Comunitatii de Microorganisme Implicate In Biodegradarea Compusilor Petrolieri din Sol

Comunității de microorganisme implicate în biodegradarea compușilor petrolieri din sol

I. PARTEA TEORETICĂ

Introducere

În cea de-a două jumătate a secolului al-XX-lea o dată cu creșterea efectivului populației umane s-a înregistrat și o creștere a nevoilor materiale și energetice care au condus implicit și la o accentuare a procesului de deteriorare al mediului. Mulți dintre oamenii de știință și-au îndreptat toate eforturile în căutarea unor metode eficiente și cu un impact cât se poate de redus asupra mediului pentru a contribuii la stoparea acest proces de deteriorare.

Una dintre cele mai mari procupării cu care se confruntă omenirea la nivel mondial este legată de remedierea solurilor contaminate cu diverse substanțe toxice folosind resurse cât se poate de naturale.

Poluarea solului cu compușii petrolieri reprezintă la ora actuală una dintre cele mai mai probleme cu care ne confruntăm datorită numeroaselor efecte negative și de lungă durată pe care le are asupra biosferie.

În ultimii ani s-au realizat numeroase studii cu privire la principalele surse de poluare. În țările puternic dezvoltate, ce au un nivel al tehnologiei avansat au fost elaborate numeroase strategii și legi în scopul diminuării acestor perturbări provocate de poluare dar și pentru a preveni eventualele contaminări ale mediului, toate acestea au fost factori care au contribuit la limitarea poluării mediului.

Pe plan mondial în ultima perioadă s-a dezvoltat o gamă largă de metode in-situ simple și eficiente pentru a asigura decontaminarea solurilor poluate cu compuși petrolieri care să permită blocarea migrării poluantului din zona de deversare în subteran sau în alte zone din apropiere, eliminarea poluantului și refacerea cadrului natural (Cocuț D și colab., 2008).

În prezent în România păstrarea unei calității bune a solului întâmpină o serie de probleme în ceea ce privește alinierea la standardele și cerințele pretinse pe plan mondial. De altfel poluarea solului cu diverși compuși petroliere reprezintă una dintre cele mai evidente probleme de mediu cu care s-a confruntat țara noastă în ultimii ani ținând cont de ritmul tot mai accelerat de utilizare a acestor substanțe în scopul satisfacerii nevoilor personale (Cocuț D și colab., 2008).

Prin prezenta lucrare îmi propun să evidențiez importanța proceselor biodegradative și a comunităților de microorganisme implicate în procesul de remediere a solurilor contaminate cu compuși petrolieri dar și contribuțiile majore pe care acestea le au în circuitul elementelor în natură.

Astfel că obiectivul principal al acestei lucrării este de a prezenta rolul proceselor biodegradative în împiedicarea concentrării anumitor compuși reziduali sau contaminanți în mediu.

Un al doilea obiectiv al acestei lucrării se referă la studiul componenței comunitățiilor de microorganisme din sol implicate în procesul de biodegradare utilizând diverse metode și tehnici de studiu, ținând cont de existența unui număr cât se poate de redus de studii în ceea ce privește structura comunitățiilor microbiene.

Un ultim obiectiv al acestei lucrării are rolul de a prezenta principalele strategii in-situ și ex-situ necesare pentru desfășurarea procesului de remediere al solurilor poluate cu compuși petrolieri.

Capitolul I. Componentele petrolului

Datorită dezvoltării imense a industriilor petroliere și chimice în secolul al-XX-lea s-a extins și o gamă largă de compuși chimici și materiale chimice care au contribuit la deteriorarea accentuată a mediului. Chimicalele sunt reprezentate îndeosebi de contaminanții organici care alcătuiesc un complex mixt de chimicale cu proprietăți fizice și chimice variate ce sunt prezente în cea mai mare parte în petrol (Ward O. & Singh A., 2004).

Una din principalele cauze ale deteriorii ecositemelor terestre este dată de poluarea cu compuși petrolieri, petrolul fiind substanța cea mai consumată de către socetatea umană. Principalele surse ale poluării cu compuși petrolieri provin în cea mai mare parte din industria petrolului. Industria petrolieră atât prin ramura ei de extracție cât și prin cea de prelucrare se numără printre industriile ce dețin o pondere semnificativă în poluarea mediului, cauzele poluării diferind în funcție de etapele desfășurate în cadrul acestui domeniu. Ramura de prelucrare a petrolului contribuie la poluarea solului prin diverse scurgeri din rezervoare și conducte, prin pierderile ce au loc în cadrul operațiunilor de încărcare-descărcare, prin infiltrări datorate depozitării neadecvate a unor reziduri rezultate din desalinizarea țițeiului brut etc. (Ciulache S. & Ionac N., 2002).

Cei mai prezenți poluanți organici din sol sunt petrolul și derivații săi datorită utilizării lor la scară largă la nivel mondial. În fiecare an cantități enorme de petrol sunt deversate la suprafață solului datorită unor defecțiuni ale unor conducte modificând structura și funcția acestuia (Huesemann M.H ., 2004).

Unul dintre cele cunoscute și recente accidente de astfel de gen a fost cel din Golful Mexic, din aprilie 2010 unde a avut loc explozia platformei Deepwater Horizon în urma căreia a avut loc deveresarea a 4,9 milioane de barli de petrol din Macondo la o adancine de 1500 m în perioada 20 aprilie-15 iulie 2010 (Figura.1). Acest accident a fost considerat ca fiind cel de al doilea dezastru marin după cel din 1989 din Alaska provocat de explozia petrolierului Exxon Valdez (Liu Z. și colab., 2012).

Figura 1. Exemplu de deversare de petrol în cazul acidentului ce a avut loc în Aprilie 2010 în Golful Mexic, a platformei Deepwater Horizon. (www.britannica.com)

Petrolul este definit că fiind un material organic derivat natural, componentele principale ale petrolului fiind hidrocarburile care se găsesc sub formă de zăcăminte în scoarța pământului în diferite regiuni. Principalele grupe de hidrocarburi prezente în petrol sunt hidrocarburile alifatice (alcanii), hidrocarburile aromatice și compuși ce conțin oxigen, sulf sau azot. În general hidrocarburile se află în stare lichidă și solidă, însă unele au o masă moleculară mică și se află în stare gazoasă. Deoarece sunt compuși nepolari, acestea nu sunt solubile în apă, dar sunt solubile în solvenți organici nepolari. Proporția acestora diferă de la un tip de zăcământ la altul. Hidrocarburile alifatice sunt reprezentate în special de alcani și intră în cea mai mare parte în compoziția petrolului dar sunt comuni și în produși rafinați ai acestuia (Morgan F. și Watkinson R.J., 1994; Postolache C., 2000).

Alcanii sunt hidrocarburi saturate care din puncte de vedere ale compoziției chimice sunt alcătuiți în cea mai mare parte din atomi hidrogen și carbon. Alcanii pot fi clasificați în funcție de structura lor chimică în alcani cu catenă liniară (n-alcani), ramificată (iozoalcani) sau ciclică (cicloalcani). Într-o proporție de 15-20% compoziția petrolul brut este alcătuită din alcani cu catenă liniară. Ca exemple de alcani cu catenă ramificată întâlnim în componența petrolului pristanul și phitanul. Cicoalcanii din compoziția petrolul brut sunt alcătuiți din unul sau mai multe inele de carbon, iar proporția cea mai mare înregistrând-o cicloalcani cu unul sau două inele circa 54.9% (Prince C.R., 2002).

Figura 2. Exemple de hidrocarburi saturate: n-alcan (hexadecan), izoalcan (pristan) și cicloalcan (decalin). (Adaptat după Prince R.C., 2002).

În compoziția petrolului se poate întâlni într-o cantitatea mai redusă alchenele (alcani nesaturați) dar care se pot găsi în cantității mult mai mari în produși rafinați ai acestuia cum este de exemplu benzina (Prince C.R., 2002).

Hidrocarburi aromatice se găsesc în proporție mai mică decât celelalte hidrocarburi din compoziția petrolului, se caracterizează prin prezența mai multor cicluri aromatice, izolate sau condensate. Acestea sunt mult mai reactive decât hidrocarburile alifatice, din aceasta cauza cele alifatice sunt mai susceptibile la transformări chimice și biochimice (Postolache C., 2000).

Capitol 1.1 Regiuni din Romania afectate de poluarea cu hidrocarburi petroliere

În România predomină poluarea cu țiței însoțită de cea a apelor sărate care provin de la procesul de extracție al petrolului. Echilibrul ecologic al solului precum și al apelor freatice este modificat prin poluarea cu petrol, înregistrându-se o suprafață de 2654 ha dintre care 1205 ha sunt excesiv de poluate pe teritoriul țării noastre. Prin extracția petrolului, structura stratului fertil de sol este modificată în cadrul parcurilor de exploatare. Efectele acestei modificări constau în tasarea solului, reducerea suprafețelor agricole sau silvice. În funcție de natura proceselor chimice pot fi determinate următoarele tipuri de poluare:

poluarea cu petrol, sau cu petrol și apă sărată, se mai numește și poluare mixtă;

poluarea ascendentă, descendentă și suprapusă;

Scurgerile datorate spargerii unor conducte aflate sub presiune determină apariția poluării ascendente care predomină la nivel național, aceste scurgeri pătrunzând deseori în pânză pedofreatică. În funcție de conținutul de argilă al solului cantitatea de produse petroliere reținute în sol diferă. Produsele petroliere se pot infiltra la 70-80 cm sau chiar mai mult îngreunând adesea realizarea procesului de depoluare. Reținerea acestor produse în sol este indicată de raportul carbon/azot (C/N). (Potra A. și colab., 2012).

