Chimia și Managementul Calitǎ ții Produselor de Consum [619583]

Ministerul Educației N aționale
Universitatea ,,OVIDIUS’’ din Constanța
Facultatea de Știinte Aplicate și Inginerie
Chimia și Managementul Calitǎ ții Produselor de Consum
ȋn Relație cu Mediul

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific
Prof. Univ. Dr. Ing. GABRIELA STANCIU

Masterand: [anonimizat]
2018

Ministerul Educației N aționale
Universitatea ,,OVIDIUS’’ din Constanța
Facultatea de Știinte Aplicate și Inginerie
Chimia și Managementul Calit ǎții Produselor de Consum
ȋn Relație cu Mediul

Acidul betulinic. Izolare,
caracterizare și acțiune terapeuticǎ

Coordonator științific ,
Prof. Univ. Dr. Ing. GABRIELA STANCIU

Masterand: [anonimizat]
2018

DECLARAȚIE

Subsemnata ENACHE L. LAURA -BIANCA , absolventǎ a Facultǎții de Ști ințe
Aplicate și Inginerie din Universitatea ,,OVIDIUS” din Constanța, promoția 2018,
programul de studii CHIMIA ȘI MANAGEMENTUL CALITǍȚII PRODUSELOR DE
CONSUM ȊN RELAȚIE CU MEDIUL , declar pe proprie rǎspundere cǎ am redactat
lucrarea de disertație cu respectar ea regulilor dreptului de autor, conform actelor normative
ȋn vigoare (Legea 8/1996 modificatǎ și completatǎ prin Legea nr. 285/2004, Ordonanța de
Urgențǎ nr. 123/2005 modificatǎ și Legea nr. 329/2006).
Pentru eliminarea acuzațiilor de plagiat:
– am executat lucrarea personal, nu am copiat -o și nu am cumparat -o, fie ȋn ȋntregime,
fie parțial;
– textele din surse romȃnești, precum și cele traduse din alte limbi au fost prelucrate
de mine și sintetizate, rezultȃnd un text original;
– ȋn cazul utilizǎrii unor fraze citate exact, au fost indicate sursele bibliografice
corespunzǎtoare, imediat dupǎ frazele respective.
Am luat la cunoștințǎ cǎ existența unor pǎrți nereferențiate sau ȋntocmite de alte persoane
poate conduce la anularea diplomei de master.

Data : Semnǎtura :

Rezumatul lucrǎrii

Lucrarea este structuratǎ ȋn douǎ parți principale și anume :
PARTEA I. CONSIDERAȚII GENERALE
Acea stǎ parte de generalitǎți este structuratǎ ȋn 4 capitole.
Primul capitol sintetizeazǎ datele din literaturǎ privind clasificarea, importanța și
dezvoltarea plantelor medicinale, cu spectru larg de proprietǎți terapeutice .
Capitulol 2 include o prezentare succintǎ a acidului betulinic și al derivaților sǎi. S -a
demonstrat că printr -o modificare a structurii părinte se pot genera un număr important de
potențiali derivați care îmbunătățesc semnificativ profilul toxicității selective.
Ȋn Capitolul 3 sunt preze ntate principale metode de izolare și determinare a compușilor
betulinici. Metoda de izolare utilizatǎ la nivel industrial este extracția cu dioxid de carbon,
aceasta fiind o metodǎ ecologicǎ, care nu polueazǎ și care nu folosește solvenți organici
pericul oși și greu de manevrat. Analiza compușilor betulinici izolați s -a realizat prin metode
spectrofotometrice și cromatografice.
Ȋn Capitolul 4 este prezentatǎ acțiunea terapeuticǎ a acidului betulinic. S -a demon strat cǎ
acidul betulinic induce apoptoza ȋn ce lulele canceroase, fiind citotoxic selectiv, suprimȃnd
dezvoltarea tumorilor.
PARTEA II. CONTRIBUȚII ORIGINALE
Ȋn Capitolul 5 este prezentatǎ partea experimentalǎ a lucrǎrii, ce constǎ ȋn recoltarea sevei
de mesteacǎn și ȋncercǎri fǎcute ȋn scopul stabilirii unei metode de analizǎ prin HPLC a
compușilor betulinici prezenți ȋn aceasta, și anume a acidului betulinic și a betulinolului.

Motto

,,Chimia este o știință care va avea asupra vieții o influență imensă
și o amplă aplicare.”

Cu ocazia definitivării lucrării de disertație, doresc sǎ adresez
mulțumiri doamnei Prof. Univ. Dr. Ing. Gabriela Stanciu,
conducătorul științific al acestei lucrări, pentru cunoștințele
împărtășite și pentru susținerea acordatǎ.

Cuprins
PARTEA I . CONSIDERAȚII GENERALE
Introducere ……………………………………………………………………………………………………….
Capitolul 1. Considerații privind utilizarea plantelor medicinale
1.1. Prezentare generală…… …………. …………………………………………………….. …………….. .
1.2. Tradiții românești privind utilizarea plantelor medicinale… ………………. ……………..
1.3. Clasificarea plantelor medicinale…………………………………. ……………….. ……………. .
1.4. Principalii factori care determină calitatea plantelor medicinale…… …………………..
Capitolul 2. Acidul betulinic și derivații sǎi. Speciile vegetale ut ilizate pentru
izolarea lor
2.1. Acidul betulinic și derivații sǎi………… …………………………………………. ……………….
2.1.1. Activitatea terapeuticǎ……………… ………………………….. ……………. …………..
2.1.2. Sinteza compușilor derivați din acidul betulinic……………………….. …………
2.2. Surse naturale utilizate pentru obținerea acidului betulinic și a derivaților sǎi …….
Capitolul 3. Metode de izolare și analizǎ a compușilor betulinici
3.1. Extracția cu lichid supercritic…………………………………………………….. ………… ……..
3.2. Extracția cu solvenți organici a acidului betulinic din frunzele de Callistemon
linearis și analiza spectrofo tometricǎ….. ……………………………………………………… ……….
3.3. Separarea și determinarea principiilor active din extractele vegetale din Eugenia
florida prin metoda HPLC și GC / FID……………………………………… ………………………….
3.4. Evaluarea conținutului de betulinol și acid betulinic în coajă de mesteacăn din
diferite zone forestiere ale Carpaților Occidentali …………………………………………………..
3.5. Izolarea acidului betulinic din Vitex Negundo L . prin metoda HPLC ………………….
Capitolul 4. Acțiunea terapeuticǎ a acidului betulinic
4.1. Apoptoza indusă de acidul betulinic în celulele leucemice ………………………………..
4.2. E fectele acidului betulinic singur și în combinație cu iradierea în celulele
melanomului uman …………………………………………………………………………………………….
4.3. Apoptoza ind usǎ de acidul betulinic ȋn celulele canc erului de colon ……………………
4.4. Esteri ai betulinolului cu proprietăți terapeutice ……………………………………………….

7

8
8
10
13

17
17
18
18

29

20

22

25
29

30

32
36
39

PARTEA II. CONTRIBUȚII ORIGINALE
Capitolul 5. Separarea și determinarea acidului betulinic și a betulinolului din seva
de mesteacǎn prin metoda HPLC
5.1. Recoltarea sev ei de mestea cǎn……………………………………………………………………….
5.2. Analiza HPLC a sevei de mesteacǎn ……………………………………………………………….
Concluzii …………………………………………………………………………………………………………..
Capitolul 6. Concluzii g enerale ……………………………………………………………. ……………
Bibliografie

44
45
52
53

7
Introducere

Cu toate progresele din domeniul chimiei de sintezǎ și semisinteză, plantele rămân cea
mai importantă sursă de substanțe cu potențial terapeutic.
Ȋn ultimii 50 de ani , datoritǎ numeroaselor incidențe tumorale , a crescut semnificativ
interesul pentru s tudierea unor compuși de sintezǎ și ȋn special al compușilor naturali, de
origine vegetalǎ, de tip triterpenic, datorit ǎ proprietǎților anticanceroase.
Ȋn acest sens, a cidul betulinic este considerat cel mai important compus natural din regnul
vegetal, avȃnd numeroase proprietǎți terapeutice ȋn majoritatea tipurilor de cancer. Acidul
betulinic are o citotoxicitate selectivǎ care nu afecteazǎ celulele normale.
Motivația cercetǎrii
Cancerul este considerat ca fiind cea mai semnificativǎ probl emǎ de sanǎtate publicǎ ,
datoritǎ patologiei sale complexe care impune o abordare medicalǎ multidisciplinarǎ. Ȋn
tratarea pacienților diagnosticaț i cu cancer se pune un accent deosebit pe produ sele naturale,
care nu dau reacț ii adverse periculoase unui org anism cu un sistem imunitar scǎzut. O atenție
deosebitǎ, ȋ n aces t sens, a fost acorda tǎ utilizǎrii compuș ilor terpenici policiclici, izolaț i din
diferite surse naturale.
Pe plan internațional, se aflǎ ȋn fazǎ experimentalǎ utilizarea acidul betulinic și a
derivaților sǎ i, ȋn diferitele tipuri de cancer.
Obiectivele cercetǎrii
Obiectivul principal al cercetǎrii , este de a elabora o m etodǎ de ana lizǎ HPLC a sevei de
mesteacǎn, ȋn scopul determinǎrii acidul ui betulinic și a betulinolului, fiind cunoscut faptul
cǎ aceștia se gǎsesc ȋn concentrații semnificative ȋn sevǎ .

8
PARTEA I. CONSIDERAȚII GENERALE
Capitolul 1 . Considerații privind utilizarea plantelor medicinale

1.1. Prezentare generalǎ
Plantele medicinale reprezintǎ specii le vegetale, cultivate sau spontane, care prin
compoziția lor chimică , prezintǎ proprietăți medicinale, fiind folosite în terapeutica umană
și veterinară din cele mai vechi timpuri [1].
Valoarea terapeutică a plantelor medicinale are la bază relația din tre structura chimică a
substanțelor active, numite și principii active, și acțiunea lor farmacodinamică pe care o
exercită asupra element elor reactive ale organismului. P lante le medicinale au o compoziție
chimică complexă , încep ând de la 2 -3 compuși până la 25 -45 substanțe chimice identificate
în unele plante, cum ar fi speciile genurilor Digitalis, Vinca, Claviceps, Papaver etc., explică
și proprietățile farmacodinamice multiple ale uneia și aceeaș i plante. Lucrurile se complică,
când avem de -a face cu am estecuri de plante cunoscute sub denumirea de "ceaiuri
medicinale" sau "specii medicinale " sau amestecuri de tincturi, pulberi de plante, sau a lte
forme farmaceutice complexe [2, 3].

1.2. Tradiții românești privind utilizarea plantelor medicinale
Practica vindec ǎrii bolilor și a alinării suferințelor fizice provocate de acestea, se real izǎ
cu ajutorul plantelor medicinale , acestea av ȃnd o tradiție străveche, ce se pierde în negura
unor vremuri foarte îndepărtate. Sute de generații , au observat o mu ltitudine de efecte
benefice ale plantelor, perfecționȃnd ȋn timp remediile inițiate de strămoșii noștri ȋndepǎrtați
daco -geții. Strămoși i noștri care au trăit acum mult timp pe meleagurile carpato -danubiene,
cu mi i de ani înainte de era noastră cunoșteau foarte multe specii de plante înzestrate c u
proprietǎți terapeutice, ceea ce le -au cree at o reputație m ǎreațǎ și au fost apreciați în întreaga
epoc ǎ antică , pentru tratamentele deosebit de efi ciente pe care le aplicau [3].
Herodot considerat și părin tele istoriei, afirma despre strǎmoșii noștri daci că sunt : „buni
cunoscători ai plantelor, având și numeroase tehnici surprinzǎtoare de îngrijire a bolnavilor
cu ajutorul plantelor“. Din scrierile lui Herodot se consta tǎ că, populațiile traco -dacice
cunoșteau fumigațiile cu cânepă indiană (hașiș), cu numeroase efecte euforice și
narcotizante contra durerilor nașterii . Aceasta demonstrează că dacii au avut legături și cu
popoarele din Orient.

