salvarea vieții în cazul anemiilor severe cauzate de boli sau chimioterapie, sau pierderii de sânge datorită unei traume, accidente sau a unei intervenții chirurgicale majore.

Așa cum se cunoaște din literatura stiințifică, înainte de a fi transfuzate, hematiile și plachete sunt stocate în condiții controlate pentru o anumită perioadă de timp (până la 42 zile pentru hematii și doar 5 zile în cazul plachetelor). Timp de decenii componentele RBCs au fost preparate sub formă de concentrate în soluție aditivă cu nutrienți, care păstrează și extind durata de viață a componentei RBCs, permițând depozitarea în condiții de refrigerare (Hogman et al., 1999; Hess et al., 2010). În timpul stocării, componentele sanguine sunt supuse de unor modificări complexe și progresive, morfologice și biochimice, denumite „leziuni de stocare”, ce pot altera funcția lor biologică (Tinmouth et al., 2006), reprezentând un factor de risc major pentru creșterea morbidității și mortalității la anumite grupe de pacienți. Desi RBCs au fost un model experimental favorit, cercetarea stocării RBCs a demonstrat că o mulțime de evenimente de biologie fundamentală ale RBCs nu sunt încă bine înțelese. Complexitatea inter-relației dintre biochimia RBCs, structura citoscheletului și proprietățile membranei au făcut dificil de prezis modul în care RBCs vor răspunde la diferite condiții de stocare. Expunerea RBCs la mediile de stocare de bază non-fiziologice, a indicat existența unor mecanisme biochimice necunoscute anterior în hematii, inclusiv procese asemănătoare celor apoptotice, ionii și canalele osmotice care se comportă în mod diferit decât era de așteptat, expunerea de receptori noi sau modificați, datorită oxidării și/sau activităților proteazelor/glicozidazelor sau senescenței (Bratosin et al., 1998; Bratosin et al., 2001; Bratosin et al., 2002; Bosman et al., 2010).

7.1. Influența pH-ului extracelular și a compoziției mediilor de conservare asupra fenomenului de apoptoză celulară a hematiilor cu consecințe asupra calității produselor stocate în conservarea acestora

În condițiile actuale ale transfuziei sanguine, mai mult de 30% din ele sunt eliminate din circulație în decursul a 24 ore și 75 % după 48 ore de la transfuzie (Luten et al., 2008), ceea ce ridică problema eficienței actului transfuzional și al consecințelor negative induse la pacienții politransfuzați. Printre leziunile de stocare ce apar, reducerea nivelului de ATP și rata hemolizei sunt cele determinate în mod curent. Conform directivei Consiliului European din 2004, condițiile generale minimale obligatorii pentru hematiile transfuzabile impun ca rata hemolizei să nu depășească 0,8% și o proporție de minim 75% din celulele transfuzate să rămână în circulație 24h după transfuzie (Council of Europe, 2004).

Toate soluțiile aditive pentru RBCs licențiate în prezent au un pH acid (aprox.5,6-5,8), care este mult sub pH-ul fiziologic normal de 7,3 al sângelui venos. Soluțiile aditive acide (și anticoagulantele) sunt utilizate doar pentru că este mai ușor să se încălzească și să se sterilizeze o soluție ce conține glucoză la un pH acid. La pH-ul fiziologic sau alcalin, glucoza se caramelizează în timpul sterilizării la cald.

Deoarece, prelevarea sângelui se face într-un mediu anticoagulant citrat-fosfat-dextroză (CPD) de pH 5,6, iar marea majoritate a mediilor de conservare utilizate au de asemeni un pH acid, precum SAGM (Sodium Adenina Glucoza Manitol) de pH 5,1± 0,3, ne-am propus studierea modificărilor de morfologie și fiziologie induse de pH-ul acid prin citometrie în flux, comparativ cu cele 2 teste obligatorii, respectiv dozarea ATP-ului și % de hemoliză. Cercetările s-au efectuat pe 2 subiecți diferiți, rezultatele fiind similare, ne-am rezumat la prezentarea unui singur experiment semnificativ.

Determinările au fost făcute prin metode de citometrie în flux (tehnologie laser rapidă, statistică și reproductivă) prin: analiza modificărilor de morfologie în sistem FSC/SSC (talie celulară/conținut celular) completată cu examinare prin microscopie electronică SEM, evaluarea influenței pH-ului extracelular din mediul de prelevare asupra pH-ului intracelular, asupra externalizării de fosfatidilserină cu Annexina-V-FITC, asupra producerii de ROS, dar mai ales asupra viabilității celulare determinată cu calceina-AM. Testele au fost corelate cu cele clasice, respectiv, determinarea hemolizei și ATP-ului.

7.1.1. Influența pH-ului extracelular din mediul de prelevare asupra hematiilor

Într-o primă etapă ne-am propus studierea influenței pH-ului acid al mediului de prelevare CPD pentru sângele destinat transfuziilor asupra eritrocitelor, prin citometrie în flux în sistem FSC/SSC (talie celulară/conținut celular).

Se constată cu ușurință că față de distribuția eritrocitelor la momentul prelevării (fig…A), morfologia eritrocitelor suferă modificări profunde atât ca talie cât și ca densitate (fig…B), pentru ca după o săptămână să se constate apariția unui număr important de gosturi (eritrocite hemolizate) ce se plasează în zona indicată de săgeată. Analiza pH-ului extracelular al mediului de prelevare a indicat modificarea de la pH 5,6 al CPD-ului la pH 6,8 după 6 ore, ajungând la neutralitate cu un pH de 7,6. Această modificare se datorează pe de o parte puterii tamponante a plasmei sanguine dar și schimburilor ionice la nivel de eritrocite așa cum indică modificarea în SSC a citogramelor, ceea ce conduce inevitabil la o dereglare a conținutului celular și implicit a fiziologiei eritrocitelor.

Figura….Analiza prin citometrie în flux în sistem FSC/SSC (talie celulară/conținut celular) a influenței pH-ului acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD.

A-To ; B-6h după prelevare; C – după 1 săptămână; x-FSC; y-SSC; z- numărul de celule; săgeata indică zona de resturi celulare (ghosturi).

7.1.2. Influența pH-ului extracelular din mediul de prelevare asupra hematiilor

Rezultatele acestui prim experiment ne-au determinat să comparăm comportamentul și modificările suferite de eritrocitele aceluiași donor prelevate comparativ pe heparină și pe anticoagulant CPD. Ulterior, eritrocitele au fost conservate în ambele cazuri în mini-pungi MacoPharma în mediu SAGM și analizate săptămânal timp de 4 săptămâni prin citometrie în flux pentru schimbările de morfologie, externalizarea de fosfatidilserină, măsurarea cantității de ROS intracelulare, măsurarea pH-ului intracelular și viabilitate celulară.

Astfel, sângele recoltat pe heparină a fost transferat în mini-pungile cu mediu de conservare SAGM, iar eritrocitele provenite de la același donator, recoltate pe CPD, au fost lăsate timp de 16h la 20°C, conform protocolului din centrele de transfuzii și apoi transferate în mini-pungile de stocare cu SAGM la un hematocrit în ambele cazuri de 60% și conservate ulterior la 4°C. O analiză a morfologiei eritrocitare prin microscopie de scanare înainte de conservare este prezentată în figura…..

Figura….. Analiza prin microscopie electronică de scanare a sângelui prelevat pe heparină (A) și conform practicilor din centrele de transfuzie, pe mediu CPD, pH 5,6 (B) după 16 h la 20°C, înainte de pasajul în mediul de conservare SAGM.

Se observă cu ușurință din Figura….(B), modificarea morfologiei celulare în cazul prelevării pe mediu CPD de pH 5,6 la 16 h de la prelevare, cu apariția de echinocite într-un număr mare.

7.1.2.1. Evaluarea prin citometrie în flux directă FSC/SSC a influenței pH-ului extracelular din mediul de prelevare asupra morfologiei hematiilor în timpul conservării în mediu SAGM

Analiza modificărilor de morfologie prin citometrie în flux constituie un test simplu și extrem de sensibil care poate furniza informații importante despre calitatea hematiilor, fiind mult mai simplă, rapidă și statistică față de microscopia optică sau de scanare.

Parametrii măsurați prin citometrie în flux sunt semnale optice a căror intensitate poate fi corelată cu proprietățile celulare. Estimarea morfologiei celulare prin măsurarea absorbției și difuziei luminii este cunoscută și ca "analiză directă în sistem FSS/SSC", (light scatter measurements).

După interceptarea luminii incidente, celula emite anumite semnale. Lumina difuzată sub un unghi ascuțit sau în ax (FSC) poate fi corelată cu talia celulară, permițând astfel de a distinge o celulă de agregate sau resturi celulare și a aprecia viabilitatea celulară, deoarece celulele moarte difuzează mai slab lumina în această direcție. Lumina difuzată sub un unghi drept (SSC) permite studierea refringenței citoplasmatice, a conținutului celular.

Analiza unei populații celulare în funcție de cei doi parametri analizați FSC/SSC, generează o citogramă sau un "dot-plot", unde fiecare celulă este reprezentată în funcție de valorile ei identificate printr-un punct, iar de celulele care prezintă caracteristici apropiate pentru cei doi parametri analizați constituie o populație sau subpopulație celulară și se prezintă ca un "nor" , ceea ce permite discriminarea celulelor vii de cele în apoptoză sau moarte, observat fiind că celulele moarte difuzează mult mai slab lumina în FSC.

Din ambele figuri, Figura….și Figura…., se observă o mai bună conservare a morfologiei eritrocitelor prelevate pe heparină prin valorile de XGeoMean care sunt mult mai aproape de cea inițială, în timp ce pentru eritrocitele prelevate pe CPD diminuarea taliei celulare se manifestă încă de la primele 16h, pentru a fi mult diminuată după 4 săptămâni în mediu SAGM. Și mai importante sunt variațiile de conținut celular exprimate prin valorile de YGeoMean care diminuează foarte mult în cazul eritrocitelor prelevate pe CPD, ceea ce semnifică modificări importante de compoziție la nivel intracelular.

Figura…… Analiza prin citometrie în flux directă în sistem FSC/SSC (talie celulară/conținut celular) a influenței pH-ului acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD asupra morfologiei celulare. XGeoMean-valoarea mediei taliei celulare; YGeoMean-valoarea mediei conținutului celular. Numărul de celule analizate-10 000. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele trei experimente realizate.

Figura…… Analiza comparativă prin citometrie în flux a valorilor X și Y GeoMean pentru RBCs conservate în mediu SAGM timp de 4 săptămâni după prelevare pe heparină și CPD.

XGeoMean-valoarea mediei taliei celulare; YGeoMean-valoarea mediei conținutului celular. Numărul de celule analizate-10 000. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele trei experimente realizate.

7.1.2.2. Evaluarea prin citometrie în flux a influenței pH-ului extracelular din mediul de prelevare asupra pH-ului intracelular.

Așa cum se observă din Figura….. și histograma comparativă a pH-ului intracelular evaluat prin citometrie în flux sub influența pH-ului acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD în timpul conservării pentru 4 săptămâni în mediu SAGM (Figura….) nu se observă mari variații ale pH-ului intracelular în urma celor 2 serii de experimente derulate, diferența fiind maxim de 0,4 unități pentru analizele efectuate la fiecare interval de timp al conservării. În toate cazurile, pH-ul intracelular nu a fost sub pH 7.

De menționat că sensibilitatea determinărilor de pH intracelular prin citometrie în flux este foarte mare iar determinările au fost făcute în triplicat.

Figura…… Analiza prin citometrie în flux a pH-ului intracelular sub influența pH-ului acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD în timpul conservării pentru 4 săptămâni în mediu SAGM. Numărul de celule analizate-10 000. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele trei experimente realizate.

Figura……Histograma comparativă a pH-ului intracelular evaluat prin citometrie în flux sub influența pH-ului acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD în timpul conservării pentru 4 săptămâni în mediu SAGM. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele două experimente realizate, fiecare determinare efectată fiind în triplicat.

7.1.2.3. Evaluarea influenței pH-ului extracelular din mediul de prelevare asupra externalizării de fosfatidilserină cu Annexină-V-FITC

Conform Figurei….. , identificarea celulelor viabile și în apoptoză s-a facut prin tehnica cadranelor cu Annexina-V-FITC (FL1) versus autofluorescența (FL2) în timpul conservării pentru 4 săptămâni în mediu SAGM, pentru evidențierea influenței exercitate de pH-ul acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD.

Fig…… Analiza prin citometrie în flux a influenței exercitate de pH-ul acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD în timpul conservării pentru 4 săptămâni în mediu SAGM. Identificarea celulelor viabile și în apoptoză s-a facut prin tehnica cadranelor cu Annexina-V-FITC (FL1) versus autofluorescența (FL2). Abscisă: intensitatea fluorescenței verzi a Annexinei-V-FITC (FL1), în scară logaritmică. Ordonată: logaritmul intensității autofluorescenței (FL2). Cadranul stânga jos: celule viabile (Annexin־); Cadranul dreapta jos: celule aflate în apoptoză (Annexina+); Procentul de celule se referă la procentul de celule în apoptoză (Annexina+). Număr de celule analizate 10.000. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele trei experimente realizate.

Figura…… Histograma comparativă a gradului de externalizare de fosfatidilserină exercitat de pH-ul acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD în timpul conservării pentru 4 săptămâni în mediu SAGM, pe baza datelor din analiza prin tehnică cadranelor cu Annexină-V-FITC (FL1) versus autofluorescența (FL2) prezentată în Figura……. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele două experimente realizate.

Se observă cu ușurință un grad mai mare de externalizare a PS, după 16h, de 4,24% pentru sângele prelevat pe CPD față de doar 1,82 la sângele recoltat pe heparină, cel mai probabil datorită pH-ului acid de 5,6 al anticoagulantului. În continuare, în timpul conservării pe același mediu SAGM, sângele recoltat pe CPD externalizează un procentaj mai mare de PS pe întreaga durată de 4 săptămâni, la sfârșitul acesteia având un procentaj de 8.78% pentru sângele prelevat pe CPD față de doar 4,65 la cel prelevat pe heparină (aproape dublu). Trebuie menționat că externalizarea de PS constituie prima etapă, precoce a fenomenului de moarte celulară prin apoptoză (erythroptosis).

7.1.2.4. Evaluarea prin citometrie în flux a influenței pH-ului extracelular din mediul de prelevare asupra producerii de ROS

Speciile reactive de oxigen (ROS), specii moleculare instabile care posedă un electron nepereche, sunt produse în mod continuu în celule ca produs al metabolismului și o concentrație crescută a acestora poate produce oxidarea unor molecule foarte variate, care în final pot conduce la moartea celulară. Stresul oxidativ se caracterizează printr-o diminuare intracelulară a antioxidanților (în particular GSH) și a moleculelor "scavenger " de radicali liberi (vitamina E și C), inhibarea activității unor enzime care contribuie la metabolismul și detoxificarea speciilor de oxigen reactive precum glutation-peroxidaza (GPx), GSH-reductaza, GSH-transferaza, catalaza (CAT) și superoxid dismutaza (SOD), și o creștere în consecință a producției de ROS (radicali de anion superoxid, peroxid de hidrogen, radical peroxil, radical hidroxil, oxid nitric, radical peroxinitrit, etc). În aceste condiții, stresul oxidativ contribuie la inducerea și derularea fenomenului de apoptoză.

Măsurarea speciilor reactive de oxigen (ROS) este foarte dificilă datorită timpului lor de viață foarte scurt și metodelor de investigare folosite ("electron spin resonance " și "spin trapping") care sunt complicate și furnizează valori aproximative atunci când populațiile analizate sunt heterogene.

Pe baza acestor date și a datelor din literatura pentru măsurarea stresului oxidativ pe numeroase tipuri celulare, inclusiv pe eritrocite normale sau talasemice prin citometrie în flux, obiectivul studiului nostru a fost evaluarea în RBCs a producerii de ROS sub acțiunea pH-ului extracelular acid al CPD-ului comparativ cu heparină ca medii de prelevare a sângelui înainte de conservarea acestuia în SAGM pentru 4 săptămâni.

Așa cum sunt prezentate în Figura…. și Figura….., cantitatea de ROS în cele 2 serii de conservare a sângelui sunt semnificativ diferite, fiind mult mai mare în cazul RBCs prelevate pe CPD, chiar la numai 16h de la prelevare. Cantitatea de ROS devine maximă după o săptămână de conservare în mediu SAGM, fiind dublă față de cea detectată în cazul sângelui prelevat pe heparină (MFI-169,8 față de 81,64). În cazul sângelui prelevat pe heparină, cantitatea de ROS devine maximă cu întârziere de o săptămână, după 14 zile de conservare (MFI-87) și se diminuează la sfârșitul perioadei ajungând la un MFI-63,8. La sfârșitul perioadei de conservare de 4 săptămâni, producția de ROS în sângele prelevat pe CPD este dublu (MFI-118,9).