Pe suprafață a cinci județe din cadrul țării noastre precum: Covasna, Bacău, Gorj, Prohova și Timiș au fost afectate de poluarea cu hidrocarburi petroliere circa 751 de hectare dintre care 278 ha au fost excesiv afectate. Situri contaminate identificate în țară noastră de asemenea sunt în industria extractivă unde s-au înregistrat 170 de situri cu o suprafață de 2725,46 hectare și în industria petrolieră incluzând zonele de extracție, conducte de transport, depozite, batale de deșeuri petroliere, unități prelucrătoare, stații PECO etc., unde s-au înregistrat 232 de situri contaminate cu o suprafață de 2664,78 hectare. Poluarea cu petrol și apă sărată rezultată în urma procesului de exploatare petrolier a afectat într-o proporție mare zone de pe teritoriul țării noastre cum ar fi Ploiești, Borzești, Onești dar cele mai mari suprafețe afectate se găsesc în județele Teleorman, Brăila, Dâmbovița, Gorj etc. (Potra A. și colab., 2012).

Capitol 1.2 Efectele poluării ecosistemelor terestre cu hidrocarburi petroliere

Există o varietate foarte mare de poluanți organici de natură geogenică cât și antropogenică, în funcție de structura lor moleculară, mărime, formă moleculară și prezența grupărilor funcționale este determinată comportarea metabolică și toxicitatea lor. Prin cunoașterea structurii moleculare a acestor poluanți organici putem evidenția manifestarea lor în diferite compartimente ale ecosistemelor. Hidrocarburile sunt sursele majore ale poluării solului, acești compuși conținând numai carbon și hidrogen (Postolache C., 2000).

Principala sursă de hidrocarburi aromatice policiclice este petrolul, acestea având efecte extrem de toxice asupra organismelor cauzând de cele mai multe ori boli în rândul populației umane. Volumul acestor compuși crescând dramatic odată cu dezvoltarea sistemelor socio-economice în profida implementării unor metode de diminuare, adoptate la nivel național și internațional. Acțiunea hidrocarburilor aromatice policiclice asupra populației umane determină de cele mai multe ori apariția unor boli precum cancerului de piele (Hoffman D.J., 2003).

Hidrocarburile petroliere prin poluarea lor excesivă poate determina apariția unor efecte semnificative atât la nivelul componentelor biotice cât și la nivelul celor abiotice care dacă nu vor fi remediate pot duce la consecințe dezastruoase (Okoh A.I., 2006).

La suprafață solului hidrocarburile formează un film impermeabil care oprește circulația apei și schimbului de gaze provocând deseori sufocarea rădăcinilor. Activitatea metabolică a bacteriilor din sol și numărul lor se reduce odată cu devenirea mediului mai anaerob (Potra A. și colab., 2011).

Efectele înregistrate în solurile cultivate ce au fost poluate cu hidrocarburi sunt împiedicarea germinației semințelor, creșterii plantelor și producției. Totodată hidrocarburile odată ajunse în sol pot penetra semințele și de asemenea pot omorî embrionul ori afecta procesul de germinație prin diminuarea cantității de apă necesare acestuia. Datorită cantității mare de carbon ce se regăsește în petrol, raportul C:N din sol este într-o continuă creștere determinând influențe negative asupra nutriției plantelor cu azot și asupra activității microbiologice (Potra A. și colab, 2011).

Capitolul II. Procesul de biodegradare

Biodegradarea poate fi definită ca abilitatea microorganismelor de a transforma sau mineraliza anumiți contaminanți organici în substanțe mai puțin toxice care pot fi integrate din nou în ciclurile biogeochimice naturale. Intensitatea cu care se poate desfașura procesul de biodegradare depinde de anumiți factori fizici și chimici cum sunt temperatura, nutrienții, oxigenul, valoarea pH-ului, umiditatea, compoziția, concentrația și biodisponibilitatea contaminanților, caracteristicile fizico-chimice și istoria mediului contaminat (Margesin și colab., 2001).

2.1 Factori care influențează rata de biodegradare a poluanților

1. Temperatura

Dintre factorii care influențează procesul de biodegradarea temperatura are un rol important deoarece afectează direct chimia poluanților, fiziologia și diversitatea florei microbiene. Deasemenea temperatura poate afecta și solubilitatea hidrocarburilor. Biodegradarea hidrocarburilor poate să aibă loc la o gamă largă de temperaturi, de cele mai multe ori o dată cu scaderea temperaturii are loc și o scădere a ratei de biodegradare (Figura 3).

Figura 3. Ratele de biodegradare ale hidrocarburilor din ecosistemele terestre, acvatice și marine (Adaptată după Das N.& Chandran P., 2010).

Conform acestei figurii rata de biodegradare cea mai ridicată are loc în ecosistemele terestre la temperaturi cuprinse între 30-400C, în ecosistemele acvatice la temperaturi cuprinse între 20-300C, iar în ecosistemele marine la temperaturi cuprinse între 15-200C (Das N.& Chandran P., 2010).

În cazul biodegradarii petrolului datorită scăderii temperaturilor are loc o creștere a vâscozității dar și o reducere a volatilității hidrocarburilor toxice cu masă moleculară mică ceea ce face ca biodegradarea să se desfașoare cu întarziere. Dacă temperaturile depășesc valorile cuprinse între 30-400C atunci are loc la nivelul membrane bacteriene o creștere a toxicității hidrocarburilor. (Das N.& Chandran P., 2010; Leahy J.G. & Colwell R.R., 1990; Coste A.și colab., 2014)

2. Nutrienții

Deasemenea și nutrienții sunt ingrediente necesare pentru ca biodegradarea unor hidrocarburilor poluante să aibă loc cu succes. Fosforul, azotul și în unele cazuri fierul pot deveni factori limitativi care pot afecta procesul de biodegradare. De exemplu atunci cand are loc o deversare de petrol în mediile marine, cantitatea de carbon crește în mod semnificatv, în timp ce disponibilitatea fosforului și azotului devine factori limitativi pentru degradarea uleiului.

În mediile terestre cantitatea de nutrienți necesară biodegradării depinde de consumul de oxigen biochimic. De obicei raportul de masă C:N:P ideal pentru desfășurarea procesului de biodegradare este 120:10:1. Nutrienți ca potasiul, fierul, sodiul, calciul, amoniul, magneziul, clorul sunt și ei necesari dar în cantități mult mai mici care să nu depașească 100mg/l (Das N.& Chandran P., 2010; Leahy J.G. & Colwell R.R., 1990; Coste A.și colab., 2014).

3. Oxigenul

Prezența oxigenului este esențială în desfașurarea procesele oxidative care intervin în timpul biodegradării hidrocarburilor din mediu. În sol cantitatea de oxigen alocată proceslor de oxidare depinde de rata de consum a microorganismelor, de tipul de sol dar și de prezența substraturilor utilizabile care pot avea drept consecința scăderea cantitații de oxigen (Leahy J.G. & Colwell R.R. 1990).

4. Valoarea pH-ului

Valoarea pH-ului trebuie să fie cuprinsă între 6-8, dar valoare luată în considerare ca fiind optimă este cea a pH-ului neutru de 7. Dacă valoarea pH-ului solului este depașită atunci se pot înregistra anumite efecte negative ca incapacitatea microorganisnelor de a degrada hidrocarburile (Leahy J.G. & Colwell R.R. 1990).

5. Umiditatea

Domeniul optim de dezvoltare al microorganismelor este influențat de umiditate ce este cuprinsă între 25-85%, apă asigură transportul nutrienților și favorizează cataliza enzimatică și totodată menține presiunea osmotică a celulelor (Doboș L și colab., 2010).

6. Catacteristicile solului

În funcție de textura fiecărui tip de sol în parte permeabilitatea și gradul de umiditate al acestuia diferă, astfel că disponibilitatea oxigenului din sol necesar pentru desfășurarea procesului de biodegradare al hidrocarburilor din mediu este condiționată în primul rând de tipul de sol dar și de rata cu care microorganismele consumă oxigenul (Leahy J.G. & Colwell R.R., 1990).

7. Caracteristicile compușilor poluanți

În funcție de concentrația, compoziția și de starea fiziologică a compușilor poluanți rata cu care loc procesul de biodegradare diferă, de exemplu s-a constatat că în cazul hidrocarburilor saturate rata cu care are loc procesul de biodegradare este mai mare decât cea a hidrocarburilor aromatice. În cazul unor concentrații crescute de compușii poluanți la nivelul solului disponibilitatea oxigenului scade datorită saturării mediului (Leahy J.G. & Colwell R.R., 1990).

Biodegradarea compușilor organici depinde și de o serie de factori biologici precum diversitatea și capacitatea metabolică a microorganismelor implicate în procesul biodegradării (Genovese M. și colab., 2008).

Microorganismele implicate în biodegradarea compușilor organici necesită o anumită cantitate de nutrienți și de un acceptor de electoni terminal cu care să degradeze substratul sau contaminantul. Microorganismele aerobe folosesc oxigenul ca acceptor de electoni în timp ce cele anaerobe utilizează în afara de oxigen și alți acceptori de electoni (McNally D., 2009).

Figura 4. O vedere conceptuală a procesului de degradare microbină

(Adaptat după McNally D., 2009).

