. Compusi Radiofarmaceutici Marcati cu Iod Radioactiv

Introducere

Introducerea trasorilor radioactivi în medicină a făcut posibilă soluționarea multor probleme ce păreau de nerezolvat și a revoluționat o serie de concepte medicale din domeniul diagnosticului și terapiei. Principiul pe care se bazează utilizarea trasorilor radioactivi in vivo constă în administrarea sau măsurarea lor intravenos sau per os urmată de detectarea sau măsurarea radioactivității la nivelul unui organ ori a întregului corp.

Deși se cunosc peste 1000 izotopi radioactivi, numai câțiva intră în componența trasorilor radioactivi folosiți în medicină, printre aceștia numărându-se Tc-99m, In-113m, In-111, I-131, I-125, Se-75, Au-198.

Având în vedere procesul de dezintegrare radioactivă, radionuclizii pot fi caracterizați prin natura și energia radiațiilor emise și prin timpul de înjumătățire. În medicina nucleară se utilizează izotopi ce emit radiații și . Deoarece radiațiile au penetrabilitate limitată, ele se folosesc cu succes în terapie și unele studii radioimunologice, în timp ce radiațiile , radiații penetrante, sunt cele mai adecvate în scintigrafie, studiul funcțiilor dinamice, al compoziției elementelor organismului și la determinările in vitro.

Pentru a obține informația dorită cu minimum de expunere a pacientului este necesar să se cunoască nu numai energia, ci și timpul de înjumătățire fizic și cel biologic al trasorului radioactiv; când trasorul rămâne mai mult timp într-un organ este de dorit să se substituie radioizotopii cu timp fizic de înjumătățire mai lung cu alții cu timp de înjumătățire mai scurt.

S-a constatat că o serie de radionuclizi prezintă o afinitate pentru câte un organ, de exemplul iodul pentru tiroidă. În unele cazuri pentru investigare este suficient să se administreze pacientului nuclidul sub forma radioelementului, în timp ce în alte cazuri este necesară utilizarea tropismului unei molecule particulare în organul studiat. În acest ultim caz trebuie preparate molecule marcate în care să fie inclus radionuclidul.

Aplicațiile biologice, farmacologice și medicale ale moleculelor marcate pun probleme numeroase și variate, date fiind atât metodele de preparare originale, cât și procedeele de control, purificare și conservare.

Pentru trasorii radioactivi folosiți în medicina nucleară s-a adoptat denumirea de radiofarmaceutice.

Un produs radiofarmaceutic este definit ca o substanță radioactivă destinată a fi introdusă într-un organism uman în scopuri terapeutice sau de diagnostic, sau ca un medicament marcat radioactiv.

Clasificarea produselor radiofarmaceutice:

A. După destinația medicală, produsele radiofarmaceutice se clasifică:

a. Utilizare in vivo:

a1) produse pentru radioterapie (de exemplu surse de 129Ir sau 198Au, soluții de Na131I); acestea au în general activității mari de ordinul 10 – 100 mei;

a2) produse pentru diagnostic (majoritatea produselor radiofarmaceutice utilizate in vivo); acestea au activității mici, de ordinul 10ei – 10 mei;

b) Utilizare in vitro:

produse pentru radioimunodozări și alte teste in vitro; au activități foarte mici de ordin 1 – 100 ei.

B. După timpul de înjumătățire al radionuclidului, compușii radiofarmaceutici se clasifică în:

b2) produse radiofarmaceutice de viață scurtă cuprinsă între 10 min și 2 zile;

Aceste produse radiofarmaceutice de viață scurtă sunt cele mai adecvate pentru diagnostic, durata lor de viață fiind comparabilă cu durata examenului clinic, și iradierea pacientului fiind redusă la minimum. Fiind în majoritate emițători + sau , ele se prepară la ciclotron sau din generatori de radioizotopi.

b2) produse radiofarmaceutice de viață medie, cuprinsă între 2 zile și 59 de zile. Ele au fost primele folosite pentru diagnostic și terapie, de exemplu radioiodul –131. Ele sunt emițători +, – sau și se prepară la reactor, ciclotron sau ca generatori de radioizotopi.

b3) produse radiofarmaceutice de viață lungă, mai lungă de 60 de zile; ele sunt mai rar folosite clinic (125J), cel mai adesea sunt utilizate pentru testări in vitro (125J, 14C, 3H etc.). Pot emite orice fel de radiații și se prepară prin diferite metode.

C. După operațiile chimice implicate, produsele radiofarmaceutice se clasifică în:

c1) preparate radioactive obținute prin iradiere a unei ținte la reactor sau la cidotron urmată de dizolvarea acesteia;

c2) preparate radioactive obținute prin iradiere, urmată de prelucrare chimică (distilare, oxidare-reducere, purificare, schimb ionic). Acesta este cazul radiofarmaceutic anorganice cele mai obținute (131J-, 32PO43-, 51CrO42-);

c3) preparate radioactive rezultate prin marcarea intrinsecă sau extrinsecă a unui compus organic cu 131J, 125J, 75Se, 197Hg, etc.

Condiții pe care trebuie să le îndeplinească produsele radiofarmaceutice pentru a fi utilizate:

să fie pure, adică să nu conțină alți izotopi radioactivi sau radionuclidul într-o altă formă chimică;

să fie stabile, deci radionuclidul să rămână fixat în moleculă pentru a se putea urmări circulația sau acumularea sa în organism;

radionuclidul cu care este marcat radiofarmaceutical să fie ușor identificabil prin detectarea radiațiilor pe care le emite;

cantitatea de radionuclid sau de compus marcat administrată trebuie să fie minimă, pentru a evita efecte biologice sau de iradiere nedorite;

să se cunoască toxicitatea compusului marcat, a radionuclizilor rezultați, prin dezintegrare.

1. Marcarea izotopică

1.1. Introducere

O substanță chimică a cărei compoziție izotopică pentru fiecare element pe care îl conține, este cea naturală, se numește nemarcată izotopic. Dacă compoziția izotopică a unui element este modificată, atunci substanța marcată izotopic cu acest element; dacă este vorba doar de modificarea proporției nuclizilor stabili ai elementului, marcajul va fi denumit marcaj stabilonuclidic; dacă pe lângă sau în locul nuclizilor stabili ai unui element apar nuclizi radioactivi, neexistenți în natură în proporția în care apar în substanță, atunci marcajul este denumit radionuclidic, radioizotopie sau radioactiv.

Astfel, de exemplu, carbonul elementar care conține 98,89% 12C și 1,11% 13C nu este marcat izotopic. Dacă există mai mult 13C decât 1,11%, atunci avem carbon marcat cu 13C (sau îmbogățit în 13C); dacă conține mai puțin 13C decât 1,11% atunci avem carbon marcat cu 12C (sau îmbogățit în 12C). Ambele marcaje izotopice sunt marcaje sunt marcaje stabilonuclidice. Dacă în proba de carbon apare 14C (care nu este un radionuclid primordial fiindcă are un timp de înjumătățire de numai 5736 ani), sau 11C cu T1/2=20 min, atunci acea probă este marcată radioactiv.

Prin acțiunea radiației cosmice se formează continuu în atmosferă o mică proporție de 14C din reacția 14N(n, p)14C, astfel că toate substanțele de origine biologică, de dată relativ recentă (sub 105 ani) au o slabă radioactivitate și în principiu sunt marcate radioactiv.

Marcajul stabilonuclidic afectează o fracțiune substanțială din proporția nuclizilor stabili (de ordinul procentului sau zecilor de procente), în timp ce marcajul radionuclidic adaugă, cu puține excepții, de exemplu 14C la nuclizii stabili o fracțiune infimă de nuclizi radioactivi. Acest fel de marcaj radionuclidic se numește „cu purtător”, dat fiindcă nuclizii „poartă” cu ei micile cantități de radionuclizi, prin adsorbție pe vasele în care sunt manipulați. Mai rar se folosește marcajul radionuclidic „fără purtător”, unde practic toți atomii elementului dat sunt radioactivi. În acest caz se atinge activitatea specifică maximă după formula:

Activitate specifică=

1.1.1. Izomeria izotopică; marcaj labil și stabil

Este cunoscut fenomenul de izomerie în chimie: moleculele compuse din aceeași atomi, legați prin legături covalente în moduri diferite duc la substanțe izomere, de exemplu: etanolul CH3-CH2-OH și dimetil-eterul CH3-O-CH3. Marcajul izotopic duce la apariția unui nou tip de izomerie, denumit izomerie optică: moleculele care cu cel puțin doi atomi ai aceluiași element în poziții neechivalente pot da naștere la izomeri izotopici. Astfel, dimetil-eterul marcat fie cu izotopi ai hidrogenului, fie ai carbonului, dă doar un singur izomer optic, căci deși există mai mulți atomi de carbon și hidrogen în moleculă ei sunt echivalenți. Dar alcoolul etilic marcat cu un izotop al carbonului *C (care poate fi radioactiv 14C ori 11C, sau stabil 12C ori 13C) duce la doi izomeri izotopici: H3*C-CH2OH (etanol-2-*C) și H3C-*CH2OH (etanol-1-*C). Analog, la marcajul etanolului cu un izotop stabil ori radioactiv al hidrogenului (*H) rezultă trei izomeri izotopici:

Ultimul din aceștia se formează prin simpla amestecare cu *H2O, căci are loc schimbul izotopic instantaneu între grupele OH din alcool și H2O; din aceea acest marcaj se numește marcaj labil și este neinteresant, căci se pierde la fel de repede în apă obișnuită. Marcajul la legăturile C-H se numește marcaj stabil și se realizează prin sinteză. Tot prin sinteză se realizează și marcajul cu carbon, care este totdeauna un marcaj stabil.

1.1.2. Marcaj izotopic intrinsec și extrinsec

Datorită faptului că proprietățile chimice ale izotopilor aceluiași element sunt practic identice, marcajul izotopic nu modifică substanțial proprietățile substanței marcate, dar permite să identificăm atomul și molecula, astfel marcată din amestecul cu altele nemarcate. Acest fapt, împreună cu detectarea de la distanță, și chiar din interiorul organismului uman, a radiațiilor emise de radionuclizi, stau la baza folosirii izotopilor în medicină și a dezvoltării produselor radiofarmaceutice.

Modificarea compoziției izotopice naturale a unui element prin nuclizi stabili sau radioactivi ai aceluiași element se numește marcaj izotopic intrinsec.

Înlocuirea unui atom al unui element printr-un radionuclid al altui element se obișnuiește să fie denumită marcaj radioizotopic extrinsec. Astfel tratarea unei albumine cu radioiod (131J, 125J sau 123J) duce la substituirea unuia sau mai multor atomi de hidrogen prin radioiod. Proprietățile moleculei marcate izotopic extrinsec nu mai sunt identice cu ale moleculei nemarcate, dar datorită faptului că acest tip de marcaj se aplică în special la moleculele foarte mari, cu mulți atomi, substituirea unui atom printr-un element diferit nu modifică decât puțin proprietățile moleculei.

O moleculă, de exemplu acid acetic, marcată extrinsec cu radioiod, este de fapt o moleculă diferită, marcată intrinsec; în acest caz este un acid iodoacetic marcat intrinsec cu radioiod, de aceea se preferă denumirea de molecule marcate intrinsec. De exemplu, hipuranul marcat cu radioiod este considerat nu ca acid hipuric marcat intrinsec. Acest lucru nu este posibil la moleculele mari, cum sunt albuminele radioiodate căci nu sunt caracterizați iod-derivații neradioactivi ai acestor albumine, iar marcarea este nespecifică.

Marcarea extrinsecă poate fi marcare extrinsecă totală și marcare extrinsecă trasoare.

Astfel, dacă se înlocuiește fiecare atom de S din metionină cu radioseleniu 75Se, se obține selenometionina – 75Se, care poate fi considerată ca o metionină marcată extrinsec total cu Se.

