Chimia și Managementul Calitǎții Produselor de Consum [306757]

Ministerul Educației Naționale

Universitatea ,,OVIDIUS’’ din Constanța

Facultatea de Știinte Aplicate și Inginerie

Chimia și Managementul Calitǎții Produselor de Consum

ȋn Relație cu Mediul

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific

Prof. Univ. Dr. Ing. GABRIELA STANCIU

Masterand: [anonimizat]-BIANCA ENACHE

CONSTANȚA

2018

Ministerul Educației Naționale

Universitatea ,,OVIDIUS’’ din Constanța

Facultatea de Știinte Aplicate și Inginerie

Chimia și Managementul Calitǎții Produselor de Consum

ȋn Relație cu Mediul

Acidul betulinic. Izolare, caracterizare și acțiune terapeuticǎ

[anonimizat]. Univ. Dr. Ing. GABRIELA STANCIU

Masterand: [anonimizat]-BIANCA ENACHE

CONSTANȚA

2018

DECLARAȚIE

Subsemnata ENACHE L. LAURA-BIANCA, absolventǎ a Facultǎții de Științe Aplicate și Inginerie din Universitatea ,,OVIDIUS” [anonimizat] 2018, programul de studii CHIMIA ȘI MANAGEMENTUL CALITǍȚII PRODUSELOR DE CONSUM ȊN [anonimizat] rǎspundere cǎ [anonimizat] ȋn vigoare (Legea 8/1996 modificatǎ și completatǎ prin Legea nr. 285/2004, Ordonanța de Urgențǎ nr. 123/2005 modificatǎ și Legea nr. 329/2006).

Pentru eliminarea acuzațiilor de plagiat:

[anonimizat]-o și nu am cumparat-o, fie ȋn ȋntregime, fie parțial;

textele din surse romȃnești, [anonimizat]ȃnd un text original;

ȋn cazul utilizǎ[anonimizat]ǎtoare, imediat dupǎ frazele respective.

Am luat la cunoștințǎ cǎ existența unor pǎrți nereferențiate sau ȋntocmite de alte persoane poate conduce la anularea diplomei de master.

Data: Semnǎtura:

Rezumatul lucrǎrii

Lucrarea este structuratǎ ȋn douǎ parți principale și anume:

PARTEA I. CONSIDERAȚII GENERALE

Aceastǎ parte de generalitǎți este structuratǎ ȋn 4 capitole.

Primul capitol sintetizeazǎ datele din literaturǎ [anonimizat], cu spectru larg de proprietǎți terapeutice.

Capitulol 2 include o prezentare succintǎ a acidului betulinic și al derivaților sǎi. S-a demonstrat că printr-o modificare a structurii părinte se pot genera un număr important de potențiali derivați care îmbunătățesc semnificativ profilul toxicității selective.

Ȋn Capitolul 3 sunt prezentate principale metode de izolare și determinare a compușilor betulinici. Metoda de izolare utilizatǎ [anonimizat] o metodǎ ecologicǎ, care nu polueazǎ și care nu folosește solvenți organici periculoși și greu de manevrat. Analiza compușilor betulinici izolați s-a realizat prin metode spectrofotometrice și cromatografice.

Ȋn Capitolul 4 este prezentatǎ acțiunea terapeuticǎ a acidului betulinic. S-a demonstrat cǎ acidul betulinic induce apoptoza ȋn [anonimizat], suprimȃnd dezvoltarea tumorilor.

PARTEA II. CONTRIBUȚII ORIGINALE

Ȋn Capitolul 5 este prezentatǎ partea experimentalǎ a lucrǎrii, ce constǎ ȋn recoltarea sevei de mesteacǎn și ȋncercǎri fǎcute ȋn scopul stabilirii unei metode de analizǎ prin HPLC a compușilor betulinici prezenți ȋn aceasta, și anume a acidului betulinic și a betulinolului.

Motto

,,Chimia este o știință care va avea asupra vieții o influență imensă și o amplă aplicare.”

Cu ocazia definitivării lucrării de disertație, doresc sǎ adresez mulțumiri doamnei Prof. Univ. Dr. Ing. Gabriela Stanciu, conducătorul științific al acestei lucrări, pentru cunoștințele împărtășite și pentru susținerea acordatǎ.

Cuprins

Introducere

Cu toate progresele din domeniul chimiei de sintezǎ și semisinteză, plantele rămân cea mai importantă sursă de substanțe cu potențial terapeutic.

Ȋn ultimii 50 de ani, datoritǎ numeroaselor incidențe tumorale, a crescut semnificativ interesul pentru studierea unor compuși de sintezǎ și ȋn special al compușilor naturali, de origine vegetalǎ, de tip triterpenic, datoritǎ proprietǎților anticanceroase.

Ȋn acest sens, acidul betulinic este considerat cel mai important compus natural din regnul vegetal, avȃnd numeroase proprietǎți terapeutice ȋn majoritatea tipurilor de cancer. Acidul betulinic are o citotoxicitate selectivǎ care nu afecteazǎ celulele normale.

Motivația cercetǎrii

Cancerul este considerat ca fiind cea mai semnificativǎ problemǎ de sanǎtate publicǎ, datoritǎ patologiei sale complexe care impune o abordare medicalǎ multidisciplinarǎ. Ȋn tratarea pacienților diagnosticați cu cancer se pune un accent deosebit pe produsele naturale, care nu dau reacții adverse periculoase unui organism cu un sistem imunitar scǎzut. O atenție deosebitǎ, ȋn acest sens, a fost acordatǎ utilizǎrii compușilor terpenici policiclici, izolați din diferite surse naturale.

Pe plan internațional, se aflǎ ȋn fazǎ experimentalǎ utilizarea acidul betulinic și a derivaților sǎi, ȋn diferitele tipuri de cancer.

Obiectivele cercetǎrii

Obiectivul principal al cercetǎrii, este de a elabora o metodǎ de analizǎ HPLC a sevei de mesteacǎn, ȋn scopul determinǎrii acidului betulinic și a betulinolului, fiind cunoscut faptul cǎ aceștia se gǎsesc ȋn concentrații semnificative ȋn sevǎ.

PARTEA I. CONSIDERAȚII GENERALE

Capitolul 1. Considerații privind utilizarea plantelor medicinale

Prezentare generalǎ

Plantele medicinale reprezintǎ speciile vegetale, cultivate sau spontane, care prin compoziția lor chimică, prezintǎ proprietăți medicinale, fiind folosite în terapeutica umană și veterinară din cele mai vechi timpuri [1].

Valoarea terapeutică a plantelor medicinale are la bază relația dintre structura chimică a substanțelor active, numite și principii active, și acțiunea lor farmacodinamică pe care o exercită asupra elementelor reactive ale organismului. Plantele medicinale au o compoziție chimică complexă, începând de la 2-3 compuși până la 25-45 substanțe chimice identificate în unele plante, cum ar fi speciile genurilor Digitalis, Vinca, Claviceps, Papaver etc., explică și proprietățile farmacodinamice multiple ale uneia și aceeași plante. Lucrurile se complică, când avem de-a face cu amestecuri de plante cunoscute sub denumirea de "ceaiuri medicinale" sau "specii medicinale" sau amestecuri de tincturi, pulberi de plante, sau alte forme farmaceutice complexe [2, 3].

Tradiții românești privind utilizarea plantelor medicinale

Practica vindecǎrii bolilor și a alinării suferințelor fizice provocate de acestea, se realizǎ cu ajutorul plantelor medicinale, acestea avȃnd o tradiție străveche, ce se pierde în negura unor vremuri foarte îndepărtate. Sute de generații, au observat o multitudine de efecte benefice ale plantelor, perfecționȃnd ȋn timp remediile inițiate de strămoșii noștri ȋndepǎrtați daco-geții. Strămoșii noștri care au trăit acum mult timp pe meleagurile carpato-danubiene, cu mii de ani înainte de era noastră cunoșteau foarte multe specii de plante înzestrate cu proprietǎți terapeutice, ceea ce le-au creeat o reputație mǎreațǎ și au fost apreciați în întreaga epocǎ antică, pentru tratamentele deosebit de eficiente pe care le aplicau [3].

Herodot considerat și părintele istoriei, afirma despre strǎmoșii noștri daci că sunt : „buni cunoscători ai plantelor, având și numeroase tehnici surprinzǎtoare de îngrijire a bolnavilor cu ajutorul plantelor“. Din scrierile lui Herodot se constatǎ că, populațiile traco-dacice cunoșteau fumigațiile cu cânepă indiană (hașiș), cu numeroase efecte euforice și narcotizante contra durerilor nașterii. Aceasta demonstrează că dacii au avut legături și cu popoarele din Orient.

Homer, un alt mare poet al antichității, afirma despre geto-daci că, „în afară de bravura și bărbăția manifestată în lupte, ei posedau și o educație morală, manifestată în grija față de străini, de bolnavi și de răniții căzuți pe pământul lor“.

În mǎreața creație poetică a lui Ovidius (43 î.e.n.-17 e.n.), completată și finalizatǎ în timpul exilului său la Tomis – Constanța (8-17 e.n.), erau menționate foarte multe plante care au potențial terapeutic, majoritatea crescȃnd în flora din spațiul carpato-danubian și mai ales la Pontus Euxinus (Marea Neagră). Dintre speciile de plante erau menționate și Aconitum, Adonis, Malva. Un alt reprezentant al culturii antice, poetul latin Vergilius afirma, în scrisorile sale, că „Pontus Euxinus rodește multe ierburi și dă leac pentru mai toate bolile“.

Dioscorides, un medic grec născut în Asia Mică în anul 1 e.n., fiind contemporan cu împăratul roman Nero, a făcut foarte multe călătorii printre care și Dacia, de unde a strȃns un bogat material, pentru a scrie o carte de mare ȋnsemnǎtate pentru medicina naturistă a vremii. Cartea a fost intitulată „Despre mijloacele de vindecare“, fiind publicată în anul 77, aceastǎ carte descria peste 600 de specii de plante medicinale, dintre care 40 de specii de plante au fost specifice teritoriului Daciei. Dintre speciile enumerate, 27 din acestea au denumiri daco-trace, 8 denumiri latine și 5 denumiri grecești, acest lucru confirmȃnd o vechimea fitoterapiei pe meleagurile țării noastre.

După cucerirea Daciei de către romani (106 e.n.), arsenalul terapeutic al florei medicinale din Dacia s-a îmbogățit cu noi specii aduse de militarii și de administrația romană.

Pseudo-Apuleius, scriitor și mare botanist din secolul al II-lea e.n., în lucrarea sa „De medica minibus herbarum“, menționa alte 37 de plante cu efecte terapeutice folosite în Dacia: aniarsexe-iarba sărată, budathla-limba boului, chlodela-țelina de câmp, ciborastra-brusture, diesema-coada vacii, dyn-urzică, dzena-cucuta de apă, kardama-papură, koikodila-păpălău, kroustane-rostopască, mantia-mure, mizela-cimbru, skite-scai. Un studiu arată că 11 specii cu denumiri dacice sunt identice cu cele notate de Dioscorides, iar 26 de specii apar numai în scrierile lui Pseudo-Apuleius, fiind probabil adunate direct de pe teritoriul Daciei romane.

Ȋn anul 275 e.n, ȋn timpul domniei împăratului Aurelian, evacuarea Daciei de către autoritățile administrative și militare romane, medicina naturistă a constituit unica metodă de alinare și vindecare a suferințelor bolnavilor.

