Compozite Ceramice Si3n4 – Biosticlă Pentru Implanturi Intervertebrale de Fuziune

PROIECT DE DIPLOMĂ

Compozite ceramice Si3N4 – Biosticlă pentru implanturi intervertebrale de fuziune

Student: Roxana-Ileana POPOVICI

Coordonator științific:

Prof. Dr. Ing. Stefania STOLERIU

2016

Rezumat

În proiectul de față, este abordat compozitul Si3N4 – biosticlă ca material pentru implant intervertebral de fuziune, datorită proprietăților care îl caracterizează.

Cercetatorii au demonstrat în diferite lucrări științifice existența proprietăților mecanice, precum duritatea, rezistența la fracturare, rezistența la încovoiere etc., precum și a proprietăților ceramice si biologice.

Acest proiect de diplomă face o sinteză de literatură referitoare la aceste compozite și la folosirea lor în implantologia osoasă și propune o tehnologie de obținere a unui implant intervertrebal de fuziune.

Experimental, au fost realizate mai multe probe de compozit nitrură de siliciu – biosticlă, cu o concentrație masică procentuală de 70/30 (Si3N4/biosticlă), utilizând două tehnci de obținere, respectiv metoda de obținere a compozitului prin amestecare mecanică și metoda de obținere a compozitului prin omogenizare la gelificarea biosticlei, în mai multe condiții de sinterizare.

Materialele au fost caracterizate morfostructural și fazal prin SEM și XRD. Au fost determinate proprietățile ceramice și mecanice, iar proprietățile biologice au fost demonstrate prin teste de viabilitate celulară și testul MTT.

ABSTRACT

Present project considers the Si3N4 – bioglass composite as material for intervertebral fusion implant due to its properties.

The researchers demonstrated the existence of various properties, such as taughness, fracture hardness, flexural strength, etc., ceramic and biological properties.

This Diploma project provides an overview on the literature on these composites and their use in bone implantology and proposes a technology for obtaining a intervertrebal fusion implant.

Experimental, there were obtained composites with silicon nitride – bioglass ratio of 70/30 (Si3N4 / bioglass) using 2 obtaining technique for composite forming – the mechanical homogenization and the gelification of bioglass on the Si3N4 particles. The composites were sintered in different conditions.

The obtained samples were characterized from morphological and phase compositon view point by SEM and XRD. Ceramic and mechanical properties have been determined and the biological properties were demonstrated by cellular viability and MTT tests.

Cuprins

1. Introducere………..……………………………………………………………………………………. 5

2. Materiale și proprietăți…………………………………………………………………………………. 7

2.1. Nitrura de siliciu (Si3N4) ………………………………………………………………………… 7

2.1.1. Proprietăți mecanice………………………………………………………………….. 8

2.1.2. Proprietăți triblogic………………………………………………………………………. 9

2.1.3. Proprietăți biologice……………………………………………………………………..10

2.2. Biosticla (45S5) …………………………………………………………………………………… 13

2.2.1. Proprietăți mecanice………………………………………………………………….15

2.2.2. Proprietăți biologice………………………………………………………………… 16

2.3. Compozit Si3N4 – biosticlă……………………………………………………………………..18

2.3.1. Proprietăți mecanice……………………………………………………………….. 19

2.3.2. Proprietăți biologice………………………………………………………………… 21

3. Obținere implant prin metoda SPS (Spark Plasma Sintering)……………………………….. 25

4. Metode de analiză………………………………………………………………………………………………… 27

4.1. Analiza termică diferențială și termogravimetrică………………………………………… 27

4.2. Metode difractometrice – Difracția de raze X………………………………………………. 28

4.3. Microscopie electronică de baleiaj (SEM) …………………………………………………. 29

5. Proceduri experimentale………………………….………………………………………………… 30

5.1. Metoda de obținere a compozitului prin amestecare mecanică………………………. 30

5.2. Metoda de obținere a compozitului prin omogenizare la gelificarea biosticlei…. 32

6.Rezultate experimentale……………………………………………………………………………… 34

6.1. Caracterizare fazală si morfostructurală (XRD si SEM) ………………………………. 34

6.2. Proprietăți ceramice…………………………………………………………………………………. 38

6.3. Proprietăți mecanice………………………………………………………………………………… 40

7. Concluzii……………………………………………………………………………………………… 44

8. Bibliografie…………………………………………………………………………………………… 46

1. Introducere

Coloana vertebrală este o parte vitală a corpului uman. Aceasta are rol de susținere a corpului, permițând toate mișcările posibile, precum și rolul de adăpostire a măduvei spinării (structură ce transmite impulsuri nervoase și controlează toate mișcările și senzațiile corpului).

Vertebrele care alcătuiesc coloana vertebrală sunt legate între ele prin discuri intervertebrale care au rol de amortizare și care oferă coloanei flexibilitate. Fracturile apar în special la pacienții implicați în accidente traumatice și, mult mai frecvent, la pacienții cu osteoporoză. [1] Fracturile vertebrale sunt printre cele mai des diagnosticate complicații; între 30-55% dintre femeile trecute de 50 de ani având cel puțin o fractură vertebrală.[1]

Cauzele traumatismelor coloanei sunt: 45% accidente de trafic rutier, 20% accidente de muncă, 15,9% accidente de sport, 15% traumatisme directe prin arme de foc. [2]

Specialiștii estimează că 1 din 3 femei și 1 din 12 bărbați cu osteoporoză vor suferi o fractură pe os patologic, majoritatea fiind localizate la nivelul coloanei vertebrale. [1] Pentru ameliorarea stării pacienților cu traume ale coloanei vertebrale și redarea funcțiilor acesteia de susținere a corpului uman, menținerea trunchiului în poziție dreaptă, facilitarea capacităților motorii și, nu în ultimul rând, protecția măduvei spinării, ingineria implanturilor pentru țesuturi dure studiază modalități de reconstrucție osoasă.

Lucrarea de față intenționează să prezinte proprietățile benefice ale compozitului nitrură de siliciu – biosticlă, ca material utilizat în reconstrucția osoasă, în speță a coloanei vertebrale (cușca intervertebrală).

Acest tip de implanturi este de obicei numit cușca intervertebrală deoarece este plasat între două vertebre. Cuștile sunt dispozitive mici, goale, cu pereții perforați. De cele mai multe ori acestea sunt umplute cu grefe osoase pentru a promova creșterea osoasă între dispozitiv și vertebre. Cuștile sunt utilizate, de obicei, pentru înlocuirea unui disc pierdut și pentru a reduce presiunea pe rădăcinile nervoase. [3]

În cazul de față, cuștile vor fi realizate integral din același material și anume compozitul Si3N4 – biosticlă. De asemenea, cuștile nu vor fi goale, ci vor fi pline cu același material copozit.

În ceea ce privește materialul care a fost ales în cadrul lucrării, pentru realizarea implantului intervertebral de fuziune, acesta are în compoziție atât un material cu rezistență mecanică foarte bună, cât și un material care este biocompatibil și care nu produce efecte toxice în organism. Aceste proprietăți sunt vizate cel mai mult pentru această aplicație, motiv care îl recomandă pentru utilizarea în domeniul implanturilor de țesuturi dure.

Nu în ultimul rând, putem menționa că implantarea, în general, prezintă atât avantaje, cât și dezavantaje date de proprietățile materialului, de condițiile și metoda implantării.

Avantajul acesteia este dat de rezolvarea anumitor traumatisme care nu pot fi vindecate prin alte metode.

Dezavantajul oricărui implant este că, pe de o parte, determină o perioadă de refacere relativ îndelungată și, pe de altă parte, nu redă integral funcțiile anatomice ale structurii pe care o înlocuiește. De asemenea, introducerea implantului în organism se realizează chirurgical, metodă invazivă, care poate avea urmări negative, colaterale.

Tehnologia implantului este supusă permanent atenției cercetătorilor pentru îmbunătățirea proprietăților implanturilor prin utilizarea unor anumitor materiale realizate prin diferite metode de sinteză.

Prima parte a lucrării acoperă aspecte teoretice legate de compozitul nitrură de siliciu – biosticlă, proprietățile acestuia și tehnici de obținere a implantului intervertebral de fuziune. Totodată, această parte oferă o vedere de ansamblu asupra implantului, a materialului din care este realizat și a aplicabilității acestuia în domeniul ingineriei țesuturilor dure. Se poate evidenția faptul că beneficiile utilizării acestui compozit sunt date de proprietățile acestuia.

