Clostridium Botulinum

Clostridium botulinum și botulism sunt cunoscute de secole și sunt științific înregistrate în publicațiile care datează de la începutul secolului al XIX-lea . Studii de caz înregistrate între 1815 și 1828 au identificat consumul de mezeluri ca principala cauză a bolii ; aceasta este originea termenului

botulismul ( in latină botulus=cârnați ). Cu toate acestea,la sfârșitul anilor 1800 a fost descoperit agentul ce cauzează botulism. Iar în secolul XX se descoperă o imagine completa a structurii toxinei, înțelegerea complexității și clasa din care face parte.

Clostridium botulinum are formă de tijă, gram-pozitiv, sporulat, bacilul anaerob care este larg distribuită în mediul înconjurător. Sporii, care sunt rezistenți la căldură, uscare, produse chimice, radiații, sunt ajutați să supraviețuiască pentru perioade foarte lungi. În condiții anaerobe și în mediu nutrțional,are loc germinarea de spori și diviziunea celulară. În comun cu habitatele de clostridia,C. botulinum este limitat la mediile cu tensiune scăzută de oxigen și cantitatea de material organic pentru a permite supraviețuirea acetuia. Din cele șapte tipuri distincte de C. Botulinium (tip A,B,C,D,E,F,G) descoperite într-o perioada de peste 70 de ani, cel de tip A se găsește în principal în probe de sol din China, America de Sud, și vestul SUA. Tipul B, de asemenea,se găsește în principal în sol, dar tinde să fie izolat în estul SUA și Europa. Tipuri de C și D se găsesc în principal în animale și

păsări din regiunile calde, întrucât tipul E este mai uzual se găsește în mare sau în sedimentele din lacuri și în pește, mai degrabă decât în

sol, cel mai adesea în zonele nordice. În ceea ce privește medicina veterinară,doar tipurile A,B,E si F produc botulismul uman,tipul C și D se gasește la animale,iar la tipul G nu au fost raportate cazuri de botulism.

Clostridium botulinum, este agentul patogen al botulismului, o intoxicatie alimentara fatala, produsa prin ingerarea de alimente ce contin toxina botulinica. Foarte sensibil la oxigen, prolifereaza în alimente în care exista un anumit grad de anaerobioza: conserve de legume, peste sau carne (toxina eliberata produce gaz care bombeaza capacul conservei), mezeluri, sunca ( în are loc o dezvoltare caracteristica "în cuiburi"), cârnati afumati etc. Intoxicatia survine la 18-96 de ore postprandial. Toxina, (termolabila) ingerata rezista la actiunea sucului gastric, patrunde în intestin, de unde ajunge în circulatia generala pe cale limfatica si actioneaza asupra sistemului nervos prin blocarea eliberarii de acetilcolina la nivelul sinapsei neuro-musculare. Se produce paralizia flasca a musculaturii buco-faringiene (disfagie, greturi, varsaturi), cu paralizia în final a muschilor respiratori.

Botulism

Botulismul este o boală rara, dar gravă. Între 2001 și 2011 a existat în medie de 141 de cazuri pe an raportate în SUA. Fără sprijin medical este cu adevărat o boala mortală. Înainte de a doua jumătate a secolului XX rata mortalității de la botulism a fost aproximativ 60%. Cu toate acestea rata a scăzut în mod constant. Între 2001 și 2011 numai 2% din cazurile confirmate de botulism din SUA a dus la moartea. Această îmbunătățire se datorează în mare măsură de evoluția medicală; în special îmbunătățirile aduse intensiv de îngrijire și disponibilitate crescută de antitoxina.

Botulismul este cauzat de C. botulinium, o neurotoxina proteină

lansată de creșterea bacterii botulinice. Toxina acționează pentru a bloca semnalizarea între neuronii motori și mușchii scheletici.

Acest lucru determină o slăbiciune musculară generalizată care de multe ori prezintă ca o pierdere de tonus muscular sau paralizie flască. Boala este mai gravă în cazurile în care mușchi, cum ar fi diafragma, care sunt importanți pentru respirație, devin afectate; acest lucru poate duce la deces prin sufocare dacă nu se poate respira. Toate serotipurile C. botulinium provoacă simptome similare și împărtășesc același mecanism general de acțiune. Prin urmare, botulismul clinic este clasificat în primul rând în funcție de diferitele rute prin care C. botulinium intra in organism. Cele cinci clase majore de botulism clinic sunt: 1. botulism transmis pri alimente, 2. rană botulism, 3. botulismul infantil, 4.toxemia intestinală adultă și 5. botulism iatrogena.