7.1.2.5. Evaluarea prin citometrie în flux a influenței pH-ului extracelular din mediul de prelevare asupra viabilității celulare determinată cu calceină-AM

Determinarea viabilității hematiilor este esențială în determinarea calității sângelui destinat transfuziilor sau în cazul unor patologii hematologice. Dificultatea majoră de determinare a viabilității eritrocitelor constă în faptul că, față de celulele eucariote unde determinarea acesteia se face cu metode bazate pe coloranți vitali care se leagă de nucleu, sau mitocondrii, hematiile umane sunt lipsite de organite intracelulare ceea ce a facut mult timp dificilă determinarea viabilității eritrocitelor cu metodologia existentă.

Începând cu anul 2005, a fost pusă la punct o metodă rapidă și sensibilă prin citometrie în flux, bazată pe utilizarea Calcein-AM, pentru determinarea viabilității hematiilor (Bratosin et al., 2005), metoda utilizată pe scară largă, internațională. Calcein-AM este cel mai bun indicator de viabilitate celulară datorită reținerii lui superioare în celulă și relativei sale insensibilități a fluorescenței emise la pH-uri situate în limitele fiziologice.

Rezultatele obținute în explorarea influentei pH-ului extracelular din mediul de prelevare asupra viabilității celulare sunt prezentate în Figura….. și Figura……Se observă cu ușurință că pe întreaga perioadă de conservare în mediu SAGM, sângele recoltat pe heparină își păstrează mult mai bine viabilitatea celulară față de cel prelevat pe CPD. În cele 16h după prelevarea sângelui pe CPD și heparină, până la repunerea acestuia în mediu de conservare SAGM, diminuarea viabilității este de 16,5% pentru sângele pe CPD. Această diminuare este mai mare, de 21% în prima săptămână și în cea de a 2-a săptămână, continuând să diminueze cu 17% pentru săptămâna 3 și cu 16% în cea de a 4-a săptămână. Per ansamblu, viabilitatea RBCs prelevate pe CPD este mai mică cu 18% față de cele prelevate pe heparină.

Fig…… Analiza prin citometrie în flux a influenței pH-ului acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD asupra producerii de ROS în timpul conservării pentru 4 săptămâni în mediu SAGM a RBCs. Numerele reprezintă media de intensitate a fluorescenței în FL1 (MFI). Numărul de celule analizate: 10.000. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele două experimente realizate.

Figura…… Histograma comparativă a nivelului de ROS produs sub influența pH-ului acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD și al heparinei în timpul conservării pentru 4 săptămâni în mediu SAGM. Valorile reprezintă MFI de fluorescență din figura….. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele două experimente realizate.

Fig…… Analiza prin citometrie în flux a viabilității celulare sub influența pH-ului acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD și al heparinei asupra hematiilor în timpul conservării pentru 4 săptămâni în mediu SAGM. Numerele reprezintă media de intensitate a fluorescenței în FL1 (MFI) pentru calceină. Numărul de celule analizate: 10.000. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele două experimente realizate.

Figura…… Histograma comparativă a viabilității celulare sub influența pH-ului acid (pH 5,6) al mediului de prelevare CPD și al heparinei în timpul conservării RBCs pentru 4 săptămâni în mediu SAGM. Valorile reprezintă MFI de fluorescență a calceinei din figura….. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele două experimente realizate.

7.1.2.6. Determinarea hemolizei și ATP-ului

Comparând valorile hemolizei prezentate în Figura ….., hemoliza în pungile cu sânge prelevat pe CPD este cu 0,34 % mai mare, ceea ce semnifică o valoare de peste 3 ori mai mare, în deplină concordanță cu testele citometrice aplicate de noi.

Figura…. Determinarea ratei de hemoliză la 4 săptămâni de conservare în mediu SAGM în funcție de mediul de prelevare (heparină și CPD). Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele două experimente realizate.

Determinarea cantității de ATP în cele 2 cazuri ( Figura….) demonstrează o diferență de 7,13 μg ATP/dL, în favoarea RBCs prelevate pe heparină.

Figura…. Determinarea cantității de ATP la 4 săptămâni de conservare în mediu SAGM în funcție de mediul de prelevare (heparină și CPD). Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele două experimente realizate.

7.2. Caracterizarea prin citometrie de flux și tehnici complementare a calității plachetelor conservate în actualele condiții de prelevare și conservare din centrele de transfuzii

Plachetele sanguine, numite si trombocite, sunt elemente figurate cunoscute pentru rolul lor în coagularea sângelui, activându-se în cazul leziunilor vasculare în scopul stopării unei hemoragii. Ele nu sunt cu adevărat celule, în sensul propriu al cuvântului ci fragmente anucleate rezultate din fragmentarea celulelor megacariocite din măduva osoasă hematopoietică. Plachetele sanguine în repaus se prezintă sub forme discoidale de 1,5-4 µm în diametru și 0,5-2 µm grosime fiind constituite din 3 compartimente celulare: sistemul membranar, organitele (mitocondrii) și citoscheletul.

În prezent, există unele probleme în ceea ce privește siguranța și calitatea plachetelor, folosite pentru transfuzii. Acestea includ reacții adverse legate de transfuziile leucocitelor, contaminare bacterială, contaminări virale, un termen de valabilitate de 5 zile și o scădere a viabilității si a funcției hemostatice a plachetelor în timpul standard de stocare care se realizează la temperatura camerei.

Alte aspecte care rămân în centrul investigațiilor în curs, sunt legate de dezvoltarea de noi soluții aditive pentru a păstra sau pentru a elimina leziunile de depozitare precum și dezvoltarea de metode practice pentru a reflecta funcțiile plachetelor și viabilitatea in vivo;

În prezent există câteva dezavantaje majore în stocarea plachetelor la temperatura camerei, durata lor de viață fiind limitată la numai 5 zile, ceea ce conduce la un procent ridicat de expirare. Mai mult de atât, pe timpul stocării descrește durata de viață a plachetelor, aproximativ 30% din conținut este pierdut după cele 5 zile.

Durata de viață a trombocitelor poate fi în strânsă corelație cu cea a activității metabolice și starea de funcționalitate a mitocondriilor. În condiții optime de depozitare, la 20-22°C rata de îmbătrânire este de aproximativ 0.4 din rata de îmbătrânire in vivo la 37°C, acest fapt fiind similar cu raportul dintre ratele metabolice la aceste două temperaturi.

Se estimează că 80% din producția de ATP în trombocite este furnizată de fosforilarea oxidativă. Mitocondriile, în alte tipuri de celule, s-au dovedit a avea o rată completă de 2-3 săptămâni. Deoarece trombocitele nu au niciun mijloc de sinteză de enzime noi și structuri mitocondriale, acest lucru sugerează că durata de viață a trombocitelor in vivo poate fi limitată de către funcția adecvată mitocondrială pentru menținerea homeostaziei normale a celulelor.

Astfel, se poate ca durata de viață să fie mai lungă in vitro la temperatura de 22°C în comparație cu cea in vivo la 37°C.

Până în prezent, cercetările noastre s-au axat pe aplicarea testelor de evaluare a apoptozei pe plachetele sanguine la momentul To și în timpul conservării până la ziua a 7-a, teste de citometrie în flux (dot-plot, determinarea nivelului de externalizare de fosfatidilserină, adaugând testul cu DIOC6 datorită prezenței mitocondriilor și de determinare a activării caspazei-3 efectoare prin intermediul citocromului c și AIF (apoptosis inducing factor) eliberate de mitocondrii. Experientele s-au efectuat pe 3 donatori, plachetele fiind izolate prin centrifugare (fracția PRP) și incubate la 20°C sub agitare blândă, de o maniera comparativă în plasmă și mediu curent de stocare PAS produs și furnizat de Macopharma.

Figura…. arată că imaginea dată pentru testul “dot-plot” conține 2 zone, respectiv plachete viabile și celule îmbătrânite ai căror parametri morfologici sunt schimbați, având o diminuare a taliei și a densității, conform cu celulele în apoptoză. Această imagine evoluează în timpul conservării, de la 1 până la a 7-a zi, zona plachetelor viabile retrăgându-se rapid la plachetele conservate în plasmă, în timp ce această zonă se menține intactă cel puțin pentru 3 zile în mediu MacoPharma comerciat pentru centrele de transfuzii.

Corelând rezultatele obținute prin analiza dot-plot cu rezultatele furnizate de testul cu Anexina-V-FITC ( Figura …..) se observă un procent mai mare de 31% și 44% pentru ziua 2 și ziua 3 la plachetele conservate în plasmă și doar de 10% și 17% pentru plachetele conservate în mediu MacoPharma.

Testul DIOC6 este și mai favorabil pentru plachetele conservate în mediu MacoPharma, el păstrând de o manieră surprinzatoare mitocondriile încă intacte pentru ziua 7 în timp ce ele sunt puternic permeabilizate pentru plachetele conservate în plasmă.

Figura …… Dot-plot mono și tridimensional pentru plachetele sanguine conservate pentru 1-7 zile în plasma sanguină (stânga) și mediu de conservare SSP+ Macopharma (dreapta).

Figura….. Analiza comparativă a histogramelor bidimensionale obținute pentru externalizarea de fosfatidilserină (PS) cu Annexina-V-FITC aplicate plachetelor sanguine conservate pentru 1-7 zile în plasma sanguină și mediu de conservare Macopharma SSP+. Numerele reprezintă % de celule Annexina-pozitive (în apoptoză).

Figura….. Analiza comparativă a histogramelor bidimensionale obținute pentru determinarea gradului de permeabilizare a membranei mitocondriale aplicate plachetelor sanguine conservate pentru 1-7 zile în plasma sanguină și mediu de conservare Macopharma SSP+. Numerele reprezintă % de celule DIOC6- pozitive, și în consecință, viabile.

Figura….. Analiza comparativă a histogramelor bidimensionale obținute pentru determinarea gradului de permeabilizare a membranei mitocondriale aplicate plachetelor sanguine conservate pentru 1-7 zile în plasma sanguină și mediu de conservare Macopharma SSP+. Numerele reprezintă % de celule DIOC6- pozitive, și în consecință, viabile.

7.3. Discuții

În anul 2000, Beutler, în revista Transfusion, menționa: «Prelungirea duratei de timp în care eritrocitele pot fi stocate în faza lichidă a devenit un scop încă de la cel de-al doilea razboi mondial. Preogresul a fost încet, pentru mai multe motive. Mai întâi de toate, caracterul fundamental al leziunilor de stocare rămâne necunoscut. În al doilea rând, nu a fost găsit niciun test bun pentru efectuarea de studii de viabilitate pe voluntari umani».   Aceste aprecieri perfect relevante ale lui Beutler au justificat interesul reînnoit pentru înțelegerea mai bine a leziunilor de stocare pentru RBCs și pentru găsirea unor modalități de ameliorare a efectelor nocive ale stocării, îmbunătățind astfel calitatea, eficacitatea și siguranța componentelor RBCs pentru toți beneficiarii transfuziei (Beutler , Glynn et al., 2010).

În timp eforturile de cercetare sunt direcționate pentru a înțelege mai bine efectele asupra stocării RBCs și impactul potențial asupra rezultatelor transfuziei un progres mai lent, se face în găsirea unor modalități de a descuraja efectele negative ale leziunii de stocare RBCs.

Deosebit de important este efectul pH-ului extern al soluțiilor aditive asupra hematiilor.

Conservanții standard, soluțiile ACD (citrat-dextroxa) și CPD (citrat-fosfat dextroxă), au un pH acid de 5,0 respectiv 5,6. Când eritrocitele stocate în mediu ACD au fost examinate prin studii de viabilitate in vivo, investigatorii au găsit că a fost superioară conservantului glucoză-citrat de sodium, care fusese folosit anterior. O neînțelegere comună este aceea că acești conservanți acidifiază sângele. Aceste convingeri se bazează pe măsurarea pH-ului sângelui stocat la 37C, deși temperatura de stocare este de 4C. Temperatura are un efect profund asupra pH-ului sângelui. Răcirea sângelui de la 37C la 4C determină creșterea pH-ului extern între 0,4 și 0,5 unități de pH și o schimbare și mai mare a pH-ului intern. Acestea, împreună cu scăderea concentrației ionilor de hidrogen, au fost întâlnite în cazul utilizării soluțiilor ACD și CPD, astfel că pH-ul extracelular al sângelui colectat anaerob la 4C este de aproximativ 7,5 și 7,7, iar pH-ul intracelular este de 7,6 și 7,8. Inversarea gradientului pH-ului uzual între interiorul și exteriorul celulei este probabil cauzat de efectul Donnan exercitat de ionul citrat în mediu. Acestea au fost obervate în sângele stocat cu ACD și CPD la 37C și la 4C.

Concentrația ionului de hidrogen nu rămâne fixă în timpul stocării sângelui. În timp ce eritrocitele metabolizează glucoza, sunt produse cantități uriașe de acid lactic. De exemplu, după 21 de zile de stocare în soluție CPD, concentrația de lactat a sângelui stocat crește cu aproximativ 15 mM, concentrația ionului de hidrogen fiind unul din factorii care influențează profund metabolismul eritrocitelor.

Efectele pH-ului asupra metabolismului eritrocitelor este foarte complex. Creșterea pH-ului de la nivelul fiziologic de 7,2, prezent în interiorul eritrocitelor circulante, stimulează activitatea enzimelor reglatoare cheie, hexokinaza (HK) și fosfofructokinaza (PFK). Creșterea pH-ului crește și activitatea DPG-mutazei care formează 2,3-DPG și 1,3-DPG și inhibă 2,3-DPG fosfataza care descompune 2,3-DPG în 3-PGA. Ionii de hidrogen deplasează echilibrul reacțiilor în care nucleotidele piridinice sunt reduse de-a lungul oxidării nucleotidelor. Astfel, echilibrul lactat/piruvat este dependent de concentrația ionilor de hidrogen: când crește pH-ul, lactatul reduce NAD (nicotinamida adenin dinucleotide) la NADH. Cantitatea scăzută de NAD disponibil încetinește reacția gliceraldehid fosfatază dehidrogenază (GAPD), care necesită NAD.

pH-ul are de asemeni influență asupra nivelului ATP-ului eritrocitelor. pH-ul ACD (pH=5) se pare a fi optim pentru păstrarea pe termen lung a ATP-ului eritrocitelor (Beutler et al., 1965). Dacă a fost adăugată adenina la ACD, pH-ul a devenit 5,5 (Beutler et al., 1965). Când sângele este colectat într-un conservant cu un astfel de nivel al pH-ului, apropiat pH-ului extern fiziologic, este atinsă o valoare ușor mai mare a pH-ului fiziologic intern. Când pH-ul inițial al conservantului este mai mic de 5, conservarea ATP-ului în RBCs este satisfacătoare timp de 1-2 săptămâni. În timp ce acidul lactic se acumulează, pH-ul sufocă glicoliza prin inhibarea HK și PFK și privează RBCs de sursa lor de energie. În consecință, nivelul ATP scade rapid. Dacă nivelul pH-ului mediului este prea ridicat, atunci evenimentele sunt altele. Scăderea nivelului ATP al RBCs este acută și se observă încă din primele ore. În 24 de ore, nivelul ATP poate scădea la 50% sau mai mult față de concentrația inițială. Motivul acestei pierderi remarcabile de ATP al RBCs este mult mai subtil decât pierderea observată în cazul nivelurilor scăzute de pH. Epuizarea rapidă a ATP în cazul conservanților cu niveluri crescute de pH a necesitat prezența glucozei (Beutler et al., 1965). Stocarea sângelui în citrat dextroză cu pH=7 duce la scăderea rapidă a nivelurilor de ATP în absența piruvatului, însă adăugarea de piruvat, care reoxidează NADH la NAD, previne această pierdere.

Efectul pH-ului asupra 2,3-DPG al eritrocitelor este cunoscut de foarte mult timp, când Guest și Rapoport (Guest et al., 1939) au demonstrat scăderea nivelurilor de 2,3-DPG care apar în timpul acidozelor. Mulți ani mai târziu, cercetătorii au demonstrat că același efect al pH-ului poate fi observat în timpul stocării in vitro (Chanutin, 1967, de Verdier et al., 1964 ). La niveluri mari ale pH-ului, conservarea 2,3-DPG a fost îmbunătățită. Când s-a studiat efectul pH-ului în mediul citrat-dextroza cu și fără adăugare de fosfat sau adenină, s-a observat că la niveluri mari de pH-ului mediului, 2,3-DPG s-a păstrat mai bine (Beutler et al., 1969). Păstrarea superioară a 2,3-DPG a fost observată în soluția CPD, care are un pH de 5,6 comparativ cu soluția ACD.

Adaugarea ionilor fosfat a exercitat cel mai mare efect de tampon asupra nivelului de pH. Mai mult, când adenina este prezentă în conservant, fosfatul stimulează puternic formarea de ATP. Cantitatea de fosfat prezentă în soluția CPD este prea mică pentru a afecta apreciabil pH-ul din mixul de sânge și conservant. Când sunt folosite cantități mai mari, efectul fosfatului încetinește scăderea pH-ului. Fosfatul stimulează puternic glicoliza. Astfel, în timp ce acționează ca un tampon eficient pentru acidul lactic produs în timpul glicolizei, în același timp crește producerea sa. Acesta este probabil motivul pentru care utilizarea nivelurilor mari de fosfat în conservanți are o valoare practică scăzută. Valorile mari de ATP care rezultă nu sunt asociate cu o viabilitate îmbunătățită, și creșterea producerii de lactat compensează creșterea capacității de tampon, iar păstrarea 2,3-DPG nu este pe deplin realizată (Beutler et al., 1969).