9
Homer, un alt mare poet al a ntichității, afirma despre geto -daci că, „în afară de bravura
și bărbăția manifestată în lupte, ei posedau și o educație morală, manifestată în grija față de
străini, de bolnavi și de răniții căzuți pe pământul lor“.
În mǎreața creație poetică a lui Ov idius (43 î.e.n. -17 e.n.), completată și finalizatǎ în
timpul exilului său la Tomis – Constanța (8 -17 e.n.), erau menționate foart e multe plante
care au potențial terapeutic , majoritatea crescȃnd în flora din spațiul carpato -danubian și
mai ales la Pontus Euxinus (Marea Neagră). Dintre specii le de plante erau menționat e și
Aconitum, Adonis, Malva. Un alt reprezentant al culturii antice, poetul latin Vergilius
afirma, în scrisorile sale, că „Pontus Euxinus rodește multe ierburi și dă leac pentru mai
toate b olile“.
Dioscorides , un medic grec născut în Asia Mică în anul 1 e.n., fiind contemporan cu
împăratul roman Nero , a făcut foarte multe călătorii printre care și Dacia, de unde a strȃns
un bogat material , pentru a scrie o carte de mare ȋnsemnǎtate pentru medicina naturistă a
vremii. Cartea a fost intitulată „De spre mijloacele de vindecare“, fiind p ublicată în anul 77,
aceast ǎ carte descria peste 600 de specii de plante medicinale, dintre care 40 de specii de
plante au fost specif ice teritoriului Daciei. Dintre specii le enumerate, 27 din acestea au
denumiri daco -trace, 8 denumiri latine și 5 denumiri grecești, acest lucru conf irmȃnd o
vechimea fitoterapiei pe meleagurile țării noastre.
După cucerirea Daciei de către romani (106 e.n.), arsenalul terapeutic al florei medicinale
din Dacia s -a îmbogățit cu noi specii aduse de militarii și de administrația romană.
Pseudo -Apuleius, scriitor și mare botanist din secolul al II-lea e.n., în lucrarea sa „De
medica minibus herbarum“, menționa alte 37 d e plante cu efecte terapeutice folosite în
Dacia: aniarsexe -iarba sărată, budathla -limba boului, chlodela -țelina de câmp, ciborastra –
brusture, diesema -coada vacii, dyn -urzică, dzena -cucuta de apă, kardama -papură,
koikodila -păpălău, kroustane -rostopască, ma ntia-mure, mizela -cimbru, skite -scai. Un
studiu arată că 11 specii cu denumiri dacice sunt identice cu cele notate de Dioscorides, iar
26 de specii apar numai în scrie rile lui Pseudo -Apuleius, fiind probabil adunate direct de pe
teritoriul Daciei romane.
Ȋn anul 275 e.n , ȋn timpul domniei împăratului Aurelian, evacuarea Daciei de către
autoritățile adm inistrative și militare romane , medicina naturistă a constituit unica metodă
de alinare și vindecare a suferințelor bolnavilor.

10
1.3. Clasificarea plantelor medicinale
Plantele medicinale se clasifi cǎ astfel :
1. Dupǎ organele utilizat e în procesul de terapeutică, există 6 grupe de plante cu proprietǎți
medicinale:
– plante medicinale la care este ultiliz atǎ doar rădăcina, bulbii ori tuberii ( Angelica
archangelica, Valeriana officinalis, Iri s germanica, Gentiana lutea ).
– plante medicinale de la care se utilizează doar tulpina și coaja ( Rhamnus frangula,
Querqus robur ).
– plante medicinale de la care se utilizează herba (tulpina + frunzele): Mentha piperita ,
Melissa offi cinalis, Satureja hortensis ).
– plante medicinale de la care se utilizează doar frunzele și foliolele ( Mentha piperita,
Salvia officinalis, Plantago lanceolata, Digi talis sp., Atropa belladona )
– plante medicinale de la care se folosesc infloresc ențele, florile sau petalele
(Lavandula angustifolia, Salvia sclarea, Althaea rosea, Calendula officinalis ,
Matricaria chamomilla ).
– plante medicinale de la care se utilizează fructele și semințele ( Carum carvi,
Coriandrum sativum, Papaver sp., Hyosciamus n iger, Si napis sp., Ricinus
communis ).
– plante medicinale de la care se utilizează ȋn mod special sucul celular și seva ( Aloe
sp., Betula sp.).
2. Dupǎ perioada de recoltare. Perioada considera tǎ optimă, pentru recoltare se stabilește pe
baza acumu lǎrii de principii active și anume în faza ȋn care acestea se acumulea zǎ maxim.
Din acest punct de vedere putem distinge următoarele grupe de plante :
– plante medicinale care se recoltează în perioada repausului vegetativ ( Atropa
belladona, Inula helenium ); din cate goria speciilor bienale , rădăcinile se recoltează
în mod special ȋn toamna anului I de vegetație ( Angelica archangelica, Pimpinella
anisum excepție face specia Colchicum autumnale (la care rădăcinile tuberizate se
recoltează vara atunci când frunzele încep să se ofileas că), dar și Aconitum nepellus
(la care tuberculii se recoltează doar în perioada înfloritului). Speciile aparținând
acestei grupe sunt considerate având în vedere utilizarea rădăcinii.
– plante medicinale care se recoltează vara, în perioada de vegetație. Această grupă
cuprinde specii anuale sau perene care se recoltează pentru fl ori, organele florale sau
herba (Ocimum basilicum, Majorana hortensis, Tagetes patu la, Calendula
officinalis ).

11
3. Dupǎ zonarea naturală reprezenta tǎ de flora spontană și zonarea culturilo r reprezenta tǎ
de specii le cultivate . Această clasificare are în vedere ȋn mod special cerințele plantelor față
de anumite condiții ecologice și sunt:
– plante medicinale iubitoare de apă , care cresc ȋn apǎ sau ȋn zone mlǎștinoase (Iris sp.,
Colchicum autumnale, Acorus ca lamus, Valeriana officinalis ).
– plante medicinale de câmpie, sunt specii de plante care sunt adaptate condițiilor de
insolație ridicată ce caracterizează ȋn general verile din sudul țării ( Foeniculum
vulgare, Pimpinella anis um, Coriandrum sativum, Papaver bracteatum ).
– plante medicinale de deal, reprezin tǎ specii le adaptate condițiilor ce caracterizează
acele zone subcarpatice cât și zonele împădurite ( Atropa belladona, Vinca minor,
Crataegus monogyna, Geum urbanum – specii di n flora spontană de deal; Papaver
somniferum, Carum carvi, Valeriana officinalis – specii cultivate ).
– plante medicinale care cresc la munte, sunt specii adaptate condițiilor caracterizate
prin: altitudine, vânturi, temperaturi cu mult mai scăzute în toată perioada anului fațǎ
de restul zonelor (Gențiana sp., Arnica , Angelica archangelica ).
4. Dupǎ ciclul de vegetație, parcurgerea fenofazelor , poate fi alt criteriu de clasificare al
plantelor medicinale:
– plante medicinale anuale, sunt speciile de plante care parcurg în totalitate ciclu de
vegetație doar într-un singur an ( Tagetes patula, Calendula off icinalis, Papaver
somniferum ).
– plante le medicinale bienale, specii de plante care își desfășoară tot ciclul de vegetație
pe parcursul a doi ani ( Carum carvi, Salvia sclarea ).
– plante medicinale vivace (perene) sunt specii de plante care au ciclul de vi ață
multianual.
5. Dupǎ aspectul lor pot fi : plante ierboase ( Valeriana officinalis, Thymus vulgaris, Papaver
bracteatum) și plante lemnoase ( Salvia officinalis, Lavandula angustifolia, Glycyrrhiza
glabra ).
6. Dupǎ caracterele botanice. Clasificare aceasta, urmărește doar criteriul strict leg at de
înșușirile morfologice dar și de tipul florii . Astfel plantele se pot clasifica și se grupează pe
ordine, genuri, familii și specii.

12
7. Dup ǎ conținutul de principii active.
– plante medicinale care conțin uleiuri esențiale sau uleiuri eterice. Ȋn ceea ce privește
conceptul despre definirea uleiurilor volatile, ȋn ultima perioadǎ a evoluat foarte
mult. Acestea pot fi definite ca fiind “compuși aromatici volatili a căror compoziție
chimică este formată dintr -o mulțime de amestecuri de hidrocarburi aromatice,
alifatice, aldehide, alcooli, acizi organici, esteri precum și alți compuși similari
hidrocarburilor și care aparțin clasei terpenoidelor“. Uleiurile volatile au un miros
specific, aromatic, acestea fiind ȋn majoritatea cazurilor solubile ȋn alcool etilic. O
picǎturǎ de ulei esențial, creeaza pe o hartie o patǎ care dispare rapid. Uleiurile
volatile au o importanțǎ deosebitǎ ȋn medicinǎ, acestea fiind utilizate ca și
expectorante, sedative, aromatice, stomahice, antispasmodice, carminative.
– plante medicinale ce conțin alcaloizi (compuși organici complecși, caracterizați prin
prezen ța azotului în molecula lor și reacție alcalină, cu formare de săruri). Au o
acțiune puternică asupra organismului uman chiar și în doze mici. Alcaloizii se
formează, de regulă, în părțile subterane ale plantei, de unde migrează în celelalte
organe în timpul perioadei de vegetație. L a mac și rostopască, alcaloizii se găsesc în
sucul lăptos. În funcție de aminoacidul precursor, alcaloizii se clasifică în: alcaloizi
derivați din glicolol , alcaloizi derivați din triptofan , alcaloizi derivați din
fenilalanina , alcaloizi derivați de la lizină – ornitină , alcaloizi prin intermediul acetil
– coenzimei A.
– plante medicinale ce conțin principii amare. Principiile amare sunt compuși vegetali
(cu structu ră glicozidică, alcaloidică ), ternari cu gust amar (chiar și la diluții mari)
care determină mărirea secreției gastrice. Dozarea principiilor amare se face prin
metoda organoleptică. Se întâlnesc mai ales la familiile Gentianaceae și Asteraceae .
– plante medicinale care conțin glucide (hidrați de carbon, heterozide sau glicozide)
(Lemnul dulce). Glucidele sunt compuși organici naturali rezultați direct în procesul
de fotosinteză.
– plante medicinale care conțin flavonoide. Flavonoidele sunt pigmenți galbeni
identificați la specii din fa milia Composit ae sub formă de flavone ( Matricaria
chamomilla , Achillea milefolium, Calendula officinalis ) sau sub formă de flavonoli
la specii din familia Leguminosae (Sophora japonica ).

13
– plante medici nale care conțin antocianozide. Antocianozidele sunt pi gmenți
hidrosolubili aflați în sucul celular care conferă florilor, fructelor și frunzelor
toamna, cu loarea roșie, violetă, albastră.
– plante medicinale care conțin taninuri. Taninurile sunt compuși naturali neazotați cu
structură polifenolică.
– plante care conțin antracenozide. Antracenozidele sunt compuși naturali ai
antracenului având proprietăți purgative. Identificarea lor se realizează prin
cromatografie în strat subțire.
8. Din punct ul de vedere al fitofarmaciștilor cea mai bună clasificare consid eratǎ de ei ar fi
dupǎ importanța terapeutică (în funcție de principiile active predomina nte) [3]:
– plante utilizate în bolile aparatului cardiovascular, care conțin, glicozide sau
heterozide cardiotonice. Ex. Digitalis sp., Convalaria majalis .
– plante utilizate în bolile aparatului respirator care pot fi cu acțiune emolientă
(Althaea sp., Plantago sp.), cu acțiune expectorantă.
– plante utilizate în afecțiunile aparatului digestiv ca Mentha sp., Melissa sp.,
Matricaria chamomilla, Carum carvi .
– plante folos ite în b olile aparatului urinar.
– plante folosite în bolile sistemului nervos ca Valeriana officinalis, Vinca
minor,Claviceps .
– plante folosite în unele boli ale aparatului genital ca Claviceps purpurea ,Calendula
officinalis .
– specii utilizate în tratamentul extern ca Hypericum perforatum , Calendula
officinalis .

1.4. Principalii factori care determină calitatea plantelor medicinale
Cadrul de viață al plantelor este reprezentat de factorii de mediu: lumina, temperatura, apa ,
aerul și substratul de cultur ǎ.
Lumina este factorul care in fluențează ȋ n mod deosebit, creșterea și dezvoltarea plantelor
prin intensitate (lucși), durată și lungime de undă. Are rol important ȋn fotosintez ă, reprezentȃnd
sursa energeti cǎ principalǎ a plantelor, dar ȋn același ti mp lumina constituie condiția esențialǎ
și de bazǎ, pentru realizarea unei producții mari și de calitate. Lumina la suprafața solului ajunge
sub două forme, lumina directă și lumina difuză.

14
Temperatura provine din radiația solară , aceasta reacționȃnd împreună cu lumina .
Temperatura aerului influențeazǎ direct intensitatea tuturor proceselor biochimice care au loc
ȋn partea aeriană a plantelor și acționează ȋn același timp și indirect asupra acestora, prin
influența care o are asupra regimului termic al solului, formarea umidității de lângă sol, precum
și asupra evaporației. Creșterea și fructificarea plantelor, depinde ȋn mod deosebit de
temperatura aerului dar și de cea a solului. Aerul ȋn mod normal se încăl zește ziua, datoritǎ
radiației reflectată pe suprafața solului. Temperatura solului este ȋntotdeauna mai ridicată cu cel
puțin cȃteva grade fațǎ de cea a aerului, în funcție de umiditatea solului.
Apa reprezintǎ al t factor esențial ȋn creșterea și dezvoltarea plantelor. Apa este un constituent
natural, ce se gǎsește ȋn ambundențǎ ȋn toate organele plantei (rădăcinile 65 – 85% apǎ, frunzele
75 – 80 % iar fructele ajung și la un procent de 90 % apǎ). Apa contribuie la toate procesele
fiziologice vitale ale plantei. Aerul are o influență indirectă asupra plantelor, modificȃnd
regimului umiditǎții solului și a principalilor indicatori ai fertilității solului, dar nu in ultimul
rȃnd și al indicatorilor determinanți, cum ar fi: substanțele nutritive, aerul, consistență reacție
(pH), căldură, activitate biologică, procese fizico -chimice și biochimice, cu rol decisiv ȋn
desfășurarea tuturor proceselor de formare a recoltelor.
Precipitațiile în exces pot influența vegetația, creșterea și dezvoltarea plantel or. Astfel, un
timp ploios și rece prelungește perioada de vegetație a plantelor, diminuează procesul de
fotosintez ǎ și împiedică maturarea și colorarea fructelor. Umiditatea în exces a solului afecteazǎ
sistemul radicular al plantelor prin asfixierea parț ială sau totală, producȃnd pagube ȋnsemnate,
iar umezeala aerului de peste 70% favorizează foarte mult atacul de mană și putrezirea coletului.
Foarte dăunător este un exces de umiditate în sol și atmosfe rǎ, în perioada coacerii și
recoltării fructelor și legumelor.
Aerul are o influență directǎ asupra plantelor de cultură, prin compoziția sa atmosferică.
Oxigenul este utilizat de plante în respirație iar dioxidul de carbon este esențial ȋn
fotosinteză.
Asigurarea necesarului de CO 2 se realizează prin mișcarea continuǎ a aerului și prin
descompunerea materiilor organice în sol. De altfel mișcarea permanentă a aerului favozizeazǎ
împrospătarea cu O 2, CO 2 și reducerea excesului de umiditate ȋn atmosferǎ.
Vânturile puternice afecteazǎ întotdeauna majoritatea plantelor deoarece, sub acțiunea lor
mecanică se produc pagube remarcabile, rup ramurile, înclină, dezrădăcinează plantele. Vântul
prin intensitate și duratǎ joacǎ un rol important în polenizarea p lantelor, avȃnd o acțiune directǎ.

