Conf. Dr. Beatrice Mihaela Radu Absolvent Roxana -Oana Ștefan (Bădău) Bucure ști 2018 2 UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI FACULTATEA DE BIOLOGIE… [607389]

1
UNIVER SITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA BIOLOGIE

Lucrare de licență

Coordonator
Conf. Dr. Beatrice Mihaela Radu

Absolvent: [anonimizat]
2018

2
UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOLOGIE
SPECIALIZAREA BIOLOGIE

Studiu asupra nivelului de expresie al receptorilor
muscarinici pentru acetilcolin ă ȋn celulele e ndoteliale
din microvascularizația cerebrală murină

Coordonator
Conf. Dr. Beatrice Mihaela Radu

Absolvent: [anonimizat]
2018

3
MMuullțțuummiirrii

Mulțumesc în primul rând p ărinților pentru tot sprijinul, în mod particular cel de
natură morală, pe care mi l -au oferit în momentele antemerg ătoare susținerii lucrării și de –
alungul perioadei mele de rebeliune „introspec tă” din timpul facultății.
Mulțumesc soț ului meu pentru liniștea și înțelegerea oferit ă în redactarea acestei
lucrări. Mulțumesc fi ului meu, care nu m -a lăsat să dorm nopțile , dându -mi ocazia de a
reflecta în timpul zilei, el fiind totodata un „stimul decl anșator potrivit” în acest proces.
Din punct de vedere științific, primele gânduri de recunoștintă se îndreaptă spre
coordonatorul licentei , Conf. Dr. Beatrice Mihaela -Radu , care cu profesionalism și
dedicație mi-a îndrumat munca cu multă competență, punân du-mi la dispoziție atât
cunoștințele sale, cât și un material bibliografic personal foarte prețios prin conținut ,
actualitate și sfera de cuprindere .
Mulțumiri speciale merg către Asistent cercetare Antonia -Teona Deftu și CS3
Adela Banciu , care a u fost or icând dispus e să îmi fie alături și să analizeze cu mine diferite
aspecte legate de partea practic ă a acestei lucrări.

4
Cuprins
Capitolul 1. Receptorii muscarinici pentru acetilcolin ă………………………. ……… 6
1.1. Subtipuri de receptori muscari nici……………… ……….. ……… …………….. ……………….. 7
1.2. Receptorii muscarinici neuronali ……………………….. ……… ………. …………………. …….8
1.3. Aplicații terapeutice ale liganzilor care acționează la nivelul receptorilor muscarinici
neuronali……………………………………………………………………………………………………… ………… 10
1.4. Receptorii muscarinici non -neuronali ……………. …………… ………………. ………………. ..14
1.4.1. Recept orii muscarinici exprimati în celulele tumorale ……… ……………. ………..15
1.4.2. Receptorii muscarinici exprimați ȋn ovare și placentă ……….. ……………. ………. 17
1.4.3. Receptorii muscarinici exprimați ȋn limfocite ……………………… …………….. …….18
1.4.4. Receptorii muscarinici exprimați ȋn celulele cutanate ………… ……………. ………. 19
1.4.5. Receptorii muscarinici exprimați ȋn keratinocite ……………………….. ……………. .20
1.4.6. Receptorii muscarinici exprimați ȋn cristalin ……………………………. ……………. ..20
1.4.7. Receptorii muscarinici exprimați ȋn celule endoteliale ……………….. ……………. .21
Capitolul 2. Receptorii muscarinici în endoteliul din microvasculariza ția
cerebrală ………………………………………………………….. …………………………………………………. 26
Capitolul 3. Scopul ș i obiectivele lucr ării……………….. …………… ……………… 32
Capitolul 4. Materiale și Metode …………………………. …………………. ……….. …….33
4.1. Cultivarea celulelor endoteliale – cultura primară………………………………… …….33
4.2. Cultivarea celulelor endoteliale – linie celular ă…………………………………… ……..33
4.3. Metoda de transcriere inversă cuplată cu reacț ie de polimerizare în lanț canti tativă ……34
4.4. Analiza datelor …………….. …………………………………………………………………….. …………… .38
Capitolul 5 . Rezultate și Discuții …………… ……………….. ……………… …………….. ………..39
5.1. Expresia genelor control Gapdh și Actb în celulele endoteliale din microvascularizația
cerebrală în cultur ă primară și în linia celulară …………………………………………….. ……………. ..39
5.2. Expresia receptorilor muscarinici pentru acetilcolin ă în celulele endoteliale din
microvascularizația cerebrală în cultura primară și în linia celulară ……………………….. …….. ..40
5.3. Expresia comparativ ă a receptori lor muscarinici pentru acetilcolin ă în celulele endoteliale
din microvascularizația cerebrală în cultur ă primară și în linia celular ă……………… ……………45
Capitolul 6 . Concluzii ……… …….………………………. ………………….. …………………. .53
Bibliografie ………… ….…………………………………………. …….. ………………………..54

5
Capitolul 1.
Receptorii muscarinici pentru acetilcolină
Acțiunile celulare ale acetilcolinei sunt mediate de două familii structurale diverse de
receptori membranari proteic i: receptorii nicotinici și muscarinici ( Hulme, și colab., 1990;
Caulfield și Birdsall, 1998; Felder, și colab., 2000; Wess, 2004; Eglen, 2005 ). Ace ști
receptori, ambii fiind compuși din mai multe subtipuri, sunt exprima ți presinaptic și
postsinaptic și au distribuții discrete în tot sistemul nervos central și periferic ( Eglen și
Birdsall, 1998 ). Este evident că ambii receptori sunt exprima ți în mai multe țesuturi
neinervate ( Wessler și colab., 1998 ).
Acetilcolina este, filogenetic, o moleculă veche implic ată în semnalizarea celulară
(Horiuchi și colab. 2003 ) care a evoluat pentru a exercita at ât func ția de neurotransmițator c ât
și mediator al funcțiilor autocrine ( Wessler și colab., 1998 ) în embrion ( Williams și colab.
2004 ) și la adulți ( Grando, 1997 ). Un sistem funcțional, non -neuronal, colinergic a fost
descris inițial în placenta umană ( Morris, 1966 ). Ulterior au fost descris e funcții le endocrine
ale acetilcolinei în țesuturi, inclusiv în endoteliu vascular al creierului ( Parnavelas și colab.,
1985 ), spermatozoizi ( Ibanez și colab., 1991 ), celulele gliale ( Lan și colab. 1966 ); keratinocite
(Zia și colab., 2000 ), limfocite ( Kawashima și Fujii, 2003 ), celulele oculare ( Duncan și
Collison, 2003 ) și epiteliul bronhial pulmonar ( Proskocil și colab., 2004 ). În general, funcțiile
hormonale ale a cetilcolinei diferă de rolul de neurotransmi țător și includ reglarea funcțiilor de
bază ale celulei inclusiv creșterea, diferențierea și apoptoza ( Tobin și Budd, 2003; Wessler, și
colab., 2003; Kawashima și Fujii, 2004 ).
Receptorii muscarinici M 1-M5 mediaz ă acțiuniile metabotropice ale acetilcolinei în
sistemul nervos. Un număr tot mai mare de informa ții indică faptul că ace știa mediază și
funcțiile autocrine ale aceticolinei. Disponibilitatea de agoniști și antagoniști m uscarinici noi
și selectivi, precum și tehnicile de inginerie genetică in vivo , au clarificat rolurile receptorilor
muscarinici în medierea ambelor funcții ale acetilcolinei.

6
1.1. Subtipuri de receptori muscarinici

Acțiunile metabotropice ale acetilc olinei sunt mediate de activarea familiei de
receptori muscarinic i din clasa I, heptahelicali , cupla ți la proteina G și cuprind cinci subtipuri
distincte: M 1, M 2, M 3, M 4 și M 5 (Caulfield și Birdsall, 1998 ). Acestea sunt codificate de gene
care nu con țin introni ( Kubo și colab., 1986 ) și au fost clonate din mai multe specii, inclusiv
om, vac ă, porc, șobolan și șoarece ( Hulme și colab., 1990 ), prezentând o secvență înaltă
omologa între specii. Într -adevăr, similaritatea în situsurile de legare a ligandului î n cele cinci
subtipuri explică de ce identificarea subtipului -selectiv de liganzii a fost dificil din punct de
vedere istoric ( Hulme și colab., 1990 ). În plus față de situsurile de legare a agonistului,
receptorii muscarinici posedă situsuri alosterice, ac ei compuși pot modula, de asemenea,
activarea agonistului ( Christopoulos și colab. 1998 ). Natura acestor situri alosterice dif eră atât
din punct de vedere al situsului de legare al agonistului cât și între subtipuri, care ar putea
permite proiectarea unui subtip de modulatori selectivi ( Birdsall și Lazareno, 2005 ).
In momentul activ ării, receptorii muscarinici se cuplează la proteine heterotrimerice
nucleotid ice de guanină (p roteina G) pentru a stimula mesagerii secundari și activitatea
canelelor de ioni ( Lanzafame și colab. 2003 ). Aceste celule efectori depind de subunitatea
proteinei G α care este activat ă. Receptorii muscarinici M 2 și M 4 se cupleaz ă la G αi, iar M1, M 3
și subtipul M 5 la G αq / 11. În unele cazuri subunitățile G βγ joacă un rol în semnalizare a celulară,
furnizând, de exemplu, un mecanism prin care receptorul M 2 activează fosfolipaza Cb și
modulează conductanțele ionice specifice. Receptorii M 2 și M 4 inhibă activitatea adenili l-
ciclazei, precum și timpul de deschidere a canalului de K+, canal c ationic neselectiv și
deschiderea receptorilor cu potențial tranzient (Zholos și colab. 2004 ). Receptorii muscarinici
M1, M 3 și M 5 stimuleaz ă fosfoinozitidele (fosfatidilinozitol 4,5 bifosfat), prin generarea a 2
molecule, inozitol 1,4,5 -trisfosfat (IP 3) și 1,2 -diacilglicerol, prin activarea fosfoinozitid –
fosfolipaza C β specifică, crescând astfel nivelul calciul intracelular (Figura 1 ).

7
Figura 1 . Subtipurile de receptori muscarinici pentru acetilcolină și tipurile de
proteine G cu care sunt cupla ți (https://www.sigmaaldrich.com )
Receptorii muscarinici regle ază o gamă variat ă de căi de semnalizare intracelular ă.
Astfel, atât G αi/o cât și G αq/11 exercită efecte citoscheletului prin activarea Rho GTP -azei
(Brown și colab., 1997; Schmidt și colab., 1999 ) și cascada de semnalizare include mai mul ți
efectori, cum ar fi fosfoinozitid -3-kinaza, tirozin -kinazele de tip non-receptori și kinazele
activate de mitogeni (MAP) ( Van Koppen și Kaiser, 2003 ). Acestea din urmă sunt căi de
semnalizare care par să joace un rol important în funcțiile autocrine ale receptorilo r
muscarinici în ceea ce privește controlul creșterii celulare și proliferarea.