Clasificarea plantelor medicinale

Plantele medicinale se clasificǎ astfel:

1. Dupǎ organele utilizate în procesul de terapeutică, există 6 grupe de plante cu proprietǎți medicinale:

plante medicinale la care este ultilizatǎ doar rădăcina, bulbii ori tuberii (Angelica archangelica, Valeriana officinalis, Iris germanica, Gentiana lutea).

plante medicinale de la care se utilizează doar tulpina și coaja (Rhamnus frangula, Querqus robur).

plante medicinale de la care se utilizează herba (tulpina + frunzele): Mentha piperita, Melissa officinalis, Satureja hortensis).

plante medicinale de la care se utilizează doar frunzele și foliolele (Mentha piperita, Salvia officinalis, Plantago lanceolata, Digitalis sp., Atropa belladona)

plante medicinale de la care se folosesc inflorescențele, florile sau petalele (Lavandula angustifolia, Salvia sclarea, Althaea rosea, Calendula officinalis, Matricaria chamomilla).

plante medicinale de la care se utilizează fructele și semințele (Carum carvi, Coriandrum sativum, Papaver sp., Hyosciamus niger, Sinapis sp., Ricinus communis).

plante medicinale de la care se utilizează ȋn mod special sucul celular și seva (Aloe sp., Betula sp.).

2. Dupǎ perioada de recoltare. Perioada consideratǎ optimă, pentru recoltare se stabilește pe baza acumulǎrii de principii active și anume în faza ȋn care acestea se acumuleazǎ maxim. Din acest punct de vedere putem distinge următoarele grupe de plante:

plante medicinale care se recoltează în perioada repausului vegetativ (Atropa belladona, Inula helenium); din categoria speciilor bienale, rădăcinile se recoltează în mod special ȋn toamna anului I de vegetație (Angelica archangelica, Pimpinella anisum excepție face specia Colchicum autumnale (la care rădăcinile tuberizate se recoltează vara atunci când frunzele încep să se ofilească), dar și Aconitum nepellus (la care tuberculii se recoltează doar în perioada înfloritului). Speciile aparținând acestei grupe sunt considerate având în vedere utilizarea rădăcinii.

plante medicinale care se recoltează vara, în perioada de vegetație. Această grupă cuprinde specii anuale sau perene care se recoltează pentru flori, organele florale sau herba (Ocimum basilicum, Majorana hortensis, Tagetes patula, Calendula officinalis).

3. Dupǎ zonarea naturală reprezentatǎ de flora spontană și zonarea culturilor reprezentatǎ de speciile cultivate. Această clasificare are în vedere ȋn mod special cerințele plantelor față de anumite condiții ecologice și sunt:

plante medicinale iubitoare de apă, care cresc ȋn apǎ sau ȋn zone mlǎștinoase (Iris sp., Colchicum autumnale, Acorus calamus, Valeriana officinalis).

plante medicinale de câmpie, sunt specii de plante care sunt adaptate condițiilor de insolație ridicată ce caracterizează ȋn general verile din sudul țării (Foeniculum vulgare, Pimpinella anisum, Coriandrum sativum, Papaver bracteatum).

plante medicinale de deal, reprezintǎ speciile adaptate condițiilor ce caracterizează acele zone subcarpatice cât și zonele împădurite (Atropa belladona, Vinca minor, Crataegus monogyna, Geum urbanum – specii din flora spontană de deal; Papaver somniferum, Carum carvi, Valeriana officinalis – specii cultivate).

plante medicinale care cresc la munte, sunt specii adaptate condițiilor caracterizate prin: altitudine, vânturi, temperaturi cu mult mai scăzute în toată perioada anului fațǎ de restul zonelor (Gențiana sp., Arnica, Angelica archangelica).

4. Dupǎ ciclul de vegetație, parcurgerea fenofazelor, poate fi alt criteriu de clasificare al plantelor medicinale:

plante medicinale anuale, sunt speciile de plante care parcurg în totalitate ciclu de vegetație doar într-un singur an (Tagetes patula, Calendula officinalis, Papaver somniferum).

plantele medicinale bienale, specii de plante care își desfășoară tot ciclul de vegetație pe parcursul a doi ani (Carum carvi, Salvia sclarea).

plante medicinale vivace (perene) sunt specii de plante care au ciclul de viață multianual.

5. Dupǎ aspectul lor pot fi: plante ierboase (Valeriana officinalis, Thymus vulgaris, Papaver bracteatum) și plante lemnoase (Salvia officinalis, Lavandula angustifolia, Glycyrrhiza glabra).

6. Dupǎ caracterele botanice. Clasificare aceasta, urmărește doar criteriul strict legat de înșușirile morfologice dar și de tipul florii. Astfel plantele se pot clasifica și se grupează pe ordine, genuri, familii și specii.

7. Dupǎ conținutul de principii active.

plante medicinale care conțin uleiuri esențiale sau uleiuri eterice. Ȋn ceea ce privește conceptul despre definirea uleiurilor volatile, ȋn ultima perioadǎ a evoluat foarte mult. Acestea pot fi definite ca fiind “compuși aromatici volatili a căror compoziție chimică este formată dintr-o mulțime de amestecuri de hidrocarburi aromatice, alifatice, aldehide, alcooli, acizi organici, esteri precum și alți compuși similari hidrocarburilor și care aparțin clasei terpenoidelor“. Uleiurile volatile au un miros specific, aromatic, acestea fiind ȋn majoritatea cazurilor solubile ȋn alcool etilic. O picǎturǎ de ulei esențial, creeaza pe o hartie o patǎ care dispare rapid. Uleiurile volatile au o importanțǎ deosebitǎ ȋn medicinǎ, acestea fiind utilizate ca și expectorante, sedative, aromatice, stomahice, antispasmodice, carminative.

plante medicinale ce conțin alcaloizi (compuși organici complecși, caracterizați prin prezența azotului în molecula lor și reacție alcalină, cu formare de săruri). Au o acțiune puternică asupra organismului uman chiar și în doze mici. Alcaloizii se formează, de regulă, în părțile subterane ale plantei, de unde migrează în celelalte organe în timpul perioadei de vegetație. La mac și rostopască, alcaloizii se găsesc în sucul lăptos. În funcție de aminoacidul precursor, alcaloizii se clasifică în: alcaloizi derivați din glicolol, alcaloizi derivați din triptofan, alcaloizi derivați din fenilalanina, alcaloizi derivați de la lizină – ornitină, alcaloizi prin intermediul acetil – coenzimei A.

plante medicinale ce conțin principii amare. Principiile amare sunt compuși vegetali (cu structură glicozidică, alcaloidică), ternari cu gust amar (chiar și la diluții mari) care determină mărirea secreției gastrice. Dozarea principiilor amare se face prin metoda organoleptică. Se întâlnesc mai ales la familiile Gentianaceae și Asteraceae.

plante medicinale care conțin glucide (hidrați de carbon, heterozide sau glicozide) (Lemnul dulce). Glucidele sunt compuși organici naturali rezultați direct în procesul de fotosinteză.

plante medicinale care conțin flavonoide. Flavonoidele sunt pigmenți galbeni identificați la specii din familia Compositae sub formă de flavone (Matricaria chamomilla, Achillea milefolium, Calendula officinalis) sau sub formă de flavonoli la specii din familia Leguminosae (Sophora japonica).

plante medicinale care conțin antocianozide. Antocianozidele sunt pigmenți hidrosolubili aflați în sucul celular care conferă florilor, fructelor și frunzelor toamna, culoarea roșie, violetă, albastră.

plante medicinale care conțin taninuri. Taninurile sunt compuși naturali neazotați cu structură polifenolică.

plante care conțin antracenozide. Antracenozidele sunt compuși naturali ai antracenului având proprietăți purgative. Identificarea lor se realizează prin cromatografie în strat subțire.

8. Din punctul de vedere al fitofarmaciștilor cea mai bună clasificare consideratǎ de ei ar fi dupǎ importanța terapeutică (în funcție de principiile active predominante) [3]:

plante utilizate în bolile aparatului cardiovascular, care conțin, glicozide sau heterozide cardiotonice. Ex. Digitalis sp., Convalaria majalis.

plante utilizate în bolile aparatului respirator care pot fi cu acțiune emolientă (Althaea sp., Plantago sp.), cu acțiune expectorantă.

plante utilizate în afecțiunile aparatului digestiv ca Mentha sp., Melissa sp., Matricaria chamomilla, Carum carvi.

plante folosite în bolile aparatului urinar.

plante folosite în bolile sistemului nervos ca Valeriana officinalis, Vinca minor,Claviceps.

plante folosite în unele boli ale aparatului genital ca Claviceps purpurea,Calendula officinalis.

specii utilizate în tratamentul extern ca Hypericum perforatum, Calendula officinalis.

1.4. Principalii factori care determină calitatea plantelor medicinale

Cadrul de viață al plantelor este reprezentat de factorii de mediu: lumina, temperatura, apa, aerul și substratul de culturǎ.

Lumina este factorul care influențează ȋn mod deosebit, creșterea și dezvoltarea plantelor prin intensitate (lucși), durată și lungime de undă. Are rol important ȋn fotosinteză, reprezentȃnd sursa energeticǎ principalǎ a plantelor, dar ȋn același timp lumina constituie condiția esențialǎ și de bazǎ, pentru realizarea unei producții mari și de calitate. Lumina la suprafața solului ajunge sub două forme, lumina directă și lumina difuză.

Temperatura provine din radiația solară, aceasta reacționȃnd împreună cu lumina. Temperatura aerului influențeazǎ direct intensitatea tuturor proceselor biochimice care au loc ȋn partea aeriană a plantelor și acționează ȋn același timp și indirect asupra acestora, prin influența care o are asupra regimului termic al solului, formarea umidității de lângă sol, precum și asupra evaporației. Creșterea și fructificarea plantelor, depinde ȋn mod deosebit de temperatura aerului dar și de cea a solului. Aerul ȋn mod normal se încălzește ziua, datoritǎ radiației reflectată pe suprafața solului. Temperatura solului este ȋntotdeauna mai ridicată cu cel puțin cȃteva grade fațǎ de cea a aerului, în funcție de umiditatea solului.

Apa reprezintǎ alt factor esențial ȋn creșterea și dezvoltarea plantelor. Apa este un constituent natural, ce se gǎsește ȋn ambundențǎ ȋn toate organele plantei (rădăcinile 65 – 85% apǎ, frunzele 75 – 80 % iar fructele ajung și la un procent de 90 % apǎ). Apa contribuie la toate procesele fiziologice vitale ale plantei. Aerul are o influență indirectă asupra plantelor, modificȃnd regimului umiditǎții solului și a principalilor indicatori ai fertilității solului, dar nu in ultimul rȃnd și al indicatorilor determinanți, cum ar fi: substanțele nutritive, aerul, consistență reacție (pH), căldură, activitate biologică, procese fizico-chimice și biochimice, cu rol decisiv ȋn desfășurarea tuturor proceselor de formare a recoltelor.

Precipitațiile în exces pot influența vegetația, creșterea și dezvoltarea plantelor. Astfel, un timp ploios și rece prelungește perioada de vegetație a plantelor, diminuează procesul de fotosintezǎ și împiedică maturarea și colorarea fructelor. Umiditatea în exces a solului afecteazǎ sistemul radicular al plantelor prin asfixierea parțială sau totală, producȃnd pagube ȋnsemnate, iar umezeala aerului de peste 70% favorizează foarte mult atacul de mană și putrezirea coletului.

Foarte dăunător este un exces de umiditate în sol și atmosferǎ, în perioada coacerii și recoltării fructelor și legumelor.

Aerul are o influență directǎ asupra plantelor de cultură, prin compoziția sa atmosferică.

Oxigenul este utilizat de plante în respirație iar dioxidul de carbon este esențial ȋn fotosinteză.

Asigurarea necesarului de CO2 se realizează prin mișcarea continuǎ a aerului și prin descompunerea materiilor organice în sol. De altfel mișcarea permanentă a aerului favozizeazǎ împrospătarea cu O2, CO2 și reducerea excesului de umiditate ȋn atmosferǎ.