Deoarece eritrocitele sunt lipsite de compuși organici fosfat, iar aceștia, în special ATP sunt cumva asociați cu viabilitatea, s-au făcut eforturi pentru a găsi substanțele cu niveluri crescute de ATP în timpul stocării.

Când a fost folosită prima dată adenozina în conservarea sângelui, se credea că aceasta poate fi folosită ca un stâlp de consolidare pentru ATP.

Eficacitatea adeninei în menținerea ATP în viabilitatea sângelui stocat a fost inițial demonstrată de Nakao et al. (Nakao et al., 1962; Wada et al., 1960) și a fost apoi confirmată de alți cercetători. Aceste studii indică faptul că adiția de adenină este suficientă pentru a extinde perioada de timp în care eritrocitele rămân viabile în sângele stocat de la 21 la 35 de zile. Adăugarea de adenină grabește ușor rata la care 2,3-DPG este epuizat din RBCs

Într-adevar, efectul adeninei este suficient de bun ca probele de sânge să fie stocate într-un conservant cu citrat-dextroză în care pH-ul a fost ajustat de la nivelul obișnuit de 5,6 la nivelul de 7,5. În absența adeninei această soluție este letală eritrocitelor dadorită epuizării rapide a ATP-ului. În prezenta adeninei, viabilitatea este de 80% la 3 săptămâni de la stocare.

În concluzie, RBCs au o capacitate de tamponare suficientă pentru a ajusta pH-ul aproape de nivelurile fiziologice în timpul primelor câteva zile de depozitare într-un mediu acid. Cu toate acestea, capacitatea de tamponare a eritrocitelor este repede epuizată datorită generării de acid lactic de către hematii prin intermediul căii glicolitice anaerobe. În consecință, pH-ul extracelular și intracelular al RBCs devine progresiv mai acid în timpul depozitării, ajungând la un pH de 6,5 după 6 săptămâni de depozitare în soluții aditive acide (van der Meer et al., 2011).

Un mediu intracelular acid alterează activitatea anumitor enzime și căi biochimice. Pentru RBCs, creșterea acidității intracelulare interfera cu producerea de adenozin 5'-trifosfat (ATP) și 2,3-difosfoglicerat (2,3-DPG), care sunt esențiale pentru supraviețuirea și funcția RBCs în furnizarea de oxigen. În timpul depozitării RBCs în soluții aditive acide, concentrația intracelulară de ATP și 2,3-DPG intră în declin (van der Meer et al., 2011).

În ultimii 15-20 de ani, cercetarea în dezvoltarea de noi soluții de aditivi s-a concentrat pe menținerea unui nivel intracelular mai ridicat de ATP și 2,3-DPG în timpul depozitării componentelor RBCs. Deși persistă concepția greșită că nivelul de ATP din celulele determină celulele dacă supraviețuiesc sau nu, aceasta este departe de a fi un indicator fiabil de viabilitate. Este adevărat că hematiile cu niveluri de ATP scăzute nu pot fosforila glucoza și, prin urmare, sunt sortite să moară, dar niveluri ridicate de ATP nu asigură supraviețuirea eritrocitelor stocate".

Prima soluție aditivă pentru RBCs, adenina-glucoza-salină (SAG) a fost dezvoltată de cercetătorii europeni în anii 1970 (Hogman et al., 1978). În 1981 aceeași cercetători au adăugat manitol pentru a ajuta la protejarea membranei RBCs și pentru a reduce hemoliza, ceea ce a permis refrigerarea RBCs stocate până la 6 săptămâni, cu un hematocrit de aproximativ 55-60% (Hogman et al., 1981). Această formulare a SAG modificată a fost numită SAGM și în zilele noastre SAGM este cea mai utilizată soluție aditivă pentru RBCs. SAGM nu a fost licențiată de către Food and Drug Administration (FDA), și, prin urmare, nu este utilizată în SUA.

Alte soluții de aditive, care sunt toate în mod esențial variații ale SAG/SAGM, au fost elaborate și comercializate, inclusiv AS-1, AS-3, AS-5, MAP și PAGGSM (Heaton et al., 1984; Simion et al., 1987; Cicha et al., 2000; Walker et al., 1990). Aceste soluții tind să asigure conservarea îmbunătățită a RBCs comparativ cu RBCs stocate în SAGM, cum ar fi scăderea hemolizei și reducerea eliminării microparticulelor (veziculelor) din eritrocite (Hess et al., 2009; Veale et al., 2011; Serrano et al., 2011).

Cu toate acestea, mecanismele biologice specifice modulate în hematiile stocate în soluțiile SAG/SAGM nu au fost identificate cu precizie.

De menționat că în ultimii 20 de ani nu a fost autorizată nicio soluție aditivă nouă pentru stocarea RBCs.

7.4. Concluzii

Rezultatele obținute din cercetarea noastră au permis:

1. Demonstrarea implicării unui fenomen de apoptoză la îmbătrânirea accelerată a hematiilor și trombocitelor în pungile de conservare ca fenomen de bază al leziunilor de stocare;

2. Evidențierea influenței negative a pH-ului extracelular acid asupra apariției mult mai timpurie și accelerată a leziunilor de stocare atât la hematii cât și la trombocite, prin aplicarea metodelor de determinare a viabilității și evidențiere a apoptozei eritrocitelor și trombocitelor din pungile de conservare, de o manieră comparativă pe sânge prelevat în condițiile practicate în centrele de transfuzii, respectiv pe CPD de pH-5,6 și pe heparină.

3. Demonstrarea eficienței și sensibilității metodelor de citometrie utilizate de noi în aprecierea calității componentelor stocate și directa corelare cu testele clasice utilizate până în prezent (% de hemoliza, cantitatea de ATP).

4.Evidențierea unei conservări mult mai bune a trombocitelor în cazul utilizării mediului curent de stocare PAS produs și furnizat de Macopharma comparativ cu plasma.

5. Validarea noilor teste de viabilitate celulară și detecție a apoptozei prin citometrie în flux în explorarea calității componentelor sanguine stocate în centrele de transfuzii.

Rezultatele obținute, permit continuarea cercetărilor și abordarea în consecință, cu reale șanse de reușită, de elaborare a unor noi soluții științifice pentru ameliorarea mediilor actuale de prelevare și conservare a hematiilor și plachetelor conservate în centrele de transfuzii.

În principiu, cercetările se vor concentra pe inhibarea apariției de ROS, cu extracte antioxidante din plante și de asemeni prin modificarea pH-ului extracelular de prelevare și conservare a componentelor.

CAPITOLUL 8. CERCETĂRI PENTRU AMELIORAREA CALITĂȚII PRODUSELOR DESTINATE TRANSFUZIEI (CONCENTRAT GLOBULAR DE HEMATII ȘI CONCENTRAT PLACHETAR)

Prelungirea duratei de pastrare a celor doua componente in Centrele de transfuzii s-a constituit intr-o preocupare majora a cercetatorilor inca dupa cel de al 2-lea razboi mondial si, in ciuda unor mici progrese, aceasta problema majora este inca nerezolvata si de mare actualitate.

8.1. Încercări de ameliorare a stocării sângelui prin modularea sau blocarea fenomenului de apoptoză

In interiorul unei celule, asa dupa cum se cunoaste in prezent, speciile reactive de oxygen sunt extrem de periculoase, ele atacand proteinele sau lipo- si glicoproteinele producand degradarea acestora. Intr-o mare masura speciile reactive de oxygen (ROS) sunt factori declansatori de apoptoza si de moarte celulara. Speciile de oxigen reactiv care posedă un electron nepereche sunt produse în mod continuu în celulă ca produși secundari ai metabolismului și pot oxida diverse molecule inducand apoptoza celulara si conducând la moarte celulară. și afectare tisulară. Se cunoaste deasemeni că speciile de oxigen reactiv prin afectarea celulara si implicit tisulara pot constitui cauza a numeroase patologii.

Inca din 2002, grupul lui Basu J. demonstreaza experimental ca sub actiunea unui stres oxidativ indus de t-butylhydroperoxid asupra eritrocitelor umane are loc o activare a procaspazei-3 cu externalizare de fosfatidilserina si evident derularea unui fenomen de apoptoza eritrocitara. in apoptoza eritrocitelor (Mandal et al ,2002).

Studiile ulterioare au demonstrat ca statusul oxidativ al eritrocitelor constituie o cauza majora a leziunilor de stocare, impunandu-se un management al stresului oxidativ pentru RBCs conservate, in scopul ameliorarii calitatii acestora in actul transfuzional (Kriebardis  et al., 2007; Antonelou et al., 2010).

In continuarea studiilor intreprinse de Bratosin si colaboratorii sai, cu rezultate brevetate inca din 1998, respectiv utilizarea unor compozitii pe baza de inhibitori de cistein-proteaze pot intarzia senescenta, autodestructia si hemoliza eritrocitelor (Bratosin et al, French Patent No. 9806288 din 19/05/1998), ne-am propus obtinerea in laborator a unor extracte din plante cu proprietati antioxidante ce vor putea constitui suplimente pentru mediile de conservare utilizate in prezent in centrele de transfuzii pentru conservarea componentelor sanguine, in special a hematiilor din CGR.

8.1.1. Ameliorarea mediilor actuale de prelevare și conservare a hematiilor prin modularea stresului oxidativ cu extracte de Crataegus pentagyna.

Asa dupa cum am mentionat, data fiind demonstrarea implicarii stresului oxidativ in derularea unui fenomen de apoptoza eritrocitara si cu atat mai mult in aparitia leziunilor de stocare, ne-am propus testarea in laborator a extractelor de Crataegus pentagyna cu proprietati antioxidante ca suplimente in mediile de conservare utilizate in prezent in centrele de transfuzii pentru conservarea componentelor sanguine, respectiv a hematiilor conservate in SAGM., conform protocolului descris in Capitolul 7 Material si metode.

8.1.1.1. Obtinerea si testarea proprietatilor antioxidante ale unor extracte vegetale de Crataegus pentagyna pe eritrocite supuse unui stres oxidativ cu H2O2

Alegerea extractelor din Crataegus pentagyna (paducel) din fructe si ramuri a plecat de la traditia utilizarii acestora sub forma de ceai la noi in tara, de la larga sa raspandire in estul si sudul Romaniei (Sarbu et al.2013) si de la cateva studii care au evidentiat continutul mare in flavonoide si polifenoli cu proprietati antioxidante (Rabiei et al., 2012; Salmanian et al., 2014), intervenind in apoptoza celulara, ceea ce le recomanda ca o sursă promitătoare de antioxidanti naturali utilizabili ca ingrediente în suplimentele dietetice pentru bolile cardiovasculare si alte stări patologice associate stresului oxidativ (Giurescu Bedreag et al., 2014).

In plus, extractele de Crataegus pentagyna au dovedit, conform cu datele din Tabelul…. si Figura….. un continut foarte mare in flavonoide si acizi polifenolcarboxilici.

Tabelul …..

Figura….. Continutul in flavone si acizi polifenolcarboxilici pentru probele din fructe si ramurele obtinute din Crataegus pentagyna (P1-P6)

Activitatea antioxidanta puternica a flavonoidelor consta in neutralizarea radicalilor hidroxil, anioni superoxid si lipid peroxid-radicali, constituind cea mai importanta functie a acestora. Un număr mare de medicamente din plante contin flavonoide, care au fost raportate de mulți autori ca având proprietati antibacteriene, anti-inflamatoare, antialergice, antimutagenice, antivirale, antineoplazice, anti-trombotice și acțiuni vasodilatatoare. (Alan & Miller, 1996).

Testarea activitatii antioxidante pentru cele 6 probe de Crataegus pentagyna obtinute de noi (P1-P6) s-a efectuat prin citometrie in flux, pe eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2, fiind testate cinci dilutii seriale pentru fiecare proba, respectiv:

dilutia 1: 25mg/ml, dilutia 2:2,5mg/ml, dilutia 3:0,25 mg/ml, dilutia 4:0,025 mg/ml, dilutia 5:0,0025 mg/ml.

Figura…… Determinarea activitatii antioxidante pentru probele de Crataegus pentagyna (P1-P6) prin citometrie in flux pe eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2 pentru 5 dilutii seriale ale fiecarei probe. MFI: media intensitatii de fluorescenta in FL1 a produsului fluorescent DCF rezultat din clivarea substratului non fluorescent DCFH-DA de catre esterazele celulare si oxidat de speciile reactive de oxigen (ROS) si masurat prin citometrie în flux.

In Figura…..sunt prezentate sintetic % de inhibitie a celor 6 probe de Crataegus pentagyna (P1-P6), raportate la proba de RBCs care nu a fost supusa stresului oxidativ indus cu H2O2. si in care s-a dozat nivelul natural de ROS.

% de inhibitie variaza intre 98% pentru P6 si 93% pt P5 la prima dilutie (…..), ajungand la 66% pt P5 si doar 24% pentru P1, procente foarte mari de inhibitie a stresului oxidativ. Se mai observa ca proba P5 isi mentine cel mai mult capacitatea inhibanta intre dilutia 1 si dilutia 5 , respectiv,intre 93 % si 66 %.

Figura…… Capacitatea de inhibare a stresului oxidativ pentru cele 6 probe de Crataegus pentagyna (P1-P6), raportate la proba de RBCs cu nivel natural de ROS, exprimata prin % de inhititie

8.1.1.2. Evaluarea prin citometrie in flux a influenței extractelor de Crataegus pentagyna asupra producerii de ROS

In Figura….. sunt prezentate de o maniera sintetica rezultatele obtinute dupa dozarea productiei de ROS prin citometrie in flux, fiind reprezentate comparativ MFI-urile de fluorescenta, pentru cele doua variante de concentratie la suplimentarea cu extracte de Crataegus pentagyna a mediului de conservare SAGM in cele 3 saptamani de conservare a RBCs la 4° C. Varianta A, conform capitolului Material si metode, a constat in adaugarea a 25% extract din fiecare proba P1-P6, din volumul total al probelor conservate. Pentru varianta B, extractele au fost adaugate intr-o concentratie mai mare, de 37,5% pentru fiecare proba P1-P6, din volumul total al probelor de sange supuse conservarii in timp.

Figura…….Analiza prin citometrie in flux a productiei de ROS generate in RBCs in cele 3 saptamani de conservare la 4° C in mediu SAGM suplimentat cu cele doua variante de concentratie la suplimentarea cu extracte de Crataegus pentagyna A (25%) si B (37,5%).

Se observa cu usurita ca in timpul conservarii RBCs cantitatea de ROS creste, o crestere spectaculoasa observandu-se intre saptamana 2 si 3, respectiv intre 14 zile si 21 zile. Se observa deasemeni ca aceasta producere de ROS este blocata atat in varianta A cat si in varianta B, in functie de concentratie si de proba (P1-P6) adaugata la mediul de conservare. Aceasta capacitate de blocare a producerii de ROS rezulta si din Figura…., unde rezultatele sunt prezentate pe saptamani de conservare.

Figura…Analiza prin citometrie in flux a productiei de ROS generate in RBCs in cele 3 saptamani de conservare la 4° C in mediu SAGM suplimentat cu cele doua variante de concentratie la suplimentarea cu extracte de Crataegus pentagyna. A: dupa o saptamana; B: dupa 2 saptamani; C: dupa 3 saptamani.

8.1.1.3. Evaluarea prin citometrie in flux a influenței extractelor de Crataegus pentagyna asupra producerii fenomenului de apoptoza in timpul conservarii RBCs.

Dupa cum am mentionat, data fiind demonstrarea implicarii stresului oxidativ in derularea unui fenomen de apoptoza eritrocitara si cu atat mai mult in aparitia leziunilor de stocare (Kriebardis  et al., 2007; Antonelou et al., 2010) sugerandu-se necesitatea unui management al stresului oxidativ pentru RBCs conservate, ne-am propus testarea in laborator a extractelor de Crataegus pentagyna cu proprietati antioxidante ca suplimente la mediile de conservare utilizate in prezent in centrele de transfuzii pentru conservarea componentelor sanguine, respectiv a hematiilor conservate in SAGM, conform protocolului descris in Capitolul 6 Material si metode, in varianta A si B de concentratie.

Din analiza rezultatelor obtinute, asa cum sunt ele prezentate in Figura …… , prin citometrie in flux cu Annexina-V-FITC si tehnica cadranelor, si sub forma comparativa de grafice, se observa cu surprindere ca % cel mai mare de RBCs viabile il contine proba martor, respectiv RBCs conservate in mediul SAGM nesuplimentat cu extract antioxidant.

La sfarsitul celor 3 saptamani de conservare, daca media de RBCs ramase viabile este de aproximativ 71%, pentru probele unde a fost adaugat extract antioxidant, procentul de RBCs viabile este mult mai mic, ajungand chiar la 46% pentru P4, ceea ce inseamna o diminuare cu 30% a celulelor viabile fata de cele martor.

