Conf.univ.dr. Cătălin CARP-CĂRARE Absolvent, Camelia ODOCHIAN IAȘI 2019 UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA… [308358]

Camelia Odochian

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ

“ION IONESCU DE LA BRAD” [anonimizat].univ.dr. [anonimizat]: [anonimizat]

2019

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA BRAD” IAȘI

FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ

APRECIEREA CALITĂȚII MICROBIOLOGICE A [anonimizat].univ.dr. [anonimizat]: [anonimizat]

2019

Declarație olografă pe propria răspundere

Lista figurilor

Figura 3.1. Așezare geografică comuna Dorna Arini

Figura 3.2 [anonimizat]-Suceava

Figura 5.1. Traseul de colectare a laptelui crud de vacă de la crescătorii de animale din zona Dornelor

Figura 5.2. Recoltarea laptelui prin muls automat

Figura 5.3 Tanc de colectare și răcire a laptelui de pe ruta de colectare

Figura 5.4. Prelevarea probelorpentru examenul microbiologic

Figura 5.5. Extras din Ordinul ANSVSA 35/2016

Figura 5.1.1. Schema de preparare a diluțiilor seriate

Figura 5.1.2. . Mediul geloză nutritivă (plate count agar) –număr total de germeni mezofili aerobi

Figura 5.2.1. BactoCount (Bentley)-analizator automat de identificare a NTGMA din lapte

Figura 5.2.2 Forma de prezentare electronică a rezultatelor pentru NTGMA/ml

Figura 5.3.1 SomaCount (Bentley) utilizat pentru determinarea NCS/ml (metodă alternativă)

Figura 5.4.1. Prelevarea probelor de lapte din bidoanele de colectare individuală

Figura 5.4.2. Probe de lapte recoltate pentru examenul bacteriologic

Figura 5.4.3. [anonimizat] 6.1.1 Buletin analiză eliberat de Laboratorul uzinal al Unității de procesare a laptelui din Dorna

Figura 6.1.2.Reprezentarea grafică a valorilor medii ale indicatorilor NTGMA/ ml și NCS/ml, [anonimizat] 2017

Figura 6.1.3. Reprezentarea grafică a valorilor medii ale indicatorilor NTGMA/ ml și NCS/ml, obținute

Figura 6.2.1. Aspectul mediul B.B.L.V [anonimizat], prelevate în anul 2018

Figura 6.2.2. Aspectul mediul B.B.L.V [anonimizat] 6.2.3. Coliformi pe mediul Levine

Figura 6.2.4. Escherichia coli pe mediul Levine

Figura 6.2.5. [anonimizat] (inel roșu la suprafața mediului)

Figura 6.2.6 Reprezentarea grafică a NTG/[anonimizat] 2018

Lista tabelelor

Tabelul 6.1.1.1. Valorile indicatorilor NTGMA/ml si NCS/[anonimizat] 6.1.1.2. Valorile indicatorilor NTGMA/ml si NCS/[anonimizat] 6.2.1.1. Rezultatele evaluării bacteriologice a [anonimizat] 2018

CUPRINS

Declarație olografa

Lista tabelelor si a figurilor

Cuprins

Introducere

Partea I. Studiul bibliografic

CAP.I MICROBIOLOGIA LAPTELUI

1.1 [anonimizat] …………………………………………….

1.1.1 Grupa bacteriilor lactice…………………………………………………………………

1.1.2 Grupa bacteriilor pseudolactice……………………………………………………….

1.1.3 Grupa drojdiilor și mucegailor…………………………………………………………

1.2. Principalele microorganisme patogene transmise prin lapte………………………….

CAP.II ASPECTE PRIVIND CALITATEA IGIENICĂ ȘI SANITARĂ A LAPTELUI

2.1. Calitatea igienică

2.2. Calitatea sanitară

CAP.III CADRUL ORGANIZATORIC UNDE S-AU DESFĂȘURAT CERCETĂRILE

Partea II. Cercetări proprii

CAP.IV. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRII

CAP.V. MATERIALE ȘI METODE

5.1. Determinarea Numărului total de germeni mezofili aerobi/ml lapte prin metoda clasică

5.2. Determinarea Numărului total de germeni mezofili aerobi/ml (NTGMA/ml) din lapte utilizând BactoCount Bentley

5.3. Determinarea numărului de celule somatice (NCS/ml) din lapte utilizând BactoCount Bentley

5.4. Examenul bacteriologic calitativ al laptelui

CAP.VI. REZULTATE ȘI DISCUȚII

CAP.VII. CONCLUZII

BIBLIGRAFIE

INTRODUCERE

Prin elementele pe care le conține, laptele reprezintă un aliment complet, ideal pentru nou-născuți în primele luni de viață și recomandat copiilor și adulților indiferent de vârstă, condiții de lucru și cu puține excepții, de starea de sănătate.

În aceste circumstanțe, consumatorii prefer un lapte care să nu satisfacă doar dezideratul cantitativ, ci mai ales calitatea igienică (starea de sănătate).

Piața unică europenă a impus o reconsiderare asupra conceptului de calitate pentru laptele celor trei specii, de vacă, capră și oaie și în consecință au fost stabilite criterii care satisfac rigorile de ordin nutritiv, igienic, sanitar, tehnologic și comercial. In acest context, calitatea laptelui reprezintă o performanță bazată pe anumiți indicatori individuali care permit aprecierea corectă a calității produsului pornind de la animalul producător, calitatea hranei, sistemul de exploatare, starea de sănătate, igiena mulsului, modul de depozitare și transport al laptelui până la unitatea de procesare.

Calitatea laptelui stabilită prin indicatorii săi – numărul total de germeni și numărul de celule somatice, împreună cu lactocitograma și în completare cu examenul bacteriologic, reprezintă o garanție de calitate și sănătate care până în prezent nu s-a putut încă înlocui prin alte metode de monitorizare.

La originea sa, miocrobiota laptelui este constituită în general de streptococci și stafilococi lactici care alcătuiesc microflora normală și din care sunt extrase și utilizate specii bacteriene de interes practic pentru industria laptelui. Laptele constituie în același timp, un mediu favorabil pentru dezvoltarea unui număr mai mare de microorganisme, inclusiv pentru cele patogene, care modifică proprietățile organoleptice și nutritive.

Având în vedere rolul deosebit de important al microorganismelor din laptele materie primă utlizat pentru consumul direct și pentru industria lactatelor precum și rolul lor pentru sănătatea publică, ne-am propus să facem o apreciere a calității microbiologice a laptelui provenit de la animalele crescute și exploatate în zona Dornelor.

CAPITOLUL I

MICROBIOLOGIA LAPTELUI

Laptele, prin compoziția chimică și structura acestuia, s-a dovedit a fi un mediu nutritiv perfect pentru dezvoltarea microorganismelor. Microorganismele din lapte provin atât din mediul extern cât și din uger, prin canalele papilare ale mameloanelor. Îmbogățirea laptelui în microorganisme se face în timpul mulsului, în raport cu starea de igienă din aer, de pe uger, de pe mâinile mulgătorilor, de pe vase, utilaje, tifoane de filtrare și în timpul condiționării și conservãrii primare. Din mediul intern, microorganismele pot apare în lapte, în cazul mamitelor sau datorită filtrării prin epiteliul glandular în anumite boli sau stări fiziologice . (Apostu S., 2006; Bârzoi D. și col., 2002; Bondoc I. și col., 2002; Bondoc I., 2007, Georgescu Gh., 2000; Rotaru O. și Mihaiu M., 2001).

Muls în condiții corespunzătoare de igienă și de la animale sănătoase, laptele are limitele bine stabilite în ceea ce privește numărul de germeni pe mililitru, nedepășind cateva sute (300-500/ml). În schimb, daca laptele este muls în condiții de igienă precare și de la animale bolnave, creșterea exagerată a microorganismelor va depăși valori de ordinal milioanelor pe mililitru. În practica largă pe teren, chiar în țările cu înalt nivel de civilizație și cu mari posibilități termice, în care se respectă normele de igienă a animalului și a mulsului, laptele imediat după mulgere conține, de regulă, zeci de mii – sute de mii de microorganisme /ml. Astfel, se poate explica de ce, modificările laptelui, produse de microorganismele care poluează, de regulă, în număr mare, nu apar la un timp mai scurt după mulgere, menționând cei doi factori mai importanți care contribuie la întârzierea aparției acestor modificări:

Răcirea sau semirăcirea laptelui după mulgere, este un proces esențial în micșorarea capăcității de multiplicare a microorganismelor poluante și totodată reduce activitatea enzimelor bacteriene.

Acțiunea bactericidă și bacteriostatică a laptelui, are loc imediat după mulgere ajungând pană la cateva ore după obținerea lui. Aceasta se datorează prezenței în laptele crud, a lacteninelor 1, 2 si 3 precum și a unor tipuri de anticorpi eliberați de către animal , depinzând de starea de imunitatea a acestuia instalată în urma contactului cu diferite microorganisme. (Apostu S., 2006; Bârzoi D., 2002; Bondoc I., 2002; Bondoc I. și col., 2007, Georgescu Gh., 2000, Rotaru O. și Mihaiu M., 2001).

Analizând cele scrise mai sus am putea spune că , calitatea microbiologică a laptelui este direct dependentă de cele două acțiuni principale ale acestuia. Acțiunea bactericidă scade numărul unor bacteriilor din lapte în primele ore după mulgere iar acțiunea bacteriostatică are rolul de a menține un număr constant de microorganisme câteva ore după mulgere.

Pentru o acțiune bactericidă și bacteriostatică de durată mai lungă un rol important il are răcirea rapidă a acestuia și menținerea la temperature scăzute care sa nu depășească 10 0 C. Păstrarea la temperatură scăzută de va face până la tratarea termică.

Odata tratat termic, laptele nu mai prezintă acțiune bactericidă și bacteriostatică intrucât substanțele responsabile sunt inactivate la temperaturi ridicate. Așadar , rezultă că un mediu mai bun pentru dezvoltarea microorganismelor din lapte este reprezentat de laptele pasteurizat. (Bondoc I., 2007, Georgescu Ghe., 1999, Rotaru O. și Mihaiu M., 2001).

PRINCIPALELE MICROORGANISME NORMALE, DIN LAPTE

În laptele vacilor sănătoase, în condiții normale se găsesc microorganisme cum ar fi bacterii lactice și pseudolactice, propionice și drojdiile tipice. Toate acestea au un rol important în industria și fabricarea produselor lactate acide , a brânzeturilor și a untului din smântână fermentată.

Grupa bacteriilor lactice

Este grupa principală de bacterii, fiind cea mai mare și cea mai importantă grupă a microflorei laptelui. Este reprezentată de bacterii nesporulate, Gram pozitive, imobile, catalază-negative, inactive față de nitrați și foarte pretențioase față de sursa de hrană vitaminică și azotată. Mediul lor propice de dezvoltare trebuie să conțină un amestec de aminoacizi, peptide și numerși factori de crestere, în special vitamine din complexul B. Majoritatea speciilor au activitate proteolitică neînsemnată care se manifestă lent. În afara de lactoză, pot fermenta și alte substanțe hidrocarbonate cu predilecție zaharide cum sunt lactoza și zaharoza. Aceste bacterii lactice (fermenții lactici adevărați), sunt echipate cu enzime glicolitice peptonizate, homo și heterofermentative. peptonizante ( Georgescu Gh., 2002; Bondoc I. și col., 2002)

Speciile bacteriene care sunt încadrate în categoria bacteriilor lactice, de interes pentru industria laptelui, aparțin următoarelor familii:

Fam. Streptococcaceae cu genurile Streptococcus și Lactococcus

Fam. Lactobaccillaceae cu genul Lactobacillus

Fam. Leuconostoccaceae cu genurile Leuconostoc și Oenococcus

Fam. Lactobacillaceae cu genul Lactobacillus

Streptococii lactici sunt germeni lactici dominanți în lapte și produse din lapte precum smântână și brânzeturile proaspete, păstrate la temperatura ambiantă. Practic nu există lapte crud fără streptococi. Ei produc o acidifiere moderată 0,5-1% acid lactic, sunt acidifianți mai moderați decat lactobacili, dar producția de acid e mai rapidă la început. Ea nu determină scăderea PH-ul decât cu puțin sub punctul izoelectric al cazeinei de 4,6.

Dintre speciile utilizate în fabricarea produselor din lapte amintim din genul Streptococcus , specia Streptococcus salivarius subspecia thermophylus, care se dezvoltă la temperatura de 40-450C și se utilizează împreună cu Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus la obținerea iaurtului și a coagulului brânzei șvaițer și Gruière. Principiu acestor bacterii este fermentarea glucidelor din lapte cu producere de acid lactic, creîndu-se un mediu favorabil dezvoltării lactobacililor. (Apostu S., 2006; Bârzoi D., 2002; Bondoc I., 2002; Bondoc I. și col., 2007, Georgescu Gh., 2000, Rotaru O. și Mihaiu M., 2001).

Principalele specii din genul Lactococcus, existente în lapte, sunt:

– Lactococcus lactis subspecia lactis ,definit ca agent obișnuit a acidifierii spontane a laptelui. Este utilizat în fabricarea brînzeturilor, produselor lactate acide și a untului.

