Consecintele Multiplicarii Mucegaiurilor Asupra Calitatii Boabelor de Grau Contaminate In Timpul Depozitarii

[NUME_REDACTAT] S., 2006, Microbiologia produselor alimentare, vol 1, Editura RISOPRINT, [NUME_REDACTAT] S., 2006, Microbiologia produselor alimentare, vol 2, Editura RISOPRINT, [NUME_REDACTAT] S., Rotar M. A., 2009, Microbiologia produselor alimentare, Lucrări practice, vol. III, Cluj-Napoca, [NUME_REDACTAT]

Bara C., 2005, Microbiologia alimentelor, [NUME_REDACTAT] din Oradea, [NUME_REDACTAT] C., 2010, Microbiologia generală a unităților agroalimentare, [NUME_REDACTAT] din Oradea, [NUME_REDACTAT] C., 2005, Tehnici și examene de laborator în controlul alimentelor, Oradea, [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT] D., Negruț M., 2008, Tratat de microbiologie clinică, Ediția a 2-a revizuită și adăugită, București, [NUME_REDACTAT]

Csep N., Csep A., 2003, Bolile plantelor cultivate și a produselor vegetale depozitate , Oradea, [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT] N., 2008, Protecția plantelor față de boli, [NUME_REDACTAT] din Oradea, [NUME_REDACTAT] V., 2001, Microbiologia alimentelor, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] N., Timar A., 2010,Materii prime vegetale- condiționarea, păstrarea și expertiza calității, Oradea, [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT] D., 1964, Microbiologia produselor alimentare, București, [NUME_REDACTAT]

Purcărea C., 2008, Transformări biochimice importante în produsele agroalimentare în timpul procesării și depozitării

Novoselev M., Ursea D., Bitănescu L., 1990, Atlas micologic, [NUME_REDACTAT] Veterinară, ISBN 973-96534-0-5

Tofan C., 2004, Microbiologie alimentară, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] Gh., Duda M., Timar A., 2012, Condiționarea și păstrarea produselor agricole, București, [NUME_REDACTAT]

[NUME_REDACTAT] fenomenului de infestare fungică și de contaminare micotoxinică este atât de mare în plan orizontal încât, practic toate substraturile vegetale, care într-un fel sau altul ajung în dieta omului și a animalelor, nu scapă acestui flagel, ele împovărându-se deseori, cu astfel de elemente indezirabile în cantități inacceptabile.

Boabele de cereale oferă prin conținutul lor ridicat de trofine un mediu ideal nutritiv pentru multiplicarea micromiceților și eliberarea micotoxinelor. Ele pot fi contaminate cu fungi și micotoxine atât în faza de vegetație a plantelor, cât mai ales în perioada de conservare, când condițiile de recoltare și păstrare sunt favorabile germinării formelor de rezistență ale micromiceților și multiplicării aparatului lor micelian.

Concentrații extrem de ridicate de micotoxine sunt adesea evidențiate în spații limitate, definite ca nișe ecologice, unde micromiceții toxigeni producători de micotoxine au invadat fie materiile prime (boabele de cereale) fie produsele finite rezultate prin procesarea acestora (făinuri, șroturi, tărâțe, gozuri, măcinișuri).

Deoarece multe boabe de cereale sunt infestate de micromiceți încă din faza de vegetație, ele reprezintă o sursă sustenabilă de contaminare în perioada de depozitare și apoi în activitatea de procesare.

Distribuția extrem de heterogenă a miceților în masa de boabe de cereale depozitate depinde de diverși factori cum ar fi: natura substratului, condițiile de depozitare, modul de recoltare a boabelor etc.

Fungii filamentoși sau levuriformi au statut ubicuitar, fiind întâlniți în mod constant în toate mediile naturale (sol, aer, apă) de unde ajung și pe substraturile vegetale. Prezența micromiceților pe boabele de cereale reprezintă un risc potențial pentru calitatea acestora și pentru sănătatea organismelor care le-ar putea consuma procesate sub diverse forme.

Aprecierea calității unui produs agroalimentar, prin investigații microbiologice, indiferent de natura și destinația acestuia, se bazează pe evaluarea încărcăturii microbiene a probelor prelevate în acest scop, izolarea și identificarea microorganismelor patogene sau a celor cu semnificație patogenă precum și pe identificarea toxinelor de natură microbiană.

Capitolul I. Dezvoltarea microorganismelor într-un produs agroalimentar

Dezvoltarea microorganismelor într-un produs agroalimentar ține de o serie de factori, dintre care în continuare vor fi descriși cei mai reprezentativi.

I.1.Condiții care caracterizează produsul agroalimentar

Factorii care caracterizează produsul agroalimentar și condiționează multiplicarea microorganismelor sunt reprezentați de: compoziția chimică a produsului agroalimentar, structura produsului agroalimentar , valoarea activității apei din produs, pH-ul și potențialul oxidoreducător al acestuia etc.

Acțiunea microorganismelor într-un produs agroalimentar poate să fie variabilă și să influențeze caracteristicile fizico-chimice, organoleptice și nutriționale ale acestuia. Activitatea microbiană se manifestă, de cele mai multe ori, în legătură cu reacțiile enzimatice. Proliferearea microbiană duce la modificări nedorite, defavorabile pentru produsul agroalimentar alterat (miros, gust, aspect, culoare, textură, valoare alimentară, valoare igienică). Modificările care apar depind de compoziția produsului și în special de conținutul în apă, glucide, proteine, eventual lipide (Tofan C., 2004). Pentru a favoriza dezvoltarea microbiană, substanțele nutritive din compoziția chimică a unui produs agroalimentar trebuie să fie prezente într-o formă utilizabilă sau degradabilă, motiv pentru care, unele substraturi agroalimentare sunt fie rezistente la atacul microorganismelor fie vor fi degradate doar de acele microorganisme care posedă enzime specifice. Astfel, stadiile inițiale de degradare a multor produse vegetale, pot fi efectuate numai de microorganisme care sintetizează enzime numite celulaze și pectiunaze, care depolimerizează polizaharidele din peretele celulelor și eliberează componente cu masă moleculară mică, metabolizabile și de către microorganisme care posedă un echipament enzimatic mai sărac. Majoritatea microorganismelor de alterare nu sunt pretențioase din punct de vedere nutritiv.

Sub acțiunea microorganismelor și a fenomenelor enzimatice proprii, produsul agroalimentar își modifică compoziția chimică și consecutiv structura, devenind astfel accesibil pentru o varietate de microorganisme. Structura anatomică influențează activitatea microbiană, ca urmare a menținerii la distanță a microorganismelor de nutrienții accesibili din produs. De exemplu, boabele cerealelor prezintă un înveliș celulozic protector care nu poate fi degradat decât de microorganismele celulozolitice. Prin absorbția de apă, acestea suferă fenomenul de mucegăire, deoarece mucegaiurile găsesc condiții favorizante (Dan V., 2001).

Pe parcursul procesului de degradare a alimentului, cerințele nutritive ale unui grup de microorganisme, se pot schimba în raport cu condițiile întâlnite în produs. Astfel unele microorganisme devin mai pretențioase din punct de vedere nutritiv când întâlnesc în aliment temperaturi ridicate sau valori mai mici ale activității apei.

Activitatea apei dintr-un produs agroalimentar reprezintă procentul de apă liberă din produs, care influențează multiplicarea și activitatea metabolică a microorganismelor, dar și rezistența lor față de diverși factori cum sunt căldura, pH-ul, radiațiile. La o anumită valoare minimă a activității apei, activitatea metabolică a microorganismelor încetează, nivelul valorii minime fiind diferit de la o specie microbiană la alta.

Supraviețuirea și înmulțirea microorganismelor sunt fenomene posibile doar în cadrul unor anumite valori de pH. Regimurile convenabile de pH sunt diferite pentru diverse genuri și specii de microorganisme. Într-un grad oarecare, celula microbiană are capacitatea de a-și regla pH-ul intern. Acest fapt explică limitele destul de largi de pH în care unele microorganisme trăiesc și se multiplică, cum este și cazul mucegaiurilor sau drojdiilor. Modul de acțiune al pH-ului asupra dezvoltării microorganismelor într-un produs alimentar, este legat de mediul în care acesta se află, de permeabilitatea membranei celulare a microorganismelor și de activitatea lor metabolică. Anumite substanțe din mediul în care se află microorganismele se modifică prin echilibrul ionic, cum este cazul ionilor metalici. La un pH acid, ionii de magneziu formează complexe insolubile, iar la pH bazic, cei de zinc, de calciu și fier se complexează. Sub această formă, ionii, care sunt indispensabili formării coenzimelor, sunt greu de utilizat. Permeabilitatea membranei celulei microbiene este de asemenea afectată de variațiile concentrației ionilor de hidrogen și hidroxid, întrucât, într-un mediu acid, permeazele cationice se saturează în ioni de hidrogen, ceea ce limitează sau anulează transportul cationilor indispensabil, iar într-un mediu alcalin, ionii hidroxilici saturează membrana celulară microbiană, împiedicân transportul anionilor indispensabili. Reacțiile enzimatice au un optim de pH pentrru dezvoltare. Peste sau sub acest optim, cinetica este perturbată (Apostu S., 2006, vol.I).