1. Botulismul transmis prin alimente. Bacteriile dăunătoare trăiesc și se înmulțesc în mediile cu foarte puțin oxigen, cum ar fi alimentele ambalate sub formă de conservă în cutii închise;
2. Botulismul transmis prin răni. Dacă bacteriile pătrund într-o rană pot cauza o infecție foarte periculoasă, urmată de producerea de toxină botulinică la nivelul plăgii.
3. Botulismul infantil. Cea mai frecventă formă de botulism, care apare după ce bacteriile (Clostridium botulinum) se înmultesc în tractul gastro-intestinal al copiilor mici cu vârste între 6 săptămâni și 6 luni.
Toate cele trei tipuri de botulism reprezintă urgențe medicale deoarece pun viața în pericol.

Cauze

Botulismul transmis prin alimente
Toxina botulinică pătrunsă în organism prin intermediul alimentelor contaminate produce tulburări în funcționarea nervilor, conducând la paralizie. Alimentele posibile de infectie sunt de obicei cele conservate, cu un continut scazut in acizi – precum fasolea, porumbul sau sfecla de zahar. Deseori aceste conserve sunt produse in gospodarii, mai degraba decat in industria alimentara. Alte alimente care se contamineaza foarte usor cu bacteriile ce produc toxina botulinica sunt cartofii copti si ardeiul iute.

Botulismul aparut la nivelul ranilor
Când Clostridium botulinum patrunde intr-o rana se poate multiplica si produce toxina botulinica; acest tip de botulism apare cel mai frecvent la persoanele care isi injecteaza droguri de risc inalt – precum heroina – contaminate cu spori de bacterii.

Botulismul infantil
Copiii mici pot face botulism daca intra in contact cu sporii de Clostridium botulinum. Contaminarea este de obicei gastro-intestinala, iar sursele cele mai frecvent incriminate sunt mierea, siropul de porumb sau contactul cu pamantul contaminat de bacterii.

Rezultate și discuții

Creșterea non- proteolitice C. botulinum și non- toxigenic C. botulinium

în condiții diferite de temperatură , pH și activitatea apei

Cele non- proteolitice au tulpini botulinice care au fost alese pentru acest

studiu( tabelul 1) sunt un amestec de tulpini de mediu , izolate de alimente ,tulpini focar sau au fost utilizate recent în cocktail-uri fiind o provocare de alimente in Unilever. Documentele produse de Comitetul National Consultativ privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare, dă tulpini recomandate ca 17B și Beluga ,pentru utilizare, în toate testele de provocare care acoperă diferite tipuri de produse alimentare – refrigerate, așa acestea au fost ambele incluse in studiul curent .

Există de asemenea o lista NACMSF de tulpini posibile propuse pentru fiecare dintre tipurile de toxine B ,E și F , multe dintre care au fost incluse în studiul de față. In documentul lor 1990, NACMCF recomandă numărul minim de tulpini într-un cocktail de a fi trei de tip B , trei tipuri E și un tip F ,pentru testarea "alimente frigorifice , carne de pasăre neîntărită sau produse care sunt ambalate pentru extensie frigorifică de conservare și sunt gata pentru consum , cu puțin sau nici un tratament termic suplimentar " .

În documentul 1992 ei recomandă un amestec de 5 tulpini de tipuri B și E și o tulpină de tip F ( care vor fi selectate din cât mai multe surse posibile ) pentru testarea " vid sau în atmosferă modificată ambalate frigorific,produse pescărești brute " . S-au folosit aceste recomandări pentru a ajuta la selectarea numărului de tulpini ale fiecărui tip toxină care au fost utilizate în acest studiu. În ceea ce privește controalele utilizate în studiu creștere , sterilitatea controleaza fiecare condiție și nu a prezentat nici o creștere după 90 de zile , cum era de așteptat .

