Condiționarea biomasei de microorganisme utile plantelor de cultură și a metaboliților acestora [306476]

CAPITOLUL 6

Condiționarea biomasei de microorganisme utile plantelor de cultură și a [anonimizat]-horticole, fiind utilizate inclusiv în scopul realizării unei protecții integrate împotriva bolilor plantelor. [anonimizat], bioproduse pentru protecția plantelor și biofertilizanți. [anonimizat], selecția pe baza caracterelor biologice utile în combaterea fitopatogenilor (in vitro) [anonimizat], câmp sau depozit. Pentru a [anonimizat] a plantelor trebuie ca: (i) [anonimizat], cu randamente ridicate de conversie a componentelor mediilor de cultura; (ii) [anonimizat] a ingredientului activ (microorganismul), cu păstrarea caracteristicilor biologice un timp cât mai îndelungat; (iii) aplicarea bioprodusului să fie compatibilă cu secvențele tehnologice recomandate de cele mai bune practici agricole și cu echipamentele existente. [anonimizat], biostimulării și protecției plantelor au un mare potențial și ar trebui să fie utilizate pe scară mai largă pentru a asigura în viitor o agricultură durabilă (Constantinescu și Sicuia, 2013).

Cercetările efectuate în cadrul acestei teze pentru condiționarea biomasei de microorganisme utile plantelor de cultură se referă la:

[anonimizat], cu activitate biologică utilă plantelor de cultură.

Condiționarea biomasei tulpinilor de Trichoderma cu acțiune de biostimulare a plantelor de cultură și acțiune puternic antagonistă față de cei mai importanți agenți fitopatogeni.

[anonimizat], derulate cu sprijinul MEN(CS) – UEFISCDI, la care am participat în calitate de membru în echipa de cercetare:

[anonimizat]. 61-045/2007, “Dezvoltarea unei metodologii de biocontrol exercitat de sisteme microbiene asupra infecțiilor fungice”, încheiat în cadrul Programului 4 – [anonimizat] 2007-2010. (BIOCONTROL);

[anonimizat] – PN-II-CI-2012-0112. Contract nr. 84CI/2012, “Activator fungic pe bază de Trichoderma pentru producere de composturi supresive și odorante destinate culturilor ornamentale” (TRICH-ODOR);

[anonimizat]-IN-CI-2012-1-0211 Contract nr. CI121/2012 “[anonimizat]” (AM-STIM);

[anonimizat]-PT-PCCA-2013-4-0995-160/2014, „Produse multifuncționale și inovative pentru alimente funcționale bioaugmentate și sigure din noi plante cultivate în România” (MAIA);

[anonimizat]-PT-PCCA-2013-4-0846/2014, “Managementul complex al resturilor vegetale în sistemele de agricultură conservativă” (CERES).

Lucrările efectuate cu suportul proiectelor menționate mai sus s-au referit la următoarele modalități de condiționare a metaboliților și biomasei de bacterii sporulante cu activitate biologică utilă plantelor de cultură (tulpini de Bacillus, Brevibacillus și/sau metaboliți ai acestora):

Condiționarea metaboliților microbieni sub formă de capsule (BIOCONTROL);

Condiționarea metaboliților microbieni sub formă de emulsie (BIOCONTROL);

Condiționarea biomasei bacteriene sub formă de granule sferonizate (AM-STIM);

Condiționarea biomasei de spori bacterieni sub formă de tabletă efervescentă (CERES);

Condiționarea biomasei de spori bacterieni sub formă de pelete bioactivate (CERES).

Lucrările efectuate pentru condiționarea tulpinilor de Trichoderma au urmărit realizarea următoarelor forme de condiționare:

Condiționare sub formă de granule cu eliberare controlată (TRICHO – DOR);

Condiționarea unui consorțiu de Trichoderma cu acțiune de biostimulare a plantelor de cultură sub formă de perle de alginat de calciu (MAIA);

Condiționarea pe suporturi ceramice poroase (MAIA);

Condiționarea pe pelete provenite din substrat epuizat de la cultura ciupercilor Pleurotus (CERES);

Condiționarea sub formă de pulbere granulată umectabilă („dry flowable”) (CERES).

6.I. Condiționarea biomasei tulpinilor de bacterii sporulante gram-pozitive cu activitate biologică utilă plantelor de cultură

6.I.1. Introducere

Bacteriile sporulante gram-pozitive (familia Bacillaceae) sunt mai ușor de formulat întrucât prezintă forme de răspândire (spori), care au o mare rezistență la factorii de mediu adverși – temperatură, activitate redusă și foarte redusă a apei, radiații solare. În continuare se vor prezenta diferitele forme de condiționare a tulpinilor bacteriene și/sau a metaboliților acestora, cu activitate biologică semnificativă, izolate în cadrul lucrărilor desfășurate cu specii de Bacillus și Brevibacillus. Prin noile abordări de condiționare a biomasei de bacterii sporulante și a metaboliților acestora s-a urmărit dezvoltarea unor bioproduse a căror aplicare să fie compatibilă cu secvențele tehnologice recomandate de cele mai bune practici agricole și cu echipamentele existente. Așa cum s-a menționat și mai sus, condiționarea biomasei bacteriene/metaboliților s-a realizat sub formă de: capsule (BIOCONTROL); emulsie (BIOCONTROL); granule sferonizate (AM-STIM); tabletă efervescentă (CERES); pelete bioactivate (CERES).

În experimentele preliminare pentru condiționarea metaboliților bacterieni sub formă de capsule, a fost folosită ca substanță test sorbatul de potasiu, respectiv acid sorbic, fiind bine cunoscută acțiunea antimicrobiană a acestora. S-a pornit în aceste încercări de la rezultatele echipei de cercetători de la Universitatea Politehnică Bucuresti – Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor, parteneră în proiectul de cercetare BIOCONTROL, care au relevat faptul că, peliculele protectoare creează condiții pentru o eliberare mai lentă a substanței active din interiorul capsulelor. Aceste rezultate au fost utilizate ca bază de pornire pentru condiționarea sub formă de capsule a metaboliților produși de tulpinile de bacili testate. Pentru condiționarea sub formă de emulsie s-a utilizat uleiul vegetal de floarea-soarelui ca agent purtător și lecitina din soia ca agent de emulsionare a supernatantului separat de biomasa de bacterii în mediul de cultură. Scopul formulării metaboliților microbieni sub formă de emulsie a fost acela de a realiza un bioprodus sub formă lichidă, care este mai ușor de administrat în practică comparativ cu formele de condiționare solide (Schisler și colab., 2004).

Granulele sferonizate s-au obținut printr-o variantă a procedeului de înglobare în făinuri vegetale, urmat de extrudare și sferonizare sub formă granulară (Boyetchko și colab., 1999). Prin realizarea acestei variante s-a urmărit o eliberare treptată a bacililor condiționați în rizosfera plantelor, pentru a ameliora colonizarea și exprimarea superioară a caracteristicilor benefice.

În cazul condiționării sub formă de tabletă s-a urmărit păstrarea avantajelor acestei formulări, cu reducerea dezavantajelor. Un prim avantaj al formulărilor sub formă de tablete este realizarea unei colonizări mai rapide a substratului, datorită persistenței ridicate a inoculului inițial rezultat ca urmare a aplicării (Armengol și colab., 2006; Jayaraj și colab., 2005). Avantajul tabletelor este ușurința respectării dozelor recomandate, dar dezavantajul comun este dat de rata de supraviețuire redusă a microorganismelor la condiționarea prin tabletare, care implică pentru microorganisme atât stresul uscării, cât și cel al comprimării. În cazul tabletelor efervescente, la aceste stresuri combinate, se mai adaugă și cel al unui pH micro-zonal cu variabilitate mare, datorat omogenizării unui (bi)carbonat bazic cu un acid. Procedeul care a fost dezvoltat a urmărit realizarea unei rate de supraviețuire avansate a microorganismelor, care sunt cultivate în condiții ce trebuie să favorizeze exprimarea mecanismelor interne de rezistență la factorii externi agresivi (ca de ex. comprimare).

Prin condiționarea pe pelete bioactivate s-a urmărit amplificarea efectelor benefice asupra plantelor de cultură exercitat de substratul epuizat de creștere de la cultivarea ciupercilor Pleurotus. Acest substrat conține o serie de precursori ai unor compuși care au un efect dovedit de biostimulant: (i) bio-siliciu înglobat în matrici biologice cu stabilitate redusă datorită bioprocesării, care este precursor al siliciului solubil, compus cu acțiune de biostimulare recunoscută (Savvas și Ntatsi, 2015); (ii) chitină, precursor al chitosanului biostimulant pentru plante (Pichyangkura și Chadchawan, 2015); (iii) proteine, precursor al aminoacizilor și al poliaminelor, compuși cu activitate de biostimulanți pentru plante (Calvo și colab., 2014; Kusano și colab., 2008; Xie și colab., 2014).

În cele ce urmează se vor detalia materialul și metodele folosite pentru realizarea diferitelor formulări și testarea lor. Rezultatele se vor descrie și vor fi discutate pentru a se preciza modul în care răspund obiectivelor referitoare la contribuția la dezvoltarea cunoașterii în domeniu, ca și a celor privind aplicabilitatea practică a respectivelor rezultate.

6.I.2. Materiale și Metode

6.I.2.1. Testarea activității antimicrobiene pentru capsule de agar cu un conținut de 1% acid sorbic

Material biologic utilizat a fost tulpina de Aspergillus niger 105 din Colecția de microorganisme a INCDCP-CECHIM, producătoare de micotoxine (Răut și colab., 2014).

Pentru cultivare s-a folosit mediul PDA sterilizat prin autoclavare la 1 atm. (1210C), timp de 20 minute, turnat în plăci Petri sterile, în cantitate de 20 ml de mediu, verificându-se sterilitatea prin incubare la 37oC, timp de 18 – 24h.

Alte materiale și echipamente utilizate au fost: plăci Petri sterile, eprubete sterile, apă distilată sterilă, pense, hotă cu flux laminar Biohazard BSC-EN, autoclav Panasonic MLS 3781L-PE.

Au fost efectuate teste de activitate antimicrobiană pentru sorturile de capsule de agar cu conținut de 1% acid sorbic, acoperite cu peliculă polimerică compozită, alcool polivinilic – celuloză bacteriană (PVA-BC), comparativ cu capsulele neprotejate și cu capsule simple de agar. Pentru aceste experimente s-a utilizat metoda difuziei radiale. Testele au fost efectuate în plăci Petri pe culturi de Aspergillus niger. În toate cazurile, plăcile Petri au fost incubate la 28șC, timp de 120 ore, observațiile s-au efectuat după 48 și 120 de ore, măsurând diametrul zonelor de inhibiție a creșterii tulpinii toxigenice de A. niger.

6.I.2.2. Condiționarea metaboliților bacterieni sub formă de capsule

În vederea stabilirii materialului de încapsulare adecvat pentru metaboliții cu activitate biocidă produși de tulpinile de Bacillus subtilis și Bacillus amyloliquefaciens, au fost efectuate experimente preliminare utilizând ca materiale de încapsulare biopolimeri naturali: alginatul de sodiu (Sigma), respectiv agar (Sigma). Ca substanță activă, s-au utilizat sorbatul de potasiu (p.a. min. 99%, Fluka), respectiv acidul sorbic (p.a. min. 99%, Fluka), fiind bine cunoscută acțiunea antimicrobiană a acestora și dispunând de o metodă simplă de analiză. Determinarea concentrațiilor de sorbat în medii lichide s-a realizat spectrofotometric, măsurându-se absorbanța la lungime de undă de 254 nm și compararea datelor cu curba de etalonare determinată în prealabil. Măsurătorile au fost efectuate cu un Spectrofotometru UV – VIS Cintra 6 (GBS Scientific – Australia). Dintre tehnicile de încapsulare, s-a ales metoda coacervării. În cazul alginatului de sodiu, întărirea s-a realizat cu ioni de Ca2+, în timp ce pentru capsulele de agar s-a utilizat răcirea soluției de agar în ulei vegetal pentru gelifiere. Rețetele de lucru sunt prezentate în tabelul 6.I.1.