Potențialul oxidoreducător al unui mediu poate să scționeze asupra sensului de deplasare a echilibrelor de reacție a metabolismului. Metabolismul unei celule microbiene cuprinde pe de o parte reacții de degradare a substratului nutritiv (reacții catabolice), eliberatoare de energie, iar pe de altă parte, reacții de sinteză a materiei vii proprii (reacții anabolice), consumatoare de energie. Aceste reacții se desfășoară pe baza echipamentului enzimatic celular, a cărui activitate este condiționată de anumite caracteristici fizico-chimice ale mediului în care se află, din care face parte și potențialul oxidoreducător. Microorganismele strict aerobe nu se pot dezvolta decât într-un mediu cu potențial oxidoreducător ridicat, în timp ce microorganismele strict anaerobe se pot dezvolta numai într-un mediu cu valori scăzute ale potențialului oxidoreducător.

I.2.Condiții care caracterizează mediul în care se găsește produsul agroalimentar

Condițiile care caracterizează mediul în care se găsește produsul agroalimentar sunt reprezentate de: temperatura de depozitare a produsului, umiditatea relativă a aerului, presiunea gazelor din spațiul de depozitare.

Fiecare specie microbiană se poate înmulți numai între anumite limite de temperatură, între ele situându-se temperatura opotimă de dezvoltare, adică temperatura la care raportul timp/generație este cel mai mic (Bara C., 2010). Pe baza temperaturilor minime, maxime și optime de înmulțire, microorganismele pot fi clasificate în cinci grupe principale: termofile, termotrofe, mezofile, psihotrofe, psihrofile (Apostu S., 2006, vol.I). Microorganismele psihrotrofe, care au temperatura otimă de înmulțire în intervalul 25-30, sunt cele mai răspândite în natură, ele având semnificația cea mai mare pentru alterarea produselor agroalimentare.

Umiditatea relativă a atmosferei în care se depozitează un produs agroalimentar (presiunea vaporilor de apă) are o foarte mare influență asupra dezvoltării microorganismelor aflate la suprafața produsului și în consecință, influențează durata de conservare a acestuia. Excesul de umiditate care se formează la suprafața unui produs agroalimentar poate avea două origini: vaporii din atmosferă sau apa din produs. Când presiunea vaporilor de apă din atmosferă este mai mare decât cea a produsului, umiditatea atmosferică va influența valoarea activității apei din aliment, astfel încât suprafața acestuia va absorbi o anumită cantitate de vapori apă, până când, presiunea vaporilor de apă de la suprafața alimentului va fi egală cu cea a vaporilor din aer. În acest fel, produsele a căror conservare se bazează în special pe conținutul redus de apă (valoare mică a activității apei) se vor altera începând cu straturile lor superficiale. Dacă gradul de umiditate nu este așa de mare, în straturile superficiale se vor dezvolta la început mucegaiurile, apoi treptat și unele bacterii. Dacă umiditatea atmosferică este mare, se creează de la început condiții favorabile dezvoltării bacteriilor în straturile superficiale ale produselor.

Presiunea și tipul gazelor din locul de depozitare a produselor agroalimentare influențează dezvoltarea microorganismelor. Microorganismele aerobe se vor dezvolta mai bine pe suprafața produselor depozitate într-o atmosferă cu presiunea parțială a oxigenului normală, iar microorganismele anaerobe în produse depozitate în condiții de anaerobioză.

I.3. Asociațiile microbiene din produsele agroalimentare

Pe lângă factorii intinseci sau extrinseci care condiționează multiplicarea microorganismelor într-un produs agroalimentar, dezvoltarea acestora este influențată de anumite atribute biologice ale fiecărei specii sau tulpini microbiene, care determină dominanța acesteia, în cadrul unor asociații microbiene.

Interrelațiile care pot apărea în condiții naturale între microorganismele care trăiesc în același mediu sau pe același produs agroalimentar sunt foarte complexe. Datorită proprietăților variate ale diverselor specii microbiene și intensității cu care decurg procesele lor metabolice, aceste relații au un rol important asupra vieții microorganismelor și indirect, asupra modificărilor pe care le suferă produsele alimentare.

Într-un anumit mediu, o specie sau o tulpină microbiană se înmulțește într-un anume mod, cu o rată caracteristică. Rata de înmulțire a unui microorganism reprezintă un factor implicit de influențare a altor microorganisme, numai în măsura în care ea se desfășoară în condiții optime, care însă nu sunt aceleași pentru toate grupele și speciile de microorganisme. Gradul de extindere a înmulțirii unui microorganism este, în general, determinat de : lungimea fazei de lag, raportul timp/generație și numărul total de celule rezultat la sfârșitul perioadei de înmulțire. Aceste condiții depind atât de proprietățile biochimice ale microorganismuluyi, cât și de factori specifici, prezenți incidental, fapt care explică diferențele în privința caracteristicilor de creștere, chiar la tulpini aparținând aceleeași specii. Acumularea de produși metabolici limitează, de obicei, multiplicarea speciei care i-a sintetizat. Dacă acești produși metabolici limitativi pot fi folosiți ca substrat nutritiv de către alte specii microbiene, acestea pot forma împreună cu primele asociații sau succesiuni, frecvent întâlnite în produsele agroalimentare. Alteori, produșii metabolici rezultați din multiplicarea unei specii microbiene, inhibă total sau parțial dezvoltarea altora. Pe perioada de timp în care microorganismele rămân active metabolic, ele continuă să interacționeze, ceea ce conferă dominanței microbiene dintr-un produs, un caracter dinamic. La început, asociația microbiană poate fi dominată de un grup sau o specie de microorganisme, după care, locul acestuia este luat de către altul. Interacțiunile dintre microorganismele care se dezvoltă într-un produs agroalimentar pot fi sinergice (când își favorizează reciproc dezvoltarea) sau antagonice (când dezvoltarea unuia inhibă dezvoltarea celuilalt).

Simbioza reprezintă o interacțiune între specii microbiene diferite, care se caracterizează prin stimularea reciprocă a dezvoltării lor. Fenomenul apare când un microorganism cauzează modificări ale condițiilor de creștere din mediul în care se găsește, modificări care sunt favorabile altor specii sau grupe de microorganisme. De exemplu, unele microorganisme pot descompune diverși hidrați de carbon sau proteine aflate în compoziția chimică a unor produse agroalimentare, care în forma descompusă, simplificată,vor fi utilizați de alte microorganisme incapabile să le producă ele însele.

În urma acțiunii lor metabolice, diverse specii de microorganisme sau grupe microbiene, elaborează diferiți aminoacizi și în acest fel contribuie la scăderea pH-ului în produsele agroalimentare, iar alte microorganisme, din contră, ca urmare a activității lor proteolitice dau naștere unor substanțe alcaline, mărind pH-ul produsului agroalimentar. Ca o consecință a acestor fenomene, s-a constatat că schimbările de pH produse de o specie sau o grupă microbiană pot favoriza înmulțirea altor microorganisme.

Un alt proces care poate avea loc într-un produs agroalimentar, este acela în cadrul căruia, substanțele inhibitoare pentru o specie microbiană, prezente la un moment dat în produs, pot fi metabolizate (descompuse) de altă specie, creându-se în acest fel condiții favorabile pentru dezvoltarea primei specii.

În urma activității metabolice a microorganismelor asupra unui substrat alimentar, se eliberează apă, care mărește valoarea activității apei din produs și în acest fel, microorganismele xerotolerante, înmulțindu-se, creează condiții de multiplicare ulterioară a microorganismelor mai puțin tolerante.

Procesele antagonice sunt fenomene aproape obișnuite în cadrul microbiologiei produselor agroalimentare. Ele constau în inhibarea directă a unui microorganism de către un altul, concurența sau competiția pentru spațiu sau substanțele nutritive și parazitismul microbian. Folosirea competitivă a substanțelor nutritive este unul dintre mecanismele cele mai frecvente ale antagonismului microbian. Antagonismul produs prin acest mecanism are la bază diferențele între ratele de înmulțire sau între activitățile metabolice ale diferitelor specii sau grupe microbiene. Aceste diferențe fac ca, la un moment dat, multe specii sau grupe microbiene să epuizeze substanțele nutritive din alimentul dat, substanțe care sunt strict necesare, critice, pentru dezvoltarea altor specii sau grupe de microorganisme, care în acest fel nu se vor dezvolta (Apostu S., 2006, vol.I).

Epuizarea oxigenului dintr-un produs agroalimentar sau acumularea dioxidului de carbon în substrat favorizează dezvoltarea anaerobilor facultativi sau a microorganismelor strict anaerobe.

Unele microorganisme aerobe, prin scăderea presiunii oxigenului, creează condiții pentru dezvoltarea microorganismelor anaerobe. Microorganismele anaerobe scad potențialul oxidoreducător al produselor agroalimentare mult mai mult decât cele aerobe, iar uneori inhibă dezvoltarea microorganismelor aerobe.