Însă la marcarea extrinsecă a unei proteine cu 131I sau 99nTe, doar o mică proporție din atomii de hidrogen ai proteinei devin marcați extrinsec, de aceea, în acest caz avem de a face cu o marcare extrinsecă trasoare.

Marcarea extrinsecă este necesară pentru a suplini lipsa unor radioizotopi emițător (sau +) pentru cele patru elemente mai des întâlnite în compușii organici: C, H, O și N.

1.1.3. Puritatea radionuclidică și radiochimică

A. Puritatea radionuclidică

Este proporția din radioactivitatea totală care se datorează nuclidului specificat. Ea caracterizează cât de bine a fost separat radionuclidul de ceilalți radionuclizi ai aceluiași element sau ai altor elemente. De exemplu, într-un preparat conținând hipuran 131I, sunt impurități radionuclidice toate moleculele marcate oriunde cu alt radionuclid al iodului (125I) sau al oricărui alt element (131Te). Localizarea chimică a marcajului cu 131I, nu constituie impurități raocalizarea chimică a marcajului cu 131I, nu constituie impurități radionuclidice.

Marcarea esterului tiofilin-metil tirosină conjugat cu 125I s-a făcut prin metoda cu cloromină-T. Teofilina radiomarcată a fost purificată cu solvent urmată de cromatografică în strat subțire [4][5].

Radioactivitățile datorate altor nuclizi sunt ignorate într-un singur caz, atunci când se determină puritatea radionuclidică a unui nuclid-părinte care are un radionuclid-fiică cu T1/2 mai mic decât nu poate fi evitată, stabilindu-se un echilibru radioactiv; acesta este cazul „generatorilor de izotopi” unde calculul purității radionuclidice a nuclidului-părinte, exemplu Mo99 se ține seama de toți radionuclizii prezenți, cu excepția radionuclidului-fiică, 99nTe. Reciproca nu este valabilă, de aceea prezența 99Mo constituie o impuritate radionuclidică a 99nTe.

B. Puritatea radiochimică

Este procentul din radionuclidul specificat în forma chimică specificată. Ea caracterizează cât de specific a fost încorporat radionuclidul în molecula dorită și nu în alte molecule neizomere sau izomere (izomerie de constituție, de poziție, geometrică, optică sau izotopică). Astfel într-un preparat conținând L-alonină-1-C14, sunt radiochimice D-alonina-1-14C, L- și D-alanina-2-14C și oricare altă moleculă marcată cu 14C. Astfel spus, o moleculă marcată specific are ca impurități radiochimice toate moleculele izotop-izomere, precum și orice alte molecule marcate cu același nuclid.

În compușii marcați cu izotopi stabili nu există o „puritate stabilonuclidică” analoagă celei radionuclidice, ci se dă îmbogățirea și nuclidul stabil specificat. Se definește însă specificitatea încorporării marcajului printr-o puritate analoagă celei radiochimice, caracterizând în preparatul dat cât din marcajul stabilo-nuclidic specificat se găsește în forma chimică specificată.

Puritățile chimice, farmaceutice și izotopice (radiochimice și radionuclidice) constituie parametri independenți, care trebuie controlați și determinați separat.

La substanțele marcate radioactivitatea acestor purități scad în timp, de aceea analizele trebuie repetate la perioade determinate.

1.2 Încorporarea izotopilor în compuși marcați

1.2.1 Marcare intrinsecă prin sinteză chimică

Aceasta este metoda cea mai des folosită pentru încorporarea majorității izotopilor în compuși marcați. Ea constă în folosirea întregului arsenal de metode chimice de sinteză, implicând reacții de adiție și substituție, în majoritatea cazurilor în mai multe faze succesive, până la obținerea produsului final, care purifică și condiționează la forma dorită. La radiomarcarea unor polipeptide cu catenă ramificată, s-a utilizat L-lisina care conținea trei resturi DL – alanină iar la sfârșitul ramificației un aminoacid. În acest caz marcarea cu 125I a fost realizată prin reacția grupărilor terminale amono cu agent preiodat Bolton – Hunter (N-succinimidă 3 – 14 hidroxi – 5 [125I] iodo fenil) propionat. [6] [7]

În planificarea sintezei chimice a unei substanțe marcate, izotopul trebuie introdus într-o etapă cât mai târzie, pentru ca numărul etapelor sintezei după introducerea izotopului în moleculă să fie cât mai mic.

În cazul radioizotopilor folosiți curent în medicina nucleară, deși acești radioizotopi pot fi obținuți teoretic puri cu activități specifice (sp) apropiate de cele maxime posibile, aproape întotdeauna se adaugă purtători pentru a coborî activitatea specifică. În acest fel se poate lucra cu cantități mai mari de substanță, mărind substanțial randamentul, se evită fenomenele de absorbție pe pereții vaselor sau de formare a radiocoloizilor care se petrec atunci când se lucrează cu ultramicrocantități și se reduce autoradioliza compusului marcat final, care este cu atât mai rapidă cu cât activitatea specifică este mai mare.

Strategia adaosului de purtători diferă de la caz la caz, eficiența adaosului de purtător este mai ridicată în studiile finale sau în separările și purificările complicate: prin adaos de substanță nemarcată la un amestec de reacție, puritatea chimică a compusului din amestec se mărește și separarea devine mai ușoară.

Alteori este mai avantajos să se adauge tot purtătorul într-o singură etapă, de exemplu în obținerea acidului acetic anhidru: prin carbonatarea iodurii de metil – magneziu (fie CO2 fie CH3MgI, fie ambele, pot fi marcate cu 14C sau 13C) se obține acetat de sodiu anhidru; prelucrarea aceasta fără diluție izotopică la acid acetic marcat duce la pierderi mari. Dacă se admite o diluție de 10 ori, cel ami simplu este adaosul a 9 moli de acid acetic anhidru nemarcat peste acetat de sodiu marcat, urmat de echilibrarea … și distilarea acidului acetic care duce la un acid acetic conținând 90% din C izotopic al acetatului de sodiu.

1.2.2. Marcare intrinsecă prin schimb izotopic

Reacția prin care o moleculă marcată (R – X) și una nemarcată (R’ – X) conținând izotopi diferiți ai aceluiași element X ăși echilibrează între ele izotopii, constituie o marcare intrinsecă prin schimb izotopic:

R – X + R’ – X R – X + R’ – X

Limitările metodei provin din faptul că numai anumite elemente (H, X: Cl, Br, T și calcogenii O, S, Se) dau această reacție și chiar atunci doar la anumite clase de compuși în anumite condiții de reacție.

Prin mecanismul reacției, schimbul izotopic este de fapt o substituție. Hidrogenul legat de elementele electreonegative ca X, O, S, N, dă extrem de ușor schimb izotopic cu hidrogenul din apă; astfel de marcaj se realizează instantaneu, dar el este labil și de aceea este rar utilizat, fiind de obicei un dezavantaj.

Hidrogenul legat de carbon nu schimbă decât în condiții speciale: în prezență de catalizatori eterogeni sau omogeni și în poziții activate specific, de exemplu poziții învecinate cu grupe carbonil. Prezența a două grupe carbonil ca în esterul malonic, activează cei doi hidrogeni astfel încât ei schimbă aproape la fel de ușor hidrogenii labili; acest lucru este util în sinteze de compuși deuterați sau tritiați întrucât prin hidroliză și decarboxilare se obține acid acetic marcat la metil, care nu mai are hidrogen labil, deoarece nu mai are decât o grupă carbonil învecinată.

O variantă a schimbului izotopic este titrierea compușilor organici prin metoda Wilzbach.

RH + T2 RT +HT

Expunând compușii RH care conțin hidrogen, într-o atmosferă de tritiu gazos, timp de câteva zile, se produce un schimb izotopic sub acțiunea radiației a tritiului. Practic, toți atomii de hidrogen pot da această reacție, indiferent de vecinătățile chimice și de starea fizică a substanței (solidă, lichidă sau pulbere); astfel se poate tritia practic orice substanță organică, oricât de complicată. Dezavantajul este randamentul redus, datorită descompunerii avansate a substanței de marcat, ceea ce necesită purificări laborioase.

Schimbul izotopic este, indispensabil în sinteza numeroaselor produse radiofarmaceutice conținând iod radioactiv (123I, 125I, 131I), prin reacție între compusul roz – bengal, acid orto – iodo – hipuric, tiroxină, etc.

2.2.3. Marcarea intrinsecă prin sinteze radiochimice

încorporarea marcajului sub acțiunea radiațiilor precum și prin reacția atomilor radioactivi posedând o mare energie cinetică (fie datorită riscului nuclear, fie accelerați artificial), constituie sinteze radiochimice.

În prezent importanța lor practică este redusă, cu excepția … prin metoda Wilzbach (aceasta prin natura ei, este de fapt o sinteză radiochimică, căci moleculele de marcat sunt excitate prin radiații ale tritiului. Pentru scurtarea timpului de expunere și reducerea descompunerii substratului, se propune ca tritierea Wilzbach să se efectueze folosind descărcări electrice, microunde, radiații sau UV.

În anul 1943 Szilard și Chalmers activând cu iodul din iodura de metil au observat că radioiodul format prin reacția 127I (n, ) 128I se poate extrage parțial cu H2O ca iod anorganic (I2 și I-) și au explicat aceasta prin ruperea legăturii chimice CH3 – I în momentul emisiei fotonului care produce un … nuclear, imprimând atomului de iod radioactiv sufucientă energie cinetică pentru această rupere. Acest iod anorganic este fără purtător, deși provine dintr-o reacție (n, ). În fază apoasă, sau în soluție diluată, majoritatea radioiodului apare ca I anorganic dar în iodura de metil lichidă, radioionul apare peste 50% ca ioduri organice (CH3I, CH2I2) datorită substituției prin atomii de iod care au suferit reculul, ceea ce duce la o retenție aparentă a radioactivității în substanța inițială.

Asemenea înglobări de radioizotopi sub acțiunea reculului nuclear au fost folosite pentru a marca și compuși organici cu C sau 3H de înaltă activitate specifică produși prin reacțiile 14N (n, p) 14C, respectiv, 6Li (n, ) 3T.

În practică se iradiază în reactor compuși conținând N sau Li, sau amestecuri de asemenea compuși cu substanțele care urmează a fi marcate, iar pentru izolarea produșilor doriți se adaugă purtător.

Dezavantajele metodei constau în marcarea neospecifică în descompunerea pronunțată a substratului, ceea ce necesită purificări avansate.

Alte sinteze radiochimice decât cele prin recul nuclear sunt:

marcare prin ioni accelerați, care nu diferă de marcarea prin recul decât prin faptul că energia „atomului fierbinte” folosit pentru marcare nu este furnizată de recul ci de un accelerator de particule.

Marcare prin excitare (denumită și marcarea indusă e transformarea nucleară): noul atom format în urma unei transformări nucleare prin captură electronică sau prin dezintegrare +, rămâne deficitar în electroni și, ca ion pozitiv sau ca atom liber, este foarte reactiv putând da ușor legături covalente.

Marcarea prin descărcări electrice, marcare indusă de radiații și marcare de tip Wilzbach: asemenea marcări se folosesc în general la tritiere.

2. Schimbul izotopic

2.1 Definiție. Exemple de reacții de schimb izotopic

Posibilitatea existenței unui schimb de atomi ai aceluiași element între forme chimice diferite ce conțin acest element, a fost sugerată pentru prima dată de D. I. Mendeleev încă din 1886. acesta aprecia că dacă se consideră două specii chimice AB și respectiv AB1, care sunt în contact direct între ele, atunci atomii A din prima specie pot trece în a doua și nvers. La compoziție chimică invariabilă a sistemului, există totuși un schimb al atomilor de aceeași speță între particule diferite ce conțin acești atomi. În perioada respectivă nu puteau fi obținute dovezi experimentale în sprijinul acestei afirmații. Odată cu descoperirea reactivității și a existenței izotopilor (atât radioactivi cât și stabili) a apărut însă posibilitatea „marcării” atomilor ce intră în componența particulelor participante la schimb și, prin aceasta, punerea în evidență a procesului de schimb care a căpătat denumirea de schimb izotopic.