Tabel 6.I.1. Rețete de obținere a capsulelor cu substanță biocidă

Picurarea soluțiilor de alginat de sodiu, respectiv de agar în mediile de reticulare/gelifiere s-a realizat cu ajutorul unor seringi, obținând-se capsule cu diametrul de 3 mm. În vederea determinării eliberării componentului activ (sorbat de potasiu) din capsule, acestea au fost introduse în apă, la un raport L/S de 10/1 și au fost prelevate probe la intervale de 2 minute. În cazul încapsulării în agar, s-a utilizat ca substanță activă acid sorbic, înlocuirea sorbatului fiind determinată de solubilitatea sa extrem de ridicată în apă. S-a folosit soluția de agar 2% cu 1% acid sorbic și s-a picurat în ulei vegetal. În funcție de orificiul de curgere, respectiv debit, s-au obținut capsule cu diametrele cuprinse între 2 și 5 mm. Pentru a crește timpul de eliberare din interiorul capsulelor, s-a optat pentru acoperirea acestora cu peliculă protectoare. S-au utilizat filme de alcool polivinilic, compozite de alcool polivinilic și celuloză bacteriană, respectiv, chitosan ca peliculă protectoare. Soluția de alcool polivinilic (10%) se obține prin dizolvarea la cald a alcoolului polivinilic (Merck, masa moleculară medie 60000, grad de hidroliză min. 98%) în apă demineralizată. Pelicula compozită se obține prin încorporare de gel de celuloză bacteriană (6-10%), fin măcinată în soluție de alcool polivinilic. Soluția de chitosan (min. 85% deacetilat, Sigma) s-a preparat prin dizolvarea chitosanului (2%) în soluție de 0,1% acid acetic. Capsulele de agar au fost acoperite cu soluția peliculogenă și după separare au fost lăsate la uscare în aer liber sau păstrate în cutii Petri închise până la efectuarea testelor de eliberare. Vizualizarea peliculei de protecție s-a realizat cu ajutorul unui microscop metalografic Olympus BX51M. Au fost efectuate teste de activitate antimicrobiană pentru sorturile de capsule de agar cu conținut de 1% acid sorbic, acoperite cu peliculă polimerică compozită PVA+BC, comparativ cu capsulele neprotejate și cu capsule simple de agar. Testele au fost efectuate în plăci Petri pe culturi de Aspergillus niger.

6.I.2.3. Condiționarea metaboliților bacterieni sub formă de emulsie

Emulsiile au fost realizate în ulei de floarea soarelui, ca agent tensioactiv fiind utilizată lecitina vegetală. În emulsie se încorporează supernatantul culturilor de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, obținut după centrifugarea culturilor de microorganisme ca atare și sterilizat la 110șC, timp de 20 minute. Compoziția emulsiilor a fost următoarea: ulei de floarea soarelui, 16 ml; lecitină vegetală, 0,5 g; supernatant (nesteril/sterilizat), 4 ml; mediu Sabouraud pentru martor, 4 ml. În vederea testării activității antimicrobiene s-a adoptat următoarea procedură de lucru: în plăci Petri cu mediu Sabouraud solid s-au introdus rondele de hârtie de filtru impregnate cu emulsiile de metaboliți, respectiv martor, și s-a inoculat cu Aspergillus niger 105 (colecție ICECHIM). A fost urmărită evoluția culturilor pe o perioadă de 7 zile.

6.I.2.4. Condiționarea biomasei bacteriene sub formă de granule sferonizate

Tulpina Bacillus parabrevis B50 a fost multiplicată și inclusă într-o compoziție care să-i faciliteze colonizarea substratului de creștere și/sau a rizosferei. Multiplicarea s-a realizat pe un mediu care conținea 10 g/l glucoză, 1,5 g/l autolizat de drojdie, K2HPO4 1,0 g/l, MgSO4·7H2O 0,2 g/l, CaCl2. 2H2O 0,1 g/l. Mediu lichid a fost corectat la pH 6,5 cu NaOH 1 N, repartizat câte 150 ml în Erlenmayer de 1 l și agitat 150 rpm pe un agitator orbital (Unimax 1010, Heidolph Instrument) la 28°C, 48 ore. După 48 ore s-a atins un nivel al populației bacteriene de 5,8 x109 ufc/ml. Această suspensie bacteriană a fost condiționată în granule. 35 ml de suspensie s-au adăugat peste 90 g de amestec format din 76 g făină integrală de ovăz, 10 g amestec care include esteri etilici ai acizilor grași, lecitină, săpun de potasiu, glicerină, lipide din ulei de rapiță și 4 g alcool polivinilic (26-88, pulbere EMPROVE®, Merck, Darmstadt, Germania). Pasta rezultată a fost extrudată pe o mașină de făcut paste (Model TR95A, Helco, Craiova, România), iar tăițeii rezultați au fost granulați pe un echipament de sferonizare (model Spheronis R-250m Grabler, Ettlingen, Germania). Granulele rezultate au fost uscate într-un uscător în pat fluid (Model TC20, Retsch, Germania), la o temperatură maximă de 40°C.

Amestecul de esteri etilici ai acizilor grași, lecitină, săpun de potasiu, glicerină, lipide nesaponificabile din ulei de rapiță utilizat a avut următoarea compoziție (% m/m): esteri etilici de acizi grași (FAEE) 48,7; grăsimi nereacționate din ulei de rapiță 4; glicerol 4,5; săpun de potasiu 7,5, lecitină 34,6 și apă 0,7.

Compoziția cu eliberare controlată pe baza tulpinii B. parabrevis B50 astfel obținută este alcătuită din 76 părți făină integrală de ovăz, 4,8 părți esteri etilici ai acizilor grași, 4 părți alcool polivinilic, 3,5 părți lecitină, 0,75 părți săpun de potasiu, 0,45 părți glicerol, 0,4 părți grăsimi din ulei de rapiță, restul până la 100 părți apă și min. 108 ufc/g B. parabrevis B50. Numărul de bacterii B. parabrevis B50 în compoziția realizată a fost verificat prin suspendarea a 0,1 g de compoziție în tampon fosfat salin steril, diluarea serială a suspensiei inițiale și etalarea pe nutrient agar.

Bioprodusul granule sferonizate rezultat prin aplicarea procedeului descris mai sus pe tulpina B. parabrevis B50 a fost testat din punct de vedere al capacității antagoniste in vivo, pentru protecția plantelor ornamentale împotriva agenților fitopatogeni de sol. Semințe de mușcată hibridă (Pelargonium x horitorul) „Moulin Rouge” au fost însămânțate în aprilie, pentru a obține plantele stoc, din care s-au obținut prin butășire, la începutul lunii septembrie, plantele pentru experimente. Butașii au fost plasați în cameră umedă în vermiculită, pentru a stimula dezvoltarea rădăcinilor. După trei săptămâni butași uniformi ca dezvoltare a rădăcinilor și tulpinii au fost plantați în ghivece de plastic de 15 cm, conținând un substrat de creștere îmbogățit cu nutrienți pentru primele săptămâni de creștere (Canna Terra Professional Plus, Canna International BV, Oosterhout, Olanda). Ghivecele au fost menținute în condiții de seră, la 22±2șC în timpul zilei și 17±2°C în timpul nopții, cu o fotoperioadă de 12 ore, suplimentată cu lumină cu intensitatea de 160 mcE/m2/s, provenită din lămpi cu halogen, atunci când intensitatea luminoasă scădea sub 500 mcE/m2/s. Substratul conținea rezerve de nutrienți inițiale, astfel încât plantele au fost fertilizate numai după trei săptămâni de creștere, prin aplicarea a 100 ml de soluție nutritivă 1 g/l de îngrășământ 20–8–20 (N–P2O5–K2O, Eurofertil, TimacAgro Romania).

Experimentul de testare in vitro a inclus următoarele variante:

V1 – martor neinoculat (cu fitopatogen sau B50);

V2 – sol inoculat cu P. ultimum DSM 62987, 106 propagule/ml, 8 săptămâni după transplantare;

V3 – sol tratat cu bioprodus B. parabrevis B50, echivalent 20 g/m2, la 4 săptămâni de la transplantare;

V4 – sol tratat cu bioprodus B. parabrevis B50, echivalent 20 g/m2, la 4 săptămâni de la transplantare și cu Pythium ultimum DSM 62987, 106 propagule/ml, 8 săptămâni după transplantare.

Fiecare variantă a inclus 12 ghivece, care au fost aranjate în blocuri de câte trei per repetiție, într-o schemă randomizată de tip pătrat latin, 4 variante în 4 repetiții.

La 4 săptămâni de la transplantarea butașilor în sol au fost tratate variantele V3 și V4, cu câte 1,5 g de produs per vas de vegetație, corespunzând la 20 g bioprodus echivalent per m2, conținând108 ufc/ml spori de B. parabrevis B50. La 8 săptămâni de la transplantarea butașilor au fost inoculate variantele V2 și V4 cu Pythium ultimum. Întrucât la temperatura camerei P. ultimum nu produce zoospori (Van der Plaats-Niterink, 1981), suspensia de propagule de P. ultimum a fost realizată din hife și oospori, fiind preparată prin cultivare pe mediu lichid (erlenmeyere de 250 ml), care conțineau 100 ml de mediu lichid cartof – glucoză, incubat pe un agitator rotativ, la 150 rotații pe min, timp de 7 zile la 24°C. Numărul de propagule a fost determinat prin numărare la cameră de numărare, aducându-se la 106 ufc/ml în mediu lichid cartof – glucoză.

La 4 săptămâni de la infecția cu P. ultimum, respectiv 12 săptămâni de la butășire, a fost cântărită masa proaspătă și cea uscată a rădăcinilor și a părților aeriene (tulpini și frunze) ale plantelor de mușcată. Datele au fost prelucrate statistic prin analiza varianței (Statistica 10, Stat Soft).

6.I.2.5. Condiționarea sporilor bacterieni sub formă de tabletă efervescentă

Procedeul utilizat a constat în următoarele etape: cultivarea axenică pe medii minimale lichide, care includ 2% dioxid de siliciu coloidal, la pH optim și la aerări de până la 50% saturație de oxigen, cu varierea temperaturii de incubare cu un interval de 10°C, 12 ore la 20°C și 12 ore la 30°C, timp de 3-5 zile; recoltarea biomasei de microorganisme și a dioxidului de siliciu coloidal rezidual prin filtrare sub vacuum de min. -0,5 bar; uscarea biomasei de microorganisme și a siliciului coloidal, recoltate prin filtrare, până la max. 5% umiditate reziduală; omogenizarea a 9-11 părți biomasă de microorganisme și siliciu coloidal, cu 14,2 -14,7 părți bicarbonat de sodiu, 4,5-4,9 părți acid alginic, 4,3-4,5 părți acid tartric, 2,2-2,4 părți alcool polivinilic, 3 părți croscarmeloză, 59,4-61,9 părți celuloză microcristalină, părțile fiind exprimate în unități de masă; granularea umedă a compoziției de mai sus cu 15 părți de soluție alcoolică, care conțin 0,7 părți lecitină modificată, cu o balanță hidrofil – lipofilă HLB mai mare de 8, urmată de uscarea în pat fluidizat, la o temperatură de max. 40°C, până la o umiditate reziduală de max. 2%; comprimarea granulelor la 60 MPa, într-o matriță cu diametru de 1,3 cm, cu formarea unor tablete efervescente de 1 g. Etapa de omogenizare a biomasei de bacterii și a siliciului coloidal uscate s-a realizat în următoarele proporții: 9 părți biomasă de microorganisme și siliciu coloidal uscate, cu 14,2 părți bicarbonat de sodiu, 4,5 părți acid alginic, 4,3 părți acid tartric, 2,4 părți alcool polivinilic, 3 părți croscarmeloză, 61,9 părți celuloză microcristalină, părțile fiind exprimate în unități de masă. La sfârșitul procedeului de condiționare s-a realizat determinarea numărului de bacterii înglobate în tableta efervescentă, prin recultivare pe medii specifice. Tableta a fost dezintegrată în apă pură, în raport de 1 g la 100 ml, iar suspensia rezultată a fost supusă unui tratament termic, prin fierbere timp de 3 min. Această testare a numărului de bacterii s-a repetat timp de 6 luni. S-a determinat și păstrarea caracteristicilor de antagonism in vitro față de fungii fitopatogeni după condiționare, prin metoda culturilor duble.

6.I.2.5. Condiționarea sporilor bacterieni sub formă de pelete bioactivate

Procedeul utilizat a fost alcătuit din următoarele etape: cultivarea axenică pe medii minimale lichide, care includ 2% diatomită, la pH optim și la aerări de până la 50% saturație de oxigen, cu varierea temperaturii de incubare cu un interval de 10°C, 12 ore la 20°C și 12 ore la 30°C, timp de 3-5 zile; recoltarea biomasei de microorganisme și a diatomitei prin filtrare sub vacuum de min. -0,5 bar; uscarea biomasei de microorganisme și a diatomitei, recoltate prin filtrare, până la max. 5% umiditate reziduală; omogenizarea a 9-11 părți biomasă de microorganisme și diatomită, cu 1,5-2,5 părți lignosulfonat de sodiu, 2,2-2,4 părți lecitină, 84,3-87,1 părți de substrat epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus, uscat până la 14% umiditate reziduală și măcinat la o granulație de 1-2 mm, părțile fiind exprimate în unități de masă; compactarea amestecului biomasă microorganism – diatomită – lignosulfonat de sodiu – lecitină – substrat epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus, prin presare într-o presă de pelete cu matrițe orizontale, pentru a forma pelete cu lungimea de aprox. 15 mm și diametrul de 5-8 mm. Lignosulfonatul de sodiu folosit a fost Borresperse NA (Borregarrd, Sarspborg, Norvegia), cu următoarele caracteristici: substanță uscată min. 93%; calciu max. 0,6%, pH (soluție 10%) 8,3±0,8. Lecitina folosită a fost Thermolec® WFC, Archer Daniels Midland (Decatur, IL, SUA), cu o balanță hidrofil-lipofilă mai mare de 8.

