Conducator științific Student As.dr.ing. Adrian Ionuț NICOARĂ Geanina Andreea BUȘCĂ 2020 PROIECT DE DIPLOMĂ Materiale pe bază de Hidroxiapatită… [305658]

Universitatea POLITEHNICA din București

Facultatea de Inginerie Medicală

PROIECT DE DIPLOMĂ

Conducator științific Student: [anonimizat].dr.ing. Adrian Ionuț NICOARĂ Geanina Andreea BUȘCĂ

2020

[anonimizat]: [anonimizat]-Andreea BUȘCĂ

Conducător Științific: As.dr.ing. Adrian NICOARĂ

București

<iunie-iulie 2020>

CUPRINS

ABSTRACT 5

INTRODUCERE 6

1. ASPECTE GENERALE 6

2. CAUZE ALE APARIȚIEI DEFECTELOR OSOASE 8

2.1. Osteoporoza 8

2.3. Cancer osos 10

2.3. Infecții cauzate de microorganisme 12

3. REPARAREA DEFECTELOR OSOASE 13

3.1. Remodelare osoasă 14

3.2. Grefe osoase 17

3.2.1. [anonimizat] 17

3.2.2. Materiale aloplastice 18

3.2.2.1 Materialele metalice 18

3.2.2.2 Materiale ceramice și biosticle 20

3.2.2.3 [anonimizat] 23

CAPITOLUL 1 25

1.1 HIDROXIAPATITA 25

1.1.1 Aspecte generale 25

1.1.2 Stuctură 26

1.1.3 Metode de obținere a Hidroxiapatitei 27

1.1.3.1 Metode uscate 28

1.1.3.2 Metode umede 28

1.1.3.3 Procese la temperaturi ridicate 31

1.1.3.4 Sinteza din surse biologice 31

1.2 HIDROXIAPATITĂ DOPATĂ 32

1.2.1 Aspecte generale 32

1.2.2 Hidroxiapatită dopată cu ioni de Ga3+ 34

1.2.2 Hidroxiapatită dopată cu ioni Zn2+ 38

1.3 COLAGEN 41

1.4 OXID DE GRAFENĂ (GO) 46

CAPITOLUL 2 50

2.1 STUDIU DE CAZ TEORETIC 50

2.1.1 HAp nedopat 50

2.1.2 HAp dopat cu Zn 55

2.1.3 HAp dopată cu Ga 64

2.1.4 Caracterizarea GO 69

2.1.5 Colagen + HAp 72

2.2 STUDIU DE CAZ PRACTIC 78

2.2.1 Metode de obținere 78

2.2.2 Metode de caracterizare 81

2.2.3 Rezultate 84

2.2.4 Bilanț economic 88

CONCLUZII 90

BIBLIOGRAFIE 93

ABSTRACT

În ultimii ani necesitatea de material ce serveste ca substituent osos a devenit din ce în ce mai mare. [anonimizat] ⅩⅩⅠ. [anonimizat], fac ca necesitatea descoperiri de material pentru substituție osoasă să fie din ce în ce mai mare.

În această lucrare se dorește obținerea de materiale pentru corectarea defectelor osoase cauzate de cancer osos și osteoporoză. Materialele sunt formate din Hidroxiapatită (HAp) dopată cu ioni de Ga3+ și Zn2+, colagen (Col) și oxid de grafenă (GO). HAp s-a obținut prin metoda Hidrotermală asistată în câmp de microunde iar GO s-a [anonimizat]. Pentru a obține structura 3D finală a materialului se utilizează o tehnică de liofilizare.

Cauzele apariției defectelor osoase precum și materialele ce servesc ca înlocuitori ai țesutului osos sunt descrise pe larg în introducerea lucrării. Proprietățile materialelor componente sunt descrise în Capitolul 1 și demonstrate în Capitolul 2.

Studiul de caz practic demonstreză proprietățile materialelor nou obținute din cele 3 componente ([anonimizat]), utilizând diverse tehnici de caracterizare performante: Difracție de raze X (XRD), Spectroscopie în infraroșu cu transformată Fourier (FTIR), Spectroscopie Raman și Spectrometrie de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS). În urma analizelor s-a demonstrat obținerea de HAp cristalină și de puritate ridicată pornind de la metoda Hidrotermală asistată în câmp de microunde.

INTRODUCERE

1. ASPECTE GENERALE

Biomaterialul este o substanță (alta în afară de medicamente) sau combinație de substanțe, de origine sintetică sau naturală, care poate fi utilizată pentru o perioadă de timp, în ansamblu sau ca parte a unui sistem care tratează, mărește sau înlocuiește orice țesut, organ sau funcție a corpului [1]. Biomaterialele acționează pentru a restabili funcția, repara sau înlocui țesutul deteriorat prin integrarea cu partea problematică a corpului, pentru a crește speranța de viață. Diversele proprietăți mecanice, fizice, chimice și structurale ale biomaterialelor permit utilizarea lor în diferite aplicații, în funcție de biocompatibilitate și caracteristici [2]. Acestea au căpătat o importanță din ce în ce mai mare datorită aplicabilității variate în medicină. Cercetările privind dezvoltarea de noi biomateriale sau manipularea structurii și compoziției biomaterialelor existente s-au concentrat intens pe similitudinea dintre proprietățile biomaterialelor și a țesutului uman natural [3]. În general, biomaterialele sunt utilizate în mod obișnuit ca implanturi, materiale pentru umplerea defectelor osoase, înlocuirea țesuturilor moi și în sistemele de administrare a medicamentelor [2,4,5].

Dezvoltarea biomaterialelor pentru orice aplicație de înlocuire ar trebui să se bazeze pe înțelegerea structurii care trebuie înlocuită. Concret, cerințele privind proprietățile materialului depind în mare măsură de locul în care v-a fi implantat și de funcția pe care trebuie să o restaureze. Pentru a evalua structurile complexe ale țesuturilor proiectate de natură, este fundamentală înțelegerea fenomenelor complexe care duc la forma și structura finală (de la nivelul macro la nivelul nanostructural) prin stabilirea relațiilor de bază între mecanismele fizico-chimice și proprietățile ideale ale structurii. Cunoașterea proceselor care stau la baza formării țesutului ce urmează a fi înlocuit precum și condițiile mediului și a funcție pe care acesta o indeplinește în organismul uman este foarte importantă în proiectarea de noi biomateriale [6].

Osul ar putea fi considerat ca fiind o structură naturală compozită anisotropă cu un nivel mai ridicat al proprietăți mecanice (rigiditate, rezistență la tracțiune) decât țesuturile moi (vase de sânge, cartilaj, piele). De exemplu, în timpul activităților zilnice, oasele sunt supuse un stres de aproximativ 4 MPa, și mai important, aceste tensiuni sunt repetitive și fluctuante în funcție de activități precum statul în picioare, jogging-ul, întinderea, urcarea etc. Starea de sănătate și activitățile pacientului și pH-ul fluidelor corpului, care pot varia între 1 și 9 în diferite zone, sunt factori care contribuie la definirea biomediului în care biomaterialele trebuie să se adapteze corespunzător [6].

Țesuturi dure umane, cum ar fi: smalțul, dentina și osul sunt materiale compozite care conțin atât substanțe organice și cât și anorganice [7]. Țesutul osos conține 20% apă și 80 % reziduu uscat. Reziduu uscat este un material compozit format din sistem fribilar, format din colagen și substanță fundamentală formată din substanțe organice 35% și substanțe minerale 65% [8]. Partea anorganică este compusă în principal din hidroxiapatită biologică ce conține diferiți ioni (Mg, P, F, S, Zn etc). Faza organică este compusă în principal din colagen și o proporție mică de proteine ​​necolagene, cum ar fi fibronectina, osteopontina, osteocalcinul și sialoproteina osoasă. Flexibilitatea osului este asigurată de colagen, în timp ce rigiditatea este menținută prin adăugare de minerale în rețeaua de colagen. Dacă conținutul de minerale ar fi eliminat din os, țesutul ar fi foarte flexibil precum tendoanele și ligamentele. În schimb, dacă conținutul organic ar fi eliminat, osul ar fi un material fragil cu o rezistență la tracțiune foarte mică[7]. Apatitul biologic este componenta biominerală a țesuturilor dure și constă din HAp carbonatată nonstoichiometrică cu cristalinitate slabă și dimensiuni mici de cristalit [9].

În procesul de biomineralizare osoasă cristalele de HAp precipită pe suprafața fibrelor de colagen de tip Ⅰ. Combinația de fibre de colagen organice și cristale anorganice de HAp este suspendată într-o matrice intercelulară de proteoglicani dând osului proprietăți mecanice și fizice. Osul are o rezistență mare la tracțiune, de două ori mai mare decât cea a porțelanului și a altor ceramice, de asemenea rezistența la compresiune longitudinală este foarte mare datorita naturii cristaline a fazei minerale, osul prezintă elasticitate datorită conținutului de fibre de colagen [8].

Pe lângă asigurarea rigidității oaselor, matricea anorganică, care contribuie cu aproximativ ~ 65–70% din greutatea osului, reprezintă principalul rezervor de ioni. Aproximativ 99% din cantitatea de calciul, aproximativ 85% din cantitatea de fosfor și între 40 și 60% din cantitatea de sodiu și magneziu a organismului este depozitată în oase [9].

Fig.1 Structura ierarhică a osului uman și dispunerea cristalelor de HAp naturală de-a lungul fibrilelor de colagen ale osului uman [10].

Există doua tipuri de țesut osos: compact și spongios. Țesutul osos compact conține în interior canalul medular (cu măduvă ososă) și este format din lamele osoase dispuse concentric în jurul unor canale subțiri (sistem Havelsian). Țesutul osos spongios este format din lamele osoase diferit așezate (trabecule) ce delimitează Areolele (acestea oferă aspectul spongios). Țesutul osos are rol în hematopoeză (datorită măduvei), rol de aparat de susținere (împreună cu sistemul muscular formează aparatul locomotor), rol de protecție pentru unele organe (cutia toracică, cutia craniană) și este un depozit de săruri minerale (menține echilibrul fosfocalcic) [11].

2. CAUZE ALE APARIȚIEI DEFECTELOR OSOASE

2.1. Osteoporoza

Osteoporoza a fost definită ca o boală sistemică caracterizată prin scăderea masei osoase și deteriorarea microarhitecturală a țesutul osos, rezultând fragilitatea și susceptibilitatea crescută a oaselor la fractura [12]. Fracturile osteoporotice sunt foarte răspândite la persoanele în vârstă și sunt asociate cu calitatea vieții redusă și dizabilitate [13]. Osteopenia și osteoporoza sunt asociate cu vârsta. Există o pierdere osoasă normală legată de vârstă de aproximativ 0,5% /an după primii treizeci de ani de viață. La persoanele în vârstă (25% din persoanele cu vârstă mai mare de 60 de ani), această pierdere osoasă este accelerată și mai semnificativă afectând astfel masa și arhitectura oaselor și predispunându-le la fractură [14].

Rezultatul semnificativ din punct de vedere clinic al osteoporozei este fractura. Osteoporoza este asimptomatică până la punctul de fractură și mulți adulți nu sunt diagnosticați cu osteoporoză decât după o fractură, cu toate acestea osteoporoza poate preceda fractura ani la rând fără vre-un simptom. Marea majoritate a adulților în vârstă care suferă o fractură prezintă o pierdere a funcției locomotorii și dureri acute. Având în vedere asocierea puternică a osteoporozei cu îmbătrânirea, mulți care prezintă o fractură pot avea afecțiuni comorbide, cum ar fi demența sau afectarea senzorială. Acești pacienți pot avea dificultăți în raportarea simptomelor și, prin urmare, ar trebui să fie suspectați de osteoporoză în cazul în care există modificări de comportament nespecifice la cei care pot fi incapabili să raporteze durerea din cauza tulburărilor cognitive sau senzoriale [15].

Osteoporoza, pierderea masei osoase, poate fi cauzată de mai mulți factori. Unele cauze pot produce reducerea masei osoase direct prin modificări ale celulelor osoase sau compoziția matricei sau indirect prin creșterea producției de hormoni endogeni sau ectopici. Acești factori sunt cunoscuți sub denumirea de cauze secundare ale osteoporozei și pot fi diverse boli precum: cancer, boala hepatică colestatică, hipertiroidism cronic, boala renală cronică, sindromul cushing, hipogonadismul, boala malabsorbtivă, mielom multiplu, boala paget, artrita reumatoida, accident vascular cerebral și diabetul zaharat de tip Ⅱ sau pierderea osoasă poate apărea în urma consumului de medicamente precum: terapia cu glucocorticoizi, antiepilepticele, inhibitori de aromateza, chimioterapeutice, excesul de tiroxină sau în urma consulumui de alcool, tutun sau a unui deficit de vitamina D [13].

Pentru tratarea osteoporozei în prezent se utilizează biofosfați. Biofosfații previn pierderile osoase și reduc riscul de fracturi osoase, însă modalitățile de administrare a tratamentului cu biofosfați și respectarea cu exactitate a planului de tratare de către pacient pun probleme considerabile în utizarea lor. În consecință, având în vedere că eficiența clinică a bisfosfaților este redusă semnificativ din cauza nerespectării de către pacienți a planului de tratare, este important să se descopere și să se dezvolte noi medicamente de tratare a osteoporozei. În această încercare, Galiul ar putea fi un potențial candidat având în vedere proprietățile antirezive [12].

2.3. Cancerul osos

Tumorile osoase maligne pot apărea ca urmare a cancerului primar sau se dezvoltă din cancerele care s-au metastazat la oase. Cancerul osos primar, cum ar fi osteosarcomul și sarcomul Ewing, sunt maligne agresive care afectează aproximativ 3500 de persoane în fiecare an și apar de obicei în copilărie. Aproximativ 30% dintre pacienții cu cancer osos primar mor în termen de 5 ani ca urmare a unui răspuns slab la terapie. Metastazele osoase apar din tipurile de cancer predominante, cum ar fi cancerul de sân, prostată, plămâni și rinichi [16]. Până la 90% din pacienții cu cancer de prostată avansat prezintă metastaze osoase și 60% -70% din pacientele cu cancer de sân prezintă de asemenea afecțiuni osoase. Deși cancerul osos apare din cauza multor tipuri de cancer, inclusiv de plămâni, de rinichi și melanomuri, este rar întâlnit în majoritatea malignităților hematologice, cu excepția mielomului multiplu (MM). Printre pacienții recent dianosticați cu MM, procente de la 65% până la 70% prezintă o implicare osoasă și > 90% au o afecțiune osoasă avansată. După cum se observă în Fig. 2 osul este un țesut foarte frecvent afectat de metastază și este depășit doar de ganglionii limfatici, ficat și plămâni [17].

Fig.2 Proporția relativă de extindere a metastazelor pe diverse țesuturi [17].

Cancerele osoase primare sunt neoplasme rare, formate din celule care au suferit transformări maligne în țesutul osos. Cancerele osoase primare diagnosticate cel mai frecvent sunt osteosarcomul, condrosarcomul și sarcomul Ewing. Dintre acestea, osteosarcomul (OS) și sarcomul Ewing (EWS) apar predominant la copii și adulți tineri. Osteosarcomele apar din celulele transformate de origine mezenchimală și ca urmare, pot avea fenotipuri care seamănă cu osteoblastele, condroblastele sau fibroblastele, dar au în comun producția malignă de osteoid. În schimb, sarcomul Ewing aparține unei familii de tumori derivate din neuroectodermul primitiv care formează tumori agresive care se dezvoltă cel mai frecvent în oase, dar pot apărea și în țesutul extraosos [16].

Din păcate, odată ce cancerul se metastazează la os, marea majoritate a pacienților sunt în prezent incurabili și suferă efectele adverse ale cancerului în os. Aceste efecte includ dureri osoase severe, fracturi patologice, sindromul de compresie a măduvei spinării și nervilor și tulburări de homeostază cu calciu și fosfați, care au consecințe majore asupra supraviețuirii pacientului și calitatății vieții. Cancerul osos fiind principala cauză de durere severă pentru pacienții care suferă un stadiu avansat de cancer. De exemplu fracturile care apar frecvent la persoanele ce suferă de cancer de sân și mielom multiplu cu leziuni osteolitice cresc riscul de deces cu > 20%, respectiv 32%, comparativ cu pacienții fără fracturi [17].

Aceste efecte severe ale cancerului în os rezultă din dereglarea marcată a remodelării osoase normale, proces care este indus de celulele canceroase și are ca rezultat dezechilibre severe în formarea și resorbția osoasă. Formarea oaselor și resorbția sunt procese strâns cuplate și sunt controlate de hormoni. Dezechilibrul remodelării osoase poate duce la metastaze care sunt fie osteolitice, fie osteoblastice. Metastazele osteolitice apar atunci când remodelarea osoasă este predominant distructiv osoasă în timp ce metastazele osteoblastice rezultă când predomină formarea oasoasă. Mulți pacienți au un amestec atât metastaze osteolitice cât și metastaze osteoblastice. Metastazele osteolitice sunt cel mai frecvent tip de metastaza osoasă și are efecte majore asupra supraviețuirii și calitatății vieții pacienților [17].

Fig 3. Schema țesutului osos în prezența celulelor canceroase [16].

În figura de mai sus se evidențiază interacțiunile dintre celulă–celulă și celulă-matrice la nivelul măduvei osoase / osului lung. Osul este compus din matrice extracelulară extrem de rigidă și specializată compusă în principal din minerale și colagen de tip I. Acest țesut complex este menținut prin interacțiuni dinamice cu celule rezidente, incluzând osteoblaste, osteoclaste, celule endoteliale, celule imune și celule hematopoietice. Țesutul osos este expus continuu la stimuli mecanici, cum ar fi forfecarea și forțe de compresie, care modulează în continuare homeostazia osoasă. Cum această nișă complexă promovează evoluția cancerului rămâne slab înțeleasă [16].

2.3. Infecții cauzate de microorganisme

Complicațiile infecțioase după o operație ortopedică sunt probleme des întâlnite, care pot duce la îndepărtarea implantului / grefei cu o a doua operație. Bacteriile gram-pozitive, cum ar fi Staphylococcus aureus (S.aureus), Staphylococcus epidermidis (S.epidermidis) și speciile Streptococcus, sunt cauzele principale ale infecțiilor în domeniul ortopedic. S. aureus a fost identificat ca fiind cel mai frecvent microorganism care cauzează infecție [10]. În ultimii ani, din cauza consumului excesiv de antibiotice, bacteriile au devenit mult mai rezistente la antibiotice astfel că descoperirea unor agenți antibacterieni a devenit extrem de urgentă. Materialele antibacteriene, în special cele anorganice, au atras un deosebit interes deoarece pot elimina infecțiile cu bacterii încrucișate, au stabilitate chimică bună, eficiență îndelungată și siguranță ridicată pentru organismul uman. Mulți ioni metalici au proprietăți antibacteriene precum Ag+, Cu2+, Ga3+, Zn2+ etc.[18].

Biofilmele microbiene sunt structuri complexe alcătuite dintr-un ansamblu de celule microbiene, care se formează prin aderarea ireversibilă la suprafața unui biomaterial a microorganismelor, implantat în organismul uman. Acesta este închis într-o matrice de polizaharidă care îl protejează de antibiotice și anticorpi. Avantajul utilizării nanoparticulelor metalice antibacteriene în comparație cu substanțele antibiotice este că acesta are o toxicitatea redusă asupra celulelor umane și că acestea pot elimina problema bacteriilor și microorganismelor rezistente la antibiotice [19].

3. REPARAREA DEFECTELOR OSOASE

Repararea defectelor osoase este una dintre cele mai frecvente proceduri de regenerare cu peste 2 milioane de grefe osoase efectuate anual în întreaga lume. Cauzele majore ale unor defecte osoase mari sunt traumele, anomaliile congenitale, rezecția țesuturilor din cauza cancerului sau resorbția osoasă din cauza metastazei osoase sau osteoporozei. Deși osul are un proces de reparație excelent, capacitatea sa de a reface defectele osoase semnificative rămâne limitată [20].

Vindecarea fracturilor osoase este un proces fiziologic complex care implică evenimente în cascadă, incluzând interacțiunea diferiților factori celulari și biomecanici. Aproximativ 5% -10% din fracturile osoase nu se vindecă normal, astfel că se întâlnește destul de frecvent alinierea fracturilor incorect. Există două modele de vindecare a fracturilor osoase în mod natural, vindecarea primară și vindecarea secundară. În primele ore după fractură în jurul acesteia apare inflamația acută. Mai multe tipuri de celule (cu specific imunitar) apar în zona imflamată și eliberează diverși factori biologici. Celule osteoprogenitoare și celulele stem mezenchimale aderă și se diferențiază (condrocite și osteoblaste) adiacent liniei fracturate formând calusul cartilaginos. În același timp, în zona subperiostală se formează un calus dur prin osificare intramembranoasă. Apoi, condrocitele devin hipertrofice, eliberează calciu și suferă de apoptoză și apare osificarea endocondrală. Monocitele se diferențiază în celule asemănătoare osteoclastului, care resorb cartilajul calcificat, iar celulele mezenchimale se diferențiază în osteoblaste, care umplu lacuna de resorbție cu os nou. Aceste procese conduc la formarea oaselor cu o structură trabeculară. În acest proces, calusul cartilaginos este preluat de un calus dur. În urma acestor procese, remodelarea osoasă începe cu activități coordonate de osteoblast și osteoclast pe o perioadă de câteva luni în care calusul fracturii este remodelat spre osul lamelar [21].

3.1. Remodelare osoasă

Remodelarea osoasă este esențială pentru menținerea homeostaziei calciului. Conceptul de resorbție osoasă și formarea concomitent de țesut osos nou a fost dezvoltată în 1970. Resorbția osoasă are loc în principiu pentru a remodela structura osoasă. Această structură este necesară pentru îndeplinirea funcției mecanice și pentru eliberarea calciul în organism. Pentru a menține echilibrul formării și resorbției osoase (homeostazie), resorbția osoasă intiază formarea de țesut nou, iar cantitatea de os nou formată restabilește cantitatea de os îndepărtată prin resorbție. Studii cinetice care utilizează radiocontractoare pe bază de calciu sau stronțiu cu scopul de a estima ratele de formare și resorbție osoasă la animale sau oameni în condiții normale sau patologice au arătat că dacă resorbția osoasă crește în condiții fiziologice sau condiții patologice, formarea de țesut osos nou crește și ea.

O serie de descoperiri de la sfârșitul anilor 90 au dezvăluit multe despre căile de semnalizare moleculară care influențează aceste procese, inclusiv diferențierea și funcția osteoblastului și controlul formării și activității osteoclastului. Deocamdată nu se știe ce controlează amploarea resorbției osoase și gradul de formare a țesutului osos nou și mai ales cum cele două sunt determinate să fie egale [22].

Ciclul de remodelare osoasă, începe în viața fetală timpurie, depinde de interacțiunea dintre 2 linii celulare, osteoblaste și osteoclaste. Celulele osteoblaste contribuie la creșterea oaselor și au origine mezenchimală. Celulele mezenchimale sunt celule stem care se pot diferenția într-o varietate de tipuri de celule, cum ar fi osteoblaste, condrocite, miocite și adipocite. Celulele osteoclaste provoacă resorbția osoasă și provin dintr-o linie hematopoietică, care include o varietate de tipuri de celule din sânge și măduva osoasă. Procesul celular de remodelare începe atunci când celulele precursoare ale osteoblastului și osteoclastului fuzionează pentru a forma o celulă multinucleată, osteoclastică.

Osteoclastul multinucleat rezultat se atașează la suprafața osoasă și începe resorbția. Aceste celule folosesc o combinație de enzime lizozomale și ioni de hidrogen pentru a descompune matricea osoasă. Această matrice osoasă este alcătuită dintr-o porțiune anorganică de cristale de fosfat de calciu (hidroxiapatită) și o porțiune organică formată din colagen, proteoglicani și glicoproteine [23]. Osteoclastele descompun matricea osoasă prin activarea mai multor factori care eliberează calciul și fosfatul din hidroxiapatita naturală. Printre acești factori, cathepsina K este o protează care catabolizează elastina, colagenul și gelatina cu capacitatea de a descompune osul și cartilajul. Numărul sau activitatea ridicată a osteoclastului va crește resorbția osoasă, încălcând astfel echilibrul dintre resorbție și formare și inducerea osteopeniei / osteoporozei [14]. Procesul de resorbție lasă regiuni „scoase” din matricea osoasă ( Lagune Howship ) [23].

Un proces invers, de umplere a Lagunelor Howship este realizat de celulele mononucleare din linia de macrofage, care continuă să se degradeze și să depună materiale organice în timp ce eliberează factori de creștere pentru a iniția faza de depunere osoasă. Precursorii mezenchimali diferențiați (osteoblaste) umplu Lacunele Howship prin depunerea de noi matrici de colagen și minerale [23]. Osteoblastele, (celule de origine mezenchimală) au capacitate puternică de a produce matrice nemineralizată, facilitând totodată mineralizarea acesteia. După finalizarea activității lor de formare a osului, osteoblastele își pot păstra capacitatea de formare osoasă, se pot diferenția în osteocite și se pot îngloba în matrice sau pot muri prin apoptoză. Predominanța uneia dintre aceste căi celulare potențiale va determina formarea osoasă normală sau cu modificări [14].

