Ciclul Celular Mitotic

CICLUL CELULAR MITOTIC

Diviziunea nucleului a fost observată pentru prima dată în 1832, de către Dumortier, la alga Conferva aurea. Prin diviziunea nucleului se asigură distribuția egală a genelor la cele două celule fiice, aceasta fiind condiționată de existența ADN dublu catenar și de mecanismul semiconservativ de replicare a acestuia.

În diviziunea celulară se disting două categorii de evenimente: evenimente reproductive, prin care sunt dublate structurile funcționale ale celulei, esențială fiind dublarea cromosomilor, și evenimente distributive, prin care materialul rezultat în urma replicației este repartizat celulelor fiice (Tudose, 1992).

Celulele fiice rezultate în urma diviziunii celulare, pot urma un proces de diferențiere sau pot da naștere, în urma repetării diviziunii, la alte celule noi. Posibilitatea de a se divide este păstrată și de către celulele diferențiate, dar ea se realizează în fapt, foarte rar, și numai atunci când este indusă secundar. Celulele nediferențiate, meristematice, păstrează însă permanent această capacitate de a se divide.

Diviziunea mitotică a fost pentru prima dată, descrisă în anul 1879, la celula animală, de către Flemming și în 1884 la celula vegetală, de către Strasburger (Lewin, 1994, Snustad și colab., 1997).

Mitoza (gr. mitosis = fir) sau diviziunea ecvațională, este modalitatea de diviziune celulară prin care, dintr-o celulă somatică rezultă două celule fiice cu număr egal de cromosomi, atât între ele, cât și cu celula mamă. Mitoza este diviziunea celulară care are loc în celule somatice și asigură transmiterea fidelă a caracterelor la celulele fiice; ea poate suferi însă, diferite influențe care adaugă aparentei stabilități a caracterelor, noi valențe. În reproducerea celulelor, apar “greșeli”- fenomene mutaționale – pe care evoluția le poate perpetua sau nu.

Caracteristica principală a diviziunii celulare este diviziunea nucleului, urmată de și diviziunea citoplasmei. Relația nucleu – citoplasmă (evidențiată încă din 1893, de către Strasburger) prezintă implicații majore în determinarea momentului diviziunii.

Ciclul celular mitotic, la plante și animale, cuprinde în principal următoarele procese: duplicarea cromosomilor unicromatidici (și a centrozomului la animale) și deplasarea spre poli a cromosomilor fii, după care, urmează diviziunea citoplasmei. În procesul mitozei se organizează aparatul mitotic alcătuit din structuri cromatice și acromatice, care este complet în metafază. Pentru realizarea acestuia, sunt necesare proteine specifice, a căror sinteză necesită un mare consum de energie.

Totalitatea proceselor prin care trece celula somatică de la formare și până la scindarea ei în două celule fiice, cu număr de cromosomi egal cu numărul de cromosomi al celulei din care au provenit, alcătuiesc ciclul celular.

Ciclul mitotic (Fig.1) cuprinde: interfaza (perioada dintre două diviziuni succesive) și cele patru faze ale diviziunii mitotice propriu-zise – profaza, metafaza, anafaza și telofaza având o durată variabilă, în funcție de specie, tipul de celule, temperatură etc., de la câteva ore, la zeci și sute de ore.

Interfaza

Interfaza are cea mai mare durată în timp în ciclul mitotic și este caracterizată de procese de biosinteză. Durata interfazei este variabilă, de la câteva ore până la zile. La plante, la un ciclu tipic de 20-24 de ore, mitoza durează 70-110 minute (profaza = 30 – 45 min., metafaza = 5 – 10 min., anafaza = 15 – 20 min. și telofaza = 20 – 30 min.) (Toma și Niță, 1995). La celula animală, un ciclu tipic durează 18 – 24 de ore, din care durata fazei G1 este de aproximativ 6 ore (în general variază cel mai mult), faza S (timpul necesar replicării genomului) durează 6 – 8 ore, iar faza G2 este, de regulă, cea mai scurtă (mai ales când mitozele se succed rapid). Mitoza, de obicei durează mai puțin de o oră (Lewin, 1994).

După Essad (1964, cf. Raicu, 1973) ciclul mitotic la Vicia faba L. durează 18 ore din care mitoza cuprinde 1,5 ore, restul revenind interfazei.

Cercetările microfotografice și microradiografice au demonstrat că interfaza este foarte puțin activă din punct de vedere morfologic, dar este cea mai activă din punct de vedere metabolic; cantitatea de ADN se dublează de la 2C la 4C. Pe baza acestor observații, Howard și Pelc, în 1953 au împărțit interfaza în trei perioade:

– perioada G1 (engl. gap = gol) – perioadă presintetică, în care nu are loc sinteza de ADN, ci doar o activare a enzimelor. Cromosomii sunt monocromatidici; se sintetizează ARN (în special ARNm) și proteine;

– perioada S (engl. synthesis = sinteză) – perioada de sinteză a ADN; până la sfârșitul fazei S toată cantitatea de ADN se replică (pe parcursul fazei S cantitatea totală de ADN crește de la 2C la 4C). La sfârșitul acestei perioade, cromosomii sunt alcătuiți din două cromatide foarte lungi și subțiri;

– perioada G2 – perioadă postsintetică, când sinteza ADN se oprește; are loc biosinteza proteinelor și a ARN, care se desfășoară și în celelalte perioade ale interfazei. Celula conține cromosomi bicromatidici.

Fig. 1 Ciclul celular mitotic (după Alberts și colab., 1994)

Pe parcursul interfazei (Fig.2), cromosomii sunt hidratați, despiralizați și nu se observă la microscopul optic (Watson, 1974).

Fig. 2 Aspectul nucleului în interfază, în celulele meristemului radicular la Allium cepa L. (2n=16) (după Hartl și Jones, 1998)

În afară de celulele la care ciclul mitotic se desfășoară în mod normal, există celule în repaus sau în perioada G0, asemănătoare fazei G1, dar diferită prin faptul că celulele nu pot intra în faza S. În faza G0 intră celulele neproliferative. Uneori, celulele se pot afla în repaus în faza 4C (exemplu: celulele embrionare din semințe), astfel încât, intră direct din G0 în G2; alteori, din G0 pot intra în G1 timpuriu (Lewin, 1994).

În explicarea cauzelor ce determină intrarea celulei în diviziune mitotică (trecerea din G2 în mitoză) există diferite ipoteze. Se pare că declanșarea mitozei este determinată de modificarea raportului nucleu / citoplasmă.

Schmucker, Dean și Hinshelwood consideră că declanșarea mitozei este determinată de modificarea raporturilor între conținutul nucleului și membrana sa. După Haberlandt, diviziunea poate fi declanșată introducând în celulele sănătoase anumiți necrohormoni proveniți din celulele rănite. Schmucker presupune că mitoza este indusă de o radiație specifică a razelor mitotice (cu intensitate foarte redusă și lungime scurtă de undă) emise de celulele vii; ele acționează asupra celulelor care au atins un anumit stadiu pregătitor. În ultimul timp, este susținută cauzalitatea chimică a diviziunii celulare; declanșarea mitozei este produsă de anumite substanțe organice (stimulatoare de creștere în concentrație mare) și substanțe anorganice (de exemplu cobaltul inhibă trecerea celulelor din interfază în profază). Se pare că intervine o kinază (proteină preexistentă cu două subunități: una ce se activează la modificările de la începutul mitozei și o ciclină ce se acumulează în interfază și este distrusă în mitoză) (Lewin, 1994).