1.2. Receptorii muscarinici neuronali

M1 sunt exprimați abundent în toate zonele importante ale creierului, inclusiv cortexul
cerebral, hipocampul și striatumul ( Oki și col ab., 2005 ). În concordanță cu această distribuție,
receptorii M 1 muscarinici sunt implica ți în procesul de învățare și memorie. Activarea
receptorilor colinergici, fie prin utilizarea acetilcolinesterazelor sau agoniști lor muscarinici,
ameliorează declinul cognitiv în studiile preclinice și clinice ( Terry și Buccafusco, 2003 ).
Ipoteza colinergic ă in demenț ă (Bartus, 2000 ) se bazează pe observațiile că receptorul
muscarinic M 2 presinaptic (precum și receptorii 5 -HT 2 și receptorii nicotinici α4-β2) are un
declin selectiv al nivelului de expresie , ȋn timp ce receptorul muscarinic postsinaptic M 1 este
preferențial păstrat în boala Alzheimer ( Terry și Buccafusco, 2003 ). În consecință, agonismul
selectiv M 1 a fost sugerat ca o abordare terapeutică în cazul demențe i, inclusiv boala
Alzheimer și tulburări de mem orie asociate cu vȃrsta ȋ naintat ă sau tulburări cognitive asociate
cu schizofrenia ( Fisher și colab., 2003 ). Stimularea receptorilor muscarinici centrali crește
secreția de protein ă solubil ă precursor al amilo idului (APP), ceea ce duce la o reducere a
producției și toxicita ții procesării APP ( Suh și Checler, 2002 ). În boala Alzheimer, în mod
specific ( Eglen, 2006 ) agonismul receptorului M 1 poate avea suplimentar beneficiul de
scăderea a plăcii citotoxice de ami loid format ă, prin procesarea APP ( Felder și colab., 2000 ).
Până în prezent, în studii le clinice de faza III de lungă durată nu a putut fi evaluat
potențialul acestor agenți de a întârzia boala în progresie.
Receptorii muscarinici M 2 sunt larg exprimaț i atât în sistemele nervoase centrale, cât
și în cele periferice ( Oki și colab 2005 ). Antagonismul selectiv al M 2 crește domeniul
colinergic prin reducerea func ției autoreceptorului în creier și în periferie. Prin urmare,
antagoniști i selectivi ai receptor ului M 2 sau mixtul antagonism M 2 / agonism M 1 de

8
asemenea, sunt o abordare terapeutică de creștere a func ției colinergice în boala Alzheimer, în
special în etapele timpurii ale deputului bolii ( Longo și Massa, 2004 ). În putamenul caudat,
receptorii musc arinici M 2 acționează ca heteroreceptori inhibitori pe terminalele
dopaminergice. Prin urmare, blocarea receptorului muscarinic M 2 selectiv poate oferi o
abordare terapeutică a schizofreniei, o boală asociată cu dopamina excesivă ( Sheardown,
2002 ). În peri ferie, receptorii M 2 muscarinici postjuncționali sunt exprima ți în miocard, și
mediază clasic efectele cronotropice și inotropice negative ale acetilcolin ei (Harvey și
Belevych, 2003 ) – deși receptorii M 3 joacă, de asemenea, un rol în controlul contractili tații
cardiac e (Wang și colab. 2004 ). Subtipul M 2 este, de asemenea, exprimat postjuncțional în
mușchiul neted din mai multe țesuturi ( Eglen și colab. 1996 ) și reglează contractilitatea în
mod sinergic cu M 3 receptori ( Ehlert, 2003 ). În cele din urmă, prez ența subtipul ui in
termina ții prejonc ționale este în corelație cu un rol de autoreceptor în mai multe țesuturi
perifice, inclusiv în mușchi ul neted ( Slutsky și colab, 2003 ).
Receptorul muscarinic M 3 este larg distribuit în sistemul nervos central (SNC), d ar la
nivel semnificativ mai mic decât ceilalți receptori muscarinici ( Felder și colab., 2000; Wess și
colab., 2003; Wess, 2004 ). Puține studii s -au concentrat asupra rolului central al acestui
subtip, deși receptorul M 3 este deficitar la șoarecii hipofagi și slabi, sugereaz ă un rol în
reglementarea aportului alimentar ( Yamada și colab, 2001 ). Clasic, receptorii M 3 muscarinici
mediază contracția multor tipuri de mușchi netezi inclusiv de respirație, gastrointestinali și
mușchii tractul ui genito -urinar ( Eglen și colab, 1996 ). Cu toate acestea, studii pe mai multe
specii, inclusiv uman ă, arată o implicare atât a M 2 cât și a M 3 în controlul motilității, cu
contribuția fiecărei variabile între țesuturi ( Ehlert, 2003 ). Aceste date au implicații pentru
programele de descoperire a drogurilor, în sensul descoperirii proprieta ților farmacologice ale
antagoni știlor muscarinici utilizați pentru tratamentul tulburărilor disfuncționale ale
musculaturii netede ( Eglen și colab, 1996 ).
În SNC, receptorii M 4 muscarinici sun t distribuiți în striatum, fiind colocaliza ți cu
receptori dopaminici pe neuronii proiecta ți pe striatum ( Felder și colab, 2000; Oki și colab,
2005 ). Activarea receptorilor muscarinici spinali duc la o puternic ă anti-nocicepție ( Duttaroy
și colab., 2002; L azareno și colab., 2004; Zhang și colab., 2005 ); desi natura exactă a
subtipului de receptor care mediază răspunsul este neclar ă. Cu toate acestea, în șoarecii
trasgenici cu deficit de receptori M 2 și M 4, răspunsurile analgezice la agoniștii muscarinici
sunt considerat reduse ( Duttaroy și colab, 2002; Wess, 2004 ).
Receptorul muscarinic M 5 este singurul muscarinic exprimat de conținutul de
dopamină a neuroniilor din substanța neagra, o structur ă care produce neurotransmi țatorul

9
dopamină al striatumului. Act ivarea receptorului muscarinic M 5 facilitează eliberarea
dopaminei striatală deși alți receptori muscarinici, inclusiv receptorul M 4 (Eglen și Nahorski,
2000 ) sunt implica ți. Receptorul muscarinic M 5 este subtipul predominant exprimat în aria
tegmentală ventrală, un țesut care oferă o importanță majoră în inervarea dopaminic ă în
nucleul accumbens și alte zone limbice ( Vilaro și colab. 1990 ), iar acetilcolina eliberată
neuronal reglează perfuzia corticală și permeabilitatea barierei hemato -encefalică prin
modificări ale fluxului sanguin local care implică eliberarea indusă de către receptorul
muscarinic prin intermediul oxidului nitric. Microvascula rizația cerebral ă exprimă, de
asemenea receptori muscarinici, unde celulele endoteliale exprim ă receptorii musc arinici M 2
și M 5, și celulele muscu lare netede vasculare exprimă toate subtipurile cu excepția
receptorilor M 4 (El-Husseiny și Hamel, 2000 ). Profilul farmacologic al subtipului de receptor
muscarinic care mediază dilatarea cerebrala vasculară corespunde ce l mai bine cu subtipul M 5
(El-Husseiny și Hamel, 2000 ), o constatare în concordan ța cu datele de la șoareci cu deficit de
receptori M5, în care dilatarea colinergică a arterei bazilare si piale este absent ă (Yamada și
colab., 2001 ).

1.3. Aplicații terape utice ale liganzilor care acționează la nivelul
receptorilor muscarinici neuronali

Rolul receptorilor muscarinici în țesutul neuronal a fost un domeniu intens de
investigații pentru multe decenii ( Hulme și colab., 1990; Caulfield și Birdsall, 1998; Felde r și
colab., 2000; Wess, 2004; Eglen, 2005 ). În consecință, mai mulți agoniști și antagoni ști care
posedă subtipuri de receptori cu specificitate in vitro și in vivo sunt disponibili , furnizând
ambele instrumente de cercetare și terapii noi ( Francotte și c olab. , 2004 ). Un rezumat al
compușilor în curs de dezvoltare este prezentat în Tabelele 1 și 2 .
În ceea ce privește utilizarea agoniștilor muscarinici M 1 pentru tratamentul tulburărilor
funcției cognitive ( Eglen, 2006 ), studiile clinice cu agoni ști ai ac estui receptor au fost
dezamăgitoare din cauza eficacității scăzute și al potentialului ridicat al efectelor secundare.

Tabelul 1 Agoniști și antagoniști ai receptorilor muscarinici aflați
în curs de testare pentru utilizarea ȋn terapia tulburări lor cogn itive (Eglen, 2006 )

Compus Selectivitatea
pentru un anumit
receptor Indica ție
terapeutic ă Faza de testare
clinic ă

10
Alvamelina Agonist M 1 /
Antagonist M 2 Patologia Alzheimer Faza clinic ă III
(oprit ă)
Arecolina Neselectiv Patologia Alzheimer Faza clinic ă II
(oprit ă)
Cevimelina Agonist M 1 Patologia Sjogren Aprobat
LY 593093 Agonist M 1 Patologia Alzheimer Faza clini că I
Milamelina Agonist M 1 / M 2 Patologia Alzheimer Faza clinic ă III
(oprit ă)
Sabcomelina Agonist M 1 / Agonist
partial M 2 Patologia Alzheimer Faza clinic ă III
(oprit ă)
SCH -217443 Antagonist M 2 Patologia Alzheimer Preclinic / Faza
clinic ă I
SDZ -210-086 Agonist M 1 Patologia Alzheimer Faza clinic ă I
(oprit ă)
Xanomelina
transdermal ă Agonist M 1 Patologia Alzheimer Faza clinic ă III,
efecte secundar e
gastro -intestinale,
produs e în
investiga ție
YM 796 Agonist M 1 Patologia Alzheimer Faza clinic ă II

Mai târziu, compuși precum alvamelina, sabcomelina și xanomelina sau SDZ 210 -086
și YM -796, au fost reevalua ți clinic și studiile clinice au fost întrer upte (Francis și colab.
1999 ). O excepție este cevimelina, aprobată în prezent pentru condi ția autoimună, Boala lui
Sjogren ( Fox, 2003 ). Majoritatea agoniștiilor muscarinelor M 1 au funcționalitate, mai degrabă
decât selectivitatea. Ca atare, prezicerea ago nismul într -un cadru terapeutic clinic este
problematic (Eglen, 2005 ). În plus, mai multe studii care măsurau efectul agoniștilor
muscarinici în patologia Alzheimer se adresează doar cognitivului. În această paradigmă, este
dificil să distingi între potenț ialul simptomatic vs. efectele ale ace stor compuși în încetinirea
bolii ( Jones, 2003 ).
Studiile clinice ( Parsons și colab., 2005 ) și datele preclinice extinse farmacologic
(Matsui și colab., 2000 ) au sugerat că antagonismul M 3 muscarinic este util pentru tratarea
ambelor tulburări ale sistemului genito -urinar ( Hegde și colab., 2004 ) și ale tractului
respirator ( Racke și Matthiesen, 2004 ). Mai mulți compuși au fost aprobati pentru utilizare în
tulburări de funcționare a muscula turii netede a vezicii urinare , inclusiv antagoniștii M 3,
darifenacinul și solifenacinul ( Tabelul 2 ).

Tabelul 2 . Antagoniștii receptorilor muscarinici
în curs de testare pentru utilizarea ȋn terapia tulburărilor musculaturii netede (Eglen, 2006 )

Compus Selectivitatea pentru Indica ție Faza de testare

11
un anum it receptor terapeutic ă clinic ă
Tolterodină (Detrusitol;
Detrol) Neselectiv Vezic ă hiperactivă Aprobat
Detrol LA (tolterodină cu
eliberare controlată orală) Neselectiv Vezic ă hiperactivă Aprobat
Ditropan XL (oxibutinină
cu elib erare controlată
orală) Neselectiv Vezic ă hiperactivă Faza clinic ă III
Oxibuti nin (plasture
transdermic) Neselectiv Vezic ă hiperactivă Faza clinic ă III
S-oxibutinin Neselectiv Vezic ă hiperactivă Faza clinic ă II
Darifenacin (Enablex) Selectiv M 3 Vezic ă hiperactivă Faza clinic ă III
Solefenacin (Vesicare) Selectiv M 3 Vezic ă hiperactivă Faza clinic ă III
NS-21 (Temiverine) Selectiv M 3 / Blocant
pentru canalele de
Ca2+ Vezic ă hiperactivă Faza clinic ă III
Vamicamidă (Urocut) Neselectiv Vezic ă hiperactivă Faza clinic ă III
Trospium Neselectiv Vezic ă hiperactivă Faza clinic ă III
Tiotropium Neselectiv / Rata
scazut ă de
selectivitate M 3 Boala pulmonară
obstructivă cronică Aprobat

Cu toate acestea, un compus prescris pe scară largă pentru tratamentul vezicii
urinare hiperactiv e este tolterodina; un antagonist muscarinic puternic și neselectiv in vitro ,
dar cu acțiuni selective in vivo (Andersson și Wein, 2004; Hegde și colab., 2004 ). În
tratamentul obstruc ției pulmonare cronice antagoniști muscarinici cu durat ă scurtă de acțiune,
cum ar fi iprotropium și oxitropium, sunt utilizate ca terapie prin bronhodilatatoare ( Keam și
Keating, 2004; Racke și Matthiesen, 2004 ). Tiotropium este un antagonist preferențial pentru
receptorii muscarinici M 1 și M 3, în virtutea un ei disocier i preferențial e lente cinetic e de la
acești receptori ( Racke și Matthiesen, 2004 ). Compusul este aprobat ca prima linie în
abordare terapeutică , cu dozare o dată pe zi și eficacitate superioară , dar av ând efect e
secundar e în comparație cu iprotr opium ( Keam și Keating, 2004 ).
Blocarea receptorilor muscarinici este utilă pentru tratamentul sindromului
intestinului iritabil cu mai multe abordări , direct antagonizând receptorii muscarinici ( De
Schryver și Samsom, 2000 ). În modelele animale, în prepa rate musculare in vivo , modularea
gastrointestinală a tulburările de motilitate, necesită concomitent blocarea receptorilor
muscarinici M 2 și M 3.