Vânturile puternice afecteazǎ întotdeauna majoritatea plantelor deoarece, sub acțiunea lor mecanică se produc pagube remarcabile, rup ramurile, înclină, dezrădăcinează plantele. Vântul prin intensitate și duratǎ joacǎ un rol important în polenizarea plantelor, avȃnd o acțiune directǎ.

Capitolul 2. Acidul betulinic și derivații sǎi. Speciile vegetale utilizate pentru izolarea lor

2.1. Acidul betulinic și derivații sǎi

Acidul betulinic este un compus natural, larg răspândit în regnul vegetal avȃnd o serie de efecte biologice, de exemplu o activitate antinaceroasǎ puternică. Acidul betulinic se izoleazǎ ȋmpreunǎ cu betulinolul.

Acidul (3β)-3-hidroxi-20(29)-lupen-28-oic sau acidul betulinic, (C₃₀H₄₈O₃), (Figura 1. a), este derivat din betulinol, (C30H50O2), (Figura 1. b), o triterpenă pentaciclică care se găsește din abundențǎ în coaja scoarței de mesteacăn, (Betula pendula, Betula costata, Betula ermanii). Aproximativ 30% din scoarța uscatǎ a mesteacǎnului este reprezentatǎ de betulinol.

Figura 1. a. Acidul betulinic b. Betulinol

2.1.1. Activitatea terapeuticǎ

Acidul betulinic este un produs natural cu o serie de efecte biologice, de exemplu o activitate antitumorală puternică. Această proprietate anticanceroasă este legată de capacitatea sa de a induce moartea celulelor canceroase prin declanșarea căii mitocondriale a apoptozei [5].

Moartea celularǎ fiziologicǎ este esențialǎ pentru dezvoltarea și functionarea normalǎ a organismelor multicelulare. Apoptoza este un proces ȋnnascut, conservat din punct de vedere evolutiv, prin care celulele sistematic ȋși inactiveazǎ, dezasamblezǎ și ȋși degradeazǎ propriile componente structurale și funcționale pentru desǎvarsirea propriului lor deces.

Celulele canceroase sunt un exemplu de complexe celulare ȋn care mecanismele apoptozei nu mai funcționeazǎ.

Celulele canceroase supraviețuiesc și se multiplicǎ farǎ a mai fi influențate de transformǎrile genetice survenite ȋn cursul vieții celulei, ȋn timp ce ȋn mod normal ar fi trebuit sa fie distruse prin apoptozǎ [23].

Spre deosebire de citotoxicitatea acidului betulinic împotriva unei varietăți de tipuri de cancer, celulele și țesuturile normale sunt relativ rezistente la acidul betulinic. Compușii care exercită o acțiune directă asupra mitocondriilor prezintă terapii experimentale promițătoare, deoarece acestea pot declanșa moartea celulelor în circumstanțe în care chimioterapeutica standard nu reușește.

Acțiunea anticanceroasă a acidului betulinic se datorează perturbării directe a mitocondriilor, prin modularea nivelelor grupului de proteine Bcl-2 ( B-cell limphoma 2) și prin blocarea factorului nuclear kappa B.

Apoptoza (gr.”apoptosis”-caderea frunzelor) este un process de moarte celulalarǎ programatǎ, umatǎ de modificari citologice caracteristice (markeri apoptotici) și mecanisme moleculare de semnalizare; este o formǎ de moarte celularǎ, urmatǎ de micșorarea dimensiunilor celulei, condensarea și fragmentarea cromatinei, formarea de vezicule cu organitele celulare fǎrǎ sǎ fie eliberatǎ citoplasma extracelular.

O mare varietate de proprietăți medicinale și acțiuni biologice au fost atribuite acidului betulinic, inclusiv proprietăți anticanceroase antitumorale, antiinflamatorii, antimicrobiene, antiischemice, antimalarice, antimelanom, citotoxice specifice pentru carcinomul pulmonar, pentru cel al colonului, și pentru tumorile neuroectodermic [29]. În plus compusul dezvoltă și o acțiune antiangiogenică, antileucemică și antilimfomatică, fiind un bun inhibitor al tumorilor maligne cerebrale, prin activarea directă a apoptozei la nivel mitocondrial. În timp ce rapoartele inițiale sugerează că acidul betulinic este selectiv citotoxic împotriva liniilor celulare melanomice, activitatea anticancer a fost raportată ulterior și împotriva altor tipuri de cancer uman, incluzând neuroblastomul, glioblastomul, meduloblastomul, tumora Ewing, leucemia precum și carcinomul la gât, colon, sân, hepatocelular, plămân, prostată, celule renale, carcinom ovarian sau de col uterin [5].

A fost raportat că acidul betulinic inhibă aminopeptidaza N, o enzimă implicată în reglarea angiogenezei și supraexprimată în mai multe forme de cancer.

De asemenea, acidul betulinic a fost citotoxic în diferite modele de rezistență la medicament, de exemplu, probe de leucemie acută care au fost rezistente la agenții chimioterapeutici standard. Astfel, acidul betulinic poate depăși anumite forme de rezistență la medicament.

Acidul betulinic a cooperat cu stimuli citotoxici diferiți pentru a suprima creșterea tumorală, inclusiv radiația ionizantă, medicamentele chimioterapeutice sau ligandul de deces TRAIL. Acest lucru sugerează că acidul betulinic poate fi utilizat ca și sensibilizator în regimuri combinate pentru a spori eficacitatea terapiei anticanceroase. Prin comparație, celulele normale de origine diferită au fost raportate a fi mult mai rezistente la acidul betulinic decât celulele cancerigene care indică o selectivitate tumorală [28].

De asemenea, s-a constatat că acidul betulinic încetinește progresia infecției HIV 1, care în cele din urmă duce la SIDA, prin prevenirea formării sincițiilor (agregate celulare). În plus, acidul betulinic are proprietăți antibacteriene și inhibă creșterea bacteriilor Staphylococcus aureus cât și a Escherichia coli.

Un inconvenient major pentru dezvoltarea clinică viitoare a acidului betulinic constă în solubilitatea lor slabă în medii apoase, cum ar fi serul de sânge și solvenții polari utilizați pentru bioteste.

O sursă de acid betulinic solubil și ingerabil este chaga (Inonotus obliquus) (Figura 2.), o ciupercă medicamentoasă , avȃnd o creștere lentă (minimum 7-10 ani) găsită ca parazit pe mesteacan în regiunile cele mai reci ale emisferei nordice. Această ciupercă convertește betulina prezentă în coaja mesteacanului într-o formă solubilă și ingerabilă de acid betulinic.

Figura 2. Inonotus obliquus

2.1.2. Sinteza compușilor derivați din acidul betulinic

De-a lungul cercetărilor efectuate la nivel mondial în domeniul agenților antitumorali, au fost studiate mai multe modificări structurale și derivatizări ale acidului betulinic, demonstrându-se că printr-o simplă modificare a structurii părinte se pot genera un număr important de potențiali derivați care îmbunătățesc semnificativ profilul toxicității selective, sau care pot induce un efect toxic general asupra celulelor leucemice. Acidul betulinic prezintă trei poziții: C3, C20 și C28 unde se pot efectua modificări chimice în vederea obținerii derivaților cu activitate antitumorală importantă.

2.2. Surse naturale utilizate pentru obținerea acidului betulinic

Coaja de mesteacǎn este cea mai importantǎ sursǎ de acid betulinic , din care se pot extrage cantitǎți industriale de betulinol și acid betulinic [7].

Mesteacănul face parte din genul Betula, familia Betulacee. Aceștia sunt copaci sau arbuști de talie mică sau medie, avȃnd o coajă albă caracteristică, care cresc ȋn special unde clima este temperată nordică. Preferǎ ȋn general zonele de deal și munte, pânǎ la 1.500 m altitudine.

Principii active:

Funzele de mesteacǎn conțin pȃnǎ la 3% flavonoide dar și acizi fenolici, metil salicilat, tanini și vitamina C.

Coaja de mesteacǎn conține: vitamina C, acizi fenolici, nicotinici și acetilsalicilici, tanini, caroteni și principii amare, mucilagii, rășini și substanțe antiseptice vegetale, de asemenea conține și zaharuri, saponine, betulinol, flavonoizi, uleiuri esențiale, betulenol și metilbetulenol.

Seva de mesteacǎn conține glucozǎ, fructozǎ (care ȋi conferǎ sevei un gust usor dulce, foarte agreabil), aminoacizi, derivați terpenici, vitamina C și o serie ȋntreagǎ de minerale valoroase: calciu, fosfor, magneziu, mangan, zinc, sodiu și fier.

Capitolul 3. Metode de izolare și analizǎ a compușilor betulinici

Un dezavantaj al procedeelor de extracție curente este că solvenții organici utilizați sunt periculoși, dificil de manevrat sau dificil de eliminat.

3.1. Extracția cu lichid supecritic

Extracția cu dioxid de carbon a acidului betulinic se realizeazǎ la o presiune de la aproximativ 340 atm până la aproximativ 680 atm și la o temperatură de aproximativ 50 ° C până la aproximativ 120 ° C [9].

Extracția cu fluid supercritic este o extracție în care se utilizează un fluid la o temperatură și o presiune mai mare decât punctul său critic; sau un lichid peste temperatura critică, indiferent de presiune. Sub punctul critic, fluidul poate coexista în ambele faze gazoase și lichide, dar deasupra punctului critic există o singură fază.

Pentru extracția acidului betulinic se utilizeazǎ partea exterioarǎ a scoarței de mesteacǎn. Ȋn mod alternativ, bucățile interioare și bucățile exterioare de coaja de mesteacǎn pot fi separate prin utilizarea unui clasificator de aer, acesta fiind un dispozitiv care funcționează pe principiul proprietăților diferite ale celor două componente (de exemplu coaja de mesteacăn interioară și exterioară) într-un curent de aer pentru a efectua o separare fizică. În mod tipic, coaja mai puțin densă exterioară se deplasează pe o distanță mai mare în fluxul de aer decât coaja interioară mai densă. Coaja interioară, împreună cu alte materiale, cade rapid din curentul de aer. Ca rezultat, coaja de mesteacăn interioarǎ și coaja de mesteacăn exterioară pot fi separate. Cu cât sunt mai mici bucățile de coajă de mesteacăn, cu atât va fi mai eficientă extracția. Pentru o fragmentare mai eficientǎ se recomandǎ uscarea coajei de mesteacǎn [9].

Aceastǎ metodǎ utilizată pentru a extrage acidul betulinic din coaja de mesteacăn, nu afecteazǎ alți compuși care rămân în coaja de mesteacăn.

Solvenții cei mai utilizați în extracția cu fluid supercritic sunt: dioxid de carbon, Xe, Freon-23, etan, N2O, SF6 și co-solvenți.

Schema procesului de extracție al principiilor active din scoarța de mesteacǎn este prezentatǎ ȋn Figura 3. Coaja de mesteacăn este introdusǎ într-un rezervor de alimentare (1) prin capacul deschis de pe partea superioară. Coaja de mesteacăn este încălzită la o presiune ridicată într-un solvent care conține dioxid de carbon, dupǎ care soluția este transferată într-un rezervor de produs (2). Produsul extras este îndepărtat și solventul care conține dioxid de carbon trece printr-un condensator (3) și apoi este reciclat în rezervorul de alimentare (1) printr-un reciclator (4).

Figura 3. Procesul de extracție cu fluid superctitic al principiilor active din coaja de mesteacǎn

Dioxidul de carbon este o componentă majoră a atmosferei și, prin urmare, este relativ sigur și abundent.

În comparație cu majoritatea altor solvenți, dioxidul de carbon este ecologic, deoarece nu va afecta atmosfera. În plus, dioxidul de carbon este neinflamabil. Mai mult, dioxidul de carbon nu lasă nici un rezid substanțial sau o rămășiță la evaporare.