– Lactococcus lactis subspecia cremoris ,bacterie ce produce creșterea acidității produsului până la 1120T și este folosit ca și cultură starter, pentru fabricarea smântânii fermentate și a untului, formând un coagul fin cu vâscozitate mare și gust acru.

– Lactococcus lactis subspecia diacetilactis , microorganism cu acțiune heterofermentativă ce mărește aciditatea produsului numai până la 40-600T. Este utilizat ca și cultură starter în fabricarea smântânii și a untului , imprimând aroma specific produselor. (Apostu S., 2006; Bârzoi D., 2002; Bondoc I., 2002;Bondoc I. și col., 2007, Georgescu Gh., 2000, Rotaru O. și Mihaiu M., 2001)

Din genul Leuconostoc, cele mai importante specii sunt: L. citrovorum și L. paracitrovorum. Ambele microorganisme formeazã diacetil în smântână. Sunt cunoscute ca microorganisme aromatizante ale smântânii fermentate si untului. Pe lângă aroma specifică pe care o oferă produsului, au capacitatea de producere a CO2, proces esențial în formarea de ochiuri mici în diferite sortimente de brânză.

Genul Lactobacillus cuprinde specii homofermentative (produc în urma fermentării glucozei și lactozei, 85-95% acid lactic și cantități reduse de CO2). Ca și condiții de dezvoltare a lactobacililor, pH-ul și temperatura sunt cele mai importante . Se dezvoltă bine la un pH de 5,0-5,8 și la temperatură cuprinsă între 50C și 530 C, valoarea optimă fiind 30-450C. În funcție de temperatura la care are loc multiplicarea lactobacililor , aceștia au fost divizați în două specii: termofile ( 37-450C , – L. lactis, L.acidophilus, L. helveticus ) și mezofile (28-300C , L. casei, subsp. Rhamnosus , – L. plantarum ).

În obținerea de produse din lapte precum a iaurtului, chefirului, brânzeturilor italiene sau a sortimentului de brânză Emmenthal se utilizează bacterii în cultură singulară sau în cultură mixtă din următoarele 3 specii: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus și Lactobacillus lactis.

L. acidophilus este utilizat la prepararea laptelui acidofil și a altor produse acidofile. (Apostu S., 2006; Bârzoi D., 2002; Bondoc I., 2002;Bondoc I. și col., 2007, Georgescu Gh., 2000, Rotaru O. și Mihaiu M., 2001, Savu C. 1997)

In funcție de produșii rezultați în urma fermentarii lactozei, bacteriile lactice se împart în homofermentative si heterofermentative.

1. Bacteriile lactice homofermentative au acțiune asupra lactozei rezultând 95% acid lactic precum și acid acetic si dioxid de carbon în cantități foarte mici. La rândul lor, bacteriile lactice se împart în două subgrupe în funcție de temperatura de multiplicare: bacterii lactice termofile și bacterii lactice mezofile.

Bacteriile lactice termofile sunt reprezentate de specii din genurile Lactobacillus și Streptococcus care: au temperatura optimă de multiplicare 37-45°C (în general nu se multiplică la 150C și 20°C); acidifică puternic laptele, producând 2,7% acid lactic, când acționează asupra laptelui și au activitate cazeolitică pronunțată.

Bacteriile lactice mezofile fac parte tot din genurile Lactobacillus si Streptococcus. Acestea au temperatura optimă de înmulțire de 20-30°C și nu se dezvoltă la temperaturi mai mari de 40°C; acidifică lent laptele formând circa 1% acid lactic prin fermentarea lactozei și au oarecare activitate cazeolitică.

2. Bacterii lactice heterofermentative, acționează asupra lactozei producând aproximativ 50% acid lactic, 20-25% alcooli (etanol și manitol) și 20-25% CO2 precum și acid acetic. Acestea sunt mai puțin utilizate în tehnologia produselor lactate din cauza proprietăților mezofile, sunt slab acidifiante și nu au acțiune asupra cazeinei.

3. Bacteriile propionice sunt microorganism anaerobe sau aerotolerante, difteroide, pleomorfe, având formă de măciucă cu capetele rotunjite. Sunt Gram positive, immobile și nesporulate. În această clasă de bacterii intră specii din genul Propionbacterium și Eubacterium . Din punct de vedere biochimic, fermentează produse lactate și diverse substanțe hidrocarbonate rezultând acid propionic, acid acetic , CO2, și mici cantități de acid izovaleric, acid formic, acid succinic și acid lactic.

Principalele microorganisme de acest gen: P. shermani și P. freudenreichi se găsesc în brânza Schweizer, la care determină formarea ochiurilor de fermentație caracteristice. Propionibacterium thoenii se întâlnește rar, iar P. rubrum produce colonii roșii pe suprafața brânzeturilor. (Apostu S., 2006; Bârzoi D., 2002; Bondoc I., 2002;Bondoc I. și col., 2007, Georgescu Gh., 2000, Rotaru O. și Mihaiu M., 2001, Savu C. 1997)

1.1.2.Grupa bacteriile pseudolactice

Bacteriile pseudolactice cunoscute ca și fermenți lactici falși, au capacitatea de fermentare a lactozei cu producerea de gaze. În această clasă sunt încadrate bacteriile coliforme și bacterii anaerobe sporulate, care au acțiune zaharolitică : Clostridium butyricum, Cl. tyrobutyricum, C.thermosaccharolyticum.

Bacteriile coliforme ajung în lapte din bălegar, din apele contaminate , de pe mâinile mulgătorului sau de pe ustensilele contaminate. Sunt bacterii Gram negative iar proprietatea biochimică specifică este fermentarea lactozei cu producerea de gaze. Principalele specii reprezentative sunt din genul : Klebsiella, Escherichia și Enterobacter. (Apostu S., 2006; Bârzoi D., 2002; Bondoc I., 2002;Bondoc I. și col., 2007, Georgescu Gh., 2000, Rotaru O. și Mihaiu M., 2001, Savu C. 1997)

Înmulțirea rapidă și în condiții variate de temperatură, a acestora, duce la impiedicarea inmulțirii bacteriilor lactice. Dacă sunt prezente în laptele destinat fabricării iaurtului, pot împiedica dezvoltarea culturii starter sau pot concura cu aceasta dacă bacteriile selecționate au o activitate redusă sau laptele deja însămânțat nu este introdus rapid la temperatura de 40-44oC.

E.coli are capacitatea de a se dezvolata la 44-45o C, fenomen în urma căruia laptele se coagulează dar față de un iaurt normal ,gustul , mirosul, aspectul și consistența sunt diferite. Coagulul prezintă o consistență redusă cu exprimarea zerului în cantitate ridicată și aciditate exagerată. Când bacteriile coliforme se dezvoltă în pasta brânzeturilor apar numeroase ochiuri de fermentare apărând defectul cunoscut sub numele de ‘‘balonare” a brânzeturilor. Unele specii pot fi și pshihotrofe și duc la modificări chiar și atunci cand laptele este păstrat la temperature de refrigerare (Rotaru O., Mihaiu M., 2001).

Specii din genul Clostridium cu effect puternic zaharolitic sunt reprezentate de: C. thermosaccharolyticum, C.butyricum și C. tyrobutyricum care au capacitatea de fermentare a lactozei din lapte cu producere de gaze, acid acetic, acid butiric și butanol. Primele două specii se întâlnesc mai frecvent în branzeturile cu defecte. Ele se pot dezvolta la temperatura de maturare a unor brânzeturi, provocând “balonarea târzie” a lor și mirosul de acid butiric. A treia specie, se întâlnește mai rar deoarece ea se înmulțește la temperaturi mai mari de 45°C. Aceste bacterii sunt răspâdite în pământ, siloz, furaje, fecale, de unde pot ajunge în lapte. (Apostu S., 2006; Mihaiu M., 2001, Savu C. 1997, Stănescu V. și col.2010)

1.1.3 Grupa drojdiilor și mucegailor

Laptele, pe lângă bacteriI poate conține levuri și mucegaiuri. Dintre cele mai întâlnite microorganisme din această grupă sunt genurile

-Saccaromyces care are ca reprezentant pe S. fragilis .Aceste microorganisme fermenteazã lactoza și uneori pot produce balonarea unor brânzeturilor slabe. În kefir și kums s-au pus în evidențã S. kefiri (S. lactis);

-Torulopsis ,fung cu proprietate de fermentare a lactozei are și cu posibilitatea de a produce modificări ale laptelui condensate în momentul în care siropul nu a fost sterilizat.;

-Rhodoturola , are capacitatea de a produce pigment galben sau roșu. Coloniile acestei specii se dezvoltă adesea pe suprafața untului sau pe brânzeturi;

-Candida, care are ca reprezentant specia C. krusei. Se dezvoltã în simbiozã cu bacteriile lactice,creându-le condiții de anaerobiozã;

-Torula ,care este reprezentatã de T. dematia și coloreazã brânzeturile în negru;

-Oospora cu specia O. lactis (Oidium lactis) care joaca rol în maturarea unor brânzeturi;

-Penicillum cu speciile: P. camemberti, P. roqueforti, P. casei, P. caseolyticum, P.glaucum. Primele specii la maturarea unor brânzeturi (Camembert, Roquefort, Gorgonzola, Neufchateler etc)

-Scopulariopsis reprezentată de specia S.brevicaulis. Aceasta se izolează adesea cu miceții din genul Penicillium

-Mucor cu speciile M. racemosus și M. mucedo specii care sunt izolate din lăptării și de unde, prin contaminare, pot ajunge în lapte. S-au identificat în laptele praf și în untul rânced.

-Rhizopus cu specia R. nigricans ,care are capacitatea de a sintetiza enzime proteolitice , fiind izolat in special din unele sortimente de unt și din brânzeturile moi

-Cladosporium, ajunge în lapte în urma contaminării cu particule de mizerie . Reprezentant al acestui gen este C. herbarum. Elaborează enzime lipolitice pe baza cărora are loc procesul de râncezire al untului. Cel mai frecvent, din unt se izolează Cladosporium butyric. (Apostu S., 2006; Savu C. 1997, Stănescu V. și col.2010)

1.2. PRINCIPALELE MICROORGANISMELE PATOGENE TRANSMISE PRIN LAPTE

Contaminarea laptelui cu bacterii patogene poate să aibă două surse principale: animalul bolnav și omul bolnav .

Transmiterea de la om în lapte a bacteriilor patogene este în special cunoscută în cazul bacteriilor tifice.Acestea ajung în lapte de la purtători prin manipulări neigienice. Salmonella typhi, paratiphy A, B și C produc febra tifoidă la om iar Salmonella thyphimurium produce gastroenterită copiilor și persoanelor în vârstă. Prin același mod de contaminare, Shigella dizenteriae ajunge în lapte provocând dizenteria umană iar Vibrio cholerae poate exista în zonele endemice de holeră. (Bârzoi D., Meica S., Neguț M., 1999; Bârzoi D., Apostu S., 2002; Sindilar E., 1998).

Corynebacterium diphteriae (agentul difteriei umane) și Streptococcus pyogenes, grupul Lancefield A (agentul scarlatinei și altor infecții la om), pot ajunge în lapte prin contaminarea acestuia de către persoanele bolnave. Dintre agenții virali care pot fi identificați în lapte în urma contaminării de către om se numără virusul poliomelitei și chiar agenții hepatitei infecțioase. (Bârzoi D., Apostu S., 2002; Sindilar E., 1998).

Streptococii hemolitici care fac parte din grupa A , reprezentativ fiind S. Pyogenes, apar în lapte în urma contaminării de către persoanele bolnave, convalescente sau de către purtătorii asimptomatici. Sursa de infecție sporadică sau epidemică pentru om este laptele consumat proaspăt sau insuficient tratat termic. S. pyogenes este distrus prin pasteurizare în 7 secunde la 57°C și în 1 sec. la 60,9°C (Bârzoi D., Apostu S., 2002; Buiuc D., Neguț M., 1999; Șindilar E., 1998; Carp-Cărare M. și col., 1998; Răpuntean Gh. și col.,1998 ).

Tulpinile coagulazo-pozitive de Stafilococcus aureus produc enterotoxine, foarte puține tulpini coagulazo-negative fiind enterotoxigene, toxina formându-se în alimentele contaminate. Până în prezent sunt cunoscute 6 enterotoxine A, B, C, D, E, F. Tipul A este cel mai răspândit în focarele epidemice, iar tipul F este implicat în sindromul șocului toxic (TSS = toxic shock syndrom). Toxinele sunt termorezistente și pot rezista la 100°C timp de 30 minute, fiind distruse abia după 120 minute. La 120°C rezistă 10-40 minute. Sursele de infecție sunt reprezentate de persoanele bolnave care vin în contact cu laptele și produsele lactate în timpul procesării, respectiv 30-35% din persoanele sănătoase găzduiesc stafilococi în nasofaringe și pe piele. Purtătorii pot contamina, prin tuse, strănut sau prin intermediul leziunilor de pe piele, alimentele cu care vin în contact. În mamita stafilococică, o proporție însemnată de tulpini izolate din laptele infectat produc enterotoxina A, responsabilă de numeroase îmbolnăviri la om (Apostu S., 2004, Bârzoi D. și col., 1999).

De la animale la om, transmiterea și răspândirea germenilor patogeni are loc în urma consumului de lapte provenit de la animalele suferinde de boli generale sau locale.