15

Capitolul 2 . Acidul betulinic și derivații sǎi. Speciile vegetale
utilizate pentru izolarea lor

2.1. Acidul betulinic și derivații sǎi
Acidul betulinic este un compus natural , larg răspândit în regnul vegetal avȃnd o serie
de efecte biologice, de exemplu o activitate antinaceroasǎ puternică. Acidul betulinic se
izoleazǎ ȋmpreunǎ cu betulin olul.
Acidul (3β) -3-hidroxi -20(29) -lupen -28-oic sau acidul betulinic, (C ₃₀H₄₈O₃), (Figura 1.
a), este derivat din betulin ol, (C 30H50O2), (Figura 1. b), o triterpenă pentaciclică care se
găsește din abundenț ǎ în coaja scoarței de mesteacăn, ( Betula pendula, Betula costata,
Betula ermanii ). Aproximativ 30% din scoarța uscatǎ a mesteacǎnul ui este repr ezentatǎ de
betulin ol.

Figura 1. a. Acidul betulinic b. Betulin ol

2.1.1. Activitatea terapeuticǎ
Acidul betulinic este un produs natural cu o serie de efecte biologice, de exemplu o
activitate antitumorală puternică. Această proprietate anticanceroasă este legată de
capacitatea sa de a induce moartea celulelor canceroase prin declanșarea căii mitocond riale
a apoptozei [5].
Moartea celularǎ fiziologicǎ este esențialǎ pentru dezvoltarea și functionarea normalǎ a
organismelor multicelulare. Apoptoza este un proces ȋnnascut, conservat din punct de
vedere evolutiv, prin care celulele sistematic ȋși inactiveazǎ , dezasamblezǎ și ȋși degradea zǎ
propriile componente structurale și funcționale pentru desǎvarsirea propriului lor deces.
Celulele canceroase sunt un exemplu de complexe celulare ȋn care mecanismele
apoptozei nu mai f uncționeazǎ.
a
.
. b
.

16
Celulele canceroase supraviețuiesc și se multiplicǎ farǎ a mai fi influențate de
transformǎrile genetice survenite ȋn cursul vieții celulei, ȋn timp ce ȋn mod normal ar fi
trebuit sa fie distruse prin apoptozǎ [23].
Spre deosebire de citotoxicitatea ac idului betulinic împotriva unei varietăți de tipuri de
cancer, celulele și țesuturile normale sunt relativ rezistente la acidul betulinic. Compușii
care exercită o acțiune directă asupra mitocondriilor prezintă terapii experimentale
promițătoare, deoarece acestea pot declanșa moartea celulelor în circumstanțe în care
chimioterapeutica standard nu reușește.
Acțiunea anticanceroasă a acidului betulinic se datorează perturbării directe a
mitocondriilor, prin modularea nivelelor grupului de proteine Bcl -2 ( B -cell limphoma 2) și
prin blocarea factorului nuclear kappa B.
Apoptoza (gr.”apoptosis” -caderea fr unzelor) este un process de moarte celulalarǎ
programatǎ, umatǎ de modificari citologice caracteristice (markeri apoptotici) și
mecanisme molecul are de semnalizare; este o formǎ de moarte celularǎ, urmatǎ de
micșorarea dimensiunilor celulei, condensarea ș i fragmentarea cromatinei, formarea de
vezicule cu organitel e celulare fǎrǎ sǎ fie eliber atǎ citoplasma extracelular.
O mare varietate de proprietăți medicinale și acțiuni biologice au fost atribuite acidului
betulinic, inclusiv proprietăți anticancer oase antitumorale, antiinflamatorii, antimicrobiene,
antiischemice, antimalarice, antimelanom, citotoxice specifice pentru carcinomul pulmonar,
pentru cel al colonului, și pentru tumorile neuroectodermic [29]. În plus compusul dezvoltă
și o acțiune antiang iogenică, antileucemică și antilimfomatică, fiind un bun inhibitor al
tumorilor maligne cerebrale, prin activarea directă a apoptozei la nivel mitocondrial. În
timp ce rapoartele inițiale sugerează că acidul betulinic este selectiv citotoxic împotriva
liniilor celulare melanomice, activitatea anticancer a fost raportată ulterior și împotriva altor
tipuri de cancer uman, incluzând neuroblastomul, glioblastomul, meduloblastomul, tumora
Ewing, leucemia precum și carcinomul la gât, colon, sân, hepatocelular, p lămân, prostată,
celule renale, carcinom ovarian sau de col uterin [5].
A fost raportat că acidul betulinic inhibă aminopeptidaza N, o enzimă implicată în
reglarea angiogenezei și supraexprimată în mai multe forme de cancer.
De asemenea, acidul betulinic a fost citotoxic în diferite modele de rezistență la
medicament, de exemplu, probe de leucemie acută care au fost rezistente la agenții
chimioterapeutici standard. Astfel, acidul betulinic poate depăși anumite forme de rezistență
la medicament.

17
Acidul betulinic a cooperat cu stimuli citotoxici diferiți pentru a suprima creșterea
tumorală, inclusiv radiația ionizantă, medicamentele chimioterapeutice sau ligandul de
deces TRAIL. Acest lucru sugerează că acidul betulinic poate fi utilizat ca și sensibilizator
în regimuri combinate pentru a spori eficacitatea terapiei anticanceroase. Prin comparație,
celulele normale de origine diferită au fost raportate a fi mult mai rezistente la acidul
betulinic decât celulele cancerigene care indică o selec tivitate tumorală [28].
De asemenea, s -a constatat că acidul betulinic încetinește progresia infecției HIV 1, care
în cele din urmă duce la SIDA, prin prevenirea formării sincițiilor (agregate celulare). În
plus, acidul betulinic are proprietăți antib acteriene și inhibă creșterea bacteriilor
Staphylococcus aureus cât și a Escherichia coli .
Un inconvenient major pentru dezvoltarea clinică viitoare a acidului betulinic constă în
solubilitatea lor slabă în medii apoase, cum ar fi serul de sânge și solvenții polari utilizați
pentru bioteste.
O sursă de acid betulinic solubil și ingerabil e ste chaga ( Inonotus obliquus ) (Figura 2.) ,
o ciupercă medicamentoasă , avȃnd o creștere lentă (minimum 7 -10 ani) găsită ca parazit pe
mesteacan în regiunile cele mai reci ale emisferei nordice. Această ciupercă convertește
betulina prezentă în coaja mestea canului într -o formă solubilă și ingerabilă de acid betulinic.

Figura 2. Inonotus obliquus

18
2.1.2. Sinteza compușilor derivați din acidul betulinic
De-a lungul cercetărilor efectuate la nivel mondial în domeniul agenților antitumorali,
au fost s tudiate mai multe modificări structurale și derivatizări ale acidului betulinic,
demonstrându -se că printr -o simplă modificare a structurii părinte se pot genera un număr
important de potențiali derivați care îmbunătățesc semnificativ profilul toxicității selective,
sau care pot induce un efect toxic general asupra celulelor leucemice. Acidul betulinic
prezintă trei poziții: C 3, C20 și C 28 unde se pot efectua modificări chimice în vederea obținerii
derivaților cu activitate antitumorală importantă.

2.2. Surse naturale utilizate pentru obținerea acidului betulinic
Coaja de m esteacǎn este cea mai importa ntǎ sursǎ de acid betulinic , din care se pot
extrage cantitǎți industriale de betulin ol și acid betulinic [7].
Mesteacănul face parte din genul Betula , familia Betulacee . Aceștia sunt copaci sau
arbuști de talie mică sau medie, avȃnd o coajă albă caracteristică, care cresc ȋn special unde
clima este temperată nordică. Preferǎ ȋn general zonele de deal și munte, pâ nǎ la 1.500 m
altitudine.
Principi i active:
Funzele de mesteacǎn conțin pȃnǎ la 3% flavonoide dar și acizi fenolici, metil salicilat,
tanini și vitamina C.
Coaja de mes teacǎn conține: vitamina C, acizi fenolici, nicotinici și acetilsalicilici, tanini,
caroteni și principii amare, mucilagii, rășini și substanțe antiseptice vegetale , de asemenea
conține și zaharuri, saponine, betulinol , flavonoizi , uleiuri esențiale, betulenol și
metilbetulenol.
Seva de m esteacǎn conțin e glucozǎ, fructozǎ (care ȋi conferǎ sevei un gust usor dul ce,
foarte agreabil), aminoacizi, derivați terpenici, vitamina C și o serie ȋntrea gǎ de minerale
valoroase: calciu, fosfor, magneziu , mangan, zinc, sodiu și fier.

19

Capitolul 3. Metode de izolare și analizǎ a compușilor betulinici

Un dezavanta j al procedeelor de extracție curente este că solvenții organici utilizați sunt
periculoși, dificil de manevrat sau dificil de eliminat.

3.1. Extracția cu lichid supecritic
Extracția cu dioxid de carbon a acidului betulinic se realize azǎ la o presiune de la
aproximativ 340 atm până la aproximativ 680 atm și la o temperatură de aproximativ 50 °
C până la aproximativ 120 ° C [9].
Extracția cu fluid supercritic este o extracție în care se utilizează un fluid la o temperatură
și o presi une mai mare decât punctul său critic; sau un lichid peste temperatura critică,
indiferent de presiune. Sub punctul critic, fluidul poate coexista în ambele faze gazoase și
lichide, dar deasupra punctului critic există o singură fază.
Pentru extracț ia acidului betulinic se utilizeazǎ partea exterioarǎ a scoarței de mesteacǎn.
Ȋn mod alternativ, bucățile interioare și bucățile exterioare de coaja de mesteacǎn pot fi
separate prin utilizarea unui clasificator de aer , acesta fiind un dispozitiv care fun cționează
pe principiul proprietăților diferite ale celor două componente (de exemplu coaja de
mesteacăn interioară și exterioară) într -un curent de aer pentru a efectua o separare fizică.
În mod tipic, coaja mai puțin densă exterioară se deplasează pe o d istanță mai mare în fluxul
de aer decât coaja interioară mai densă. Coaja interioară, împreună cu alte materiale, cade
rapid din curentul de aer. Ca rezultat, coaja de mesteacăn interioarǎ și coaja de mesteacăn
exterioară pot fi separate. Cu cât sunt mai m ici bucățile de coajă de mesteacăn, cu atât va fi
mai eficientă extracția. Pent ru o fragmentare mai eficientǎ se recoma ndǎ uscarea coajei de
mesteacǎn [9].
Aceastǎ metodǎ utilizată pentru a extrage acidul betulinic din coaja de mesteacăn, nu
afecteazǎ alți compuși care rămân în coaja de mesteacăn.
Solvenții cei mai utilizați în extracția cu fluid supercritic sunt: dioxid de carbon, Xe,
Freon -23, etan, N 2O, SF 6 și co-solvenți.

20
Schema procesului de extracție al principiilor active din sco arța de m esteacǎn este
prezenta tǎ ȋn Figura 3. Coaja de mesteacăn este introdusǎ într -un rezervor de alimentare (1)
prin capacul deschis de pe partea superioară. Coaja de mesteacăn este încălzită la o presiune
ridicată într -un solvent care conține dioxid de carbon, dupǎ care soluția este transferată într –
un rezervor de produs (2). Produsul extras este îndepărtat și solventul care conține dioxid
de carbon trece printr -un condensator (3) și apoi este reciclat în rezervorul de al imentare (1)
printr -un reciclator (4).