Amestecul rezultat prin omogenizare în pat fluidizat a fost peletizat prin folosirea unei prese de pelete cu matrițe orizontale, model Kahl 14-175 (Amandus Kahl, Reinbek / Hamburg, Germania), la o putere specifică de 1 kW pentru 0,015-0,02 m2, cu menținerea temperaturii amestecului de peletizat la circa 65°C, pentru a forma pelete cu lungimea de aprox. 15 mm și diametrul de 5-8 mm.

Din peletele bioactivate s-a realizat un experiment în care s-a determinat eliberarea de siliciu solubil (acid orto-silicic) și de poliamine. O cantitate de 1 g de pelete bioactivate a fost suspendată în 100 ml de apă pură, distribuită în vase din HDPE (Nalgene, Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA. S-au închis vasele cu vată și s-au incubat cu agitare la 5 rpm, timp de trei săptămâni. Din două în două zile s-au prelevat aseptic probe în care s-a determinat conținutul de acid orotosilicic și de poliamine totale (cadaverină, putresceină, spermină, spermidină). Pentru determinarea acidului ortosilicic s-a utilizat 1 ml de probă, care a fost adus în tuburi Eppendorf conice de 5 ml (Eppendorf, Hamburg, Germania). Conținutul de acid ortosilicic liber a fost determinat prin utilizarea unei metode spectrofotometrice (Coradin și colab., 2004), cu un kit Merck (Merck Silicate Assay, 1.14794, Merck-Millipore). Această metodă spectrofotometrică este bazată pe reacția dintre silicat și ionii molibdat, pentru a forma un complex colorat de silicomolibdat albastru, care poate fi detectat spectrofotometric la 810 nm. Concentrația absolută de acid silicic a fost calculată după construcția unei curbe de calibrare, folosind un standard de siliciu (Merck 170236, Merck-Millipore). Poliaminele au fost determinate prin utilizarea unei metode lichid cromatografice (Taibi și colab., 2000), care permite cuantificarea celor mai importante biologic poliamine – cadaverină, putresceină, spermină, spermidină. Ca martor în cadrul acestui test s-au utilizat pelete de substrat epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus, care nu aveau incluse tulpini de microorganisme / bacterii.

6.I.3. Rezultate și Discuții

6.I.3.1. Teste de activitate antimicrobiană pentru sorturile de capsule de agar cu conținut de 1% acid sorbic, acoperite cu peliculă polimerică compozită, alcool polivinilic – celuloză bacteriană (PVA-BC), comparativ cu capsulele neprotejate și cu capsule simple de agar.

Testele au fost efectuate în plăci Petri pe culturi de Aspergillus niger. În figura 6.I.1. sunt prezentate rezultatele după 48, respectiv, 120 de ore. Deși în primele 48 de ore zona de inhibiție pentru capsulele de agar neprotejate a fost mai mare, de circa 21 mm comparativ cu 18-19 mm pentru capsulele acoperite cu peliculă polimerică, după 120 de ore s-a constatat o mai bună rezistență a celor din urmă, ceea ce dovedește faptul că substanța activă s-a eliberat în mediu treptat. Aceste rezultate preliminare au fost utilizate pentru a demonstra eficiența procedeului de condiționare a biomasei bacteriene sub formă de capsule.

În vederea eficientizării utilizării la întreaga capacitate a activității biocide, a fost propusă încapsularea metaboliților bacterieni sau aplicarea acestora sub formă de emulsie.

6.I.3.2. Încapsularea metaboliților bacterieni

Experimentele preliminare au relevat eficiența încapsulării substanțelor cu acțiune biocidă în biopolimeri naturali, facilitându-se în acest mod eliberarea controlată din mediul de încapsulare. Ca material de încapsulare s-a ales agarul, în care s-au încapsulat metaboliții bacterieni (supernatantul), respectiv concentratele acestora obținute prin distilare în condiții care să protejeze substanțele active din supernatant de degradarea termică. Capsulele de agar s-au obținut prin picurarea soluțiilor în ulei vegetal. Acțiunea antimicrobiană a capsulelor care conțineau metaboliți microbieni / concentrate de metaboliți microbieni a fost testată față de tulpina toxigenă de Aspergillus niger. Rezultatele testelor, după 6 zile, pentru metaboliții bacterieni, sunt prezentate în figurile 6.I.2. și 6.I.3. Aceste rezultate demonstrează o bună eficacitate a metaboliților microbieni condiționați. Din analiza rezultatelor testelor se remarcă faptul că, activitatea antifungică a metaboliților produși de tulpina testată de Bacillus amyloliquefaciens, este mai pronunțată în cazul în care se utilizează capsule cu supernatant concentrat prin distilare (fig. 6.1.2.).

În cazul capsulelor cu metaboliți produși de tulpina testată de Bacillus subtilis, diferențele dintre concentrat și supernatant au fost mici, observându-se o inhibiție mai bună în cazul utilizării supernatantului neconcentrat. Aceste rezultate sugerează existența unui metabolit bacterian cu o termolabilitate pronunțată în supernatantele mediilor de cultură ale tulpinii de Bacillus subtilis testate. Cel mai probabil acești compuși antifungici cu o termolabilitate crescută sunt din categoria proteinelor cu activitate antifungică secretate în mediu de bacteriile din genul Bacillus (Li și colab., 2009; Wong și colab., 2008) și nu din categoria lipopeptidelor antifungice, care au o stabilitate termică ridicată (Grover și colab., 2010; Hu și colab., 2007).

6.I.3.3. Condiționarea metaboliților bacterieni sub formă de emulsie.

Aplicarea foliară de biocide sub formă lichidă este mai avantajoasă decât sub formă de pulbere. În acest sens, s-a încercat condiționarea metaboliților bacterieni sub formă de emulsie, care poate oferi o protecție împotriva degradării rapide a compusului activ. Emulsiile au fost realizate în ulei de floarea soarelui, ca agent tensioactiv fiind utilizată lecitina vegetală. În emulsie se încorporează supernatantele culturilor de Bacillus subtilis și Bacillus amyloliquefaciens, obținute după centrifugarea culturilor de microorganisme, ca atare și sterilizat. Compoziția emulsiilor a fost următoarea: ulei de floarea soarelui, 16 ml; lecitină vegetală, 0,5 g; supernatant (nesteril/sterilizat), 4 ml; mediu Sabouraud pentru martor, 4 ml.

Testarea activității antifungice față de Aspergillus niger, s-a realizat în plăci Petri cu mediu Sabouraud solid și a fost urmărită evoluția culturilor pe o perioadă de 7 zile (figurile 6.I.4. și 6.I.5.).

Sterilizarea reduce activitatea antifungică a metaboliților condiționați sub formă de emulsiei. Această diminuare a activității antifungice a metaboliților din supernatant este mai puțin pronunțată în cazul tulpinii de B. amyloliquefaciens (fig. 6.I.4) și este semnificativă în cazul tulpinii de B. subtilis (fig. 6.I.5). Rezultatele confirmă ipoteza existenței unei proteine antifungice cu o termolabilitate semnificativă în supernatantele culturii de B.subtilis testate. În cazul metaboliților secretați de B. amyloliquefaciens predomină probabil (lipo)peptide antibiotice cu o stabilitate termică mai ridicată, care-și păstrează o semnificativă activitate antifungică și după sterilizare.

6.I.3.4. Condiționarea biomasei bacteriene sub formă de granule sferonizate

Bioprodusul sub formă de granule sferonizate conține minim 108 ufc/g Bacillus parabrevis B50. Avantajul principal al formei de condiționare propuse este asigurarea unei colonizări uniforme și reproductibile de către tulpina B50 a substratului de creștere pe care se aplică respectivul bioprodus. În cazul aplicării bioprodusului / compoziției cu eliberare controlată, sporii rămași neeliberați din compoziția de granule sferonizate propuse fiind protejați de acțiunea bacteriostatică a lipopeptidelor cu activitate bacteriocinică (Abriouel și colab., 2011; Chowdhury și colab., 2015), sintetizate de formele vegetative ale aceleași tulpini provenite din primul val eliberat și care au colonizat deja substratul. Protejarea față de acțiunea bacteriostatică a antibioticelor datorită acumulării preponderente a lipopeptidelor bacteriocinice în componenta hidrofobă a compoziției de formulare.

Rezultatele sunt prezentate în tabelul 6.I.2. și demonstrează atât existenta unui antagonism al tulpinii Brevibacillus parabrevis B50 față de Pythium ultimun, cât și capacitatea acestei tulpini de a determina o stimulare a creșterii plantelor de mușcată, în condițiile experimentale date.

Tabel 6.I.2. Efectul tratamentelor cu Bacillus parabrevis B50 asupra dezvoltării bolii produse de Pythium ultimum la mușcate și asupra creșterii plantelor de mușcată

Rezultatele prezentate în tabelul 6.I.2. justifică considerarea tulpinii B. parabrevis B50 ca fiind o tulpină din categoria recent definită de rizobacterii cu acțiune de biostimulare a plantelor (Calvo și colab., 2014; du Jardin, 2015; Ruzzi și Aroca, 2015). Acest tip de microorganisme au atât un rol de protecție a plantelor față de stresurile biotice și abiotice, cât și un rol de stimulare, datorită facilitării preluării și utilizării nutrienților și accelerării unor procese fiziologice. Utilizarea acestor rizobacterii cu activitate de stimulare a plantelor este semnificativă, datorită versatilității lor. Având în vedere caracteristicile de biostimulant ale tulpinii B. parabrevis B50 aceasta a fost depusă într-o colecție internațională, National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Universitatea Corvinus din Budapesta, cu numărul de depozit NCAIM (P) B 001413 și protejată prin depunerea unor cereri de brevet (EP 2765185 A2, RO128931 A0).

Aceeași tulpină bacteriană B50 a fost folosită și pentru condiționarea, sub formă de tabletă efervescentă și sub formă de peleți, bioactivate. Prin respectivele condiționări s-a urmărit valorificarea mai bună a caracteristicilor de biostimulant pentru plante.

6.I.3.5. Condiționarea sporilor bacterieni sub formă de tabletă efervescentă

În figura 6.I.6. este reprezentată evoluția numărului de spori bacterieni în tabletele efervescente realizate în cadrul acestei lucrări. Testele realizate au demonstrat că sporii bacterieni supraviețuiesc procedeului de condiționare și sunt stabile în compoziția rezultată. De asemenea, eliberarea din tableta efervescentă nu afectează semnificativ rata de supraviețuire, bacteriile fiind protejate față de variațiile de pH induse de sistemul efervescent, datorită procedeului de cultivare, în condiții care să favorizeze exprimarea mecanismelor interne de rezistență la factorii externi, inclusiv prin favorizarea efectului protector al acidului ortosilicic.

Figura 6.I.6. Supraviețuirea sporilor bacterieni de Bacillus parabrevis B50 în compoziția

de tabletă efervescentă realizată

În figura 6.I.7. este prezentată păstrarea caracteristicilor de inhibare a fungilor fitopatogeni după condiționare, sub formă de tabletă efervescentă a bacteriilor biostimulante B. parabrevis B50.

Figura 6.I.7. Păstrarea caracteristicilor biologice de antagonism in vivo ale bacteriei Bacillus parabrevis B50 după condiționarea ca tabletă efervescentă, evidențiată prin metoda culturilor duble. a-c) antagonism față de Rhizoctonia solanii ATCC 66873: a – inoculare cu suspensie de bacterii B50 după cultivare peste noapte pe mediu LB; b – martor agent fitopatogen; c – suspensie de bacterii B50 provenite din tableta efervescentă. d-f) antagonism față de Alternaria alternata DSM 12633: d- inoculare cu suspensie de bacterii B50 după cultivare peste noapte pe mediu LB; e – martor agent fitopatogen; f – suspensie de bacterii B50 provenite din tableta efervescentă

Această formă de condiționare a bacteriilor benefice plantelor de cultură prezintă următoarele avantaje: nu necesită condiții speciale de reducere a umidității la tabletare și, ulterior, la depozitare și transport, datorită higroscopicității reduse a sistemului efervescent, care include acid alginic și capacității ridicate de reținere a apei de către dioxidul de siliciu aflat în proporție mare; formează o compoziție care are o umectabilitate ameliorată, sub acțiunea lecitinei și a stearatului; cu o capacitate ridicată de autosuspendare în apă datorită sistemului efervescent, care este apoi menținută de agenții de suspendare pe care-i conține, alcool polivinilic, sau care se formează la dizolvare, alginatul de sodiu și citratul de sodiu; generează soluții care au o spumare redusă, datorită creșterii semnificative a vâscozității sub acțiunea combinată a alginatului de sodiu și a alcoolului polivinilic; suspensia de aplicare are o bună fixare de suprafața materialului vegetal după aplicare, sub acțiunea aderentă conjugată a alcoolului polivinilic și a alginatului de sodiu și formează pelicule pe suprafața resturilor vegetale pe care se aplică, în care apa este reținută de macromoleculele cu caracter hidrofil ridicat.

