Complecși Supramoleculari Ai Calixarenelor cu Compusi Bologici

INTRODUCERE

Lucrarea de doctorat având ca tematică COMPLECȘI SUPRAMOLECULARI AI CALIXARENELOR CU COMPUȘI BIOLOGICI este structurată în două părți:

– partea teoretică care cuprinde trei capitole principale în care se face o trecere în revistă a principalelor elemente, decurse din literatura de specialitate din țară și strănătate, legate de problematica abordată.

Primul capitol este dedicat prezentării sintetice a chimiei supramoleculare – recunoașterea compușilor chimici și biologici cu receptori macrociclici, a interacțiilor specifice chimiei supramoleculare cât și a metodelor de caracterizare a complecșilor gazdă-oaspete formați între receptori macrociclici și compușii biologici.

Cel de-al doilea capitol abordează problematica specifică calix[n]arenelor utilizate în procesele de separare ale compușilor chimici biologici insistându-se asupra calix[n]arenelor derivatizate utilizate în extracția cu solvenți, respectiv structura și nomenclatura calix[n]arenelor, tipuri de calix[n]arene, complexarea calixarenelor cu diferiți compuși (anioni, cationi, compuși biologici), utilizarea calix[n]arenelor în chimia analitică. Sunt trecute în acest sens în revistă calixarenele adoptate în procesul de extracție și cel de transport prin membrane, calixarenele utilizate ca receptori ion-selectivi, cele folosite în cromatografia de lichide sau în electroforeza capilară.

Capitolul trei se referă la compușii biologici extractibili cu receptori macrociclici (clasificarea acestora, stereochimica proprie, proprietățile electrochimice, punctul izoelectric, reacții chimice ale aminoacizilor).

CHIMIE SUPRAMOLECULARĂ – ASPECTE GENERALE PRIVIND RECUNOAȘTEREA COMPUȘILOR CHIMICI ȘI BIOLOGICI CU RECEPTORI MACROCICLICI

Chimie supramoleculară

După cum se știe, chimia moleculară are la bază studiul moleculelor, în timp ce chimia supramoleculară se bazează pe studiul speciilor supramoleculare, denumite „receptor molecular” și „substrat” (fig.1.1.). Așa cum asamblarea atomilor prin legături covalente constituie obiectul chimiei moleculare, asamblarea moleculelor prin legături necovalente constituie domeniul chimiei supramoleculare. (carte C. Luca pag 54)

Supramolecula reprezintă un ansamblu rezultat din unirea a două subansamble: receptor molecular și substrat molecular.

Receptorul molecular are capacitatea de a fixa substratul într-un centru structuro-funcțional, denumit centru de fixare. Moleculele receptoare trebuie să prezinte o dimensiune, formă și arhitectură moleculara complementară cu substraturile

Substratul molecular este fixat de către receptor prin intermediul unui centru structuro-funcțional propriu, denumit centru de prindere. Substratul poate fi reprezentat de cationi, anioni, molecule organice neutre sau chiar gazde,

Recunoașterea moleculară necesită ca receptorul și substratul să se afle în contact pe o zonă de suprafață mare. Receptorii moleculari conțin cavități intramoleculare de dimensiuni mari, permițând astfel incluziunea substratului sau cel puțin incluziunea centrului de prindere al substratului.

Fig. 1.1. Relația dintre chimia moleculară și cea supramoleculară

Chimia supramoleculară s-a dezvoltat în ultima perioadă ca un câmp stiințific ce cuprinde elemente de chimie, fizică și biologie. Conceptul de chimie supramoleculară a fost introdus în 1978 de către Lehn.(1 referat 2008) Această parte a chimie a fost denumită ca fiind „chimia dincolo de molecule” ce se bazează pe entități organizate de o complexitate foarte mare, ce rezultă din asocierea a două sau mai multor specii chimice unite prin forțe intermoleculare. (2 referat 2008)

Chimia supramoleculară stabilește principiile manipulării corecte a caracteristicilor energetice și stereochimice ale forțelor necovalente intermoleculare ca: interacții electrostatice; legături de hidrogen; forțe van der Waals etc, toate acestea în interiorul unei arhitecturi moleculare bine definite (carte C. Luca).

Înainte de descoperirea accidentala a eterilor corană de către Pedersen, cuvântul “supramoleculă” nu era foarte utilizat, dar cu timpul, alături de ciclodextrine, (4 referat 2008) eterii coroană au fost introduși ca un alt exemplu de interacții gazdă – oaspete. După o serie de cercetări au fost descoperite și calixarenele, ele devenind a III-a generație de supramolecule. Toate aceste trei clase de compuși există sub denumirea de supramolecule. Deoarece încă nu există o delimitare între oaspete-gazdă și supramolecule, nu este posibil ca de fiecare dată să se realizeze o diferențiere între acestea două.

Chimia supramoleculară prezintă o serie de aplicații:

Un receptor molecular dotat cu grupări lipofile care îl fac solubil într-un solvent organic (sau un sistem membranar), poate juca rolul de trasportor selectiv sau specific al unui substrat pe care îl recunoaște.

Receptorii moleculari care formează cu substratul o supramoleculă cu sarcină pozitivă iși pot asocia în procesul de extracție un anion cu care formează o pereche de ioni. Transportul unui astfel de anion într-o fază organică, în care aceasta devine foarte reactiv ca urmare a pierderii sferei de hidratare, a condus la o extindere a catalizei prin transport interfazic. (carte C. Luca).

În ultimii ani chimia supramoleculară prezintă o extindere a aplicațiilor prin relizarea unor noi metode de analiză în diverse domenii: cromatografie prin faze staționare cu structuri macrociclice, separarea prin extracția cu solvenți și prin membrane utilizând transportori macrociclici, electroanaliză prin realizarea de senzori și microsenzori electrochimici.

Recunoașterea moleculară

Studiul fenomenelor de recunoaștere a receptorilor moleculari față de un substrat a început odată cu dezvoltarea chimiei coordinative a cationilor alcalini, ca urmare a descoperirii că o serie de compuși naturali cu structură macrociclică din clasa antibioticelor (valinomicina, monactina, nonactina etc) complexează diferențiat anionii acestor metale.(carte C. Luca pag 61)

Designul supramoleculelor include două procese principale – recunoașterea moleculară și autoasamblarea. Recunoașterea moleculară este un proces în care unele molecule gazdă (sau receptoare) formează selectiv legături cu alte molecule (oaspete sau substrat) rezultând un sistem bine structurat prin forțe intermoleculare. Crearea de noi receptori moleculari reprezintă una din principalele probleme ale chimiei organice.

În procesul de recunoaștere moleculară trebuie să existe o foarte bună corespondență între forma receptorului și substrat (E. Fisher, Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1894, 27, 2985)

Recunoașterea moleculară este de două tipuri:

Recunoaștere moleculară statică – bazată pe principiul fundamental lacăt-cheie în care există o reacție de complexare de tipul 1:1 între molecula gazdă și molecula oaspete pentru a forma complexul de tipul gazdă-oaspete.

Recunoaștere moleculară dinamică – în acest caz legarea primei molecule oaspete duce la modificări ale conformației ceea ce afectează constanta de asociere a celei de a doua molecule oaspete (fig. 1.2.)

Fig. 1.2. Recunoașterea moleculară statică și dinamică (en.wikipedia.org/wiki/Molecular_recognition)

Compușii macrociclici sunt caracterizati de o serie de legături, conexiuni, punți, care în cele mai multe cazuri conțin cavități intramoleculare pentru o serie de substraturi, astfel încât ei pot deveni favoriți ca și receptori. Din seria de compuși macrociclici, cei mai investigați sunt calixarenele si derivații săi, ciclodextrinele și eterii coroana (fig. 1.3) (5 referat 2008)

Fig. 1.3. Compuși macrociclici utilizati în recunoașterea moleculară

Interacțiile caracteristice chimiei supramoleculare

Există o serie de interacții ce pot avea loc între atomi și molecule, cum ar fi legăturile intermoleculare (atracții între două molecule) sau intramoleculare (legături ionice, covalente, legături ce se formează în interiorul unei molecule) (fig. 1.4.). Chimia supramoleculară este însă caracterizată de legături intermoleculare, slabe, de tipul legăturii de hidrogen, legătura van der Waals, interacții electrostatice (ion-ion, ion-dipol, dipol-dipol, dipol-dipol indus) toate acestea având loc în interiorul unei arhitecturi moleculare bine definite .

Fig. 1.4. Legături intra și intermoleculare

Aceste legături necovalente joacă un rol important și în procesele biologice. Astfel, aranjarea proteinelor într-o formă tridimensională, recunoasterea specifică a substratului de către enzimă și detecția semnalului moleculei, sunt caracterizate de forțe necovalente. Astfel fenomenul de recunoaștere moleculară chimică și biologică poate fi definit ca fiind chimia interacțiunilor slabe. Geometria, tăria și specificitatea acestor interacții sunt diferite. Aceste legături sunt puternic afectate de prezența apei.(carte L. Mutihac)

În chimia supramoleculară există o legătură între dimensiunea moleculei oaspete și interacțiile ce pot aparea. Astfel s-a observat ca numărul forțelor slabe crește cu cât structura moleculei oaspete devine mai complexă (tabelul 1.1). (Zoshihisa Inoue and Takehiko Wada Moelcular recognition in chemsitr- and biology as viewd from enthalpy-entropy compensatin effect: Global understanding of supramolecular interactins Advance in Supramolecular Chemistry, vol.4, pag. 55-96)

Tabel 1.1. Tipuri de interacții în chimia supramoleculară

Legatura prin forțe Van der Waals

Denumirea de forțe/interacții van der Waals provine de la numele cercetătorului olandez Johannes Diderik van der Waals, reprezentând suma forțelor de atracție sau de respingere dintre molecule nepolare (sau dintre porțiuni ale aceleiași molecule). Aceste interacții depind de dimensiunea și forma moleculelor covalente. Există trei tipuri de interacții:

Forțe dipol-dipol (forțe Keesom) – Acest tip de forțe apar în moleculele polare care posedă un moment magnetic permanent. Ele cresc cu creșterea polarității moleculei și scad foarte repede cu distanța. (fig. 1.4)

Forțe dipol – dipol indus (forțe Debye) – Forțele de inducție se manifestă între molecule nepolare și molecule polare. Moleculele nepolare, în prezența unui câmp electric vor suporta deformarea învelisului, transformându-se în dipoli induși.
Între aceștia și moleculele polare partenere vor apărea forțe electrostatice de tip dipol-dipol indus. Acestea sunt interacțiuni mai slabe decât cele de tip dipol-dipol.

Forțe dipol indus-dipol indus (Forțe de dispersie London)- apar atunci când moleculele neutre sunt supuse interacțiunii cu un câmp electric. Prezența câmpului are ca efect o deplasare a electronilor către polul pozitiv și a nucleului către cel negativ. Această deplasare în interiorul moleculei are ca efect crearea unui dipol care se numeste dipol indus. Aceste forțe sunt mai slabe decât interacțiile dipol-dipol, scad cu distanța manifestându-se numai între moleculele apropiate, dar cresc cu creșterea masei moleculare.

Legăturile van der Waals sunt caracteristice și compușilor biologici, ele se formeză între resturile hidrocarbonate ale aminoacizilor. Aceste interacțiuni sunt date, în principal, de resturile de alanină, fenilalanina, leucina, valina, izoleucina etc. Majoritatea radicalilor nepolari, hidrofobi ai acestor aminoacizi se orientează spre interiorul moleculei asigurând stabilitatea structurii acestora. Radicalii polari, ionizați, ai unor aminoacizi (în primul rând cei de arginină, lizină, acid aspartic și acid glutamic) sunt orientați spre exteriorul moleculei proteice unde interactionează cu dipolii apei din mediu (structura proteinelor ref II).

Legătura de hidrogen

Legătura de hidrogen este o interacțiune implicând un atom de hidrogen situat între o pereche de alți atomi, având o înaltă afinitate pentru electroni. Legăturile de hidrogen pot exista între atomi din molecule diferite sau făcând parte din aceeași moleculă.

Condiția formării unei legături de hidrogen puternice este ca legătura H-X să fie puternic polară, iar acest aspect se realizează dacă elementul X este F,O,N.

Legătura de hidrogen este mai puternică (4.5kcal/M) decât forțele van der Waals dar, de 10 ori mai slabă decât legătura covalentă sau ionică. În tabelul 1.2. sunt prezentate câteva exemple de legături de hidrogen. (carte L. Mutihac)

Tabel 1.2. Legătura de hidrogen (carte L. Mutihac)

Legăturile de hidrogen dintre bazele ce conțin azot, din nucleotidele de pe cele două lanțuri de ADN (guanine cu citozine, adenine cu timine – fig. 1.5.) dau naștere structurii dublu-elicoidale, care e crucială pentru transmiterea informațiilor genetice.

Fig. 1.5. Exemple de legături de hidrogen ale compușilor biologici

Structura secundară a proteinelor (fig. 1.6) este determinată de apariția legăturilor de hidrogen cu participarea legăturilor amidice din peptide. Conformațiile cu număr maxim de legături de hidrogen sunt cele mai stabile (plisata). Acest tip de structura se întâlnește în cazul proteinelor fibroase și globulare (cele globulare fiind mai încrețite în timp ce proteinele fibroase sunt alungite).

Fig. 1.6. Structura α-helix a proteinei cu legături de hidrogen (http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_structure)

Interacția hidrofobă

Efectele hidrofobe se bazează pe tendința moleculelor nepolare de a se auto-asocia în apă în loc de a se dizova în mod individual (fig. 1.7.). Interacțiunea hidrofobă este în principal un eefct entropic rezultat din ruperea printr-o dinamică ridicată a legăturilor de hidorgen dintre moleculele apei prin soluția nepolară. Silverstein, T. P. (1998). "The Real Reason Why Oil and Water Don't Mix". Journal of Chemical Education 75: 116–346. doi:10.1021/ed075p116. http://facstaff.unca.edu/jschmelt/oilwater.pdf. Retrieved 09 December 2011.  e

Fig. 1.7. Efecte hidrofobe – secțiunea unei molecule de mioglobină (http://www.chembio.uoguelph.ca/educmat/phy456/protstr3.htm)chembio.uoguelph.cachembio.uoguelph.ca

Spre deosebire de legătura de hidrogen și forțele van der Waals care se referă la factorii entalpici, efectele hidrofobe se referă la factorii entropici. (carte L. Mutihac).

Interacțiile hidrofobe prezintă aplicații în diverse domenii, inclusiv în chimia poceselor in vivo. La nivel molecular, aceste atracții hidrofobe stau la baza structurii proteinelor, legarea unui substrat de enzimă, și formarea de membrane care definesc limitele celulelor și compartimentele lor interne. (carte L. Mutihac).

Efectele hidrofobe pot fi utilizate în biochimie pentru a separa un amestec de proteine pe baza hidrofobicității lor, dar și în separările cromatografice prin utilizarea unei faze staționare hidrofobă.

1.3.4. Interacția cation – π

Interacțiile de tip cation – π (fig. 1.8.), au devenit cunoscute în ultima decada. In anii 80’ s-a demonstrat ca ele sunt foarte importante în formarea receptorilor artificiali de tip ciclofan dar și în procesele de recunoaștere moleculară (complexarea calixarenelor cu cationi). În figura 1.8. sunt reprezentate interacțiuni cation – π arătând momentul quadrupol al unui ciclu aroamtic și interacțiunea dintre norul parțial negativ și un cation.

Tăria interacției de tip cation – π depinde de:

tipul de cation organic

conformația și dimensiunea cavității macromoleculei

substituenții calixarenei din partea de jos și sus a ciclului ce pot influența dimensiunea cavității, conformația și flexibilitatea moleculei gazdă

solventul și tipul de anion. (W. Abraham Iclusion of Organic Cations by calix(n)arene Journa of Inclusion Phenomena and Macroczclic Cgemistrz 43: 159-174, 2002

Fig. 1.8. Interacții de tip cation- π

1.3.5. Interacția – stacking

Forțele de atracție de 0-50 kJ mol-1pot fi atribuite legăturilor stacking ale cilcurilor aromatice. Prezența momentului quadrupolului descris anterios permite formarea de interacțiuni electrostatice de atracție dintre regiunile ciclurilor în regiuni încărcate diferit. Există orientări de tip “capăt – față”, “față în față”, cât și geometrii inetrmediare, dar configurația de tip “față în față” nu corespunde niciodată la o suprapunere directă care ar da forțe de repulsie. J. E. Barbara – Analysis of self – assembling complexes via supramolecular maa spectrometry

1.4. Liganzi macrociclici utilizați în procesele de complexare și separare a compușilor chimici și biologici

1.4.1. Calix[n]arenele

1.4.1.1. Considerații generale

Numele de calix[n]arene a fost stabilit de C.D.Gutsche care a observat o asemănare între forma acestui compus și un vas grecesc (fig.1.9) cunoscut sub denumirea de “calix”.

Calixarenele sunt [1n] metaciclofani care derivă din condensarea fenolilor și formaldehidelor în diferite condiții. Ei se studiază de mulți ani, dar deabia acum s-a stabilit exact structura lor atât în stare solidă cât și în soluție.

Fig.1.9. Asemănarea dintre calixarene și vasul grecesc denumit crater

Datorită cavității performante cât și a formei pe care o reprezintă (crater) calixarenele pot acționa ca moleculă gazdă.

1.4.1.2. Structura și nomenclatura calixarenelor

În ceea ce privește structura calixarenelor acestea se împart în două mari clase:

Derivați ciclooligomeri ai fenolilor

Derivați ciclooligomeri ai resorcinolului care se mai numesc resorcinarene, resorcarene, resorcin[4]arene.

S-au observat două regiuni importante în cazul calixarenelor: grupările –OH și poziția –para ale ciclului aromatic, care au fost denumite “lower rim” și “upper rim”, respective partea de jos și partea de sus a macrociclului (fig. 1.10)

.

Fig. 1.10. Conformația con a calix[4]arenei (G. McMahon, S.O’Malley, K. Nolan Important calixarene derivatives – their sznthesis and applications. ARKIVOC 2003 (vii) 23-31.)

În afară de nomenclatură, mai există și alte 2 diferențieri între cele 2 clase ale calixarenelor:

Prima se referă la sinteză, iar a doua

Orientarea grupărilor față de macrociclu.

În cazul în care calix[n]arenele se obțin în urma condensării catalitice dintre p-alchilfenoli și formaldehide, iar grupările OH sunt orientate în interiorul macrociclului, sunt denumite endo-OH calixarene iar în cazul în care calixresorc[4]arenele sunt obținute în urma condensării catalitice acide dintre resorcinol și aldehide sunt denumite exo – OH calixarene datorită orientării grupărilor departe de centru.

Calixarenele obținute din grupări fenolice și metilenice prezintă mulți izomeri conformaționali datorită celor două posibilități de rotație a unității fenolice: rotatia oxigenului prin inel și rotația para-substituentului prin inel.

În ultimii 10 ani, o serie de publicații au prezentat conformațiile calixarenelor, accentul fiind pus pe calix(4)arena, ea fiind caracterizată de 4 conformații diferite. Cele 4 cicluri aromatice se pot rota în jurul grupării metilen, astfel încât se formează trei structuri conformaționale diferite. În cazul în care toate cele patru cicluri formează același unghi cu axa, perpendicular pe centru planului C2-C8-C14-C20, se formează confomația con cu simetrie C4. Dacă unul dintre cicluri se înclină, structura va deveni con parțial. Dacă două cicluri vecine se înclină structura obținută este de tipul 1,2 alt cu simetrie C2h. Ultima posibilitate este conformația în care două cicluri aromatice opuse se înclină, cu 1,3 alt având simetrie D2d.

Gutsche a denumit cele 4 conformații posibile (fig.1.11.) pentru calix[4]arena: Con (u,u,u,u); Con parțial (u,u,u,d); alternant 1,2, (u,u,d,d); alternant 1,3 (u,d,u,d).

Fig. 1.11. Conformațiile calix(4)arenei (http://www.helsinki.fi/polymeerikemia/research/calix4arenes.html)

1.4.1.3. Clasificarea calix[n]arenelor

Cele mai cunoscute calixarenele sunt cele cu n = 4, 6, 8, unități. Calixarenele care au valori impare ale lui n sau cu valori ale lui n mai mari decât 8 sunt destul de rare și sunt dificil de separat.

Cele mai cunoscute calixarenele sunt cele tetramere – calix[4]arene sunt tetrameri ciclici care se obțin din grupări fenolice si aldehidice. Una din cele mai importante trăsături ale calix[4]arenei este structura ei asemanatoare unei cupe, care poate fi observată atât în stare solidă cât și în stare lichidă.

Calix[5]arena, datorită dificultăților întâlnite atât în procesul lor de sinteză, cât și în cazul derivatizării selective, nu există foarte multe publicații ce prezintă elemente legate de calix(5)arena. Au fost preparați mai mulți derivați ai calix[5]arenelor care au funcții ca eteri coroană sau esteri, și se cunoaște faptul că acești compuși au o afinitate puternică față de ionii metalelor alcaline.