Satisfacerea unor condiții este esențială pentru ca procesul de biodegradarea să decurgă normal. Aceste condiții includ existența unui organism care să dețină enzimele necesare biodegradării (existența acestui organism cu potențial catabolic adecvat este necesar dar în același timp nu este suficient pentru ca biodegradarea să aibă loc), prezența acelui organism în mediul contaminat (deși majoritatea microorganisme cu capacități biodegradative sunt prezente aproape în toate mediile de pe suprafața pământului se poate întampla ca în unele medii aceste microorganisme să lipsescă), compusul poluant care trebuie să fie supus biodegradării trebuie să fie accesibil organismului cu potențial catabolic adecvat (foarte mulți poluanți persistă în mediu chiar dacă microorganismele implicate în procesul de biodegradare sunt prezente), datorită unui număr mic de populații de microorganisme care degradează compuși sintetici anumite condiții din mediu trebuie să fie satisfăcute astfel încat să favorizeze proliferarea microorganismelor cu potențial activ (Alexander M., 1995).

Biodegradare are la baza 2 procese și anume: cresterea care presupune folosirea poluanțiilor organici ca sursă de carbon și energie, în urma acestui proces se obține degradarea completă a poluanților (mineralizarea) și cometabolismul care se referă la metabolizarea unui comupus organic în prezența unui substrat de creștere care este utilizat îndeosebi ca sursă primară atât de carbon cât și de energie (Fritsche W.& Hofrichter M., 2000).

2.2 Exemple de procese de biodegradare

Procesul de biodegradare al compușilor organici se poate desfășură atât în condiții aerobe cât și anaerobe.

Biodegradarea aerobă a hidrocarburilor

De cele mai multe ori procesul de degradare al compușilor organici se realizează în condiții aerobe, oxigenul fiind considerat principalul acceptor de electoni din timpul proceselor de degradare microbiană. Compușii organici care se pot degrada complet și care au o rata ridicată de degradare sunt reprezentați în principal de derivații ai petrolului dar și de produsele petrochimice. Bacteriile chemo-organotrofice sunt estențiale în procesul de degradare al compușilor organici deoarece pot utiliza ca sursă de carbon și energie dar și ca donori de electroni o gama largă de compușii naturali și de sinteză (Tabel 1). De cele mai multe ori comunitățile microbiene pot avea un potențial de biodegradare mult mai mare (Fritsche W. & Hofrichter M., 2000)

Tabel 1. Bacterii predominante din solurile poluate cu hidrocarburi aromatice și alifatice,

hidrocarburi aromatice policiclice și compuși halogenați.

(Adaptat după Fritsche W.& Hofrichter M., 2000).

Din comunitățile de microorganisme fac parte și drojdiile care au și ele capacitate de a degrada compuși organici. Acestea pot degrada compuși organici ca hidrocarburile alifatice prezente în petrol și produsele petroliere. Dintre acestea specii ca Candida lipolytica, Rhodoturula rubra utilizează n-alcani cu C10-C24 ca unică sursă de carbon și energie. (Fritsche W. & Hofrichter M., 2000).

Rata de biodegradare a compușilor organici este mai mare în prezența oxigenului (condiții aerobe), pentru a creștere rata de degradare sunt necesare îndeplinirea unor condiții precum:

Compușii organici trebuie să fie accesibili microorganismelor care au activitate biodegradativă, degradarea hidrocarburile datorită insolubilității lor în apă necesită implicarea unor microorganisme care pot produce biosurfactanți (agenți tensioactivi).

Procesul oxidativ constă în atacul intracelular inițial al poluanților organici, încorporarea oxigenului este considerat cheia enzimatică a reacției catalizată de oxidaze.

Degradarea periferică a poluanților organici constă în transformarea pas cu pas în intermediari ai metabolismului central ca de exemplul ciclul acizilor tricarboxilici.

Producerea metaboliților secundari (piruvat, acetil coenzima A) și încorporarea acestora în biomasa celulară (Fritsche W. & Hofrichter M., 2000).

Figura 5. Încorporarea în biomasă a hidrocarburilor pe calea oxidativă, la microorganisme aerobe (Adaptat după Fritsche W. & Hofrichter M, 2000).

Biodegradarea anaerobă a hidrocarburilor

Încă de la sfarșitul anilor 1980 s-a dovedit ca un număr tot mai mare de microorganisme utilizează ca substraturi de creștere hidrocarburile saturate și aromatice în condiții stric anoxice. Dacă microorganismele aerobe utilizează oxigenul ca acceptor de electroni microorganismele anaerobe utilizează în respirația anaerobă ca acceptori de electoni azotul, sulful sau fierul. Bacteriile anaerobe fața de cele aerobe obțin o cantitate mai mică de energie din conversia substraturilor și au drept consecința o cantitatea mică de biomasă produsă. Din punct de vedere al stabilității hidrocarburile alifatice (alcani) sunt considerate a fi mai stabile în condiții anaerobe (Widdel.F & Rabus.R., 2001).

2.3 Microorganisme implicate în biodegradarea hidrocarburilor petroliere

Numeroase microorganisme au fost identificate dealungul timpului ca fiind capabile să utilizeze o gamă largă de hidrocarburi petroliere ca sursă primară de carbon și energie.

În procesul de biodegradare microorganismele pot degrada complet sau parțial hidrocarburile.

Principalele grupe de microorganisme izolate din medii poluate cu hidrocarburi capabile să realizeze procesul de biodegradare sunt:

Bacteriile: Bacillus lipolyticum, Achromobacter sp., Actinomyces sp., Micrococcus (ex: Micrococcus paraffinae), Mycobacterium sp., Nocardia sp., Pseudomonas sp. (ex: Pseudomonas aeruginosa), Spirillum sp., Vibrio sp. etc

Cianobacteriile: Anabaena sp., Coccochloris sp., Oscillatoria sp., Nostoc sp., etc.

Drojdiile: Candida sp., Saccharomyces sp., Sporobolomyces sp., Rhodospirillum sp.etc. Dintre acestea speciile de Candida sunt cele mai frecvent întalnite în solurile poluate.

Fungii filamentoși: Cladosporium sp., (ex: Cladosporium resinae), Aspergillus sp.,( ex: Aspergillus effusus, Aspergillus versicolor), Penicillium sp., etc.

Alge: Chlamydomonas sp, Chorella sp, Amphora sp, Porphyridium sp.etc

Într-un studiu realizate de Das și colab 2010 s-a putut constatat că dintre toate aceste grupe de microorganisme bacteriile sunt considerate ca fiind principalele microorganisme implicate în biodegradarea hidrocarburilor petroliere.

În solurile contaminate cu petrol brut din N-E Indiei au fost găsite specii de Acinetobacter capabile să utilizeze ca unică sursă de carbon n-alcani cu o lungime a lanțului de pâna la 40 de atomi de carbon (Das N.& Chandran P., 2010).

Degradarea hidrocarburilor se face diferit în funcție de sensibilitatea lor la atacul microbian. Astfel hidrocarburile susceptbile la degradarea microbiană sunt clasate după cum urmează: alcani cu catenă liniară (hidrocarburile cel mai ușor de degradat), alcani cu catenă ramificată, aromatici cu greutate moleculară mică, alcani ciclici, aromatici cu greutate moleculară mare. Unii compușii cum sunt hidrocarburile policiclice cu greutate moleculară mare nu pot fi degradați în totalitate (Saadoun și colab., 2002).

De exemplu în timpul procesului de biodegradare a petrolului brut microorganismele pot fi considerate a fii ideale dacă îndeplinesc o serie de condiții și anume să poată avea capacitatea de a degrada o gamă cât mai largă de compuși petrolieri, rata de reproducere a microorganismelor sa fie rapidă, să fie capabile să se multiplice și în mediile naturale și nu în ultimul rând să fie stabile din punct de vedere genetic în așa fel înca să se poată practica recultivarea și conservarea acestora. (Zarnea., 1994; Abassi și colab., 2008).

Tyagi și colab., 2011 au constatat că unele microorganisme implicate în procese de biodegradare au afinitate pentru anumiți compuși organici. Unele specii de Pseudomonas, Ralstonia, Rhodoccocus sunt capabile să degradeze hidrocarburi petroliere și hidrocarburi aromatice ca benzenul, toluenul, etilbenzenul și xilenul, în timp ce degradarea hidrocarburilor poliaromatice cum este naftalina de Pseudomonas, fenantrenul de Pseudomonas și Haemophilus, antracenul de Rhodoccocus, pirenul de Haemophilus și Mycobacterium și benzopirenul cu efecte extrem de cancerigene de Rhodoccocus și Mycobacterium.

Capitolul III. Comunității de microorganisme

Diversitatea și numărul microorganismelor atât din ecosistemele terestre cât și din cele acvatice este foarte mare (bacterii, fungi, alge, actinomicete etc). Dar ca număr și potențial de biodegradare bacteriile sunt considerate ca fiind principala grupă de microorganisme implicată în procesul de degradare al compușilor petrolieri. (Leahy J.G. & Colwell R.R. 1990).

Comunitatea de microorganisme poate să fie definită ca un ansamblu de mai multe specii care coexistă în aceelași mediu și interacționează între ele. Importanața cunoșterii conceptului de comunitate de microorganisme este esențială pentru a putea prezici modul în care evoluează mediul (Konopka A., 2009).