12
Antagoniștii receptorilor muscarinici au fost identificați ca antispasmolitice gastro –
intestinale, cum ar fi otiloniu, și sunt antagoniști neselectivi, cu proprietăți suplimentare în
blocarea canalelor de calciu , fiind implicați și în antagonismul altor neurotransmițători ( Strege
și colab., 2004 ). Un obiectiv important în tratamentul sindromul intestinului iritab il este de a
ameliora durerea asociată cu boala. Antispasmolitice generale sunt nesatisfăcătoare ca terapii
în tratamentul sindromul ui intestinului iritabil ( Talley, 2003 ). Cu toate acestea, agoniștii
muscarinici sunt agenți puternici anti -nociceptivi ( Harris și colab., 1969 ) și compușii cu
acțiuni mixt ă de agonist / antagonist muscarinic ar putea fi o abordare optimă.
În ceea ce privește controlul central al anti -nocicepției, receptorii muscarinici M 2 joacă
rolul predominant, în timp ce activarea receptor ului M 4 are o contribu ție minoră ( Duttaroy și
colab., 2002; Chen și colab., 2005 ). In orice caz, agonismul selectiv al celor din urmă nu va
avea ca rezultat efecte cardiovasculare majore, sugerând că agonismul M4 este o abordare
preferată față de analgezi a (Ellis și colab., 1999 ). În cele din urmă, receptorul muscarinic M 4
poate juca, de asemenea, un rol în etiologia psihozei ( Teaktong și colab., 2005 ) și datele
anterioare au arătat că agonistul mixt M 1 / M 4, xanomelina, exercita efecte antipsihotice la
animale ( Andersen și colab., 2003 ). Până în prezent, nu există agoniști sau antagoniști
selectivi pentru receptorul muscarinic M 5, în dezvoltare clinică. Cu toate acestea, antagoniștii
muscarinici ai receptorului M 5 ar putea fi o abordare nouă a tratamentulu i schizofreniei
(Wang și colab., 2005 ) sau adic ției (Basile și colab., 2002 ). În plus, deficitele în vasodilatația
indus ă de activarea colinergic ă, pot fi de asemenea implicate în etiologia bolii Alzheimer
(Roman, 2005 ), sugerând că antagonismul selectiv a l receptorului muscarinic M 5 poate fi o
abordare clinic ă utilă.

1.4. Receptori i muscarinici non -neuronali

În neuronii colinergici se sintetizează acetilcolina din colină și acetil -CoA de către
colin -acetil -transferaza (ChAT) și apoi translocată la veziculele sinaptice de către
transportor ul vezicular specific al acetilcolintransferazei . În neuroni, acetilcolina este
transportată de către un tran sportor cu afinitate ridicat ă pentru colină (CHT1 ). A fost sugerat
de mai multe grupuri în ultimul deceniu fap tul ca acetilcolina exercită un rol hormonal.
Această sugestie se bazează pe observații cum c ă în multe țesuturi neinervate, acetilcolina este
sintetizată, eliberată și degradată prin intermediul enzimelor asociate cu semnalizare
colinergică. Deoarece meta bolismul moleculei este rapid și rec eptorii colinergici (muscarinici

13
și nicotinici ) sunt exprimați pe oricare dintre celulele endocrine sau cele din imediata
vecinătate, o funcție autocrină / paracrină este probabil ă.
Cu toate acestea, exprimarea aceticol inesterazei este un motiv insuficient pentru
postularea unui rol hormonal moleculei de acetilcolină, așa cum enzim a posed ă alte roluri
decât cele implicate în semnali zarea colinergică ( Soreq și Seidman, 2001 ).
În consecință, expresia locusului colinergic este o dovadă mai evident ă a prezenței
unui sistem colinergic funcțional în țesuturi neinervate ( Eiden, 1998 ). Locusul colinergic este
o zona conservat ă filogenetic a genomului responsabil pentru codificarea ChAT și al unui
transportor vezicular specific (VAChT ). Acea stă zonă genomică funcționează ca un operon
(Eiden, 1998 ), cu gene pentru ChAT îmbrăcate în primul intron al VAChT, permițând
coordonarea ambelor. Expresia locus ului colinergic , împreună cu expresia CHT1 și
acetilcolinesterazei , este o dovadă evident ă că țesutul este colinergic autentic ( Eiden, 1998 ).
Astfel de modele de expresie au fost raportate în multe țesuturi colinergice neinervate, cum ar
fi endoteliu l vascular ( Haberberger și colab., 2000 ), carcinoame pulmonare și ovariene ( Song
și cola b., 2003 ), keratinocite ( Kurzen și Schallreute r, 2004 ), limfocite ( Kawashima și Fujii,
2004 ) și placentă ( Pfeil și colab., 2004 ).
Există diferențe între sistemele colinerg ice în țesuturile neuronale și non -neuronale
(Wessler și colab., 2001 ). Astfel, dove zile emergente sugerează faptul c ă locusul colinergic în
țesuturi non -neuronale, cum ar fi placenta, e ste diferit fața de cel din țesuturi neuronale. De
exemplu, gena de reglare a moleculelor REST / NRSF ( elementul represor 1 care silențiaza
factorul de tr anscrip ție / factorul de silen țiere restrictiv ă neuronal ) și CoREST sunt exp rimate
la o valoare mai mare la nivelul placentei umane decât în componenta neuronil or motorii din
măduva spin ării (Oda și colab., 2 004). Mai mult, în timp ce ChAT este exprimată ubicuitar,
expresia VAChT se limitează la anumite celule placentare, sugerând faptul c ă acetilcolina
vezicular ă cât și non -vezicular ă este eliberată diferențiat de catre celule le neuronal e și
nonneuronal e (Pfeil și colab., 2004 ). La nivelul celulelor mici d in carcinomul pulmonar,
acetilcolina exercită o acțiune autocri nă, și este prezent un mecanism nonvezicular de secreție
al acetilcolinei ( Song și colab., 2003 ).
Trebuie remarcat faptul că în timp ce enzimele care mediaz ă sinteza, eliberarea și
degradarea acetilcolinei sunt exprimate într -un țesut dat, receptorii nicotinici precum și
receptorii muscarinici pot fi implicați în acțiuni ample autocrine ale acetilcolinei. În multe
țesuturi neinervate, cum ar fi c elulele mici din carcinomul pulmonar (Song și col ab., 2003 ),
keratinocitele ( Zia și colab., 2000; Kurzen și colab., 2004 ) sau limfocitele ( De Rosa și colab.,

14
2005 ), atât receptorii muscarinici, cât și receptorii nicotinici mediază funcțiile autocrine ale
acetilcolinei.

1.4.1. Receptorii muscarinici ex primati in celulele tumorale

Neurotransmițătorii, cum ar fi acetilcolina, acționează ca semnale timpurii în
dezvoltarea sistemului nervos ( Nguyen și colab., 2001 ). Apari ția filogenetică timpurie a
acetilcolinei ca hormon sugerează că aceasta își păstreaz ă o funcție similară în timpul
ontogeniei. Astfel, receptorii musc arinici sunt exprima ți în celule embrionare ( Lammerding –
Koppel și colab., 1995 ); care apar mai devreme de 14 zile pentru a regla proliferarea
neuronal ă și diferențierea celulelor ( Schlumf ș i colab., 1991 ). În celulele progenitoare
neuronale, e xpresia receptorului muscarinic apare înainte de debutul sinaptogenezei și
neurotransmisiei ( Williams și colab., 2004 ), ceea ce sugerează că acetilcolina acționează prin
intermediul unei bucle autocrine locale în embrion . Însă roluri ale subtipurilor individuale de
receptori muscarinici în dezvoltarea timpurie nu sunt studiate pe scară largă ( Ma și colab.,
2004 ), deși modificarea mi grării celulelor embrionare și morfogeneza pot ap ărea ( Sailer și
colab., 2000 ). În dezvoltarea timpurie, receptorii muscarinici M 2 sunt exprimați în neuronii
din rădăcinile dorsale ale ganglionilor spinali, precum și celule non -neurale, cum ar fi celulele
Schwann. În acest caz, ei controlează diferențierea neuronilor senzoriali și creșterea axonală
(Biagiono și colab., 2000 ). Cu toate acestea, există puține efecte vizibile asupra dezvoltării ȋn
experimentele de deleție a genelor care codific ă receptorii muscarinici ( Wess și colab., 2003;
Wess, 2004 ). Prin urmare, este neclar c ât de critice sunt funcțiile embriologice ale receptorilor
muscarinici sau dacă există doar o simplă reglare colinergică a dezvoltării. Receptorii
muscarinici sunt exprimați în celulele tumorale primare si metastatice unde acetilcolina
acționează într -o mani eră autocrină ( Song și colab., 2003 ). După cum s -a discutat mai sus,
expresia receptorilor muscarinici este o trăsătură embrionară. Expresia în celulele tumorale,
cum ar fi melanoamele ( Oppitz și colab., 2002 ) reactivarea genelor embrionare în timpul
malig nității ( Sailer și colab., 2000 ).
Efectele morfogenice ale activării receptorilor muscarinici au fost raportate în multe
celule tumorale. Astfel, activarea receptorilor muscarinici M 1, M 3 sau M 5, dar nu și a
receptorilor M 2 sau M 4, induc focare de transfor mare în celulele 3T3 ( Gutkind și colab. 1991 ).
De asemenea, celulele mici din carcinomul pulmonar sintetizează și eliberarea acetilco linei
(Song și colab., 2003 ) și exprimă M 3 și M 5 muscarinic i (Willams și Lennon, 1990; Fucile si
colab., 1997; Song și cola b., 2003 ), creând astfel o buclă funcțională colinergică autocrină .

15
Activarea acestor subtipuri în celulele mici din carcinomul pulmonar (Song și colab., 2003 ) și
în celule din adenocarcinom murinic ( Espanol și Sales, 2004 ) induc creșterea și proliferare.
Subtipurile de receptori muscarinici reglează diverse căi de semnalizare AMPc / calciu
dependente. Există o literatură extensivă în legatura cu celulele stem progenitoare și celulele
tumorale în care este implicat ă semnalizarea prin activarea receptorilo r muscarinici. Activarea
căii de semnalizare kinaza -1/2 / MAP ( Gutkind și colab., 1991 ) oferă un mijloc prin care
receptorii muscarinici exercită controlul oncogen al creșterii celulelor neurale ( Ma și colab.,
2004 ); au fost raportate date similare în celu lele cancerului gastric, de colon și de sân
(Kodaira și colab., 1999; Ukegawa și colab., 2003; Jimenez și Montiel, 2005 ).
Efectele morf ogene ale activ ării receptorilor muscarinic i depind de fenotipul celular și
/ sau activitatea celulară predominantă ( Lanzafame și colab., 2003 ). În celule PC12 lipsite de
factor trofic ( Lindenboim și colab. 1995; Leloup și colab., 2000 ) sau ȋn celule mici din
carcinomul pulmonar , activarea receptorului M 3 provoacă antiproliferativitate semnalelor prin
activarea legării prot einei GTP, Rac1, cu modificarea ulterioară a moleculelor de aderența
(Williams, 2003 ). Agoniștii muscarinici sunt agenți eficienți în inhibarea apoptozei. Pre –
tratarea celulelor SH -SY5Y cu oxotremorină M inhibă apoptoza indusă de deteriorarea ADN
(De Sarn o și colab., 2003 ). În celulele CHO transfectate cu receptori muscarinici M 1, M 3 și
M5, agoniștii au produs de asemenea un răspuns protector împotriva apoptozei ( Budd și colab.
2004 ), suprimând astfel moartea cel ulelor și promov ând expansiunea clonal ă. Ace st efect
apare printr -un mecanism independent de calea de semnalizare calciu / fosfolipază C, dar
poate implica o reglare a proteinei anti -apoptotice Bcl -2 (Budd și colab. 2003; Tobin și Budd,
2003 ).
În dezvoltarea tumorii, expresia receptorilor mus carini ci este invers proporțion ală cu
supraviețuirea pacientului ( Oppitz și colab., 2002 ). Deși nu este clar dacă activarea
receptorului muscarinic este legat cauzal de progresia tumorii, este raportat că expunerea la
antagoniști muscarinici inversează prolifera rea celular ă (Song și colab., 2003 ).
În plus față de morfogeneză, receptorii muscarinici non -neuronali controleaz ă, de
asemenea, mișcarea celulelor. Receptorii muscarinici M3 sau M5, ȋn c elulele de melanon uman
SK-mel 28 , facilitează mișcarea indusă de fi bronectină, prin procese care implică creșterea
nivelului calciului intracelular ( Boss și colab. 2005 ). Această idee este conformă cu
descoperirile din țesutul embrionar, în care contracția celulară și agregarea sunt, de asemenea,
induse de activarea recep torilor muscarinic i (Sailer și colab., 2000 ). Astfel, în structurile
epiteliale embriologice cum ar fi tubul neural și vezicula optică , expresia acetilcolinerazei

16
coincide cu expresia receptorilor muscarinici. Aici, receptorii muscarinici modulează
mișcare a celulei ( Eglen, 2006 ) în timpul morfogenezei ( Drews și colab., 2004 ).