Primele dovezi experimentale ale existenței schimbului izotopic au fost obținute de G. Hevesy și L. Zechmeister în 1920. folosind pentru marcare izotopul natural al plumbului, RaD () ei au dovedit existența schimbului izotopic între clorură de Pb și azotat de Pb precum și între acetatul de Pb divalent și acetatul de Pb tetravalent.

Trebuie făcută distincția între schimbul izotopic în sisteme omogene și cel în sisteme eterogene. Dacă primul are loc într-o singură fază, cel de-al doilea se produce între faze diferite și implică un transfer de masă prin interfața dintre faze.

Se numește schimb izotopic orice proces care nu duce la modificări obișnuite chimice sau fizico-chimice în sistemul respectiv dar are ca rezultat o redistribuire a izotopilor unuia sau mai multor elemente între diferite specii chimice din sistem.

Sensul acestei definiții poate fi înțeles mai clar pe baza câtorva exemple de procese chimice și fizice care constituie procese de schimb izotopic.

1. Schimbul izotopic al plumbului între PbCl2 și Pb(NO3)2 a fost prima reacție de acest gen studiată experimental. În soluția de azotat de plumb marcată cu se introduc cristale reactive de PbCl2 și apoi sistemul se încălzește până la dizolvarea completă a cristalelor. Prin răcire se precipită din nou clorura de plumb care se dovedește a fi radioactivă, având loc reacția de schimb:

PbCl2 + Pb(NO3)2 PbCl2 + Pb(NO3)2

2. Schimbul izotopic al fierului între clorura feroasă și clorura ferică poate fi urmărit folosind ca trasor radioactiv radionuclidul Într-o soluție acidă a FeCl2 se introduce o altă soluție neactivă de FeCl3 iar după câteva minute se extrage clorura ferică cu dizopropileter și se constată a devenit activă, deci a avut loc schimbul:

FeCl3 + Fe*Cl2 FeCl*3 + FeCl2

3. Schimbul izotopic al carbonului în compuși organometalici poate fi exemplificat:

C*6H5HgBr + Hg(C6H5)2 C6H5HgBr + (C6*H5)2

Schimbul izotopic are loc ca urmare a unui transfer de radicali fenil de la o specie chimică la cealaltă.

4. Schimbul izotopic al bromului în 2,4 dibromutoluen este un schimb intramolecular al atomilor de brom din poziții diferite în raport cu gruparea metil:

5. Schimbul izotopic al bromului între cristale de bromură de argint și brom lichid, este un exemplu de schimb eterogen solid-lichid.

AgBr(s)+1/2Br2*(l)AgBr(s)*+1/2Br2(l)

6. Schimbul izotopic eterogen de tipul solid-gaz îl constituie schimbul dintre cristale de iodură de argint și iod gazos:

AgI(s)+1/2I2*(s)AgI(s)*+1/2I2(g)

7. Un schimb izotropic în fază gazoasă are loc, între acidul clorhidric și clorura de metil și poate fi urmărit folosind izotopul radioactiv ca trasor:

HCl*(g)+CH3Cl(g)HCl(g)+CH3Cl*(s)

2.2. Constantă de echilibru. Coeficient de schimb. Grad de schimb

Reacțiile de schimb izotopic sunt reacții reversibile care duc în final la o stare de echilibru ce poate fi caracterizată din punct de vedere cantitativ, printr-o constantă de echilibru K și un coeficient de schimb, .

Pentru o reacție de schimb izotopic de forma generală:

AX*+BXAX+BX* (3.1.)

expresia constantei de echilibru este:

(3.2.)

în care [AX] și [BX] reprezintă concentrațiile, de obicei molare, ale speciilor chimice respective.

Se numește coeficient de schimb, , mărimea definită prin relația:

(3.3.)

Pentru reacțiile de schimb de tipul (3.1.) în care toți coeficienții stoechiometrici sunt egali cu unitatea, se observă ușor identitatea dintre constanta de echilibru și coeficientul de schimb: a=K.

În cazul reacțiilor mai complexe de forma generală:

mAX*n+nBXmmAXn+nBX*m (3.4.)

unde m și n sunt identici și diferă de unitate, coeficientul de schimb diferă de constanta de exhilibru:

(3.5.)

iar

(3.6.)

Dacă notăm cu a și b concentrațiile globale ale speciilor chimice AX și respectiv BX

[AX]+[AX*]=a (3.8.)

[BX]+[BX*]=b

și introducem activitățile specifice molare, SA și respectiv SB, acestea se definesc prin relațiile:

și (3.8.)

De aici, rezultă:

[AX*]=așa și [BX*]=bSB (3.9.)

Din (3.7) și (3.9.) se obține:

[AX]=a-[AX*]=a-aSA=a(1-SA) (3.10.)

[BX]=b-[BX*]=b-bSB=b(1-SB)

Introducând concentrațiile speciilor chimice din (3.9.) și (3.10) în expresia gradului de schimb (3.3.) rezultă:

, adică

care reprezintă coeficientul de schimb exprimat prin activitățile specifice ale celor două specii chimice participante la schimb.

Dacă în momentul inițial atomii marcați cu X* se găsesc numai în forma chimică AX, atunci pentru reacții simple de tipul (3.1.) conservarea activității totale din sistem se scrie:

aS0=așa+bSB=aSA+bSB (3.11.)

în care indicele zero simbolizează momentul inițial al reacției, iar indicele infinit reprezintă starea de echilibru.

Exprimând pe SB din prima egalitate (3.11.) avem:

și înlocuindu-l în expresia lui se obține:

Pentru simplificarea acestei expresii este mai convenabil să se exprime inversul coeficientului de schimb, 1/:

(3.12.)

care reprezintă coeficientul de schimb exprimat numai prin activitatea specifică a speciei chimice inițial active. În cazul cel mai frecvent întâlnit în practică, cel al utilizării unor izotopi radioactivi în ultramicroconcentrații, SA0<<1 și SA<<1 și deci SA din numitorul expresiei (3.12) poate fi neglijat.

Rezultă în acest caz o expresie mult simplificată a coeficientului de schimb funcție de activitatea specifică a speciei chimice inițial active:

(3.13.)

Pentru reacții de schimb izotopic mai complexe de forma (3.4.), conservarea activității totale din sistem se scrie:

na0SA0=naSA+mbSB=naSA+mbSB

În acest caz în expresiile (3.12.) și (3.13) concentrația totală a speciei AXn trebuie multiplicată cu un n iar cea a speciei BXm cu m. Se obține astfel, pentru cazul general:

și:

Măsura în care reacția de schimb izotopic se apropie de starea de echilibru este reflectată de parametrul numit grad de schimb sau fracție de schimb și notat cu F.

În cazul în care momentul inițial numai specia chimică AX este activă (SB0=0) atunci gradul de schimb se exprimă cel mai comod prin reacția:

adică gradul de schimb la un moment dat de timp, este raportul dintre activitatea specifică în acel moment de timp a speciei chimice inițial inactive și activitatea acestei specii la stabilirea echilibrului.

Evoluția în timp a gradului de schimb reflectă viteza reacției de schimb izotopic.

2.3. Cinetica reacțiilor de schimb izotopic în sisteme omogene

2.3.1. Mecanismul reacțiilor de schimb izotopic omogen

Diversitatea mare a reacțiilor de schimb izotopic determină mai multe tipuri de mecanisme ale acestora. Adesea, acestea sunt destul de complicate implicând ca intermediari diverse specii chimice ca molecule, ioni, radicali simpli sau complecși, etc.

2.3.1.1. Mecanism disociativ

Una din căile pe care se poate realiza o reacție de schimb izotopic este disocierea reversibilă a uneia sau ambelor specii chimice participante la schimb. În funcție de condițiile în care are loc, disocierea poate avea caracter homolitic când rezultă ca intermediari specii neutre din punct de vedere electric (atomi sau radicali) sau poate avea caracter heterolitic rezultând intermediari ionici.

Procesele cu caracter homolitic au pondere însemnată în cazul reacțiilor în fază gazoasă în timp ce procesele cu caracter heterolitic joacă un rol important în reacțiile de schimb izotopic în soluții.

Schema generală a unui mecanism disociativ care implică disocierea ambelor specii participante la schimb este următoarea:

AX*A+X*

BX

AX+BX*

Dacă mecanismul implică disocierea doar a uneia din speciile participante el se numește semidisociativ.

Schimbul izotopic prin mecanism disociativ este foarte probabil în numeroase cazuri dar el a fost dovedit experimental numai în unele dintre aceste, cum ar fi de exemplu schimbul dintre moleculele de hidrogen și cele de deuterice în fază gazoasă.

La temperaturi nu prea ridicate la care gradul de disociere a moleculelor de hidrogen este relativ mic, schimbul are loc practic numai prin mecanism semidisociativ adică prin interacțiune dintre atomii de hidrogen cu molecule nedisociate, după schema:

H2+D22HD

D22D H22H

D+H2HD+H sau H+D2HD+D

H+D2HD+D D+H2HD+D

……………… ………………

La temperaturi ridicate însă, când gradul de disociere atinge valori suficient de ridicate și concentrația atomilor devine comparabilă cu cea a moleculelor din sistem, rolul preponderent îl are mecanismul disociativ, după schema:

H2H+H

BX

HD+HD

Un alt exemplu de mecanism semiodisociativ îl constituie schimbul dintre vaporii de iod și ioduri de alchil în fază gazoasă, conform schemei:

I*2+RIRI*+II*

I*22I*

I*+RIII*+R

R+I2*RI*+I*

În cazul reacțiilor de schimb izotopic în soluții, ca urmare a efectelor de solvatare, îndeosebi în solvenți polari, cu constantă dielectrică mare, se pot scinda ușor chiar și cele mai puternice legături chimice. Fragmentele rezultate în acest caz sunt de regulă fragmente ionice având loc scindări heterolitice.

Un exemplu de schimb izotopic ce decurge prin mecanism disociativ ionic este schimbul de cationi sau anioni în soluții de săruri. Din această categorie fac parte și reacțiile de schimb între anioni anorganici și compuși ergonometalici de tip ionic, cum ar fi reacția:

CH3Mg+Br-+KBr*CH3Mg+Br*-+KBr

Tot mecanism disociativ are și schimbul de halogen între o halogenură anorganică și combinații complexe ce conțin halogen:

[PtI4]2-+I*-[PtI3I*]-+I-

Dacă procesul de disociere este o reacție monomoleculară și este mai lent decât schimbul ulterior, atunci reacția de schimb apare de ordinul întâi, viteza ei depinzând doar de concentrația ueia dintre speciile participante la schimb. De exemplu, în cazul schimbului iodului între iodura de terț butil și NaI* în dioxid de sulf lichid, s-a constatat că viteza reacției de schimb nu depinde de concentrația iodurii de sodiu. Mecanismul este tip SN1:

(CH3)3Cl + NaI* (CH3)3Cl*+NaI

Etapa lentă: (CH3)3Cl (CH3)3++I-

Etapa rapidă: (CH3)3++I*- (CH3)3+

Pentru reacțiile de schimb între halogenuri organice și anorganice este caracteristic mecanismul semidisociativ, de tip SN2. În acest caz la schimb participă ionii halogenură proveniți din disocierea halogenurii organice, care atacă nucleofil moleculele nedisociate de hslogenură organică, reacția evoluând prin intermediul unei stări de tranziție:

R-X+NaX*R-X*+NaX

Etapa disociativă: NaX*Na++X*-

Etapa lentă: X*-+R-XX*-R+X-

stare de tranziție

2.3.1.2. Mecanismul asociativ

Acest tip de mecanism se întâlnește adesea în cazul reacțiilor de schimb izotopic în soluții de electroliți și neeloctriliți și constă într-o succesiune de procese de asociere cu formarea unor complecși, dimeri, urmate apoi de descompunerea acestora.

