Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în [608224]

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

3

CUPRINS

Introducere ……………………………………………………………………………………………………………………………………5
PARTEA I………………………………………………………………………………………………………………………………………..6
CAPITOLUL 1………………………………………………………………………………………………………………………………….6
CANCERUL DE PIELE …………………………………………………………………………………………………………………6
1.1 Generalită ți…………………………………………………………………………………………………………………………..6
1.2 Diagnosticul………………………………………………………………………………………………………………………….7
1.3 Stadializarea …………………………………………………………………………………………………………………………7
1.4 Melanomul……………………………………………………………………………………………………………………………8
1.5 Cauzele cancerului de piele…………………………………………………………………………………………………….9
1.6 Statistici privind cancerul de piele …………………………………………………………………………………………11
CAPITOLUL 2………………………………………………………………………………………………………………………………..13
SUBSTAN ȚE CITOSTATICE UTILIZATE ÎN CANCERUL DE PIELE…………………………………………..13
2.1 Generalită ți Carboplatin ……………………………………………………………………………………………………….13
2.2 Absorb ția și mecanismul de ac țiune al Carboplatinului ……………………………………………………………14
2.3 Studii in vitro și in vivo privind utilizarea Carboplatinului……………………………………………………….14
CAPITOLUL 3………………………………………………………………………………………………………………………………..17
ANTOCIANII ……………………………………………………………………………………………………………………………..17
3.1 Generalită ți…………………………………………………………………………………………………………………………17
3.2 Structura chimică a antocianilor…………………………………………………………………………………………….18
3.3 Mecanismul de ac țiune al antocianilor……………………………………………………………………………………19
3.4 Studii efectutate in vivo și in vitro ………………………………………………………………………………………….20
PARTEA A II-A………………………………………………………………………………………………………………………………23
Scopul și obiectivele propuse…………………………………………………………………………………………………………….23

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

4
CAPITOLUL 4………………………………………………………………………………………………………………………………..24
MATERIALE ȘI METODE…………………………………………………………………………………………………………..24
4.1 Linii celulare utilizate…………………………………………………………………………………………………………..24
4.2 Medii și reagen ți …………………………………………………………………………………………………………………25
4.3 Obținerea fracției bogate ȋn antociani……………………………………………………………………………………..28
4.4 Men ținerea liniilor celulare în cultură…………………………………………………………………………………….31
4.5 Planul experimental……………………………………………………………………………………………………………..33
4.6 Metode de evaluare a culturii ………………………………………………………………………………………………..35
CAPITOLUL 5………………………………………………………………………………………………………………………………..38
REZULTATE ȘI DISCU ȚII ……………………………………………………………………………………………………………..38
5.1 Efectul extractului de afin asupra proliferării liniilor celul are A375 și HS27 ………………………………….38
5.2 Efectul citostaticului Carboplatin asupra proliferării lin iilor celulare A375 și HS27………………………..41
5.3 Efectul combina țiilor de extract si citostatic asupra proliferării liniilor celulare A375 și HS27 …………42
5.4 Efectul extractului de afin asupra declan șării apoptozei……………………………………………………………….45
5.5 Efectul citostaticului Carboplatin asupra declan șării apoptozei……………………………………………………..48
CAPITOLUL 6………………………………………………………………………………………………………………………………..50
Concluzii …………………………………………………………………………………………………………………………………….50
LISTĂ DE ABREVIERI ȘI ACRONIME …………………………………………………………………………………………..52
Bibliografie……………………………………………………………………………………………………………………………………..53

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

5

Introducere

Cancerul de piele s-a dovedit a fi una dintre cele mai frecve nte forme de cancer întâlnită în
rândul pacien ților umani. În urma unor statistici efectuate la nivel mondial s- a demonstrat faptul că
o treime din formele de cancer depistate în lume este reprez entată de cancerul cutanat. Tot acelea și
statistici indică faptul că inciden ța acestei maladii a crescut de patu ori în ultimii treizec i de ani, una
din cinci persoane fiind diagnosticată cu această boală.
Prin prisma acestor informa ții, respectiv rata de apari ție tot mai ridicată, simptomatologie
nespecifică, apari ția unor posibile complica ții în tratare și frecven ța decesurilor, se încearcă
descoperirea unor substan țe ce posedă proprietă ți biologice active, cu rol atât preventiv cât și
terapeutic, a căror biodisponibilitate să fie crescută. Ast fel de substan țe sunt antocianii, ace știa fiind
extra și cu succes din fructe și legume. Antocianii sunt a șadar molecule biologic-active, a căror
ac țiune a fost eviden țiată prin efectuarea unor studii atât in vivo cât și in vitro . Frac țiunile
antocianice au fost întrebuin țate tratării cancerului, bolilor cardio-vasculare, bolilor neurolo gice,
bolilor de ordin oftalmologic, diabetului, obezită ții. Surse majore de antociani sunt: afinele, cire șele,
zmeura, căp șunile, coacăzele însă extrac ția lor se poate realiza și din alte surse, cantitatea rezultată
fiind mai redusă.
Prin numărul mare de studii realizate atât in vivo cât și in vitro s-a concluzionat faptul că
antocianii au capacitatea de a chela ionii metalici și de a opri lan țul reac țiilor declan șate de radicalii
oxigenului liber, ace știa posedând proprietă ți antimicrobiale, antioxidante, neuro-protectoare, anti-
carcinogenice, și nu în ultimul rând pro-apoptotice. Aceste idei au fost punctul de pornire al
prezentului studiu care are ca obiectiv testarea efectului unui extract antocianic de afine asupra
liniilor celulare A375, melanom malign uman și HS27, fibroblast uman, comparativ cu un citostatic,
respectiv Carboplatin.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

6

PARTEA I

CAPITOLUL 1
CANCERUL DE PIELE

1.1 Generalită ți

Datorită mărimii sale, pielea este cu siguran ță cel mai mare organ care intră în alcătuirea
organismului uman. Din punct de vedere embriologic aceasta derivă din foi țele embrionare numite
neuroectoderm și mezoderm, fiind formată la rândul ei din trei componente respe ctiv epiderm, derm
și hipoderm.
Expunerea acestui organ la diferi ți factori de mediu cu poten țial cancerigen și lipsa unor
măsuri de protec ție duce la apari ția celei mai frecvent întâlnite neoplazii umane, cancerul de piele
(9-13%).
Frecven ța și gravitatea acestei neoplazii depind de forma sa histologică deoarece a fost
dovedit faptul că apari ția cancerului de piele poate avea loc în diferite celule și structuri apar ținând
straturilor componente men ționate anterior, acest aspect îngreunând totodată diagnosticarea boli i în
stadiile incipiente.

Clasificarea tipurilor de cancer cutanat după frecven ță:

A. Tipuri frecvente de cancer de piele:
– Melanomul: reprezintă 4% din totalitatea tumorilor maligne;
– Epiteliomul bazocelular (bazaliomul): dezvoltare în stratul celular bazal;
– Epiteliomul spinocelular (spinaliomul): dezvoltare de tumori în stratul spi nocelular;

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

7

B. Forme rare:
– Fibrosarcomul: reprezentat de tumori maligne ale țesutului conjunctiv;
– Miosarcomul: reprezentat de tumori maligne ale glandelor seba cee, celulelor vaselor de
sânge, tumori malige la nivelul mu șchilor;
– carcinomul Merkel: tumori maligne ale celulelor tactile;
– sarcomul Kaposi, frecvent întâlnit în cazurile de SIDA;

1.2 Diagnosticul

Diagnosticul acestor neoplazii se poate realiza în mai mul te moduri. Primul mod de
diagnosticare îl reprezintă diagnosticul clinic. În cadrul acest uia are loc o examinare a unei suprafe țe
cât mai mare de piele, incluzând zone precum scalpul, urechile, z ona palmelor și plantelor, zona
interdigitală.
În urma examenului clinic se poate realiza o biopsie cutana tă a leziunilor suspecte, fie ele
leziuni solare, cicatrici, zone de eritem cronic, telangiectazi i. Biopsia cutanată poate fi excizională,
pentru tumorile mici, sau incizională pentru tumorile de dimensiuni mai crescute. Biopsia
superficială se realizează cu ajutorul unui scalpel și se poate utiliza în leziuni ulcero-nodulare sau
chistice. (https://www.cancer.org/cancer/melanoma-skin-cancer/detection-diagnos is-staging/how-
diagnosed.html)

1.3 Stadializarea

Stadializarea bolii (Tab. 1.1) reprezintă un pas foarte import ant în prognosticul final.
Prognosticul cel mai favorabil îl au carcinoamele cutanate dator ită evolu ției lente și posibilită ții
diagnosticului precoce. În cazult leziunilor limitate, primul t ratament poate obține o vindecare
definitivă în 80-90% din cazuri în timp ce tratarea recidivelor de termină un nivel de vindecare de

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

8
92-96%. Pentru formele avansate rata de supraviețuire este de ci nci ani procentul fiind de 55-60%
din cazuri.
În cadrul stadializării are loc o apreciere a extinderii loc o-regionale, se urmărește
localizarea și dimensiunea tumorii, relația și legătura cu țesuturile și organele învecinate. Este
necesară precizarea tipului histologic și a altor factori m orfopatologici cu valoare și importan ță
deosebită în prognostic precum: starea ganglionilor limfati ci regionali și juxtaregionali, invazia
intravasculară, gradul de invazie în profunzime, gradul de diferențiere tumorală precum și
eviden țierea altor markeri tumorali cu valoare prognostică și în supravegher ea recidivei tumorale.
Antecedentele personale pot sugera apartenența la o grupă de risc cr escut pentru cancer.

Tab. 1.1
Clasificarea clinică a tumorilor maligne apar ținând cancerelor cutanate conform American
Joint Committee on Cancer
Tumoră primară (T) Adenopatii loco-regionale
(N) Gruparea pe stadia
TX nu poate fi determinată
TS carcinom preinvaziv stadiul 0 T s N 0
Nx interesarea
ganglionilor
regionali nu este
eviden țiată T0 fără existen ța tumorii
primare stadiul I T 1 N 0
T1 tumoră ≤ 2 cm în diametru N0 fără invazia
ganglionară regional stadiul II T 4 N 0
T2 tumoră > 2 cm dar mai < 5
cm
T3 tumoră > 5 cm stadiul III orice T N 1
T4 tumoră ce invadează
țesuturile profunde N1 metastaze în
ganglionii limfatici
regionali stadiul IV orice T orice N

(Sursa: http://www.umfiasi.ro/Rezidenti/suporturid ecurs/Facultatea%20de%20Medicina/Oncologie/
oncologie%20medicala-%20tematica%20curs%20rezidenti/36%2 0Cancerul%20piele.pdf)

1.4 Melanomul

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

9
Melanomul (Fig. 1.1) este acel tip de cancer de piele ce der ivă din melanocite, celule care
conferă culoare pielii. Forma benignă a melanomulul este reprezentat ă de aluni țe.
Apari ția melanoamelor poate fi de două tipuri: apari ție spontană și apari ție cu extindere
superficială. Melanomul cu apariție spontană are de cele ma i multe ori o culoare brun-închisă sau
poate fi chiar negru. Mai frecvent este însă melanomul cu ext indere superficial, sub forma unei mici
pete de culoare brun-închis, galben-deschis sau policromă, ușor proe minentă, cu suprafață
mamelonată, puțin rugoasă si contur neregulat.
Melanoamele pot apărea în orice a zonă a corpului, însă anumite z one sunt mult mai
predispuse la acestea. În cazul sexului masculin, zone predisp use sunt considerate a fi pieptul și
spatele, în timp ce la sexul feminin picioarele, fa ța și gâtul sunt zonele cu inciden ța cea mai
crescută.
Ca și frecven ță de apari ție, melanomul are o rată de dezvoltare crescută, fiind diagnosticat
des iar vindecarea lui este foarte posibilă în stadiile incip iente. În cazul netratării lui, melanomul se
poate întinde și pe alte zone ale corpului, fiind foarte greu curabil. (Annette Pflugfelder, 2011)

Fig. 1.1 Melanom benign vs. malign
(Sursa: http://www.skincancer.org/Media/Default/Page/skin-c ancer-information/Melanoma/b.jpg )