Numeroase microorganisme produc metaboliți cu acțiune antimicrobiană. Unii dintre aceștia au o structură chimică simplă și o activitate nespecifică, cum sunt ionuu de hidrogen, dioxidul de carbon, apa oxigenată, etanolul, diferiți acizi organici și inhibă, în general, microflora de putrefacție; alți metaboliți sintetizați de unele microorganisme, cum sunt antibioticele, au o structură chimică complexă și o acțiune inhibitoare specifică.

Profilul microbian al unui produs agroalimentar se modifică continuu, în sensul că, o asociație microbiană îi urmează alteia. Înlocuirea unei asociații microbiene cu alta reprezintă succesiunea microbiană și este determinată de interacțiunea dintre factorii care țin de produsul agroalimentar, factorii de mediu și factorii care țin de microorganisme. Alterarea produsului implică o succesiune de microorganisme.

Capitolul II. Factori care influențează pe durata depozitării boabelor de grâu contaminarea acestora cu mucegaiuri

Păstrarea optimă a boabelor de grâu are loc în condiții de control a factorilor de mediu, a umidității și temperaturii din masa de cereale, acțiuni prin care se dirijează în sens pozitiv procesele biochimice ale masei de cereale, se împiedică dezvoltarea microorganismelor și se prelungește astfel vitalitatea acesora ([NUME_REDACTAT]., Duda M., Timar A., 2012).

Umiditatea boabelor de grâu

Microorganismele au nevoie de apă pentru a se dezvolta și multiplica, motiv pentru care, boabele de grâu care au în compoziția lor chimică o cantitate redusă de apă, nu vor constitui un mediu propice pentru evoluția microorganismelor. Cu toate acestea, unele tipuri de microorganisme, cum sunt mucegaiurile xerotolerante, se pot dezvolta la o umiditate relativă a aerului de 65% și la o valoare a temperaturii de 25, condiții în care boabele de grâu au o cantitate de apă de 14,5-15,5%.

Conținutul în apă al substratului nutritiv are, în consecință, o influență hotărâtoare asupra creșterii micetelor toxinogene saprofite și asupra eliberării micotoxinelor (Novoselev M., Ursea D., Bitănescu L., 1990).

Temperatura de depozitare a boabelor de grâu

Cea mai mare parte a microorganismelor care contaminează boabele de grâu fac parte din categoria celor mezofile și din acest considerent, pentru a realiza o conservare convenabilă a acestora, este necesar ca temperatura din spațiul de depozitare să fie cât mai mică cu putință. Pe de altă parte însă, majoritatea mucegaiurilor care se dezvoltă pe boabele de grâu pe durata depozitării acestora, sunt de tip psihotrof și datorită acestui fapt, se multiplică și își exercită efectele negative la temperaturile de depozitare obișnuite, adică în intervalul 20-25. Cu toate acestea, însă, există diferențe între diversele specii de mucegaiuri care produc contaminarea boabelor, privind temperatura optimă de dezvoltare. Astfel, mucegaiurile din genul Penicillium generează micotoxine la o temperatură mai mică sau egală cu 25, în timp ce, mucegaiurile din genul Aspergillus sintetizează micotoxine la 30 sau chiar mai mult.

Temperatura de acțiune a mucegaiurilor depinde, însă și de umiditatea boabelor de grâu, în sensul că, cu cât umiditatea boabelor este mai crescută, cu atât intervalul de temperatură în care se pot înmulți aceste microorganisme este mai extins.

Aerarea din spațiul de depozitare a boabelor de grâu

Cele mai multe tipuri de mucegaiuri care contaminează cerealele sunt de tip aerob și astfel, atunci când concentrația de oxigen din aerul spațiului unde sunt depozitate boabele de grâu, scade, multiplicarea germenilor este inhibată. În această situație, vor fi active mucegaiurile de tip anaerob, bineînțeles, cu condiția ca temperatura și umiditatea din depozit să fie convenabile pentru aceste microorganisme. Consecințaa acțiunii mucegaiurilor de tip anaerob este scăderea activității respiratorii a boabelor de grâu, fapt care duce la apariția unor procese de fermentare anaerobă a glucidelor, inițiate de către drojdii, care pot coexista în aceste condiții cu mucegaiurile. În urma acestor procese se formează alcooli, care inactivează parțial sau total embrionul din boabele de grâu.

Mecanismul prin care are loc acțiunea mucegaiurilor în boabele de grâu pe perioada depozitării lor este următorul: în perioada inițială a depozitării, ca urmare a prezenței oxigenului în aerul spațiilor dintre boabe, este favorizată dezvoltarea microorganismelor aerobe; ca urmare, procesele de respirație a boabelor fiind active, oxigenul este consumat și crește concentrația dioxidului de carbon eliberat în aerul din depozit; pe măsura creșterii concentrației dioxidului de carbon, boabele de grâu trec de la o respirație aerobă, la una anaerobă și numărul microorganismelor aerobe scade; la concentrații de 5-10% dioxid de carbon în aer, sunt inhibate mucegaiuri ca cele din genurile Penicillium și Aspergillus.

În depozitele deschise acest fenomen de conservare nu are loc, întrucât oxigenul este totdeauna accesibil, cel puțin în straturile superioare, ceea ce face posibilă multiplicarea mucegaiurilor cu producere de căldură, umiditate și o intensificare a activității microbiene (Apostu S., 2006).

Structura țesuturilor de acoperire a boabelor de grâu

Structura țesuturilor de acoperire a boabelor de grâu nu este uniformă pe întreaga lor suprafață, asfel că, în regiunea embrionului ele sunt mai subțiri și ca urmare, pot fi perforate mult mai ușor de mucegaiuri.

Pătrunderea dificilă a microorganismelor, mai ales a celor saprofite, în bob, se explică prin rezistența mecanică a învelișului și prin conținutul în substanțe bactericide (Moțoc D., 1964).

Integritatea boabelor de grâu

Boabele de grâu sparte sau zdrobite în cursul recoltării ori cu ocazia diferitelor manipulări sunt cele mai expuse atacului mucegaiurilor, întrucât suprafața bobului nefiind intactă, ci lipsită de țesutul de acoperire, respiră mai intens și absoarbe cu o mai mare ușurință apa, astfel încât boabele afectate vor avea un proces mai mare de umiditate.

Puritatea masei de boabe de grâu

În situația în care lanurile de grâu care s-au recoltat au fost invadate de alte tipuri de vegetație sau în cazul în care recoltarea boabelor s-a făcut necorespunzător, pe suprafața boabelor se depun diverse impurități, fapt care facilitează atacul mucegaiurilor.

Impuritățile de natură minerală sunt pietricelele, nisipul, resturi de pământ, sticlă, corpuri metalice. Impuritățile de natură organică sunt boabele altor culturi aflate întâmplător în masa culturii de bază, boabe cu defecte ale cerealei de bază (grâul), semințe de buruieni, pleavă, paie, resturi de coceni, frunze (Hodișan N., Timar A.,2010).

[NUME_REDACTAT] are un efect diferit asupra mucegaiurilor. În această privință comportarea sporilor de mucegai, care se răspândesc pe calea aerului și prin vânt, este hotărâtoare. Sporii cu perete celular subțire, de culoare deschisă, își pot pierde în prezența luminii capacitatea de germinare, în timp ce sporii cu perete gros, de culoare mai închisă, sunt, în general, mai rezistenți (Csep N., 2008).

Capitolul III. Încingerea boabelor de grâu pe perioada de depozitare sub acțiunea mucegaiurilor

Încingerea boabelor de grâu este un fenomen nedorit care survine în condițiile depozitării acestora necorespunzător. Procesul se manifestă prin creșterea temperaturii masei de boabe depozitate, datorită unei activități enzimatice intense inițiată de microorganismele care contaminează cerealele pe durata depozitării lor. Acest fenomen are drept consecință eliberarea de căldură în masa de boabe, ca urmare a intensificării proceselor fiziologice ale boabelor de grâu contaminate.

Activitatea fiziologică a masei boabelor de grâu este influențată de diverși factori, printre care se numără: gradul de maturare al boabelor la recoltare, gradul de puritate al boabelor și condițiile de depozitare. Astfel, boabele insuficient maturate, proaspăt recoltate sunt mult mai expuse încingerii decât cele recoltate într-un stadiu avansat de maturare, întrucât au un procent crescut de umiditate, o respirație mai intensă și o microfloră epifită mai activă.

Imediat după recoltare, boabele de grâu nu sunt complet mature și facultatea germinativă este redusă. După recoltare, urmează procesul de maturare care completează coacerea. Pe măsura coacerii boabelor, acestea devin mai uscate întrucât conținutul lor de apă scade și are loc o acumulare a substanțelor. Asfel, crește conținutul de proteine insolubile, de tipul gluteninei și gliadinei, crește conținutul de amidon și scade cantitatea de celuloză. Aceste modificări biochimice care au loc la nivelul bobului, favorizează dezvoltarea mucegaiurilor în boabe (Purcărea C., 2008).