Dezvoltarea precum și diversitatea microbiontei din sol depinde de o serie de factori printre care se numară concentrația de oxigen, temperatura, cantitatea de nutrienți, prezența anumitor poluanți etc. În cazul apariției unor dezechilibre ale acestor factori, dinamica microbiotei solului v-a avea de de suferit chiar dacă comunitățiile de microorganisme au o capacitatea foarte mare de răspuns la stres. O asemenea situație de adaptare la condițiile de stres este întalnită în cazul substanțelor poluante care presupune apariția unor modificări genetice, inducerea sau reducerea sintezei de enzime, prezența unor plasmide etc. (Ford T., 1994).

3.1 Limitări generale ce apar în studiul diversitătii microorganismelor

Dealungul timpului s-au înregistrat numeroase probleme legate de studierea diversității bacterine și fungice, acestea probleme datorându-se în primul rând existenței unor limite metodologice dar și lipsei unor cunoștințe din domeniul taxonomiei. Este foarte dificil practicarea studiului diversității unui grup de microorganisme atunci când nu se cunoaște modul în care se realizează clasificarea și identificarea acestora. (Kirk J.L. și colab., 2004).

3.1.1 Heteorgenitatea spațială

Pentru a se putea măsura diversitatea de microorganisme din sol se folosește adesea replici de la 1 pana la 5 g de sol dar se consideră ca acest tip de abordare întâmpină o serie de probleme atunci cand se dorește aplicarea acesteia. O primă problemă este legată de hetrogenitatea înnăscută a solului. De exemplu pentru a studia heterogenitatea spațială a unor comunități de microorganisme dintr-un sol agricol se folosește mai multe scări spațiale cu intervale de eșantionare de la 2,5 cm până la 11 m.

O a doua problemă a acestei abordării este aceea că heterogenitatea solului conferă apariția unor microhabitate potrivite pentru creșterea microorganismelor care duc la formarea unor agregate de microorganisme (Kirk J.L. și colab., 2004).

3.1.2 Incapacitatea cultivării microorganismelor din sol

Datorită diversității fenotipici și genotipice imense a microorganismelor găsite în sol se consideră că un număr foarte restrâns (0.1-1%) de specii de microorganisme pot fi cultivate prin tehnici obișnuite de laborator, ceea ce sugerează că restul de 99% de specii de microorganisme din natură nu pot fi cultivate pe medii de laborator (Kirk J.L. și colab., 2004).

3.1.3 Ambiguitatea taxonomică a microorganismelor

Una din problemele majore cu care se confruntă studiul diversității microoorgansimelor este legat de definirea speciilor de microorganisme, până în prezent existând o serie de definiții dar toate fiind diferite (Kirk J.L. și colab., 2004).

3.2 Tehnici și metode de studiu ale comunităților de microorganisme

Din punct de vedere al ecologiei caracterizarea comunitățiilor de microorganisme se realizează cu ajutorul a două domenii de studiu și anume:

Studiul diversității microorganismelor care presupune identificarea, izolarea și cuantificarea microorganismelor în diferite habitate.

Studiul activității microbiene care face referire la modul în care activitățile acestora contribuie la observarea diversității microbiene.

Diversitatea microorganismelor în mediu poate fii evidențiată cu ajutorul unei game largi de indici. (Tabel 2) (Xu J., 2006).

Tabel 2. Indici de diversitate microbiană în mediile naturale. (Adaptat după Xu.J., 2006).

Dacă la început estimarea diversității și activității microorganismelor în mediu se facea pe baza microorganismelor cultivabile pe diferite medii nutritive dar și pe analizele experimentale de laborator ex-situ, mai recent s-a constatat ca aceste metode nu evidenția în totalitate heterogenitatea microorganismelor din mediu datorită cultivării doar speciilor cunoscute până în prezent și ale căror condiții de cultivare le erau cunoscute (Xu J., 2006).

Datorită existenței unor microorganisme necultivabile s-a dezvoltat o metodă genomică pentru analiza comunităților de microorganisme din mediu care poartă denumirea de metagenomică. Metagenomica este o metodă care presupune pe lângă clonarea fragmentelor de ADN/ARN izolate din comunitățile de microorganisme și secvențierea și analiza acestor fragmente. (Xu J., 2006; Ferrer M. și colab, 2008).

Principalele metode genomice folosite pentru a putea studia ecologia microorganismelor sunt următoarele: Secvențierea ADN (DNA sequencing), Sistemele de clonare AND, Tehnica FISH (Fluorescent in situ hibridizationin), Tehnica Micro-array, Tehnica RDA (Representational difference analysis), DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis), Bazele bioinformatice (Bioinformatics) (Xu.J., 2006).

Secvențierea ADN este cea mai avansată tehnică în genomică și presupune evidențierea succesiunilor de nucleotide din cadrul moleculelor de ADN.

Tehnica DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) este o tehnică de electroforză în gel care în combinație cu tehnica PCR au ajutat la amplificarea și analiza genei nucleare ARN ribosomal contribuind în acest fel la înțelegerea și aprecierea importanței pe care o are diversitatea microorganismelor în mediu.

Sistemul de clonare ADN permite separarea și amplificarea secvențelor ADN din gene necunoscute care provin din rezervoare genetice heterogene (Xu.J., 2006).

3.3 Componența comunităților de microorganisme

La nivelul unui ecosistem microorganismele pot fi indigene sau temporare, în anumite condiții (concentrații crescute de nutrienți) sau chiar adăugate pot interveni în desfășurarea unor procese esențiale, așa cum este este procesul de degradare al poluanților. Microorganismele sunt foarte importante în programele de protecție a mediului datorită capacității lor de a degrada diverse substraturi reziduale demonstând în acest fel și heterogenitatea pe care o poate avea microbionta. (Abed R.M. și colab., 2002 ; Ford T., 1994; Genovese M. și colab., 2008).

S-a constatat că în prezența anumitor poluanți numărul populațiile de microorganisme cresc cu până 10% ținând cont că în mod obișnuit populațiile acestora nu depașeau 1 % din

totalul comunităților, fapt datorat unor schimbării de mediu care au ca rezultat schimbarea compoziție comunității de microorganisme favorizând în acest mod dezvoltarea celor capabile să metabolizeze compușii poluanți. (Atlas R.M. și colab., 1995; Cappello S. și colab., 2006).

O singură specie poate sintetiza un numar restâns de substraturi, pe când un consorțiu alcătuit din specii care aparțin diferitor grupe de microorganisme posedă un spectru enzimatic mult mare larg putând astfel interveni în degradarea unor compuși greu de îndepărtat din mediu (Cappello S. et al., 2006)., așa cum este petrolul care este persistent în mediu datorită naturii lui hidrofobe și a volatilității reduse a acestuia (Greene A. și colab., 2000; Macnaughton S.J. și colab., 1999).

La nivelul solului poluat cu hidrocarburi s-a constatat că în componența comunităților bacteriene predomină bacteriile Gram-negative (Green A. și colab., 2000; Macnaughton S.J. și colab, 1999), în timp ce în urma anumitor tehnici de analiză precum PCR-DGGE se constată faptul că în solurile nepoluate predonimă bacteriile Gram-pozitive ca componente majore ale comunității de microorganisme (Macnaughton S.J. și colab., 1999).

În urma unor analize de identificare a principalelor clase de microorganisme implicate în procesul de biodegradare realizate pe probe de sol contaminate cu hidrocarburi petroliere s-au distins următoarele grupuri taxonomice (Figurile 6.1 și 6.2) (Genovese M. și colab., 2008)

Pe baza unor studii s-a constatat ca și alte grupe de microorganisme din ecosisteme pot avea o importanță destul importantă în strategiile de remediere astfel că unele studii au reflectat importanța unor fungilor ca de exemplu Trametes versicolor, Phanerochaete chrysosponum etc. (Field J.A., 1992) unor cianobacterii care asigură necesarul de oxigen pentru biodegradarea compușilor aromatici (Abed R.M. et al., 2002).

Figura 6.1. Distribuția schematică a grupurilor taxonomice din cadrul unei populații de microorganisme, din sol contaminat cu hidrocarburi, în urma analizelor ADNr 16S (Adaptat după Genovese M. și colab., 2008).

Figura 6.2 Distribuția procentuală a principalelor genuri bacteriene, identificate la nivelul solului contaminat cu hidrocarburi, rezultate obținute în urma analizei ADNr 16 S. Grupurile de care aparțin: α (alfa-Proteobacteria), β (beta-Proteobacteria), δ (delta-Proteobacteria), γ (gama-Proteobacteria), B/C (Bacteroidetes/Chlorobi), A (Actinobacteria), C (Clostridia) și N (Bacterii Necultivabile). (Adaptat după Genovese M. și colab., 2008).

Capitolul IV. Procesul de bioremediere

În ultimele decenii poluarea mediului cu produse petroliere și petrochimice a atras din ce în ce mai multă atenție. Contaminarea mediului natural cu petrol și derivații acestuia a provocat degradarea solului și zonelor arabile, cele mai multe pete și zone de contaminare întâlnindu-se în mediile subterane, poluarea cu aceste produse petroliere având numeroase efecte nocive asupra mediului și ființelor umane. Pentru a putea evita toate aceste consecințe au trebuit îmbunătățite cunoștințele cu privire la remediere și efectele acesteia mai ales în țările în curs de dezvoltare unde se urmărește o dezvoltatrea durabilă a mediului. Bioremedierea este cea mai populară metodă de decontaminare datorită costului său relativ scăzut. Utilizarea activității microbiene naturale poate reduce concentrația și/sau toxicitatea diferitelor substanțe chimice cum ar fi produsele petroliere și hidrocarburile alifatice și aromatice (Dindar E. și colab., 2013).