Acidul betulinic poate fi separat și purificat prin formarea specifică a sărurilor aluminoase nesolubile ale acidului betulinic cu alcoolații de aluminiu.

Un alcoolat de aluminiu adecvat este izopropoxidul de aluminiu, dar pot fi utilizați și alți alcoolați sau rășini schimbătoare de ioni pentru purificarea acidului betulinic.

Purificarea acidului betulinic: produs rezultat ȋn urma extragerii cu dioxid de carbon a fost fiert cu etanol și s-a adăugat izopropoxid de aluminiu. Amestecul rezultat a fost filtrat fierbinte și filtratul a fost răcit la 0°C timp de 3 ore. Cristalele s-au format ȋn soluție și s-au filtrat pentru a se obține betulinol (puritate mai mare de 90%, randament 3% din coaja uscată).

Solidele obținute prin filtrarea fierbinte au fost combinate, spălate cu etanol fierbinte, acidulate cu HCI 2%, filtrate, spălate cu hexan, spălate cu hexan-eter și hidrolizate cu hidroxid de sodiu 5% în etanol pentru a se obține acid betulinic ( puritate mai mare de 95%).

3.2. Extracția cu solvenți organici a acidului betulinic din frunzele de Callistemon linearis și analiza spectrofotometricǎ

Callistemon linearis (Figura 4), numit și arborele de ceai, este un arbust ȋnalt originar din Australia. Ȋn fitoterapie sunt utilizate doar frunzele și ramurile tinere. Frunzele conțin urmǎtoarele principii active: terpineol, cineol, pinen, terpinen. Acidul betulinic a fost izolat ȋn randament bun din frunzele de Callistemon linearis, utilizȃnd ca metodǎ CSS (cromatografia ȋn strat subțire) [11].

Figura 4. Callistemon linearis

Frunzele proaspete de Callistemon linearis au fost colectate de la Chittagong. Frunzele plantei au fost mǎcerate și uscate la aer timp de câteva zile. Dupǎ care au fost uscate în cuptor timp de 24 ore la 40 ° C. Frunzele uscate au fost apoi mǎrunțite [10].

Principiile active din frunzele de Callistemon linearis au fost separate și identificate prin CSS (cromatografie ȋn strat subțire), respectiv prin cromatografia pe coloanǎ, utilizȃnd o coloana de sephadex. Eluentul utilizat a fost toluenul, acetatul de etilil 85 – 15 %.

Ȋn urma analizei au fost determinați 2 compuși: compusul 1 a fost identificat ca acid betulinic ( Figura 5. a.) și compusul 2 a fost identificat ca fiind alt acid ( Figura 5. b.).

Figura 5. a. Compus 1 și b. Compus 2

3.3. Separarea și determinarea principiilor active din extractele vegetale din Eugenia florida prin metoda HPLC și GC / FID

Acidul betulinic este un triterpenoid cunoscut izolat din diferite organe și specii de plante, inclusiv Eugenia florida. Acest metabolit prezintă o activitate inhibitoare asupra creșterii celulelor melanomului uman și replicarea virusului SIDA [7].

Acidul betulinic are și proprietăți antibacteriene și inhibă creșterea coloniilor de Escherichia coli și Staphylococcus aureus.

Cercetarea este necesară pentru a identifica noi surse naturale, care produc cantități mari de substanță ușor regenerabile din plante (frunze), dezvoltarea de metode cromatografice, studii rapide pentru a identifica cele mai bune luni de izolare a principiilor active.

Pentru căutarea unor noi surse de metaboliți bioactivi din plante braziliene, au fost investigate frunzele de Eugenia florida. Această specie aparține familiei Myrtaceae. Compuși precum flavonoidele, triterpenii, taninurile și în special uleiurile esențiale constituite din monoterpene și sesquiterpene au fost deja izolate din genul Eugenia. Speciile acestei familii sunt larg răspândite în pădurile braziliene, o mare parte fiind cunoscută pentru fructele comestibile, lemnul, uleiurile esențiale sau scopurile ornamentale. Cele mai importante genuri ale acestei familii sunt: Melaleuca, Eucalyptus, Psidium și Eugenia [14].

Mai mulți factori care pot coordona sau modifica rata de producție a metaboliților secundari, factorii genetici, mediul fizic, metoda de colectare (data, ora), condițiile de uscare și transport, depozitarea, pH-ul solului, condițiile de creștere, partea de plante utilizată, interacțiunile dintre plante, prezența microorganismelor, pot afecta în mod direct concentrația componentelor chimice ale fiecărei specii [7, 14].

Variația sezonieră (colectarea plantelor în diferite perioade sau sezoane) este un factor foarte important în procentajul și producția de metaboliți secundari. Datorită importanței sale, este necesar un studiu al sezonalității, atunci când se lucrează cu plante medicinale.

Această lucrare are ca obiectiv principal elaborarea unui protocol pentru cuantificarea principiilor active prezente în frunzele Eugenia florida, utilizând tehnicile cromatografice GC / FID și HPLC.

Material vegetal

Frunzele sănătoase de la Eugenia florida au fost colectate în decurs de 12 luni din campusul Fundației Oswaldo Cruz, statul Rio de Janeiro.

Extracția acidului betulinic

Frunzele de Eugenia florida au fost uscate la 40°C, măcinate și supuse extracției cu etanol. Extractul diluat a fost îndepărtat sub presiune redusă. O parte din extractul de metanol a fost dizolvată în metanol și recristalizată utilizând amestecuri de CHCl3 și MeOH. Prin recristalizare s-a obținut un cristal alb (EF-1). EF-1 a fost analizat prin RMN.

După calibrarea cu standardul acidului betulinic, au fost analizate extractele lunare din frunzele de Eugenia florida. Extractele respective au fost analizate în triplicat și s-au calculat zonele medii corespunzătoare acidului betulinic. Din aceste zone medii, compoziția procentuală a acidului betulinic din extract a fost calculată folosind ecuația liniară generată în timpul calibrării acidului betulinic efectuată prin HPLC-UV și GC-FID [14].

Cuantificarea acidului betulinic prezent în extractele de etanol din frunzele de Eugenia florida determinate prin GC-FID și HPLC-UV la 210nm.

S-a constatat că acidul betulinic a fost prezent în toate extractele analizate, cu randamente mult mai mari decât cele găsite în literatură.

Nivelul acidului betulinic în frunzele Eugenia florida a crescut semnificativ în perioada mai, iunie, iulie (toamna-iarnă) și septembrie, octombrie și noiembrie (iarna), datorată în principal acumulării acestui compus în țesuturile vegetale. Unii autori afirmǎ cǎ triterpenii pentaciclici, la fel ca betulinolul, acidul ursolic, acidul, β-amirina și lupeolul, ar trebui să fie toxici pentru insecte, datorită capacității lor de a inhiba ambalarea lanțurilor acilice în straturile bilaterale lipidice ale membranelor insectelor.

Tabelul nr. 1. Cuantificarea acidului betulinic

Aceste fluctuații observate în lunile descrise în Tabelul nr. 1 pot fi legate de ecologia chimică a plantei Eugenia florida, de exemplu, atracția polenizatorilor sau fenologia reproductivă a speciilor.

Este posibil ca aceastǎ concentrație crescută de acid betulinic în luna martie să se datoreze cantității mari de precipitații caracteristice statului Rio de Janeiro. Cu toate acestea, sunt necesare mai multe cercetări pentru a determina dacă alți factori pot influența concentrația acestui metabolit, să se verifice dacă aceastǎ plantǎ ȋn alte regiuni are același comportament sau este diferit și să examineze dacă efectul solventului poate afecta creșterea concentrației acestui metabolit.

3.4. Evaluarea conținutului de Betulinol și Acid Betulinic în coajă de mesteacăn din diferite zone forestiere ale Carpaților Occidentali

România este o țară bogată având în vedere varietatea pădurilor de mesteacǎn. La acestea se regăsesc patru specii principale (Betula pendula Roth., Betula pubescens Ehrh., Betula humilis Schrank și Betula nana L.), în Carpații Occidentali cel mai rǎspȃndit fiind Betula pendula Roth. Mesteacǎnul se caracterizează printr-o amplitudine ecologică ridicată, care se dezvoltă fără condiții speciale. Prin forma sa unică și aspectul alb al scoarței, prin frunzișul deosebit, poate fi și un copac decorativ [2].

Lemnul de mesteacǎn are proprietăți tari, utilizate în general pentru tâmplărie sau chiar pentru industria acvatică. Este o sursă bună de metanol, oțet, cărbune și scoarța bogată în tanin care a fost folosită în principal pentru a obține hidrocarburi grele și uleiuri lubrifiante. Uleiul extras este utilizat drept combustibil pentru iluminat (în special în nordul Europei).

Coaja de mesteacăn este formată dintr-o epidermă suberoasă albă cu straturi multiple care se exfoliază în folii înguste. Aproape jumătate din acesta conține un fel de rășină care conține betuline. Frunzele conțin substanțe importante, inclusiv flavonoidele, care pot fi valorificate pentru diferite produse. Coaja de mesteacăn este, de asemenea, cunoscută ca un agent antipiretic, care conține 4-5% tanini și uleiuri esențiale.

Acidul betulinic este un compus biologic minor, dar cu o eficacitate ridicată în tratarea diferitelor boli. Interesul pentru acidul betulinic a crescut recent, deoarece anumiți derivați din această compoziție sunt considerați a fi potențiali agenți împotriva cancerului tumoral, precum și în terapia cronică cu hepatită [5].

Coaja de mesteacăn conține triterpene pentaciclice, în principal betulinol (BE, până la 34%), dar și acid betulinic (BA), acid oleanolic (OA), lupeol (LU) și eritrodiol (ER).

Pentru corelarea conținutului de betulin și acizi betulinici din probe, au fost înregistrate condițiile geografice și de vegetație în locațiile specifice ale fiecărui tip de probă. Au fost colectate mostre de coaja de vârste similare, din diferite zone montane din Carpații Occidentali [13].

Au fost colectate două grupe de probe de coajă de copac:

– un grup (eșantioane 1 până la 5) din suprafețele de pășunat în care arborii de mesteacăn au apărut spontan ( Figura 6.). Arborii au fost situați în zonele înalte de deal și pre-munte, situate la 46 ° 65 'latitudine nordică, 23 ° 03' longitudine estică și la o altitudine cuprinsă între 900 m și 1050 m altitudine, cu expoziție însorită și pante diferite.

– un alt grup (eșantioane 6-10) din pădurile copacilor combinați ( Figura 7.). A fost colectat de la mesteceni găsiți în bazinul "Valea Ierii", situat la 46 ° 65 'latitudine nordică, 23 ° 35' longitudine estică și altitudine medie 1000 m asl cu condiții similare, dar cu pante diferite din zona (nr.7, 8 și 9) sau în afara pădurilor (nr.6 și 10)

Figura 6. Poziția geografică a locurilor de recoltare pentru probele 1-5

Figura 7. Detalii privind suprafețele cu mesteacǎn de unde au fost recoltate probele 6-10 (regiunea Bondureasa)

Caracterizarea zonelor specifice din unitatea de producție Bondureasa IV

1. versant inferior, sol frământat, expoziție sudică, altitudine 980 m și unghi pantă 38 grade. Floarea indicativă: Asperula-Oxalis. Birchii sunt difuzați în zonele goale dintre pădurile de pin (P) și fag (B) (rapoarte de 8P + 2B) cu o consistență medie de 0,5.

2. Partea mijlocie, solul frământat, expoziția de Nord, altitudinea 1210 m și unghiul pantă de 40 grade. Floarea indicativă: Vaccinium. Birchii (Bi) sunt difuzați în pădurile de molid (S) (compoziția 6S + 4 Bi) cu o consistență de 0,3.