6.I.3.6. Condiționarea sporilor bacterieni sub formă de pelete bioactivate

Și în cazul procedeului de formulare a sporilor bacterieni sub formă de pelete bioactivate (biopelete) s-a urmărit obținerea, într-o primă etapă, a unei biomase de spori bacterieni cu rezistență ridicată. Rata de supraviețuire avansată a microorganismelor a fost realizată prin cultivare în condiții care să favorizeze exprimarea mecanismelor interne de rezistență la factorii externi, datorită efectului protector al acidului silicic, combinat cu șocurile de temperatură. Eliberarea constantă a unor concentrații mici, biologic active, de acid ortosilicic din diatomită, este prezentă datorită cultivării microorganismelor pe mediu minimal, care stimulează producerea de către microorganisme a biocompușilor implicați în solubilizarea acidului ortosilicic. Procedeul de condiționare dezvoltat reduce în mod semnificativ aderența substratului epuizat la matrița de peletizare, datorită efectului lubrifiant combinat al lignosulfonatului și al lecitinei.

Prin încorporarea bacteriilor B. parabrevis B50 în peletele realizate din substrat epuizat de ciuperci Pleurotus, s-a urmărit și optimizarea eliberării compușilor bioactivi. Așa cum s-a arătat, substratul epuizat de Pleurotus conține o serie de precursori ai unor compuși care au un efect dovedit de biostimulant: (i) bio-siliciu înglobat în matrici biologice cu stabilitate redusă datorită bioprocesării, care este precursor al siliciului solubil, compus cu acțiune de biostimulare recunoscută (Savvas și Ntatsi, 2015); (ii) chitină, precursor al chitosanului biostimulant pentru plante (Pichyangkura și Chadchawan, 2015); (iii) proteine, precursor al aminoacizilor și al poliaminelor, compuși cu activitate de biostimulanți pentru plante (Calvo și colab., 2014; Kusano și colab., 2008; Xie și colab., 2014).

În figura 6.I.8., este prezentată dinamica eliberării acidului ortosilicic și a poliaminelor din peletele bioactivate cu bacterii Bacillus parabrevis B50. Tratamentul cu bacterii B50 mărește semnificativ eliberarea de poliamine și de siliciu solubil (acid ortosilicic).

Figura 6.I.8. Dinamica eliberării acidului ortosilicic și a poliaminelor totale din biopeletele provenite din substrat epuizat de la cultura ciupercilor Pleurotus, în care sunt înglobate

bacterii Bacillus parabrevis B50

Siliciul (ca acid ortosilicic, non-disociat la pH-ul solului, biodisponibil pentru preluare de către rădăcinile plantelor) este un biostimulant pentru plante, care influențează absorbția și eficiența utilizării nutrienților, întârzierea senescenței plantelor și atenuează efectele stresurilor abiotice si biotice la plante (Savvas și Ntatsi, în 2015), din cauza activării de spectru larg a sistemului de apărare din plante (Van Bockhaven și colab., 2013). Poliaminele sunt factori de endo – și exo-semnalizare, implicați în creșterea și dezvoltare plantelor (Kusano și colab., 2008), răspunsul plantelor la stresurile biotice (Jimenez-Bremont și colab., 2014) și abiotice (Marco și colab., 2011), ca și în interacțiunile dintre plante și microorganismele benefice (Nassar și colab., 2003; Perrig și colab., 2007; Xie și colab., 2014). Peletele bioactivate reprezintă deci o modalitate prin care activitatea biostimulantă a bacteriilor B. parabrevis B50 este amplificată de compuși cu efect biostimulant a căror rată de eliberare din peleții de substrat de ciuperci epuizat este crescută semnificativ datorită înglobării respectivei tulpini.

6.4. Concluzii

Activitatea antifungică față de tulpina toxigenă de Aspergillus niger 105 a supernatantelor obținute prin cultivarea tulpinii de Bacillus amyloliquefaciens, sub formă de concentrate, a fost mai bună comparativ cu cea a supernatantului ca atare, spre deosebire de Bacillus subtilis, pentru care diferențele între concentrat și supernatant au fost mici, observându-se o inhibiție mai bună la supernatantul ca atare, față de supernatantul neconcentrat.

În toate cazurile emulsiile preparate cu supernatant nesterilizat prin autoclavare au prezentat activitate antifungică superioară celui sterilizat, fapt care sugerează existența unor metaboliți microbieni cu activitate antifungică care au o stabilitate termică redusă.

A fost obținut un bioprodus sub formă de granule sferonizate prin utilizarea unei variante a procedeului de înglobare în făinuri vegetale, urmat de producerea de tăiței și sferonizarea acestora. Prin realizarea acestei variante s-a urmărit o eliberare treptată a bacililor condiționați în rizosfera plantelor, pentru a ameliora colonizarea și exprimarea superioară a caracteristicilor benefice. Aplicarea acestui procedeu de condiționare pe tulpina Brevibacillus parabrevis B50 a permis păstrarea caracteristicilor sale de biostimulant, exprimate atât prin protecția biologică a plantelor față de agenți fitopatogeni, ca și prin stimularea creșterii și dezvoltării plantelor.

A fost realizat un procedeu de formulare ca tabletă efervescentă, ce a inclus cultivarea în condiții care să favorizeze exprimarea mecanismelor interne de rezistență la factorii externi. Biomasa de microorganisme și siliciu coloidal a fost amestecată cu ingredientele de condiționare, bicarbonat de sodiu, părți acid alginic acid tartric, 2,2-2,4 alcool polivinilic, croscarmeloză, celuloză microcristalină, granulată umed în prezență de lecitină modificată, uscată în pat fluidizat. Compoziția granulară rezultată a fost comprimată la 60 MPa, într-o matriță cu diametru de 1,3 cm, cu formarea unor tablete efervescente de 1 g. În tabletele efervescente formate se păstrează activitatea biologică a tulpinii Brevibacillus parabrevis B50.

S-au înglobat spori bacterieni proveniți din tulpina B. parabrevis B50 în pulbere de substrat epuizat provenit de la cultivarea ciupercilor Pleurotus. Prin înglobarea respectivelor bacterii s-a obținut un bioprodus din care se eliberează accelerat compuși cu acțiune biostimulantă asupra plantelor, acid ortosilicic și poliamine.

6.II. Condiționarea tulpinilor de Trichoderma cu acțiune de biostimulare a plantelor de cultură și acțiune puternic antagonistă față de cei mai

importanți agenți fitopatogeni

6.II.1. Introducere

În cadrul acestui subcapitol prezentăm rezultatele obținute în ceea ce privește condiționarea tulpinilor de Trichoderma multi-funcționale, care au atât o acțiune de biostimulare a plantelor de cultură, cât și puternic antagonistă față de cei mai importanți agenți fitopatogeni. Astfel de tulpini cu utilizări multiple au fost deja descrise. Brevetul SUA 8877481 B2 descrie utilizarea unor tulpini de Trichoderma, Trichoderma atroviride WW10TC4 (număr de depozit ATCC PTA 9707), Trichoderma harzianum RR17Bc (număr de depozit ATCC PTA 9708), Trichoderma harzianum F11 Bab (număr de depozit ATCC PTA 9709), aplicate separat sau în combinații ale acestora, pentru: inducerea rezistenței plantelor la stresuri biotice și abiotice; reducerea impactului negativ al azotatului în exces (emisii de protoxid de azot din sol, levigarea ionilor azotat în acvifer și ape de suprafață) datorită creșterii eficienței de utilizare a azotului de către plante; mărirea cantității de carbon sechestrat din atmosferă datorită intensificării proceselor de fotosinteză în plantele a căror rizosferă este colonizată de respectivele tulpini.

Spre deosebire de bacteriile endo-sporulante gram-pozitive (familia Bacillaceae), cu forme de răspândire prin spori, care au o mare rezistență la factorii de mediu adverși, propagulele tulpinilor de Trichoderma (conidii, chlamidospori) sunt mai sensibile la temperaturi ridicate, ca și la uscare. Procedeele de condiționare care au fost dezvoltate în cadrul acestei lucrări au urmărit mărirea ratei de supraviețuire la condiționare. Pentru a crește supraviețuirea propagulelor fungice de Trichoderma, s-a realizat un procedeu de condiționare sub formă de granule cu eliberare controlată care a implicat cultivarea pe medii semisolide, urmată de extrudere și granulare prin sferonizare. O altă soluție care a fost utilizată a fost aceea a realizării unor consorții comptabile, care au fost apoi condiționate sub formă de perle de alginat de sodiu. O modalitate inovativă de condiționare a fost aceea prin utilizarea suporturilor ceramice poroase. S-au utilizat ca suport de condiționare și peletele provenite prin densificarea substratului epuizat de la cultura ciupercilor Pleurotus. De asemenea, s-a realizat și o condiționare a propagulelor de Trichoderma sub formă de pulbere granulată umectabilă („dry flowable”).

Rezultatele vor fi prezentate după o detaliere a materialului și a metodelor folosite. Aceste rezultate vor fi în continuare discutate, pentru a se preciza modul în care contribuie la atingerea obiectivelor acestei lucrări referitoare la dezvoltarea cunoașterii în domeniu și la aplicarea în practică a rezultatelor obținute.

6.II.2. Materiale și Metode

6.II.2.1. Condiționare sub formă de granule cu eliberare controlată

Granulele cu eliberare controlată au fost realizate în cadrul unui procedeu care urmărea dezvoltarea unui activator pentru obținerea compostului odorant din coajă de conifere. Compoziția cu eliberare controlată dezvoltată în cadrul acestui procedeu a fost destinată facilitării colonizării materialelor destinate compostării, asigurând supraviețuirea propagulelor neeliberate și după colonizarea inițială a substratului cu tulpina producătoare de compuși volatili fungistatici, inclusiv pentru propagulele aceleași tulpini aflate în stare de dormantă, și, în final, accelerarea procesului de obținere a composturilor destinate utilizării pentru mulcirea solului culturilor ornamentale.

Pentru acest procedeu s-au folosit tulpini de Trichoderma cu activitate antagonistă, care produc compuși bioactivi odoranți. Izolarea tulpinilor de Trichoderma, selectarea de tulpini cu activitate antagonistă, activitate de hidroliză a carboximetilcelulozei și de producere a compușilor odoranți a fost prezentată în cadrul experimentelor derulate în capitolele 2 și 4 ale tezei, selectându-se izolatele Trichoderma asperellum T36 și T50. Acestea prezintă potențial antagonistic față de o serie de agenți fitopatogeni virulenți. Tulpinile Trichoderma asperellum T36 și Trichoderma asperellum T50 sunt puternic antagoniste față de următoarele tulpini fitopatogene: Fusarium graminearum, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis allii, Verticillium dahliae, Phytophthora parasitica, inclusiv datorită producerii unor metaboliți volatili și odoranți: 6-pentil-α-pironă, Aceste tulpini accelerează formarea de compost supresiv din coajă de brad. T. asperellum T36 și T. asperellum T50 au înregistrat și o foarte bună activitate chitinazică și celulazică.

Procedeul utilizat pentru realizarea unei formulări granulare filmate, cu eliberare controlată a tulpinilor de Trichoderma, este ilustrat în figura 6.II.1. S-a optat pentru un procedeu în care multiplicarea tulpinilor de Trichoderma se realizează în două trepte, inițial pe mediu lichid care stimulează producerea de -glucanaze, respectiv, un mediu cu zer / lactoză, cunoscută fiind eficiența lactozei în inducerea celulazelor / -glucanazelor (Ivanova și colab., 2013), iar ulterior pe mediu semisolid, prin care se amplifică producerea de enzime implicate în degradarea materialului lignocelulozic.

Figura 6.II.1. Ilustrarea procedeului de realizare a activatorului granular de compost, formulare cu eliberare controlată, granulă filmată

Biomasa de Trichoderma obținută pe mediu lichid s-a inoculat în pungi de polipropilenă (obținute din saci PP sterilizabili), care conțineau rumeguș umectat cu apă deionizată și sterilizat în prealabil la 121șC, timp de 25 de minute. După inoculare, s-a incubat 7 zile în camera climatică (Model SGC 120 LED, Weiss Gallenkamp, Lougborough, Marea Britanie). După 7 zile, biomasa de Trichoderma amestecată cu rumeguș parțial degradat, s-a malaxat, în raport de 1:1, cu o suspensie conținând 10% făină, 10% amestec de esteri etilici ai acizilor grași, lecitină, săpun de potasiu, glicerină, lipide din ulei de rapiță și 4% alcool polivinilic (pulbere Emprove, Merck, Darmstadt, Germania). Pasta de produs rezultată a fost extrudată pe o mașină de făcut paste / tăiței. Tăițeii rezultați au fost granulați pe un echipament de sferonizare (model Spheronis R-250 Grabler, Ettlinger Germania). Granulele rezultate au fost uscate într-un uscător în pat fluidizat (model TC20, Retsch, Germania), la o temperatură maximă de 37șC. O astfel de formulare, în care era inclusă o componentă hidrofobă, avea ca scop protejarea propagulelor

neeliberate de acțiunea toxică a principalului component volatil odorant produs de tulpinile selectate, respectiv 6-pentil-pirona. Pentil-pironele volatile produse de tulpinile de Trichoderma au un efect fungistatic și asupra celulelor vegetative / propagulelor din aceeași tulpină (Sarhy-Bagnon și colab., 2000).