Figura 3. Procesul de extracție cu fluid superctitic al principiilor active din coaja de
mesteacǎn

Dioxidul de carbon este o componentă majoră a atmosferei și, prin urmare, este relativ
sigur și abundent.
În comparație cu majoritatea altor solvenți, dioxidul de carbon este ecologic, deoarece
nu va afecta atmosfera. În plus, dioxidul de carbon este neinflamabil. Mai mult, dioxidul de
carbon nu lasă nici un rezid substanțial sau o rămășiță la evaporare.
Acidul betulinic poate fi separat și purificat prin formarea specifică a sărurilor
aluminoase nesolubile ale acidului betulinic cu alcoolații de aluminiu.
Un alcoolat de aluminiu adecvat este izopropoxidul de aluminiu, dar pot fi utilizați și al ți
alcoolați sau rășini schimbătoare de ioni pentru purificarea acidului betulinic.

21
Purificarea acidului betulinic: produs rezultat ȋn urma extragerii cu dioxid de carbon a
fost fiert cu etanol și s -a adăug at izopropoxid de aluminiu . Amestecul rezu ltat a fost filtrat
fierbinte ș i filtratul a fost răcit la 0° C timp de 3 ore. Cristalele s -au format ȋn soluție și s -au
filtrat pentru a se obține bet ulinol (puritate mai mare de 90%, randament 3% din coaja
uscată).
Solidele obținute prin filtrarea f ierbinte au fost combinate, spălate cu etanol fierbinte,
acidulate cu HCI 2%, filtrate, spălate cu hexan, spălate cu hexan -eter și hidrolizate cu
hidroxid de sodiu 5% în etanol pentru a se obține acid betulinic ( puritate mai mare de 95%).

3.2. Extracția cu solvenț i organici a acidului betulinic din frunzele
de Callistemon linearis și analiza spectrofotometricǎ
Callistemon linearis (Figura 4), numit și arborele de ceai, este un arbust ȋnalt originar
din Austral ia. Ȋn fitoterapie sunt utilizat e doar fr unzele și ramurile tinere. Frunzele conțin
urmǎtoarele principii active: terpineol, cineol, pinen, terpinen. Acidul betulinic a fost izolat
ȋn randament bun din frunzele de Callistemon linearis , utilizȃnd ca metodǎ CSS
(cromatografia ȋn strat subțire) [11].

Figura 4. Callistemon linearis

Frunzele proaspete de Callistemon linearis au fost colectate de la Chittagong. Frunzele
plantei au fost mǎcerate și usca te la aer timp de câteva zile. Du pǎ care au fost uscate în
cuptor timp de 24 ore la 40 ° C. Frunzele uscate au fost apoi mǎrunțite [10].
Principiile active din frunzele de Callistemon linear is au fost separate și identificate prin
CSS (cromatografie ȋn strat subțire) , respectiv prin cromatografia p e coloanǎ, utilizȃnd o
coloana de sephadex. Eluentul utilizat a fost toluenul, acetatul de etilil 85 – 15 %.

22
Ȋn urma analizei au fost determinați 2 compuși: compusul 1 a fost identificat ca acid
betulinic ( Figura 5. a.) și compusul 2 a fost identificat ca fiind alt acid ( Figura 5. b.).

Figura 5. a. Compus 1 și b. Compus 2

3.3. Separarea și determinarea principiilor active din extractele
vegetale din Eugenia florida prin metoda HPLC și GC / FID
Acidul betulinic este un triterpenoid cunoscut izolat din diferite organe și specii de
plante, inclusiv Eugenia florida . Acest metabolit prezintă o activitate inhibitoare asupra
creșterii celulelor melanomului uman și replicarea virusului SIDA [7].
Acidul betulinic are și proprietăți antibacteriene și inhibă creșterea coloniilor de
Escherichia coli și Staphylococcus aureus .
Cercetarea este necesară pentru a identifica noi surse naturale, care produc cantități mari
de substanță ușor re generabile d in plante (frunze) , dezvoltarea de metode cromatografice ,
studii rapide pentru a identifica cele mai bune luni de izolare a principiilor active .
Pentru c ăutarea unor noi surse de metaboliți bio activi din plante braziliene, au fost
investigat e frunzele de Eugenia florida . Această specie aparține familiei Myrtaceae .
Compuși precum flavonoidele, triterpenii, taninurile și în special uleiurile esențiale
constituite din monoterpene și sesquiterpene au fost deja izolate din genul Eugenia . Speciile
acestei fam ilii sunt larg răspândite în pădurile braziliene, o mare parte fiind cunoscută pentru
fructele comestibile, lemnul, uleiurile esențiale sau scopurile ornamentale. Cele mai
importante genuri ale acestei familii sunt: Melaleuca, Eucalyptus, Psidium și Eugeni a [14].
Mai mulți factori care pot coordona sau modifica rata de producție a metaboliților
secundari, factorii genetici, mediul fizic, met oda de colectare (data, ora ), condițiile de uscare
și transport, depozitarea, pH -ul solului, condițiile de creștere, partea de plante utilizată,

23
interacțiunile dintre plante, prezența microorganismelor, pot afecta în mod direct
concentrația componentelor chimice ale fiecărei specii [7, 14] .
Variația sezonieră (colectarea plantelor în diferite perioade sau sezoane) este un factor
foarte important în procentajul și producția de metaboliți secundari. Datorită importanței
sale, este necesar un studiu al sezonalității, atunci când se lucrează cu plante medicinale.
Această lucrare a re ca obiectiv principal elaborarea unui protocol pentru cuantificarea
principiilor active prezent e în frunzele Eugenia florida , utilizând tehnicile cromatografice
GC / FID și HPLC.
Material vegetal
Frunzele sănătoase de la Eugenia florida au fost colectate în decurs de 12 luni din
campusul Fundației Oswaldo Cruz, statul Rio de Janeiro.
Extracția acidului betulinic
Frunzele de Eugenia florida au fost uscate la 40°C, măcinate și supuse extracți ei cu
etanol. Extractul diluat a fost îndepărtat sub presiune redusă. O parte din extractul de
metanol a fost dizolvată în metanol și recristalizată utilizând amestecuri de CHCl 3 și MeOH.
Prin recristalizare s -a obținu t un cristal alb (EF -1). EF-1 a fost analizat prin RMN.
După calibrarea cu standardul acidului betulinic, au fost analizate extractele lunare din
frunzele de Eugenia florida. Extractele respective au fost analizate în triplicat și s -au
calculat zonele medii corespunzătoare a cidului betulinic. Din aceste zone medii, compoziția
procentuală a acidului betulinic din extract a fost calculată folosind ecuația liniară generată
în timpul calibrării acidului betulinic efectuată prin HPLC -UV și GC -FID [14].
Cuantificarea acidului betul inic prezent în extractele de etanol din frunzele de Eugenia
florida determinate prin GC -FID și HPLC -UV la 210nm .
S-a constatat că acidul betulinic a fost prezent în toate extractele analizate, cu randamente
mult mai mari decât cele găsite în literatu ră.
Nivelul acidului betulinic în frunzele Eugenia florida a crescut semnificativ în perioada
mai, iunie, iulie (toamna -iarnă) și septembrie, octombrie și noiembrie (iarna), datorată în
principal acumulării acestui compus în țesuturile vegetale. Unii autori afirmǎ cǎ triterpenii
pentaciclici, la fel ca betulinolul, acidul ursolic, acidul, β -amirina și lupeolul, ar trebui să fie
toxici pentru insecte, datorită capacității lor de a inhiba ambalarea lanțurilor acilice în
straturile bilaterale lipidice ale membranelor insectelor.

24

Tabel ul nr. 1. Cuantificarea acidului betulinic
Lunǎ (an) CG-FID (%) HPLC (%)
August (2009) 7.43 8.01
Septembrie (2009) 16.83 8.57
Octomb rie (2009) 26.27 11.18
Noiembrie (2009) 17.97 8.36
Decembrie (2009) 8.24 4.83
Ianuarie (2010) 6.90 2.79
Februarie (2010) 7.92 5.12
Martie (2010) 23.03 6.12
Aprilie (2010) 9.68 6.31
Mai (2010) 14.85 9.16
Iunie (2010) 19.33 9.99
Iulie (2010) 15.23 5.62

Aceste fluctuații observate în lunile descrise în Tabelul nr. 1 pot fi legate de ecologia
chimică a plantei Eugenia florida , de exemplu, atracția polenizatorilor sau fenologia
reproductivă a speciilor.
Este posibil ca aceas tǎ concentrație crescută de acid betulinic în luna martie să se datoreze
cantității mari de precipitații caracteristice statului Rio de Janeiro. Cu toate acestea, sunt
necesare mai multe cercetări pentru a determina dacă alți factori pot influența concentrația
acestui metabolit, să se verifice dacă aceas tǎ plant ǎ ȋn alte regiuni are același comportament
sau este diferit și să examineze dacă efectul solventului poate afecta creșterea concentrației
acestui metabolit.

25
3.4. Evaluarea conținutului de Betulin ol și Acid Betulinic în coajă de
mesteacăn din diferite zone forestiere ale Carpaților Occidentali
România este o țară bogată având în vedere varietatea pădurilor de meste acǎn. La acestea
se regăsesc patru specii principale ( Betula pendula Roth., Betula pubescens Ehrh., Betula
humilis Schrank și Betula nana L .), în Carpații Occidentali cel mai rǎspȃ ndit fiind Betula
pendula Roth . Mestea cǎnul se caracterizează printr -o amplitudine ecologică ridicată, care
se dezvoltă fără condiții speciale. Prin forma sa unică și aspectul alb al scoarței, prin
frunzișul deosebit, poate fi și un copac decorativ [2].
Lemnul de meste acǎn are proprietăți tari, utilizate în general pentru tâmplărie sau chiar
pentru industria acvatică. Este o sursă bună de metanol, oțet, cărbune și scoarța bo gată în
tanin care a fost folosită în principal pentru a obține hidrocarbu ri grele și uleiuri lubrifiante.
Uleiul extras este utilizat drept combustibil pentru iluminat (în special în nordul Europei).
Coaja de mesteacăn este formată dintr -o epidermă s uberoasă albă cu straturi multiple
care se exfoliază în folii înguste. Aproape jumătate din acesta conține un fel de rășină care
conține betuline . Frunzele conțin substanțe importante , inclusiv flavonoid ele, care pot fi
valorificate pentru diferite produse . Coaja de mesteacăn este, de asemenea, cun oscută ca un
agent antipiretic , care conține 4 -5% tanini și uleiur i esențiale.
Acidul betulinic este un compus biologic minor, dar cu o eficacitate ridicată în tratarea
diferitelor boli. Interesul pentru acidul betulin ic a crescut recent, deoarece anumiți derivați
din această compoziție sunt co nsiderați a fi potențial i agenți împotriva cancerului tumoral ,
precum și în terapia cronică cu hepatită [5].
Coaja de mesteacăn conține triterpene pen taciclice, în principal betulinol (BE, până la
34%), dar și acid betulinic (BA), acid oleanolic (OA), lupeol (LU) și eritrodiol (ER).
Pentru corelarea conținutului de betulin și acizi betulinici din probe, au fost înregistrate
condițiile geografice și de vegetație în locațiile specifice ale fiecărui tip de probă. Au fost
colectate mostre de coaja de vârste similare, din diferite zone montane din Carpații
Occidentali [13].
Au fost colectate două grupe de probe de coajă de copac:
– un grup (eșantioane 1 până la 5 ) din suprafețele de pășunat în care arborii de mesteacăn au
apărut spontan ( Figura 6.). Arborii au fost situați în zonele înalte de deal și pre -munte,
situate la 46 ° 65 'latitudine nordică, 23 ° 03' longitudine estică și la o altitudine cuprinsă
între 9 00 m și 1050 m altitudine, cu expoziție însorită și pante diferite .

26
– un alt grup (eșantioane 6 -10) di n pădurile copacilor combinați ( Figura 7.). A fost colectat
de la mesteceni găsiți în bazinul "Valea Ierii", situat la 46 ° 65 'latitudine nordică, 23 ° 35'
longitudine estică și altitudine medie 1000 m asl cu condiții similare, dar cu pante diferite
din zona (nr.7, 8 și 9) sau în afara pădurilor (nr.6 și 10)

Figura 6. Poziția geografică a locurilor de recoltare pentru probele 1 -5

Figura 7. Detalii privind suprafețele cu mesteacǎ n de unde au fost recoltate probele 6 -10
(regiunea Bondureasa)

Caracterizarea zonelor specifice din unitatea de producție Bondureasa IV
1. versant inferior, sol frământat, expoziție sudică, altitudine 980 m și unghi pantă 38 grade.
Floarea indicativă: Asperula -Oxalis. Birchii sunt difuzați în zonele goale dintre pădurile de
pin (P) și fag (B) (rapoarte de 8P + 2B) cu o consistență medie de 0,5.