Osteocitele sunt celulele cele mai abundente din matricea osoasă, care se află în spații mici din cadrul matricei osoase mineralizate numite lacune. După înglobarea în matrice, osteoblastele își schimbă fenotipul și devin celule „asemănătoare neuronului” care își trimit procesele dendritice (cuprinse între 40 și 100 pe celulă) prin canaliculi pentru a dezvolta rețele extrem de interconectate, care sunt utilizate pentru schimbul de nutrienți și deșeuri prin joncțiuni la distanță. Până de curând, osteocitele erau considerate jucători pasivi în procesul de formare osoasă, însă cercetările recente [24–26] au demonstrat că osteocitele sunt regulatori majori ai acestui proces prin secreția de factori pro-osteoclastogeni, cum ar fi activatorul receptor al factorului nuclear kappa-nuclear ligand (RANKL) și important regulatori ai osteoblastogenezei cum ar fi sclerostina (inhibitor) sau Dickkopf WNT Signging Pathway Inhibitor 1 (stimulator) [13]. Osteocitele sunt mecanico-senzori importanți. Ca atare, la osteocite răspund forțe mecanice prin scăderea secreției de sclerostină și creșterea Dkk1, ceea ce induce formarea oaselor. Odată cu îmbătrânirea, numărul osteocitelor scade. În plus, datorită altor factori precum sedentarismul, scăderea nivelului factorilor de creștere anabolizanți sau menopauză, osteocitele produc cantități mai mari de sclerostină, având astfel un impact negativ asupra formării oaselor. Datorită acestor modificări legate de vârstă, osteocitele secretă nivele mai mari de RANKL, ceea ce crește resorbția osoasă [27].

Dovada formării osoase este indicată de prezența fosfatazei alcaline (ALP), a fosfatazei alcaline osoase (B-ALP), a osteocalcinei (OC) și a propeptidei C și N-terminale de tip procollagen (PICP și PINP). ALP este specific pentru formarea oaselor, dar numai dacă pacientul prezintă afecțiuni hepatice. B-ALP este un produs specific celulelelor osteoblastice. OC este un alt produs specific pentru osteoblast și pot exista mai multe tipuri active. PICP și PINP sunt produse ale fibroblastelor și osteoblastelor care proliferează [23].

Markerii de resorbție osoasă include hidroxiprolina (OHP), piridinolina (PYD), deoxipiridinolina (DPD), sialoproteină osoasă (BSP) și fosfatază acidă rezistentă la tartrat (TR-ACP). OHP este o parte majoră a colagenului proteic și joacă un rol în stabilitatea colagenului. PYD are concentrații mari în colagenul osos și cel al cartilajului osos, dar nu este prezent în colagenul din piele. Spre deosebire de PYD, DPD este foarte concentrat în colagenul osos, dar este absent în cartilaj și piele. BSP este făcută de osteoblaste și este prezentă în matricea osoasă extracelulară [23].

Fig.4 Ciclul de remodelare osoasă. Remodelarea osoasă . Activarea osteoclastelor este controlată prin calea RANK / RANKL / OPG [8].

3.2. Grefe osoase

În mod tradițional, tratamentele osoase s-au bazat pe utilizarea grefelor osoase, în special grefe autologe,alogene,xenogene și aloplastice, sau pe înlocuirea cu proteze folosind sisteme de materiale metalice, ceramice, și polimerice [20].

3.2.1. Grefe osoase autogene, alogene și xenogene

În ciuda numeroaselor progrese în medicină, standardul de aur pentru tratamentul acestor defecte osoase este încă transplantul de osos autolog. Aceasta presupune recoltarea osului dintr-o altă zonă anatomică la pacient pentru a fi utilizat ca material de transplant la locul defectelor. Grefa osoasă de origine autogenă are ca dezavantaj cantitatea limitată de material precum și stress chirurgical suplimentar, cea ce nu reprezintă situația ideală pentru pacient [20]. Avantajele autogrefei osoase sunt: biocompatibilitatea crescută, induce osteogeneza, nu prezintă probleme de imunogenicitate și trasmitere de boli. Grefa osoasă de tip alogrefă presupune prelevarea de material osos de la alt pacient din aceeași specie. Materialului osos prelevat ii se aplică tratamente de uscare, deshidratare și refrigerare în vederea diminuării sau eliminării riscului de trasmitere de boli și a problemelor de imunogenicitate. Dezavantajul alogrefelor constă în lipsa de celule osteoformatoare și a factorilor de creștere. Grefele osoase xenogene presupun transplantul de grefă osoasă prelevat de la animale (os bovin). Aceste sunt preparate din os animal devitalizat, deproteinizat și sterilizat. În aceasta categorie intră și membranele de colagen resorbabile. Matricea osoasa anorganică menține structura osoasă dar nu are și proprietăți osteogenice. Osul de origine bovină este frecvent folosit, acestuia i se îndepartează în totalitate componenta organica ceea ce reduce riscul de reject imunologic [28].

Tehnicile de înlocuire osoasă sau repararea anumitor defecte osoase reprezintă un interes de peste 500 de ani. În anul 1505 d.Hr chirurgul Ibrahim Bin Abdullah menționează pentru prima dată tehnica folosirii oaselor craniene de capră sau câine pentru a vindeca un defect osos cranian uman (cranioplastie). Se crede că este prima descriere detaliată a procedurii cranioplastiei. Astăzi, cele trei abordări de grefă osoasă de tip autolog (de la pacient), alogen (de la un alt donator uman) și xenogen (transplantul de grefă osoasă derivat de la animale) nu ar părea atât de diferite de abordarea descrisă în cartea sa [20].

3.2.2. Materiale aloplastice

Materiale aloplastice sunt cunoscute ca fiind materialele sintetice, utilizîndu-se metale, materiale ceramice, polimeri sau alte materiale compozite [6].

Proiectarea structurală avansată pentru restaurarea țesutului osos necesită materiale cu combinații complexe de proprietăți mecanice. Rigiditatea adaptată, rezistența ridicată la coroziune, rezistența la impact, abraziunea și chimismul suprafeței reprezintă o combinație de proprietăți care influențează biocompatibilitatea și adeziunea celulelor. Un alt aspect important este durata de viată a implantului sau a biomaterialului [6].

Stucturi tridimensionale de tip schelă necesită proprietăți multifuncționale pentru a oferi un substrat adecvat pentru atașarea celulelor, migrație, proliferare și diferențiere. Mai mult, proprietățile biomecanice programate trebuie să fie satisfăcute, deoarece funcția portantă trebuie transferată de la materialul proiectat la matricea extracelulară în creștere. În acest scop, sunt luate în considerare materiale degradabile și parțial degradabile [6].

3.2.2.1 Materialele metalice

Cererea de compatibilitate mecanică cu țesutul dur duce istoric la considerarea metalelor și a ceramicii mai potrivite decât polimerii pentru aceste tipuri de aplicații. Cu toate acestea, această abordare nu este complet acceptabilă în multe cazuri, din cauza nepotrivirilor cu proprietățile țesuturilor mineralizate naturale. Mai precis, metalele sunt preferate pentru rezistență ridicată, ductilitate și rezistență la uzură, dar pot oferi probleme în ceea ce privește biocompatibilitatea scăzută, coroziunea, rigiditatea prea mare în comparație cu țesutul natural, densități mari și eliberarea de ioni metalici cu posibile reacții alergice ale țesuturilor [6].

Metale precum oțelul inoxidabil, titanul și aliajele Co / Cr au fost utilizate în mod obișnuit pentru fixarea fracturilor și pentru artroplastii osoase. Deși oferă rezistența și rigiditatea potrivite pentru a alinia și controla mișcarea oaselor în timpul vindecării, acestea sunt mult mai rigide decât osul natural. Ca urmare a diferenței mari de rigiditate între os și metale poate apărea un efect de protecție la stres, determinând atrofia osoasă pe termen lung. În consecință, osul protejat împotriva stresului nu se vindecă complet și este susceptibil la o fractură nouă. Mai mult decât atât, compoziția chimică metalică poate provoca reacții adverse (răspunsuri alogene cu efecte negative asupra mineralizării osoase și răspunsuri sistemice adverse ca formare de tumorii locale) prin eliberarea de ioni metalici, datorată coroziunii necontrolate, ca efect a diferenței de potențial electric [6]. Metalele sunt folosite în diverse forme pentru a fixa osul fracturat, cele mai utilizate fiind: cuie, ace, șuruburi, plăci, tije, etc. Cel mai mare dezavantaj al acestor materiale este că acestea vor rămâne în corpul uman dacă nu este necesară îndepărtarea lor printr-o intervenție chirurgicală ulterioară, producând o serie de efecte adverse precum inflamații și alergii datorită coroziunii și uzuri acestor materiale [21].

Există două tipuri de aliaje CoCr utilizate pe scară largă în fabricațiile de implanturi precum genunchiul și șoldul. Primul aliaj CoCrMo este cunoscut sub numele de „Vitallium”, este un aliaj turnat, descoperit de Venable și Stucke în 1936.  Acest aliaj a fost folosit mai multe decenii și în stomatologie.

Al doilea aliaj CoCrWNi este prelucrat prin forjare la cald (aliaje forjate) și conține wolfram și un conținut mai mare de nichel. Aliajele turnate conțin până la 0,5%(procent gravimetric) carbon pentru a îmbunătăți casabilitatea prin scăderea temperaturii de topire la ~ 1350șC. Cromul îmbunătățește rezistența la coroziune, precum și rezistența aliajului. Se adaugă molibdenul pentru a produce particule mai fine, ceea ce duce la rezistențe mai mari atât pentru componentele turnate cât și pentru cele forjate [21].

Titanul este utilizat în implatologie ca titan pur comercial (CP Ti) sau aliaj Ti–6Al–4V și Ti–6Al–7Nb. Titanul și aliajele sale îndeplinesc criteriile cheie necesare pentru proiectarea implanturilor ortopedice, inclusiv rezistență la coroziune superioară, biocompatibilitate și rezistență mecanică. Se utilizează foarte des în implantologia dentară și artroplastii osoase, deoarece este bio-inert. Pentru a spori performanțele clinice sunt necesare procese de optimizare semnificativă a geometriei și modificarea suprafeței [29].

Un nou aliaj pe bază de Zirconiu și Niobiu este folosit pentru fabricarea componentelor metalice ale protezei de genunchi, cunoscut sub denumirea comercială OXINIUM. Acesta conține 97,5% Zr și 2,5% Nb. Cel mai mare avantaj al acestui aliaj constă în faptul că nu necesită modificarea suprafeței prin acoperirea cu fosfați pentru a favoriza osteointegrarea ci printr-un tratament termic suprafața acestuia se transformă în ceramică zirconică. Acest aliaj combină proprietățile mecanice excelente ale metalului cu proprietățile care favorizează osteointegrarea ale oxidului de zirconiu. În comparație cu aliajul CoCr, OXINIUM are un coeficient de frecare mult mai mic, rezistență la oboseală și duritate mai mare [30].

Implanturile osoase trebuie să respecte o serie de proprietăți precum caracteristicile fizico-chimice ale implanturilor, inclusiv proprietățile mecanice, topologia suprafeței cât mai asemănătoare cu ale oaselor naturale pe care le substituie, pentru a favoriza osteointegrarea [29].

Forma implanturilor metalice sau componentelor de fixare se poate realiza prin metode convenționale sau neconvenționale: turnare, forjare la cald sau rece, extrudare, presare izostatică la cald ( HIP ), frezare proiectare asistată de computer, fabricare asistată de computer (CAD / CAM) etc. [31].

3.2.2.2 Materiale ceramice și biosticle

Materiale bioactive și bioresorbabile

Materialele bioactive sunt materiale care realizează interacțiuni fizico-chimice cu țesutul viu (țesut osos) în vederea favorizării biointegrării biomaterialului cu țesutul (osteointegrare). Aceste interacțiuni pot fi de tipul: schimb ionic între materialul bioactiv și lichidele fiziologice rezultând în timp un strat biologic activ care este chimic și cristalografic echivalent cu structura osoasă [32].

Materialele biodegradabile (sau bioresorbabile): sunt materiale care pot fi ușor absorbite de organism și înlocuite treptat de țesuturile adiacente (țesutul osos) în urma unui proces de dizolvare / resorbție [32].

Deoarece grefele osoase au unele dezavantaje, inclusiv morbiditatea locului de unde se rezectează osul donatorului, disponibilitatea limitată și volumul osos mic la autografe, transmiterea bolilor și răspunsul imun la alogrefă, s-au luat în considerare diverse biomateriale pentru a înlocui grefele osoase naturale. Un scaffold ideal ar trebui să aibă o structură poroasă interconectată, biodegradabilitate controlată, proprietăți mecanice similare cu osul, biocompatibilitate, dimensiunea porilor adecvată pentru a permite creșterea și înmulțirea celulelor și transportul substanțelor nutritive. Porozitatea schelei este importantă pentru aderența celulară, creșterea, revascularizarea, alimentația adecvată și alți factori care pot influența creșterea celulară și a țesuturilor [33]. Însă gradul de porozitate și dimensiunea porilor mai mare duce la scăderea proprietăților mecanice. Numeroase materiale ceramice inclusiv hidroxiapatită, tri fosfat de calciu, silicat de calciu etc. precum și biosticle sunt utilizate pentru a crea structuri 3D care să favorizeze regenerarea osoasă [34].

Fosfatul de tricalciu (TCP) face parte din categoria materialelor bioresorbabile și este utilizat pe scară largă în ingineria țesuturilor osoase datorită structurii și compoziției chimice similare cu a conținutului de minerale din osul natural. TCP prezintă caracteristici precum osteoconductie, osteointegrare (la contactul cu suprafața osului natural), osteoinducție, favorizează creșterea țesutului vascular. TCP poate fi găsit cu diferite structuri cristaline β și α –TCP. Faza β-TCP este cea mai populară datorită temperaturii de formare mai scăzute, proprietăților structurale, mecanice și biologice. Faza α-TCP este mai puțin densă, mai fragilă și necesită o temperatură mai mare de formare [34].

Fosfatul dicalcic (DCP) este mult mai puțin utilizat în ingineria țesutului osos din cauza proprietăților mecanice slabe și fragile și a ratei mari de resorbție in vivo [35].

Ceramica pe bază de silicați de calciu (CaSi) a fost, de asemenea, studiată în ultimele decenii, datorită biocompatibilității superioare și proprietăților mecanice mai bune în comparație cu HAp, precum și a bioactivității excelente și a ratei de degradare mai rapidă în comparație cu materialele pe bază de fosfați. Degradarea structurilor de silicat de calciu eliberează ioni de Si și ioni și Ca care s-au dovedit a stimula proliferarea celulelor osteoblastice [35].

Biosticla este un compus chimic care face parte dintr-o familie compozițională recunoscută pentru proprietățile sale excelente precum bioactivitate și o capacitate mai mare de a dezvolta o legătură puternică cu țesutul osos și de a se lega cu osul natural mai repede decât alte ceramice bioactive. Pe lângă aceste proprietăți, biosticlele, prezintă și proprietăți antimicrobiene și antiinflamatorii. Această clasă de biomateriale este bazată pe un amestec cu cristalinitate redusă de oxizi (SiO2-Na2O-K2O-CaO-MgO-P2O5). Prima biosticlă apărută este cunoscută sub numele de ,,BIOGLASS 45S5” și a fost brevetată în anul 1968 de către Larry Hench. În funcție de procentul de SiO2 aceste biomateriale pot fi bioinerte, bioactive sau bioresorbabile [36].

Materiale inerte

Materialele bioinerte (sau inerte chimic) sunt materiale care nu interacționează cu țesutul viu când sunt puse în contact direct cu osul, deasemenea acestea nu provoacă răspuns negativ sau provoacă un răspuns minim din partea gazdei [32].

Cele mai utilizate ceramici inerte din punct de vedere chimic, în aplicații ortopedice sunt Zircona și Alumina. Ceramica pe bază de Alumină (Al2O3) apare în mod natural sub formă de bauxită, safire și rubine. Este utilizată în aplicații ortopedice precum proteze de șold și în implanturile dentare datorită rezistenței sale excelente la coroziune, compatibilitate bună, rezistență la uzură, și rezistență mare la tracțiune. Ceramica stabilizată pe bază de Zirconă este mai puțin fragilă decât Al2O3. Zirconia (ZrO2) este folosită deasemenea în protezele totale de șold și în medicină dentară. Avantajele zirconiei sunt reprezentate de modulul de elasticitate scăzut și rezistența ridicată la uzură precum și de afinitatea ridicată pentru țesutul osos, proprietățile noncarcinogene și absența unui efect oncogen. Cel mai mare dezavantaj al acestei ceramicii constă în îmbătrânirea acesteia în prezeța unui mediu apos, care promovează transformarea fazei tetragonale în faza monoclinică și, în cele din urmă, duce la ruperea și fisurarea suprafeței [37]. Pentru a evita această transformare zircona poate fi stabilizată cu diverși oxizi precum: oxid de ytriu, oxid de calciu, oxid de magneziu etc. [38].

3.2.2.3 Materiale Compozite de tip ceramică – biopolimer

Deoarece știința și tehnologia materialelor reprezintă astăzi, singura modalitate posibilă de a satisface nevoile multifuncționale convingătoare și de a extinde combinațiile de proprietăți ale materialelor se bazează pe dezvoltarea materialelor compozite [39].

Biomaterialele compozite sunt o clasă relativ nouă de materiale care presupun existența a 2 componente: un material biopolimeric și biodegradabil și a unei ceramici bioactive și ușor resorbabile, de preferat cu particule de dimensiuni nanometrice. Biopolimerii se împart în două categorii: biopolimeri naturali, preum chitosanul (CS), colagenul (Col), celuloza, fibroina de mătase (SF), alginatul și fucoidanul și polimeri sintetici, precum policaprolactona (PCL), acid poli (lactic-co-glicolic) (PLGA), polietilenglicol (PEG), poli (acid lactic) (PLA) și poliuretan (PU) [39].

Deoarece osul natural este un biocompozit, o atenție considerabilă s-a concentrat pe producerea de materiale compozite pentru regenerarea țesutului osos. Materiale compozite bazate pe biopolimerii naturali și fosfații de calciu sunt utilizați pe scară largă pentru înlocuirea oaselor deoarece compoziția lor imită matricea extracelulară (ECM), acestea sunt bioabsorbabile, biocompatibile, biodegradabile și capabile să adsoarbă molecule bioactive [40]. Deși polimerii naturali prezintă proprietăți biologice excelente [41] aceștia prezintă mai multe dezavantaje privind proprietățile mecanice slabe [42], reproductibilitate scăzută în funcție de sursa naturală, solubilitate în apă sau hidrofilicitate ridicată (umflare) [43], procesabilitate slabă, posibilă denaturare în timpul prelucrării, imunogenitate [44] și, în unele cazuri, potențial risc de transmitere a agenților patogeni de origine animală. Ceramicile precum HAp sau alti fosfați de calciu în ciuda osteoconductivității excelente sunt foarte fragile și greu de procesat pentru a obține structuri foarte poroase. Combinația dintre biopolimer –ceramică prezintă avantajele ambelor componente și în plus sunt îmbunătățite și proprietățile mecanice [40]. De exemplu colagenul este moale și ductil iar cristalele de apatit sunt rigide și fragile. În compozit fibrilele de colagen cu diametrul de aproximativ 100 nm sunt întărite de cristale de apatit iar proprietățile elastice ale colagenului reduc fragilitatea hidroxiapatitei, astfel că materialul compozit are proprietăți mecanice superioare materialelor componente [6].

Materialele compozite sunt similare cu țesutul osos natural datorită matricei polimerice biocompatibile și biodegradabile cu pori deschiși și interconectați. În acest caz, matricele polimerice trebuie să posede proprietăți multifuncționale pentru a oferi un aspect al suprafeței adecvat pentru atașarea, migrării, proliferării și diferențierii celulelor. Mai mult, materialele compozite trebuie să prezinte proprietăți biomecanice adecvate pentru a garanta transferul optim al funcției portante din materialul proiectat în matricea extracelulară aflată în creștere. Acestea pot fi proiectate pentru a satisface cerințele de rigiditate și rezistență pentru înlocuirea țesutului dur. Mai mult, ele pot reprezenta, de asemenea, o modalitate interesantă de a satisface nevoile multifuncționale convingătoare cerute pentru rezultatele biologice specifice. În acest scop, în ultimele două decenii au fost proiectate diferite compozite degradabile și parțial degradabile, folosind diferite tehnici de fabricație [6].

CAPITOLUL 1

1.1 HIDROXIAPATITA

1.1.1 Aspecte generale

Hidroxiapatita (HAp) este un fosfat de calciu cu formula chimică Ca10(PO4)6(OH)2, este un mineral important în compoziția oaselor și a dinților. HAp este des folosită în ultimele două decenii în aplicații ortopedice datorită proprietăților sale unice, cum ar fi excelentă biocompatibilitate și bioactivitate [45]. HAp este un compus anorganic important, cu capacitatea de a stimula osteoconductia (permite atașarea și promovează creșterea celulelor osoase) și osteoinductia (stimulează activ formarea de noi celule osoase) [35]. În contact cu organismul uman, nu produce reacții inflamatorii și este bioactiv [46]. De asemenea, aceasta este termodinamic stabilă în starea sa cristalină în fluidul corpului și are o compoziție foarte similară cu godeul mineral al osului natural și se poate integra cu acesta fără a provoca toxicitate locală sau sistemică, inflamație sau răspunsul corpului străin [47]. În oasele umane HAp naturală se găsește sub formă de particule (morfologie de tijă) cu lățimea și lungimea de ordinul nanometrilor [48].

Zhou și colaboratorii [49] au raportat rezultatele clinice ale HAp. Autorii au remarcat integrarea de către osul natural a HAp sintetic și favorizarea formării de os nou. Dimensiunea particulelor de hidroxiapatită fiind foarte importantă, observandu-se că particulele de ordin nano pot influența mai mult formarea de os nou în comparație cu cele de ordin micrometric. Nanoparticulele de HAp pot promova adeziunea osteoblastelor, proliferarea și sinteza de fosfatază alcalină, astfel că poate favoriza refacerea defectului osos într-un timp mult mai scurt [48].

Proprietățile fizice ale HAp depind de metoda de sinteză. Forma sintetică prezintă un grad de cristalinitate mai mic,având o suprafață specifică mare în comparație cu HAp natural. De altfel, în cazul HAp sintetice, se pot obține valori ridicate ale gradului de porozitate [47]. Proprietățile mecanice ale HAp sunt foarte scăzute, ceramica este în general casantă, acesta fiind principalul dezavantaj. Pentru a îmbunătății aceste proprietăți se poate utiliza HAp în combinație cu un polimer sau un amestec de polimeri (colagen, chitosan, alginat etc.). În urma acestui amestec rezultă un compozit care combină rezistența la compresiune și duritatea ceramicii și elasticitatea polimerilor ce se poate utilizeaza în aplicațiile ortopedice sub formă de granule, material poros sau dens și pentru a acoperi suprafața care se află în contact cu osul a implantelor [46].

1.1.2 Stuctură

În anul 1926 Jong și colaboratorii [50] constată formula chimică a Hidroxiapatitei (Ca10 (PO4)6(OH)2 și confirmând astfel componenta minerală a osului ca fiind o formă de Hidroxiapatită [47]. Kay și colaboratorii [51] precum și Posner și colaboratorii [52], în anii 1950-1960, cu ajutorul radiației X și a difracției de neutroni a fost determinată structura cristalografică a Hidroxiapatitei. Aceasta are un conținut de 55,82% CaO, 42,39% P2O5, 1,79% grupări OH și raport atomic Ca/P =1,67. Deși HAp are o compoziție stoechiometrică, structura și rețeaua cristalului asemănătoare cu substanța anorganică din osul natural [37], îi lipsește mulți alți ioni care sunt prezenți și în osul nativ, dar poate fi substituită cu ioni pentru a reda îndeaproape compoziția chimică a osului [53]. Fiecare substituție afectează parametrii celulei elementare a Hidroxiapatitei, care la rândul său afectează cristalinitatea, stabilitatea termică, stabilitate structurală, micromorfologie, alte proprietăți fizico-chimice și proprietăți biologice. Totuși aceasta rămâne cea mai stabilă fază dintre toți fosfații de calciu având o densitate de 3,156 g/cm3, un punct de topire de 1650 °C, un indice de refracție de la 1,64 până la 1,65, o duritate de nivel 5 pe scara Mohs și o constantă de solubilitate în apă de 58,65 la 37 °C [48].

S-a constatat că, de regulă, HAp are o structură hexagonală cu parametrii de rețea a=9,432 Å, b=6,881 Å și c=6,881 Å, ce se încadrează în grupul spațial P63/m. Doar în unele excepții structura HAp este monoclinică [37]. Structura hexagonală este formată din aranjamentul tetraedic al grupărilor fosfat (scheletul celulei unitate), doi dintre atomii de Oxigen sunt aliniați cu axa c iar ceilalți doi sunt în plan orizontal. Conține două situsuri de cationi pentru ionii de Ca (situsul Ca(ɪ) și Ca(ɪɪ)) și un singur situs pentru(PO4)3, ionii OH- sunt poziționați la colțurile celulei unitate în axe paralele cu axa c. Atomii de Ca (ɪ) sunt coordonați de nouă atomi de oxigen situați în șase tetraedri fosfat diferiți, în timp ce atomii de Ca (ɪɪ) au o coordonare neregulată de șapte ori cu șase atomi de oxigen a cinci grupe fosfat în plus față de ionii hidroxil [11]. Posturile vacante de-a lungul axei c trebuie să fie, de asemenea, menționate, deoarece există diferențe dependente de direcție în mobilitatea ionilor OH și, de asemenea, cu ioni Ca2+(ɪɪ) asociați acestora. Acestea sunt foarte importante deoarece pot juca un rol în transformarea structurală a fosfatului de calciu amorf în HAp cristalină și la deshidroxilarea HAp în Oxitohidroxiapatită [54].