Calix[6]arenele prezintă o cavitate mai mare decât calix[4]arenele, fiind astfel mai potrivite pentru recunoașterea moleculară. S-a observat totuși, că utilizarea caIix[6]arenelor drept gazde specifice pentru recunoașterea moleculară nu este o soluție foarte bună datorită marii libertăți conformaționale. În cazul calix[6]arenelor grupările aril nu sunt chiar perpendiculare ele având o inclinare de 450 sau mai mult, astfel, Gutsche a adaugat litera “o” (exterior) și ‘i” (interior), astfel încât nomenclatura “up/down” s-a extins la sisteme mai complexe.

Calix[6]arenele poseda 8 posibili izomeri conformaționali: con, conpartial, alternant – 1,2; alternant – 1,3; alternant – 1,4; alternant – 1,2,3; alternant – 1,2,4 si alternant – 1,3,5 prezentați în figura 1.12.

Bott și colaboratorii (8 referat 3) au demonstrat faptul că în stare solidă conformația calix[6]arenelor este strâns legată de solventul din care este cristalizat compusul.

De exemplu în cazul în care solventul (benzen) nu formează legături de hidrogen cu gupările OH ale calixarenei, rezultatul este con turtit (uo,u,uo,uo,u,uo) în care toate grupările OH sunt legate intramolecular prin intermediul hidrogenului, iar în cazul în care solventul (acetona) poate distruge legăturile de hidrogen intramoleculare, calixarena adoptă o conformație alternant – 1,2,3 deformată (u,u,uo,d,d,do)

Calixarene heptamere – o structură determinată cu raze – X a 7 t-Bu arată faptul că molecula adoptă o conformație turtită (u,u,uo,u,u,u,uo) așa cum se poate observa și din figura 1.13. Pe de altă parte, o structură a 7Et arată o conformație mai puțin stabilă calculată la 5,4 kcal / mol, în care două dintre resturile fenolice sunt inversate, drept consecință a influențelor cumulate ale para substituentului și a forțelor de împachetare a cristalului.

Fig.1.13. Structura cristalografică determinată cu raze – X pentru: a) p-terț-butilcalix[7]arena – cristalizată cu două molecule de piridină L și M: b) p-terț-butilcali[8]arena – cristalizată cu opt molecule de piridină

Calixarene octamere – extinzând conceptul de cooperativitate și multivalență la complexarea ionului metalic, au fost sintetizate o serie de amide ale calix[8]arenelor, (8 referat 3) (fig. 1.14.) ei fiind liganzi cationici foarte flexibili și capabili să rețină doi ioni de stronțiu, formând astfel o structură centrosimetrică.

Fig. 1.14. Calix8]arena (a) și (b) structura cristalină cu raze – X a complexului (1:2) p-metoxicalix[8]arena : Stronțiu (referat 3)

Acești liganzi prezintă o selectivitate ridicată Sr2+/Na+ în extracția lichid – lichid și în soluție omogenă de metanol, astfel încât ei pot fi utilizați pentru îndepărtarea ionului de stronțiu din deșeuri radioactive.

Calixarene funcționalizate – se formează prin atașarea în partea superioară și/sau inferioară a scheletului calixarenic a unor grupări funcționale (eteri, amide, cetone, esteri sau eteri coroană).

Prima p-terț-butilcalixă[4]arena derivatizată cu eter coroană a fost raportată in 1983, (articol calixazacrown I. Queslati) urmând o serie de alte cercetări privind sinteza și recunoașterea moleculară.

Calix-eter-coroană sunt molecule ce conțin un eter coroană în partea inferioară și uneori în partea superioară a scheletului calixarenic prin eterificarea grupărilor fenolice –OH.

Studiile privind aplicațiile acestor compuși s-au bazat în special pe proprietățile lor de complexare a metalelor alcaline, alcalino-pământoase dar și a cationilor metalelor tranziționale (Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+). De exemplu, s-a observat (Ghidini, E. Ugoyyoli.F, Ungaro, R., Harkema, S., El-Fadl, A., A.; Reinhoudt, D. N. J.Am. Chem. Soc. 1990, 112, 6979) o selectivitate mult mai mare (de 12,000) a calix [4]eter-coroană pentru K+(fold selectivity) decât pentru Na+, în timp ce calix[6]eter-coroană prezintă o selectivitate mult mai mare (33,000) pentru Cs+ decât pentru Na+. Această selectivitate mare a liganzilor de tip calix-eter-coroană este specifică conformației de tip con parțial. În cazul conformației de tip con selectivitatea acestor liganzi scade până la 100.

Calix-eter-coroană pot fi folosiți si pentru realizarea unor cipuri de proteină utilizate pentru testarea activității enzimelor, screeningul anticorpilor și interacțiilor de tip proteină-proteină (J. Kim. J. Vicens Progres of calixcrown chemistry). Aceste cipuri de proteină au avut un interes foarte mare datorită avantajelor în robotică, microelectronică și bioinformatică. Calixcoroanele s-au folosit la fabricarea cipurilor de proteină pentru determinarea activității enzimatice, screeningul de anticorpi și interacțiile proteină – proteină, proteină – ADN.

Ultimele cercetări (articol J. Vicens Calixcrown and related supramolecular systems) au fost concentrate asupra unui nou compus macrociclic – calix[4]aza-eter-coroană. El s-a obținut prin atașarea unor lanțuri NH-etilen la atomii de oxigen ai grupării fenolice prin intermediul unor grupări acetamido (fig. 1.15.)

Fig. 1.15. Structura calix[4]aza-eter-coroană (articol J. Vicens Calixcrown and related supramolecular systems)

I. Queslati și colab. a studiat proprietățile de extracție din apă în diclormetan și complexarea în acetonitril a calix-aza-etercoroană cu metalele alcaline și cationii metalelor tranziționale (Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+).

Dendrimerii sunt macromolecule monodispersate extrem de ramificate cu structură complexă. Datorită comportamentului unic, acest tip de macromolecule prezintă o serie de aplicații în domeniul biomedical și industrial.

Există unele studii legate de calixdendrimeri, (J. Kim. J. Vicens Progres of calixcrown chemistry) unii fiind construiți din calix-eter-coroană (fig. 1.16)

Fig. 1.16. Structura calixdendrimerului format din unități calix-eter-coroană (J. Kim. J. Vicens Progres of calixcrown chemistry)

Tiacalixarene – în ultimii 5 ani publicațiile au pus accentul pe o nouă clasă de calixarene – tiacalixarene A în care punțile metilen dintre fragmentele aormatice sunt înlocuite de atomi de sulf. (X = S, n = 4, 5,5). (9-10 referat 3) Legăturile C-S (1,77Å) (11) sunt mai lungi decât C-C (1,54 Å); (12 referat 3) astfel încât cavitatea calixarenelor devine mai mare; punțile de sulfură nu sunt doar centri adiționali pentru coordinare, ei fiind utilizați si pentru alte funcționalități.

În 1997, Kumagai (16 referat 3) a propus o procedură pentru sinteza p-terț-butil-tiacalix(4)arena II prin încălzirea la temperatura de 230 0C a unei mixturi de p-terț-butilfenol, sulf și hidroxid de sodiu , în tetraetilen glicol dimetil eter. Rezultatul obținut a fost de 54%. În urma reacției s-a obținut o mixtură complexă de sulf cu oligomerii fenolului și p-terț-butiltiacalix(5)arena și –(6)arena VII și VIII.

II, R = t-Bu, n=4; VII, R=t-Bu, n=5; VIII, R=t-Bu, n=6;

IX, R=Cme2CH2Cme2CH3, n=4. (referat 3)

1.4.1.4. Complexarea calixarenelor cu diverși compuși

În ceea ce privește complexarea calixarenelor, s-a observat existența unor diferențe fundamentale între anioni sau cationi, care trebuiesc luate în considerare [33 referat 1]:

Încarcarea electrică – aceasta este o diferență evidentă dar nu chiar atât de importantă, care afectează alegerea grupării funcționale (ex, amina poate lega cationi, în timp ce o amină protonată poate coordina anioni).

Dimensiunea – în general anionii sunt mai mari decât cationii izoelectronici (tabelul 1.3.). Cazurile în care anionii conțin mai mult decât un atom sunt destul de des întâlnite, ceea ce înseamna că dimensiunea legăturii pentru anioni trebuie sa fie mult mai mare decât cea pentru cationi.

Tabel 1.3. Comparația razelor ionice în stare solidă pentru diferite perechi cation/anion.

Geometria – Anionii spre deosebire de cationi care prezintă o geometrie sferică, sunt caracterizați de o varietate de geometrii (fig. 1.17.).

Fig. 1.17. Geometrii comune pentru anioni.

Dependența de pH – spre deosebire de cationi, anionii există numai pentru un domeniu limitat de pH (de ex. anionii carboxilat există numai pentru un pH mai mare de 5 sau 6)

Solvatarea – gradul de solvatare al anionilor are un efect puternic asupra interacțiilor, astfel încât solventul poate avea un efect negativ asupra puterii și selectivității legăturii.

Tipul de legatură – pentru legarea anionilor s-au dezvoltat diferite strategii care includ:

Legătura de hidrogen: anionii interacționeaza cu compuși polari H – X (X = N, O, S etc.) pentru a forma legătura de hidrogen. Astfel aminele, amidele, alcooli și tiolii pot acționa ca anioni potențiali de legătură, fiind utilizați în acest sens.

Atracția electrostatică: o metodă des întâlnită este cea în care are loc o atracție între un anion și o grupare schimbătoare pozitivă. Există și alte metode de includere a schimbării în legătură: amine protonate sau amine quaternare.

Acizii Lewis: un electron incomplet sau centrul acidului Lewis sunt folosiți pentru a atrage un anion bogat în electroni.

A )Complexarea calixarenelor cu anionii și cationi

Calix[4]pirolii sunt înrudiți cu calix[4]arenele. Denumirea originală este octaalchilporfirina, ei sunt macrociclii tetrapirolici, legați în poziția prin carbon hibridizat sp3. Acești macrocicli au fost descoperiți de către Baeyer acum 100 de ani (1) [34 referat 1]. De atunci au fost sintetizați și alți octaalchilporfirine .

Una dintre cele mai importante trăsături ale calixarenelor (în special calix[4]arena – fig. 1.18) este cea legată de faptul că proprietățile de complexare cu ioni metalici nu depind numai de natura grupării de legătura atașată la platforma, ci și de aranjamentul stereochimic, care este determinat de conformația calixarenelor. Este cunoscut faptul că prin introducerea în partea de jos a ciclului calix[4]arenei (1: n = 4) a unei grupari alchil, duce la oprirea procesului de inversiune a ciclului, formându-se astfel 4 stereoizomeri diferiti (con, partial con, alternant 1,3 și alternant 1,2) [36 referat 1].

Fig. 1.18 Structura calixarenei

Complexarea calixarenelor cu compuși biologici

Recunoașterea selectivă a substratelor organice de interes biologic, cum sunt zaharul sau aminoacizii, de către receptorii sintetici este un subiect de maxim interes în chimia supramoleculară și bioorganică. [47 referat 1] Datorită importanței majore, recunoașterea aminoacizilor în formă cationică, amfionică sau aniionică, incluzând recunoașterea chiralității lor de diferite grupe de receptori macrociclici sintetici, a fost prezentată în multe studii. Deoarece majoritatea proceselor biologice au loc în apă, studiile asupra lor sunt efectuate tot în apă. În ultimii ani, calixarenele solubile [48-52 referat 1] în apă au fost folosite pentru incluziunea diferitelor specii de oaspeți încărcați sau nu electric, însă despre complexarea receptorilor sintetici cu aminoacizi în soluții apoase au fost publicate foarte puține articole [53 referat 1]

O varietate de receptori sintetici a fost imaginată și studiată din punct de vedere al tăriei legăturii și selectivității față de diferiți aminoacizi. Legarea aminoacidului de acești receptori se bazează pe formarea legăturilor de hidrogen combinate cu atracții electrostatice. Studiile privitoare la structura și aspectele termodinamice ale interacției dintre receptori macrociclici și componenta biologică sunt folosite pentru analiza sistemelor biochimice.

S-a studiat complexarea unor aminoacizi și peptide de către p-sulfonatocalix[4]arena și hexasodiu p-sulfonatocalix[6]arena în soluție apoasă [54 referat 1]. Complexarea aminoacizilor și a peptidelor cu calixarene solubile în apă, în soluții apoase, este favorizată de contribuțiile entalpice și defavorizată de contribuțiile entropice.

P-sufonatocalix[n]arenele (n = 4, 6, 8) solubile în apă sintetizate de Shinkai și Ungaro sunt capabile să recunoscă compuși de interes biologic în soluții apoase. Proprietățile de complexare ale calixarenelor solubile în apă, față de ionii organici, aminoacizi, molecule organice neutre cum ar fi alcooli, cetone, în soluții apoase au fost investigate prin spectrometria 1H RMN, colorimetric și prin titrări microcolorimetrice. Rezultatele obținute arată faptul că capabilitățile de incluziune ale gazdelor investigate sunt corelate cu proprietățile lor conformaționale. Studiile au arătat că p-sulfonatocalix4]arena este capabilă să complexeze amino acizi, prin introducerea grupării aromatice sau alifatice în cavitatea calixarenei. Cu ajutorul spectrometriei 1H RMN, s-a observat că prin complexarea argininei sau lisinei de către p-sulfonatocalix[4]arena în apă, se formează un complex 1:1. În urma experimentelor efectuate prin HPLC și 1H RMN, privind complexarea p – solfonatocalix[4]arena cu diferiți amoniacizi, s-a constatat apariția unor diverse interacții hidrofobe, perechi de ioni, aromatic-aromatic și electrostatice, între acești amino acizi studiați și p-sufonatocalix[4]arena.

În urma cercetărilor s-a constatat că spre deosebire de complecși formați între amino acizi și calixarene solubile în apă (fig. 1.19.), complexarea peptidelor cu anumiți liganzi este favorizată de contribuțiile entalpice.

Fig. 1.19. Structura chimică a calixarenelor solubile în apă:

(a) p- sulfonatocalix[4]arena, (b) hexasodiu p-sulfonatocalix[6]arena.

1.4.2. Ciclodextrinele

1.4.2.1. Considerații generale

Ciclodextrinele (CDs), sau cicloamilozele, sunt cicluri mari de molecule, care conțin minim 6 unități D-glucopiranozice unite prin legături – 1,4. [77 referat 1]

Ele au fost descoperite în 1891 de către Villers [78 referat 1], iar prepararea și izolarea lor a fost studiată de catre Schardinger in 1900 – 10. [79 referat 1], astfel încât ele au fost numite și dextrinele lui Schardinger.

Ciclodextrinele au diferite dimensiuni, în general conținând 6, 7, 8 unități de glucoză, fiind denumite (6) -, (7) – si (8) -, ciclodextrine. Există și ciclodextrine ce conțin mai mult de 8 unități de glucoză.

Structura ciclodextrinelor a fost studiată cu ajutorul razelor X, a spectrometriei 1H RMN și 13C RMN cât și cu ajutorul spectrometriei IR . Ciclodextrinele au o serie de proprietăți unice datorită naturii ciclului. Una dintre ele se referă la proprietățile de incluziune ale cavității ciclodextrinei [80 referat 1], iar cea de-a doua la capacitatea ciclodextrinelor de a fi utilizate ca molecule gazdă pentru componenții “oaspeți “ mici , ele fiind și modele pentru proteine.

1.4.2.2. Structura ciclodextrinelor

Ciclodextrinele sunt obținute biotehnologic prin degradarea enzimatică a amidonului și anume prin acțiunea “Bacillus macerans” asupra amidonului. [79 referat 1]. În general se obține un amestec de -, – si CD sau chiar CD mai mari. Structura -, – si CD se poate observa în figura 1.20.

Fig. 1.20. Structurile -, – si CD

Fiecare ciclodextrină a fost izolată prin cristalizare fragmentată, folosind compuși gazdă specifici. De exemplu, – CD, se poate obține prin cristalizare cu ciclohexan, – CD se obține utilizând fluorobenzen și – CD se obține utilizând antracen. În ceea ce privesc ciclodextrinele care au un grad mare de polimerizare, cum ar fi – CD, au fost determinate cu ajutorul structurii cristaline a razelor – X. [81 referat 1]

1.4.2.3. Proprietățile ciclodextrinelor

Ca o consecință a structurii, ciclodextrinele sunt caracterizate de proprietăți fizice și chimice specifice. Unele dintre cele mai importante proprietăți fizice sunt prezentate în tabelul 1.4.

Tabel 1.4. Proprietățile fizice și dimensiunea moleculară a ciclodextrinelor.

1.4.2.4. Complexarea ciclodextrinelor

Datorită caracterului apolar al cavității în comparație cu caracterul polar al exteriorului, ciclodextrinele au capacitatea de a forma compuși de incluziune cu molecule gazdă hidrofobe în soluții apoase, predominant datorită interacțiilor hidrofobe.

O condiție esențială care trebuie îndeplinită pentru a se forma acești compuși de incluziune este aceea că moleculele gazdă trebuie să se încadreze în interiorul cavității, chiar și numai parțial. Moleculele mici formează de obicei compuși de incluziune 1:1. În acest caz, un ciclu al ciclodextrinei include o moleculă. Se poate întâmpla ca gazda să fie inclusă parțial de o ciclodextrină. Acest lucru se întamplă când trebuie incluse molecule mai mari decât cavitatea.

Formarea complexului în soluție este un proces de echilibru:

Unde: CD = ciclodextrina

G = molecula gazdă

CD – G = complexul de incluziune

1.4.3. Eterii coroană și criptanzii

1.4.3.1. Considerații generale

Eterii coroană sunt oligoeteri sintetici cu molecule de tipul (-CH2 – CH2 – O -)n , cu n 2, denumiți astfel datorită structurii lor spațiale, care seamană cu o coroană

Sintetizați de către Pedersen (fig. 1.21), [185 referat 1] primii eteri coroana au fost compușii denumiți simplu [18]-coroana-6 și respectiv, dibenzo-[18]-coroana-6.

Fig. 1.21. Sinteza eterilor coroană

Jean – Marie Lehn [186 referat 1], a preparat eteri coroana care au al treilea lanț legat de capătul opus al macrociclului. Acești compuși pot reține cationi, formând complecși foarte stabili. Lehn a sugerat numele de criptand din limba grecească k, care înseamnă “a ascunde”. Când cationul este complet ascuns în interiorul cavității criptandului, complexul se numeste criptat.

Cram a studiat sferanzii, care sunt caracterizați printr-o structură mai complicată decât cea a eterilor coroană și a criptanzilor. Ca și în cazul criptanzilor, complecșii sferanzilor se numesc sferați.

Structura și nomenclatura eterilor coroana

Eterii coroana sunt caracterizați de unități –CH2CH2O- sau etilenoxi, ce se repetă. Cel mai mic sistem molecular este dioxanul, care conține două unități etilenoxi. S-a observat totuși că 1,4,7- Trioxaciclononanul este cel mai mic eter coroană, în timp ce dioxanul este cel mai simplu eter ciclic (fig. 1.22.).

Fig. 1.22. Structura eterilor coroană

În principal, coroanele și criptanzii se pot construi prin repetarea unităților metilenoxi, propilenoxi si butilenoxi.

În ceea ce privește denumirea eterilor coroană, Pedersen a propus o nomenclatură unde sunt cuprinse: numărul și tipul grupărilor substituente, numărul total de atomi și numărul de atomi donori din inel (heteroatomii).În tabelul 1.5. sunt prezentate atât nomenclatura IUPAC cât și cea a lui Pedersen.

Tabel 1.5. Nomenclatura eterilor coroana

Proprietățile eterilor coroană

Eterii sunt molecule polare, dar datorită hidrării sterice, între moleculele lor în stare lichidă există o forță slabă de atracție dipol-dipol. Se observă că fiecare atom de oxigen este încărcat parțial negativ, iar fiecare atom de carbon este încărcat parțial pozitiv.

Din punct de vedere al proprietăților chimice, putem spune ca acești polieteri sunt compuși neutri puțin colorați, fiind puțin solubili în apă și alcool, relativ solubili în solvenți aromatici și foarte solubili în clorura de metilen sau cloroform. Ei sunt influențați de reacțiile de substituție caracteristice eterilor aromatici (halogenare, nitrare). Eterii coroană sunt descompuși în urma reacților care duc la scindarea eterilor.

O proprietate importantă a eterilor coroană este aceea legată de capacitatea lor de a forma complecși stabili cu ionii metalici.

1.5. Tehnici aplicate în studiul complecșilor gazdă – oaspete

În ultimul secol, interacțiile de tip gazdă-oaspete au fost bine studiate în scopul obținerii unor perspective fundamentale în chimia supramoleculară. Cele mai multe lucrări au fost realizate folosind tehnici, cum ar fi RMN, difracția cu raze X, spectrometria de masă etc. Aceste tehnici ne dau informații privind structura complexului format, interacțiile caracteristice ce pot apărea între molecula gazdă și molecula oaspete dar și proprietățile și aplicațiile lor.

1.5.1. Rezonanță magnetică nucleară

Rezonanța magnetică nucleară (RMN) reprezintă una dintre cele mai puternice tehnici spectroscopice din chimia analitică. RMN este o tehnică de bază în studiul complecșilor gazdă-oaspete, ce permite identificarea structurii diferiților complecși aflați sub formă de agregați, ioni pereche sau sisteme încapsulate.

Spectrometria prin rezonanță magnetică nucleară se referă la studiul structurii atomice a macromoleculelor în soluție.