Compoziția de bioprodus realizată a fost utilizată pentru obținerea de compost supresiv din coajă de brad. O cantitate de 10 kg de coajă de brad măcinată grosier a fost trecută în lighene de plastic de 30 litri și a fost tratată cu 100 ml T. asperellum T50 suspensie 106 spori/ml sau cu compoziție de bioprodus granular filmat, conținând 106 spori/g T. asperellum T50. S-a umectat cu 10 litri de soluție 2% (m/v) îngrășământ complex NP 20-20 în apă de robinet, conținând 4 g N și 4 g P2O5 și s-a omogenizat. S-a lucrat față de un martor tratat cu 100 ml apă sterilă, fiecare variantă în 4 repetiții. S-a menținut la temperatura camerei timp de 90 zile, în zilele 22, 44 și 66 efectuându-se analize ale conținutului de celuloză, lignină și 6-PP. Celuloza a fost determinată după delipidizarea substratului prin extracție la Soxhlet cu benzen, tratare repetată cu o soluție alcalină de carbonat de sodiu pentru îndepărtarea hemicelulozelor, hidroliză cu acid sulfuric, neutralizare cu hidroxid de sodiu și determinarea glucidelor reducătoare cu reactiv DNS (Wood și colab., 2012). Lignina a fost determinată gravimetric din probe, după extracții repetate la reflux cu soluții de acid sulfuric a materialului delapidata (Ehrman, 1996; Hatfield și Fukushima, 2005; Sluiter și colab., 2010). 6-PP a fost determinată gaz-cromatografic, după extragere în clorură de metilen (El-Hasan și colab., 2007). Toate experimentele au fost realizate în 4 repetiții, iar datele au fost prelucrate statistic prin analiza varianței (Statistica 10, StatSoft).

6.II.2.2. Condiționarea unui consorțiu de Trichoderma cu acțiune de biostimulare a plantelor de cultură sub formă de perle de alginat de calciu

În conformitate cu obiectivele proiectului în cadrul căruia s-au desfășurat activitățile de condiționare ale unui consorțiu de Trichoderma („Produse multifuncționale și inovative pentru alimente funcționale bioaugmentate și sigure din noi plante cultivate în România -MAIA”) a fost selectat un consorțiu de tulpini de Trichoderma, care au o acțiune de biostimulanți pentru plantele de cultură, cu o amorsare echilibrată a diferitelor căi de apărare, însoțită de activarea metabolismului secundar și de acumularea de compuși bioactivi / fitonutrienți în plantele de cultură, în special în cele nutraceutice. Pentru condiționarea acestui consorțiu de Trichoderma s-a optat pentru formularea sub formă de perle de alginat de calciu, în conformitate cu procedeul de coacervare a soluțiilor de alginat în prezența ionilor de calciu datorită fenomenului de gelifiere ionotropă (Reis și colab., 2006). Biomasa umedă a fiecăreia dintre cele două tulpini din consorțiu a fost reluată în tampon fosfat salin (TFS), în raport de 1:1. S-au amestecat proporții egale din cele două suspensii de tulpini de Trichoderma, și s-a adăugat apoi o soluție 5% de alginat de sodiu (în raport de 1ml soluție alginat la 1ml suspensie de biomasă) și aluminosilicat de sodiu (Florisil 50 0,1 g / 1g de biomasa umedă inițială). Suspensia rezultată a fost apoi coacervată prin picurare într-o soluție de CaCl2 0,25 M. Granulele umede formate au fost apoi uscate într-un uscător zonal în curent de aer cald (30-35șC). Procedeul de condiționare este ilustrat în fig. 6.II.2.

Figura 6.II.2. Prezentarea procedeului de condiționare sub formă de perle de alginat a consorțiului de tulpini biostimulante de Trichoderma

S-au realizat experimente pentru determinarea eliberării controlate din perlele de alginat de calciu, ca și experimente de determinare a păstrării caracteristicilor de antagonism după condiționarea tulpinilor sub formă de perle de alginat de calciu.

6.II.2.3. Condiționarea tulpinilor de Trichoderma pe suporturi ceramice poroase

A fost realizat un procedeu, ușor de ridicat la scară, de condiționare a microorganismelor benefice plantelor, în special a celor cu activitate de biostimulare a plantelor de cultură, în suporturi ceramice poroase, prin care să se asigure o rată ridicată de supraviețuire a microorganismelor și o obținere simplificată a bioprodusului care înglobează respectivele microorganisme. Procedeul a fost aplicat pentru tulpina biostimulantă T. asperellum T36, care are o semnificativă multi-funcționalitate (Răut și colab., 2015). Procedeul realizat constă în următoarele etape: cultivarea axenică pe medii minimale semi-lichide, care includ 20% ceramici poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic, la pH optim și aerare prin agitare, cu varierea temperaturii de incubare cu un interval de 10°C, 12 ore la 20°C și 12 ore la 30°C, timp de 3-5 zile; recoltarea biomasei de microorganisme și a ceramicilor poroase prin filtrare sub vacuum de min. -0,5 bar; uscarea biomasei de microorganisme și a ceramicilor poroase, până la max. 5% umiditate reziduală.

Ceramicele poroase cu capacitate de eliberare a acidului ortosilicic s-au obținut din: diatomită 40%, amestec Na2SiO3 + dioxid de siliciu coloidal, 1,5:1, 55% și 5% substrat epuizat de ciuperci Pleurotus, cultivate pe paie de grâu, amestecare – omogenizare – granulare continuă a ingredientelor, uscare la 104°C și calcinare la 960°C. Respectivele ceramici poroase eliberează constant în mediul de cultură acid ortosilicic, sub pragul de concentrație de 1 mM.

Diatomita utilizată pentru obținerea ceramicelor poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic are următoarele caracteristici: schelet de silice cu 85-95% SiO2, 6% Al2O3, 1% Fe2O3 și 0,35 % CaO. Amestecul de Na2SiO3 + sol SiO2 (3:2,5) utilizat pentru obținerea ceramicelor poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic a fost obținut dintr-o soluție apoasă de Na2SiO3 cu conținut de substanță solidă 33 -35% și dioxid de siliciu coloidal, fiind preparat prin adăugare treptată în porțiuni mici și amestecare continuă a celor două componente. Dioxidul de siliciu coloidal utilizat pentru obținerea ceramicele poroase cu capacitate mare de eliberare a acidului ortosilicic are o suprafață specifică BET cuprinsă între 129 și 155 m2/g, un conținut de siliciu de min. 39,50 % și generează suspensii cu un pH de 5,5. Uscarea biomasei de microorganisme și a ceramicelor poroase s-a realizat în pat fluidizat, în condiții blânde, la max. 40°C temperatură de operare.

A fost realizat un experiment de determinare a supraviețuiri propagulelor de Trichoderma înglobate în structurile de ceramici poroase. O cantitate de aprox. 5 g de granule ceramice conținând tulpina T. asperellum T36, cântărite cu precizie, a fost suspendată timp de 1 oră în 200 ml TFS. Din suspensia rezultată s-au preluat câte 0,25 ml care s-au inoculat pe un mediu selectiv (Williams și colab., 2003), care conținea 0,2 g MgSO4 . 7H2O, 0,9 g K2HPO4, 1,0 g NH4NO3, 0,15 g KCl, 0.15 g Roz Bengal (sare de sodiu, R3877 Sigma, Sigma – Aldrich, Saint Louis, MO, SUA), 3 g glucoză, 20 g agar în 950 ml apă distilată, la care s-au adăugat după sterilizare (prin autoclavare la 121șC pentru 20 min), ingredientele antimicrobiene care-i conferă specificitatea. Aceste ingredientele antimicrobiene care-i conferă specificitatea utilizate (exprimate per litru de mediu) sunt: 0,25 g cloramfenicol (C0378 Sigma – Aldrich), 9 ml de soluție stoc de streptomicină (1% masă/volum, S6501 Sigma-Aldrich), 0,2 g pentacloronitrobenzen (quintozene, P2205 Sigma-Aldrich) și 1,5 ml propamocarb condiționat (Previcur 607 SL, Bayer Crop Science, Monheim am Rhein, Germania, 607 g ingredient activ per litru). Toate aceste ingrediente s-au adus la 40 ml cu apă distilată sterilă, au fost sterilizate prin filtrare și apoi s-au adăugat la mediul bazal răcit la limita de solidificare.

6.II.2.4. Condiționarea pe pelete provenite din substrat epuizat de la cultura ciupercilor Pleurotus

Peletele provenite din substrat epuizat de la cultivarea ciupercilor Pleurotus au fost considerate ca fiind unul din amendamentele optime pentru reducerea efectelor negative ale sistemelor de agricultură conservativă, în cadrul proiectului „Managementul complex al resturilor vegetale în sistemele de agricultură conservativă – CERES”. Substratul epuizat de ciuperci Pleurotus (SPS) peletizat este mai potrivit pentru transportul pe distanțe lungi și pentru împrăștierea mecanică. Peleții au o eficiență fertilizantă mai ridicată (datorită eliberării controlate și inhibării nitrificării) și un impact de mediu redus (datorită inhibării eluției bazelor și unei mai scăzute eluvieri a nitratului). Scopul utilizării SPS este de a stimula activitatea chitinolitică în sol și de a asigura o mai bună supraviețuire și dezvoltare a microorganismelor aplicate pentru bioactivarea / fortifierea acestui substrat. Procedeul de peletizare a SPS elaborat implică folosirea unei mori de peleți și a unor osmoprotectanți accesibili (melasă sau vinasă conținând betaină), pentru a crește rata de supraviețuire a microorganismelor fortifiante inoculate în SPS.

(Glicin) Betaina, prezentă în melasă / vinasă în cantități mari este un donor de grupări metil, implicat în accelerarea ciclului metioninei (metionină – S-Adenozil-metionină – homocisteină – metionină). Acest ciclu al metioninei are rol în reglarea: (i) exprimării genelor prin metilare, inclusiv a răspunsului epigenetic la factorii de mediu și (ii) lanțului de molecule semnal, intra- și inter-celular, poliamine – oxid nitric – peroxinitrit. Ciclul metioninei este deci implicat în răspunsul organismelor la factorii de stres biotici și abiotici (Sauter și colab., 2013). Datorită acestei implicări, în reglarea metabolismului unor compuși cheie pentru răspunsul organismelor la factorii de stres din mediu, (glicin)betaina are un efect osmo-protectant (de protecție la variațiile de salinitate și/sau temperatură) și de anti-oxidant fiziologic, protejând microorganismele față de factorii de mediu adverși.

A fost elaborat un procedeu de peletizare a substratului epuizat de la cultura ciupercilor Pleurotus. Principalele aspecte ale acestui procedeu, care implică densificarea / comprimarea pulberii SPS prin forțarea trecerii printr-o matriță, sunt prezentate în figura 6.II.3.

Figura 6.II.3. Procedeu de peletizare a substratului epuizat de la cultura ciupercilor Pleurotus utilizat ca suport pentru dezvoltarea tulpinilor de Trichoderma. a) presa de peletizat cu matrițe orizontale utilizată în cadrul procedeului; b) aspectul matrițelor orizontale; c) formarea peleților în cadrul matriței; d) peleți de substrat epuizat cu consorții microbiene

Tulpina folosită pentru bioactivarea / fortifierea SPS este T. asperellum T36, descrisă deja în cadrul acestei lucrări. Această tulpină are o activitate chitinolitică semnificativă, care a fost evidențiată prin screening pe mediu cu chitină coloidală (4,5 g chitina coloidala, 0,3g MgSO4. 7H2O, 3 g ( NH4)SO4, 2 g KH2PO4, 1 g acid citric monohidrat, 15 g agar, 0.15 g bromcrezol purpuriu și 200 μl Tween 80, pH ajustat la 4,7). Datorită acestei activități chitinolitice a fost luată în considerare această tulpină pentru a fi utilizată ca fortifiant al peletelor SPS. Tulpina a fost cultivată pe mediu lichid cartof glucoză, iar suspensia rezultată, conținând 109 ufc/ml a fost inoculată pe peletele SPS, distribuite în plăci Roux, în raport de 1:1 (m/v). După o săptămână de incubare s-au prelevat peletele care s-au uscat într-un uscător în pat fluidizat (model TC20, Retsch). Peletele au fost menținute la temperatura camerei timp de 6 luni. S-au prelevat probe în care s-a determinat activitatea chitinazică (Sandhya și colab., 2004) și nivelul propagulelor de Trichoderma, prin folosirea mediului selectiv (Williams și colab., 2003).

6.II.2.5. Condiționarea sub formă de pulbere granulată umectabilă („dry flowable”)

Pulberea granulară umectabilă „dry-flowable” reprezintă una din formele de condiționare cele mai avantajoase, care combină stabilitatea formelor de păstrare a propagulelor dormante în stare uscată, cu versatilitatea formulărilor de aplicare lichide (Woo și colab., 2014). A fost dezvoltat un procedeu de formulare sub formă de pulbere granulară umectabilă, care implică două etape: (i) încapsularea tulpinilor de Trichoderma biostimulante și uscarea microcapsulelor prin pulverizare; (ii) amestecarea biomasei încapsulate uscate cu ingredientele de condiționare și condiționarea finală în pat fluidizat. Scopul încapsulării înaintea uscării prin pulverizare a fost acela de a crește rata de supraviețuire a tulpinilor de Trichoderma la uscare.