La o analiza atenta, coreland nivelul de ROS prezentat in Figura… si Figura….cu gradul de apoptoza (RBCs viabile ramase in pungile de conservare), constatam ca dupa 3 saptamani, nivelul de ROS este foarte mare in cazul tuturor probelor, ceea ce semnifica o pierdere a capacitatilor antioxidante in timp. Ca exemplu, pentru proba P4, unde cantitatea de ROS a fost cea mai mare (MFI-640), % de RBCs viabile este cel mai mic, respectiv de 46%. Greu de explicat ramane cazul probei martor, unde , desi productia de ROS este foarte mare( MFI-660), % de RBCs viabile ramane totusi mult superior , de aprox. 70%.

Figura … Analiza gradului de apoptoza eritrocitare prin citometrie in flux , tehnica cadranelor. % se refera la RBCs viabile (Annexina-V-FITC negative), dupa 1 saptamana si 3 saptamani de conservare in mediu SAGM suplimentat cu extracte de Crataegus pentagyna ( P1-P6).

Figura … Analiza comparativa a gradului de RBCs viabile ( Annexina-V-FITC negative), dupa 1 saptamana si respectiv 3 saptamani de conservare in mediu SAGM suplimentat cu extracte de Crataegus pentagyna ( P1-P6) in varianta A (25% extract) si B (37,5%extract).

8.1.1.4 Concluzii

1. Rezultatele obtinute, par a sugera ca suplimentarea mediilor de conservare utilizate in prezent in centrele de transfuzii pentru conservarea componentelor sanguine, respectiv a hematiilor conservate in SAGM cu extracte antioxidante, nu poate impiedica aparitia leziunilor de stocare, asa cum a fost emisa ipoteza in literatura internationala si in ipoteza noastra de lucru.

2. Managementul stresului oxidativ, dupa primele noastre rezultate , pare a fi un proces mult mai complex care implica pe de o parte studii de stabilitate a extractelor antioxidante in timp si corelarea cu o eventuala toxicitate a cestora, care poate genera in paralel amplificarea enomenului de apoptoza in timpul conservarii.

3. In acelasi scop, se impune compararea unor extracte din mai multe plante si efectuarea in paralel cu analiza prin citometrie in flux de teste biochimice, cum ar fi % de hemoliza, dozarea ATP-ului, etc.

8.2. Încercări de ameliorare a conservarii sângelui prin iradierea RBCs cu laser in timpul conservarii acestora in mediul SAGM

Pentru ameliorarea calitatii eritrocitelor destinate transfuziei ne-am propus continuarea unor cercetari desfasurate în colaborare cu dr. Dan Siposan de la Academia Tehnică Militară și cu Centrul de Transfuzii al Armatei din Bucuresti prin aplicarea unor tehnici de iradiere cu laser de joasă frecvență, respectiv λ= 465 nm si λ= 660 nm.

Iradierea laser de mică intensitate a fost utilizata pentru a trata diverse procese patologice, cum ar fi repararea tisulara (Lundeberg et.al., 1991), vindecarea rănilor (Lagan et. al., 2001) sau restenoza vasculara (Kipshidze et. al.,1994).

Iradierea sângelui cu laser de mică intensitate a dovedit ca acesta poate modula reologia sângelui, poate duce la îmbunătățirea microcirculației (Siposan & Lukacs, 2000), creșterea activitatii pentru unele enzime (Kujawa et. al., 2004; Piasecka et al.,2000) și chiar la îmbunătățirea deformabilitatii eritrocitelor (Xian-Qiang et al., 2004).

Anumite rezultate obtinute pana in prezent au evidentiat capacitatea reparatorie a laserului de joasa intensitate asupra alterarilor produse membranei de catre radicalii liberi, in special prin iradierea cu laser de 18 nw asupra eritrocitelor alterate fata de 9 nw.

Alte studii au evidentiat faptul ca iradierea cauzeaza hemoliza imediată a eritrocitelor, dar numai la doze mult mai mari decât cele utilizate în prezent (Jacobs, 1998), cu alterarea membranei si difuzia în mod liber a ionii (liză osmotică). În timpul conservarii post-iradiere, hemoliza crește semnificativ la eritrocitele iradiate fata de lotul martor, dar diferența este semnificativă numai după 4 saptamani (Moroff et al., 1999; Moore & Ledford, 1985; Leitner et al., 2001; Davey et al.,1992; Hillyer et al., 1991).

Datorita rezultatelor controversate (Antosik et al., 2015), ne-am propus si noi, sa verificam efectele iradierii cu laser de joasa frecventa. Experimentele s-au desfășurat conform conditiilor si schemei de prelevare, conservare si iradiere prezentata la capitolul Material si Metode.

Calitatea hematiilor s-a apreciat la un interval de 12 ore de la iradierea eritrocitelor prin aceleasi teste de citometrie in flux si microscopie de scanare, derulate pe o perioada de timp de pana la 4 saptamani, evaluand viabilitatea celulara prin dozarea activitatii esterazelor intracelulare cu Calceina-AM, si coreland viabilitatea cu fenomenul de apoptoza prin determinarea gradului de externalizare a fosfatidilserinei si cu determinarea schimbarilor de morfologie celulara.

8.2.1. Evidențierea modificărilor morfologice prin microscopie electronică de scanare si citometrie în flux

Pe durata intregului experiment, la fiecare prelevare efectuata conform protocolului descris, la 12 ore dupa aplicarea dozei de iradiere laser, s-a analizat prin citometrie in flux directa dispunerea hematiilor in sistem FSC/SSC ( talie/densitate), dispunere cuantificata prin valorile XGeoMean si respectiv YGeoMean care exprima modificarile morfologice ale celulelor. .

Asa cum rezulta din Figura……care contine o analiză comparativă prin citometrie în flux a histogramelor de morfologie reprezentate prin XGeoMean (dimensiunea celulei) si Y GeoMean (continutul celular) pentru RBCs conservate în mediu SAGM timp de 3 săptămâni si iradiate cu laser de nivel scăzut (C și D), pentru ambii donatori nu a arătat variații în valorile X GeoMean sau un hemoliza importantă, care este de obicei exprimata în valori mai scăzute pentru YGeo Media (conținut celular), cu excepția probe B14, B15 și B16 , unde se remarca o foarte lejera hemoliza. Aceasta mica hemoliza se poate datora unei iradieri neuniforme ca urmare a tehnicii manuale folosite la iradiere sau la dimensiunea mica a mini- pungilor utilizate pentru conservarea sângelui. De asemenea, ea se poate datora unei particularitati a Donatorului B care poate avea RBCs mai sensibile. .

Rezultatele obtinute prin citometrie au fost intotdeauna confirmate de microscopia ESEM, care a demonstrat, asa cum se observa si in Figura……o mai buna conservare a formei discoidale la RBCs iradiate comparativ cu RBCs care nu au fost supuse tratamentului cu laser de joasa frecventa.

Figura…… Analiza comparativă prin citometrie în flux a valorilor X-și Y GeoMean pentru RBCs conservate în mediu SAGM timp de 3 săptămâni si iradiate cu laser de nivel scăzut.

A si B reprezintă analiza dot-plot FSC/ SSC a RBCs, înainte de iradiere (la momentul T0, al prelevarii sângelui). C și D, histogramele comparative ale XGeoMean și YGeoMean pentru probele iradiate. A1 și B1: RBCs control conbservate 3 saptamani fara iradiere. Datele sunt reprezentative pentru trei analize cu rezultate similare. Numărul de celule analizate:10000. Rezultatele prezentate sunt dintr-un experiment reprezentativ din trei efectuate.

Figura…….. Evidentierea prin microscopie de scanare ESEM a aspectului morfologic pentru RBCs conservate in mediu SAGM (M) comparativ cu proba A9 iradiata cu λ= 465 nm (A) si B19 iradiata cu λ= 660 nm (B), la 4 saptamani de conservare. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru experimentele realizate.

9.2.2. Analiza gradului de externalizare a fosfatidilserinei ca marker de apoptoza determinat cu Anexina-V-FITC

Din analiza gradului de externalizare a fosfatidilserinei cu anexina V-FITC ca marker de apoptoza prezentata sintetic in Figura….. se observa atat pentru donorul 1 cat si 2, o externalizare de aproximativ 35 % (35.7 % pentru esantionul martor D1 si de 34.36% pentru esantionul martor D2). In cazul iradierii cu laser albastru se observa ca efect, o fixare mai slaba a Annexinei V-FITC cu procentaje care coboara pana la aproximativ 10 % , iar in cazul iradierii cu laser rosu procentul diminueaza chiar pana la aproximativ 8-9 %, in cazul donatorului D1. Pentru donatorul D2, desi se pleaca de la acelasi grad de externalizare in cazul martorului, diminuarea procentului de celule care externalizeaza fosfatidilserina in urma iradierii cu laser bleu sau rosu este mult mai mica, ajungand la procente de aproximativ 18 % si respectiv, aproximativ 15 % .

Figura ….. Analiza comparativă a procentului de eritrocite apoptotice determinat cu annexin-V-FITC pentru RBCs conservate în mediul SAGM timp de 3 săptămâni si iradiate cu laser de nivel scăzut. Abscisa: doza de iradiere (J/cm3); Ordonata: procentul de celule Annexin-V-FITC pozitive. Datele sunt reprezentative pentru trei analize cu rezultate similare. Numărul de celule numărate: 10000. Rezultatele prezentate provin de la unul din cele trei experimente reprezentative efectuate.

9.2.3. Aprecierea viabilitatii celulare prin citometrie de flux cu Calcein-AM

Determinarea viabilitatii celulare pe baza testului original cu Calcein-AM este prezentata de o maniera sintetica si comparativa sub forma de MFI in Figura ….pentru fiecare esantion supus iradierii laser comparativ cu martorul initial si cel neiradiat. Efectul benefic, de reintinerire, al iradierii laser se poate observa cu usurinta, in special la iradierea cu λ=600 nm , indicand o îmbunătățire substantiala a viabilitatii pentru celulele supuse iradierii laser.

Figura….. Determinarea viabilității cu calcein-AM a hematiilor donatorului 2 la 3 saptamani de conservare in mediul SAGM (cf. Tabel ….), neiradiate (2) si iradiate (3-12) cu cele doua lungimi de undă, respectiv: λ=465 nm (rosu) si λ=600 nm (albastru). 1:viabilitatea initiala a RBCs. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru trei experimente realizate.

Concluzii:

In urma iradierii eritrocitelor cu laser de nivel scăzut, λ=465 nm (rosu) si λ=600 nm (albastru) si a aplicării testelor noastre de citometrie în flux pentru aprecierea comparativă a calității sângelui conservat, s-au constatat urmatoarele efecte benefice:

imbunatatire a viabilității estimată cu Calcein-AM;

Reducerea cu aproape 50 % a externalizării de fosfatidilserina evaluata cu annexină-V- FITC;

Analiza morfologiei celulare prin microscopie de scanare SEM a evidențiat o mai bună conservare a formei discocitare în cazul celulelor iradiate față de martor;

Toate aceste efecte benefice au fost proporționale cu doza și timpul de iradiere;

Efectul de "intinerire" pentru RBCs conservate in mediu SAGM este proporțional cu doza și timpul de iradiere;

Iradierea laser de joasa frecventa poate constitui o modalitate de întinerire a sângelui destinat transfuziei, cu evitarea tuturor complicațiilor produse în special la politransfuzați in special a efectului imunosupresor și a complicațiilor de tip infecțios;

Continuarea cercetarilor pe aceasta directie, inclusiv in vivo vor putea conduce la aplicarea ulterioară a acestei tehnici în conservarea sangelui.

Capitolul 9. Cercetări pentru ameliorarea calității produselor destinate transfuziei (concentrat globular de hematii și concentrat plachetar)

Prelungirea duratei de pastrare a celor doua componente in Centrele de transfuzii s-a constituit intr-o preocupare majora a cercetatorilor inca dupa cel de al 2-lea razboi mondial si, in ciuda unor mici progrese, aceasta problema majora este inca nerezolvata si de mare actualitate.

9.1. Încercări de ameliorare a stocării sângelui prin modularea sau blocarea fenomenului de apoptoză

In interiorul unei celule, asa dupa cum se cunoaste in prezent, speciile reactive de oxygen sunt extrem de periculoase, ele atacand proteinele sau lipo- si glicoproteinele producand degradarea acestora. Intr-o mare masura speciile reactive de oxygen (ROS) sunt factori declansatori de apoptoza si de moarte celulara. Speciile de oxigen reactiv care posedă un electron nepereche sunt produse în mod continuu în celulă ca produși secundari ai metabolismului și pot oxida diverse molecule inducand apoptoza celulara si conducând la moarte celulară. și afectare tisulară. Se cunoaste deasemeni că speciile de oxigen reactiv prin afectarea celulara si implicit tisulara pot constitui cauza a numeroase patologii.

Inca din 2002, grupul lui Basu J. demonstreaza experimental ca sub actiunea unui stres oxidativ indus de t-butylhydroperoxid asupra eritrocitelor umane are loc o activare a procaspazei-3 cu externalizare de fosfatidilserina si evident derularea unui fenomen de apoptoza eritrocitara. in apoptoza eritrocitelor (Mandal et al ,2002).

Studiile ulterioare au demonstrat ca statusul oxidativ al eritrocitelor constituie o cauza majora a leziunilor de stocare, impunandu-se un management al stresului oxidativ pentru RBCs conservate, in scopul ameliorarii calitatii acestora in actul transfuzional (Kriebardis  et al., 2007; Antonelou et al., 2010).

In continuarea studiilor intreprinse de Bratosin si colaboratorii sai, cu rezultate brevetate inca din 1998, respectiv utilizarea unor compozitii pe baza de inhibitori de cistein-proteaze pot intarzia senescenta, autodestructia si hemoliza eritrocitelor (Bratosin et al, French Patent No. 9806288 din 19/05/1998), ne-am propus obtinerea in laborator a unor extracte din plante cu proprietati antioxidante ce vor putea constitui suplimente pentru mediile de conservare utilizate in prezent in centrele de transfuzii pentru conservarea componentelor sanguine, in special a hematiilor din CGR.

9.1.1. Ameliorarea mediilor actuale de prelevare și conservare a hematiilor prin modularea stresului oxidativ cu extracte de Crataegus pentagyna.

Asa dupa cum am mentionat, data fiind demonstrarea implicarii stresului oxidativ in derularea unui fenomen de apoptoza eritrocitara si cu atat mai mult in aparitia leziunilor de stocare, ne-am propus testarea in laborator a extractelor de Crataegus pentagyna cu proprietati antioxidante ca suplimente in mediile de conservare utilizate in prezent in centrele de transfuzii pentru conservarea componentelor sanguine, respectiv a hematiilor conservate in SAGM., conform protocolului descris in Capitolul 7 Material si metode.

9.1.1.1. Obtinerea si testarea proprietatilor antioxidante ale unor extracte vegetale de Crataegus pentagyna pe eritrocite supuse unui stres oxidativ cu H2O2

Alegerea extractelor din Crataegus pentagyna (paducel) din fructe si ramuri a plecat de la traditia utilizarii acestora sub forma de ceai la noi in tara, de la larga sa raspandire in estul si sudul Romaniei (Sarbu et al.2013) si de la cateva studii care au evidentiat continutul mare in flavonoide si polifenoli cu proprietati antioxidante (Rabiei et al., 2012; Salmanian et al., 2014), intervenind in apoptoza celulara, ceea ce le recomanda ca o sursă promitătoare de antioxidanti naturali utilizabili ca ingrediente în suplimentele dietetice pentru bolile cardiovasculare si alte stări patologice associate stresului oxidativ (Giurescu Bedreag et al., 2014).

In plus, extractele de Crataegus pentagyna au dovedit, conform cu datele din Tabelul…. si Figura….. un continut foarte mare in flavonoide si acizi polifenolcarboxilici.

Tabelul …..

Figura….. Continutul in flavone si acizi polifenolcarboxilici pentru probele din fructe si ramurele obtinute din Crataegus pentagyna (P1-P6)

Activitatea antioxidanta puternica a flavonoidelor consta in neutralizarea radicalilor hidroxil, anioni superoxid si lipid peroxid-radicali, constituind cea mai importanta functie a acestora. Un număr mare de medicamente din plante contin flavonoide, care au fost raportate de mulți autori ca având proprietati antibacteriene, anti-inflamatoare, antialergice, antimutagenice, antivirale, antineoplazice, anti-trombotice și acțiuni vasodilatatoare. (Alan & Miller, 1996).

Testarea activitatii antioxidante pentru cele 6 probe de Crataegus pentagyna obtinute de noi (P1-P6) s-a efectuat prin citometrie in flux, pe eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2, fiind testate cinci dilutii seriale pentru fiecare proba, respectiv :

dilutia 1: 25mg/ml, dilutia 2:2,5mg/ml, dilutia 3:0,25 mg/ml, dilutia 4:0,025 mg/ml, dilutia 5:0,0025 mg/ml.

Figura…… Determinarea activitatii antioxidante pentru probele de Crataegus pentagyna (P1-P6) prin citometrie in flux pe eritrocite umane supuse unui stres oxidativ indus cu H2O2 pentru 5 dilutii seriale ale fiecarei probe. MFI: media intensitatii de fluorescenta in FL1 a produsului fluorescent DCF rezultat din clivarea substratului non fluorescent DCFH-DA de catre esterazele celulare si oxidat de speciile reactive de oxigen (ROS) si masurat prin citometrie în flux.