La baza acestui fenomen stă magnetismul nuclear. RMN se bazează pe proprietățile magnetice ale nucleelor. Tehnica are la bază observația conform căreia nucleele anumitor atomi au un moment magnetic nuclear, adică se comportă în câmp magnetic ca niște magneți microscopici, cărora le este caracteristică o mărime cuantică denumită spin nuclear.

Forțele care apar la formarea legăturilor gazdă – oaspete sutn reprezentate de inetracțiuni secudnare dintre molecule cum ar fi legatura de hidrogen și interacțiuni – . Astfel, RMN-ul se folosește, de asemenea, drept tehnică pentru stabilirea acestor interacțiuni în compelxul gazdă – oaspete.

Cu toate acestea, un factor improtant ce trebuie reținut când se analizează legăturile dintre gazdă și oaspete, este timpul luat pentru achiziția datelor comparativ cu timpul pentru foramrea legăturii. În foarte multe situații, evenimentele de formare a legăturilor sunt mult mai rapide decât timpul necesar achizișiei datelor, situație în care rezultatul este un semnal mediu pentru fiecare moleculă individuală și complex. Scala de timp la RMN este de ordinul milisecundelor, care în unele cazuri în care reacția de legătură este rapidă, limitează acuratețea tehnică.

1.5.2. Difracția cu raze X

Difracția cu raze X reprezintă o tehnică instrumentală, rapidă și reproductibilă, necesară atât identificării componentelor solide analizate cât și a proporției diferitelor minerale componente. Poate furniza și alte informații, privitoare la gradul de cristalinitate, la posibila lor modificare chimico-structurală (prin formarea de soluții solide în prezența unor elemente de substituție)(carte Gh. Nichifor, G.L. Radu Tahnici experimentale în analiza chimică).

Principul acestei tehnici constă în apariția unei dispersii în urma interacției dintre vectorul electric al razelor X și electronii materialului prin care trec.

În ceea ce privesc studiile complecșilor de tip gazdă-oaspete în stare solidă, în ultima perioadă s-a pus accentul pe corelarea parametrilor moleculari – tipologia cavității, dimensiunea și distribuția substituentului – cu preferințele conformaționale și proprietățile de complexare ale compușilor supramoleculari cu ioni sau molecule neutre organice. Aceste studii sunt realizate prin difracția cu raze X, ce oferă o descriere clară a structurii moleculare, acesta fiind un punct de plecare în clarificarea unor aspecte legate de fenomenul de incluziune moleculară, cel puțin în stare solidă. (G.D. Andreetti, F. Ugozzolii – Inclusion Properties and host-guest Interactions of calixarenes in solid state).

1.5.3. Spectrometria de masă

Spectrometria de masă reprezintă una dintre cele mai importante tehnici de identificare și detecție a complecșilor de tip gazdă – ospete, ea fiind cea mai sensitivă metodă de analiză moleculară. Această metodă poate furniza informații atât despre masa moleculară relativă cât și despre structura analiților.

Principiul spectrometriei de masă constă în conversia compușilor din probe în ioni gazoși care apoi sunt separați sau filtrați, funcție de raportul masă/sarcină, iar apoi detectați.

Studiul complecșilor formați prin legături necovalente (enzimă – substrat, receptor – ligand, gazdă – oaspete etc) s-a extins foarte mult în urma introducerii unei noi metode – ionizare prin dispersie (împrăștiere) de electroni (ESI), metodă ce permite producerea de ioni de la macromolecule.

Informațiile legate de structura complexului obținute prim metoda ESI – MS nu pot fi comparate cu cele obținute prin RMN sau difracția cu raze X, dar pot furniza informații importante legate de stoechiometria complexului.

Pentru a se efectua măsurători directe de tip MS la complecși necovalenți, tehnica de ionizare MS folosită trebuie să satisfacă următoarele criterii:

Metoda de ionizare trebuie să fie capabilă a genera ioni de proteină intacți în faza gazoasă, din soluțiile ce pot conține buffer biologic;

Energia internă transferată la macromolecule în timpul procesului de ionizare trebuie să fie suficient de scăzută pentru a se preveni denaturarea proteinei și disocierea complexului;

Instrumentația MS trebuie să aibă un domeniu de masă suficient pentru a se eprmite observarea complexului ionizat.

În mod corespunzător, ESI-MS a devenit un instrument pentru investigarea ariei geenrale de recunoaștere moleculară, bazat pe legătura necovalentă cum ar fi interacțiunile electrostatice, hidrofobe și legături de hidrogen. Exemplele de complecși necovalenți deetrminați prin ESI-MS includ enzimă-substrat, receptor-ligand, gazdă-oaspete, proteine multimetrice intacte, specii ADN duplex, complecși oligonucleotidici cu medicamente și rpotene etc. Stoichiometria se poate măsura prin ESI-MS și identifica detalii privind stabilitatea complecșilor atât la organizarea structurală cât și la ciclul de ansamblu. Aceste studii au ca scop analiza biomoleculară a căror mase sunt deja cunoscute; focalizarea este apoi dirijată asupra deplasărilor de masă asociate cu formarea de complecși sau la modificările în intensitatea semnalului.

Informațiile structurale obținute prin utilizarea ESI-MS nu pot fi comparate cu cele obținute prin RMN multidimensional și cristalografie cu raze X, care asigură o rezoluție ridicată la structurile tridimensionale ale interacțiunilor biomoleculare. Cu toate acestea ESI-MS poate asigura informații importante legate de stoichiometria complexului, și implică materiale semnificativ mai puține alături de un timp de analiză mai redus comparativ cu RMN multidimensional și cu cristalografia cu raze X.

1.5.4. Spectrometria UV-VIS

Spectrometria UV-VIS reprezintă una dintre cele mai vechi și rapide metode de a studia activitatea de legare a moleculelor. Absorbția luminii UV se realizează la nivel de picosecunde, urmată de apariția semnalului individual al speciei de interes. În acealași timp absorbția este direct proporțională cu grosimea probei (b), și concentrația (c) speciei absorbante conform legii Lambert – Beer:

unde ε este o constantă de proporționalitate numită absorbție.

În ceea ce privesc complecși de tip gadă-oaspete, există situația în care una dintre molecule (gazdă sau oaspete) este transparentă la lumina UV în timp ce cealaltă moleculă este sensitivă la UV.

Componenții biologici pot fi măsurați semi-cantitativ prin spectrometria UV-VIS. De exemplu proteinele la 280 nm și acizii nucleici la 260 nm. Reziduurile amino aromatice în proteină (Tyr, Phe, Trp) absorb în regiunea de 280 nm. (carte L.Mutihac)

Spectroscopia UV-VIS este una dntre metodele cele mai vechi și rapide de studiu al activității legăturilor la diefrite molecule. Absorbția radiației UV are loc în domeniul picosecundelor deoarece semnalele individuale de la specii pot fi observate. În acest timp, intensitatea absorbției se corelează direct cu concentrația speciilor, lucru care permite calcularea fără dificultate a constantelor de asociere. De cele mai multe ori atât gazda cât și oaspetele sutn transparente în UV în timp ce alte molecule sut senzitive în UV. Modificarea în concenrația moleculelor senzitive în UV este astfel monitorizată și transpusă într-o linie dreaptă folosind metoda Benesi – Hildebrand, prin care se calculează direct constanta de asociere. Informații suplimentare se obțin de asemenea privitor la stoichiometria complecșilor deoarece metoda Benesi – Hildebrand pornește de la premiza unei stoichiometrii 1:1 între gazdă și oaspete. Adele vor da o linie dreaptă doar dacă compelxu format are o stoichiometrie similară de 1:1.

1.5.5. Dicroismul circular

Dicroismul circular este o metodă ce permite obținerea informațiilor legate de structura (conformația) tridimensională a macromoleculelor în soluție.

Dicroismul circular măsoară absorbția diferențiată a luminii polarizate cicular (R) și (L) – ca o funcție a lungimii de undă.

Dicroismul circular poate furniza informații legate de structura proteinelor (structura secundară a proteinelor) dar și despre structura ADN.

1.5.6.Metode calorimetrice

În chimia supramoleculară se poate discuta despre fenomenul de recunoaștere moleculară din punct de vedere cantitativ, doar dacă se determină parametrii termodinamici pentru fiecare interacție supra(moleculară) de interes. (Molecular recognition in chemistrz and biologz as viewed from enthalpz-entropz compensation effect: Global understanding of supramolecular interactions) vol 4, pag. 55-96.

Determinarea constantei de stabilitate a unei supramolecule permite calcularea entalpiei libere de formare la o temperatură data T, ΔGs(T):

Unde R este constanta gazelor perfecte. Entalpia liberă de formare poate fi corelată cu entalpia ΔHs(T) și cu entropia ΔSs(T), prin:

Mărimile ΔGs(T), ΔHs(T) și ΔSs(T) reprezintă parametrii termodinamici ai procesului de formare a supramoleculei. Acești parametrii termodinamici pot fi determinați direct din date calorimetrice sau din date potențiometrice și spectrometrice. (carte C. Luca, I. Tanase, A.M. Joșceanu Aplicații ale chimiei supramoleculare Ed Tehnica 1996)

Deși calorimetria prezintă unele dezavantaje, (utilizarea unei cantități mari de probă, echipamente sofisticate, experiență în măsurătorile calorimetrice) în comparație cu alte metode de determinare a valorilor termodinamice, ea este singura metodă pentru măsurarea directă a entalpiei.

2. UTILIZAREA CALIX[N]ARENELOR ȘI DERIVAȚIILOR ACESTORA ÎN SEPARAREA UNOR COMPUȘI BIOLOGICI

2.1. Calix[n]arene utilizate în procesul de extracție cu solvenți

2.1.1. Considerații generale

Extracția este un proces de separare care utilizează un solvent (lichid) pt a separa un component dintr-un amestec în stare lichidă sau solidă. Extractul obținut este apoi supus unei operații de recuperare a solventului și purificare a compusului extras.

Dacă amestecul inițial este lichid, procesul se numește extracție lichid-lichid, dacă amestecul este solid procesul se numește extracție solid-lichid.

Extracția lichid-lichid (LLE) este una dintre cele mai vechi tehnici de separare, cu multe aplicații analitice (ex. utilizat în cercetare, industrie pentru producerea de compuși chimici puri, purificarea deșeurilor etc). Aceasta metodă de separare presupune două lichide nemiscibile, între care speciile chimice se distribuie conform afinității (solubilității) lor față de ele.

Primele cercetări în domeniul extracției în solvenți a complecșilor cu liganzi macrociclici au fost efectuate de C.J. Pedersen care a remarcat corelația dintre stabilitatea complecșilor și randamentul de extracție a cationilor metalelor alcaline. H.K. Frensdorff a studiat apoi extracția picraților de metale alcaline în prezența liganzilor macrociclici diciclohexil-[18]/coroană-6 și dibenzo-[18]-coroană-6, stabilind rolul polieterilor macrociclici în procesele de extracție a cationilor alcalini. (carte C. Luca, I. Tanase, A.M. Joșceanu Aplicații ale chimiei supramoleculare Ed Tehnica 1996)

În general procesul de extracție este favorizat de stabilitatea complexului, iar aceasta este controlată de potrivirea dimensională între diametrul speciei complexate și diametrul cavității intramoleculare a ligandului macrociclic.

Procesul de extracție cu solvenți a unor specii chimice pe baza complecșilor cu liganzi macrociclici, prezintă o multitudine de aspecte intens studiate, dar încă insuficient elucidate. (M. Takagi, H. Nakamurs, Anal. Chim. Acta, 126, 185 (1981))

Un rol important în procesele de extracție îl joacă:

Stabilitatea complecșilor cu ligandul macrociclic în faza apoasă – dimensiunea speciei extracției

Structura și funcțiile ligandului – lungimea lanțurilor metilenice poate influența abilitatea de legare și extracție a compușilor biologici.

Repartiția între fazele sistemului a însăși ligandului macrociclic – mărirea raportului dintre numărul de heteroatomi și numărul de atomi de carbon din inelul ligandului conduce la mărirea solubilității în apă și deci la micșorarea constantei de repartiție. Prezența nucleelor aromatice și a radicalilor alchil accentuează în mod însemnat caracterul lipofil al liganzilor macrociclici, care devin mai solubili în solvenți organici și micșorează solubilitatea lor în apă. ( Z. Takeda, K. Oshio, Z. Segawa, Chem. Lett., 5, 601, (1979), T. Kimura, T. Iwashimo, T. Hamado, Anal. Chem. 51, 1113 (1979)

Natura anionului formator al perechii de ioni – extracția unor compuși biologici în solvanți organici se face în formă de pereche de ioni cu un anion având structură și proprietăți favorabile exracției. Acești anioni de cuplaj au masă moleculară mare și caracter lipofil pronunțat. Exemple de anioni utilizați ca pereche de ioni în extracția compușilor biologici: ionul picrat [79], ionul tropeolin 00 ([4-4 " – (anilinofenilazo)] acid benzensulfonic) (fig. 2.1) [80].

Fig. 2.1. Compuși utilizați ca pereche de ioni

Natura solventului – influența solventului organic asupra extractibilității perechilor de ioni este datorată constantei sale dielectrice. Solvenții cu constantă dielectrică mică împiedică disocierea perechii ionice, favorizând astfel extracția. Un rol important îl are solventul organic prin intermediul naturii anionului care formează perechea de ioni. R.M.Izatt, D.W. McBride Jr. J.S. Bradshaw, J.J. Christensen, Isr. J. Chem., 25, 27 (1985)

Efectele sinergetice – speciile chimice exisente în faza apoasă a sistemului lichi-lichid pot influența procesul de extracție, înainte de toate, prin schimbarea coeficienților de activitate ai speciilor implicate în echilibrul de extracție.

2.1.2. Aplicații ale calix[n]arenelor in procesul de extracție a unor compuși biologici

De când au fost descoperite ca produși de reacție obținuți în urma condensării fenolului cu formaldehida, calixarenele au câștigat o mare atenție pentru aplicațiile lor ca agenți tensioactivi și chemoreceptori. Calixarenele iși găsesc multe aplicații datorită multiplicității de opțiuni pentru elaborarea structurală.

În cele mai recente studii accentul a fost pus pe utilizarea calix(n)arenelor solubile în apă pentru a complexa aminoacizii și proteinele în apă (61 refereta III) cât și asupra abilităților p-terț-butilcalix(n)arenelor (n = 6,8). Studiile efectuate au demonstrat faptul că dimensiunea cavității calixarenei reprezintă una dintre cei mai importanți factori pentru recunoașterea aminoacizilor.

L. Mutihac (64) a studiat abilitățile de extracție a unor metilesterii aminoacizilor (L-leucina, L-valina, L-cisteina, L-izoleucina, L-serina și L-fenilalanina). Rezultatele experimentale au arătat faptul ca metilesterii aminoacizilor sunt extrași în faza organică de către p-terț-butilcalix(n= arenelor (n=6,8) în prezența acidului benzensulfonic tropaeolin 00((4-)4-anilinofenilazo). S-a observat eficiența ambelor calixarene de a extrage metilesterii aminoacizilor. Exceptând L-valina (35% factor de extracție) și L-serina (37%), p-terț-butilcalix(6)arena are capacitate mai mare de extracție decât p-terț-butilcalix(8)arena. Secvența de extracție utilizând p-terț-butilcalix/6)arena a fost: L-PhrOMe > L-CysOMe (>L-IleOMe >L-LueOMe > L-SerOMe > L-ValOMe, iar utilizând p-terț-butilcalix/8)arena: L-IleOMe > L-PheOMe >L – ValOMe ≈ L-SerOMe > L-LeuOMe > L-CysOMe.

Complexarea aminoacizilor și oligopeptidelor a fost studiată atât in soluție (22-26 articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes) cât și în stare solidă (30 articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes).

Ungaro (27 articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes) alături de alți cercetători au studiat interacțiile para-sulfonato-calixarene cât și a derivaților săi cu o serie de aminoacizi, oligopeptide și peptide. În urma studiilor RMN, microcalorimetrie și HPLC, s-a observat că para-sulfonat-calix[4]arena prezintă cea mai mare constantă de asociere pentru aminoacizii lisina și arginina (constanta de asociere pH 8: SC4 – L –arginină: 1.5 x 103 M-1, SC4 – L-lisina: 0.74 x 103 M-1) (24 articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes).

Bushman și colab. (28 articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes) au studiat capacitatea de complexare a aminoacizilor și dipeptidelor de către SC4, SC6 prin titrări calorimetrice și au demonstrate că dimensiunea cavității nu poate influența procesul de complexare.

Proprietățile de complexare în soluție a aminoacizilor de către calixarenele funcționalizate au fost deasemenea studiate de Da Silva și colab. (22 articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes). În cazul calixarenelor funcționalizate, spre deosebire de para-sulfonato-calix[n]arene, constantele de asociere prezintă o stoechiometrie de tip 1:1, iar grupările poziționate în partea de jos a scheletului modifică puternic interacțiile cu aminoacizii.

Alături de studiile în soluție, Seltki și colab. (30 articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes) au studiat complexarea aminoacizilor de către para-sulfonato-calix[n]arena în stare solidă (fig. 2.2), obținând o stoechiometrice 1:2 dintre SC4 și lisina.

Fig. 2.2. Structura complexul format între SC4 în stare solidă și lisina articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes)

Lazăr și colab. (33 articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes)) au determinat structura în stare solidă a SC4 cu arginina.

Fig. 2.3. Structura complexul format între SC4 în stare solidă și arginina articol Biochemistry of the para-sulfonato-calix(n) arenes)

2.2. Calix[n]arene utilizate în procesul de transport prin membrane

2.2.1. Considerații generale

În ultimii ani s-a dezvoltat în mod însemnat domeniul tehnicilor de separare și concentrare prin membrane, ca urmare a orientării către procese eficiente din punct de vedere al consumurilor energetice și de materii prime. (C.J. Pedersen, J. Am. Chem. Soc. 89, 7017 (1967); Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 27, 1305 (1968). Eficacitatea unui proces de separare prin membrană este dată, în general, de fluxul speciilor prin membrană și de selectivitatea membranei pentru specia sau speciile care se separă.

Procesul de transport prin membrane poate fi inclus în procesele fizice generale de separare a diferitelor componente ale unui sistem.

Membrana poate fi definită ( E.Drioli, G. Iorio and G. Catapano, i Handbook of industrial membrane technologz (M.C. Porter, ed), Nozes Publ. Park ridge, New Jersez 1989, p. 401) ca fiind o barieră între două lichide care selectează trecerea unuia sau a mai multor componenți dintr-un lichid în altul prin barieră.

2.2.2. Tipuri de membrane

Conceptele științelor moderne s-au dezvoltat în bună măsură inspirându-se din modelele naturale. În acest sens, s-a incercat imitarea modelelor biologice, oferindu-se noi soluții practice în beneficiul tehnicii și mai ales al tehnologiei moderne. Un astfel de exemplu îl constituie membranele naturale (biologice) și procesele ce au loc la nivelul acestora. Imitarea membranelor biologice dar „in vitro” a dus la apariția membranelor sintetice, care inițial erau utilizate în laboratoarele de cercetare, ulterior fiind aplicate și în practica industrială.(carte Tehnici experimentale in analiza chimica).

Membranele se pot clasifica după două criterii majore: consistența și proveniența meterialelor (fig. 2.4.) sau după mecanismul de transfer a masei.

Fig. 2.4. Clasificarea membranelor după origine, consistență și materiale

(T. Melin, R. Rautenbach, Membranverfahren, Springer, Berlin 2007)

2.2.2.1. Membrane biologice

Membranele biologice sunt structuri omniprezente ce delimitează celulele între ele precum și organitele celulare (mitocondrii, nucleu, cloroplastie, lisosomi etc). Ele sunt constituite din 30-80% lipide, 20-60% proteine și 0-10% carbohidrați aceste procente pot însă varia. Constituenții lipidici și cei proteici sunt legați între ei prin interacții hidrofobe (în interiorul membranei) interacții de tip polar manifestându-se la interfețele cu mediile apoase. Structura unei astfel de membrană este prezentată în figura 2.5.

Fig. 2.5. Structura unei membrane biologice (http://taksreview.wikispaces.com/6+Cell+membrane,+homeostasis,+active+and+passive+transport,+osmosis)

Rolul de compartimentare se datoreză constituenților lipidici ce prezintă o structură amfifilă care determină cele două parți (polară și nepolară) ale membranei. Aceștia se dispun în mediul biologic de preferință sub forma unui strat dublu lipidic cu părțile nepolare în interior, iar cele polare orientate spre mediile apoase. .(carte Tehnici experimentale in analiza chimica)

Membrana biologică este în general impermeabilă pentru majoritatea moleculelor polare deci pentru majoritatea metaboliților săi interni.

2.2.2.2. Membrane sintetice (lichice)

Un domeniu aparte în cadrul tehnicilor de separare îl constituie membranele lichide. Ele sunt utilizate în special la nivel de laborator în scopul studierii caracteristicilor de transport și de selectivitate. .(carte Tehnici experimentale in analiza chimica)

Procesele de separare utilizând membrane lichide iși au originea în rezultatele extracției lichi-lichid. Spre deosebire de procesul clasic de extracție lichid-lichid, fenomenul de transport prin membrane lichide prezintă unele avantaje:

Volumul de solvent utilizat pentru separare este mult mai mic (reducerea cantității de solvent cu până la 20 % față de cantitatea utilizată în procesul de extracție clasic)

Viteza de extracție este mult mai mare comparativ cu cea a extracției convenționale

Utilizarea unor solvenți cu coeficient de distribuție deosebit de scăzuți

Instalații mai compacte

Costuri scăzute de investiții

În funcție de modul de relizare, membranele lichide pot fi:

Membrane lichide propriu-zise (fig.2.6.)