În controalele de viabilitate la 30 ° C , toate tulpinile au fost capabile să crească în cadrul celei mai optime conditii ( pH 6,5 , aw 0,99 ) ,tuburile arată o creștere vizibilă în decurs de 1 zi pentru toate tulpinile cu excepția tulpinei 3678 ( care a arătat turbiditate vizibilă în toate cele trei tuburi după 4 zile ) . Tabelul 2 prezintă o comparație de creștere a Clostridium non- toxigenic ( tulpina 3677 ) cu fiecare dintre tulpinile de C. botulinum . Cifrele din tabel corespund din prima zi în care turbiditatea a fost observată în orice tub triplicat pentru fiecare tulpină (cu excepția cazului în care acest lucru este marcat N90 , care înseamnă că nu a existat nici o creștere vizibilă în 90 de zile ) .

Piesele din tabel care au un fundal negru sau alb ( fara model ) arată că , în cazul în care

creșterea a avut loc, turbiditatea a fost văzuta în potențialul surogat înainte

( sau în același timp ) de creștere a fost văzut în tulpinile botulinice

(de exemplu, condițiile în care surogat ar fi adecvat pentru utilizare ) . Cu toate acestea ,situația opusă a fost observată pentru tulpinile 3676 și 3678 , astfel încât aceste două au fost considerate ca un potential surogat de 2 tulpini cocktail .

Cu toate acestea ,situația opusă a fost observată pentru tulpinile 3676 și

3678 , astfel încât aceste două au fost considerate ca un potential surogat de 2 tulpini cocktail . Tabelul 3 prezintă timpul ( zilele ) la primul turbiditate folosind date combinate pentru tulpinile 3676 și 3678 în comparație cu cea tulpinile botulinice . Se poate observa că , în majoritatea cazurilor ,în cocktail ar arăta o creștere egală sau mai mare cu cea observată pentru C. tulpinile botulinice .

Excepția cea mai dură e condiția ca( aw 0,98 , pH 5,5 ) , în toate celelalte cazuri, C. tulpinile botulinice au crescut mai repede decât tulpinile 3676 și 3678 , aceasta a fost doar de unu la patru zile mai repede .

Ca o marjă de siguranță ar fi întotdeauna construit în stabilirea unui proces

de conservare , se poate spune că , pentru aceste condiții , un cocktail surogat

( cuprinzând tulpini 3676 și 3678 ), ar fi potrivit , deoarece creșterea a fost similară cu cea a tulpinilor C. Botulinum.

Acest lucru subliniaza importanta de a construi într- o marjă de siguranță , în cazul în care stabilirea unui termen de valabilitate bazat pe date purtatoare.

La 10 ° C , pentru cele mai dificile condiții de AW și pH-ului ( 0,98 și 5,5 , respectiv ) tulpinile 3676 și 3678 au arătat o creștere în 29 d zile . Acest lucru a fost mai rapid decât cel observat pentru tulpinile C. botulinum 3 , 6, 7 , 11, 12 , 13 și 14( care au variat de la 30 de zile la nici o creștere în 90 de zile ) .

Cu toate acestea , este necesar să se constate , în aceste condiții , unele tulpini C. botulinice pot creste mai repede decât tulpinile 3676 și 3678 ( tulpini 1, 2 , 4 , 5 , 8, 9 și 10 )cu o creștere variind 15-27 de zile .

În conformitate cu aceasta stare ( mai dură )la 10 ° C ,cele cocktail nu pot fi potrivite pentru utilizare ( dacă nu este pentru scopuri de screening inainte de un studiu de validare utilizând relevante tulpini C. botulinum ) .

La 7 ° C , în cele mai dificile condiții ( tabelul 3 ) nu se putea face o comparație între cocktail surogat propus și tulpinile C. botulinum , ca nici una dintre tulpini nu au crescut în 90 de zile .

Cu toate acestea , este puțin probabil că un produs alimentar refrigerat de conservare ar fi mult mai mult decat 90 de zile , astfel propus 2 tulpini cocktail surogat ar fi util pentru provocare.Testarea de alimente refrigerate în multe condiții .