Fig.1.1 Structura cristalului de Hidroxiapatită de-a lungul axei c [54].

1.1.3 Metode de obținere a Hidroxiapatitei

Deși s-au dezvoltat multe metode de sinteză, prepararea HAp cu caracteristici specifice rămâne încă dificilă din cauza posibilității formării de produse intermediare toxice sau nedorite în timpul sintezei HAp. Prin urmare, studiile asupra noilor parametri de sinteză HAp sunt încă în curs de desfășurare. HAp poate fi sintetizat chimic (HAp sintetic) sau extrasă din surse naturale (HAp natural ). Sadat-Shojai și colaboratorii [55] au ajuns la concluzia că HAp sintetic poate fi fabricată prin diferite metode, metode uscate (în stare solidă și mecanicochimică), metode umede (precipitații chimice, hidroliză, sol-gel, hidrotermale, emulsie și sonochimice) și procedee la temperaturi ridicate (ardere și piroliză). Comparativ cu HAp sintetic, HAp natural este non-stoichiometric, deoarece conține oligoelemente precum Na+, Zn2+, Mg2+, K+, Si2+, Ba2+, F și CO32- care o fac similară cu compoziția chimică a osului uman [2].

1.1.3.1 Metode uscate

Nu necesită solvenți, nu necesită condiții de sinteză controlate precis deoarece caracteristicile pulberii de HAp nu depind de parametrii de sinteză [56].

Reacția în fază solidă este o procedură relativ simplă cu cost scăzut, folosită pentru producerea de pulbere de HAp în masă. Precursorii de calciu si fosfat sunt măcinați, amestecați și apoi calcinați la temperatură înaltă (exemplu 1000°C). Se obțin dimensiuni ale particulelor de ordinul micrometrillor cu morfologie neregulată, stoechiometria raportului Ca/P este variabilă, pulberea de HAp poate prezenta eterogenicitate datorită coeficienților de difuzie mici în fază solidă, se obține o pulbere de HAp cristalină datorită temperaturii înalte de calcinare [56].

Metoda mecano-chimică este o metodă simplă cu costuri mici, materialele sunt macinate cu ajutorul unei mori planetare, se menține raportul stoechiometric între reactivi.Variabilele de care depind caracteristicile HAp sunt tipul de reactivi, mediul și timpul de macinare, tipul și diametrul bilelor de măcinare, raportul de masă pulbere-bilă și viteza de rotație [48]. Se obține pulbere de HAp foarte cristalină însă de puritate scăzută [56] și particule heretogene cu o structură bine definită [48].

1.1.3.2 Metode umede

Avantajul acestor metode constă în faptul că se poate controla morfologia și dimensiunea particulelor în funcție de condițiile de sinteză. Unul dintre dezavantajele potențial principal este temperatura scăzută de preparare în comparație cu metodele uscate, ceea ce duce la generarea de faze CaP, altele decât HAp (α-Tricalcium phosphate (α-TCP), β-Tricalcium phosphate (β-TCP) etc.) și / sau la scăderea gradului de cristalinitate a pulberii rezultate. În plus, diverși ioni din soluția apoasă pot fi încorporați în structura cristalului, ceea ce duce la o pulbere de HAp cu impurități [56].

Reacția de Coprecipitare este cea mai simplă cale de sinteză umedă de nanoparticule de HAp. Se realizează la temperatura camerei [56], presupune precipitarea a doi sau mai mulți compuși simultan într-un solvent, implică nuclearea (începutul formării particulelor), creșterea și aglomerarea particulelor, această metodă fiind un rezultat al suprasaturării [47]. Exemplu de flux de obținere a HAp prin medota coprecipitării: se solubilizează precursorii de calciu și fosfat separat, prin picurare solutia de fosfat se adaugă peste cea de calciu menținându-se un pH bazic. Urmează etapa de maturare la temperatura camerei. Impuritățile se elimină în etapa de spălare și calcinare [56]. Dimensiunea, morfologia și suprafața specifică a particulelor depinde de condițiile de sinteză (temperatura de reacție, PH, dimensiunea și viteza de picurare etc.). Se păstrează raportul Ca/P =1,67 și se poate controla dimensiunea particulelor [46].

Reacția de Hidroliză se utilizează atunci când dorim să trasformăm un fosfat de calciu deja pregătit sau comercial (DCPA, fosfat de calciu dibasic deshidratat (DCPD), TCP ) în HAp. Transformările de fază depind puternic de valoarea PH-ului, temperatura și prezența altor ioni în afară de excesul de calciu și fosfat. Dimensiunea și morfologia particulelor este variabilă [56].

Metoda Sol-Gel presupune o primă etapă de hidrolizare în care un reactant sau un amestec de reactanți (de regulă alcoxizi) sunt hidrolizați, trecând într-o stare de soluție și o a doua etapă presupune formarea rețelelor 3D ( prin policondensare sau poliesterificare ). Etapa ulterioară a acestui proces implică maturarea gelului (solidificare), urmată de uscare și deshidratare (temperatură > 800°C) [47] și în final, eliminarea reziduurilor organice din gelul uscat rezultat folosind un tratament termic (calcinare) [56]. Avantajul acestei metode este faptul că se obține o pulbere omogenă de HAp, se pastrează raportul stoechiometric Ca/P, particule de dimensiuni nano. Dezavantajele majore includ generarea de faze secundare (de obicei oxid de calciu, CaO) și costul ridicat al unora dintre materiile prime, în special precursorii alcoxid [56], controlul asupra morfologiei particulelor este redus, tratamentul termic al produsului amorf modifică morfologia particulelor, modifică cristalinitatea, și induce aglomerarea particulelor [47].

Sinteza hidrotermală este un proces ecologic (se află sub chimia verde) și este calea directă pentru fabricarea nanoparticulelor submicronice la o temperatură relativ mai scăzută fără a fi necesară o etapă ulterioară de calcinare. Procesul hidrotermal a fost utilizat pentru sinteza diferitelor produse, cum ar fi oxizii metalici, fosfați și HAp [47]. Mecanismul metodei este asemănător cu cel al metodei de coprecipitare chimică doar că etapa de maturare este realizată la o temperatură ridicată, de obicei deasupra punctului de fierbere al apei, în interiorul unui vas sub presiune într-o incintă închisă [56]. Se utilizează precursori de calciu (nitrat,carbonat, clorură de calciu) și precursori de fosfat (fosfat de dihidrogen de amoniu, acid fosforic, fosfat de dihidrogen de sodiu) [47]. Se păstrează stoechiometria raportului Ca/P asemănătoare cu a HAp natural, se obține pulbere de HAp foarte cristalină și de puritate ridicată, favorizează diminuarea gradului de aglomerare ale particulelor, distribuția particulelor este într-un domeniu îngust. În funcție de modificarea anumitor parametri de sinteză (timp de maturare în timpul procesului, temperatura, presiune, Ph etc.) se obțin diverse morfologii (nanotije [57], nanotuburi [58], nanoplaci [59] etc) și dimensiuni ale particulelor (nano sau micro)[56], de exemplu valoarea ridicată a PH-ului va contribui la o creștere izotropă sau anisotropă slabă, astfel încât cristalul poate crește pentru a forma nanoparticule sferice, în general această metodă folosindu-se pentru obținerea de tije, deoarece această metodă favorizează creșterea particulei pe o singură direcție [48]. Se pot utiliza aditivi pentru modificarea morfologiei nanoparticulelor de HAp în timpul sintezei (bromură de hexadeciltrimetilamoniu(CTAB),poliamidoamină(PAMAM),dendrimeri-de-etil-diamin-tetra-acetic (EDTA)). Nanoplăcile de HAp sunt foarte ușor de utilizat în ingineria țesuturilor deoarece această morfologie este similară cu morfologia țesutului biologic natural [46]. Dezavantajul acestei metode este costul crescut asociat cu utilizarea unor echipamente scumpe și controlul dificil al distribuției de mărime a nanoparticulelor [48].

Sinteza hidrotermală asistată de câmp de microunde presupune utilizarea unui câmp de microunde în timpul procesului de maturare; creșterea temperaturii depinde de interacțiunea între microunde și materiale. Sub câmpul electromagnetic, particulele pot prezenta polarizare, cum ar fi polarizarea electronilor, polarizarea atomului, polarizarea orientării și polarizarea încărcării spațiale. În comparație cu metodele tradiționalele de încălzire externă, încălzirea cu microunde este rapidă, volumetrică (în toată masa de material, dinspre interior spre exterior); încălzirea se realizează fără procesul de conducție a căldurii, determinând o încălzire uniformă într-o perioadă scurtă de timp (de câteva minute în comparație cu metoda convențională care necesită multe ore). Astfel că se reduce considerabil timpul de sinteză, deci și costul de sinteză a pulberii de HAp [60]. Datorită lipsei de gradient termic se accelerează rata de cristalizare, se scurtează timpul de cristalizare și se reduce temperatura de cristalizare și în plus metoda se realizează fără a utiliza surfactanți / șabloane pentru a controla morfologia nanoparticulelor [61]. Metoda hidrotermală asistată cu câmp de microunde poate fi, de asemenea, aplicată pentru a fabrica corpuri structurate poroase interconectate prin spumarea precipitatelor HAp (deficiente de Ca) care conțin apă. Se utilizează carbune activ ca material de înglobare pentru prepararea de ceramice cu dimensiuni nano și/sau micro ale particulelor [48].

Metoda microemulsiei este folosită pentru a obține nanoparticule de HAp cu dimensiune controlată, o bună dispersie, control asupra aglomerării nanoparticulelor și distribuție de dimensiuni restrânse [46], de altfel se poate controla morfologia și nu necesită utilizarea temperaturii înalte [56]. Microemulsiile sunt stabile în soluții izotrope care sunt compuse dintr-o fază non-polară (de obicei ulei), o fază polară (de obicei apă) și un agent tensioactiv [46]. Se utilizează surfactanții (moleculă amfifilă cu un cap hidrofil și coadă hidrofobă) care pot reduce tensiunea superficială a lichidelor imiscibile, rezultând o fază dispersată limitată în regimurile nanometrice, emulsia generată este astfel capabilă să elibereze particule de dimensiuni nano [56].

1.1.3.3 Procese la temperaturi ridicate

Se remarcă prin utilizarea temperaturii ridicată pentru a arde sau a arde partial precursorii.Se realizează prin două tehnici: combustie și piroliză [56].

Combustie este o metodă relativ simplă, necostisitoare în urma căreia se obține o pulbere de HAp foarte omogenă și de puritate mare, cu particule de dimensiuni nano. Se amestecă soluțiile apoase de precursori de calciu și fosfat, se adaugă HNO3 concentrat pentru a dizolva precipitatul alb rezultat, combustibilul este încorporat ulterior în soluția rezultată. Reacția este inițiată prin încălzirea amestecului într-un cuptor la o temperatură destul de scăzută (de exemplu 300 °C), aceasta este apoi urmată de o creștere bruscă a temperaturii, ca urmare a arderii, la o valoare maximă. Ultima etapă este răcirea rapidă a amestecului [56].

Piroliză nu necesită un combustibil amestecat cu reactanții. Particulele de HAp se formează într-o fază gazoasă generată de evaporarea fizică a precursorilor în stare lichidă. Procesul de piroliză se desfăsoară într-o incintă închisă în lipsă totală sau partială de oxigen. Se obține pulbere de HAp de cristalinitate mare cu nanoparticule asamblate în agregate micrometrice [56].

1.1.3.4 Sinteza din surse biologice

Hidroxiapatita naturală este extrasă din surse biologice precum: os de mamifere (os de pește, os bovin, os de cal), plante și minerale (calcar), coajă de ou, cochilie de scoici, din surse acvatice (alge, os de pește)[62–65]. HAp naturală este nonstoechiometric fiind fie deficidară în calciu fie în fosfor. HAp naturală este substituită în pozițiile de calciu de către ioni de sodiu, magneziu, zinc etc. și de către ionii fluorid în locul ionilor hidroxil. Prezența acestor ioni în HAp naturală îmbunătățește interacțiunea cu țesutul osos natural și totodată utilizarea HAp extrasă din surse naturale poate fi considerată a fi un proces ecologic, durabil și economic pentru fabricarea acestor materiale, deoarece aceste materiale sunt disponibile în cantități mari. Pentru extragerea HAp naturală din osul bovin se efectuează fie o etapă de spălare (fierbere, agenți tensioactivi, soluții alcaline) sau o etapă de calcinare la temperaturi de până la 1400°C pentru a elimina compușii organici (grasime, maduvă osoasă, celule etc.) [66–69]. În funcție de metoda de extragere și de parametrii spefici metodelor (temperatură, timp, concentrație) se poate obține particule de HAp cu morfologie de tip fulg (nanoflakes), semi-sferice, de tip ac, plăcuțe (plate like) și dimensiuni nanometrice sau micronice [2]. Extragerea HAp din surse biogene este efecientă din punct de vedere al costurilor, are mai puține produse secundare, disponibilitate mare și în funcție de sursa biogenă se poate obține HAp cu cristalinitate ridicată.Mai mult de atât se poate păstra arhitectura naturală a țesutului osos. Rahavi și colaboratorii [70] au comparat HAp obținută prin metoda sol-gel și HAp obținută prin calcinarea oaselor provenite de la animale la 700°C. În urma acestui studiu s-a constatat că în cea ce privește metoda sol-gel, conversia materiilor prime nu a fost de 100% , regăsindu-se cantități mici de fosfat beta-tricalcic. Prin metoda sol-gel se menține raportul stoechiometric Ca/P însă gradul de aglomerare este mai mare în cazul HAp sintetică (dimensiunea particulelor este mai mică). HAp extrasă din oase naturale are un grad mai mare de cristalinitate [47].

1.2 HIDROXIAPATITĂ DOPATĂ

1.2.1 Aspecte generale

Hidroxiapatita naturală este un material cristalin și nonstoichiometric datorită prezenței altor ioni precum ioni Zn2+, Mg2+, K+, Fe2+, F-, etc. HAp sintetic în comparație cu HAp natural este un material stoechimetric, mai puțin cristalizat și se resoarbe cu viteze mai lente decât viteza regenerării osoase. De aceea sunt de preferat ceramicele HAp slab cristaline sau amorfe atunci când se ia în considerare viteza de formare a osului nou. Pentru a imita cât mai precis chimismul Hidroxiapatitei naturale, se poate dopa și co-dopa Hidroxiapatita sintetică cu diverși ioni [9].

Un avantaj remarcabil al Hidroxiapatitei sintetice este acela că poate să incorporeze în structura sa atomică aproape jumătate din elementele din sistemult periodic [10]. În principiu complexele anionice pot înlocui grupările fosfat iar cationii metalici bivalenți și trivalenți pot substitui calciul. Substituția ionică poate afecta structura cristalul, cristalinitatea, proprietățile suprafeței (de exemplu sarcina electrică), solubilitatea, proprietățile mecanice și proprietățile biologice [71–78] (mineralele și urmele de elemente metalice accelerează formarea oaselor)[10]. Tot mai multi cercetători prezintă un interes deosebit față de dopajul și co-dopajul Hidroxiapatitei sintetice datorită îmbunătățirea performanței biologice a Hidroxiapatitei prin această metodă [10].

În figura de mai jos se pot observa numărul anual de articole despre Hidroxiapatită dopată și co-dopată publicate pe site-ul “ Science Direct ,, în perioada 2015-2020 [79].

Fig.1.2 Numărul anual de articole despre Hidroxiapatită dopată și co-dopată în perioada 2015-2020 [79].

Există 2 tipuri de substituție: cationica (ionii substituienți înlocuiesc atomii de Ca ) și anionică (substituie atat grupări hidroxil cât și fosfat). Substituția HAp cu zinc este o substituție cationică. Bigi și colab.[80] au descoperit că doar 20% dintre ionii de Ca pot fi substituiți [53].

Substituțiile ionilor bivalenți ( Zn2+, Mg2+ ,Sr2+ ) nu provoacă dezechilibru de sarcină în structura de apatit, însă ionii monovalenți precum Na+ și K+ provoacă un dezechilibru de sarcină care poate fi neutralizată prin crearea de vacanțe suplimentare sau prin apariția substituțiilor simultane ale cationilor și anionilor fără formarea vreunui post vacant [81].

Localizarea cationilor de substituție în structura apatitică este, în general corelată cu raza lor ionică. Site-ul Ca(I) este mai mic în volum decât situl Ca(II). Astfel că, un cation cu o rază mai mare decât raza din Ca(I) trebuie să prefere și să ocupe site-ul Ca(II). Cu toate acestea, unele experimentele au arătat invers (de exemplu, ionul Mn2+ (raza ionică de 0,080 nm) substituie calciul (raza ionică de 0,099 nm) în site-ul Ca(I) în fluoroapatit, însă în clorarapatită, se substituie simultan în ambele site-uri. Sarcina ionilor și legăturile corespunzătoare afectează distribuția dintre cationi între aceste două site-uri. În altă ordine de idei distribuția catinonilor poate fi influențată de interacțiunea Metal-Oxigen: site-ul Ca(I) permite cationi mai mari datorită distanței Metal –Oxigen mai lungi. Însă când numărul ionilor mai mari crește, repulsia între atomii din poziția Metal (I) ar provoca o lărgire a axei c, care este parțial restrânsă prin distribuirea atomilor metalici în site-ul Ca (II) [9].

Cationi trivalenți ( Ga3+, Al3+, Y3+ ) sunt încorporați sub formă de hidroxi-ioni cu valență inferioară, pentru a menține echilibrul de sarcină. Capacitatea de schimbare a ionilor trivalenți pare să depindă mai mult densitatea lor de încărcare decât de razele lor ionice [9]. Santos și colab. [10] au investigat defectele în urma dopajului HAp cu ioni trivalenți și tetravalenți și au raportat că ionii trivalenți au o preferință energetică pentru site-urile de Ca iar ionii tetravalenți pentru cele de P. [10].

1.2.2 Hidroxiapatită dopată cu ioni de Ga3+

Galiul (Ga) este un element din grupa a treia a metalelor cu numărul atomic 31, el a fost descoperit în 1875 de chimistul francez Emile Lecoq de Boisbaudran. Acest element există în scoarța terestră, este de culoare alb-argintiu, are o temperatură de topire de 28,7646 °C și este obținut ca produs secundar la extracția minereurilor de aluminiu și zinc. Ionul de Ga3+ are proprietăți asemănătoare cu ionul de Fe3+ în sensul că raza ionică octaedrică pentru Ga3+ este de 0,620 Å în comparație cu 0,645 Å pentru Fe3+, raza ionică tetraedrică este 0,47 Å pentru Ga 3+ și respectiv 0,49 Å pentru Fe3+ , potențialul de ionizare și afinitatea electronilor pentru Ga3+ sunt 64 eV și 30,71 eV, în timp ce pentru Fe3+ sunt 54,8 eV și, respectiv, 30,65 eV [82].

Inserția ionilor de Ga3+ în matricea Hidroxiapatitei ajută la îmbunătățirea proprietăților mecanice ale Hidroxiapatitei. S-a demonstrat că parametrii de rețea ai HAp nesubstituită sunt identici cu ai Hidroxiapatitei subtituite cu ioni de Ga3+. Ionii de Ga3+ nu înlocuiesc ionii de Ca2+ din reteaua de HAp datorită substituției heterovalente, deci nu se produc distorsiuni în cadrul matricei hidroxiapatitei, aceștia rămân puternic fixați sub formă de soluție solidă de intercalație [83]. Există două moduri posibile de încorporare a metalelor trivalente în rețea cristalină de hidroxiapatită: prin heterovalență / substituire și prin intercalare, de ex. prin formarea de soluții solide de substituție / intercalare. Ca sumă de raze ionice Ga3+ + NH4+= 2,69 Å depășește spațiul disponibil pentru situsul Ⅱ al Ca2+ = 1,98 Å și, în același timp, parametrii de rețea nu cresc, înseamnă că atunci când se utilizează Ga(NO3)3 ( precursor ), galiul formează o soluție solidă de intercalare /substituție. Pe de altă parte, când se utilizează galatul de sodiu pentru sinteză (suma Ga3+ + Na+ = 1,64 Å), în principiu, perechea heterovalentă poate înlocui Ca2+ din situsul Ⅱ disponibil în rețea, dar este prea mică pentru a forma o soluție solidă de substituție. In cele din urma, eșecul de a obține soluții solide de înlocuire poate fi datorat solubilității mai mari a acestor compuși în comparație cu a hidroxiapatitei fără galiu [84].

Deși sărurile și complexele de galiu nu au nicio funcție fiziologică cunoscută în corpul uman, anumite caracteristici, în special proprietățile asemănătoare cu fierul ale acestora, le permite să interacționeze cu procesele celulare și proteinele biologice importante, (raza ionică, afinitatea electronilor, potențial de ionizare) [83]. Fierul joacă un rol important în transportul de electroni mitocondriali, sinteza ADN-ului, metaloenzime, reacții redox și proliferare celulară, astfel că odată ce ionii de Galiu intră în celulele cu activitate metabolica rapidă (celule canceroase sau bacteriene) prin canalele ionilor de Fe, prin mecanisme de transfer in dependență și independență, ionii de Galiu induc apoptoza celulară. S-a demonstrat că galiul are efect antineoplastic asupra cancerului mamar, de prostată și limfatic [85].

O proprietate importantă a galiului este afinitatea ridicată de a se lega la transferină (proteina de transport a fierului în circulație), însă în comparație cu fierul, galiul nu poate fi redus în condiții fiziologice. Acestă proprietate face ca ionii de Galiu să aibă un efect antibacterian pronunțat. Bacteriile necesită ioni de fier pentru creștere și pentru funcționarea unor enzime (cele implicate în sinteza ADN, transport electroni), prin urmare, galiul perturbă homeostazia de fier celular (galiul se leagă de anumite proteine) astfel că galiul inhibă creșterea și reproducerea bacterilor [18].

În 1931 Levaditi [86] a pus în evidență potențialul terapeutic al galiului, folosind tartrat de Ga pentru tratarea sifilisului la iepure. Cercetările privind toxicitatea acestuia și distribuția tesuturilor au început în 1940 utilizând radioizotopii 67 Ga, 72 Ga, constatări precum cresterea și remodelarea unor țesuturi (de exemplu țesut osos), precum și prezența unor elemente similare galiului cu activitate antineoplastică au condus la orientarea cercetărilor galiului în tratamente împotriva cancerului. Acesta a fost găsit ca fiind extrem de eficient în reducerea creșterii unor tumori subcutanate făra a prezenta o toxicitate semnificativă. În urma unor studii clinice ulterioare, 43% din pacienții cu limfoame maligne recidivate au raspuns favorabil la tratamentul cu nitrați de galiu. S-au constat și alte proprietăți ale galiului precum proprietăți antiinflamatorii (galiul acumulându-se în zona de interes reducând inflamația), imunosupresivitate (suprimarea artritei adjuvante la șoarece similară cu artrita reumatoidă a oamenilor), antiresorptivitate (în țesutul osos, galiul este utilizat pentru suprimarea osteolizei și durerilor osoase asociate cu mielom multiplu și metastaze osoase precum și în tratarea microcalcifierilor de malignitate) [12].

Efectul inhibitor al ionilor de Ga asupra activității de resorbție osoasa a osteoclastelor a fost evidențiat în numeroase studii. Hall și colab.[87] au efectuat teste in vivo, acestia au implantat subcutanat particule osoase incărcate cu Ga (provenite de la șobolani injectați anterior cu Ga) unor șobolani timp de 5-12 zile. În urma acestui test s-a demostrat că particulele osoase care conțineau galiu au fost resorbite în număr mai mic în comparație cu cele făra galiu precum și că efectul galiului de a inhiba resorbția osoasă nu a redus numărul de osteoclaste și nu a afectat morfologia acestora. Un alt studiu ce viza tratare osteoporozei la găini, a arătat reducerea mortalității găinilor hrănite cu suplimente cu galiu, creșterea concentrațiilor de minerale osoase a vertebrelor, creșterea volumului osului trabecular si a grosimei trabeculare și corticale [12].

Deoarece galiul inhibă activitatea osteoclastelor fără a afecta negativ osteoclastele poate reprezenta o strategie terapeutică locală promițătoare împotriva resorbției osoase cauzate de osteoporoză și metastază osoasă [12]. În plus proprietatea galiului de a se lega de transferină, ii permite acestuia să se acumuleze în celule cu proliferare accelerată, inclusiv în țesutul malign. Odată intrat în celulele tumorale, Ga blochează sinteza ADN-ului, modifică permeabilitatea membranei plasmatice și funcțiile mitocondriale, aceste evenimente ducând la apoptoza celulară [88].