În formă foarte generală acest tip de mecanism se poate reprezenta astfel:

AX*+BX[ABXX*]AX+BX*

Un exemplu tipic de astfel de mecanism îl constituie schimbul bromului gazos cu o soluție de bromură de potasiu:

Br2(g)+KBr*(sol) Br2*(g)+KBr(sol)

La trecerea de vapori de brom peste o soluție apoasă de KBr marcată cu Br se constată un schimb practic instantaneu al bromului. Mecanismul acestuia este următorul:

ionii Br*- din soluție formează cu moleculele de brom un complex de viață scurtă de forma:

în care toate legăturile dintre atomii de brom sunt echivalente. Descompunerea acestui complex se poate realiza prin scindarea cu aceeași probabilitate a oricăror două legături:

Acest mecanism implică două etape distincte:

2.3.1.4. Mecanismul schimbului izotopic prin transfer de electroni

Între atomii unui element dat care se găsesc în stări de oxidare diferite, sunt posibile transferuri de electroni care au ca rezultat o redistribuire a izotopilor între cele două specii chimice, deci se produce un schimb izotopic care nu implică deplasarea atomilor izotopici dintr-o specie chimică în alta, deci nu necesită scindarea legăturilor chimice. Din această cauză, un astfel de schimb izotopic este de regulă rapid, ceea ce creează dificultăți în studiul experimental al acestor reacții.

Exemple de reacții de schimb izotopic cu un astfel de mecanism sunt schimburile între FeCl2 și FeCl3, TiCl și TiCl3, Pb(CH3COO)2 și Pb(CH3COO)4, [Fe(CN)6]3- și [Fe(CN)6]4-, MnO4- și MnO42-.

Reacția MnO42-+ Mn*O4- Mn*O42-+ MnO4-

are loc conform schemei:

MnO42- Mn*O4-

MnO4- Mn*O42-

Faptul că în aceste reacții nu se scindează legături chimice explică de ce viteza lor este mare, timpul de semischimb este de ordinul secundelor, dar se cunosc și cazuri când astfel de reacții sunt lente:

Sn*Cl2+SnCl4 Sn*Cl4+SnCl2

2.3.2. Legea logaritmică a gradului de schimb. Ecuația lui McKay

În cazul unui schimb izotopic simplu într-un sistem omogen, viteza cu care izotopul respectiv (radioactiv sau stabil) trece în compusul în care nu există momentul inițial, se supune unei legi exponențiale simple. Această lege este respectată independent de mecanismul reacției de schimb și nu depinde nici de numărul de atomi din moleculă care sunt capabili să participe la schimb. Această lege a fost stabilită prima dată de H. A. McKay în 1938 pentru cazul cel mai simplu când molecula conține un singur atom capabil să participe la reacția de schimb.

Considerăm reacția de forma generală:

AX* +BXAX+BX*

K1 și k2 sunt constantele de viteză ale reacțiilor directă și respectiv inversă de schimb izotopic al atomului X între formele AX și BX.

Exprimând viteza reacției de schimb prin variația în timp a concentrației speciei chimice [BX*], avem:

În aproximația identității proprietăților termodinamice ale izotopilor cele două constante de viteză k1 și k2 sunt egale:

k1=k2=k

(3.14)

Introducem activitățile specifice molare:

[AX]+[AX*] =a

[BX]+[BX*]=b

rezultă: și respectiv

sau și

Înmulțim și împărțim ecuația (3.14) cu produsul:

obținem:

(3.15)

Produsul kab=R este o mărime constantă pentru un sistem dat și se numește viteza globală de schimb a atomilor X între speciile chimice [AX] și [BX]. (ale căror concentrații globale rămân constante în cursul reacției de schimb.

Ținând cont de faptul că [BX*]=bSB se obține:

(3.16)

Dar: sau

sau

Înlocuind aceste rapoarte de concentrații în ecuația (3.16) aceasta devine:

(3.17)

b= constantă ce poate fi scoasă în afara derivatei.

(3.18)

Această ecuație exprimă dependența vitezei reacției de schimb de activitățile specifice ale ambelor specii chimice participante.

Dacă se are în vedere conservarea activității totale din sistem și că inițial numai specia AX este activă, putem exprima această viteză numai prin activitatea speciei BX și mărimi constante:

(3.19)

(3.20)

Dacă la stabilirea echilibrului se realizează o repartiție uniformă a izotopilor în cele două specii chimice, rezultă:

iar relația (3.20) devine:

(3.21)

Din egalitatea avem:

Exprimând pe SA din (3.21) și apoi introducându-l în (3.18) avem:

sau:

în care viteza reacției de schimb este exprimată numai printr-o singură mărime variabilă în timp, activitatea specifică SB a speciei chimice BX care inițial nu este activă.

Pentru a integra această ecuație diferențială, procedăm la separarea variabilelor:

sau

care prin integrare conduce la:

(3.22)

Constanta de integrare se determină în condițiile limită: la t=0, SB=

Adică constanta= care introdusă în relația (3.22) rezultă:

sau

Pentru a exprima într-o formă mai simplă această dependență de timp a vitezei de reacție, în locul activităților specifice se introduce gradul de schimb F, definit prin:

În acest scop la numărătorul expresiei de sub logaritmul din ecuația adunăm și scădem mărimea constantă :

Aceasta este ecuația lui McKay în formă logaritmică. Ea poate fi scrisă și în formă exponențială:

sau F=1-

Prin urmare, activitatea specifică a speciei inițial active AX* scade exponențial, în timp ce activitatea specifică a speciei inițial neactive BX* crește după o lege invers exponențială, după cum este reprezentat în figura de mai jos:

Figura Variația în timp a activităților specifice ale speciilor chimice participante la schimbul izotopic.

2.4. Factori care influențează reacțiile de schimb izotopic

În studiul reacțiilor de schimb izotopic trebuie avut în vedere faptul că acestea sunt foarte sensibile la acțiunea unor factori cum ar fi acțiunea catalitică a materialului din care este făcut vasul de reacție, prezența luminii sau altor radiații electromagnetice, precum și a unor impurități chiar și în cantități extrem de mici.

De exemplu, viteza reacției de schimb prin transfer de electroni între Fe3+ și Fe2+ sub formă de complecși cu EDTA, crește în prezența sticlei parafinei, polistirenului și scade în prezența unor cationi polivalenți.

Una din dificultățile cele mai des întâlnite în studiul reacțiilor de schimb izotopic este așa numitul „schimb de nul” care se poate datora fie separării incomplete a speciilor chimice participante la schimb, fie schimbului indus. Acesta din urmă apare ca urmare a faptului că procesul de separare, mai ales când aceasta se realizează prin precipitarea uneia din speciile participante la schimb, se pot forma intermediari care pot schimba foarte rapid anumiți atomi.

Se consideră ecuația de schimb dintre speciile AX* și BX

AX*+BX AX+BX*

Presupunem că separarea acestor forme chimice se face prin precipitarea speciei AX. În cursul separării, un anumit număr de atomi X, care anterior separării erau în specia chimică BX, pot trece în AX ca urmare a schimbului ce are loc în timpul separării, ca urmare a separării incomplete sau ca urmare a ambelor procese simultan. În acest caz, relația dintre gradul real de schimb, F, la momentul de timp t și gradul aparent de schimb F, la același moment de timp, este dată de expresia:

în care este gradul de schimb observat după separarea în momentul de timp t=0 (schimbul aparent de nul).

În același timp, gradul real de schimb este dat și de relația:

în care s-a notat:

S – activitatea specifică la momentul de timp t a formei inițial active;

S0 – activitatea specifică la formei inițial inactive la momentul t=0;

S – activitatea specifică de echilibru.

2.4 Schimbul izotopic în sisteme eterogene

Schimbul izotopic poate avea loc și în sisteme eterogene solid – lichid (soluție), solid-gaz sau lichid (soluție-gaz.

În acest caz, inițial atomii marcați, sunt distribuiți uniform în una dintre faze, de obicei în cea lichidă sau gazoasă, iar uniformizarea concentrației acestora și deci, realizarea echilibrului, se vor face fie prin recristalizări repetate ale fazei solide, fie prin schimbul de la interfața dintre cele două faze urmat de difuzia atomilor schimbați în interiorul fazei solide, fie prin schimbul de la interfața dintre cele două faze urmat de difuzia atomilor schimbați în interiorul fazei solide sau lichide. Viteza reacției de schimb izotopic va depinde de vitezele de difuziune în cele două faze și de viteza de schimb prin interfață, și va fi determinată de procesul care decurge mai lent.

Considerăm două cazuri limită care pot fi întâlnite în practică.

Procesul de schimb este guvernat de reacția de schimb prin interfață, vitezele de difuzie în ambele faze fiind mult mai mare decât viteza de schimb prin interfață.

Dacă în locul concentrațiilor substanțelor participante la reacția de schimb se introduc numerele de atomi ai elementului participant la schimb, de pe suprafața fazei solide N(s) și respectiv din soluție, N(sol) iar viteza reacției de schimb se exprimă prin numărul de atomi N, schimbați în unitatea de timp, atunci ecuația logaritmică a gradului de schimb va fi de forma:

iar timpul de semischimb va avea expresia:

Procesul de schimb este guvernat de difuziune, viteza de difuziune în una dintre faze fiind mult mai mică decât viteza procesului de schimb prin interfață. În acest caz pentru deducerea dependenței gradului de schimb de timp este necesar să se ia în considerare difuzia în fiecare din cele două faze implicate în schimb. Pentru simplitate, se consideră cazul când una dintre faze, egalizarea concentrației se realizează rapid iar viteza procesului de schimb izotopic este determinată numai de viteza de difuzie în cealaltă fază, neexistând gradient de concentrație în prima fază.

Un astfel de caz îl constituie schimbul între un solid și un gaz sau un solid și o soluție supusă permanent agitației mecanice intense.

Considerăm faza solidă de forma unei plăci cu fețe paralele, având grosimea 2 imersată în soluția (sau gazul) care conține atomii radioactivi.

Forma curbei de distribuție a atomilor radioactivi într-o placă subțire în cazul reacției de schimb izotopic eterogen controlat prin difuzia în una dintre faze.

Raportul dintre aria fețelor laterale ale plăcii și grosimea acesteia este suficient de mare pentru a putea neglija difuzia dintre fețele înguste ale plăcii și tot schimbul se produce numai prin fețele laterale.

3. Obținerea compușilor marcați cu 123I, 125I și 131I

Radiofarmaceuticele ce conțin radionuclizi ai I ocupă un loc important în medicina nucleară, atât în studiile de metabolism și dinamice cât și în diagnostic. De asemenea, crește utilizarea lor pentru dozarea în vitro a unor compuși biologici și în determinările imunologice. În acest scop metodele de marcarea radiofarmaceuticelor cu radionuclizi ai I vor purta amprentele unor caracteristici ce le deosebesc prin condițiile impuse de conservare a integrității biologice a compusului marcat. Astfel comportamentul biologic al unui produs radiofarmaceutic poate fi determinat de felul marcării lui. Intrinsecă sau extrinsecă, marcarea intrinsecă fiind ideală.