1.4.2. Receptorii muscarinici exprimați ȋn ovare și placentă

Prezența unui sistem autocrin colinergic care implică receptori muscarinici în tumorile
ovariene celulele ( Oppitz și co lab., 2002 ) corespunde cu prezenț a activității acetilcolinei în
țesutul ovarian uman. În acest țesut, fibrele nervoase, deși exprimă catecolamine sau peptide,
nu au imunoreactivitate pentru enzime colinergice responsabile pentru sinteză și eliberare
(Mayer hofer si Fritz, 2002; Mayerhofer, și colab., 2003 ). Celulele granuloase ovariene posedă
imunoreactivitate colinergică și eliberează acetilcolina într -o glandă endocrină ( Fritz și colab.,
2001 ). Aceste celule exprimă și ele receptorii muscarinici M 1 și M 5, ambele duc la creșteri ale
calciului intracelular. Aceste cai de semnalizare modulează deschiderea joncțiunii gap, posibil
prin fosforilarea conexinei 43 ( Mayerhofer și Fritz, 2002 ). În cele din urmă, funcția
receptorilor muscarinici în țesutul ovarian est e de a regla proliferarea celulară sau producția
de progesteron ( Fritz și colab., 2001 ).
Prezența unui sistem colinergic local în placenta, un țesut fără inervație, este cunoscuta
de ani de zile ( Morris, 1966; Sastry, 1997; Wessler și colab., 2001 ). Numer oase tipuri de
celule din placenta , inclusiv trofoblaste, celule mezenchimale și celule epiteliale ale sacului
vitelin , exprimă enzime implicate în sinteză și eliberare de acetilcolină. Funcțiile acetilcolinei
în placenta umană includ reglarea circula ției sangelui din placenta , deschiderea și închiderea
canalelor trofoblastice, contracția miofibroblastelor, facilitarea transportului de aminoacizi și
eliberarea hormonilor preze nți în placent ă și modularea sintezei prostaglandinelor ( Wessler și
colab., 2001 ). In plus , cotiledonul placentar izolat de la om este folosit ca un model
experimental pentru studierea sistemelor colinergice non -neuronale, fiind robust și fără
neuroni colinergici ( Wessler și colab., 2001 ). Acest model a fost folosit pentru a caracteriza
funcțiile sistemelor de absorbție colinergice, prin compararea farmacologiei în acest țesut la
cea observată în sisteme neuronale.

1.4.3. Receptorii muscarinici exprimați ȋn limfocite

Acetil colina este prezentă în plasmă multor specii, având aproximat iv 60%
provenien ța din limfocitele mononucleare ( Kawashimi, și colab., 1998 ). Sursele suplimentare
ale moleculei includ timusul, ganglionii limfatici și splină. Limfocitele exprimă și

17
componente de semn alizare colinergică, incluzand ChAT, recaptarea coline rgică de afinitate
mare, AChază și receptori colinergici ( Kawashima și Fujii, 2003 ). Este probabil ca
acetilcolina acționează, prin activarea receptorilor muscarinici, într -o manieră autocrină
(Kawashima și Fujii, 2003 ). Consecințele precise ale prezen ței receptorilor muscarinici în
limfocite nu sunt clare, dar a fost propus un rol modulator în răspuns ul imunitar ( Kawashima
și Fujii, 2004 ). Astfel, stimularea agonistă a receptorilor muscarinici din limfocitelor de tip T
sau B crește expresia c-fos și semnal izarea prin intermediul IL-2 (Nomura și colab. 2002 ).
Deoarece acest efect este însoțit de creșteri ale nivelului calciului intracelular, este probabil
implicată activarea receptorilor M 1, M 3 sau M 5 (Kawashima și Fujii, 2003 ). Poate exista o
relație între activarea receptorului M 1 muscarinic și producția de IL -2 (Nomura și colab.,
2002 ), deși acest lucru nu a fost confirmat în celulele mononucleare umane ( Telford și colab.,
2004 ). Studii folosind șoareci transgenici au demonstrat că dele ția receptorului M 1 determin ă
o capacitate semnificativ redusă în diferențierea limfocitele citotoxice CD8+, susținând un
posibil rol al receptorul ui muscarinic M 1 în activarea r ăspunsului imun ( Zimring și colab.
2005 ). În șoareci purtători de adenocarcinom, receptorii muscar inici M 1, M 2 și M 3 modulează,
de asemenea, angiogeneza macrofag ă, posibil prin intermediul prostaglandinei E2 ( De La
Torre și colab., 2005 ).
Expresia limfocitar ă a receptorilor m uscarinici este modulat ă în diverse condiții
(Shenkman și colab., 1986; Cocci ni și colab., 2005 ). În limfocite, răspunsuri le imunologice la
fitohemaglutinină (Celule T) sau la Staphylococcus aureus (Celulele B), conduc la
supraexpresia receptorului muscarinic M 5 (Fujii și colab., 2003 ). De asemenea, stresul de
imobilizare crește ex presia receptorului muscarinic ( Kubera și colab., 1992 ), deși în acest
studiu nu a fost caracterizate subtipurile de receptor muscarinic implicate.
Expresia receptorilor muscarinici în limfocite poate fi modificată , de asemenea , de
tratamentul medicamento s, de vârstă sau de condiț ii patologice . Astfel, receptorii muscarinici
limfocitar i la șobolani sunt în cantita ți mici sau mari în func ție de expunerea la agoniști
muscarinici sau respectiv, la antagoniști ( Costa, și colab., 1990 ). Tratamentul cronic al
pacienților cu antagoniștii muscarinici cre ște și densitatea receptorilor muscarinici ( Rabey și
colab. 1986 ). Densitatea receptorilor muscarinici în celulele T crește cu vârsta, dar scade în
patologia Alzheimer ( Rabey și colab., 1986; Ferrero și colab., 1990 ; Tayebati, și colab.,
2003 ). Deși, mecanismele care stau la baza oricărora dintre aceste efecte nu sunt cunoscute,
receptorii muscarinici limfocitari au fost propu și ca markeri pentru tulburări ale sistemului
nervos central ( Costa și colab., 1990 ).

18
1.4.4. Receptorii muscarinici exprimați ȋn celulele cutanate

Un sistem colinergic autocrin, car e implică activarea receptorilor muscarinic i
modulează funcția celulară cutanată ( Grando, și colab. 1993; Kurzen și colab., 2004 ), inclusiv
modularea receptorilor muscarinici neuronali și non -neuronali ( Eglen, 2006 ), proliferarea și
migrarea keratinocitelor, formarea barierei, producția de transpirați e și de sebum, precum și
microcirculația cutanată și angiogeneza ( Grando și colab., 1993; Grando, 1997, 2003; Kurzen
și Schallreuter, 2004 ). Mai multe studii au caracterizat distri buția receptorilor muscarinici în
pielea umană. Astfel, biopsii ale pielii antebra țului la om au arătat că exprimă receptorii
muscarinici M 2 (Ndoye și colab., 1998; Elwary și colab. 2004 ), fiind în concordan ța cu
studiile mai vechi de expresie a receptorilor muscarinici la nivelul pielii de șobolan
(Haberberger și Bodenbenner, 2000 ). Pielea scalpului uman exprimă, de asemenea , receptori
muscarinici ( Kurzen și colab. 2004 ), unde receptorii M 1 și M4 sunt prezenți în strat urile
superioare spinos și granular ale pielii, iar și receptorii M2, M 3 și M 5 sunt prezen ți în straturile
inferioare. Arredondo și colab. (2003) , a determinat expresia tuturor subtipurile de receptori
muscarinici în epiteliul gin gival și a sugerat un rol al acetilcolinei keratinocitare în controlul
homeostazei orale gingivale. Nivelul de expresie al receptori lor muscarinici cutana ți poate fi
reglat fiziologic. De exemplu, nivelul de acetilcolină cre ște în biopsiile cutanate ale
paciențiilor cu dermatită atopică ( Wessler și colab., 2003 ).

1.4.5. Receptorii muscarinici exprimați ȋn keratinocite

Mecanismele care stau la baza medierii exercitate de receptorii muscarini ci asupra
interacțiunilor celulă -celulă nu sunt clare, dar bloca rea prelungit ă cu oligonucleotide anti -M3
duce la detașarea celulară, însoțită de schimbări în expresia e-caderinei, b -cateninei și c –
cateninei (Nguyen și colab., 2004 ). Șoarecii transgenici care nu au receptori muscarinici M 3
prezintă o aderență celulară modificată în epiteliul stratificat ( Nguyen și colab. 2004 ).
Interacțiunea subtipurilor receptorilor muscarinici în functia pielii este, totuși, complexă în
sensul c ă receptorii muscarinici M3 și M 4 influențează reciproc migrarea lateral ă a
keratinocitelor (Chernyavsky și colab. 2004 ). Astfel, activarea receptorului muscarinic M 3
inhibă migrarea, ceea ce duce la exprimarea integrinelor sedentare. Prin contrast, activarea
receptorului muscarinic M 4 stimulează migrația și induce expresia integrinei ( Chernyavs ky și
colab., 2004 ). Keratin ocitele diferen țiate descarc ă un produs secretor care servește ca un
umectant și în cele din urmă induce apoptoza. Activarea receptorului muscarinic M 1 provoacă

19
secreția acestui umectant ca răspuns la acetilcolina eliberată loca l (Nguyen și colab., 2001 ).
Receptorii muscarinici epidermici prin urmare, modulează moartea celulară programată, și
permit o tranziție bruscă a keratinocitelor granulare viabile în corneocite moarte, care apoi
sunt îndepărtate ( Nguyen și colab., 2004 ). În keratinocitele gingivale umane, activarea
receptorilor muscarinici poate controla progresia ciclului celular, iar expresia p53, a ciclinei
D1 și p21 este îmbunătățită în aceste celule de catre muscarină și este blocat ă de atropină
(Arredondo și colab., 20 03).

1.4.6. Receptorii muscarinici exprimați ȋn cristalin

Cristalinul la mamifere nu prezint ă inervație și nu este aprovizionat cu sânge și
cuprinde numai două tipuri de celule – celule epiteliale și celule fibroase complet diferențiate
(Duncan și Coll ison, 2003 ). Cristalinul exprimă acetilcolineraza și receptorii muscarinici și
poate, prin urmare, să posede un sistem colinergic non -neuronal ( Duncan și Collison, 2003 ).
Stimularea receptorilor muscarin ici duce la o creștere a nivelului de calciu intracel ular ( Drews
și colab., 2004 ), sugerând p rezența unui subtip de receptor G q cuplat . Într -adevăr, receptorii
muscarinici M 3 au fost identificați atât în epiteliul lenticular anterio r (Gupta și colab., 1994 )
cât și în celulele lenticulare umane cultivate, iar activarea receptorului duce la mobilizarea
calciului ( Williams și Lennon, 1990; Collison și colab. 2000; Williams și colab., 2004 ).
Activarea receptorului muscarinic induce depolarizarea membranei în celulele lenticulare la
șobolani și la iepuri ( Rhodos și colab., 2002 ) cu analiza farmacologică limitată care implică
activarea receptorilor M 1. Receptorii muscarinici M 3 sunt exprima ți în linia celular ă
lenticular ă, HLE -B3, sau în culturile primare de celule lenticulare (Collison și colab., 2000 ).
Puține stu dii au definit funcția fiziologică a receptorului muscarinic în țesutul
lenticular. Prezen ța lor poate reflec ta funcția morfogenică vestigică existentă în embrion
(Oppitz si colab., 2003 ). Durand și colab. (2002) raportează că la șobolan, opacitatea
lenticular ă este crescută după 12 luni de tratament cu antagoniști muscarinici, tolterodină sau
atropină. Deoarece aceste date nu au fost raportate în țesuturile lenticulare ale altor specii,
inclusiv omul, semnificația acestor constatări fiind neclară.