Comportamentul ionilor de Ga în mediul fiziologic

În condiții fiziologice, în soluții apoase, ionul de Ga este trivalent și se poate hidroliza aproape complet pe o gamă largă de PH, rezultând în urma hidrolizării ionului Ga3+ diferite specii de hidroxid precum Ga(OH)4 , concomitent cu scăderea PH-ului cauzată de formarea H3O+. La PH mare precipită Ga(OH)3 amorf și foarte insolubil care tinde să se transforme într-o stare stabila, cristalină, GaO(OH), însă la PH fiziologic (aproximativ 7,4) nu există în esență Ga3+deci procentul de Ga(OH)3 este foarte mic, Ga hidrolizat găsindu-se în mare parte sub formă de Ga(OH)4. Insolubilitatea Ga(OH)3 este cauzată de coordonarea a șase molecule de apă cu ionul Ga3+ care apoi sunt înlocuite progresiv cu grupări hidroxil [12].

Fig.1.3 Diagrama ilustrează diferite specii apoase de Ga în funcție de PH la 25◦C [12].

Comportamentul ionilor de Ga în funcție de pH este luat în considerare la administrarea și dezvoltarea medicamentelor pe bază de Ga. De exemplu dacă săruri de Ga s-ar administra pe cale orală, absorbția de ioni de Ga ar fi foarte scazută din cauza formării unor hidroxizi slab solubili la nivel gastric (pH acid), de aceea este necesar să se dezvolte un sistem de eliberare a ionilor de galiu direct în zona de interes. La nivelul țesutului osos Ga se acumulează preferențial în regiuni metabolice active precum matafiză, cartilaj de creștere și zone de fractură [12].

1.2.3 Hidroxiapatită dopată cu ioni Zn2+

Zincul este un element din perioada a patra, grupa a douăsprezecea din tabelul lui Mendeleev, cu numărul atomic 30 și cinci izotopi stabili (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn, 70Zn). Se găsește în scoarța terestră sub formă de minereu de zinc (Sphalerită). Zincul a fost folosit începând cu secolul I î.Hr.pentru fabricarea monedelor și a obiectelor decorative din alamă (aliaj de cupru și zinc), însă prima sinteză de metal pur a avut loc în anul 1746 de către savantul Andreas Marggraf prin reducerea calaminei folosind cărbune [89].

Substituția HAp cu zinc este o substituție cationică. Bigi și colab. [53] au descoperit că doar 25% dintre ionii de Ca pot fi substituiți [53]. Studiile de simulare numerică au relatat că ionii de Zn2+sunt mai favorabili din punct de vedere energetic petru substituirea ionilor de Ca2+ din situsul Ⅱ. Rezultate contradictorii apar în cazul subtituției ionilor de Zn2+ în locurile vacante de Ca2+ și în coloanele de ioni OH-. Zn efectează structura cristalului de HAp deoarece acesta inhibă cristalizarea și formarea de HAp, cauzează distorsiuni în structură și modifică proprietățile biologice [54].

Li și colaboratorii [90] au observat că stabilitatea termică și cristalinitatea apatitului scad semnificativ odată cu creșterea concentrației de Zn, de altfel cantitatea care poate fi incorporată în rețeaua de apatit depinde de metoda de sinteză. Miyaji și colab.[91] au studiat substituția Zn progresivă în HAp, iar concluziile lor indică faptul că crescând concentrația de Zn produsul final se schimbă de la apatitul cristalin substituit la o fază asemănătoare cu apatitul amorf, ei sugerând limita de substituție a Zn în HAp fiind de 15 mol%, comparativ cu 25% mol sugerat de Bigi și colab. S-au observat modificări ale parametrilor de rețea a HAp substituită cu Zn datorate diferențelor de rază ionică (0,074 nm pentru ionul Zn2+ și 0,099 nm pentru Ca2+). Miyaji și colab.[91] sugearează că parametrul de rețea c scade progresiv cu creșterea concentrației de Zn, parametrul a crește pentru concentrații de Zn mai mari de 5 % (atribuindu-se probabil unor substituții ale grupărilor OH din apatit cu ioni de Zn).

Tang și colab.[92] au arătat că cea mai favorabilă structură pentru Zn este coordonarea tetraedrică, așa cum se arată în Fig.1.4. Privind mai mult îndeaproape la coordonarea tetraedrică (Fig.1.4), se poate vedea că printre cei patru atomi de oxigen legați de Zn, unul este din cea mai apropiată grupare hidroxil și trei sunt din grupări de fosfat adiacente. Această aranjare a atomilor provoacă reducerea parametrului de rețea a de la 0,9488 la 0,9319 nm.

Gruparea hidroxil se îndepărtează de poziția axei sale C și de Zn, atomul se deplasează în afara site-ului Ca(Ⅱ). Ambele se apropie între ele, iar distanța Zn– O(OH) este de 0,202 nm față de 0,269 nm în distanțele ideale în HAp. Preferința Zn pentru situsul Ca(Ⅱ) poate facilita absorbția și eliberarea Zn de către HAp [9].

Fig.1.4 Vizualizare detaliată a coordonării octaedrice locale a Zn încorporat în structura Hap cu distanțe interatomice [9].

Zincul este al doilea cel mai abundent oligo-metal din organismult uman și un micronutrient esențial, el fiind implicat în peste 300 de reacții enzimatice (anhidraza carbonică, superoxid dismutaza, dehidrogenază lactică, fosfataza alcalină, carboxipeptidaza etc.), în plus acesta nu se reduce în mediu fiziologic precum fierul și cuprul. Corpul unui adult conține aproximativ 2-3 grame de Zn, dintre care 30% aparțin țesutului osos și 60% mușchilor scheletici. [93] Cantitatea de Zn necesară unui organism adult este de 15 mg/zi. Zincul joacă un rol deosebit în creșterea și dezvoltarea organismului atât în perioada intrauterină cât și după aceea, deoarece joacă un rol crucial în sinteza de ADN și ARN (responsabili de diviziunea celulară) datorită enzimelor dependente de Zn (timidinkinază, ADN polimerază, ARN polimerază) [53].

Papirusurile egiptene dezvăluie utilizarea zincului în creme de piele, terapeutice (vindecarea rănilor și tratarea bolilor de piele) în Egiptul Antic. În 1771 Gaubis a menționat pentru prima dată într-o lucrare științifică terapia cu zinc pentru tratarea convulsiilor și spasmelor. În 1961 neurologul Schouwink [94] a demonstrat că sărurile de Zinc nu produc reacții adverse, zincul devenind principalul element în tratarea bolii Wilson. În secolul douăzeci se recomandă suplimente cu zinc persoanelor cu dezvoltare sexuală întârziată, creștere și dezvoltare întârziată, precum si pentru a accelera vindecarea rănilor. În 1975, zincul este folosit pentru a vindeca acrodermatita enterohepatică [89].

În prezent nanoparticulele de zinc sunt folosite în aplicații biomedicale precum terapia cancerului, administrare de medicamente, agent antimicrobian, bioimagistică, ingineria țesutului osos, în produse farmaceutice regenerative (dermatologie) etc. [89,95–97].

În 1974, Ronaghy și colaboratorii [93] au efectuat studii ce implică suplimentarea cu Zn a copiilor de sex masculin din Iran, în urma cărora s-a descoperit că 40mg/zi de Zn stimulează creșterea osoasă [53]. Deficitul sever de Zn se manifestă ca anemie, boli cardiovasculare, retard de creștere, hipogonadism și epuizare mentală. Alte studii efectuate de Laudermilk [98] în 2012 suplimentând fete prepubescente, au dezvăluit ca Zincul ajută la creșterea dimensiunilor oaselor și a rezistenței acestora, influențând pozitiv și geometria acestora, densitatea oaselor crescând cu 1%.

În 2006, Tang și coloboratorii [99] au identificat transportorii de Zn, ZIP-1, iar în anul 2008, Yamaguchi [100] a demostrat că prezența zincului sporește expresiile RUNX2 (factor de transcripție asociat cu osificarea), osteoprotegrin și regucalcin în osteoblaste. Efectul asupra inhibării osteoclastelor se datorează faptului că zincul poate inhiba stimularea RANKL și semnalizarea unei căi înrudite cu RANKL în pre-osteoclaste (dezvoltarea osteoclastelor depinde de doi factori hematopoietici: citokina, activatorul receptor al ligantului HF-kB (RANKL) și factor de stimulare a coloniei 1-macrofag ( MSCF ) [53].

Efectul antimicrobian al zincului se atribuie parțial oxidării ionilor de Zn2+ și generării de ROS (specii reactive de oxigen care produc liza celulară), interacțiunea electrostatică între Zn2+ și peretele celular încărcat negativ dar și deteriorării pereților celulari indusă de interiorizarea ionilor de Zn în celula bacteriană [19]. Diverse studii relatează efectul toxic impotriva S.aureus, E. Coli, bacteriilor de holeră, Bacillus subtilis (gram pozitive), ciuperca Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa în mare parte prin generarea de ROS. O dezorganizare mai mare a peretele celular și membrana celulară și contracția celulară a bacteriilor la tratamentul cu Zn a fost observată la β-lactamazelor cu spectru extins care generează E.coli și Klebsiella pneumoniae [89].

1.3 COLAGEN

Colagenul este o proteină fibroasă insolubilă în soluții apoase în forma sa natală dar solubilă în forma denaturată. Colagenul este principala proteină responsabilă pentru structura corespunzătoare a oaselor, tendoane, piele, printre alte țesuturi și organe. Este distribuit din abundență în matricea extracelulară (ECM) și în țesutul conjunctiv al mamiferelor și este cea mai abundentă proteină la animale [101] (constituind mai mult de o treime din țesutul proteic al corpului ) [39], deoarece este responsabilă de menținerea integrității structurale a organelor și țesuturilor. Pe lângă funcția sa de proteină structurală, colagenul are mai multe alte funcții biologice, cum ar fi reglarea aderenței celulare, a migrării și diferențierii [101].

De-a lungul mai multor decenii, a evoluat un sistem de nomenclatură în care fiecărui tip de colagen i s-a atribuit un număr (numere romane), care reflectă în general ordinea cronologică în care a fost descoperit. Fiecare lanț α de un tip diferit de colagen este desemnat cu un număr progresiv (α1, α2, s.a.m.d.) urmat de numărul tipului de colagen. De exemplu, pentru a exprima compoziția în lanț a unei molecule tipice de colagen I, care este formată din două catene α1 și o catena α2, se utilizează notația [α1 (I)] 2 [α2 (I)] [102].

Există cel puțin 20 de tipuri de colagen, în funcție de anumite caracteristici structurale, totuși, în corpul uman, 80% -90% colagen aparține tipurilor I, II și III, care sunt colageni fibrilari cu o lungime de aproximativ 300 nm. Tipul I este cel mai abundent tip de colagen în piele, tendon, os, ligamente, dentină și țesuturi interstițiale, tipul II se găsește în principal în cartilaj și umoarea vitroasă , iar tipul III este localizat de preferință în piele, mușchi și vase de sânge. Restul de 20% -10% dintre colagenii umani aparțin colagenului de tip V (colagen fibrilat similar cu tipul I) și tipurilor VI și IX. Colagenul de tipul VI este abundent în majoritatea țesuturilor interstițiale iar colagenul de tipul IX se găsește în principal în cartilaj și umoare vitroasă [103].

Colagenul este generat de fibroblaste într-o formă procolagenă, cu o structură triplă elicoidală [103]. Procolagenul este transformat în tropocolagen prin îndepărtarea N- și C-propeptidelor cu ajutorul proteazelor, ceea ce duce la telopeptide scurte nonelice. Tropocollagenul triplu se autoasamblează în formă de elice, liniar (propeptidele terminalele N și C fiind dispuse față în față) și lateral, în mod eșalonat, pentru a forma tablouri organizate de micro-fibrile. Ansamblurile sunt stabilizate prin legături intra și intermoleculare. Fibrilele mature capătă rezistență și stabilitate după procesul de reticulare în care sunt implicate telopeptidele. Procesul de reticulare are loc după asamblarea fibrilelor. Fibrele se pot asambla suplimentar pentru a produce fibre și rețele macroscopice distribuite în diferite țesuturi corporale [104].

Fig 1.5 Structura colagenului. Transformarea Procolagenului în Tropocolagen [104].

Structura primară a colagenului este o triplă de aminoacizi (-Gly-X-Y-) n unde Gly este glicina, X este prolină și Y este hidroxiprolină [40] (singura secvență care nu perturbă conformația elicoidală a triplului helix) [102]. Hidroxiprolina este un aminoacid necodat produs prin hidroxilarea posttranslațională a prolinei și constituie în colagen mai mult de 50% din conținutul total de aminoacizi [40]. Cel mai frecvent triplet este Gly-Pro-Hyp (10,5% din toate tripletele), amino-acizii Prolină și Hydroxyprolină contribuie la stabilitatea triplului helix. Alte triplete frecvente sunt: ​​Gly-Leu-Hyp (5,5% din totalul tripletelor), Gly-Pro-Ala (3,4%), Gly-Ala-Hyp (3,4%), Gly-Glu-Hyp (2,8%), Gly- Pro-Lys (2,7%), Gly-Glu-Arg (2,7%), Gly-Pro-Arg (2,6%), Gly-Glu-Lys (2,5%), Gly-Phe-Hyp (2,5%), Gly- Pro-Gln (2,5%) și Gly-Ser-Hyp (2,3%) [102].

Structura secundară este un α helix, unde (-Gly-X-Y-) n tripeptide sunt legate între ele, cu formarea unei elice triple de tip I, II și III. Domeniile nonelice sunt la sfârșitul lanțurilor α, unde C-terminal inițiază formarea triplu helix și N-terminal este implicat în reglarea diametrelor fibrilare primare. Telopeptidele scurte nonhelicoidale ale colagenului sunt legate prin legături covalente cu alte molecule de colagen și alte molecule prezente în ECM [40].

Structura terțiară a moleculelor de colagen este un triplu helix, care este de obicei format ca un heterotrimer cu două catene identice și o catenă diferită [40].

Fig 1.6 (a) Tripla helix de colagen. (b) lanțuri α c ) secvența polipeptidică Gly-X-Y, X și Y fiind prolină și hidroxiprolină [102].

Structura de triplu helix este specifică familiei de colagen și este responsabilă pentru proprietățile mecanice și bioactivitatea sa. Modificarea acestei structuri (mutații, denaturare) fiind asociate cu diferite boli sau îmbătrânire [102]. Triplul helix are o structură asemănătoare unei tije, cu diametrul de 1,5 nm și lungimea de aproximativ 300 nm, cu domenii nonhelicale terminale, N- și C- propeptide [104]. Triplul helix de colagen se caracterizează prin împletirea a trei lanțuri polipeptidice elicoidale (numite lanțuri α) cu pasul 9,5 Å, formând o structură superhelicală. Fiecare polipeptidă formează o helixă stângă în care fiecare al treilea reziduu de aminoacid ajunge în centrul superhelixului [102].

Un lanț de proteine conține 1000 de aminoacizi, este format printr-o legătură covalentă a secvențelor repetate de trei aminoacizi Gly-X-Y, corespunzând glicinei (Gly-reprezentând aproximativ o treime din secvență), prolină sau hidroxiprolină (reprezentând o șesime din motivul secvenței) și un alt aminoacid [104].

Trei lanțuri individuale de procolagen se conectează prin legături de hidrogen, legături dipol-dipol, legături ionice și interacțiuni van der Waals pentru a forma un triplu helix la dreapta [104]. În tripla helix de colagen, legăturile peptidice care leagă aminoacizii adiacenți sunt în interiorul moleculei. Astfel, triplul helix de colagen este rezistent la atacul proteazelor generale, cum ar fi pepsina. Potențialul de interacțiune și legăturile încrucișate cresc deoarece aminoacizii din pozițiile X și Y au lanțurile lor laterale pe suprafața exterioară a proteinei [102].

Din motive sterice, centrul triplului helix trebuie să fie ocupat de glicină (aminoacidul trebuie să aibă dimensiuni mici pentru a permite o asamblare strânsă)[102], în timp ce celelalte reziduuri de aminoacizi sunt dispuse pe suprafața exterioară [104]. Aminoacizii succesivi sunt separați axial cu 2,86 Å [102].

În structura cuaternară fibrilele de colagen sunt capabile să se autoasamble într-o formă supramoleculară de cinci molecule de colagen triplu elicoidale extrem de orientate. Colagenul fibrilar este insolubil în structura sa natală în apă, dar forma denaturată de procolageni poate fi solubilizată în soluții apoase [40].

Datorită structurii lor tridimensionale, fibrilele de colagen au o rezistență la tracțiune foarte bună. Matricea de colagen care conține colagen de tip II (fibre cu diametru mai mic decât cele de la colagen de tip I și sunt orientate aleatoriu în matricea proteoglicană vâscoasă) prezintă o rezistență la compresiune permițând astfel articulațiilor să absoarbă șocurile [103].

Colagenul a găsit o largă varietate de aplicații în domeniul medical, inclusiv: suturi, agenți hemostatici, înlocuirea și regenerarea țesuturilor (os, cartilaj, piele, vase de sânge, trahee, esofag etc.), chirurgie cosmetică (buze, piele), compozite dentare, regenerarea pielii, contraceptive (metoda barieră), matrici biodegradabile, înveliș protectoar al nervilor, înveliș protectoar al implanturilor, bandaj al corneei, lentile de contact, eliberare controlată de medicament etc. Poate fi ușor modificat în diferite forme fizice, cum ar fi pulberi, particule, fibre, geluri, soluții, filme, membrane, bureți, amestecuri cu alți polimeri și ceramică (compozite pe bază de ceramică) [40].

Tabel 1.1. Avantajele și dezavantajele utilizării colagenului ca biomaterial natural [105–108].

Metode de extragere ale colagenului

Colagenul se poate extrage din diverse surse precum deșeuri de pește, oase și piele ale unor păsări și mamifere ( bovine, porc etc. ) etc. [109–111].

Una dintre cele mai utilizate metode de a extrage colagenul la nivel industrial este Hidroliza chimică însă din punct de vedere al menținerii proprietăților biologice este de preferat utilizarea hidrolizei enzimatice. Hidroliza chimică se bazează pe solubilitatea colagenului în soluții saline, de exemplu NaCl [112]. Procesele enzimatice generează mai puține reziduri și pot reduce timpul de procesare, dar acestea au un cost crescut în comparație cu procesele hidrolizei chimice. Pentru a extrage colagen este necesar să se îndepărteze numeroase legături covalente intra și intermoleculare, care implică în principal reziduuri de lizină și hidroxi-lizină, legături ester și altele. Înainte de a putea fi extras colagenul, este efectuată o pre-tratare folosind un acid sau o bază în funcție de originea materii prime din care urmează a fi extras colagenul. Pre-tratamentul este utilizat pentru a îndepărta substanțe necolagene [113].

O altă metodă de extragere a colagenului include utilizarea ultrasunetelor de frecvență inaltă în combinație cu metodele clasice de extragere. Ultrasunetele cu intensitate scăzută sunt utilizate pentru a demonstra proprietăți fizico-chimice, cum ar fi compoziția, structura, starea fizică și debitul unei substanțe. Ultrasunetele de intensitate mare sunt utilizate pentru a promova emulsificarea, distrugerea celulelor, reacțiile chimice și pentru a inhiba activitatea enzimelor. Acestea pot produce încălzire, compresie / expansiune etc dar cea mai importantă proprietate a sa este cavitația, unde produce zeci de milioane de micro-bule pe secundă în lichide, iar aceste micro bule se generează și se opresc prin ultrasunetele în mod repetat. Acest fenomen provoacă turbulențe mari instantaneu, creșterea temperaturii la 5.000 K și creșterea presiunii până la 1.200 bar. Energia generată în acest moment descompune materialul [114]. Avantajele utilizării acetei metode sunt reducerea timpului de procesare și creșterea randamentului procesului [110].

1.4 OXID DE GRAFENĂ (GO)

Deși existența grafenului se cunoaște din 1859, fiind studiat mult timp de către Wallace [115], acesta a atras un interes deosebit după ce Andre Geim și Nosovelov [116] a izolat un singur strat de grafen în anul 2004 prin clivarea mecanică a unui cristal de grafit folosind metoda scotch tape. Datorită absenței grupărilor de oxigen, grafenul este considerat hidrofob. Oxidul de grafenă (GO) a fost produs prin exfolierea oxidului de grafit și este un singur strat de oxid de grafit. Singura diferență între grafen și GO este prezența atomilor de oxigen legați de carbon în acesta din urmă. GO este produsul unui derivat hidrofil al grafenului [117].

Oxidul de grafenă se poate obține prin exfolierea grafitului oxidat (de exemplu cu ajutorul ultrasunetelor ) [118]. Oxidarea grafitului presupune tratarea acestuia cu acizi și agenți puternici oxidanți (KMnO4). Prima etapă este amestecarea grafitului cu acid sulfuric (H2SO4) pentru a face grafitul reactiv. A doua etapă este adăugarea permanganatului de potasiu. Permanganatul de potasiu în reactie cu H2SO4 generează heptaoxidul de mangan (Mn2O7), specia activă responsabilă de oxidarea grafitului. Se poate utiliza o sursă naturală de grafit, supusă purificarii [119]. Grafena oxidată rezultata este un material nestoichiometric heterogen, care contine grupari hidroxil, epoxi si carbonil pe partile bazale, și grupari carboxil si carbonil pe margini [118].

Fig.1.7 Modelul structural pentru oxidul de grafenă [119].

Structura grafenei presupune un singur strat de atomi de carbon hibrodizați sp2 și aranjați hexagonal formând elementul de construcție 2D al multor alotrope de carbon precum bile – 0D, nanotuburi de carbon – 1D și grafit – 3D. Grafenul a fost foarte cercetat în ultimul deceniu în domenii precum nanoelectronnică, nanocompozite, senzori etc. datorită proprietăților remarcabile [120]. Grafenul monostrat perfect atomic a afișat modului lui Young de 1,0 TPa și o rezistență la fractură de 130 GPa (datorită legăturii C-C puternice), mai puternică decât orice alte biomateriale, suprafață specifică mare (2630 m2/g) ,conductivitate termică (5 000 W/m/K) și electrică (10 000 s/cm), bune proprietăți optice [120–122]. Proprietățile mecanice ale grafenului sunt influențate de defectele de structură (locuri vacante monoatomice și dislocări Stone- Wales [121,122] (Un defect Stone -Wales este un defect cristalografic care implică schimbarea conectivității a doi atomi de carbon legați π, ceea ce duce la rotația lor cu 90° în raport cu punctul mediu al legăturii lor) [123] și defecte de dopaj sau de funcționalizare [124].

Fig.1.8 Defect Stone-Wales

Structura GO permite modificări chimice suplimentare (funcționalizarea suprafeței cu grupări sau biomolecule prin legături covalente, legături de hidrogen, interacțiuni ionice) [120]. Oxidului de grafenă conține oxigen reactiv, ceea ce îi atribuie activități chimice mai ridicate pentru modificarea suprafeței, dar cu modul mai mic al lui Young (207,6 ± 23,4 GPa). GO poate fi redus la oxid de grafenă redus (rGO) cu un modul Young mai mare de 0,25 TPa. Comparativ cu grafenul curat, derivatele sale oxigenate (GO) și rGO) au afișat un comportament de stabilizare mai mare în mediile apoase [124].

Compozitele pe bază de grafen au avantaje mari atunci când sunt utilizate în repararea și regenerarea oaselor, deoarece pot induce diferențierea osteogenă și condrogenică a celulelor stem. În comparație cu alte materiale de armare, grafenul și derivații săi (oxid de grafen (GO) și oxid de grafen redus (rGO), pot crește mult proprietățile mecanice ale compozitului, îmbunătățește elasticitatea și flexibilitatea (adaptabilitate la suprafețe plane sau neregulate) [124].

GO a fost introdus în domeniul biomedical în 2008 de către Dai și colaboratorii săi [125] când aceștia au studiat grafena pentru suport pentru sisteme cu eliberare controlată de medicament. Cele mai spectaculoase rezultate ale GO sunt în ramura ingineriei și regenerării țesuturilor. Ingineria țesuturilor este un domeniu științific pentru reproducerea sau regenerarea țesuturilor deteriorate sau a organelor întregi, folosind o combinație de celule, schele inginerești, și molecule biologic active pentru a restaura, menține sau îmbunătății funcția țesuturilor. Un biomaterial ideal poate transporta biomolecule active, generează semnale fiziologice adecvate, stimulează proprietățile mecanice din țesutul nativ și oferă un substrat pentru interfața cu celulele vii, favorizând atașarea celulelor, proliferarea și diferențierea celulelor [120]. Prin urmare, principalul obiectiv pentru încorporarea grafenului și a derivatelor sale în HAp este îmbunătățirea proprietăților mecanice generale ale compozitul, pentru a-și îndeplini mai bine funcțiile biologice [121].

Deși HAp reprezintă unul dintre cele mai biocompatibile materiale, proprietățile mecanice ale sale sunt foarte slabe în comparație cu cele ale osului natural [126]. HAp are duritate, rezistență la fracturare și la abraziune mai scăzute decât a osului natural [122]. Pentru a îmbunătății aceste proprietăți se poate folosii GO ca agent de armare și astfel crește stabilitatea, duritatea (straturile dure promovează osteogeneza), rezistența la compresiune, modulul lui Young [120]. Li și colaboratorii [127] au remarcat faptul că nanocompozitul pe bază de grafenă și HAp are proprietăți de biocompatibilitate mai bune decât nanoparticulele hidroxiapatitei pure [128]. În plus, prezența GO poate îmbunătăți proprietățile biomedicale ale colagenului, incluzând structura suprafeței, rezistența la compresiune și înglobarea celulelor osteoblastice, biocompatibilitate și biodegradabilitate sporită.