A doua parte constituie partea practică a lucrării și încearcă să susțină viabilitatea aspectelor teoretice, prin realizarea în laborator a unor probe de compozit, prin diferite metode de sinteză care au la bază metoda sol-gel de obținere a biosticlei și utilizând diferite condiții de sinterizare.

Această parte este continuată prin prezentarea rezultatelor testării prorietăților mecanice, precum și a unor teste in vitro pe culturi celulare care au ca scop evidențierea proprietăților de biocompatibilitate și bioactivitate a materialului compozit nitrură de siliciu – biosticlă.

Lucrarea adaugă ilustrativ și printr-o suită de tabele și grafice, date și informații care au menirea să creeze o imagine completă asupra laturii teoretice și a rezultatelor obținute în cadrul părții practice.

2. Materiale și proprietăți

Osul natural este un material compozit hibrid polimer-ceramică, format din următoarele componente: anorganice (HA), organice (colagen), celulare (osteoblaste, osteoclaste, osteocite) și apă.

Combinația dintre materialele bioactive și bioinerte oferă foarte multe posibilități în ingineria țesuturilor dure. [4]

În această lucrare vom studia proprietățile benefice ale biocompozitului Nitrură de siliciu – biosticlă care îl recomandă pentru utilizarea în domeniul ingineriei pentru țesuturi dure.

2.1.Nitrura de Siliciu (Si3N4)

Si3N4 este un material ceramic care prezintă o combinație de proprietăți mecanice, tribologice, termice și chimice care îl face potrivit pentru realizarea componentelor cu performanță ridicată în medii severe, în mai multe aplicații industriale. Aceste proprietăți și anume: duritate, rezistență la fracturare, la frecare și coeficient de uzură, sunt de asemenea foarte importante pentru multe aplicații medicale cu mare încărcătură de bioceramică în corpul uman. O altă proprietate de dorit a implaturilor pe bază de ceramică este bioactivitatea.[4]

Acest material cristalizează în sistemul hexagonal sub două forme polimorfe numite alfa (la temperaturi joase) și beta (la temperaturi ridicate). Cele două transformări au loc la 1400°C și conduc la dezvoltarea unei microstructuri -Si3N4 alungită. [5]

β-Si3N4 este o structură cristalină care are șase atomi de siliciu și opt de azot, într-o unitate celulară de patrusprezece atomi. De asemenea, Si3N4 poate fi găsit în natură, în structuri cristaline cubice (γ) și trigonale (α). [4]

Pe baza acestor proprietăți, nitrura de siliciu atrage foarte mult interes pentru aplicații ortopedice și dentare.[4]

Proprietățile mecanice și tribologice ale Si3N4 sunt strâns legate de microstructura ceramicii.[6]

Doar câteva studii au raportat comportamentul biologic al nitrurii de siliciu. Totuși, studii recente au arătat ca suprafețele lustruite de Si3N4 au abilitatea de a sprijini proliferarea celulelor osteoblaste in vitro. [7]

In general, Si3N4 este obținut prin process de sinterizare, incluzând sinterizarea prin reacții de legatură a nitrurii de siliciu, sinterizarea prin presare la cald, sinterizarea prin presare izostatică la cald etc. [8]

Studiile de cercetare privind prelucrarea ceramicilor Si3N4 s-au intensificat în special în ultimele două decade. Ceramicile Si3N4 au proprietăți unice precum suprafață specifică mare, bună rezistență la oxidare, duritate relativ mare și rezistență la fracturare, rezistență la coroziune termo-chimică, bună prelucrabilitate, rezistență mare la șocuri neobișnuite și termice, proprietăți dielectrice acceptabile, bună toleranță la solicitare și distrugere, rezistență la temperaturi mari și coeficient scăzut de dilatare termică.[9]

2.1.1. Proprietăți mecanice

Tabelul 1 rezumă, pe scurt, duritatea, rezistența la fracturare și densitatea sinterizată a Si3N4. Este demn de remarcat faptul că Si3N4 prezintă rezistență mare la fracturare, comparativ cu Si3N4 presat la cald în mod convențional. [10]

Pentru măsurarea durității și a rezistenței, s-a recurs la indicii convenționali Vickers [10]

Tabel 1. Proprietăți mecanice ale Si3N4. [10]

Figura 1. Curba tensiune-deformare pentru Si3N4 [10]

În Figura 1, curba solidului este cea mai bună curbă care se potrivește cu datele. Si3N4 prezintă o non-linearitate slabă în curba tensiune-deformare. [10]

2.1.2. Proprietăți tribologice

În Tabelul 2 sunt prezentate proprietățile de duritate ale Si3N4, în comparație cu cele ale Al2O3, ZrO2-Al2O3 (ZTA), Y2O3-ZrO2 (YSZ) stabilizat și CoCr (la temperatura camerei, dacă nu s-au precizat alte condiții). Proprietățile osului cortical sunt prezentate în referință. [11]

Tabelul 2. Proprietăți tribologice ale Si3N4.[11]

În absența oxidării materialului în vivo, Si3N4 are proprietățile de fricțiune necesare pentru articularea împotriva ei însăși, chiar și atunci când apa este singurul lubrifiant [66]. De asemenea, este bine cunoscut că Si3N4, având suprafețe de compoziții și procese variate, este subiect al degradării prin oxidare, în mod deosebit în prezența umidității. [11]

2.1.3. Proprietăți biologice

a) Citotoxicitatea

Testele de citotoxicitate au fost realizate utilizând linia celulară L929. Probele au fost marcate fluorescent și observate la microscopul de fluorescent. [12]

Probele de Si3N4 au fost comparate cu probe de oxid de aluminiu și titan. [12]

Figura 2. Imagini de microscopie de fluorescență a celulelor viabile pe: (a) pamânt, (b) Si3N4, (c) oxid de aluminiu și (d) titan.[12]

Răspunsul toxic al probelor de nitrura de siliciu, evaluat prin teste de viabilitate celulară a demonstrat că nu există efecte toxice. Aproximativ 100% din celulele regăsite pe surafața probelor au fost indicate viabile de testul cu iodură de propidiu si prin marcarea fluorescentă a nucleelor (Figura 12). Cu ajutorul microscopiei de fluorescență s-au putut observa nuclee de formă rotund-ovală pe suprafața probelor. Nu s-au observant clusteri celulari cu fibroblaste polimorfe sau celule multinucleare. De asemenea, celulele s-au distribuit uniform pe probe. [12]

b) Proliferarea celulara

În Figura 3 sunt prezentați indicatori de proliferare celulară pentru mostre diferite. Se pare că structurile de la suprafață au un impact asupra proliferării celulare. Efectul suprafeței lustruite a diferitelor materiale este că prezintă o semnificativ mai mare productivitate a celulelor, în comparație cu creșterea celulară pe discuri corespunzătoare, nelustruite, cu excepția SiN V. Mai mult, productivitatea celulară a materialelor lustruite a fost mai mare decât valorile din formele grafice tubulare goale, cu excepția SiN III și V; nivele semnificative au fost obținute numai pentru SiN I – IV. Luate împreună, cantitatea celulelor arată o largă varietate. Totuși, sunt frapante cantitățile mici de celule a SiN III, atât de sol, cât și a celui lustruit. [12]

Figura 3. Proliferare celulară pe Si3N4.[12]

c) Osteointegrarea

Au fost realizate studii pentru determinarea osteointegrării in vivo pe șoricei. În cadrul proiectului de cercetare au fost realizate implanturi de Si3N4 sub formă cilindrică și au fost implantate chirurgical în tibie de iepure. Implanturile au fost păstrate în iepuri timp de 8 săptămâni.[13]

După aceste 8 săptămâni, osul a fost rezectat pentru vizualizarea implantului. Blocul (format din os și implant) a fost placat cu aur si examinat cu ajutorul microscopiei electronice de baleiaj. [13]

Figura 4. Imagine SEM a implantului.[13] Figura 5. Imagine SEM a implantului.[13]

Figura 6. Imagine SEM a implantului aflat în Figura 7. Imagine SEM a implantului aflat în poziție distal [13] poziție proximală [13]

În Figura 4 este prezentată o imagine SEM a implantului de Si3N4 în care se poate observa: în partea dreaptă – implantul instalat în poziția proximală a tibiei și în partea stangă – implantul instalat în poziție distală.[13]

În Figura 5 este prezentată tot o imagine SEM a implantului de Si3N4. Săgețile albe indică deschideri pentru nutrienți aflate în osul nou format, în timp ce săgeata neagră indică zona de interfață. [13]

În Figura 6 este prezentată o imagine SEM a implantului de Si3N4 instalat în poziție distală, în tibie. Se poate observa că puntea osoasă formată se extinde către suprafața implantului.[13]