3. versantul inferior, solul înfășurat, expoziția nord-vestică, altitudinea 920 m și unghiul pantă de 20 grade. Floarea indicativă: Asperula-Dentaria. Birchii sunt difuzați în zonele goale dintre pădurile de pin (P) și fag (B) (rapoarte de 8P + 2B) cu o consistență medie de 0,6.

4. Partea mijlocie, solul înfășurat, expoziția de Vest, altitudinea 960 m și panta angei de 25 de grade. Floarea indicativă: Asperula-Dentaria. Birchii (Bi) sunt răspândiți în păduri de molid (S) (compoziția 10S) cu o consistență medie de 0,7.

5. versantul inferior, solul frământat, expoziția de Sud, altitudinea 980 m și unghiul pantă de 38 grade. Floarea indicativă: Asperula-Oxalis. Birchii sunt difuzați în zonele goale dintre pădurile de pin (P) și fag (B) (rapoarte de 4P + 1B) cu o consistență medie de 0,6.

Ȋn Figura 8 este prezentatǎ cromatograma HPLC-UV a unui amestec de 2 standarde pure de acid betulinic și betulinol, 0,02 mg / ml și, respectiv, 0,05 mg / ml. Timpii de retenție: tR = 4,45 min pentru BA și tR = 5,02 min pentru B. Detectarea a fost stabilită la 210 nm pe g de coajă, în timp ce betulinolul a avut valori medii de 10,60 ± 0,97 mg / g coajă.

Betulinul și acidul betulinic au fost extrase din scoarță de mesteacăn și analizate utilizând cromatografia lichidelor de înaltă performanță cu detecția ultravioletă (HPLC-UV).

Din fiecare probă de coajă au fost folosite alicote de 0,5 g în triplicat, care au fost amestecate cu 10 ml metanol 95% și omogenizate la sonicare timp de 15 min.

După 30 de minute, extractul a fost filtrat prin hârtie și membrană .

Proba filtrată a fost injectată în coloană HPLC a unui dispozitiv HPLC Agilent 1200 cu detecție UV, aplicând o fază mobilă izocratică constând din acetonitril.

Temperatura de funcționare la 25 ° C și detectarea la 210 nm au fost stabilite ca fiind optime.

Pentru a identifica betulinolul (B) și acidul betulinic (BA), un amestec de standarde pure a fost separat după o optimizare anterioară a protocolului de separare stabilit în laborator.

Solventul de extracție a fost ales ca etanol 95%. Rezultatele au arătat că tot triterpenoidul bioactiv din coaja de mesteacăn alb a fost dependent în mod semnificativ de locație (Tabelul nr. 2).

Figura 8. Cromatograma HPLC-UV a unui amestec de două standarde pure de acid betulinic (BA) și betulinol (B)

Tabelul nr. 2. Valorile medii ale concentrațiilor de acid betulinic (BA) și betulinol (B)

3.5. Izolarea acidului betulinic din Vitex Negundo L. prin metoda HPLC

Vitex negundo, ȋn medicina tradiționalǎ indianǎ, a fost utilizat pentru tratarea diferitelor boli.

A fost elaborată o metodă HPLC(cromatografie lichidǎ de înaltă performanță) simplă, sensibilă și precisă pentru analiza probelor de Vitex negundo L.

Extracția a fost verificată utilizând diferiți solvenți cum ar fi metanol, cloroform, etanol 95%, acetonă și diclormetan. S-a găsit că, cloroformul a fost un solvent bun de extracție care a permis extracția acidului betulinic cu cel mai mare conținut. Metoda implică coloana RP C18 cu metanol-acetonitril-apă (90: 5: 5% v / v / v) pH 2,5 ajustată cu acid orto fosforic ca fază mobilă și detecție UV la 270 nm [12].

Extracția și prepararea soluțiilor de probă: frunzele și semințele de Vitex negundo au fost extrase cu cloroform (20 ml x 3). Se combină toate extractele de cloroform și se evaporă la sec în baia de apă pentru a obține rezidul. De asemenea, pulberele de frunze au fost extrase cu metanol, cu 95% etanol, cu acetonă și cu diclormetan (20 ml x 3). Se combină toate extractele, se evaporă la sec în baia de apă pentru a obține rezidul. Rezidurile tuturor probelor au fost dizolvate în 10 ml de metanol. Soluțiile obținute s-au filtrat prin filtru Whatmann înainte de analiza HPLC. Toate soluțiile de testat s-au diluat în continuare utilizând metanol [12].

Tabelul nr. 3. Acidul betulinic obținut ȋn urma extracției cu diferiți solvenți

S-au observat variații semnificative ale conținutului de acid betulinic și triterpenoide totale în frunzele Vitex negundo cu solvenți de extracție diferiți (Tabelul nr. 3).

Capitolul 4. Acțiunea terapeuticǎ a acidului betulinic

4.1. Apoptoza indusă de acidul betulinic în celulele leucemice

În celulele tumorale neuroectodermice, acidul betulinic activează mitocondriile care apoi eliberează citocromul c. Formarea ulterioara a apoptozei conduce la activarea caspazelor și fragmentǎrii nucleare. Formarea speciilor reactive de oxigen, neosinteza proteinei și topoizomerazele I și II sunt implicate în inducerea apoptozei, dar acidul betulinic semnalează apoptoza independent de receptorii p53 și receptorul morții [7].

Celulele primare de leucemie acută au fost obținute la diagnosticul inițial sau la recădere înainte de tratamentul antitumoral prin puncție de măduvă osoasă de la 47 de copii [15].

Acidul betulinic s-a dizolvat în DMSO(Dimetil sulfoxid) (4 mg / ml) la 37 ° C.

Stimularea completă cu toți 11 stimuli a fost efectuată pe 25 de probe, care au fost utilizate pentru compararea acidului betulinic cu medicamente citotoxice. În eșantioanele rămase, testarea a fost incompletă din cauza volumului mic de eșantion.

Celulele tumorale primare de la 40 de copii cu leucemie acută netratată au fost testate pentru apoptoza indusă de acidul betulinic in vitro. 10 mg / ml de acid betulinic a provocat apoptoza specifică de cel puțin 10% în 65% (26/40) de probe și mai mult de 50% apoptoză specifică în 30% (12/40) (Tabelul nr.4).

În două probe primare, 3 mg / ml acid betulinic au fost suficiente pentru a induce apoptoză specifică mai mare de 50%. Apoptoza a fost independentă de vârsta, sexul si tipul de leucemie.

Când acidul betulinic a fost aplicat pe liniile de celule leucemice, celulele leucemice T de tip JURKAT au suferit o apoptoză rapidă dependentă de doză și de timp, rezultând 75% celule moarte în decurs de 6 ore cu 10 mg / ml acid betulinic.

Într-o probă de celule c-ALL la prima recădere, 9/10 medicamente citotoxice nu au putut induce nici o moarte celulară, în timp ce acidul betulinic a indus o apoptoză specifică de 93% (Tabelul nr. 4).

Tabelul nr. 4. Supraviețuirea probelor după tratamentul cu acid betulinic sau cu medicamente

Pentru a testa rezistențele acidului betulinic și al medicamentelor citotoxice, s-au stabilit liniile celulare JURKAT și CEM rezistente la medicamente. Celulele leucemice de tip T au fost incubate cu concentrații crescute de dexametazonă, doxorubicină, metotrexat sau vincristină timp de 12 luni, astfel încât celulele derivate au rezistat până la concentrația de 100 de ori mai mare decât cea a celulelor parentale (Figura 9 a). În concordanță cu rezultatele anterioare, 4 apoptoze induse de acidul betulinic nu diferă în liniile de celule parentale și derivate în afară de celulele JURKAT rezistente la metotrexat, care au prezentat o sensibilitate semnificativ mai mare față de apoptoza indusă de BA (Figura 9 b și c). În probele primare, inducerea apoptozei de către acidul betulinic nu s-a corelat cu inducerea apoptozei cu doxorubicină (Figura 9 d) sau cu orice alt medicament testat citotoxic .

Figura 9. Lipsa rezistențelor încrucișate între BA și medicamentele citotoxice

4.2. Efectele acidului betulinic singur și în combinație cu iradierea în celulele melanomului uman

Recent, acidul betulinic a fost identificat ca un inhibitor foarte selectiv al creșterii melanomului uman și sa raportat că induce apoptoza în aceste celule [5].

S-a investigat proprietățile inhibitoare a acestui compus singur și în combinație cu radiațiile ionizante într-un panou de linii celulare de melanom umane precum și în melanocite umane normale [16].

Acidul betulinic a suprimat puternic și în mod consecvent capacitatea de creștere și de formare a coloniilor tuturor liniilor celulare de melanom uman investigate.

Acțiunea inhibitoare a acidului betulinic a fost mai pronunțată în liniile celulare de melanom uman decât în melanocitele umane normale.

În mod deosebit, în ciuda inducerii apoptozei, analiza expresiei Bcl-2 în celulele tratate cu acid betulinic a evidențiat faptul că expresia proteinei anti-apoptotice Mcl-1 a fost indusă.

Deși pacienții cu melanom malign au un prognostic excelent atunci când sunt tratați într-o fază incipientă, gestionarea melanomului avansat este încă o problemă majoră care nu este rezolvată în mod satisfăcător de regimurile de tratament curente, cum ar fi chimioterapia și / sau imunoterapia [5, 16].

Efectul radioterapiei poate fi sporit, totuși, în combinație cu substanțe care acționează ca modificatori de răspuns sau radiosensibilizatori. În melanomul uman, de exemplu, o combinație de radioterapie cu hipertermie s-a dovedit a fi benefică.

Observarea faptului că acidul betulinic este o substanță foarte selectivă împotriva celulelor melanomului uman in vitro și într-un model de șoarece ne-a determinat să investigăm efectele acidului betulinic în monoterapie și în combinație cu radioterapia într-un grup de melanom uman. Acidul betulinic și derivații săi inhibă, de asemenea, intrarea de tip 1 al virusului imunodeficienței umane, probabil după o etapă de legare ulterioară. În plus față de activitatea sa împotriva celulelor melanomului uman, acidul betulinic inhibă creșterea celulelor tumorale neuroectodermice, unde are potențialul de a induce apoptoza. Este interesant de remarcat în acest context că atât celulele neuroectodermale cât și melanocitele sunt derivate din creasta neurală.

Au fost obținute melanocite epidermice umane normale (adulți și neonatali) de la Clonetics Corporation (CellSystems Biotechnologie, Germania). Celulele au fost cultivate în mediu de creștere a melanocitelor (MGM-2, fără ser) conținând 12-miristat-13-acetat de forbol (10 pg per ml), hidrocortizon (0,5 pg per ml) factorul de creștere B (1 pg per ml) și gentamicin sulfat și amfotericin-B (ambele la 50 pg / ml) suplimentat cu extract de hipofizare bovin.

Linile celulare de melanom uman MES20 și MES21 au fost generate din metastaze melanomice și caracterizate în laboratorul. Liniile celulare Neo II-tr și Neo-IV-tr au fost stabilite din melanocite normale primare neonatale umane. Liniile de celule melanom utilizate pentru acest studiu, precum și linia celulară Neo-II / IV-tr au fost menținute în mediu Eagle modificat de Dulbecco (4500 mg glucoză pe litru) suplimentat cu ser 10% fetal bovin.

Analiza de legare a anexinei V

Celulele au fost recoltate prin tripsină-EDTA, spălate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și ajustate în tampon de legare la calciu la o densitate celulară de 1,5 x 106 celule pe ml. Celulele au fost incubate timp de 10 minute cu Annexin V-FITC și iodură de propidiu (concentrații finale 1 pg / ml), spălate în PBS și plasate pe diapozitive de sticlă pentru analiza prin microscopie fluorescentă.