De asemenea, GO favorizează osteogeneza datorită abilității de a crește depozitul de calciu sau concentrația locală de dexametazonă (antiinflamator) prin stivuirea legăturilor π între inelele aromatice ale biomoleculelor, dar și datorită morfologiei suprafeței (aspră și neregulată) și a durității suprafeței [120].

Oxidul de grafenă este folosit de asemenea în sisteme cu eliberare controlată de medicamente, biosenzor pentru detectarea glucozei, imagistică, terapia cancerului, ingineriei de țesuturi și altele, datorită suprafeței sale extrem de mari și a biocompatibilități bune [118,119,122,129–131].

Fig.1.9 Diagrama schematică a diferitelor aplicații biomedicale ale oxidului de grafenă [128].

CAPITOLUL 2

2.1 STUDIU DE CAZ TEORETIC

2.1.1 HAp nedopat

Cercetătorii Jia Chena și colaboratorii [1] au sintetizat HAp prin metoda Hidrotermală asistată cu câmp de microunde la 160 °C timp de 30 de minute. Ei au utilizat precursorii Ca(NO3)·4H2O și (NH4)2HPO4, și au menținut pH 9 [132]. Pentru a demonstra puritatea pulberii de HAp obținută prin acestă metodă, autorii au comparat difractograma probei de HAp cu cea a HAp comerciale. Nu s-au observat alte interferențe de difracție specifice unor specii străine [132].

Fig.2.1 XRD HAp comercială (HA) și HAp realizată în laborator de către Jia Chena și colab. [132].

Puritatea și cristalinitatea HAp sintetizată prin metoda Hidrotermală au fost demonstrate și de către Liang An și colab.[133]. Aceștia au sintetizat HAp la 100 °C timp de 6 ore. Comparând difractogramele HAp standard (card JCPDS nr. 09-0432) cu HAp sintetizată în laborator, autorii au demonstrat că au obținut o probă foarte cristalină cu dimensiune de cristalit mică fără a observa impurității [133].

Yong-Zai Wang și Ying Fu [134] au studiat influența temperaturii și a perioadei de timp în care are loc procesul hidrotermal asistat în câmp de microunde, asupra cristalinității, purității și morfologiei probei de HAp. Autorii au preparat HAp folosind folosind materiile prime: azotat de calciu tetrahidrat, acid fosforic și 1,2-etilendiamina, prin metoda Hidrotermală asistată cu câmp de microunde la temperatură cuprinsă în intervalul de 100-140 °C. Probele obținute au fost caracterizate prin XRD, FTIR și SEM. Rezultatele au arătat cristalizarea unei singure faze HAp la toate temperaturile de sinteză. Autorii au arătat că se pot obține nanoparticule cu un nivel ridicat de cristalinitate la 140 ° C doar 1 min [134].

Fig 2.2 Difractogramele probelor de HAp realizate de Yong-Zai Wang și Ying Fu: 1) în urma procesului Hidrotermal fără tratament termic ulterior și 2) în urma procesului de calcinare la 900 °C timp de 1h; (a) 100 °C pentru 30 min, (b) 120 °C pentru 30 min, (c) 140 °C pentru 1 min și (d) 140 °C timp de 30 min [134].

Tabel 2.1 Mărimi de cristal și parametri de rețea calculați ale particulelor HAp sintetizate de către Yong-Zai Wang și Ying Fu în diferite condiții [134].

Modelele XRD ale diferitelor probe de sintetizate de Yong-Zai Wang și Ying Fu [134], prin metoda hidrotermală asistată în câmp de microunde arată că toate interferențele de difracție pot fi indexate în faza hexagonală a HAp (grupa spațială P63 / m, nr. PDF 00-054-0022). Nu se observă alte impurități cristaline, ceea ce indică puritatea ridicată a probelor. Maximele de difracție devin ascuțite și bine conturate odată cu creșterea temperaturii și / sau a timpului de reacție, ceea ce arată îmbunătățirea gradului de cristalinitate a probelor obținute. Acesta indică faptul că o fază HAp cristalină bună ar putea fi obținută la 140 °C la o perioadă mai scurtă de 1 min. În cazul probelor calcinate la 900 °C timp de 1 h, în afară de HAp au apărut cantități mici de fosfat tricalcic (TCP), după cum rezultă din Fig.2.2. Autorii au demonstrat în lucrările lor anterioare că HAp cu deficit de calciu se va transforma în TCP atunci când este tratat termic la 700-900 °C [134].

Autorii au calculat dimensiunea medie a cristalelor și parametrii de rețea pentru fiecare eșantion, prin abordarea fundamentală a parametrilor (FPA) a software-ului TOPOS. Așa cum se arată în tabelul de mai sus, dimensiunea cristalelor în planele de difracție (100) și (002) are valori diferite, ceea ce indică faptul că particulele au o morfologie anisotropă care se extinde pe direcția (001). Conform datelor prezentate în tabelul 2.1, dimensiunea cristalitului crește odată cu creșterea temperaturii de tratament și / sau timpului de reacție.Volumul celulelor unitare și parametrii de rețea ai nanoparticulelor de HAp au indicat o mică contracție a rețelei cu o creștere a temperaturii și / sau a timpului de tratament [134].

Fig.2.3 Spectrele FTIR ale probelor de HAp obținute la (a) 100 °C timp de 30 min, (b) 120 °C pentru 30 min, (c) 140 °C pentru 1 min și (d) 140 °C pentru 30 min [134].

Spectrele FTIR (Fig.2.3) ale probelor obținute de Yong-Zai Wang și Ying Fu [134], demonstrează obținerea de HAp comform analizei XRD. Benzile de absorbție prezintă vârfurile corespunzătoare grupării OH- (636 și 3568 cm-1), gruparii PO43-(472, 566, 603, 965 și 1032-1093 cm-1) și H2O rezidual (3422 și 1640 cm-1), în timp ce benzile slabe (870 și 2918 cm-11) pot fi atribuite HPO4. Nu a fost identificat nici o bandă de absorbție a CO3. Rezultatele au confirmat, de asemenea, că faza HAp obținută în această lucrare este un HAp cu deficit de calciu [134].

Fig 2.4 Imagini SEM ale probelor de HAp obținute la (a) 100 °C pentru 30 min, (b) 120 °C pentru 30 min, (c) 140 °C pentru 1 min și (d) 140 °C pentru 30 min [134].

Cu ajutorul metodei de caracterizare SEM, Yong-Zai Wang și Ying Fu [134] au demostrat influența mare asupra morfologiilor, dimensiunilor și aglomerării particulelor a condițiilor de sinteză . Odată cu creșterea temperaturii hidrotermale și / sau a timpului, gradul de cristalinitate și dimensiunea cristalitului a nanoparticulelor HAp au crescut, iar morfologia pulberii HAp s-a modificat [134].

La temperatura de reacție de 100 °C timp de 30 min (a), s-au putut prepara nanorode mai mici cu tendiță de agregare mare, cu dimensiuni relativ uniforme. La temperatura de reacție de 120 °C timp de 30 de minute, nanoparticulele au fost mai puțin aglomerate și s-au format mai multe nanorode alungite (b). Datorită încălzirii volumetrice prin iradiere cu microunde, sinteza Hitrotermală are ca rezultat o nucleare omogenă într-un timp foarte scurt, nuclearea și creșterea au loc simultan, ceea ce duce la cristale mici de HAp, cu dimensiuni uniforme, acest lucru se observă în figurile 2.4 a și b. Când temperatura de reacție a fost de până la 140 °C timp de 1 min, morfologiile probei s-au schimbat într-o tijă asemănătoare prismei, cu secțiune hexagonală regulată (c). Mărirea timpului de reacție de la 1 min la 30 min la o temperatură constantă de 140 °C, a dus la o morfologie a nanoparticulelor de tip prismă bine dispersată, cu capete relativ ascuțite (d). La temperatura de reacție de 140 °C, nuclearea și creșterea concurează dinamic datorită oscilației rapide a ionilor în soluție, doar o parte din nucleele fosfatului de calciu ar putea supraviețui pentru a crește în cristale HAp mai mari cu morfologii regulate (Fig 2.4.c). Procesul de cristalizare s-a desfășurat foarte rapid în această etapă. Prelungind timpul de reacție la 140 °C, creșterea cristalelor a progresat continuu prin precipitarea de Ca2+, PO43- și OH- pe cristalele de HAp formate inițial, în cele din urmă, s-au format unele particule de prismă plafonată (Fig 2.4.d) [134].

Liang An și colab.[133] au obținut în urma procesului hidrotermal particule cu morfologie de tip nanobenzi. Efectele timpului de reacție hidrotermală asupra formarea nanobeltelor HAp au fost cercetate prin variația timpul de reacție de la 0 și 24 h cu temperatura hidrotermică fixată la 200 °C și valoarea pH-ului soluției Na2HPO4 fixat la 11.5 în timpul procesului de preparare a HAp.

Fig.2.5.a prezintă imaginea SEM a probei înainte de reacția hidrotermică. În acest caz nu se pot observa nanobelete. Când timpul de reacție este de 0,5 ore (Fig. 2.5.b), în afară de nanorode și nanofoițe, se pot observa câteva nanobenzi. Extinderea timpului de reacție la 2 ore (Fig.2.5.c), duce la transformarea nanorodurile și nanosheet-urile în nanobelete, fiecare de aproximativ 0,3–1,0 μm lungime și 30–100 nm lățime. Când timpul de reacție atinge 4 ore, dimensiunea nanobeletele nu au avut nici o schimbare semnificativă, dar prezintă o morfologie uniformă, separată. Prin creșterea timpul de reacție până la 8 ore, nanobeletele au atins o dimensiune mai mare. Când extindem timpul de reacție mai mult nu se pot observa modificări morfologice semnificative [133].

Fig.2.5 Imagini SEM ale probelor de HAp preparate la diferite intervale de timp prin metoda hidrotermală (a) 0 h, (b) 0,5 h, (c) 2 h, (d) 4 h, (e) 12 h și (f) 24 h [133].

2.1.2 HAp dopat cu Zn

Montoya-Cisneros și colaboratorii [135] au sintetizat hidroxiapatită dopată cu un conținut de Zn de 2, 4 și 6% procente molare prin tratament Hidrotermal asistat cu microunde, la 150șC timp de 1 oră. Nanoparticulele Zn@HAp au fost caracterizate prin difracție de raze X, spectroscopie FTIR și microscopie cu electroni de transmisie. Autorii au obținut cu succes particule fine de Zn@HAp conținând 2, 4 și 6 mol% Zn la 150șC timp de 1 oră, însă nu a fost posibilă incorporarea întregii cantități de Zn în structura HAp. Deși procesul hidrotermal asistat cu microunde a furnizat nuclearea rapidă a particulelor de Zn@HAp în suspensia coloidală precursoare în timpul scurt de reacție de 1 h, Zn(OH)2 hidrolizat a afectat nivelul de suprasaturare a solutului din lichidul hidrotermic, împiedicând precipitarea conținutului nominal de Zn în etapa de cristalizare [135].

Fig 2.6 (a)Difractogramele XRD ale probelor de Zn@HA, preparate de către Montoya-Cisneros și colab., prin metoda Hidrotermală asistată cu câmp de microunde la 150 șC timp de 1 oră. Graficele Rafinării Rietveld ale particulelor de Zn@HAp conținând (b)1,4, (c)3,6 și (d)5,3 mol% de Zn [135].

Tabel 2.2 Caracteristicile chimice și fizice ale particulelor de Zn@HA preparate cu concentrație diferită de Zn2+ de către K.L. Montoya-Cisneros și colab., prin sinteza Hidrotermală asistată de microunde la 150 șC timp de 1 oră [135].

Notă:

a Formula chimică a probelor a fost calculată din conținutul de Ca, Zn și P determinat prin ICP-AES și OH- a fost calculată prin balanța de încărcare.

bValoarea obținută folosind metoda Rietveld [135].

Rafinările Rietveld prezentate în Fig 2.6.b-d au fost calculate luând în considerare faptul că conținutul total de Zn în structura HAp a fost încorporat în Situri de Ca (II), așa cum se sugerează în literatură. Abordarea de rafinare selectată a furnizat cele mai mici valori ale factorului de bun de potrivire (GOF / χ2), care au fost sub 1,0 (tabelul 2.2), indicând exactitatea corectă a rafinării efectuate în acest studiu. În schimb, folosind o a doua abordare de rafinament, concentrațiile echimolare de Zn localizate atât la Ca (I) cât și în siturile de Ca (II) au fost luate în considerare, acest lucru a dus la o diferență marcată între modelele experimentale și cele calculate, demonstrată de o variație considerabilă în linia de referință reziduală și o valoare mare a GOF (7,0%), ceea ce indică o adaptare slabă a acestui rafinament [135].

Modelele de difracție au fost indexate cu structura hexagonală a HAp (JCPDS nr. 09-432). S-a observat o ușoară scădere a intensității și lărgirea benzii de difracție odată cu creșterea conținutului de Zn încorporat în structura HAp (Fig.2.6 a), ceea ce a promovat tulburarea structurală și reducerea dimensiunii cristalitului (tabelul 2.2). Substituția parțială a Ca cu Zn a provocat o scădere a parametrilor de rețea Zn@HAp până la un conținut de Zn de 3,65 mol%. Această tendință s-a produs din cauza diferenței dintre raza atomică a Zn (0,74 Å) și a Ca (0,99 Å). Cu toate acestea, o creștere a „a0” a avut loc când s-a încorporat 5,3 mol% de Zn. Acest fenomen ar putea fi atribuit variațiilor lungimii legăturii OH- în structura HAp. Analizele Rietveld au indicat că încorporarea a 3,42% mol Zn a dus la o extindere a lungimii legăturii O-H până la 2,5613 Å, care este mai mare decât cea găsită în HAp pur (2.3945 Å). În schimb, s-a obținut o reducere a lungimii legăturii O-H (2.476 Å) atunci când conținutul de Zn a fost crescut până la 5,3 mol% [135].

Fig.2.7 Spectrele FTIR ale probei de HAp și Zn@HA sintetizate de către Montoya-Cisneros și colab., la 150șC timp de 1 h: (a) 0, (b) 1,4, (c) 3,6 și (d) 5,3 mol% de Zn [135].

Rezultatele analizelor FTIR, au ilustrat o reducere sistematică a benzii OH vibraționale la 3570 cm-1 cu creșterea conținutului de Zn în structura HAp. Prin urmare, autorii presupun că variația anormală a structurii HAp observată la un conținut de Zn de 5,3 mol%, nu s-a datorat moleculelor de apă adsorbite, așa cum s-a propus în datele de literatură, deoarece nici banda pentru apă la 1630 cm-1, nici banda vibrațională a HPO42- la 870 cm-1 nu au fost observate în analiza FTIR a probelor. S-a raportat prezența ionilor HPO42- pentru a promova adsorbția apei în structura HAp. Autorii presupun că modificarea (creșterea) parametrului „a0” la conținutul Zn peste 5 mol% să fie indusă în structura HAp din cauza unei distorsiuni localizate a ionilor OH. Această variație anormală este de acord cu rezultatele raportate în literatură. Acești autori au susținut, de asemenea, că creșterea neașteptată a „a0” se poate datora distorsiunilor celulelor de rețea induse de încorporarea de Zn peste un conținut de 10 mol% [135].

Fig 2.8 Imaginile TEM și distribuțiile mărimii particulelor de Zn@HAp care conțin (a, d) 1,4, (b, e) 3,6 și (c, d) 5,3 mol% de Zn [135].

Imaginile TEM au relevat faptul că pulberile Zn@HA obținute de către K.L. Montoya-Cisneros și colab. [135], constau din particule de dimensiuni nanometrice care prezintă o morfologie de tip tijă. O reducere a mărimii particulelor Zn@HAp a avut loc treptat (fig. a-c), iar mărimea particulelor a variat între 29-67 nm. Aceste dimensiuni de particule au fost similare valorilor lor calculate prin rafinamentul Rietveld. Scăderea dimensiunii particulelor poate apărea din cauza diferențelor în starea de suprasaturare a lichidului hidrotermic, care sunt probabil induse de conținutul de Zn, provocând formarea masivă de nuclee care împiedică dezvoltarea particulelor [135].

Željko Radovanović1 și colaboratorii [136] au studiat efectul antimicroban al ionilor de Zn2+ ce subtituie ionii de Ca2+ în HAp. Probele au fost testate pe Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa și Candida albicans în mediu lichid. HAp a fost sintetizată prin metoda Hidrotermală la 160 C timp de 3 ore, urmată de un tratament termic la 1200 C timp de 2 ore (HAp12). Cercetătorii au dopat cu 0,2 și 0,4 % Zn (procente molare). Determinarea viabilității celulelor fibroblaste MRC-5 a fost efectuată folosind două tipuri de teste in vitro, MTT și DET. În ambele teste, viabilitatea celulelor a fost explorată după 48 de ore, 72 de ore și 96 de contacte cu pulberile [136].

Tabel 2.3 Efectul antimicrobian al HAp și Hap@Zn2+ inainte (HAp) și dupa tratamentul termic (HAp12) [136].

Željko Radovanović1 și colaboratorii [136], au obținut rezultatele activității antimicrobiene a pulberilor HAp simplu și HAp dopat testate împotriva S. aureus (ATCC 25923), E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27833) și C. albicans (ATCC 24433) în tabelul de mai sus.

Gradul de reducere, R, a fost calculat comparativ cu HAp folosind ecuația:

R (%) = 100(CFUHAp–CFUZn@HAp)/CFUHAp[136]. (1)

Comparând rezultatele activității antimicrobiene a pulberilor dopate și nedopate, s-a putut concluziona că activitatea antimicrobiană a crescut odată cu conținutul din ce în ce mai mare de ioni Zn încorporați în pulberile HAp. Pulberea HAp nedopată a prezentat o activitate antimicrobiană similară împotriva tuturor speciilor de microorganisme testate, cu excepția S. aureus, care a fost mai susceptibilă. Cele mai pronunțate efecte asupra reducerii tuturor speciilor de microorganisme s-au observat folosind pulberi dopate cu Zn în urma tratamentului la 1200 °C. Probabil, motivul acestei activități superioare constă în faptul că faza TCP formată în timpul tratamentului este mai solubilă decât faza HAp [136].

Fig 2.8 Rata de supraviețuire a celulelor fibroblaste (MRC-5), testul MMT [136].

Diagrama testului MTT arată o creștere reală a viabilității celulei cu timpul de contact. Numărul celulelor în contact cu HAp și Zn (0,4) HAp12 au fost aproximativ egal, în timp ce celulele în contact cu pulberea Zn (0,2) HAp12 au avut o rată de supraviețuire ușor mai mică. După 96 de ore, celulele au arătat aceeași viabilitate ca în proba control, ceea ce înseamnă că pulberile nu au prezentat niciun efect citotoxic asupra celulelor și astfel biocompatibilitatea lor a fost demonstrată [136].

Fig.2.9 Rata de supraviețuire a celulelor fibroblaste (MRC-5), testul DET [136].

Testul DET a confirmat clar rezultatele testului MTT. Testul DET a arătat, de asemenea, o creștere treptată a viabilității celulare odată cu creșterea timpului de contact al celulelor cu pulberea. Viabilitatea este mai bună în cazul celulelor care au fost în contact cu pulberea Zn (0,4) HAp12 decât cu pulberea Zn (0,2) HAp12, acest lucru poate fi explicat prin expunerea lor la concentrații puțin mai mari de ioni Zn care, în calitate de micronutrienți, au crescut proliferarea celulelor. Diferența de compoziție a fazei între HAp nedopată și HAp dopată, este evidentă, relatându-se o proliferare mai mare a celulelor MRC-5 după 96 h în extracte de pulbere de Zn (0,2) HAp12 și Zn (0,4) HAp12 [136].

Fig 2.10 FE-SEM. Micrografii de celule MRC-5 aderate pe suprafața unui vas Petri din plastic. Celulele MRC-5 au fost în contact cu pulberi: a) HAp12, b) Zn (0,2) HAp12 și c) Zn (0,4) HAp12 [136].

Analiza histologică a celulelor MRC-5 care au aderat la suprafața vasului Petri este prezentată în figura de mai sus. Forma celulelor este ovală și alungită. S-a remarcat că extensiile citoplasmatice au fost răspândite din celulele care se conectează la celulele fibroblaste vecine. Aspectul celulelor este un indiciu al viabilității lor. Acest test a confirmat rezultatele obținute prin testele MTT și DET.

H. Begam și colab. [137] au demonstrat efectul antibacterian pentru HAP@Zn. Diametrul zonei de inhibiție a fost mai mare în cazul probelor de HAp dopate cu Zn în contact cu bacteria gram-pozitivă (S. aureus). S-a format o zonă de inhibiție și în cazul bacteriei gram-negative (E. coli). HAP pur (100%) nu a arătat nicio activitate antibacteriană împotriva ambelor bacterii .Cu cât concentratia ionilor de zinc creste, creste și diametrul zonei de inhibitie, deci efectul antibacterian este mai puternic [137].

Fig.2.11 Evidentierea efectului antibacterian cu ajutorul diametrului zonei de inhibitie a ) Hap @ Zn – S.aureus ; b)Hap @ Zn – E .coli ; c)Hap simplu –ambele bacterii [137].

Tot H. Begam și colab. [137] au demonstrat viabilitatea celulelor osteoblaste MG63 în contact cu HAp@Zn utilizând microscopie cu scanare laser confocală. După 14 zile de cultură, HAp dopat a prezentat un număr mai mare de celule viabile în comparație cu HAp pur. Forma rotundă distinctă a nucleului de celulelor MG63 a fost distribuit pe toată suprafața având diametrul nucleului 14,27 ± 4,5 μm care sugerează o creștere normală a celulelor pe probă [137].

2.1.3 HAp dopată cu Ga

Mario Kurtjak și colab. [138] au publicat în anul 2016 un studiu privind doparea HAp cu ioni de Ga. Aceștia au realizat doparea de HAp prin metoda co-precipitării folosind ca materii prime azotatul de calciu, fosfatul de amoniu di bazic și azotatul de galiu [138].

Fig 2.12 Difracția cu raze X (a) HAp nedopat (b) HAp dopat cu Ga la 30 C, 600 C, 800 C , 1000 C, 1100 C și 1200 C. (*) HAp, (○) β-TCP, (♦) α-TCP, (●) din Ga ( III) , (∆)Ga2O3 și triunghiuri negre (▼) GaPO4 [138].

Tabel 2.4 Caracteristicile compoziției, suprafeței și caracteristicile termice ale HAp și HAp@Ga[138].

Analiza XRD a arătat că apatitele care conțin Ga (III) conțin o singură fază cristalină care a fost identificat ca hidroxiapatită hexagonală (referință PDF numărul 01-089-6438). În comparație cu HAp, maximele de difracție ale HAp@Ga sunt mult mai largi. Aceasta poate fi fie o indicație a unui cristalit de dimensiuni reduse datorită inerenței ionilor Ga3+ asupra creșterii cristalelor de apatită sau consecința unei modificări a structurii apatitului prin încorporarea ionilor Ga3+ [138].

Fig 2.13 Caracteristicile termice (curbele TGA și DSC) ale (a) HAp și (b) HAp@Ga [138].

Analizele DSC și XRD au fost utilizate pentru monitorizarea descompunerii și transformării în fază a apatitelor conținând Ga (III) și a celor pure. HAp pur a prezentat transformările tipice ale hidroxiapatitei: pierderea de apa adsorbită la 200 °C, pierderea apei structurale la 600 °C, transformarea HAp în β-TCP la 800 C, transformarea a β-TCP la α-TCP la 1100 C și conversia α-TCP în α0-TCP la 1400°C. Analiza XRD de temperatură înaltă (HT) a hidroxiapatitei pure a confirmat transformarea sa în β -TCP peste 800 C și transformarea ulterioară a β -TCP la α -TCP peste 1100°C, astfel încât la 1200°C au fost prezenți atât HAp cât și α –TCP [138].

În cazul apatitelor care conțin Ga (III) transformarea a trecut de la apatit la Ga (III) -dopat β -TCP (β -TCP (Ga)). HAp (Ga) a început transformarea în β -TCP (Ga) la 600°C. În difractograma analizei XRD maximul interferenței de difracție a fazei β -TCP (Ga) formată a rămas scăzut, chiar și la temperaturi mai ridicate. Absența unor vârfuri exotermice în DSC din HAp (Ga) CP este o dovadă a nanocristalinității. Peste 1000 °C apare o cantitate mică de Ga2O3. S-a observat că β-TCP dopat de Ga, este aparent mult mai stabil termic decât β -TCP-ul non-dopat, nu s-a transformat în α-TCP și a rămas stabil la 1200 °C. Peste această temperatură, în sistemele cu un conținut mai mic de Ga3+ se transformă în alta faza (un maxim de difracție la 1400 °C) [138].

Fig 2.14 Spectrele FTIR ale HAp (a) și (b) HAp@Ga [138].