Biomasa a fost obținută prin cultivare pe mediu Weidling cu următoarea compoziție: glucoză 25 g; bactopeptonă 2 g; KH2PO4 1 g; MgSO4 1 g; FeCl3 0,1 g; apa deionizată și filtrată până la 1000ml; pH 6,4. După 5 zile, conidiile și clamidosporii au fost separați prin filtrare.

Procedeul de încapsulare și uscare a tulpinilor de Trichoderma biostimulante a fost alcătuit din următoarele etape: amestecarea a 800 ml soluție bicarbonat de sodiu 1 M cu 200 ml de suspensie, concentrată din tulpinile de T. asperellum T36 sau T50, conținând 5×1011 ufc/ml; adăugarea celor 1000 ml de suspensie de propagule Trichoderma în bicarbonat de sodiu 1 M peste 17,6 g acid alginic și solubilizarea acidului alginic prin formarea de alginat de sodiu și eliberare de bioxid de carbon; formarea microgranulelor sferice prin extrudarea suspensiei de celule de drojdie – alginat de sodiu cu ajutorul unui echipament Encapsulator B390 (Buchi, Flawil, Elveția), la o rată constantă de 0,25 ml/min. și sub acțiunea combinată a gravitației și a unui câmp electric format de un generator electrostatic de picături, care generează o diferență de potențial electric de 6 kV pe distanța de 2,5 cm între acul de formare a picăturilor și baia de coagulare cu soluție de CaCl2 0,25 M; menținerea timp de 30-35 min. a granulelor în soluția de clorură de calciu, pentru întărire; spălarea granulelor prin introducere timp de 15 min. în apă distilată; menținerea granulelor de alginat cu drojdie încapsulată până la utilizare în soluție fiziologică Ringer, dar nu mai mult de 48 ore; amestecarea a 300 g de granule de alginat cu tulpini de Trichoderma încapsulate cu 1000 ml soluție de bicarbonat de sodiu 0,1 M și omogenizarea suspensiei cu 0,75-0,85 g stearat de magneziu și 0,05-0,07 g ascorbat de sodiu; uscarea suspensiei astfel rezultate pe o instalație de uscare prin pulverizare, Mini-Spray Dryer B290 (Buchi), la o temperatură de intrare a agentului de uscare de 120-140șC și la o temperatură de ieșire a agentului de uscare de 65-70șC.

Procedeul de amestecare a biomasei încapsulate uscate cu ingredientele de condiționare și condiționarea finală în pat fluidizat a fost realizat pe un uscător / granulator în pat fluidizat Mini-Glatt (Glatt, Binzen, Germania), fiind alcătuit din următoarele etape: amestecarea a 28-28,5 g granule uscate cu 3,1-3,2 g acid acrilic, 2,9-3,0 g acid citric, 1,4 -1,6 g alcool polivinilic; dizolvarea separată a 0,7 -0,75 g de lecitină în 5 ml de alcool etilic; granularea umedă a 36-36,3 g de amestec conținând granule de alginat uscate cu 5 ml soluție alcoolică preparată ca mai sus; uscarea / condiționare a produsului rezultat ca urmare a granulării umede la temperatură de max. 30-35șC.

Au fost determinate caracteristici fizico-chimice ale formulării pulberii granulate umectabile, respectiv umectabilitatea, suspendabilitatea, spuma persistentă, pH-ul, umiditatea reziduală. Aceste caracteristici au fost determinate în apă dură standardWHO (metoda WHO/M/29), folosind metode standardizate CIPAC (Utz și colab., 1995). Determinările au fost realizate la începutul și la sfârșitul unei perioade de stocare de 6 luni.

Determinarea suspendabilității formulelor de pulbere umectabilă. S-au luat 5 g de biopreparat (cântărite la balanță tehnică) și s-au introdus într-un cilindru de 100 ml. S-a adăugat apă dură standard până la gradația 100. S-a agitat timp de 3 minute, după care s-a lăsat în repaus 60 minute. S-a sucționat suspensia de la gradația 10 în sus cu ajutorul unei trompe de apă. Ceea ce a rămas sub gradația 10 s-a trecut cantitativ într-o capsulă tarată, care s-a uscat la masă constantă și apoi s-a cântărit.

Suspendabilitatea s-a determinat după formula:

; în care:

m1 – masa (tara) capsulei de cântărire;

m2 – masa capsulei și a suspensiei adăugate;

5 – masa de produs luată inițial în lucru.

Prepararea apei dure standard. Apa dură standard s-a obținut prin amestecarea a 68,5 ml soluție A cu 17 ml soluție B într-un berzelius de 1000 ml. S-a diluat apoi cu circa 800 ml apă distilată și s-a adus pH-ul la 6-7 prin adăugare de NaOH 0,1 N. S-a transferat într-un vas cotat de 1000 ml și s-a adus la semn cu apă distilată.

Soluția A s-a preparat astfel: S-au cântărit 4 g carbonat de calciu și s-au transferat într-un flacon conic de 50 ml, cu o cantitate minimă de apă distilată. S-au adăugat încet 82 ml HCl 1 N, agitând conținutul. Când tot carbonatul de calciu s-a dizolvat, s-a diluat soluția la circa 400 ml cu apă distilată și s-a fiert pentru eliminarea CO2. S-a răcit soluția și apoi s-au adăugat 2 picături soluție roșu de metil și s-a neutralizat cu soluție de amoniac 1 N până la culoare intermediară portocalie. S-a transferat cantitativ într-un balon cotat de 1000 ml, s-a adus la semn cu apă distilată și apoi s-a transvazat pentru păstrare într-un flacon de polietilenă.

Soluția B s-a preparat astfel: s-au cântărit exact 1,613 g oxid de magneziu și s-au transferat într-un flacon de 500 ml cu o cantitate minimă de apă distilată. S-au adăugat 82 ml HCl 1 N. S-a reîncălzit încet până la dizolvare, s-a diluat la circa 400 ml cu apă distilată și s-a fiert pentru eliminarea CO2. S-a răcit soluția și apoi s-au adăugat 2 picături soluție roșu de metil și s-a neutralizat cu o soluție de amoniac 1 N până la culoarea intermediară portocalie. S-a transferat cantitativ într-un balon cotat de 1000 ml, s-a adus la semn cu apă distilată și s-a transvazat pentru păstrare într-un flacon de polietilenă.

Determinarea umectabilității formulelor de pulbere granulară umectabilă. O cantitate de 1 g biopreparat, cântărit la balanța tehnică, a fost depus pe meniscul (la suprafața) a 100 ml apă dură standard aflați într-un vas berzelius de 250 ml. S-a așteptat 1 minut, după care s-a verificat starea biopreparatului. În cazul unei formule cu umectabilitate corespunzătoare preparatul se dispersa complet în apă dură standard în mai puțin de 1 minut. În cazul formulelor necorespunzătoare, produsul forma la contact cu apa aglomerări în care pătrunderea apei se făcea greu și numai după aplicarea unei agitări mecanice viguroase.

Determinarea pH-ului. Valoarea pH-ului emulsiei sau suspensiei 5 % în apă distilată s-a determinat cu ajutorul pH-metrului cu electrod de sticlă, conform CIPAC MT 75: s-au cântărit 5 g de probă, s-au diluat până la 100 ml cu apă distilată. S-a agitat energic timp de 1 min. S-a măsurat pH-ul cu un electrod de sticlă.

Determinarea spumei persistente. Spuma persistentă s-a determinat conform CIPAC MT 47.2., după cum urmează: într-un cilindru de 250 ml gradații de 2 ml și cu distanța între marcajul 0 și 250 ml de 20 – 21,5 cm și între marcajul de 250 ml și vârful dopului de 4-6 cm s-au introdus aprox. 180 ml apă dură standard D (342 ppm CaCO3), cantitatea de microemulsie conform dozei de aplicare pentru 200 ml emulsie și s-a completat cu apă dură până la 200 ml.

S-a pus dopul și s-a răsturnat cilindrul la 1800 de 30 ori. S-a lăsat în repaus și s-a citit volumul spumei la 10 sec., 1 min., 3 min. și 12 min.± 10 sec.

În bioproduse a fost determinat și numărul de propagule viabile de Trichoderma, prin cultivare pe mediu selectiv (Williams și colab., 2003), ca și activitatea apei. Activitatea apei s-a determinat folosind un echipament dedicat (4TE, AquaLab, Pullman, WA, SUA), în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Determinările au fost făcute lunar, pentru bioproduse formulate ca pulberi granulare umectabile („dry-flowable”), menținute la temperatura camerei, în recipiente brune din material plastic (PET).

6.II.3. Rezultate și discuții

6.II.3.1. Condiționare sub formă de granule cu eliberare controlată – activator de compost

Compoziția cu eliberare controlată pe baza tulpinii T. harzianum Td50b rezultată este alcătuită din 70 părți rumeguș de lemn parțial hidrolizat, 10 părți făină, 4,8 părți esteri etilici ai acizilor grași, 4 părți alcool polivinilic, 3,5 părți lecitină, 0,75 părți săpun de potasiu, 0,45 părți glicerol, 0,4 părți grăsimi din ulei de rapiță, restul până la 100 părți apă și min. 106 ufc/g Trichoderma T50. Numărul de spori din tulpina T50 din compoziția de mai sus a fost determinat prin extragere în tampon fosfat salin, diluții seriale și cultivare pe mediul selectiv (William și colab., 2003). Compoziția realizată a fost utilizată pentru obținerea de compost supresiv din coajă de brad.

Rezultatele sunt prezentate în tab. 6.II.1. și demonstrează faptul că tratamentul cu tulpina T50 accelerează descompunerea materialului vegetal, iar compoziția sub formă granulară cu eliberare controlată facilitează acest proces de accelerare a degradării materialului vegetal utilizat, scoarța de brad. Nivelul de 6-PP se stabilizează la valori apropiate în cazul ambelor tratamente la care s-a aplicat tulpina T50, datorită volatilității compusului odorant. Rezultate similare au fost obținute și de alți autori în cazul fermentațiilor semisolide cu tulpini de Trichoderma producătoare de 6-pentil-α-pironă (El-Hasan și colab., 2007; Sarhy-Bagnon și colab., 2000).

Tabel 6.II.1. Accelerarea degradării scoarței de brad din substratul de compostare de către tulpina deTrichoderma asperellum T50 și acumularea de 6-pentil-α-pironă în material.

Valorile urmate de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P>0,05. ND – nedetectabil

Avantajele acestei compoziții sub formă granulară cu eliberare controlată, realizate în cadrul acestei lucrări sunt: asigurarea unei colonizări uniforme și reproductibile de către tulpina T50 cu propagule eliberate succesiv, datorită acumulării preponderente în componenta hidrofobă a compoziției de 6-pentil-pironă, compus volatil produs de populația provenită din primul val eliberat, deja dezvoltată în substrat și fungistatic pentru propagulele aceleași tulpini; accelerarea procesului de obținere a composturilor supresive și odorante prin folosirea compoziției care eliberează succesiv inocul de propagule ale tulpinii T50, înalt producătoare de celulaze; formarea unui compost supresiv pentru bolile plantelor ornamentale și cu caracteristici odorante superioare prin utilizarea tulpinii T50 ca activator de compostare, datorită unei colonizări extinse.

6.II.3.2. Condiționarea unui consorțiu de Trichoderma cu acțiune de biostimulare a plantelor de cultură sub formă de perle de alginat de calciu

Consorțiul de tulpini de Trichoderma, format din tulpinile T36 și T50, care au o acțiune de biostimulanți pentru plantele de cultură, determină o amorsare echilibrată a diferitelor căi de apărare, însoțită de activarea metabolismului secundar și de acumularea de compuși bioactivi / fitonutrienți în plantele de cultură, în special în cele nutraceutice. Acest consorțiu a fost utilizat pentru tratamente în vegetație ale plantelor de cultură nutraceutice recent introduse în cultură în România la partenerul Hofigal SA, din cadrul proiectului PN-II-PT-PCCA-2013-4-0995-160/2014, „Produse multifuncționale și inovative pentru alimente funcționale bioaugmentate și sigure din noi plante cultivate în România” (MAIA). Rezultatele parțiale obținute după primul an de experimentări, în curs de prelucrare și de publicare, susțin o amorsare echilibrată a diferitelor căi de apărare, datorită biodisponibilizării siliciului.