În Figura 7 se poate observa o imagine SEM a implantului instalat în poziție proximală, în tibie. În acest caz, puntea osoasă prezenta în Figura 3 nu este vizibilă. [13]

Cu ajutorul microscopiei electronice de baleiaj s-a demonstrat că noul os s-a format în jurul implantului, mai ales în zona corticală. [13]

Osul nou format a crescut implicând și suprafața implantului și se pare că s-a extins către cavitatea măduvei, lucru care este un indicator al osteoconductivității.[13]

Prezența deschiderilor pentru nutrienți în osul nou format arata buna calitate a osului nou, ținand cont de faptul că aceste deschideri sunt responsabile de conducerea nutrienților în interiorul osului.[13]

Bazându-ne pe Figurile 3 si 4, putem spune că procesul de creștere osoasă variază în funcție de poziția în care se află implantul, de exemplu în cazul de față, dacă Si3N4 a fost implantat în regiunea distală în care distanța dintre suprafața implantului și os este mică, osul a putut crește și ajunge la suprafața implantului, formând o punte osoasă. În cazul poziționării implantului în zona proximală a tibiei, puntea osoasă nu s-a format, probabil din cauza distanței mari dintre implant și țesutul osos. [13]

2.2. Biosticla

Biosticlele sunt bioceramice foarte bioactive, aceasta fiind demonstrată, atât in vitro, cât și in vivo, prin formarea unor legături puternice cu osul cu care au fost puse în contact.[7]

Aceaste biomateriale, bazate pe un amestec amorf de oxizi (SiO2-Na2O-K2O-CaO-MgO-P2O5), au fost brevetate în anul 1968 de Larry Hench, prin prepararea binecunoscutei Biosticle 45S5. [14]

Biosticla 45S5 este un material anorganic care se comercializează și care este folosită ca înlocuitor de os de mai bine de 20 de ani. Aceasta este prima sticlă bioactivă dezvoltată de Hench în 1969 și are urmatoarea compoziție chimică: 45% SiO2, 24,5% Na2O, 24,5% CaO și 6% P2O5. Această sticlă este foarte bioactivă și este atât osteoinductivă, căt și osteoconductivă, permițând aplicarea sa în ingineria țesutului osos. Mai mult decât atât, s-a dovedit că disoluția ionică a produselor de biosticlă 45S5 poate îmbunătăți formarea de țesut osos nou (osteogeneză) printr-un control direct asupra genelor care reglează inducția și proliferarea celulară.[15]

Hench și Clark au fost primii cercetători care au descoperit proprietatea de bioactivitate a acestui material în vitro și în vivo și au reușit să demonstreze potențialul osteointegrator. În aceeași lucrare au fost remarcate, atât proprietățile antimicrobiene și antiinflamatorii, cât și posibilitatea de a controla cu ușurință cristalinitatea prin aplicarea tratamentelor termice corespunzătoare fazei sticloase prezente în structura biosticlei. [14]

Studii realizate asupra sticlelor bioactive au presupus că legăturile pe care acestea le pot forma se limitează doar la oase. Wilson a arătat că atunci când implanturile de biosticlă sunt imobilizate în zone subcutanate cu fibre puternice de colagen, se atașează la stratul de hidroxiapatită care crește la interfața dintre material și țesut. Studii ulterioare au măsurat ratele de atașare a țesutului moale la biosticlă și au arătat că o compoziție optimă pentru legarea țesutului moale este 52% SiO2 în sistemul SiO2 – CaO – Na2O – P2O5 (Figura 1) . Această descoperire a asigurat bazele științifice pentru deosebirea materialelor bioactive din clasa A, acelea care au avut rate suficiente de reacții la suprafață pentru a forma legături atât cu osul, cât și cu țesutul subțire, în timp ce materialele bioactive din clasa B formează legături doar cu osul.[16]

Această descoperire a asigurat bazele pentru designul și utilizarea clinică a primelor două produse de biosticlă care necesitau atât o interfață stabilă între țesutul moale și implant, cât și între os și implant. [16]

Figura 8. Diagrama lui Hench [16]

Timp de 45 de ani de la descoperirea sticlei bioactive – biosticla 45S5, s-au realizat mai mult de 1000 de publicații care descriu această clasă unică de materiale bioactive și performanța lor in vitro și in vivo. În ultimii 20 de ani, numeroase aplicații clinice au fost dezvoltate și aprobate pentru utilizarea comercială. Rezultatul constă în utilizarea pe plan mondial a biosticlelor pentru o varietate de aplicații dentare și medicale. Foarte multe cărți au fost scrise, care rezumă mai multe aspecte ale dezvoltării biosticlelor în acești 45 de ani. [16]

Studii anterioare au arătat că există 5 transformări structurale în timpul încălzirii biosticlei până la 1000 ° C: o prima tranziție a sticlei, o separare de faze sticlă-în-sticlă, două procese de cristalizare și o tranziție secundară a sticlei. [15]

Până în 1982, toate procesele de obținere a sticlelor bioactive implicau topirea sticlei la temperaturi foarte mari. În 1982, Hench, Prassas si Phalippou au arătat că este posibilă o alternativă a procesului de obținere a sticlelor pe bază de silice, utilizând precursori chimici și procesul de obținere sol-gel urmat de uscare și stabilizare termală. Rezultatul a constat într-un gel mezoporos derivat din metoda sol-gel, care poate fi convertit într-o sticlă densă sau utilizat ca sticlă poroasă, parțial densificată. [16]

Mediul apos existent în cadrul procesului sol-gel favorizează precipitarea HA din structura amorfă a sticlelor bioactive bazate pe siliciu. [17]

Activitatea biologică a biosticlelor este asigurată de către schimbul ionic care apare între sistemul vitros și fluidele fiziologice.

Biosticla 45S5 este una dintre bioceramicele cu cea mai rapidă formare a stratului de hidroxiapatită pe suprafața sa. In plus, funcționalitatea sa este așa de mare îâcat poate să se lege la țesuturi moi precum cartilagele și muschii și poate chiar să inducă formarea de țesut

nou. Principalul său dezavantaj constă în rezistența sa mecanică scăzută, care face să fie aplicabilă numai în zone ale corpului unde materialul nu suferă tensiuni care pot duce la spargere. [18]

O modalitate de îmbunătățire a proprietăților mecanice ale biosticlei este prin tratament termic, permițând sticlei să se cristalizeze într-o sticlă ceramică. În același timp, cristalizarea nu modifică semnificativ bioactivitatea. [18]

Legătura material implantat – țesut se datorează formării unui strat de hidroxiapatită carbonatată HCA pe stratul bogat în silice, cu aceeași viteză cu care celulele vii formează metaboliți interfaciali. Biosticlele se leagă mecano-chimic sau biochimic de țesutul osos sau de fibrele de colagen în contact cu țesutul moale, viu. [14]

S-a dovedit, de asemenea, că biosticla nu produce răspunsuri toxicologice în nici un model de test. [16]

Utilizarea biosticlelor se datorează printre altele și caracteristicilor de porozitate ale acestora, care permit o propagare foarte intimă a țesuturilor, asigurându-se pe această cale o legătură perfectă cu implantul. [14]

2.2.1. Proprietăți mecanice

Rezistența la compresiune a materialelor sinterizate a fost măsurată folosind testerul Instron 4204. [19]

Pe timpul testului de rezistență, încărcătura a fost aplicată până când a început să aibă loc densificarea probelor poroase.[19]

Figura 9 demonstrează proprietățile mecanice ale biosticlei 45S5-materiale ceramice după sinterizare prin tehnica SPS și tratamentul convențional la cald. Proprietățile mecanice au crescut odată cu creșterea temperaturii de sinterizare. Valorile maximale ale coeficientului

lui Young obținute prin tratamentul convențional la cald au fost, în medie, de aproximativ 90 GPa, mai mic decât coeficientul maximal al lui Young (~110 GPa) obținut prin tehnica SPS la 950°C (Figura 9a). [19]

Mai mult decât atât, deviația standard mică a proprietaților mecanice ale mostrelor SPS indică faptul că performanța lor mecanică este demnă de încredere. [19]

Figura 9. Proprietățile mecanice ale biosticlei obținută prin metoda sol-gel.[19]

Rezistența la compresiune finală (UCS) a acestui sistem de materiale a fost, luate împreună, mai mare după sinterizarea prin tehnica SPS, decât prin tratamentul convențional la cald (Figura 9b), cu UCS maximal fiind de ~110 și, respectiv, de ~98 MPa. Totuși, diferența în UCS maximal a materialelor sinterizate prin cele două metode este semnificativă (p>0.05). [19]