Mycobacterium bovis se transmite de la animalele bolnave la om, în principal prin consumul de lapte crud, deși este posibilă infectarea din alte surse și pe alte căi. Contaminarea, prin consumul de lapte, se produce cel mai frecvent atunci când laptele provine de la vacile cu mamită tuberculoasă și, mai ales, în cazul vacilor cu tuberculoză cronică lobular infiltrativă. (Bârzoi D., Apostu S., 2002; Bondoc I.,2007; Buiuc D., Neguț M., 1999; Sindilar E., 1998).

Brucella abortus și Brucella melitens rezistă, aproape 40 zile la 00C, în laptele proaspăt provenit de la vaci, oi și capre. Boala brucelică este însoțită de avort și eliminarea germenilor prin lapte, care poate să dureze 7-8 ani, sau chiar toată viața economică a vacilor (Bârzoi D., Apostu S., 2002; Sindilar E., 1998).

În laptele de vacă Salmonella spp persistă până la 60 zile; acidifierea laptelui distruge salmonelele, rămânând viabile cele înglobate deja în particulele de cazeina, protejate de efectul nefavorabil al acidității. S. typhimurium și toate serotipurile de S. enteritidis sunt potențial patogene pentru om. Laptele și produsele lactate contaminate (cu materii fecale de la animalele bolnave sau purtătoare în timpul mulsului, cu alte materii infectate – furaje etc.) constituie unele dintre cele mai importante surse de infecție pentru cele care recunosc ca agenți etiologici pe S. typhi și serotipurile paratifice cu tropism uman (Bârzoi D., Apostu S., 2002; Bondoc I., 2007; Sindilar E., 1998, Stănescu V. și Apostu S., 2010).

Listeria monocytogenes este considerată patogenă pentru om și animale. Laptele constituie sursa principală de îmbolnăvire pentru om, provenit de la vaci cu mamite în forme subclinice, acute și cronice.. Contaminarea laptelui crud cu Listeria monocytogenes are caracter sezonier. Concentrația bacteriei Listeria monocytogenes în lapte este în general inferioară de 1 UFC/ml, dar poate atinge și 10 UFC/ml (Bârzoi D., Apostu S., 2002; Carp-Cărare M. și col., 1998; Sindilar E., 1998). Termorezistența bacteriei Listeria monocytogenes este destul de redusă. Astfel, se consideră că, la temperaturi superioare celei de 72°C, bacteria este distrusă în câteva secunde (Fleming D.W., 1985, Bondoc I., Sindilar E., 2002, Carp Cărare M., 1998).

Streptococii din grupa B prezintă patogenitate redusă pentru om, S. agalactiae fiind agentul mamitei contagioase a vacilor și patogen pentru om.

Mamitele streptococice produse de către S. agalactiae, S. dysgalactiae și S. uberis, determină modificări ale laptelui; la început gust sărat-amar cu sediment gălbui sau portocaliu, uneori cu sânge. Într-un stadiu mai avansat laptele prezintă flocoane devine vâscos și purulent (Bârzoi D., Apostu S., 2002; Șindilar E., 2000; Mihaiu M., Rotaru O., 2006, Stănescu V și Apostu S., 2010).

Streptococcus zooepidemicus contaminează laptele mult mai rar, fiind izolat din laptele mamitic. Laptele mai poate fi contaminat cu S. salivarius dar și cu Enterococcus fecalis (grup D), în cazul unui muls neigienic, putând determina grave toxiinfecții alimentare. Streptococii fecali (Enterococcus faecalis) au origine enterică constituind o populație importantă în conținutul digestiv. În alimente, enterococii pot supraviețui unor tratamente fizice a căror aplicare conduce obișnuit la distrugerea bacteriilor patogene. Acesta este motivul pentru care prezența lor este cercetată ca indicator global al condițiilor igienice de producție (Bârzoi D., Apostu S., 2002;Sindilar E., 2000; Mihaiu M., Rotaru O., 2006; Bondoc I., Sindilar E., 2002).

Microorganismele din genul Campylobacter cu semnificație patogenă majoră pentru om și animale sunt: C. jejuni; C coli; C. fetus; C. lari; C. urealyticus.

Campylobacter jejuni (enterita vibrionică) și uneori Campylobacter coli, determină 85-90% din cazurile de gastroenterită acută campilobacteriană la om, cu caracter epidemiologic de TIA. Consumul de lapte contaminat alături de cel al apei contaminate au stat la baza celor mai grave epidemii (Apostu S., 2004, Bârzoi D., Meica S., Neguț M.,1999, Stănescu V.și Apostu S., 2010).

Coxiella (Ricketsia) burnetii se poate transmite și prin laptele crud contaminat. Este o bacterie ce rezistă la pasteurizarea înaltă obișnuită (72°C timp de 15 secunde). Se elimină prin lapte timp de 17-40 zile, eliminarea putându-se prelungi până la 24-41 luni (Șindilar E., 2000); nu este distrusă prin pasteurizare medie, rezistând în laptele sterilizat și însămânțat 45 zile, iar în laptele acidulat 24 ore. Igienizarea laptelui contaminat cu C. burneti se realizează prin pasteurizarea foarte înaltă (Bârzoi D., Apostu S., 2002;Sindilar E., 2000; Mihaiu M., Rotaru O., 2006; Bondoc I., Sindilar E., 2002).

Bacillus cereus este o bacterie telurică și sporogenă, se găsește în condiții diverse de mediu. În laptele crud, datorită florei lactice spontane concurente, nu se poate dezvolta, dar în laptele pasteurizat sau fiert se poate multiplica și se găsește frecvent. De asemeni, se găsește în brânza telemea, urdă, smântână. Sporii au o rezistență mare la temperaturile ridicate, fiind izolați din laptele praf și laptele U.H.T. Bacillus cereus este responsabil de toxiinfecții alimentare prin consumul de alimente contaminate, care evoluează cel mai frecvent cu sindrom diareic și vomitiv (Apostu S., 2004, Bârzoi D. și col., 1999, Mihaiu M. și Mihaiu R., 1998; Floriștean V.2006).

În lapte, pot exista și microorganism patogene cu o puternică acțiune proteolitică desfășurată pe baza echipamentului enzymatic al acestora. În această categorie sunt incluse microorganisme din aproape toate ramurile taxonomice cum ar fi: bacilli Gram negativi nesporogeni și bacilli Gram pozitivi sporogeni, aerobi sau anaerobi (Clostridium și Bacillus) , coci Gram pozitivi, levuri, mucegaiuri precum și actinomicete.

Speciile bacteriene din genul, Serratia marcescens au acțiune peptonizantă și alcalinizantă asupra laptelui, fiind strict aerobe. Laptele contaminat superă modificări întrucât sub acțiunea acestor bacteria nu mai are loc faza de acidifiere și de coagulare . Așadar, când acționează Ps. fluorescens , laptele devine un lichid de culoare galben verzuie ușor fluorescent , tulbure și cu un miros specific amoniacal de urină sau de pește. Alteori, acțiunea peptonizantă a bacteriilor oferă laptelui o culoare violet-albăstruie (Ps. syncyanea) sau roz-roșie (S. marcescens). Modificări de culoare s-au identifiat mai frecvent în brânzeturi. Deoarece unele bacterii din această grupă sunt psihotrofe produc modificări chiar și în laptele sau brânza depozitate la rece. Astfel , măsura rapidă de a răcii laptele sau produsele din lapte nu impiedică dezvoltarea microorganismelor din genul Serratia. (Rotaru O. și Mihaiu M., 2001;Mihaiu M. și Mihaiu R., 1998; Stănescu V și Apostu S., 2010, Savu C., 1997).

În aceastã grupã intră și bacteriile din familia Enterobacteriaceae care are ca reprezentanți genurile: Escherichia (E.coli), Enterobacter (E. aerogenes și E. cloace) și Proteus (P. vulgaris, P. mirabilis). E. coli este un indicator igienico-sanitar important pentru aprecierea gradului de contaminare. E. coli în asociere cu E. aerogenes produc balonarea precoce a brânzeturilor ( Bondoc I., Sindilar E., 2002).

O altă categorie de microorganisme de contaminare sunt încadrate în familia Bacillaceae. Ele aparțin genurilor: Bacillus (B. mycoides, B. subtilis, B. mezentericus, B. cereus) și Clostridium. Din genul Clostridium interesează Cl. butyricum, cu varietatea Cl. tirobutiricum ce produce balonarea brânzeturilor și Cl. sporogenes, care produce putrezirea albă a brânzeturilor. Cele două genuri , cele mai des întâlnite au importanță întrucât sunt bacterii formatoare de spori , motiv pentru care rezintă tratamentelor termice aplicate laptelui crud dar și fenomenelor de maturare-fermentare care au loc în industria produselor lactate. Speciile din genul Clostridium și Bacillus, fiind microorganisme telurice, ajung în lapte, în timpul mulgerii și manipulării, o dată cu praful atmosferic, mizeria de pe corpul animalelor sau prin contactul cu vasele de muls, cu mâinile operatorilor sau cu diferite ustensile neigienizate (Rotaru O. și Mihaiu M., 2001;Mihaiu M. și Mihaiu R., 1998; Stănescu V și Apostu S., 2010, Savu C., 1997).

De asemenea s-au identificat Micrococcus freudenreichi (imprimă un aspect filant smântânii) și Micrococcus caseolyticus din familia Micrococcaceae care acțiunează prin descompunerea cazeinei.

Laptele poate fi contaminat și cu alte bacterii care produc unele boli, cum ar fi: edemul malign, mamită actinobacilară, mamită actinomicotică, mamită gangrenoasă. In aceste cazuri laptele se fierbe și se distruge.

Virusurile. Contaminarea prin manipulatori umani este cea mai importantă dintre sursele de contaminare a laptelui cu virusuri patogene pentru om. Enterovirusurile sunt reprezentate de peste 50 de tipuri diferite răspândite în întreaga lume, între acestea numărându-se virusul poliomelitei și virusul coxsackie, tulpinile acestuia din urmă supraviețuind la tratamente termice de 71°C timp de 15 secunde (Bârzoi D., Apostu S., 2002;Sindilar E., 2000; Mihaiu M. și Mihaiu R., 1998; Bondoc I., Sindilar E., 2002).

Adenovirus aparținând Parapoxvirus, familia Poxviridae, strâns înrudit din punct de vedere antigenic cu virusul stomatitei papuloase a bovinelor și cu cel al ectimei contagioase, produce pseudovariola vacilor. Contaminarea se realizează prin mâinile mulgătorilor, de la o vacă la alta, sau prin intermediul aparatelor de muls; este transmis prin intermediul vacilor lactante, care sunt frecvent afectate (Bârzoi D., Apostu S., 2002;Sindilar E., 2000; Mihaiu M., Rotaru O., 2006; Bondoc I., Sindilar E., 2002).

Variola ugerului este generată de un adenovirus din grupul Orthopoxvirus, familia Poxviridae. Virusul paravaccinal se transmite la om prin consumul de lapte crud, fierberea și pasteurizarea distrugând virusul (Bârzoi D., Apostu S., 2002; Bondoc I., Sindilar E., 2002)

Febra aftoasă produsă de diverse serotipuri de virusul aftos, poate fi transmisă la om prin lapte și produse lactate, dar cazurile de îmbolnăvire la om sunt rare. Virusul se elimină prin lapte în perioada de generalizare a bolii și apoi prin limfa veziculelor de pe sfârcuri și uger. În laptele crud virusul poate rezista 24 ore la temperatura de 17-20 °C. În laptele răcit la +5°C virusul rezistă 12 zile. Temperatura de 60-80°C distruge virusul în 10 minute. Se interzice consumul laptelui crud în fermele contaminate. Laptele animalelor bolnave din gospodăriile populației se va fierbe în mod obligatoriu (Bârzoi D., Apostu S., 2002;Sindilar E., 2000; Mihaiu M. și Mihaiu R., 1998; Bondoc I., Sindilar E., 2002, Stănescu V. și Apostu S., 2010).

ARN virus, aparținând genului Lyssavirus, familia Rhabdoviridae se poate transmite accidental prin consumul de lapte. Laptele animalelor cu rabie este considerat "avirulent" de unii cercetători, iar alții îl consideră slab "virulent" și inconstant, cert este că acesta poate conține virusul rabic.

Laptele provenit de la animale din ferme: cu leucoză enzootică bovină este obligatoriu pasteurizat (Savu C., Georgescu N, 2004).

CAPITOLUL II

ASPECTE PRIVIND CALITATEA IGIENICA SI SANITARĂ A LAPTELUI MATERIE PRIMĂ

Calitatea laptelui este unul din factorii care influențează valoarea laptelui materie primă.