Bioremedierea este un proces considerat foarte eficient în care sunt utilizate microorganisme pentru a metaboliza diferiți contaminanți din sol printr-un proces oxidant sau reducător. Microorganismele prezente în sol pot degrada în condții optime complet anumiți contaminanți până la CO2, H2O, acizi organici și metan aceștia fiind produși netoxici (Popescu D.L. și colab., 2008).

Prin procesul de bioremediere se poate realiza: oxidarea contaminanților organici complet (numită și mineralizare), biotransformarea compușilor organici în metaboliți mai mici sau mai puțin toxici, reducerea grupărilor -nitro prin transfer electronic de la un donor (acizi grași, zaharuri) în urma căreaia se pot obține niște compuși cu toxicitate mai redusă (Popescu D.L. și colab., 2008).

4.1 Strategii de bioremediere

1. Biostimularea: în solurile sau apele contaminate se adaugă atât în stare lichidă cât și gazoasă nutrienți și oxigen pentru a avantaja dezvoltarea și activitatea bacteriilor prezente în mediile respective. Se urmărește apoi dispariția contaminanțiilor pentru a putea determina rata de remediere. Biostimularea este eficientă atunci când există un număr mare de microorganisme prezente în substrat (Popescu A., 2008; Malschi D., 2014).

2. Bioaugmentarea: constă în introducerea unor microorganisme care au afinitate pentru diferiții cantaminanți prezenți în aceste medii pentru a le degrada. Bioaugmentarea este utilizată în deosebi pentru a degrada contaminanții aflați în instalațiile de puificare a apei. Acest tip de bioremediere este considerat până astăzi ca fiind cel mai eficient mod de a decontamina mediile în care condițiile de dezvoltare optimă a microorganismelor amplaste nu pot fi urmărite. Un dezavantaj al acestei strategii de bioremediere este acela că necesită un termen lung de aplicare. Bioaugmentarea poate avea loc și în condiții aerobe cât și în condiții anaerobe. Dacă în prezența oxigenului (condiții aerobe) și a unei cantități suficiente de nutrienți microorganismele au capacitatea de a degrada mai mulți poluanți organici în carbon, apă dar și mase de celule microbiene, în absena oxigenului (condiții anaerobe) microorganismele transformă poluanții organici în metan, cantități mici de carbon și uneori cantități extreme de mici de hidrogen . (Popescu A., 2008; Malschi D., 2014).

3. Bioremedierea intrinsecă: numită și atenuare naturală monitorizată și are loc în mod natural atât în apele cât și în solurile contaminate. Atenuarea naturală monitorizată este un tip natural de bioremediere și are loc îndeosebi în siturile contaminate cu produse petroliere (ex: vechile stații de alimentare cu carburanți). Acest tip de bioremediere necesită o monitorizare cât se poate de strictă pentru a se asigura pe de o parte protecția mediului iar pe de altă parte sănătatea umană. (Popescu A., 2008; Malschi D., 2014).

Biodegradarea aerobă este acea remediere care are loc în prezența oxigenului și se desfășoară prin oxidarea parțială sau totală prin care se pot obține diferiți constituenți minerali precum ar fi: CO2 și apă. Contaminanții organici pot fi mineralizați doar dacă în mediul respectiv sunt prezenți sulfați și nitrați. Transformarea contaminanților în metan, dioxid de carbon și urme de hidrogen se numește bioremediere metanogenică. Un tip de biodegradare aerobă este dehalogenarea reductivă care constă în transformarea contaminanților în contaminanți cu o toxicitate mai redusă ca urmare a procesului de dehalogenare. Bioremedierea aerobă are o viteză mai mare de desfășurare decât bioremedierea anaerobă, aceasta fiind deseori preferată în detrimentul celeilalte. În unele cazuri bioremedierea anaerobă este singura opțiune rămasă deoarece mulți dintre contaminanți sunt metabolizați în condiții de reducere (Popescu A., 2008; Malschi D., 2014).

Bioremediere se poate face in-situ și se numește bioremediere in-situ (pe loc) sau se poate face ex-situ și se numește bioremediere ex-situ (prin transportarea substratului poluat la instalații speciale de tratare).

4.1.1 Bioremediere in-situ

Bioremedierea in-situ este o metodă care constă în degradarea pe loc (,, in-situ’’) a unor contaminanți utilizând microorganisme, iar această metodă are ca scop producerea unor compuși cu un grad mai scăzut de periculozitate. De cele mai multe ori bioremedierea in-situ permite degradarea contaminanți din apele subterane dar și din solurile saturate și nesaturate.

Metode de aplicare ale bioremedierii in-situ:

Bioremediere in-situ accelerată

Atenuarea naturală monitorizată

Bioremedierea in-situ accelerată constă în stimularea creșterii unui consorțiu de bacterii prin adăugarea de substrat sau nutrienți la un acfiver. Deseori acestasta metodă este utilizată acolo unde se dorește să aibă loc o creștere a procesului de biotransformare a unui contaminant desigur ținând cont că viteza acestui proces depinde de prezența nutrienților precum și de cedarea și acceptarea de electroni. Prin tehnologia de bioremediere in-situ accelerată se urmărește creșterea cantității biomasei din interiorul acviferului contaminat în acest fel se poate obține o biodegradabilitate mai mare a contaminantului. În cazul bioremedierii in-situ accelerate aerobe pentru ca procesul să se desfășoare cât se poate de normal necesită o creștere a cantitații de oxigen (acceptor de electroni), pe când în schimb în cazul celei anaerobe o creșterea a cantității de donori de electroni (lactat, benzoat etc.) dar și a acceptorilor de electroni (nitrat, sulfat etc.) (Malschi D., 2014).

Atenuarea naturală monitorizată (bioremedierea intrinsecă) constă în folosirea microorganismelor prezente în sol pentru a degrada contaminanții fără ca să aibă loc intervenția umană. Pentru a se putea folosi această tehnologie se presupune o cunoaștere foarte bună a sitului dat și o monitorizare pe termen lung a acestuia. Gradul de eficiență al acestea metode depinde de o serie de factori cum ar fi concentrația contaminanților prezenți dar și carcteristicile fizice, chimice și biologice ale solului și apei subterane (Malschi D., 2014).

4.1.2 Avantajele și dezavantajele bioremedierii in-situ

1. Avantajele bioremedierii in-situ:

Prin aplicarea acestei metode are loc transformarea contaminanților în substanțe inofensive (H2O, CO2, etanul etc).

Timpul necesar pentru tratarea poluării solului prin bioremediere intrinsecă (atenuarea naturală monitorizată) este adesea mult mai rapidă decât dacă se utilizează tehnologiile de pompare-tratare.

Bioremedierea in-situ are niște costuri mult mai scăzute decât alte tehnologii de remediere.

Suprafața zonei pentru care se folosește bioremedierea in-situ poate să fie mult mai mare decât în cazul altor tehnologi de remediere (Malschi D., 2014).

2. Dezavantajele bioremedierii in-situ:

Unii dintre contaminanți să nu poată fi complet transformați în compuși inofensivi datorită unor particularități pe care le prezintă situl respectiv.

În procesul biotransformare pot apărea niște produși intermediari care pot avea o toxicitate și mobilitate mult mai mare decât a compusului inițial.

Există posibilitatea ca biodegradarea unor compușii să fie imposibilă

Bioremedierea in-situ accelerată este greu de aplicat mai ales în acviferele care au o permeabilitate scăzută datorită limitării procesului de transport al nutrienților.

Concetrațiile toxice de compușii organici și metalele grele contribuie la inhibarea activității microorganismelor care îngreunează și uneori chiar fac imposibilă aplicarea bioremedierii (Malschi D., 2014).

Exemplu de tratament biologic in-situ:

Bioventilarea este o tehnologie care are ca scop biodegradarea naturală in-situ a compușilor degradabili aerobi prin furnizarea de oxigen necesar susținerii activității microbiene din sol. Oxigenului este aplicat direct prin injectarea în poluanții reziduali din sol. Aplicabilitatea acestei tehnologii este de durată medie sau lungă putând dura de la câteva luni până la câțiva ani. Bioventilarea a fost folosită cu succes pentru remedierea unor soluri contaminate cu hidrocarburi petroliere, pesticide, compuși chimici organici etc. Costurile necesare pentru punerea în aplicare a acestei metode depind de tipul de sol și de numărul de puțuri de injectare/extracție instalate (Malschi D., 2014).

Factori care care pot limita aplicabilitatea și eficiența acestei metode:

Gradul de umiditate scăzut al solului poate influența procesul de biodegradare și eficiența bioventilării.

Scăderea temperaturii poate încetini procesul de remediere chiar dacă s-au realizat și remedieri cu succes în medii cu temperaturi scăzute.

Permeabilitatea scăzută a solului poate reduce eficiența bioventilării (Malschi D., 2014).

4.1.3 Bioremedierea ex-situ presupune utilizarea unor metode

Metoda Biopile se realizează prin tratarea biologică și controlarea parametriilor (umiditate sol, concentrație în oxigen, conținutul de N și P). Acesata metodă de bioremediere are ca scop scăderea concentrației constituenților petrolului prin creșterea și proliferarea numărului de microorganisme din solul contaminat. Pentru atingerea acestui scop, solul trebuie aranjat și așezat în gramezi în care sunt introduse instalații de aerare și de adăugare de minerale (nutrienți și apă) ce sunt prevăzute cu sisteme de pompare care să asigure condițiile necesare pentru dezvoltarea microorganismelor. Timpul necesar aplicării al acestei metode nu este lung, poate dura de la câteva săptamâni pâna la câteva luni și poate fi aplicată pentru compușii organici volatili nehalogenați, hidrocarburile din carburanți, compușii organici volatili halogenați, pesticide etc. (Potra. A și colab., 2012., Van De Steene J., 2007; Malschi D., 2014 ).