Membrane lichide pe suport sau imobilizate (fig.2.6.)

Membrane lichide de emulsie (fig.2.6.)

Fig. 2.6. Configurația unei membrane (a) lichide propriu-zise; (b) membrane lichide emulsie; (c) membrane lichide suportate (E. L. Ortiz, Membrane process, Chemical Engineering, 2011)

Membrane lichide propriu-zise

Membranele lichide sunt alcătuite din faze lichide, omogene sau eterogene, hidrofobe sau hidrofile.

Aceste sisteme de separare conțin trei faze principale: faza sursă (FS), faza care conține specia chimică ce urmeză a fi transportată, faza membranară (M) care este de natură hidrofobă, ea comportându-se ca o barieră permselectivă situată între faza apoasă și faza receptoare (FR) ce reprezintă punctul de destinație al speciei transportate. Mecanismul de separare care funcționează la nivelul acestor membrane presupune în primul rând o solubilizare a speciilor care urmează a fi transportate și apoi difuzia și transferul efectiv al acestora, transfer care se realizează cu ajutorul unot transportori. Acești transportori sunt de regulă constituenți membranari care prind la interfața FS/M compusul care urmează a fi transportat și-l eliberează la cealaltă interfață M/FR. În interiorul membranei prnderea efectivă a compusului transportat se realizează ca urmare a selectivității și specificității transportorului materializat prin formarea unor legături nespecifice între acesta și compusul transportat. Astfel se obțin complecși de tip „compus – transportor” caracterizați de constante de formare și de disociere a căror valori sunt optime pentru realizarea transferului propriu-zis. .(carte Tehnici experimentale in analiza chimica).

Transportorii utilizați pot fi amine organice protonate și cationiți diverși,(4,5 carte Aplic. Ale chimiei supramolec Luca) dar și liganzi macrociclici. Utilizarea liganzilor macrociclici ca transportori în membrane lichide s-a dovedit a fi foarte eficientă datorită cavității endopolarofile a acestora, în care se pot complexa ioni și molecule prin interacții ion – dipol, sau dipol-dipol în măsura în care există potrivire dimensională între diametrul cavității ligandului și al speciei complexate. În plus, exteriorul lipofilic al ligandului macrociclic concură la solubilizarea complexului format în solvenți organici care alcătuiesc membrana lichidă.(4-6, 11 carte Aplic. Ale chimiei supramolec Luca).

Membrane lichide pe suport sau imobilizate

Un astfel de sistem este alcătuit din faze lichide nemiscibile aflate în contact, dar la interfețele acestora apare un suport poros cel mai adesea confecționat din material polimeric sau ceramic, care este impregnat cu solventul organic (fig. 2.7.). Aceste membrane au o suprafață de transfer mult mărită conferând astfel fluxuri generoase pentru lichidele care le traversează.

Fig. 2.7.Schema unei membrane lichide suportate sau imobilizate pe un suport solid

Acest tip de membrane sunt utilizate de regulă în practica industrială modernă, având aplicații și în medicină.

Membrane lichide de emulsie

Membranele de tip emulsie (21, 22 carte Luca) se obțin prin agitarea unei emulsii apă în ulei într-o fază apoasă. Emulsia apă-ulei este stabilizată de un surfactant. Datorită dimensiunilor foarte mici ale particulelor emulsiei, suprafața de contact a membranelor emulsie este foarte mare, ceea ce face ca fluxurile speciei chimice transportate să fie mari.

2.2.3. Influența transportorilor macrociclici asupra transportului prin membrane

Transportorul de natură macrociclică este o moleculă liposolubilă, capabilă să mărească solubilitatea unei specii chimice în membrană și să asigure fluxul acesteia și selectivitatea transportului ca urmare a interacțiilor dintre transportor și specia chimică transportată.

Procesul de transport prin membrane poate fi influențat de o serie de factori:

concentrația transportorului macrociclic în faza membrană – mărirea concentrației transportorului macrociclic în faza membrană influențează în sens pozitiv transportul prin membrană (carte Luca), acest lucru nu este general valabil. Liganzii macrociclici utilizați ca transportori, care au constante de repartiție cu valori mici, conduc la pierderea unei părți de transportor prin trecerea lui în formă liberă din membrană în fazele apoase ale sistemului. În acest caz eficiența separării este micșorată. Scăderea solubilității în apă a transportorului macrociclic se poate reliza prin adiționarea grupărilor hidrofobe la molecula macrociclică. Dacă constanta de stabilitate a complexului nu-și schimbă valoarea, atunci transportul prin membrane lichide este îmbunătățit.

solventul membrană – solventul utilizat în membrană poate influența procesul de transport prin intermediul repartiției transportorului între faza organică și fazele apoase și prin gradul de disociere al perechii de ioni din solvent. R.M Izat și colab au studiat capacitatea de transport a unor derivați clorurați ai metanului cu diciclohexil[18]-coroană-6, stabilind următoarea secvență: CH2Cl2>CHCl3>CCl4.

Influența anionului de cuplaj – natura anionului de cuplare poate infleunța transportul prin membrană. Viteza de transport este funcție de energia liberă de hidratare a anionului, de caracterul lipofil al anionului și de interacțiile anionului cu grupările grafate pe coroana ligandului macrociclic.

stabilitatea complexului cu ligandul macrociclic – stabilitatea complexului cu ligandul macorciclic trebuie să fie astfel încât să asigure trecerea acestuia din FS în membrană, dar o stabilitate prea mare inhibă trecerea în continuare din membrană în FR.

Faza receptoare FR – natura și compoziția FR este foarte importantă. Studiile (30 carte Luca) au arătat că în cazul unei complexări puternice cu transportorul și a unei complexări slabe cu anionul din FR se obține un transport slab.

temperatura – K. Pannel și colab. (40 carte C- Luca) au arătat faptul că transportul ionului de Na+ scade cu creșterea temperaturii.

2.2.4. Fenomene de transport prin membrane lichide

Sistemele de transport membranar funcționează ca o „poartă” lăsând să pătrundă în ambele direcții selectiv însă numai anumite substanțe de natură polară. Pentru a funcționa, aceste sisteme necesită o forță motrice care poate fi obținută fie caloric, fie ca rezultat al variației între cele două interfețe membranare a unei proprietăți fizico-chimice. Diferența care apare între cele două fețe are unei membrane și care poate fi de concentrație, temperatură pH, presiune etc se numește gradient.

Ca și în cazul modelelor naturale, respectiv, membrane biologice, și la nivelul membranelor sintetice există o serie două tipuri de mecanisme de transport: transportul pasiv și transportul activ.

2.2.4.1. Transportul pasiv

Sistemul de transport pasiv funcționează în sensul unui gradient, de obicei gradient de concentrație. În fig. 2.8. este prezentat principiul unui astfel de sistem cu transportori macrociclici.

Fig. 2.8. Transportul pasiv

Într-un astfel de mecanism de transport, specia transportată, de obicei un cation, formează un complex cationic cu ligandul macrociclic transportor T, complex care asociat cu un anion A- formează o pereche de ioni care străbate membrana. Se realiezază astfel transportul compusului din faza sursă în faza receptoare. Prezența în faza receptoare a unui anion cu acțiune complexă asupra cationului transportat mărește fluxul de transport. (carte C- Luca)

2.4.2.2. Transportul activ

Spre deosebire de principiul transportului pasiv, sistemul transportului activ funcționează contrar unui gradient. În fig. 2.9. este prezentat prin principiul transportului activ.

Fig. 2.9. Transportul activ

Așa cum este prezentat în fig. 2.9., transportorul macrociclic din membrană fixează protonul la interfața cu faza apoasă acceptoare, acidă, ducându-l apoi prin difuzie la interfața cu faza apoasă bazică, unde îl pierde prin neutralizare. Transportorul fixează cationul M+ din faza sursă și îl transportă prin difuzie la interfața cu faza receptoare acidă unde îl eliberează ca urmare a protonării. Prin acest mecanism, gradientul concentrației ionului H+ și deci transportul acestui ion din faza receptoare în faza sursă duce la transporul cationului M+ în sens invers.(carte C- Luca)

Spre deosebire de transportul pasiv, cel activ este considerat mai important deoarece acesta participă direct la reglarea și menținerea stabilă a metabolismului prin abilitatea lor de a corecta marile fluctuații existente în interiorul oricărei celule vii.

2.4.2.3. Transportul mediat

Acest tip de transport este foarte utilizat, deoarece oferă rapiditate în transport și selectivitate. Astfel de echilibre se realizează într-o primă etapă la interfața FS/M și apoi la cea de-a doua interfață M/FR.

Modelul transportului ca ion-pereche, prin membrana lichidă a aminelor sau aminoacizilor în forma protonată, din faza apoasă în faza organică, poate fi reprezentată prin următoarele ecuații:

Transportul prin membrana:

unde: os – interfața membrană / faza sursă

or – interfața membrană / faza receptoare

Trecerea în faza receptoare:

Procesul de transport mediat poate fi influențat de următorii factori:

stabilitatea complexului – la extracția din FS în M o stabilitate mare a complexului poate impiedica desfacerea lui la cealaltă interfață M/FR

influența anionului pereche

influența fazelor apoase și organice

mecanismul de transport

2.2.5. Aplicații ale calix[n]arenelor în procesul de transport prin membrane a unor compuși biologici

Calixarenele sunt gazde supramoleculare care au abilitatea de a forma complecși cu diferite specii cationice si anionice. În comparație cu ciclodextrinele, calixarenele sunt caracterizate de o mare flexibilitate sterică. Acești receptori au posibilitatea de a forma complecși interesanți atât cu cationii metalici cît și cu compușii biologici, datorită extractibilității și selectivității lor.[57 referat 1]. Separarea moleculelor cu ajutorul membranelor joacă un rol important atăt în sistemele biologice cât și în aplicațiile industriale. [58 – referat 1]. Studiind efectele calixarenelor folosite ca transportori prin membrană, se observă că pe langă capacitatea lor și a derivaților săi de a fi folosite ca fluide purtătoare în transportul cationilor metalici și legile acestui transport, calixarenele sunt foarte utile în înțelegerea principiilor, forțelor motrice și a factorilor principali ce influențează transportul cationilor metalici ca: K+, Na+, Ca2+, Mg2+, prin membrane celulare.

Reinhoudt [59] a utilizat calixarenele ca transportori de molecule în membrane lichide. Astfel, transportul selective al K+ poate fi realizat folosind membrane lichide imobilizate pe un suport ce contine calix[4]arena – coroană – 5. A fost studiată și selectivitatea diferitelor calixarene în solutie, în legarea și transportul cationilor metalici [60,61 referat 1]

L. Mutihac și colab. (articol Calixarene derivatives as carriers in liquid membrane transpor) au studiat transportul unor amine si amoniacizi aromatici metil esterificați prin membrane lichide ce conțin p-tert-butilcalix[n]arene (n = 6,8) ca transportori, folosind drept solvent organic cloroformul și picratul contraion. Ca aminoacizi aromatici folosiți: L-fenilalanina metilesterificată și hidroclorurată (L – PheOMe*HCl); L-triptofanul metilesterificat și hidroclorurat (L-TrpOMe*HCl) și L-tirozina metilesterificată si hidroclorurată (L-TyrOMe*HCl). Din datele experimentale se observă că în cazul utilizării p-terț-butilcalix[8]arena ca transportor, eficiența transportului pentru amoniacizi menționați mai sus este dată de succesiunea: L – PheOMe*HCl > L-TrpOMe*HCl > L-TyrOMe*HCl. Se observă că L-fenilalanina a fost transportată mai eficient decât L-triptofanul și decât L-tirozina.

Din punct de vedere al efectului calixarenelor asupra transportului, s-a observat ca p-terțbutilcalix[8]arena > p – tert butilcalix[6]arena. Acest lucru a fost confirmat și prin alt studiu realizat de L. Mutihac și colab. (articol Some Aspects of Extractabilitz and trasport of AA esters bz calixarenes) în care aceste doua supramolecule au fost utilizate pentru extracția și transportul unor aminoacizi metilesteri în prezența tropeolin 00. Dacă în cazul extracției p – tert butilcalix[6]arena a avut o capacitate mai mare de a extrage aminoacizii studiați, p-tert butilcalix[8]arena a obținut randamente de transport mult mai bune. Acest lucru a demonstrat faptul că atât structura calixarenei cât și natura aminoacizilor studiați înfluențează procesul de transport prin membrană.

Chang (54) a prezentat transportul N-benzoil amino acizi prin membrană lichidă de cloroform. S-a observat ca rata de transport depinde de hidrofobicitatea anionilor gazdă și de dimensiunea cationilor metalelor alcaline ce se găsesc în faza de sursă. Rezultatelor experimentale au demonstrat că derivatul etoxicarbonilmetil al p-terț-butilcalix(6)arena poate fi utilizat ca purtător pentru recunoșterea și separarea selectivă a unor aminoacizi.

Antipin (55) a studiat separarea prin membrana lichidă ce conține un suport polimeric poros a formei zwiterionice a aminoacizilor aromatici utilizând α – aminofosfonatul calix(4)arenei. Grupările aminofosfonate influențează eficiența și rata transportului prin membrană.

2.3. Calix[n]arene utilizate ca receptori în electrozi ion-selectivi

După cum se știe, calixarenele sunt complecși selectivi utilizați pentru separarea și analiza ionilor metalici căt și a compușilor organici. Calix[4]arenele sunt capabile să adopte 4 conformații, printre conformațiile lor, conformația con datorită structurii moleculare sterice, face posibilă complexarea selectivă a ionilor specifici.[62 – referat 1]. Intre 1980 – 1990, McKervey și Diamond, au cercetat diverși derivați ai calixarenelor ce pot fi utilizați în membrane ale electrozilor ion – selectiv. Astfel s-a observat că cele mai utilizate calixarene sunt cele tetramere (4 unitati fenolice).

In 1994, McKervey și colaboratorii săi au studiat tetraetil ester calix[4]arena care este utilizată pentru electrozii ion selectivi de sodiu. Astfel de electozi se utilizează în spital pentru a măsura sodiului din sange. Alte colaborări ale lui McKervey și Diamond au demonstrat capacitatea calixarenelor de a fi utilizate în producerea electrozilor selectivi pentru potasiu si cesiu [63 + referat 1]. În 1996, McKervey a pus în evidență capacitatea calixarenelor hexamere de a forma legături selective cu cesiu si strontium. Acest lucru a demonstrat faptul că introducerea unor noi grupări în partea de jos a ciclului calixarenei, afecteaza afinitățile legăturii pentru cationii metalici.

Prin introducerea unor atomi de azot si sulf, calixarenele tetramere s-au folosit ca purtători neutri în electrozi ion-selectivi cu membrane PVC pentru determinarea ionului de argint. [64, 65]. Pentru a fi utilizate în EIS, calixarenele trebuie să fie imobilizate în membrane organice care sunt hidrofobice in natura. Mai mult chiar, în cazul în care avem de a face cu o analiză în soluție apoasă,calixarenele trebuie să fie insolubile în apă. În astfel de cazuri calixarenele trebuie să fie lipofilice cu o solubilitate foarte scazută în apă.

Un caz experimental [62] este acela în care s-au utilizat 3 piridino calyx[4]arene ca ionofori utilizați în electrozi ion-selectivi cu membrana PVC pentru determinarea Ag+. Acești ionofori sunt prezentați în figura 2.10.

Figura 2.10. Structura chimică a ionoforilor

Toate măsurătorile potentiometrice s-au realizat la 2980 K la pH-metru. Pentru măsurarea potențialelor electrodului s-a utilizat un electrod de referinta cu dublă joncțiune Ag – AgCl. Celula electrochimică a fost: Ag-AgCl / 1×10-3 mol dm-3 AgNO3 / membrana de PVC / 0.1 mol dm-3 NH4NO3 / 3 mol dm-3 KCl / Ag – AgCl.

2.4. Calix[n]arene utilizate în cromatografia de lichide

În ultimii ani cercetările efectuate cu acest tip de liganți macrociclici au scos in evidență capacitatea lor de a fi utilizați în diverse tehnici de separare cum ar fi gaz cromatografia, cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) cât și electroforeza capilară. (3-6 articol preparation and characterisation of a new p-tert-butil-calix(8)arena – bonded stationarz phase for high – preformance liquid chromatography). Rezultatele au arătat că utilizarea calixarenelor duce la imbunătățirea selectivității separării. (7 articol preparation and characterisation of a new p-tert-butil-calix(8)arena – bonded stationarz phase for high – preformance liquid chromatography).

Utilizarea ca faze staționare în cromatografia de gaze a tiacalix(4)arenelor modificate chiralic ce conțin grupări CH2C(O)NHCHMePh în partea de jos a ciclului pentru separarea enantiomerilor aminoacizilor, aminelor și alcoolilor datorită legăturii de hidrogen stereoselectivă a constituit un alt subiect de interes pentru o serie de cercetători.

J.D. Glennon, E.Horne (59 referat 3) au studiat transportul selectiv al esterilor aminoacizilor utilizând calixarenele cât și comportamentul lor cromatografic în cazul în care calix(4) arenele sunt legate de silica gel. S-a studiat reteția completă pe coloană a tuturor esterilor aminoacizilor cu excepția aspartamului în cazul în care s-a utilizat ca fază mobilă apa pură. Dacă la faza mobilă s-a adugat percloratul de litiu, s-a obținut o îmbunătățire a formei și a simetriei picurilor. Retenția scade cu creșterea conținutului de acetonitril în faza mobilă, dacă injectările s-au efectuat cu faze mobile apoase de 20%, 15%, 10% și 5% de ACN, toate cu 10mM perclorat de litiu. Ordinea de reținere s-a observat a fi foarte aproape de lipoficitatea esterilor aminoacizilor: TME >PEE > ABE > PME > AEE > APM.

Lai-Sheng Li , Shi-Lu Da, Yu-Qi Feng , Min Liu (60 referat 3) au preparat o faza staționara pentru HPLC ce conține p-terț-butil-calix(6)-1,4-benzocoroană-4 (CR6BS) legată de silica gel, utilizând ca reactiv de cuplare 3-glicidoxipropiltrimetoxisilan. Structura acestei noi faze staționare a fost studiată prin DFTIR, iar performanțele cromatografice au fost evaluate prin utilizarea unor soluții neutre, acide și bazice ca probe de analiză. Pentru a pune în evidența perfomențele acestei noi faze staționare, cercetătorii au studiat în paralel o altă fază staționară ce contine p-terț-butil-calix(6)arena legată de silicagel (C6BS). Rezultatele au arătat că această nouă faza staționară are proprietăți excelente ca fază reversibilă ce sunt similare cu C6BS, dar totuși selectivitatea pentru anumiți compuși aromatici este diferită de cea a C6BS. Spre deosebire de C6BS, CR6BS prin atomiii de oxigen din punțile de eter poate produce complexarea unor compuși, conformația rigidă a CR6BS fiind responsabilă de aceste performanțe diferite.

Menyes și colab (14 articol preparation and characterisation of a new p-tert-butil-calix(8)arena – bonded stationarz phase for high – preformance liquid chromatography). au raportat că faza staționară ce conține p-tert-butil-calix[6]arena legată covalent de silice utilizată pentru separarea PAH și a fuerenelor prezintă o selectivitate mult mai bună și un consum mai mic de solvent decât utilizarea fazei staționare convenționale de tip RP–C18.

În ultimii ani cercetările în acest domeniu s-au concentrat pe utilizarea unor faze staționare ce conțin p-tert-butil-calix[n]arena (n = 4, 6, 8) în scopul separării unor izomeri poziționali, PAH, nucleotide, medicamente (15, 15 articol preparation and characterisation of a new p-tert-butil-calix(8)arena – bonded stationarz phase for high – preformance liquid chromatography).) Rezultatele experimentale au arătat faptul că aceste faze staționare are excellent reverse – phase packings with inclusion capability.

Din cercetările efectuate de……..s-a observat capacitatea gelului de silice modificat ce conține calix[4]pirolil de a face diferența dintre diferite specii anionice simple, dar și capacitatea lor de a separa nucleotide și oligonucleotide complexe.

2.5. Calix[n]arene utilizate în separarea prin electroforeză capilară

Calixarenele sunt macrocicli oligomeri cu o geometrie asemănătoare unui vas conic care acceptă în interiorul cavității diferite molecule gazdă. Acești compuși absorb în UV cu un maxim la 204 nm. Utilizarea calixarenelor sulfonate solubile în apă ca fază mobilă in combinație cu diferite săruri, permite utilizarea electroforezei ca metodă de determinare a compușilor speciali care sunt transparenți în UV.