Conform măsurilor stipulate de Regulamentele CE 854/2004 (organizarea controalelor oficiale privind produsele de origine animală), 853/2004 (prelevarea probelor de lapte crud in scopul stabilirii criteriilor pentru calitatea laptelui), Decizia CE 2007/557 (autorizarea unor unități de procesare să recepționeze și să proceseze lapte conform și neconform cu standardele UE, fără separare pe linii distincte de producție), calitatea laptelui este reprezentată de o serie de aspecte care permit clasificarea acesteia în:

calitatea compozițională, nutritivă și biologică: (compoziția laptelui, densitatea laptelui, punctul criogenic, prezența/absența antibioticelor și a substanțelor inhibitorii, aciditatea laptelui);

calitatea igienică (NTGMA/ml -numărul total de germeni mezofili aerobi/ml lapte);

calitatea sanitară (NCS/ml -numărul de celule somatice /ml lapte). (www.inia.cl)

Riscurile microbiologice legate de produsele alimentare reprezintă o sursă majoră a bolilor provocate de produse alimentare la om. Laptele, ca rodus alimentar, nu trebuie să conțină microorganisme sau toxine sau metaboliți ale acestora în cantități care prezintă un risc inacceptabil pentru sănătatea umană (Regulamentul CE 2073/2005). Criteriile microbiologice definesc caracterul de siguranță alimentară a produselor alimentare și pe baza lor sunt stabilite limitele peste care un produs este considerat contaminat cu microorganisme patogene și neacceptat pentru consum (Regulamentul CE 2073/2005).

Contaminarea laptelui materie primă se datorează unor factori, precum: starea generală a animalelor și a glandei mamare în particular, starea igienică generală a exploatării, condițiile igienice în care se practică mulsul manual sau mecanic, igiena condiționării primare a laptelui, condițiile igienice de manipulare, transportul și depozitarea laptelui.

Impuritățile din lapte oferă relații importante privind condițiile de igienă în care s-a realizat recoltarea laptelui (igiena vaselor, a mulgătorilor, a încăperilor în care a fost menținut) și asupra modului cum a fost manipulat laptele (STAS 6349/5-8-80). Impuritățile laptelui sunt constituite din fire de păr, descuamații, resturi vegetale, porțiuni de materii fecale, particule de praf, murdării de pe vasele de muls. După cantitatea de impurități și aspectul lor, laptele se împarte în:

-lapte curat (clasa I ), cu următorul aspect: fără impurități sau cu foarte puține impurități, abia vizibile, reprtizate în centrul rondelei;

-lapte mediocru (clasa a II-a), care prezintă următorul aspect: număr redus de impurități, cu diferite forme și mărimi situate mai ales în zona de mijloc a rondelei;

-lapte murdar (clasa a III- a), care prezintă numeroase impurități, cu diferite forme și mărimi, plasate pe toată suprafața rondelei (Bondoc I., 2007; Mihaiu M., Mihaiu R.,1998; Rotaru G. și col., 1997; Savu C și col., 1997;Savu C și col., 2004; Stănescu V., Apostu S., 2010). Normativele actuale prevăd pentru laptele materie primă gradul de impurificare I. (Regulamentul CE 2073/2005).

Conform normativelor actuale, cerințele de conformitate pentru laptele crud se bazează pe doi parametri: conținutul de germeni la 300C (NTG-ml) și conținutul de celule somatice (NCS/ml)(Regulamentul CE nr.2073/2005). Parametrii menționați sunt incluși în standarde agreate și aplicate de către toate țările UE, ele fiind incluse în legislația românească prin Ordinul 389/2002 al Ministerului Agriculturii, Pădurilor si Apelor.

La ora actuală, laptele de vacă preluat pentru procesare de la producători poate fi conform sau neconform ) în funcție de parametrii prevăzuți pentru NTG și NCS (Ord.389/2002 Regulamentul CE 1441/2007

).

2.1. ASPECTE PRIVIND CALITATEA IGIENICĂ A LAPTELUI

Conform normativelor actualizate, pentru ca un lapte să fie calitativ, trebuie îndeplinite condiții de igienă de la producător până ajunge pe masa consumatorului. Laptele care părăsește ugerul vaci are un număr limitat de bacterii (< 100/ml) dar imediat ce este expus aerului și microflorei de contaminare, mulsul cu mâini murdare, echipamentul de muls și stocare murdar favorizează multiplicarea și creșterea numărului de bacterii. Răcirea laptelui la temperaturi sub 4 °C reduce rata de multiplicare a bacteriilor ( Regulament CE 853/2004).

După intrarea României în UE, au fost parcurse mai multe etape până la îndeplinirea totală a cerințelor igienice de conformitate:

Etapa I 1.01.2005 – 31.12.2008 NTG<=1.000.000;

Etapa II 1.01.2009 – 31.12.2009 NTG<=500.000;

Etapa III 1.01.2010 – prezent NTG<=100.000 pentru laptele crud de vacă

NTG<=500.000 pentru laptele crud provenit de la alte specii (Regulamentul C.E. 853/2004).

Laptele de la alte specii decât vacile, care este utilizat pentru fabricarea produselor lactate ce nu implică procedee termice, are indicatorul microbiologic NTGMA/ml modificat încărcătura microbiană fiind acceptata pana la valoarea de 500.000 ufc/ml. (Regulamentul C.E. 853/2004).Stabilirea criteriilor de calitate se face prin medii geometrice, pentru NTG-ml, prin prelevarea a două probe de lapte pe lună (Regulamentul C.E. 853/2004).

Conform regulamentului CE nr.2073/2005 și Regulamentului CE 1441/2007, în toate statele membre UE sunt monitorizați aceiași indicatori microbiologici pentru produsele alimentare.

Dacă pentru laptele crud indiferent de specia de la care provine, stabilirea de conformitate se face doar pe baza numărului total de germeni/ml și numărului de celule somatice/ml, pentru produsele lactate fabricate din lapte crud, sunt alte criterii microbiologice. Conform Regulamentului CE 1441/2007, pentru aceste produse indicatorii microbiologici: Enterobacteriaceae (ISO 21528-1), E.coli ( ISO 16649-1/-2), Stafilococi coagulazo-pozitivi (ISO 6888-1 sau 2), (fig.2.1.1).

Fig.2.1.1. Extras din Regulamentul CE 1441/2007

2.2.CALITATEA SANITARĂ A LAPTELUI

Numărarea celulelor din lapte a fost generalizată în ultimii ani în tot mai multe țări, constituind o realizare importantă în domeniul controlului calității laptelui și dobândind o largă recunoaștere.

Nivelul celulelor din lapte este un indicator de calitate igienică, care capătă o importanță deosebită. În multe țări a fost scoasă în evidență corelația între nivelul de celule și producția de lapte. Evaluările cantitative și calitative a celulelor prezente în lapte sunt importante pentru a putea înțelege numeroase mecanisme, fiziologice sau/și patologice din glanda mamară (STAS 2418/A1/1998).

Noțiunea de celule somatice, adică celule care provin din patrimoniul celular propriu al organismului se definește ca totalitatea celulelor existente la un moment dat într-un anumit volum de lapte, indiferent de structura, forma și originea lor. În această categorie sunt incluse nu numai celulele de origine mamară (parenchim, stromă) ci și cele provenite prin diapedeză din circulație. Se exclud formele celulare, străine laptelui (microbi, levuri, miceți, paraziți) care pot fi prezente în caz de infecții sau a unei poluări externe a laptelui cu ocazia mulsului (Rotaru și Ognean, 1998).

Această extindere a fost posibilă grație metodelor instrumentale și automatizate de numărare (Coulter, Counter, Fossomatic, Combi-Fross), care permit prelucrarea unui număr mare de eșantionate pentru un cost unitar redus (Apostu S., 2004).

Efectele negative ale mamitei asupra producției, compoziției și salubrității laptelui are o unanimă recunoaștere, motiv pentru care noile reglementări ale U.E. pun accentul pe numărul de celule somatice, astfel încât țările membre să ia măsuri de reducere a numărului de celule pe ml lapte și să rămână astfel competitive ( SR EN ISO 13366-1/2008). Nivelul celulelor somatice este considerat fiziologic la un lapte de sub 100.000 celule/ml. Intre 100.000 și 400.000 celule/ml se poate suspecta o infecție sublinica, iar peste 400.000 celule/ml se considera mastită clinică.

Mastita este una dintre cele mai costisitoare boli ale vacilor și apare atunci când, la nivelul ugerului, se produce infectarea și multiplicarea bacteriilor, afectând acinul glandular. Consecința este apariția unui număr crescut de celule somatice în lapte. Un număr minim de celule somatice este permanent prezent în lapte, dar în caz de infecție/mastita, numărul de celule somatice crește. Astfel numărul de celule somatice este un excelent indicator pentru identificarea mastitei. Mastita reduce producția de lapte până la 15%.(www.infolapte.ro).

Când în glanda mamară pătrund bacterii, ducând la apariția mastitei, leucocitele (denumite și celule somatice) se vor deplasa la locul infecției pentru a combate infecția. Dacă ne gândim că, 12% pierdere din producția de lapte înseamnă pentru fermier minim 400 l/vaca/an, ajungem la concluzia că prin schimbarea compoziției laptelui, coroborat cu o cantitate mai redusă de cazeină (principala proteină din lapte) și mai puțină grăsime, scade considerabil și profitul, atât al producătorilor cât și a procesatorilor de lapte ( Șindilar E și col. 2002, Voicu E. și col. 2007).

Importanța acestei afecțiuni este accentuată de manifestarea ei subclinică, ceea ce impune efectuarea unor teste rapide pe lapte recoltat direct de la ugerul vacii pentru prevenirea apariției mastitelor. O vacă cu mastită subclinică nu dă un lapte care să pară anormal și nici nu prezintă semne clinice cum ar fi un uger dureros sau inflamat. Testele rapide pot fi făcute și pe laptele muls în găleată sau laptele din tanc, pentru determinarea numărului de celule somatice (SCC) al întregii cirezi (Bornet G., 2000).

Astfel, conform “Programului acțiunilor de supraveghere, prevenire și control al bolilor la animale, al celor transmisibile de la animale la om, protecția animalelor și protecția mediului”, sunt necesare examene de laborator (numărarea celulelor somatice) cu raportare trimestrială a stării de sănătate a glandei mamare (www.ansv.ro/program_strategic).

Numărul de celule somatice se poate aprecia prin metode calitative (testul CMT, Schalm, Brabant, etc.) și cantitative (I.Bondoc, 2007).

Conform normelor în vigoare laptele crud de vacă trebuie să conțină 400.000 NCS/ml. Această limită reprezintă media geometrică variabilă constatată pe o perioadă de trei luni, cu cel puțin o prelevare pe lună și analizate într-un laborator sanitar veterinar autorizat (https://eur-lex.europa.eu).

CAPITOLUL III

DESCRIEREA CADRULUI INSTITUȚIONAL

Studiul a fost efectuat în zona Dorna-Arini din județul Suceava iar analizele de laborator au fost efectuate în cadrul Laboratoarelor uzinale din cadrul unei Unități de prelucrare a laptelui din Dorna-Suceava și Laboratorul de Microbiologie din cadrul Facultății de Medicină veterinară Iași.

Dorna-Arini este o comună în județul Suceava, Moldova, România, formată din satele Cozănești (reședința), Dorna-Arini, Gheorghițeni, Ortoaia, Rusca și Sunători.

Figura 3.1. Așezare geografică comuna Dorna Arini

Comuna Dorna-Arini se află la o altitudinea medie de 1100 m și se situează la marginea de S-E a depresiunii Dornelor, în zona de contact dintre Munții Bistritei (Masivul Pietrosul) și Munții Rarău (Masivul Giumalău). Localitatea este traversată de râul Bistrița, care o desparte în doua sectoare asimetrice: cel drept (al Masivului Pietrosul) domol, cu terase etajate și muscele prelungi de o înăltime redusă (900 – 1200 m) iar cel stâng (al Masivului Giumalău) abrupt și fără terase. Dacă în partea de S-V a comunei energia reliefului este domoală, înaintând spre E-NE, valea se îngustează considerabil, devine abruptă, formând chei (Cheile Zugrenilor).

Clima localității este temperat montană cu două topoclimate distincte: montan și depresionar.

Temperatura medie anuală în depresiune este de 4,5 °C iar pe culme 2 °C. Umiditatea aerului este de aproximativ 83%, iar precipitatiile ating valoarea medie anuală de 635,3 mm. în depresiune și 926 mm. pe culme.

Condițiile climaterice și de relief sunt favorabile creșterii animalelor fiind de altfel, o tradiție în această zonă geografică (fig. 3.2).

PARTEA II. CERCETĂRI PROPRII

CAPITOLUL IV

SCOPUL ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

Creșterea și multiplicarea microorganismelor în produsele alimentare este influențată de o serie de factori care depind de caracteristicile țesuturilor vegetale și animale (factori intrinseci: valoarea pH, umiditatea relativă, potențialul de oxido-reducere, conținutul în substanțe nutritive, conținutul de constituenți antimicrobieni,structura biologică) dar și de condițiile de stocare a alimentelor (factori extrinseci).

Laptele și derivatele din lapte reprezintă un mediu nutritiv propice pentru dezvoltarea și multiplicarea bacteriilor reducând astfel valoarea calitativă a acestuia. Laptele devine impropriu pentru consum mai ales când intervin microorganismele patogene și acționează prin degradarea constituienților și a microorganismelor lactice cu producerea în final a unor metabolite toxici (Popa G. și col. 1986 Maisi P și col. 1987). Salubritatea laptelui este în corelație directă cu microflora inițială a laptelui crud, starea de sănătate a animalelor, igiena mulsului, condițiile de conservare și transport a laptelui (Haenlein, G. W.,2002 Ciotău C., 2006).