1.4.7. Receptorii muscarinici exprimați ȋn celule endoteliale

Mai multe tipuri de celule endoteliale posedă un sistem neur onal colinergic func țional
(Wessler și Kirkpatrick, 2001 ). În vasculariza ție, imunoreactivitatea ChAT apare în culturi de

20
celule endotel iale ombilicale umane, celulele angiosarcomului, p recum ș i în vasele sanguine
din pielea umană (Kirkpatrick și colab., 2003 ). Epiteliul vascular exprimă cel mai mult
elemente ale locusului genei colinergice ( Haberberger și colab., 2000 ), furni zând dovezi
suplimentare pentru a confirma existenta unui sistem colinergic în aceste țesuturi. Funcțional,
receptori i muscarinici M 1 și M 3 mediază relaxarea mușchiului neted vascular prin inducerea
eliberării ( Eglen, 2006 ) de fac tori difuzați, inclusiv oxidul nitric (Eglen și Whiting, 1990 ).
Khurana și colab. ( 2004) au raportat că efectele vasodilatatoare ale agoniștilor muscarinici
sunt semnificativ redus e la șoareci , prezentând o deleție a receptorilor muscarinici M 3.
Un sistem de sinteză non -neuronal pentru acetilc olină este prezent și în epiteliu l căilor
respiratorii ( Wessler și Kirkpatrick, 2001; Ra cke și Matthiesen, 2004 ). Mai mult decât atât,
ChAT și acetilcolina sunt exprimate în majoritatea celulelor epiteliale ale căilor respiratorii
(celule calciforme, celul e ciliate și celule bazale), producția celule lor submucusoaselor și cele
ale mușchi ului neted ( Reinheimer și colab., 1996 ). O buclă autocrină care implică receptorii
muscarinici este probabil să fie operativă în aceste celule ( Proskocil și colab., 2004; L ips și
colab., 2005 ). Funcția receptorilor muscarinici epiteliari ai căilor respiratorii, posibil a
receptorul ui muscarinic M3 (Mak și colab., 1992 ), este speculativă, dar ar putea implica
controlul creșterii celulelor ( Proskocil și colab., 2004 ). Contrar acestei ipoteze , un alt studiu a
indicat faptul c ă agoni știi receptorului muscarinic M 1 induc proliferarea celulelor epiteliale
traheale de șobolan (Metzen și colab., 2003 ). Receptorii muscari nici M 3 din celulele epiteliale
mediază de asemenea eliberarea unui factor difuzibil, m odularea contractilității (Gao și
Vanhoutte, 1988; Lev și colab., 1990 ). Natura chimică a acest ui factor este necunoscută, deși
studiile timpuri i au sugerat că acesta nu este oxidul nitric ( Gao și Vanhoutte, 1988 ).
Receptorii muscar inici M 2 sunt foarte exprimați în mucoasa vezicii umane, țesut
neinervat, la care poate acționa acetilcolina în mod autocrin ( Mansfield și colab., 2005 ).
Activarea receptorilor muscarinici în uroteliu duce la relaxarea muschi ului detrusor al vezicii
urinar e (Forvaeus și colab., 1999; Păducel și colab., 2 000; Templeman și colab., 2002;
Chaiyaprasithi și colab., 2003; Bozkurt și Sahin -Erdemli, 2004 ), prin eliberarea unui factor
chimic neidentificat. Deoarece epiteliul urinar nu este inervat colinergic, o bucl ă autocrină
pentru acetilcolin ă există în acest țesut pentru a modula contractilitatea ( Chess -Williams,
2002; Fry și colab., 2004 ).
Se știu puține lucruri despre funcția epitelială a receptorilor muscarinici di n tractul
gastrointestinal, deși receptorii m uscarinici cuplați cu Gq au rol în recrutarea căilor de
semnalizare a adeziunii focale, inclusiv în exprimarea kinazelor de adeziune focală
(Calandrella și colab., 2004 ).

21
O literatură farmacologică extinsă, împreună cu date emergente provenite din studiile
la șoareci transgenici, indică faptul că toate cele cinci subtipuri muscarinice funcționează în
sistemele colinergice neuronale și non -neuronale. Cu toate acestea, conceptul de acetilcolină
care acționează într -o maniera autocrină asupra acestor subtipuri de receptori este relativ nou ,
și acțiunile fiziologice ale subtipurilor de receptori muscarinici în sistemele non -neuronale
sunt prezentate în Tabelul 3 . Distribuția neuronal ă/non-neuronal ă a receptoril or muscarinici a
fost probabil subestimată din cauza utilizării limitate a unor agenți farmacologici selectiv
pentru un anumit subtip de receptor , dar și datorita lipsei unor studii sistematice de măsurare a
expresiei protei ce (Proskocil și colab., 2004 ).
Funcțiile autocrine care implică activarea receptor ului muscarinic pot fi împărțite în
două mari grupuri – cele care privesc controlul celulei (creșterea sau proliferarea ) și cele care
mediază. În unele țesuturi aceste funcții se suprapun, ca în cazul epiteliilor căilor respiratorii,
unde au loc reac ții ale receptorilor muscarinici at ât secretor ii cât și proliferativi.
Lipsa datelor disponibile cu privire la rolul receptori lor muscarinici cuplați cu proteine
Gi-cuplați în r olul hormonal al acetilcolinei (Tabelul 3) este surprinzătoare, tinând cont că
recep torii muscarinici M 2 și M 4 sunt exprima ți abundent în multe țesuturi colinergice non –
neuronale ( Williams și colab. 2004 ). A fost descris rolul receptoru lui muscarinic M 4 în
reglarea keratinocite lor (Chernyavsky și colab., 2004 ). De asemenea, a fost postula t rolul
receptorul ui M2 în dezvolta rea și proliferarea keratinocite lor (Biagiono et al., 2000 , Zhou și
colab. 2004 ).

22
Tabelul 3 Acțiuni fiziologice ale subtipurilor de receptori muscarinici
în sistemele non-neuronale (Eglen, 2006 ).

Subtip de
receptor Funcție Referință
Receptor M 1 Modularea joncțiunii gap în celulele
granuloase ovariene Fritz și colab. (2001)
Producția de IL -2 a limfocitelor Nomura și colab. (2002)
CD8 + diferențierea limfocitelor Zimring și colab. (2005)
Secreția umectantului de keratinocite Nguyen și colab. (2001)
Proliferarea celulelor traheale izolate Metzen și colab. (2003)
Receptor M 2 Diferențierea neuronilor senzoriali Biagiono și colab. (2000)
Creșterea axonală
Receptor M 3 Relaxare a vasculară prin eliberarea NO Eglen și Whiting (1990)
Creșterea și proliferarea tumorilor Song și colab. (2003)
Facilitarea mișcării celulare induse de
fibronectină Boss și colab. (2005)
Inducerea adeziunii celulă -celulă a
keratinocitelor Nguyen și colab. (2004)
Inhibarea migrări i celulare Chernyavsky si colab. (2004)
Inhibarea apoptozei Budd și colab., 2004
Receptor M 4 Stimularea migrației keratinocitare Chernyavsky si colab. (2004)
Receptor M 5 Creșterea și proliferarea celulelor mici din
carcinomul de pl ămân si a celulelor d e
adenocarcinom murinic Song și colab. (2003),
Espanol si Sales (2004)

Există multiple studii în derulare care testeaz ă efectele terapeutice ale agoniștilor
antagoniștilor receptorilor muscarinici. De exemplu, medicamentele anticolinergice
neselective ar putea asigura controlul proliferării tumorale, dat fiind faptul că activarea
receptorilor muscarinici mediază proliferarea mai multor carcinoame, în special cele ale
plămânului ( Song și colab., 2003; Trombino și colab. 2004 ). Abilitatea receptorilor
muscarinici de a modula funcția limfocitară sugerează că răspunsul imun poate fi abordat din
punct de vedere colinergic ( Kawashima și Fujii, 2003 ). Expresia receptorilor muscarinici în
piele și capacitatea lor de a modula funcția keratinocitelor sugerează că compușii muscarinici
pot fi utili zați în vindecarea rănilor ( Chernyavsky și colab., 2004 ). Unele antispasmoli tice
administrate terapeutic sunt excretate în urină, cresc ând posibilit atea apari ției unui efect local
antimuscarinic ș i o modificare a capacit ătii vezicii urinare ( Andersson și Wein, 2004; Hegde
și colab., 2004 ). De asemenea, a fost demonstrată acțiunea locală directă a oxibutininei dupa
administrarea intravezicală ( Oki și colab. 2004 ).

23
În concluzie, acetilcolina acțion ează atât în reglarea autocr ină, cȃt și ca
neurotransmițător . Înțelegerea distribu ției func ționale a receptorilor muscarinici crește șansa
descoperirii de noi căi pentru intervenția terapeutică.

24
Capit olul 2. Receptorii muscarinici ȋ n endoteliul d in
microvascularizația cerebrală
Acetilcolina, prin intermediul receptorilor colinergici, a fost implicat ă în reglarea
fluxul ui sanguin în numeroase p ături vasculare cerebrale și periferice. În circulatia cerebral ă,
implicarea receptorilor colinergici în funcțiile vasomotorii, a fost demonst rată farmacologic,
în vasele piale și în arterel e mari cerebrale ale diferitelor specii inclusiv om (Edvinsson și
colab., 1977; Krause și Edvinsson, 1984; Tsukahara și colab. 1986; Dauphin și Hamel, 1990;
Dauphin și colab., 1991; Garcia -Villalon și colab. 1991; Rand și Garland, 1992 ). Acetilcolina
este un regulator important al fluxului sanguin cerebral la om și în multe alte specii ( Sato și
Sato, 1995; Dauphin și MacKenzie, 1995 ). Fibrele nervoase intracorticale și bazalocortice
colinergice au fost asocia te intim cu microvasele și capilarele din cortexul cerebral la șobolan
(Vaucher și Hamel, 1995 ) și om ( Tong și Hamel, 1997 ).
Pe lângă inte racțiunile directe cu celule mi crovasculare musculare netede și
endoteliale , acetilcolina ar putea afecta, de asemen ea, perfuzia creierului local și al te funcții
microvasculare prin astrocitele perivasculare, sugerate ca intermediari în controlul colinergic
al microcirculației ( Vaucher și Hamel, 1995 ). Interesant, procesele astrocitelor din creierul
bovin și șobolan a u demonstrat că exprimă receptori colinergici muscarinici ( Moro si colab.,
1995; Luiten si colab., 1996 ), receptori care ar p utea fi implicați în reglarea locală a perfuziei
corticale prin eliberarea mediatorilor vasoactivi ( Alkayed și colab., 1997 ). Având în vedere ca
astrocitele din creier, în mod particular cele asociate cu microvasele, sunt dotate cu receptori
muscarinici ( Van der Zee și colab., 1993 ) și că transcriptele ARN -ului mesager pentru
receptorii M 1 și M 3 au fost detectate în musculatura neted ă a vaselor cerebrale ( Dauphin și
colab. 1991 ) sau în celule le endoteliale aortice ( Tracey si Peach, 1992 ), contribuie la ipoteza
conform car uia acești receptori particip ă în reglarea fiziologic ă a funcțiilor microvaselor
creierului. Studii farmacologice și m oleculare anterioare au demonstrat, de a semenea,
expresia ARNm care codific ă receptorii M 2, M 3 și M 5 în celulele astrogliale uman e (Guizzetti
si colab. 1996 ) și receptorii M 1 si M 3 în celule le astrogliale murine în cultură ( Andre și colab.,
1994 ). Expresia receptorilor muscarinici în celulele astrogli ale perivasculare este de mare
interes fiziologic datorită implic ării acestora în re glarea tonusului microvascular,