Profaza

În profază au loc procesele: mărirea volumului nucleului, condensarea cromosomilor, stabilirea polilor pentru diviziune, dezorganizarea membranei nucleare, dispariția nucleolilor și formarea fusului acromatic.

La începutul acestei faze, cromosomii se prezintă sub formă de filamente subțiri, lungi, alcătuind un spirem. În profaza timpurie (Fig.3) ei se dispun în tot spațiul nuclear (în celulele vii se observă ușor, având indicele de refracție 1,50 față de cel al carioplasmei de 1,37). În profaza târzie (Fig.4), gradul de spiralizare al cromosomilor crește și ei devin mai scurți și mai compacți, apărând formați din două cromatide, foarte apropiate între ele și înfășurate una în jurul celeilalte. La începutul profazei, are loc o primă spiralizare a cromosomilor denumită “spiralizarea mică”, ce se realizează prin micșorarea numărului de spire și mărirea diametrului lor. Spre sfârșitul profazei, are loc a doua spiralizare denumită “spiralizare somatică”, în care numărul de spire continuă să scadă, ele apropiindu-se tot mai mult. Se admite și existența celei de a treia spiralizări. Semnificația funcțională a acestor procese este aceea de a facilita deplasarea cromosomilor și de a păstra integritatea acestora.

În profază, distanța dintre cromosomi crește treptat și are loc dezorganizarea nucleului și a membranei nucleare, dispariția nucleolilor și formarea fusului mitotic.

Centriolii migrează spre polii celulei, plasându-se în două puncte opuse. Între centrioli se organizează fusul de diviziune (fus acromatic, fus mitotic sau fus nuclear), alcătuit dintr-un număr mare de filamente, cu extremitățile inserate pe centrioli. Fusul nuclear este un organit tranzitoriu, cu ajutorul căruia se realizează distribuirea egală a cromosomilor în cele două celule fiice. Filamentele fusului de diviziune sunt de două tipuri: filamente fusoriale de sprijin (continue) de la un centriol la altul ce condiționează structura fusului și filamente cromosomiale (kinetice), care sunt sintetizate și pleacă de la centromerul fiecărui cromosom și înaintează simultan, cu aceeași viteză, spre cei doi poli ai celulei.

Fig. 3 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în profază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig. 4 Aspect al nucleului unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în profază târzie (după Hartl și Jones, 1998)

La plantele superioare, centriolii lipsesc din celulă, rolul lor fiind preluat de calotele polare ce se alungesc în formă de conuri, atingând polii celulei în timp ce bazele lor se confundă. Calotele polare sunt reprezentate de citoplasma perinucleară diferențiată într-o zonă clară, care crește treptat spre polii viitorului fus acromatic. Mitoza ce se desfășoară în aceste condiții se numește mitoză anastrală (Toma și Niță, 1995).

Stadiul final al profazei – prometafaza, se caracterizează prin totala dezorganizare a membranei nucleare, care se fragmentează în porțiuni relativ mari, ce păstrează infrastructura de membrană dublă și rămân, în parte, în interiorul fusului de diviziune, participând mai târziu la formarea membranelor nucleilor fii. Cromosomii exercită mișcări neregulate între polii celulei și planul ecuatorial al acesteia.

Metafaza

În această fază are loc desăvârșirea aparatului mitotic, iar cromosomii, spiralizați la maxim, se dispun în placa ecuatorială metafazică (Fig.5). Mișcarea de dispunere a cromosomilor în placa ecuatorială, la distanță egală de polii fusului de diviziune prezintă, după Darlington, trei componente:

adunarea cromosomilor într-o poziție de echilibru între cei doi poli, mișcare datorată interacțiunii între polii fusului și centromeri;

orientarea cromosomilor în placa ecuatorială astfel ca, centromerii să fie situați în axul longitudinal al fusului de diviziune, cromatidele fiind orientate lateral;

distribuirea cromosomilor în placa metafazică se realizează în jurul unui fus central gol (în secțiune transversală apare ca un halo), cromosomii fiind dispuși la periferia fusului, cu brațele orientate în afară.

Forma plăcii metafazice este variabilă de la un tip celular la altul, dar constantă pentru același tip de celule. La organismele cu cromosomi scurți și celule mari, întregul cromosom poate fi încadrat în placa metafazică, în același plan cu centromerii. La alte tipuri de celule, se remarcă tendința cromosomilor mici de a se dispune în axa centrală a fusului, iar a celor mari, periferic. Când cromosomii sunt lungi, brațele lor se orientează, de regulă, spre unul din cei doi poli, uneori chiar spre ambii poli.

Anumiți factori influențează configurația plăcii ecuatoriale, determinând modificări în diviziune. Distrugerea experimentală a fusului duce la desprinderea cromosomilor din placa ecuatorială; menținerea lor în placa ecuatorială se datorează unei forțe alternative de repulsie și de atracție dintre poli și centromeri. După Ostergren, există un echilibru al acestor forțe; aceleași forțe care țin cromosomii în placa ecuatorială, cât timp centromerul este nedivizat, sunt responsabile de atracția centromerilor fii spre polii opuși. După Darlington, separarea cromosomilor fii în anafază se datorează unei forțe de repulsie apărute imediat după diviziunea centromerului.

Morfologia cromosomilor se studiază în metafază, deoarece în această fază ei sunt condensați în cel mai înalt grad. Fiecare cromosom este alcătuit din două cromatide și prezintă în lungul acestora, spre sfârșitul metafazei, o fisură longitudinală, care reprezintă spațiul dintre cele două cromatide surori. La sfârșitul metafazei (Fig.6), cromatidele surori încep să se separe (clivarea longitudinală), făcându-se trecerea spre anafază.

Fig. 5 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în metafază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig. 6 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în metafază târzie(după Hartl și Jones, 1998)

Anafaza

Anafaza se caracterizează prin formarea, din cromatidele surori, a cromosomilor fii și migrarea lor spre cei doi poli ai celulei. Formarea cromosomilor fii debutează în anafaza timpurie, când are loc clivarea centromerilor, cromatidele rămânând încă apropiate unele de altele. O dată terminată clivarea centromerilor, începe separarea cromatidelor în lungul fisurii longitudinale evidențiate în metafază (Fig.7). După Lewin (1994), la celulele animale, în anafază, centromerul este duplicat funcțional. Când și acest proces se încheie, cromatidele fiice, fiecare cu câte un centromer propriu, încep migrarea spre poli (Fig.8), devenind cromosomi fii.

Se admite că mișcarea cromosomilor spre poli este o consecință a scurtării filamentelor fusoriale de sprijin, care leagă polii fusului (prin pierderea sau adiția de tubulină din microtubuli). Alungirea determină stabilitatea fusului, iar scurtarea este mecanismul implicat în mișcarea cromosomilor spre poli. Această mișcare este posibilă datorită existenței în structura fusului mitotic a unor proteine de natură actinică. Cromosomii se pot deplasa la perioade diferite de timp și cu viteze diferite; de regulă, mișcarea anafazică începe simultan la toți cromosomii, indiferent de mărimea lor. Mișcarea cromosomilor este continuă, liniară. Fragmentele acentrice (lipsite de centromer) ale cromosomilor, nu pot migra la poli, dar ajung aici datorită curenților citoplasmatici. Viteza de migrare a cromosomilor este de 0,2-5m / min. În cazul în care setul de cromosomi migrează aproape perfect sincron, se formează “placa anafazică” sau “dublul aster”. Chiar dacă mișcarea cromosomilor nu este sincronă, ea nu începe decât după ce toți cromosomii sunt plasați în placa ecuatorială.