Fenomenul încingerii poate avea loc în două moduri: fie sub forma unor focare fie sub forma încingerii în straturi (Apostu S., 2006). Încingerea în focare este consecința prezenței unei mase de boabe neuniformă, în sensul că, în anumite locuri ale acesteia există boabe cu o umiditate mai ridicată și care au la suprafațî un număr mai mare de corpi străini higroscopici. Încingerea în straturi se datorează diferenței dintre temperatura masei boabelor de grâu din depozit și temperatura mediului din spațiul de depozitare, fapt care generează formarea apei de condens, respectiv a unor straturi de boabe cu o umiditate crescută, localizate inițial în straturile superficiale ale masei de cereale, după care, fenomenul migrează ulterior în staturile mai reci,din interiorul masei, unde se crează condiții favorabile dezvoltării microorganismelor și intensificării proceselor fiziologice din boabe.

Principalul rol în producerea fenomenului de încincere a boabelor de grâu depozitate necorespunzător revine mucegaiurilor, care pe perioada multiplicării lor utilizează substanțele glucidice din boabele de grâu, prin descompunerea cărora produc dioxid de carbon și apă, cu eliberarea unei cantități semnificative de căldură. Dezvoltarea mucegaiurilor în masa boabelor de grâu încinse, comparativ cu a altor tipuri de microorganisme cum sunt bacteriile sau levurile, este favorizată de capacitatea lor de a se multiplica în substrate cu umiditate mai redusă, de proprietatea lor de a se dezvolta la o temperatură optimă care coincide cu temperatura de depozitare a boabelor de cereale, de posibilitatea lor de a se dezvolta în condiții de aerobioză, de faptul că dețin echipamente enzimatice bogate care le permit să acționeze și asupra țesuturilor de protecție ale boabelor de grâu, etc.

Fenomenul de încingere evoluează sub forma mai multor etape consecutive. Inițial, se constată o creștere a numărului de mucegaiuri și bacterii din masa de boabe, după care procesul de încingere se dezvoltă și se trece la faza a doua, caracterizată printr-o creștere a temperaturii masei la 25-40, care facilitează dezvoltarea intensă, în continuare, a mucegaiurilor dar și a altor grupe de microorganisme cum sunt actinomicetele și microccocii. Fazei de dezvoltare îi urmează faza de vârf a încingerii, când temperatura începe să urce față de cea din etapa anterioară, ajungând în finalul acestei etape la valori de 55-65, la care rămân active mucegaiurile termofile, ca unele specii de Aspergillus sau anumite specii de bacterii termotolerante. Ultima etapă a procesului de încingere se numește etapa finală, care se caracterizează prin reducerea în continuare a numărului de microorganisme, ca urmare a temperaturilor înalte la care au fost expuse în etapa anterioară, precum și datorită scăderii umidității boabelor încinse.

Capitolul IV. Consecințele multiplicării mucegaiurilor asupra calității boabelor de grâu contaminate în timpul depozitării

Modificări ale indicilor de prospețime ale boabelor

Boabele de grâu supuse acțiunii mucegaiurilor în timpul depozitării, suferă alterări calitative în ceea ce privește : aspectul, culoarea, mirosul.

Aspectul boabelor de grâu contaminate cu mucegaiuri pe durata depozitării se modifică, în sensul că, suprafața lor devine rugoasă, își pierd luciul sau își modifică forma caracteristică.

Culoarea boabelor alterate se modifică treptat; inițial se formează pete de diverse culori, care ulterior, în cazul în care fenomenul de încingere este avansat, se înnegresc și apar carbonizate.

Mirosul boabelor atacate de mucegaiuri este o altă consecință a alterării, el fiind caracteristic, de mucegai și nu dispare după aerarea boabelor.

Modificări cantitative ale masei de boabe de grâu

Ca urmarea a consumului de către mucegaiurile dezvoltate în boabele de grâu, a substanțelor nutritive ale acestora, mai ales în situația unei depozitări de lungă durată, se constată pierderi în greutate ale boabelor.

Modificări ale proprietăților tehnologice ale boabelor de grâu

În funcție de gradul de încingere, boabele de grâu contaminate cu mucegaiuri suferă diverse modificări. Asfel, dacă inițial, ele își pierd culoarea, luciul și capacitatea de germinate, în stadiile avansate ale procesului, boabele ajung să-și piardă toate calitățile care le fac utilizabile (scade cantitativ și calitativ glutenul, embrionul boabelor este distrus.

Prezența micotoxinelor produse în boabele de grâu mucegăite

Micotoxinele generate de mucegaiuri din genul [NUME_REDACTAT] cele mai importante produse de Penicillium sunt reprezentate de: ochratoxina, citrioviridină, citrină, acid ciclopiazonic, patulină, roquefortină C.

Ochratoxina A este cea mai importantă specie de toxină generată de specia Penicillium verucosum, în cantități mari, iar în cantitate mai redusă de către alte specii ale genului, ca: Penicillium commune, Penicillium veridicatum, Penicillium palitans.

Pe lângă mucegaiurile din genul Penicillium, ochratoxina A mai poate fi sintetizată și de alte specii de fungi, ca de exemplu: Aspergillus ochraceus, Aspergillus alliaceus.

Micotoxinele generate de mucegaiuri din genul [NUME_REDACTAT] sintetizate de diverse specii de mucegaiuri din genul Aspergillus sunt reprezentate de aflatoxine. Se cunosc mai multe tipuri de aflatoxine: aflatoxina B1, aflatoxina B2, aflatoxina G1, aflatoxina G2.

Capitolul V. Fusariozele grâului

Bolile cauzate de mucegaiuri la grâu, numite fusarioze, reprezintă o categorie de îmbolnăviri datorate contaminării cu miceți din genul Fusarium. Dintre aceștia, există câțiva care aparțin unor specii micotoxigene, cum ar fi: Fusarium equiseti, Fusarium graminearum (roseum), Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum.

Fusariozele apar frecvent la grâu, infectarea plantei în perioada de vegetație fiind favorizată de umiditatea ridicată sau precipitațiile frecvente din regiunea culturii. Fusarioza pe spice este de asemenea favorizată de vremea umedă cu precipitații dese și de temperaturile moderate după înspicare (Csep N., Csep A., 2003).

Mucegaiurile genului Fusarium sunt agenți fitopatogeni care cauzează modificări ale plantei cereale pe durata vegatației, care constau în: putrezirea plantelor abia ieșite din pământ, modificări ale tulpinii și spicului, formarea unor micelii constituite de spori de mucegai pe diverse organe ale plantei. În condițiile în care umiditatea relativă a aerului depășește 75%, mucegaiurile din genul Fusarium se pot dezvolta și pe tulpina plantei, care se îngălbenește și se acoperă deseori cu un start roz, pe care se formează conidiofori cu aspect de seceră, septați. Boabele plantei rămân mici, zbârcite și își pierd capacitatea de germinare.

Fusariozele grâului cauzează o scădere a recoltei de boabe, precum și o reducere semnificativă a calității nutritive și a proprietăților tehnologice ale acestora.

Fungii din genul Fusarium pot sintetiza în boabele de grâu pe care le contaminează diverse micotoxine care ulterior ajung în făina obținută prin recoltarea boabelor respective și care se folosește la obținerea pâinii sau a altor produse de panificație, prin consumul cărora de către om, generează îmbolnăviri grave. Cele mai importante tipuri de micotoxine produse de mucegaiurile genului Fusarium se numesc fusariotoxine, ele fiind reprezentate de: toxina-2, nivalenol, desoxinivalenol (vomitoxină), diacetoxinpenol, neosolaniol, diacetoxiscirpenol, zearalenona (Apostu S., 2006).

Unul dintre efectele nocive generate de fusariotoxine la om este imunotoxicitatea, care constă în supresia de către toxine a sistemului imun al organismului, ceea ce duce la creșterea sensibilității organismului uman față de bolile neoplazice și în stimularea unei funcții imune care produce tulburări autoimune. În practică, s-a constatat că imunotoxicitatea și imunomodulația apar chiar și după expunerea organismului la doze mici de fusariotoxine, având din acest motiv semnificația cea mai crescută asupra sănătății umane.

Unele tipuri de fusariotoxine, denumite fumosine, sintetizate de unele specii de Fusarium, mai cu seamă de specia Fusarium moniliforme, își desfășoară acțiunea asupra organismului uman, afectând metabolismul sfingolipidic. Se cunoaște faptul că prin metabolizarea sfingosinei rezultă ceramidele, compuși care reglează sinteza AND-ului. Fumosina B1, cea mai importantă dintre fumonisine, se absoarbe la nivelul tubului digestiv al omului și interferează sinteza ceramidei, fapt care explică proprietățile cancerigene ale toxinei. Fumosinele sunt deseori implicate în îmbolnăviri ale omului cu aspect de toxiinfecții alimentare, apărute în urma consumului de produse făcute din cereale contaminate și inhibă asimilarea vitaminelor de către organismul uman.

Alte tipuri de fusariotoxine, cum sunt toxina-2 și desoxinivalenolul, atunci când sunt eliberate în organism, afectează diviziunea celulară a limfocitelor B și T, fapt care mărește sensibilitatea acestuia la infecțiile generate de diverse microorganisme (Candida, Listeria, Salmonella, Mycobacterium, Cryptococcus).

Capitolul VI. Surse de contaminare a boabelor de grâu cu microorganisme

Microorganismele prezente la suprafața și în interiorul boabelor de grâu, sunt reprezentate de 3 grupe majore de microorganisme: microflora din rizosferă, microflora epifită a plantei cereale și microflora provenită de pe obiectele de recoltare, transport și depozitare.