În funcție de dimensiunea ariei alocate pentru aplicarea metodei biopile, de gradul de contaminare al acesteia, de condițiile climatice existente și de natura contaminantului proiectarea unui astfel de sistem biopile poate varia. La modul general acest sistem poate avea o înălțime cuprinsă între 2 m și 4 m, lățimea poate varia de la 2 m pâna la 20 m iar lungimea este dependentă de dimensiunea ariei alocate construirii unui astfel de sistem (Van De Steene J., 2007).

Costurile necesare pentru punerea în aplicare a acestei metode depind de natura poluaților, de procedura care se va aplica, de necesitatea unui tratament suplimentar sau post-tratament și de necesitatea unui echipament care să se ocupe de controlul aerului (Malschi D., 2014).

Factori care care pot limita aplicabilitatea și eficiența acestei metode:

Necesitatea efectuării unei excavării a solurilor cantaminate.

Testarea gradul de tratare în scopul determinării biodegradabilității poluanților, oxigenarea adecvată și rate de încărcare a nutrienților

Grămezile care au aceleași dimensiuni au nevoie de mai mult timp pentru a fi curățate decât procesele aflate în fază de nămol (Malschi D., 2014).

Figura 7. Sistemul tipic al unei biopile. (După Malschi D., 2014 adaptat după Valérie Guérin, Pierre Menger., 2010).

Metoda Land farming (Cultivarea Pământului) este una dintre tehnologiile de bioremediere ce impune instalarea unor conducte, scopul acestora fiind de a monitoriza scurgerile poluanților. Această metodă presupune excavarea solului contaminat. Pentru asigurarea aerisirii mediilor poluate se practică periodic așezarea acestora în straturi. Condițiile solului (umiditate, aerisire, pH etc.) sunt în permanet verificate pentru a optimiza rada de biodegradre a contaminaților. Metoda land farming este folosită mai ales pentru tratarea siturilor poluate cu hidrocarburi petroliere cum este de exemplu benzina ce este o hidrocarbură cu masa moleculară mică iar tratarea acesteia presupune realizarea unor procese de volatilizare. Eficiența acestei metode depinde de caracteristicile solului supus depoluării, tipul de microorganisme folosite și de natura poluanții existenț (Potra. A și colab., 2012., Malschi D., 2014 ).

Factori care care pot limita aplicabilitatea și eficiența acestei metode:

Necesitatea unui spațiu mare.

Factorii care pot influența biodegradarea poluanților (temperatură, umiditate etc) nu pot fi ținuti sub control ceea ce face ca durata de finalizare a remedierii să se prelungească.

Degradarea poluanților anorganici este imposibilă.

De exemplu solvenții care sunt poluanți volatili trebuiesc tratați în prealabil deoarece se pot evapora în atmosferă și pot produce ulterior poluare (Malschi D., 2014).

Figura 8. Operațiunea tipică Land fandfarming (După Malschi D., 2014 adaptat după Valérie Guérin, Pierre Menger., 2010)

Metoda Composting constă în amestecarea solului cu substanțe organice, urmată apoi de formarea unor grămezi dispuse la distanțe optime pentru a putea facilita procesul de biodegradare. În metoda composting se folosesc 3 tipuri de procese și anume îngrășarea movilelor statice aerisite (grămezile formate sunt aerisite cu ajutorul unor pompe de aspirație), compostingul în vase agitate mecanic (presupune amestecarea și aerisirea composting-ului în vasul reactorului) și composting-ul pe brazede (presupune amestecarea brazdelor pe care este plasat composting-ul cu ajutorul unor echipamente mobile). Aceasta metodă are un domeniu aplicabilitate destul de larg putând fi aplicată mai ales la solurile poluate cu compuși organici biodegradabili (Malschi D., 2014). Costurile variază în funcție de cantitatea de sol care trebuie supusă decontaminării, de tipul de poluatnt, de disponibilitatea amendamentelor, de necesitatea unui tratament suplimentar sau post-tratament și de necesitatea unui echipament care să se ocupe de controlul aerului.

Factori care care pot limita aplicabilitatea și eficiența acestei metode.

Necesitatea unui spațiu mare.

Composting-ul duce la o creștere în volum a materialui fapt datorat adăugării de amendamente.

Tratarea metalelor grele nu se poate efectua cu ajutorul acestei metode cunoscându-se că nivelul ridicat al concentrațiilor de metale pot fi toxice pentru microorganisme.

Figura 9. Etapele de desfășurare ale metodei Composting (După Malschi D., 2014)

Folosirea acestor procese în remedierea solurilor contaminante cu hidrocarburi petroliere și derivații acestora au avut succes. Sursa principală de carbon și energie pentru dezvoltarea microorganismelor din sol este dată de hidrocarburile din petrol. Cea mai importantă problemă de mediu actuală este poluarea solului cu hidrocarburi de petrol, această fiind deasemenea și cea mai frecvent întâlnită. Majoritatea hidrocarburilor sunt biodegradabile iar un factor ce limitează degradarea completă a acestora este dat de prezența microorganismelor în sol. (Marinescu M. și colab., 2009).

Realizarea unei dezvoltări durabile a societății noastre constă în eliminarea hidrocarburilor din petrol poluante, care au un impact puternic asupra mediului. Rata de bioremediere este controlată de trei procese majore: procesul de transfer al oxigenului din aer în soluțiile apoase, procesul de transfer al uleiului din sol în soluțiile apoase și rata de biodegradare a uleiului în soluție apoasă (Marinescu M. și colab., 2009).

Biodegradarea ecosistemului poluat cu petrol se pot face cu ajutorul unor bacterii, si/sau fungi și protozoare. În urma contaminarii asupra volumul de hidrocarburi deversat din sol au loc procese fizice și chimice cum ar fi volatilizarea și scurgerea. În plus poate fi împiedicată adsorbția hidrocarburilor la matricea solului datorită disponibilității microorgansmelor implicate în biodegradare. Aceste procese contribuie la reducerea concentrației totale de hidrocarburi din sol provocând deasemenea și modificări în compoziția generală a acestora. Mobilitatea și disponibilitatea hidrocarburilor în sol depinde de proprietățile fizice și chimice ale solului (Ausma S. Și colab., 2002).

Raportul concentrațiilor de carbon, fosfor și azot reprezintă un factor major în remedierea efectivă a hidrocarburilor în soluri. Microorganismele capabile să biodegradeze diferitele componentele ale hidrocarburilor petroliere, cum ar fi hidrocarburile aromatice policiclice (PAHs), naftalină, hidrocarburile monoaromatice precum toluenul sau hidrocarburile alifatice reprezentate în mare parte de n-alcani pot fi izolate cu ușurință din mediul înconjurător, mai ales din siturile contaminate cu petrol (Geetha S.J și colab., 2013).

Microorganismele utilizate în procesele de bioremediere au sarcina de a transforma contaminații anorganici cum este amoniacul, nitrații și perclorații. De asemenea microorganismele nu au capacitatea de a biodegrada metalele grele dar ele pot fi folositoare pentru a modifica starea de oxidare a acestora în acest fel ele au un grad de toxicitate mai scăzut dar devin și imobile. Un exemplu este acela că microorganismele pot transforma cromul hexavalent în crom trivalent. În funcție de cantitatea de contaminant prezentă în sol, microrganismele pot avea de suferit, de aceea în cazul unei concentrații ridicate de contaminanți aceștia pot deveni toxici pentru microorganisme. În anumite cazuri chiar și concentrațiile scăzute de contaminanți pot avea efecte toxice asupra microorganismelor prezente în sol (Popescu A., 2008).

Pentru bioremedierea mediilor poluate cu hidrocarburi sunt folosite o serie de preparate microbiene. Cele mai comercializate preparate microbiane din lume au la bază consorții microbiene în care predomină în special reprezentanți din genului Pseudomonas, Xanthomonas și Bacillus (Cocuț D.C. și colab, 2008).

În urma studiilor realizate de Mohammed D. și colab în anul 2007 a fost subliniată ideea că, culturile microbiene indigene îmbunătățite au biodegardat într-o măsură mai mare în primele zile ale procesului de bioremediere a hidrocarburilor petroliere decât biopreparatele comerciale ce au nevoie de o perioadă mult mai lungă de timp.

Coste A și colab.,2014 au evidențiat faptul că pentru bioremedierea solului poluat cu hidrocarburi se utilizează adesea îngrășământ organic ce urmărește îmbunătățirea activității microorganismelor indigene, această fiind o metodă ecologică de remediere a ecosistemelor deteriorate. În urma efectuării acestui studiu s-a putut concluzionat faptul ca aplicarea îngrășământului organic influențează rata de degradarea a hidrocarburilor petroliere, îmbunătățind activitatea microorganismelor din sol. Uneori datorită unui număr scăzut de microorganisme în sol rata de degradare a hidrocarburilor petroliere este scăzută. Utilizarea acestei variante de bioremediere face ca numărul de microorganisme să crească ceea ce duce și la o creștere a ratei de degradare. Acest îngrasamat organic face ca fertilitatea solului să crească fapt datorat unei cantității ridicate de elemente nutritive ca de exemplu: fosfor, azot, potasiu etc.