În celulele animale, de regulă, autosomii migrează concomitent, iar heterosomii au o viteză de migrare diferită. În celulele plantelor, spre sfârșitul anafazei, fusul mitotic se mărește în volum în regiunea ecuatorială și ia formă de butoiaș, formând ulterior fragmoplastul.

Pentru a explica mecanismul mișcării anafazice a cromosomilor au fost emise și alte ipoteze. Astfel, Lillie, Bernstein, Kuwada și Darlington, explică această mișcare prin existența unor forțe electrice și magnetice. Metz, susține idea că, cromosomii ar poseda forțe proprii de locomoție, putând migra independent spre poli. Mazia a emis în 1961, ipoteza că mișcarea anafazică a cromosomilor s-ar datora unor forțe de atracție și de repulsie între cromosomi și polii fusului; cromosomii fiind încărcați electric pozitiv, se resping între ei, în același timp fiind atrași de poli, care sunt încărcați electric negativ.

Fig. 7 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în anafază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Milovidov și Perakis au arătat că celulele aflate în diviziune și supuse acțiunii unui câmp magnetic, nu sunt influențate de acesta, deci interacțiunea cromosom – pol nu implică forțe de atracție sau respingere electromagnetică. Schaede, Burton și Haynes consideră că mișcarea anafazică a cromosomilor este determinată de curenții citoplasmatici, direcționarea fiind realizată de aparatul mitotic.

Fig.8 Aspect al cromosomilor unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în anafază târzie (după Hartl și Jones, 1998)

O altă ipoteză este aceea susținută de Szent-Gyorgyi și Hoffman- Berling, după care, aparatul mitotic este un gel în care funcționează filamente de tip actomiozinic, ce implică contractilitatea fibrelor cromosomiale, ca urmare a modificării gradului de hidratare a aparatului mitotic. Chimic însă, proteinele izolate din aparatul mitotic au puține asemănări cu actomiozina.

Telofaza

Telofaza este ultima fază a mitozei, caracterizată prin prezența fenomenelor opuse celor din profază. Cromosomii suferă un proces de despiralizare și revin la aspectul interfazic. Fragmentele de membrană nucleară migrează spre periferia fusului de diviziune; numărul lor crește printr-o sinteză suplimentară. Aceste vezicule se agregă în jurul masei cromosomiale, se turtesc, înconjoară nucleul interfazic și formează noua membrană nucleară. O parte din veziculele membranoase ajung la nivelul liniei de demarcație dintre cele două celule fiice. Are loc și reorganizarea nucleolilor la nivelul regiunilor ce îndeplinesc funcția de organizatori nucleolari (Fig.9 și Fig.10).

Fig.9 Celulă din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în telofază timpurie (după Hartl și Jones, 1998)

Fig.10 Aspect al nucleilor fii, aparținând unei celule din meristemul radicular de la Allium cepa L. (2n=16), aflată în telofază târzie (după Hartl și Jones, 1998)

Citochineza

În cazul creșterii plasmodiale, diviziunile nucleare pot să nu fie urmate de citochineză (de exemplu: diviziunea celulelor la plantele inferioare – alge – Siphonales, la unele ciuperci, sau la formarea endospermului în sacul embrionar). În mod obișnuit însă, diviziunea nucleară este urmată de citochineză (plasmodiereză, citodiereză sau plasmotomie).

Citochineza poate avea loc centripet – la plantele inferioare (Cladophora, Spirogyra), când membrana ce separă cele două celule fiice apare sub forma unui inel ce crește centripetal, asemănător unei diafragme ()Toma și Niță, 1995).

La plantele superioare, citochineza are loc centrifug. După Buvat, în zona ecuatorială a fragmoplastului, se dispun vezicule proteice, printre care se intercalează fragmente ale reticulului endoplasmic, ce migrează în această regiune dinspre poli. Împreună cu elementele microtubulare, se formează o structură fibrilară. În jurul fibrelor microtubulare se aglomerează vezicule mici golgiene (Fig.11a,b). Veziculele se măresc, se contopesc și vin în contact cu pereții celulei mame, formând lamela mediană (Fig.11c). Celulele fiice formate, elaborează membrana primară, străbătută de plasmodesme (Fig.11d,e). La animale, separarea celulelor fiice se face prin formarea unui inel contractil, deci prin ștrangulare(Fig.12 a, b).

Fig. 11 Formarea peretelui despărțitor, între celulele-fiice, consecutiv diviziunii mitotice la plantele superioare (după De Robertis și De Robertis,1983)

Fig.12 Separarea celulelor-fiice, prin intermediul formării inelului contractil, consecutiv diviziunii mitotice, la organismele animale (după De Robertis și De Robertis,1983)

Poziția aparatului mitotic determină desfășurarea egală sau inegală a citochinezei. Doar la Spirogyra, la care în mod normal nucleul este situat în mijlocul celulei, deplasarea nucleului are drept consecință o diviziune inegală a citoplasmei. Prin experiențe de micromanipulare, Kawamura a stabilit că există o relație riguroasă între aparatul mitotic și planul citochinezei, aceasta realizându-se perpendicular pe ecuatorul fusului de diviziune.

În celulele normale, mitoza și citochineza sunt riguros coordonate. Dacă are loc blocarea citochinezei, mitoza se desfășoară normal, producându-se o celulă binucleată.

Odată cu replicarea cromosomilor, are loc și replicarea organitelor citoplasmatice sau separarea lor din celula mamă în celulele fiice, după care acestea își completează, prin noi sinteze, setul de organite intracitoplasmatice. În profază, reticulul endoplasmic este transformat într-un sistem discontinuu de vezicule sferice, dispuse în special în regiunile periferice ale citoplasmei. În metafază, mitocondriile se adună în jurul fusului; în anafază, ele se grupează în jurul regiunii ecuatoriale, odată cu separarea celulelor fiice având loc și repartizarea acestora. În interfaza celulelor fiice, el revine la forma tipică.

În diviziunea mitotică, metafaza și anafaza sunt fazele cele mai scurte ale diviziunii, în timp ce profaza, uneori și telofaza, sunt cele mai lungi. Desfășurarea în timp a mitozei depinde și de tipul celulei, vârstă, starea fiziologică, condiții de mediu (mai ales temperatura). Influența temperaturii asupra ciclului mitotic a fost demonstrată de către Brown, la meristemul rădăcinilor de mazăre – Pisum sativum L., unde viteza ciclului mitotic crește proporțional cu temperatura (la 15C durează 177 min., iar la 30C doar 65,5 min.). Mitoza poate fi blocată prin acțiunea șocurilor de temperatură, narcoticelor, otrăvurilor etc. (Raicu și colab., 1973)

Durata fazelor ciclului mitotic (în minute), în funcție de tipul celulei, după Lobașev (1963) (cf. Raicu și colab., 1973) este:

METODE DE STUDIU A CROMOSOMILOR ÎN MITOZĂ

Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la plantele superioare

Cromosomii la plantele superioare se evidențiază în celulele aflate în diviziune mitotică din țesuturile meristematice, din zonele de creștere ale organelor vegetative (apex radicular, apex caulinar), sau în celulele meristemoide din calus.