25
homeostaziei metabolic e și a permeabilit ății barierei hematoencefalice ( Tao-Cheng și colab.,
1987; Tsacopoulos și Magistretti, 1996; Alkayed si colab., 1997 ).
Stimularea neuronilor co linergici din partea anterioara a creierului bazal are ca
rezultat vasodilatația microvaselor cerebrale, un răspuns parțial mediat de receptorii
muscarinici ( Iadecola și colab., 1983, Biesold și colab., 1989; Dauphin și colab. 1991 ). Deși
aceste microvase , împreun ă cu astrocitele lor perivasculare , sunt cunoscute ca fiind inervate
de termina țiile nervoase colinergice ( Chedotal si colab., 1994 ) care eliberează acetilcol ina
când sunt stimulate (Kurosawa și colab., 1989 ), localizarea exactă a receptorilor colinergici
muscarinici care mediază dilatarea cerebrală rămân e încă să fie stabilită. Constatarea
prezenței receptorilor colinergici la nivelul microvasculariza ției, receptori capabili să medieze
răspunsurile vasomotorii în alte p ături cerebrovasculare, indic ă faptul că microvasele
creier ului posedă receptorii adecvați sa regleze diametrul și, pri n urmare, distribuția sângelui.
La nivelul microcirculației creierului, ace tilcolina induce vasodilatația arteriolelor
intracorticale la șobolan ( Dacey și Bassett, 1987 ), bovine și umane ( Elhusseiny și Hamel,
1998 ). De asemenea, r eceptorii colinergici au fost asocia ți cu controlul tonusul ui
cerebrovascular în arteriole izolate de la șoarece (Dacey și Basset, 1987 ), și în vasele piale de
dimensiuni mici la șoarece ( Shimizu și colab., 1993 ). La nivelul microcircula ției
intraparenchimale a creierului, receptorii muscarinici au fost demonstra ți că sunt implica ți în
diverse func ții de tip vasodilatare ( Dacey și Basset, 1987 ), flux cerebral local ( Arneric și
colab., 1987; Scremin și colab., 1988; Biesold și colab., 1989; Lacombe și colab., 1989;
Dauphin și colab., 1991 ) și reglare a permeabilită ții barierei hematoencefalice ( Duckles,
1988).
Interesant, creșteri mediate colinergic ale fluxului sanguin au fost observate în
subdiviziunile frontale și parietale ale cortexului cerebral în urma stimulării neuronilor
creierului bazal și/sau receptorilor colinergici muscarinici (Sato și Sato, 19 95). Situ surile de
legare a le receptorilor muscarinici au fost identificate in microvasculariza ția cerebrală
(Estrada și colab., 1983 ), și, multiple subtipuri de receptori colinergici au fost identificate la
nivelul microvaselor și capilarelor, inclusiv la om ( Garcia – Villalon și colab., 1991; Linville și
Hamel, 1995 ). Cu toate acestea, absența unor liganzi de legare selectivi pentru toate tipurile
de receptori colinergici au făcut dificilă identificarea subtipului de receptor implicat. Mai
mult, studii le de legare a radioliganzilor

în omogenate de tesut nu au putut l ocaliza receptorii colinergici într-un anumit subtip celular
specific din fracțiile microvasculare izolate ( Linville și Hamel, 1995; Moro și colab., 1995 ).

26
Except ând prezen ța siturilor de leg are a receptorilor muscarinici la nivelul
microvasele cerebrale ( Estrada și Krause, 1982; Estrada și colab., 1983; Gramas și colab.,
1983 ) se cunosc pu ține lucruri despre subtipurile de receptori colinergici prezen ți în
microvasculatura cerebrală ( Garcia -Villalon și colab. 1991 ). Unele studii indic ă absen ța
receptorilor colinergici la nivelul microcircula ției creierului uman ( Ferrari -Dileo și Potter,
1985; O’Neill și colab., 1988 ). Pentru identificarea subtipurilor de receptori colinergici
prezen ți în micro circulatia cerebrală, au fost efectuate , de asemenea, teste farmacologice
utiliz ând antagoni ști ai receptorilor muscarinici iar rezultatele ob ținute au fost comparate cu
datele farmacologice ob ținute prin teste pe receptori muscarinici exprima ți în sisteme celulare
heteroloage de expresie ( Linville și Hamel, 1992; Linville și colab., 1993 ).
Studiile cu radioliganzi au confirmat prezen ța receptorilor muscarinici în majoritatea
arterelor cerebrale umane, c âine ( Tsukahara și colab., 1986 ) și bovine ( Vanderhey den și
colab., 1988 ) și în vasele piale la bovine, om și porcine ( Estrada și Kraus e, 1982; Dauphin și
Hamel, 1992 ; Lasbennes și colab., 1992 ).
Diverse studii sugereaz ă că răspunsul vasomotor distinct la nivel cerebral este
mediat de receptori specifici co linergici. De exemplu, în arterele mediane cerebrale la pisic ă,
receptorii M 1 si M 3 mediaz ă vasoconstric ția și vasodilatatea, ambele r ăspunsuri fiind în
legatur ă cu metabolismul fosfoinozitidei ( Dauphin si Hamel, 1990 , 1992; Dauphin si colab.,
1994 ). De as emenea, s -a demonstrat c ă receptorii M 3 mediaz ă vasodilata rea în arterele piale la
iepure ( Garcia -Villalon si colab., 1991 ). În vasele piale de dimensiuni mici de la șoareci ,
studiile in vivo au demonstrat c ă receptorii M 1 si M 3 mediaz ă vasoconstric ția și vasodilatarea
(Shimizu si colab., 1993 ).
Receptorii M 1 au fost identificați în vasele cerebrale de sânge de la diferite specii
atât în artere mari ( Tsukahara și colab., 1986; Dauphin și colab. 1991; Garcia -Villalon și
colab. 1991 ) cât și în arteriole mici piale ( Shimizu și colab., 1993 ). În mod similar a fost
demonstrat faptul ca vasorelaxarea poate fi d ependentă de receptorii M 3 exprima ți in vivo la
nivelul arterelor cerebrale izolate ( Dauphin și Hamel, 1990 ) și arteriole de șoarece de
dimensiuni mici ( Shimizu și colab. 1993 ). Astfel, este posibil ca receptori i colin ergici din
microvasculari zație să medi eze funcțiile vasomotorii sau să regleze permeabilitatea barierei
hematoencefalice (Spatz și colab., 1989 ).
În arterele cerebrale mari, activarea recepto rilor muscarinici pentru acetilcolin ă
poate avea ca rezultat răspunsuri vas culare diferite în funcție de subtip ul de receptor
colinergic activat . Studiil e farmacologice au identificat subtipul M 3 este impli cat în
vasodilat area indus ă de acetilcolin ă (Dauph in și Hamel, 1990 ; Garcia -Villalon și colab. ,

27
1991 ), în timp ce subtipul M l a fost implicat în vasoconstricția cerebrală ( Dauphin și colab.,
1991, Shimiz u și colab., 1993 )
În arterele cerebrale mari ale diferitelor specii, receptorii M 3 (Dauphin și Hamel,
1990; Garcia -Villalon și colab., 1991; Dauphin și Mackenzie, 1995 ) și M 5 (Hamel și colab.,
1994; Phillips ș i colab., 1997 ) au fost sugera ți ca fiind implica ți în vasodila tația indusă de
acetilcolină și mediat ă de oxidul nitric eliberat din endoteliu.
Rolul receptorului M 5 în microcirculație este de mare interes , ținând cont de studiile
care sugereaz ă că acest subtip de receptor muscarinici este asociat cu generarea și eliberarea
oxidului nitric ( Wang și colab., 1994 ), o substan ță cunoscută c ă ar putea fi implicată în
vasodilatație corticală med iată de receptorii muscarinici provocată de stimularea creierului
bazal.
Elhusseiny și colab., 1999 prin s tudiile de RT -PCR au demonstrat expresia
receptorilor M2 în celulele endoteliale din microvasculariza ția cere brala uman ă, expresia
receptorilor M1, M 2, M 3 si M 5 în celulele musculaturii netede din microvasculariza ția
cerebral ă uman ă, și expresia receptorilor M1, M 2 si M 3, și slab M 4 în astrocitele umane în
cultur ă (Figura 2).

Figura 2. Geluri de electroforeza pe care au fost migra ți produ șii de RT -PCR ai expresiei
receptorilor muscarinici în celule din microvasculariza ția uman ă și astrocite umane în cultur ă
(Elhusseiny și colab., 1999 ).
De asemenea, aceeași autori ( Elhusseiny și colab., 1999 ) au identificat prin studii de
RT-PCR expresia receptorilor M 3 în microvasele umane din probe de creier post -mortem, și
au constatat absența receptorilor M 2 în microvasele și capilarele umane din probe de creier
post-mortem ( Figura 3 ).

28

Figura 3. Geluri de electrofore za pe care au fost migra ți produ șii de RT -PCR ai expresiei
receptorilor muscarinici în microvasele și capilarele umane din probe de creier post -mortem
(Elhusseiny și colab., 1999 ).

Elhusseiny și colab., 1999 au analizat prin RT -PCR expresia tuturor recep torilor
muscarinici în probe umane și rezultatele sunt sumarizate în Figura 4 .

Figura 4. Rezultate ale RT -PCR indic ând expresia receptorilor muscarinici în CAP –
capilare, MV – microvase, EC – celule endoteliale, SMC – celule musculare netede din
vascu lariza ție, AST – astrocite ( în cultur ă) (Elhusseiny și colab., 1999 ).

De asemenea au fost realizate studii de imunohistochimie ( Figura 5 ) și
imunofluorescen ță (Figura 6 ) pentru identificarea receptorilor muscarinici în vasculariza ția
cerebral ă la șobolan . Badaut și colab., 19 97 au identificat c ă receptorii muscarinici sunt
localiza ți pe suprafaț a vaselor sanguine, av ând un marcaj intens la nivelul vaselor mari, mai
slab la nivelul vaselor medii (diametru sub 50 μm) și a fost aproape absent la nivelul
capilarelor. Din pă cate acest studiu utilizeaz ă anticorpi anti -M35, care sunt destul de
nespecifici (Badaut și colab., 19 97).

29

Figura 5. (A) Marcaj cu Cresyl violet, (B) Marcaj de imunofluorescen ța a receptorilor
muscarinici în artera bazila ră la sobolan. A – fața abluminal ă, L – fața luminal ă, AD –
adventi ția, M – media, EM – membrana elastic ă, I – intima ( Badaut și colab., 19 97).

Figura 6. Dublu marcaj al receptorilor muscarinici (FITC, verde) și al endoteliului (Cy3,
rosu) la nivelul capilarelor din va sculariza ția cerebral ă la șobolan ( Badaut și colab., 19 97).

30
Capitolul 3. Scopul și obiectivele lucrarii
Scopul lucrării este studiul nivelului de expresie al receptorilor muscarinici pentru
acetilcolin ă ȋn celulele endoteliale din microvascularizația cer ebrală murină .

Obiectivele tezei sunt :

1) Identificarea nivelului de expresie al receptorilor muscarinici pentru acetilcolin ă ȋn
celulele endoteliale din microvascularizația cerebrală murină în culturi primare

2) Identificarea nivelului de expresie al recepto rilor muscarinici pentru acetilcolin ă ȋn
celulele endoteliale din microvascularizația cerebrală murină într-o linie celular ă
(bEnd.3)

3) Compara ție între expresia receptorilor muscarinici între celulele endoteliale în
cultura primar ă și în linia celular ă

31
Capitolul 4 . Materiale si Metode
4.1. Cult ivarea celulelor endoteliale – cultura primar ă

Celulele endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă în cultura primar ă au fost ob ținute
de la șoareci Balb/c . Celulele au fost achizi ționate de la firma german ă PeloBiotech (cod
catalog #PB-BALB -5023 ) și au fost cultivate între pasajele 3 si 6, în conformitate cu
instruc țiunile producatorului. Celulele au fost men ținute în incubator într-o atmosfer ă de 5%
CO 2 și o temperatur ă constant ă de 37°C . Celulele au fost testat e pentru infec ția cu
micoplasm ă folosind mascajul nucleelor cu Hoechst (#B2883, Sigma). Celulele au fost
însămânțate la o densitate de 2 x 104 celule /cm2 pe flask -uri de 25 cm2 si desprinse pentru
experimentele de qRT-PCR.

4.2. Cult ivarea celulelor endote liale – linie celular ă

Celulele endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă imortalizate de la șoarece,
bEnd.3, sunt o linie celular ă murin ă transformat ă de la șoareci Balb/c . Celulele bEnd.3 au fost
achizi ționate de la ATCC, cod catalog #ATCC® CRL -2299 ™, și au fost cultivate între
pasajul 22 si 30. Celulele au fost cultivate în DMEM cu Glutamax -I, 10% ser fetal bovin
(Gibco), 100 U/ml penicilină, 100 μg/ml streptomicină. Celulele au fost men ținute în
incubator într-o atmosfer ă de 5% CO 2 și o temperatur ă constant ă de 37°C . Celulele au fost
testate pentru infec ția cu micoplasm ă folosind mascajul nucleelor cu Hoechst (#B2883,
Sigma). Celulele au fost însămânțate la o densitate de 2 x 104 celule /cm2 pe flask -uri de 25
cm2 și desprinse pentru experimentele de qRT-PCR. Celulele vizualizate la microscop și
etapele preg ătirii culturii celulare sunt prezentate în Figura 7 și Figura 8 .

32

Figura 7. Celulele endoteliale bEnd.3 la microscop inversat WPI (obiectiv, 4x aer)

Figura 8. Etapele preg ătirii culturii cel ulare de celule endoteliale.