27
2. Partea mijlocie, solul frământat, expoziția de Nord, altitudinea 1210 m și unghiul pantă
de 40 grade. Floarea indicativă: Vaccinium. Birchii (Bi) sunt difuzați în pădurile de molid
(S) (compoziția 6S + 4 Bi) cu o consistență de 0,3.
3. versantul inferior, solul înfășurat, expoziția nord -vestică, altitudinea 920 m și ung hiul
pantă de 20 grade. Floarea indicativă: Asperula -Dentaria. Birchii sunt difuzați în zonele
goale dintre pădurile de pin (P) și fag (B) (rapoarte de 8P + 2B) cu o consistență medie de
0,6.
4. Partea mijlocie, solul înfășurat, expoziția de Vest, altitudi nea 960 m și panta angei de 25
de grade. Floarea indicativă: Asperula -Dentaria. Birchii (Bi) sunt răspândiți în păduri de
molid (S) (compoziția 10S) cu o consistență medie de 0,7.
5. versantul inferior, solul frământat, expoziția de Sud, altitudinea 980 m și unghiul pantă
de 38 grade. Floarea indicativă: Asperula -Oxalis. Birchii sunt difuzați în zonele goale dintre
pădurile de pin (P) și fag (B) (rapoarte de 4P + 1B) cu o consistență medie de 0,6.
Ȋn Figura 8 este prezenta tǎ cromatograma HPLC -UV a unui amestec de 2 standarde pure
de acid betulinic și betulin ol, 0,02 mg / ml și, respectiv, 0,05 mg / ml. Timpii de retenție: tR
= 4,45 min pentru BA și tR = 5,02 min pentru B. Detectarea a fost stabilită la 210 nm pe g
de coajă, în timp ce betuli nolul a avut valori medii de 10,60 ± 0,97 mg / g coajă .
Betulinul și acidul betulinic au fost extrase din scoarță de mesteacăn și analizate utilizând
cromatografia lichidelor de înaltă performanță cu detecția ultravioletă (HPLC -UV).
Din fiecare probă de coaj ă au fost folosite alicote de 0,5 g în triplicat, care au fost
amestecate cu 10 ml metanol 95% și omogenizate la sonicare timp de 15 min.
După 30 de minute, extractul a fost filtrat prin hârtie și membrană .
Proba filtrată a fost injectată în coloană HPLC a unui dispozitiv HPLC Agilent 1200 cu
detecție UV, aplicând o fază mobilă izocratică constând din acetonitril.
Temperatura de funcționare la 25 ° C și detectarea la 210 nm au fost stabilite ca fiin d
optime.
Pentru a identifica betulinolul (B) și acidul betulinic (BA), un amestec de standarde pure
a fost separat după o optimizare anterioară a protocolului de separare stabilit în laborator.
Solventul de extracție a fost ales ca etanol 95%. R ezultatele au arătat că tot triterpenoidul
bioactiv din coaja de mesteacăn alb a fost dependent în mod semnificativ de locație (Tabelul
nr. 2) .

28

Figura 8. Cromatograma HPLC -UV a unui amestec de două standarde pure de acid
betulinic (BA) și betulin ol (B)

Tabel ul nr. 2. Valorile medii ale concentrațiilor de acid betulinic (BA) și betulin ol (B)
Nr.
Crt. Regiunea de
recoltare Acid betulinic
(X ± SD) (mg/g) Betulin ol
(X ± SD)
(mg/g) Procentaj
(BA / B ×
100)
1. Belis 11.64 ± 1.23 165.60 ± 14.23 7.00
2. Rasca 14.68 ± 1.50 126.91 ± 11.56 11.56
3. Dangau 12.31 ± 1.07 109.14 ± 10.03 11.27
4. Marieșel 11.15 ± 1.11 130.81 ± 12.78 8.52
5. Pȃrȃul Porcului 14.15 ± 1.39 101.82 ± 14.23 13.89
Valoarea medie
(1-5) 12.78 ± 1.26 126.85 ± 12.56 10.44
6. PU* IV ua 129
A 11.80 ± 1.11 81.99 ± 7.83 14.39
7. PU IV ua 3 B 7.34 ± 0.73 57.44 ± 5.02 12.77
8. PU IV ua 30 A 9.76 ± 0.88 86.17 ± 8.62 11.32
9. PU IV ua 26 A 8.60 ± 0.75 77.98 ± 7.83 11.02
10. PU IV ua 25 A 15.44 ± 1.39 145.63 ± 12.86 10.60
Valoarea medie
(6-10) 10.60 ± 0.97 89.84 ± 8.43 12.02

29

3.5. Izolarea acidului betulinic din Vitex Negundo L . prin metoda HPLC
Vitex negundo , ȋn medicina tradiționalǎ indianǎ, a fost utilizat pentru tratarea diferitelor
boli.
A fost elaborată o metodă HPLC (cromatografie lichidǎ de înaltă performanță ) simplă,
sensibilă și precisă pentru analiza probelor de Vitex negundo L .
Extracția a fost verificată utilizând diferiți solvenți cum ar fi metanol, cloroform, etanol
95%, acetonă și diclormetan. S -a găsit că, cloroformul a fost un solvent bun de extracție
care a permis extracția acidului betulinic cu cel mai mare conținut. Metoda implică coloana
RP C18 cu metanol -acetonitril -apă (90: 5: 5% v / v / v) pH 2,5 ajustată cu aci d orto fosforic
ca fază mobilă și detecție UV la 270 nm [12].
Extracția și prepararea soluțiilor de probă: frunze le și semințe le de Vitex negundo au fost
extrase cu cloroform (20 ml x 3). Se combină toate extractele de cloroform și se evaporă la
sec în bai a de apă pentru a obține rezidu l. De asemenea, pulbere le de frunze au fost extrase
cu metanol, cu 95% etanol, cu acetonă și cu diclormetan (20 ml x 3). Se combină toate
extractele, se evaporă la sec în ba ia de apă pentru a obține rezidul. Rezidu rile tuturor
probelor au fost dizolvate în 10 ml de metanol. Soluțiile obținute s -au filtrat prin filtru
Whatmann înainte de analiza HPLC. Toate soluțiile de testat s -au diluat în continuare
utilizând metanol [12].

Tabel ul nr. 3 . Acidul betulinic obținut ȋn urma extracției cu diferiți solvenți
Solventul de extracție BA % w/w
Cloroform 0.060
Metanol 0.058
Etanol 95% 0.027
Acetonǎ 0.025
Diclormetan 0.015

S-au observat variații semnificative ale conținutului de acid betulinic și triterpenoide
totale în frunzele Vitex negundo cu solvenți de extracție diferiți (Tabelul nr. 3) .

30

Capitolul 4. Acțiunea terapeuticǎ a acidului betulinic

4.1. Apoptoza indusă de acidul betulinic în celulele leucemice
În celulele tumorale neuroectodermice, acidul betulinic activează mitocondriile care
apoi eliberează citocromul c. Formarea ulterioara a apoptozei conduce la activarea
caspazelor și fragmentǎrii nucleare. Formarea speciilor reactive de oxigen, neosinteza
proteinei și topoizomerazele I și II sunt implicate în inducerea apoptozei, dar acidul betulinic
semnalează apoptoza independent de receptorii p53 și receptorul morții [7].
Celulele primare de leucemi e acută au fost obținute la diagnosticul inițial sau la recădere
înainte de tratamentul antitumoral prin puncție de măduvă osoasă de la 47 de copii [15].
Acidul betulinic s -a dizolvat în DMSO(Dimetil sulfoxid) (4 mg / ml) la 37 ° C.
Stimularea completă cu toți 11 stimuli a fost efectuată pe 25 de probe, care au fost
utilizate pentru compararea acidului betulinic cu medicamente citotoxice. În eșantioanele
rămase, testarea a fost incompletă din cauza volumului mic de eșantion.
Celulele tumor ale primare de la 40 de copii cu leucemie acută netratată au fost testate
pentru apoptoza indusă de acidul betulinic in vitro. 10 mg / ml de acid betulinic a provocat
apoptoza specifică de cel puțin 10% în 65% (26/40) de probe și mai mult de 50% apoptoză
specifică în 30% (12/40) (Tabelul nr.4 ).
În două probe primare, 3 mg / ml acid betulinic au fost suficiente pentru a induce
apoptoză specifică mai mare de 50%. Apoptoza a fost independentă de vârsta, sexul si tipul
de leucemie.
Când acidul be tulinic a fost aplicat pe liniile de celule leucemice, celulele leucemice T
de tip JURKAT au suferit o apoptoză rapidă dependentă de doză și de timp, rezultând 75%
celule moarte în decurs de 6 ore cu 10 mg / ml acid betulinic.
Într-o probă de celule c-ALL la prima recădere, 9/10 medicamente citotoxice nu au putut
induce nici o moarte celulară, în timp ce acidul betulinic a indus o apoptoză specifică de
93% (Tabelul nr. 4 ).

31

Tabelul nr. 4. Supraviețuirea probelor după trata mentul cu acid betulinic sau cu medicamente
# Age Gender Type State of disease BA AraC Asp Cyclo Dexa Doxo MTX Pred 6-TG VCR VP-
16
2 8 m c-ALL 1st relapse 7 100 100 100 100 27 100 100 100 100 100
7 1 m Pre-B-ALL Diagnosis 29 87 92 93 100 64 96 96 91 96 66
19 13 f AML 2nd relapse 45 85 84 91 86 63 99 87 97 92 94
12 3 f c-ALL Diagnosis 45 100 95 100 100 37 98 100 73 98 91
6 2 f c-ALL Diagnosis 46 98 100 68 100 27 100 86 100 100 84
16 2 f c-ALL Diagnosis 48 98 100 100 100 94 100 100 100 100 82
9 3 m c-ALL Diagnosis 50 94 94 100 90 72 100 90 96 88 97
18 1 m AML 1st relapse 51 90 71 91 100 64 100 100 100 100 53
15 15 m T-ALL Diagnosis 53 100 91 53 21 9 100 29 74 99 12
14 2 f c-ALL Diagnosis 56 100 100 100 100 78 100 100 100 100 90
5 3 m pre-B-ALL Diagnosis 57 100 100 94 82 54 100 76 100 100 66
11 2 f c-ALL Diagnosis 60 95 88 96 78 91 99 86 100 97 84
24 9 f c-ALL 1st relapse 78 100 96 100 95 96 100 83 100 100 100
17 2 f c-ALL Diagnosis 85 94 92 95 95 92 100 100 98 100 100
31 7 m AML Diagnosis 92 98 87 96 93 39 100 100 91 100 89
27 4 m pre-B-ALL Diagnosis 95 96 100 51 71 24 100 71 96 53 75
25 2 f c-ALL Diagnosis 100 98 83 87 86 78 100 85 100 94 86
40 6 m c-ALL 1st relapse 100 95 86 96 92 50 97 95 90 98 60
30 5 m c-ALL Diagnosis 100 100 89 100 100 79 100 100 100 100 79
37 11 m c-ALL Diagnosis 100 100 100 100 94 100 100 91 100 100 100
39 9 m pre-B-ALL Diagnosis 100 100 95 97 97 90 99 96 98 92 100
38 1 m pre-B-ALL Diagnosis 100 100 95 100 61 9 99 52 100 100 13
36 4 m T-ALL Diagnosis 100 100 100 96 40 51 100 43 100 100 93
34 15 f pre-B-ALL Diagnosis 100 85 93 58 70 93 95 74 90 97 84
35 1 m pre-B-ALL Diagnosis 100 100 77 74 54 37 100 47 100 96 48

Pentru a testa rezistențele acidului betulinic și al medicamentelor citotoxice, s -au stabilit
liniile celulare JURKAT și CEM rezistente la medi camente. Celulele leucemice de tip T au
fost incubate cu concentrații crescute de dexametazonă, doxorubicină, metot rexat sau
vincristină timp de 12 luni, astfel încât celulele derivate au rezistat până la concentrația de
100 de ori mai mare decât cea a celulelor parentale (Figura 9 a). În concordanță cu
rezultatele anterioare, 4 apoptoze induse de acidul betulinic nu diferă în liniile de celule
parentale și derivate în afară de celulele JURKAT rezistente la metotrexat, care au prezentat
o sensibilitate se mnificativ mai mare față de apoptoza indusă de BA (Figura 9 b și c). În
probele primare, inducerea apoptozei de către acidul betulinic nu s-a corelat cu inducerea
apoptozei cu doxorubicină (Figura 9 d) sau cu orice alt medicament testat citotoxic .

32

Figura 9. Lipsa rezistențelor încrucișate între BA și medicamentele citotoxice

4.2. Efectele acidului betulinic singur și în combinație cu iradierea în
celulele melanomului uman
Recent, acidul betulinic a fost identificat ca un inhibitor foarte selectiv al creșterii
melanomului uman și sa raportat că induce apoptoza în aceste celule [5].
S-a investigat proprietățile inhibitoare a acestui compus singur și în combinație cu
radiațiile ionizante într -un panou de linii celulare de melanom umane precum și în
melanocite umane normale [16].
Acidul betulinic a suprimat puternic și în mod consecve nt capacitatea de creștere și de
formare a coloniilor tuturor liniilor celulare de melanom uman investigate.
Acțiunea inhibitoare a acidului betulinic a fost mai pronunțată în liniile celulare de
melanom uman decât în melanocitele umane normale .
În mod deosebit, în ciuda inducerii apoptozei, analiza expresiei Bcl -2 în celulele tratate
cu acid betulinic a evidențiat faptul că expresia proteinei anti -apoptotice Mcl -1 a fost indusă.
Deși pacienții cu melanom malign au un prognostic excelent atun ci când sunt tratați într –
o fază incipientă, gestionarea melanomului avansat este încă o problemă majoră care nu este
rezolvată în mod satisfăcător de regimurile de tratament curente, cum ar fi chimioterapia și
/ sau imunoterapia [5, 16] .