În comparatie cu HAp pură, spectrele FTIR ale HAp (Ga) prezintă o scădere a structurii benzilor corespunzătoare vibrațiilor ionilor PO43- (960–1100 cm-1 și 560–630 cm-1), o bandă coborâtă a vibrațiilor OH (la 3573 cm-1) și vibrații O – H ( la 3700 la 2500 cm-1). S-au calculat factorii de divizare pentru P-O asimetric, s-au obținut valori similare pentru probele HAp (Ga) și HAp simplu. Aceste rezultate pot fi explicate prin adsorbția de Ga3+ pe suprafața structurii de apatit care inhibă vibrațiile OH de suprafață și tulburarea părții exterioare a cristalelor de apatită datorită încorporarii ionilor Ga3+, lărgește banda OH și micșorează înălțimea, ca parte a schimbării ionilor OH de la ordonat la dezordonat, în timp ce cristalinitatea parții interne fără ioni Ga3+ este bine păstrată. În plus, un raport C / P mai mic (calculat pe înălțimile benzii CO32- la 1422 cm-1 și banda PO43- la 1035 cm-1) a fost observat pentru HAp (Ga) în comparație cu HAp-ul simplu [138].

Fig 2.15 Caracteristicile morfologice ale probei HAp@Ga: (a)SEM, insert EDAX (b)TEM, insert SAED și HR-TEM [138].

Morfologia particulelor de HAp dopată cu ioni de Ga este de tip nanoplăci cu lungimi de 30 nm și lățimi de 10 nm. Analizele EDS au confirmat prezența galiu și distribuția sa uniformă. Analiza SAED a confirmat că probele de HAp ce conțin GA sunt structuri cristaline local similare cu HAp pură și nu dezvăluie nicio denaturare care ar putea fi atribuită încorporării ionilor Ga3+ în structura apatitului [138].

Fig 2.16 31P Spectrele RMN MAS ale (a) HAp și (b) HAp@Ga [138].

Analiza RMN a furnizat date și mai precise cu privire la structura HAp și la încorporarea acestor ioni de Ga3+. S-a observat un vârf îngust la 3 ppm, care provine din ionii de fosfat apatitic și un vârf larg dedesubt cu aproximativ același centru (ușor în sus) provenit din PO43 și HPO4 [138].

Deoarece proba HAp(Ga) este nanocristalină cu particule (raport mai mare suprafață-volum), semnalul larg al stratului de suprafață este mult mare. Încorporarea ionilor Ga3+ în stratul de suprafață dezordonat duce la o schimbare chimică a semnalului larg, astfel încât toate probele HAp (Ga) conțin un vârf larg suplimentar. Acest vârf este centrat la 0,7 ppm pentru HAp(Ga) și crește dacă crește și concentrația ionilor de Ga. HAp nanocristalin (Ga) prezintă un semnal puternic al apei și un semnal OH neintensiv. Autorii au dovedit că ionii Ga3+ sunt localizați în stratul de suprafață dezordonat, mai degrabă decât în miezul cristalin apatitic [138].

Fig 2.17 Diametrul zonei de inhibiție.Test antibacterian împotriva P. aeruginosa din (a) HAp (b) HAp@Ga [138].

Activitatea antibacteriană a hidroxiapatitelor dopate de galiu a fost evaluat cu tulpina P. aeruginosa MW1. Proba de HAp nedopată nu a prezentat modificări, nu a creat un diametru de inhibiție fapt ce sugerează faptul că HAp nedopată nu are efect antibacterian. În cazul probei HAp@Ga s-a observat crearea unei zone de inhibiție. Autorii au relatat de asemenea că diametrul zonei de inhibiție crește cu concentrația ionilor de Ga [138].

Fig 2.18 Viabilitatea celulelor fibroblastele L929 in contact cu HAp și HAp dopat cu diferite concentrații de Ga [138].

Autorii au demonstrat că viabilitatea celulelor scade odată cu creșterea concentrației de ioni de Ga din dopaj cât și cu creșterea concentrației de probe. Probele HAp și HAp dopat 6% și 8% Ga au permis supraviețuirea celulelor în intervalul de concentrație 0,1-1 mg/mL. Materialul cu un conținut mai mare de Ga (16% în greutate) a fost deja toxic [138].

Viabilitatea celulară in prezența HAp dopată cu ioni de Ga (aproximativ 4% și 11% procente masice), a fost demonstrată și de P.Melnikov și colab. [83]. Aceștia au cultivat celule de maimuță VERO (ATCC-CCL81) și au efectuat un test spectrofotometric, măsurând absorbția la 540 nm. Autorii nu au observat o diferență semnificativă statistic între probe și control, astfel încât hidroxiapatita dopată cu galiu poate fi caracterizată ca un material compatibil biologic la concentrația ionilor de Ga până în 11% [83].

2.1.4 Caracterizarea GO

Cercetătorii Hassan Nosrati și colab. [45] au investigat formarea în situ a grafen-hidroxiapatitei tridimensionale folosind oxid de grafen, nitrat de calciu tetrahidrat și soluții de fosfat de diamamoniu. Pulberea de HAp a fost sintetizată utilizând metoda de sinteză Hidrotermală la 180 °C , timp de 6 ore, 2,2 MPa, pH 11 [45].

Fig 2.19 Imagini SEM ale GO (a) oxid de grafenă, HG-0 (b) HAp simplu, HG-3 (c și d) HAp +oxid de grafenă 1.5 % procente masice [45].

Fig 2.19 ilustrează imaginile SEM ale probelor create folosind metoda hidrotermală. În Fig.3.12.a, rGO nanofoița este foarte subțire, cu unele plieri. Morfologia nHAp este prezentată în Fig.3.12.b cu orientarea preferată de creștere a axei c a nano-tuburilor de HAp hexagonală cu o lungime medie 15 µm. Acest lucru este similar cu HAp natural în os și smalț. Compozitul HG-3 este prezentat în Fig.3.12.c și d rGO este ondulat pe nHAp, formând structuri uniforme și netede de suprafață. Fig.3.12.d reprezintă o imagine SEM de înaltă rezoluție a unui nHAp individual cu rGO (suprafață încrețită ) [45].

Fig.2.20 Difractograme ale GO (a) oxid de grafenă, HG-0 (b) Hap simplu, HG-3 (c și d) Hap +oxid de grafenă 1.5 %[45].

Fig 2.21 Spetre Raman ale GO (a), HA-Go1.5% înainte de sinterizare(BS) (b) și HA-Go1.5% după sinterizare (AS) (c) [45].

Difractogramele XRD (Fig 2.21) pentru GO prezintă maxime de difracție centrate la 9.85 și 24,72 și 43,54. Modelul XRD pentru GO arată un maxim de difracție intens și ascuțit la 2h = 9,85 care este atribuit planului (001), care corespunde unei distanțe interplanare d de 0,83 nm. Aceasta este în concordanță cu structura lamelară a GO. Comparativ, difractograma rGO arată dispariția acestui maxim puternic și apariția unui maxim lat (002) la 24,85, ceea ce corespunde unei distanțe d de 0,35 nm, ceea ce indică reducerea cu succes a GO. Difractogramele c și d corespund HG-0 și HG-3. Maximele majore corespund hidroxiapatitei (JCPDS PDF 09-0432) care conține interferențe de difracție ascuțite și cu valori ridicate ale intensității datorită gradului ridicat de cristalinitate. Se remarcă 2 faze ale HAp (-TCP și a-TCP). Cele două vârfuri ale -TCP (JCPDS PDF 070-2065) apar la 2h = 27.77 și 2h = 31.02 sunt absente după amestecarea cu GO, în timp ce al treilea vârf este cel mai înalt la 2h = 34,33 și se suprapune cu vârful de HG-0 (2h = 34,3). Pe de altă parte, cele mai mari vârfuri ale -TCP (JCPDS PDF 029-0359) la 2h = 30,71 sunt absente și a doua și a treia maximă (2h=28,89 și 2h=34,21) se suprapun cu vârfurile de HG-0 (2h = 28,93 și 2h = 34.3) [45].

Peizhen Duan și colab.[139] au obținut sfere de hidroxiapatită poroasă (SHA) și oxid de grafenă (GO) cu un conținut diferit de GO (procente masice) de 16%, 40% și 71% , printr-o metodă facilă și controlabilă cu asistată cu ultrasunete la temperatura camerei. Rezultatele au arătat că SHA au fost acoperit de GO, iar compozitele SHA / GO au avut o suprafață neregulată cu diferite grade de denivelări. Modulul elastic și duritatea compozitelor SHA / GO au fost de până la 12,45 ± 0,33 GPa și 686,67 ± 26,95 MPa, ceea ce a indicat că conținutul GO a avut efect asupra compozitelor SHA / GO. Și proprietățile mecanice ale compozitelor SHA / GO au fost similare cu particulele SHA. Mineralizarea biomimetică în soluția SBF a arătat că stratul de apatit este asemănător osului, ceea ce a demonstrat că materialele SHA / GO au proprietatea de osseointegrare. Mai mult, citocompatibilitatea in vitro a compozitelor SHA / GO și GO pur au fost evaluate prin testele de adeziune și proliferare celulară folosind celule MC3T3-E1,ceea ce a demonstrat că probele SHA / GO pot favoriza creșterea și adeziunea celulară [139].

Fig 2.22 Testele MTT pentru proliferarea celulelor MC3T3-E1 pe GO pur, SHA / GO-2 și proba control, celulele au fost cultivate timp de 1, 3, 5 zile în aceeași condiție de cultură. (Barele de eroare reprezintă abaterea standard de la media ± deviație standard, n = 3: *** p <0,001) [139].

2.1.5 Compozite Colagen – HAp

Alina Sionkowska și Justyna Kozłowska [140] au studiat un material compozit obținut prin tehnica Liofilizării, pe bază de HAp comercial și colagen izolat din tendoanele animalelor. Pulberea de HAp a fost amestecată cu colagenul în raport masic HAp/Col: 80/20 și 50/50. Amestecurile HAp / Col au fost introduse într-un recipient de polistiren și apoi au fost supuse la -22 ° C. Amestecurile s-au uscat prin liofilizare la -20 ° C și 100 Pa timp de 48 ore [140].

Fig.2.23 Materialul compozit format din HAp și Col în urma procesului de Liofilizare [140].

Fig 2.24 Spectrele FTIR ale probelor de HAp, Col ,HAp/Col [140].

Tabel 2.5 Alocările frecvențelor vibraționale observate pentru HAp și colagen [140].

Spectrul probei compozitului HAp / Col este caracterizat prin benzi de absorbție rezultate din HAp și colagen. S-au observat benzi tipice pentru colagen, cum ar fi N-H care se întinde la 3305 cm-1 pentru amida A, C – H care se întinde la 3081 cm cm-1 pentru amida B, CO întinzându-se la 1635 cm-1 pentru amida I și deformarea N – H la ± 1545 cm-1 pentru amida II. Benzi fosfat ce demonstrează prezența HAp există între 900 și 1200 cm-1 în spectre IR. În spectrul HAp se poate găsi benzi tipice de vibrații de întindere a grupărilor fosfat la 1025 și 1047 cm-1. Există, de asemenea, benzi CO3 situate la 1445, 1414 și 876 cm-1. Mai mult, între 450 și 670 cm-1 se gasesc benzile de PO43-. În spectrul FTIR HAp / Col s-a observat o deplasare a benzii corespunzătoare –COO- care se întinde la un număr de undă mai mic. Acest fapt sugerează formarea unei noi legături chimice între ioni Ca2+ de pe suprafața HAp și -COO- de pe suprafața de colagen. În acest studiu, analiza ATR-IR realizată de autori nu a indicat nicio modificare a modului de vibrație Col pentru niciunul dintre raporturile HAp / Col utilizate (tabelul de mai sus) [140].

Fig 2.25 Imagini SEM ale probei de Col, x100 [140].

Fig 2.26 Imagini SEM ale compozitelor HAp / Col: (a) 50/50, × 100, (b) 50/50, × 500, (c) 80/20, × 100, (d) 80/20, × 500 [140].

Morfologiile poroase ale bureților compoziti au fost studiate prin microscopie electronică de baleaj. S-a observat o macroporozitate complet interconectată în cazul probelor de HAp / Col. Porii prezintă o morfologie neregulată, mărimile lor variază de la câțiva microni la aproximativ 500µm. Microstructura compozitului dezvăluie o matrice de colagen fibroasă poroasă încorporată cu particule relativ mari de HAp [140].

Fig 2.27 Curba TG a HAp [140].

Fig. 2.28 Curbele TG și DTG ale probei de colagen și ale compozitelor HAp / Col [140].

Tabel 2.6 Parametrii termici ai HAp, colagen și compozitelor HAp / Col [140].

Din curbele TG autorii au determinat scăderea masei în timpul procesului de încălzire. Temperatura vitezei maxime a procesului (Tmax) a fost determinată din maximul pe curba DTG (Tabel 2.6). Pentru HAp s-a inregistrat o pierdere în greutate de la temperatura camerei până la 130 ° C de 0,5%, probabil din cauza evaporării apei adsorbite. În intervalul 130–600 °C, s-a inregistrat o pierdere în greutate de 0,9% din cauza descompunerii HAp. În curba DTG caracteristică pentru colagen se pot observa două vârfuri. Aceste vârfuri sunt reprezentative pentru distrugerea probei în două etape din cauza temperaturii. Prima etapă (între 25 și 150 °C) este legată de evaporarea apei absorbite de colagen. În cea de-a doua etapă (între 250 și 500°C), apa este legată de colagen și se eliberează mici produse moleculare de degradare termică a colagenului. Pentru amestecurile HAp / Col cu raportul de masă 50/50 am observat că pierderea de apă absorbită și pierderea în greutate pentru a doua etapă sunt mult mai mici decât pentru colagenul pur. Pentru HAp / Col cu raportul de masă 80/20, am observat trei vârfuri pe curba DTG.

Al doilea vârf pe curba DTG apare cu un maxim la 290 °C și este însoțit de o scădere semnificativă a masei de 8,1%. Al treilea vârf pe curba DTG apare cu un maxim la 397 °C, iar pierderea în greutate a acestui proces este de 9,5%. Prezența a trei vârfuri pe curba DTG pentru HAp / Col cu raport masic 80/20 în loc de două vârfuri cum s-a observat în cazul HAp / Col cu raportul 50/50 și a colagenului pur sugerează că lanțurile de colagen au fost încorporat cu HAp în mai multe complexe cu diferite stabilități termice. Există multe posibilități de a forma o structura 3D prin mai multe lanțuri lungi de colagen și o cantitate imensă de nanohidroxiapatită (80% în compozit) [140].

T.W. Sun și colab.[141] au studiat proprietățile mecanice relativ slabe ale schaffold-urilor poroase din compozit HAp / Col. Materialele cu structură 3D au fost obținute în urma proceselor de liofilizare. Temperatura de inghetare a fost aleasă în jur de -20°C [141].

Fig. 2.29 Proprietățile mecanice ale scaffold-urilor HAp / Col cu cantități de HAp diferite și Col pur (a) Curbe de solicitare-stres; (b) Modulul young [141].

Proprietățile mecanice ale materialelor au efecte mari asupra reparației și reconstrucției defectelor osoase. Probele HANRs (HAp nanotije) / Col cu un conținut HANRs mai mare de 70% în greutate prezintă proprietăți mecanice foarte slabe și nu pot fi utilizate pentru teste compresive. Probele UHANW (HAp nanofire) / Col cu un conșinut de UHANWs până la 100% în greutate pot fi preparate cu ușurință și prezintă proprietăți mecanice relativ bune. Din Fig.2.29.b, se poate observa că modulul Young al schaffold-urilor UHANWs / Col crește semnificativ odată cu creșterea conținutului UHANWs cuprins între 0 și 70% în greutate și atinge valoarea maximă de 191,9 ± 7,2 kPa la o fracțiune în greutate UHANWs 70% în greutate, care este de aproximativ 4 ori mai mare decât a schelei de colagen pur (15,0 ± 2,3 kPa). Odată cu creșterea suplimentară în greutate a UHANW-urilor, modulul Young pentru UHANWs / Col scade rapid. Mai important, schela poroasă anorganică UHANW preparată în absența colagenului prezintă, de asemenea, proprietăți mecanice relativ bune, iar modulul lui Young este de 13,6 ± 2,1 kPa. În comparație cu schela pură de colagen, modulul Young al schelelor HANRs / Col prezintă o tendință descendentă accentuată cu procentele masice de HANRs cuprinse între 0 și 70% în greutate. În plus, schela de 70% în greutate UHANWs / Col prezintă o proprietate mecanică excelentă, iar modulul lui Young este de aproximativ 63 de ori decât cea a schelei 70% în greutate HANRs / Col (0,99 ± 0,02 kPa). Aceste rezultate experimentale demonstrează că UHANW-urile așa cum sunt pregătite sunt materiale de întărire promițătoare și pot îmbunătăți semnificativ proprietățile mecanice ale schelelor UHANWs / Col. Dacă procentul de UHANWs crește la peste 70% în greutate, proprietățile mecanice ale schelelor scad rapid, ceea ce indică faptul că matricea de colagen joacă un rol important în proprietățile mecanice ale schelelor UHANWs / Col [141].

2.2 STUDIU DE CAZ PRACTIC

2.2.1 Metode de obținere

Obținerea pulberii de HAp simplu și HAp substituit.

În această lucrare s-a obținut HAp prin metoda Hidrotermală asistată cu câmp de microunde, utilizând precursorul de calciu: Ca(NO3)2 (Sigma-Aldrich 99,9 %), precursorul fosfat NH4H2PO4 (Sigma-Aldrich 99%), iar pentru probele dopate și co-dopate s-a utilizat precursorul de galiu Ga(NO3)3 (Sigma-Aldrich 99%) și precursorul de zinc Zn(NO3)2 (Sigma-Aldrich 99%). Pentru solubilizarea precursorilor s-a utilizat apă distilată.

În dozarea materiei prime s-a luat în considerare raportul stoechiometric Ca/P =1,667 , procente molare 3% și 6 % dopant , astfel că s-au obținut 6 probe: Hap simplu , Hap@ 3% Zn , Hap @ 3% Ga, Hap @ 6% Zn, Hap @ 6% Ga, Hap @ 6% Zn – @6% Ga.

pH-ul soluțiilor a fost ajustat la 10 (folosind soluție amoniacală), presiunea din incinta instalației Hidrotermale a fost setată la 16 bar, temperatura a fost de 200 °C, iar timpul de reacție a fost de 35 de minute.Aparatul utilizat în sinteză a fost Synthwave.

Fig.2.30 Schema obținerii HAp prin metoda hidrotermală asistată cu câmp de microunde

Obținerea oxidului de Grafenă

GO a fost obținut prin metoda lui Hummer. Astfel, 20 g de grafit plasat anterior au fost amestecate cu o soluție de H2SO4 concentrat (60 ml), K2S2O8 (10 g) și P2O5 (10 g) la 80 °C. Amestecul a fost apoi lăsat să se răcească la temperatura camerei după care a fost diluat cu o cantitate mare de apă, filtrat și spălat până când filtratul a atins un pH neutru. Pulberea obținută a fost uscată timp de 24 de ore la 80 °C. S-au adăugat 20 grame de grafit preoxidat peste 460 ml H2SO4 concentrat și amestecul a fost amestecat într-un pahar Berzelius în baie de gheață (T<5 °C). La acest amestec s-au adăugat încet 60 g de KMnO4. După câteva minute, paharul Berzelius a ieșit din baia de gheață și a fost plasat pe o placă de agitare magnetică la 35 °C timp de 2 ore. După încălzire peste amestec, s-au adăugat 920 ml de H2O distilat și peste 15 minute s-a oprit reacția prin adăugarea unei cantități mari de H2O distilată și 30% H2O2. Amestecul rezultat a fost decantat, filtrat și spălat cu HCl 5% și H2O distilat până când s-a obținut un pH neutru. Pulberea obținută a fost uscată în aer la 60 °C timp de 24 ore.

Fig.2.31 Schema obținerii oxidului de grafenă (GO).

Obținerea materialului compozit

Pentru a obține materialul compozit, s-au mojarat pulberile de HAp și HAp dopat , fiecare pulbere s-a amestecat în raport masic de 50:50 cu colagenul adăugându-se 1,5 % Oxid de Grafenă din masa de HAp+Colagen. Această etapă s-a efectuat sub agitare magnetică. Pentru reticularea colagenului s-a folosit Glutaraldehidă. Materialul obținut a fost supus unui proces de liofilizare.

Fig.2.32 Schema obținerii materialelor alcătuite din HAp dopată, Col și GO.

2.2.2 Metode de caracterizare

Deoarece materialele analizate în studiul de caz teoretic prezintă proprietăți remarcabile, în această lucrare se încearcă studierea unor materiale formate din toate componentele descrise în sub-capitolul anterior (HAp dopată, Col, GO).

Se poate anticipa că materialele compozite obținute vor prezenta proprietăți superioare componentelor de bază, atât din punct de vedere biologic cât și structural. Pentru a demonstra îmbunătățirea proprietăților s-au utilizat o serie de metode performante de caracterizare.

Difracția de raze X ( XRD)

Pentru a determina gradul de cristalinitate, dimensiunea de cristalit, modalitatea de cristalizare și pentru a identifica fazele probelor s-a utilizat analiza XRD. Probele au fost analizate folosind un echipament PANalytical Empyrean (de la Malvern PANalytical, Bruno, Nederland) în geometria Bragg – Brentano, echipat cu tub cu raze X cu anod de Cu (CuK = 1.541874 Å). Difractograma de raze X (XRD) a fost achiziționată în intervalul 2theta cuprins între 5–80°, cu un pas de achiziție de 0,02° și un timp de achiziție de 100 s pe pas.

Radiatia X caracteristică se obține cu ajutorul tubului de raze X. Principalele component ale unui tub de raze X sunt: o sursă de electroni, constituita dintr-un filament (Wolfram), un sistem de focalizare a electronilor, un anod dintr-un metal pur (Cu, Cr, Co, Mo, Fe, Ag, etc.). Tot acest ansamblu este montat într-o incinta cu vid înalt, în jur de 10-6 Torr (1Torr=1mmHg, 760 Torr= 1atm = 1,0139*105 Pascali) [142].

Electronii emiși de filament (catod) și accelerați spre anod, bombardează anodul cu viteze foarte mari și își pierd energia sub forma de căldura ți raze X [142].

Pentru a obține radiație monocromatică, radiația emisă de filament este filtrată, apoi colimată în scopul formării unui fascicul convergent care ulterior este direcționat către proba de analiza. În urma interacției radiației cu proba, rețeaua cristalografică a probei determină difracția radiației. Efectul de difracție caracteristic probei investigate, se formează prin interferarea pozitivă a difracțiilor individuale ale tuturor atomilor rețelei cristalografice [142].

Legea lui Bragg n=2dsinϴ realizează legătura dintre lungimea de undă caracteristică radiației electromagnetice (, numărul întreg pozitiv n, dinstanța interplanară (d), unghiul theta (unghiul sub care radiația X interacționează cu planele probei). Echipamentul cuprinde un detector care inregistrează radiațiile difractate. Impulsurile detectorului sunt preluate de către Programul de Achiziție a datelor, acesta aplică modelul matematic al transformatei Fourier, asigurând conversia și amplificarea impulsurilor. Impulsurile sunt afișate sub formă de difractograme [143].

Spectroscopie în infraroșu cu transformata Fourier ( FTIR)

Pentru a observa legăturile chimice și grupările funcționale din probele realizate și pentru a demonstra obținerea HAp, s-au efectuat analize de spectroscopie în infraroșu cu transformata Fourier (FTIR). Pentru acestă analiză s-a utilizat Spectofotometrul Nicolet™ iS50 FTIR. Măsurătorile s-au efectuat în intervalul 4000 and 400 cm-1, la temperatura camerei, utilizând modulul de reflexie totala atenuată (ATR) și 32 de scanări ale probei la o rezoluție de 4 cm-1.

Când radiația IR interacționează cu proba, o parte din radiație este absorbită de către moleculele probei și apar vibrații specifice unei grupări funcționale /legături chimice .Semnalul rezultat al detectorului este un spectru reprezentând o „amprentă” moleculară a probei. Utilitatea spectroscopiei cu infraroșu apare deoarece structuri chimice diferite (molecule) produc amprente spectrale diferite.[144]

Spectroscopie Raman

Spectrele Raman, prezentate în acest studiu, au fost realizate cu un instrument LabRAM HR Evolution (din Horiba, Longjumeau, Franța), folosind un LASER de 633 nm, filtru 100% ND. Timpul de achiziție a fost de 10s și numărul de suprapuneri (acumulări) a fost de 10. Spectrul a fost achiziționat în intervalul 100-1200 cm-1 cu ajutorul obiectivului 50x și un gratting de 600gr / mm.

Radiatia monocromatica incidenta unei molecule, poate suferi cateva tipuri de imprastiere: Rayleigh (elastica) – unde energia fotonului ramane aceeasi; Raman (neelastica) – unde energia fotonului poate creste (anti-Stokes) sau poate descreste (Stokes). Schimbarea in energie poate fi stocata sau eliberata prin miscare vibrationala. Împrăștierea Raman are loc cu o probabilitate mult mai mica (de ~107 ori mai putin) decat cea Rayleigh . Schimbările in energiea fotonilor sunt masurate ca deplasari de frecventa si raportate ca numar de unda (cm-1) pentru simplificare. Radiația Raman imprastiată depinde de starile vibrationale ale moleculelor, furnizand o “amprenta” a probei analizate [145].