1.5 Cauzele cancerului de piele

Factorii de risc implica ți în etiologia cancerului de piele:
I. Factori exogeni:

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

10
A. Factori fizici:
Expunerea la radia țiile solare ultraviolete 190-320 nm este una dintre cele mai fre cvente
cauze ale cancerului cutanat. Acestea ajung în contact cu pie lea nu doar în circumstan țe naturale, de
la soare, ci și prin mijloace artificiale, solariile. Studiul îndelungat al a cestor factori fizici a dovedit
faptul că există trei tipuri de radia ții ultraviolete implicate mai mult sau mai pu țin în această
maladie.
a. Radia țiile ultraviolete de tip A produc îmbătrânirea pielii și modificări pe termen
lung ale morfologiei acesteia cum ar fi apari ția ridurilor și pot influența însă nu
semnificativ ADN-ul celulelor.
b. Radia țiile ultraviolete de tip B ac ționează cu o putere mai mare asupra pielii, find
cauzele arsurilor solare și influen țând direct ADN-ul celular, fiind considerate cauza
principală a cancerelor.
c. Radia țiile ultraviolete de tip C nu sunt considerate a fi o cauză a ac estei boli deoarece
acestea nu ajung în atmosferă, a șadar nu sunt prezente în lumina solară.
Folosirea iradierii drept tehnică terapeutică a cunoscut o dez voltare importantă în societatea
modernă. Prin aceasta se dore ște nu doar vindecarea unei boli, cum ar fi acneea, ci și împiedicarea
apari ției recidivei. Efectele iradierii pot fii acute sau tardive, apari ția și intensitatea lor depinzând de
zona supusă iradierii și doza totală aplicată.
B. Factori chimici:
Un factor chimic îl reprezintă expunerea la arsenic. Boala B owen are o dezvoltare situată la
nivelul epidermului. Boala duce la formarea pe piele sau pe m ucoase a unor plăci roz-cenu șii,
rotunjite, cu suprafa ță neregulată, aceste leziuni întinzându-se și transformându-se într-un epiteliom
spinocelular.

II. Factori endogeni:
A. Factori imunologici:
Implicarea factorului imunologic în apari ția cancerelor a fost dovedită experimental.
Deficien țele imunitare congenitale sau dobândite prin aplicarea de trat amente imunosupresoare sunt

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

11
cauza unui procent de 5-6% din totalitatea cancerelor cutanate. Ca pacitatea răspunsului imun poate
fi influen țată totodată de apari ția în organism a unei infec ții.
Inflama țiile cronice: fistulele, dermatitele, cicatricile postvacci nale, leziunile atrofice
creează un micromediu local favorabil unei cre șteri celulare neorganizate, răspunsul imun al
organismului fa ță de aceste celule fiind blocat.
B. Factori ereditari:
Un exemplu concret în cadrul factorilor ereditari îl reprez intă boala numită Xeroderma
pigmentosum. Aceasta se caracterizează prin apari ția unor tumori cutanate și este aspciată unei
fotosensibilitată ți cutanate și o îmbătranire prematură a pielii. Boala vizează copii c u vârsta până în
5 ani. Manifestarea acestei boli include arsuri solare importa nte chiar și după o expunere de scurtă
durată, pete neregulate prezente pe palme, picioare și la nivelul cavită ții bucale, piele sub țire și
uscată, afec țiuni neurologice severe.
C. Factori genetici:
În urma îndelungilor cercetări efectuate, au fost descoperite diferite gene oncogene
amplificate și mutate H-ras, K-ras, M-ras, C-myc precum și gena supresoare p53 implicate in
apari ția cancerului. Genele H-ras, K-ras, M-ras sunt gene ce codifi că proteine. Muta țiile genei H-
ras sunt implicate în 22% dintre cazurile de apari ție ale tumorilor la nivelul gâtului și capului. Gena
K-ras apare ca fiind cauza majorită ții tumorilor solide, în timp ce gena N-ras intervine cel mai
frecvent în melanoame (19%). O altă leziune genetică este dată de pierderea func ției normale a
genei supresoare p53, respectiv func ția de a produce o fosfoproteină nucleară implicată în reglare a
cre șterii și diviziunii celulare. Această genă se află situată pe cromozom ul 17p13.
(http://www.umfiasi.ro/Rezidenti/suporturidecurs/Facultatea%20de%20Me dicina/Oncologie/oncolo
gie%20medicala-%20tematica%20curs%20rezidenti/36%20Cancerul%20piele.pdf)

1.6 Statistici privind cancerul de piele

Inciden ța, prevalen ța și mortalitatea prin cancer (Tab. 1.2) a devenit o problemă a
societă ții moderne.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

12
La nivel mondial statisticile ne indică faptul că anual sunt diag nosticate aproximativ
200.000 de cazuri noi de melanom, 85% dintre acestea afectând popula ția țărilor occidentale.
În ceea ce prive ște Statele Unite ale Americii, în fiecare ora o persoană diagnosticată cu
melanom moare. Statisticile arată faptul că în anul 2017, un număr de aproximativ 87.110 cazuri de
melanom invaziv vor apărea, iar un număr de 9730 de persoane vor deceda .
(http://www.skincancer.org/skin-cancer-information/skin-cancer-fact s#melanoma)
În Fran ța, între anii 1980 și 2005 frecven ța melanomului a crescut de trei ori, 70% dintre
cazuri având drept cauză principală expunerea excesivă la soare.
În anul 2007, 73.600 de canadieni au fost diagnostica ți, 1 din 7 persoane fiind predispusă
unei forme de cancer cutanat de-a lungul vie ții sale. Din 73.600 persoane diagnosticate, 8000 de
persoane aveau vârsta cuprinsă între 24 și 44 de ani iar melanomul a fost prezent în 4600 cazuri.
În România, Societatea de Medicină Estetică și Dermatologie Cosmetică și Chirurgicală
atestă faptul că în 80% dintre cazurile de melanom malign pac ien ții au o rată de supravie țuire de
maxim 5 ani de la depistarea afec țiunii. Astfel, riscul de melanom a crescut cu 3% de la an la an,
începând cu anul 1992 și până în anul 2011, în timp ce în perioada cuprinsă între anii 1983 și 2008,
inciden ța a crescut de la 1-2 cazuri la 4-6 cazuri per 100.000 locuitori, vârs ta medie fiind cuprinsă
între 45-55 ani.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

13

CAPITOLUL 2
SUBSTAN ȚE CITOSTATICE UTILIZATE ÎN CANCERUL DE PIELE

2.1 Generalită ți Carboplatin

Carboplatin Actavis conține o substanța activă numită carbop latină, care aparține unui grup
de medicamente cunoscute sub denumirea de compuși coordinativi ce con țin platină, utilizați pentru
tratamentul cancerului (Fig. 2.1).
Acest citostatic poate fi administrat intravenos sau intra-pe ritoneal, doza administrată
depinzând de starea generală de sănătate a pacientului, înăl țimea și greutatea acestuia precum și
reac ția organismului la diferite substan țe medicamentoase.
Datorită reac țiilor individuale specifice fiecărei persoane, reac țiile adverse pot fi
numeroase. Un procent de 10-29% dintre pacien ții cărora le este administrat acest citostatic acuză
senza ția de ardere provocată de injectarea medicamentului, durere a bdominală, diaree sau
constipa ție, stare de grea ță și vomă la 24 de ore după administrarea tratamentului, stare de
slăbiciune și pierderea părului.

Fig. 2.1 Structura chimică a Carboplatinului

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

14
(http://www.ofichem.com/useruploads/images/carbopla tin1.png)
2.2 Absorb ția și mecanismul de ac țiune al Carboplatinului

În cadrul tumorilor diviziunea celulară nu este una controlată. Celule le normale se opresc
din diviziune atunci când întâlnesc alte celule asemănătoare, fenome n cunoscut sub denumirea de
inhibi ție de contact. Ciclul celular porne ște din faza de odihnă, trece în faza de cre ștere activă iar
apoi la diviziune.
Abilitatea medicamentelor folosite în chemoterapie de a uc ide celule canceroase depinde
de capacitatea lor de a stopa diviziunea celulară. Odată cu adm inistrarea intravenoasă sau
intraperoneală citostaticul ac ționează asupra celulelor cancerigene distrugându-le ADN-ul și ARN-
ul responsabil de diviziunea celulei, iar astfel dacă celulele nu sunt capabile să se dividă, ele vor
muri. Cu cât diviziunea are loc mai rapid, cu atât este mai cr escută rata apoptozei sub influen ța
citostaticului.

2.3 Studii in vitro și in vivo privind utilizarea Carboplatinului

Odată cu realizarea numeroaselor studii in vitro utilizarea Carboplatinului în tratarea
cancerului a cunoscut o continuă dezvoltare iar astfel acest citost atic a început să fie administrat nu
doar în cazul cancerului ovarian ci și în cancerul pulmonar, endometrial, esofagian, cervical, cancere
de la nivelul gâtului, capului și nu în ultimul rând in cazul cancerului cutanat.
Tratarea cancerului ovarian, a fost și rămâne o problemă a cărei solu ționare este în continuă
cercetare. Fiind a patra cauză de mortalitate la femei și a doua cauză de mortalitate în rândul
cancerelor, după cel de col uterin, în România, studiile efectuate în acest context, de prevenire și
tratare sunt numeroase. In vitro , s-a demonstrat faptul că acest citostatic, Carboplatin, a diminuat
capacitatea proliferativă a liniilor ovariene tumorale Skov-3 și BG-1 (Baumann; 2013). Acelea și
rezultate au fost ob ținute și pe linii celulare precum CAOV3, OV90, OVCAR3, SKOV3,
TOV112D, A2780CP, A2780S, CHI, CHIcisR, M41, M41CSR, Tyknu, și TyknuCisR, diferen ța

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

15
fiind dată de utilizarea a altor două substan țe citostatice, Cisplatin și Paclitaxel (DuBoisetal., 2003;
Pfistereretal., 2006; DuBoisetal., 2006; Bookmanetal., 2009; Bicaku și colab., 2012) .
Tot in vitro , Carboplatinul a fost administrat în diferite doze pentru a d etermina rata de
apoptoză unei linii celulare transgenice de retinoblastom mur in, B16F10. S-a constatat că utilizarea
concomitentă a căldurii și carboplatinului într-o linie celulară de retinoblastom muri n transgenic are
efecte pozitive. Au fost utilizate doze de 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 100 și 50 ng per placă
(Murray și colab.; 1997) .
Un alt studiu in vitro demonstrează efectul Carboplatinului comparativ Cisplatinului asupra
liniilor celulare CEM, HL60, K562 și U937, linii provenite de la zece pacien ți diagnostica ți cu
leucemie și progenitori hematopoetici proveni ți din cinci probe prelevate din cordoane ombilicale.
A fost nevoie de o administrare de 10 ori mai mare a Carboplati nului fa ță de Cisplatin în ceea ce
prive ște celulele leucemice, în timp ce progenitorii hematopoetici au prezentat un răspuns egal la
aceea și concentra ție de citostatic (Wu-Chou., 2000) .
In vivo s-au realizat studii pe pacien ți diagnostica ți cu cancer de vezică urinară, un cancer
urologic comun, care are cea mai mare rată de recuren ță dintre toate tumorile maligne. S-a dorit
evaluarea răspunsului la combina ția gemcitabina cu carboplatin cât și evaluarea toxicită ților la
pacien ții cu cancer de vezică urinară avansat locoregional sau metast atic. Au fost administrate șase
cicluri, pacien ții prezentând cancer urotelial avansat, local sau metastati c, stadiile III – IV,
tratamentul incluzând gemcitabină 1000 mg/m în zilele 1 și 8 și carboplatină începând din ziua 1 la
fiecare 21 de zile. Tratamentul a fost în general bine tolera t. Cea mai frecventă toxicitate
hematologică a fost cea de grad 2-3, 14 % dintre pacien ți prezentând neutropenie. Cea mai frecventă
a fost toxicitatea nonhematologică de grad 2-3, 5% au prezentat gr ea ță si vărsături dar și toxicitate
neurologică. Toxicitatea renală a ajuns la gradul 2, afectând 24% dint re pacien ți. Rata de răspuns a
fost de 62 % (Sur.,2015).
În ceea ce prive ște tratarea cancerului cutanat, au fost realizate studii co mparative între
Carboplatin, Oxaliplatin și Cisplatin. Liniile celulare utilizate au fost G361, melanom și C32
melanom malign. În ambele linii celulare rezultatele mai b une au fost ob ținute în urma utlizării
Oxaliplatinului, pe locul doi situându-se Cisplatinul, iar ultimul f iind Carboplatin (Mohammed și
Retsas; 2000) .