33
Efectul radi oterapiei poate fi sporit, totuși, în combinație cu substanțe care acționează ca
modificatori de răspuns sau radiosensibilizatori. În melanomul uman, de exemplu, o
combinație de radioterapie cu hipertermie s -a dovedit a fi benefică.
Observarea faptulu i că acidul betulinic este o substanță foarte selectivă împotriva
celulelor melanomului uman in vitro și într -un model de șoarece ne -a determinat să
investigăm efectele acidului betulinic în monoterapie și în combinație cu radioterapia într –
un grup de mela nom uman. Acidul betulinic și derivații săi inhibă, de asemenea, intrarea de
tip 1 al virusului imunodeficienței umane, probabil du pă o etapă de legare ulterioară. În plus
față de activitatea sa împotriva celulelor melanomului uman, acidul betulinic inhibă
creșterea celulelor tumorale neuroectodermice, unde are potențialul de a induce apoptoza.
Este interesant de remarcat în acest context că atât celulele neuroectodermale cât și
melanocitele sunt derivate din creasta neurală.
Au fost obținute melanoci te epidermice umane normale (adulți și neonatali) de la
Clonetics Corporation (CellSystems Biotechnologie, Germania). Celulele au fost cultivate
în mediu de creștere a melanocitelor (MGM -2, fără ser) conținând 12 -miristat -13-acetat de
forbol (10 pg per ml) , hidrocortizon (0,5 pg per ml) factorul de creștere B (1 pg per ml) și
gentamicin sulfat și amfotericin -B (ambele la 50 pg / ml) suplimentat cu extract de
hipofizare bovin.
Linile celulare de melanom uman MES20 și MES21 au fost generate din metastaz e
melanomice și caracterizate în laboratorul. Liniile celulare Neo II -tr și Neo -IV-tr au fost
stabilite din melanocite normale primare neonatale umane. Liniile de celule melanom
utilizate pentru acest studiu, precum și linia celulară Neo -II / IV -tr au fost menținute în
mediu Eagle modificat de Dulbecco (4500 mg glucoză pe litru) suplimentat cu ser 10% fetal
bovin.
Analiza de legare a anexinei V
Celulele au fost recoltate prin tripsină -EDTA, spălate în soluție salină tamponată cu
fosfat (PBS) și ajustat e în tampon de legare la calciu la o densitate celulară de 1,5 x 106
celule pe ml. Celulele au fost incubate timp de 10 minute cu Annexin V -FITC și iodură de
propidiu (concentrații finale 1 pg / ml), spălate în PBS și plasate pe diapozitive de sticlă
pentr u analiza prin microscopie fluorescentă.

34
Testări clonogene
În experimentele de supraviețuire clonogenică, celulele subconfluente au fost tratate cu
acid betulinic și apoi iradiate. Celulele au fost tripsinizate și placate după diluarea adecvată
pe plăci de cultură de 5 cm. Între 200 și 2000 de celule s -au însămânțat pentru a obține între
100 și 300 de colonii separate per vas. După 8 -12 zile plăcile de cultură au fost spălate,
fixate în etanol 95% și colorate cu violet de cristal 0,1%. Coloniile ca re conțin mai mult de
50 de celule au fost înregistrate ca supraviețuitori clonogenici. Experimentele de formare a
coloniilor au fost realizate de trei ori cu fiecare linie celulară și pentru fiecare tip de
tratament. Celulele au fost iradiate cu o sursă c onvențională de radiații cu raze X de 250 kV
generată de o mașină Stabilipan .
Rezultate
Următoarele experimente au fost efectuate pentru a evalua răspunsul celulelor
melanomului la acidul betulinic singur sau în combinație cu iradierea. În plus față de liniile
celulare de melanom, am investigat, de asemenea, efectele acidului betulinic asupra
melanocitelor umane normale în timpul pasajelor timpurii, precum și asupra liniilor de
celule permanente generate direct din melanocite umane normale (linii celula re Neo -II-tr și
Neo-IV-tr) .
Au fost comparat e inițial curbele clonogene de supraviețuire a patru linii celulare de
melanom diferite (ME20, ME21, 518A2 și A375) după tratamentul cu acid betulinic singur
sau în combinație cu iradierea ( Figura 10 A). Concentrațiile de acid betulinic au fost
cuprinse între 1 și 5 μg pe ml. Fracțiunea supraviețuitoare obținută după tratamentul
celulelor cu acid betulinic singur a fost înmulțită cu fracția supraviețuită măsurată obținută
după iradierea celulelor cu o doză de 2 Gy. Prin urmare, acest produs reprezintă
supraviețuirea așteptată dacă cele două tratamente sunt independente una de cealaltă și
contribuie la supraviețuire într -o manieră pur adi tivă. Barele eclozate din Figura 10 (B))
reprezintă această cantitate c alculată de inhibare a creșterii. Analiza acestor date a arătat că
acidul betulinic și iradierea au un efect aditiv asupra inhibării capacității de formare a
coloniilor. Efectul acidului betulinic în combinație cu iradierea a fost, de asemenea,
investigat în ceea ce privește momentul administrării în trei linii celulare de melanom
(MES20, 518A2, A375). Momentul adiției acidului betulinic în combinație cu iradierea nu
a avut un impact major asupra rezultatelor testelor de formare a coloniilor, indicând în pl us
că cele două tratamente funcționea ză independent unul de celălalt .

35

Figura 10. Efectul acidului betulinic și al radioterapiei asupra supraviețuirii

Figura 11. Influența momentului expunerii la acid betulinic asupra supraviețuirii

În concluzie, datele obținute sugerează că acidul betulinic ar putea fi util în tratamentul
pacienților care suferă de melanom.

36
Această ipoteză se bazează pe următoarele observații. Acidul betulinic a inhibat în mod
constant creșterea tuturor l iniilor celulare de melanom testate. Efectul acidului betulinic
asupra liniilor de celule melanomice este, de asemenea, mai puternic decât efectul inhibitor
al creșterii acidului betulinic asupra melanocitelor primare. Efectele acidului betulinic în
combin ație cu iradierea asupra supraviețuirii sunt în mod clar aditive, măsurate prin testul
de formare a coloniilor [16]. Dacă căile morții celulare ale acestor două tratamente se
suprapun, atunci ne -am putea aștepta ca acestea să interfereze unele cu altele, ducând
eventual la efecte neadditive. Toate datele noastre raportate aici indică faptul că acidul
betulinic și iradierea diferă cel mai probabil în modul lor de acțiune, în concordanță cu
modul pur aditiv de inhibare a creșterii.

4.3. Apoptoza indusa de a cidul betulinic ȋn celulele cancerului de colon
Studiile anterioare arată că acidul betulinic (BA) induce o degradare dependentă de
proteazomă, a factorilor de transcripție Sp1, Sp3 și Sp4 în celulele cancerului de prostată și
acest studiu s -a concent rat asupra mecanismului de acțiune al acidului betulinic în celulele
cancerului de colon [25].
Cancerul colorectal este o cauză principală de deces în majoritatea țărilor dezvoltate,
inclusiv în Statele Unite, iar în 2010 se estimează că au fost peste 102 700 de cazuri noi de
cancer de colon și 51 370 de decese.
Liniile celulare de cancer de colon RKO și SW480 au fost obținute de la Centrul de
Cancer M.D. Anderson (Houston, TX) .
Proliferarea celulelor și testele de progresie ale ciclului celular
Celulele de cancer de colon RKO și SW480 (2 x 104 pe godeu) au fost placate în plăci
cu 12 godeuri și lăsate să se atașeze timp de 24 de ore. Mediul a fost apoi schimbat în mediu
F-12 DMEM / Ham conținând FBS de 2,5% carbon și a fost adăugat dimetil su lfoxid
(DM SO)] .
Celulele au fost apoi tripsinizate și numărate după 48 și 96 de ore folosind un numărător
de celule Coulter Z1.
Celulele RKO și SW480 au fost tratate cu vehicul (DMSO) sau BA timp de 24 de ore.
Celulele au fost tripsinizate, centrifugate și resuspendate în soluție de colorare care
conține 50 ug / ml iodură de propidiu, 4 mmol / l citrat d e sodiu și 30 unități / ml RNase .
După ce au fost incubate la temperatura camerei timp de 1 h, celulele au fost analizate .

37
Analiza Northern blot
Pentru analiza miRNA, 20 ug ARN total per canal a fost electroforezat pe g el 15% TBE
uree poliacrilamină , transferat electroforetic în 0,5 x TBE la 300 m Å timp de 45 min la
membrana GeneScreen Plus (PerkinElmer, Boston, MA) legat și hibridizat î n tampon de
hibridizare ULTRAhyb -Oligo (Ambion, Austin, TX) la 42 ° C cu oligonucleotide ADN
marcate cu capăt 32P. Probele au fost spălate la 42 ° C în 2X SSC și 0,5% SDS timp de 30
de minute cu agitare ușoară.
Primerii au fost obținuți din IDT și fol osiți pentru amplificare au fost după cum urmează:
ZBTB10 (sens 5' -GCT GGA TAG TAG TTA TGT TGC -3; antisens 5' -CTG AGT GGT
TTG ATG GAC AGA G -3 ').
Studiile de xenogrefă la șoareci
Șoarecii feminini au fost achiziționați de la Harlan Laboratories (Indi anapolis, IN).
Pentru a produce tumori, celulele RKO (5 x 106; ≥ 90% viabile) au fost injectate subcutanat
șoarecilor . Tumorile au fost lăsate să crească timp de 6 zile până când au fost palpabile, iar
șoarecii au fost apoi randomizați în două grupe (6 șoa reci / grup) și administra te prin gavaj
oral ulei de porumb sau BA (25 mg / kg / zi) la fiecare două zile timp de 22 de zile.
Șoarecii au fost cântăriți și mărimea tumorii a fost măsurată la fiecare a doua zi pentru a
permite calcularea volumelor tumorilor: V = LW2 / 2, unde L și W au fost lungimea și,
respectiv, lățimea. După tratamentul BA, animalele au fost sacrificate; s -au determinat
greutățile corporale finale ale corpului și tumorii și s -au colectat organele viscerale majore
și s-au utilizat lizatele pentru analiza Western blot a proteinelor Sp [25].
Rezultate
BA inhibă creșterea liniilor celulare de cancer multiplu și se demonstrează că BA a
inhibat proliferarea celulelor RKO și SW480 după tratament timp de 48 sau 96 de ore.
Inhibarea cr eșterii a fost observată la concentrații de ≥ 5 μM în ambele linii celulare la cele
două momente de timp. Efectele BA asupra distribuției celulelor în fazele G0 / G1, S și G2
/ M ale ciclului celular au fost dependente de contextul celular. În celulele RKO , BA a redus
dramatic procentul de celule în faza G0 / G1 și S și a crescut procentul în G2 / M, în timp
ce în celulele SW480, a existat o ușoară scădere a fazei G0 / G1 și S și o creștere paralelă a
procentul de celule în G2 / M. Tratamentul celulelor RKO și SW480 cu BA a scazut, de
asem enea, scindarea PARP , care este în concordanță cu inducerea apoptozei în aceste linii
celulare; totuși, după tratamentul celulelor de numai 24 de ore, <10% din celule au fost sub –
G1 în analiza FACS .

38
Ȋn Figura 12 este prezentatǎ inhibarea proliferării celulare. Celulele au fost tratate cu BA
pentru 48 sau 96 de ore și apoi numărate (Progresia c iclului celular în RKO și SW480 ).
Progresia ciclului celular în celulele RKO (B) și SW480 (C). (D) Celulele RKO și SW480
au fos t tratate cu BA timp de 24 de ore și lizatele de celule întregi au fost analizate [25].

Figura 12. Inhibarea proliferării celulare

39

Figura 13. Acidul betulinic (BA) inhibă creșterea tumorii colonului in vivo

Figura 13 prezintǎ inhibarea cre șterii tumorale (A) și a greutăților (B). BA (25 mg / kg /
zi) a fost administrat (oral) la șoareci la fiecare 2 zile . (C) Reglare a nivelului proteinelor
Sp1, Sp3 și Sp4. Rezultatele din (A) – (C) reprezintă mijloace ± SE pentru cel puțin 8 șoareci
în gru pul de control (uleiul de porumb) și grupurile tratate cu BA, și inhibarea semnificativă
(p <0,05) de BA este indicată (*) [25].

4.4. Esteri ai betulin olulu i cu proprietăți terapeutice
Produșii de oxidare ai betulinolului : acid betulinic și acidul betulonic au numeroase
proprietăți farmacologice: activitate antivirală ( incuzând activitatea anti -HIV),
antiinflamatoare, antimalarică, anti –Leichmania, antitumorală. Acțiunea anticanceroasă a
acidului betulinic se datorează perturbării directe a mitocon driilor, prin modularea nivelelor
grupului de proteine Bcl -2 ( B -cell limphoma 2) și prin blocarea factorului nuclear kappa
B. În ceea ce privește acțiunea anti -Leichmania acidul dihidrobetulinic s -a demonstrat ca
produce apoptoza prin inhibarea ADN -topoiz omerazei. Adăugând diferite grupari esterice
la C 28 din structura acidului betulinic, betulinei sau acidului dihidrobetulinic a îmbunătățit
acțiunea anti -Leishmania [27].