Tabel 3

Din punct de vedere istoric , atunci când studiază cultura de C. botulinum în refrigerat,testele de provocare alimentare , mulți oameni au studiat mult timp starea de turbiditate și este cunoscut faptul că creșterea(și producerea de toxine), poate apărea înainte de turbiditate sau producția de gaze si este văzută ( Stringer et al . , 1999) , astfel încât activitatea viitoare s-ar putea fie pentru a valida cele 2 tulpini cocktail surogat ( folosind metode de placare )împotriva creștere de C. botulinum tulpini , pentru a fi utilizate în viitoarele teste de provocare .

Pentru neurotoxigenic tip Clostridium butyricum E , Anniballi et al .

( 2002) a raportat o creștere ( turbiditate ), dar eșecul de producerea de toxine , astfel incat evaluarea turbidității ar putea fi considerata drept criteriu de precauție pentru a stabili eșecul unui test provocare.

Dozarea biologică pe animale este departe de a fi ideală , deoarece implică testarea pe animale . Cu toate acestea ,testarea toxinei este cerută de unele autorități de reglementare ( de exemplu, US Food and Drug Administration ), pentru a verifica dacă produsele alimentare nu sunt în măsură să susțină creștere și producerea de toxine de C. botulinum .Pentru producerea de toxine să apară , este nevoie de o creștere , deci efectuarea preliminara.Studiile de creștere de peste timp vor permite determinarea în cazul în care s-ar putea să apară creșterea ( și , prin urmare, este posibil producerea de toxine ) .

Astfel, cocktail- surogat ar putea fi utilizat în studiile de screening , care ar putea duce la o reducerea numărului de teste biologice necesitand animale .

Inactivarea termică a non- toxigenic Clostridium botulinium comparativ cu

C. tulpini botulinice

Cinetica de inactivare termică a fost determinată pentru 3 Clostridium, tulpinile 3676 , 3677 și 3678 , la temperaturi de 77 ° C , 80 ° C , 82 ° C ,

85 ° C și 87 ° C . Fig . 1 și 2 prezintă graficele de inactivare termică pentru

tulpina 3676 la 77 ° C și respectiv 80 ° C .

Pentru toate tulpinile , la toate temperaturile testate,modelul prezentat arată o potrivire rezonabilă a datelor , care a demonstrat cinetica cu o concavitate în jos ( după cum se observă în Fig. 1 și 2 ).

Majoritatea Weibull are valorile peste 0.5 ,care arată că există o curbă semnificativ până la moartea termică.

Timpul de o reducere de 6 log 10 a fost utilizat în scopul de a face comparații cu datele din literatură pentru încălzirea de studii, având în vedere că tratamentele acceptabile pentru tulpinileC. botulinum necesita o reducere de 6 log10 ( NACMCF , 1990) .

S-a observat că , la 77 ° C, pentru toate cele 3 tulpini , parcele de acces termice

a arătat între 0 și până la 1,5 minute. Acest lucru ar putea fi explicat prin faptul că culturile de spori au fost termic activate înaintea experimentelor de inactivare termică .

Folosind ecuația de integrare temperatură-timp s-a estimat că o etapă de activare,la o temperatură de 60 ° C timp de 30 de minute ar fi echivalent cu 0.71 minute la 77 ° C pentru tulpina 3676 , 0,97 min pentru tulpina 3677 și1.08 min pentru tulpina 3678. La 80 ° C și peste aceste temperaturi , dacă este prezent ar fi mai mici și , prin urmare, ar avea un efect redus asupra curbei de inactivare.

În scopul de a face unele comparații cu date din literatură , numai acele

lucrări în cazul în care datele au fost generate folosind psychrotrophic

C. botulinum în 15 tampon M / la pH 7,0 ( și fără lizozim în recuperarea

mass-media ) au fost incluse . Cu toate acestea , se observă că toate aceste documente folosesc metode diferite pentru producția vegetală spor , încălzire , recuperare și analiza datelor lor.

În cazul în care aceste documente nu da timp de o reducere de 6 log 10 , aceasta a fost calculată din dat valoare D . Pentru toate datele (experimental și literatură ), timpul de la un 6 log10 a arătat o relație liniară cu privire la creșterea de temperatura ( fig. 3 ) .