Microflora din rizosferă este alcătuită din microorganismele prezente în solul în care este ancorată planta cereală de grâu. Cea mai mare parte a microorganismelor prezente pe boabele de cereale provin din sol. În timpul recoltării cerealelor, la separarea lor de spic, are loc o impurificare a boabelor cu microorganisme. Praful care se ridică la cules și treieriș și ajunge la suprafața boabelor de grâu provine din sol (Bara C., 2005).

Microflora epifită este reprezentată de microorganismele situate pe tulpina, frunzele și florile plantei de grâu. Cea mai mare parte a lor au originea în microflora rizosferei, de unde, în perioada de vegetație a plantei, trec pe părțile vegetative ale acesteia, unde continuă să se multiplice lent și rezistă timp îndelungat. O altă parte a microorganismelor epifite ajung pe planta de grâu prin intermediul insectelor, curenților de aer sau prin contacte ocazionale cu diverse viețuitoare sau obiecte. Microorganismele care fac parte din microflora epifită, în generale, nu sunt pretențioase din punct de vedere nutritiv și sunt adaptate să supraviețuiască chiar și în condițiile unor rezerve reduse de hrană, secretate în mod obișnuit de țesuturile de la suprafața plantelor. Microorganismele din flora epifită trec de pe suprafața plantei pe cea a boabelor, mai ales în perioada coacerii, când se desfac învelișurile care le acoperă. Ele sunt reprezentate mai ales de mucegaiuri și bacterii nesporogene. Boabele de grâu în formare au o umiditate ridicată, iar pe suprafața lor ajung prin fenomenul de exosmoză, la suprafața lor, substanțe nutritive care constituie o sursă nutritivă pentru microorganisme.

Recoltarea plantelor de grâu, în perioada în care boabele au atins maturitatea deplină, constituie o sursă semnificativă de contaminare a acestora, întrucât, pe parcursul recoltării, praful antrenat de la nivelul solului, prin manevrele efectuate în această etapă, se depun pe suprafața boabelor proaspăt recoltate. Numărul de microorganisme ajunse pe boabe este variabil, în funcție de condițiile în care se face recoltarea, cantitatea de praf antrenată din sol, contactul direct al boabelor cu solul, caracteristicile morfologice ale boabelor (boabele cu suprafața rugoasă, cu denivelări, zbârcite , rețin un număr mai mare de microorganisme). Transportul în condiții neigienice a boabelor de grâu recoltate reprezintă o altă sursă de contaminare a acestora cu microorganisme, mai ales cu microorganisme patogene pentru om și animale.

O altă modalitate de contaminare a boabelor de grâu o constituie depozitarea lor în spații neigienizate, în care au fost păstrate anterior alte boabe de cereale puternic infectate cu microorganisme sau cu diverse materiale contaminate.

Capitolul VII. Partea experimentală

VII.1.Scopul experimentului

Partea de cercetare a lucrării a avut ca scop: aprecierea cantitativă și calitativă a microorganismelor de natură fungică, care se dezvoltă la suprafața semințelor de grâu, pe durata depozitării acestora, în diverse condiții de mediu.

VII.2.Material experimental

Materialul experimental a fost reprezentat de 35 de probe de semințe de grâu prelevate din depozite, de la un număr de 5 producători de cereale, din județul Bihor, în anul 2013.

Probele au fost analizate în cadrul laboratorului de microbiologie al facultății.

VII.3.Condiții de efectuare a experimentului

Am realizat examenele microbiologice ale studiului experimental în condiții aseptice, cu materiale de laborator (instrumente, recipiente din sticlă, medii de cultură etc.) sterilizate și păstrate în condiții de conservare a calității lor. Pe durata desfășurării întregului experiment s-a recurs la întreaga diversitate a echipamentului de protecție (halat, mănuși, ochelari). Toate materialele contaminate (mănuși, sticlărie) au fost imersionate în recipienți cu soluție decontaminantă.

La prepararea mediilor de cultură, pentru dizolvarea ingredientelor, am folosit apă distilată, pentru a nu conține substanțe care să influențeze creșterea florei micotice sau să inhibe multiplicarea ei (cum ar fi de exemplu clorul). Utilizarea tehnicilor standardizate de analiză microbiologică presupune folosirea unor medii standardizate, care au aceeași compoziție chimică și se livrează fie sub forma componentelor de bază fie ca medii complete, dar ambele forme de comercializare sunt deshidratate și impun măsuri speciale de păstrare și utilizare. Din aceste considerente, flacoanele sau sticlele care conțin substanțele respective vor ermetizate, protejate de lumină, depozitate în spații răcoroase, uscate, la temperatura recomandată de producător.Ele se folosesc numai pe durata perioadei de valabilitate, iar după deschidere, se manipulează foarte atent, închizându-se rapid și cu mare atenție. Rehidratarea se face în condiții obișnuite cu apă distilată adusă la fierbere, în care se introduc treptat pulberile nutritive, amestecându-se continuu cu o lingură de lemn sau cu o baghetă de sticlă.

Germinarea formelor de rezistență și dezvoltarea aparatului micelian al fungilor sunt procese, în mod hotărâtor condiționate , de valoarea pH-ului pe care o are mediul de cultură proaspăt preparat, motiv pentru care, dacă e nevoie, după stabilirea acestuia cu ajutorul pH-metrului electronic, se face ajustarea pH- ului mediului folosind fie o soluție de Na OH fie o soluție de HCl.

Mediul fierbinte și cu pH-ul ajustat se distribuie în recipienți (eprubete, flacoane) care vor avea volumul de 2-3 ori mai mare decât cantitatea repartizată, evitânduse în acest mod contactul mediului cu dopul recipientului în timpul autoclavării. Mediile de cultură care nu se folosesc imediat se protejează împotriva luminii, radiației solare și a deshidratării (Bara C., 2005).

VII.4.Metode experimentale

Determinarea numărului total de fungi per gram produs

La baza acestei determinări a stat metoda diluțiilor seriate, care a constat în următoarele:

Din proba de analizat am recoltat cu o spatulă sterilă și am cântărit cu ajutorul balanței analitice 5 grame produs, pe care le-am trecut cantitativ într-un recipient conținând 45 ml ser fiziologic steril, obținând astfel o diluție de 1/10. Din această primă diluție, cu ajutorul unei pipete sterile, am pipetat un volum de 1ml suspensie barbotată în prealabil, pe care am descărcat-o într-o eprubetă ce conținea 9 ml ser fiziologic steril, obținând astfel, o diluție de 1/100. În mod analog, am obținut diluțiile 1/1000 ți 1/10000, pe care le-am folosit în experiment. Pentru fiecare diluție am însămânțat câte 2 cutii Petri, prin introducarea a câte 1 ml suspensie la 10 ml mediu topit și răcit la 45 oC. Am omogenizat conținutul cutiilor Petri însămânțate, imprimându-le mișcări de rotație în sensuri opuse, pe orizontală, până la înglobarea totală a inoculului în mediu. Am incubat plăcile la termostat pentru o durată de 5 zile, la temperatura constantă de 25 oC, perioadă după care am numărat coloniile de mucegaiuri dezvoltate în fiecare placă Petri. Am făcut media aritmetică pentru fiecare dilluție folosită în experiment, am aplicat factorul de diluție, iar rezultatele obținute le-am însumat și le-am raportat la numărul diluțiilor (Apostu S., Rotar M. A., 2009).

Examen microscopic direct între lamă și lamelă

Manipularea culturilor de fungi în vederea efectuării examenului microscopic, s-a efectuat în incintă de siguranță microbiologică (hotă verticală cu flux laminar) din dotarea laboratorului de microbiologie al facultății, prevăzută cu lampă UV, sub protecția becului de gaz Bunsen.

Elementele morfologice frecvent identificabile prin examen microscopic direct sunt: fragmentele hifale, fine, regulate, septate, ramificate dicotomic în unghi ascuțit (45).

Preparatul extemporaneu cu lactofenol și albastru de anilină a fost efectuat parcurgând următoarele etape:

– pe o lamă de sticlă curată, degresată, am depus cu ajutorul unei pipete sterile, o picătură de lactofenol-albastru de anilină

– am prelevat cu ajutorul unei anse microbiologice cu vârf ac, un fragment de dimensiuni milimetrice din colonia de examinat, etalând-o în picătura de lactofenol-albastru de anilină depusă pe lamă

– am acoperit lama de sticlă cu o lamelă sterilă, presând-o ușor și încălzind preparatul la flacără, câteva secunde, pentru a se obține un film cât mai fin

– am examinat preparatul la microscopul optic, folosind succesiv obiectivele 10, 20, 40, 100 x.

Examenul caracterelor culturale

Mediul de izolare convenabil pentru fungii care urmau să fie identificați a fost reprezentat de agarul Sabouraud cu cloramfenicol.