Testări clonogene

În experimentele de supraviețuire clonogenică, celulele subconfluente au fost tratate cu acid betulinic și apoi iradiate. Celulele au fost tripsinizate și placate după diluarea adecvată pe plăci de cultură de 5 cm. Între 200 și 2000 de celule s-au însămânțat pentru a obține între 100 și 300 de colonii separate per vas. După 8-12 zile plăcile de cultură au fost spălate, fixate în etanol 95% și colorate cu violet de cristal 0,1%. Coloniile care conțin mai mult de 50 de celule au fost înregistrate ca supraviețuitori clonogenici. Experimentele de formare a coloniilor au fost realizate de trei ori cu fiecare linie celulară și pentru fiecare tip de tratament. Celulele au fost iradiate cu o sursă convențională de radiații cu raze X de 250 kV generată de o mașină Stabilipan.

Rezultate

Următoarele experimente au fost efectuate pentru a evalua răspunsul celulelor melanomului la acidul betulinic singur sau în combinație cu iradierea. În plus față de liniile celulare de melanom, am investigat, de asemenea, efectele acidului betulinic asupra melanocitelor umane normale în timpul pasajelor timpurii, precum și asupra liniilor de celule permanente generate direct din melanocite umane normale (linii celulare Neo-II-tr și Neo-IV-tr) .

Au fost comparate inițial curbele clonogene de supraviețuire a patru linii celulare de melanom diferite (ME20, ME21, 518A2 și A375) după tratamentul cu acid betulinic singur sau în combinație cu iradierea (Figura 10 A). Concentrațiile de acid betulinic au fost cuprinse între 1 și 5 μg pe ml. Fracțiunea supraviețuitoare obținută după tratamentul celulelor cu acid betulinic singur a fost înmulțită cu fracția supraviețuită măsurată obținută după iradierea celulelor cu o doză de 2 Gy. Prin urmare, acest produs reprezintă supraviețuirea așteptată dacă cele două tratamente sunt independente una de cealaltă și contribuie la supraviețuire într-o manieră pur aditivă. Barele eclozate din Figura 10 (B)) reprezintă această cantitate calculată de inhibare a creșterii. Analiza acestor date a arătat că acidul betulinic și iradierea au un efect aditiv asupra inhibării capacității de formare a coloniilor. Efectul acidului betulinic în combinație cu iradierea a fost, de asemenea, investigat în ceea ce privește momentul administrării în trei linii celulare de melanom (MES20, 518A2, A375). Momentul adiției acidului betulinic în combinație cu iradierea nu a avut un impact major asupra rezultatelor testelor de formare a coloniilor, indicând în plus că cele două tratamente funcționează independent unul de celălalt.

Figura 10. Efectul acidului betulinic și al radioterapiei asupra supraviețuirii

Figura 11. Influența momentului expunerii la acid betulinic asupra supraviețuirii

În concluzie, datele obținute sugerează că acidul betulinic ar putea fi util în tratamentul pacienților care suferă de melanom.

Această ipoteză se bazează pe următoarele observații. Acidul betulinic a inhibat în mod constant creșterea tuturor liniilor celulare de melanom testate. Efectul acidului betulinic asupra liniilor de celule melanomice este, de asemenea, mai puternic decât efectul inhibitor al creșterii acidului betulinic asupra melanocitelor primare. Efectele acidului betulinic în combinație cu iradierea asupra supraviețuirii sunt în mod clar aditive, măsurate prin testul de formare a coloniilor [16]. Dacă căile morții celulare ale acestor două tratamente se suprapun, atunci ne-am putea aștepta ca acestea să interfereze unele cu altele, ducând eventual la efecte neadditive. Toate datele noastre raportate aici indică faptul că acidul betulinic și iradierea diferă cel mai probabil în modul lor de acțiune, în concordanță cu modul pur aditiv de inhibare a creșterii.

4.3. Apoptoza indusa de acidul betulinic ȋn celulele cancerului de colon

Studiile anterioare arată că acidul betulinic (BA) induce o degradare dependentă de proteazomă, a factorilor de transcripție Sp1, Sp3 și Sp4 în celulele cancerului de prostată și acest studiu s-a concentrat asupra mecanismului de acțiune al acidului betulinic în celulele cancerului de colon [25].

Cancerul colorectal este o cauză principală de deces în majoritatea țărilor dezvoltate, inclusiv în Statele Unite, iar în 2010 se estimează că au fost peste 102 700 de cazuri noi de cancer de colon și 51 370 de decese.

Liniile celulare de cancer de colon RKO și SW480 au fost obținute de la Centrul de Cancer M.D. Anderson (Houston, TX).

Proliferarea celulelor și testele de progresie ale ciclului celular

Celulele de cancer de colon RKO și SW480 (2 x 104 pe godeu) au fost placate în plăci cu 12 godeuri și lăsate să se atașeze timp de 24 de ore. Mediul a fost apoi schimbat în mediu F-12 DMEM / Ham conținând FBS de 2,5% carbon și a fost adăugat dimetil sulfoxid (DMSO)].

Celulele au fost apoi tripsinizate și numărate după 48 și 96 de ore folosind un numărător de celule Coulter Z1.

Celulele RKO și SW480 au fost tratate cu vehicul (DMSO) sau BA timp de 24 de ore.

Celulele au fost tripsinizate, centrifugate și resuspendate în soluție de colorare care conține 50 ug / ml iodură de propidiu, 4 mmol / l citrat de sodiu și 30 unități / ml RNase. După ce au fost incubate la temperatura camerei timp de 1 h, celulele au fost analizate.

Analiza Northern blot

Pentru analiza miRNA, 20 ug ARN total per canal a fost electroforezat pe gel 15% TBE uree poliacrilamină, transferat electroforetic în 0,5 x TBE la 300 mÅ timp de 45 min la membrana GeneScreen Plus (PerkinElmer, Boston, MA) legat și hibridizat în tampon de hibridizare ULTRAhyb-Oligo (Ambion, Austin, TX) la 42 ° C cu oligonucleotide ADN marcate cu capăt 32P. Probele au fost spălate la 42 ° C în 2X SSC și 0,5% SDS timp de 30 de minute cu agitare ușoară.

Primerii au fost obținuți din IDT și folosiți pentru amplificare au fost după cum urmează: ZBTB10 (sens 5'-GCT GGA TAG TAG TTA TGT TGC-3; antisens 5'-CTG AGT GGT TTG ATG GAC AGA G-3 ').

Studiile de xenogrefă la șoareci

Șoarecii feminini au fost achiziționați de la Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Pentru a produce tumori, celulele RKO (5 x 106; ≥ 90% viabile) au fost injectate subcutanat șoarecilor. Tumorile au fost lăsate să crească timp de 6 zile până când au fost palpabile, iar șoarecii au fost apoi randomizați în două grupe (6 șoareci / grup) și administrate prin gavaj oral ulei de porumb sau BA (25 mg / kg / zi) la fiecare două zile timp de 22 de zile.

Șoarecii au fost cântăriți și mărimea tumorii a fost măsurată la fiecare a doua zi pentru a permite calcularea volumelor tumorilor: V = LW2 / 2, unde L și W au fost lungimea și, respectiv, lățimea. După tratamentul BA, animalele au fost sacrificate; s-au determinat greutățile corporale finale ale corpului și tumorii și s-au colectat organele viscerale majore și s-au utilizat lizatele pentru analiza Western blot a proteinelor Sp [25].

Rezultate

BA inhibă creșterea liniilor celulare de cancer multiplu și se demonstrează că BA a inhibat proliferarea celulelor RKO și SW480 după tratament timp de 48 sau 96 de ore. Inhibarea creșterii a fost observată la concentrații de ≥ 5 μM în ambele linii celulare la cele două momente de timp. Efectele BA asupra distribuției celulelor în fazele G0 / G1, S și G2 / M ale ciclului celular au fost dependente de contextul celular. În celulele RKO, BA a redus dramatic procentul de celule în faza G0 / G1 și S și a crescut procentul în G2 / M, în timp ce în celulele SW480, a existat o ușoară scădere a fazei G0 / G1 și S și o creștere paralelă a procentul de celule în G2 / M. Tratamentul celulelor RKO și SW480 cu BA a scazut, de asemenea, scindarea PARP, care este în concordanță cu inducerea apoptozei în aceste linii celulare; totuși, după tratamentul celulelor de numai 24 de ore, <10% din celule au fost sub-G1 în analiza FACS.

Ȋn Figura 12 este prezentatǎ inhibarea proliferării celulare. Celulele au fost tratate cu BA pentru 48 sau 96 de ore și apoi numărate (Progresia ciclului celular în RKO și SW480). Progresia ciclului celular în celulele RKO (B) și SW480 (C). (D) Celulele RKO și SW480 au fost tratate cu BA timp de 24 de ore și lizatele de celule întregi au fost analizate [25].

Figura 12. Inhibarea proliferării celulare

Figura 13. Acidul betulinic (BA) inhibă creșterea tumorii colonului in vivo

Figura 13 prezintǎ inhibarea creșterii tumorale (A) și a greutăților (B). BA (25 mg / kg / zi) a fost administrat (oral) la șoareci la fiecare 2 zile. (C) Reglare a nivelului proteinelor Sp1, Sp3 și Sp4. Rezultatele din (A) – (C) reprezintă mijloace ± SE pentru cel puțin 8 șoareci în grupul de control (uleiul de porumb) și grupurile tratate cu BA, și inhibarea semnificativă (p <0,05) de BA este indicată (*) [25].

4.4. Esteri ai betulinolului cu proprietăți terapeutice

Produșii de oxidare ai betulinolului: acid betulinic și acidul betulonic au numeroase proprietăți farmacologice: activitate antivirală (incuzând activitatea anti-HIV), antiinflamatoare, antimalarică, anti –Leichmania, antitumorală. Acțiunea anticanceroasă a acidului betulinic se datorează perturbării directe a mitocondriilor, prin modularea nivelelor grupului de proteine Bcl-2 ( B-cell limphoma 2) și prin blocarea factorului nuclear kappa B. În ceea ce privește acțiunea anti-Leichmania acidul dihidrobetulinic s-a demonstrat ca produce apoptoza prin inhibarea ADN-topoizomerazei. Adăugând diferite grupari esterice la C28 din structura acidului betulinic, betulinei sau acidului dihidrobetulinic a îmbunătățit acțiunea anti-Leishmania [27].

Triterpenoidele , avănd în general o solubilitate în apă scăzută , au de asemenea și o slabă biodisponibilitate a unor componente. Pentru a înbunătăți solubilitatea în apă și biodisponibilitatea derivaților betulinei se pot face numeroase modificări structurale.

Betulinolul poate fi esterificat la gruparea hidroxil, de la C din poziția 3 la gruparea hidroxil de la C din poziția 28 . Aceste funcționalități pot fi utilizate la sinteza unor derivați betulinici mai activi și cu specificitate mai mare [18].

"Bet-CA"- un ester derivat de acid betulinic și dicloracetat.

Plecând de la ideea cǎ acidul betulinic este un derivat natural și cǎ are acțiune antitumorală iar dicloracetatul este capabil sǎ inverseze fenotipul Warburg ( transformarea glucozei în lactat pentru a alimenta fosforilarea oxidativǎ din mitocondrii chiar și ȋn prezența oxigenului) prin proprietatea de a inhiba piruvat-dehidrogenazei, a fost sintetizat compusul "Bet-CA"( Figura 14). Prin alipirea unei molecule de dicloracetat la gruparea hidroxil de la C3, din structura acidului betulinic, s-a obținut un ester cu solubilitate mult mai mare, care ulterior în organism va fi scindat sub acțiunea esterazelor la o molecula de acid betulinic și una de dicloracetat [26, 27].