Trebuie menționat faptul că UCS-ul osului cortical este în intervalul 50–150 MP. De aici, rezultă că în ceea ce privește proprietățile mecanice, biosticla 45S5-ceramică sinterizată este comparabilă cu osul compact natural.[19]

Totuși, din cauza proprietății slabe de rezistență la fracturare, utilizarea medicală a biosticlei a fost centrată în zone de stres minim, și anume, se folosesc pentru: realizarea de oscioare ale urechii medii, reconstrucții alveolare, implanturi dentare, pelicule pentru acoperirea totală a unor proteze (din alumină sau din aliaj de titan), pentru tratamente moderne ale cancerului etc. [19]

Pe de alta parte, există alte biosticle precum sticlele-ceramice apatită-wollastonit, care sunt bioactive si au rezistență mecanică bună, dar formarea stratului de hidroxiapatită durează mai mult decât în cazul biosticlei 45S5. [18]

2.2.2. Proprietăți biologice

Cercetatorii au realizat teste biologice prin punerea în contact a biosticlei cu o cultură de celule MG63 pentru a evidenția proprietatea de bicompatibilitate și bioactivitate a biosticlei.[19]

În cadrul cerecetărilor, s-a demonstrat că biosticla susține procesul de proliferare celulară și că este un mediu prielnic pentru dezvoltarea unor celule cu morfologie normală. [19]

Hydroxyapatita a fost folosită în acest test ca un control pozitiv. S-a observat că mediul ce conține extracte de pudră sinterizată sprijină proliferarea celulelor MG63, iar în ziua a doua, prin observare vizuală la microscop, s-au putut identifica diferențe, nu mari, la proliferarea celulelor în grupuri cu tratament convențional la cald (Figura 10) și materiale sinterizate la 800 și 950 °C cu tehnica SPS (Figura 11c și Figura 11d).[19]

Figura 10. Morfologia celulelor MG63 după 2 zile în: (a) mediu de cultură standard,(b) în mediu extras din HA și (c-d)mediu extras din biosticla sinterizată prin tratament termic convențional la 1000 și 1200°C [19]

Figura 11.Morfologia tipică a culturii celulare după 2 zile,îăn mediu extras din biosticla sinterizată prin SPS la temperaturi de: (a) 600°C, (b) 750°C, (c) 800°C și (d) 950°C. [19]

Creșterea celulelor a fost aparent înceată, în medie la două zile, conținând extracte de materiale sinterizate prin tehnica SPS la temperatură scăzută, adică 600°C și 750°C (Figura 11a și Figura 11b). [19]

2.3. Compozitul Si3N4 – biosticlă

Teoretic, compozitul ar trebui să combine proprietățile avantajoase ale ambelor materiale, cum sunt: rezistența mecanică bună, rezistența la fracturare, biocompatibilitatea, bioactivitatea etc.

S-au realizat numeroase studii asupra materialului compozit Si3N4 – biosticlă și au fost stabilite anumite proprietăți și valori ale acestora pentru diferite compoziții cum sunt cele prezentate în Tabelul 3. [4]

Tabelul 3.Compoziții Si3N4–biosticlă compozit.[4]

Pentru aceste compoziții, prezentate în Tabelul 3, cercetătorii au realizat diferite teste pentru a determina valori experimentale ale anumitor proprietăți sau caracteristici pe care compozitul le are.

2.3.1. Proprietăți mecanice

În tabelul 4 sunt prezentate valorile obținute de cerecetatori pentru densitate, densitate relativă și porozitate.[4]

Tabel 4. Densități aparente, densități relative și porozitate pentru compozitul Si3N4 – biosticla [4]

Microstructura materialelor este un aspect foarte important mai ales în cazul în care sunt realizate pentru aplicații biomedicale.[4]

Din rezultatele prezentate în Tabelul 4 se poate observa că densitatea relativă a compozitului Si3N4 – biosticlă crește odată cu adaosul de biosticlă. De asemenea, se poate observa și faptul cș densitatea relativș a compozitului este mai mare decât cea a biosticlei, motiv pentru care putem spune că biosticla joacă rolul unui aditiv de sinterizare.[4]

Porozitatea per total a compozitului scade odată cu creșterea conținutului de biosticlă. Acest lucru este în concordanță cu creșterea densității materialului odată cu adaosul de biosticlă.[4]

Cele mai semnificative caracteristici cu privire la proprietățile mecanice sunt îmbunătățirea rezistenței la rupere și a rezistenței la încovoiere, prezentate în Tabelul 5. Aceste proprietăți reprezintă cheia pentru funcționarea in vivo a implanturilor pentru aplicații medicale de încărcătură ridicată. În plus, inexistența fazei intergranulare detrimentală după procesare și buna legătură a celor doi constituenți ai compozitului, asigură un bun transfer de stres. [20]

Proprietățile mecanice ale noii biosticle Si3N4 sunt prezentate în Tabelul 5, împreună cu date ale altor bioceramici și bioceramici compozite. Comparând cu bioceramicile bioactive precum materialele bazate pe apatite, biosticlele și sticlele ceramice, s-a realizat o

îmbunătățire semnificativă a valorii rezistenței la fracturare, conform cu cel raportat pentru osul cortical. Respectiv, valoarea KIC a compozitului crește ca cea a biosticlei ca rezultat al efectului granulelor de Si3N4 folosite ca deflectoare de fisurare. [7]

Tabel 5. Rezistența mecanică. [7]

S-au făcut cateva încercări pentru obținerea unor astfel de materiale care combină comportamentul bioactiv cu proprietăți mecanice adecvate, în mod special rezistența la fracturare pentru aplicații medicale de încarcatură mare. Aceste proprietăți sunt de obicei detalii cheie pentru funcționarea în vivo a majorității implanturilor bioceramice. Mai departe, pentru un transfer de stres eficace, trebuie să se obțină o bună legătură între cele două componente ale compozitului. [7]

2.3.2. Proprietati biologice

a) Bioactivitatea

În același studiu de cercetare [4], s-a demonstrat că materialul compozit Si3N4 posedă proprietatea de bioactivitate.

Bioactivitatea materialului poate fi dovedită prin formarea de apatite la suprafața acestuia, atunci când este imersat în SBF (Simulated Body Fluid). [4]

S-au realizat imagini SEM la 7 și 21 de zile după imersarea în SBF, pentru a se putea observa dacă se formează apatite la suprafața materialului. După 7 zile de la imersare (Figura 12), se poate observa formarea unui strat de apatită pe suprafață, iar după 21 de zile (Figura 13) se poate observa faptul ca suprafața materialului este aproape în întregime acoperită de apatite.[2]. Imaginile detaliate ilustrează o formă sferică a particulelor de HA. [4]

Figura 12. Imagine SEM după 7 zile în SBF Figura 13. Imagine SEM după 21 zile în SBF

Si3N4 – 30.[4] Si3N4 – 30.[4]

Biosticla joaca rolul unui aditiv de sinterizare care suportă parțial sinterizarea compozitului, dar care, în special, promovează proprietatea de bioactivitate a materialului. [4]

Compozitul nu prezintă efecte de natură citotoxică în organismul uman. De asemenea, s-a demonstrat că acest compozit are abilitatea de a forma un strat de apatită la suprafața sa atunci când este imersat în SBF (Simulated Body Fluid) în anumite condiții, ceea ce este un indicator al bioactivității. Stratul de apatită format favorizează regenerarea osoasă, determinând osteointegrarea implantului. [20]

b) Osteointegrarea

Pentru acest test s-au utilizat celule osteoblaste MG63. Acestea au fost plantate pe suprafața compozitului Si3N4 – biosticlă, timp de 5 zile. Celulele au proliferat foarte bine și au prezentat o morfologie normală (Figurile 14 și 15). În prima zi, valorile observate cu MTT au fost semnificativ mai mari pentru proba control sugerând o creștere a atașării celulelor pe recipientele standard de plastic, comparativ cu suprafata materialului. Oricum, în pofida valorilor inițiale mici, date de MTT, creșterea celulară pe suprafața compozitului a arătat o rată mai mare de creștere în perioada de 5 zile. [20] Dizolvarea fazei biosticlei care are loc în contact cu mediul de cultură crește suprafața disponibilă pentru proliferarea celulelor MG63. [20]

Diferențele de arie a suprafețelor pot consta în creșterea proliferării celulare observate în cazul compozitului, comparative cu mediul de cultură control. Oricum, acest factor aparent nu explică în totalitate diferențele de proliferare celulară observate. [20]