Rezultatele studiilor au arătat că inactivare trei nontoxigenic de tulpini au demonstrat similare ( sau mai mare) rezistenta la caldura la

9 din 12 psychrotrophic C. tulpini botulinice raportate de specialiști( Fig . 3 ) . NACMCF (1990 , 1992) recomandă ca tulpinile 17B și Beluga sunt folosite în toate studiile de provocare folosind psychrotrophic C. spori botulinum. Nu există date privind caracteristicile de inactivare termice tulpinii Beluga în M / 15 tampon poate fi găsită în literatura de specialitate astfel încât nici o comparație ar putea fi . Cu toate acestea , tulpina 17B ( date de la Scott si Bernard , 1982) pare a fi rezistente la mai multă căldură decât tulpinile de testare și cele mai multe dintre celelalte tulpini literatură . Cele trei seturi de date care arată cea mai mare rezistență la căldură ( 2129B , 17b și 17844 ) face tot si provin de la aceeași sursă ( Scott și Bernard , 1982) .

In documentatia lor , deși au raportat cele mai mari valori de rezistență termică care au observat pentru tulpina 17B ( D82.2 de 16,7 min) , au gasit

că acest lucru nu a fost obținut în mod constant și menționează că , cu un al doilea,suspensie de spori 17B , au observat rezistenta la caldura mult mai mici

( D82.2 de 0,83 min ) . Ei au fost siguri de motivul pentru aceste

discrepanțe , dar sugerează că ar putea fi din cauza diferențelor în

mediu sporulare , care rezultă din utilizarea de loturi diferite de

Componente deshidratate în inimile de carne de vită . Tulpina Saratoga este

De asemenea, de la aceeași sursă ( Scott și Bernard , 1982 ), dar nu

arata ca i-a crescut rezistența în comparație cu alte tulpini de tip E din Fig . 3,sugerând că rezistența vazut de 17B poate sa fi fost din cauza lotului de variabilitate.

Campden BRI recomandă ca pentru testele de provocare folosind psychrotrophic

C. botulinum , trebuie utilizat cel puțin două tulpini ( o tulpină

ar trebui să fie de tip B , iar celălalt ar trebui să fie de tip E) și ambele ar trebui să fie din colecții de referință ( Campden BRI , 2010 ) . Mai multe de tip B

și tulpini de tip E au caracteristici similare inactivare termică la

tulpinile clostridia non – toxigene utilizate în acest studiu ( fig . 3 ) și

prin urmare, ar putea fi înlocuit cu tulpini 3676 , 3677 sau 3678 în conformitate cu orientările Campden BRI .

Recomandările mai oferă un câștig asigurat de către NACMCF ( 1990 , 1992 ) pot fi mai susceptibile de a fi urmate pentru motive de siguranță și ( în funcție de

acestea orientări ) nici una dintre tulpinile de testare non- toxigene ar putea fi

substituit în mod direct , având în vedere rezultatele din acest studiu . Cu toate acestea ,3potențiale tulpini surogat ar putea fi utile în studiile de screening , pentru a restrange gama de condiții pentru testarea finală , prin urmare limitarea

manipularea toxigenic C. botulinum .

Ei au folosit termica mortii timpului ( TDT ) tehnica tub

pentru a determina valorile D ale tulpinilor . Ca utilizările de calcul

numai numărul inițial și o estimare a numărului de finale, o evaluare

cineticii de inactivare termică se poate face și prin urmarecalculată

timp de o reducere de 6 log nu poate fi foarte precis . rezultatele

generat în acest studiu curent au inclus decantare și -au luat

în considerare caracteristicile neliniare ale parcelelor cu moartea termice ,

ceea ce face dificil de a compara aceste rezultate direct cu literatura de specialitate .

Progrese în metodologia de analiză a datelor au dus la

capacitatea de a descrie cu acuratețecurbura inactivare termică

parcele . Deoarece aceste progrese sunt relativ recente , multe dintre autorii

nu referencedwould au fost capabili de a utiliza abordări, cum ar asWeibull

modelarea pentru a descrie curbura terenurile lor și , prin urmare, mulți

doar folosit o linie de potrivesc cel mai bine . Modalitati de asemenea, variază considerabil între lucrări și aceste diferențe ar fi putut duce la variații în

Rezultate observate ( de exemplu, diferențele dintre metodele de producție spori

menstrua încălzire , aparate de încălzire , mass-media de recuperare și

Condiții de recuperare , pentru a numi doar câteva ) .