În lucrările practice de citogenetică vegetală se folosesc mai ales specii de plante cu cromosomi de dimensiuni mari și în număr relativ mic. Pentru evidențierea cromosomilor, în celulele aflate în diviziune mitotică, se folosesc țesuturile meristematice din zona de creștere a rădăcinii de ceapă – Allium cepa L. (2n = 16), secară – Secale cereale L. (2n = 14), bob – Vicia faba L. (2n = 12) etc.

Materialul biologic tipic, este reprezentat de țesutul meristematic din apexul radicular al rădăcinii de ceapă – Allium cepa L. (2n = 16).

Rădăcinile de ceapă se obțin după o perioadă de 2-3 zile de la punerea într-un pahar cu apă a bulbului de ceapă, astfel ca numai discul să pătrundă în lichid. La temperatura camerei, rădăcinile ating în 2-3 zile, lungimea de 10-15 mm și pot fi detașate (Fig.13).

Fig. 13 Germinarea unui bulb de ceapă, în laborator

Pentru obținerea rădăcinițelor embrionare, semințele se pun la germinat pe hârtie de filtru, umectată cu apă, în cutii Petri, la temperatura camerei. Germinarea semințelor la unele specii de plante se face în nisip umed , în condiții speciale.

Recoltarea rădăcinilor se realizează când acestea ating lungimea de 10-15 mm. Momentul optim de recoltare – când un număr mare de celule se află în diviziune – se determină prin tatonare. Timpul optim de recoltare pe parcursul unei zile este între orele 7 – 10, funcție de durata ciclului celular la specia respectivă.

Metode de evidențiere a cromosomilor la plante

Metoda rapidă Feulgen de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n = 16)

Metodele rapide de colorare sunt bazate pe hidroliza substanțelor pectice din pereții celulari și colorarea diferențiată a constituenților celulari.

Principiul metodei:

În celulele în diviziune, doar ADN-ul cromosomial este colorat selectiv în roșu violaceu, de către o soluție de fuxină bazică decolorată (reactiv Schiff). Metoda a fost elaborată de Feulgen și Rossenbeck (1924) și modificată de Tomasi (1936); se aplică pentru evidențierea cromosomilor mitotici la diferite specii de plante (Tudose, 1967).

Materiale necesare:

material biologic (rădăcini de ceapă de 1-1,5 cm);

sticlărie (pahare Berzelius, flacoane, lame de microscop, lamele, pipete);

instrumentar (pensete, lame, bețe de chibrit);

aparatură (microscop optic, termostat, frigider);

hârtie de filtru

reactivi

prefixatori:

soluție apoasă de colchicină (0,01 – 0,2%);

emulsie de – bromnaftalen (25 ml bromnaftalen – C10H7Br în 75 ml apă distilată; se agită bine, se lasă în repaus pentru depunerea excesului de bromnaftalen și se folosește doar partea superioară a emulsiei);

cloronaftalen (C10H7Cl);

iodonaftalen (C10H7I);

apă rece la 2-4C

fixatori nucleari:

alcool etilic absolut – acid acetic glacial (3 :1);

fixator Carnoy (6 părți alcool etilic absolut : 3 părți cloroform : 1 parte acid acetic glacial);

fixator Battaglia (5 părți alcool etilic absolut : 1 parte acid acetic glacial : 1 parte formol : 1 parte cloroform)

coloranți:

reactiv Schiff – preparat după Darlington și La Cour (1960) (cf. Tudose, 1967): 1 g cristale de fuxină bazică se pisează în mojar, apoi se introduc într-un balon de sticlă, adăugându-se 200 cm3 apă distilată, la temperatura de 1000C; se agită puternic și se lasă la răcit până ajunge la temperatura de 500C. Se filtrează, se adaugă 30 cm3 HCl 1N și 3 g metabisulfit de potasiu cristale. Soluția se lasă 24 de ore într-o sticlă bine închisă, la întuneric și la rece, timp în care culoarea sa devine gălbui deschis; pentru decolorare se adaugă 0,5 g cărbune vegetal și se filtrează după 1 min., printr-o hârtie de filtru grosieră. Reactivul se poate păstra timp îndelungat la întuneric și la rece, la 40C. Dacă soluția nu este păstrată la rece, se poate observa începerea recolorării. Pentru a evita recolorarea, se adaugă în soluție, 2 – 4 g metabisulfit de potasiu.

preparat după Peșkov (1943) (cf. Tudose, 1967): într-un balon de sticlă se pun 0,5 g fuxină bazică, peste care se adaugă 90 cm3 de apă distilată la 1000C; se astupă balonul cu un dop de vată și se fierbe la o plită electrică încă 3 – 4 min. Se lasă să se răcească până la 500C și se adaugă 2 cm3 HCl cu =1,19 g / cm3. Se continuă răcirea până la 25C și se adaugă 10 cm3 apă distilată, conținând 2 g bisulfit de sodiu (Na2SO3) sau 4 g de bisulfit de sodiu cristalizat (Na2SO3 x 7 H2O). Amestecul se lasă să se răcească, apoi se filtrează și se păstrează la întuneric și la rece, la 40C, putând fi folosit timp îndelungat. Soluția folosită la colorare se recomandă să nu se arunce, deoarece poate fi folosită de nenumărate ori, până când capacitatea ei de colorare scade.

Etape de lucru:

Prefixarea

Prefixarea este necesară pentru a inhiba formarea fusului de diviziune, determinând acumularea de celule în metafază. Această etapă nu se recomandă să se execute când se urmărește observarea tuturor etapelor diviziunii. Prefixarea este absolut necesară însă, la efectuarea preparatelor folosite pentru studierea cariotipului, realizând o scurtare prin spiralizare, a cromosomilor.

Materialul biologic (rădăcinile de ceapă de 1 – 1,5 cm lungime) se introduce în flacoane mici de sticlă, adăugându-se 2 – 3 ml de prefixator. După trecerea timpului necesar prefixării, prefixatorul se îndepărtează cu o pipetă sau prin decantare. Ca prefixatori se folosesc: soluție apoasă de colchicină 0,01-0,2%, în care materialul se ține 2 – 3 ore la temperatura camerei; emulsie de bromnaftalen, 4 – 5 ore la temperatura camerei; apă rece la 2 – 40C, 4 – 24 ore, la frigider. Pentru studiul cromosomilor în mitoză la ceapă, recomandăm prefixarea bulbilor de ceapă germinați, cu rădăcini de 1 – 1,5 cm, timp de 24 de ore la frigider (3-40C), sau prefixarea cu soluție de colchicină, 0,2%, timp de 2 ore la temperatura camerei.

Fixarea

Fixarea are rolul de a omorî celulele, în starea în care se află în acel moment și de a coagula constituenții celulari, fără a modifica structura internă și externă a celulelor. Prin fixare, biocoloizii celulei se coagulează, constituenții celulari putându-se colora cu diferiți coloranți.

Fixarea se realizează prin adăugarea peste materialul biologic a 2-3 ml de fixator, după îndepărtarea substanței de prefixare. La ceapă, se prelevează rădăcinile și se plasează într-un flacon de sticlă, în vederea efectuării fixării cu fixator Battaglia, timp de 12 min., la temperatura camerei. În general, timpul de fixare variază în funcție de soluția de fixare și de consistența materialului fixat.

Dacă prelucrarea materialului biologic nu se continuă imediat, el se conservă la frigider (2 – 40C), în alcool etilic 70%.