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

16

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

17

CAPITOLUL 3
ANTOCIANII

3.1 Generalită ți

Antocianii sunt coloran ți naturali ce pot fi identifica ți în frunzele si fructele plantelor. Pe
lângă rolul estetic pe care îl au, ace știa sunt cunoscu ți totodată sub denumirea de molecule biologic-
active datorită importan ței lor în domeniul cercetării. Majoritatea studiilor efectuate pe antociani au
ca obiectiv rezolvarea problemelor legate stabilitatea și purificarea extractului, și respectiv
evaluarea efectului lui antioxidant pe culturi celulare.
Surse majore de antociani sunt în special fructele de pădure: a finele (Vaccinium myrtyllus) ,
coacăzele negre (Ribes nigrum), zmeura (Rubus idaeus), căp șunile (Fragaria viridis), meri șoarele
(Vaccinium vitis-idaea) însă cantită ți semnificative pot fi extrase și din soc (Sambucus nigra) ,
cire șe (Prunus avium), aronia (Aronia melanocarpa), albăstrele (Centaurea cyanus), mac (Papaver
rhoeas), unele cereale și legume.
Dintre cele mai importante proprietă ți se pot enumera cele antimicrobiale, antioxidante,
neuro-protectoare, anti-carcinogenice, și nu în ultimul rând pro-apoptotice. Frac țiunile antocianice
au fost întrebuin țate tratării cancerului, bolilor cardio-vasculare, bolilor neurologi ce, bolilor de ordin
oftalmologic, diabetului, obezită ții (Kähkönen și colab., 2001) .
Importan ța utilizării antocianilor și a proprietă ților lor benefice a fost eviden țiată și în
domenii precum industria farmaceutică și cea cosmetică, medicină, ȋnsă cantită țile ob ținute în urma
extragerii lor din material primă nu reu șesc să satisfacă cerin țele consumatorilor. De exemplu,
antocianii extra și din Hibiscus sp au fost utiliza ți cu succes în hipertensiune și disfunc ții ale

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

18
ficatului în timp ce antocianii extra și din Vaccinium sp și-au demonstrate eficacitatea în bolile de
ordin oftalmologic, infec ții microbiene, diaree și alte probleme de sănătate. Pe de altă parte,
solubilitatea și stabilitatea acestora ȋn apă au dus la utilizarea acestora ȋn industria alimentară, ca și
coloranți (Castanelo și colab., 2009; Socaciu., 2007; Duran și colab, 2001).

3.2 Structura chimică a antocianilor

Antocianozidele sunt pigmen ți naturali de natură vegetală ce imprimă plantelor culoare.
Culoarea acestora poate varia între ro șu, violet și albastru (Giusti și Wrolstad., 2003) .
Din punct de vedere chimic, antocianii (Tab. 3.1) sunt componente flavonoide ce derivă din
2-fenil-cromonă (Fig. 3.1).

Fig. 3.1 Structura chimică a antocianilor
(http://bioblog.alkemillacosmetici.it/wp-content/up loads/2015/09/cianidina2.jpg)

Tab. 3.1
Structura chimică a celor mai importanți antociani (adaptată după Har borne, 1998)
Nume Substitu ție Culoarea în vizibil Lungimea de undă
max.(nm) in MeOH-
HCl
R1 R2
Cianidină (Cy) OH H Roz închis 535
Peonidină (Pn) OCH 3 H 532
Pelargonidină (Pg) H H Ro șu 520
Malvidină (Mv) OCH 3 OCH 3 542

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

19
Delfinidină (Dp) OH OH Purpuriu 546
Petunidină (Pt) OCH 3 OH 543
(Sursa: http://www.usamvcluj.ro/files/teze/2012/sco nta.pdf)
În cazul florilor și plantelor decorative antocianii prezintă o structură chimică s uperioară
celor din fructe și legume, două dintre excep ții fiind afinele și strugurii, deoarece conțin antociani ȋn
număr mare ce prezintă structuri chimice complexe (Cara și colab., 2008).

3.3 Mecanismul de ac țiune al antocianilor

În multe dintre interven țiile antocianilor în sănătatea umană, detaliile legate de
bioactivitate, ingestie, absorb ție și distribu ția în organism nu au fost complet elucidate deoarece
ace știa nu ac ționează aproape niciodată independent în organism. Problema legată de consumul de
antocianină și sănătatea umană reprezintă încă un mister pentru știin ță și cercetători deoarece nu a
fost descoperită în totalitate farmacocinetica acestor com ponente. Există cel pu țin patru obstacole
primare care au împiedicat formularea de către profesioni știi din domeniul medical a unor orientări
privind consumul de antociani.
Prima și probabil cea mai complicată piesă a puzzle-ului este că, în ceea ce prive ște
activitatea biologică a pigmen ților antocianici în corpul uman, aceasta nu este una autodependentă.
Ace ști componen ți interac ționează cu alte componente pentru a exercita o poten ță maximă.
Un alt handicap comun recunoscut oamenilor de știin ță care explorează proprietă țile
bioactive ale flavonoidelor și a doua parte a puzzle-ului antocianic este faptul că aceste substan țe
fitochimice se pot degrada u șor. Multe dintre metodele clasice fitochimice, inclusiv cromatogr afia,
utilizate pentru a efectua extrac ția pigmen ților din țesuturile vegetale pot degrada antocianinele sau
le pot inactiva în timpul etapelor de purificare.
O a treia piesă a puzzle-ului este natura inductibilă a mult ora dintre flavonoidele bioactive,
inclusiv antocianinele. Piesa finală de puzzle din "enigma antocian ină" este incapacitatea
cercetătorului sau a medicului de a urmări progresul metabolic a l antocianilor după ingestie, datorită
numeroaselor produse de defalcare metabolică care sunt produse rap id in situ. Există un interes în

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

20
încercarea de a urmări transportul bioflavonoidelor prin organism, pe ntru a determina absorb ția și
biodisponibilitatea și pentru a vedea unde se acumulează produsele de degradare și pentru cât timp.
Poten țialul antocianilor de a interveni în procesul cancerigen pare a fi legat de multiplele
mecanisme de ac țiune pe care ace știa le exercită. Prin aceste mecanisme, atât antocianii indi viduali
cât și mixurile de bioflavonoide oferă protec ție integrită ții ADN-ului, modifică simptomatologia
bolilor dependente de activiatea hormonală a organismului și inhibă secre ția enzimatică. Totodată
provoacă o cre ștere a produc ției de citokine modificându-se răspunsul imun, permeabilitatea,
capilaritatea și fragilitatea membranelor.
Hou și colab. dezvăluie faptul că antocianii inhibă formarea tumorilor prin bl ocarea sintezei
protein-kinazei. Aceasta afirma ție a fost primul pas către o bază știin țifică prin intermediul căreia a
fost demonstrată proprietatea anticarcinogenică.
În ciuda activită ții de cercetare și a interesului crescând în domeniul produselor naturale și
men ținerea sănătă ții, există pu ține informa ții despre absorb ția, biodistribu ția și metabolismul
antocianinelor și flavonoidelor cu care ace știa interac ționează.

3.4 Studii efectutate in vivo și in vitro

Proprietă țile benefice ale antocianilor au fost îndelung studiate prin ef ectuarea unor
experimente atât in vitro cât și in vivo. În ambele cazuri cercetarea a demonstrat că aces te substan țe
au abilitatea de a reduce proliferarea celulelor canceroas e și de a inhiba formarea tumorilor.
Totodată a fost demonstrat faptul că prin poten țarea efectului antocianic cu alte substan țe rezultatele
ob ținute în urma tratamentelor au fost îmbunătă țite.
În ceea ce prive ște rolul antocianilor în bolile cardiovasculare, acesta este str âns legat de
protec ția fa ță de stresul oxidativ. Prin efectuarea unui studiu în cadrul căruia trei antociani:
delphinidin, malvidin, cyanidin izola ți din soc au fost încorpora ți în plasmalema și citosolul
celulelor endoteliale, reu șindu-se astfel să se demonstreze rolul protector al antocianilor. In vivo
acest fapt indică abilitatea antocianilor de a reduce bolile inflamatorii și de a cre ște capilaritatea și

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

21
permeabilitatea membranelor. Mai multe investiga ții au demonstrat faptul că în particular, cyanidin-
3-sambubiozid-5-glucozid și cyanidin3, 5-diglucozid sunt biodisponibili în celulele endoteliale
prevenind ateroscleroza și bolile degenerative neurologice. Un alt studiu care a demonstrat
eficacitatea antioxidantă, poten țialul citotoxic, asimilarea la nivel celular precum și abilitatea anti-
angiogenică a fost efectuat prin ob ținerea unui extract din șase fructe: afine, soc, meri șoare, zmeură,
căp șuni și coacăze. Au fost evaluate mai multe combina ții, în final ob ținându-se formula OptiBerry
IH141, ce prezenta o capacitate mare de absorb ție a radicalilor de oxigen, o citotoxicitate redusă și
proprietă ți anti-angiogenice superioare altor combina ții testate. În sfera tumorilor vasculare,
OptiBerry a inhibat H 2O2 și VEGF (factorul de cre ștere endothelial vascular), care este o cheie
reglatoare a angiogenezei tumorilor.
Într-un model de angiogeneză realizat in vitro , extractul OptiBerry a inhibat seminificativ
secre ția de MCP-1 (proteina chemoatractantă de monocite-1) și transcrip ția NF-κB (complex proteic
care controlează transcrip ția ADN-ului, produc ția de citokine și suprevie țuirea celulelor). Celulelor
endoteliale tratate în prealabil cu OptiBerry le-a scăzut abilitatea de a forma hemangioame și alte
tipuri de tumori cu 50%.
OptiBerry a fost testat și in vivo , pe șoareci. Oral au fost administrate 5g/kg masă corporal
iar cutanat 2g/kg. După realizarea necropsiei nu au fost evide n țiate schimbări de greutate sau reac ții
adverse grave, însă au fost constatate mici irita ții la nivelul pielii și a ochilor (Debasis Bagchi;
2005).
Zhao și colab . au demonstrat faptul că dezvoltarea liniilor celulare HT-29, c ancer de colon
și NCM460 – celule normale epiteliale provenind din colon a fost inhib ată de extractele bogate în
antocianii din struguri (Vitis vinifera) , Aronia (Aronia melanocarpa) și afin (Vaccinium myrtillus).
In vivo , au avut loc experien țe ce implicau cre șterea stresului la șoareci iar apoi hrănirea lor
cu extracte bogate în antociani, cum ar fi delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin, și malvidin.
Tsuda și al. faptul că antocianii extra și din porumbul mov, administra ți în tandem cu o dietă bazată
pe grăsimi a oprit depunerea grăsimii, masa corporală a șoarecilor rămânând aceea și, și mai mult de
atât șoarecii nu au prezentat hiperglicemie, hiperinsulemie și hipertensiune, simptome provocate de
aportul crescut în lipide. Prevenirea generării radicalilor l iberi, scăderea peroxidării lipidice, și

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

22
scăderea concentra țiilor de zahăr din sânge, urină și serul de sangvin au demonstrat rolul
antocianilor în preven ția diabetului și obezită ții.
Cho și colab. au demonstrat rolul antocianilor în func țiile cognitive și motorii. Ace știa au
arătat faptul că administrarea antocianilor semipurifica ți din cartoful dulce mov cre ște
performan țele cognitive, îmbunătă țește memoria, prevenind declinul func ției neurale în raport cu
vârsta.
În cadrul altor experien țe efectuate pe șoareci, împotriva pleuriziei, afecțiune a aparatului
respirator ce se caracterizează prin inflamarea membra nei ce acoperă plămânii și căptușește
cavitatea toracică, antocianii și-au demonstrat de asemenea proprietă țile benefice, rezultatele
indicând o diminuare a inflama ției prin diminuarea expresiei enzimelor implicate în acest proces .
In vitro antocianii din prune au avut o citotoxicitate selectivă asupra liniei celulare HT-29,
linie tumorală provenind din colon și asupra liniei CCD-18Co, linie normală apar ținând colonului.
Rezultatele au arătat rolul chemopreventiv și antiinflamator al antocianilor din acest fruct prin
scăderea markerilor specifici unei inflama ții.
Ac țiunea antimicrobială a fost demonstrată prin experimente asupra Helicobacter pylori , un
agent patogen nociv responsabil de diverse afec țiuni gastro-intestinale, inclusiv ulcer duodenal și
cancer gastric.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