In Figura…..sunt prezentate sintetic % de inhibitie a celor 6 probe de Crataegus pentagyna (P1-P6), raportate la proba de RBCs care nu a fost supusa stresului oxidativ indus cu H2O2. si in care s-a dozat nivelul natural de ROS.

% de inhibitie variaza intre 98% pentru P6 si 93% pt P5 la prima dilutie (…..), ajungand la 66% pt P5 si doar 24% pentru P1, procente foarte mari de inhibitie a stresului oxidativ. Se mai observa ca proba P5 isi mentine cel mai mult capacitatea inhibanta intre dilutia 1 si dilutia 5 , respectiv,intre 93 % si 66 %.

Figura…… Capacitatea de inhibare a stresului oxidativ pentru cele 6 probe de Crataegus pentagyna (P1-P6), raportate la proba de RBCs cu nivel natural de ROS, exprimata prin % de inhititie.

9.1.1.2. Evaluarea prin citometrie in flux a influenței extractelor de Crataegus pentagyna asupra producerii de ROS

In Figura….. sunt prezentate de o maniera sintetica rezultatele obtinute dupa dozarea productiei de ROS prin citometrie in flux, fiind reprezentate comparativ MFI-urile de fluorescenta, pentru cele doua variante de concentratie la suplimentarea cu extracte de Crataegus pentagyna a mediului de conservare SAGM in cele 3 saptamani de conservare a RBCs la 4° C. Varianta A, conform capitolului Material si metode, a constat in adaugarea a 25% extract din fiecare proba P1-P6, din volumul total al probelor conservate. Pentru varianta B, extractele au fost adaugate intr-o concentratie mai mare, de 37,5% pentru fiecare proba P1-P6, din volumul total al probelor de sange supuse conservarii in timp.

Figura…….Analiza prin citometrie in flux a productiei de ROS generate in RBCs in cele 3 saptamani de conservare la 4° C in mediu SAGM suplimentat cu cele doua variante de concentratie la suplimentarea cu extracte de Crataegus pentagyna A (25%) si B (37,5%).

Se observa cu usurita ca in timpul conservarii RBCs cantitatea de ROS creste, o crestere spectaculoasa observandu-se intre saptamana 2 si 3, respectiv intre 14 zile si 21 zile. Se observa deasemeni ca aceasta producere de ROS este blocata atat in varianta A cat si in varianta B, in functie de concentratie si de proba (P1-P6) adaugata la mediul de conservare.

Aceasta capacitate de blocare a producerii de ROS rezulta si din Figura…., unde rezultatele sunt prezentate pe saptamani de conservare.

Figura…Analiza prin citometrie in flux a productiei de ROS generate in RBCs in cele 3 saptamani de conservare la 4° C in mediu SAGM suplimentat cu cele doua variante de concentratie la suplimentarea cu extracte de Crataegus pentagyna. A: dupa o saptamana; B: dupa 2 saptamani; C: dupa 3 saptamani.

9.1.1.3. Evaluarea prin citometrie in flux a influenței extractelor de Crataegus pentagyna asupra producerii fenomenului de apoptoza in timpul conservarii RBCs.

Dupa cum am mentionat, data fiind demonstrarea implicarii stresului oxidativ in derularea unui fenomen de apoptoza eritrocitara si cu atat mai mult in aparitia leziunilor de stocare (Kriebardis  et al., 2007; Antonelou et al., 2010) sugerandu-se necesitatea unui management al stresului oxidativ pentru RBCs conservate, ne-am propus testarea in laborator a extractelor de Crataegus pentagyna cu proprietati antioxidante ca suplimente la mediile de conservare utilizate in prezent in centrele de transfuzii pentru conservarea componentelor sanguine, respectiv a hematiilor conservate in SAGM, conform protocolului descris in Capitolul 7 Material si metode, in varianta A si B de concentratie.

Din analiza rezultatelor obtinute, asa cum sunt ele prezentate in Figura …… , prin citometrie in flux cu Annexina-V-FITC si tehnica cadranelor, si sub forma comparativa de grafice, se observa cu surprindere ca % cel mai mare de RBCs viabile il contine proba martor, respectiv RBCs conservate in mediul SAGM nesuplimentat cu extract antioxidant.

La sfarsitul celor 3 saptamani de conservare, daca media de RBCs ramase viabile este de aproximativ 71%, pentru probele unde a fost adaugat extract antioxidant, procentul de RBCs viabile este mult mai mic, ajungand chiar la 46% pentru P4, ceea ce inseamna o diminuare cu 30% a celulelor viabile fata de cele martor.

La o analiza atenta, coreland nivelul de ROS prezentat in Figura… si Figura….cu gradul de apoptoza (RBCs viabile ramase in pungile de conservare), constatam ca dupa 3 saptamani, nivelul de ROS este foarte mare in cazul tuturor probelor, ceea ce semnifica o pierdere a capacitatilor antioxidante in timp. Ca exemplu, pentru proba P4, unde cantitatea de ROS a fost cea mai mare (MFI-640), % de RBCs viabile este cel mai mic, respectiv de 46%. Greu de explicat ramane cazul probei martor, unde , desi productia de ROS este foarte mare( MFI-660), % de RBCs viabile ramane totusi mult superior , de aprox. 70%

Figura … Analiza gradului de apoptoza eritrocitare prin citometrie in flux , tehnica cadranelor. % se refera la RBCs viabile ( Annexina-V-FITC negative), dupa 1 saptamana si 3 saptamani de conservare in mediu SAGM suplimentat cu extracte de Crataegus pentagyna ( P1-P6).

Figura … Analiza comparativa a gradului de RBCs viabile ( Annexina-V-FITC negative), dupa 1 saptamana si respectiv 3 saptamani de conservare in mediu SAGM suplimentat cu extracte de Crataegus pentagyna ( P1-P6) in varianta A (25% extract) si B (37,5%extract).

9.1.1.4. Concluzii

1. Rezultatele obtinute, par a sugera ca suplimentarea mediilor de conservare utilizate in prezent in centrele de transfuzii pentru conservarea componentelor sanguine, respectiv a hematiilor conservate in SAGM cu extracte antioxidante, nu poate impiedica aparitia leziunilor de stocare, asa cum a fost emisa ipoteza in literatura internationala si in ipoteza noastra de lucru.

2. Managementul stresului oxidativ, dupa primele noastre rezultate , pare a fi un proces mult mai complex care implica pe de o parte studii de stabilitate a extractelor antioxidante in timp si corelarea cu o eventuala toxicitate a cestora, care poate genera in paralel amplificarea enomenului de apoptoza in timpul conservarii.

3. In acelasi scop, se impune compararea unor extracte din mai multe plante si efectuarea in paralel cu analiza prin citometrie in flux de teste biochimice, cum ar fi % de hemoliza, dozarea ATP-ului, etc.

9.2. Încercări de ameliorare a conservarii sângelui prin iradierea RBCs cu laser in timpul conservarii acestora in mediul SAGM

Pentru ameliorarea calitatii eritrocitelor destinate transfuziei ne-am propus continuarea unor cercetari desfasurate în colaborare cu dr. Dan Siposan de la Academia Tehnică Militară și cu Centrul de Transfuzii al Armatei din Bucuresti prin aplicarea unor tehnici de iradiere cu laser de joasă frecvență, respectiv λ= 465 nm si λ= 660 nm.

Iradierea laser de mică intensitate a fost utilizata pentru a trata diverse procese patologice, cum ar fi repararea tisulara (Lundeberg et.al., 1991), vindecarea rănilor (Lagan et. al., 2001) sau restenoza vasculara (Kipshidze et. al.,1994).

Iradierea sângelui cu laser de mică intensitate a dovedit ca acesta poate modula reologia sângelui, poate duce la îmbunătățirea microcirculației (Siposan & Lukacs, 2000), creșterea activitatii pentru unele enzime (Kujawa et. al., 2004; Piasecka et al.,2000) și chiar la îmbunătățirea deformabilitatii eritrocitelor (Xian-Qiang et al., 2004).

Anumite rezultate obtinute pana in prezent au evidentiat capacitatea reparatorie a laserului de joasa intensitate asupra alterarilor produse membranei de catre radicalii liberi, in special prin iradierea cu laser de 18 nw asupra eritrocitelor alterate fata de 9 nw.

Alte studii au evidentiat faptul ca iradierea cauzeaza hemoliza imediată a eritrocitelor, dar numai la doze mult mai mari decât cele utilizate în prezent (Jacobs, 1998), cu alterarea membranei si difuzia în mod liber a ionii (liză osmotică). În timpul conservarii post-iradiere, hemoliza crește semnificativ la eritrocitele iradiate fata de lotul martor, dar diferența este semnificativă numai după 4 saptamani (Moroff et al., 1999; Moore & Ledford, 1985; Leitner et al., 2001; Davey et al.,1992; Hillyer et al., 1991).

Datorita rezultatelor controversate (Antosik et al., 2015), ne-am propus si noi, sa verificam efectele iradierii cu laser de joasa frecventa. Experimentele s-au desfășurat conform conditiilor si schemei de prelevare, conservare si iradiere prezentata la capitolul Material si Metode.

Calitatea hematiilor s-a apreciat la un interval de 12 ore de la iradierea eritrocitelor prin aceleasi teste de citometrie in flux si microscopie de scanare, derulate pe o perioada de timp de pana la 4 saptamani, evaluand viabilitatea celulara prin dozarea activitatii esterazelor intracelulare cu Calceina-AM, si coreland viabilitatea cu fenomenul de apoptoza prin determinarea gradului de externalizare a fosfatidilserinei si cu determinarea schimbarilor de morfologie celulara.

9.2.1. Evidențierea modificărilor morfologice prin microscopie electronică de scanare si citometrie în flux

Pe durata intregului experiment , la fiecare prelevare efectuata conform protocolului descris, la 12 ore dupa aplicarea dozei de iradiere laser, s-a analizat prin citometrie in flux directa dispunerea hematiilor in sistem FSC/SSC ( talie/densitate), dispunere cuantificata prin valorile XGeoMean si respectiv YGeoMean care exprima modificarile morfologice ale celulelor. .

Asa cum rezulta din Figura……care contine o analiză comparativă prin citometrie în flux a histogramelor de morfologie reprezentate prin XGeoMean (dimensiunea celulei) si Y GeoMean (continutul celular) pentru RBCs conservate în mediu SAGM timp de 3 săptămâni si iradiate cu laser de nivel scăzut (C și D), pentru ambii donatori nu a arătat variații în valorile X GeoMean sau un hemoliza importantă, care este de obicei exprimata în valori mai scăzute pentru YGeo Media (conținut celular), cu excepția probe B14, B15 și B16 , unde se remarca o foarte lejera hemoliza. Aceasta mica hemoliza se poate datora unei iradieri neuniforme ca urmare a tehnicii manuale folosite la iradiere sau la dimensiunea mica a mini- pungilor utilizate pentru conservarea sângelui. De asemenea, ea se poate datora unei particularitati a Donatorului B care poate avea RBCs mai sensibile. .

Rezultatele obtinute prin citometrie au fost intotdeauna confirmate de microscopia ESEM, care a demonstrat, asa cum se observa si in Figura……o mai buna conservare a formei discoidale la RBCs iradiate comparativ cu RBCs care nu au fost supuse tratamentului cu laser de joasa frecventa.

Figura…… Analiza comparativă prin citometrie în flux a valorilor X-și Y GeoMean pentru RBCs conservate în mediu SAGM timp de 3 săptămâni si iradiate cu laser de nivel scăzut. A si B reprezintă analiza dot-plot FSC/ SSC a RBCs, înainte de iradiere (la momentul T0, al prelevarii sângelui). C și D, histogramele comparative ale XGeoMean și YGeoMean pentru probele iradiate. A1 și B1: RBCs control conbservate 3 saptamani fara iradiere. Datele sunt reprezentative pentru trei analize cu rezultate similare. Numărul de celule analizate:10000. Rezultatele prezentate sunt dintr-un experiment reprezentativ din trei efectuate.

Figura…….. Evidentierea prin microscopie de scanare ESEM a aspectului morfologic pentru RBCs conservate in mediu SAGM (M) comparativ cu proba A9 iradiata cu λ= 465 nm (A) si B19 iradiata cu λ= 660 nm (B), la 4 saptamani de conservare. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru experimentele realizate.

9.2.2. Analiza gradului de externalizare a fosfatidilserinei ca marker de apoptoza determinat cu Anexina-V-FITC

Din analiza gradului de externalizare a fosfatidilserinei cu anexina V-FITC ca marker de apoptoza prezentata sintetic in Figura….. se observa atat pentru donorul 1 cat si 2, o externalizare de aproximativ 35 % (35.7 % pentru esantionul martor D1 si de 34.36% pentru esantionul martor D2). In cazul iradierii cu laser albastru se observa ca efect, o fixare mai slaba a Annexinei V-FITC cu procentaje care coboara pana la aproximativ 10 % , iar in cazul iradierii cu laser rosu procentul diminueaza chiar pana la aproximativ 8-9 %, in cazul donatorului D1. Pentru donatorul D2, desi se pleaca de la acelasi grad de externalizare in cazul martorului, diminuarea procentului de celule care externalizeaza fosfatidilserina in urma iradierii cu laser bleu sau rosu este mult mai mica, ajungand la procente de aproximativ 18 % si respectiv, aproximativ 15 % .

Figura ….. Analiza comparativă a procentului de eritrocite apoptotice determinat cu annexin-V-FITC pentru RBCs conservate în mediul SAGM timp de 3 săptămâni si iradiate cu laser de nivel scăzut. Abscisa: doza de iradiere (J / cm3); Ordonata: procentul de celule Annexin-V-FITC pozitive. Datele sunt reprezentative pentru trei analize cu rezultate similare. Numărul de celule numărate: 10000. Rezultatele prezentate provin de la unul din cele trei experimente reprezentative efectuate.

9.2.3. Aprecierea viabilitatii celulare prin citometrie de flux cu Calcein-AM

Determinarea viabilitatii celulare pe baza testului original cu Calcein-AM este prezentata de o maniera sintetica si comparativa sub forma de MFI in Figura ….pentru fiecare esantion supus iradierii laser comparativ cu martorul initial si cel neiradiat. Efectul benefic, de reintinerire, al iradierii laser se poate observa cu usurinta, in special la iradierea cu λ=600 nm , indicand o îmbunătățire substantiala a viabilitatii pentru celulele supuse iradierii laser.

Figura….. Determinarea viabilității cu calcein-AM a hematiilor donatorului 2 la 3 saptamani de conservare in mediul SAGM (cf. Tabel ….), neiradiate (2) si iradiate (3-12) cu cele doua lungimi de undă, respectiv: λ=465 nm (rosu) si λ=600 nm (albastru). 1:viabilitatea initiala a RBCs. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru trei experimente realizate.

In urma iradierii eritrocitelor cu laser de nivel scăzut, λ=465 nm (rosu) si λ=600 nm (albastru) si a aplicării testelor noastre de citometrie în flux pentru aprecierea comparativă a calității sângelui conservat, s-au constatat urmatoarele efecte benefice:

1. O imbunatatire a viabilității estimată cu Calcein-AM;

2. Reducerea cu aproape 50 % a externalizării de fosfatidilserina evaluata cu

annexină-V- FITC;

3. Analiza morfologiei celulare prin microscopie de scanare SEM a evidențiat o mai

bună conservare a formei discocitare în cazul celulelor iradiate față de martor;

4. Toate aceste efecte benefice au fost proporționale cu doza și timpul de iradiere;

Efectul de "intinerire" pentru RBCs conservate in mediu SAGM este proporțional cu doza și timpul de iradiere;

Iradierea laser de joasa frecventa poate constitui o modalitate de întinerire a sângelui destinat transfuziei, cu evitarea tuturor complicațiilor produse în special la politransfuzați in special a efectului imunosupresor și a complicațiilor de tip infecțios;

Continuarea cercetarilor pe aceasta directie, inclusiv in vivo vor putea conduce la aplicarea ulterioară a acestei tehnici în conservarea sangelui.

Capitolul 10. Cercetări privind influenȚa condiȚiilor ecologice din Antarctica asupra viabilitĂȚii eritrocitelor; Posibile implicaȚii În conservarea sÂngelui

Climatul planetei noastre este rezultatul a trei factori principali: energia solară, efectul de seră și circulația atmosferică și oceanica. În plus, variațiile geografice și sezoniere în energia solară sunt determinate de curbura Pământului, înclinația axei sale și orbita sa in jurul Soarelui. Acești factori produc zone climatice diferite, care, la rândul lor, afectează distribuția plantelor, animalelor și populațiile umane.

Cercetarile au fost efectuate pe un numar de 3 cercetatori participanti la doua expeditii la Polul Sud, la Statia Antarctică King Sejong a Institutului Coreean pentru Cercetări Polare.