Arce și colaboratori săi au utilizat calixarenele ca modificatori selectivi și bromura de potasiu ca electrolit în electroforeza capilară [67 –referat 1]. Astfel, calixarenele au fost folosite pentru separarea prin electroforeza capilară a diferiților compuși fenolici. [68–referat 1]. Electroforeza capilară a pus în evidență o serie de metode pentru separarea calixarenelor sulfonate, [69, 70 referat 1] mai recent acilcalix[4]arena chirală a fost sintetizată și utilizată ca faza pseudo-staționară în electroforeza capilară. [71 referat 1]. Calix[4]arena a fost utilizată pentru a separa izomerii de poziție prin electroforeza capilară, [72 referat 1] iar PAH –urile prin cromatografie electrocinetică capilară. [73 referat 1]. Arce și clolaboratorii au utilizat următorii reactivi: p-sulfonic calix[6]arena și p-sulfonic calix[4]arena ca gazdă, iar compușii ce au fost studiați: histidina, lizina, glicina, alanina, serina și treonina ca amino acizi, metilamina, etilamina, etanolamina, morfina, butilamina și hexilamina. În urma experimentului s-a constat că exista o serie de avantaje legate de utilizarea calix[4]arenei și calix[6]arenei în electroforeza capilara:

Dimensiunea cavității care este mult mai flexibilă decât cea a ciclodextrinelor

Calixarenele pot fi ușor sintetizate și derivate

Absorbanța puternică a calixarenelor permite separarea și detecția indirectă a unui număr mare de analiți.

Experimentul a fost influențat de mai mulți factori:

Compoziția tamponului

Efectul tăriei ionice

Efectul concentrației calixarenei

În urma acestui experiment, s-a constatat că prin utilizarea calixarenelor în electroforeza capilară, s-a separat un grup de 7 amino acizi în mai puțin de 16 minute, după ce au fost separați au fost detectați direct, [74 referat 1] după derivatizare. [75 referat 1], sau indirect . [76 referat 1]. Amino acizi nearomatici, glicina, alanina, serina, lizina ți arghinina prezintă o absorbanță în UV mică, numai 3 amino acizi aroamatici, fenilalanina, tirozina și triptofan absorb puternic în UV.

3. RECUNOAȘTEREA MOLECULARĂ A COMPUȘILOR BIOLOGICI CU RECEPORI MACROCICLICI

3.1. Considerații generale

Este cunoscut faptul că aminoacizii, proteinele, acizii nucleici fac parte din compușii biologici de mare importanță atât în domeniul medicinei (ei fiind vitali organismului) cât și procesele chimice de complexare cu compușii supramoleculari. Totodată în aceeași sferă de investigație se înscriu și carbohidrații.

În cele ce urmează se va prezenta o trecere în revistă a acestor compuși biologici extractibili cu receptori macrociclici, accentul find pus pe aminoacizi.

3.2. Compuși biologici extractibili cu receptori macrociclici

3.2.1. Aminoacizi

Aminoacizii sunt componentele monomere de bază ale proteinelor. Pot fi considerați alfabetul după care se „scriu” proteinele (20). Aminoacizii prezintă caracteristici comune ce permit legarea lor împreună pentru a forma lanțuri polipeptidice, dar în același timp au și unele caracteristici ce nu sunt comune, ceea ce determină un caracter unic al lanțului polipeptidic.

Există 20 de aminoacizi proteinogeni specificați prin codul genetic, prezenți în toate organismele vii.

Aminoacizii naturali au formula generală:

R-CH-COOH

NH2

în care gruparea aminică se află la carbonul față de carboxil. Excepție face prolina al cărui azot,deși tot în poziția față de carboxil, face parte dintr-un inel pirolidinic, fiind o grupă aminică secundară. În figura 3.1. este prezentată structura aminoacizilor din proteine.

Fig. 3.1. Structura aminoacizilor din proteine

Clasificarea aminoacizilor

Cea mai importantă clasificare a aminoacizilor se bazează pe polaritatea gruparilor R în apă la un pH apropiat de 7. Există patru clase importante: (21)

Distribuția lor calitativă și cantitativă într-o proteină determină caracteristicile chimice, valoarea nutritivă cât și funcțiile lor metabolice în organism. Dintre cei 20 de aminoacizi uzuali, organismul uman poate sintetiza un număr limitat de aminoacizi, restul fiind furnizați zilnic prin hrană și se numesc aminoacizi esențiali (9 – referat 3).Cei mai mulți autori, consideră drept aminoacizi esențiali următorii: valina, fenilalanina, metionina, lisina, triptofanul; alții, includ și leucina,izoleucina ,treonina și histidina.

Aminoacizii îndeplinesc mai multe roluri biologice, fiind în același timp:

ioni dipolari cu un moment de dipol mare, care determină o creștere considerabilă a mediului în care se dizolvă;

electroliți amfoteri solubili în apă, cu capacitatea de a acționa ca substanțe tampon în diferite domenii de pH;

sunt optic activi, datorită faptului că posedă unul sau mai mulți atomi de carbon asimetrici, cu excepția glicinei;

sunt compuși cu grupări reactive capabile să participe la reacții chimice având ca rezultat o mare gamă de produse sintetice;

sunt liganzi ai multor metale;

participă la reacții metabolice cruciale, de care depinde viața și sunt substanțe în vitro pentru o gamă mare de enzime;

sunt constituenți esențiali ai moleculelor proteice ale căror caractere specifice, biologice și chimice sunt determinate în mare parte de numărul, distribuția și interrelațiile aminoacizilor din care se compun.

Stereochimia aminoacizilor

Toți aminoacizii proteinogeni (cu excepția glicocolului) au un atom de carbon asimetric și deci pot exista sub forma a doi antipozi optici. Treonina și izoleucina au doi centri asimetrici și deci au patru stereoizomeri.

Activitatea optică este exprimată cantitativ prin rotația specifică []D , la temperatura de 20 sau 25, iar D fiind lungimea de undă – de obicei linia D a sodiului, 589.3 nm. Activitatea optică depinde de natura solventului, iar în cazul soluțiilor apoase, de pH. În general, rotația optică specifică a unui aminoacid monoaminic sau monocarboxilic este maximă la punctul izoelectric. Rotația specifică depinde de natura catenei aminoacidului.

S–a stabilit că toți aminoacizii din proteinele naturale se înrudesc cu L-glicerinaldehida și deci fac parte din seria L. În peretele celular al unor microorganisme sau în unele antibiotice se găsesc și aminoacizi din seria D. În notația modernă, literele D și L se înlocuiesc cu R, respectiv S./5,8 + referat 3/.

COOH COOH

H-C-NH2 H2N-C-H

R R

D-aminoacid L-aminoacid

Proprietăți electrochimice

Datorită prezenței în moleculă atât a unei grupări funcționale acide (-COOH), cât și a uneia bazice (-NH2), aminoacizii sunt substanțe cu caracter amfoter. Atât în cristale cât și în soluție apoasă, moleculele lor apar sub formă de ioni dipolari (amfioni). Dovada acestui fapt s-a făcut prin difracția razelor X, determinarea constantelor de bazicitate și aciditate, a momentelor dielectrice, precum și pe baza interpretării spectrelor Raman. Structura care reprezintă caracterul lor dipolar rezultă prin reacția protolitică intramoleculară:

R-CH-COOH R-CH-COO-

NH2 +NH3

În prezența acizilor sau bazelor, soluțiile aminoacizilor funcționează ca soluții tampon. Dacă se adaugă soluției de aminoacid un acid tare (HCl), protonii săi sunt consumați, dând un acid slab:

R-CH-COO- + H3O+ R-CH-COOH + H2O

+NH3 +NH3

În prezența unei baze tari, ionii HO- sunt consumați, formându-se o bază slabă:

R-CH-COO- + HO- R-CH-COO- + H2O

+NH3 +NH2

Punctul izoelectric al aminoacizilor

S-a constat că un aminoacid aflat în soluție acidă (pH mic) este protonat și există sub formă de cation iar în cazul unei soluții bazice (pH ridicat) aminoacidul este deprotonat și există sub forma de anion. Astfel, la o valoare de pH intermediara, aminoacidul trebuie să fie între forma anionică și cationică având o formă neutră, amfiionică. Acest pH se numește punct izoelectric. (22)

R R R

H3N+ – CHCOOH H+ H3N+ – CHCOO – H+ H2N – CHCOO-

pH mic punct izoelectric pH mare

protonat amfiion deprotonat

Punctul izoelectric al aminoacizilor depinde de structura acestora astfel:

Amoniacizii care au lanțuri laterale neutre au punctul izoelectric aproape de neutru, în domeniu de pH 5.0 – 6.5. (aceste valori nu sunt exact la pH = 7, deoarece grupările carboxil sunt mai puternic acide în soluții apoase decât bazicitatea grupărilor amino).

Aminoacizii cu lanțuri laterale acide au punct izoelectric destul de jos (acid)

Aminoacizii cu lanțuri laterale bazice sunt caracterizate de punct izoelectric mai mare (basic)

Un exemplu de astfel de aminoacizi este dat de acidul aspartic care este caracterizat de un punct izoelectric la pH = 3.0 și lizina ce are punctul izoelectric la pH = 9.7.

Reacțiile chimice ale aminoacizilor

O reacție importantă și specifică pentru gruparea – NH2 din poziția față de carboxil este reacția dată de ninhidrină. Prin încălzirea cu ninhidrină a unui aminoacid are loc o dezaminare oxidativă a acestuia. Acest tip de reacție este folosită pentru determinarea cantitativă a aminoacizilor. În prima fază se formează produsul de reducere al ninhidrinei, aldehida corespunzatoare aminoacidului , amoniac și bioxid de carbon: [24] În a doua fază, ninhidrina, produsul redus al ninhidrinei și amoniacul reacționează și dau o substanță albastră.

O altă reacție importantă este cea a grupării -amino cu 1-fluoro-2,4-dinitrobenzen (FDNB). (25) Această reacție a fost introdusă de Sanger pentru determinarea cantitativă a grupărilor amino din aminoacizi și peptide. FDHB reactionează cu -aminoacizii în soluție slab alcalină și formează derivați 2,4-dinitrofenil de culoare galbenă.

3.2.2. Peptide

Peptidele sunt combinații de tip amidic rezultate prin condensarea a două sau mai multor molecule de aminoacizi.

R-CH-COOH + H2N-CH-COOH -H2O H2N-CH-CONH-CH-COOH

NH2 R R R

Peptidele pot rezulta din două, trei sau "n" molecule de aminoacizi. Pentru sistematizarea acestor compuși, convențional ei se clasifică în (26):

peptide (oligopeptide) – compuși formați dintr-un număr relativ mic de -aminoacizi;

polipeptide – compuși formați dintr-un număr mai mare de -aminoacizi, dar cu masa moleculară mai mică de 10000;

proteine (poliprotide superioare, holoproteide) – compuși cu masa moleculară mai mare de 10000;

heteroproteide – compuși care pe lângă un lanț proteic, mai conțin și o grupare neproteică numită grupare prostetică.

Fiecare peptidă conține un aminoacid N-terminal și un aminoacid C-terminal (fig. 3.2.)

Fig. 3.2.Structura peptidelor http://www.molecularstation.com/molecular-biology-images/510-peptide-pictures/136-peptide-bond.html

Pentru a determina structura unei peptide se poate folosi o metodă de secventare a peptidei așa numita degradare Edman. Aceasta metodă este folisită pentru stabilirea aminoacidului N-terminal și constă în tratarea proteinei cu fenil izotiocianat, rezultând un compus tioureeic care prin degradare acidă conduce la restul de proteină și un derivat de N-fenil hidantoina ușor de identificat.

3.2.3. Proteine

Proteinele sunt structuri moleculare foarte sofisticate ce produc energie, materie și informație. (28). Ele sunt componente esențiale ale vieții. Se cunoaște faptul că proteinele catalizează un domeniu foarte mare de reacții chimice, furnizează o rigiditate structurală celulei, controlează circuitul materiei prin membrane, reglează concentrațiile metaboliților, acționează ca senzori și comutatori.

3.2.3.1. Clasificarea proteinelor

In funcție de compoziția lor proteinele se clasifică în două mari clase:

Proteinele simple – în urma hidrolizei se obțin doar aminoacizi (ex. albumina din resul sângelui);

Proteine conjugate – în urma hidrolizei se obțin pe lângă aminoacizi și grupări prostetice ( componente organice sau anorganice).

Din punct de vedere conformațional proteinele se împart în: proteine fibroase și proteine globulare.

3.2.3.2. Structura proteinelor

Cu cât numărul de -aminoacizi, care formează molecula unui compus de natură proteică este mai mare, cu atât problemele pe care le ridică structura acestor compuși sunt mai complexe. Cercetările efectuate în acest domeniu, au condus la rezultate experimentale pe baza cărora se disting patru grade structurale sau niveluri de organizare, deosebindu-se prin complexitatea lor. Acestea au fost numite structuri primare, secundare, terțiare și cuaternare (29-30).

Structura primară – este caracterizată de un aranjament liniar al aminoacizilor constituenți. Proteinele aflate în această structură au în partea stângă aminoacidul cu N-terminal iar în dreapta aminoacidul cu C – terminal.

Structura secundară este determinată de aranjarea în spațiu a catenei polipeptidice și de legăturile care se stabilesc între catene. Legăturile de hidrogen, între grupările NH- și C=O, joacă un rol esențial la acest nivel de organizare (31). Prin intermediul spectrelor de raze X, s-a stabilit că catena peptidica adoptă o conformație răsucită sub forma de elice sau una încrețită (plisată). Acest tip de structură se întâlnește în cazul proteinelor fibroase și globulare (cele globulare fiind mai încrețite în timp ce proteinele fibroase sunt alungite). Pentru acest tip de structură, lanțurile polipeptidice pot prezenta trei aranjamente geometrice: helix, (întâlnită în special în cazul proteinelor globulare) planurile (32): și ultima conformație cea rasucită “turns” este formată din patru segmente sub formă de U stabilizate prin legături de hidrogen între laturi. Sunt situate la suprafața proteinelor și redirecționează lanțul polipeptidic spre interior.(33)

Structura terțiară acest nivel de organizare înglobează structura secundară și definește raporturile dintre segmentele de -elice și structură , modul de împachetare a lanțului polipeptidic. Factorii determinanți ai structurii terțiare ai unei proteine sunt interacțiunile necovalente între radicalii R de la C, fie că aceștia se află în regiuni cu structură sau , fie că sunt cuprinși în segmente neorganizate. La acest nivel de organizare terțiar, molecula proteică dobândește forma sa specifică (34).

Structura cuaternară – proteinele pot conține două sau mai multe lanțuri polipeptidice care sunt unite prin aceleași forțe necovalente care stabilizează structura terțiara a proteinelor.

În fig. 3.3. sunt prezentate toate cele patru tipuri de structuri: primară, secundară, terțiară și cuaternară ale proteinelor (35) :

Fig. 3.3. Tipuri de structuri ale proteinelor

3.2.4. Acizii nucleici

Acizii nucleici în starea lor naturală sunt caracterizați de structuri tridimensionale.

S-a observat că acizii nucleici în asociere cu unele proteine fomează complecși supramoleculari cu structuri foarte complexe și activități funcționale cum ar fii ribozomii și virușii. Cantitatea de ADN ce furnizează un set complet de instrucțiuni genetice poartă denumirea de genom.

Dacă în bacterii genomul este constituentul unui singur cromozom, în organismele umane acesta este purtat într-un set de 46 de cromozomi (43).

După proveniența lor, respectiv după materialele din care au fost extrase, acizii nucleici erau considerați de două tipuri: acizi timonucleici (acizi nucleici din timus sau acizi nucleici animali) și acizi zimonucleici (acizi nucleici din drojdie sau acizi nucleici vegetali). Întrucât s-a constatat că deosebirea dintre ei constă în natura componentului glucidic (acizii timonucleici conțin în molecula lor dezoxi-D-riboza, iar acizii zimonucleici conțin D-riboza), denumirile lor au fost înlocuite cu denumirile de acizi dezoxiribonucleici (ADN), și acizi ribonucleici (ARN). Structura acestor compuși este rezentată în fig.3.4.

În urma unei hidrolize slab catalizata enzimatic, acidul nucleic se divide în blocurile lui monomerice denumite nucleotide. Fiecare nucleotidă poate fi divizată mai departe prin hidroliză catalizată enzimatic formând nucleoside și acidul fosforic, fiecare nucleosida putând fi mai departe hidrolizată formând compusul zaharos – aldopentoza și amina heterociclică.

Fig. 3.4. Structura ADN și ARN

4. DESCRIEREA PROGRAMULUI INDIVIDUAL DE DOCTORAT

Programul individual de doctorat a cuprins, în principal, trei etape:

E1 etapa de studiu documentar a literaturii de specialitate din țară și străinătate legată de tematica abordată prin teza de doctorat în vederea evidențierii următoarelor aspecte cheie:

elemente privitoare la tipuri și structuri ale compușilor supramoleculari;

aspecte legate de tipuri de complecși ai calixarenei și calixarenei funcționalizate cu substanțe biologice (în speță aminoacizi, peptide și nucleobaze)

modul de separare prin extracția lichid/lichid ai compelcșilor urmăriți

E2 – etapa de lucrări de laborator, respectriv:

etalonarea aparaturii instrumentale;

stabilirea modului de lucru;

selectarea procedurilor de analiză;

prepararea reactivilor și a produșilor de testat;

stabilirea modului de extracție;

determinarea parametrilor isntrumentalin și analitici, optimi de lucru;

asigurarea calității datelor analitice (AQC/QA/QC) în conformitate cu SR ISO 17025/2005.

E3 –etapa de prelucrare și interpretare a datelor experimentale.

Scopul programului doctoral l-a constituit dezvoltarea bazei de cunoștiințe teorteice și practice la utilizarea calixarenelor și al extracției selective a unor aminoacizi și alți compuși organici din soluții apoase, în vederea stabilirii parametrilor instrumentali și analitici optimi.

Trei obiective principale s-au urmărit în această direcție:

Extracția compușilor biologici cu calix[4]arena, calix[4]azaetercoroană și a dendrimerilor aplicată la: (i) aminoacizi, (ii) peptide și (iii) nucleobaze.

Caracterizarea transportului aminoacizilor alifatici și aromatici cu calix[4]azaetercoroană

Evaluarea factorilor de performanță în condiții optime de lucru, respectiv:

3.1. randamentul de extracție;

3.2. reproductibilitatea;

3.3 timpul optim de extracție

Schema nr. 4.1. prezintă sintetic modul de organizare al programului individual doctoral.

Schema nr. 4.1. Modul de organizare al programului individual doctoral

5.STUDIUL PRIVIND EXTRACȚIA AMINOACIZILORALIFATICI ȘI AROMATICI CU CALIX[4]ARENE FUNCȚIONALIZATE

5.1. Aspecte cu caracter introductiv

În chimia analitică și în mod special la separare, transportul joacă un rol improtant în analiza componenților din amestecuri, separarea amestecurilor racemice, recuperarea unor substanțe minerale, reciclare.

Calixarenele sunt molecule în formă de cupă (fig. 5.1.), conținând 4,5 sau 8 grupări fenolice unite între ele prin punți de metilen într-un macrociclu și sunt capabile să formeze complecși de incluziune cu o largă varietate de specii oaspete.

Fig. 5.1. Forma cupă a calixarenelor

Calixarenele funcționalizate, în calitate de extractanți s-au dovedit a fi receptori adecvați în extracția cu colvenți, în transportul prin membrane lichide precum și pentru separarea diferiților compuși.

Recunoașterea moleculară de compuși chimici și biologici de către calix[n]arene are la bază inetracțiuni multiple necovalente de tipul legăturilor de hydrogen, forțe van der Waals, legături π- π, stacking – cation π și efecte hidrofobe care depind de tipul, forma și flexibilitatea receptorului și a substratului.

În ultimii ani s-au sintetizat o serie de calix[4]arene funcționalizate având grefate pe ramurile inferioare ale calixarenei diverse grupări funcționale, capabile să mărească eficiența extracției.

5.2. Echilibre de repartiție în procesul de extracție a compușilor biologici utilizănd liganzi macrociclici

Extracția cu solvenți este o metodă de separare a componenților dintr-un amestec omogen solid sau lichid, într-un solvent selectiv numit extractor, pe baza diferenței de solubilitate.

Dacă amestecul inițial este lichid, procesul se numește extracție lichid-lichid; în cazul în care amestecul este solid, procesul se denumește extracție solid – lichid.

Aceste tehnici reprezintă procesele fundamentale de separare adoptate în cercetare și industrie pentru producerea de compuși chimici puri (de exemplu produse farmaceutice, substanțe organice grele, materiale nucleare, metale, etc) în chimica analitică cât și pentru tratarea deșeurilor din mediul înconjurător.

Primele procese de extracție s-au utilizat la izolarea și îmbogățirea compușilor naturali. În evul mediu, extracția s-a folosit pentru diverse studii experimentale iar după 1870 s-a întrebuințat la distrubuția de compuși organici și anorganici între dietileter sau sulfură de carbon și apă.

În anul 1891, W. Nernst a propus legea distribuției iar între 1900-1940 extracția cu solvenți s-a adoptat la separarea substanțelor organice și în chimica analitică – extracția de ioni metalici din acizi organici.

În perioada 1950 – 1960, extracția cu solvenți s-a introdus pentru separarea și procesul de purificare al metalelor iar după 1970 la recuperarea unor deșeuri din mediul ambiant.