Radionuclidul poate fi astfel ales încât el ă facă parte integrantă din procesul metabolic, fiind un produs ce intră în componență (structurală sau funcțională) a organului respectiv, și care să poată fi marcat radioactiv. Astfel de produse sunt: hormaonii tiroidieni (tiroxina și triiodotiromina) care inițial conțin atomi de I în structura lor chimică și permit o marcare cu I radioactiv. În acest caz marcarea radioactivă a compusului respectiv nu aterează sau nu diminuează „integralitatea biologică” a acestuia și ca atare în organism el se comportă identic ca și compusul nemarcat. Deoarece numărul compușilor biologici ce pot fi marcați intrinsec este destul de redus, majoritatea produșilor radiofarmaceutici sunt marcați extrinsec prin introducerea unui „atom străin” de I în structura acestor compuși. Cu toate acestea s-a observat că atunci când molecula unui produs radiofarmaceutic, mai ales a celor cu greutate moleculară mare nu conțin mai mult de un atom de I (radioactiv sau stabil) comportamentul lor biologic este satisfăcător având o perioadă biologică mare și nu sunt toxici; printre compușii radiofarmaceutici marcați intrinsec cu radionuclizi ai I amintim următorii: proteine din plasma sanguină (serunoalbumina umană, macro și mocroagregate, globuline, fibrinogen), hormonii proteici (insulină, hormonul de creștere, hormonul adrenocartricotropic, hormonul parotiroid, hormonul de stimulare a tiroidei etc), anticorpi, antigene baze pirimidinice și purinice, hormoni estrogeni și androgeni, peptide și polipeptide, aminoacizi etc.

Reacțiile prin care atomii de I pot fi introduși și în molecula unui compus farmaceutic pentru a deveni radiofarmaceutic sunt:

schimb izotopic;

iodurare oxidativă (substituție):

C-H +I+ C-I +H+

adiție

Marcarea cu I radioactiv prin schimb izotopic implică prezența unuia sau mai multor atomi de I neradioactiv în molecula comusului respectiv, fiind deci o marcare intrinsecă (izotopică). Atomii de I neradioactiv pot fi introduși în moleculă prin sinteză sau prin late metode de încorporare sau sunt endogeni. Marcarea prin iodurare oxidativă și adiție nu implică prezența atomilor de I neradioactiv în molecula compusului farmaceutic, fiind deci o marcare extrinsecă.

3.1 Marcarea cu I radioactiv prin schimb izotopic.

O serie de compuși organici din clasele și grupele celor amintiți mai sus care în structura lor conțin atomi de I radionuclizi ai I prin metoda schimbului izotopic. Radionuclidul respectiv, în majoritatea cazurilor se află în formă chimică de NaI (fără purtător, agenți reducători și sau stabilizatori, cu activitate specifică înaltă și o concentrație radioactivă de 10 – 100 n/nl.

Deoarece schimbul izotopic în acest caz, are loc între un atom de I neradioactiv aflat în compus respectiv într-o poziție specifică oarecare, legat direct de nucleul benzenic, ciclul penta, nucleul pirimidinic sau ciclul pirolidonă etc și un atom radioactiv al I (I 123I, 125I, 131I)ultimul trebuie să se afle în aceeași formă de valență(stare oxidată) ca și primul I radioactiv din NaI fiind în forma chimică I nu poate intra în reacție de schimb izotopic ci numai în formele I0 și I+ fapt pentru care acesta trebuie oxidat. În acest scop în calitate de oxidant de obicei se utilizează apă oxigenată, iodatul de potasiu sau cloramina-T. De asemenea, I radioactiv din NaI poate fi trecut în forma oxidată și pe cale electrochimică. Această metodă se utilizează în ultimul timp tot mai des pentru marcarea proteinelor și a unor compuși biologici ușor degradabili. Metodele de iodurare cu cloramina-T și cea electrochimică fiind metode directe de iodurare, acestea se folosesc cu preponderență la iodurarea prin reacția de substituție și mai puțin cea de schimb izotopic. În unele cazuri ca agent de iodurare radioactivă este folosită și monoclorura de iod.

Radioiodurarea este o reacție rapidă regioselectivă și cu randament mare (50 – 80% după 30 minute la temperatura de 140), care este posibilă în funcție de gradul activării sau dezactivării electronice a substratului.

Radioiodurarea cu 125I sau 131I este o tehnică folosită la marcarea peptidelor biologic active sau proteinelor datorită radioactivității specifice mari a emulsiilor de radiații . Analizând dependența iodurării de pH a resturilor de tirozină și histidină s-a arătat că metodele de marcare pot fi aplicate pe multe peptide cu catenă scurtă. S-a arătat că activitățile biologice ale peptidelor iodurate sau neiodurate pot diferi și pot fi folosite la marcarea steochiometrică. [9], [10], [11]

Metoda cu iodură și iodat

Randamentul de utilizare a I radioactiv în acest caz este de max 50% deoarece în iodul molecular 131I numai un atom este propice marcării.

131I-+IO-3+6[H+] 3 131I2+3H2O

3131I2+3H2O 3HO131I+3H++3131I-

KI+127I+131I2 K127I+131I2

131I 131I+ – 131I-

131I+ – 131I- +R-127I R-131I++127I-131I-

Reacția de schimb izotopic decurge cu randament max la cald în condiții de pH între 5 – 6 și 90 – 100C timp de 2 – 3 ore. S-a observat că iradierea probei cu un flux de lumină de la o lampă de 200W sau UV produce o creștere considerabilă, a randamentului de marcare atingând 100%.

b) Metoda cu ICl. Aplicând această metodă la marcarea cu I radioactiv a compușilor organici, utilizarea acestora poate atinge randament max de 100% dat fiind că atomii de I din molecula de ICl se află oxidați în formă de I+. Monoclorura de I neradioactiv necesară pentru marcări se prepară conform reacției.

HCl+2I- +IO3 3I-Cl2+3H2O

Pentru marcare monoclorura de I neradioactiv este necesară a fi trecută în prealabil în forma radioactivă prin echilibrare cu NaI radioactivă în mediu acid ori slab acid conform reacției de schimb izotopic:

ICl + Na131I 131ICl+NaCl+HI

În mediul alcalin monoclorura de I radioactiv este hidrolizată cu formare de acid hipoiodos:

131ICl+NaOH Na131I+NaCl

Ambele reacții decurg foarte rapid, furnizând ca agenți de iodurare în mediu slab acid, 131ICl iar în mediu alcalin Na131I.

Acidul hipoiodos în mediu alcalin disproporționează conform reacției:

3Na131I+3OH- 2131I-+IO-3+3H2O

ceea ce produce o scădere a eficienței de iodurare. Pentru a împiedica această disproporționare, este necesar ca în sistem să fie un mare exces de ICl și un pH slab acid, în mediu de HCl favorizând astfel reacția:

3NO131I3H++3Cl- 3131ICl +3H2O

c) Metoda cu cloramina-T

Spre deosebire de iodurarea prin metodele descrise mai sus care sunt mai dure putând altera comportamentul biologic al compusului marcat metoda de iodurare cu cloramina-T (sarea de Na N-monoclor-p-toluen sulfonamidei este mai puțin dură, deorece agentul de oxidare este un oxidant de categorie medie, care în mediu apos, încet pune în libertate acid hipocloros. Această caracteristică pozitivă recomandă ca metoda în special să fie frecvent utilizată pentru marcarea I radioactiv (123I, 131I) a proteinelor.

Reacțiile de oxidare a I în acest caz sunt probabil următoarele:

2Na131I+HOCl 131ICl+131ION+2Na+

S-a investigat formarea ionului 125IO-3 în timpul marcării proteinelor cu 125I folosind metoda cu cloramina-T [12]

Încorporarea I radioactiv în proteine are loc cu randament maxim în intervalul de pH=7 – 8 și cu un exces de cloramină-T luat în proporție de cca 10g de proteină; când se raportează la NaIradioactiv fără purtător și agenți reducători ori de stabilizare această proporție este de cca 50 g la 1ml Na131I. O creștere a cantității de cloramină-T nu duce la creșteri considerabile de randament de marcare a proteinelor, iar în unele cazuri excesul de oxidant poate avea efecte negative asupra integrității biologice a compușilor respectivi la care marcarea cu I radioactiv nu trebuie să depășească în medie 0,5 – 1 atm de I per moleculă, cantitatea de oxidant trebuie redusă, sau se reduce la 20s timpul de contact al proteinei cu oxidantul. S-a observat că stocarea cloraminei-T timp îndelungat (peste 0,5 – 1 an) provoacă o diminuare considerabilă a capacității sale de oxidare. În acest cât cantitatea de oxidant introdusă în sistem poate fi mărită uneori cu 100% ținând seama că pentru a obține o oxidare aproape totală a I este necesar în acest caz un exces de oxidant luat în proporție de 150 – 200 molecule de cloramină-T la o moleculă de Na131I, uneori chiar mai mult.

Oprirea reacției de iodurare se realizează prin introducerea în sistem a unei cantități echivalente de metabisulfit de Na, în proporție de 1,50 h la 1g cloramină-T

Marcarea cu 131I a compușilor farmaceutici prin metoda schimbului izotopic permite obținerea de activități specifice înalte și totodată o marcare într-o poziție stabilă.

d) Metoda electrochimică

marcarea proteinelor cu I prin metoda electrochimică în comparație cu alte metode, asigură într-o măsură mai mare integritatea biologică a moleculei proteice. Acest fapt a determinat ca metoda electrochimică să devină o metodă curentă de marcarea proteinelor cu I radioactiv, fiind simplă și accesibilă în special laboratoarelor de spital în care utilizarea produsului se face pe loc.

Practic marcarea se realizează într-o celulă electrochimică (vas cilindru de sticlă) cu o capacitate de 15 – 50ml în care se introduce un anod de platină de formă cilindrică și un catod care se separă de comportamentul anodului printr-o membrană de dializă. Anodul și catodul sunt alimente cu curent continuu de intensitate ce variază de la compus la compus, fiind cuprinsă în multe cazuri între 0,1 și 50 mA măsurată cu un amperametru. Pentru a evita acumularea de I liber în sistem (soluție), se recurge la folosirea unei intensități a curentului sub 1mA.

Funcție de stabilitatea chimică a fiecărui compus se reglează pH-ul astfel ca încorporarea I radioactiv în compusul radiofarmaceutic să fie optimă, folosind în acest scop soluția tampon de pH dorit.

3.2. Metoda de marcare prin substituție

Halogenarea compușilor aromatici, a unor compuși alifatici aminoacizi, polipeptide și proteine deseori se face prin metoda substituției electrofile. În aceste cazuri grupa incidentă X (atomii sau moleculele de halogen) este un reactant electrofil, de cele mai multe ori un ion pozitiv sau uneori molecule neutre.

Marcarea cu I radioactiv a acestor compuși prin substituție electrofilă are loc conform ecuației generale:

Ar-H+X+Ar-X+H+

R-M+X+R-X+M+

ArH – compusul aromatic

R – compusul alifatic sau alt gen de compus (nearomatic) care are în structura sa grupa și care poate fi un proton, ion metalic, halogen pozitiv etc., iar X un atom sau molecula de halogen.

Reacția de substituție are loc în două etape consecutive:

formarea speciei active electrofile, a I prin una din reacțiile de oxidare anterioare

reacția de substituție

Speciile active electrofile ale I pot fi I02, I+ și I0 care se obțin în final prin reacția de oxidare în soluție cu oxidanții menționați mai sus.

În mediu slab acid, acidul hipoiodos reacționează cu compușii aromatici cu o viteză comparabilă. Cinetica reacției este descrisă de relația:

V=k[ArH][HOI][H+]

sau atunci când compusul aromatic are o reactivitate mare viteza de iodurare depinde numai de concentrația acidului hipoiodos, iar relația devine:

v=K[HOI]

Din cele spuse mai sus rezultă că reactantul electrofil propriu-zis aste acidul hipoiodos (sau acidul conjugat al acestuia) ori ionul pozitiv de I format prin ruperea acestuia, conform

H-O-I+H+H–IH2O+I+

H

În ceea ce privește mecanismul de iodurare a compușilor aromatici prin substituție electrofilă în prezent există dovezi experimentale că următoarele două ar fi posibile.

a) iodurarea are loc prin substituție electrofilă în care predomină un mecanism de dislocuire directă cu formarea unei stări de tranziție:

I+

Ar-H+I+Ar Ar-I+H+

H

b) iodurarea are loc prin substituție electrofilă în două etape fiind adiția reactantului electrofil, adică a ionului pozitiv de I la nucleul aromatic formând un intermediar instabil urmată de a doua etapă în care acest intermediar elimină un proton pe care-l cedează mediului de reacție:

H

Ar-H+I+Ar Ar-I+H+

I

Oxidarea I, necesară reacției de substituție se realizează folosind agenți de oxidare, ca de exemplu cloramina-T, mai rar monoclorura de I și frecvent oxidarea electrochimică.