Spălarea

Rolul spălării este de a îndepărta urmele de fixator. Spălarea se realizează cu soluție de HCl 1N, la temperatura camerei, timp de 5 min. Din flacoane, se îndepărtează soluția de fixare și se adaugă soluția de spălare.

Hidroliza

Rolul hidrolizei este de a ușura colorarea, prin dizolvarea parțială a substanțelor pectice intercelulare, distrugerea parțială a pecto-celulozei parietale, precum și ușurarea etalării celulelor între lamă și lamelă.

După îndepărtarea soluției de fixare, sau a alcoolului, se realizează hidroliza la cald sau la rece.

Hidroliza la cald se realizează la temperatura de 600C, prin adăugarea de 2 – 3 ml HCl 1N. Timpul este variabil, funcție de duritatea țesuturilor; se stabilește prin tatonări (la ceapă, 7 – 8 min.). Hidroliza la cald este anevoioasă și nu dă cele mai bune rezultate, deoarece, în general, când țesuturile sunt destul de moi, se macerează prea tare, se coagulează și materialul este compromis. De aceea, la ceapă se folosește, de preferință, hidroliza la rece.

Hidroliza la rece se realizează prin adăugarea de soluție HCl 50%, după îndepărtarea soluției de spălare. La ceapă, hidroliza se realizează timp de 10-15 min., la temperatura camerei.

Colorarea

După îndepărtarea soluției de hidroliză (cu ajutorul unei hârtii de filtru se îndepărtează urmele de soluție de hidroliză), se adaugă 2-3 ml de reactiv Schiff, astfel încât rădăcinile să fie scufundate în colorant, iar colorantul să rămână incolor. După 15-20 de min., zona meristematică din vârful rădăcinii începe să se coloreze în roșu-violaceu, apoi în violet intens, deoarece aici se află celule în diviziune; restul rădăcinii, unde frecvența diviziunilor este scăzută, iar celulele sunt mari și alungite, rămâne vizibil necolorată. Pentru o bună colorare sunt necesare 30 min. – 1 oră, la temperatura camerei. O colorare intensă, uniformă, se obține dacă materialul introdus în colorant se păstrează la frigider, câteva ore. Pentru mărirea contrastului între cromosomi și citoplasmă se recomandă menținerea rădăcinilor scoase din colorant într-o soluție de acid acetic 45%, timp de 10 – 15 min. sau în apă, timp de 30 de min., spălând astfel excesul de colorant. În cazul în care nu s-a realizat o colorare satisfăcătoare, intensificarea ei se realizează prin executarea preparatului într-o picătură de carmin acetic. În colorant, la frigider, materialul se poate păstra maxim 1-2 zile, după care se degradează, având loc și colorarea citoplasmei.

Efectuarea preparatelor microscopice

Efectuarea preparatelor temporare rapide (tip squash)

Preparatele microscopice rapide se obțin prin etalarea vârfului colorat al rădăcinii (de preferință o porțiune de 1-2 mm), pe o lamă de microscop curată și degresată (prin spălarea lamelor în amestecuri oxidante speciale folosite în lucrările de citologie, în alcool etilic 96%, sau în spirt sanitar, urmate de o bună ștergere cu o bucată de tifon, înaintea efectuării preparatului), într-o picătură de acid acetic 45%. În prealabil, vârful colorat al rădăcinii se poate trece printr-un cristalizor cu apă. Așezând deasupra vârfului detașat al rădăcinii o lamelă și ținând cu un deget o latură a lamelei, se etalează preparatul prin bătăi ritmice și sistematice în lamelă, cu un băț de chibrit, pentru dispunerea celulelor într-un singur strat și dispersarea cromosomilor în celule. Eliminarea excesului de soluție și desăvârșirea dispersării celulelor și a cromosomilor se realizează cu ajutorul unei hârtii de filtru, apăsând cu degetul mare peste lamelă, fără a o mișca. Pentru a împiedica împrăștierea cromosomilor și pentru o bună fixare a celulelor pe lamă, se recomandă ungerea acesteia înaintea executării preparatului cu albumină glicerinată. Lama unsă este trecută cu partea uscată deasupra unei flăcări, evitând coagularea albuminei glicerinate.

Cu cât etalarea se efectuează mai bine, cu atât preparatul este mai bun, prezentând cromosomii bine dispersați și individualizați. Trebuie evitată deplasarea lamelei pe lamă în timpul etalării, fapt ce duce la rostogolirea celulelor și la compromiterea parțială sau totală a preparatului. După etalare, între lamă și lamelă, trebuie să se observe cu ochiul liber un strat foarte fin de material celular colorat în violet.

Preparatele astfel obținute, se pot observa la microscop imediat după efectuare, timp de câteva ore, deoarece la lumină și la temperatura camerei, colorantul va dispersa în citoplasmă.

Efectuarea preparatelor semipermanente

Pentru studiul preparatelor și în ziua următoare, acestea se efectuează semipermanent, pentru a evita evaporarea acidului acetic 45%, ceea ce ar duce la deshidratarea celulelor. Astfel de preparate se realizează prin parafinarea marginilor lamelei, sau prin adăugare de glicerină pe marginile acesteia, la contactul cu lama și îndepărtarea excesului de glicerină cu ajutorul unei hârtii de filtru. Lamele semipermanente se pot păstra la frigider timp de 24 – 48 de ore. După o păstrare îndelungată, colorarea se intensifică, cuprinzând și citoplasma.

Efectuarea preparatelor permanente prin includere în balsam de Canada

Preparatele microscopice pe care dorim să le păstrăm timp îndelungat, cu scopul de a servi drept model, sau ca dovadă a unei cercetări științifice, se montează în balsam de Canada (rășină miscibilă cu xilenul sau toluenul). În jurul lamelei se pune o picătură de alcool 96% și cu ajutorul unei lame de ras, se desprinde cu atenție lamela de pe lamă, printr-o mișcare de ridicare a lamelei. Materialul de studiu rămâne prins de lamă și de lamelă. Atât lama, cât și lamela, se trec prin două băi succesive de alcool etilic absolut sau alcool butilic și două băi de xilen sau toluen, timp de 2-5 min., pentru fiecare baie.

Rolul alcoolului este acela de a deshidrata țesuturile și de a le spăla de acidul acetic; xilenul va înlocui apa din țesuturi; de asemenea, balsamul de Canada este miscibil cu xilenul.

Lamele se introduc în pahare Borel sau orice alt tip de pahar, iar lamelele în capsule de sticlă sau porțelan, întotdeauna cu preparatul biologic plasat la fața superioară. Pe lama umedă, în regiunea unde sunt celule, se pune o picătură de balsam de Canada, iar deasupra se aplică o lamelă curată și degresată. Pe aceeași lamă, alături (în regiunea fără celule) se pune o altă picătură de balsam de Canada peste care se așează lamela inițială, cu fața ce conține celulele, în jos. Se îndepărtează excesul de balsam de Canada printr-o ușoară apăsare pe lamele, cu o bucată de hârtie de filtru, realizându-se astfel, și prinderea lamelelor de lamă. Preparatul se usucă la termostat, la 400C, timp de câteva zile și se etichetează (se notează specia și țesutul din care s-a efectuat preparatul, metoda de colorare, data, eventual numele persoanei care a efectuat preparatul etc.), putând fi păstrat apoi timp îndelungat.

Examinarea preparatelor la microscopul optic

Examinarea preparatelor se efectuează în lumină puternică, cu folosirea unui filtru verde, care mărește contrastul între cromosomi și citoplasmă. Se recomandă ca observarea să înceapă cu obiectivul 10x, apoi, se schimbă obiectivele 20x, 40x și chiar 90x (cu imersie în ulei de cedru).