Figura 14. Sinteza Bet-CA

Bet-CA s-a obținut prin tratarea acidului betulinic cu clorura acidului dicloracetic ȋn prezența piridinei și 4-dimetilaminopiridina în diclormetan anhidru. După o amestecare la temperatura camerei, timp de 18 ore în atmosferă de azot reacția este finalizată și dupǎ care se reduce volumul de reacție ȋn rotavapor. Produșii de reacție obținuți, au fost purificați prin cromatografie pe coloana folosind plăci cu silicagel, sistemul de solvenți folosit fiind acetat de etil:eter de petrol ȋn proporție de 3:7. Formarea Bet-CA, a fost confirmată prin spectrul infraroșu cȃnd gruparea, –OH de la C3 al acidului betulinic dispare la 3450 cm-1 iar gruparea C=O apare la 1745 cm-1. Structura Bet-CA a fost confirmată prin ESI-MS (electrospray ionization- mass spectrometry) având masa moleculară de 589,29 și punctul de topire de 269°C.

Ținând cont de acțiunile acidului betulinic (BA) și dicloracetatului (DCA), s-a presupus ca Bet-CA va avea o acțiune citotoxica mai bună fiind și mai selectiv. Pentru a demonstra aceasta s-a testat acțiunea BA, DCA și Bet-CA asupra unor culturi de celule canceroase: MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 (adenocarcinom de sân uman), DU 145 (carcinom de prostata uman), PC-3 (adenocarcinom de prostată de gradul IV uman), B16-F10 (cancer de piele la șoarece), WI-38 (fibroblast de plaman normal) și NIH/3T3 (filbroblast embrionic la șoarece). Celulele canceroase au fost cultivate în DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) sau RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser fetal bovin si 1% penicilina/streptomicina, în atmosferă cu 5% CO2 la 37° C. Celulele au fost incubate cu compușii de analizat in concentrații de la 5 la 70 µm timp de 72 h. Efectele inhibitorii asupra celulelor canceroase au fost evaluate prin metoda MTT.

Din Tabelul nr. 5 se poate observa, cǎ doza la care Bet-CA a provocat moartea a 50% din celulele canceroase ( IC50) este mult mai mică decât a BA, DCA sau amestecul lor 1:1.

Tabelul nr. 5. Compararea valorii IC50 (µm) pentru Bet-CA, BA, DCA și BA+DCA

Pe baza acestor rezultate se consideră că Bet-CA este un potențial candidat ȋn ceea ce privește tratamentul celulelor canceroase.

Testele in vivo au fost realizate pe șoareci. S-a lucrat cu șoareci de sex feminin, cu greutatea cuprinsă între 20-25 g, un lot martor și un lot testat, fiecare a câte 6 animale; Cu 24 ore înainte de experiment animalele au fost ținute în laborator, alternându-li-se 12 ore de ȋntuneric cu 12 ore de lumină, au fost hrăniți cu mâncare standard și apă fără restricții. În prima zi de studiu animalelor din ambele loturi li s-a injectat subcutanat 106 celule canceroase B16-F10 (cancer de piele la șoareci). După 3 zile lotul testat s-a injectat cu Bet-CA, BA, DCA SI BA+DCA ȋn doze de 2,5mg/kg corp, din 3 in 3 zile, iar lotul martor a fost injectat la aceleași intervale de timp și ȋn aceeași cantitate cu vehicul de control. În ziua 25 șoarecii din ambele loturi au fost sacrificate, tumorile s-au extirpat, au fost fotografiate și masurate [Figura 15 A]. Toate tumorile lotului testat au scăzut ȋn volum în comparație cu lotul martor, iar ȋn ceea ce privește lotul testat s-a observat o regresie semnificativă a tumorilor la șoarecii tratați cu Bet-CA comparativ cu șoarecii tratați cu ceilalți agenți [Figura 15 B]. Acest lucru evidențiază acțiunea citotoxica superioară a Bet-CA fața de BA sau DCA.

Figura 15. Reducerea tumorilor canceroase și metastazelor pulmonare la șoareci sub acțiunea Bet-CA, BA, DCA, BA+DCA

Al doilea studiu in vivo, a vizat rolul inhibitor al Bet-CA asupra metastazelor pulmonare la șoarece provocate de culturile de celule B16-F10 (cancer de piele la șoarece). S-a lucrat de asemenea cu un lot martor și unul testat, alcatuite fiecare din câte 6 șoareci de sex feminin. Toate animalele au fost injectate cu celule B16-F10. După 3 zile lotului testat i s-au injectat doze de 2,5mg/kg corp de Bet-CA, BA, DCA și BA+DCA 1:1 , din 2 in 2 zile timp de 14 zile, iar lotul martor a primit la același interval de timp și ȋn aceeași cantitate vehicul de control [Figura 15 C]. Toți șoarecii au fost sacrificați în a 14 zi. Leziunile pulmonare au fost măsurate și analizate microscopic. După cum s-a anticipat s-a observat un numar mai mic de leziuni la animalele tratate cu Bet-CA comparativ cu celelalte animale [Figura 15 D]. În plus, au fost testate efectele toxice ale Bet-CA asupra organelor utilizând colorația cu hematoxylină/eozină a unor părți reprezentative din țesuturi. Testele histologice asupra plamânilor, ficatului, splinei și rinichilor au arătat ca Bet-CA nu a prezentat toxicitate.

Studii au demonstrat nu doar că Bet-CA oprește răspândirea și dezvoltarea tumorilor primare și încetinirea metastazǎrii, au demonstrat cǎ Bet-CA nu prezintă acțiune toxică asupra țesuturilor sanătoase.

Derivații esterici ai betulinolului pot fi astfel ȋnscrși pe lista potențialilor agenți terapeutici anticancer.

Ceea ce ne desparte ȋnsă de introducerea ȋn terapeuticǎ, sunt cercetǎrile pe subiecți umani, cercetări ȋn cadrul cǎrora derivații de betulinol trebuie sǎ prezinte acțiune potentă și selectivă fară reacții adverse [19].

Avem astfel dovezi numeroase, să credem că ȋn viitorul apropiat terapia cancerului va fi ȋmbunatațită iar această maladie va fi mai ușor de combătut și tratat.

PARTEA A II-A. CONTRIBUȚII ORIGINALE

Capitolul 5. Separarea și determinarea acidului betulinic și a betulinolului din seva de mesteacǎn prin metoda HPLC

5.1. Recoltarea sevei de mesteacǎn

Seva de mesteacǎn se recolteazǎ primǎvara, cȃnd natura revine la viațǎ.

1. Pe trunchi se face o singurǎ tăietură, oblic-verticală cu o lungime care sǎ nu fie mai mare de (1/3) din circumferința copacului, sau o tăietură „în V” cȃt mai micǎ, astfel ca rănirea copacului să fie minimă.

Doar o datǎ pe an se poate extrage seva dintr-un mesteacǎn și doar anul urmǎtor se poate face o nouǎ tǎieturǎ pe același copac. Tǎietura nouǎ trebuie sa fie diametral opus și la alt nivel fațǎ de tǎietura din anul precedent, astfel ȋncat sǎ nu se punǎ ȋn dificultate circulația sevei, deoarece poate duce la uscarea copacului.

2. Pentru crestarea copacului este recomandatǎ folosirea cuțitelor și fierăstraielor din inox.

3. Pentru recoltarea sevei de mesteacǎn se folosește un bețisor de lemn sau un furtun care se introduce ȋn coaja tǎietura copacului. Pentru procesul de extracție a sevei se utilizeazǎ doar ustensile din plastic și lemn.

5. Flaconul de plastic se leagǎ cu o sȃrmǎ ȋn jurul mesteacanului și gura flaconului se poziționeaza sub furtun, astfel ȋncȃt seva sǎ se prelingǎ direct ȋn flacon (Figura 16).

6. Când flaconul s-a umplut se dezleagă de pe pom, se pune dopul și se leagă în locul lui un alt flacon curat. Este recomandat ca flaconul să se lege pe mesteacǎn pe direcția nord, pentru ca soarele să nu încălzească seva, deoarece la căldură se formeazǎ efectul de serǎ și seva se alterează pierzȃnd din calitǎți.

Figura 16. Recoltarea sevei de mesteacǎn

5.2. Analiza HPLC a sevei de mesteacǎn

Seva de mesteacăn este cunoscută datoritǎ capacității sale terapeutice, testate de-a lungul anilor și se poate utiliza atât ca uz intern, cât și ca uz extern. Seva de mesteacăn conține principii active care au acțiune diuretică, antiinflamatoare și antibacteriană.

Dintre principiile active prezente ȋn seva de mesteacǎn, cel mai important și remarcat este acidul betulinic, acesta izolȃndu-se ȋntotdeauna ȋmpreunǎ cu betulinolul.

Este foarte importantǎ perfecționarea metodelor de izolare a principiilor active, pentru a obține un randament cȃt mai mare de acid betulinic. Ȋn literatura de specialitate este precizat cǎ acidul betulinic fațǎ de betulinol se gǎsește ȋn procente mai mari.

Ȋn lucrarea de față s-a urmărit realizarea unei metode de separare și determinare a compușilor betulinici prezenți în seva de mesteacăn prin metoda HPLC.

Ȋn acest scop au fost efectuate mai multe încercări în diferite condiții de operare și anume variind componența fazei mobile și respectiv debitul acesteia ȋn vederea stabilirii condițiilor optime pentru separarea și determinarea compușilor betulinici prezenți ȋn sevǎ.

Cromatografia de lichide de ȋnaltǎ performanțǎ (HPLC) acoperǎ azi, ȋn proporție aproximativ 80%, analiza substanțelor moleculare: organice, organo-metalice și anorganice, inclusiv compușii foarte polari sau labili termic precum și compușii cu masǎ molecularǎ ridicatǎ.

Materiale și metodă

Aparatura folosită a fost un sistem HPLC Agilent 1200 dotat cu pompă cuaternară, DAD, termostat, sistem de degazare, autosampler (Figura 17).

Coloana cromatografică utilizată este de tip C18, 150 mm 4,6 mm; 5 µm (Zorbax XDB);

Figura 17. Schema sistemului HPLC

Condiții de lucru

Condițiile de lucru stabilite prin multiple încercări pentru separarea și determinarea betulinolului sunt următoarele:

faza mobilă: soluția A – acid fosforic 0,1%: soluția B – acetonitril 20: 80;

temperatura: 25șC; debit: 0.7 mL/min;

lungimea de undă pentru detecție: 210 nm;

volumul de injecție: 5 µL;

timpul de analiză: 10 minute.

Substanța de referință (soluție în acetat de etil): betulinol = 0,13 mg/mL.

Condițiile de lucru stabilite prin multiple încercări pentru separarea și determinarea acidului betulinic sunt următoarele:

faza mobilă: soluția A – apă; soluția B – acetonitril 10: 90;

temperatura: 25șC; debit: 1 mL/min;

lungimea de undă pentru detecție: 210 nm;

volumul de injecție: 5 µL;

timpul de analiză: 10 minute.

Substanța de referință (soluție în metanol): acid betulinic = 0.10 mg/mL.

Condițiile optime de separare și de determinare cantitativă a compușilor de interes au fost stabilite prin multiple încercări. Reproductibilitatea metodei s-a apreciat prin pătratul coeficienților de corelare ai curbelor de calibrare.

Pregătirea probelor

Pentru realizarea separărilor și determinărilor analiților de interes, seva de mesteacăn păstrată la congelator s-a decongelat, s-a omogenizat cu grijă, s-a filtrat printr-un filtru Millipore de 0,45 µm și apoi în sistemul cromatografic s-a injectat un volum de 5 µL probă de sevă.

Rezultate și discuții

Separarea și determinarea betulinolului

În Tabelul nr. 6 se prezintă timpul de retenție obținut pentru betulinol în condițiile cromatografice optimizate. Deviația standard s-a obținut în urma prelucrării statistice a celor 6 injecții (soft SPSS 10).