Spectrometrie de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS)

Spectrometria de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS) este o tehnologie de analiză elementară capabilă să detecteze cea mai mare parte a tabelului periodic al elementelor la nivel de miligram până la nanogram pe litru. Este utilizat într-o varietate de industrii precum: monitorizarea mediului, analiza geochimică, metalurgie, analiză farmaceutică și cercetare. Această analiză utilizează o sursă de ionizare care descompune complet o probă în elementele sale constitutive și transformă acele elemente în ioni. De obicei sursa este compusă dintr-un gaz, de exemplu argon, iar energia este „cuplată” cu acesta folosind o bobină de inducție pentru a forma plasma [146].

Concentrațiile de Zn și Ga au fost determinate prin utilizarea unui echipament de spectrometrie de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS) Agilent 8800 (Agilent Technologies, Japonia). Măsurătorile la ICP-MS au fost efectuate pentru ~10 mg probă, cantitățile exacte fiind specificate în Tabel. Probele au fost dizolvate în 100 μl HNO₃, prin ultrasonare timp de 30 minute la temperatura camerei. Soluțiile obținute au fost aduse la semn în baloane cotate de 100 ml, ulterior realizându-se o diluție 1:100 cu apă ultrapură. Cuantificarea rezultatelor s-a făcut prin metoda calibrării externe, folosind o soluție standard muli-element 100 µg/ml, din care s-au preparat punctele curbei de calibrare pentru fiecare element în parte. Curbele de calibrare pentru toți izotopii vizați au fost liniare în intervalul 1- 100 µg/l, cu coeficienți de corelație R>0.99. Limitele de detecție ale echipamentului precum și coeficienții de corelație sunt specificați pentru fiecare element în tabelul de mai jos. Concentrațiile citite la ICP-MS sunt exprimate în μg/L (ppb) și eu fost transformate în μg/mg folosind Ecuația:

unde,





2.2.3 Rezultate

Fig 2.33 Spectrele Raman ale probelor de HAp simplu, HAp dopat și HAp co-dopat, obținute în laborator.

În urma acestei analize (Fig 2.33) se poate observa prezența grupării fosfat la numerele de undă 431, 589, 960 și 1046 cm-1 în toate spectrele corespunzătoare probelor. Apariția grupărilor fosfat demonstreză faptul că proba este hidroxiapatită. Nu se observă interferențe ce pot fi atribuite altor impurități.

Se pot observa valori ale intensității mai mari în cazul probelor HAp@Zn, datorate cel mai probabil distorsiunilor din rețeaua HAp în urma substituției ionilor de Ca în situsul Ⅱ de către ionii de Zn. În cazul probelor ce conțin Ga nu se observă modificări ale intensității .

Fig 2.34 Spectrul Raman al oxidului de grafenă (GO).

În figura de mai sus putem observa vibrațiile caracteristice GO la numere de undă 1356 și 1592 cm-1 . Banda D din oxidul de grafenă este observată la 1356 cm-1, în timp ce banda G se observă la 1592 cm-1. Banda G este legată de împrăștierea de primă ordine a modului E2g observată pentru domeniile de carbon sp2, iar banda D este asociată cu defecte structurale, carbon amorf sau margini care pot încălca simetria și regula de selecție. Raportul între intensitatea benzii D și a benzii G, poate fi utilizat pentru a măsura gradul de dezordine. O creștere a rației intensității benzii indică o creștere a tulburării din material. În figura de mai sus nu am indentificat un raport al intensității benzii D la cea a benzi G, cea ce sugerează că structura GO este ordonată.

Fig 2.35 Difractogramele probelor de HAp simplu, HAp dopat și HAp co-dopat, obținute în laborator.

În urma analizei XRD se poate observa un grad de cristalinitate crescut al probelor HAp și HAp dopată, se pot observa indicii Miller ai HAp (fisa ASTM 01-085-7367). Sistemul de cristalizare este hexagonal. Parametrii de rețea ai celulei sunt: a = 9.4365 (Å), b= 9.4365 (Å) și c = 6.8797 (Å). Din dimensiunea lățimii la jumătatea înălțimii putem aproxima că dimensiunea de cristalit este mică. Nu s-au observat alte faze fosfatice. Putem observa valori ale intensități mai mari în cazul probelor ce conțin dopanți, mai ales în cazul probelor ce conțin Zn 3 % și Ga 3% . Gradul de cristalinitate scade cu creșterea concentrației de dopant. Acest lucru susține faptul că substituția ionilor de Ca cu ioni de Zn a avut loc. În cazul probei ce conține Ga 3%, putem observa un maxim de difracție cu indicii Miller 220, apariția acestuia poate reprezenta prezența unei alte faze. Dimensiunea de cristalit scade pentru probele ce conțin dopanți. Cea mai mică dimensiune de cristalit se observă la proba ce conține ambii dopanți, fapt ce reiese din dimensiunea lățimii la jumătatea înălțimii (FWHM).

Fig 2.36 Difracție de raze X pe pulberea de oxid de grafenă (GO).

Difractograme XRD pentru GO arată un maxim de difracție intens și ascuțit care este atribuit planului (001), specific structurii GO.

Fig 2.37 Spectrele FTIR pentru probele HAp simplu și HAp dopat cu diferite concentrații de ioni de Ga3+ și Zn2+.

În urma analizei FTIR se poate demonstra obținerea HAp, datorită vibrațiilor unor grupări specifice, înregistrate la anumite numere de undă. Prezența grupării PO4 apatit se remarcă la numerele de undă 1089,47; 962,29; 600,24 și 562,57 cm-1. Prezența acestei grupări este comfirmată și de Spectrul Raman. Gruparea HPO apare la 1025,34 cm-1 iar gruparea OH la 630,8 cm-1. Valoarea absorbanței creste pentru probele ce conțin dopanți, se remarcă proba ce conține Ga 3% ca având cea mai mare valoare a absorbanței .Valoarea absorbanței scade pentru HAp co dopată în comparație cu HAp simplu.

Tabel 2.7 Concentrația ionilor de Zn2+ și Ga3+. Analiza ICP-MS.

În tabelul 2.7 se poate observa concentrația ionilor dopanți în proba de HAp. În cazul HAp simplu, după cum era de asteptat nu s-au identificat prezența ionilor Zn2+ și Ga3+. Concentrațiile ionilor din probe se pot observa în tabelul de mai sus.

2.2.4 Bilanț economic

Tabel 2.8 Bilanțul economic al materiei prime pentru obținerea a 20 g GO [147], [139].

Cost total materie primă: 292,2472 euro/ 20 g oxid de grafenă ( 43,83 euro pentru 3 g GO)

Angajat: 464,58 euro/ 160 ore. Timp sinteză 8 ore- 23,229 euro.

Tabel 2.9 Bilanțul economic al materiei prime necesare obținerii 100 de grame de probă HAp@6Zn@6Ga [147],[148].

Cost total de materie primă: 389,263 euro/100 g probă.

Angajat: 464,58 euro/ 160 ore. Timp sinteză 3 ore- 8,71 euro.

Colagen din piele bovină 100 g/ 333 euro [147].

Raport masic HAp: Col = 50:50

La 100 g HAp dopat am nevoie de 100 de g colagen și 3 grame de GO.

Prețul final al materialului:

43,83 + 23,229+ 333+ 389,263 +8,71= 798,032 euro

CONCLUZII

În concluzie în acestă lucrare s-a reușit obținerea de HAp dopată și co-dopată cu ioni de Zn și Ga prin metoda hidrotermală asistată în câmp de microunde. Obținerea HAp s-a demostrat prin analiza Raman și FTIR, s-a obsevat prezența grupărilor funcționale specifice HAp. Cristalinitatea probelor a fost demonstrată cu ajutorul analizei XRD. Pulberea de oxid de grafenă s-a obținut prin metoda Hummer, de asemenea obținerea GO s-a demonstrat prin analize. În final în acestă lucrare s-a obținut un material compozit pe bază de HAp dopată și co-dopată, colagen și oxid de grafenă, cu ajutorul tehnicii de liofilizare. Pentru considerente de viitor, acest material poate fi obținut cu diverse structuri și morfologii ce servesc la tratarea patologiilor osoase și a regenerării osoase într-un timp mai scurt, deoarece poate fi încărcat cu biomolecule active sau se poate încărca cu medicament. De asemenea, acest material se poate utiliza în acoperire suprafețelor implanturilor metalice ce vin în contact direct cu osul.

Materialele de colagen, obținute prin liofilizare, datorită flexibilității, formei, biocompatibilității, afinității pentru proteine și biodegradabilității, pot fi excelenți candidați pentru materiale de grefă osoasă. Prezența hidroxiapatitei generează mai multe site-uri de legare pentru aderența mai multor macromolecule de interes. Proprietățile mecanice și biologice sunt îmbunătățite în materialul compozit. Modulul lui Young al materialului compozit format din HAp și Col este de 4 ori mai mare decât al materialului format din colagen pur. Deasemenea pentru a avea proprietăți mecanice mai bune, ale materialului compozit, trebuie luată în considerare morfologia nanoparticulelor de HAp, de exemplu nanofirele de HAp sunt extrem de flexibile și se pot împleti între ele pentru a construi o structură poroasă tridimensională asemănătoare țesăturii în matricea de colagen.Materialele compozote supuse unui proces de liofilizare prezintă o structură poroasă, biocompatibilitate ridicată și o excelentă capacitate de a promova aderența și înmulțirea celulelor pe suprafața schelei. Datorită acestor avantaje, compozitele formate din HAp și colagen sunt promițătoare pentru aplicații ortopedice și dentare, pe lângă repararea defectelor osoase, sau pot fi utilizate ca suport pentru elimerarea controlată de medicament. Pentru a favoriza eficacitatea acestor materiale se poate dopa și co-dopa HAp cu ioni metalici.

Pulberile de HAp@Zn au activități antimicrobiene bune împotriva microorganismelor și bacteriilor. HAp cu un conținut mai mare de Zn au un grad mai mare de reducere a microorganismelor. Efectul antimicrobian al Zincului se atribuie parțial oxidării ionilor de Zn2+ și generării de ROS (specii reactive de oxigen care produc liza celulară), interacțiunea electrostatică între Zn2+ și peretele celular încărcat negativ dar și deteriorării pereților celulari indusă de interiorizarea ionilor de Zn în celula bacteriană. HAp@Zn prezintă o bună biocompatibilitate cu celulele osoase. Viabilitatea celulelor crește atunci când intră în contact cu HAp cu un conținut mai mare de Zn, deoarece acesta este un micronutrient esențial, implicat în aproximativ 300 de reacții enzimatice. Prezența ionilor de Zn în apatit pe lângă efectul antimicrobian, stimulează activitatea osteoblastelor și o inhibă ce cea a osteoclastelor, acest lucru face ca pulberea HAp@Zn să fie un canditat ideal în regenerarea țesutului osos.

Ionii de Zn2+ sunt mai favorabili din punct de vedere energetic petru substituirea ionilor de Ca2+ din situsul 2. Cristalinitate și stabilitatea termică a HAp este influențată semnificativ de concentrația ionilor de Zn, aceste două proprietăți scad odată cu creșterea concentrației de ioni metalici. Apar de asemenea modificări și în structura HAp deoarece există diferențe între cele două raze ionice (0,074 nm pentru ionul Zn2+ și 0,099 nm pentru Ca2+). Scăderea cristalinității hap se poate observa și în analiza XRD efectuată în strudiul de caz practic pentru proba ce conține 6% Zn. S-a relatat de asemenea, în literatură, că dopajul apatitului cu ioni de Zn2+ duce la obținerea unei suprafețe exterioare mai dure a materialului cea ce favorizează adeziunea si proliferarea celulelor osoase.

Inserția ionilor de Ga3+ în matricea Hidroxiapatitei ajută la îmbunătățirea proprietăților mecanice ale Hidroxiapatitei. Datele de literatură sugerează că ionii de Ga3+ nu înlocuiesc ionii de Ca2+ din reteau de HAp datorită substituției heterovalente, deci nu se produc distorsiuni în cadrul matricei hidroxiapatitei, aceștia rămân puternic fixați sub formă de soluție solidă de intercalație, deoarece nici raza ionică a Ga3+ (0,62Å) și nici încărcarea (3+) nu fac posibilă o astfel de înlocuire.

Deși în organismult uman ionii de Ga3+ nu sunt cunoscuții ca având funcții fiziologice importante, proprietățile biologice ale acestora sunt strâns legate de similitudinea cu ionii de Fe3+, raza ionică, afinitatea electronilor și potențialul de ionizare. Bacteriile necesită ioni de fier pentru creștere și pentru funcționarea unor enzime, astfel că ionii Ga3+ intră în celulele cu activitate metabolica rapidă (celule canceroase sau bacteriene) prin canalele ionilor de Fe, prin mecanisme de transferin dependență și independență, perturbă homeostazia de fier celular și induc apoptoza celulară. Deoarece galiul inhibă activitatea osteoclastelor fără a afecta negativ osteoclastele poate reprezenta o strategie terapeutică locală promițătoare împotriva resorbției osoase cauzate de osteoporoză și metastază osoasă. Datorită acestor proprietăți ale ionilor de galiu, pulberea de HAp@Ga poate fi un candidat promițător în tratarea osteoporozei și a cancerului osos.

Cel mai mare avantaj al utilizării acestor ioni metalici pentru tratarea patologiilor osoase, constă în faptul că, nu afectează țesutul sănătos din jur, deoarece sunt atrași de celulele cu activitate metabolică mare.

Pe lângă imbunătățirea proprietăților mecanice (elasticitate, flexibilitate,duritatea suprafeței, rezistență la compresiune, conductivitate termică și electrică) ale materialului, compozitele pe bază de oxid de grafenă au avantaje mari atunci când sunt utilizate în repararea și regenerarea oaselor, deoarece poate induce diferențierea osteogenă și condrogenică a celulelor stem. Pentru a imbunătății proprietățile mecanice ale HAp se poate folosii GO ca agent de armare și astfel crește stabilitatea, duritatea (straturile dure promovează osteogeneza), rezistența la compresiune și modulul lui Young. De asemenea, prezența GO poate îmbunătăți proprietățile biomedicale ale colagenului, incluzând structura suprafeței, rezistența la compresiune și înglobarea celulelor osteoblastice, biocompatibilitate și biodegradabilitate sporită.

BIBLIOGRAFIE

[1] E.J.D. Bronzino, J.B. Park, Y.K. Kim, Park, J. B. “Biomaterials.,” Biomed. Eng. (NY). (2000).

[2] N.A.S. Mohd Pu’ad, P. Koshy, H.Z. Abdullah, M.I. Idris, T.C. Lee, Syntheses of hydroxyapatite from natural sources, Heliyon. 5 (2019) e01588. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e01588.

[3] E. Col, Raportul științific și tehnic, (2014).

[4] L. Floroian, M. Badea, Referat general BIOMATERIALE CU APLICATII ÎN MEDICINA, (2015) 2015.

[5] R.K. Tekade, Drug delivery systems, 2019. https://doi.org/10.1016/C2017-0-01074-1.

[6] R. De Santis, V. Guarino, L. Ambrosio, Composite biomaterials for bone repair, Second Edi, Elsevier Ltd, 2019. https://doi.org/10.1016/b978-0-08-102451-5.00010-x.

[7] J.A. Planell, S.M. Best, D. Lacroix, A. Merolli, Bone repair biomaterials, 2009. https://doi.org/10.1533/9781845696610.

[8] N. Lynnerup, H.D. Klaus, Fundamentals of Human Bone and Dental Biology, Elsevier Inc., 2019. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-809738-0.00004-1.

[9] M. Šupová, Substituted hydroxyapatites for biomedical applications: A review, Ceram. Int. 41 (2015) 9203–9231. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2015.03.316.

[10] B. Yilmaz, A.Z. Alshemary, Z. Evis, Co-doped hydroxyapatites as potential materials for biomedical applications, Microchem. J. 144 (2019) 443–453. https://doi.org/10.1016/j.microc.2018.10.007.

[11] No Title, (n.d.). https://www.academia.edu/15115285/Dezvoltarea_sistemului_osos.

[12] E. Verron, J.M. Bouler, J.C. Scimeca, Gallium as a potential candidate for treatment of osteoporosis, Drug Discov. Today. 17 (2012) 1127–1132. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2012.06.007.

[13] J. Zanker, S.L. Brennan-Olsen, G. Duque, Aging Bone, Osteoporosis and Fragility Fracture, Elsevier Inc., 2019. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-801238-3.11432-1.

[14] J. Zanker, G. Duque, Osteoporosis in Older Persons: Old and New Players, J. Am. Geriatr. Soc. (2019). https://doi.org/10.1111/jgs.15716.

[15] F. Cosman, S.J. de Beur, M.S. LeBoff, E.M. Lewiecki, B. Tanner, S. Randall, R. Lindsay, Clinician’s Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis, Osteoporos. Int. (2014). https://doi.org/10.1007/s00198-014-2794-2.

[16] E.C. González Díaz, S. Sinha, R.S. Avedian, F. Yang, Tissue-engineered 3D models for elucidating primary and metastatic bone cancer progression, Acta Biomater. 99 (2019) 18–32. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2019.08.020.

[17] G.D. Roodman, T.A. Guise, Bone and Cancer, Second Edi, Elsevier Inc., 2019. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-813259-3.00022-1.

[18] M. Yang, J. Ren, R. Zhang, Novel gallium-doped amorphous calcium phosphate nanoparticles: Preparation, application and structure study, J. Non. Cryst. Solids. 466–467 (2017) 15–20. https://doi.org/10.1016/j.jnoncrysol.2017.03.034.

[19] A. Almaguer-Flores, P. Silva-Bermúdez, S.E. Rodil, Nanostructured biomaterials with antimicrobial activity for tissue engineering, Elsevier Ltd., 2020. https://doi.org/10.1016/b978-0-08-102594-9.00004-8.

[20] C. Kiernan, C. Knuth, E. Farrell, Endochondral Ossification, Elsevier Inc., 2018. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-811467-4.00006-1.

[21] J. Li, L. Qin, K. Yang, Z. Ma, Y. Wang, L. Cheng, D. Zhao, Materials evolution of bone plates for internal fixation of bone fractures: A review, J. Mater. Sci. Technol. 36 (2020) 190–208. https://doi.org/10.1016/j.jmst.2019.07.024.

[22] T.J. Martin, G.A. Rodan, Coupling of Bone Resorption and Formation during Bone Remodeling, Osteoporosis. (2001) 361–371. https://doi.org/10.1016/b978-012470862-4/50013-1.

[23] P.R.S. Sharma2, Physiology, Bone Remodeling, 2019. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK499863/.

[24] J. Klein-Nulend, L.F. Bonewald, The osteocyte, in: Princ. Bone Biol., 2019. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-814841-9.00006-3.

[25] P.R. Buenzli, N.A. Sims, Quantifying the osteocyte network in the human skeleton, Bone. (2015). https://doi.org/10.1016/j.bone.2015.02.016.

[26] T. Komori, Animal models for osteoporosis, Eur. J. Pharmacol. (2015). https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2015.03.028.

[27] S.L. Dallas, M. Prideaux, L.F. Bonewald, The osteocyte: An endocrine cell . . . and more, Endocr. Rev. (2013). https://doi.org/10.1210/er.2012-1026.

[28] No Title, (n.d.). http://www.drseceleanu.ro/grefe-reconstructii-osoase/tipuri-de-grefe-osoase/.

[29] J. Li, X. Cui, G.J. Hooper, K.S. Lim, T.B.F. Woodfield, Rational design, bio-functionalization and biological performance of hybrid additive manufactured titanium implants for orthopaedic applications: A review, J. Mech. Behav. Biomed. Mater. (2020). https://doi.org/10.1016/j.jmbbm.2020.103671.

[30] No Title, (n.d.). http://rediscoveryourgo.com/verilastknee.aspx.

[31] Y. Takeuchi, M. Tanaka, J. Tanaka, A. Kamimoto, M. Furuchi, H. Imai, Fabrication systems for restorations and fixed dental prostheses made of titanium and titanium alloys, J. Prosthodont. Res. (2020). https://doi.org/10.1016/j.jpor.2019.07.008.

[32] P.D.C.M.G. CIOBANU, MATERIALE BIOCOMPATIBILE (BIOMATERIALE), (2016). http://www.didactic.icpm.tuiasi.ro/cv/ciobanugabriela/curs MATERIALE BIOCOMPATIBILE_master PFC.pdf.

[33] R.S. Katari, A. Peloso, G. Orlando, Tissue engineering, Adv. Surg. (2014). https://doi.org/10.1016/j.yasu.2014.05.007.

[34] G. Turnbull, J. Clarke, F. Picard, P. Riches, L. Jia, F. Han, B. Li, W. Shu, 3D bioactive composite scaffolds for bone tissue engineering, Bioact. Mater. (2018). https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2017.10.001.

[35] R.G. Ribas, V.M. Schatkoski, T.L. do A. Montanheiro, B.R.C. de Menezes, C. Stegemann, D.M.G. Leite, G.P. Thim, Current advances in bone tissue engineering concerning ceramic and bioglass scaffolds: A review, Ceram. Int. 45 (2019) 21051–21061. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2019.07.096.

[36] C. univ. dr. fiz. L. Floroian1, conf. univ. dr. M. Badea2, prof. univ. dr. I. Șamotă2, BIOSTICLA – cel mai nou tip de biomaterial cu un mare POTENTIAL OSTEOINTEGRATOR, (2015). http://webbut.unitbv.ro/jmb/JMB 2015 nr 1/01_04_referat_biosticla.pdf.

[37] D. Ficai, A. Ficai, A. Melinescu, E. Andronescu, Nanotechnology: A challenge in hard tissue engineering with emphasis on bone cancer therapy, Elsevier Inc., 2017. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-46144-3.00020-9.

[38] N. A, C.I. HARD, T. ENGINEERING, W.E.O. BONE, C. THERAPY, NANOTECHNOLOGY: A CHALLENGE IN HARD TISSUE ENGINEERING WITH EMPHASIS ON BONE CANCER THERAPY, (n.d.). http://solacolu.chim.upb.ro/pag_240_247web.pdf.

[39] A. Bharadwaz, A.C. Jayasuriya, Recent trends in the application of widely used natural and synthetic polymer nanocomposites in bone tissue regeneration, Mater. Sci. Eng. C. 110 (2020) 110698. https://doi.org/10.1016/j.msec.2020.110698.

[40] A. Yanovska, S. Bolshanina, Composite materials based on hydroxyapatite embedded in biopolymer matrices: ways of synthesis and application, Elsevier Inc., 2019. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-816901-8.00013-4.

[41] R. Hu, T. Zhou, B. Li, R.T.K. Kwok, J. Shen, A. Qin, B.Z. Tang, Selective viable cell discrimination by a conjugated polymer featuring aggregation-induced emission characteristic, Biomaterials. 230 (2020) 119658. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.119658.

[42] A.O. Pintea, D.L. Manea, Influence of Natural Organic Polymers upon the Mechanical Properties of Plaster Mortars, Procedia Manuf. 46 (2020) 165–172. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.promfg.2020.03.025.

[43] X. Tong, W. Pan, T. Su, M. Zhang, W. Dong, X. Qi, Recent advances in natural polymer-based drug delivery systems, React. Funct. Polym. 148 (2020) 104501. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2020.104501.

[44] M. Zahran, A.H. Marei, Innovative natural polymer metal nanocomposites and their antimicrobial activity, Int. J. Biol. Macromol. 136 (2019) 586–596. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.06.114.

[45] S. Baradaran, E. Moghaddam, W.J. Basirun, M. Mehrali, M. Sookhakian, M. Hamdi, M.R.N. Moghaddam, Y. Alias, Mechanical properties and biomedical applications of a nanotube hydroxyapatite-reduced graphene oxide composite, Carbon N. Y. 69 (2014) 32–45. https://doi.org/10.1016/j.carbon.2013.11.054.

[46] E. Andronescu, A.M. Grumezescu, M.I. Gușă, A.M. Holban, F.C. Ilie, A. Irimia, I.F. Nicoară, M. Țone, Nano-hydroxyapatite: Novel approaches in biomedical applications, Nanobiomaterials Hard Tissue Eng. Appl. Nanobiomaterials. (2016) 189–213. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-42862-0.00006-7.

[47] H. Khalid, A.A. Chaudhry, Basics of hydroxyapatite—structure, synthesis, properties, and clinical applications, Elsevier Ltd, 2020. https://doi.org/10.1016/b978-0-08-102834-6.00004-5.

[48] Y. Lu, W. Dong, J. Ding, W. Wang, A. Wang, Hydroxyapatite Nanomaterials: Synthesis, Properties, and Functional Applications, Elsevier Inc., 2019. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-814533-3.00010-7.

[49] H. bin Zhang, K. chao Zhou, Z. you Li, S. ping Huang, Plate-like hydroxyapatite nanoparticles synthesized by the hydrothermal method, J. Phys. Chem. Solids. (2009). https://doi.org/10.1016/j.jpcs.2008.10.011.

[50] J.H. Bowes, M.M. Murray, The chemical composition of teeth: The composition of human enamel and dentine., Biochem. J. (1935). https://doi.org/10.1042/bj0292721.

[51] M.I. Kay, R.A. Young, A.S. Posner, Crystal structure of hydroxyapatite, Nature. (1964). https://doi.org/10.1038/2041050a0.