5.2.1. Extracția bazată pe difuzia unei singure specii la interfața dintre faza apoasă și faza organică

Aminoacizii în forma protonată, R-NH3+, se pot extrage în solvenți organici după complexarea cu un ligand macrocilic și o cuplare au un anion adecvat (carte C. Luca 85-90). În astfel de cazuri trebuie lucrat la o valoare a pH-ului fazei apoase care să asigure formarea speciei protonate, conform echilibrului:

Caracterizat de constanta de aciditate

Forma cationică a aminoacidului existent în soluție într-un domeniu de pH dependent de valoarea constantei de aciditate Ka poate fi complexată de un ligand macrociclic, neutru, pe baza echilibrului:

Caracterizat de constanta de stabilitate β.

unde:

– reprezintă concentrația complexului după extracție (mol/L)

– reprezintă concentrația aminoacidului în faza apoasă înainte de extracție (mol/L)

[L] – reprezintă concentrația ligandului macrociclic în faza organică (mol/L)

5.2.2. Extracția bazată pe difuzăa unei perechi de ioni la interfața dintre faza apoasă și cea organică

Complexul format între aminaocid și ligandul macrociclic se poate extrage în solvent organic în formă de pereche de ioni, prin cuplarea cu un anion A-, acesta putând proveni de la un acid tare sau slab.

Echilibru caracterizat de constanta de aciditate

Valoarea constantei K’a determină domeniul de pH în care anionul A- predomină în soluție.

Complexul cationic , cuplat cu anionul A- se extrage din apă în solvent organicn potrivit echilibrului:

Cu constanta de extracție:

În cazul extracției unui aminoacid, specia HA care furnizează anionul de cuplaj A- trebuie ales în funcție de valoarea constantei sale de aciditateîn comparație cu constanta de aciditate a amincidului studiat. Condiția limită este:

Astfel la un pH = pKa = pK’a, R-NH2 este protonat (transformat în R-NH3+) și HA este transformat în A-.

Echilibrele chimice care au loc în sistemul lichid-lichid sunt prezentate în fig. 5.2.

Fig. 5.2. Echilibrele procesului de extracție a aminoacizilor

În cazul în care aminoacidul nu se extrage foarte bine în solventul organic sub formă de R-NH3A, K”ex având valoare mică, procesul de extracție se realizează pe baza echilibrului:

iar constanta de extracție este dată de relația:

Se cunoaște faptul că liganzii macrociclici sunt caracetrizață de valori mari ale constantelor de repartiție, ei fiind repartizați preferențial în solventul organic. În acest caz, raportul de distribuție al unui aminoacid este dat de relația:

Prin corelarea acestei ecuații cu expresia constantei de extracție Kex, rezultă:

Raportul de distribuție se poate determina experimental utilizând o metodă de analiză ce permite calcularea concentrației speciei extrase R-NH3LA în faza organică. Acest raport de distribuție permite și calculul constantei de extracție Kex, astfel ecuația de determinare a se poate scrie sub forma:

sau:

Aceste două ecuații permit determinarea grafică a constantei Kex. Această metodă a fost aplicată pentru extracția de aminoacizi complexați cu eteri coroană și cuplați cu anionul de galben de metanil (carte C. Luca 18) sau cuplați cu anionul acidului difenilamino-azobenzen-p-sulfonic (carte C. Luca 19).

5.3. Aparatură instrumentală și mod de lucru

5.3.1. Reactivi utilizați

Reactivi utilizați în procesele de extracție au fost următorii:

aminoacizi alifatici: L-alanina (L-Ala), L-valina (L-Val), L-leucina (L-Leu), L-izoleucina (fig. 5.3)

aminoacizi alifatici metilesteri: L-serina metilester (L-SerOMe), L-ciseina metilester (L-CysOMe), L-treolina metilester (L-ThrOMe), L-valina metilester (L-ValOMe), L-leucina metilester (L-LeuOMe), L-izoleucina metilester (L-IleOMe) (fig. 5.3.)

aminoacizi aromatici: L-triptofan (L-Trp), L-fenilalanina (L-Phe), L-tirozina (L-Tyr) (fig. 5.4.)

aminoacizi aromatici metilesteri: L-triptofan metilester (L-TrpOMe) L-fenilalanina metil ester (L-PheOMe), L-tirozina metilester (L-TyrOMe) (fig. 5.4.)

Fig. 5.3. Structura aminoacizilor alifatici, alifatici metilesteri

Fig. 5.4. Structura aminoacizilor aromatici, aroamtici metilesteri

calix[4]arenele și calix[4]azaetercoroană: calix[4]arena, p-terțbutilcalix[4]arena, dendrimer, calix[4]azaetercoroană 1 (1,3-[etilen-biaminocarbonilmetoxi]-p-terțbutilcalix[4]arena, calix[4]azaetercoroană 2 (1,3-[propilen-biaminocarbonilmetoxi]-p-terțbutilcalix[4]arena și calix[4]azaetercoroană 3 ………….

cloroform (p.a. Merck)

HCl, LiOH, NaOH, apă bidistilată

Acid picric și tropaeolin 00 ([4-4 " – (anilinofenilazo)] acid benzensulfonic) ca pereche de ioni (p.a.Fluka)

Calix[4]azaetercoroană (1-3) au fost sintetizate în laboratorul Laboratoire de Conception Moléculaire al Universității din Strasbourg, Franța. Structurile acestor calixaza-eteri coroana sunt prezenatate în fig. 5.5, 5.6 și 5.7.

Fig. 5.5. Structura chimică a calix[4]aza etericoroană (1)

Fig. 5.6. Structura chimică a calix[4]aza etericoroană (2)

Fig. 5.7. Structura chimică a calix[4]aza etericoroană (3)

STRUCTURA CALIXAZA-ETERCOROANA 3

SINTEZA CALIXAZA-ETERCOROANA 1-3

5.3.2. Aparatură utilizată

Extracțiile și aminoacizilor studiați cu calix[4]azaetercoroană 1-3 cât și cu ceilalți liganzi macrociclici (calix[4]arena, p-terțbutilcalix[4]arena, dendrimer) s-au realizat utilizând următoarele:

Sticlărie:

baloane cotate tip A de 25 și 50 și 100 ml

pipete gradate tip A de 1, 5 și 10 ml

pipete automate de 1 ml

pâlnii de separare de …

pahare Berzelius de 10 ml

Aparatură instrumentală:

balanță analitică Precisa

spectrometru UV-VIS tip Jasco V-530

Spectrometru Cary Bio

pH-metru Pracitronic MV-870 cu electrod de sticlă și electrod de calomel.

5.3.3. Mod de lucru

S-au preparat soluții stock în baloane de 100 de ml de aminoacizi alifatici și aromatici în apă de concentrație 1 x 10-3M, soluțiile perechilor de ioni, respectiv tropaeolin oo de concentrație 10-4M și acid picric de concentrație 10-3M, și soluțiile calix[4]azaeter coroană în cloroform saturat cu apă de concentrații 1,25 x 10-4M – 10-3M.

Din soluțiile stock au fost preparate soluțiile de lucru în baloane de 25 de ml care conțin: aminoacidul analizat de concetrații cuprinse între 5 x 10-4M și 1 x 10-3M, anionul pereche – acidul picric de concentrație 8 x 10-5M (în cazul în care s-a folosit acidul picric, probele au fost acidulate până la pH =2 cu HCl 0,05N) sau tropaeolin 00 de concentrație 3 x 10-5M (în acest caz probele au fost analizate la pH=5). pH-ul soluțiilor a fost măsurat cu pH-metrul digital MV-870 Pracitronic.

Extracția aminoacizilor alifatici și aromatici din faza apoasă în faza organică (CHCl3), s-a efectuat în pâlnii de separare astfel (fig. 5.8.):

Fig. 5.8. Prepararea soluțiilor necesare extracției aminoacizilor

5 ml soluție apoasă de aminoacid nativ sau metilester din soluția de lucru (cu anionul pereche – acid picric sau tropaeolin oo) cu 5 ml soluție organică (cloroform) de calix[4]arenă derivatizată din soluția stock au fost agitate timp de 30 de minute la temperatura de 20±10C.

Absorbanțele fazei apoase atât înainte de extracție cât și după extracție au fost citite la spectrometru la lungimea de undă nm în cazul în care s-a folosit tropaeolin oo și = 345 nm în cazul în care s-a folosit acidul picric ca anion pereche.

Au fost trastate și spectrele calix[4]azaeterilorcoroana (1-3) și s-a observat ca aceștia absorb la nm – calix[4]azaeterilorcoroana (1), nm – calix[4]azaeterilorcoroana (2) și nm – calix[4]azaeterilorcoroana (3).

Extractabilitatea a fost calculată după relația Pedersen [178], astfel:

unde: – absorbanța fazei apoase înainte de extracție;

– absorbanța fazei apoase după extracție;

Fiecare experiment a fost repetat de 5 ori.

5.4. Rezultate și discuții

Rezulatatele experimentale obținute în urma testării capacității de separare a compușilor biologici (aminoacizi, peptide, nucleobaze) utilizănd calix[4]azaetercoroană (1-3) sunt prezentate în capitolele următoare.

5.4.1. Aspecte privind extracția aminoacizilor alifatici cu calix[4]azaetercoroană (1-3) în prezența unui anion pereche

Aminoacizii alifatici sunt aminoacizii care conțin grupări funcționale legate de o catenă alifatică, chiar dacă în moleculă există un nucleu aromatic. Dintre aminoacizii alifatici, cei mai importanți sunt α –aminoacizii, cei care conțin grupele funcționale legate de același atom de carbon.

În următoarele capitole sunt prezentate rezultatele obținute în urma procesului de extracție lichid-lichid a L-Val, L și D-Ala, L-Leu, L-Ile utilizând ca extractant calix[4] funcționalizată 1, 2 și 3.

5.4.1.1. Extracția L-valinei cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Valina este un aminoacid alifatic, ce face parte din categoria acizilor monoamino – monocarboxilici, mai puțin solubil în apă datorită caracterului nepolar, cu structura prezentată în fig. 5.9. El este un aminoacid esențial fiind foarte important pentru metabolismul muscular, pentru refacerea țesuturilor, având rol și de calmant.

Fg. 5.9. Structura L-valinei

În lucrarea de față s-a studiat capacitatea de extracție a L-valinei utilizând trei liganzi macrociclici (calix[4]azaetercoroană (1-3)).

Soluția de aminoacid căt și soluțiile celor trei liganzi macrociclici au fost preparate conform fig. 5.8. având următoarele concentrații: L-Val = 5 x 10-4M, calix[4]azaeter-coroana (1-3) = 10-3M și tropaeolin 00 = 3 x 10-5M.

Procesul de extracție s-a realizat în prezența anionului pereche – tropaeolin oo de concentrație 3 x 10-5M, la pH 5,5. Absorbanțele fazei apoase atât înainte de extracție (absorbanța fazei apoase inițiale) cât și după extracție au fost citite spectrofotometric în domeniul VIS la lungimea de undă 440 nm.

Extractabilitatea (exprimată în randamente de extracție) a celor 3 calix[4]arene funcționalizate (1-3) este prezentată în fig. 5.10.

Fig. 5.10. Extractabilitatea L-Val utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Randamentele de extracție prezintă următoarea secvență descrecătoare:

Calix 2 (95.6%) > Calix 3 (81.3 %) > Calix 1 (75.2 %)

Capacitatea de extracție a L-valinei utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3) este destul de mare, calix 2 obținând cel mai mare randament de extracție, aporape de 100% (95.6%).

5.4.1.2. Extracția L-Alaninei cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Alanina denumită și acidul 2-aminopropanoic este un aminoacid neesențial, alifatic, ce face parte din categoria acizilor monoamino – monocarboxilici, cu caracter nepolar, având structura prezentată în figura…..

Alanina un aminoacid chimic nereactiv și are un rol important în stabilirea, precum și în menținerea, structurii tridimensionale a proteinelor datorită tendinței de a “evita” apa (hidrofobicitate).

Alanina conține o grupare amino grefată pe un schelet de acid propanoic (fig. 5.11.)

Fig. 5.11. Structura alaninei

Alanina se găsește sub forma a 2 izomeri: : L-alanina și D-alanina (fig. 5.12.). L-alanina este printre cei mai utilizați în sinteza proteinelor, în timp ce D-alanina a fost identificată în peretele celulelor bacteriene.

Fig. 5.12. Izomerii alaninei

În cazul alaninei, a fost sudiată capacitatea de extracție a ambilor izomeri (L și D).

Fig. 5.13.Extractabilitatea L-Ala utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Fig. 5.14.Extractabilitatea D-Ala utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

În fig. 5.13. și 5.14. sunt prezentate randamentele de extracție obținute pentru D și L-alanina (concentrație 5 x 10-4M) atât în prezența tropaeolin 00 (concentrație 3 x 10-5M) cât și în prezența acidului picric (concentrație 8 x 10-5M). După cum se poate observa, valorile randamentelor de extracție sunt mai mari în cazul în care s-a utilizat acidul picric ca anion pereche. În acest caz extracția a avut loc în mediul acid ( HCl 0,05N). Secvența randamentelor de extracție este următoarea:

Acid picric:

L-Ala Calix 3 (89.3%) > Calix 2 (84.1 %) > Calix 1 (78.9 %)

D-Ala Calix 3 (91.83%) > Calix 1 (90.71 %) > Calix 2 (89.07 %)

Tropaeolin 00:

L-Ala Calix 2 (70.9%) > Calix 3 (64.3 %) > Calix 1 (59.4 %)

D-Ala Calix 3 (68.97%) > Calix 2 (57.10 %) > Calix 1 (51.29 %)

Calix 3 a obținut randamentele de extracție cele mai mari (aproape de 100%) atât la pH 2 (acid picric + HCl 0.05N) cât și la pH 5.5 (tropaeolin 00), urmat de Calix 2 (randamente de extracție cuprinse între 84.1% – 57,1%) și Calix 1 (randamente de extracție cuprinse între 90.71% – 51.29%).

5.4.1.3. Extracția L-Leucinei cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Leucina (abrevierea Leu) ca și valina este un aminoacid esențial ce face parte din categoria aminoacizilor alifatici,cu radical nepolar (hidrofob) cu structura prezentată în fig. 5.15.

.

Fig. 5.15.Structura leucinei

Din punct de vedere al aplicațiilor, se cunoaște faptul că Leucina reglează nivelul de zahăr din sânge, ajută la refacerea țesuturilor, împedică distrugerea mușchilor în cazul unei traume suferite de organism sau a stresului și crește producerea de hormoni în organism.

În fig. 5.16. sunt prezentate rezultatele obținute în urma procesului de extracție lichid-lichid a leucinei cu cei trei liganzi macrociclici: calix 1, calix 2, calix 3.

Fig. 5.16. Randamentele de extracție pentru L-Leu utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Extracția L-Leu s-a realizat utilizând un anion pereche – tropaeolin 00 de concentrație 3 x 10-5M la pH 5.5. Concentrațiile extractantului, respectiv aminoacidului au fost: calix[4]azaeter-coroana (1-3) = 10-3M și L-Leu = 5 x 10-4M.

Rezultatele experimentale au demostrat faptul că receptorii macrociclici utilizați au o capacitate mare de extracție, obținându-se rezultate de la 60%- randament de extracție până la 92.4% – randament de extracție. Valoarea cea mai mare a fost obținută de către calix 2.

Extracția L-Izoleucinei cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Izoleucină sau acidul α-amino-βmetilvalerianic este un aminoacid ce prezintăWith a hydrocarbon side chain, isoleucine is classified as a hydrophobic amino acid. un lanț lateral de hidrocarburi, fiind clasificat ca un aminoacid hidrofob. Izoleucina este unul din cei doi aminoacizi care prezintă un lanț lateral chiral (fig.5.17.)

Fig. 5.17. Structura leucinei

Izoleucina prezintă 4 stereizomeri: L și D-izoleucină, alături de L și D-aloizoleucina

Din punct de vedere al aplicațiilor, ca și leucina, izoleucina ajută la refacerea mușchilor după exerciții fizice, creșterea nivelului de zahăr din sînge cât și a nivelului de energie.

Cele două faze utilizate în procesul de extracție au fost :

Faza apoasă : L-Ile de concentrație 5 x 10-4M, tropaeolin 00 – anion pereche și apă bidistilată

Faza organica : calix[4]azaetercoroană (1-3) de concentrație 10-3M saturată cu cloroform.

Ca și în cazul L-Leu, rezultatele experimentale prezentate în fig. 5.18. indică faptul ca cel mai bun extractant a fost calix 2, cu care s-a obținut un randament de extracție de 98.4% Secvența descrescătoare a randamentelor de extracție utilizănd cei trei receptori este:

Calix 2 (98.4%) > Calix 3 (84.2 %) > Calix 1 (70.8 %)

Se remarcă faptul că această capacitate de extracție a celor trei receptori este identică cu cea obținută și pentru L-Leu.

Fig. 5.18. Randamentele de extracție pentru L-Ile utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Elemente privind studiul extracției aminoacizilor alifatici metilesteri

Alături de studiile de extracție a aminoacizii alifatici prezentate în capitolele anterioare, au fost testate și capacitățile de extracție ale celor 3 calix[4]azaeteri coroana (1 -3) pentru aminoacizii alifatici metil esteri. În capitolele următoare sunt prezentate rezultatele obținute în urma procesului de extracție lichid-lichid a L-ValOMe, L-LeuOMe, L-IleOMe, L-SerOMe, L-CysOMe și L-ThrOMe.

Concentrațiile compușilor studiați au fost următoarele:

Faza apoasa: Aminoacidul metilester de concentrație 5 x 10-4M

Acidul picric de concentrație 8 x 10-5M (pH = 2) sau

Tropaeolin 00 de concentrație 3 x 10+5M (pH = 5.5)

Faza organică: calix[4]azaetercoroană (1-3) conc. 10-3M

Extracția L-Valinei metilester cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Structura L-ValOMe este prezentată în fig. 5.19.

Fig. 5.19. Structura valinei metilester

Rezultatele obținute (fig. 5.20.) arată faptul că randamentele de extracție sunt influențate de anionul pereche utilizat. Astfel, extractantul a avut o capacitate mai mare de extracție când s-a folosit acidul picric ca anion pereche, deci în mediul mai acid, pH = 2.2, randamentele de extracție obținute fiind de aproape 100 %.

Cel mai mare randament de extracție s-a obținut cu calix 1 (98.2%) atunci când s-a utilizat acidul picric ca anion pereche, iar cel mai mic randament de extracție s-a obținut cu calix 3 (16.9%) în acest caz folosindu-se ca anion pereche tropaeolin 00.

Fig. 5.20. Randamentele de extracție pentru L-ValOMe utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Extracția L-Leucinei metilester cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Structura L-LeuOMe prezentată în fig. 5.21. arată faptul că, spre deosebire de valina, leucina are o grupare metilen suplimentară.

Fig. 5.21. Structura L-LeuOMe

Ca și în cazul L-ValOMe, se observă că randamentele de extracție depind de anionul pereche utilizat. Astfel, dacă în cazul acidului picric s-au obținut randamente de extracție de la 78.99% până la 97.23%, în timp ce în prezența tropaeolinului 00 extractabilitatea aminoacizilor nu a depășit 50%.

Ordinea descrescătoare a extracției în prezența celor doi anioni pereche este următoarea:

Acid picric (pH= 2)

Calix 2 (97.23%) > Calix 1 (87.93 %) > Calix 3 (78.99 %)

Tropaeolin 00 (pH= 5.5)

Calix 2 (44.98%) > Calix 3 (34.08 %) > Calix 1 (17.72 %)

Fig. 5.22. Randamentele de extracție pentru L-LeuOMe utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Din fig. 5.22. se poate observa că extractantul cel mai bun pentru L-LeuOMe a fost calix 2.

Extracția L-Serina metilester cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Serina este un aminoacid alifatic (non-aromatic) ce derivă din aminoacidul glicina. El conține o grupare hidroxil (fig. 5.23.) care într-un micromediu special reprezintă situsul catalitic activ al multor enzime, având rolul unui catalizator nucleofil și putând ioniza.

Gruparea – OH face ca aminoacidul să fie extrem de reactiv și hidrofilic, putând foarte ușor să formeze legături de hidrogen.

Fig. 5.23. Structura L-SerOMe

Din rezultatele prezentate în fig. 5.24. se poate spune că L-SerOMe se extrage foarte bine cu calix[4]azaeter-coroana (1-3) dacă se utilizează anionul pereche acidul picric. În acest caz s-au obținut randamente de extracție foarte bune: cu calix 1 (98.33%) și cu calix 3 (73.78%).

Același lucru nu se poate spune și în cazul extracției în prezență de tropaeolin 00, unde randamentele de extracție au fost foarte mici, respectiv calix 2 (10.41%), calix 3 (6.72%) și calix 1 (5.92%).

Fig. 5.24. Randamentele de extracție pentru L-SerOMe utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Extracția L-treonina metilester cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Treonina este un amino acidul neutru, care are ca și serina o grupare hidroxil foarte reactivă, el fiind extrem de hidrofilic. This is an odd amino acid in that it contains two centers of asymmetry (two asymetric carbon atoms). Acesta este un aminoacid care conține doi atomi de carbon asimetrici. Atât carbonul α cât și carbonul β din structura (fig. 5.25.) treoninei sunt optic activi.