23

PARTEA A II-A

Scopul și obiectivele propuse

În studiul de fa ță s-a dorit testarea efectului unui extract antocianic de afine comparativ și
în combina ție cu citostaticul Carboplatin. Ambele substan țe au fost utilizate asupra a două linii
celulare, și anume: linia celulară A375, melanom malign uman și linia celulară HS27, fibroblast
normal uman.
Pentru realizarea scopului au fost urmărite obiective precum observarea efectului celor
două substan țe luate în studiu asupra ratei de proliferare și procentului de apoptoză.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

24

CAPITOLUL 4
MATERIALE ȘI METODE

4.1 Linii celulare utilizate

În cadrul prezentului studiu au fost utlizate două linii celulare: A375 (melanom malign
uman) și HS27 (fibroblast uman).

a. A375 (Fig. 4.1) este o linie celulară de melanom malign recoltată de la o f emeie în vârstă
de 54 de ani care a fost diagnosticată cu acest tip de cancer c utanat. Linia celulară
produce melanoame amelanotice ce au o cre ștere rapidă în cazul șoarecilor Swiss NIH
trata ți cu ser anti-timocite. Această linie celulară are o morfologie de tip epitelial ( Fig.
4.1 ) iar odată cu multiplicarea celulelor are loc și aderarea acestora la placa de cultură.

a. b.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

25
Fig. 4.1 Morfologia celulelor epiteliale din linia A375: a. obiectiv 4x; b. obiec tiv 10x;
(foto original)
b. HS27 (Fig. 4.2) este o serie de linii fibroblaste umane dezvoltată în cadrul NBL,
California. Materialul a fost ob ținut de la un nou-născut de culoare, iar celulele posedă
fenotipul tip A G6PD. Studiile de longevitate efectuate la NBL au demonstrat că celulele
pot fi propagate pentru 42 de pasaje. În celulele analizate nu au existat abera ții
consecvente.

Fig. 4.2 Morfologia celulelor epiteliale din linia HS27: a. obiectiv 4x; b. obiec tiv 10x;
(foto original)

4.2 Medii și reagen ți

În ceea ce prive ște mediul de cultură utilizat, acesta este DMEM, suplimenta t cu o
concentra ție de 10% ser fetal.
Mediul Dulbecco's Modified Eagle Medium , cunoscut și sub denumirea de DMEM este
unul dintre cele mai utilizate medii de cultură, fapt pentru car e compozi ția sa a suferit mai multe
modificări de-a lungul timpului, conform literaturii de specialit ate. Formula originală DMEM (Tab.
4.1) con ține 1000 mg/l de glucoză și a fost raportată pentru prima dată pentru cultivarea c elulelor de
șoarece, respectiv a celulelor embrionare. O modificare ulterioa ră a constat în schimbarea cantită ții
de glucoză la 4500 mg/l, fapt ce s-a dovedit a fi optim pentru cultivarea anum itor tipuri de celule.
b. a.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

26

Tab. 4.1
Compozi ția mediului de cultură DMEM

Substan ță Concentra ția (mg/l)
NaCl 6400
KCl 400
CaCl 2 200
MgS0 4 200
NaH 2PO 4 124
D-glucoză 1000
Fe(NO 3)3 0.1
Piruvat de Na 110
Fenol ro șu 15
NaHCO 3 3700
L-arginină 84
L-cisteină 48
L-glutamină 580
L-histidină 42
L-izoleucină 105
L-leucină 105
L-lizină 146
L-metionină 30
L-fenilalanină 66
L-treonină 95
L-triptofan 16
L-tirozină 72
L-valină 94
Glicină 30
L-serină 42
Colină 4
Acid folic 4
Inositol 7.2
Nicotinamidă 4
D-Ca-pantotenat 4
Piridoxal 4
Riboflavină 0.4
Tiamină 4
(Sursa: https://www.globalcube.net/clients/beldico /content/medias/products/6_imp/labo/diagnostics/
cell_biology/BIOCHROM_Media.pdf)

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

27

Serul fetal bovin (FBS) este serul-supliment utilizat frecvent în domeniul culturilor de
celule. Primul pas în ob ținerea serului fetal este recoltarea frac ției sanguine prin punc ția cardiacă a
fetusului. Aceasta are loc în condi ții sterile, în cadrul abatoarelor. Al doilea pas este repre zentat de
îndepărtarea hematocitelor și coagulului de fibrină prin centrifugare. Componenta majoră a ser ului
de vi țel este reprezentată de albumina serică bovină (ABS), care împreună cu alte proteine de
constitu ție au rolul de a men ține supravie țuirea culturii de celule și diviziunea acesteia, fiindu-i
asigurate cerin țele metabolice. Prin utilizarea serului fetal bovin se ob ține un titru scăzut de
anticorpi și un nivel ridicat de factori de cre ștere embrionari.
Solu ția de tripsină a fost utilizată cu scopul deta șării celulelor ata șate de pere ții flask-
urilor. În mod normal, tripsina este o serin-protează cu secre ție la nivel pancreatic. Există două
tipuri de tripsină, sintetizate în duoden sub formă inactivă: tri psinogen 1 sau tripsină cationică și
tripsinogen 2 sau tripsina anionică, stocate în organism sub forma unor granule de zimogen. De
obicei din punct de vedere cantitativ, secre ția de tripsinogen 1 este de două-patru ori mai mare decât
a tripsinogenului 2, în cadrul afec țiunilor pancreatice raportul fiind invers-propor țional. Această
enzimă are rol în hidroliza legăturilor peptidice formate înt re grupările carboxi ale lizinei și
argininei cu al ți aminoacizi.
PBS -ul cunoscut și sub denumirea de Phosphate Buffered Saline , este o solu ție alcătuită
dintr-un solvent, respectiv apa și mai mul ți solvi ți, respectiv clorura de sodiu și fosfat de sodiu.
Uneori pe lângă ace știa în compozi ția PBS-ului mai pot fi adăugate și clorura și fosfatul de potasiu.
(Tab. 4.2) Printre proprietă țile acestei solu ții tampon pot fi enumerate proprietatea izotonică și cea
non-toxică, capacitatea de a men ține PH-ul în limite optime. Pe lângă întrebuin țarea în cercetarea
biologică PBS-ul poate fi utilizat atât ca diluant cât și la clătirea plăcilor de cultură.

Tab. 4.2
Compozi ția de bază a PBS-ului
Denumire sare Concentra ția (mmol/L) Concentra ția (g/L)
NaCl 137 8.0

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

28
KCl 2.7 0.2
Na 2HPO 4 10 1.42
KH 2PO 4 1.8 0.24
(Sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/Phosphate-buf fered_saline)

Hoechst 33258 este unul dintre cei trei coloran ți fluorescen ți supravitali de culoare albastră
(Hoechst 33342 și Hoechst 34580) utilizat cu scopul de a eviden ția ADN-ul celular. S-a demonstrat
faptul că acest colorant are o afinitate crescută pentru sec ven țele bogate în adenină și timină. Acesta
este solubil în apă și în solven ți organici. Colora ția albastră este vizibilă la o emisie de aproximativ
461 nm și este eviden țiată cu ajutorul unei lămpi cu arc de xenon sau mercur sau prin int ermediul
unor lasere ultraviolete. Intensitatea fluorescen ței culorii variază în func ție de PH-ul solventului.
Colorantul este stabil la o temperatură de 2-6o C, ferit de lumină și pentru o perioadă de maxim șase
luni. De și utilizările celor trei coloran ți sunt similare fiind folosi ți pentru studiile de apoptoză și
ciclu celular, colorantul Hoechst 33258 s-a dovedit a fi mai pu țin permeabil intra-celular.
Solu ția MTT (bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu) permite
evaluarea metabolismului oxidativ și a răspunsului unei culturi de celule la factori externi, factori
care pot avea un efect pozitiv sau din contră, negativ asupra rat ei de supravie țuire a celulelor în
cultură. Solu ția se ob ține prin dizolvare în PBS a 0,5 mg/ml MTT. Tot în cadrul testului M TT a fost
utilizat și DMSO ( dimetil sulfoxidul). Acesta este un lichid incolor, un solvent polar important care
dizolvă atât compu și polari, cât și compu și nepolari fiind miscibil într-o gamă variată de solven ți
organici, de exemplu apa. Testul MTT este folosit pentru studii de viabilitate, citotoxi citate și
proliferare celulară.

4.3 Obținerea fracției bogate ȋn antociani

Antocianii și compușii fenolici au fost extrași ȋn urma omogenizări fructelor (5g) cu metanol
acidifiat (0.3 % HCl (v/v), cu ajutorul unui Ultraturax (Miccra D-9 KT Digitronic, Germany).
Omogenizatul obținut s-a păstrat la 4 șC ȋn ȋntumeric timp de 24 h. Metanolul acidifiat se folosește ȋn
general pentru a evita degradarea antocianilor, aceștia sunt s tabili doar la pH acid (Grace și colab.,
2009).

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

29
Extractele ob ținute au fost filtrate de câteva ori prin hârtie de filtru ap oi au fost concentrate
sub presiune cu ajutorul unui rotavapor pentru a evapora metanolul. Ext ractul ob ținut care con ține
atât antociani cât și alți compuși fenolici s-a supus unei pa rtiții cu acetat de etil, pentru a elimina
compușii mai puțin polari. Extractul apos rămas ȋn urma partiției a fost încărcat în coloana C18 Sep-
Pak (5ml, 1g sorbent) Waters Corp Milford. MA pentru a obține fracția boga tă în antociani.
Purificarea s-a realizat cu ajutorul protocolul descris de Gius ti și colab. (1999). Sorbentul
C18 este cel mai eficient și frecvent utilizat ȋn purificarea antocianilor. Mecanismul de purificare
include o fază sta ționară nepolară și o fază mobilă polară (Rodriguez-Saona și Wrolstad, 2001) .
Fracția bogată ȋn antociani obținută ȋn urma purificării a fost reluată ȋn apa distilată, filtrată prin filtru
de 0.45 µm iar apoi analizată HPLC-DAD-ESI-MS.

4.3.1 Analiza HPLC – DAD-MS a antocianilor

Separarea cromatografică a antocianilor, conform tabelului 4.3, s-a realizat cu ajutorul unui
sistem Shimadzu, echipat cu detecție cu fotodiodă și cu detector S PD-M20A PDA. Sistemul
Shimadzu LCMS-2010 EV (Shimadzu instrumente știin țifice, Inc, Columbia, MD), echipat cu un
detector de SPDM20A PDA, monoquadrupol cu ionizare electronică de pulve rizare (ESI) cu
detector MS a fost utilizat pentru identificarea antocianilor . S-a folosit pentru separarea antocianilor
coloana C18 Waters Corp (3.5µm, 4.6×150mm; Milford, MA). Faza mobilă uti lizată a fost acid
formic 4,5% în apă, respectiv acetonitrilul. Debitul a fost 0.8 ml/ min iar analiz ele au fost realizate la
temperatură de 35 șC. Cromatogramele (fig. 4.3) au fost înregistra te la lungimea de undă de 520 nm.
Cuantificarea antocianilor s-a făcut utilizând curba de calibrare de ma lvidin-3-glucozid.
Pentru a determina antocianii prezenți în extactele de afine s-a folosit următorul protocol
HPLC:
– sistem HPLC Shimadzu echipat cu un detector UV-VIS (DAD) și o coloană Luna C18
(5µm, 25 cm x 4.6 mm, Phenomenex).
– faza mobilă: solvent A – acid formic (4.5%) în apă bidistilată
solvent B – acetonitril.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

30
Sistemul de evaluare a gradientului a fost: B 10%, 0-9 min; 12% B, 9-17 min; 25% B 17 –
30 min; 90% B, 30-50 min; 10% B, 50-55 min. Debitul a fost de 0,8 ml/ min, iar evaluarea s-a
efectuat la 35° C. Cromatogramele au fost înregistrate la 520 nm.