4.3. Metoda de transcriere inversă cuplată cu reacție de polimerizare în lanț cant itativă
(qRT -PCR)

Pentru a cuantifica nivelul de expresie al ARNm care codifică recept orii M 1, M 2, M 3,
M4 si M 5 în celulele endoteliale din mic rovasculariza ția cerebral ă murin ă, ARN -ul total a fost
extras utiliz ând kitul GenElute Mammalian Total RNA MiniPrep Kit (RTN70, Sigma)
(Figura 9 ). Am utilizat tratamentul cu DNAaza I pentru a înlatura contam inarea probelor cu
ADN genomic.

33

Figura 9. Pregatire probe PCR.

34
Etapa de extrac ție a ARN -ului total s -a realizat parcurg ându-se urmatoarele etape:
(1) Lizarea celulelor și inactivarea RNazelor folosind solu ția de liz ă (500 µL) si 2 –
mercapto -etanol (5 µL ). Etapa este critic ă și trebuie realizat ă rapid și complet.
(2) Filtrarea lizatului. Aceast ă etapă se realizeaz ă pentru a îndeparta debriurile celulare
și ADN -ul contaminant, folosind coloana de filtrare a kitului.
a. Filtratul se leag ă de o coloana de silicagel prin ad ăugarea unei solu ții de etanol 70 %.
b. Se centrifughea ză timp de 15 secunde la 14500 x g.
(3) 3 etape de spalare cu Solu țiile de Spalare 1 si 2. a. Se centrifugheaz ă timp de 15
secunde, respectiv 2 minute pentru a îndeparta complet etanolul din solu ția de spalare 2.
(4) Eluarea ARN -ului t otal în 50 µl Buffer de eluție.
a. În coloana de legare se adaug ă tamponul de elu ție și se centrifugheaz ă timp de 1
minut la vitez ă maxim ă.
b. ARN -ul astfel ob ținut poate fi pastrat la -70°C sau poate fi folosit imediat pentru
revers transcrierea în ADNco mplementar .
c. Concentra ția și puritatea ARN -ului total izolat s e determin ă prin masur ători
spectrofotometrice.
Concentra ția de ARN a fost determinat ă prin m ăsurători spectrofotometrice (Beckman
Coulter DU 730) , prin citirea absorban ței la lungimile de und a 260 nm și 280 nm. Pentru
celulele endoteliale în cultur ă primar ă am ob ținut un raport al absorban țelor de A 260/A280 =
1.90 ± 0.02, iar pentru linia celula ră am ob ținut un raport al absorban țelor de A 260/A280 = 2.10
± 0.05.
Reac ția de revers transcrip ție a fost realizat ă utiliz ând kitul High -Capacity cDNA
Archive Kit (Applied Biosystems, USA) și sistemul de PCR GeneAmp 9700 (Applied
Biosystems). Kitul permite conversia cantitativ ă a 0.1 – 10 µg ARN total în ADN
complementar. Procedura de revers -transcriere (Tabel 4) presupune mai întai realizarea unui
amestec de revers -transcriere ( tampon de revers transcriere, dinucleotidetrifosfat, primeri
aleatori și revers trascriptaza MultiScribe) peste care se adaug ă probele de ARN.

35
Tabel 4 . Condi țiile optime pentru realizarea revers transcrierii.

Pasul 1 Pasul 2 Pasul 3 Pasul 4
Temperatura (oC) 25 37 85 4
Timp 10 min 120 min 5 sec ∞

Abunde nța relativ ă a transcriptelor Chrm1 -Chrm5 a fost determinat ă prin metoda de
transcriere inversă cuplată cu reacț ie de polim erizare în lanț cantita tivă (qRT -PCR) utiliz ând
tehnologia TaqMan și folosind un sistem de tip ABI Prism 7300 Sequence Detection System
(Applied Biosystems, USA) . Au fost utilizați primeri Taqman (Thermo Fisher Scientific ,
USA) care sunt prezen tați in Tabe lul 5.

Tabel 5 . Primeri Taqman utiliza ți (Thermo Fisher Scientific )

Primer Taqman
(#cod catalog) Gena Proteina codificat ă Specie
Mm00432509_s1 Chrm1 Receptor M 1 Șoarece
Mm00627005_m1 Chrm1 Receptor M 1 Șoarece
Mm01701855_s1 Chrm2 Receptor M 2 Șoarece
Mm01167087_m1 Chrm2 Receptor M 2 Șoarece
Mm01338409_m1 Chrm3 Receptor M 3 Șoarece
Mm00432514_s1 Chrm4 Receptor M 4 Șoarece
Mm01701883_s1 Chrm5 Receptor M 5 Șoarece
Mm999999_g1 Gapdh gliceradehid ă 3-fosfat dehidrogenaz ă Șoarece
Mm00607939_s1 Actb β-actin ă Șoarece

Reac țiile au fost realizate în triplicat fiind amplificate pana la 50 cicluri. Genele de
referin ță utilizate au fost Actb (care codific ă β-actin a) și Gapdh (care codifică gliceradehida 3 –
fosfat dehidrogenaz ă), vezi Tabel 5.
Etapele necesare pent ru cuantificarea relativ ă a nivelului de expresie sunt:
(1) Realizarea unui amestec de reac ție (TaqMan Gene Expression PCR master mix,
primeri și probe TaqMan, ap ă fara RNaze) pentru fiecare gen ă de interes peste care se adaug ă
ADN -ul complementar.
(2) Amp lificarea prin real -time PCR (ABI PRISM 7300, Applied Biosystem) folosind
următorii pasi de temperatur ă:
– 50°C, 2 minute;
– 95°C, 10 minute;

36
– 50 cicluri:
– 95°C, 15 secunde;
– 60°C, 1 minut

4.4. Analiza datelor

Au fost analizate curbele de amplif icare qRT -PCR și a fost identificat ă valoarea prag
(CT), Figura 10 . Valoarea C T este invers proportionala cu cantitatea de acid nucleic.

Figura 10.Valoarea prag în curba de amplificare qRT -PCR

Aceast ă metod ă permite cuantificarea diferen țelor în nivel ul de expresie genica a
diferitelor gene ținta în diferite condi ții experimentale. Nivelul de expresie al genelor studiate
se normalizeaz ă față de expresia unei gene de control (gena de referin ța) ce nu îsi modific ă
expresia în functie de condi țiile de luc ru. În cazul acestor experimente, contro alele endogen e
folosit e au fost Gapdh (gliceraldehid 3 -fosfat dehidrogenaz ă) și Actb (β-actin ă).
Analiza cantitativ ă a nivelului mRNA care codific ă pentru receptorii muscarinici ai
acetilcolinei s-a facut prin norma rea fie la Gapdh mRNA , fie la Actb mRNA , prin metoda
descris ă anterior de Livak si Schmittgen 2001 .

37
Capitolul 5 . Rezultate și Discuții
5.1. Expresia genelor control Gapdh și Actb în celulele endoteliale din
microvasculariza ția cerebral ă în cultura primar ă și în linia celular ă

Am ob ținut în fiecare godeu o cantitate de 150 ng ADNc. Am identificat pentru fiecare
genă de referin ța (Gapdh si Actb) valorile C T din grafice (Tabel 6) at ât pentru celulele
endo teliale în cultura primar ă cât și în linia celular ă imortalizat ă. Am facut media a trei valori
ale C T obținute în 3 godeuri diferite și am calculat devia ția standard.

Tabel 6 . Valoarea C T pentru genele de referin ța Gapdh si Actb în celulele endoteliale
din microvasculariza ția cerebral ă

Gena Cultura primar ă Linie celular ă
CT Medie C T CT Medie C T
Gapdh 15,0258 14,90 ± 0,28 15,3487 15,04 ± 0,29
14,5816 14,9976
15,1061 14,7628
Actb 16,8164 16,67 ± 0,13 15,6976 15,48 ± 0,18
16,6598 15,3871
16,5486 15,3686

Am reprezentat grafic media ± SD pe ntru valorile C T obținute pentru cele doua gene în
celulele endoliale în cultura primar ă cât și în linia celular ă imortalizat ă (Figura 11 ). Se
observa c ă nivelul de expresie al genei Gapdh este comparabil ă între celulele endoliale în
cultura primar ă cât și în linia celular ă imortalizat ă. În schimb, în cazul genei Actb, valorile C T
sunt mai mari în cultura primar ă decât în linia celular ă.

38

Figura 11 . Valorile C T obtinute pentru genele Gapdh si Actb în celulele endoliale în
cultura primar ă și în linia celul ară imortalizat ă

5.2. Expresia receptorilor muscarinici pentru acetilcolin ă în celulele
endote liale din microvasculariza ția cerebral ă în cultura primar ă și în linia
celular ă

În cazul genei Chrm1 , am utilizat doi primeri Mm00432509_s1 și Mm00627005_m1
(Tabel 7 ), și am ob ținut amplificare în toate cele trei godeuri doar pentru primerul
Mm00432509_s1 , dupa care am facut calculul pentru C T ale mediei si devia ției standard.

Tabel 7. Valorile C T pentru gena Chrm1 , utiliz ând doi primeri diferiti, în celulele
endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă

Gena Cultura primar ă Linie celular ă
CT Medie C T CT Medie C T
chrm1
(primer
Mm00432509_s1) 39,0253 38,63 ± 0,43 36,375 36,08 ±
38,1581 35,4421
38,7053 36,4121
chrm1 42,1745 – 39,5441 –

39
(primer
Mm00627005_m1) 41,6648 –
– –
Am reprezentat grafic în Figura 12 , valorile C T pentru chrm1 ARNm pentru celulele
endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă în cultura primar ă și în linia celular ă. Se observ ă
că nivelul de expresie al genei chrm1 este mai mare (valori CT mai mici) în celulele endoliale
în linia celular ă imortalizat ă decât în cultura primar ă.

Figura 12 . Valorile C T obtinute pentru gena chrm1 în celulele endo teliale în cultura
primar ă și în linia celular ă imortalizat ă

În cazul genei Chrm2 , am utilizat de asemenea doi primeri Mm01701855_s1 si
Mm01167087_m1 (Tabel 8 ), si am ob ținut amplificare în toate cele trei godeuri doar pentru
primerul Mm01701855_s1 , dupa care am facut calculul pentru C T ale mediei si devia ției
standard.

40
Tabel 8 . Valorile C T pentru gena Chrm 2, utiliz ând doi primeri diferi ți, în celulele
endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă

Gena Cultura primar ă Linie celular ă
CT Medie C T CT Medie C T
chrm2
(primer
Mm01701855_s1 ) 38,1568 38,89 ± 0,73 38,4309 38,91 ± 1,11
39,6329 40,1778
38,901 38,1149
chrm2
(primer
Mm01167087_m1 ) 43,298 – – –
– 39,8105
– –

Am reprezentat grafic în Figura 13 , valorile C T pentru chrm 2 ARNm pentru celulele
endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă în cultura primar ă și în linia celular ă. Se observ ă
că nivelul de expresie al genei chrm2 este comparabil în celulele endo teliale în linia celular ă
imortalizat ă și în cultura primar ă. Având în vedere nivelul de expresie extrem de sc ăzut al
genei chrm2 devia ția standard este ma i mare și exista diferen țe între godeuri de mai mult de 1
ciclu de amplificare.

Figura 13 . Valorile C T obtinute pentru gena chrm2 în celulele endo teliale în cultura
primar ă și în linia celular ă imortalizat ă

41
Tabel 9 . Valorile C T pentru genele Chrm 3, Chrm4, și Chrm 5, în celulele endoteliale din
microvasculariza ția cerebral ă

Gena Cultura primar ă Linie celular ă
CT Medie C T CT Medie C T
chrm3
(primer
Mm01338409_m1 ) 23,1912 23,75 ± 0,96 22,0316 21,98 ± 0,32
23,1966 21,649
24,8672 22,2877
chrm4
(primer
Mm00432514_s1 ) 29,343 28,75 ± 0,50 26,2931 26,70 ± 0,44
28,4655 26,6544
28,459 27,1765
Chrm5
(primer
Mm01701883_s1 ) 33,1529 32,62 ± 0,47 31,5738 32,17 ± 0,64
32,4779 32,0965
32,245 32,8655

Am reprezentat grafic in Figura 14, valoril e C T pentru chrm3 ARNm pentru celulele
endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă în cultura primar ă și în linia celular ă. Se observ ă
că nivelul de expresie al genei chrm3 este mai mare (valori C T mai mici) în celulele
endo teliale în linia celular ă imor talizat ă decât în cultura primar ă.
Figura 14. Valorile C T obtinute pentru gena chrm3 în celulele endoliale în cultura primar ă și
în linia celular ă imortalizat ă

42
Am reprezentat grafic in Figura 15, valorile C T pentru chrm4 ARNm pentru celulele
endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă în cultura primar ă și în linia celular ă. Se observ ă
că nivelul de expresie al genei chrm4 este mai mare (valori C T mai mici) în celulele endoliale
în linia celular ă imortalizat ă decât în cultura primar ă.