Datorită răspândirii largi a contaminanții există un risc mare asupra sănătății populației umane dar și asupra mediului, cel mai mare interes a fost direcționat asupra petrolului și produselor petroliere datorită răspândirii la scară largă a acestor contaminanții. Prin bioremediere se încearcă de altfel înlăturarea comtaminanții dar și restaurarea sistemelor poluate datorită gradului mare de transformări realizate de microorganismele (Okoh A.I, 2006).

La nivel mondial se observă un salt important în aplicarea unor metode eficiente, rapide care să asigure distrugerea poluanților și refacerea cadrului natural. După anii 1970 aplicarea bioremedierii în agricultură folosind microorganisme devine din ce în ce mai cunoscută (Cocuț D.C. și colab., 2008).

4.2 Aplicarea bioremedierii – studii de caz

În anul 1975 în orașul din Charleston din Carolina Sud a avut loc o scurgere masivă de kerosen care provenea dintr-un depozit militar. Acest lucru a impus luarea imediată a unor măsuri de recuperare și izolare a scurgerii de kerosen dar nu a putut împiedica pătrunderea kerosenului în stratul nisipos permeabil atingând nivelul pânzei freatice. La foarte puțin timp după ce a avut loc scurgerea, apa din sol a împrăștiat substanțele toxice precum benzenul saturat din solul poluat cu combustibil până într-o zonă rezidențială. S-a pus problema îndepărtării solului contaminat precum și a apei subtereane dar acest lucru le era imposibil așa că au apela la o tehnologie de bioremediere. În urma unor studii efectuate de U.S.Geological Survey (USGS)

s-a demostrat că unele microorgansime care erau prezent în mod natural în sol au degradat compușii toxici din combustibil în dioxid de carbon acesta ne prezentând un pericol atât pentru mediu cât și pentru sănătatea umană. Tot în urma acestor studii s-a constatat că aplicarea unor nutrienții contribuie la creșterea vitezei de biodegradare a microorganismelor.

Un alt succes înregistrat în urma aplicării bioremedierii este în cazul scurgerii de țiței din Bemidji, Minnesota. În anul 1979 o conductă care transporta țiței s-a spart poluând un acvifer de subteran, U.S.Geological Survey (USGS) efectuând numeroase studii asupra sitului contaminat a putut constata că substanțele toxice împrăștiate din țiței au fost degradate în mod accelerat de populații microbiene naturale. În acest fel s-a demonstrat că pata de contaminarea a apei subterane a fost stopată numai după câțiva ani deoarece viteza de degradare a microorganismalor a egalat viteza de extinderea a contaminantului. Acest studiu stă la baza bioremedierii intrinseci, fiind exemplu cel mai bun de remediere a apei subterane contaminate fără ca să abia loc intervenția umană.

Exemplu mai concret care a subliniat importanța și eficiența procesului de bioremdiere este acela din Galloway New Jersey, unde a avut loc o poluare cu benzină. Benzina este cel mai cunoscut poluant al apelor subterane din Statele Unite. Studii efectuate asupra acestui sit contaminat au arătat faptul că degradarea substanțelor toxice din benzină este datorată ratei accelerate de degradare a microoganismelor (Malschi D., 2009).

II. PARTEA EXPERIMENTALĂ

Capitolul V. Scopul și obiectivele studiului.

În acest studiu preliminar s-a urmărit analiza comunității microbiene dintr-un microcosm.

Obiective generale:

Determinarea potențialului metabolic al comunitaților bacteriene folosind Ecoplates;

Determinarea diversității de utilizare a substatului folosind indici de diversitate;

Capitolul VI. Materiale și metode

6.1 Determinarea potențialului metabolic al comunitaților bacteriene

Pentru a putea efectua acest studiu s-a realizat construcția unei biopile (microcosm). Acestă construcție a presupus cântarirea și punerea în interiorul construcției a 125 kg de sol precum și determinarea tipului de sol și a compoziției totale de carbon și nitrogen al acestuia cu ajutorul unor măsurători granulometrice. Ulterior solul a fost supus poluării prin adăugarea unui volum de 9 litri de kerosen.

Figura 10. Microcosm (Poster Cluj 2015., Preliminary analysis of microbial communities profiles from soil).

Tabel 3. Caracteristicile solului nepoluat obținute în urma măsurătorilor granulometrice

Microorganismele au un rol important în foarte multe procese biologice de aceea este necesară efectuarea unei evaluării a întreagii populații și a întregului ecosistem deoarece în acest mod se poate obține cea mai probabilă reflectare a condițiilor de mediu naturale. Activitatea enzimatică a populațiilor este stric corelată cu compoziția sa, astfel că apariția unor modificări în activitatea enzimatică ar putea reprezenta indicatorul schimbărilor care au loc în populațiile de microorganisme sub o gamă largă de condiții. Din această cauză este necesar să se efectueze o cercetare a cărui scop este de a caracteriza comunitățiile de microorganisme în probele de mediu având în vedere faptul că “profilul fiziologic al comunității’’(CLPP-community-level physiological profile) poate fi un instrument util pentru a înțelge aspectele ecologice de bază (Gryta A. și colab., 2014).

În studiile ecologice pentru a se putea determina potențialul metabolic al comunitățiilor de microorganisme s-a introdus o nouă tehnică numită tehnica Biolog. Această tehnică presupune folosirea unor plăci Biolog EcoPlateTM prevăzute cu 96 de godeuri care conțin 31 de surse de carbon diferite aflate în triplicat. În fiecare godeu se găsește un colorant (tetrazolium violet) care în urma utilizării sursei de carbon de către microorganisme virează în violet ca rezultat al unei reacții redox (Muniz S. și colab.,2014).

Tehnica Biolog este utilizată și pentru a indica adesea reducerea sau dispariția biodiversității unor specii de microorganisme din solurile sensibile la diferiți contaminanți. Pe baza rezultatelor obținute în urma folosirii acestei tehnicii se poate indica necesitatea de refacere a solului contaminat (Stefanowicz A., 2006).

Conform Tiquia S.M., 2010 cele 31 de surse de carbon sunt grupate în șase clase și anume:

Amine: Putresceină, Feniletilamină;

Amino acizi: L-Arginină, L-Asparagină, L-Fenilalanină, L-Serină, acid Glicil-L-Glutamic, L-Treonină;

Carbohidrați: α-D-Lactoză, β-Metil-D-Glucozid, D-Celobioză, D-Manitol, I-Eritritol, Glocozo-1-fosfat, acid γ-lacton D-galactonic, N-acetil-D-glucozamină, D,L-α-glicerol fosfat, D-Xiloză;

Acizi carboxilici: acid α-Cetobutiric, acid D-Glucozaminic, acid D-Malic, acid γ-Hidroxibutiric, acid metil ester piruvic, acid D-Galacturonic, acid Itaconic;

Polimeri: α-Ciclodextrin, Tween 40, Tween 80, Glicogen;

Compuși fenolici: acid 2-Hidroxi benzoic, acid 4-Hidroxi benzoic.

Comunițătile bacteriene utilizează substraturile cu rate diferite, aspect care poate fi observat prin timpul necesar pentru virarea culorii dar și prin intensitatea acesteia, în acest mod se poate obține “profilul fiziologic al comunității’’(CLPP-community-level physiological profile). (Chazarenc F. și colab., 2010; Stefanowicz A., 2006).

Figura 9. Biolog EcoPlateTM – surse de carbon (www.biolog.com).

Au fost prelevate probe de sol din microcosmul poluat cu kerosen pe o perioadă de trei săptămâni iar proba notată cu T0 reprezintă solul nepoluat cu kerosen. Solul a fost prelevat din cele 4 colțuri ale microcosmosului și din centru după care s-a efectuat omogenizarea acestora. Într-un tub Falcon de 15 ml s-au cântărit 5 g de sol peste care s-a adăugat un volum de apă, obținându-se astfel un volum final de 10 ml. Tuburile au fost apoi vortexate la o viteză de 2200 rpm timp de 5 minute cu o pauză de decantare de 10 minute și a fost repetată această operațiune de 3 ori. După ce tuburile au fost vortexate au fost incubate la 280 C cu agitare la 150 rpm pe orizontală.

După expirarea timpului probele au fost lăsate la decantare timp de 15 minute, iar din supernatantul rămas s-au realizat diluții seriale zecimale până la 10-5 după care suspensia celulară obținută a fost inoculată în Ecoplates cu ajutorul unei pipete multicell cu patru canale câte 150 µL per godeu, ulterior plăcuțele au fost citite la un cititor automat al sistemului Biolog mai exact s-a citit densitatea optică la 590 nm și 750 nm. Activitatea metabolică a comunităților de microorganisme a fost monitoritază din 24 în 24 de ore timp de cinci zile înregistrându-se absorbanțele la lungimile de undă menționate mai sus.

Prelucrarea datelor a presupus importul datelor din programul specific MicroLog în format Excel. O primă prelucrare a constat în scăderea densităților optice inițiale din densitățile obținute pentru timpul de 24h, 48h, 72h și 96h și prelucrarea ulterioară a acestora și obținerea indicilor de diversitate.

Stefanowicz A., 2006 prezintă o serie de avantaje și dezavantajea ale tehnicii Biolog.

Avantaje precum:

Plăcile Biolog permit caracterizarea unei comunități pe baza așa-numitelor profile fiziologice individuale care se obțin în urma inoculării bacteriene;

Inocularea suspensiilor de sol se face direct pe plăci permițând astfel obținerea profilelor fiziologice ale întregii comunități microbiene;

Este o tehnică rapidă și convenabilă pentru studierea și compararea diversității funcționale a întregi comunități microbiene;

Rata de dezvoltare a culorii oferă informații cu privire la activitatea metabolică, densitatea și diversitatea celulelor bacteriene din inocul;

Tehnica Biolog conferă vaste posibilități în domeniul protecției mediului.