Stația Antarctică King Sejong este localizată în Insulele King George, Peninsula Antarctică Barton din vestul Antarcticii. Localizarea stației constituie un avantaj strategic pentru cercetarea în în toate domeniile majore: științele vieții, științele geonomice și științele fizicii, precum și în domeniile de cercetare interdisciplinară. Institutul Coreean pentru Cercetări Polare (KOPRI) a fost înființat în anul 1987, ca institut de cercetare susținut guvernamental, specializat în domeniul științelor polare și operator al Programul Coreean de Cercetare Antarctice (KARP), KOPRI deținand cea mai mare infrastructură de cercetare în domeniu din lume.

Figura…..Localizarea Statiei Antarctice King Sejong a Institutului Coreean pentru Cercetări Polare din Insula King George si imaginea panoramica a acesteia.

Platforma de cercetare găzduiește cercetători proprii și cercetători ai partenerilor, care pot fi: expediționari științifici care desfășoară activități în timpul verii polare și cei care extind studiile pe parcursul întregului an.

Expediția Științifică Guvernamentală Românească în Antarctica – ROICE 2015 si ROICE-2016 a fost organizata de către INCDSB în parteneriat cu Institutul Coreean pentru Cercetări Polare (KOPRI). Echipa de cercetători români a participat la această expediție în perioada 3 – 23 februarie 2015 si……..2016 si s-a desfășurat cu scopul de a investiga ecosistemele Antarctice, prin studierea comunităților microbiene din diverse habitate, în vederea identificării și caracterizării microcosmosului specific acestor habitate si in egală măsură, urmărindu-se studierea efectelor și adaptărilor organismelor în medii extreme ( Figura……), in mod particular a organismului uman.

Figura…..Imagini din timpul expeditiei reliefand expunerea organismelor la conditii extreme.

Scopul studiului nostru a constat in a analiza într-o primă etapă, influența condițiilor de mediu asupra viabilității eritrocitelor umane la persoane care au ramas o perioada de timp in Antarctica, ca o adaptare hematologica, considerand că celulele roșii din sânge pot fi modele excelente pentru studii asupra adaptării celulelor la mediu.

In aceste conditii este de asteptat ca adaptarea organismelor la conditii extreme sa fie determinata de adaptari la nivel celular, in special la nivelul hematiilor din sange, al hemoglobinei sau al unor enzime celulare implicate in transportul oxigenului (2,3- DPG) sau la nivelul viabilitatii acestora, cu consecinta finala declansarea fenomenului de apoptoza eritrocitara.

Celulele roșii din sânge uman (RBCs) sau eritrocitele au o durată de viață definită de 120 de zile, acestea fiind specializate în transportul gazelor respiratorii în sânge. Eritrocitele umane nu au nucleu și nici organite, ceea ce asigura un spațiu maxim pentru hemoglobina. Imbatranirea, senescenta eritrocitara, este asociata cu contracția celulei, microveziculizarea membranei plasmatice, o schimbare progresivă de formă, de la discocite la sferocite, modificări ale citoscheletului asociate cu degradarea proteinelor, in special cu spectrina și pierderea de asimetrie a fosfolipidelor membranei plasmatice care duce la externalizarea de fosfatidilserină, care ar putea reprezenta unul dintre semnalele care permit macrofagelor fagocitarea eritrocitelor senescente (erythroptosis) [Bratosin et al.,2001]. In plus, in ultimii ani, au fost introduse noi criterii de analiza si caracterizare a hematiilor umane prin citometrie in flux (metoda moderna, rapida si statistica de analiza multiparametrica, celula de celula), inclusiv un test original de apreciere a viabilitatii, test direct corelabil cu cantitatea de ATP intracelular (Bratosin et al., 2005).

In acest context, cu noi criterii si metode bazate pe citometrie in flux, am dorit sa investigam modificarile celulare la nivel de eritrocit, modificari de biologie posibil implicate in fenomenul de adaptare a corpului uman la conditii extreme, respectiv: i) aprecierea modificarilor de morfologie prin citometrie in flux in sistemFSC/SSC si microscopie de scanare, ii) aprecierea viabilitatii eritrocitelor cu Calcein-AM, si ca o consecinta directa, iii) analiza fenomenului de apoptoza eritrocitara. Deasemeni am investigat tot prin citometrie in flux, solicitarea medulara de introducere in circulatie de noi hematii, prin determinarea numarului de reticulocite aflate in fluxul sanguin.

10.1. Evaluarea prin citometrie in flux directa FSC/SSC a influenței conditiilor de mediu din Antarctica asupra morfologiei hematiilor umane dupa 3 saptamani la Polul Sud

O analiză prin citometrie in flux directa in sistem FSC/SSC pentru evaluarea hematiilor umane inainte de expeditie si dupa 3 saptamani petrecute in conditii extreme in Antarctica, a evidentiat legere modificari de morfologie, asa cum se prezinta si in Figura…., analiza reprezentativa pentru studiul efectuat.

In toate cazurile s-a observat o modificare a dispunerii celulare , cu migrare dinspre regiunea R3, regiune cu hematii mari, tinere , spre R2, regiune cu eritrocite mai mici. In cazul prezentat, aceasta redistribuire populationala este de 10%, sageatab indicand zona imbogatita cu hematii, cel mai probabil hematii batrane, daca se tine cont de parametrii caracteristici. Aceasta schimbare de distributie observata in imaginea prezentata in cele 2 citograme sunt cuantificate prin variatia XGeoMean si YGeoMean.

Diminuarea XGeoMean-ului de la 320 la un XGeoMean de 296, deci o diminuare a taliei celulare, insotita de diminuarea YGeoMean de la 316 la 286, confirma modificarea de morfologie a hematiilor in timpul expunerii organismului la conditii extreme.

Figura…. …… Analiza prin citometrie in flux directa in sistem FSC/SSC (talie celulara/continut celular) a influenței conditiilor de mediu din Antarctica asupra morfologiei hematiilor umane dupa 3 saptamani la Polul Sud (B) comparativ cu momentul plecarii in expeditie (A). XGeoMean-valoarea mediei taliei celulare; YGeoMean-valoarea mediei continutului celular. Numarul de celule analizate:10 000. Sageata indica zona unde s-au concentrat mai multe celule. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru experimentele realizate.

Aceasta lejera modificare de morfologie a fost observata si prin microscopie de scanare, asa cum se prezinta in Figura……

Figura…. Analiza prin microscopie electronica de scanare SEM a eritrocitelor umane prelevate inainte si dupa 3 saptamani de expunere a organismului la conditii extreme. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru experimentele realizate.

10.2. Evaluarea influenței conditiilor de mediu din Antarctica asupra externalizarii de fosfatidilserina cu Annexina-V-FITC, dupa 3 saptamani la Polul Sud

O analiza a fenomenului de apoptoza eritrocitara prin tehnica cadranelor dupa incubare cu Anexina-V-FITC ahematiilor prelevate inainte si dupa 3 saptamani de expunere a organismului la conditiile extreme din Antarctica evidentiaza un % insemnat de hematii care externalizeaza fosfatidilserina pe suprafata externa. Acest procetaj a variat intre 2,5% si 11, 14 %, asa cum se observa in Figura….., cu o medie de 6,4%.

Figura…. Analiza prin citometrie in flux a influentei conditiilor de mediu din Antarctica asupra externalizarii de fosfatidilserina, dupa 3 saptamani la Polul Sud (B) comparativ cu momentul plecarii in expeditie (A). Identificarea celulelor viabile si în apoptoză s-a facut prin tehnica cadranelor cu Annexina-V-FITC (FL1) versus autofluorescenta (FL2). Abscisă: intensitatea fluorescenței verzi a Annexinei-V-FITC (FL1), în scară logaritmică. Ordonată: logaritmul intensității autofluorescentei (FL2). Cadran stânga jos: celule viabile (Annexin־); Cadran dreapta jos: celule aflate în apoptoză (Annexina+); Procentul de celule se referă la procentul de celule în apoptoză (Annexina+). Număr de celule analizate 10.000. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru cele trei experimente realizate.

10.3. Evaluarea prin citometrie in flux a influenței conditiilor de mediu din Antarctica asupra viabilitatii celulare determinata cu calceina-AM, dupa 3 saptamani la Polul Sud

Pentru a intelege aparitia fenomenului de apoptoza eritrocitara in urma influentei timp de 3 saptamani a organismului uman la conditii extreme, asa cum sunt cele de la Polul Sud, s-a determinat viabilitatea hematiilor cu Calcein-AM. In toate cazurile, asa cum se observa si in Figura….activitatea esterazica diminueaza in medie cu 25-37 % .

In cazul prezentat, reprezentativ pentru analizele efectuate, viabilitatea exprimata ca MFI diminueaza de la 1561 la 937. Se observa deasemeni ca populatia de celule non-viabile (hematii moarte) din regiunea M2 creste in general cu 10%. , ceea ce semnifica probabil ca este formata din hematiile care externalizeaza fosfatidilserina ( Annexin-V-FITC pozitive din Figura…).

Figura…. Analiza prin citometrie in flux a influentei conditiilor de mediu din Antarctica asupra viabilitatii celulare determinata cu Calcein-AM, dupa 3 saptamani la Polul Sud. MFI= media de fluorescenta a calceinei ca expresie a activitatii esterazice intracelulare; Procentul de celule se referă la procentul de celule viabile ( M1) si moarte (M2). Număr de celule analizate 10.000. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru experimentele realizate.

10.4. Determinarea prin citometrie de flux a numarului de reticulocite din sangele circulant, dupa 3 saptamani la Polul Sud

Date fiind rezultatele observate, respectiv o diminuare a viabilitatii celulare in toate hematiile, si o crestere a hematiilor apoptotice si non viabile, am presupus ca in consecinta exista si un „clearence” accentuat al acestor hematii afectate de conditiile climatice extreme, stiut fiind ca hematiile care externalizeaza PS sunt imediat recunoscute ca non-conforme de catre macrofagele sistemului fagocitar. Pentru mentinerea homeostaziei organismului, in astfel de situatii are loc o productie si o intrare in circulatie de hematii tinere produse in maduva hematopoietica. In cazul acestui efort de adaptare a organismului, am determinat de o maniera comparativa, numarul de reticulocite circulante.

Rezultatele, asa cum sunt ele prezentate in Figura….. ca rezultate reprezentative, au evidentiat intr-adevar o dublare a % de reticulocite circulante (hematii cu o maturare incompleta),ca indicator fiziologic al efortului de adaptare al organismului. In toate cazurile, a existat o crestere a numarului de reticulocite circulante , variind intre 10 si 35%.

Figura…. Analiza prin citometrie in flux a influentei conditiilor de mediu din Antarctica asupra numarului de reticulocite din sangele circulant, dupa 3 saptamani la Polul Sud. Procentul de celule se referă la procentul de reticulocite: M1( bleu) : regiunea martor de autofluorescenta; M2 (mov): % de reticulocite circulante inainte de expeditie; M3 (roz): % de reticulocite circulante la sfarsitul expeditiei. Număr de celule analizate 10.000. Rezultatele prezentate sunt reprezentative pentru experimentele realizate.

10.5. Concluzii

In urma cercetarilor efectuate pentru intelegerea mecanismelor la nivel celular de adaptare a organismelor la conditii extreme, putem afirma ca:

Rezultatele noastre preliminare, obținute prin compararea datelor colectate de la 3 persoane, înainte și după 3 săptămâni de ședere în Antarctica, in urma a 2-a expeditii, demonstrează o influență clară asupra viabilității eritrocitelor prin scăderea acesteia, ceea ce poate semnifica o mai rapidă îmbătrânire a eritrocitelor.

Este greu de precizat care dintre factorii climatici a cauzat aceasta schimbare de viabilitate eritrocitara.

Cresterea numarului de reticulocite pare a fi un mecanism compensatoriu pentru inlocuirea eritrocitelor scoase din circulatie printr-un mecanism de imbatranire rapida, evidentiat si prin diminuarea viabilitatii eritrocitelor ramase in circulatie.

Desi nu au existat modificări morfologice semnificative caracteristice eritrocitelor batrane, totusi fenomenul de imbatranire eritrocitara, asa cum se cunoaste pana in prezent, este un fenomen extrem de complex, generat de o multitudine de factori si cu tot atat de multi markeri de senescenta ce determina scoaterea acestor eritrocite din circulatie.

Rezultatele obtinute constituie doar date preliminare ce ne obliga la corelarea in viitor cu alti parametri hematologici uzuali (hematocrit, MCV, numar hematii si reticulocite, etc.) determinati intr-un laborator de hematologie clinica si la o analiza pe un numar mai mare de organisme.

Cercetarile intreprinse, prin continutul stiintific al temei (subiectul fiind practic neabordat pe plan stiintific international) ne-a permis obtinerea unor progrese in intelegerea mecanismelor de adaptare la nivel celular in conditii extreme si implicit, cu posibile aplicatii viitoare de îmbunătățire a vieții și sănătății populației in general.

Impactul de adaptare la conditiile de viata din Antarctica asupra parametrilor hematologici, in particular asupra biologiei hematiilor umane poate fi la nivel morfologic, fiziologic sau molecular, iar intelegerea acestora poate avea aplicatii practice in conservarea sangelui, respectiv in adaptarea conditiilor de pastrare a acestora, respectiv crioconservare, conservare la frig, 4 °C, presiune, etc.

CAPITOLUL 11. UTILIZAREA HEMATIILOR UMANE PENTRU DETERMINAREA IN VITRO A TOXICITĂȚII/ BIOCOMPATIBILITĂȚII UNOR NANOPARTICULE/MATERIALE SINTETIZATE PENTRU UZ MEDICAL

Avansarea rapidă a nanotehnologiilor (știința care integrează ingineria cu biologia, chimia și fizica) a mărit posibilitatea folosirii nanoparticulelor obținute prin diferite metode de inginerie pentru tratamentul bolilor. Nanoparticulele interacționează cu mediile biologice, cu celulele corpului și cu mediul extracelular, și pot declanșa o secvență de efecte biologice. Aceste efecte depind în mare măsură de caracteristicile fizico-chimice și dinamice ale nanoparticulelor, care determină biocompatibilitatea și eficiența rezultatelor prevăzute. Pe masură ce sporesc aplicațiile nanomaterialelor, crește riscul expunerii pentru populație.

Marea diversitate a căilor prin care nanoparticulele pot fi preluate de corp complică foarte mult evaluarea riscurilor. Unele produse vor implica furnizarea directă de nanoparticule către oameni, de exemplu, injectarea de sisteme inteligente de eliberare a medicamentelor sau markeri de diagnostic și aplicarea de cosmetice pe piele. În unele cazuri, ar putea fi vorba de ingerare neintenționată, de exemplu, ingerarea de nanoparticule folosite în tehnologia de ambalare a alimentelor.

Nanoparticulele metalice dețin potențial pentru a fi utilizate atât în imagistică de diagnosticare cât și în livrarea targetată de medicamente. Aceste nanoparticule sunt adesea livrate în formă coloidală și vizează să crească indexul terapeutic al medicamentelor împotriva cancerului prin direcționarea pasivă sau activă în timp ce atenuează efectele toxice prin limitarea expunerii medicamentului la celulele și țesuturile sănătoase.

În prezent există încă puține studii privind toxicitatea nanoparticulelor dar și modul de stabilire a toxicității acestora, nanoparticulele fiind investigate într-un număr limitat de sisteme de testări, iar extrapolarea acestor date la alte materiale nu este acceptată.

Avansarea rapidă a nanotehnologiilor a mărit posibilitatea folosirii nanoparticulelor obținute prin diferite metode de inginerie pentru tratamentul bolilor. Nanoparticulele interacționează cu mediile biologice, cu celulele corpului și cu mediul extracelular, și pot declanșa o secvență de efecte biologice. Aceste efecte depind în mare măsură de caracteristicile fizico-chimice și dinamice ale nanoparticulelor, care determină biocompatibilitatea și eficiența rezultatelor prevăzute.

În prezent nu au fost stabilite criterii standard de biocompatibilitate, în particular pentru nanoparticulele folosite în sistemele de livrare de medicamente. Prin urmare, este nevoie de un ghid de siguranță corespunzător nanoparticulelor asupra sănătății umane.

În livrarea de medicamente, este crucial să evaluezi compatibilitatea nanoparticulelor pentru a asigura eliberarea medicamentelor în condiții de siguranță și pentru a minimiza citotoxicitatea. O serie de studii recente au raportat că răspunsul sistemului biologic la nanoparticule este specific proprietăților de suprafață mai mult decât masa sa.

În 2010, Johane și Langer explică biocompatibilitatea în contextul livrării de medicamente și al biocompatibilității definite ca expresie a relației dintre un material și mediul său biologic. În general, un grad înalt de biocompatibilitate este atins atunci când un material interacționează cu corpul fără a induce răspunsuri inacceptabile toxice, imunogene, trombogene sau răspunsuri cancerigene. Pentru evaluarea biocompatibilității există o serie de factori relevanți care trebuie să fie luați în considerare.

În primul rând, biocompatibilitatea se bazează pe anatomie, ceea ce duce la faptul că reacțiile la materiale specifice sunt diferite de la o locație la alta. Prin urmare, un alt fapt de care trebuie să fim conștienți este acela că în cazul în care un biomaterial pentru o anume aplicație poate provoca un efect adevers într-un anumit tip de țesut, nu va provoca în mod necesar același răspuns dacă va fi folosit pentru alt tip de aplicare sau în alt tip de țesut.