Tabelul nr. 6. Timpul de retenție al betulinolului

În Figura 18 se prezintă cromatograma obținută pentru soluția standard de betulinol iar în Figura 19 spectrul de absorbție al betulinolului.

Identificarea și determinarea cantitativă a principiilor active din soluția de analizat s-a efectuat prin compararea cromatogramei standardului cu a soluției de analizat.

Pătratul coeficientului de corelare al curbei de calibrare pentru determinarea betulinolului este prezentat în Tabelul nr. 7.

Tabelul nr. 7. Pătratul coeficientului de corelare al curbei de calibrare

Figura 18. Cromatograma HPLC a betulinolului

Figura 19. Spectrul de absorbție al betulinolului

Figura 20 prezintă cromatograma sevei de mesteacăn obținută în condițiile de lucru optime pentru separarea și determinarea betulinolului. Picul caracteristic betulinolului este bine evidențiat la timpul de retenție de 2,4 minute.

Figura 20. Cromatograma HPLC a sevei de mesteacăn în condițiile de lucru pentru separarea și determinarea betulinolului

Concentrația betulinolului găsită în seva de mesteacăn este de 0,025 mg/mL.

b. Separarea și determinarea acidului betulinic

În Tabelul nr. 8 se prezintă timpul de retenție obținut pentru acidul betulinic în condițiile cromatografice optimizate. Deviația standard s-a obținut în urma prelucrării statistice a celor 6 injecții (soft SPSS 10).

Tabelul nr. 8. Timpul de retenție al acidului betulinic

Pătratul coeficientului de corelare al curbei de calibrare pentru determinarea acidului betulinic este prezentat în Tabelul nr. 9.

Tabelul nr. 9. Pătratul coeficientului de corelare al curbei de calibrare

În Figura 21 se prezintă cromatograma obținută pentru soluția standard de acid betulinic în condițiile optimizate prezentate iar în Figura 22 cromatograma probei de sevă de mesteacǎn în condițiile stabilite pentru separarea și determinarea acidului betulinic. Picul caracteristic acidului betulinic este bine evidențiat la timpul de retenție de 1,491 minute.

Figura 21. Cromatograma HPLC a acidului betulinic

Figura 22. Cromatograma HPLC a sevei de mesteacǎn

Concentrația acidului betulinic determinat în seva de mesteacăn este de 0,349 mg/mL.

Concluzii

Ȋn lucrarea de față s-a urmărit realizarea unei metode de separare și determinare a compușilor betulinici prezenți în seva de mesteacăn prin metoda HPLC.

Ȋn acest scop au fost efectuate mai multe încercări în diferite condiții de operare și anume variind componența fazei mobile și respectiv debitul ȋn vederea stabilirii condițiilor optime pentru separarea și determinarea compușilor betulinici prezenți ȋn sevǎ. S-au stabilit condiții mai bune de operare utilizând ca fazǎ mobilǎ: soluție A – acid fosforic 0,1%: soluție B – acetonitril 20: 80 cu un debit de 0,7 mL/min pentru betulinol și soluția A – apă: soluția B – acetonitril 10: 90 cu un debit de 1 mL/min pentru acidul betulinic.

Studiul experimental este în desfășurare.

Metoda HPLC reprezintǎ o tehnică excelentă pentru determinarea acidului betulinic și a betulinolului din extractul de coajă de mesteacăn, cu o bună sensibilitate, precizie și reproductibilitate.

Ȋn urma analizei HPLC a sevei de mesteacǎn s-au determinat urmǎtoarele concentrații ale celor doi compuși de interes: 0,025 µg/mL betulinol și 0,349 mg/mL acid betulinic. Rezultatele sunt ȋn concordanțǎ cu cele prezentate ȋn literatura de specialitate.

Concentrația acidului betulinic din seva de mesteacǎn studiată este semnificativ mai mare fațǎ de cea a betulinolului, fapt prezentat și ȋn literatura de specialitate.

Capitolul 6. Concluzii generale

Ȋncǎ din cele mai vechi timpuri plantele au fost folosite ȋn terapii medicinale, pentru a trata sau ameliora simptomele anumitor boli, fapt care a determinat un interes deosebit al oamenilor de științǎ de a studia, izola și caractariza principiile active prezente ȋn plantele medicinale.

Principala sursǎ de acid betulinic și respectiv betulinol este mesteacǎnul.

Un dezavantaj al procedeelor de extracție curente este că solvenții organici utilizați sunt periculoși, dificil de manevrat sau dificil de eliminat. Extracția cu dioxid de carbon, este metoda de izolare a acidului betulinic utilizatǎ la nivel industrial, aceasta fiind o metodǎ sigurǎ și nepoluantǎ.

Compusul natural betulinic prezintă o activitate anticanceroasă puternică prin activarea căii mitocondriale a apoptozei în celulele canceroase.

Datorită citotoxicității sale selective față de celulele maligne comparativ cu celulele normale, acidul betulinic este un nou agent experimental promițǎtor pentru tratamentul cancerelor umane.

Sensibilitatea celulelor leucemice pentru acidul betulinic este independentă de rezistența la medicamentele citotoxice, astfel încât acidul betulinic ar putea avea capacitatea să inducă apoptoza în celulele leucemice cu rezistență dobândită împotriva medicamentelor citotoxice.

Ȋn partea experimentală a lucrării s-a urmărit realizarea unei metode de separare și determinare a compușilor betulinici prezenți în seva de mesteacăn prin metoda HPLC.

Metoda HPLC reprezintǎ o tehnică excelentă pentru determinarea acidului betulinic și a derivaților săi din produse naturale, cu o bună sensibilitate, precizie și reproductibilitate.

Ȋn urma analizei HPLC a sevei de mesteacǎn s-au determinat urmǎtoarele rezultate: 0,025 µg/mL betulinol și 0,349 mg/mL acid betulinic. Rezultatele sunt ȋn concordanțǎ cu cele raportate în literatura de specialitate.

Bibliografie

1. Antal DS, Biriescu S, Canciu CM, Traditional medicine in Banat region(Romania): results of an ethnobotanical survey; pg. 12-76, 2010.

2. Alexan M, Ovidiu C, Craiu F, Flora medicinală a României, Ed. Ceres, București, 2003.

3. TĂMAȘ, M., Botanică farmaceutică, vol II. Sistematică, Ed. Medicală, Universitatea ”Iuliu Hațieganu”, Cluj-Napoca, pg. 32-64, 2002.

4. Sahoo N, Manchikanti P, Dey S. Herbal drugs: Standards and regulation. Fitoterapia, pg. 462-471, 2010.

5. Zuco V, Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell linel, but not on normal cells. Cancer Lett, nr. 175, pg. 17-25, 2008.

6. G-Y. Wang, L. Jin, F-J. Piao and R-B. Han, Betulin esters with coumarin-3-carboxylic and 3,4,5-trimethoxybenzoic acids, Mendeleev Communications, nr. 27, pg. 93-94, 2017.

7. Kaur R., Kapoor K., Kaur H., Plants as a source of anticancer agents, J. Nat. Prod. Plant Resour., nr. 1, pg. 119-124, 2011.

8. Konate N. Etude De La Consommation Des Medicaments Traditionnels Ameliores Dans Le Cercle De Kadiolo. Universitatea din Bamako, Republica Mali,2005.

9. Markus A, Mathias M , Rolf D . Birch Bark Dry Extract by Supercritical Fluid Technology, Jose Augusto Paixao Coelho, Appl. Sci., 7, 292, 2017.

10. Ayesha H, M. Mahboob A, Mustafizur R, Choudhury M. Isolation of Betulinic Acid and 2,3-Dihydroxyolean-12-en-28-oic Acid from the Leaves of Callistemon linearis, Dhaka Univ. J. Sci., nr. 61(2), pg.211-212, 2013.

11. Das, A., K. Zaman and A.V. Singh, Antimicrobial and antioxidant activities of Callistemon linearis DC leaf extract. Pharmacology, nr .3, pg. 875- 881, 2008.

12. Noel, M.G. and F.M. Dayrit. Triterpenes in the callus culture of Vitex negundo L. Philip. J. Sci., nr. 134, pg. 5-19, 2005.

13. Holonec L., Ranga F., Crainic D , Truta A., Evaluation of Betulin and Betulinic Acid Content in Birch Bark from Different Forestry Areas of Western Carpathians, Bot Horti Agrobo, nr. 40(2), pg. 99-105, 2012.

14. Alaíde S. Barreto, Gláucio D. Feliciano, Analysis of the Presence of the Betulinic Acid

in the Leaves of Eugenia florida by Using the Technique GC/MS, GC/FID and HPLC/DAD, Journal Brazilian Chemical Society,12, pg. 180-18, 2009.

15. Ehrhardt H., Fulda S., Debatin K. Betulinic acid-induced apoptosis in leukemia cells, Leukemia 18, pg. 1406–1412, 2004.

16. Edgar S., Pimentel E., Jansen B., Effects of Betulinic Acid Alone and in Combination with Irradiation in Human Melanoma Cells, Jurnal of Investigative Dermatology, 114:935-940, 2007.

17. Mr. Rajendra K. Patel, Development and validation of rp-hplc method for quantification of betulinic acid in vitex negundo l. And its polyherbal formulations, IJPSR, Vol. 7, 2016.

18. R. Haavikko in Synthesis of Betulin Derivatives with New Bioactivities, Helsinki, Finlanda, 2015.

19. Rzeski W., Stepulak A., Szymański M., Juszczak M., Grabarska A., Sifringer M., Kaczor J., Kandefer-Szerszeń M., Betulin elicits anti-cancer effects in tumour primary cultures and cell lines in vitro, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., nr. 105, pg. 425-432, 2009;

20. S. Saha, M. Ghosh and S.K. Dutta, A potent tumoricidal co-drug ‘Bet-CA’ – an ester derivative of betulinic acid and dichloroacetate selectively and synergistically kills cancer cells, in Scientific Reports, 2015.

21. Schmidt L, Kuzmanoff K, Ling-Indeck L, Pezzuto M. Betulinic acid induces apoptosis in human neuroblastoma. European Journal of Cancer, 33,2007.

22. World Health Organisation MC. Traditional Medicine, Fact Sheet No. 134. 2008.

23. Supino D, Righetti C, Marchesi E, Gambacorti C, Formeli F. Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines., Cancer Letters, nr. 175, pg. 17–25, 2009.

24. Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E. Cancer Statistics, CA Cancer J Clin, nr. 60, pg. 277–300, 2010.

25. Schettino M, Ammaturo F, Labriola D, Franciscis P, Colacurci N, et al. Betulinic acid and possible influence on the clearance of Human Papilloma Virus: cytological and virological follow-up. Minerva Ginecol 65: 661–668, 2013.

26. Saha, M. Ghosh and S.K. Dutta, A potent tumoricidal co-drug ‘Bet-CA’ – an ester derivative of betulinic acid and dichloroacetate selectively and synergistically kills cancer cells, in Scientific Reports, 5 : 7762 | DOI: 10.1038, 2015.

27. Haavikko R., Synthesis of Betulin Derivatives with New Bioactivities, Helsinki, Finlanda 2015.

28. Liu CM, Yang YF, Zhang X. BA inhibits cell proliferation. Biomed Pharmacother, nr. 80, pg. 338–342, 2016 .

29. Fulda S, Kroemer G. Targeting mitochondrial apoptosis by betulinic acid in human cancers. Drug Discov Today, nr. 14, pg. 885–890, 2009.

30.Servick K. Breast cancer. Breast cancer: a world of differences. Science. 2014; 343:1452–1453.

31. Gheorgheosu T, Duicu O, Dehelan C, Soica C, Muntean D. Betulinic acid as a potent and complex antitumor phytochemical: a minireview. Anti-Cancer Agent Me, pg. 936–945, 2014.