40
Triterpenoidele , avănd în general o solubilitate în apă scăzută , au de asemen ea și o slabă
biodisponibilitate a unor componente . Pentru a înbunătăți solubilitatea în apă și
biodisponibilitatea derivaților betulinei se pot face numeroase modificări structurale.
Betulinolul poate fi esterificat la gruparea hidroxil , de la C din poziția 3 la gruparea
hidroxil de la C din poziția 28 . Aceste funcționalități pot fi utilizate la sinteza unor derivați
betulinici mai activi și cu specificitate mai mare [18].
"Bet-CA"- un ester derivat de acid betulinic ș i dicloracetat .
Plecând de la ideea cǎ acidul betulinic este un derivat natural și cǎ are acțiune
antitumorală iar di cloracetatul este capabil sǎ inverseze fenotipul Warburg ( transformarea
glucozei în lactat pentru a alimenta fosforilarea oxidat ivǎ din mitocondrii chiar și ȋn prezența
oxigenului) prin proprietatea de a inhiba piruvat -dehidrogenazei, a fost sintetizat compusul
"Bet-CA"( Figura 14). Prin a lipirea unei molecule de dicloracetat la gruparea hidroxil de la
C3, din structura acidului betulinic , s-a obținut un ester cu solubilitate mult mai mare , care
ulterior în organism va fi scindat sub acțiunea esterazelor la o molecula de acid betulinic și
una de dicloracetat [26, 27] .

Figura 14. Sinteza Bet -CA

Bet-CA s -a obținut prin tratarea acidului betulinic cu clorura acidului dicloracetic ȋn
prezența piridinei și 4-dimetilaminopiridina în diclormetan anhidru. După o amestecare la
temperatura camerei , timp de 18 ore în atmosferă de azot reacția este finalizată ș i dupǎ care
se reduce volumul de reacție ȋn rotavapor. Produșii de reacție obținuți, au fost purificați prin
cromatografie pe coloana folosind plăci cu silicagel, sistemul de solvenți folosit fiind acetat
de etil:eter de petrol ȋn propo rție de 3:7. Formarea Bet -CA, a fost confi rmată prin spectrul
infraroșu c ȃnd gruparea , –OH de la C 3 al acidului betulinic dispare la 3450 cm -1 iar gruparea
C=O apare la 1745 cm -1. Structura Bet -CA a fost confirmată prin ESI -MS (electrospray
ionization – mass spectrometry) având masa moleculară de 589,29 și punctul de topire de
269°C.

41
Ținând cont de acțiunile acidului betulinic (BA) și dicloracetatului (DCA) , s-a presupus
ca Bet -CA va avea o acțiune citotoxica mai bună fiind și mai selectiv. Pentru a demonstra
aceasta s -a testat acțiunea BA, DCA și Bet -CA asupra unor culturi de celule canceroase:
MCF7, MDA -MB-231, MDA -MB-468 (adenocarcinom de sân uman), DU 145 (carcinom
de prostata uman), PC -3 (adenocarcinom de prostată de gradul IV uman), B16 -F10 (cancer
de piele la șoarece), WI -38 (fibroblast de plaman normal) și NIH/3T3 (fi lbroblast embrionic
la șoarece). Celulele canceroase au fost cultivate în DMEM (Dulbecco's Modified Eagle
Medium) sau RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser fetal bovin si 1% penicilina/streptomicina,
în atmosferă cu 5% CO 2 la 37° C. Celulele au fost incubate c u compușii de analizat in
concentrații de la 5 la 70 µm timp de 72 h. Efectele inhibitorii asupra celulelor canceroase
au fost evaluate prin metoda MTT.
Din T abelul nr. 5 se poate observa, c ǎ doza la care Bet -CA a provocat moartea a 50%
din celulele canceroase ( IC 50) este mult mai mică decât a BA, DCA sau amestecul lor 1:1.

Tabel ul nr. 5 . Compararea valorii IC 50 (µm) pentru Bet -CA, BA, DCA și BA+DCA

Pe baza acestor rezultate se consideră că Bet -CA este un potențial candidat ȋ n ceea ce
privește tratamentul celulelor canceroase.
Testele in vivo au fost realizate pe șoareci. S -a lucrat cu șoareci de sex feminin, cu
greutatea cuprinsă între 20 -25 g, un lot martor și un lot testat, fiecare a câte 6 animale; Cu
24 ore înainte de experiment animalele au fost ținute în laborator, alternându -li-se 12 ore de
ȋntuneric cu 12 ore de lumină, au fo st hrăniți cu mâncare standard și apă fără restricții. În
prima zi de studiu animalelor din ambele loturi li s -a injectat subcutana t 106 celule
canceroase B16 -F10 (cancer de piele la șoareci). După 3 zil e lotul testat s -a injectat cu Bet –
CA, BA, DCA SI BA+DCA ȋ n doze de 2,5mg/kg corp, din 3 in 3 zile, iar lotul martor a
fost injectat la aceleași intervale de timp și ȋn aceea și cantit ate cu vehicul de control. În ziua
25 șoarecii din ambele loturi au fost sacrificate, tumorile s -au extirpat, au fost fotografiate
și masurate [Figura 15 A] . Toate tumorile lotului testat au scăzu t ȋn volum în c omparație cu
lotul martor, iar ȋ n ceea ce privește lotul testat s -a observat o regresie semnificativă a

42
tumorilor la șoarecii tratați cu Bet -CA comparativ cu șoarecii trat ați cu ceilalți agenți [Figura
15 B] . Acest lucru evidențiază acțiunea citotoxica superioară a Bet -CA fața de BA sau DCA.

Figura 15. Reducerea tumorilor canceroase și metastazelor pulmonare la șoareci sub
acțiunea Bet -CA, BA, DCA, BA+DCA

Al doilea studiu in vivo, a vizat rolul inhibitor al Bet -CA asupra metastazelor pulmonare
la șoarece provocate de culturile de celule B16 -F10 (cancer de piele la șoarece). S -a lucrat
de asemenea cu un lot martor și unul testat, alcatuite fiecare din câte 6 șoareci de sex
feminin. Toate animalele au fost injectate cu celule B16 -F10. După 3 zile lotului testat i s –
au injectat doze d e 2,5mg/kg corp de Bet -CA, BA, DCA și BA+DCA 1:1 , din 2 in 2 zile
timp de 14 zile, iar lotul martor a primit la același interval de timp și ȋn aceeași cantitate
vehicul de control [Figura 15 C]. Toți șoarecii au fost sacrificați în a 14 zi. Leziunile
pulm onare au fost măsurate și analizate microscopic. După cum s -a anticipat s -a observat
un numar mai mic de leziuni la animalele tratate cu Bet -CA comparativ cu celelalte animale
[Figura 15 D]. În plus, au fost testate efectele toxice ale Bet -CA asupra organe lor utilizând
colorația cu hematoxylină/eozină a unor părți reprezentative din țesuturi. Testele histologice

43
asupra plamânilor, ficatului, splinei și rinichilor au arătat ca Bet -CA nu a prezentat
toxicitate.
Studii au demonstrat nu doar că Bet -CA opre ște răspândirea și dezvoltarea tumorilor
primar e și încetinirea metasta zǎrii, au demonstrat c ǎ Bet-CA nu prezintă acțiune toxică
asupra țesuturilor sanătoase.
Derivați i esterici ai betuli nolului pot fi astfel ȋnscrși pe lista potențialilor ag enți
terapeutici anticancer.
Ceea ce ne desparte ȋnsă de introduce rea ȋn terapeuticǎ, sunt c ercetǎ rile pe subiecț i
umani, cercetări ȋ n cad rul cǎrora derivații de betulinol trebuie sǎ prezinte acțiune potentă și
selectivă fară reacții adverse [19].
Avem astfel dovezi numeroase, să credem că ȋn viitor ul apropiat terapia cancerului va fi
ȋmbunatațită iar această maladie va fi mai ușor de combătut și tratat .

44

PARTEA A II-A. CONTRIBUȚII ORIGINALE
Capitolul 5. Separarea și determinarea acidului betulinic și a
betulinolului din seva de mesteacǎn prin metoda HPLC

5.1. Recoltarea sevei de mesteacǎ n
Seva de mesteacǎn se recolteazǎ primǎvara, cȃnd natura revine la viațǎ.
1. Pe trunchi se face o singurǎ tăietură, oblic -verticală cu o lungime care sǎ nu fie mai
mare de (1/3) din circumferința copacului, sau o tăietură „în V” cȃt mai micǎ, astfel ca
rănirea copacului să fie minimă.
Doar o datǎ pe an se poate e xtrage seva dintr -un mesteacǎn și doar anul urmǎtor se poate
face o nou ǎ tǎieturǎ pe acelaș i copa c. Tǎietura nouǎ trebuie sa fie diametral opus și la alt
nivel fațǎ de tǎ ietura din anul precedent , astfel ȋncat sǎ nu se punǎ ȋn dificultate circulaț ia
sevei , deoarece poate duce la us carea copacului.
2. Pentru cres tarea copacului este recomandatǎ folosire a cuț itelor ș i fierăstraielor din
inox.
3. Pen tru recoltarea sevei de mesteacǎn se folosește un beț isor de lemn sau un furtun care
se introduce ȋn coaja tǎietura copa cului . Pentru procesul de extracție a sevei se uti lizeazǎ
doar ustensile din plastic ș i lemn.
5. Flaconul de pl astic se leagǎ cu o sȃ rmǎ ȋn jurul mesteacanului ș i gura flaconului se
poziționeaza sub furtun , astfel ȋncȃt seva sǎ se prelingǎ direct ȋn flacon (Figura 16).
6. Când flaconul s -a umplut se dezleagă de pe pom, se pune dopul și se leagă în locul lui
un alt flacon curat. Este recomandat ca flaconul să se lege pe mesteacǎ n pe direcția nord,
pentru ca soarele să nu încălzească seva, deoarece la căldură se formeazǎ efect ul de ser ǎ și
seva se alterează pierzȃnd din calitǎți .

45

Figura 16. Recoltarea sevei de mesteacǎn

5.2. Analiza HPLC a sevei de mesteacǎn
Seva de mesteacăn este cunoscută datoritǎ capacității sale terapeutice, testate de -a lungul
anilor și se poate utiliza atât ca uz intern, cât și ca uz extern. Seva de mesteacăn conține
principii active care au acțiune diuretică, antiinflamatoare și antibacteriană.
Dintre principiile active prezente ȋn seva de mesteacǎn, cel mai important și remarc at
este acidul betulinic, acesta izolȃndu -se ȋntotdeauna ȋmpreunǎ cu betulin olul.
Este foarte importantǎ perfecționarea metodelor de izolare a principiilor active, pentru a
obține un randament cȃt mai mare de acid betulinic. Ȋn literatura de specialit ate este precizat
cǎ acidul betulinic fațǎ de betulin ol se gǎsește ȋn procente mai mari .
Ȋn lucrarea de față s -a urmărit realizarea unei metode de separare și determinare a
compușilor betulinici prezenți în seva de mesteacăn prin metoda HPLC.
Ȋn acest scop au fost efectuate mai multe încercări în diferite condiții de operare și anume
variind componența fazei mobile și respectiv debitul acesteia ȋn vederea stabilirii condițiilor
optime pentru separarea și determinarea compușilor betulinici prezenți ȋn sevǎ.
Cromatografia de lichide de ȋnaltǎ performanțǎ (HPLC) acoperǎ azi, ȋn proporție
aproximativ 80%, analiza substanțelor moleculare: organice, organo -metalice și anorganice,
inclusiv compușii foarte polari sau labili termic precum și co mpușii cu masǎ molecularǎ
ridicatǎ.

46

Materiale și metodă
Aparatura folosită a fost un sistem HPLC Agilent 1200 dotat cu pompă cuaternară,
DAD, termostat, sistem de degazare, autosampler (Figura 17).
Coloana cromatografică utilizată este de tip C18, 150 mm
 4,6 mm; 5 µm (Zorbax
XDB);

Figura 17. Schema sistemului HPLC

Condiții de lucru
Condițiile de lucru stabilite prin multiple încercări pentru separarea și determinarea
betulinolului sunt următoarele:
 faza mobilă: soluția A – acid fosforic 0,1%: soluția B – acetonitril 20: 80;
 temperatura: 25șC; debit: 0.7 mL/min;
 lungimea de undă pentru detecție: 210 nm;
 volumul de injecție: 5 µL;
 timpul de analiză: 10 minute.
 Substanța de referință (soluț ie în acetat de etil): betulinol = 0,13 mg/mL.

47
Condițiile de lucru stabilite prin multiple încercări pentru separarea și determinarea
acidului betulinic sunt următoarele:
 faza mobilă: soluția A – apă; soluția B – acetonitril 10: 90;
 temperatura: 25șC; debit: 1 mL/min;
 lungimea de undă pentru detecție: 210 nm;
 volumul de injecție: 5 µL;
 timpul de analiză: 10 minute.
 Substanța de referință (soluție în metanol): acid betulinic = 0.10 mg/mL.
Condițiile optime de separare și de determinare cantit ativă a compușilor de interes au fost
stabilite prin multiple încercări. Reproductibilitatea metodei s -a apreciat prin pătratul
coeficienților de corelare ai curbelor de calibrare.
Pregătirea probelor
Pentru realizarea separărilor și determinărilor an aliților de interes, seva de mesteacăn
păstrată la congelator s -a decongelat, s -a omogenizat cu grijă, s -a filtrat printr -un filtru
Millipore de 0,45 µm și apoi în sistemul cromatografic s -a injectat un volum de 5 µL probă
de sevă.
Rezultate și discuții
a. Separarea și determinarea betulinolului
În Tabelul nr. 6 se prezintă timpul de retenție obținut pentru betulinol în condițiile
cromatografice optimizate. Deviația standard s -a obținut în urma prelucrării statistice a celor
6 injecții (soft SPSS 10).