Figura 14. Viabilitatea/proliferarea celulelor MG63 pe suprafața compozitului Si3N4 – biosticlă timp de 5 zile. Culturi control (●), culturi crescute pe probe de material (■), culturi crescute pe probe de material pre-imersate (□).[20]

Pentru a observa atât aderarea celulelor la suprafața materialului, cât și proliferarea și morfologia acestora, s-a utilizat microscopia electronică de baleiaj (SEM). [20]

În urma acestor teste, s-a demonstrat că acest compozit susține cresterea celulelor osteoblaste. Compozitul a prezentat o îmbunătățire a proliferarii celulelor osteoblaste și a producției de osteocalcină, comparativ cu suportul de cutură standard. [20]

Cercetatorii au realizat, de asemenea, teste in vitro și pe culturi celulare din maduva osoasă umană, pentru a observa comportamentul materialului în contact cu maduva osoasă și fenomenele ce apar la interfața compozit – țesut osos.[20]

Acest sistem de culturi celulare se pare a fi un model in vitro foarte util pentru abordarea diferențierii osteoblastelor de celulele măduvei osoase umane plantate pe suprafața compozitului.[20]

Figura 15. Imagini SEM a compozitului Si3N4 – biosticlă după însămânțarea cu celule MG63 timp de 1 zi (A), 3 zile (B) și 5 zile (C)[20]

Adeziunea celulelor măduvei osoase umane la suprafața compozitului a avut loc în doar cateva minute (Figura 16A). Atașarea și împrăștierea celulelor (Figura 16 A-C) au urmat același model ca cel observat în cazul suporturilor de culturi standard de plastic. Modificările morfologice care au avut loc în timpul procesului de adeziune corespund reorganizării citoscheletonului (structura care are rol în formarea, creșterea și funcționarea celulei).[20]

Evaluarea probelor s-a realizat cu ajutorul SEM, după o perioadă de 35 de zile de incubare (Figura 16A-E) și a arătat că acest material permite proliferarea acestor celule. În plus, s-a observat o diferențiere a osteoblastelor cu formarea structurilor globulare mineralizate. [20]

Figura 16. Imagini SEM ale compozitului Si3N4 – biosticlă însămânțat cu celule ale măduvei osoase umane, timp de 1h (A), 3h (B), 24h (C), 7 zile (D) și 28 zile (E).[20]

3. Obținerea implantului prin metoda SPS

(Spark Plasma Sintering)

Sinterizarea în plasmă scânteietoare (SPS), cunoscută și ca tehnica de sinterizare asistată de câmp (FAST), aparține clasei tehnicilor de sinterizare în care densificarea este sporită prin aplicarea simultană a presiunii axiale și a temperaturii crescute, generate de un flux de curent înalt.[27]

SPS a fost folosită cu succes în prepararea materialelor clasificate funcțional, a ceramicilor, materialelor magnetice, aliajelor etc.[27]

Se presupune ca SPS are avantaje semnificative în scăderea temperaturii de sinterizare și a perioadelor de sinterizare, pregătind ceramicile de mare densitate.[27]

SPS prezentată în Figura 17, este o tehnică nouă de sinterizare eficace, care a fost folosită în cercetarea și dezvoltarea diferitelor tipuri de materiale. Totuși, nu există o înțelegere uniformă a mecanismului de sinterizare a SPS. În general, SPS este o metodă de sinterizare de presiune, bazată pe aplicarea simultană a presiunii axiale și a plasmei de înaltă temperatură generată, pentru o clipă, în golurile dintre materialele pulbere prin descărcarea electrică la începutul pulsului de energie ON-OFF de curent continuu (DC). În plus față de descarcarea de caldură Joule datorită curentului electric și a deformării plasmatice produse de presiune, SPS generează, de asemenea, un puls voltaic de curent continuu între particulele de pulbere și folosește eficace caldura spontană generată de descărcarea dintre particulele de pulbere, rezultând astfel câteva caracteristici speciale. Comparată cu sinterizarea convențională, SPS are două caracteristici importante:

(1) Procesul SPS poate face ca pulsul de energie înaltă să se concentreze în punctul de joncțiune granular, economisind astfel energie;

(2) O scânteie de mare energie, de puls de curent de mic voltaj generează, pentru o clipă, plasmă scânteietoare și produce o temperatură foarte localizată, începând de la cateva până la 10.000 de grade Celsius între particule, rezultând apoi în difuzia termică optimă și migrarea granule de graniță, adică poate fi intensificat mai mult transferul de material și astfel, ceramicile de înaltă densitate pot fi obținute prin sinterizarea în plasmă scânteietoare cu o temperatură de sinterizare scăzută și o perioadă scurtă de sinterizare.[27]

Figura 17. Schema de funcționare a Spark Plasma Sintering (SPS) [27]

În ultimele decade, au fost folosite tehnici mai avansate pentru consolidarea pudrei ceramice, precum sinterizarea în microunde și sinterizarea în atmosferă nitrogenată. Totuși, există câteva rapoarte care se axează pe aplicarea tehnicii SPS de preparare a ceramicii dense.[27]

Deoarece atomii de siliciu și azot sunt legați puternic covalent, densificarea nitrurii de siliciu este greu să se realizeze prin utilizarea de procedee de sinterizare convenționale. Prin urmare, vom folosi sinterizarea prin spark plasma (SPS).[27]

În urma utilizării tehnicii Spark Plasma Sintering (SPS), se vor obține implanturi de fuziune intervertebrală cu diferite forme și dimensiuni, cum sunt cele prezentate în Figura 18.

Figura 18. Implanturi realizate din compozitul Si3N4 – biosticla. [11]

4. Metode de analiză

4.1. Analiza termică diferențială și termogravimetrică

Cu ajutorul înregistrărilor în timp a temperaturilor, DTA studiază transformările de fază, obținute în decursul încălzirii unei substanțe solide. Majoritatea substanțelor solide supuse încălzirii suferă o serie de transformări, atât fizice cât și chimice. Transformările discontinue sunt cele mai importante transformări si au loc în intervale restrânse de temperatură, de exemplu: descompunerile termice, fierberea, sublimarea, cristalizarea, transformările polimorfe, topirea. [21]

Toate aceste procese au loc cu absobție sau degajare de căldură și pot fi evidențiate prin măsurarea temperaturii probei [34].

Curbele DTA dau informații privind temperaturile la care au loc transformările, sensul și mărimea acestora, prin temperaturi de maxim de efect. [22]

TGA este o metodă analitică, ce constă în măsurarea schimbărilor masei unei probe, sub influenta temperaturii. Măsurătorile pot fi efectuate în aer sau într-o atmosferă inertă precum azot, argon sau heliu, pentru a preveni reacțiile de oxidare, iar masa este înregistrată în funcție de temperatură. [23] Această metodă analizează dependența pierderii de masă de temperatura unei probe de material, când acesta este încălzit cu o viteză constantă, până la finalizarea procesului de degradare. [23]

Analiza TG permite cântărirea continuă a unei probe încălzite într-o atmosferă controlată (aer, azot, argon etc.). Instrumentul utilizat în analiza termogravimetrică este compus dintr-o microbalanță înconjurată de un cuptor încălzit electric și este prevăzut cu un termocuplu capabil să monitorizeze temperatura. Proba studiată este introdusă într-un creuzet deschis, ce este atașat de microbalanță. Ansamblul microbalanței măsoară masa inițială a probei la temperatura camerei și apoi, odata cu creșterea temperaturii, monitorizează continuu schimbările masei probei.

Rezultatele sunt înregistrate ca pierdere masică/timp (pentru analizele izoterme) sau pierdere masică/temperatură (în cazul unei îăcalziri constante a probei). [24]

Analiza termogravimetrică ne oferă o serie de informații foarte importante ce pot fi utilizate în vederea cunoașterii aplicabilității materialului. Din punct de vedere cantitativ, curbele termice pot explica desfășurarea unor procese.

Curbele TG ne oferă informații privind variațiile de masă, sensul acestora și intervalul de temperatură în care au loc. În condiții experimentale constante, panta curbei ne oferă informații privind cinetica reacțiilor care au determinat pierderea de masă.

4.2. Metode difractometrice – Difracția de raze X

Pulberile sau pastilele ceramice obținute în urma procesului de sinterizare sunt analizate difractometric cu ajutorul unei tehnici nedistructive de analiză a materialelor, difractometru de raze X.