Tab. 4.3
Separarea cromatografică a antocianilor
Număr peak Timp
reten ție Compus Concentra ția ug/ml extract
purificat
1. 8.937 Delfinidin-3- O-galactosid 7997.591
2. 10.019 Delfinidin-3- O-glucosid 17905.33
3. 11.726 Cianidin-3- O-galactosid 7021
4. 12.149 Delfinidin-3- O-arabinosid 10724.78
5. 13.332 Cianidin-3- O-glucosid 7871.524
6. 14.353 Petunidin-3- O-galactosid 2770.076
7. 15.582 Cianidin-3-O-arabinosid 4823.877
8. 16.075 Paeonidin-3- O-galactosid 6826.918
9. 18.924 Petunidin-3- O-arabinosid 1202.483
10. 19.526 Malvidin-3- O-galactosid 414.6503
11. 20.677 Malvidin-3- O-glucosid 1137.593
12. 21.289 Malvidin-3- O-arabinosid 792.1424
TOTAL 69487.96

Fig. 4.3 Analiza HPLC – DAD-MS a antocianilor

1 2

4
3
5
6
7 7
8 9 10 11 12

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

31

4.4 Men ținerea liniilor celulare în cultură

4.4.1 Decongelarea celulelor

În prealabil ca celulele să fie scoase din container pentru decongelare, a fost pregătită o baie
marină cu temperatura de 37 o C, adâncimea apei fiind de aproximativ 10 centimetri. După realizarea
acestui pas, suportul pentru crio-tuburi a fost ridicat din azot ul lichid, unde a fost conservat la
temperatura de -196 o C, fiind ales criotubul ce con ține linia celulară dorită. Criotubul a fost introdus
în baia marină, decongelarea fiind vizibilă după o scurtă per ioadă. În urma procesului de congelare
mi șcările moleculare și metabolismul intra-celular încetinesc, urmând ca acestea s ă fie reluate odată
cu decongelarea celulelor. După dezghe ț, tubul a fost scos din apa băii marine și șters de surplusul
de apă, iar mai apoi fiind dezinfectat cu alcool 70% și transferat în hota cu flux laminar. Peste
celulele dezghe țate se adaugă mediu de cultură, foarte lent, deoarece acestea sunt sensibile la
ac țiunile de tip mecanic și osmotic, asigurând timpul de eliminare a agentului crioprotector (DMSO)
și rehidratarea celulei.

4.4.2 Subcultura celulelor

În urma însămân țării celulelor în flask-uri și aderarea lor, plăcile au fost analizate cu
ajutorul microscopului Olympus IX51, în contrast de fază, urmărindu-se rata de cre ștere. În cazul
ambelor linii celulare utilizate în prezentul studiu, odată cu a tingerea procentului de acoperire a unei
suprafe țe de 70-80% din placa de cultură s-a realizat pasarea acestora în subcul turi (Fig. 4.4).

S-a respectat următorul protocol:
– mediul de cultură a fost eliminat din plăci;

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

32
– flask-ul a fost clătit de două ori folosindu-se câte 3 ml PBS;
– au fost adăuga ți 500 µl solu ție tripsină pentru deta șarea monostratului celular;
– flask-ul a fost introdus în termostat timp de două minute, la o temperatură de 37 o C;
– a fost verificat modul de ac țiune al enzimei, urmărindu-se gradul deta șării celulelor;
– pentru a stopa ac țiunea enzimei au fost adăuga ți 1 ml mediu DMEM complet;
– con ținutul flask-ului a fost transvazat în tuburi sterile iar mai apoi acestea au fost
centrifugate timp de zece minute, la 2500 rota ții/minut.
– a fost eliminat mediul, fără a fi agitat tubul pentru a nu se deta șa depozitul de
celule;
– peste depozit a fost adăugat 1 ml mediu, în care au fost resuspendate celulele;
– în func ție de concentra ția dorită, s-a preluat un anumit volum din suspensie și a fost
însămân țat în alte plăci, astfel ob ținându-se continuitatea liniei celulare;
– cultura ob ținută a fost păstrată în incubator, la o temperatură de 37 oC, 5% CO 2 și o
umiditate de 90%.
– surplusul de celule a fost congelat cu scopul de a asigura continuitate liniei celulare;

Fig. 4.4 Realizarea subculturilor liniilor celulare: a. Protocol de luc ru; b. Subculturi
(foto original)

4.3.3 Congelarea celulelor
a. b.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

33
Pentru congelarea celulelor a fost respectat următorul protocol:
– au fost pregătite în prealabil materialele necesare congelării: flask-urile ce con țineau
linia celulară dorită, mediul DMEM normal, mediu de cultură dublu c oncentrat,
pipete, solu ția de tripsină, tuburi pentru centrifugare, criotuburi, ghea ță;
– mediul normal, mediul dublu concentrat și tuburile au fost ținute pe patul de ghea ță;
– peste monostratul celular a fost adăugată tripsină pentru a deta șa celulele după care
a fost adăugat 1 ml mediu pentru a stopa ac țiunea enzimei;
– con ținutul flask-ului a fost transvazat într-un tub iar mai apoi sup us centrifugării
timp de 10 minute la 2500 rota ții/minut;
– din acest moment s-a lucrat foarte repede, pe ghea ță;
– depozitul ob ținut în urma centrifugării a fost resuspendat în mediu dublu conce ntrat
și supus pipetării pentru a elimina aglomerările de celule;
– în fiecare criotub pregătit a fost pusă o cantitate de 1,5 m l din această suspensie
celulară urmând ca acestea să fie introduse în godeurile cutiei CryoCell ;
– cutia CryoCell con ținând celulele destinate congelării a fost pusă într-un ultra-
congelator, la -80 o C timp de aproximativ 24 de ore;
– în ziua următoare criotuburile au fost scoase din ultra-congelator și introduse în azot
lichid, la o temperatură de -196 o C;

4.5 Planul experimental

În cazul ambelor linii celulare, A375 (Fig. 4.5) și HS27, variantele experimentale au fost:
A. Extract afin:
– martor: mediu de cultură;
– A25: 25 µg/ml;
– A50: 50 µg/ml;
– A100: 100 µg/ml;
– A150: 150 µg/ml;

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

34
– A200: 200 µg/ml;
– A300: 300 µg/ml;
– A400: 400 µg/ml;

B. Carboplatin:
– martor (M): mediu de cultură;
– C0.5: 0.5 µg/ml;
– C1: 1 µg/ml;
– C5: 5 µg/ml;
– C10: 10 µg/ml;
– C20: 20 µg/ml;
– C40: 40 µg/ml;

C. Concentra ții crescute de extract de afin:
– A500: 500 µg/ml;
– A600: 600 µg/ml;
– A700: 700 µg/ml;
– A800: 800 µg/ml;

D. Combina ții extract de afin și Carboplatin:
– martor (M): mediu de cultură;
– V1: A100 + C5: 100 µg/ml + 5 µg/ml;
– V2: A100 + C20: 100 µg/ml + 20 µg/ml;
– V3: A100 + C40: 100 µg/ml + 40 µg/ml;
– V4: A200 + C5: 200 µg/ml + 5 µg/ml;
– V5: A200 + C20: 200 µg/ml + 40 µg/ml;
– V6: A100 + C40: 200 µg/ml + 20 µg/ml;
– V7: A400 + C5: 400 µg/ml + 5 µg/ml;
– V8: A400 + C20: 400 µg/ml + 20 µg/ml;
– V9: A400 + C40: 400 µg/ml + 40 µg/ml; 4.5 Model variantă experimental
pentru linia celulară A375

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

35

4.6 Metode de evaluare a culturii

4.6.1 Determinarea efectului antiproliferativ utilizând testul MTT

Principiul metodei testului MTT este tratarea celulelor cu solu ție MTT [bromură de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazoliu], de culoare galbenă. Această solu ție permite evaluarea
metabolismului și răspunsului culturilor celulare fa ță de anumi ți factori de natură exogenă, factori
ce pot avea un impact pozitiv sau negativ asupra culturii și implicit celulelor.

Metoda de lucru:
– subculturile realizare în flask-uri, atât pentru linia A375 cât și pentru linia HS27 au
fost însămân țate în plăci de cultură cu 96 godeuri, fiecare godeu con ținând 200 µl
mediu cu suspensie celulară;
– după însămân țare plăcile au fost ținute la incubat timp de 24 de ore, permi țând
aderarea celulelor la fundul godeurilor;
– după trecerea timpului de incubare au fost aplicate trata mentele conform planului
experimental, urmând din nou o incubare timp de 24 de ore;
– a fost îndepărtat mediul de cultură, fiecare godeu fiind spălat cu o cantitate de 150
µl PBS ce con ține calciu și magneziu;
– a fost eliminat PBS-ul și înlocuit cu 150 µl solu ție MTT, după care placa cu godeuri
a fost supusă din nou incubării, timp de o oră;
– după o oră MTT-ul a fost înlocuit cu 150 µl DMSO/godeu, fiind vizibil ă de colorare
de culoare violet, datorată colorării mitocondriilor celulelor vii;
– fiecare placă a fost supusă citirii la Microplate Reader (Fig . 4.6), la 550 și 630 nm;
Datele rezultate au fost trecute în tabele folosindu-se progr amul Excel, urmând a fi
calculate procentele de proliferare conform următoarei formule:

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

36

Fig. 4.6 Aparatul Microplate Reader
(foto original)

4.6.2 Determinarea efectului apoptotic prin utilizarea colorantului Hoech st 33258

Pentru efectuarea acestui test la s-au folosit plăci Petr i cu diametrul de 35 mm în acestea
fiind însămân țate liniile celulare. S-a utilizat o solu ție de fixare fiind preparată dintr-un amestec
echimolar de metanol și PBS. Solu ția de colorare a fost realizată amestecându-se PBS și colorant
Hoechst. Au fost alese câte 3 concentra ții atât de la extractul de afin, cât și de la citostatic. Pentru
extract s-au folosit concentra țiile: A100: 100 µg/ml; A200: 200 µg/ml și A400: 400 µg/ml iar pentru
Carboplatin s-au folosit următoarele concentra ții: C5: 5 µg/ml; C20: 20 µg/ml și C40: 40 µg/ml.

Mod de lucru:
– pentru fiecare linie celulară au fost pregătite câte 7 plăc i Petri cu diametrul de 35
mm, fiecare placă corespunzând martorului și respective concentra țiilor din planul
experimental;

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

37
– fiecare placă a fost însămân țată prin adăugarea a 3 ml de mediu ce con ținea
suspensie celulară, plăcile fiind mai apoi incubate timp de 24 de ore;
– după 24 de ore a fost adăugat tratamentul iar plăcile au fost din nou incubate timp
de 24 de ore;
– a fost înlăturat mediul, monostratul spălându-se cu solu ție PBS;
– s-au adăugat 2 ml solu ție de fixare metanol/PBS și s-a lăsat să ac ționeze timp de 2
minute;
– după cele 2 minute solu ția de fixare a fost golită și au fost adăuga ți 2 ml metanol
proaspăt, acesta fiind lăsat să ac ționeze timp de 10 minute;
– după îndepărtarea metanolului placa poate fi uscată și păstrată sau poate fi colorată
direct;
– colorarea s-a realizat prin adăugarea a 1 ml colorant în fie care placă Petri, după 10
minute de la acest pas fiind posibilă evaluarea celulelor cu a jutorul microscopului
cu fluorescen ță IX51 Olympus;
Colora ția observată cu ajutorul microscopului indică starea celulel or, în câmpul
microscopic fiind vizibile atât celule cu nucleul integru cât și celule cu nucleul frac ționat. Astfel
avem:
– celule ce prezintă o colora ție uniformă albastru-intens, reprezentând celulele vii;
– celule ce prezintă o colora ție albastru-deschis fragmentară, reprezentând celule
aflate în apoptoză, petele luminoase indicând condensarea cromatin ei intra-
nucleare;
Au fost efectuate poze și numărate 200 de celule per concentra ție plus 200 de celule per
proba martor, după care a fost aplicată următoarea formulă:

x100, unde:

CT= numărul total de celule (200)
CA= celule aflate în apoptoză

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

38
4.6.3 Prelucrarea statistică a datelor

Prelucrarea statistică a datelor pentru toate experimentel e a avut loc prin intermediul
programelor Excel și Instapad Graph. Au fost calculate medii, analiza de varian ță și devia ția
standard.