Deoarece reactivul Schiff colorează selectiv numai ADN-ul, la microscopul optic, se vor observa cromosomii colorați în roșu-violet; nucleolii, citoplasma și organitele celulare rămânând incolore. Pereții celulari nu se colorează, fiind greu vizibili, de culoare gălbuie; uneori se observă doar cromosomii celulelor în diviziune și nucleii celulelor în interfază. Pentru a delimita celulele, se poate realiza o ușoară colorare a citoplasmei, cu o soluție alcoolică foarte slabă de verde de metil. Această colorare se realizează înaintea efectuării preparatului permanent, prin trecerea lamei și a lamelei pentru un timp foarte scurt (câteva secunde), prin soluție alcoolică de verde de metil. Astfel, citoplasma se colorează în verde deschis și celulele pot fi ușor delimitate, iar cromosomii se observă mai bine, datorită contrastului de culoare.

La microscopul optic se vor observa celule în interfază cu nuclei mici, colorați în roșu-violet, cu nucleoli incolori, ce apar ca niște corpusculi luminoși de formă mai mult sau mai puțin rotundă. Se observă și celule în diferite faze ale diviziunii mitotice:

celule în profază timpurie, când cromosomii încep să devină vizibili la microscopul optic și au aspectul unor filamente fine și subțiri; în profaza târzie, când cromosomii se individualizează, fiind situați în nucleu. Spre sfârșitul profazei se dezorganizează membrana nucleară;

celule în metafază (fază cu frecvență ridicată în preparatele microscopice, în cazul în care s-a efectuat prefixarea); se pot număra și observa morfologic cromosomii care au atins maximul spiralizării, fiind bine individualizați. La Allium cepa L. (2n = 16) se pot observa cu ușurință și se pot număra 16 cromosomi, de forma unor bastonașe, cu capetele mai mult sau mai puțin îndoite. Prin studiu mai amănunțit cu obiectivul de imersie se poate observa morfologia fiecărui cromosom în parte, putându-se executa microfotografii;

celule în anafază – în anafază timpurie, cu cromosomii fii unicromatidici ce se deplasează spre polii celulei și anafază târzie, cu cromosomii fii la cei doi poli ai celulei, sub formă de stea – diaster;

celule în telofază timpurie, când cromosomii fii au ajuns la polii celulei și telofază târzie, caracterizată prin formarea nucleilor fii și apariția peretelui despărțitor (fragmoplastul).

Folosirea noniusului în studiul preparatelor microscopice

De o mare importanță în studiul preparatelor microscopice este folosirea noniusului, întocmit cu ajutorul scalelor gradate pe care le prezintă microscopul pe masa mobilă ce determină mișcarea preparatului, în direcție transversală și longitudinală.

Noniusul se folosește pentru a marca poziția celulelor ce prezintă interes deosebit în studiul efectuat, celule la care se va reveni pentru studiu mai amănunțit, sau care urmează a fi fotografiate.

Întocmirea noniusului se realizează, de preferință, la obiectivul 10x. Practic, este foarte simplu de notat noniusul pentru oricare celulă de interes deosebit în studiul efectuat. O primă condiție este aceea de a utiliza mereu același microscop, la care s-au fixat foarte bine susținătoarele lamei; a doua condiție este aceea a așezării preparatului pe masa mobilă în aceeași poziție (de exemplu, cu eticheta în dreapta).

Stabilirea noniusului se realizează prin notarea coordonatelor indicate de scalele gradate. De regulă, se notează mai întâi cifrele de pe abscisă, apoi de pe ordonată. De exemplu, notarea se face astfel: 40,7 x 74,3. Citirea se efectuează ca la citirea șublerului: se citesc întregi sutele, zecile și unitățile, iar subunitățile se citesc pe scara mică, unde coincid două gradații ale scalei mici și mari. Noniusul se notează în caietul de observații, după ce s-a notat numărul preparatului studiat (Tudose, 1967).

În laboratorul nostru, pentru studiul cromosomilor în mitoză la alte specii de plante, se utilizează metoda Feulgen, în diverse variante, adaptate pentru diferite tipuri de material biologic (orz, bob, secară, grâu și mac). Etapele de lucru generale, sunt:

prefixare la temperatura camerei, în soluție de colchicină 0,2% și spălare 2 ore cu apă distilată (pentru studiul cromosomilor în metafază);

fixare cu fixator Battaglia, la temperatura camerei, timp de 30 min. la orz, bob, secară și grâu și 20 de min. la mac;

spălare cu HCl 1N timp de 5 min.;

hidroliză cu HCl 50%, 12 min. la bob, 20 min. la orz, 30 min. la secară și grâu și 5 min. la mac;

colorare cu reactiv Schiff, la temperatura camerei, între 20 – 30 min., până la 2 – 3 ore.

Metoda rapidă de colorare a cromosomilor la ceapă Allium cepa L. (2n=16) în mitoză cu soluție carmin-acetică

Metoda a fost elaborată în 1926 de către Belling (cf. Tudose, 1967)și se bazează pe faptul că acidul carminic (din colorantul natural carmin, extras din femelele homopterului Coccus cacti), se comportă ca un colorant acid în soluție alcalină și se încarcă negativ, iar în soluție acidă, ca un colorant bazic, încărcându-se pozitiv. Această metodă este des folosită în studiile de citogenetică vegetală, deoarece este ușor de efectuat, necesitând un timp scurt.

Materialul biologic, sticlăria, instrumentarul și reactivii utilizați sunt identici cu cei folosiți în cazul metodei Feulgen.

Colorantul utilizat este soluția carmin acetică (55 cm3 apă distilată la 1000C, 45 cm3 acid acetic glacial și 0,5 g carmin). Amestecul se pune într-un balon de sticlă, se agită și se așează în bain-marie, lăsându-se să fiarbă câteva minute. Se agită din nou și se lasă să se răcească; se filtrează și se adaugă câteva cristale de acetat de fier (cu rol de mordant), ce se dizolvă încet în soluție, excesul depunându-se la baza vasului. Se păstrează la întuneric și la rece (la frigider).

Etape de lucru:

Prefixarea

Prefixarea materialului biologic lipsește, sau poate fi efectuată la fel ca la metoda Feulgen.

Fixarea

Fixarea nu este necesară; se poate realiza în fixator alcool : acid acetic (3 : 1), timp de 2 – 12 ore, sau cu alt fixator. Dacă nu se continuă lucrul, materialul poate fi păstrat la rece, în fiole cu alcool 70%, bine închise.

Hidroliza și colorarea

Hidroliza și colorarea se efectuează simultan, în soluția carmin-acetică. Într-o sticlă de ceas sau o capsulă de porțelan, se pun 3 – 5 cm3 colorant carmin acetic, peste materialul de studiat (rădăcinițe de 10 – 15 mm lungime). Pentru realizarea hidrolizei se adaugă câteva picături (10 – 15) de HCl 1N; se încălzește 20 – 25 min. la flacăra unei lămpi de spirt sau a unui bec de gaz, evitând fierberea și agitând, până când materialul capătă culoarea roșu închis, devine moale și se lasă la baza vasului.

Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatele microscopice se realizează pe o lamă de microscop, într-o picătură de carmin acetic, în care se așează vârful unei rădăcinițe. Pentru intensificarea culorii, se amestecă ușor colorantul cu ajutorul unei spatule metalice. Se așează deasupra o lamelă, se etalează și se îndepărtează excesul de colorant, în același mod ca la metoda Feulgen.