3.3. Metoda marcării prin adiție la dubla legătură:

În general se știe că halogenii adiționează la dubla legătură alchenică, formând combinații halogenate prin legarea atomilor de halogeni de atomul de C, conform reacției:

-CHCH- +X2-CHX-CHX-

care are loc la temperatura camerei și presiune normală.

Deoarece dintre toți halogenii I adiționează la dubla legătură cel mai greu, reacția de adiție a I decurge cu randament mult mai mare numai sub acțiunea luminii ultraviolete pentru a ridica starea energetică a sistemului pe nivele superioare favorabile acestei reacții. Dacă halogenul se află sub formă de hidracid acesta adiționează la dubla legătură, formând monohalogeni – alcani, dintre hidroacizii halogenilor cel mai ușor reacționează acidul iodhidric.

CH2CH2 + HICH3-CH2I

Adiția I la dubla legătură alchenică într-o măsură mult mai mică decât ceilalți halogeni, se datorează reversibilității reacției:

R2CCR2 + I2 IR2C-C+R2+I-

În care în primul stadiu, echilibrul este mult deplasat spre stânga. Un exemplu

De marcare cu I radioactiv prin reacția de adiție la dubla legătură este marcarea unor polizaharide ca insulina folosită în determinarea funcției renale (glomerulare) și a apei extracelulare din organismul uman:

a) reacția insulinei cu bromură de alil pentru a forma esterul alilinulin:

CH2CH-CH2Br+R-OHCH=CH-CH2-O-R+HBr

b) adiția iodului radioactiv

CH2=CH-CH2-O-R+I2*CH2I*-CHI*-CH2-O-R

4. Tehnici de marcare a complecșilor radiofarmaceutici marcați cu iod radioactiv

a. Acidul o-iodohipuric (N-o-iodo-benzoilglicină)

Acest acid sau sarea de sodiu a acestuia, denumită comercial hipuran, se utilizează frecvent în medicina nucleară sub formă de soluție injectabilă, pentru diagnostic în determinarea funcției renale.

Marcarea acidului o-iodohipuric sau a sării de sodiu cu 131I se face prin metoda schimbului izotopic după cum urmează:

– într-un volum de 1,5 ml soluție apoasă de o-iodohipurat de sodiu de concentrație 240 mg/ml se introduce o cantitate determinată de iodură de sodiu Na131i fără purtător și agent reducător cu o activitate totală de 5-2,5 mci (circa 0,2…0,5 ml) precum și câteva picături de soluție de KIO3 0,2%. Se ajustează pH la 5,6 cu HCl 0,5 N și apoi vasul de reacție se închide ermetic și se încălzește pe baia de apă sub un flux de lumină la un bec de 150-200 watt (la distanța de 15 cm), timp de 90 min. După expirarea timpului de încălzire, în vasul de reacție se introduc 3-4 picături de Na2S2O3 0,1 M și se agită conținutul vasului oprind astfel procesul de iodurare prin trecerea 131I+ în 131I-.

Funcție de conținutul de 131I- liber soluția radioactivă de o-iodohipurat de sodiu se purifică de radioiodura liberă prin precipitare în mediu de HCl (pH=1), prin filtrare pe coloana umplută cu anioniți (Dowex –1 sau Amberlit 1RA-400) sau prin contactare cu un amestec de precipitare sau centrifugare pentru separarea produsului final. După ajustarea pH 1a 6-8 produsul final se sterilizează prin autoclavare sau filtrare Millpore.

b. Hormonii tiroidieni marcați cu 131I (125I)

Tiroxina 131I (tetraiodotironina) și triiodotironina – 131I este utilizată în studiul metabolismului și transportului tiroxinei endogene în medicina in vivo. De asemenea, este folosită și pentru determinarea naturii și a cantității de tiroxină legată de proteinele plasmatice in vitro.

Funcție de numărul de atomi de I neradioactiv introduși prin sinteză în cele două nuclee benzenice structura chimică de mai sus poate conține trei sau patru atomi de I neradioactiv care prin metoda schimbului izotopic pot fi parțial sau total înlocuiți cu atomi de iod radioactiv (131I sau 125I). Când în structura chimică există trei atomi de I în pozițiile 3,5,3’ acesta se identifică cu un alt hormon tiroidian triiodotrironina.

Marcarea tiroxinei cu 131I sau 125I se efectuează în pozițiile 3,5,3’,5’ sau uneori numai în 3’,5’ având o activitate specifică până la 50 mci/mg în soluție injectabilă când radionuclidul este 131I sau până la 15 mci/mg când este marcată cu 125I pentru utilizarea in vitro sub formă de soluție 50% propilen-glicol.

Ambii hormoni (T4 și T3) se pot marca radioactiv prin metoda schimbului izotopic, folosind drept agent de marcare atât monoclorura de I cât și cloramina-T. Ultimul este folosit cel mai frecvent. De obicei ca materie primă pentru marcarea cu 131I sau 125I se folosesc compușii respectivi marcați radioactivi în pozițiile 3,5,3’,5’ și respectiv 3,5,3’. Uneori pentru marcarea radioactivă a acestor hormoni atunci când nu se dispune de compuși iodurați T3 și T4, se folosește metoda de substituție și astfel prin marcarea cu I atironinei se pot obține mai mulți derivați iodurați ai acesteia cu mono, di-, tri- și tetraiodotironina (tiroxina).

Dificultatea acestei metode de marcare constă în faptul că se obține un amestec de derivați iodurați ai tironinei cu o pondere mai mare sau mai mică a celor tri și tetraiodurați funcție de o serie de factori (cantitatea de agent oxidant, pH soluției, cantitatea de iodură radioactivă) și care în final necesită o separare radiochimică (cromatografie pe coloană sau schimbări de ioni, gel Sephadex sau cromatografie pe hârtie sau pe strat subțire urmată de o soluție individuală a spoturilor compușilor respectivi).

Purificarea acestor produse radiofarmaceutice de iodul liber (131I- sau 125I-) se efectuează prin metoda cromatografică sau prin filtrare pe geluri sau Sephadex.

Tiroxina – 131I și triiodotironina –131I în soluții apoase suferă o descompunere rapidă însoțită de formarea de derivați – oxidați (acizi 3,5,3’,5’ teraiodotirolactic 3,5,3’ – triiodotirolactic), acestor hormoni și de eliberarea de iod radioactiv sub formă de iodură, ca urmare a efectelor radiolitice ale radiațiilor ionizante emise de radionuclidul cu care este marcat hormonul respectiv (autoradioliză). Studii detaliate în acest scop au fost întreprinse de mai mulți autori care au arătat că în afară de acești produși de autoradioliză, la doze mai mari de radiații (activități specifice înalte) cuprinse între 0,5…1,5 Mrad mai pot forma și compuși hidroxilați de tipul 3,4 dihidroxifenilalanină (DOPA), hidroxitironină, hidroxitiroxină, iar la doze și mai mari are loc o scindare a tiroxinei sau triiodofironinei în două părți: componenta fenolică și o componentă ce conține derivați ai acidului fenilpiruvic.

Autoradioliza acestor doi hormoni tiroidieni este mai redusă dacă aceștia se află într-o soluție alcoolică, de exemplu 50% propilen-glicol.

Aceste studii au demonstrat că, cantitatea de 131I organic (legat în tiroxină) se reduce proporțional cu doza absorbită, astfel la o doză de 0,5 Mrad circa 50% de iod radioactiv organic este pus în libertate sub formă de iodură (anorganic) ceea ce impune condiții stricte de stocare a produsului finit, imediat după marcare și o limitare a valabilității la circa două săptămâni.

Determinarea purității radiochimice se efectuează prin metoda cromatografică pe hârtie în strat subțire sau prin electroferoză.

Mono- și dioiodotirosina-131I sau 125I

Ambii compuși se obțin prin iodurarea directă (substituție) a L-tirosinei prin metoda cu cloramină-T în soluție tampon de borat la pH=8, în prezență de iodură de sodiu (131I sau 125I). Funcție de concentrația L-tirosinei și de timpul de reacție (iodurare) în final poate să rezulte diiodotirosina-131I sau un amestec al acesteia cu monoiodotirosina-131I. Astfel la concentrații foarte mici ale aminoacidului în general rezultă numai diiodotirosina în raportul 6:1, iar la concentrații și mai mari doar monoiodotirosină.

Alături de metode cu cloramină-T pentru marcarea cu iod radioactiv prin iodurare directă se mai folosesc metodele electrochimice și aceea cu monoclorură de iod sau iodat. Purificarea de iod liber sau de alți produși de reacție se realizează prin metoda cromatografiei pe hârtie sau în strat subțire pe schimbători de ioni sau filtrare pe coloane cu gel Sephadex.

c. Lipide – 131I

Dintre compușii radiofarmaceutici mai importanți ai acestei clase utilizați în prezent în investigațiile și diagnosticul malabsorbției în intestine provocată de tulburările gastriointestinale sau insuficiența pancreatică sunt: trioleina – 131I, acidul aleic – 131I și unele uleiurilor de plante și arbori, ca uleiurile de măsline, de arahide și altele. Marcarea acestor compuși cu 131I se efectuează prin reacția de a adiția a I radioactiv la dubla legătură C=C folosind drept agent oxidant monoclorura de I sau iodatul. S-a observat că puritatea radiochimică a trioleinei marcate cu 131I depinde în mare măsură de puritatea chimică a substanței inițiale. Astfel, unele impurități din trioleina nemarcată constau din mono-, di- și trigliceride care suferă o iodurare preferențială și reduc randamentul de marcare al trioleinei.

Purificarea trioleinei de aceste impurități radioactive se realizează prin metoda cromatografică pe hârtie și în strat subțire, iar de iodul liber 131I prin extracția din soluție de eter cu o soluție de iodură de tiosulfat.

Conținutul de iod liber în trioleina marcată cu 131I de obicei este mai mic de 1% și acesta se determină prin separarea de I liber pe coloana cu schimbători de ioni sau cromatgrafice pe hârtie și în strat subțire.

d. Proteine plasmatice

Dintre proteinele plasmatice mai importante pentru medicina nucleară, în prezent au devenit următoarele: serumolbumina, figrinogenul și gamaglobulina. Marcarea cu 131I sau 125I a acestor proteine constă într-o iodurare a grupelor tirosinice din molecula proteinei respective conform reacțiilor:

R: -CH2-CH(NH2)-COOH

care în prezența unei baze pierde un proton în locul căruia se va lega I de atomul de carbon din poziția 3 al nucleului benzenic al grupei tirosinice:

Reacția este în strânsă dependență de concentrația OH- și I- din sistem și această reacție controlează întregul proces de iodurare a proteinelor plasmatice. În ceea ce privește cinetica reacțiilor de iodurare mult mai mică a proteinelor plasmatice s-a observat că viteza mult mai mare de iodurare a grupelor tirosinei este la treapta monoiodotirosinei pe când formarea de diiodotirosină are loc cu viteză mult mai mică. Astfel, iodurarea monoiodoacetil-tirosinei în mediul bazic este de 30 ori mai înceată decât cea a acestil-tirosinei, încât valorile pH cuprinse între 6,5 și 7,5 atât tirosina cât și monoiodotirosina practic se află nedisociatic; se consideră că vitezele de iodurare ale acestor compuși în aceste condiții sunt aproximativ egale.