Pentru obținerea mediului Sabouraud cu cloramfenicol am folosit următoarele ingrediente :

– dextroză 40 g

– peptonă 10 g

– agar 20 g

– apă distilată 1000 ml

– cloramfenicol 50 mg

Am preparat mediul după cum urmează: am amestecat ingredientele, iar amestecul obținut l-am fiert până la dizolvarea acestora; am ajustat pH-ul mediului obținut la valoarea de 5,6; pentru inhibarea creșterii bacteriilor, am adăugat la mediul de cultură soluție de cloramfenicol, în cantitate de 0,05 mg/ml (soluția de cloramfenicol s-a obținut prin dizolvarea în 10 ml alcool de 95 oC, a 50 mg de cloramfenicol) ; am repartizat mediul în plăci Petri care s-au sterilizat prin autoclavare, la 121oC.

Pentru speciile genului Aspergillus, efectuarea subculturilor pe mediul agar Czapek-Dox a fost obligatorie, acesta fiind mediul de elecție pentru studiul caracterelor macroscopice și microscopice în vederea identificării speciei.

Compoziția mediului de cultură Czapek-Dox a fost următoarea:

– zaharoză 30 g

– nitrat de sodiu 2 g

– fosfat dipotasic 1 g

– sulfat de magneziu 0,5 g

– clorură de potasiu 0,5 g

– sulfat feros 0, 01 g

– agar 20 g

– apă distilată 1000 ml

Pentru a prepara mediul în vederea însămânțării fungilor, am amestecat ingrediantele și am supus amestecul obținut fierberii. Am ajustat pH-ul mediului la valoarea de 7,3, după care, am autoclavat amestecul timp de 15 minute la 121C. După răcirea amestecului la 50C, am turnat mediul în plăci Petri.

În cazul celorlalte genuri și specii identificate, pentru exprimarea plenară a caracterelor morfologice, am efectuat subculturi pe mediile cartof-dextroză-agar (PDA), pe mediu agar cu malț (MA) și pe mediul geloză-sânge.

Pentru prepararea mediului cu cartof s-au utilizat următoarele ingrediente:

– cartofi 200 g

– glucoză 20 g

– agar 20 g

– apă distilată 1000 ml.

Prepararea mediului s-a făcut în felul următor: s-au cântărit cartofii curățați, s-au spălat, s-au tăiat în cubulețe cu latura de 1-1,5 cm și s-au fiert într-un vas smălțuit, în 500 ml apă distilată; s-a filtrat extractul obținut după fierberea cartofilor prin vată și tifon; într-o cantitate de 500 ml apă distilată s-au adăugat 20 grame agar, iar amestecul s-a fiert pe o baie de apă, până când agarul s-a topit; s-a amestecat extractul de cartofi cu agarul topit, adăugând 20 g glucoză, agitând până la dizolvarea componentelor și s-a completat restul diferenței până la 1000 ml, cu apă distilată; s-a ajustat pH-ul la valoarea 6,5 prin adăugare de soluție de NaOH 10%; mediul astfel preparat s-a repartizat în plăci Petri care s-au sterilizat prin autoclavare, la 121oC.

Pentru obținerea mediului agar cu malț (extract) am utilizat două componente:

– extract de malț 20 g

– agar 20 g

– apă distilată 1000 ml

Pentru a prepara mediul, am încălzit extractul de malț în apa distilată, până la dizolvarea acestuia, după care am adăugat agarul și am fiert amestecul, până la topire. Am ajustat pH-ul mediului la valoarea de 6,5 cu o soluție de hidroxid de sodiu, după care am sterilizat amestecul timp de 20 de minute, prin autoclavare, la temperatura de 121oC. După răcirea amestecului, l-am repartizat în plăci Petri pe care le-am lăsat deschise, la temperatura camerei, pentru solidificare.

VII.5. Rezultate experimentale

În urma analizei globale a incidenței mucegaiurilor în probele de grâu supuse analizelor micologice, pe baza daterminărilor cantitative și calitative, am constatat că cea mai mare pondere din totalul probelor contaminate o prezintă diverse specii de mucegaiuri aparținând genului Penicillium (73%), urmat de specia Aspergillus fumigatus care a reprezentat din totalul probelor de grâu contaminate o proporție de 14% și de diverse specii de mucegaiuri din genul Fusarium prezente în procent de 7%, restul mucegaiurilor prezentând încărcături medii mult mai reduse: Aspergillus terreus 2,5%, Aspergillus clavatus 0,5%, alte specii de Aspergillus 1,5%, Mucor 1,5%.

Fig.nr.VII.1.Analiza globală a încărcăturii de mucegaiuri din probele de semințe de grâu analizate și incidența genurilor și speciilor identificate

Caracteristicile mucegaiurilor identificate ca aparținând genului Penicillium:

Din genul Penicillium, am identificat în probele de grâu contaminate cu mucegaiuri, 2 specii: Penicillium chrysogenum și Penicillium purpurogenum.

Identificarea caracterului de gen și specie am realizat-o pe baza caracteristicilor culturale ale coloniilor însămânțate pe mediile de cultură utilizate în experiment și pe baza caracterelor microscopice ale celulelor de mucegai evidențiate prin examen microscopic direct între lamă și lamelă al preparatului colorat cu lactofenol.

Examinarea coloniilor din genul Penicillium a urmărit: diametrul, culoarea (pe față și revers), aspectul și textura acestora, dacă au marginea albă sau nu, dacă prezintă șanțuri sau zbârcituri

Caractere culturale

a. Culoarea coloniilor

Variază foarte mult cu substratul, temperatura, vârsta, lumina, pH-ul, mediul etc. Ea poate fi de nuanțe și intensități diferite, variind de la alb, crem, bej, verzui, galben-verzui, albastru-verzui, brun deschis sau brun închis, galben, portocaliu, cărămiziu, violet, purpuriu, roșiatic etc.

Coloniile sunt constituite într-un miceliu „de bază” de obicei sumers sau lipsit de mediu și unul aerian mai mult sau mai puțin înalt și cu textură diferită (velutinoasă, pufoasă, pâsloasă, etc).

b. Conturul coloniilor

Poate fi circular sau neregulat cu marginea netedă complet, lobată sau neregulată, arahnoidă, etc. Coloniile pot fi plane, bombate, umbilicate sau umbonate, pot fi netede, încrețite sau cu șanțuri radiare mai mult sau mai puțin pronunțate (Buiuc D., Negruț M., 2008)

Unele tulpini au marginea de aceeași culoare cu restul coloniei sau pot avea o dungă mai mult sau mai puțin lată, de culoare albă sau gălbuie, mai alb în perioada de creștere intensă.

c. Aspectul sau textura coloniilor :

Velutinoase (catifelate);

Pufoase sau lânoase;

Funiculoase;

Fasciculare sau corenifirme.

La coloniile catifelate conidioforii pornesc în majoritate de pe miceliul de bază sau din cel de pe substrat, având o poziție mai mult sau mai puțin perpendicular pe acestea și o lungime aproape uniformă.

În general, coloniile de acest tip sunt mai puțin înalte.

La tipul pufos sau lânos miceliul aerian este mai bogat și constituit din filamente ce se întrețes mai strâns sau lax. De obicei se dezvoltă pe acest miceliu ca ramuri ale filamentelor. De obicei la acest tip există în timpul creșterii coloniei o margine albă sau gălbuie, de miceliu steril, care cu timpul dispare. Prezența ei se datorește faptului că conidioforii încep să se dezvolte de la centru spre margine. La acest tip coloniile sunt mai mult sau mai puțin înalte.

La tipul coloniilor funiculoase hifele miceliului aerian se adună cordoane sau pachete de diverse grosimi, care uneori se ridică oblic în sus, alteori se târăsc pe suprafața mediului. Conidioforii își iau originea din aceste pachete, dar se pot dezvolta și pe hifele izolate.

La tipul fasciculat sau coreniform conidioforii aderă între ei formând mici tufe sau coloane erecte de diferite înălțimi și grosimi, vizibile mai bine către marginea coloniilor și cu timpul pe toată suprafața.

d. Zona coloniilor

La cele mai multe specii suprafața coloniilor este uniformă, la altele însă dezvoltarea se face în zone concentrice mai mult sau mai puțin regulată, pe toată perioada de creștere; zonarea este uneori evidențiată numai în anumite condiții de cultivare ca spre exemplu în alternanțe de lumină și întuneric sau datorită consumului de anumite elemente nutritive de către filamentele de la marginea coloniilor, în plină creștere (datorită consumului de anumite elemente nutritive de către filamentele de la marginea coloniilor, în plină creștere) sau datorită acumulării unor metaboliți toxici care le inhibă sporularea.

Fig nr. VII.2.Aspectul unor colonii de Penicillium chrysogenum avers pe agar Sabouraud cu cloramfenicol

Fig nr.VII.3.Aspectul unor colonii de Penicillium chrysogenum revers pe agar Sabouraud cu

cloramfenicol

Fig nr.VII.4. Aspectul unei colonii de Penicillium purpurogenum avers pe agar cu extract de malț

Fig nr.VII.5. Aspectul unei colonii de Penicillium purpurogenum revers pe agar cu extract de malț

Caracterele microscopice

Am făcut observații pe baza imaginilor microscopice, pentru a determina forma capătului conidian, în ce secțiune se încadrează specia, dacă are scleroți sau peritecii.