Fig. 5.25. Structura L-ThrOMe

În cazul treoninei metilester, se observă că randamentul de extracție cel mai mare s-a obținut cu extractantul 3 în prezența acidului picric – 71.15%, dar se observă extractantul 2 și 1 nu sunt reprezentați grafic, acești liganzi nu au avut capacitate de a extrage treonina metiester în prezența acidului picric. Nu același lucru se poate observa în cazul în care s-a utilizat tropaeolin 00 ca anion pereche. Cu toate că randamentele de extracție în acest caz sunt mai mici (calix 2 – 32.27%, calix 3 – 13.88%, calix 1 – 4.82%) se poate spune ca toți cei trei receptori au capacitatea de a extrage L-ThrOMe (fig. 5.26.).

Fig. 5.26. Randamentele de extracție pentru L-ThrOMe utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Extracția L-cisteina metilester cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Cisteina este un α – aminoacid, semiesențial, ceea ce înseamnă că poate fi biosintetizat în organismul uman.

Cisteina și metionina sunt cei doi aminoacizi care au legat de catena laterală o grupare –SH, ceea ce îl faceThis is extremely reactive, and can form hydrogen bonds. extrem de reactiv, putând forma legături de hidrogen. Cysteine is very important because it can also form disulphide bridges (explained in a later tutorial).

Chiar dacă prin gruparea-SH cisteina poate forma legaturi de hidrogen, caracterul alifatic al lanțului lateral îl face destul de hidrofob.

Structura cisteinei metilester este prezentată în fig. 5.27.

Fig. 5.27. Structura L-CysOMe

Spre deosebire de rezultatele obținute pentru ceilalți aminoacizi metili esteri, în cazul cisteinei s-au obținut randamente de extracție de aproape 50% în cazul extracție realizată în prezența tropeolin 00. Astfel ordinea descrescătoare a randamentelor de extracție este:

Calix 1 (49.36%) > Calix 2 (48.57 %) > Calix 1 (12.00 %)

În cazul în care s-a utilizat acidul picric ca anion pereche, calix 1 și calix 2 nu au putut extrage cisteina metilestre, în schimb despre calix 3 se poate spune că este un extractant foarte bun pentru L-CysOMe deoarece randamentul de extracție a fost de 78.04% (fig. 5.28).

Fig. 5.28.Randamentele de extracție pentru L-CysOMe utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)oleucina.

Elemente privind studiul extracției aminoacizilor aromatici

Aminoacizii aromatici sunt aminoacizii care conțin un inel aromatic. Datorită naturii hidrofobe a acestor inele aromatice, acești aminoacizi sunt foarte hidrofobi. Amino-acizi aromatici sunt relativ nepolari. Aminoacizii aromatici absorb lumina doar în domeniul UV. Tyrosine and tryptophan absorb more than do phenylalanine; tryptophan is responsible for most of the absorbance of ultraviolet light (ca. 280 nm) by proteins.

În capitolele următoare sunt prezentate rezultatele obținute în urma extracției aminoacizilor aromatici utilizând trei extractanți: calix[4]azaetercoroană 1, calix[4]azaetercoroană 2 și calix[4]azaetercoroană 3.

Extracția L-Triptofanului cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Triptofanul este un aminaocid aromatic, derivat al alaninei, ce prezintă un substituent indol la atomul de carbon β (fig. 5.29.). El este un aminoacid esențial, fiind cel mai mare aminoacid din structura unei proteine.

Fig. 5.29. Structura triptofanului

Majoritatea aminoacizilor aromatici studiați au un caracter hidrofob, însă triptofanul prezintă cea mai mare hidrofobicitate.

Concentrațiile soluțiilor utilizate în acest proces de extracție lichid-lichid au fost: soluția L-Trp concentrație 5 x 10-4M, tropaeolin 00 concentrație 3 x 10-5M și receptorii macrociclici – calix 1-3 de concentrație 10-3M. Extracția s-a realizat la pH 5.5.

Proteinele în structura cărora se regăsește triptofan pot absorbi în domeniul UV la lungimea de undă 280 nm. Utilizăndu-se tropaeolin 00 ca anion pereche, absorbanța fazei apoase s-a determinat în domeniul vizibil la lungimea de undă de 440 nm.

Absorbtivitatea molară a triptofanului este de cinci ori mai mare decât a tirozinei și de 50 de ori mai mare decât a fenilalaninei.

În fig. 5.30. se observă o creștere a randamentelor de extracție de la stânga la dreapta, respectiv de la calix 1 (43.7%), calix 2 (62.4 %) și calix 3 (71.1%).

Ca și în cazul alaninei, se observă că randamentele cele mai mari de extracție s-au obținut cu calix 3.

Fig. 5.30. Randamentele de extracție pentru L-Trp utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

5.4.3.2. Extracția L-Fenilalaninei cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Fenilalanina sau acidul -fenil–amino propionic face parte din categoria aminoacizilor aromatici, care alături de triptofan și tirozină determină proprietățile fluorescente ale proteinelor. El este un aminoacid esențial, clasificat ca fiind nepolar (hidrofob) datorită naturii hidrofobe a ciclului benzenic (fig. 5.31.).

În structura proteinelor și în mediu apos, acest aminoacid este orientat spre interiorul moleculei, evitând contactul cu apa, stabilindu-se interacții de tip van der Waals între mai multe molecule de fenilalanină.

Fig. 5.31.Structura fenilalaninei

Fenilalanina este un derivat al alaninei care poate fi convertintă în organism printr-o reacție de hidroliză cu ajutorul unei enzime fenilalanin-hidroxilaza în tirozină.

Ca și triptofanul, fenilalanina poate absorbi tot în domeniul UV la lungimea de undă 257 nm (datorită tranziției π- π*), dar în cercetările de față, utilizănd tropaeolin 00 ca anion pereche, banda s-a deplasat în domeniul vizibil, astfel încât absorbanța fazei apoase (ce conține fenilalanina de concentrație 5 x 10-4M, tropaeolin 00 de concentrație 3 x 10-5M și apă bidistilată), a fost obținută la lungimea de unda 440 nm.

Rezultatele obținute sunt prezentate în fig. 5.32.

Fig. 5.32. Randamentele de extracție pentru L-Phe utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Spre deosebire de alanina și triptofan, unde s-a obținut un randament foarte mare de extracție utilizănd calix 3, în cazul fenilalaninei, acest aminoacid fiind și el un derivat al alaninei, se observă însă o capacitate mai mare de extracție pentru calix 2. Secvența randamentelor de extracție arată însă o diferența mica între calix 2 și calix 3:

calix 2 (87.1%)>calix 3 (80.9 %) > calix 1 (55.1%)

Extracția L-Tirozinei cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Tirozina este un aminoacid semi-esențial, neutru, ce are în structură sa o grupare fenilică. El este un derivat al fenilalaninei prin hidroxilare în poziția para. Gruparea ei hidroxil are un caracter slab acid, ca și al fenolului, putând forma legături de hidrogen și este o grupare funcțională importantă a unor enzime, găsindu-se în situsul catalitic activ al acestora.

Tirozina este unul dintre cei mai răspândiți aminoacizi naturali. Se caracterizează prin slabă solubilitate în apă, dar este totuși mai solubil decât fenilalanina..

Ea are o deosebită însemnătate în organismele animale prin faptul că poate forma adrelină, tiroxină și tiramină.

Structura tirozinei este prezentată în fig. 5.33.

Fig. 5.33. Structura Tirozinei

După cum se poate observa în fig. 5.34., secvența randamentelor de extracție este foarte asemănătoare cu cea a fenilalaninei (tirozina fiind un derivat al fenilalaninei). Astfel, se poate observa ca randamentul cel mai mare de extracție a fost obținut cu calix 2 (84.41%), urmat de calix 3 (79.60%) și ultimul fiind calix 1 (61.22%).

Aceste rezultate indică faptul că repectorul macrociclic calix 3 este cel mai bun extractant atât pentru tirozină cât și pentru fenilalanina.

Fig. 5.34. Randamentele de extracție pentru L-Tyr utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Elemente privind studiul extracției aminoacizilor aromatici metilesteri

Aminoacizii aromatici metilesteri utilizați pentru acest studiu au fost: L-TrpOMe, L-PheOMe și L-TyrOMe.

Ca și în studiul celorlanți aminoacizi prezentați anterior și extracțiile acestor aminoacizi au fost efectuate în prezența acidului picric (concentrație 8 x 10-5M) și a tropaeolin 00 (concentrație 3 x 10-5M). Concentrațiile aminaocizilor studiați cât și a extractanților au fost: L-TrpOMe, L-PheOMe și L-TyrOMe – concentrație 5 x 10-4M și calix[4]azaetercoroană (1-3) de concentrație 10-3M.

Structurile cât și rezultatele obținute sunt prezentate în capitolele următoare.

5.4.4.1. Extracția L-TrpOMe cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Structura și rezultatele obținute sunt prezentate în fig. 5.35.

Fig. 5.35. Structura L-TrpOMe

Dacă în prezența tropaeolin 00 randamentele de extracție obținute scad de la calix 1 la calix 3, în prezența acidului picric acestea cresc de la calix 1 la calix 3.

Se observă o extracție mult mai bună a triptofanului metil ester cand se utilizează acidul picric, randamentele de extracție fiind de peste 80%, respectiv calix 3 (90.3%)>calix 2 (87.4 %) > calix 1 (81.5%) (fig. 5.36.).

Fig. 5.36.Randamentele de extracție pentru L-TrpOMe utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

5.4.4.2. Extracția L-PheOMe cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Fig. 5.37. prezintă structura L-PheOMe extras cu cei trei receptori macrociclici calix 1-3.

Fig. 5.37. Structura L-PheOMe

Utilizarea celor trei liganzi macrociclici calix 1-3 ca extractanți pentru L-PheOMe, a dus la obținerea unor randamente de extracție foarte mari, atât în cazul în care s-a utilizat tropaeolin 00 ca anion pereche cât și în prezența acidului picric. În fig…. se poate observa că secvența de extracție a celor trei liganzi este aceeași, indiferente de anionul pereche utilizat. Cel mai randament de extracție a fost obținut cu calix 2 (99.7%), urmat de calix 3 (99.3%) iar cel mai mic cu calix 1 (83.6%).

Rezultatele prezentate în fig. 5.38. indică faptul că toți cei trei receptori macrociclici sunt buni extractanți pentru L-PheOMe atât în prezența tropaeolin 00 cât și în prezența acidului picric.

Fig. 5.38.Randamentele de extracție pentru L-PheOMe utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

Extracția L-TyrOMe cu calix[4]azaetercoroană (1-3)

Structura L-TyrOMe extrasă cu liganzii calix 1-3 este prezentată în fig. 5.39.

Fig. 5.39. Structura L-TyrOMe

În cazul tirozinei metilester, acidul picric nu a favorizat extracția, acest lucru fiind observat prin lipsa din grafic a randamentelor de extracție pentru calix 1 și calix 2.

Nu același lucru se poate spune despre tropaeolin 00, în prezența căruia s-au obținut randamente de extracție între 63-83%. Capacitatea cea mai mare de extracție a avut-o calix 2 pentru care s-a obținut randamentul de 83.31% urmat de calix 3 – 80.69% și de calix 1 – 63.32% (fig. 5.40).

Fig. 5.40. Randamentele de extracție pentru L-TyrOMe utilizând calix[4]azaeter-coroana (1-3)

5.4.5. Aspecte privind extracția peptidelor utilizând calix 1

Peptidele sunt polimeri scurți ai α aminoacizilor uniți prin legături peptidice. In funție de numărul resturilor de monomer, peptidele pot fi: dipeptide, tripeptide sau chiar polipeptide, în cazul în care numărul de monomeri este de 50.

Pe lângă capacitatea de extracție a recepotrului macrociclic Calix 1 a aminoacizilor, s-a studiat și capacitatea acestui de a extrage peptide.

În fig. 5.41. este prezentată structura celor trei peptide utilizate în procesul de extracție lichi-lichid: Gly-L-Ala , L-Leu-Gly și Gly-L-Phe.

Fig. 5.41. Structura peptidelor

Extracția dipeptidelor de concentrații 5 x 10-4M a avut loc în prezența anionilor pereche: tropaeolin 00 (concentrație 3 x 10-5M) la pH 5.5 și acid picric (concentrație 8 x 10-5M) la pH 2 (prin acidulare cu HCl 0.05 N).

Dacă în cazul extracției aminoacizilor alifatici și aromatici calix 1 a obținut randamente de extracție de peste 50%, în cazul peptidelor, se observă în fig. 5.42. că randamentele de extracție sunt sub 10%.

Fig. 5.42. Randamentele de extracție pentru Gly-L-Phe, L-Leu-Gly, Gly-L-Ala utilizând calix[4]azaeter-coroana (1) în prezența tropaeolin 00

Fig. 5.43. Randamentele de extracție pentru Gly-L-Phe, L-Leu-Gly, Gly-L-Ala utilizând calix[4]azaeter-coroana (1) în prezența acidului picric

Rezultatele obținute prezentate în fig. 5.43. conduc la următoarele observații:

prin folosirea anionului pereche – tropaeolin 00, ecartul randamentelor de extracție se situează în domeniul 7.62% – 4.27%, ordinea fiind:

Gly-L-Ala > Gly-L-Phe > L-Leu-Gly

dacă acidul picric se utilizează ca anion pereche, ecartul eficiențelor de extracție la celeași peptide este de: 8.58% – 0.72% în ordinea:

Gly-L-Phe > L-Leu-Gly > Gly-L-Ala

Din datele obținute se poate spune că tropaeolin 00 conduce la randamente mai bune de extracție (în medie 5.4%) față de acidul picric (medie 3.41%).

5.4.6. Studiul privind extracția nucleobazelor utilizând diferiți liganzi macrociclici

Este cunoscut faptul că moleculele bazelor azotate intră în constituirea nucleotidelor, ele însele fiind constituente ale ARN și ADN.

Există o serie de publicații legate de metodele de separare ale nucleobazelor fie prin electroforeză (S.E: Geldart, P.R. Brown, J. Chromatogr. A 831 (1999) 123.) sau alte tehnici, dar utilizarea separării prin extracție lichid-lichid nu a fost foarte studiată.

În acest sens, în capitolul de față s-a luat în considerare utilizarea unor baze purinice și pirimidinice în scopul evidențierii capacității de extracție a unor liganzilor macrociclici.

Nucleobazele utilizate au fost: adenina (din categoria bazelor azotate purinice) și citozina (din categoria bazelor azotate pirimidinice). Structurile acestor nucleobaze sunt prezentate în fig. 5.44.

Fig. 5.44. Structura nucleobazelor- adenina și citozina

Liganzii macrociclici utilizați pentru extracția acestor nucleobaze au fost: calix[4]arena, p-terțbutilcalix[4]arena și ca calix[4]azaeter-coroana (2). Structurile acestor receptori sunt preezntate în fig. 5.45.

Fig. 5.45. Structura liganzilor macrociclici utilizați

Faza apoasă implicată în procesul de extracție a conținut: soluțiile nucleobazelor (adenina și citozina) de concentrații 8 x 10-5M, anionul pereche tropaeolin de concentrație 1 x 10-5M și apă bididstilată, iar faza organică receptorii macrociclici, respectiv calix[4]arena, p-terțbutilcalix[4]arena și calix[4]azaeter-coroana de concentrații 5 x 10-4M. Rezultatele obținute sunt prezentate în fig. 5.46.

Fig. 5.46. Randamentele de extracție pentru adenina și citozina utilizând calix[4]azaeter-coroana (2) p-terț-butil-calix[4]arena și calix[4]arena

Din cei trei extractanți studiați calix 2 a avut cea mai mare capacitate de extracție, pentru citozină obținându-se un randament de extracție de 42.05%. În polul opus, cel mai mic randament de extracție a fost obținut cu p-terț-butil-calix[4]arena, care atât pentru adenina cât și pentru citozina a obținut randamente de extracție de sub 2%.

Rezultatele prezentate în fig. 5.46. scot în evidența faptul că pentru nucleobazele studiate extractantul cel mai bun este calix 2.

5.4.7. Studiul privind extracția aminoacizilor neproteici calix 2

Spre deosebire de aminoacizii de tip α, în care gruparea amino este legată la carbonul α, în cazul aminoacizilor neproteici gruparea amino este legată la carbonul β, de aici și denumirea de aminoacizi de tip β. Acest tip de aminoacizi nu participă la formarea proteinelor, ei se regăsesc în proteine doar în urma unor modificări ce pot apărea în timpul sintezei proteinelor.

În cadrul acestei lucrări a fost studiat calix 2 – ca extractant pentru o serie de aminoacizi neproteici: β – alanina, acidul 5-aminocaproic, acidul 6-aminocaproic și acidul 8-aminocaprilic.

β – alanina sau acidul 3-aminopropanoic (fig.5.47.) este un aminoacid non esențial , singurul acid natural beta amino. Ea se formează în urma sintezei în țesutul muscular a aminaocidului dipeptidic derivat – carnozina.

Fig. 5.47. Structura acidului 3-aminopropanoic

Acidul aminocaproic (fig.5.48.) este un analog al aminoacidului lizina. Acest tip de aminoacid neproteic prezintă capacitatea de a fi un foarte bun inhibitor pentru enzime, el având o serie de aplicații în medicină.

Fig. 5.48. Structura acidului aminocaproic

Testarea capacității receptorului calix 2 de a extrage acest tip de aminoacizi, de concentrație 5 x 10-4M, s-a realizat în prezența unui anion pereche – tropaeolin 00 de concentrație 3 x 10-5M.

În fig. 5.49. sunt prezentate randamentele de extracție obținute.

Fig. 5.49. Randamentele de extracție pentru aminoacizii neproteici utilizând calix (2)

Randamentele de extracție cresc cu creșterea numărului legăturilor de hidrogen formate, astfel, dacă în cazul acidului 5 aminocaproic s-a obținut un randament de extracție de 8.67%, în cazul acidului 8-aminocaprilic s-a obținut un randament de extracție de 31.31%.

5.4.7. Extracția aminoacizilor alifatici și aromatici cu diferite concentrații de calix 1

Cercetările efectuate în această lucrare au ca pricipal scop utilizarea unor receptori macrociclici de tip calix[4]azaeter-coroana (1), (2) și (3) în procesele de separare a unor compuși biologici. În acest sens, pentru a vedea cum variază randamentele de extracție în funcție de concentrația diferită de ligand, calix (1) a fost selectat pentru a fi utilizat ca extractant atât pentru un aminoacid alifatic cât și unul aromatic.

Aminaocidul alifatic selectat a fost L-Alanina – concentrație 5 x 10-4M ( în prezența anionului pereche acid picric de concentrație 8 x 10-5M obținându-se randamente de extracție de peste 90%), iar aminoacidul aromatic selectat a fost L-PheOMe 5 x 10-4M (în prezența anionului pereche tropaeolin 00 de concentrație 3 x 10-5M s-a obținut tot un randament de extracție de peste 90%).

Concentrațiile ligandului calix (1) au fost 1 x 10-3M; 5 x 10-4M; 2,5 x 10-4M; 1,25 x 10-4M.

În tabelul 5.1. sunt prezentate rezultatele obținute de calix (1).

Tabel 5.1. Randamentele de extracție obținute pentru L-PheOMe și L-Ala

Fig. 5.50.Extracția aminoacizilor aromatici în funcție de concentrația de ligand calix (1)

Rezultatele prezentate în fig. 5.50. demonstrează faptul că există o strânsă legătură între concentrația ligandului și capacitatea sa de a extrage compușii biologici (cu cât concentrația este mai mare cu atât și capactitatea lui de a extrage este mai mare). Randamentele de extracție cele mai mari au fost obținute în cazul în care concentrația ligandului a fost de 10-3M atât pentru aminoacidul alifatic cât și pentru cel aromatic.

Calix (1) este mai selectiv în extracția aminoacizilor aromatici, comparativ cu cei alifatici, randamentele de extracție fiind de aproape 4 ori mai mari.

5.4.8. Corelația dintre extractibilitatea și hidrofobicitatea aminoacizilor aromatici și alifatici

Capacitatea de extracție a aminoacizilor alifatici și aromatici de către calix[4]azaeterii coroană (1-3) poate fi dependentă de hidrofobicitatea aminoacizilor studiați. În fig. 5.51. este prezentată relația dintre extracție (%) și hidrofobicitatea aminoacizilor.

Fig. 5.51. Relația dintre hidrofobicitate (* ref. 182) și extracția aminoacizilor

alifatici și aromatici cu calix[4]azaeterii coroană (1-3) în prezența tropaeolin 00 ca anion pereche

Rezultatele prezentate în fig. 5.51. indică faptul că între extracția aminoacizilor studiați cu calix (1-3) și hidrofobicitatea lor nu există nici o relație.

5.4.9. Extracția unor compuși biologici utilizând dendrimer

Dendrimerii, spre deosebire de polimerii liniari, sunt macromolecule monodisperse cu o structură unică ce permite formarea unor multiple complexări prin grupările terminale. Datorită formei globulare și a prezenței cavității interne, aceste macromolecule au capacitatea de a reține molecule oaspete în interiorul cavității. În fig. 5.52. este prezentată structura unui dendrimer cu cele trei părți principale.

Proprietățile dendrimerilor sunt influențate de lanțurile terminale ale acestuia. Astfel, solubilitatea dendrimerilor este puternic infleunțată de natura grupărilor de suprafață. Dendrimerii care au grupările terminale hidrofile sunt solubile în solvenți polari, în timp ce dendrimerii care au grupările terminale hidrofobe sunt solubile în solvenți nepolari.