Proprietățile biologice ale proteinelor plasmatice marcate cu radioactiv depind în mare măsură de gradul de iodurare, de tehnicile și de metodele de iodurare. În general se acceptă, conform datelor experimentale că iodurarea proteinelor plasmatice prin încorporarea în medie până la un atom de I per moleculă de proteine nu duce la alterarea integrității biologice a acestora. Cu toate acestea unele proteine plasmatice, de exemplu fibrinogenul, își modifică comportamentul biologic chiar la gradul de iodurare de 0,5 atomi I/moleculă, pe când albumina numai peste 2-3 atomi I/moleculă.

În afară de gradul de iodurare excesiv al grupelor tirosinice asupra proprietăților (comportamentul) biologice ale proteinelor plasmatice și în general al tuturor proteinelor, un rol important îl au reacțiile secundare de oxidare a grupelor –SH ale unor aminoacizi ce intră în compoziția proteinelor, între care mai cu seamă menționăm cisteina.

Aceste reacții secundare au loc concomitent cu procesul de iodurare și sunt inevitabile, dar prin anumite măsuri de protecție a proteinelor în timpul reacției de iodurare acestea pot fi diminuate, funcție de tipul proteinei în care se încorporează I radioactiv.

În general se știe că oxidarea grupelor –SH poate să conducă la rezultate neegale în comportarea biologică a proteinelor, funcție de tipul proteinei. Astfel acidul hipoiodos reacționează cu o serie de aminoacizi ce conțin grupe –SH conform ecuației:

HOI+RSHRSI+H2O

Aceștia odată iodurați pot suferi reacții de conjugare ca urmare a legării între ele a două molecule de aminoacid prin intermediul atomilor de sulf și eliminarea I sub formă de iodură:

ESH+RSIRSSR+H++I-

De asemenea, iodurarea histominei sau oxidarea în unele cazuri a triptofanului (alte componente principale ale proteinelor plasmatice) duce la modificări ale integrității biologice a moleculei proteinei respective:

Condițiile principale ce trebuie respectate în procesul de marcaje cu I radioactiv a proteinelor, pentru evitarea alterării integrității lor biologice sunt următoarele:

Proteina destinată marcării cu iod radioactiv trebuie să fie foarte pură, să nu conțină și alți compuși proteinici. În acest sens se recomandă o verificare a purității proteinei prin metode adecvate sau prin determinarea ratei de catabolizare fracționată.

Iodura de sodiu –131I sau 125I trebuie să fie purtători, agenți reducători, stabilizanți sau substanțe bacteriostatice. Cantitatea de iod radioactiv introdusă în sistem trebuie să fie minimă, astfel ca să se asigure un număr de impulsuri suficient pentru dezvoltarea proteinei marcate. Un exces de iod radioactiv poate duce și la oxidarea totală a grupărilor –SH, ceea ce modifică substabțial integritatea biologică a proteinei respective. Activitatea specifică prea mare a iodurii de sodiu radioactive, de asemenea poate avea efecte negative, producând autoradioliza proteinelor marcate. Pentru evitarea acestui fenomen se introduc în sisteme, după marcare, proteine ca serumalbumina pentru protejarea proteinei marcate. Gradul de iodurare se recomandă a se menține de un atom de iod pe moleculă sau mai mic dacă situația permite.

Proteinele, în general sunt foarte sensibile la temperaturi: acizii și bazele sau solvenții organici influențează negativ asupra proprietăților biologice. În acest sens se impune ca procesul de marcare să se efectueze în medii ce au pH cât mai apropiat de neutru.

Cantitatea de oxidant introdusă în sistem trebuie să fie minimă, dar suficientă ca oxidarea iodului să fie efectuată în timp scurt, astfel ca proteina să fie cât mai puțin afectată de prezența agentului oxidant.

Iodul radioactiv rămas după marcarea sub formă de iodură trebuie îndepărtat din sistem prin purificarea proteinei cu ajutorul metodelor adecvate: filtrarea pe coloană cu gel Sephadex, dializă, cromatografie coloane cu schimbători de ioni, etc., iar cantitatea de ion liber rămas după purificare trebuie să fie cât mai mică posibil.

Proteinele marcate se păstrează în condiții sterile și la temperaturi cuprinse între +4 și -40C, funcție de perioada de stocare. Marcarea cu iod radioactiv (131I sau 125I) a serumalbumina se realizează prin una din tehnicile enunțate.

Îndeosebi se folosește metoda electrochimică, care așa cum se menționează nu produce nici o alterare a proprietăților biologice a acestei proteine pe când celelalte metode s-a demonstrat că pot provoca mai mult sau mai puțin modificări de structură și în consecință alterarea integrității biologice prin oxidarea grupelor –SH sau de altă natură.

În ultimii ani tot mai mult este utilizată ca metodă de iodurare a proteinelor, oxidarea enzimatică a iodurii folosind sistemul: proteină + peroxidază + glucoză = oxidază + iodură de potasiu. Această metodă de oxidare a iodului promite a fi cea mai „blândă” și ca atare fără să producă modificări ale integrității biologice. Mecanismul reacției enzimatice constă din următoarele:

generarea H2O2 de către sistemul glucoză – glucoză – oxidază cu mențiunea că H2O2 formată nu este eliberată în mediul de reacție;

oxidarea peroxidazei și formarea compexului peroxidază-H2O2;

iodurarea labilă probabil a peroxidazei, a punților –S–S ale enzimei;

transferul formei oxidate a iodului din peroxidază către substratul proteic din sistem. S-a observat că asupra mecanismului de oxidare enzimatic un rol inhibitor îl are excesul de ion aflat în sistem, de aceea concentrația iodurii trebuie bine calculată și menționată în limitele de maximă eficiență. Prin această metodă este posibilă o marcare a proteinelor in vivo diferențiind astfel proteinele de suprafață din limfocitele normale și cele neoplastice.

Marcarea fibrinogenului este mai dificilă decât a altor proteine, deoarece un grad de iodurare mai mare de 0,5 atomi de iod/moleculă produce modificări sensibile în comportamentul biologic al acestei proteine mai ales intact după marcare trebuie să fie peste 90% (raportat la activitatea totală).

e. Anticorpi

Anticorpii fiind substanțe cu caracter proteic prezenți în fracțiunea globulinică a serului, marcarea lor cu izotopi radioactivi ai ionului, deschide noi posibilități de diagnosticare in vitro precum și de utilizare a acestora în scopuri terapeutice. Metodele de marcare cu iod radioactiv anticorpilor sunt identice cu cele utilizate și descrise pentru marcarea proteinelor.

O serie de anticorpi marcați cu iod radioactiv au fost utilizați în studii și diagnosticul unor tumori, în localizarea acestora. Se știe că din întreaga cantitate a anticorpilor din fracțiunea globulinică a serului, circa 0,2% reacționează nespecific cu diferite antigene, pe când reacțiile specifice cu antigenele produc numai o parte mică, circa 0,02% din totalul anticorpilor aflați în fracțiunea globulinică.

Având la bază specificitatea de reacție a unor anticorpi marcați radioactiv s-au studiat și elaborat metode de determinare a unor antigene folosind metoda radioimunologică. Un astfel de exemplu îl constituie dozarea radioimunologică a -feto-proteinelor (-FP) umane în care agentul iodurat radioactiv este anticorpul -FP sau chiar antigena. Aplicând metoda cu cloramină-T de marcare cu iod radioactiv a anti–FP sau chiar a -FP, se obțin anticorpi marcați 125I de activitate specifică –15…40 ci/g care la astfel de activități conțin circa 0,5 atomi I/ml și pot fi stocați la +4C timp de peste 5 săptămâni.

Deși -FP nu este o substanță antigenică în organism gazdă, ea poate produce anticorpi la alte specii de animale. Considerând că marcarea directă a anticorpului sau a antigenei cu iod radioactiv poate duce la o alterare a integrității lor biologice, ceea ce ar afecta direct reacția imunologică, autorii au elaborat o nouă metodă de dozare a -FP în care acești factori au fost eliminați. În această metodă spre deosebire de cea clasică agentul marcat cu iod radioactiv este anti-I9G (capră – anti-iepure). Concentrația antigenei în proba de analizat este determinată prin tracțiunea de anticorp liber, la echilibru și care la rândul ei este determinată prin titrarea cu anti-I9G marcată cu 125I după ce această fracțiune de anticorp liber a fost în prealabil absorbită pe un suport antigen în fază solidă. În prezent această metodă se aplică la noi în țară ca metodă curentă de determinarea -FP.

f. Aminoacizi

Un mare rol în analiza radioimunologică (RIA) îl va avea marcarea cu un iod radioactiv a grupărilor tirosil sau a derivaților acestora (tyrosylresidues) conjugate la o serie de compuși proteici ce nu conțin grupări tirosinice.

În acest fel se vor lărgi considerabil posibilitățile de utilizare în RIA a unor compuși proteici sau neproteici (antigene) care altfel nu puteau fi marcați cu iod radioactiv și care au mare afinitate față de antiseruri, de exemplu conjugarea grupei desaminotirosinil cu grupa arginil N-terminală a bradykininei sau conjugarea cu tetrapeptida C-terminală a gastrinei.

În afară de triiodotironina, tiroxina și derivații acestora până în prezent numai câțiva aminoacizi marcați cu iod se mai utilizează ca atare în medicina nucleară, îndeosebi acei care conțin în structura lor nuclee benzenice.

Între aceștia menționăm DL-fenilalamina, triptofanul. Astfel DL-triptofanul reacționează cu ion conform reacției:

g. Hormoni proteici

Până în prezent hormonii proteici (poliproteici) mai des utilizați în medicina nucleară pentru studii și determinări imunologice sunt: insulina, hormonul de creștere sau somatotrofina (HGH), hormonul andrenocorticotropic (ACTH), hormonul paratiroid (PHH), hormonul placentar lactogen (HPL), glucogonul, gastrina și angiotensina I.

Majoritatea acestor hormoni pentru a putea fi utilizați în radioimunologie se marchează cu iod radioactiv, frecvent cu 125I și rar cu 131I.

Marcarea radioactivă cu ajutorul uneia din cele trei metode principale de marcare a proteinelor cu iod radioactiv: metoda ICl.

Mecanismul de marcare constă în oxidarea iodului din forma iodură I-, în ioni pozitivi I+ care în prezența proteinelor în mediu aproape neutru (pH=6,5…7,5) intră în reacție de substituție a atomilor de hidrogen, din grupele tirosinice ale hormonilor respectivi sau în reacția de adiție la dubla legătură.

În ultimii ani pentru marcarea hormonilor polipeptidici este utilizată în majoritatea cazurilor, numai metoda cu cloramina-T, a fost modificată pentru acest scop.

Astfel reacția de iodurare a hormonului respectiv are loc în mediu tampon fosfat cu dozarea exactă a cantității de ion radioactiv. Se lucrează cu volum foarte mic, iar timpul de reacție este foarte scurt de ordin 20…30 s.

i. Baze pirimidonice, ribozidice și desoxiribozide

Faptul că acizii nucleici conțin baze pirimidinice fimină, uracil și citozină, marcarea lor cu izotopi radioactivi permite studiul comportării acestora, a metabolismului lor, în organismul uman, îndeosebi a localizării în țesuturile tumorale. Astfel, s-a observat că 5-iodo-desoxiuridina marcată cu 131I este încorporată în tumori de către acidul desoxiribonucleic, în locul timidinei, studiind cu ajutorul acestui trasor radioactiv traseul biologic al acizilor ribonucleici la nivelul celulelor.

Marcarea cu iod radioactiv a bazelor pirimidinice, ribozidelor și desoxiribozidelor se realizează prin sinteză introducând la început în moleculă pirimidină iodul radioactiv și apoi prin schimb izotopic se introduce iodul radioactiv sau acesta se introduce direct ca de exemplu în 2’-desoxiuridină prin iodurarea acestui compus pentru obținerea compusului trasor 5-iodo-2’-desoxiuridină. Iodurarea timidinei și a derivaților pirimidinei se mai poate efectua și prin reacții enzimatice (biosinteză), dar acestea sunt mai dificil de condus pentru ca marcarea să fie specifică. O serie de compuși marcați specific cu iod radioactiv se pot obține prin metoda cu cloramină-T sau electrochimică, de exemplu 5-ioduracil și 5-ioduridină.