Conidioforii pot fi de diferite tipuri: unii sunt lungi depășind 2-3 mm, alții dimpotrivă sunt foarte scurți (25-50µ); unii iau naștere din filamentele miceliului de bază, alții din cele ale miceliului aerian; unii sunt netezi, alții rugoși total sau parțial; unii sunt simpli, alții ramificați; se dezvoltă singuri sau în tufe sau coremii. Speciile genului Penicillium sunt lipsite de „celula picior” de la locul de pornire al conodioforilor.

Cel mai important caracter al speciilor de Penicillium îl constituie structura de la capătul conidioforilor care împreună cu lanțurile de conidii alcătuiesc capătul conidian (pensula sau peniciliul).

Sterigmele (fialide sau celule conidiogene) se dezvoltă câte 3-10 sau mai multe în verticil, fie pe conidiofor fie pe metule. Sunt de lungimi și forme diferite (lanceolate, cilindrice, cu vârful îngust tubular sau mai mult sau mai puțin umflat, indicând modul de formare a coloniilor).

Metulele se dezvoltă la capătul conidioforului sau al ramurilor acestuia, în verticil de câte 3-5. Pe fiecare metulă se dezvoltă verticilele de sterigme, de aceea sunt mai late decât acestea și de lungimi variate.

Sub etajul metulelor, la speciile asimetrice ca și la secția Polyverticilată, se găsesc 1-2 ramuri (sau mai multe) fie numai pe o latură a conidioforului (în primul caz) sau pe ambele laturi (în cazul al 2-lea).

Conidiile iau naștere la capătul sterigmelor separându-se de acestea printr-un perete. După ce atins mărimea normală a speciei, sub prima conidie apare un nou perete și separă a 2-a conidie. Procesul de formare se continuă până ce se dezvoltă un lanț mai mult sau mai puțin lung de conidii, cea mai tânără fiind la baza lanțului (dezvoltare acropetală). Forma conidiilor variază cu specia, în general fiind globulare sau subglobulare, cilindrice, eliptice, ovale. Dimensiunile variază între 2 și 10 µ. Forma și dimensiunile variază și cu vârsta coloniilor. Ele pot fi netede sau cu achinulații. La unele specii, între conidii se observă câte o mică punte denumită conectiv sau disjunctor.

Capetele conidiene (peniciliul) sunt alcătuite din metule, sterigme și lanțurile conidiilor care după direcția pe care o iau dau forma acestora de pensulă, de mătură, de coloană mai mult sau mai puțin uniformă sau ciufulită.

Prezența scleroților constituie un caracter de diferențiere între specii. Se întâlnesc de regulă la speciile incluse în primele 3 secții, pentru unele specii fiind caracteristice, pentru altele ocazionale, apărând uneori în anumite condiții. Scleroții sunt alcătuiți dintr-un țesut pseudoparenchimatos și ale cărui celule sunt separate prin pereți groși. Dimensiunile și mai ales culoarea variază cu specia.

Cleistoteciile (periteciile) se întâlnesc de asemenea la speciile din primele 3 secții, fiind caracteristice pentru unele specii sau serii de specii. Se cunosc două tipuri de peritecii: unele care se dezvoltă ca o masă de celule cu pereții groși asemenea acleroților, dar în interiorul lor se diferențiază ascele cu ascosporii ca la membrii seriei Carpentales, altele se diferențiază printr-o rețea de hife specializate, înconjurate de un strat protector.

Ascele pot fi globuloase, hialine și conțin câte 8 ascospori. Aceștia sunt ovali sau eliptici, hialini, netezi sau achinulați cu 2 creste ecuatoriale.

Fig.nr.VII.6.Aspect de microscopie directă: Penicillium chrysogenum – preparat microscopic între lamă și lamelă, colorație lactofenol, obiectiv 100x

Fig.nr.7.Aspect de microscopie directă: Penicillium purpurogenum – preparat microscopic între lamă și lamelă, colorație albastru- lactofenol, obiectiv 100x

Caracteristicile mucegaiurilor identificate ca aparținând genului Aspergillus:

Am constatat că dintre speciile genului Aspergillus care au contaminat probele de grâu, cea care predomină este Aspergillus fumigatus. Alte specii de mucegaiuri din genul Aspergillus pe care le-am identificat în probele recoltate și care s-au dezvoltat într-un număr mai redus au fost: Aspergillus terreus, Aspergillus clavatus.

Caracterele culturale

Elementele de identificare ale coloniilor speciilor de Aspergillus de care am ținut seama în experiment au fost:

– culoarea miceliului aerian care include filamentele miceliului vegetativ, capetele conidiene, cleistoteciile, scleroții și alte structuri morfologice care datorită abundenței lor pot imprima culoarea caracteristică speciei

– pigmentația miceliului bazal sau submers, care se observă pe rezervorul coloniei

– marginea coloniilor poate constitui uneori un element de diferențiere între specii sau de recunoaștere a unor specii; la multe specii marginea este bine delimitată sau difuză, poate fi netedă sau lobară, de aceeași grosime cu restul coloniei sau mult mai subțire, este submersă sau aeriană

– forma coloniilor variază de la circulară la neregulată sau stelată, bombată, umbilicată sau umbonată, cu suprafața netedă, cu șanțuri radiale sau încrețită neregulat, caractere ce pot varia cu: substratul, temperatura sau alți factori de mediu. Astfel, unele culturi pot fi catifelate sau pufoase, pâsloase sau lânoase ca vata, sau grăunțoase sub formă de tufe mici, aspect de crustă.

Fig.nr.VII.8. Aspectul unei colonii de Aspergillus fumigatus dezvoltată pe agar Sabouraud cu cloramfenicol

Fig.nr.VII.9. Aspectul unei colonii de Aspergillus fumigatus dezvoltată pe geloză-sânge

Fig.nr.VII.10. Aspectul unor colonii de Aspergillus terreus dezvoltate pe agar [NUME_REDACTAT].nr. VII.11.Aspectul cultural al unei colonii de Aspergillus terreus dezvoltată pe mediul agar Sabouraud cu cloramfenicol, la 2 zile de la inoculare pe mediu

Fig.nr.VII.12. Aspectul cultural al unor colonii de Aspergillus terreus dezvoltate pe mediul agar Sabouraud cu cloramfenicol, la 4 zile de la inoculare pe mediu

Fig.nr. VII.13.Aspectul unei colonii de Aspergillus clavatus dezvoltată pe agar Sabouraud cu cloramfenicol

Caracterele microscopice

La microscopul optic, pe imaginile obținute din culturi, a putut fi observat aparatul conidian alcătuit din conidiofor care își are originea fie din filamentele miceliului de bază, având drept punct de plecare o celulă cu pereții îngroșați denumită celulă picior, fie ca ramuri laterale ale filamentului miceliului aerian. Conidioforii apar microscopic constituiți dintr-un singur ax drept, erect sau sârmos, cu peretele subțire sau puțin îngroșat, neted, mai mult sau mai puțin rugos sau încrustat cu cristale de pigmenți, colorat în nuanțe de galben până la brun deschis.Conidioforii sunt septați sau neseptați, se umflă la capăt într-o veziculă de formă și mărime variabilă (globoasă, hemisferică, clavată, piriformă, etc.), caractere ce constituie elemente de diferențiere între speciile genului. Vezicula este total, pe jumătate sau doar treimea superioară acoperită de sterigme. Acestea la unele specii sunt dispuse pe un singur rând sau serie (uniseriate) sau două rânduri suprapuse (biseriate). Cele pe care iau naștere conidiile se mai numesc și fialide (din cauza formei) sau celule conidiogene (adică generatoare de conidii). Sterigmele secundare se dezvoltă câte 2-3 pe o sterigmă primară. La capătul fiecăreia se dezvoltă conidiile de dimensiuni și forme diferite (de la globoase, la subgloboase, ovale, eliptice sau cilindrice, periforme sau în formă de butoiaș); sunt netede sau echinulate, rugoase sau prezintă bare rigide, perpendiculare pe peretele conidiei. Peretele poate fi necolorat sau colorat în gălbui, verde, brun, etc. în funcție de specie. Conidiile se dezvoltă în lanțuri de diferite lungimi, legate una de alta printr-un conectiv (disjunctor) vizibil sau nu. Veziculele cu sterigme și lanțurile de conidii constituie capetele conidiene, care au diverse forme (globoase, radiate, în coloane de diferite forme, lungimi și culori), în funcție de specie. Astfel, pot fi albe, gălbui, crem, verzi de diverse nuanțe, verzi-gălbui, verzi-cenușii, verzi-albăstrui,etc. Ele imprimă și culoarea coloniei. Aceasta variază însă cu vârsta, mediul, cu abundența capetelor conidiene, cu prezența cleistoteciilor, a scleroților, etc.

Cleistoteciile sunt peritecii complet închise, cu peretele de obicei subțire (constituit din 2-3 rânduri de celule turtite), care la maturitate se rupe lăsând ascele libere. Acestea se dezvoltă într-o masă de celule subțiri. Cleistoteciile pot fi la unele specii foarte numeroase, ele imprimând culoarea întregii colonii. Au forma globoasă sau ovală. Modul de formare și poziția lor în culturi sunt elemente de diferențiere între specii. Astfel, la unele specii cleistoteciile se formează pe suprafața mediului, fiind depășite de capetele conidiene, la altele sunt amestecate în rețeaua de filamente ale miceliului aerian iar la alte specii grupurile de cleistotecii se dezvoltă la nivelul sau imediat sub nivelul capetelor conidiene.