Calitatea microbiologică a laptelui este importantă nu doar pentru fermier ci și pentru fabricile procesatoare care transformă laptele în produse. Încărcătura microbiană influențează perioada maximă de stocare a laptelui, gama de produse ce pot fi fabricate, gustul produselor rezultate, termenul de valabilitatea al produselor rezultate dar și pierderile de producție ale procesatorului ( Ivana Simona și col.,2011).

Este recunoscut faptul că îndeplinirea cerințelor calitative ale laptelui reprezintă o condiție esențială pentru ca procesatorii să-și poată valorifica produsele finite în spațiul intracomunitar sau la export. Creșterea numărului total de germeni (NTG/ml) și a numărului de celule somatice (NCS/ml) în laptele crud presupune în mod evident, modificarea calităților organoleptice ale laptelui și prin urmare, a produselor lactate și extrem de important, un risc evident de îmbolnăvire pentru consumatori (Georgescu G. și col. 2007).

Examenul microbiologic al laptelui este obligatoriu la unitățile de prelucare industrială a acestuia și este efectuat ori de câte ori se constată modificări ale caracterele organoleptice sau se suspicionează contaminarea laptelui cu diverși germeni patogeni. De asemenea, se impune examenul microbiologic al laptelui atunci când nu se cunoaște originea acestuia.

Având în vedere toate aceste circumstanțe, ne-am propus să evaluam calitatea microbiologică a laptelui crud de vacă provenit din microfermele familiale din zona Dornelor și care este colectat de către o Unitate de prelucrare a laptelui din zona Dorna.

Pentru aceasta s-a urmărit:

– dinamica valorilor medii lunare la indicatorii NTGMA/ml și NCS/ml lapte crud de vacă provenit de pe o rută de colectare a laptelui dn zona Dorna ;

– examenul microbiologic efectuat pe probe individuale de lapte, prelevate din unele microferme familiale care distribuie laptele pe aceeași Unitate de prelucrare a laptelui.

Capitolul V

MATERIALE ȘI METODE

Evaluările s-au efectuat pe eșantioanele de lapte prelevate și testate din cisternele de colectare, în perioada 2017-2018. Laptele a fost obținut din microfermele familiale din zona Dorna și care fac parte din una din rutele de colectare a laptelui de vacă pentru o Unitate de procesare a laptelui din Zonă (fig. 5.1. ).

Protocolul prevede ca laptele să fie recoltat în bidoane speciale, de către angajații unității de prelucrare a laptelui (fig.5.1.2 ).

Laptele de pe ruta de colectare este transportat la centrul de colectare, unde laptele este stocat în tancuri de răcire (fig.5.1.3 ) După finalizarea colectării, laptele este transferat cu o cisternă către Unitatea de procesare a laptelui.

După prelevarea în recipiente sterile, probele au fost direcționate către laboratorul uzinal de analize, menținând o temperatură de transport cuprinsă între 0-40C (fig. 5.1.4.). Probele de lapte au fost reprezentative pentru eșantion, s-au analizat în maxim 6 ore de la recoltare, iar în unele situații au fost conservate și păstrate la 2-50C timp de maxim 24 ore.

Aprecierea gradului de contaminare microbiologică a laptelui se realizează conform standardelor SR ISO care au la bază tehnici de identificare microbiologică clasică. În practica de laborator au fost acceptate și analizatoare imunomicrobiologice care au rolul de a reduce timpul de analiză, volumul de muncă, consumabilele și, prin urmare, costurile.

În Ordinul ANSVSA 35 din 2016 sunt prezentate criteriile actualizate de evaluare microbiologică a laptelui crud, reglementate prin Regulamentul CE 853/2004 cu amendamentele ulterioare, iar metodele de lucru sunt standardizate și detaliate în standardele SE EN ISO 4833 și SR EN ISO 13366-1/AC sau ISO 13366-2 (fig.5.1.5 ).

5.1. Determinarea Numarului total de germeni mezofili aerobi/ml lapte prin metoda clasică

Metoda standardizată pentru determinarea NTGMA/ml lapte, a fost și rămâne, metoda culturilor în plăci care are ca principiu de lucru, efectuarea diluțiilor zecimale din produsul testat și efectuarea însămânțărilor prin încorporare, în două plăci cu mediu nutritiv pentru fiecare diluție în parte.

S-a realizat în conformitate cu cerințele SR ISO 4833/1992 respectiv SR ISO 4833/ 2003.

Principiul metodei constă în numărarea microorganismelor per mililitru de probă, dezvoltate sub formă de colonii pe un mediul solid, după incubarea în condiții de aerobioză, timp de 72 h la 300C.

Este important ca eșantionul examinat să fie reprezentativ și să nu fie deteriorat sau modificat în timpul transportului sau depozitării. Proba se pregătește conform standardului specific ISO 6887 sau ISO 3261.

Metoda de lucru:

a)Omogenizarea și obținerea diluțiilor:

Înainte de însămânțarea, în mediile de cultură, probele de lapte s-au omogenizat prin agitare și barbotare. S-a luat 1ml de probă și s-a introdus într-o eprubetă cu 9 ml ser fiziologic turnat în prealabil, obținându-se diluția 10-1. Dacă s-a estimat un număr mare de bacterii în probă s-au făcut, în continuare, diluții zecimale până la 10-3 …..10-6. (fig.5.1.1).

b)Însămânțarea:

Din diluțiile realizate, cu pipete sterile de 1 ml, după omogenizare, s-au repartizat câte 1ml în 2 plăci Petri, peste care s-a turnat aproximativ 15 ml mediu de cultură, topit și răcit la 45°C.

De la efectuarea diluției și până la încorporarea probei în mediu nutritiv, nu a trecut mai mult de 15 – 20 de minute. Se omogenizează conținutul plăcilor prin mișcări de rotație în plan orizontal în ambele sensuri și se lasă să se solidifice geloza.

c)Incubarea

Plăcile Petri însămânțate s-au întors cu capacul în jos și s-au introdus în termostat la temparatura de +30°C timp de 72 ore.

d)Numărarea coloniilor și exprimarea rezultatelor

Numărarea coloniilor s-a făcut ochioscopic luându-se în considerare numai plăcile Petri care conțin între 10 și 300 colonii (fig.5.1.2.).

Conform standardului, coloniile extinse s-au considerat ca o singură colonie. În cazul în care plăcile au fost acoperite pe mai puțin de un sfert din suprafață de către coloniile extinse, acestea au fost numărate pe partea de placă rămasă, iar în cazul în care suprafața mediului de cultură a fost acoperită de colonii extise pe mai mult de un sfert din placă, plăcile au fost excluse de la numărare.

În cazul în care s-a însămânțat o singură diluție, s-a calculat media aritmetică a numărului de colonii găsite în plăcile însămânțate cu aceeași diluție. Numărul găsit s-a înmulțit cu factorul de diluție respectiv.

În cazul în care s-au inoculat două sau mai multe diluții succesive, numărul total de germeni s-a determinat conform formulei:

N =Σc / (n1 + 0,1 x n2) x d

Unde: N = numărul total de germeni

Σc = suma coloniilor numărate pe toate cutiile reținute

n1 = numărul coloniilor din plăcile reținute, în care s-au numărat între 15 și 300 colonii la prima diluție

n2 = numărul coloniilor din plăcile reținute, în care s-au numărat între 15 și 300 colonii la a doua diluție

d = factorul de diluție corespunzător primei diluții

Rezultatul se exprimă în unități formatoare de colonii (ufc)/ml.

Datorită volumului mare de probe care trebuie lucrate într-un timp scurt, unitatea de prelucrare a laptelui deține un Bactocount Bentley calibrat și autorizat pentru efectuarea automată a analizelor pentru determinarea numărului total de germeni și numărului de celule somatice din lapte.

5.2. Determinarea Numărului total de germeni mezofili aerobi/ml (NTGMA/ml) din lapte utilizând BactoCount Bentley

Bactoscan-ul este o astfel de alternativă modernă la metoda de numărare cu placi Petri si este proiectat pentru deteminarea complet automată, rapidă și fidelă a calității igienice a laptelui proapăt. Aceasta este realizată prin cuantificarea numărului total de bacterii individuale (IBC) dintr-o proba de lapte. (Fig.5.2.1)

BactoCount IBCm marchează bacteriile cu o vopsea fluorescentă, reduce și dispersează componentele laptelui astfel încât bacteriile să poată fi numărate. Un detector de fluorescență detectează lumina emisă de către bacterii. Pulsațiile de lumină sunt convertite în pulsații electronice și apoi numărate și afișate pe un calculator.

BactoCount IBCm folosește citometria în flux () pentru numărarea rapidă a bacteriilor individuale în laptele nepasteurizat. Probele de lapte au fost dispersate manual în fiole individuale. Un reactiv de incubare, compus dintr-un tampon de clarificare, o enzimă proteolitică, un marker fluorescent au fost apoi adăugate pentru a liza celulele somatice, pentru a solubiliza globulele de grăsime și proteinele, pentru a permeabiliza bacteriile și marca ADN-ul. Fiolele sunt apoi așezate într-un incubator la 50°C. Markerul fluorescent se intercalează rapid și selectiv în toți acizii nucleici ai bacteriilor dublu catenar. Amestecul a fost apoi sonicat manual în timpul incubării în două ocazii diferite. Procesul de sonicare a fost folosit pentru a ajuta la descompunerea chimică a particulelor, pentru a distruge restul coloniilor de bacterii, pentru a îmbunătăți detectarea bacteriilor individuale și pentru a reduce fluorescența de fundal.

După perioada de incubare, amestecul s-a transferat manual, de pe tava de incubare, la o pipetă de prelevare a probelor. Amestecul a fost introdus la citometrul în flux unde bacteriile au fost aliniate și expuse unei raze intense de laser fluorescentă. Semnalul fluorescent este colectat de lentile optice, filtrat și detectat într-un fotomultiplicator. Impulsurile fluorescente se intensifică și sunt înregistrate și folosite ca parametri de rețea. Impulsurile sortate sunt apoi traduse în numerotare individuală a bacteriilor după calibrarea instrumentului.

Tehnica de lucru:

1.Prelevarea probelor de lapte

1 ml de lapte s-a introdus manual cu pipeta într-o fiolă din oțel inoxidabil.

2. Adăugarea reactivului de incubare:

Pentru a începe marcarea bacteriilor și degradarea componentelor care intervin, s-au introdus 2 ml de reactiv de incubare.

3. Incubarea

Fiola cu probă a fost așezată pe un modul de incubare unde este incubată la 50° C pentru a accelera reacția enzimatică și degradarea componentelor care intervin.

4. Prima sonicare

O sondă de ultrasunete s-a folosit pentru a ajuta la descompunerea particulelor care intervin și pentru a optimiza contactul dintre reactivi și diferitele elemente din proba de lapte.Tratamentul cu ultrasunete a permis optimizarea ratei semnal/zgomot, scăzând zgomotul de fundal și crescând marcarea ADN-ului bacteriilor. Sonda de ultrasunete s-a aplicat manual după o anumită perioadă de incubare.

5. Incubare

6. A doua sonicare

7. Incubare

8. Injectarea în citometrul flux

Proba s-a mutat de pe placa de incubare la pipeta de prelevare a probelor a instrumentului. O parte a amestecului de incubare s-a folosit pentru a purja liniile, supapele și acul de injectare. Din amestecul de incubare 200:1 s-a prelevat de o seringă și injectat în citometrul în flux.

9. Analiză

Bacteriile marcate curg print-un capilar și sunt concentrate hidromatic în centrul fluxului de celule. Bacteriile marcate sunt apoi expuse la o rază intensă de laser și fluorescență. Semnalul de fluorescență este colectat de lentilele optice, filtrat și detectat cu un fotomultiplicator de înaltă sensibilitate. Lățimea și intensitatea impulsurilor fluorescente sunt colectate și salvate.

Impulsurile sunt apoi sortate ca o funcție a înălțimii și lățimii lor și impulsurile peste limitele predefinite sunt numărate și traduse în numărătoarea individuală bacteriană (fig.5.2.2.).

Figura 5.2.2 Forma de prezentare electronică a rezultatelor pentru NTGMA/ml

Laptele livrat de producător ,fabricilor de procesare a laptelui, trebuie să corespundă normelor de calitate, atestate prin buletinele de analiza și control ale laboratoarelor acreditate și acceptate de producători si procesatori, să provină de la animale bine hranite, controlate sanitar-veterinar, indemne de boli si nesupuse unor tratamente medicamentoase.

5.3. Determinarea numărului de celule somatice (NCS/ml) din lapte utilizând BactoCount Bentley

Conform SR EN ISO 13366 determinarea numărului de celule somatice este reglementată prin trei metode:

metoda microscopică (SR EN ISO 13366-1:2008)

metoda fluoro-opto-electronică (SR EN ISO 13366-2:2007), adoptată prin metoda confirmării, de la CEN ( Comitetul European pentru Standardizare. Acest standard defineste o metoda pentru numararea celulelor somatice atat din materia prima, lapte, cat si din laptele conservat prin mijloace chimice. Metoda utilizeaza un aparat special, avand la baza principiul fluorescentei din optica. Celulele somatice: au o intensitate fluorescenta minima datorata colorarii ADN-ului din nucleul lor.

Metoda de numărare eloctronică a celulelor somatice

Metoda de numărare eloctronică a celulelor somatice;

În laboratorul de analize s-a efectuat determinare NCS/ml cu ajutorul aparatului SomaCount IBCm (fig 5.3.1). Tehnica de lucru este identifică cu cea de la NTGMA, diferențele constând în compoziția reactivului de incubare care conținea 2 soluții în loc de trei și prin lipsa sonicării probelor examinate.