Fig. 5.52. Reprezentarea schematică a celor trei părți principale ale dendrimerului

Dendrimerul utilizat în studiul de față prezintă structura……

Compușii biologici utilizați au fost aminoacizii aromatici metil esteri: L-TrpOMe, L-PheOMe, L-TyrOMe și nucleobazele adenina și citozina.

Faza organica: dendrimerul de concentrație 2,5 x 10-5M saturat în cloroform

Faza apoasă: L-TrpOMe – concentrație 10-4M

L-PheOMe – concentrație 10-3M

L-TyrOMe – concentrație 10-3M

Adenina – concentrație 10-3M

Citozina – concentrație 10-3M

Rezultatele obținute (fig. 5.53.) indică o tendință descrescătoare de extracție de la L-TrpOMe >L-PheOMe>L-TyrOMe>Adenina>Citozina, randamnetul cel mai mare fiind de 32,05 pentru L-TrpOMe.

Fig. 5.53. Randamente de extracție pentru aminoacizi și nucleobaze utilizând dendrimerul

5.4.10. Stoechiometria aminoacizilor aromatici și alifatici cu calix 1

În vederea stabilirii raportului de combinare dintre liganzii macrociclici calix[4]azaetercoroană (1-3) și compușii biologici studiați, s-au efectuat extracții cu concentrații diferite de liganzi, menținând concentrația aminoacizilor constantă.

Raportul de distribuție se calculează cu formula de mai jos:

unde: – reprezintă concentrația aminoacidului în faza organică

– reprezintă concentrația aminoacidului în faza apoasă

Pentru determinarea concentrației aminoacidului în faza organică, s-a aplicat legea Beer și s-a calculat concentrația complexului:

Unde:

A = absorbanța fazei apoase după extracție

= coeficientul de extincție calculat anterior

L = lungimea cuvei (1 cm)

Concentrația aminoacidului din faza apoasă , este dată de concentrația inițială a aminoacidului minus concentrația complexului .

Raportul de distribuție D, se va calcula:

Stoechiometria formării complecșilor a fost determinată prin metoda pantei dreptei obținută grafic printr-o dependență liniară ligand macrociclic – aminoacid. În acest sens au fost selectați doi aminoacizi alifatici (L-Ala și L-Val – conc. 5 x 10-4M) și doi aminoacizi aromatici emilesteri (L-PheOMe și L-TrpOMe – conc. 5 x 10-4M). S-au utilizat anioni pereche atât pentru aminoacizii alifatici cât și pentru cei aromatici metilesteri, pentru cei alifatici s-a utilizat acidul picric (conc. 8 x 10-5M) ca anion pereche, iar pentru cei aromatici metilesteri, s-a utilizat tropaeolin 00 (conc. 3 x 10-5M).

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 5.2.

Tabel 5.2.Valorile lui log D și log L, obținute în urma extracției aminoacizilor aromatici

cu concentrații diferite de ligand macrociclic

Elementele legate de compoziția complecșilor aminoacizilor extrași în faza organică sunt prezentate în fig. 5.54 – 5.57.

Fig. 5.54.Raportul de combinare a L-Ala cu calix 1

Fig. 5.55. Raportul de combinare a L-Val cu calix 1

Fig. 5.56. Raportul de combinare a L-PheOMe cu calix 1

Fig. 5.57. Raportul de combinare a L-TrpOMe cu calix 1

Conform graficelor prezentate mai sus, se observă că pentru toți aminoacizii studiați s-au obținut curbe liniare cu panta 1, raportul de combinare a calix 1 cu toți amoniacizii studiați fiind 1:1.

5.4.11. Determinarea constantelor de e xtracție a aminoacizilor aromatici și alifatici cu calix 1

S-au calculat constantele de extracție pentru doi aminoacizi alifatici, L-Ala, L-Val și doi aminoacizi aromatici metil esteri L-TrpOMe și L-PheOMe. Atât pentru aminoacizii alifatici cât și pentru cei aromatici, extracția s-a realizat in prezența unui anion pereche, pentru aminoacizii alifatici s-a utilizat acidul picric (conc. 8 x 10-5M), iar pentru cei aromatici metilesteri s-a utilizat tropaeolin 00 (conc. 3 x 10-5M).

Complexul cationic format între aminoacizii studiați și calix 1, cuplat cu anionul A- se extrage din faza apoasă în faza organică conform echilibrului:

Cu constantă globală de extracție:

unde: – concentrația complexului după extracție (mol/L)

– concentrația aminoacidului în faza apoasă (mol/L)

[L] – concentrația ligandului macrociclic în faza organică (mol/L)

[A] – concentrația anionului pereche

În tabelul 5.3. sunt prezentate constantele de extracție obținute.

Tabel 5.3. Constantele de extracție ale aminoacizilor alifatici și aromatici cu calix 1

*Cligand =1,25 x 10 -4 – 10-3 M

**Caminoacid = 5 x 10-4 M

Chiar dacă structura aminoacizilor studiați este diferită, unii aminoacizi fac parte din categoria celor alifatici iar ceilalți din categoria celor aromatici, diferența dintre constantele de extracție obținute este minoră, cea mai mare constanta de extracție obținându-se pentru L-Ala iar cea mai mică pentru L-PheOMe.

5.4. Concluzii

5.4.1. Concluzii generale

Procesul de extracție lichid – lichid este o metodă de separare a componenților dintr-un amestec omogen lichid, într-un solvent selectiv numit extractor, pe baza diferenței de solubilitate.

În lucrarea de față a fost studiată capacitatea unor liganzi macrociclici, calix[4]azaetercoroana 1-3 de a extrage compuși biologici. Din clasa compușilor biologici au fost studiați aminoacizii alifatici, aromatici metilesteri, neproteici, peptidele și nucleobazele.

Extracția depinde atât de concentrația ligandului macrociclic cât și de cea a compușilor biologici, randamentele de extracție cele mai mari au fost obținute în cazul în care concentrația ligandului a fost de 5 x 10-4M.

5.4.2. Concluzii specifice privind extracția aminoacizilor

Cercetările efectuate în cadrul acestei lucrări au arătat faptul că randamentele de extracție sunt influențate de anionul pereche utilizat. Astfel, extractantul a avut o capacitate mai mare de extracție când s-a folosit acidul picric ca anion pereche, deci în mediul mai acid, pH = 2.2, randamentele de extracție obținute fiind de aproape 100 %.

Din punct de vedere al selectivității liganzilor macrociclici față de aminoacizii studiați, s-a observat că receptorul calix 3 este mai selectiv în extracția aminoacizilor aromatici (s-au obținut randamente de extracție de până la 99,27% pentru L-PheOMe), comparativ cu cei alifatici.

Raportul de combinare a calix 1 cu toți amoniacizii studiația este 1:1.

5.4.3. Concluzii specifice privind extracția peptidelor

Dacă în cazul extracției aminoacizilor alifatici și aromatici calix 1 a obținut randamente de extracție de peste 50%, în cazul peptidelor randamentele de extracție au fost sub 10%.

Influența anionului pereche a fost observată și în cazul extracției peptidelor. Din datele obținute se poate spune că utilizarea tropaeolin 00 ca anion pereche conduce la randamente mai bune de extracție (în medie 5.4%) față de acidul picric (medie 3.41%).

5.4.4. Concluzii specifice privind extracția nucleobazelor

Extracția nucleobazelor a fost efectuată utilizând trei liganzi macrociclici: calix[4]arena, p-terțbutilcalix[4]arena și calix[4]azaetercoroana 2. Rezultatele obținute evidența faptul că pentru nucleobazele studiate extractantul cel mai bun este calix 2.

5.4.5. Concluzii specifice privind extracția aminaocizilor neproteici

Numărul legăturilor de hidrogen formate, poate influența randamentele de extracție, astfel, dacă în cazul acidului 5 aminocaproic s-a obținut un randament de extracție de 8.67%, în cazul acidului 8-aminocaprilic s-a obținut un randament de extracție de 31.31%.

6. TRANSPORTUL AMINOACIZILOR ALIFATICI ȘI AROMATICI CU CALIXAZA [1,3]

6.1. Aspecte cu caracter general

Rezultatele cercetărilor din ultimii ani asupra mecanismelor de transport prin membrane asistat de transportori macrociclici deschid noi orizonturi chimiei supramoleculare cu implicații importante în chimia abiotică. (C. Luca carte)

Cercetările anterioare au demonstrat faptul că procesul de transport prin membrane este mult mai eficient în cazul în care se utilizează ca transportori liganzii macorciclici, acest lucru fiind în principal datorat atât cavității endopolare cât și a exteriorului lipofilic al acestora.

În ceea ce privește transportul prin membrane lichide, au fost stabilite trei tipuri de sisteme de transport (difuzia, transportul facilitat și transportul activ) cu diferențe în funcție de caracteristicile substanței trasportate.

Încă din 1983, de când au fost descoperiți calixeteriicoroană, au fost dezvoltate o serie de cercetări legate de sinteza și de recunoașterea moleculară, în scopul utilizării acestor receptori macrociclici în procesele de cataliză, electrozi ion selectivi și transportul prin membrane lichide. Prin înlocuirea O-donorilor eterului coroană cu N-donori se formează „azacoroană”. Cele mai recente cercetări calitative legate de prorietățile legăturii ionice ale calix[4]azaetercoroană au indicat o afinitate aparent slabă pentru ionii metalelor divalente și trivalente. (I. Queslati – Cali(aza)crowns: sznthesis, recognition and coordination. A mini review.)

În capitolele următoare se vor prezenta rezultatele obținute în urma utilizării calix[4]azaetercoroană [1-3] ca transportori pentru aminoacizii alifatici și aromatici.

6.2. Aparatură instrumentală și mod de lucru

6.2.1. Reactivi utilizați

Reactivi utilizați în procesele de transport prin membrană au fost următorii:

aminoacizi alifatici (fig….): L-alanina (L-Ala), L-valina (L-Val), L-leucina (L-Leu), L-izoleucina (L-Ile)

aminoacizi alifatici metilesteri (fig….): L-serina metilester (L-SerOMe), L-valina metilester (L-ValOMe), L-leucina metilester (L-LeuOMe)

aminoacizi aromatici metilesteri (fig….): L-triptofan metilester (L-TrpOMe) L-fenilalanina metil ester (L-PheOMe)

calix[4]azaetercoroană 1 (1,3-[etilen-biaminocarbonilmetoxi]-p-terțbutilcalix[4]arena, și calix[4]azaetercoroană 3 …………. (fig….). Acești receptori macrociclici au fost sintetizați în laboratorul Laboratoire de Conception Moléculaire al Universității din Strasbourg, Franța

cloroform (p.a. Merck)

Soluție tampon (NaOAc/HCl și MES/NaOH), puritate analitică

Acid picric și tropaeolin 00 ([4-4 " – (anilinofenilazo)] acid benzensulfonic) ca pereche de ioni (p.a.Fluka)

Apa bidistilată (Milipore)

6.2.2. Aparatură utilizată

Procesul de transport prin membrană a aminoacizilor alifatici și aromatici metilesteri a fost realizat utilizănd dispozitivul din fig. 6.1.

Fig. 6.1. Dispozitivul utilizat pentru procesul de transportul prin membrane

Procesul de transport prin membrane, indiferent de natura sistemului membranar, are la baza următoarele etape:

Difuzia speciei chimice (M+A-) din faza apoasa sursă (FS) la interfața cu membrana (M). În cazul cercetărilor prezentate în lucrarea de față s-a utilizat ca fază sursă (FS): 5 ml soluție apoasă de aminoacid alifatic sau aromatic metilester de concentrație 5 x 10-4 M, s-a lucrat la pH = 5.5 utilizând anionul pereche tropaeolin 00 de concentrație 3 x 10-5 M și la pH = 2 (HCl 0,05 N) utilizând acidul picric de concentrație 8 x 10 -5 M ca anion pereche;

Adsorbția speciei chimice (M+A-), în cazul nostru a aminoacidului, precum și a transportorului la interfață;

Formarea complexului transportor – specie chimică transportată [M+A….C]la interfața FS/M; În cazul nostru membrana a fost formată din 20 ml calix[4]arena funcționalizată în cloroform de concentrație 5 x 10-4 M;

Desorbția complexului la interfața M/FR. Faza receptoare fiind constituită din 5 ml soluție apoasă Li OH 0,001 N pH = 11

6.2.3. Mod de lucru

Utilizarea calix[4]azaetercoroana ca transportor a presup următoarele etape:

Prepararea soluțiilor stock și a soluțiilor de lucru pentru faza sursă, membrană și faza receptoare;

Introducerea celor trei soluții de lucru în dispozitivul descris în fig…… și agitarea lor cu o viteza de 180 rpm la temperatura camerei timp de 24 de ore;

Determinarea spectrofotometrică a concentrației aminaocidului studiat atât pentru faza sursă cât și pentru faza receptoare prin citirea absorbanțelor la spectrofotometrul UV-VIS Jasco V-530;

Calcularea randamentului de transport utilizănd formula de calcul…..

unde: – absorbanța fazei apoase din faza receptoare, după transport;

– absorbanța fazei apoase inițiale din faza sursă, înainte de transport.

Utilizarea acidului picric și a tropaeolinului ca anioni pereche, a mutat banda spectrala a soluțiilor de aminoacizi în domeniul viz ibil, astfel absorbanțele fazei surse și fazei receptoare au fost citite la spectrometru la lungimea de undă nm în cazul în care s-a folosit tropaeolin oo și = 345 nm în cazul în care s-a folosit acidul picric ca anion pereche.

Apa și cloroformul au fost saturate fiecare, una cu cealaltă, înainte de transport iar pH-ul soluției apoase s-a măsurat cu un pH-metru Pracitronic MV-870 cu electrod de sticlă. Fiecare experiment a fost repetat de trei ori.

6.3. Rezultate obținute

Randamentele de transport obținute în urma utilizării calix[4]azaetericoroană (1,3) ca transportori sunt prezentate în capitolele următoare.

6.3.1. Transportul aminoacizilor aromatici și alifatici metilesteri cu calix[4]azaetercoroană 1

În procesul de transport al aminoacizilor aromatici metilesteri s-a utilizat calix[4]azaetercoroană 1, a cărui structură este prezentată în fig. 6.2., el asigurând transportul speciilor investigate din faza sursă în faza receptoare. Componența celor trei faze a fost:

Faza sursă: Aminoacid aromatic și alifatic metilester (conc. 5 x 10-4 M), acid picric (conc. 8 x 10 -5 M) sau tropaeolin 00 (conc. 3 x 10-5 M) HCl (conc. 0,05 N), apa bidistilată.

Membrana: calix[4]azaetercoroană 1, cloroform

Faza receptoare: Li OH 0,001 N pH = 11

Fig. 6.2. Structura calix[4]azaetercoroană 1

Fig. 6.3. Transportul aminoacizilor aromatici și alifatici metilesteri cu calix[4]azaetercoroană 1

Randamentele de transport (fig. 6.3.) ale aminoacizilor studiați au fost până în 50%, cu următoarea secvență:

L-SerOMe > L-ValOMe > L-TrpOMe >L-PheOMe >L-LeuOMe

Rezultatele obținute indică faptul că structura aminoacizilor poate influența procesul de transport, astfel pentru aminoacizii alifatici metil esteri au fost obținute randamente de extracție mai mari decât în cazul celor aromatici metilesteri.

6.3.2. Transportul aminoacizilor alifatici cu calix[4]azaetercoroană 1

Ca și în cazul transportului aminoacizilor metil esteri s-au utilizat atât acidul picric cât și tropaeolin 00 ca anioni pereche, iar membrana cu transportorul calix[4]azaetercoroană 1. Spre deosebire de transportul aminoacizilor aroamtici și alifatici metil esteri, în cazul celor alifatici s-au obținut randamente de transport mai mici (fig. 6.4.) 42,74% pentru L-Ala, 9,49% L-Val și 0.57% L-Ile.

Fig. 6.4. Transportul aminoacizilor alifatici cu calix[4]azaetercoroană 1

6.3.3. Transportul aminoacizilor alifatici cu calix[4]azaetercoroană 3

Structura calix 3

Randamentele de transport (fig. 6.5.) obținute se încadrează în intervalul 65,21 – 80,63%. Cele mai mari valori s-au obținut pentru aminaocizii aromatici metilesteri, L-PheOMe 80,63%, L-TrpOMe 77,3%, urmați de aminoacizii alifatici metilesteri L-ValOMe 69,28%, L-LeuOMe – 68,64%, L-SerOMe 65,21%. Aminoacizii aromatici derivatizați sunt caracterizați de o hidrofobicitate mai mare decât aminoacizii alifatici, rezultând astfel randamente de transport mai mari.

Fig. 6.5. Transportul aminoacizilor aromatici și alifatici metilesteri cu calix[4]azaetercoroană 3

6.3.4. Transportul aminoacizilor aromatici și alifatici metilesteri cu calix[4]azaetercoroană 1 și 3

Transportul aminoacizii aromatici și alifatici metilesteri a fost realizat atât cu calix 1 cât și cu calix 3. Rezultatele prezentate în fig. 6.6. indică o afinitate mai mare a calix 3 pentru aminoacizii aromatici și alifatici metilesteri spre deosebire de calix 1.

Fig. 6.6. Transportul aminoacizilor aromatici și alifatici metilesteri cu calix[4]azaetercoroană 1, 3

Se observă însă că aceste randamente de transport diferă și în funcție de transportorul utilizat. Dacă în cazul transportorului calix 3 randamentele cele mai mari s-au obținut pentru aminoacizii aromatici metil esteri ( L-PheOMe 80,63%, L-TrpOMe 77,3%), nu aceleași rezultate s-au obținut în cazul utilizării calix 1 ca transportor, rezultatele cele mai bune obținându-se pentru aminoacizii alifatici metilesteri (L-SerOMe 41,24%, L-ValOMe 33,1%).

6.3.5. Influența hidrofobicității asupra transportului aminoacizilor

Ca și în cazul procesului de extracție, hidrofobicitatea aminoacizilor este un factor important și în procesul de transport. În fig. 6.7. este prezentată relația dintre hidrofibicitate și transport.

Fig. 6.7. Corelație între transport și hidrofobicitatea aminoacizilor

Influența hidrofobicității este evidentă în cazul în care s-a utilizat ca transportor calix 1, transportul fiind mai eficient cu cât hidrofobicitatea aminoacizilor este mai mare, însă în cazul în care s-a utilizat calix 3 ca transportor nu există nici o corelație între hidrofobicitate și randamentele de transport ale aminoacizilor.

6.3.6. Comparație între transportul și extracția aminaocizilor aromatici și alifatici

Aminoacizii alifatici și aromatici au fost studiați atât prin procesul de extracție cât și prin transportul prin membrană, utilizănd calix[4]arenele derivatizate (1-3). În fig. 6.8. și 6.9. sunt prezentate rezultatele obținute atât în cazul în care calix (1-3) au fost utilizați ca extractanți cât și ca transportori.

Fig. 6.8. Extracția și transportul aminoacizilor aromatici și alifatici metilesteri cu calix[4]azaetercoroană 1 utilizân acidul picric ca anion pereche

Atât în cazul trasportului cât și al extracției, rezultatele cele mai bune s-au obținut pentru aminoacizii alifatici metil esteri L-ValOMe și L-SerOMe (fig. 6.8.).

Fig. 6.9. Extracția și transportul aminoacizilor aromatici și alifatici metilesteri cu calix[4]azaetercoroană 3 utilizân acidul picric ca anion pereche

Extractantul și transportorul calix 3 a prezentat o afinitate mai mare pentru aminaocizii aromatici metilesteri, rezultatele cele mai bune obținându-se pentru L-PheOMe și L-TrpOMe (fig. 6.9.).

6.4. Concluzii

Transportul aminoacizilor aromatici și alifatici utilizând ca membrană calix[4]azaetercoroană 1-3 este influențat de o serie de factori: complexarea și decomplexarea la interfețele fază sursă/ membrană, respectiv membrană/fază receptoare, reacțiile prezente la interfețele cu cele două faze (membrană și receptoare) dar și solvatarea și desolvatarea aminoacidului la interfețe.

În procesul de transport studiat în această lucrare cele trei faze au fost:

Faza sursă: Aminoacid aromatic și alifatic metilester (conc. 5 x 10-4 M), acid picric (conc. 8 x 10 -5 M) sau tropaeolin 00 (conc. 3 x 10-5 M) HCl (conc. 0,05 N), apa bidistilată.

Membrana: calix[4]azaetercoroană 1, cloroform

Faza receptoare: Li OH 0,001 N pH = 11

Transportul aminoacizilor este influențat și de structura transportorului, astfel s-a observat o afinitate accentuată a calix 3 pentru aminoacizii aromatici metilesteri, în timp ce calix 1 prezintă o afinitate mai mare pentru aminoacizii alifatici metilesteri.

Această afinitate a transportorilor calix 1 pentru aminoacizii alifatici și calix 3 pentru aminoacizii aromatici s-a observat și în cazul procesului de extracție, randamentele cele mai bune de extracție s-au obținut pentru:

Calix 1 – L-ValOMe, L-SerOMe

Calix 3 – L-PheOMe, L-TrpOMe

Randamentele de transport mari obținute în cazul aminoacizilor aromatici metiliesteri, pot fi corelate și cu hidrofobicitatea mare a acestor aminaocizi comparativ cu cea a aminoacizilor alifatici.