[52] A.S. Posner, A. Perloff, A.F. Diorio, Refinement of the hydroxyapatite structure, Acta Crystallogr. (1958). https://doi.org/10.1107/s0365110x58000815.

[53] D. Shepherd, Zinc-substituted hydroxyapatite for the inhibition of osteoporosis, Elsevier Ltd., 2015. https://doi.org/10.1016/b978-1-78242-033-0.00005-5.

[54] R.T. Candidato, R. Sergi, J. Jouin, O. Noguera, L. Pawłowski, Advanced microstructural study of solution precursor plasma sprayed Zn doped hydroxyapatite coatings, J. Eur. Ceram. Soc. 38 (2018) 2134–2144. https://doi.org/10.1016/j.jeurceramsoc.2017.12.037.

[55] M. Sadat-Shojai, M.T. Khorasani, A. Jamshidi, Hydrothermal processing of hydroxyapatite nanoparticles – A Taguchi experimental design approach, J. Cryst. Growth. (2012). https://doi.org/10.1016/j.jcrysgro.2012.09.010.

[56] M. Sadat-Shojai, M.T. Khorasani, E. Dinpanah-Khoshdargi, A. Jamshidi, Synthesis methods for nanosized hydroxyapatite with diverse structures, Acta Biomater. 9 (2013) 7591–7621. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2013.04.012.

[57] H. Nosrati, R.S. Mamoory, D.Q.S. Le, C.E. Bünger, R.Z. Emameh, F. Dabir, Gas injection approach for synthesis of hydroxyapatite nanorods via hydrothermal method, Mater. Charact. 159 (2020) 110071. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.matchar.2019.110071.

[58] S. Beaufils, T. Rouillon, P. Millet, J. Le Bideau, P. Weiss, J.-P. Chopart, A.-L. Daltin, Synthesis of calcium-deficient hydroxyapatite nanowires and nanotubes performed by template-assisted electrodeposition, Mater. Sci. Eng. C. 98 (2019) 333–346. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.msec.2018.12.071.

[59] H.M. Mousa, A.P. Tiwari, J. Kim, S.P. Adhikari, C.H. Park, C.S. Kim, A novel in situ deposition of hydroxyapatite nanoplates using anodization/hydrothermal process onto magnesium alloy surface towards third generation biomaterials, Mater. Lett. 164 (2016) 144–147. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.matlet.2015.10.145.

[60] L.Y. Meng, B. Wang, M.G. Ma, K.L. Lin, The progress of microwave-assisted hydrothermal method in the synthesis of functional nanomaterials, Mater. Today Chem. 1–2 (2016) 63–83. https://doi.org/10.1016/j.mtchem.2016.11.003.

[61] Y. Su, K. Li, X. Hou, S. He, Surface defects repairing of sprayed Ca-P coating by the microwave-hydrothermal method, Ceram. Int. 44 (2018) 21699–21709. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2018.08.258.

[62] E.S. Akpan, M. Dauda, L.S. Kuburi, D.O. Obada, D. Dodoo-Arhin, A comparative study of the mechanical integrity of natural hydroxyapatite scaffolds prepared from two biogenic sources using a low compaction pressure method, Results Phys. 17 (2020) 103051. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.rinp.2020.103051.

[63] M. Chesley, R. Kennard, S. Roozbahani, S.M. Kim, K. Kukk, M. Mason, One-step hydrothermal synthesis with in situ milling of biologically relevant hydroxyapatite, Mater. Sci. Eng. C. 113 (2020) 110962. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.msec.2020.110962.

[64] D. Belamri, A. Harabi, N. Karbouaa, N. Benyahia, The effect of KF on the structural evolution of natural hydroxyapatite during conventional and microwave sintering, Ceram. Int. 46 (2020) 1189–1194. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2019.09.091.

[65] M.F. Alif, W. Aprillia, S. Arief, A hydrothermal synthesis of natural hydroxyapatite obtained from Corbicula moltkiana freshwater clams shell biowaste, Mater. Lett. 230 (2018) 40–43. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.matlet.2018.07.034.

[66] S. Ramesh, Z.Z. Loo, C.Y. Tan, W.J.K. Chew, Y.C. Ching, F. Tarlochan, H. Chandran, S. Krishnasamy, L.T. Bang, A.A.D. Sarhan, Characterization of biogenic hydroxyapatite derived from animal bones for biomedical applications, Ceram. Int. 44 (2018) 10525–10530. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2018.03.072.

[67] M.R. Mucalo, 14 – Animal-bone derived hydroxyapatite in biomedical applications, in: M.B.T.-H. (Hap) for B.A. Mucalo (Ed.), Woodhead Publ. Ser. Biomater., Woodhead Publishing, 2015: pp. 307–342. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/B978-1-78242-033-0.00014-6.

[68] N.A.M. Barakat, K.A. Khalil, F.A. Sheikh, A.M. Omran, B. Gaihre, S.M. Khil, H.Y. Kim, Physiochemical characterizations of hydroxyapatite extracted from bovine bones by three different methods: Extraction of biologically desirable HAp, Mater. Sci. Eng. C. 28 (2008) 1381–1387. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.msec.2008.03.003.

[69] A. Ruksudjarit, K. Pengpat, G. Rujijanagul, T. Tunkasiri, Synthesis and characterization of nanocrystalline hydroxyapatite from natural bovine bone, Curr. Appl. Phys. 8 (2008) 270–272. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.cap.2007.10.076.

[70] S. Rahavi, A. Monshi, R. Emadi, A. Doostmohammadi, H. Akbarian, Determination of crystallite size in synthetic and natural hydroxyapatite: A comparison between XRD and TEM results, in: Adv. Mater. Res., 2013. https://doi.org/10.4028/www.scientific.net/AMR.620.28.

[71] T.J. Webster, E.A. Massa-Schlueter, J.L. Smith, E.B. Slamovich, Osteoblast response to hydroxyapatite doped with divalent and trivalent cations, Biomaterials. 25 (2004) 2111–2121. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2003.09.001.

[72] Y. Nie, C. Hu, C. Kong, Enhanced fluoride adsorption using Al (III) modified calcium hydroxyapatite, J. Hazard. Mater. 233–234 (2012) 194–199. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2012.07.020.

[73] S. Kulanthaivel, U. Mishra, T. Agarwal, S. Giri, K. Pal, K. Pramanik, I. Banerjee, Improving the osteogenic and angiogenic properties of synthetic hydroxyapatite by dual doping of bivalent cobalt and magnesium ion, Ceram. Int. 41 (2015) 11323–11333. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2015.05.090.

[74] C.M. Mardziah, S. Ramesh, M.F. Abdul Wahid, H. Chandran, A. Sidhu, S. Krishnasamy, J. Purbolaksono, Effect of zinc ions on the structural characteristics of hydroxyapatite bioceramics, Ceram. Int. 46 (2020) 13945–13952. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2020.02.192.

[75] I.E. Kolesnikov, A.M. Nikolaev, E. Lähderanta, O. V Frank-Kamenetskaya, M.A. Kuz’mina, Structural and luminescence properties of Ce3+-doped hydroxyapatite nanocrystalline powders, Opt. Mater. (Amst). 99 (2020) 109550. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.optmat.2019.109550.

[76] M. Safarzadeh, S. Ramesh, C.Y. Tan, H. Chandran, A.F.M. Noor, S. Krishnasamy, U.J. Alengaram, S. Ramesh, Effect of multi-ions doping on the properties of carbonated hydroxyapatite bioceramic, Ceram. Int. 45 (2019) 3473–3477. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2018.11.003.

[77] B.K. Mahmood, O. Kaygili, N. Bulut, S. V Dorozhkin, T. Ates, S. Koytepe, C. Gürses, F. Ercan, H. Kebiroglu, R.S. Agid, T. İnce, Effects of strontium – erbium co-doping on the structural properties of hydroxyapatite: An Experimental and theoretical study, Ceram. Int. 46 (2020) 16354–16363. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2020.03.194.

[78] M.A. Pogosova, L. V González, Influence of anion substitution on the crystal structure and color properties of copper-doped strontium hydroxyapatite, Ceram. Int. 44 (2018) 20140–20147. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2018.07.307.

[79] S. Direct, No Title, (n.d.). https://www.sciencedirect.com/search?qs=hydroxyapatite doped&articleTypes=FLA&lastSelectedFacet=articleTypes.

[80] A. Bigi, E. Boanini, M. Gazzano, 7 – Ion substitution in biological and synthetic apatites, in: C. Aparicio, M.-P.B.T.-B. and B. Ginebra (Eds.), Woodhead Publishing, Boston, 2016: pp. 235–266. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/B978-1-78242-338-6.00008-9.

[81] H. El Feki, A. Ben Salah, A. Daoud, A. Lamure, C. Lacabanne, Studies by thermally stimulated current (TSC) of hydroxy- and fluoro-carbonated apatites containing sodium ions, J. Phys. Condens. Matter. (2000). https://doi.org/10.1088/0953-8984/12/38/309.

[82] C.R. Chitambar, Gallium and its competing roles with iron in biological systems, Biochim. Biophys. Acta – Mol. Cell Res. 1863 (2016) 2044–2053. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2016.04.027.

[83] P. Melnikov, M. de Fatima Cepa Matos, A. Malzac, A. Rainho Teixeira, D.M. de Albuquerque, Evaluation of in vitro toxicity of hydroxyapatite doped with gallium, Mater. Lett. 253 (2019) 343–345. https://doi.org/10.1016/j.matlet.2019.06.095.

[84] P. Melnikov, A.R. Teixeira, A. Malzac, M. de B. Coelho, Gallium-containing hydroxyapatite for potential use in orthopedics, Mater. Chem. Phys. 117 (2009) 86–90. https://doi.org/10.1016/j.matchemphys.2009.05.046.

[85] J. Qi, Q. Yao, K. Qian, L. Tian, Z. Cheng, D. Yang, Y. Wang, Synthesis, antiproliferative activity and mechanism of gallium(III)-thiosemicarbazone complexes as potential anti-breast cancer agents, Eur. J. Med. Chem. 154 (2018) 91–100. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2018.05.016.

[86] C. Levaditi, New Researches ON THE CHEMOTHERAPY OF SYPHILIS.: Being an Address delivered to the Section of Dermatology of the Royal Society of Medicine on Jan. 21st, Lancet. 207 (1926) 215–217. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/S0140-6736(01)15583-2.

[87] T.J. Hall, T.J. Chambers, Gallium inhibits bone resorption by a direct effect on osteoclasts, Bone Miner. 8 (1990) 211–216. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/0169-6009(90)90106-P.

[88] I. Strazic-Geljic, I. Guberovic, B. Didak, H. Schmid-Antomarchi, A. Schmid-Alliana, F. Boukhechba, J.M. Bouler, J.C. Scimeca, E. Verron, Gallium, a promising candidate to disrupt the vicious cycle driving osteolytic metastases, Biochem. Pharmacol. 116 (2016) 11–21. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2016.06.020.

[89] A.K. Barui, R. Kotcherlakota, C.R. Patra, Biomedical applications of zinc oxide nanoparticles, Elsevier Inc., 2018. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813661-4.00006-7.

[90] Z. Chen, Y. Liu, L. Mao, L. Gong, W. Sun, L. Feng, Effect of cation doping on the structure of hydroxyapatite and the mechanism of defluoridation, Ceram. Int. 44 (2018) 6002–6009. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2017.12.191.

[91] F. Miyaji, Y. Kono, Y. Suyama, Formation and structure of zinc-substituted calcium hydroxyapatite, Mater. Res. Bull. (2005). https://doi.org/10.1016/j.materresbull.2004.10.020.

[92] Y. Tang, H.F. Chappell, M.T. Dove, R.J. Reeder, Y.J. Lee, Zinc incorporation into hydroxylapatite, Biomaterials. (2009). https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.01.043.

[93] Y. Su, I. Cockerill, Y. Wang, Y.X. Qin, L. Chang, Y. Zheng, D. Zhu, Zinc-Based Biomaterials for Regeneration and Therapy, Trends Biotechnol. 37 (2019) 428–441. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.10.009.

[94] T.U. Hoogenraad, R. Koevoet, E.G.W.M. De Ruyter Korver, Oral zinc sulphate as long-term treatment in wilson’s disease (Hepatolenticular degeneration), Eur. Neurol. (1979). https://doi.org/10.1159/000115077.

[95] D. Wilson, Candida albicans, Trends Microbiol. (2019). https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.10.010.

[96] D.J. Eide, Zinc transporters and the cellular trafficking of zinc, Biochim. Biophys. Acta – Mol. Cell Res. (2006). https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2006.03.005.

[97] Z.L. Wang, Nanostructures of zinc oxide, Mater. Today. (2004). https://doi.org/10.1016/S1369-7021(04)00286-X.

[98] M.J. Laudermilk, M.M. Manore, C.A. Thomson, L.B. Houtkooper, J.N. Farr, S.B. Going, Vitamin C and zinc intakes are related to bone macroarchitectural structure and strength in prepubescent girls, Calcif. Tissue Int. (2012). https://doi.org/10.1007/s00223-012-9656-8.

[99] L. Tang, Z. Lin, Y. ming Li, Effects of different magnitudes of mechanical strain on Osteoblasts in vitro, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2006). https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2006.03.123.

[100] S. Sakaguchi, T. Yamaguchi, T. Nomura, M. Ono, Regulatory T Cells and Immune Tolerance, Cell. (2008). https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.05.009.

[101] C.M. Yamazaki, Y. Kadoya, K. Hozumi, H. Okano-Kosugi, S. Asada, K. Kitagawa, M. Nomizu, T. Koide, A collagen-mimetic triple helical supramolecule that evokes integrin-dependent cell responses, Biomaterials. (2010). https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.10.014.

[102] C. Knupp, J.M. Squire, Molecular packing in network-forming collagens, Adv. Protein Chem. (2005). https://doi.org/10.1016/S0065-3233(05)70011-5.

[103] C. Teixeira, R. Ferraz, C. Prudêncio, P. Gomes, Collagen-like materials for tissue regeneration and repair, Elsevier Ltd., 2018. https://doi.org/10.1016/B978-0-08-100803-4.00011-5.

[104] M.D. Shoulders, K.J. Kamer, R.T. Raines, Origin of the stability conferred upon collagen by fluorination, Bioorganic Med. Chem. Lett. 19 (2009) 3859–3862. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2009.03.168.

[105] F.H. Silver, M. Jaffe, R.G. Shah, Structure and behavior of collagen fibers, in: Handb. Prop. Text. Tech. Fibres, 2018. https://doi.org/10.1016/B978-0-08-101272-7.00011-0.

[106] R. Geta , David (Gh. Asachi Technical University of Iasi, Iasi, Collagen-based 3D structuresdversatile, efficient materials for biomedical applications, in: 2009.

[107] G. Bou-Gharios, B. De Crombrugghe, Type I Collagen Structure, Synthesis, and Regulation, in: Princ. Bone Biol. Two-Volume Set, 2008. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-373884-4.00034-3.

[108] L. Gu, T. Shan, Y. xuan Ma, F.R. Tay, L. Niu, Novel Biomedical Applications of Crosslinked Collagen, Trends Biotechnol. (2019). https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.10.007.

[109] H.J. Song, H.Y. Lim, W. Chun, K.C. Choi, J.H. Sung, G.Y. Sung, Fabrication of a pumpless, microfluidic skin chip from different collagen sources, J. Ind. Eng. Chem. (2017). https://doi.org/10.1016/j.jiec.2017.07.034.

[110] P.K. Bhagwat, P.B. Dandge, Collagen and collagenolytic proteases: A review, Biocatal. Agric. Biotechnol. (2018). https://doi.org/10.1016/j.bcab.2018.05.005.

[111] A.N. Akram, C. Zhang, Effect of ultrasonication on the yield, functional and physicochemical characteristics of collagen-II from chicken sternal cartilage, Food Chem. (2020). https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.125544.

[112] F.L. Zhang, Y. Le Liu, J. Yu, Q. Li, X.H. Li, J.H. Wang, F.X. Wang, Optimization of conditions for extracting muscle protein from grass carp using response surface methodology, in: Adv. Mater. Res., 2014. https://doi.org/10.4028/www.scientific.net/AMR.1004-1005.837.

[113] M.M. Schmidt, R.C.P. Dornelles, R.O. Mello, E.H. Kubota, M.A. Mazutti, A.P. Kempka, I.M. Demiate, Collagen extraction process, Int. Food Res. J. 23 (2016) 913–922.

[114] K.M. Song, S.K. Jung, Y.H. Kim, Y.E. Kim, N.H. Lee, Development of industrial ultrasound system for mass production of collagen and biochemical characteristics of extracted collagen, Food Bioprod. Process. (2018). https://doi.org/10.1016/j.fbp.2018.04.001.

[115] P.R. Wallace, The band theory of graphite, Phys. Rev. (1947). https://doi.org/10.1103/PhysRev.71.622.

[116] A.A. Jones, D. Ph, N. Safron, Mechanical Exfoliation to Make Graphene and Visualization, Lessons Inst. Chem. Educ. Nanoscale Sci. Eng. Cent. Univ. Wisconsin-Madison. (2004).

[117] K. Radhapyari, S. Datta, S. Dutta, N. Jadon, R. Khan, Graphene-based nanostructures for biomedical applications, Elsevier B.V., 2020. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-817650-4.00004-8.

[118] M. Ramadas, G. Bharath, N. Ponpandian, A.M. Ballamurugan, Investigation on biophysical properties of Hydroxyapatite/Graphene oxide (HAp/GO) based binary nanocomposite for biomedical applications, Mater. Chem. Phys. 199 (2017) 179–184. https://doi.org/10.1016/j.matchemphys.2017.07.001.

[119] M. Iliuț, Rezumatul Tezei de Doctorat Sinteza și caracterizarea unor noi nanocompozite pe bază de grafene cu proprietăți optice și electronice îmbună t ăț ite Maria ILIUȚ, (2013) 1–45.

[120] L. Shang, Y. Qi, H. Lu, H. Pei, Y. Li, L. Qu, Z. Wu, W. Zhang, Graphene and Graphene Oxide for Tissue Engineering and Regeneration, Elsevier Inc., 2019. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-815341-3.00007-9.

[121] C. Lee, X. Wei, J.W. Kysar, J. Hone, Measurement of the elastic properties and intrinsic strength of monolayer graphene, Science (80-. ). (2008). https://doi.org/10.1126/science.1157996.

[122] G. Wei, C. Gong, K. Hu, Y. Wang, Y. Zhang, Biomimetic hydroxyapatite on graphene supports for biomedical applications: A review, Nanomaterials. 9 (2019) 1–20. https://doi.org/10.3390/nano9101435.

[123] E. Brayfindley, E.E. Irace, C. Castro, W.L. Karney, Stone-Wales Rearrangements in Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: A Computational Study, J. Org. Chem. (2015). https://doi.org/10.1021/acs.joc.5b00066.

[124] M. Li, P. Xiong, F. Yan, S. Li, C. Ren, Z. Yin, A. Li, H. Li, X. Ji, Y. Zheng, Y. Cheng, An overview of graphene-based hydroxyapatite composites for orthopedic applications, Bioact. Mater. 3 (2018) 1–18. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2018.01.001.

[125] X. Sun, Z. Liu, K. Welsher, J.T. Robinson, A. Goodwin, S. Zaric, H. Dai, Nano-graphene oxide for cellular imaging and drug delivery, Nano Res. (2008). https://doi.org/10.1007/s12274-008-8021-8.

[126] A. Bhattacharjee, A. Gupta, M. Verma, P.A. Murugan, P. Sengupta, S. Matheshwaran, I. Manna, K. Balani, Site-specific antibacterial efficacy and cyto/hemo-compatibility of zinc substituted hydroxyapatite, Ceram. Int. 45 (2019) 12225–12233. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2019.03.132.

[127] Y. Wang, Z. Li, J. Wang, J. Li, Y. Lin, Graphene and graphene oxide: Biofunctionalization and applications in biotechnology, Trends Biotechnol. (2011). https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2011.01.008.

[128] T.K. Ghorai, Graphene oxide-based nanocomposites and biomedical applications, Elsevier Ltd., 2019. https://doi.org/10.1016/B978-0-08-102555-0.00009-1.

[129] J. Liu, L. Cui, D. Losic, Graphene and graphene oxide as new nanocarriers for drug delivery applications, Acta Biomater. (2013). https://doi.org/10.1016/j.actbio.2013.08.016.

[130] V. Georgakilas, J.N. Tiwari, K.C. Kemp, J.A. Perman, A.B. Bourlinos, K.S. Kim, R. Zboril, Noncovalent Functionalization of Graphene and Graphene Oxide for Energy Materials, Biosensing, Catalytic, and Biomedical Applications, Chem. Rev. (2016). https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.5b00620.

[131] D.A. Dikin, S. Stankovich, E.J. Zimney, R.D. Piner, G.H.B. Dommett, G. Evmenenko, S.T. Nguyen, R.S. Ruoff, Preparation and characterization of graphene oxide paper, Nature. (2007). https://doi.org/10.1038/nature06016.

[132] J. Chen, J. Liu, H. Deng, S. Yao, Y. Wang, Regulatory synthesis and characterization of hydroxyapatite nanocrystals by a microwave-assisted hydrothermal method, Ceram. Int. 46 (2020) 2185–2193. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2019.09.203.

[133] L. An, W. Li, Y. Xu, D. Zeng, Y. Cheng, G. Wang, Controlled additive-free hydrothermal synthesis and characterization of uniform hydroxyapatite nanobelts, Ceram. Int. 42 (2016) 3104–3112. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2015.10.099.

[134] Y.Z. Wang, Y. Fu, Microwave-hydrothermal synthesis and characterization of hydroxyapatite nanocrystallites, Mater. Lett. 65 (2011) 3388–3390. https://doi.org/10.1016/j.matlet.2011.07.095.

[135] K.L. Montoya-Cisneros, J.C. Rendón-Ángeles, Z. Matamoros-Veloza, K. Yanagisawa, Rapid synthesis and characterization of Zn substituted hydroxyapatite nanoparticles via a microwave-assisted hydrothermal method, Mater. Lett. 195 (2017) 5–9. https://doi.org/10.1016/j.matlet.2017.02.080.

[136] Ž. Radovanović, D. Veljović, B. Jokić, S. Dimitrijević, G. Bogdanović, V. Kojić, R. Petrović, D. Janaćković, Biocompatibility and antimicrobial activity of zinc(II)-doped hydroxyapatite, synthesized by a hydrothermal method, J. Serbian Chem. Soc. 77 (2012) 1787–1798. https://doi.org/10.2298/JSC121019131R.

[137] H. Begam, B. Kundu, A. Chanda, S.K. Nandi, MG63 osteoblast cell response on Zn doped hydroxyapatite (HAp) with various surface features, Ceram. Int. 43 (2017) 3752–3760. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2016.12.010.

[138] M. Kurtjak, M. Vukomanović, A. Krajnc, L. Kramer, B. Turk, D. Suvorov, Designing Ga(iii)-containing hydroxyapatite with antibacterial activity, RSC Adv. 6 (2016) 112839–112852. https://doi.org/10.1039/c6ra23424k.

[139] S. et al. Archibald, Ac ce pte d M us pt, Geophys. Res. Lett. in press (2017) 0–31.

[140] A. Sionkowska, J. Kozłowska, Characterization of collagen/hydroxyapatite composite sponges as a potential bone substitute, Int. J. Biol. Macromol. 47 (2010) 483–487. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2010.07.002.

[141] T.W. Sun, Y.J. Zhu, F. Chen, F.F. Chen, Y.Y. Jiang, Y.G. Zhang, J. Wu, Ultralong hydroxyapatite nanowires/collagen scaffolds with hierarchical porous structure, enhanced mechanical properties and excellent cellular attachment, Elsevier Ltd and Techna Group S.r.l., 2017. https://doi.org/10.1016/j.ceramint.2017.08.137.

[142] L. LOREDANA, No TDIFRACTOMETRIE DE RAZE X PE PULBERI CRISTALINE itle, in: n.d. http://www.isjolt.ro/wp-content/uploads/2018/01/fizica_Lica-Loredana_Difractometrie-de-raze-X.pdf.

[143] Caiet de laborator .An/Secba, (2019).

[144] No Title, (n.d.). https://www.thermofisher.com/ro/en/home/industrial/spectroscopy-elemental-isotope-analysis/spectroscopy-elemental-isotope-analysis-learning-center/molecular-spectroscopy-information/ftir-information/ftir-basics.html.

[145] S. l. dr. ing. C. DAMIAN, Caracterizarea structurala a materialelor prin Spectroscopie Raman si de fotoelectroni cu raze X – prezentare fundamente teoretice, (n.d.). http://www.tsocm.pub.ro/PERFORM/suportcurs/2015-08-21 A4.pdf.

[146] No Title, (n.d.). https://www.thermofisher.com/ro/en/home/industrial/spectroscopy-elemental-isotope-analysis/spectroscopy-elemental-isotope-analysis-learning-center/trace-elemental-analysis-tea-information/inductively-coupled-plasma-mass-spectrometry-icp-ms-information.htm.

[147] No Title, (n.d.). https://www.sigmaaldrich.com/european-export.html.

[148] No Title, (n.d.). https://www.fishersci.co.uk/shop/products/ammonium-hydroxide-solution-5-0m-honeywell-2/15633520.