Aparatul ne oferă informații cu privire la analizele calitative, de identificare a fazelor cristaline în probele pulverulente, precum și la analizele cantitative și la determinarea gradului de cristalinitate. [22]

Domeniul de unde electromagnetice cuprins între 100 Å și 0.1 Å (1A=10-10m), reprezintă radiația X sau radiația Roentgen. Această radiație, se formează atunci când electronii cu viteză suficient de mare se ciocnesc de un material, transformându-și energia cinetică în energie de radiație.

Principiul de funcționare al analizei difractometrice se bazează pe interacțiunea dintre razele X și structura cristalină a materialului analizat. Rezultatul analizei este o difractogramă, iar compușii cristalini prezintă întotdeauna, pentru aceeași structură cristalină, aceeași difractogramă. [25]

Difractograma permite:

identificarea fazelor prezente în material prin determinarea poziției picurilor de difracție;

determinarea concentrației fazelor prin mărimea picurilor;

determinarea cantității de faze amorfe existente (prin zgomotul de fond prezent în înregistrarea spectrului);

lărgimea picurilor oferă informații privind dimensiunea medie a cristalelor: cristalitele mari determină picuri ascuțite, iar dimensiuni mici ale cristalitelor determină picuri mai largi. [22].

Utilizând un difractometru cu raze X se pot identifica ușor fazele dintr-un material și forma cristalină în care se găsesc.

4.3. Microscopie electronică de baleiaj (SEM)

Un microscop electronic este un tip de microscop ce are în componența sa un fascicul de electroni pentru a ilumina proba și produce o imagine marită de până la aproximativ 10.000.000 ori.

Microscopul electronic utilizează lentile electrostatice și electromagnetice care controlează fasciculul de electroni pe care îl concentrează pentru a forma o imagine. Microscoapele electronice sunt utilizate pentru a studia o gamă largă de probe biologice și anorganice. Industrial, este adesea utilizat pentru controlul calității și analizarea defectelor de fabricație, de dimensiuni foarte mici. [23].

Radiația emisă de fiecare punct al probei este colectată prin intermediul unui detector și utilizată pentru reglarea intensității unui fascicul de electroni dintr-un tub catodic, care baleiază ecranul fluorescent al tubului sincron cu fasciculul de electroni primari. [26] Toate microscoapele electronice de baleiaj (SEM) au o coloană în care se creează un flux de electroni (tun), o cameră a probei, unde fluxul de electroni interacționează cu proba, detectori care monitorizează o multitudine de semnale rezultate de la interacția probă – flux de electroni, un sistem de vizualizare – de ecranare a unei imagini din semnalele captate.[26]

Compoziția probei analizate afectează, atât profunzimea în care fasciculul inițial de electroni pătrunde în probă cât și forma volumului de interacție. Probele mai dense reduc capacitatea de pătrundere și distanța parcursă de semnalul emis de către probă, înainte ca acesta să fie resorbit. Astfel, există o zonă în care sunt emiși electronii secundari și o alta alocată electronilor retroîmprăștiați. [26] Electronii secundari (SE) sunt electroni din probă, emiși în urma interacției acesteia cu fasciculul primar de electroni. Acești electroni oferă o bună rezoluție imaginii. Contrastul într-o imagine dată de electronii secundari este dat de topografia materialului. În zonele mai înalte, au loc interacții mai puternice emițându-se astfel un număr mai mare de electroni secundari, ceea ce asigură o imagine mai luminoasă în vârfurile suprafeței probei. Acest lucru ușurează interpretarea unei imagini date de electronii secundari. [26]

Microscopul electronic de baleiaj este inutil pentru studierea probelor ude, impurificate, uleioase, neconductoare sau pentru analiza unor transformări dinamice cum ar fi măcinarea, topirea, răcirea, hidratarea sau determinările de rezistență mecanică [26].

5. Proceduri experimentale

Experimental, s-au abordat două metode de obținere pentru a studia comportamentul și proprietățile compozitului Si3N4 – biosticlă. Astfel, s-au obținut două materiale cu aceeași compoziție (70% Si3N4 și 30% biosticlă), dar utilizând căi diferite. De asemenea, aceste materiale au fost sinterizate, atât la temperaturi diferite, cât și în atmosfere diferite.

Se menționează faptul că nitrura de siliciu (Si3N4), utilizată în cadrul proiectului, a fost comercială, iar biosticla a fost obținută în laborator, conform unei rute neconvenționale sol-gel. Biosticla utilizată la obținerea compozitului este de tip 45S5.

5.1. Metoda de obținere a compozitului prin amestecare mecanică

Fluxul tehnlogic, pentru această metodă de obținere, urmărește etapele prezentate în Figura 19.

O metodă de obținere a compozitului considerat presupune obținerea biosticlei prin metoda sol-gel si apoi se omogenizează cu Si3N4 în vederea obținerii compozitului.

După etapa de uscare a gelului de biosticlă, a fost realizată o analiză termică complexă (Figura 20), pentru a stabili temperatura de calcinare a gelului de biosticlă.

În etapa de omogenizare a componentelor compozitului, sunt adăugate Si3N4 și etanolul, după care sunt introduse împreună în moara cu bile pentru omogenizare. Etanolul este adăugat pentru o mai bună omogenizare a materialelor.

Figura 19. Flux tehnologic, obținere compozit prin omogenizare mecanică

Figura 20. Analiză termică complexă a gelului de biosticlă

În Figura 20 este prezentată analiza termică complexă a gelului uscat de biosticlă în care putem observa toate pierderile de masă care au loc la diferite temperaturi și cu ajutorul căreia putem stabili o temperatură de calcinare a materialului compozit.

Efectul endoterm de la 100°C se datorează pierderii apei fizice, iar restul efectelor sunt de descompunere, fie a hidrocompușilor, fie a compușilor intermediari.

Temperatura de calcinare a fost stabilită la 720°C, deoarece la această temperatură se termină toate procesele însoțite de pierdere de masă.

5.2. Metoda de obținere a compozitului prin omogenizare la gelificarea biosticlei

Fluxul tehnologic urmărește pașii prezentați în Figura 21. Figura prezentată mai jos este varianta adaptată a procesului de sinteză a biosticlei, în care sunt adăugate diferite etape sau substanțe în scopul obținerii compozitului.

În etapa de omogenizare a precursorilor a fost adăugat Si3N4 și Triton. Tritonul este un dispersant, adăugat cu scopul de a menține nitrura de siliciu în suspensie și de a obține un compozit omogen. Fără acest dispersant, nitrura de siliciu s-ar fi depus pe fundul paharului,

iar în etapa de gelifiere particulele nu ar fi fost înglobate în biosticlă și distribuite omogen în material.

După etapa de omogenizare s-a adus solul la pH acid (2-3) cu acid azotic (HNO3).

Figura 21. Flux tehnologic, obținere compozit prin omogenizare în sol-gel

Etapa de sinterizare a fost relizată la două temperaturi diferite, în cazul nitrurii de siliciu și în două tipuri de atmosfere, în cazul compozitului.

6. Rezultate experimentale

În urma procesului de sinteză a compozitului nitrură de siliciu – biosticlă, am obținut 6 probe și anume:

– Si3N4, sinterizat la 980°C, în atmosferă de azot (N2);

– Si3N4, sinterizat la 1200°C, în atmosferă de N2;

– Si3N4 + biosticlă, obținut prin omogenizare în sol-gel, sinterizat la 980°C, în atmosferă de N2;

– Si3N4 + biosticlă, obținut prin omogenizare mecanică, sinterizat la 980°C, în atmosferă de N2;

– Si3N4 + biosticlă, obținut prin omogenizare în sol-gel, sinterizat la 980°C, în aer;

– Si3N4 + biosticlă, obținut prin omogenizare mecanică, sinterizat la 980°C, în aer.

6.1. Caracterizarea fazală și morfostructurală (XRD și SEM)

1. Caracterizarea fazală a fost determinată prin difracție de raze X atât pentru probele obținute, cât și pentru nitrura de siliciu și biosticlă individual.

Figura 22. Difractograma biosticlei calcinate

În Figura 22 se pot observa picuri aferenți unor compuși slab cristalizați ai biosticlei. Cristalinitatea este foarte redusă, acest lucru putând fi observat prin faptul că picurile sunt foarte largi.

Spectrul de difracție al nitrurii de siliciu este prezentat în Figura 23. Acest spectru arată coexistența a două forme polimorfe de nitrură de siliciu.

Figura 23. Spectrul de difracție al Si3N4 nesinterizată

Pentru probele sinterizate (atât nitrura de siliciu, cât și compozitele) s-au obținut spectrele din figurile următoare.