5.4. Examenul bacteriologic calitativ al laptelui

Laptele crud reprezintă un mediu de cultură excelent pentru multiplicarea microorganismelor. În toată perioada anului, animalele aflate în perioada de lactatie sunt expuse infecțiilor la nivelul glandei mamare cu germeni de contaminare condiționat patogeni.

În cadrul laboratorului uzinal, conform unei diagrame proprii de testare prin autocontrol, o parte din eșantioanele de lapte de vacă au fost analizate și pentru indicatorii microbiologici: Enterobacteriaceae/ml și stafilococi coagulazo-pozitivi/ml.

Într-un tanc de colectare, un eventual lapte contaminat este mult diluat iar probabilitatea de a se identificata microorganismele patogene este mult diminuată. În aceste condiții, ne-am propus să analizăm din punct de vedere bacteriologic câteva probe de lapte, prelevate după muls, din bidoanele de recoltare și care este achizitionat de unitatea de prelucrare a laptelui, din zona Dornelor (fig.5.4.1 )

Astfel, cu scopul de a face o evaluare suplimentară a calității microbiologice a laptelui de vacă, în anul 2018 s-au prelevat și examinat 14 probe de lapte, recoltate în lunile mai și iunie (fig.5.4.2 ).

Probele de lapte au fost testate la Laboratorului de Microbiologie din cadrul Facultății de Medicină Veterinară -USAMV Iași (fig.5.4.3.).

Examenul bacteriologic a urmat etapele clasice de diagnostic, respectiv examenul bacterioscocic direct urmat de examenul bacteriologic propriu-zis.

Examenul bacterioscopic direct

Această primă etapă este necesară pentru punerea în evidență a eventualelor microorganisme prezente în materialul patologic și, implicit, alegerea mediilor de cultură adecvate. Etapele de lucru includ executarea frotiului, colorarea și examinarea morfologiei bacteriene. Colorarea froturilor s-a făcut prin trei metode: metoda uzuală Gram, metoda Giemsa pentru evidențierea capsulei bacteriene și metoda Ziehl Neelsen pentru punerea în evidență a bacteriilor alcalo-acido-rezistente (micobacterii, nocardii). Examinarea frotiurilor colorate în vederea evaluării morfologiei bacteriene, s-a efectuat la microscopul optic Optika și Leica utilizând obiective cu imersie x100 și oculare de x10.

Examenul bacteriologic propriu-zis a constat în efectuarea însămânțării probelor de lapte atât pe medii de cultură uzuale aerobe și anaerobe, cât și pe medii speciale și selective. După însămânțare, mediile de cultură s-au incubat în termostat, la 370C, în condiții de aerobioză și anaerobioză. Pentru cultivarea bacteriilor anaerobe, incubarea s-a realizat într-un recipient cu etanșare perfectă și în care s-au introdus substanțe care crează și mențin anaerobioza.

Mediile de cultură uzuale pentru cultivarea bacteriilor aerobe, utilizate în practica bacteriologică curentă au fost reprezentate de bulion (mediu lichid), agar nutritiv sau geloza (mediu solid), îmbogățite cu produse biologice (ser normal de cal și sânge 5% de berbec sau cal). Pentru bacteriile anaerobe s-au folosit bulion și geloza VF (Liver Meat Glucose Cysteine Broth and Agar) bulion Tarozzi, geloza Veillon, bulion cu thioglicolat pentru bacterii anaerobe.

Mediile selective utilizate conțin substanțe ce inhibă dezvoltarea bacteriilor de contaminare, colectate, eventual, în timpul prelevării. Există o diversitate de medii selective, în raport cu diversitatea microorganismelor patogene suspicionate.

Mediile selective și diferențiale utilizate au fost:

– Mediul EMB (Levine) – cu agenți inhibitori de tipul eozinei Y și albastrului de metilen, care inhibă bacteriile gram pozitive;

Mediul Mac Conkey – cu agenți inhibitori de tipul sărurilor biliare și cristalului violet;

Mediul Chapmann – conține 7,5% NaCl (inhibitor pentru celelalte bacterii) și manitol, utilizat pentru devoltarea stafilococilor coagulazo-pozitivi din produse biologice;

Mediul Agar – infuzie cord – creier, pentru bacterii pretențioase anaerobe și aerobe;

Mediul Agar- bilă – esculin – azid de sodiu, selectiv pentru izolarea și identificarea enterococilor;

Mediul Brucella – agar selectiv pentru microorganisme anaerobe;

Mediul SPS Agar (Perfringens Selective Agar)

Mediul GBS – mediu special pentru izolarea și identificarea streptococilor de grup B ( Streptococcus agalactiae),

După 24-48 ore de incubare, tulpinile microbiene dezvoltate pe mediile de cultură au fost examinate din punct de vedere cultural și morfologic.

Evaluarea bacteriilor pe mediile de cultură a constat în aprecierea aspectelor culturale:

în mediu lichid, urmărind gradul de turbiditate sau limpezimea mediului, caracterele depozitului (granular, floconos, aderent, neaderent) precum și prezența unor formațiuni la suprafață (inel, peliculă);

pe medii solide, urmărind: modul de dezvoltare (cultură în gazon sau colonii izolate), forma, dimensiunea, marginile și suprafața coloniilor bacteriene, gradul de opacitate sau transparență, prezența pigmenților și aderența la mediu;

Aspectele culturale au fost corelate cu morfologia bacteriană care a constat în aprecierea formelor, dimensiunilor, modul de grupare celulară, prezența sau absența unor structuri cum sunt endosporii, granulele metacromatice. Afinitatea tinctorială (reacțiile de culoare) a fost determinată prin colorația diferențială Gram, care împarte bacteriile în Gram pozitive (violete), Gram negative (roșii) și gram variabile, colorația Ziehl Neelsen care împarte bacteriile în acido-rezistente (roșii) și neacido-rezistente (albastre).

Toate tulpinile bacteriene izolate au fost evaluate și din punct de vedere al metabolismului enzimatic, unele teste de patogenitate și serotipizare.

Pentru diferențierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae de cele non-Enterobacteriaceae, s-a folosit testul oxidazei. Este un test colorimetric și constă în punerea în contact a tulpinei bacteriene Gram negative cu reactivul de tetrametil parafenilen diamină, impregnate în benzi de hârtie de filtru. Virarea culorii galben în mov-albastru indica un test pozitiv. Enterobacteriaceele sunt oxidază negative.

Pentru diferențierea Gram negativilor s-au efectuat teste biochimice uzuale utilizând mediile politrope :

MIU (mobilitate, indol, uree) conține roșu fenol pentru determinarea testului ureazic iar pentru testul indolului se atașează o bandă îmbibată cu reactiv Ehrlich-Kovacs la suprafața mediului;

TSI (triple sugar iron agar) conține glucoză, lactoză, zaharoză pentru studiul fermentării acestora, sulfat de Fe pentru detectarea producerii de hidrogen sulfurat;

De asemenea, în unele cazuri, activitatea metabolică a fost completată și testată utilizând galeriile API 20 NE, API 20 E. Galeriile API sunt constituite din microtuburi care conțin diverse substraturi sub formă deshidratată.S-au testat doar tulpinile izolate în culturi pure din care s-au efectuat suspensii cu turbiditate echivalentă scării nefelometrice 0,5 Mc Farland. Galeriile inoculate s-au termostatat la 35-37°C, timp de 24 ore, după care s-a făcut prima citire, notându-se rezultatele obținute. Metaboliții produși s-au pus în evidență cu diferiți indicatori de pH sau prin adăugarea de reactivi, după 24 sau 48 ore de incubare la 35-37 oC. După citire (după 24 sau 48 ore) s-au introdus și agenții suplimentari, care diferă de la un sistem de identificare la altul: Api 20E (TDA, IND,VP, NIT). Reacțiile produse în timpul perioadei de incubație s-au tradus prin schimbări spontane de culoare. După o incubație de 18-24 de ore, la o temperatură de 35-370C, citirea reacțiilor s-a făcut vizual, cu ajutorul unui tabel de citire. Identificarea s-a realizat plecând de la profilul numeric. Interpretarea codului numeric s-a realizat cu ajutorul Catalogului de interpretare: după obținerea codului numeric, în catalog se găsesc informațiile corespunzătoare codului respectiv.

CAPITOLUL VI

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Starea de sănătate a vacilor, mediul, procedurile de muls și salubritatea echipamentelor pot influența nivelul contaminării microbiene a laptelui crud. Toți acești factori vor influența numărul total de bacterii (NTGMA) și numărul de celule somatice (NCS/ml) precum și tipurile de bacterii prezente în lapte, la un moment dat.

6.1. Determinarea NTGMA/ml și NCS/ml pentru laptele crud de vacă

În perioada 2017-2018, a fost evaluată dinamica mediei lunare pentru indicatorii NTGMA/ml și NCS/ml cu care se monitorizează calitatea igienică și microbiologică a laptelui. Evaluările s-au realizat conform buletinelor de analiză eliberate de Laboratorul uzinal al Unității de procesare a laptelui ( fig.6.1.1).

Rezultatele obținute pe eșantioanele recoltate în anul 2017, sunt prezentate în tabelul 6.1.1.1 și tabelul 6.1.1.2

Tabelul 6.1.1.1

Valorile indicatorilor NTGMA/ml si NCS/ml la eșantioanele de lapte crud de colectură, în anul 2017

Valorile medii obținute la eșantioanele prelevate din laptele de colectură, pentru cei doi indicatori NTGMA/ml și NCS/ml au fluctuat pe parcursul celor 12 luni.

Din analiza mediilor lunare obținute la NTGMA/ml raportate la valorile maxim admise conform legilației în vigoare, reiese conformitatea laptelui crud de colectură la majoritatea eșantioanelor examinate pe parcursul anului 2017 (până în 100.000 ufc/ml), cu excepția lunilor iunie (110.000 ufc/ml) și iulie (105.000 ufc/ml) (fig. 6.1.2 ).

În ce privește indicatorul NCS/ml lapte, valorile medii lunare au arătat conformitatea laptelui în toate lunile anului cu excepția lunii martie când s-a identificat o creștere ușoară a valorilor de la 400.000 celule somatice /ml la 480.000 celule somatice/ml. În luna aprilie, valoarea NCS/ml la laptele de colectură s-a normalizat, urmând o scădere treptată , cu ușoare variații, a valorilor mediei lunare până la sfârșitul anului.

În anul 2018, calitatea microbiologică a laptelui colectat pentru Unitatea de prelucrare a laptelui, a fost superioară anului anterior, aspect evidențiat din analiza celor doi indicatori NTGMA/ml și NCS/ml.

Comparativ cu anul anterior, calitatea microbiologică a laptelui de colectură a fost corespunzătoare în cele 11 din cele 12 luni ale anului, excepție făcând luna lui mai, când s-au înregistrat valori crescute peste limitele admise la ambii indicatori. Astfel, NTGMA/ml a fost de 250.000 ufc/ml, limita admisă fiind de 100.000 ufc/ml iar NCS/ml a fost de 500.000 celule somatice/ml față de 400.000 celule somatice/ ml cât prevăd normativele actuale (tabelul 6.1.1.2 , fig.6.1.3 )

Tabelul 6.1.1.2

Valorile indicatorilor NTGMA/ml si NCS/ml la eșantioanele de lapte crud de colectură, în anul 2018

Analiza generală a datelor obținute pe parcursul anilor 2017-2018, arată că, laptele de colectură provenit de pe una din rutele de colectare din zona Dornelor, îndeplinește în majoritatea cazurilor standardele impuse pentru un lapte de calitate.

Apariția fluctuațiilor valorice la cei doi indicatori luati în studiu, poate avea diferite cauze. Factorii care pot influența creșterea numărului de microorganisme și a numărului de celule somatice în lapte, sunt diferiți și țin de animal, de crescătorul de animale sau de condițiile de transport care trebuie să fie proprii produsului colectat, având în vedere perisabilitatea laptelui.

În cei doi ani luați în studiu s-a observant că valorile medii obținute la NTGMA, au depășit limitele admise la sfărșitul primăverii și începutul verii. Această creștere a numărului de germeni aerobi mezofili în această perioadă poate fi consecința creșterii temperaturii ambientale care favorizează în mod firesc dezvoltarea microorganismelor și a transportului în cisterne care nu asigură temperatura optimă întreține multiplicarea microbiană. La fel de important este temperatura de depozitare a laptelui și durata de timp în care laptele este stocat înainte de a fi preluat de cisterna de colectare și care permit multiplicarea contaminanților bacterieni.

Alți factori care pot influența aceste valori ale NTGMA sunt legați de o eventuală contaminare inițială a laptelui. Laptele este sintetizat de celulele din interiorul glandei mamare. Glanda mamară a fost considerat un organ steril dar utilizarea metodelor moleculare de cuantificare și secvențiere a ADN-ului bacterian, a furnizat rezultate care sugerează existența unor comunități microbiene comensale [Oikonomou G, și col., 2012; Martín R și col., 2007]. După această etapă, contaminarea bacteriană poate apărea, în general, din trei surse principale; din interiorul ugerului, din afara ugerului și de pe suprafațele echipamentelor utilizate pentru manipularea și depozitarea laptelui. (Coorevits și colab ., 2008 , Lejeune si Rajala Schultz, 2009, Cheyrou și colab ., 2011).