CAPITOLUL 5
REZULTATE ȘI DISCU ȚII

5.1 Efectul extractului de afin asupra proliferării liniilor celulare A375 și HS27

Prin utilizarea testului MTT s-a putut stabili răspunsul c ulturii de celule la factori exogeni,
factori care ar putea avea un efect pozitiv sau din contră, nega tiv asupra ratei de multiplicare a
celulelor în cultură. În acest caz factorul exterior se refer ă la adi ția unor concentra ții diferite de
extract de afine în placa de cultură.

În ceea ce prive ște linia celulară A375, din tabelul 5.1 se poate observa o tendin ță de
cre ștere a proliferării odată cu administrarea unei concentra ții mai mari de antociani. Se poate
concluziona faptul că extractul de afin favorizează multiplicarea cel ulelor.

Tab. 5.1
Efectul extractului de afin asupra proliferării liniilor celu lare A375 și HS27
Varianta experimentală Proliferare A375 (%) Proliferare HS27 (%)
A25 97.60 ± 7.71 104.60 ± 1.25
A50 104.18 ± 7.83 103.50 ± 3.31
A100 111.83 ± 3.38 102.54 ± 2.96
A150 90.23 ± 2.89 121.77 ± 3.42
A200 135.24 ± 1.53 110.49 ± 2.70
A300 145.40 ± 1.47 124.39 ± 3.91

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

39
A400 138.01 ± 11.05 119.27 ± 2.68

Varia țiile proliferării au fost considerabile pe măsura cre șterii cantită ților de antociani
administrate. Cel mai semnificativ efect de scădere a prol iferării celulare pentru această linie l-au
avut variantele experimentale A25 și A150, în timp ce cre șterea proliferării a fost determinată de
variantele A300 și A400.
Cu ajutorul testului compara țiilor multiple Tukey-Kramer a putut fi stabilită semnifica ția
diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia A375 tratate cu ext ract de afin, conform tabelului
5.2.
Tab. 5.2
Semnifica ția diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia A375 tratate cu extract d e
afin
24 ore 25 50 100 150 200 300 400
25 – n.s n.s n.s ** ** **
50 – – n.s n.s * ** *
100 – – – n.s n.s * n.s
150 – – – – ** *** **
200 – – – – – n.s n.s
300 – – – – – – n.s
400 – – – – – – –
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct sem nificativ mai mare; ***-foarte semnificativ mai
mare

În ceea ce prive ște linia celulară HS27, se poate observa faptul că rata prol iferării cre ște, la
fel ca și in cazul liniei celulare A375, odată cu o concentra ție mai bogată în antociani. Cele mai
scăzute rate de proliferare au fost înregistrate pentru var iantele A25, A50 și A100, cea mai mare
proliferare având loc în cadrul variantelor A150 și A300.
Comparativ, dintre cele două linii utilizate în studiul de fa ță linia A375 a înregistrat valori
procentuale mai crescute privind proliferarea sub influen ța frac ției bogate în antociani.
Cu ajutorul testului compara țiilor multiple Tukey-Kramer a putut fi stabilită semnifica ția
diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia HS27 tratate cu ex tract de afin, conform tabelului
5.3.
Tab. 5.3

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

40
Semnifica ția diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia HS27 tratate cu extr act de afin
24 ore 25 50 100 150 200 300 400
25 – n.s n.s ** n.s ** *
50 – – n.s ** n.n *** *
100 – – – ** n.s *** **
150 – – – – ** *** **
200 – – – – * n.s n.s
300 – – – – – – n.s
400 – – – – – – –
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct sem nificativ mai mare; ***-foarte semnificativ mai
mare
În urma rezultatelor ob ținute la concentra țiile ini țiale, am mai adăugat 4 variantăe
experimentale asupra liniei A375, conform tabelului 5.4, aceasta a vând ca scop cre șterea
concentra ției de antociani administrată și evaluarea efectului acestor noi concentra ții asupra ratei de
proliferare.
Au fost adăugate variantele: A500, A600, A700, A800, protocolul de lucru urmat fi ind
identic pe tot parcursul experimentului.
În urma testului MTT s-a dovedit faptul că la fel ca și în cazul variantei experimentale
ini țiale, tendin ța proliferării celulelor din linia A375 este aceea de a cre ște direct propor țional cu
administrarea unei concentra ții mai mari de antociani. Cea mai mare rată de proliferar e a fost
înregistrată pentru varianta experimentală A600, iar cea ma i mică rată s-a înregistrat pentru varianta
A700.
S-a putut concluziona faptul că extractul de afin favorizează multiplicar ea celulelor.

Tab. 5.4
Evaluarea efectului concentra țiilor crescute de antociani asupra ratei de proliferare a liniei A 375
Varianta experimentală Proliferare A375 (%)
A500 105.09 ± 1.86
A600 113.47 ± 2.95
A700 82.23 ± 2.21
A800 100.79 ± 5.49

Cu ajutorul testului compara țiilor multiple Tukey-Kramer a putut fi stabilită semnifica ția
diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia A375 tratate cu ext ract de afin în concentra ții mai
ridicate, conform tabelului 5.5.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

41
Tab. 5.5
Semnifica ția diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia A375 tratate cu extract d e
afin în concentra ții mai mari
24 ore A500 A600 A700 A800
A500 – n.s ** n.s
A600 – – *** n.s
A700 – – – oo
A800 – – – –
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct sem nificativ mai mare; ***-foarte semnificativ mai
mare; oo -distinct semnificativ mai mic
5.2 Efectul citostaticului Carboplatin asupra proli ferării liniilor
celulare A375 și HS27

Un alt factor exterior se referă la adi ția unor concentra ții diferite de citostatic în placa de
cultură având ca obiectiv principal observarea ratei de proliferar e.
Din tabelul 5.5 se poate observa faptul că în cazul liniei A375 a avut loc o scădere a
proliferării celulare în urma utilizării variantelor C5 și C40, în timp ce prin utilizarea variantelor C1
și C10 rata de proliferare celulară a crescut. Odată cu adi ția unei cantită ți mai mare de citostatic
tendin ța proliferării este de a se diminua.
Diferen țele privind proliferarea celulelor din linia A375 tratate cu cit ostaticul Carboplatin
nu sunt semnificative din punct de vedere statistic.
Tab. 5.6
Efectul citostaticului Carboplatin asupra proliferării liniilo r celulare A375 și HS27
Varianta experimental Proliferare A375 (%) Proliferare HS27 (%)
C0.5 94.91 ± 10.46 109.13 ± 0.60
C1 104.68 ± 3.20 89.86 ± 1.10
C5 89.99 ± 1.91 89.24 ± 1.34
C10 101.56 ± 6.29 88.20 ± 1.04
C20 93.46 ± 12.43 92.19 ± 1.88
C40 84.16 ± 8.92 92.83 ± 2.06

Urmând acela și protocol în cadrul ambelor linii, în cadrul liniei HS27 tendin ța de
proliferare este mai uniformă fa ță de prima linie utilizată, valorile ob ținute fiind situate sub valoarea
martorului. Din tabelul 5.6 se poate observa o cre ștere a proliferării pentru varianta C0.5, în timp ce
pentru celelalte variante tendin ța proliferării se diminuează.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

42
Cu ajutorul testului compara țiilor multiple Tukey-Kramer a putut fi stabilită semnifica ția
diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia HS27 tratate cu ci tostatic, conform tabelului 5.7.
Pentru linia A375 aceste diferen țe nu sunt semnificative din punct de vedere statistic în timp ce
pentru HS27 valorile corespunzătoare variantelor C1, C5, C10, C20 și C40 sunt semnificativ mai
mici decât cea pentru C0.5

Tab. 5.7
Semnifica ția diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia HS27 tratate cu citos tatic
24 ore C0.5 C1 C5 C10 C20 C40
C0.5 – *** *** *** *** ***
C1 – – n.s n.s n.s n.s
C5 – – – n.s n.s n.s
C10 – – – – n.s n.s
C20 – – – – – n.s
C40 – – – – – –
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct sem nificativ mai mare; ***-foarte semnificativ mai
mare

5.3 Efectul combina țiilor de extract si citostatic asupra proliferării liniilor
celulare A375 și HS27

Având în vedere rezultatele ob ținute la testul de proliferare în continuare s-a dorit testarea
unor combina ții de extract de afin și Carboplatin, astfel încât au fost alese concentra țiile care
anterior au dat cele mai semnificative rezultate, câte trei pentru fi ecare substan ță utilizată.
În func ție de concentra ția amestecului de extract și citostatic s-au ob ținut nouă variante
experimentale pentru care proliferarea celulară a variat consi derabil.
Din tabelul 5.8 se poate observa faptul că pentru celulele din l inia A375, varianta
experimentală V3 având concentra ția de 100 µg/ml extract și 40 µg/ml citostatic (Fig. 5.1) a avut un
impact semnificativ asupra proliferării celulelor tumoral e, înregistrând cea mai mică rată de
proliferare.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

43

Fig. 5.1. Placă cu 96 de godeuri: A. Aplicarea tratamentului; B. Test M TT;
(foto original)
Tot conform tabelului 5.8 se poate observa faptul că și în cadrul variantelor V4, V5, V6
rata proliferării s-a diminuat fa ță de martor.
Conform datelor statistice ob ținute se poate afirma din nou faptul că o cantitate mai mare
de antociani, prezentă în variantele V7, V8, și V9 stimulează proliferarea celulară. În schimb o
cantitate scăzută de antociani (100 µg/ml și 200 µg/ml) combinată cu 5 µg/ml, 20 µg/ml sau 40
µg/ml Carboplatin are ca efect scăderea la aproape jum ătate fa ță de martor a ratei de proliferare
pentru linia de celule de origine tumorală.

Tab. 5.8
Proliferarea celulelor din liniile A375 și HS27 tratate cu amestecuri de extract de afin și citostatic
24 ore Proliferare A375
(%) Proliferare HS27
(%)
V1= A100 + C5 77.73 ± 3.04 109.98 ± 1.78
V2=A100+ C20 80.08 ± 2.34 112.54 ± 2.90
V3= A100 + C40 54.67 ± 2.52 93.21 ± 1.26
V4= A200 + C5 65.89 ± 2.93 101.73 ± 2.22
V5= A200 + C20 74.24 ± 3.91 97.82 ± 1.49
V6= A200 + C40 66.38 ± 2.27 88.89 ± 1.83
V7= A400 + C5 105.23 ± 2.32 105.51 ± 2.48
V8= A400 + C20 116.16 ± 2.66 113.17 ± 2.21
V9= A400 + C40 154.68 ± 20.85 100.02 ± 0.85

Pentru linia HS27 cele mai mici rate de proliferare au fost în cadrul variantelor V3, V5, V6.
Semnifica ția diferen țelor pentru proliferarea celulelor din liniile A375 și HS27 tratate cu amestecuri B. A.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

44
de antociani și citostatic au fost interpretate statistic prin testul T ukey-Kramer și pot fi regăsite în
tabelele 5.9 respectiv 5.10.

Tab. 5.9
Semnifica ția diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia A375 tratate cu amestecu ri de
antociani și citostatic
24 ore V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9
V1 – n.s n.s n.s n.s n.s n.s * ***
V2 – – n.s n.s n.s n.s n.s * ***
V3 – – – n.s n.s n.s *** *** ***
V4 – – – – n.s n.s * *** ***
V5 – – – – – n.s n.s ** ***
V6 – – – – – – * ** ***
V7 – – – – – – – n.s **
V8 – – – – – – – – *
V9 – – – – – – – – –
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct sem nificativ mai mare; ***-foarte semnificativ mai
mare

Din punct de vedere statistic, diferen țe foarte semnificativ mai mari au fost înregistrate
pentru V9 (Tab. 5.9) acest fapt demonstrând tendin ța de cre ștere a proliferării celulare.