Metoda de colorare a cromosomilor cu orceină acetică

Metoda a fost elaborată în 1941 de către La Cour (cf. Tudose, 1967)și dă bune rezultate în cazul plantelor cu cromosomi de dimensiuni mici (de exemplu, la Zea mays). Se folosește la studiul cromosomilor în mitoză, dar și pentru alcătuirea cariotipului, deoarece orceina este un colorant puternic și colorează foarte bine cromosomii.

Materialul biologic, sticlăria, instrumentarul și reactivii utilizați sunt identici cu cei folosiți în cazul metodei Feulgen.

Colorantul utilizat este orceina acetică (2,2 g orceină în 100 cm3 acid acetic glacial). Orceina se dizolvă în acid acetic glacial la temperatura de fierbere, după care se continuă fierberea 2 – 3 minute, se lasă să se răcească și se filtrează. Din această soluție (soluție de rezervă) se prepară soluția standard (45 părți de soluție de rezervă și 55 părți apă distilată). În această soluție standard de orceină acetică 1%, care se prepară în momentul colorării, se adaugă 1/10 părți HCl 1N, pentru a grăbi hidroliza.

Etape de lucru:

Prefixarea

Prefixarea se realizează în emulsie de bromnaftalen, timp de 5 ore, la rece (0 – 40C).

Fixarea

Fixarea se realizează în fixator alcool : acid acetic (3 : 1), timp de 24 – 48 de ore, sau în alt fixator. Atât fixarea, cât și prefixarea pot lipsi, dar efectuându-se, se obțin o hidroliză și o colorare mai bune.

Hidroliza și colorarea

Soluția standard de orceină acetică cu HCl 1N se pune peste materialul de studiat, într-o capsulă de porțelan; se încălzește câteva minute, evitând fierberea, până când țesuturile devin moi și capătă culoare închisă.

Efectuarea preparatelor temporare, rapide (de tip squash)

Preparatele microscopice se realizează pe o lamă de microscop, după răcirea materialului, într-o picătură proaspătă de orceină acetică (fără HCl). Pentru obținerea preparatelor permanente nu se pot folosi tehnicile cunoscute, deoarece are loc un proces de micșorare a contrastului dintre cromosomi și citoplasmă.

Preparatele pot fi păstrate câteva zile, la frigider, prin efectuarea lor semipermanente. Se recomandă studierea imediată după prelucrare și efectuarea microfotografiilor.

Metoda Carr de colorare a cromosomilor la Papaver somniferum L. (2n=22)

Materialul biologic este reprezentat de radicule de mac – Papaver somniferum L., în vârstă de 3 – 5 zile, cu lungimea de 0,5 – 1 cm.

Sticlăria, instrumentarul și reactivii utilizați sunt identici cu cei folosiți în cazul metodei Feulgen.

Colorantul utilizat este carbol fuxina modificată – colorant Carr (Gamborg și Wetter, 1975):

1. Carbol fuxină (Carr și Walker, 1961)

soluția stoc A – 3 g fuxină bazică, în 100 ml alcool etilic 70% (se păstrează timp nelimitat);

soluția stoc B – 10 ml soluție stoc A se adaugă la 90 ml fenol 5%, în apă distilată (se folosește două săptămâni);

soluția carbol fuxină pentru colorare – 45 ml soluție stoc B se adaugă la 6 ml acid acetic glacial și 6 ml formaldehidă 37%.

2. Carbol fuxină modificată

la 2 – 10 ml soluție carbol fuxină pentru colorare se adăugă 90-98 ml acid acetic 45% și 1,8 g sorbitol.

O colorare mai bună a nucleilor s-a obținut folosind carbol fuxină modificată, preparată de timp îndelungat (soluția modificată se păstrează la temperatura camerei cel puțin două săptămâni, în recipiente de culoare închisă). Soluția de colorare este stabilă și nu s-au observat modificări (precipitare sau decolorare), timp de doi ani de păstrare la temperatura camerei.

Etape de lucru:

Prefixare

Prefixarea se realizează cu soluție de colchicină 0,2%, timp de 2 ore (pentru studiul cromosomilor metafazici).

Fixare

Fixarea se realizează cu fixator Battaglia, timp de 20 de min., la temperatura camerei. Se înlătură soluția de fixare și se adaugă alcool etilic 70%, în cazul în care se dorește păstrarea îndelungată la frigider.

Hidroliză

Hidroliza se realizează cu HCl 50%, 5 min., la temperatura camerei. Anterior hidrolizei se poate realiza și o spălare cu HCl 1N, 5 min. la temperatura camerei.

Colorare

Colorarea se realizează cu colorant Carr, după îndepărtarea soluției de hidroliză. Se clătește materialul biologic cu colorant și apoi se adaugă din nou colorant; se păstrează 24 de ore la frigider, timp în care se realizează colorarea materialului nuclear. Materialul biologic se poate păstra în colorant, la frigider, timp îndelungat.

Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatele se realizează pe o lamă de microscop, într-o picătură de acid acetic 45%, în care se plasează 3 – 5 rădăcinițe; se secționează 1 mm din apexul radicular al fiecărei rădăcinițe (se îndepărtează restul materialului biologic), se acoperă cu lamela și se realizează etalarea.

Preparatele microscopice se studiază la microscopul optic; se pot realiza și preparate permanente în balsam de Canada, după tehnica descrisă anterior.

Metode citogenetice pentru studiul cromosomilor mitotici la animale

Studiul cromosomilor la animale se poate realiza direct – în țesuturile cu activitate mitotică intensă (țesut hematopoetic, hepatic, splenic, gonadal, epiteliul cornean, țesuturi embrionare sau de regenerare, cât și indirect – în culturi de țesuturi.

Metode pentru studiul cromosomilor în diferite țesuturi provenite de la animale adulte

Studiul cromosomilor la pești (Fam. Cyprinidae)

Tehnica Ohno (1965)

Material biologic: splină, rinichi, gonade, branhii.

Reactivi: colchicină 0,5%, apă distilată, acid acetic 50%, HCl 1N, colorant Giemsa.

Instrumentar: lame de microscop, lamele, seringă, foarfece, ac spatulat, pensete etc.

Etape de lucru:

Pretratament

Pretratamentul se realizează cu colchicină. Colchicina blochează celulele în diviziune în stadiul de metafază, prin inhibarea activității fusului nuclear, determinând acumularea în țesuturile tratate a unui număr sporit de metafaze, cu cromosomii bine individualizați, liberi în citoplasmă.

Se injectează animalele adulte intramuscular (în musculatura dorsală) cu soluție de colchicină 0,5%, în cantitate de 0,5-1 ml. (în funcție de talie), cu două ore înainte de sacrificare.

Tratament

Tratamentul se realizează cu soluție hipotonică (hipotonă), ce determină o umflare și o fluidizare a citoplasmei celulare, permițând astfel dispersarea cromosomilor, deci o etalare superioară.

După sacrificarea animalului se recoltează splina, rinichiul, gonadele și branhiile, care se fragmentează în bucăți de aproximativ 2 mm3. Hipotonia se realizează în apă distilată, la pH neutru, timp de 15 min., la temperatura camerei.

Fixare

Fixarea are rolul de a omorî celulele, fără să altereze componentele celulare. Drept fixator se folosește soluția de acid acetic 50%, timp de 15-30 min., la temperatura camerei.