Tabelul nr. 6. Timp ul de retenție al betulinolului
Nr. C rt. Compus Timp de retenție ± DS, minute
1. Betulinol 2,4 ± 0,0028

În Figura 18 se prezintă cromatograma obținută pentru soluția standard d e betulinol iar
în Figura 19 spectrul de absorbție al betulinolului.
Identificarea și determinarea cantitativă a principiilor active din soluția de analizat s -a
efectuat prin compararea cromatogramei standardului cu a soluției de analizat.
Pătratul coeficientului de corelare al curbei de calibrare pentru determinarea betulinolului
este prezentat în Tabelul nr. 7.

48
Tabelul nr. 7. Pătratul coeficientului de corelare al curbei de calibrare
Nr. Crt. Compus r2
1. Betulinol 0.99942

Figura 18. Cromatograma HPLC a betulinolului

Figura 19. Spectrul de absorbție al betulinolului

49
Figura 20 prezintă cromatograma sevei de mesteacăn obținută în condițiile de lucru
optime pentru separarea și determinarea betulinolului. Picul caracteristic betulinolului este
bine evidențiat la timpul de retenție de 2,4 minute .

Figura 20. Cromatograma HPLC a sevei de mesteacăn în condițiile de lucru pentru
separarea și determinarea betulinolului

Concentrația betulinolului găsită în seva de mesteacăn este de 0,025 mg/mL.

b. Separarea și determinarea acidului betulinic

În Tabelul nr. 8 se prezintă timpul de retenție obținut pentru acidul betulinic în condițiile
cromatografice optimizate. Deviația standard s -a obținut în urma prelucrării statistice a celor
6 injecții (soft SPSS 10).

Tabelul nr. 8. Timpul de retenție al acidului betulinic
Nr. Crt. Compus Timp de retenție ± DS,
minute
1. Acid betulinic 1,491 ± 0,0052

Pătratul coeficientului de corelare al curbei de calibrare pentru determinarea acidului
betulinic este prezentat în Tabelul nr. 9.

50

Tabelul nr. 9. Pătratul coeficientului de corelare al curbei de calibrare
Nr. C rt. Compus fenolic r2
1. Acid betulinic 0,99866

În Figura 21 se prezintă cromatograma obținută pentru soluția standard de acid betulinic
în condițiil e optimizate prezentate iar în F igura 22 cromatograma probei de sevă de
mestea cǎn în condițiile stabilite pentru separarea și determinarea acidului betulinic. Picul
caracteristic acidului betulinic este bine evidențiat la timpul de re tenție de 1,491 minute.

Figura 21. Cromatograma HPLC a acidului betulinic

51

Figura 22. Cromatograma HPLC a sevei de mesteacǎn

Concentrația acidului betulinic determinat în seva de mesteacăn este de 0,349 mg/mL.

52
Concluzii

Ȋn lucrarea de față s -a urmărit realizarea unei metode de separare și determinare a
compușilor betulinici prezenți în seva de mesteacăn prin metoda HPLC.
Ȋn acest scop au fost efectuate mai multe încercări în diferite condiții de operare și anume
variind componența fazei mobile și respectiv debitul ȋn vederea stabilirii condițiilor optime
pentru separarea și determinarea compușilor betulinici prezenți ȋn sevǎ. S -au stabilit condiții
mai bune de operare utilizând ca fazǎ mobilǎ: soluție A – acid fosforic 0,1%: soluție B –
acetonitril 20: 80 cu un debit de 0,7 mL/min pentru betulinol și soluția A – apă: soluția B –
acetonitril 10: 90 cu un debit de 1 mL/m in pentru acidul betulinic.
Studiul experimental este în desfășurare.
Metoda HPLC reprezintǎ o tehnică excelentă pentru d eterminarea acidului betulinic ș i a
betulinolului din extractul de coajă de mesteacăn, cu o bună sensibilitate, precizie și
reproductibilitate.
Ȋn urma analizei HPLC a sevei de mesteacǎn s -au determinat urmǎtoarele concentrații
ale celor doi compuși de interes: 0,025 µg/mL betulinol și 0,349 mg/mL acid betulinic.
Rezultatele sunt ȋn concordanțǎ cu cele prezentate ȋn litera tura de specialitate.
Concentrația acidului betulinic din seva de mesteacǎn studiată este semnificativ mai
mare fațǎ de cea a betulinolului, fapt prezentat și ȋn literatura de specialitate.

53
Capitolul 6. Concluzii generale

Ȋncǎ din cele mai vechi timpuri plantele au fost folosite ȋn terapii medicinale, pentru a
trata sau ameliora simptomele anumitor boli, fapt care a determinat un interes deosebit al
oamenilor de științǎ de a studia, izola și caractariza principiile active prezente ȋn pl antele
medicinale.
Principala sursǎ de acid betulinic și respectiv betulinol este mesteacǎnul .
Un dezavantaj al procedeelor de extracție curente este că solvenții organici utilizați sunt
periculoși, dificil de manevrat sau dificil de eliminat. Ex tracția cu dioxid de carbon, este
metoda de izolare a acidului betulinic utilizat ǎ la nivel industrial, aceasta fiind o metodǎ
sigurǎ și nepoluantǎ.
Compusul natural betulinic prezintă o activitate anticanceroasă puternică prin activarea
căii mitocond riale a apoptozei în celulele canceroase.
Datorită citotoxicității sale selective față de celulele maligne comparativ cu celulele
normale, acidul betulinic este u n nou agent experimental pro mițǎtor pentru tratamentul
cancerelor umane.
Sensibilita tea celulelor leucemice pentru acidul betulinic este independentă de rezistența
la medicamentele citotoxice, astfel încât acidul betulinic ar putea avea capacitatea să inducă
apoptoza în celulele leucemice cu rezistență dob ândită împotriva medicamentelor
citotoxice.
Ȋn partea experimentală a lucrării s-a urmărit realizarea unei metode de separare și
determinare a compușilor betulinici prezenți în seva de mesteacăn prin metoda HPLC .
Metoda HPLC reprezintǎ o tehnică excelentă pentru determinarea acidului betulinic și a
derivaților săi din produse naturale , cu o bună sensibilitate, precizie și reproductibilitate.
Ȋn urma analizei HPLC a sevei de mesteacǎn s -au determinat urmǎtoarel e rezultate: 0,025
µg/mL betulin ol și 0,349 mg/mL acid betulinic. Rezultatele sunt ȋn concordanțǎ cu cele
raportate în literatura de specialitate.

54
Bibliografie

1. Antal DS, Biriescu S, Canciu CM, Traditional medicine in Banat region(Romania):
results of an ethnobotanical survey ; pg. 12 -76, 2010 .
2. Alexan M , Ovidiu C, Craiu F , Flora medicinală a României , Ed. Ceres, București , 2003 .
3. TĂMAȘ, M. , Botanică farmaceutică , vol II. Sistematică, Ed. Medicală, Universitatea
”Iuliu Hațieganu”, Cluj-Napoca , pg. 32-64, 2002 .
4. Sahoo N, Manchikanti P, Dey S. Herbal drugs: Standards and regulation . Fitoterapia,
pg. 462-471, 2010 .
5. Zuco V, Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell linel, but not on normal
cells. Cancer Lett, nr. 175 , pg. 17 -25, 2008.
6. G-Y. Wang, L. Jin, F -J. Piao and R -B. Han, Betulin esters with coumarin -3-carboxylic
and 3,4,5 -trimethoxybenzoic acids, Mendeleev Communications , nr. 27, pg. 93-94, 2017 .
7. Kaur R., Kapoor K., Kaur H., Plants as a source of anticancer agents , J. Nat. Prod. Plant
Resour. , nr. 1, pg. 119-124, 2011 .
8. Konate N. Etude De La Consommation Des Medicaments Traditionnels Ameliores Dans
Le Cercle De Kadiolo . Universitatea din Bamako, Republica Mali,2005.
9. Markus A, Mathias M , Rolf D . Birch B ark Dry Extract by Supercritical Fluid
Technology , Jose Augusto Paixao Coelho, Appl. Sci., 7, 292, 2017.
10. Ayesha H, M. Mahboob A, Mustafizur R, Choudhury M. Isolation of Betulinic Acid and
2,3-Dihydroxyolean -12-en-28-oic Acid from the Leaves of Calliste mon linearis , Dhaka
Univ. J. Sci. , nr. 61(2), pg.211 -212, 2013 .
11. Das, A ., K. Zaman and A.V. Singh, Antimicrobial and antioxidant activities of
Callistemon linearis DC leaf extract . Pharmacology, nr .3, pg. 875- 881, 2008 .
12. Noel, M.G. and F.M. Dayrit . Triterpenes in the callus culture of Vitex negundo L. Philip.
J. Sci., nr. 134, pg. 5-19, 2005 .
13. Holonec L., Ranga F., Crainic D , Truta A., Evaluation of Betulin and Betulinic Acid
Content in Birch Bark from Different Forestry Areas of Western Carpat hians, Bot Horti
Agrobo, nr. 40(2), pg. 99-105, 2012.
14. Alaíde S. Barreto, Gláucio D. Feliciano, Analysis of the Presence of the Betulinic Acid
in the Leaves of Eugenia florida by Using the Technique GC/MS, GC/FID and HPLC/DAD,
Journal Brazilian Chemica l Society,12, pg. 180-18, 2009.

55
15. Ehrhardt H., Fulda S., Debatin K. Betulinic acid -induced apoptosis in leukemia cells,
Leukemia 18, pg. 1406 –1412 , 2004 .
16. Edgar S., Pimentel E., Jansen B., Effects of Betulinic Acid Alone and in Combination
with Irradiation in Human Melanoma Cells, Jurnal of Investigative Dermatology , 114:935 –
940, 2007.
17. Mr. Rajendra K. Patel, Development and validation of rp -hplc method for quantification
of betulinic aci d in vitex negundo l. And its polyherbal formulations , IJPSR , Vol. 7, 2016.
18. R. Haavikko in Synthesis of Betulin Derivatives with New Bioactivities, Helsinki,
Finlanda , 2015 .
19. Rzeski W., Stepulak A., Szymański M., Juszczak M., Grabarska A., Sifringer M.,
Kaczor J., Kandefer -Szerszeń M., Betulin elicits anti -cancer effects in tumour primary
cultures and cell lines in vitro , Basic Clin. Pharma col. Toxicol., nr. 105 , pg. 425-432, 2009 ;
20. S. Saha, M. Ghosh and S.K. Dutta, A potent tumoricidal co -drug ‘B et-CA’ – an ester
derivative of betulinic acid and dichloroacetate selectively and synergistically kills cancer
cells, in Scientific Reports, 2015.
21. Schmidt L, Kuzmanoff K , Ling -Indeck L, Pezzuto M . Betulinic acid induces apoptosis
in human neuroblastoma . European Journal of Cancer , 33,2007 .
22. World Health Organisation MC. Traditional Medicine , Fact Sheet No. 134. 2008.
23. Supino D, Righetti C, Marc hesi E, Gambacorti C, Formeli F . Selective cytotoxicity of
betulinic acid on tumor cell lin es., Cancer Letters , nr. 175, pg. 17–25, 2009 .
24. Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E. Cancer Statistics , CA Cancer J Clin, nr. 60, pg. 277–
300, 2010 .
25. Schettino M, Ammaturo F, Labriola D, Franciscis P, Colacurci N, et al. Betulinic acid
and possible infl uence on the clearance of Human Papilloma Virus: cytological and
virological follow -up. Minerva Ginecol 65: 661 –668, 2013 .
26. Saha, M. Ghosh and S.K. Dutta , A potent tumoricidal co -drug ‘Bet -CA’ – an ester
derivative of betulinic acid and dichloroacetate selectively and synergistically kills cancer
cells, in Scientific Reports, 5 : 7762 | DOI: 10.1038, 2015.
27. Haavikko R., Synthesis of Betulin Derivatives with New Bioactivities , Helsinki, Finlanda
2015 .
28. Liu CM, Yang YF, Zhang X . BA inhibits cell proliferation . Biomed Pharmacother , nr.
80, pg. 338–342, 2016 .
29. Fulda S, Kroemer G . Targeting mitochondrial apoptosis by betulinic acid in human
cancers . Drug Discov Today, nr. 14, pg. 885–890, 2009 .

56
30.Servick K. Breast cancer. Breast c ancer: a world of differences . Science. 2014;
343:1452 –1453.
31. Gheorgheosu T, Duicu O, Dehel an C, Soica C, Muntean D. Betulinic acid as a potent
and complex antitumor phytochemical: a minireview. Anti -Cancer Agent Me, pg. 936–945,
2014 .