În Figura 24 putem observa coexistența a două forme polimorfe, ca și în cazul Si3N4 nesinterizată.

Figura 24. Spectru de difracție Si3N4 sinterizată.

Figura 25. Spectru de difracție compozite sinterizate în N2.

În Figura 25 putem observa spectrul de difracție pentru compozitele Si3N4 + biosticlă sinterizate în atmosferă de azot. Se decelează, alături de cele două forme polimorfe ale nitrurii de siliciu, picuri aferenși devitritului (este specific cristalizării biosticlei la temperatură de sinterizare).

În momentul în care tratăm termic în aer, în afara formelor polimorfe ale nitrurii de siliciu și formarea devitritului, se remarcă prezența picului de SiO2, acest lucru fiind vizibil în Figura 26 – spectrele de difracție ale compozitelor Si3N4 + biosticlă sinterizate în aer.

Analiza XRD a fost realizată pe suprafața probei, motiv pentru care există posibilitatea ca SiO2 să fie prezent doar pe suprafața materialului și nu în compoziția sa.

Figura 26. Spectru de difracție compozite sinterizate în aer

2. Caracterizarea morfostructurală a fost realizată prin intermediul microscopiei elecronice de baleiaj (SEM). Această tehnică de microscopie vizează doar proprietățile de suprafață ale materialului, nu și pe cele structurale.

Imaginile SEM ne oferă informații precum porozitate, distribuție pori, densitate etc.

În imaginile SEM pentru nitrura de siliciu (Figura 27), se observă că suprafața are un aspect slab sinterizat, cu porozitate ridicată, fără punți intergranulare. În probele compozite se remarcă legăturile dintre particule și o porozitate mult mai redusă, schimbări care sunt date de prezența biosticlei în compozit.

A B C

D E F

Figura 27. Imagini SEM ale materialelor sinterizate: A – Si3N4_980°C_N2; B – Si3N4 + biosticla_mec_980°C_N2; C – Si3N4 + biosticla_SG_980°C_N2; D– Si3N4_1200°C_N2; E- Si3N4 + biosticla_SG_980°C_N2; F- Si3N4 + biosticla_mec_980°C_N2;

6.2. Proprietățile ceramice

Proprietățile ceramice vizează în special densitatea relativă și porozitatea deschisă.

Aceste valori au fost calculate prin tehnica arhimedică (Metoda lui Arthur). Tehnica presupune imersarea probelor în xilen, după vidarea acestora. Xilenul este o substanță lichidă, care intră în porii materialului. În funcție de porozitatea materialului sintetizat, xilenul este mai mult sau mai puțin reținut de probe. Se cântăresc probele înainte de imersare și după imersare (în aer și în xilen). Pe baza acestor date se calculează densitatea relativă și porozitatea deschisă.

În cazul acestui material, este de dorit ca acesta să prezinte o densitate relativă cât mai mare și o porozitate deschisă cât mai mică.

În Figura 28 sunt prezentate, sub formă de grafic, pentru o mai bună vizualizare a rezultatelor, datele centralizate obținute în urma tehnicii prezentate mai sus (tehnica arhimedică). Se observă că materialul prezintă o densitate destul de mare și, prin urmare, o porozitate deschisă mică. De asemenea, se mai poate observa că biocompozitul este superior nitrurii de siliciu ca urmare a prezenței biosticlei care poate juca și rolul de adaos de sinterizare pentru nitrura de siliciu, iar cele sinterizate în atmosferă de azot prezintă cele mai bune proprietăți din acest punct de vedere (ca urmare a lipsei apariției SiO2).

Figura 28. Proprietăți ceramice ale materialelor sinterizate

6.3. Proprietățile mecanice

Proprietățile mecanice au fost determinate prin compresiune la presă uniaxială.

Putem observa în Figura 29 că adaosul de biosticlă îmbunătățește proprietățile mecanice ale nitrurii de siliciu. De asemenea, mai putem observa că probele sinterizate în atmosferă de azot au proprietăți mecanice mai bune, însă diferența nu este foarte mare.

În ceea ce privește modulul de elasticitate, acesta este prezent, însă nu are valori foarte mari. Și în acest caz, probele compozite sinterizate în atmosferă de azot prezintă proprietăți mai bune.

Figura 29. Proprietăți mecanice.

6.4. Proprietățile biologice

A fost evaluată proliferarea celulară – MTT assay (CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega). Pe baza metodei colorimetrice cantitative se permite aprecierea proliferării, viabilității și citotoxicității celulare. Metoda se bazează pe reducerea unei săruri de tetrazoliu galbene MTT (bromură de 3-(4,5 dimetiltiazoliu)-2,5-difeniltetrazoliu) la formazan de culoare albastru-închis. Reducerea realizată de enzime mitocondriale (în special succinat de hidrogenază) este un indiciu al integrității celulare/mitocondriale. Formazanul insolubil în apă poate fi solubilizat cu izopropanol, dimetilsulfoxid sau alt solvent organic. Densitatea optică (DO) a formazanului solubilizat este evaluată spectrofotometric, obținându-se o funcție absorbanță-concentrație colorant-număr de celule active metabolic din cultură. Celulele se cultivă în plăcuțe cu 96 de godeuri, având o densitate de însămânțare de 3000 celule /godeu în diferite condiții experimentale. Ulterior s-a adăugat 15 µl soluție I și s-a incubat la 37 °C timp de 4 ore. Se adaugă soluția II și se pipetează energic pentru solubilizarea cristalelor de formazan. Se incubează 1 oră, apoi se pipetează pentru omogenizare și se elimină bulele pentru a nu interfera cu citirea. Se citește la spectrofotometru la 570 nm (TECAN, Männedorf, Switzerland).

CellTracker ™ Red CMTPX este un colorant fluorescent utilizat pentru monitorizarea viabilității și motilității celulare. Colorantul fluorescent CellTracker ™ Red CMTPX a fost proiectat pentru a trece liber prin membranele celulare în interiorul celulelor, unde este transformat într-un produs de reacție impermeabil de către celule. Colorantul CellTracker ™ Red CMTPX este reținut în celulele vii și se transmite de la o generație la alta către celulele fiice. Colorantul CellTracker ™ Red CMTPX este proiectat să afișeze fluorescență pentru cel puțin 72 de ore, având proprietăți superioare: acesta este stabil, netoxic la concentrații de lucru, bine păstrat în celule și fluorescent la pH fiziologic. Red CMTPX se adaugă peste celule la o concentrație de 3 µM și se incubează timp de 30 de minute. Se spală celulele pentru îndepărtarea colorantului care nu a pătruns în celule și se vizualizează la microscopul de fluorescență având un spectru de emisie în roșu (577/602 nm).

Rezultatele demonstrează că expunerea liniilor celulare endoteliale EAhy926 la materialele ceramice obținute prezintă o viabilitate celulară ridicată, care se încadrează în limitele normale redate de proba de control.

Putem observa, de asemenea, că atât după 24 de ore, cât și după 72 de ore (Figura 30) celulele tind să prolifereze, viabilitatea acestora nefiind afectată.

a

b

Figura 30. Viabilitatea celulară după 24 de ore (a) și 72 de ore (b)

Analiza de microscopie de fluorescență a culturilor de celule puse în contact cu probele analizate (Figura 31) ilustrează, după 72 de ore de la incubare, că celulele continuă să prolifereze, probele ceramice fiind biocompatibile, atât viabilitatea celulară, cât și morfologia celulelor nefiind afectată.

a b

c d

Figura 31. Microscopie de fluorescență a probelor cu

a- Si3N4_1200°C, b- Si3N4_BG_SG_980°C, c- Si3N4_BG_MIX_980°C, d- probă martor

7. Concluzii

În ceea ce privește aspectele teoretice ale lucrării, se poate concluziona că Si3N4 are proprietăți mecanice foarte bune, potrivite aplicațiilor în domeniul implaturilor de țesuturi dure. Totodată, teoria demonstrează că Si3N4 prezintă și proprietăți biologice, cum sunt biocompatibilitatea și bioactivitatea. Pe de altă parte, biosticla nu prezintă proprietăți mecanice satisfacatoare pentru utilizarea ca implant osos, dar prezintă proprietăți biologice care recomandă folosirea sa în ingineria țesuturilor dure, cum sunt biocompatibilitatea și bioactivitatea remarcabile atât in vitro, cât și in vivo.