Figura 15 . Valo rile C T obtinute pentru gena chrm4 în celulele endoliale în cultura
primar ă și în linia celular ă imortalizat ă

Am reprezentat grafic în Figura 16, valorile C T pentru chrm5 ARNm pentru celulele
endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă în cultura primar ă și în linia celular ă. Se observ ă
că nivelul de expresie al genei chrm5 este comparabil între celulele endo teliale în linia
celular ă imortalizat ă și în cultura primar ă.

43

Figura 16 . Valorile C T obtinute pentru gena chrm5 în celulele endo teliale în cultur a
primar ă și în linia celular ă imortalizat ă

5.3. Expresia comparativ ă a receptorilor muscarinici pentru
acetilcolin ă în celulele endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă în
cultura primar ă și în linia celular ă

Am f ăcut o comparație cantitativ ă a niv elului de expresie al ARNm pentru cei cinci
receptori muscarinici ai acetilcolinei utiliz ând metoda Livak.
Analiza expresiei ARNm care codifică receptorii muscarinici în cultura primar ă de
celule endoteliale este prezentat ă în Tabelul 10 și Tabelul 11 în raport cu gena de referin ță
Actb și în Tabelul 12 și Tabelul 13 în raport cu gena de referin ță Gapdh .
De asemenea, analiza expresiei ARNm care codific ă receptorii muscarinici în linia
celular ă de celule endoteliale este prezentat ă în Tabelul 14 și Tabelul 15 în raport cu gena de
referin ță Actb și în Tabelul 16 și Tabelul 17 în raport cu gena de referin ță Gapdh .

44

Tabel 10. Valorile ΔC T pentru cei cinci receptori muscarinici în raport
cu gena de referin ță Actb pentru c ultura primar ă de celule endoteliale

Cultura
primar ă de
celule
endoteliale CT(Actb )-CT(chrm1 ) CT(Actb )-CT(chrm2 ) CT(Actb )-CT(chrm3 ) CT(Actb )-CT(chrm4 ) CT(Actb )-CT(chrm5 )
-22,2089 -21,3404 -6,3748 -12,5266 -16,3365
-21,4983 -22,9731 -6,5368 -11,8057 -15,8181
-22,1567 -22,3524 -8,3186 -11,9104 -15,6964

Tabel 1 1. Valorile 2ΔCT pentru cei cinci receptori muscarinici în raport
cu gena de referin ță Actb pentru c ultura primar ă de celule endoteliale

Cultura
primar ă de
celule
endoteliale 2ΔCT(Actb )-CT(chrm1 ) 2ΔCT(Actb )-CT(chrm2 ) 2ΔCT(Actb )-CT(chrm3 ) 2ΔCT(Actb )-CT(chrm4 ) 2ΔCT(Actb )-CT(chrm5 )
2,06 * 10-7 3,77 * 10-7 1,20 * 10-2 1,69 * 10-4 1,21 * 10-5
3,38 * 10-7 1,21 * 10-7 1,08 * 10-2 2,79 * 10-4 1,73 * 10-5
2,14 * 10-7 1,87 * 10-7 0,31 * 10-2 2,60 * 10-4 1,88 * 10-5

45
Tabel 12. Valor ile ΔC T pentru cei cinci receptori muscarinici în raport
cu gena de referin ță Gapdh pentru cultura primar ă de celule endoteliale

Linie
celular ă de
celule
endoteliale CT(Gapdh )-CT(chrm1 ) CT(Gapdh )-CT(chrm2 ) CT(Gapdh )-CT(chrm3 ) CT(Gapdh )-CT(chrm4 ) CT(Gapdh )-CT(chrm5 )
-23,9995 -23,131 0 -8,1654 -14,3172 -18,1271
-23,5765 -25,0513 -8,615 -13,8839 -17,8963
-23,5992 -23,7949 -9,7611 -13,3529 -17,1389

Tabel 1 3. Valorile 2ΔCT pentru cei cinci receptori muscarinici în raport
cu gena de referin ță Gapdh pentru cultura primar ă de celule endoteliale

Cultura
primar ă de
celule
endoteliale 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm1 ) 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm2 ) 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm3 ) 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm4 ) 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm5 )
5,96 * 10-8 1,09 * 10-7 3,48 * 10-3 4,90 * 10-5 3,49 * 10-6
7,99 * 10-8 2,88 * 10-8 2,55 * 10-3 6,61 * 10-5 4,10 * 10-6
7,86 * 10-8 6,87 * 10-8 1,15 * 10-3 9,56 * 10-5 6,93 * 10-6

46
Tabel 14. Valorile ΔC T pentru cei cinci receptori muscarinici în raport
cu gena de referin ță Actb pentru linia celular ă de celule e ndoteliale

Cultura
primar ă de
celule
endoteliale CT(Actb )-CT(chrm1 ) CT(Actb )-CT(chrm2 ) CT(Actb )-CT(chrm3 ) CT(Actb )-CT(chrm4 ) CT(Actb )-CT(chrm5 )
-20,6774 -22,7333 -6,334 0 -10,5955 -15,8762
-20,055 0 -24,7907 -6,2619 -11,2673 -16,7094
-21,0435 -22,7463 -6,9191 -11,8079 -17,4969

Tabel 1 5. Valorile 2ΔCT pentru cei cinci receptori muscarinici în raport
cu gena de referin ță Actb pentru linia celular ă de celule endoteliale

Cultura
primar ă de
celule
endoteliale 2ΔCT(Actb )-CT(chrm1 ) 2ΔCT(Actb )-CT(chrm2 ) 2ΔCT(Actb )-CT(chrm3 ) 2ΔCT(Actb )-CT(chrm4 ) 2ΔCT(Actb )-CT(chrm5 )
5,96 * 10-7 1,43 * 10-7 1,24 * 10-2 6,46 * 10-4 1,66 * 10-5
9,18 * 10-7 3,44 * 10-7 1,30 * 10-2 4,06 * 10-4 9,33 * 10-6
4,63 * 10-7 1,42 * 10-7 0,82 * 10-2 2,79 * 10-4 5,41 * 10-6

47
Tabe l 16. Valorile ΔC T pentru cei cinci receptori muscarinici în raport
cu gena de referin ță Gapdh pentru linia celular ă de celule endoteliale

Linie
celular ă de
celule
endoteliale CT(Gapdh )-CT(chrm1 ) CT(Gapdh )-CT(chrm2 ) CT(Gapdh )-CT(chrm3 ) CT(Gapdh )-CT(chrm4 ) CT(Gapdh )-CT(chrm5 )
-21,0263 -23,0822 -6,6829 -10,9444 -16,2251
-20,4445 -25,1802 -6,6514 -11,6568 -17,0989
-21,6493 -23,3521 -7,5249 -12,4137 -18,1027

Tabel 1 7. Valorile 2ΔCT pentru cei cinci receptori muscarinici în raport
cu gena de referin ță Gapdh pentru linia celular ă de celule endoteliale

Cultura
primara de
celule
endoteliale 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm1 ) 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm2 ) 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm3 ) 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm4 ) 2ΔCT(Gapdh )-CT(chrm5 )
4,68 * 10-7 1,13 * 10-7 9,73 * 10-3 5,07 * 10-4 1,31 * 10-5
7,00 * 10-7 2,63 * 10-8 9,95 * 10-3 3,10 * 10-4 7,12 * 10-6
3,04 * 10-7 9,34 * 10-8 5,43 * 10-3 1,83 * 10-4 3,55 * 10-6

48
Am reprezentat grafic valorile 2ΔCT pentru cei cinci receptori muscarinici pentru cultura
primar ă de celule endoteliale în Figura 17 în raport cu gena de referin ță Actb și în Figura 1 8
în raport cu gena de referin ță Gapdh . În plus, am reprezentat grafic valorile 2ΔCT pentru cei
cinci receptori muscarinici pentru linia celular ă de celule endoteliale în Figura 1 9 în raport cu
gena de referin ță Actb și în Figura 20 în raport cu gena de referin ță Gapdh .
Atât în cazul culturii primare de celule endoteliale, c ât și în cazul liniei celulare de
celule endoteliale, se observ ă că expresia ARNm care codifică pentru receptorii muscari nici
de acetilcolin ă are secventa M 3 > M 4 > M 5 > M 1 > M 2. Aceasta secvent ă de expresie este
reproductibil ă indifere nt de gena de referin ță aleas ă.
Ȋn prezentul studiu am demonstrat că toate cele 5 subtipuri de receptori muscarinici
pentru acetilcolină sunt prezenți în celulele endoteliale din microvascularizația cerebrală, atât
în cultura primară BMVEC, cât și în linia celulară imortalizată bEnd.3.
Am demonstrat că receptorii M 2 au un nivel de expresie slab, în timp ce receptorii M 1,
M4 și M 5 au un nivel d e expresie mediu/mare. Am detectat nivele foarte crescute ale expresiei
receptorilor muscarinici M 3, care sunt în acord cu datele raportate anterior în literatură, în
arteriolele care asigur ă microvascularizația retiniană la șoarece ( Gericke și colab. 2011 ).
În comparație cu studiul lui Gericke și colab. 2011 , care nu detecteaz ă decat prezența
receptorilor M 3 în microvascularizația murină retiniană, în studiul nostru am detectat și
expresia celorlalte 4 subtipuri de receptori muscarinici (M 1, M 2, M 4 si M 5). Aceste diferențe
sunt date de faptul c ă în studiul precedent limita de detectie a expresiei receptorilor
muscarinici relativ ă la nivelul de beta -actina este de 10-4, ceea ce este mult peste nivelul la
care detectăm expresia receptorilor muscarinici M 1, M 2, M 4 si M 5.
Nivelul foarte scazut al expresiei receptorilor M 2 pe care l -am identificat în celulele
endoteliale din microvascularizația cerebrală murină este în acord cu datele de proteomică
raportate anterior la nivelul arterelor cerebrale la șoarece ( Badhwar și colab., 2014 ). De
asemenea, rezultatele lucrarii sunt promi țătoare ținând cont de faptul c ă studiile anterioare
utiliz ând radioliganzii au detectat receptorul M 2 în microvasculatură cerebrală umană izolată
(Linville și Hamel, 1995 ) și studii de imunocitochimie au demonstrat expresia receptorilor M 2
în endoteliul de la sobolan, primate, sau în capilarele creierul ui uman ( Levey și colab. 1995;
Smiley și colab., 1998 ).

49

Figura 17 . Valorile 2ΔCt obtinute pentru cei cinci receptori în raport cu gen a de referin ță
Actb în cultura primar ă de celulele endoteliale

Figura 18 . Valorile 2ΔCt obtinute pentru cei cinci receptori în raport cu gena de referin ță
Gapdh în cultura primar ă de celule endoteliale

50

Figura 1 9. Valorile 2ΔCt obtinute pentru cei cinc i receptori în raport cu gena de referin ță Actb
în linia celular ă de celule endoteliale

Figura 20 . Valorile 2ΔCt obtinute pentru cei cinci receptori în raport cu gena de referin ță
Gapdh în celulele endoteliale în cultura primară

51
Capitolul 6 . Concluzii
Principalele concluzii ale studiului sunt :

1. Receptorul M 3 are nivelul de expresie cel mai mare în celulele endoteliale din
microvasculariza ția cerebral ă murin ă

2. Au fost detectate nivele scazute de expresie pentru receptorii M 1 și M 2 în
celulele endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă murin ă

3. Secven ța de expresie a ARNm care codific ă receptorii muscarinici este M 3 >
M4 > M 5 > M 1 > M 2, în celulele endoteliale din microvasculariza ția cerebral ă
murin ă, indiferent dac ă folosim o gen ă de referin ță care codif ică o protein ă
structural ă din citoschelet ( Actb) sau o gen ă de referin ță care codific ă o
protein ă de tip enzimatic ( Gapdh )

4. Secven ța de expresie a ARNm care codific ă receptorii muscarinici este
reproductibil ă atât în cultura primar ă cât și în linia celula ră, ceea ce indic ă
faptul c ă testele farmacologice realizate pe linia celular ă bEnd.3 sunt robuste și
au translabilitate către modelele animale

5. Rezultatele ob ținute au o mare importan ță farmacologic ă datorit ă multitudinii
de teste care se realizeaz ă pe șoareci/ șoareci transgenici în care sunt țintiți
receptorii muscarinici pentru acetilcolin ă din microvasculariza ția cerebrala în
scop terapeutic pentru multiple patologice neurologice și psihiatrice.