În al doilea rând, într-o perspectivă interdependentă, caracteristicile intrinseci ale biomaterialelor, în mod exclusiv, nu vor determina dacă acel material este biocompatibil sau nu. Prin urmare, timpul de injumătățire (half-life) este un alt factor important care merită atenție.

În al treilea rând, biocompatibilitatea este o chestiune relativă care depinde de raportul risc-beneficiu și se bazează pe o declarație subiectivă, deoarece în general, inflamația ar dispărea cu totul în timp și țesuturile vecine nu prezintă o dovadă bună de prejudiciu.

În ultimul rând, dar poate cel mai important, lipsa de date adecvate cu privire la procesele biologice ca răspuns la materiale străine, precum și metodele lipsite de sensibilitate disponibile pentru aprecierea biocompatibilității au limitat înțelegerea biocompatibilității materialelor. Toate acestea evidențiază necesitatea de evaluare a biocompatibilității biomaterialelor.

În ansamblu, putem concluziona că biocompatibilitatea materialelor se poate referi la un efect local sau total asupra organismului.

Biocompatibilitatea este un cuvânt folosit în general în știința biomaterialelor, dar este încă o mare incertitudine cu privire la înțelesul său, precum și asupra mecanismelor care constituie colectiv biocompatibilitatea. Imaginarea de sisteme eficiente și biocompatibile de livrare a medicamentelor, bazate pe nanoparticule reprezintă un vis al oamenilor de știință de mulți ani încoace, dar suntem încă departe de obiectivul final din domeniul de cercetare în relație cu sănătatea umană.

Utilizarea nanoparticulelor în aplicații biologice și medicale a crescut în ultimii ani și înțelegerea potențialelor efecte toxice asupra organismului este crucială înainte de utilizarea clinică.

În prezent există încă puține studii privind toxicitatea nanoparticulelor dar și modul de stabilire a toxicității acestora, nanoparticulele fiind investigate într-un număr limitat de sisteme de testări, iar extrapolarea acestor date la alte materiale nu este acceptată.

Cele mai folosite sisteme de culturi celulare pentru a testa biocompatibilitatea (citotoxicitatea) lor sunt de origine non-umană.

Pentru a evalua biocompatibilitatea (citotoxicitatea) unor nanoparticule sintetizate cu scop de aplicații medicale, am dezvoltat un nou sistem celular experimental, pe bază de eritrocite umane (RBCs) și am evaluat efectele toxice prin analiză de citometrie în flux și microscopie optică.

. Recent, s-a dovedit că moartea programată a eritrocitelor umane este legată de un mecanism de apoptoză care operează în absența mitocondriilor și a efectorilor terminali ai apoptozei nucleare (erythroptosis sau eryptosis). În plus am aplicat un nou test rapid și sensibil prin citometrie în flux utilizând calcein-AM pentru determinarea viabilității hematiilor umane.

Prin urmare, în studiul de față, pentru a evalua interacțiunile celulă-nanoparticule, eritrocitele umane au fost expuse la diferite concentrații de nanoparticule și analizate prin citometrie în flux, după 3 și 24 de ore de incubare pentru evidențierea modificărilor morfologice (FSC/SSC) și a viabilității (test Calcein-AM).

11.1. Analiza prin microscopie inversă

Analiza prin microscopie în lumină directă s-a realizat cu ajutorul unui microscop optic inversat model MCX1600 fabricat în Austria și camera Micro Publisher RTV 3 mp cu racier (Figura….- Figura…..) și a avut ca scop completarea rezultatelor obținute prin citometrie în flux pentru determinarea modificărilor de morfologie.

Figura ….. Analiza prin microscopie optică inversă a suspensiei martor de hematii la momentul T0 (RBCs-T0) și după 24h (RBCs-24h) de incubare în ser fiziologic la temperatura camerei

Figura…… Analiza prin microscopie optică inversată a suspensiei de hematii incubate pentru 3h si 24h cu diferite diluții în ser fiziologic ale suspensiei P1 de nanoparticule la temperatura camerei.

Figura …. Analiza prin microscopie optică inversată a suspensiei de hematii incubate pentru 3h si 24h cu diferite diluții în ser fiziologic ale suspensiei P2 de nanoparticule la temperatura camerei

Figura …… Analiza prin microscopie optică inversată a suspensiei de hematii incubate pentru 3h si 24h cu diferite diluții în ser fiziologic ale suspensiei P3 de nanoparticule la temperatura camerei

Figura ….. Analiza prin microscopie optica inversată a suspensiei de hematii incubate pentru 3h si 24h cu diferite diluții în ser fiziologic ale suspensiei P4 de nanoparticule la temperatura camerei

Figura ….. Analiza prin microscopie optică inversată a suspensiei de hematii incubate pentru 3h si 24h cu diferite diluții în ser fiziologic ale suspensiei P5 de nanoparticule la temperatura camerei

Figura …… Analiza prin microscopie optică inversată a suspensiei de hematii incubate pentru 3h si 24h cu diferite diluții în ser fiziologic ale suspensiei P6 de nanoparticule la temperatura camerei

11.2. Analiza prin citometrie în flux a modificărilor de morfologie, în sistem FSC/SSC (light scatter measurements)

Estimarea viabilității celulare prin măsurarea absorbției și difuziei luminii, cunoscută și ca "analiza directă în sistem FSS/SSC ", (light scatter measurements) este deosebit de simplă și sensibilă. După interceptarea luminii incidente, celula emite un anumit număr de semnale. Lumina difuzată sub un unghi ascuțit sau în ax (FSC) poate fi corelată cu talia celulară, permițând astfel de a distinge o celulă de agregate sau resturi celulare și a aprecia viabilitatea celulară, deoarece celulele moarte difuzează mai slab lumina în această direcție. Lumina difuzată sub un unghi drept (SSC) permite studierea refringenței citoplasmatice, a morfologiei și a raportului nucleo-citoplasmatic.

Modificările de morfologie observate prin microscopie optică au fost corelate cu analiza prin citometrie în flux în sistem “dot-plot” FSC/SSC (talie celulară/granularitate, densitate), parametri cuantificați prin XGeoMean și YGeoMean. Analizele în sistem FSC/SSC atât după 3h cât și după 24h a hematiilor incubate în prezența diferitelor diluții de nanoparticule au demonstrat o perfectă corelare și evidențiere a modificărilor morfologice, așa cum sunt ele prezentate în figurile următoare.

Astfel în cazul martorului de 24h (T24h), valoarea XGeoMean crește de la 383,7 la 511,82, în timp ce pentru YGeoMean care reflectă conținutul celular se observă o diminuare a acestuia la martorul de 24h de la 133,52 pentru T0 la 115, 73, semnificând faptul că a avut loc o foarte lejeră hemoliză, probabil datorată faptului că mediul de incubare nu a fost perfect izoton. Toate probele de nanoparticule, în diferitele lor diluții, sunt prezentate, pe lângă analiza primară sub formă de citograme cu XGeoMean și YGeoMean, sub forma unor grafice pentru o mai ușoară interpretare a rezultatelor, în figurile 23 și respectiv 24.

Comparând cu proba martor de incubare (M), se observă cu ușurință că nanoparticulele din proba P2 prezintă cea mai mare toxicitate, ea inducând modificările cele mai mari pentru valorile XGeoMean și YGeoMean, urmată de cele din P5 și P1 (Fig. – ). Celelalte probe prezintă o capacitate mult mai mică de a induce modificări morfologice, și în concluzie o toxicitate mult diminuată, chiar neglijabilă, ca pentru proba P3 sau P6.

Observatie: La 24h, datorita afectarii hematiilor cu P2, nu s-a putut efectua analiza.

Figura…….Analiza prin citometrie în flux în sistem FSC/SSC pentru determinarea schimbărilor de morfologie a hematiilor umane incubate cu diferite diluții seriale de nanoparticule din probele P1–P6 după 3 si 6 ore de incubare comparativ cu momentul inițial (T0) si martorul de incubare T24h.

Figura …… Analiza comparativă a XGeoMean și YGeoMean rezultate prin citometrie în flux în sistem FSC/SSC pentru determinarea schimbărilor de morfologie a hematiilor umane incubate cu diferitele diluții seriale de nanoparticule din probele P1-P6 după 24 ore incubare

11.3. Analiza discriminativă a eritrocitelor viabile si în apoptoză cu Annexin-V-FITC/Propidium Iodide

Comparând % de celule Annexin V-FITC negativ (cadranul LL-stanga jos) adică celule normale cu cel Annexin V-FITC pozitiv (cadranul LR-dreapta jos) conținând celule în apoptoză și din cadranul Annexin V-FITC pozitiv și iodura de propidiu pozitiv (UR-dreapta sus), care conține celulele moarte se poate aprecia în final toxicitatea diferitelor nanoparticule luate în studiu (P1-P6). Pentru eșantionul proaspăt de hematii se constată un procent de 98,98 % celule viabile, și doar 1,02 % în apoptoză. Deoarece hematiile umane nu prezintă nucleu, nu s-a utilizat și marcajul cu iodura de propidiu, specific celulelor moarte (Fig.27- 32). Martorul incubat timp de 24h la temperatura camerei, care s-a servit de martor pentru compararea probelor incubate cu diferitele nanoparticule nu a diferit față de martorul T0. Pentru eșantioanele incubate cu concentrații descrescatoare de nanoparticule, se constată că apoptoza este proporțională cu concentrația, pentru concentrațiile mari, în unele cazuri după 24h având o hemoliză totală pentru P2.

Figura…….Analiza prin citometrie în flux prin tehnica cadranelor în sistem FL1/FL2 (Anexina-V-FITC/autofluorescența hematii) pentru determinarea toxicității prin discriminarea fenomenului de apoptoză pentru hematiile umane incubate cu diferite diluții seriale de nanoparticule din probele P1-P6 după 3 ore de incubare comparative cu momentul inițial

Figura …… Analiza sintetică comparativă a toxicității probelor de nanoparticule P1-P6 prin analiza apoptozei hematiilor (% de hematii viabile si % de hematii moarte) după 3h si respectiv 24 ore de incubare cu dilutiile seriale.

Cuantificarea apoptozei cu kitul de Annexină V-FITC se dovedește astfel a fi o metodă sigură și extrem de sensibilă pentru aprecierea gradului de toxicitate.

11.4. Estimarea toxicității nanoparticulelor prin măsurarea viabilității hematiilor umane cu Calcein-AM

Estimarea toxicității nanoparticulelor prin măsurarea viabilității hematiilor umane cu Calcein-AM se bazează așa cum am descris la Capitolul Material și metode, pe măsurarea activității esterazelor intracelulare.

Calcein-AM este cel mai bun indicator de viabilitate celulară datorită reținerii lui superioare în celulă și relativei sale insensibilități a fluorescenței emise la pH-uri situate în limitele fiziologice. Calcein-AM traversează membrana celulelor viabile și va fi hidrolizată de către esterazele citosolice în calceină, produs verde fluorescent, ce va fi reținut în celulele cu membrană intactă. Pierderea de calceină este similară cu pierderea viabilității celulare si se poate măsura prin citometrie in flux, exprimându-se sub forma de histogramă de fluorescență, putând astfel să comparăm MFI-ul (mean fluorescence intensity)

Figura …… Analiza comparativă sub formă de grafice pentru determinarea toxicității probelor de nanoparticule P1-P6 după incubarea cu diferite diluții seriale a acestora pentru 3 ore prin testul cu Calcein-AM, exprimată ca % de hematii viabile și Mean de fluorescență

Din analiza comparată a histogramelor de fluorescență în FL1 (intensitatea de fluorescență a Calceinei) pentru regiunile M1 (regiunea de celule viabile) și M2 (regiunea celulelor moarte) atât ca procentaje cât și ca MFI (Mean Fluorescence Intensity) se poate observa din figura 48, că martorul de incubare după 24h pierde din cantitatea de calceină, explicabil pentru că în mediul salin nu s-a adăugat glucoză ca sursă de energie. Datorită faptului că simpla incubare a eritrocitelor pentru 24h la temperatura camerei alterează viabilitatea celulară, compararea influenței exercitate de diferitele probe de nanoparticule s-a facut față de martorul incubat T24h.

A fost de asemeni comparat % de celule încă viabile (M1) după 3h și după 24%, așa cum se observă în figurile 5.41-5.47. Graficul din Fig.33 conține prin suprapunere toate probele analizate. De asemeni, pentru o mai ușoară interpretare a rezultatelor, dar mai ales pentru cazul în care se dorește calcularea dozei EC50, definită ca acea concentrație care induce moartea a 50% din celule, au fost trasate pentru fiecare probă (P1-P6) graficele cu % celulelor vii și moarte, prezentate în Fig.33- 35.

Din analiza globală a rezultatelor obține prin testul de viabilitate, confirmă toxicitatea extrem de mare a probei P2, urmată de proba P5

11.5. Discutii si concluzii

Pentru evaluarea citotoxicității nanoparticulelor analizate în cadrul prezentei lucrări s-a utilizat un nou model celular exprimental pe bază de eritrocite umane (anucleate), evaluarea efectelor toxice produse realizandu-se prin analiza de citometrie in flux. Aceasta evaluare are ca principiu general demonstrarea faptului că moartea celulară programată a eritrocitelor umane este tot un mecanism apoptotic (Bratosin et al., 2001).

Pentru evaluarea interacțiilor celulă-nanoparticule, eritrocite umane expuse la diferite concentrații descrescătoare de nanoparticule au fost analizate după 3 și 24h de la incubare prin citometrie în flux pentru modificările de morfologie (FSC/SSC), apoptoză (Annexin-V-FITC) și viabilitate celulară determinată cu calcein-AM pe baza unui test original (Bratosin et al., 2005). S-a utilizat de asemeni o analiză complementară de microscopie optică in fază inversă.

Această analiză multiparametrică prin citometrie de flux, permite o discriminare precisă între eritrocitele viabile (mature) și cele apoptose-like si ea poate fi aplicată cu succes în studiul toxicității unor unor diverse nanoparticule, dovedindu-se a fi o metodă extrem de sensibilă. De asemeni, metoda poate fi aplicată cu succes pentru stabilirea toxicității sau biocompatibilității unor materiale implantabile, etc.

Determinarea toxicității nanoparticulelor reprezintă o arie largă de investigație, unde acest nou model celular își demonstrează avantajele, până în prezent cele mai folosite sisteme fiind culturile celulare de origine non-umană care necesită dotări și cheltuieli de intretinere a culturilor.

CAPITOLUL 12. ÎNCERCĂRI DE VALORIFICARE SUPERIOARĂ A PRODUSELOR DE TRANSFUZIE DUPĂ EXPIRAREA TERMENULUI DE STOCARE.

PRODUSE PENTRU APLICATII BIOMEDICALE PE BAZA DE HPL OBTINUT DIN CONCENTRAT PLACHETAR AJUNS LA SFÂRSITUL PERIOADEI DE CONSERVARE

Asa cum am prezentat in Capitolul 5, plachetele sunt structuri anucleate mic,i de origine hematopoietică, eliberate în fluxul sanguin, si care circula timp de 7-10 zile înainte de a fi înlocuite. Ele contribuie la hemostaza și vindecarea ranilor prin secreția de factori de creștere și citokine.

Studiile recente au evidentiat, în afară de hemostază si unele aplicatii biotehnologice prin exploatarea secretiei factorilor de crestere pentru potentiale tratamente clinice, cum ar fi vindecarea ranilor. Utiliza pentru prima data in 1987, PRP autolog (Ferrariet al., 1987) a deschis perspective pentru multe biomateriale pe bază de plachete cum ar fi gelul plachetar, lipiciul plachetar și plasma imbogatita în plachete au fost recent utilizate în chirurgia orala/maxilofaciala, in tratamentul ulcerelor cronice si in ortopedie, facilitand vindecarea si intensificarea osului grefat dupa implantare, fiind utilizate deasemeni pentru imbunatatirea tehnicilor de culturi celulare si în proiectarea de noi terapii celulare, rezultatele fiind promițătoare.

Timpul de viata al unităților plachetare in centrele de transfuzii este cel mai scurt, datorita riscului crescut de contaminare cu agenti patogeni, după câteva zile de depozitare la temperatura camerei nefiind legată de funcționalitatea plachetelor. După o perioadă scurta de 5-7 zile, unitățile plachetare nu mai sunt considerate sigure pentru transfuzii umane, chiar dacă funcția plachetelor adecvate poate fi încă intacta. S-a raportat că până la 20% din totalul unităților plachetare expira inainte de a putea fi folosite și sunt, prin urmare, eliminate (Verma & Agarwal , 2009). Prin urmare, ar putea fi posibil să se utilizeze plachete în alte scopuri decât transfuzie, după expirarea acestora. unitățile plachetare expirate fiind fabricate în conformitate cu standardele international acceptate ce se aplică la producerea materialelor de transfuzie pentru pacienți umani

De aceea, scopul cercetarilor noastre a fost de a demonstra ca lizatul de plachete umane (HPL sau hPL) obtinut din unitățile plachetare expirate poate fi utilizat ca o alternativă a SFB, similar cu HPL produs din unitățile plachetare proaspăt isolate.