Un dezavantaj al tulpinilor / consorțiilor deja descrise este determinat de faptul că ele activează numai una din căile implicate în mecanismele de apărare din plante, de obicei calea acidului salicilic / rezistența dobândită sistemic (Shoresh și colab., 2010). Diferitele tipuri de răspunsuri de apărare sunt reglate de diferiți fitohormoni – acid salicilic (SA), acid jasmonic (JA), etilenă (ET) și acid abscisic (ABC) (Pieterse și colab., 2012). În general, SA este asociat cu rezistență la agenți patogeni biotrofi și la insectele care înțeapă și sug, iar JA și ET/ABA sunt asociate cu rezistență la agenți patogeni necrotrofi și, respectiv, la insectele care rup și mestecă. Căile SA / JA – ET-ABA sunt antagoniste / în disonanță, generând o balansare între rezistență la biotrofi / insecte care înțeapă și sug și necrotrofi / insecte care rup și mestecă. Diferitele forme de stres abiotic (temperaturi extreme, radiație solară, agenți chimici pro-oxidanți) intervin și ele în căile SA / JA-ET-ABA, în special prin modificarea nivelului speciilor reactive de oxigen si azot, inclusiv a celui de oxid nitric (Xia și colab., 2015). Toată această rețea de interacțiuni pozitive și negative determină în anumite situații o creștere a susceptibilității plantelor față de factori de stres biotici controlați de altă cale decât cea care a fost activată (Caarls și colab., 2015). Deci activarea sistemului defensiv de către tulpinile biostimulante de Trichoderma poate determina, concomitent cu creșterea rezistenței față de unii factori de stres biotic și abiotic, creșterea susceptibilității față de alți factori, la care calea de rezistență este în disonanță cu cea activată.

În figura 6.II.4 de mai jos sunt prezentate aspecte ale experimentelor de determinare a eliberării controlate din perlele de alginat de calciu, ca și cele referitoare la păstrarea caracteristicilor de antagonism după condiționare.

Figura 6.II.4. Eliberarea controlată a tulpinilor de Trichoderma din perle de alginat de calciu și păstrarea caracteristicilor de antagonism față de agenții fitopatogeni. a-c) aspectul plăcilor Petri în care s-au depus perle cu tulpini de Trichoderma: a-inițial; b-după 3 zile; c-după 7 zile.

d-f) păstrarea caracteristicilor de antagonism: d- culturi duble; e- gazon martor Fusarium graminearum DSM4527; f- depunere granule peste gazon de F. graminearum DSM4527

Formularea consorțiului de tulpini biostimulante de Trichoderma sub formă de perle de alginat de calciu a permis păstrarea caracteristicilor de antagonism, fără interacții reciproce negative între cele două tulpini. Această formulare are avantajul de a asigura o supraviețuire ridicată a microorganismelor la uscare, datorită protecției împotriva radicalilor liberi care se formează la uscare și care distrug integritatea sistemului de membrane celulare. Menținerea integrității membranelor (și în special a celor mitocondriale) reduce producerea de specii reactive de oxigen și, implicit, mortalitatea celulară produsă de acestea. Închiderea în gel de alginat de calciu presupune și un avantaj suplimentar – bioprodusele rezultate fiind de tipul celor cu eliberare controlată. Formulările de uz agricol cu eliberare controlată sunt “depozitanți cu eliminare lentă” ai microorganismului activ într-o anumită perioadă de timp; această eliberare lentă este determinată de includerea microorganismului într-o matrice de polimer biodegradabil.

6.II.2.3. Condiționarea tulpinilor de Trichoderma pe suporturi ceramice poroase

În figura 6.II.5. este reprezentată evoluția numărului de propagule de Trichoderma în suportul de ceramici poroase. Testele de supraviețuire realizate au demonstrat că respectivele propagule (conidii, clamidospori) supraviețuiesc procedeului de condiționare / uscare. De asemenea, eliberarea din structura poroasă de suport ceramic nu afectează semnificativ rata de supraviețuire, propagulele de Trichoderma fiind protejate față de stresul oxidativ asociat uscării, datorită procedeului de cultivare în condiții care să favorizeze exprimarea mecanismelor interne de rezistență la factorii de mediu agresivi.

Figura 6.II.5. Supraviețuirea propagulelor tulpinii biostimulante Trichoderma asperellum T36 în structurile ceramice poroase utilizate ca suport de condiționare

6.II.3.4. Condiționarea pe pelete provenite din substrat epuizat de la cultura ciupercilor Pleurotus

Scopul condiționării tulpinii biostimulante T36 pe pelete provenite din substrat epuizat de la cultura ciupercilor Pleurotus a fost acela de a amplifica activitatea chitinolitică a substraturilor tratate. Rezultatele prezentate în figura 6.II.6. confirmă existența unei relații de directă proporționalitate între activitatea chitinolitică și numărul de propagule din tulpina T36. Datorită inducerii acestei activități în tulpinile astfel condiționate, colonizarea diferitelor substrate tratate, este amplificată, în paralel cu inducerea activității chitinolitice. Activitatea chitinolitică a diferitelor substrate a fost asociată cu activitatea supresivă față de diferiți agenți fitopatogeni (Blaya și colab., 2013; Singh și colab., 1999).

Figura 6.II.6. Supraviețuirea propagulelor tulpinii biostimulante Trichoderma asperellum T36 în peletele de substrat epuizat de la cultura ciupercilor Pleurotus utilizate ca suport de condiționare

Tulpina biostimulantă T. asperellum T36 are o rată ridicată de supraviețuire după condiționarea în peletele provenite din substratul epuizat provenit de la cultura ciupercilor Pleurotus. Dezvoltarea ciupercilor pe acest substrat de condiționare este asociată unei induceri semnificative a activității chitinazice.

6.II.3.5. Condiționarea sub formă de pulbere granulată umectabilă („dry flowable”)

In tabelul 6.II.2. sunt prezentate principalele caracteristici biologice și fizico-chimice ale formulărilor sub formă de pulbere granulară umectabilă (dry flowable) ale tulpinilor de Trichoderma studiate.

Tabel 6.II.2. Principalelecaracteristici biologice și fizico-chimice ale formulărilor sub formă de pulbere granulară umectabilă ale tulpinilor de Trichoderma studiate

Importanța practică a acestor caracteritici prezentate în tabelul 6.II.2. este discutată în continuare.

Umectabilitatea / spontaneitatea de dispersie. Este o caracteristică care apreciază viteza cu care produsul se dispersează în apă fără agitare sau cu agitare minimală, denumită “umectabilitate” de către CIPAC și “spontaneitate de dispersie” de către ISO. Această caracteristică este esențială pentru utilizarea în practică a produsului, atunci când doza pentru suprafața tratată trebuie dispersată cât mai rapid în norma de udare corespunzătoare. In mod uzual, polizharidele din componența peretelui celular al microroganismelor condiționate au tendința de a forma structuri hidrocoloidale care rețin apa și reduc semnificativ umectabilitatea / spontaneitatea la dispersie.

Suspendabilitate. Este o caracteristică care indică stabilitatea suspensiei formate prin amestecare produsului în apă dură standard. Această caracteristică este esențială pentru repartizarea uniformă a dozei pe suprafața dată. Un bioprodus care are tendința de a separa ingrediente, în sepcial ingredientele active, nu va avea reproductibilitate la aplicare.

Spumă persistentă. Este o caracteristică importantă pentru asigurarea unei bune funcționării a aparatelor / mașinilor de stropit. O spumă persistentă va împiedica buna funcționare a duzelor de stropit, datorită formării bulelor de spumă.

pH-ul soluției rezultate prin suspendarea. Caracteristică care s-a considerat importantă pentru evitarea arsurilor pe plante la aplicarea bioprodusului.

Aceste caracteristici biologice și fizico-chimice depind în mod esențial de activitatea apei în substrat – figura 6.II.7. O activitate redusă a apei permite menținerea caracteristicilor optime.

Fig. 6.II.7. Evoluția activității apei în bioprodusele condiționate ca pulbere granulară umectabilă

Bioprodusele condiționate ca pulbere granulară umectabilă realizate în cadrul acestei lucrări au o bună stabilitate în timp, în special datorită faptului că nu-și modifică caracteristicile fizico-chimice esențiale, inclusiv cele asociate activității apei în substrat.

6.4. Concluzii

A fost realizată o condiționare a tulpinii T50 sub formă de granule filmate, cu eliberare controlată. Avantajele acestei formulări sunt: asigurarea unei colonizări uniforme și reproductibile de către tulpina T50 cu propagule eliberate succesiv; protejarea propagulelor ne-eliberate de toxicitatea reziduală a 6-pentil-pironei, compus volatil produs de populația provenită din primul val eliberat; accelerarea procesului de obținere a composturilor supresive și odorante; formarea unui compost supresiv pentru bolile plantelor ornamentale și cu caracteristici odorante superioare.

S-a realizat o condiționare sub formă de perle de alginat de calciu a consorțiului de tulpini de Trichoderma care determină o activare echilibrată a sistemelor de apărare din plante. Această formulare asigură menținerea caracteristicilor antagoniste față de agenți fitopatogeni, fără a amplifica eventualele interacții negative ale tulpinilor din consorțiu.

A fost realizat un procedeu de condiționare a tulpinilor de Trichoderma pe suporturi de ceramici poroase, care a inclus o etapă de cultivare în condiții care să favorizeze exprimarea mecanismelor interne de rezistență la factorii externi. Propagulele de Trichoderma incluse în suproturile ceramice au avut o rată mare de supraviețuire la uscare.

Tulpina biostimulantă T. asperellum T36 are o rată ridicată de supraviețuire după condiționarea în peletele provenite din substratul epuizat provenit de la cultura ciupercilor Pleurotus. Dezvoltarea ciupercilor pe acest substrat de condiționare este asociată unei induceri semnificative a activității chitinazice.

A fost dezvoltat un procedeu de formulare ca pulbere granulară umectabilă, care implică două etape: (i) încapsularea tulpinilor de Trichoderma biostimulante și uscarea microcapsulelor prin pulverizare și (ii) amestecarea biomasei încapsulate uscate cu ingredientele de condiționare și condiționarea finală în pat fluidizat. Bioprodusele astfel condiționate ca pulbere granulară umectabilă realizate în cadrul acestei lucrări au o bună stabilitate în timp, în special datorită faptului că nu-și modifică caracteristicile fizico-chimice esențiale, inclusiv cele asociate activității apei în substrat.

6.III. Protejarea soluțiilor inovative. Brevete si cereri de brevet de invenție

In cazul condiționării microorganismelor utile plantelor de cultură, având în vedere aplicabilitatea practică soluțiile tehnice originale, procedee și/sau compoziții de condiționare au fost protejate prin depunerea de cereri de brevet, interne și/sau internaționale.

Din rezultatele obținute în cadrul ProiectuluiPN II Parteneriate “Dezvoltarea unei metodologii de biocontrol exercitat de sisteme microbiene asupra infecțiilor fungice” – (BIOCONTROL), am obținut un brevet de invenție OSIM. Acesta se referă la un procedeu de obținere a unui produs bacterian cu activitate antifungică, utilizabil în prevenirea creșterii și dezvoltării fungilor toxigenici și implicit în inhibarea producerii de micotoxine:

Brevet RO nr. 126895 B1/29.11.2013, Gheorghe A. T., Jecu L., Răut I., Voicu A., Lăzăroaie M. M., Roșeanu A., Chelaru F., Florian P., Stoica A., Stroescu M., Brevet RO nr. 126895 B1/29.11.2013. „Metoda de obținere a unui compus bacterian cu activitatea antifungică”.

De asemenea, în vederea brevetării, izolatele Trichoderma asperellum T50(Td50b) și Trichoderma asperelumT36 (Td36b) au fost depozitate cu numărul de depozit T50 – NCAIM (P) F 001412; T36 – NCAIM (P) F 001434 la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Universitatea Corvinus din Budapesta, Ungaria.

Din rezultatele obținute în cadrul proiectuluiPN-II-CI-2012-0112, contract nr. 84CI/2012, “Activator fungic pe bază de Trichoderma pentru producere de composturi supresive și odorante destinate culturilor ornamentale” (TRICH-ODOR), au fost depuse 2 cereri de brevet de invenție la OSIM și EPO (Oficiul European de Brevete):

Cerere de brevet de invenție OSIM: A/00890 din 27.11.2012, publicată ca RO128889 A0, Oancea F., Mara G., Șesan T. E., Mathe I., Răut I., Abraham B., Lanyi S., “Tulpină de Trichoderma și compoziție cu eliberare controlată care conține respectiva tulpină”;

Cerere de brevet de invenție EPOEP 12464023.6 din 29.11.2012, publicată ca EP2735607 A1, Oancea F., Mara G., Șesan T. E., Mathe I., Răut I., Abraham B., Lanyi S., “Trichodermastrain and controlled release composition which contain said strain”.

Din rezultatele obținute în cadrul proiectului PNII-IN-CI-2012-1-0211 Contract nr. CI121/2012 “Îngrăsăminte complexe cu spori de endo-micoriză și biostimulanți ai simbiozelor micorizale” (AM-STIM), au fost depuse 2 cereri de brevet de invenție la OSIM și EPO (Oficiul European de Brevete):

Cerere de brevet de invenție OSIM: A00141 din 11.02.2013, publicată ca RO128931 A0, Oancea F., Pairault, A.L., Doni M., Răut I., Călin, M., Jecu M.L. „Tulpină de Brevibacillus prabrevis și compoziție cu eliberare controlată pe baza de aceasta”;

Cererere de brevet de invenție EPO EP13464002 din 13.02.2013, publicată ca EP2765185 A2, Oancea F., Pairault, A.L., Doni M., Răut I., Călin, M., Jecu M. „Brevibacillus parabrevis strain and controlled release composition based on it”.