Ascele sunt mici, globoase sau ovale, cu peretele subțire și conțin de regulă câte 8 ascospori. Aceștia sunt caracteristici atât ca formă cât și ca ornamentație. În general au forma leticulară sau bivalvă, o suprafață netedă, echinulată sau cu creste. La unele specii există un șanț ecuatorial flancat pe ambele margini cu câte o creastă dreaptă sau ondulată, netedă sau ornamentală. În proiecție aceste creste apar ca niște prelungiri țepoase la cele două capete ale ascosporului. Toate aceste caractere ale ascosporilor sunt elemente de diferențiere între specii.

Fig.nr.VII.14. Preparat microscopic între lamă și lamelă, colorație lactofenol, obiectiv 100x – Aspergillus fumigatus

În figură se poate observa aspectul de microscopie directă pentru specia Aspergillus fumigatus: un aparat conidian de tip columnar, cu conidiofori scurți având pereții netezi care prezintă vezicule terminale de formă conică, având un singur rând de fialide (sterigme) dispuse uniseriat în cele două treimi superioare ale veziculelor; conidiile se dispun succesiv formând lanțuri lungi, sunt globuloase, echinulate, având pereți duri viguroși, colorați brun-verzui.

Fig.nr.VII.15.Aspect de microscopie directă: Aspergillus terreus – preparat microscopic între lamă și lamelă, colorație lactofenol, obiectiv 100x

Fig.nr.VII.16.Aspect de microscopie directă: Aspergillus clavatus – preparat microscopic între lamă și lamelă, colorație lactofenol, obiectiv 100x

Caracteristicile mucegaiurilor identificate ca aparținând genului Fusarium:

Am identificat pe baza caracteristicilor culturale și microscopice 3 specii din genul Fusarium în probele de grâu analizate: Fusarium moniliforme (Fusarium verticilloides), Fusarium oxysporum și Fusarium solani.

Caractere culturale

Caracterele principale de recunoaștere a coloniilor din genul Fusarium dezvoltate pe mediile de cultură utilizate în experiment au fost: aspectul, culoarea, prezența microconidiilor, prezența macroconidiilor și forma specifică a acestora din urmă.

Fig.nr.VII.17. Colonie de Fusarium moniliforme pe mediul cartof-dextroză-agar

Fig.nr.VII.18. Colonii de Fusarium oxysporum pe mediul extract de malț-agar

Fig.nr.VII. 19.Colonii de Fusarium oxysporum pe mediul [NUME_REDACTAT].nr. VII.20.Aspect cultural al unei colonii de Fusarium solani pe mediul cartof-dextroză-agar

Caractere microscopice

Identificarea microscopică a speciilor de Fusarium a fost destul de dificilă, întrucât speciile de Fusarium produc frecvent: unele macroconidii, altele microconidii și un al treilea grup atât macroconidii cât și microconidii. Astfel, Fusarium moniliforme produce numai microconidii, Fusarium oxysporum produce microconidii, macroconidii și clamidospori, Fusarium solani produce microconidii, macroconidii și clamidospori.

Forma macroconidiilor a constituit un caracter principal de diferențiere a speciilor. Macroconidiile speciilor din genul Fusarium pot fi : drepte, curbate ca o seceră sau numai cu capetele curbate; pot avea o latură curbată iar cealaltă dreaptă, unele au capetele curbate; unele au capetele scurte și rotunjite. Numărul septelor variază de la 1-10, cel mai frecvent este de la 3-5 sau 7. Mărimea macroconidiilor variază foarte mult în funcție de tulpină, substrat, temperatură.

Clamidosporii pot fi terminali sau intercalari, pot fi câte unul sau în lanț până la 5-6, sau în grupuri câte 3-4, au suprafața vâscoasă sau netedă, sunt globoși sau alungiți, incolori sau colorați în gălbui până la brun-închis.

Fig.nr.VII.21.Aspect de microscopie directă: Fusarium moniliforme – preparat microscopic între lamă și lamelă, colorație albastru-lactofenol, obiectiv 100x

Fig.nr.VII.22.Aspect de microscopie directă: Fusarium oxysporum conidiofori cu monofialide – preparat microscopic între lamă și lamelă, colorație lactofenol, obiectiv 100x

Fig.nr.VII.23.Aspect de microscopie directă: Fusarium solani microconidii – preparat microscopic între lamă și lamelă, colorație lactofenol, obiectiv 100x

Caracteristicile mucegaiurilor identificate ca aparținând genului Mucor:

Caractere culturale

Miceliul fungilor din genul Mucor s-a dezvoltat abundent la suprafața substratului, fiind format din filamente continui, neseptate, ramificate, care alcătuiesc o pâslă de culoare gălbuie-cenușie.

Fig.nr.VII.24.Aspectul cultural al unei colonii de Mucor spp. dezvoltată pe agar Sabouraud cu cloramfenicol

Caractere microscopice

De pe filamente s-au dezvoltat sporangiofori drepți simpli sau ramificați care prezintă terminal sporangi globuloși cenușii negricioși.

Sporangioforul se continuă cu sporangele printr-o porțiune dilatată numită „columelă”. Sporangele are peretele îngroșat și prin rupere sau liză pune în libertate sporii. Între columelă și peretele sporangelui se formează sporii unicelulari, sferici sau elipsoidali, de culoare gălbuie.

Fig.nr.VII.25. Aspect microscopic al preparatului colorat cu albastru- lactofenol, obiectiv 100x: Mucor spp. columelă și sporangiu conținând sporangiospori

[NUME_REDACTAT] boabelor de grâu produse de mucegaiuri au implicațiile cele mai mari în privința recoltelor obținute, proprietăților tehnologice ale grăunțelor și a nocivității pentru om și animale. Ele determină o scădere a recoltei de boabe și reduc calitățile tehnologice și nutritive ale acestora, deoarece mucegaiul pătruns în boabe le modifică compoziția chimică prin degradarea parțială a glucidelor și protidelor. Odată cu acțiunea lor asupra boabelor, aceste mucegaiuri produc o serie de micotoxine care ajung în făină, în pâine sau în alte produse de panificație și pot determina îmbolnăviri grave la om.

În urma analizei globale a incidenței mucegaiurilor în probele de grâu supuse analizelor micologice din cadrul studiului experimental al lucrării, pe baza aprecierilor cantitativă și calitativă a microorganismelor, care se dezvoltă la suprafața boabelor de grâu, pe durata depozitării acestora, în diverse condiții de mediu, am constatat că cea mai mare pondere din totalul probelor contaminate o prezintă diverse specii de mucegaiuri aparținând genului Penicillium (73%), urmat de specia Aspergillus fumigatus care a reprezentat din totalul probelor de grâu contaminate, o proporție de 14% și de diverse specii de mucegaiuri din genul Fusarium prezente în procent de 7%, restul mucegaiurilor prezentând încărcături medii mult mai reduse: Aspergillus terreus 2,5%, Aspergillus clavatus 0,5%, alte specii de Aspergillus 1,5%, Mucor 1,5%.

[NUME_REDACTAT] S., 2006, Microbiologia produselor alimentare, vol 1, Editura RISOPRINT, [NUME_REDACTAT] S., 2006, Microbiologia produselor alimentare, vol 2, Editura RISOPRINT, [NUME_REDACTAT] S., Rotar M. A., 2009, Microbiologia produselor alimentare, Lucrări practice, vol. III, Cluj-Napoca, [NUME_REDACTAT]

Bara C., 2005, Microbiologia alimentelor, [NUME_REDACTAT] din Oradea, [NUME_REDACTAT] C., 2010, Microbiologia generală a unităților agroalimentare, [NUME_REDACTAT] din Oradea, [NUME_REDACTAT] C., 2005, Tehnici și examene de laborator în controlul alimentelor, Oradea, [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT] D., Negruț M., 2008, Tratat de microbiologie clinică, Ediția a 2-a revizuită și adăugită, București, [NUME_REDACTAT]

Csep N., Csep A., 2003, Bolile plantelor cultivate și a produselor vegetale depozitate , Oradea, [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT] N., 2008, Protecția plantelor față de boli, [NUME_REDACTAT] din Oradea, [NUME_REDACTAT] V., 2001, Microbiologia alimentelor, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] N., Timar A., 2010,Materii prime vegetale- condiționarea, păstrarea și expertiza calității, Oradea, [NUME_REDACTAT] din [NUME_REDACTAT] D., 1964, Microbiologia produselor alimentare, București, [NUME_REDACTAT]

Purcărea C., 2008, Transformări biochimice importante în produsele agroalimentare în timpul procesării și depozitării

Novoselev M., Ursea D., Bitănescu L., 1990, Atlas micologic, [NUME_REDACTAT] Veterinară, ISBN 973-96534-0-5

Tofan C., 2004, Microbiologie alimentară, [NUME_REDACTAT], [NUME_REDACTAT] Gh., Duda M., Timar A., 2012, Condiționarea și păstrarea produselor agricole, București, [NUME_REDACTAT]