În același context, eventualele deficiențe de igienă care pot să apară pe tot parcursul trasabilității laptelui au drept consecință creșterea numărului de microorganisme din lapte. Uneori, beneficiarul întâmpină greutăți în implementarea normelor de igienă la nivelul producătorului particular, care acceptă mai greu normele impuse.

– O altă cauză a creșterii valorilor celor doi indicatori de calitate microbiologică poate fi infecția localizată la nivelul ugerului.

Laptele crud, în timp ce părăsește ugerul vacilor sănătoase, conține, în mod normal, un număr foarte mic de microorganisme și, în general, va conține mai puțin de 1000 cfu/ml. (Kurweil, 1973). În mod obișnuit, laptele de vacă conține o populație de bacteria lactice semnificativă care include specii din genurile: Lactococcus (8,2 x 10 1 -1,4 x 10 4 CFU mL -1 ),Streptococ (1,41 x 10 1 -1,5 x 10 4 CFU mL -1 ), Lactobacillus (1,0 x 10 2 -3,2 x 10 4 CFU mL -1 ), Leuconostoc (9,8 x 10 1 -2,5 x 10 3 CFU mL -1 ) și Enterococcus spp. (2,57 x 10 1 -1.58 x 10 3 CFU ml -1). Există și microorganisme psihotrofe, cum ar fi Pseudomonas, Acinetobacter și Aeromonas spp., care se dezvoltă foarte bine în timpul păstrării la temperature de refrigerare (Raats și col., 2011). Cu toate acestea, noile evoluții în ceea ce privește tehnologiile de secvențiere a ADN-ului au evidențiat faptul că diversitatea acestor bacterii este mai mare decât cea apreciată inițial (Masoud și col., 2012).

O vacă cu mastită va elimina un număr mai mare de microorganisme în laptele produs. Influența mastitei asupra numărului total de bacterii ale laptelui în vrac depinde de tipul de bacterii, de stadiul de infecție și de numărul de sferturi infectate. O vacă cu mastită generalizată poate elimina peste 10.000.000 de celule bacteriene / ml lapte. Principalele grupe de microorganisme sunt micrococi (inclusiv stafilococi) și streptococi. Dintre acestea, cele mai agresive bacterii care pot declanșa o mastită și pot duce la o creștere reprezentativă a numărului de bacterii din lapte sunt streptococii, în special Streptococcus agalactiae șu Streptococcus uberis și coliformii (Bramley & McKinnon, 1990; Bramley și colab, 1984;. Gonzalez și colab, 1986;.). Lipsa de igienă a ugerului poate fi o altă sursă de contaminare a laptelui. În timpul mulsului, principala sursă de bacterii din lapte sunt suprafețele de contact ale laptelui cu echipamentele de muls. De asemenea, în timpul depozitării și transportului, microflora din lapte se schimbă și se constată o creștere a numărului de bacterii psihotrofice ( Slaghuis, B., 1997)

Infecțiile gladei mamare sunt însoțite de procese inflamatori care duc la creșterea numărului de celule somatice din lapte, peste valorile admise (400.000 celule somatice /ml). NCS crește în cazul mastitei,deoarece globulele albe din sânge sunt atrase la locul infecției. Această creștere a numărului de celule somatice atinge valori maxime la începutul procesului inflamator, iar descreșterea se face brusc, menținându-se într-un echilibru valoric normal, până la sfârșitul anului.

Prezența în lapte a celulelor somatice cu valori apropiate de limita maxim admisă, poate fi și cauza unor mamite subclinice, a stressului de muls și sezonul, vârsta și stadiul lactatiei (în lactația a III-a crește numărul celulelor somatice), infecții localizate la alte organe și alte cauze indirecte (Voicu E., 2010). Este dificil de stabilit care sunt cauzele variațiilor ușoare ale NCS/ml peste normele admise cât timp există factori fiziologici multipli, care influențează prezența acestora. Pentru vacile în lactație, multe cercetări au raportat fluctuații semnificative ale NCS-ului din lapte în funcție de timpul eșalonării mulsului. NCS-ul a fost mai ridicat în laptele proaspăt recoltat, urmat de o scădere graduală, până la mulsul următor. S-a raportat și o variație importantă a NCS la mulsul de dimineață și seară în zile consecutive. Aceste variații diurne ale NCS-ului sunt importante în stabilirea unor proceduri reprezentative statistic pentru 24 de ore (Harris B., 1995). Cu toate acestea, peste această limită, indiferent dacă laptele prezintă sau nu, modificări senzoriale sau biochimice intră automat în categoria suspect si este scos din circuitul de valorificare.

6.2. Identificarea germenilor patogeni în probele de lapte crud provenit de la vacă și oaie

Studiile au arătat că o treime din laptele crud poate conține cel puțin un tip de agent patogen, chiar și atunci când provine din animale sănătoase din punct de vedere clinic sau din lapte care pare să fie conform (adică prezintă un număr mic de bacterii ), ( Desmasures și col. , 1997; Griffiths, 2010a; Lucey, 2015). Ele pot proveni de la animale sau din contaminarea mediului în timpul colectării și depozitării laptelui.

Cu toate acestea, conform registrelor interne ale Unității de prelucrare a laptelui, toate eșantioanele de lapte de vacă prelevate din tancurile de colectare a laptelui de pe ruta de colectare luată în studiu, au fost conforme la indicatorii microbiologici: Enterobacteriaceae/ml și stafilococi coagulazo-pozitivi/ml lapte.

Examenul bacteriologic efectuat pe cele 14 probe de lapte de vacă recoltat din bidoanele de colectare individuale, a constat în determinarea numărului total de germeni într-un mililitru de lapte, prezența coliformilor, prezența speciei Escherichia coli și a speciei Staphylococcus aureus.

Pentru determinarea NTG /ml din probele de lapte s-a utilizat metoda diluțiilor seriate. După efectuarea acestor diluții, probele s-au însămânțat prin încorporare în geloză nutritivă. Din fiecare diluție s-a luat câte 1 ml lapte și s-a disribuit în plăci Petri .Plăcile s-au incubat la termostat la temperatura de 370C, timp de 48 de ore, După incubare s-a procedat la citirea și interpretarea rezultatelor, care sunt sintetizate în tabelul 6.2.1.1

Pentru determinarea bacteriilor coliforme (Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter) și a Escherichia coli din probele de lapte, s-au efectuat diluții seriate, din care s-a prelevat câte 1 ml și care s-a repartizat în câte trei eprubete pentru fiecare diluție, eprubete ce conțin mediul de îmbogățire B.B.L.V (bulion-bilă de bou-lactoză-verde briliant), în cantitate de 10 ml și tubulețe Durham pentru identificarea prezenței gazelor de fermentație (figura 6.2.1). Eprubetele s-au termostatat timp de 48 de ore la 30-370 C, iar apoi s-au notat eprubetele în care s-a observat prezența gazelor în tubul colector sau care au prezentat turbiditate (figura 6.2.2).

Figura 6.2.1. Aspectul mediul B.B.L.V însămânțat cu diluțiile de lapte, înainte de termostatate

Figura 6.2.2. Aspectul mediul B.B.L.V după termostatare – prezența gazelor de fermentație și turbiditate

Din tuburile considerate prezumtiv pozitive, s-a striat o ansă de cultură pe mediul geloză-eozină-albastru de metilen (GEAM sau Levine) repartizat în plăci Petri, astfel încât să se obțină colonii izolate. Plăcile s-au incubat la 30-370C timp de 24 ore. S-a confirmat prezența bacteriilor în tuburile cu mediu lichid din care s-au dezvoltat colonii cu următoarele caracteristici:

– colonii ușor bombate, cu margini netede, diametru de 2-4 mm, de culoare violet închis până la negru, cu suprafață cu luciu metalic și reflex auriu-verzui;

– colonii atipice cu diametrul de 4-6 mm, bombate, cu aspect mucoid, fără luciu metalic, de culoare roz, cu centrul gri-brun (fig 6.2.3 ).

Pentru a evidenția Escherichia coli, din coloniile caracteristice, colonii închise la culoare cu luciu metalic și reflex auriu-verzui, dezvoltate pe mediul Levine (fig. 6.2.4), s-au însămânțat într-o eprubetă cu Bulion nutritiv, care s-a incubat la 440C, timp de 24-48 ore, după care s-au pus câteva picături de reactiv Kovacs, pentru a evidenția formarea indolului din triptofan. (fig.6.2.5 ).

În scopul determinării prezenței stafilococilor coagulază-pozitivi, pe suprafața uscată a unei plăci Petri cu mediu Chapman, s-a etalat 0,1 ml din diluțiile seriate ale probei de analizat. Plăcile s-au incubat la 30-370C, timp de 24-48 ore și apoi s-au interpretat rezultatele. Pe mediul Chapman, stafilococii formează colonii tipice de culoare galbenă, iar mediul virează în galben, fapt ce indică fermentarea manitolului. În urma testării, nu au fost izolați stafilococi manitol și coagulază pozitivi.

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 6.2.1.1

Tabelul 6.2.1.1

Rezultatele evaluării bacteriologice a probelor de lapte prelevate în perioada mai-iunie 2018

Analizând rezultate obținute, se observă faptul că încărcătura microbiană a laptelui a variat de la o probă la alta, majoritatea (8 probe) fiind conforme. La 6 din cele 14 probe de lapte examinate, încărcătura microbiană a depășit limita maxima admisă de 100.000 ufc/ml, valorile situându-se între 110.000 – 215.000 ufc/ml ceea ce denotă o calitate igienică îndoielnică. Acest aspect este susținut și de prezența coliformilor și în mod special a speciei Escherichia coli, microorganisme care au ca nișă ecologică tubul digestiv.

Gradul de contaminare cu bacterii coliforme reflectă condițiile de igienă în care sunt întreținute animalele sau condițiile de igienă în care s-au recoltat probele și s-au manipulat ustensilele pentru muls. Contaminarea laptelui cu bacterii coliforme se realizează prioritar prin intermediul apei cu care se spală vasele și al materiilor fecale.

Din analiza datelor prezentate a reieșit că încărcătură microbiană a laptelui prelevat individual din bidoanele de colectare a fost semnificativ mai ridicată, comparând rezultatele obținute la eșantioanele prelevate din tancurile de colectare și testate în cadrul laboratorului uzinal al Unității de procesare a laptelui.

Sistemul de colectare a laptelui prin muls manual nu poate fi eliminat în totalitate. Numărul mic de ferme din zona Dornelor, specializate pe creșterea vacilor de lapte, duce la necesitatea colectării laptelui de vacă de la crescătorii individuali (gospodăriile populației), constituite în rute de colectare aferente fiecărei unități de procesare a laptelui. Acest aspect avantajează beneficiarul prin costul redus/litru de lapte, dar are dezavantajul condițiilor de igienă în care se derulează mulsul. Există astfel riscul contaminării și a laptelui recoltat corespunzător, prin amestecul în bidoanele respectiv tancurile de colectare.

Analiza finală a investigațiilor efectuate prin determinarea celor doi parametrii de calitate igienică (NTGMA/ml lapte și NCS/ml lapte) precum și identificarea coliformilor respectiv a specie Escherichia coli, reflectă unele deficiențe igienice pe parcursul trasabilității laptelui. . Cresterea numărului total de germeni din lapte cu precădere în primele luni de primăvară explicația ar putea fi consecința furajării în stabulație, existând riscul contaminării microbiene a laptelui cu microorganismele din microaeroflora adăposturilor, știind faptul că laptele a fost recoltat de la animale exploatate în sistem gospodăresc.

CAPITOLUL VII

CONCLUZII

În perioada 2017-2018, laptele de colectură din zona Dornelor, a cărui beneficiar este o Unitate de prelucrare a laptelui din zona, îndeplinește în majoritatea cazurilor, standardele impuse pentru igiena și salubritatea laptelui.

În anul 2017, valorile mediei lunare obținute la NTGMA/ml lapte de colectură, au fost conforme (până în 100.000 ufc/ml) la majoritatea eșantioanelor examinate, cu excepția lunilor iunie (110.000 ufc/ml) și iulie (105.000 ufc/ml).

În anul 2017, valorile medii lunare obținute la NCS/ml laptele de colectură, au fost conforme, cu excepția lunii martie când s-a identificat o creștere ușoară a mediei, de la 400.000 celule somatice /ml la 480.000 celule somatice/ml.

În anul 2018, valorile mediei lunare obținute la NTGMA/ml și NCS/ml pentru laptele de colectură de pe aceeași rută de colectare, au fost conforme în 11 din cele 12 luni ale anului.

Examenul microbiologic efectuat pe 14 probe de lapte prelevate din bidoanele de colectare ale unor microferme familiale, a evidențiat un număr de 6 probe neconforme la NTGMA/ml, 7 probe contaminate cu coliformi și respectiv Escherichia coli. Nu au fost identificați stafilococi coagulazo-pozitivi.

Rezultatele obținute reflectă necesitatea respectării sau îmbunătățirii condițiilor de igienă la nivelul fiecărei microferme familiale.