Din rezultatele obținute în cadrul proiectului PN-II-PT-PCCA-2013-4-0995-160/2014, „Produse multifuncționale și inovative pentru alimente funcționale bioaugmentate și sigure din noi plante cultivate în România” (MAIA) au fost depuse 2 cereri de brevet OSIM:

Cererea de brevet OSIM 0948/02.12.2015, Răut I., Oancea F., Sesan T.E., Doni M., Arsenie M.L. Jecu M.L., „Procedeu de condiționare a microorganismelor biostimulante pentru plante pe suporturi ceramice poroase”;

Cererea de brevet OSIM 952/02.12.2015, Răut I., Sesan T.E., Oancea F., Doni M., Arsenie M.L, Jecu M.L., „Consortiu de Trichoderma cu actiune de biostimulare a plantelor de cultură”.

Din rezultatele obținute în cadrul proiectului PN-II-PT-PCCA-2013-4-0846/2014, “Managementul complex al resturilor vegetale în sistemele de agricultură conservativă” (CERES) au fost depuse 5 cereri de brevet de invenție OSIM:

Cererea de brevet OSIM 0936/02.12.2014, Răut I., Sesan T.E., Oancea F., Doni M., Arsenie M.L, Jecu M.L., „Tulpină biostimulantă de Trichoderma asperellum și compoziție pe bază de aceasta pentru utilizare în sistemele de agricultură conservativă”;

Cererea de brevet OSIM O935/02.12.2014, Oancea F., Răut I., Sesan T.E., Doni M., Popescu M., Jecu M.L “Procedeu de înalt randament pentru selecția consorțiilor de microorganisme destinate tratamentului materialului vegetal”;

Cererea de brevet OSIM O926/02.12.2014, Oancea F., Răut I., Sesan T.E., Doni M., Popescu M., Jecu M.L., „Procedeu de selecție a consorțiilor de microorganism care eliberează și solubilizează biosiliciul din materialul vegetal”;

Cererea de brevet OSIM 0945/02.12.2015, Oancea F., Velea S., Popescu M., Răut I., „Procedeu de obținere a unor pelete bioactivate cu microorganisme din substrat epuizat de cultura ciupercilor”;

Cererea de brevet OSIM 0946/02.12.2015,Oancea F., Velea S., Popescu M., Răut I., „Procedeu de condiționare a microorganismelor biostimulante pentru plante sub formă de tabletă efervescentă”.

Referințe

Abriouel, H., Franz, C.M., Omar, N.B., and Gálvez, A. (2011). Diversity and applications of Bacillus bacteriocins. FEMS microbiology reviews 35, 201-232.

Armengol, G., Hernandez, J., Velez, J.G., and Orduz, S. (2006). Long-lasting effects of a Bacillus thuringiensis serovar israelensis experimental tablet formulation for Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) control. Journal of economic entomology 99, 1590-1595.

Blaya, J., López-Mondéjar, R., Lloret, E., Pascual, J.A., and Ros, M. (2013). Changes induced by Trichoderma harzianum in suppressive compost controlling Fusarium wilt. Pesticide biochemistry and physiology 107, 112-119.

Boyetchko, S., Pedersen, E., Punja, Z., and Reddy, M. (1999). Formulations of biopesticides. Methods in biotechnology 5, 487-508.

Caarls, L., Pieterse, C.M., and Van Wees, S.C. (2015). How salicylic acid takes transcriptional control over jasmonic acid signaling. Frontiers in plant science 6.

Calvo, P., Nelson, L., and Kloepper, J.W. (2014). Agricultural uses of plant biostimulants. Plant and Soil 383, 3-41.

Chowdhury, S.P., Hartmann, A., Gao, X., and Borriss, R. (2015). Biocontrol mechanism by root-associated Bacillus amyloliquefaciens FZB42–a review. Frontiers in microbiology 6.

Cochrane, S.A., and Vederas, J.C. (2016). Lipopeptides from Bacillus and Paenibacillus spp.: a gold mine of antibiotic candidates. Medicinal research reviews 36, 4-31.

Coradin, T., Eglin, D., and Livage, J. (2004). The silicomolybdic acid spectrophotometric method and its application to silicate/biopolymer interaction studies. Spectroscopy-an International Journal 18, 567-576.

du Jardin, P. (2015). Plant biostimulants: Definition, concept, main categories and regulation. Scientia Horticulturae 196, 3-14.

Ehrman, T. (1996). Laboratory Analytical Procedure LAP 004: Determination of Acid-Soluble Lignin in Biomass (NREL).

El-Hasan, A., Walker, F., Schöne, J., and Buchenauer, H. (2007). Antagonistic effect of 6-pentyl-alpha-pyrone produced by Trichoderma harzianum toward Fusarium moniliforme/Antagonistische Wirkung von 6-Pentyl-alpha-pyron aus Trichoderma harzianum gegen Fusarium moniliforme. Journal of plant diseases and protection, 62-68.

Grover, M., Nain, L., Singh, S.B., and Saxena, A.K. (2010). Molecular and biochemical approaches for characterization of antifungal trait of a potent biocontrol agent Bacillus subtilis RP24. Current microbiology 60, 99-106.

Hatfield, R., and Fukushima, R.S. (2005). Can lignin be accurately measured? Crop science 45, 832-839.

Hu, L.B., Shi, Z.Q., Zhang, T., and Yang, Z.M. (2007). Fengycin antibiotics isolated from B-FS01 culture inhibit the growth of Fusarium moniliforme Sheldon ATCC 38932. FEMS microbiology letters 272, 91-98.

Ivanova, C., Bååth, J.A., Seiboth, B., and Kubicek, C.P. (2013). Systems analysis of lactose metabolism in Trichoderma reesei identifies a lactose permease that is essential for cellulase induction. PLoS One 8, e62631.

Jayaraj, J., Radhakrishnan, N., Kannan, R., Sakthivel, K., Suganya, D., Venkatesan, S., and Velazhahan, R. (2005). Development of new formulations of Bacillus subtilis for management of tomato damping-off caused by Pythium aphanidermatum. Biocontrol Science and Technology 15, 55-65.

Jimenez-Bremont, J.F., Marina, M., Guerrero-Gonzalez, M.D., Rossi, F.R., Sanchez-Rangel, D., Rodriguez-Kessler, M., Ruiz, O., and Garriz, A. (2014). Physiological and molecular implications of plant polyamine metabolism during biotic interactions. Frontiers in Plant Science 5, 14.

Kusano, T., Berberich, T., Tateda, C., and Takahashi, Y. (2008). Polyamines: essential factors for growth and survival. Planta 228, 367-381.

Lapsansky, E.R., Milroy, A.M., Andales, M.J., and Vivanco, J.M. (2016). Soil memory as a potential mechanism for encouraging sustainable plant health and productivity. Current opinion in biotechnology 38, 137-142.

Li, J., Yang, Q., Zhao, L.-h., Zhang, S.-m., Wang, Y.-x., and Zhao, X.-y. (2009). Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29. Journal of Zhejiang University Science B 10, 264-272.

Marco, F., Alcazar, R., Tiburcio, A.F., and Carrasco, P. (2011). Interactions between Polyamines and Abiotic Stress Pathway Responses Unraveled by Transcriptome Analysis of Polyamine Overproducers. Omics-a Journal of Integrative Biology 15, 775-781.

Nassar, A.H., El-Tarabily, K.A., and Sivasithamparam, K. (2003). Growth promotion of bean (Phaseolus vulgaris L.) by a polyamine-producing isolate of Streptomyces griseoluteus. Plant Growth Regulation 40, 97-106.

Perrig, D., Boiero, M.L., Masciarelli, O.A., Penna, C., Ruiz, O.A., Cassan, F.D., and Luna, M.V. (2007). Plant-growth-promoting compounds produced by two agronomically important strains of Azospirillum brasilense, and implications for inoculant formulation. Applied Microbiology and Biotechnology 75, 1143-1150.

Pichyangkura, R., and Chadchawan, S. (2015). Biostimulant activity of chitosan in horticulture. Scientia Horticulturae 196, 49-65.

Pieterse, C.M., Van der Does, D., Zamioudis, C., Leon-Reyes, A., and Van Wees, S.C. (2012). Hormonal modulation of plant immunity. Annual review of cell and developmental biology 28, 489-521.

Raut, I., Calin, M., Lazaroaie, M.M., Roseanu, A., Badea-Doni, M., Oancea, F., and Jecu, L. (2014). Inhibition of Toxigenic Aspergillus niger by Microbial Metabolites. Revista de Chimie 65, 779-783.

Raut, I., Oancea, F., Șesan, T.E., Jecu, L., Arsene, M.L., Doni, M.B., and Vasilescu, G. (2015). Trichoderma asperellum Td36–Versatile strain for treatment of high residue agricultural systems and nutraceutical crops. Journal of Biotechnology 208, S62.

Reis, C.P., Neufeld, R.J., Vilela, S., Ribeiro, A.J., and Veiga, F. (2006). Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. Journal of microencapsulation 23, 245-257.

Ruzzi, M., and Aroca, R. (2015). Plant growth-promoting rhizobacteria act as biostimulants in horticulture. Scientia Horticulturae 196, 124-134.

Sandhya, C., Adapa, L.K., Nampoothiri, K.M., Binod, P., Szakacs, G., and Pandey, A. (2004). Extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in submerged fermentation. Journal of basic microbiology 44, 49-58.

Sarhy-Bagnon, V., Lozano, P., Saucedo-Castañeda, G., and Roussos, S. (2000). Production of 6-pentyl-α-pyrone by Trichoderma harzianum in liquid and solid state cultures. Process Biochemistry 36, 103-109.

Sauter, M., Moffatt, B., Saechao, M.C., Hell, R., and Wirtz, M. (2013). Methionine salvage and S-adenosylmethionine: essential links between sulfur, ethylene and polyamine biosynthesis. Biochemical Journal 451, 145-154.

Savvas, D., and Ntatsi, G. (2015). Biostimulant activity of silicon in horticulture. Scientia Horticulturae 196, 66-81.

Schisler, D., Slininger, P., Behle, R., and Jackson, M. (2004). Formulation of Bacillus spp. for biological control of plant diseases. Phytopathology 94, 1267-1271.

Shoresh, M., Harman, G.E., and Mastouri, F. (2010). Induced systemic resistance and plant responses to fungal biocontrol agents. Annual review of phytopathology 48, 21-43.

Singh, P.P., Shin, Y.C., Park, C.S., and Chung, Y.R. (1999). Biological control of Fusarium wilt of cucumber by chitinolytic bacteria. Phytopathology 89, 92-99.

Sluiter, J.B., Ruiz, R.O., Scarlata, C.J., Sluiter, A.D., and Templeton, D.W. (2010). Compositional Analysis of Lignocellulosic Feedstocks. 1. Review and Description of Methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58, 9043-9053.

Taibi, G., Schiavo, M.R., Gueli, M.C., Rindina, P.C., Muratore, R., and Nicotra, C.M.A. (2000). Rapid and simultaneous high-performance liquid chromatography assay of polyamines and monoacetylpolyamines in biological specimens. Journal of Chromatography B 745, 431-437.

Utz, C.G., Sekmistrz, J.M., and Hollis, R.P. (1995). Effects of Nonionic Surfactants on Properties of Water Dispersible Granule Formulations. In Pesticide Formulations and Application Systems: Fourteenth Volume (ASTM International).

Van Bockhaven, J., De Vleesschauwer, D., and Hofte, M. (2013). Towards establishing broad-spectrum disease resistance in plants: silicon leads the way. Journal of Experimental Botany 64, 1281-1293.

Van der Plaats-Niterink, A.J. (1981). Monograph of the genus Pythium. Studies in mycology.

Williams, J., Clarkson, J.M., Mills, P.R., and Cooper, R.M. (2003). A selective medium for quantitative reisolation of Trichoderma harzianum from Agaricus bisporus compost. Applied and Environmental Microbiology 69, 4190-4191.

Wong, J., Hao, J., Cao, Z., Qiao, M., Xu, H., Bai, Y., and Ng, T. (2008). An antifungal protein from Bacillus amyloliquefaciens. Journal of applied microbiology 105, 1888-1898.

Woo, S.L., Ruocco, M., Vinale, F., Nigro, M., Marra, R., Lombardi, N., Pascale, A., Lanzuise, S., Manganiello, G., and Lorito, M. (2014). Trichoderma-based products and their widespread use in agriculture. The Open Mycology Journal 8.

Wood, I.P., Elliston, A., Ryden, P., Bancroft, I., Roberts, I.N., and Waldron, K.W. (2012). Rapid quantification of reducing sugars in biomass hydrolysates: Improving the speed and precision of the dinitrosalicylic acid assay. biomass and bioenergy 44, 117-121.

Xia, X.-J., Zhou, Y.-H., Shi, K., Zhou, J., Foyer, C.H., and Yu, J.-Q. (2015). Interplay between reactive oxygen species and hormones in the control of plant development and stress tolerance. Journal of Experimental Botany 66, 2839-2856.

Xie, S.S., Wu, H.J., Zang, H.Y., Wu, L.M., Zhu, Q.Q., and Gao, X.W. (2014). Plant Growth Promotion by Spermidine-Producing Bacillus subtilis OKB105. Molecular Plant-Microbe Interactions 27, 655-663.