Combinarea Si3N4 cu biosticla va conduce la obținerea unui material compozit care va îmbina proprietățile celor 2 materiale. Cu alte cuvinte, puntem spune că, din punct de vedere teoretic, materialul ar trebui să aibă atât proprietăți mecanice, cât și proprietăți biologice superioare. De asemenea, teoria susține că biosticla reduce temperatura de sinterizare a nitrurii de siliciu, devenind astfel și un adaos de sinterizare.

În lucrare se propune o tehnologie de obținere a unui implant prin metoda Spark Plasma Sintering (SPS) care nu afectează proprietățile materialului, scade temperatura de sinterizare și conduce la obținerea unui implant cu o structură densă.

Partea experimentală a acestei lucrari demonstrează că cea mai bună metodă de obținere a compozitului nitrură de siliciu – biosticlă este prin adăugarea de Si3N4 în timpul procesului sol-gel de obținere a biosticlei, deoarece testele realizate ulterior au arătat că proba obținută prin această metodă deține proprietăți mecanice mai bune, comparativ cu restul probelor realizate în alte condiții. În plus, testele au arătat și o îmbunătățire a proprietăților biologice a probelor obținute prin tehnologia de obținere a compozitului prin omogenizare la gelificarea biosticlei.

Rezultatele experimentale arată că adaosul de biosticlă îmbunătățește proprietățile materialului și micșorează temperatura de sinterizare a acestuia. De asemenea, în urma analizelor care au fost realizate în cadrul acestui proiect, s-a demonstrat că biocompozitul Si3N4 – biosticlă are proprietăți ceramice, mecanice și de suprafață care îl recomandă pentru utilizarea ca implant de fuziune intervertebrală.

În general, facându-ne o imagine atotcuprinzatoare asupra tematicii abordate de lucrare, putem concluziona că, având la bază anumite tehnologii, în anumite condiții, compozitul Si3N4 – biosticlă deține proprietățile necesare (prezentate în partea teoretică și demonstrate în partea practică a lucrării) utilizării ca implant intervertebral de fuziune.

Totuși, în utilizarea clinică, există posibilitatea eșecului implantului, fie din cauza unei manipulări neadecvate în timpul procedurii de implantare, fie din cauza unei sterilizări precare.

8. Bibliografie

[1] http://www.sfatulmedicului.ro/Osteoporoza/complicatiile-osteoporozei-fracturile-vertebrale_6007;

[2] http://www.prostemcell.org/leziuni-ale-coloanei-vertebrale/traumatismele-coloanei-vertebrale.html;

[4] Františka Frajkorová, Katarína Bodišová, Martin Boháč, Eva Bartoníčková, Jaroslav Sedláček, Preparation and characterisation of porous composite biomaterials based on silicon nitride and bioglass, Ceramics International, Volume 41, Issue 8, September 2015, Pages 9770-9778, ISSN 0272-88425;

[5] Berroth K, Prescher T. Development and industrial application of silicon nitride based ceramics. Key Eng Mater 2005;

[6] Roberto Arce, F.M. Stábile, S.Y. Martinez Stagnaro, J. Ortiga, C. Volzone, International Congress of Science and Technology of Metallurgy and Materials, SAM – CONAMET 2014 Production of Porous Scaffolds from Bioglass 45S5-derived Glasses, Procedia Materials Science, Volume 9, 2015, Pages 558-562, ISSN 2211-8128;

[7] M. Amaral, M.A. Lopes, R.F. Silva, J.D. Santos, Densification route and mechanical properties of Si3N4–bioglass biocomposites, Biomaterials, Volume 23, Issue 3, February 2002, Pages 857-862, ISSN 0142-9612 ;

[8] Yongsheng Liu, Laifei Cheng, Litong Zhang, Yongdong Xu, Yi Liu, Design, preparation, and structure of particle preforms for Si3N4(p)/Si3N4 radome composites prepared using chemical vapor infiltration process, Journal of University of Science and Technology Beijing, Mineral, Metallurgy, Material, Volume 15, Issue 1, 2008, Pages 62-66, ISSN 1005-8850;

[9] Ayse Kalemtas, Gulsum Topates, Hüseyin Özcoban, Hasan Mandal, Ferhat Kara, Rolf Janssen, Mechanical characterization of highly porous β-Si3N4 ceramics fabricated via partial sintering & starch addition, Journal of the European Ceramic Society, Volume 33, Issue 9, August 2013, Pages 1507-1515, ISSN 0955-2219;

[10] Kang, Chang Gyu, et al. "Mechanical Properties of Si3N4 Ceramics Prepared by Nitrided Pressureless Sintered (NPS) Process." Solid State Phenomena. Vol. 124. Trans Tech Publications, 2007;

[11] B.S. Bal, M.N. Rahaman, Orthopedic applications of silicon nitride ceramics, Acta Biomaterialia, Volume 8, Issue 8, August 2012, Pages 2889-2898, ISSN 1742-7061;

[12] Neumann, A., Reske, T., Held, M., Jahnke, K., Ragoß, C., Maier, H. R., Comparative investigation of the biocompatibility of various silicon nitride ceramic qualities in vitro, Journal of Materials Science: Materials in Medicine, Volume 15, Issue 10, 2004, Pages 1135-1140, ISSN 1573-4838;

[13] C.C. Guedes e Silva, B. König Jr., M.J. Carbonari, M. Yoshimoto, S. Allegrini Jr., J.C. Bressiani, Bone growth around silicon nitride implants—An evaluation by scanning electron microscopy, Materials Characterization, Volume 59, Issue 9, September 2008, Pages 1339-1341, ISSN 1044-5803;

[14] Laura Floroian, Mihaela Badea, Iosif Șamotă, Bioglass – the newest type of biomaterial with great potential of osteointegration, Universitatea „Transilvania” din Brașov, 2015;

[15] Oana Bretcanu, Xanthippi Chatzistavrou, Konstantinos Paraskevopoulos, Reinhard Conradt, Ian Thompson, Aldo R. Boccaccini, Sintering and crystallisation of 45S5 Bioglass® powder, Journal of the European Ceramic Society, Volume 29, Issue 16, 15 December 2009, Pages 3299-3306, ISSN 0955-2219;

[16] Hench, Larry L, Bioglass: 10 milestones from concept to commerce, Journal of Non-Crystalline Solids, Issue 432, 2016, ISSN 0022-3093;

[17] Qi-Zhi Chen, George A. Thouas, Fabrication and characterization of sol–gel derived 45S5 Bioglass®–ceramic scaffolds, Acta Biomaterialia, Volume 7, Issue 10, October 2011, Pages 3616-3626, ISSN 1742-7061;

[18] Roberto Arce, F.M. Stábile, S.Y. Martinez Stagnaro, J. Ortiga, C. Volzone, International Congress of Science and Technology of Metallurgy and Materials, SAM – CONAMET 2014Production of Porous Scaffolds from Bioglass 45S5-derived Glasses, Procedia Materials Science, Volume 9, 2015, Pages 558-562, ISSN 2211-8128;

[19] Q.Z. Chen, J.L. Xu, L.G. Yu, X.Y. Fang, K.A. Khor, Spark plasma sintering of sol–gel derived 45S5 Bioglass®-ceramics: Mechanical properties and biocompatibility evaluation, Materials Science and Engineering: C, Volume 32, Issue 3, 1 April 2012, Pages 494-502, ISSN 0928-4931;

[20] M. Amarala, M.A. Costab, M.A. Lopesc,d, R.F. Silvaa, J.D. Santosc,d, M.H. Fernandese, Si3N4-bioglass composites stimulate the proliferationof MG63 osteoblast-like cells and support the osteogenic differentiation of humanbon e marrow cells, 21 June 2002;

[21] Constanța Sava, Suport curs 1- Analiza termică, „Chimie Analitică. Analiza Instrumentală”;

[22] Anca Iulia Popescu, Cercetări experimentare pe ceramică „Ivoclar IPS InLine“, Universitatea „Titu Maiorescu“, București,(2010);

[23] Ștefan Marin Iordache, Biosenzori pe bază de nanostructuri carbonice funcționalizate.Aplicații, Facultatea de Fizică – Universitatea din București, (2011);

[24] http://www.impactanalytical.com/techniques/tgaTech.aspx ;

[25] Radu A. Cârcel, Fotocatalizatori oxidici pentru epurarea apelor uzate din industria textilă, Universitatea Transilvania din Brașov, (2011);

[26] Y.C. Zhang, H.Y. Wu, M.C. Zhu, E.Q. Wang, D.X. Li, Advanced Materials Research 266 (2011);

[27] Chang, A., et al., Spark Plasma Sintering of Negative Temperature Coefficient Thermistor Ceramics. 2015.