BIBLIOGRAFIE

Apostu S., (2004) – Managementul calității alimentelor, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca

Apostu S., (2006) – Microbiologia produselor alimentare. Lucrări practice.Vol. , Edit. Risoprint, Cluj-Napoca

Bărzoi D., Apostu S., (2002) – Microbiologia produselor alimentare, Ed. RISOPRINT, Cluj-Napoca.

Bondoc I., (2007) – Tehnologia și controlul calității laptelui și produselor lactate ,Vol.I. Ed. “Ion Ionescu de la Brad” Iași

Bondoc I., Șindilar E.V., (2002) – Controlul sanitar veterinar al calității și salubrității alimentelor. Vol. I., Ed. "Ion Ionescu de la Brad", Iași.

Bramley, A.J., C.H. McKinnon, R.T. Staker and D.L. Simpkin. 1984. The effect of udder infection on the bacterial flora of the bulk milk of ten dairy herds. J. Appl. Bacteriol. 57:317.

Bramley, A.J. and C.H. McKinnon. 1990. The microbiology of raw milk. pp. 163-208 in Dairy Microbiology, Vol. 1. Robinson, R.K. (ed.) Elsevier Science Publishers, London.

Carp-Cărare M., Guguianu Eleonora, Timofte Dorina, (1997) – Lucrări practice de microbiologie veterinară, Universitatea Agronomică și de Medicină Veterinară „Ion Ionescu de la Brad”, Iași

Ciotău C., (2006) – Contribuții privind aprecierea calității și stării igienice a unor sortimente de lapte praf produse de SC Rarăul SA Câmpulung Moldovenesc, Teză de doctorat, Iași

Floriștean V., (2006) – Caracterizarea bacteriologică și patologică a unor specii de Bacillus cereus izolate din alimente”, F.M.V. Iași

Georgescu G., Coșarcă D., Duicu G., Petruț Sorina, Claudia Alexandru, Hilda Gieb-Schramm, (2007) – Ghid de bune practice de igienă și de producție în industria laptelui și produselor lactate, Editura Afir, București.

Georgescu Gh., (1999) – Calitățile și defectele laptelui în concept european. Rev. Agricultorul român, Nr.1, p.13

Georgescu Gh., (2007) – Cartea producătorului și procesatorului de lapte,vol. II, Editura Ceres, București.

Georgescu Ghe. și col.,(2005) – Cartea producătorului și procesatorului de lapte. Vol. 4., Ed.Ceres, București

Georgescu Ghe., (2000) – Laptele și produsele lactate, Ed. Ceres, București.

Gonzalez, R.N., D.E. Jasper, R.B. Busnell, and T.B. Farber. 1986. Relationship between mastitis pathogen numbers in bulk tank milk and bovine udder infections. J. Amer. Vet. Med. Assoc. 189:442.

Haenlein, G. W.,(2002)- Relationship of somatic cell counts in goat milk to mastitis and productivity. Small Rumin. Res. 45:163–178.

Harris B., 1995 – The effect of feeding zinc proteinate on lactating dairy cows, Biotechnology in the Feed Industry Proceedings of Alltech's 11th Animal Symposium, Edit. T. P. Lyons and K.A. Jacques 27-31, Gainesville

https://academic.oup.com/femsre/article/37/5/664/541439

Ivana Simona, (2011) – Microbiologia alimentelor, vol.1, Ed. Asclepius, București

Ivana Simona., (2011) – Microbiologia alimentelor, vol.II și III (Patogeni alimentari), Ed. Asclepius, București

Kurweil, R., M. Busse. 1973. Total count and microflora of freshly drawn milk. Milchwissenschaft 28:427

Lucey J., 2015 – Raw milk consumption-risks and benefits. Nutr.Food.Sci 50 (4), p.189-193

M.W. Griffiths, The microbiological safety of raw milk, Improving the Safety and Quality of Milk, 10.1533/9781845699420.1.27, (27-63), (2010).

Maisi P., Junttila J., Seppanen J,.1987- Detection of subclinical mastitis in ewes. Br. Vet. J. 143:402–409.

Martín R, Heilig HG, Zoetendal EG, Jiménez E, Fernández L, Smidt H, Rodríguez JM. Cultivation-independent assessment of the bacterial diversity of breast milk among healthy women. Res Microbiol. 2007;158:31–37. doi: 10.1016/j.resmic.2006.11.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Masoud W Vogensen FK Lillevang S Abu Al-Soud W Sorensen SJ & Jakobsen M (2012) The fate of indigenous microbiota, starter cultures, Escherichia coli, Listeria innocua and Staphylococcus aureus in Danish raw milk and cheeses determined by pyrosequencing and quantitative real time (qRT)-PCR. Int J Food Microbiol 153: 192–202.

Mihaiu M., 1995 – Cercetări privind unii indici de calitate ai laptelui obținut în unități de producție din Transilvania.Teză de doctorat F.M.V. Cluj Napoca

Mihaiu M., Mihaiu Romolica, (1998)- Laptele și controlul calității sale, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca.

N. Desmasures, W. Opportune and M. Guéguen, Lactococcus spp., yeasts and Pseudomonas spp. on teats and udders of milking cows as potential sources of milk contamination, International Dairy Journal, 7, 10, (643), (1997).

Oikonomou G, Machado VS, Santisteban C, Schukken YH, Bicalho RC. Microbial diversity of bovine mastitic milk as described by pyrosequencing of metagenomic 16s rDNA. PLoS One. 2012;7:e47671. doi: 10.1371/journal.pone.0047671. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Pascal Rainard- Mammary microbiota of dairy ruminants: fact or fiction?, Vet Res. 2017; 48: 25. Published online 2017 Apr 17. doi: 10.1186/s13567-017-0429-2

Pomies D., Gasqui P., Bony J., Coulon J.P., Barnouin J.(2000) – Effect of turning out dairy cows to pasture on milk somatic cell count. Ann. Zootech., 49, 1, 39-44.

Popa G., Segal B., Apostol C, Dumitrache S., Segal Rodica (1986)- Toxicologia produselor alimentare. Ed. Academiei Române, București.

Raats D Offek M Minz D & Halpern M (2011) Molecular analysis of bacterial communities in raw cow milk and the impact of refrigeration on its structure and dynamics. Food Microbiol 28: 465–471.

Răpuntean Gh., Răpuntean S., (1998) – Bacteriologie veterinară, Ed, Ceres, București

Rotaru Gabriela, Moraru Carmen, (1997) – HACCP. Analiza riscurilor. Punctele critice de control. Ed. Academica, Galați

Rotaru O., Mihaiu M., (2001) – Igiena veterinară a produselor alimentare, vol.II- Lapte, ouă, miere, procesarea și conservarea alimentelor, Ed. Risoprint,pag.207

Rotaru O., Mihaiu M., (2002) – Igiena veterinară a produselor alimentare. Patologie prin alimente, Ed. Todesco, Cluj-Napoca.

Sandu Mariana, Man C., (2006) – Study regarding the ecological milk coming from farm and milk of great mixture coming from personal households in an industrial processing unit. Buletinul USAMV, nr.62, pag.107

Savu C., (1999) – Poluarea mediului și prezența substanțelor toxice în alimente. Controlul calității alimentelor, Ed. Semne, București.

Savu C., Georgescu Narcisa, (2004) – Siguranța alimentelor, riscuri și beneficii, Ed. SemnE, București

Savu C., Mihai Gabriela (1997) – Controlul sanitar veterinar al alimentelor, Ed. Ceres, București.

Slaghuis, B.- Source and significance of contaminants on different levels of raw milk production, Publisher : International Dairy Federation, 1997, Conference,

Standarde de stat: Norme tehnice de calitate și de metode de analiză pentru laptele integral-materie primă, STAS 6349/5-8-80

Stănescu V. (1988) – Igiena și controlul alimentelor. Practicum sanitar veterinar, 1998, Ed. Fundației "România de Mâine", București

Stănescu V., Apostu S., (2010) – Igiena inspecția și siguranța alimentelor de origine animală, Vol. I, Ed. Risoprint, Cluj Napoca

Stănescu V., Apostu S., (2010) – Igiena inspecția și siguranța alimentelor de origine animală, Vol. II, Ed. Risoprint, Cluj Napoca

Stănescu V., Apostu S., (2010) – Igiena inspecția și siguranța alimentelor de origine animală, Vol. III, Ed. Risoprint, Cluj Napoca

Șindilar E., Chidon A. D., (2002) – Contribuții la studiul incidenței speciei Staphylococcus aureus în lapte și unele produse lactate. Revista Română de Medicină Veterinară, București, vol.10,nr.3, 434.

Șindilar E., Ciotău C, Șindilar E.V., Bondoc I., (2002) – Aspecte privind dinamica lunară a încărcăturii bacteriene și a numărului de celule somatice a laptelui recepționat pe două rute. Lucrări științifice, U.S.A.M.V., voi. 45 (4), pag. 677-682.

Theodore J.D. Knight-Jones, M. Bernard Hang’ombe, Mwansa M. Songe, Yona Sinkala, and Delia Grace- Microbial Contamination and Hygiene of Fresh Cow’s Milk Produced by Smallholders in Western Zambia, Int J Environ Res Public Health. 2016 Jul; 13(7): 737. Published online 2016 Jul 21. doi: 10.3390/ijerph13070737

Voicu Elena, Carp-Cărare Mihai, (2007) – Researches regarding milk salubrity, Lucrări stiintifice USAMV Iași , vol. 50 (9) cu ISSN 1457-7406.Seria medicină veterinară

STAS 1981/A1/1998- Lapte și produse lactate

SR ISO 6610/1992 – Lapte și produse lactate : Stabilirea numărului de unități formatoare de colonii de microorganisme; Metoda numărării coloniilor la 300C.

SR ISO 5541-1 – Lapte și produse lactate – Stabilirea numărului de bacterii coliforme, Partea 1- Metoda numărării coloniilor la 300C.

SR ISO 4833/94- Standarde de stat: Norme tehnice de calitate și de metode de analiză pentru laptele integral-materie primă; Metodă orizontală pentru enumerarea microorganismelor; Tehnica de numărare a coloniilor la 300C.

SR ISO 7923/97- Standarde de stat: Norme tehnice de calitate și de metode de analiză pentru laptele integral-materie primă

SR ISO 13666-1-3/97/98- Standarde de stat: Norme tehnice de calitate și de metode de analiză pentru laptele integral-materie primă

SR ISO 6887-1/1999 – Microbiologia alimentelor și furajelor. Reguli generale pentru pregătirea suspensiei inițiale și a diluțiilor zecimale pentru examenul microbiologic

SR ISO 7402/1996 – Directive generale pentru numărarea, fără revifiere a Enterobacteriaceaelor

SR ISO 21528-2/2007 – Microbiologia alimențelor și nutrețurilor, Metoda orizontală pentru detecția și enumerarea enterobacteriaceelor. Partea 2 – Metoda de enumerare a coloniilor

SR ISO 18593/ 2007 – Microbiologia alimentelor și nutrețurilor. Metode orizontale privind tehnicile de eșantionare de pe suprafețe folosind plăci de contact și tampoane.

SR ISO 13366-2/2007 – Lapte. Enumerarea celulelor somatice, Partea 2: Linii directoare privind modul de operare a numărătorilor fluoro-opto-electronice.

SR EN ISO 13366-1/2008 – Lapte- Determinarea numărului de celule somatice , Metoda microscopică (metoda de referință)

xxxOrdinul nr. 975/1998 privind aprobarea Normelor igienico-sanitare pentru alimente.

xxxOrdinul M.S. 975/1998 privind aprobarea Normelor igienico-sanitare pentru alimente.

xxxOrdinul M.S. 976/1998 pentru aprobarea Normelor de igienă privind producția, prelucrarea, depozitarea, păstrarea, transportul și desfacerea alimentelor.

xxxOrdinul M.A.A.P. nr. 230/2002 pentru aprobarea Normei privind denumirile sub care se vinde și condițiile de calitate ale laptelui de consum.

xxxOrdinul M.A.A.P. nr. 389/2002 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind condițiile de sănătate pentru producerea și comercializarea laptelui crud, a laptelui tratat termic și a produselor pe bază de lapte, cu modificările și completările ulterioare.

xxxOrdinul M.A.A.P. nr. 346/2002 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind condițiile generale de igienă în exploatațiile de animale producătoare de lapte.

xxxOrdinul M.A.P.A.M. nr. 106/2004 privind completarea Ordinului Ministrului Sănătății și Familiei și al Ministrului Agriculturii, Alimentației și Pădurilor nr. 84/91/2002 pentru aprobarea Normelor privind contaminanții din alimente.

xxxOrdinul A.N.S.V.S.A. nr. 147/2004 pentru aprobarea normelor sanitare veterinare și pentru siguranța alimentelor privind reziduurile de pesticide din produsele de origine animală și nonanimală și reziduurile de medicamente de uz veterinar în produsele de origine animală.

xxx Ordinul ANSVSA 35/2016 –

xxxRegulament CE 853/2004 care stabilește cerințe de sănătate, criterii de calitate privind laptele crud, sec.IX., anexa III, cap.1

xxxRegulament CE nr.2073 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare, cu amendamentele ulterioare.

xxxISO 707:1997, Laptele si produsele lactate – Ghid pentru esantionare

www.ansv.ro

www.asro.ro/

www.europa.eu.int/eur

www.infolapte.ro