Tab. 5.10
Semnifica ția diferen țelor pentru proliferarea celulelor din linia HS27 tratate cu amest ecuri de
antociani și citostatic
24 ore V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9
V1 – n.s *** n.s ** *** n.s n.s *
V2 – – *** * *** *** n.s n.s **

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

45
V3 – – – n.s n.s ** *** n.s n.s
V4 – – – – ** n.s ** n.s n.s
V5 – – – – – n.s *** *** **
V6 – – – – – – *** *** **
V7 – – – – – – – n.s n.s
V8 – – – – – – – – **
V9 – – – – – – – – –
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct sem nificativ mai mare; ***-foarte semnificativ mai
mare

Și pentru linia HS27 s-a înregistrat o tendin ță asemănătoare cu situa ția de la linia A375 însă
diferen țele fa ță de martor nu au fost atât de pronun țate pentru linia de celule normale. Rezultatele
testelor de proliferare sugerează un efect mai puternic al combina țiilor de extract de afin și citostatic
față de substan țele utilizate individual dar și că aceste combina ții sunt mai nocive pentru celulele
din melanomul malign decât pentru fibroblastele normale.

5.4 Efectul extractului de afin asupra declan șării apoptozei

După observarea efectului substan țelor asupra proliferării liniilor celulare s-a încercat
depistarea efectului apoptotic prin analizarea plăcilor Pe tri cu ajutorul microscopului cu
fluorescen ță.

Fig. 5.2 Plăci Petri însămân țate cu scopul de a fi supuse colorării
(foto original)

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

46
Apoptoza a putut fi determinată prin aplicarea unei colora ții. Colorantul Hoechst 33258
este unul dintre coloran ții fluorescen ți supravitali de culoare albastră utilizat cu scopul de a
eviden ția ADN-ul celular.
Concomitent cu analiza plăcilor colorate la microscopul cu fluore scen ță am fotografiat
fiecare placă de cultură. Un al doilea pas a fost numărarea a 200 de celule, determinarea celor trei
tipuri de celule: celule normale, celule în diviziune și celule apoptotice (Fig. 5.2) și apoi s-au
calculat procentele corespunzătoare fiecărei categorii.

A.

Fig. 5.2 Celule colorate cu Hoechst, vizualizate la microscopul cu flu orecen ță: A.= celulă vie;
B= celule în diviziune; C= celulă apoptotică; (foto original)

Pentru linia A375, conform tabelului 5.11 se poate observa o tendin ță de scădere a
apoptozei concomitent cu adi ția unei concentra ții crescute de extract antocianic. Cea mai crescută
valoare a apoptozei s-a înrergistrat pentru varianta exper imentală A100, cea mai mică valoare fiind
corelată variantei A400.
Pentru linia celulară HS27, conform tabelului 5.11, tendin ța apoptotică este tot de a se
diminua pe măsura cre șterii concentra ției. Cea mai mare valoare a fost eviden țiată in jurul variantei
A100, iar cea mai mică pentru variant A400.
A. B. C.
B.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

47
Tab. 5.11
Evaluarea efectului extractului de afin asupra ratei apoptotice a l iniilor A375 și HS27
24 ore Apoptoză A375 (%) Apoptoză HS27 (%)
M 3.66 ± 0.33 4 ± 0.57
A100 28.66 ± 0.33 32.66 ± 1.45
A200 26.33 ± 0.66 28.66 ± 0.88
A400 17.66 ± 0.33 25.33 ± 0.33

Pentru ambele linii celulare, aflate sub ac țiunea antocianilor, au putut fi observate un număr
mare de celule aflate în diviziune, fapt ce poate explica val orile crescute ob ținute în cadrul evaluării
proliferării fa ță de valorile mai scăzute identificate în cadrul determinării ratei apoptotice, în raport
cu martorul.
Semnifica ția diferen țelor pentru apoptoza celulelor pot fi observate în cadrul tab elelor 5.12
pentru linia A375 și 5.13 pentru linia HS27.

Tab. 5.12
Semnifica ția diferen țelor pentru apoptoza celulelor din linia A375 tratate cu extract de af in
24 ore M A100 A200 A400
M – *** *** ***
A100 – – * ***
A200 – – – ***
A400 – – – –
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct sem nificativ mai mare; ***-foarte
semnificativ mai mare

Se poate observa faptul că pentru varianta A400 diferen țele statistice sunt foarte semnificativ
mai mari în raport cu martorul, V100 și V200 indicând o scădere a apoptpzei conform tabelului
5.12.
Tab. 5.13
Semnifica ția diferen țelor pentru apoptoza celulelor din linia HS27 tratate cu extract de afin
24 ore M A100 A200 A400
M – *** *** ***
A100 – – n.s **
A200 – – – n.s
A400 – – – –

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

48
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct sem nificativ mai mare; ***-foarte
semnificativ mai mare

Pentru toate variantele experimentale gradul de apoptoză a fost se mnificativ mai mare decât
în cazul martorului.

5.5 Efectul citostaticului Carboplatin asupra decla n șării apoptozei

În cazul determinării apoptozei declan șate de citostaticul Carboplatin, protocolul pentru
colorarea plăcilor a fost identic cu cel folosit pentru extrac tul de afin. După colorare a avut loc o
examinare la microscopul cu fluorescen ță pentru fiecare placă în parte și s-au numărat celulele.
Cifrele ob ținute au fost prelucrate iar astfel a fost stabilit procentul cel ulelor aflate în apoptoză.

Tab. 5.14
Evaluarea efectului citostaticului Carboplatin asupra ratei apoptoti ce a liniilor A375 și HS27
24 ore Apoptoză A375 (%) Apoptoză HS27 (%)
M 3.66 ± 0.33 4 ± 0.57
C5 28.33 ± 0.33 28.00 ± 0.57
C20 29.33 ± 0.33 29.33 ± 1.202
C40 28.00 ± 0.57 30.33 ± 3.28

Pentru linia celulară A375 tratamentul con ținând Carboplatin a înregistrat cea mai scăzută
valoare a apoptozei pentru varianta C40 și cea mai crescută valoare pentru varianta C20.
Pentru linia HS27 cea mai scăzută rată de apoptoză a fost p entru varianta C5, iar cea mai
crescută pentru varianta C40 (Tab. 5.14).
Pentru toate variantele experimentale gradul de apoptoză a fost se mnificativ mai mare decât
în cazul martorului. Gradele de semnifica ție sunt prezentate în tabelul 5.15 pentru linia celulară
A375 și în tabelul 5.16 pentru linia HS27.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

49
Tab. 5.15
Semnifica ția diferen țelor pentru apoptoza celulelor din linia A375 tratate cu citostatic
24 ore M C5 C20 C40
M – *** *** ***
C5 – – n.s n.s
C20 – – – n.s
C40 – – – –
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct semnif icativ mai mare; ***-foarte
semnificativ mai mare

În cazul ambelor linii celulare, aflate sub ac țiunea citostaticului au putut fi observate un
număr mare de celule aflate în diviziune. La adăugarea citostat icului proliferarea a înregistrat pentru
majoritatea variantelor valori mai mici fa ță de martor, acest fapt indicând o rată de apoptoză mai
ridicată în cadrul tratamentului cu citostatic.

Tab. 5.16
Semnifica ția diferen țelor pentru apoptoza celulelor din linia HS27 tratate cu citostat ic
24 ore M C5 C20 C40
M – *** *** ***
C5 – – n.s n.s
C20 – – – n.s
C40 – – – –
n.s- nesemnificativ; *-semnificativ mai mare; **-distinct se mnificativ mai mare; ***-foarte
semnificativ mai mare

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

50

CAPITOLUL 6
Concluzii

Testele efectuate în cadrul studiului de fa ță au urmărit determinarea in vitro a efectelor
extractului antocianic de afine comparativ și în combina ție cu citostaticul Carboplatin. Ambele
substan țe au fost utilizate asupra a două linii celulare, și anume: linia celulară A375, melanom
malign uman și linia celulară HS27, fibroblast normal uman. S-a urmărit rata de prol iferare și gradul
de apoptoză.
Pentru linia A375, melanom malign:
– s-a observat o cre ștere a proliferării odată cu administrarea unei concentra ții mai
mari de antociani; cel mai semnificativ efect de scădere a proliferării celulare pentru
această linie l-au avut variantele experimentale A25 și A150, în timp ce cre șterea
proliferării a fost determinată de variantele A300 și A400;
– în cazul liniei A375 a avut loc o scădere a proliferării celular e în urma utilizării
variantelor C5 și C40, în timp ce prin utilizarea variantelor C1 și C10 rata de
proliferare celulară a crescut;
– cea mai crescută valoare a apoptozei s-a înregistrat pe ntru varianta experimentală
A100, cea mai mică valoare fiind corelată variantei A400;
– pentru celulele din linia A375, varianta experimentală V3 având concentra ția de 100
µg/ml extract și 40 µg/ml citostatic a avut un impact semnificativ asupra p roliferării
celulelor tumorale, înregistrând cea mai mică rată de proliferare.
Pentru linia HS27, fibroblast uman normal:
– în ceea ce prive ște linia celulară HS27, se poate observa faptul că rata pr oliferării
cre ște, la fel ca și in cazul liniei celulare A375, odată cu concentra ția antocianilor;

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

51
cele mai scăzute rate de proliferare au fost înregistrate pentru v ariantele A25, A50 și
A100, cea mai mare proliferare având loc în cazul variantelor A150 și A300;
– s-a observat o cre ștere a proliferării pentru varianta C0.5, în timp ce pentru cel elalte
variante tendin ța proliferării a fost de a se diminua; Pentru linia HS27 cel e mai mici
rate de proliferare au fost la variantele A100 + C40, A200 + C5 și A200 + C40.
În concluzie se poate afirma că o cantitate mai mare d e antociani (300 µg/ml, 400 µg/ml)
stimulează proliferarea celulară în timp ce o cantitate s căzută de extract antocianic de afin (100
µg/ml și 200 µg/ml) combinată cu 5 µg/ml, 20 µg/ml sau 40 µg/ml Carbopl atin are ca efect
reducerea proliferării celulare în special la linia A375 și mai pu țin la linia HS27. Astfel s-a observat
un efect mai puternic al combina țiilor de extract de afin și citostatic fa ță de substan țele utilizate
individual dar și că aceste combina ții sunt mai nocive pentru celulele din melanomul malign decât
pentru fibroblastele normale.
În urma determinării procentului de apoptoză a devenit evident faptul că atât pentru linia
A375 cât și pentru linia HS27 varianta A100, con ținând 100 µg/ml antociani a avut dus la apari ția
celui mai mare număr de celule apoptotice.
Referitor la Carboplatin, pentru linia A375, varianta C20 a avut un impact semnificativ în
timp ce pentru linia HS27 varianta C40 induce cre șterea semnificativă a nivelului procentual de
celule apoptotice.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

52

LISTĂ DE ABREVIERI ȘI ACRONIME

ABS= albumină serică bovină

ADN= acid dezoxiribonucleic;

ARN= acid ribonucleic;

CA= celule aflate în apoptoză

CN= celule vii normale;

CT= numărul total de celule;

DMEM= Dulbecco’s Modified Eagle Medium;

DMSO= dimetil sulfoxid;

FBS= Fetal Bovine Serum;

MCP-1= proteina chemoatractantă de monocite-1;

MTT= [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazoliu];

NF-κB= complex proteic;

PBS= Phosphate Buffered Saline;