Această metodă permite estimarea schimbărilor ce apar în comunitățile de microorganisme din sol ca rezultat al expunerii pe termen scurt sau lung a solului la contaminare;

Analiza profilelor fiziologice ale comunitățiilor de microorganisme aflate în diferite medii și habitate permite estimarea similarității dintre acestea;

Această tehnică este utilizată și pentru a determina schimbările ce apar în comunitățiile de microorganisme pe baza răspunsului metabolic dintre comunitățile din zonele contaminate și zonele aflate sub control;

Dezavantaje precum:

Nu poate preciza care specie este implicată în degradarea substraturilor aflate în plăci datorită diversității bacteriene foarte mari a acestora;

Sursele de carbon folosite de comunitățiile de microorganisme nu poate reflecta substratul natural al acestora;

Profilul fiziologic obținut pe placă este rezultatul activității unei părți a comunității bacteriene și trebuie ținut cont de acest aspect atunci când sunt stabilite concluziile ce țin de funcționarea întregii comunități;

6.2 Determinarea diversității de utilizare a substatului folosind indici de diversitate;

Pentru a putea determina diversitatea de utilizare a substratului (Diversity of substrate utilisation-DSU) este necesară calcularea unor indici de diversitate.

Indicele Shannon-Wiener (H) este unul dintre cei mai utilizați indici de diversitate și care mai este cunoscut și sub denumirea de Shannon-Weaver. Aceste indice este utilizat pentru a caracteriza diversitatea speciilor dintr-o comunitate și i-a în considerare pe lângă numărul speciilor dintr-o comunitate și abundența acestora. În cazul acestui studiu acest indice Shannon-Wiener (H) descrie abilitatea comunității microbiene de a degrada mai multe sau mai puține surse de carbon, fiind de altfel și un indice de diversitate fiziologic al comunității microbiene. Comunitățiile microbiene care au abilitatea de a degrada mai multe substraturi și pe care le pot degrada cu aceeași eficiență vor avea o valoare a indicelui Shannon-Wiener (H) mai mare decât a comunităților care degradează mai puține substraturi. Valoarea indicelui Shannon-Wiener (H) ne permite să evaluăm abundența speciilor ce este distribuită între toate speciile din comunitatea microbiană din probele de sol (Muniz S. și colab.,2014).

Ecuația după care este calculat indicele Shannon-Wiener:

N

H = -∑ pi ln pi

i=1

Unde H = indicele de diversitate Shannon-Wiener;

p = este proporția activității microbiene din fiecare substrat;

N = numărul total de substraturi de pe o placă;

i = activitatea microbiană totală;

Pentru a analiza relația dintre diversitatea microbiană și funcționarea ecosistemului, gama și uniformitatea funcțiilor catabolice poate fi evaluată in-situ (diversitate catabolică) (Dirk Van Elsas și colab., 2006).

Diversitatea catabolică constă atât în bogația cât și în uniformitatea utilizării substratului. În acest caz bogăția este numărul de substraturi metabolizate de către comunitatea de microorganisme din sol, în timp ce uniformitatea se referă la variabilitatea utilizării substratului.

Catabolic evenness (Uniformitatea substratului) a fost calculată din profilul de răspuns al respirației ca ∑ =1/pi2 unde pi este suma tuturor substraturilor și pi = r/∑ri (unde ri este definit ca răspunsul respirației fiecărui substrat iar ∑ri ca procentul total de răspuns al respirației, suma tuturor substraturilor) (Valiolahpor R. Și colab.,2011). De exemplu comunitățile cu o uniformitate catabolică scăzută sunt mai puțin rezistente la stres și perturbări decât cele cu o uniformitate catabolică mai mare (Dirk Van Elsas și colab., 2006).

AWCD (average well color development), a fost definită ca media aritmetică a valorilor absorbanței pentru fiecare substrat (Gueneta B. și colab., 2011) și este o expresie a activității microbiene din probe ce integrează densitatea celulară și diversitatea de utilizare a substratului (Janniche G.S și colab., 2012). Activitatea microbiană din fiecare placă a fost exprimată ca AWCD (average well color development), după următoarea formulă de calcul: AWCD=Σ (C-R)/n unde C este producția de culoare din fiecare godeu, R valoarea abosorbanțelor plăcilor și n este numărul de substraturi (Choi K.H și colab., 1999).

VII. Rezultate și discuții

7.1 Determinarea potențialului metabolic al comunitaților bacteriene

În urma incubării plăcilor Biolog EcoPlateTM are loc o reacției colorimetrică, care indică matabolizarea surselor de carbon și obținerea un “profilul fiziologic al comunității’’(CLPP-community-level physiological profile) specific fiecărei probe în parte (Figura 12).

Figura 11. Exemplu de placă Biolog EcoPlateTM în care a avut loc reacția calorimetică

Pentru obținerea ,,profilului fiziologic al comunității’’ s-a calculat mai întâi media aritmetică pentru fiecare sursă de carbon în parte, deoarece acestea sunt în triplicat, iar valorile obținute au fost grupate în funcție de clasă (amine, carbohidrați, complexe de surse de carbon, acizi carboxilici, amino-acizi, carbon-fosfat) urmând ca apoi să se calculeze media arimetică a valorilor absorbanțelor pentru fiecare clasă în funcție de numărul surselor de carbon din fiecare categorie (Figura 12).

Figura 12. Profilul fiziologic al comunității obținut la 72 h după incubare

Din datele obținute putem să observăm ca atât în proba Ti (proba de sol prelevată înainte de poluarea cu kerosen) cât și în proba T0 (proba de sol prelevată la interval de 1 h după poluarea cu kerosen) activitatea microbiană este scăzută ceea ce sugerează că și potențialul metabolic al acesteia este scăzut fapt datorat fie incapacității unor microorganisme de a utiliza sursele respective de carbon, fie numărului redus de microorganisme indigene din solul respectiv dar care care este urmată de o creștere a activității microbiene în urmatoarele probe ceea ce sugerează că numărul speciilor care pot folosi kerosenul ca sursă de carbon crește. Se poate observa că variațiile cele mai mari a metabolizării surselor de carbon au fost identificate în cazul probei T1 la carbohidrați, aminoacizi, amine și acizi carboxilici. Pentru carbohidrați s-a identificat cea mai mare variație ceea ce explică importanța acestora ca surse primare de carbon.

7.2 Determinarea diversității de utilizare a substatului folosind indici de diversitate

Tabel 4. Valorile obținute în urma calculării indicelui Shannon-Wiener (H) și a numărului speciilor la 72 h de la incubare.

Figura 13. Reprezentarea valorilor obținute în urma calculării indicelui Shannon-Wiener (H) la 72 h de la incubare.

Figura 14. Reprezentarea valorilor obținute în urma calculării numărului de specii din probe la 72 h după incubare.

Putem observa că valorile indicelui Shannon-Wiener variază de la valoarea cea mai mică de 3,17 pâna la valoarea cea mai mare de 3,29, ceea ce înseamnă diversitatea speciilor din comunitate și abundența acestora crește, lucru observat și din valorile obținute în urma calculării numărului de specii din probe, deci și abilitatea de a degrada mai multe substraturi este mai mare.

Tabel 5. Valorile obținute în urma calculării Catabolic evenness la 72 h de la incubare.

Figura 14. Reprezentarea valorilor obținute în urma calculării Catabolic evenness la 72h de la incubare.

Din rezultatele obținute valorile uniformității catabolice variază de la 20.716 până la 25.432 ceea ce înseamnă că comunitatea microbiană din sol tinde spre a avea o uniformitate catabolică tot mai mare care să îi permită rezistență la condițiile de stres la care este supusă.

Tabel 6. Valorile obținute în urma calculării AWCD la 24 h , 48 h, 72 h și 96 h de la incubare.

Din acest tabel se poate observa că rata de dezvoltare a culorii din fiecare probă se desfășoara diferit, ceea ce sugerează îm anumite probe activitatea metabolică, diversitatea și densitatea celulelor este mai mare.

Concluzii

1. Metabolizarea surselor de carbon și biodegradarea este influențată în primul rând de numărul de specii de microorganisme prezente în sol cât și de gradul de poluare.

2. Din profilul fiziologic al comunității se poate observa ca activitatea microbiană este mai scăzută la început poluării, urmată de o creștere a activității metabolice o dată cu trecerea timpul.

3. O valoare mai mare a indicelui de diversitate microbiană poate fi explicată printr-o creștere a populațiilor microbiene implicate în absorbția de n-alcani și hidrocarburi aromatice din kerosen.

În concluzie este foarte importantă cunoașterea efectelor pe care le poate avea poluarea cu hidrocarburi asupra ecosistemelor terestre dar și metodele necesare remedierii acestora. Privind în ansamblu poluarea ecosistemelor terestre poate afecta nu numai germinația semințelor și creșterea plantelor cât și sănătatea umană având consecințe grave asupra aceasteia. Rezultatele obținute în urma cercetărilor realizate de unii oamenii de știință au demonstrat că pentru desfășurarea procesului de depoluare este necesară cunoașterea culturilor microbiene care duc la degradarea completă sau parțială a compușilor poluanți, caracteristicile mediului supus depoluării, alegerea oxidantului și a substanțelor nutritive, precum și natura poluanților existenți în mediul respectiv și capacitatea acestora de biodegradabilitate.