12.1. Prepararea lizatelor plachetare (HPL)

O unitate de transfuzie cu concentrat plachetar (CP) obtinut prin afereza , cu un volum de 50 ml/unit, continand 5,5×1010 in plasma, pH 6,2, a fost divizat in 2 probe.O proba a fost conservata la temperatura camerei (200 C ), timp de 7 zile dupa colectare, sub agitare până la expirare, iar apoi a fost depozitata la -80 ° C. Cealalta proba a fost depozitata imediat dupa colectare la -80 ° C.

Inainte de prelucrare, ambele unitati congelate au fost dezghetate la 37° C, pe baie de apa, ceea ce a condus la liza trombocitelor. Probele au fost centrifugate timp de 30 minute la 4500g, fiind recuperate supernatantele. Pentru obtinerea unui lizat filtrat, supernatantele au fost filtrate pe un filtru de 0,45 µm (Millipore, MA, ). Filtratul obtinut a fost alicotat in criotuburi si depozitate la -80 ° C. Inainte de utilizare ca supliment de crestere in mediul de cultura celulara , probele alicotate au fost dupa dezghetare recentrifugate 15 minute la 4500g si s-au folosit numai supernatantele.

12.2. Testarea comparativa a HPL obtinut din plachete proaspat conservate si ajunse la termenul de expirare pe o cultura de fibroblaste

Fibroblastele de șoarece (NCTC, clona 929) au fost cultivate pentru expansiune în mediu de cultură MEM suplimentat cu 10% SFB, penicilina (100U/ml), streptomicina (0,1 mg/ml), amfotericina (0,25µg/ml) utilizând placi de 6 godeuri, 4×104 celule/godeu, în 2 ml mediu de cultură DMEM complet.

Pentru testarea comparativa celulele au fost impartite in trei culturi pentru expansiuni viitoare in mediu DMEM suplimentat cu 10% lizat plachetar proaspat (HPL-p), 10% lizat plachetar obtinut dupa expirarea plachetelor (HPL-e) sau10% ser fetal ( SFB) si cultivate într-un incubator cu 5% CO2, 95% umiditate și 37° C. Celulele au fost cultivate în mod independent și au fost efectuate experimente în triplicate, fiind analizate la 3 si 5 zile de cultura.

Asa cum se poate constata din Figurile…..si …..expansiunea celulara in prezenta de lizat plachetar obtinut din plachete proaspete sau ajunse la limita conservarii de 7 zile a fost mult superioara fata de multiplicarea celulara in proba martor , in prezenta de SVF. In plus, nu au exista diferente de proliferare a celulelor la suiplimen tarea cu lizat plachetar obtinut din plachete proaspete sau dupa conservarea lor in plasma timp de 7 zile.

Aceste observatii permit in concluzie posibilitatea de a utiliza plachetele pentru imbunatatirea tehnicilor de cultură celulară, rezultatele fiind mai mult decat promițătoare, si chiar posibilitatea inlocuirii serului fetal.

Figura…. Analiză prin microscopie optica a fibroblastelor de șoarece (NCTC, clona 929) cultivate în suport de microbile de alginat de sodiu suplimentate cu SVF, HPL-p sau HPL-e, după 3 zile de cultivare (20x).

Figura…. Analiză prin microscopie optica a fibroblastelor de șoarece (NCTC, clona 929) cultivate în suport de microbile de alginat de sodiu suplimentate cu SVF, HPL-p sau HPL-e, după 5 zile de cultivare (30x).

12.3. Obținerea unui suport 3D (scaffold) cu microbile de alginat continand HPL-e pentru cultivarea celulelor utilizabile în medicină regenerativă( gel de alginat cu HPL)

Pe baza rezultatelor bune obtinute in care am demonstrat ca lizatul plachetelor expirate (HPL-e) a generat aceleasi efecte ca lizatul obtinut din plachete proaspete (HPL-p) asupra expansiunii celulare a liniei de fibroblaste, si chiar superioare culturii cu SVF, am elaborat o metodă de obținere a unui gel suport 3D pentru utuilizari in medicina regenerativa.

In acest sens am folosit alginatul, un polizaharid natural, anionic și hidrofilic, derivat în principal din alge brune și bacterii, materialul cel mai des utilizat pentru încapsularea de celule si cultivarea lor intr-un suport 3D, pentru avantajele oferite. Alginatul permite obținerea unei game variate de biomateriale, matrici suport sau sistem de livrare utilizate în medicină putand fi condiționat într-o varietate de forme: hidrogeluri moi, geluri elastice, microsfere, fibre, spume, nanoparticule, multistraturi, el fiind pretabil ca material pentru încapsularea celulară și vehicul injectabil pentru transplantarea celulelor. In plus are proprietăți remarcabile pentru medicina: biocompatibilitate, biodegradabilitate, non-antigenicitate, cost scăzut și gelificarea ușoară cu cationi bivalenți incat a pewrmis condus obținerea unei game variate de biomateriale pe bază de alginat pentru repararea și regenerarea diferitelor țesuturi cum ar fi pielea, cartilajul și țesutul osos, etc.

Astfel, am elaborat o metodă de obținere a unui gel pe baza de microbile de alginat in care incapsularea celulelor se face in prezenta de lizat plachetar ca stimulant de crestere celulara.

Metoda utilizată de noi a fost conform celei descrise de Marijnissen et al., 2002, cu adaptare pentru includerea lizatului plachetar. Sedimentul de fibroblaste în concentrație de 4×105 celule/ml a fost suspendat in 5 ml solutie NaCl 155mM in care a fost dizolvat 0,06 g alginat de sodiu si suplimentat dupa aceea cu 10% – 20% HPL-p sau HPL-e. Suspensia celule/alginat de sodiu obținută a fost transferată ulterior picătură cu picătură în 70 ml soluție CaCl2 de concentrație 102 mM, realizându-se astfel polimerizarea și încapsularea celulelor în microbilele de alginat continand HPL. Ulterior, microbilele au fost spalate cu mediul de cultură DMEM și cultivate în continuare în mediul de cultură, în condiții standard (370C și 5% CO2), în raport de 10-12 microsfere/mL, timp de 5-7 zile. ( Figura……….).

Astfel, în urma analizelor efectuate prin microscopie optică, s-a observat o proliferare mai crescută a fibroblastelor de șobolan înglobate în gelul de alginat de sodiu suplimentat cu lizat HPL-p sau HPL-e, fata de proba martor cu SVF. Expansiunea celulara precum si viabilitatea celulara determinata prin dubla coloratie cu kitul Live/Dead , respectiv cu calceina- AM/Iodura de Propidiu ( Figura….) nu au evidentiat diferente .

Figura … Analiză prin microscopie optica a fibroblastelor de șoarece (NCTC, clona 929) cultivate în suport de microbile de alginat de sodiu suplimentate cu SVF, HPL-p sau HPL-e, după 5 zile de cultivare (20x).

Figura .. Fibroblaste de șoarece (NCTC, clona 929) cultivate în suport de microbile de alginat de sodiu suplimentate cu SVF, HPL-p sau HPL-e, după 5 zile de cultivare (microscopie de fluorescență si coloratie pentru viabilitate Live/Dead; 30x)

12.4. Concluzii

1. In cercetarile noastre, utilizarea HPL preparat din concentrate plachetare expirate (HPL-e) ca supliment de creștere a culturii de fibroblaste de soarece (NCTC, clona 929) a fost comparata cu HPL derivat din concentrate plachetare proaspete (HPLp) și cu utilizarea tradițională a SFB. Caracteristicile de bază ale fibroblastelor au rămas neschimbate, fara modificari morfologice, in timp ce utilizarea HPL ca supliment a condus la cresterea semnificativa a proliferarii, datorata probabil prezenței unor factori aditionali din HPL, care nu se gasesc, în general, in SFB.

2. Deoarece utilizarea HPL expirat sau proaspat nu a afectat creșterea ratei de expansiune, utilizarea unităților plachetare expirate ca suplimente de creștere pentru expansiunea celulara poate fi avantajoasă. Această creștere a proliferării și a ratei de dublare a populației se datoreaza cu siguranta unor factori de creștere prezenți în HPL.

3. In plus, mediul suplimentat cu HPL poate fi folosit în aceeași măsură ca și SFB. Acest lucru indică faptul că lizatele plachetare ar putea avea abilități de protecție asemanatori, în general, atribuite SFB, dar fără a furniza inhibitori proteolitici si risc de contaminare virala.

4. Obtinerea HPL din plachete ajunse la limita duratei de conservare in centrele de transfuzii precum si posibilitatea stocarii acestora la -80° C asigura indeplinirea criteriilor stricte de securitate, cum ar fi cele aplicate produselor din sânge, asigurand sterilitatea și stabilitatea condițiilor de depozitare.

5. Lizatul celular HPL, dar si gelul plachetar obtinut, pot fi considerate componente sanguine și urmărite cu același sistem de baze de date pentru a furniza trasabilitatea completă a produsului de la donare la utilizarea de catre pacient.

6. Atat HPL cat si gelul plachetar obtinut poate fi folosit in chirurgia regenerativă si domeniul medicinei dentare clinice, in cabinetele de chirurgie plastica si estetica, inlocuind procedeul de obtinere al PRP-ului autolog, consummator de timp si materiale sau imposibil de practicat in cabinetele mici.

STADIUL CUNOAȘTERII IN DOMENIU

(Cambria, 22, Bold, Majuscule)

TEXT: Font Cambria, 12, la 1.5 rânduri

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Quisque molestie purus non velit semper, at tincidunt tortor ultrices. Sed nec magna posuere turpis placerat hendrerit eu sit amet mauris. Nulla dapibus diam at porta fermentum. In nec dui posuere, accumsan massa eu, ullamcorper massa. Ut suscipit venenatis nisi ac pulvinar. Integer leo orci, facilisis vitae felis id, vulputate malesuada dui.

CAPITOLUL 1. TITLU

(Cambria, 22, Bold, Majuscule)

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Quisque molestie purus non velit semper, at tincidunt tortor ultrices. Sed nec magna posuere turpis placerat hendrerit eu sit amet mauris. Nulla dapibus diam at porta fermentum. In nec dui posuere, accumsan massa eu, ullamcorper massa. Ut suscipit venenatis nisi ac pulvinar. Integer leo orci, facilisis vitae felis id, vulputate malesuada dui.

1.1. Titlu subcapitol (Cambria, 16, Bold, Minuscule)

Sed feugiat felis vel ex feugiat, ac ultricies turpis tempus. Duis ut fermentum lorem. Nullam quis turpis molestie, lobortis orci ut, placerat nunc. Phasellus quis metus nec erat mattis porttitor. Praesent quis semper massa. In at est ullamcorper, aliquet dui et, aliquet odio. Vivamus sapien nibh, mattis ac orci sed, ornare pharetra nulla. Morbi mattis erat eu metus dapibus tempor.

1.1.1. Titlu sub-subcapitol (Cambria, 14, Bold, Minuscule)

Nulla eu felis maximus, efficitur mauris quis, vestibulum ipsum. Integer lacinia nisl sem, a pulvinar diam lacinia ac. Aliquam tempor nunc fermentum fermentum faucibus. Vivamus lacus nibh, pharetra non

1.1.1.1. Titlu sub-sub-subcapitol (Cambria, 12, Bold, Minuscule)

Curabitur eu felis et arcu efficitur placerat. Praesent sollicitudin vestibulum tincidunt. Suspendisse pellentesque vulputate nulla vel hendrerit. Nulla facilisi. Etiam elementum lectus a interdum aliquam. Donec sed magna hendrerit, tempus nibh vitae, tristique massa. Sed risus nisl, condimentum a tellus quis, faucibus faucibus lorem.

CAPITOLUL 2. TITLU

(Cambria, 22, Bold, Majuscule)

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Quisque molestie purus non velit semper, at tincidunt tortor ultrices. Sed nec magna posuere turpis placerat hendrerit eu sit amet mauris. Nulla dapibus diam at porta fermentum. In nec dui posuere, accumsan massa eu, ullamcorper massa. Ut suscipit venenatis nisi ac pulvinar. Integer leo orci, facilisis vitae felis id, vulputate malesuada dui.

2.1. Titlu subcapitol (Cambria, 16, Bold, Minuscule)

Sed feugiat felis vel ex feugiat, ac ultricies turpis tempus. Duis ut fermentum lorem. Nullam quis turpis molestie, lobortis orci ut, placerat nunc. Phasellus quis metus nec erat mattis porttitor. Praesent quis semper massa. In at est ullamcorper, aliquet dui et, aliquet odio. Vivamus sapien nibh, mattis ac orci sed, ornare pharetra nulla. Morbi mattis erat eu metus dapibus tempor.

CONTRIBUȚIA PERSONALĂ

(Cambria, 22, Bold, Majuscule)

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Quisque molestie purus non velit semper, at tincidunt tortor ultrices. Sed nec magna posuere turpis placerat hendrerit eu sit amet mauris. Nulla dapibus diam at porta fermentum. In nec dui posuere, accumsan massa eu, ullamcorper massa. Ut suscipit venenatis nisi ac pulvinar. Integer leo orci, facilisis vitae felis id, vulputate malesuada dui.

1. IPOTEZA DE LUCRU/SCOP/OBIECTIVE GENERALE

(Cambria, 22, Bold, Majuscule)

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Quisque molestie purus non velit semper, at tincidunt tortor ultrices. Sed nec magna posuere turpis placerat hendrerit eu sit amet mauris. Nulla dapibus diam at porta fermentum. In nec dui posuere, accumsan massa eu, ullamcorper massa. Ut suscipit venenatis nisi ac pulvinar. Integer leo orci, facilisis vitae felis id, vulputate malesuada dui.

2. TITLU STUDIU/EXPERIMENT 1

(Cambria, 22, Bold, Majuscule)

2.1. Ipoteză/Scop/obiective (Cambria, 16, Bold, Minuscule)

Sed feugiat felis vel ex feugiat, ac ultricies turpis tempus. Duis ut fermentum lorem. Nullam quis turpis molestie, lobortis orci ut, placerat nunc. Phasellus quis metus nec erat mattis porttitor. Praesent quis semper massa. In at est ullamcorper, aliquet dui et, aliquet odio. Vivamus sapien nibh, mattis ac orci sed, ornare pharetra nulla. Morbi mattis erat eu metus dapibus tempor.

…………………

(pagina x, fără header, goală)

BIBLIOGRAFIE

(Cambria, 22, Bold, Majuscule)

(Cambria, 12, Minuscule)

Referințele sunt citate în funcție de tipul publicației:

Articole publicate în jurnale:

1. Autor 1, A.B.; Autor 2, C.D. Titlul Articolului. Numele abreviat al jurnalului Anul, Volumul, paginație (sau număr de pagini), DOI sau alt cod de identificare (dacă este cazul).

Cărți sau capitole de cărți

2. Autor 1, A.; Autor 2, B. Titlu cărții, ed. 3; Editura: Locația Editurii, Țara, Anul; p. 154–196.

3. Autor 1, A.; Autor 2, B. Titlul capitolului. In Titlul cărții, ed. 2; Editor 1, A.; Editor 2, B., Editori; Editura: Locația Editurii, Țara, Anul; Volum 3, p. 154–196.

Proceeding conferință:

4. Autor 1, A.B.; Autor 2, C.D.; Autor 3, E.F. Titlul prezentării. În Titlul volumului conferinței (dacă este cazul), Proceeding al Conferintei cu titlul…., Locația conferinței, Țara, Data conferinței; Editor 1, Editor 2, Editori. (dacă este cazul); Editura: Oraș, Țară, An (dacă este cazul); Numărul abstractului (optional), paginație (optional).

Teze de master, doctorat:

5. Autor 1, A.B. Titlul tezei. Nivelul tezei, Universitatea, Locația universității, Data finașizării tezei.

Websites:

6.Titlul site-ului. Disponibil online: URL (accesat în ziua, luna, anul).

LISTA DE PUBLICAȚII (Cambria, 22, Bold, Majuscule)

Articole publicate in extenso ca rezultat al cercetării doctorale (Cambria, 18, Bold, Minuscule)

(Cambria, 12)

Autor 1, A.B.; Autor 2, C.D. Titlul Articolului. Numele jurnalului Anul, Volumul, paginație (sau număr de pagini), DOI sau alt cod de identificare (dacă este cazul), Factorul de impact pentru articolele ISI sau bazelede date în care este indexată revista în cazul revistelor BDI.

ANEXE

(Dacă este cazul, Cambria, 22, Bold, Majuscule)

(Cambria, 12, Minuscule)

Nulla eu felis maximus, efficitur mauris quis, vestibulum ipsum. Integer lacinia nisl sem, a pulvinar diam lacinia ac.

Nulla eu felis maximus, efficitur mauris quis, vestibulum ipsum. Integer lacinia nisl sem, a pulvinar diam lacinia ac.

Nulla eu felis maximus, efficitur mauris quis, vestibulum ipsum. Integer lacinia nisl sem, a pulvinar diam lacinia ac.

Nulla eu felis maximus, efficitur mauris quis, vestibulum ipsum. Integer lacinia nisl sem, a pulvinar diam lacinia ac.