UV= radia ții ultraviolete.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

53

Bibliografie

1. Anil Mohith, Andrew P., Spyros R., 1996, The combination of paclitaxel with cisplatin exhibits
antagonism in vitro against human melanoma. Anti-Cancer Drugs, 7, 493-498.
2. Atnip Allison, Sigurdson Gregory, Bomser Joshua, Giusti Mónica, 2017, Ti me, Concentration, and
pH-Dependent Transport and Uptake of Anthocyanins in a Human Ga stric Epithelial (NCI-N87) Cell
Line, International Journal of Molecular Sciences, 18, 446.
3. Bicaku E., Xiong Y., Marchion DC., Chon HS., Stickles XB., Chen N., Judson P L., Hakam A.,
Gonzalez-Bosquet J., Wenham RM, 2012. In vitro analysis of ovarian canc er response to cisplatin,
carboplatin, and paclitaxel identifies common pathways that ar e also associated with overall patient
survival. British Journal of Cancer, 106, 1967–1975.
4. Brown J.M., Attardi Laura D., 2005, The role of apoptosis in cance r development and treatment
response, Nature Reviwes Cancer, 5, 231-237.
5. Cara R., Qingli WU., James E., 2008, Recent Advances in Anthocyanin Ana lysis and
Characterization, CCurrent Analytical Chemistry, 4(2), 75–101.
6. Debasis B., Sashwati R., Viren P., Guanglong He, Savita Kh, Navdeep O., Christina P., Simona G.,
Manashi B., Chandan K. Sen, 2005, Safety and whole-body antioxidant poten tial of a novel
anthocyanin-rich formulation of edible berries. Molecular and Cellular Bioche mistry 281, 197–209.
7. Duthie Susan J., 2007, Berry phytochemicals, genomic stability and can cer, Evidence for
chemoprotection at several stages in the carcinogenic process , Molecular Nutrition Food Resources,
51,665–67.
8. Engin Ulukaya, Ceyda A., Ferda A., Elif İ., Yusuf Y, 2011, A Glance at the methods for detection of
apoptosis qualitatively and quantitatively, Turkish Journal of Bioc hemistry, 36 (3), 261–269.
9. Fimognari C., Lenzi M., Hreli P., Chemoprevention of Cancer by I sothiocyanates and Anthocyanins,
Mechanisms of Action and Structure-Activity Relationship, Cu rrent Medicinal Chemistry, 15, 440-
447.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

54
10. Giusti M. M., Rodriguez-Saona L. E., Wrolstad R. E.. 1999. Molar absorpt ivity and color
characteristics of acylated and non-acylated pelargonidin based anthocyanins. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 47(11),4631-4637.
11. Giusti M.M., Wrolstad R.E., 2003, Acylated anthocyanins from edible sour ces and their applications
in food systems, Biochemical Engineering Journal 14, 217-225.
12. Grigore Mariana, Avram Alina, 2015. Caracterele fenotipice pigmentare – factori de risc importanți
în cancerul cutanat. Practica medicală. 10(2), 39.
13. Gülden M., Jess Anne, Kammann Julia, Maser E., Hasso S., 2010, Cytotoxic pot ency of H2O2 in cell
cultures, Impact of cell concentration and exposure time, Free Radical Biology & Medicine Journal,
49,1298–1305.
14. He J., Giusti M.M., 2010, Anthocyanins, natural colorants with health-p romoting properties, Food
Science Technology, 1, 163-187.
15. He J. și Giusti M.M., 2011, High-purity isolation of anthocyanin mixtures from fruits and vegetables
– a novel solid-phase extraction method using mixed mode cation exchange chromatography, Journal
of Chromatography, A 1218,7914-7922.
16. Herrmann K, 1976, Flavonols and flavones in food plants, A review, Jour nal of Food Technology,
11, 433-448.
17. Huang H.P., Shih Y.W., Chang Y.C., Hung C.N., Wang C.J., 2008, Chemoinhibitory effect of
mulberry anthocyanins on melanoma metastasis involved in the Ras /PI3K pathway, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 56, 9286-9293.
18. Jacob Lokich M.D, 2001, What Is the ‘‘Best’’ Platinum, Cisplatin, Carboplatin, or Oxaliplatin?.
Boston Cancer Investigation, 19(7), 756–760.
19. Kischkel F. C., Eich Julia, Meyer I. Carina, Weidemüller Paul a, Jens K.. Rauaa Yassin-Kelepir. Job
Laura. Braicu Ioana, Kopp-Schneider Annette, Jalid Sehouli, Leon De W ilde R., 2017, New in vitro
system to predict chemotherapeutic efficacy of drug combinations i n fresh tumor samples.
20. Kristo S. Aleksandra, Klimis-Zacas Dorothy, Sikalidis A. K., 2016, Protective Role of Dietary
Berries in Cancer, Antioxidants, 5, 37.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

55
21. Kuntz Sabine, Kuntz, Clemens, Rudloff Silvia, 2015, Inhibition of pan creatic cancer cell migration
by plasma anthocyanins isolated from healthy volunteers receivi ng an anthocyanin
rich berry juice,
European Journal of Nutrition, 56,203–214.
22. Lila Mary Ann, 2004, Anthocyanins and Human Health, An In Vitro Investig ative Approach, Journal
of Biomedicine and Biotechnology, 306–313.
23. Lucioli Simona, 2012, Anthocyanins, Mechanism of action and therapeutic e fficacy. Medicinal
Plants as Antioxidant Agents, Understanding Their Mechanism of Action and Therapeutic Efficacy,
2012, 27-57. Research Signpost. Kerala, India.
24. Malik Minnie, Cuiwei Z., Schoen Norberta, Giusti M, Moyer P. Mar y, Magnuson A. Bernadene,
2009, Anthocyanin-Rich Extract From Aronia meloncarpa E. Induces a Cel l Cycle Block in Colon
Cancer but Not Normal Colonic Cells, Nutrition and Cancer, 46,2, 186-196.
25. Malik Minnie, Cuiwei Zhao, Schoene Norberta, Guisti M. Monica, Moyer P. Mary, Magnuson A.
Bernadene, 2009, Anthocyanin-Rich Extract From Aronia meloncarpa E. I nduces a Cell Cycle Block
in Colon Cancer but Not Normal Colonic Cells, Nutrition and Cancer, 46,2, 186-196.
26. Mayank Singh, Himani S., Neeta S., 2007, Hydrogen peroxide induces ap optosis in HeLa cells
through mitochondrial pathway, Mitochondrion, 7,367–373.
27. Mohammed Q., Spyros R., 2000, Oxaliplatin is active in vitro agai nst human melanoma cell lines,
comparison with cisplatin and carboplatin. Anti-Cancer Drugs 2000, 11, pp. 859±863 . London, UK.
28. Murray G.T., Dcciarelli Nicole, McCabe Cathleen, Ksander B ., Feuer W., Joyce S., Mieler F.W.,
O'Brien J., 1997, In Vitro Efficacy of Carboplatin and Hyperthermia in a Mur ine Retinoblastoma Cell
Line. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 38(12), 2516-2522.
29. Neto Catherine, 2007, Cranberry and blueberry, Evidence for prot ective effects against cancer and
vascular diseases, Molecular nutrition and food resource, 51, 652–664.
30. Pflugfelder A, Eigentler TK, Keim U, Weide B, Leiter U, și colab., 2011, Effectiveness of
Carboplatin and Paclitaxel as First- and Second-Line Treat ment in 61 Patients with Metastatic
Melanoma, 306–313.
31. Ribble D., Goldstein N. B., Norris D. A., Shellman Y. G., 2005, A sim ple technique for quantifying
apoptosis in 96-well plates, BioMed Central, 5, 12.

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

56
32. Rodriguez-Saona L.E. și Wrolstad R.E., 2001, Extraction, isolation, and purification of anthocyani ns.
Current Protocols in Food Analytical Chemistry, Hoboken, NJ, John Wiley & Sons, Inc., F1.1.1-
F1.1.11.
33. Rugină Dumitri ța, Scon ța Zori ța, Leopold Loredana, Pintea Adela, Bunea Andrea, Socaciu Carmen,
2012, Antioxidant Activities of Chokeberry Extracts and the Cytotoxi c Action of Their Anthocyanin
Fraction on HeLa Human Cervical Tumor Cells, Journal of Medicinal Food, 15 ( 8) 2012, 700–706.
34. Unger T. F., Hermann A. K., Garri T., Rudy L de W., Irene Witte, 2009, DNA damage induced by
cis- and carboplatinas indicator for in vitro sensitivity of ovarian carcinoma cells, BMC Cancer,
9,359.
35. Urias-Lugo D. A., Heredia J. B., Muy-Rangel M. D., Valdez-Torres J. B., 2015, Anthocyanins and
Phenolic Acids of Hybrid and Native Blue Maize (Zea mays L.) Extracts and Their Antiproliferative
Activity in Mammary (MCF7), Liver (HepG2), Colon (Caco2 and HT 29) and Prostate (PC3) Cancer
Cells, Plant Foods Human Nutrition, 70,193–199.
36. U-Syn Ha, Woong Jin Bae, Su Jin Kim, Byung Il Yoon, Sung Hoo Hong, Ji Y oul Lee, Tae-Kon
Hwang, Sung Yeoun Hwang, Zhiping Wang și Sae Woong Kim, 2015, Anthocyanin induces
apoptosis of DU-145 cells in vitro and inhibits xenograft growth of prostate cancer, Yonsei Medical
Journal, 56(1),16-23.
37. Yang-ja Lee, Shacter Emily, 1999, Oxidative stress inhibits a poptosis in human lymphoma cells,
The Journal of Biological Chemistry, 274, 19792–19798.
38. Zafer Akan, Ayse Inhan Garip, 2013, Antioxidants may protect canc er cells from apoptosis signals
and enhance cell viability, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention , 14 (8), 46114614.
39. Scon ța Zori ța Maria, 2012, Extrac ția, purificarea, caracterizarea și testarea in vitro a frac țiilor bogate
în antociani ob ținute din Aronia Melanocarpa și Vaccinium sp., Teză de doctorat, Universitatea de
Știin țe Agricole și Medicină Veterinară, Cluj Napoca.
40. *** http://www.cancer.gov
41. *** http://www-dep.iarc.fr
42. *** http://www.usamvcluj.ro/files/teze/2012/sconta.pdf
43. *** https://en.wikipedia.org/wiki/Phosphate-buffered_saline
44. ***https://www.cancer.org/cancer/melanoma-skin-cancer/detecti on-diagnosis-staging/how-
diagnosed.html
45. ***http://www.umfiasi.ro/Rezidenti/suporturidecurs/Facultatea %20de%20Medicina/Oncologie/
oncologie%20medicala-%20tematica%20curs%20rezidenti/36%20Cancerul%20 piele.pdf
46. *** http://www.skincancer.org/skin-cancer-information/skin-cancer-fa cts#melanoma

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

57
47. ***http://cancerdepiele.ro/wp/informatii-pentru-pacienti/cance rul-de-piele-ce-trebuie-sa-stii/lang/en/
48. *** https://www.globalcube.net/clients/beldico/content/medias /products/6_imp/labo/diagnostics/
cell_biology/BIOCHROM_Media.pdf

Declara ție olografă pe proprie răspundere, privind originalitatea lucrării și
respectarea drepturilor de autor

Subsemnatul/Subsemnata…………….…………………………, student(ă) la Universitatea de
Stiin țe Agricole si Medicină Veterinară Cluj-Napoca, Facultate a……………………………………….,
Specializarea….………………………………………… declar pe propria răspundere, cunosc ând prevederile
art. 292 Cod Penal, privind falsul în declara ții, că lucrarea de licen ță cu titlul
…………………………………………………………………………………………………………………..……………………
……………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………..……………………………………
……………………………………… nu este un plagiat, fiind rezultatul cercetărilor propr ii efectuate în acest
sens.
Lucrarea este elaborată de mine si nu a mai fost prezentat ă niciodată la o altă facultate sau institu ție
de învă țământ superior din țară sau străinătate.
De asemenea, declar că toate sursele bibliografice utiliz ate, inclusiv cele consultate pe Internet sau
din jurnale elctronice, sunt men ționate detaliat în lista bibliografică, cu respectarea r egulilor de evitare a
plagiatului, respectiv:
− toate fragmentele de text reproduse exact, chiar si în trad ucere proprie din altă limbă, sunt scrise
între ghilimele si de țin referin ța precisă a sursei;
− reformularea în cuvinte proprii a textelor scrise de c ătre al ți autori este men ționată cu referin ța
precisă în textul lucrării;
− rezumarea ideilor altor autori este specificată cu referin ța precisă la textul original al

Cernat Alexandra Andreea Testarea efectului unui extract de afine asupra cel ulelor tumorale în
compara ție cu citostaticul Carboplatin

58
articolului sau manualului consultat.
Prin prezenta Declara ție confirm că am luat la cunostin ță faptul că, în cazul în care se va dovedi cu
probe concrete că lucrarea a fost plagiată, voi fi exmatriculat (ă) din examenul de diplomă/licen ță.

Cluj-Napoca Absolvent,

Data……………………/