Metoda utilizată în acest studiu curent elimină unele dintre

surse de eroare experimentale (de exemplu, aspecte legate de uscat încălzire și

întârziat veni – up timp) , precum și luând în considerare neliniaritatea în

analiza datelor . Prin urmare, activitatea viitoare ar putea fi de a utiliza aceste

metode și tehnici de analiză a datelor pentru a studiatoxigeni

C. botulinum tulpini care au fost raportate anterior , și , prin urmare,

ar permite o comparație mai bună cu 3 surogatele potențiale.

Zone potențiale pentru investigații suplimentare

În afara lucrărilor realizate pe neurotoxine puternice , tulpinile

nu au fost analizate pentru producerea de alte toxine proteice . Prin urmare,

Se recomandă ca provocare studii sunt efectuate într-un laborator CL2 ,

face pentru alte bacterii producătoare de toxine , cum ar fi Staphylococcus aureus sau Bacillus cereus . Dacă Cercetatorii au vrut să se ocupe de Clostridium tulpini într-un laborator care a fost o clasă mai mică decât CL2 .

Se recomandă eforturi suplimentare pentru a verifica dacă tulpinile sunt nepatogenicși nu produc alte toxine proteice .

Unele tulpini de bază non- proteolitic C. botulinum au fost observate pentru a produceAgenți bacteriocin – , cum ar fi una împotriva celeilalte. Prin urmare , înainte de a utiliza surogate împreună într-un cocktail , acesta este un domeniu care poate justifica ancheta și ar putea fi efectuate folosind metodele descrise de

Eklund și colab . ( 2004) .

Bibliografie

Busta, F.F., Suslow, T.V., Parish, M.E., Beuchat, L.R., Farber, J.N., Garrett, E.H., Harris, L.J.,

2003. The use of indicators and surrogate microorganisms for the evaluation of pathogens

in fresh and fresh-cut produce. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2 (Supplement),

179–185.

Campbell, K.D., Collins, M.D., East, A.K., 1993a. Gene probes for identification of the botulinal

neurotoxin gene and specific identification of neurotoxin types B, E, and F. J. Clin.

Microbiol. 31, 2255.

Campbell, K.D., East, A.K., Thompson, D.E., Collins, M.D., 1993b. Studies on the large subunit

ribosomal RNA genes and intergenic spacer regions of non-proteolytic Clostridium

botulinum types B, E and F. Res. Microbiol. 144, 171–180.

Campden BRI, 2010. Challenge testing protocols for the assessing the safety and quality of

food and drink. Guideline No. 63 Campden BRI Food and drink innovation.

Carlin, F., Peck, M.W., 1996. Growth and toxin production by non-proteolytic Clostridium

botulinum in cooked pureed vegetables at refrigeration temperatures. Appl. Environ.

Microbiol. 62, 3069–3072.

Carlin, F., Girardin, H., Peck, M.W., Stringer, S.C., Barker, G.C., Martinez, A., Fernandez, A.,

Fernandez, P., Waites, W.M., Movahedi, S., van Leusden, F., Nauta, M., Moezelaar, R.,

Del Torre, M., Litman, S., 2000. Research on factors allowing a risk assessment of

spore-forming pathogenic bacteria in cooked chilled foods containing vegetables: a

FAIR collaborative project. Int. J. Food Microbiol. 60, 117–135.

Carlin, F., Broussolle, V., Perelle, S., Litman, S., Fach, P., 2004. Prevalence of Clostridium botulinum

in food raw materials used in REPFEDs manufactured in France. Int. J. Food

Microbiol. 91, 141–145.

Daelman, J., Jacxsens, L., Devlieghere, F., Uyttendaele,M., 2013. Microbial safety and quality

of various types of cooked chilled foods. Food Control 30, 510–517.

Del Torre, M., Stecchini, M.L., Braconnier, A., Peck, M.W., 2004. Prevalence of Clostridium

species and behaviour of Clostridium botulinum in gnocchi, a REPFED of Italian origin.

Int. J. Food Microbiol. 96, 115–131.

Dong, Q., Tu, K., Guo, L., Li, H., Zhao, Y., 2007. Response surface model for prediction of

growth parameters fromspores of Clostridium sporogenes under different experimental

conditions. Food Microbiol. 24, 624–632.