Hidroliză

Hidroliza se efectuează în scopul macerării țesuturilor, în vederea facilitării pătrunderii colorantului în nucleu; se realizează cu HCl 1N, la 600C, timp de 10-15 min.

Colorare

Colorarea se realizează cu soluție Giemsa, în scopul obținerii contrastului necesar examinării microscopice a cromosomilor.

Efectuare de preparate microscopice de tip squash

Pe o lamă de microscop, într-o picătură de acid acetic 45%, se plasează un fragment de țesut, se acoperă cu lamela și se etalează prin bătăi ritmice cu un băț de chibrit.

Preparatele se pot realiza permanente în balsam de Canada, după tehnica descrisă.

Tehnica Ojima și Hitotsumachi (1967)

Această tehnică este o variantă a metodei anterioare.

După tratamentul cu soluție hipotonică materialul se recoltează printr-o centrifugare ușoară și se tratează cu fixator alcool / acid acetic 3/1, timp de 24 de ore. Colorarea se realizează cu reactiv Schiff sau cu soluție de carmin acetic 2%, apoi se efectuează preparate microscopice de tip squash. Se pot efectua preparate permanente în balsam de Canada.

Tehnica Raicu și Taisescu (1972)

Pretratament

Pretratamentul se realizează cu soluție de colchicină 0,5%, prin injectare intramusculară, cu două ore înainte de sacrificare.

Tratament cu soluție hipotonică

Se prelevă splina, ficatul, rinichiul, gonadele și branhiile, se fragmentează și se introduc în soluție hipotonă de citrat de sodiu 0,4-0,7%; tratamentul se efectuează timp de 45 de minute, pe un agitator magnetic, la temperatura camerei.

Filtrare

Filtrarea se realizează prin tifon dublu într-o eprubetă de centrifugă; se centrifughează timp de 15 min., la 1500 rpm și se decantează supernatantul.

Fixare

Sedimentul celular se resuspendă în fixator (alcool etilic / acid acetic 3/1); se picură fixator pe pereții eprubetei și se lasă ½ oră la frigider, apoi se centrifughează. După centrifugare se elimină supernatantul și se repetă de 3-5 ori fixarea.

Efectuarea frotiurilor

Din ultima suspensie celulară se efectuează frotiuri pe lame înghețate, după tehnica uscării la aer.

Colorare

Colorarea se realizează cu soluție Giemsa 15%, timp de 20 min.

Studiul cromosomilor la amfibieni

Tehnica Spurway și Callan (1960)

Această tehnică este utilizată pentru evidențierea cromosomilor din celulele țesutului gonadal (testicul), la diferite specii de Triturus.

Etape de lucru:

Tratament

Pentru studiul cromosomilor metafazici este necesară înlocuirea tratamentului hipotonic cu o colchicinizare cu soluție de colchicină 0,04% în apă distilată, timp de 30 min., la 370C.

Fixare

Țesutul gonadal fragmentat se fixează 2-3 ore în fixator alcool acetic 3/1.

Colorare

Colorarea se realizează cu soluție carmin acetică 2%, cu acetat de fier, timp de 10 min.

Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatele se efectuează prin tehnica squash. Se plasează o porțiune din țesutul colorat pe lamă și se acoperă cu lamela, apoi se presează ușor pentru etalare.

Efectuarea preparatelor permanente

Preparatul se introduce în acid acetic 10% pentru desprinderea lamelei și se trece în alcool acetic 3/1, timp de câteva secunde. Ulterior se trec atât lama, cât și lamela prin două băi de alcool și două băi de xilol, apoi se montează preparatul în balsam de Canada.

Studiul cromosomilor la mamifere

Tehnica Fredga (1964)

Material biologic: cornee de șobolan, șoarece, hamster, cobai.

Hipotonia

Se asfixiază animalul (șobolan, șoarece, hamster, cobai) cu eter sau cloroform și se extirpă globii oculari cu un foarfece fin și o pensă curbă, evitând atingerea corneei. Globii oculari se plasează într-un vas cu soluție hipotonă de citrat de sodiu 0,7% (în apă distilată), la 370C, timp de 30 min.

Fixarea

Fixarea materialului se realizează în soluție de acid acetic 50% – 9 părți și o parte HCl 1N, 5 min.

Colorarea

Colorarea se realizează în soluție de orceină acetică 2%, 2 min.

Efectuarea preparatelor microscopice

Globul ocular se plasează pe o lamă de microscop curată și cu un ac spatulat se răzuie celulele din epiteliul cornean într-o picătură de colorant. Se acoperă cu lamela și se presează cu grijă, realizându-se un preparat de tip squash.

Tehnica Meylan (1964, 1967)

Material biologic: splină, testicul de șobolan, șoarece etc.

Pretratament

Animalul se injectează intraperitoneal cu 2 ml soluție colcemid 0,1% pentru 100 g animal viu. Pretratamentul se realizează timp de 90 min.

Hipotonia

Animalul se anesteziază cu eter, se sacrifică și se recoltează splina și testiculul, care se introduc 10 min. în cuve cu apă distilată și se fragmentează în bucăți mici.

Fixare

Pentru fixarea materialului, se îndepărtează apa distilată și se adaugă fixatorul (acid acetic 50%); fixarea se realizează timp de 40 min.

Etalarea

Pe o lamă albuminată se plasează un fragment de splină sau testicul și se acoperă cu lamela unsă cu vaselină. Materialul se strivește între lamă și lamelă prin apăsare cu degetul mare al mâinii.

Spălarea

Lamele se introduc într-o baie de alcool etilic 70%, până la desprinderea lamelelor. Lamele se așează în stativ în poziție verticală și se lasă 24 de ore, la temperatura camerei, pentru uscare. Astfel se pot conserva câteva luni. Pentru efectuarea studiului preparatelor, lamele se rehidratează în apă distilată timp de 20 min. Dacă lamele nu au fost uscate, se efectuează o spălare rapidă în apă distilată.

Hidroliza

Hidroliza se realizează în HCl 1N, timp de 13 min., la 560C.

Colorarea

Colorarea se realizează cu hematoxilină Erlich, 20 min. sau cu reactiv Schiff, timp de 2-6 ore.

Efectuarea preparatelor permanente

Se efectuează o spălare cu apă de robinet, urmată de o trecere în două băi de alcool și apoi în două băi de xilen. Preparatul se montează în balsam de Canada.

Tehnica rapidă Fredga (1968)

Material biologic: splină de șoarece, șobolan, etc.

Pretratament

Se injectează animalul intraperitoneal cu soluție colchicină 0,04%, cu 1-1 ¼ oră înainte de sacrificare.

Hipotonia

Se sacrifică animalul, se recoltează splina și se introduce într-un vas cu soluție izotonă de citrat de sodiu 2,2%. Se mărunțește cu foarfecele până la obținerea unei suspensii celulare. Se elimină țesuturile rămase și se adaugă două volume de apă distilată. Astfel, soluția de citrat de sodiu devine hipotonă. Tratamentul durează 10 min.

Fixarea

Se elimină supernatantul și peste suspensia de celule dizolvate se adaugă fixatorul (9 părți acid acetic 60% și 1 parte HCl 1N), lăsându-se 10-15 min.

Colorarea

Colorarea se realizează cu soluție de orceină acetică 2%, lăsându-se 2-3 min.

Efectuarea preparatelor microscopice

Preparatele se efectuează prin tehnica squash (etalarea materialului între lamă și lamelă prin strivire).