S-a observat că derivații iodați ai desoxiuridinei suferă în organism o degradare rapidă în comparație cu alți compuși din clasa bazelor pirimidinice și a ribozidelor. Acest fapt limitează oarecum utilizarea largă a acestor radiofarmaceutice în detectarea și localizarea tumorilor tisulare.

5. Partea experimentală

1. Obiectivul propus

Lucrarea prezentă are ca scop stabilirea condițiilor optime în care se realizează marcarea cu izotopi radioactivi a unor compuși biologic-activi în scopul obținerii unor compuși radiofarmaceutici.

În prezenta lucrare am ales ca sisteme de lucru câteva uleiuri vegetale: de floarea soarelui, mentă și levandă și antibiotice din clasa penicilinelor.

Ca parametri fizico-chimici, cu influență asupra randamentului de înglobare a iodului radioactiv –131 am urmărit:

timpul de contact;

natura oxidantului;

temperatura

2. Prepararea soluțiilor necesare pentru marcarea izotopică a uleiurilor vegetale

soluție H2O2 de concentrație 1% și 30%;

soluție KIO3;

soluție Na2S2O3 de concentrație de 0,1N;

soluție de ulei în eter;

soluție radioactivă de iod 131 în eter.

Se prepară soluția radioactivă prin dizolvarea soluției de 131I în eter. Se prepară o soluție de ulei vegetal în eter, luând 2 ml de ulei și 18 ml de dietil eter. Din această soluție se vor lua 18,5 ml ce se trec în pâlnia de separare peste care se adaugă 1 ml H2O2 sau KIO3, soluție radioactivă –1 ml. Se agită puternic și se separă cele două straturi: stratul organic și stratul apos, după ce în prealabil au fost lăsate în contact un timp suficient (15 min.) pentru a se putea stabili echilibrul chimic între uleiul marcat și cel nemarcat. Reacția se oprește prin adăugarea a 10 ml Na2S2O3. Se separă cele două straturi, după care se măsoară activitatea stratului organic.

A se reține faptul că reacția are loc atâta timp cât se află în contact soluția de ulei în eter etilic, soluția de apă oxigenată și soluția radioactivă, pentru ca la adăugarea soluției de tiosulfat de sodiu reacția se oprește brusc, prin trecerea 131I0 în 131I-.

3 Modul de lucru la marcarea uleiurilor vegetale

Se pun în contact soluțiile de ulei în eter etilic, soluția radioactivă de iod –131 în eter etilic și soluția de apă oxigenată. Ca agent oxidant în loc de apă oxigenată se mai poate folosi și iodat de potasiu KIO3. Se lasă un timp de contact suficient pentru stabilirea echilibrului chimic, după care se adaugă soluție de tiosulfat de sodiu, reacția oprindu-se. Se separă faza organică de cea apoasă și se măsoară activitatea fazei organice. Din aceasta se va calcula randamentul în funcție de diferitele condiții de reacții ca fiind raportul dintre activitatea fazei organice măsurate și activitatea soluției radioactive introduse.

Măsurătorile se efectuează cu detectorul Seiger-Muller.

4. Prepararea soluțiilor pentru marcarea penicilinei

Soluții necesare:

penicilină dizolvată în apă;

soluție apă oxigenată de concentrație 1% și 30%;

soluție KIO3;

soluție Na2S2O3 de concentrație de 0,1N;

soluție radioactivă de iod 131I.

5. Mod de lucru la marcarea penicilinei

Se dizolvă soluția radioactivă de iod –131 în eter.

Se prepară soluția de penicilină prin dizolvarea a 500 mg penicilină în 10 ml apă.

Probele se prepară astfel: peste soluția de penicilină se adaugă 10 ml cloroform, 1 ml apă oxigenată și 1 ml soluție radioactivă. Se agită puternic în pâlnia de separare și se lasă un timp suficient pentru stabilirea echilibrului chimic. Apoi se oprește reacția prin adăugarea a 10 ml Na2S2O3. Se separă straturile apos și organic și se măsoară activitatea a 30 ml de fază organică. Din acesta se va calcula randamentul de marcare ca și la uleiurile vegetale.

6. Rezultate experimentale obținute la marcarea uleiurilor vegetale și a penicilinei

a) Stabilirea timpului de contact necesar pentru realizarea echilibrului de marcare

În acest sens am folosit uleiul de floarea soarelui realizând separarea fazelor după 5, 10, 15, 20 min.

Rezultatele sunt prezentate în tabelul (1). În cazul acestor uleiuri echilibrul de marcare se stabilește rapid astfel încât după 5 minute randamentul atinge valori care nu se modifică sensibil. Se consideră că 10 minute este timp suficient pentru stabilirea echilibrului chimic.

În cazul penicilinei rezultatele analoge sunt prezentate în tabelul (2), din care se constată o creștere a randamentului de marcare până la valori ale timpului de contact în jur de 15 min.

Tabel (1) Dependența randamentului de marcare de timpul de contact la uleiul de floarea soarelui

Tabel (2) Dependența randamentului de marcare de timpul de contact la penicilină

b) Natura oxidantului

Pentru introducerea iodului radioactiv în uleiuri este necesară oxidarea acestuia în prealabil de la I- la I2. În literatură se recomandă folosirea în acest scop a iodatului de potasiu (KIO3) ca agent oxidant.

Noi am încercat în afară de KIO3 și apă oxigenată în cazul uleiurilor vegetale folosite și cu agent oxidant KIO3 randamentele de marcare care s-au obținut sunt relativ mici, în special la uleiul de floarea soarelui (tabelul (3)).

Aceste randamente se consideră ca nesatisfăcătoare deoarece randamentele acceptabile în scopuri practice trebuie să fie situate peste 50%.

Astfel de randamente s-au obținut folosind ca agent oxidant apa oxigenată atât diluată, 1% cât și concentrată 30%.

În cazul celor trei uleiuri folosite randamentele de marcare obținute sunt mai mari decât în cazul folosirii KIO3 și cresc cu creșterea concentrației de oxidant atingând valori de peste 90% (tabelul (4)).

În cazul penicilinei, randamentele de marcare obținute nu sunt sensibil diferite în cazul celor doi oxidanți folosiți și practic nu depind nici de concentrația oxidantului. În toate cazurile randamentele s-au situat în jur de 50% (tabelul (5)).

Tabel (3) Dependența randamentului de marcare de natura oxidantului (KIO3) la uleiuri vegetale

Tabel (4) Dependența randamentului de marcare de concentrația agentului oxidant (H2O2)

Tabel (5) Dependența randamentului de marcare de natura agentului oxidant la penicilină

c) Temperatura

În acest scop am lucrat după metodica prezentată anterior, din probele respective au fost menținute în termostat la o temperatură de 20, 30, 40C. Se poate constata că atât în cazul celor trei uleiuri folosite cât și în cazul penicilinei randamentul de marcare scade cu creșterea temperaturii (tabel (6)).

Deși randamentul scade, scăderea nu este mare; totuși ea este sistematică. Am putea explica această scădere dacă am considera că procesul de marcare este un proces de echilibru cu formarea unui complex a cărui stabilitate scade odată cu creșterea temperaturii.

Tabel (6) Dependența randamentului de marcare de temperatură

Folosind izobara de reacție Van’t Hoff am estimat valoarea entalpiei reacției de complexare atât pentru cele trei uleiuri cât și pentru penicilină.

integrând rezultă:

d(ln K)= dT

ln K2 – ln K1=

Raportul constantelor de echilibru se înlocuiește cu raportul randamentul de marcare pentru că aceste mărimi sunt proporționale.

Calculul entalpiei de reacției la marcarea izotopică:

– ulei de floarea soarelui

T1=293 K =68%

T1=303 K =56%

kJ/mol

kJ/mol

kJ/mol

kJ/mol

– ulei de mentă

kJ/mol

kJ/mol

kJ/mol

kJ/mol

– ulei de levandă

kJ/mol

kJ/mol

kJ/mol

kJ/mol

– penicilină

kJ/mol

kJ/mol

kJ/mol

kJ/mol

Se constată că în toate cazurile procesul de introducere a iodului este exoterm și în consecință este recomandabil să se considere randamentul de marcare la o temperatură apropiată de temperatura fiziologică a corpului uman, deoarece la introducerea radiofarmaceuticelor în organism este foarte probabil să se realizeze echilibrul de disociere a complexului radiofarmaceutic și în consecință evaluarea corectă a constatărilor experimentale se face pe baza acestui randament de marcare.

În concluzie, procesul de marcare izotopică a compușilor fiziologic activi în scopul obținerii de radiofarmaceutice este un proces complex influențat de o serie de factori de care trebuie să se țină seama respective cât și în utilizarea lor pentru elucidarea unor procese ce au loc în organismul viu sau pentru stabilirea unui diagnostic corect și rapid.

Bibliografie

Pop, T.; Balaban, A.T.; Bălățeanu, I.; Georgescu, S., Medicină nucleară, Ed. Medicală, București, 1983

Compuși marcați și radiofarmaceutici cu aplicații în medicina nucleară, 1979

Balaban, A.T.; Fărcășiu, D; Harary, F, I Labelled Comp., 1970, 6, 211, 2;

Bhallo, H.L.; Vovio, P.R.; Samuel, S., I Radioanol, Nucl. Chem., 1997, 220 (1);

Menon S, Samuel S, Balokrishnon SA J. Radianal Nucl. Chem 1997, 220 (1)

Pimm, Malcolm V, Gribben Sandra J, Hudecz J. La belled Compal Radiopharm 1995, 36 (2)

Wefelman, Amon R, Hoefnogel, Cornelis A Nuklear Medezin 1996 35 (4)

Corneliu Podină Radiochimie

Molrlein, Stephen M Radiocim Acta 1990, 50 (1-2)

Tsomides, Theodore J, Eisen, Herman N Anal Biochem 1993 219 (1-2)

Vassaros L, Mikecz P, Berei K Radiochem Acta 1990, 50 (1-2)

Szabom, Toth S J. Radioanal Nucl Chem 1993, 176 (2)

L.J. Anghileri j. Appl Radiochem Acta 1971, (15, 92, 31)

A. D. Willliams, D.E Freeman, W. H. Florsheim J. Charomatographie 1969, (45, 371, 44)

D. Sehring J. Nucl Med 1968, (22,695,45)

Verma, Saguna, Kumor S, Prodeep Laloraya Biochem Biophys Res Commun 1990 170 (3)

A. Y. Volkema, F. S. Loomeyer J. Lab Clin Med. 1967 (70, 121, 77)

L.A. Sherman, S. Harwing, O.A. Kayne J. Appl Radiation Isotopes 1974 (25, 81, 94)

A. Hemville, S. Jenkin Anal. Biochem 1973, (52, 336, 95)

R.A. Peabodv, T. Halse, M. J. Tsapogas J. Nucl. Ned. 1972 (13, 843, 119)

E.D. Day, S. Lossitier, M. S. Maholey J. Nucl Med 1965 (6,38,191)

R.S. Yolow, S.A. Berson, I. Clen Invest 1960 (39,157, 196)

Jenkinson, A. V.; Maddalena, D.; Snowdom, G. M. Aust. Nucl. Sci Tehnol Organ, ANSTO/E 1989 (vol. 113/207539e)

Knust, E. Joachim, Dutschka, Klaus Appl. Radiat Isot. 2000, (vol. 132/241782f)

Yamata, Akihiro, Traboulsi, Ashrof Anal. Biochem 2000, (vol. 123/290696q)

Xiao W, Wang L., Ryan J. M, Pater A Radiat. Res 1999 (vol 131/308425s)

Barolli, Maria Graciela, Pomilio J. Labelled Compd. Radipharm 1997 (vol. 128/13150k)