Cercetările experimentale prezentate în această lucrare au constat în urmărirea efectelor induse de administrarea a două extracte vegetale obținute… [310799]

II.1. OBIECTIVELE LUCRĂRII

Cercetările experimentale prezentate în această lucrare au constat în urmărirea efectelor induse de administrarea a două extracte vegetale obținute din specii de Calendula (Calendula officinalis și Calendula arvensis) [anonimizat]: în condiții normale fără intervenția prealabilă a unor agenți experimentali imunosupresori și după administrarea de ciclofosfamidă. [anonimizat], în special prin cel imunosupresor (Ardelean A. și colab., 2000, Crăciun C. și colab., 1994, 1999, Pașca C. și colab., 2000). [anonimizat]. [anonimizat] o complicație extrem de gravă în primul rând prin faptul că se sensibilizează organismul la diferite infecții dar și prin faptul că o imunitate deprimată grăbește evoluția cancerului și apariția metastazelor. [anonimizat] a organismului, este una din problemele majore cu care se confruntă specialiștii în timpul și după terapia citostatică.

Pentru a [anonimizat]-[anonimizat], splină, [anonimizat] : normale și după administrarea de ciclofosfamidă (vezi capitolele 3 și 4 din partea experimentală). Studiile s-[anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat] (Ardelean A. și colab, 1999, 2000, Pașca C. și colab., 2000). Aceste perturbări sunt strâns corelate cu instalarea unor grave alterări structurale și funcționale la nivelul structurilor limfopoietice centrale și periferice (Crăciun C. și colab., 1997, 1999). [anonimizat]-am realizat cu scopul de a [anonimizat].

[anonimizat], datorită legăturilor funcționale strânse între acest organ endocrin și organele sistemului imun (Giurgea R., 1994). [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat]. Cortisolul, la om și șobolan determină deprimarea imunității celulare și umorale, dar și inhibarea răspunsului imun primar și în mică măsură a celui secundar. În plus, relația organe limfatice-suprarenală a putut fi dovedită fie prin suprarenalectomie, fie prin eliminarea structurilor limfatice. Suprarenalectomia determină o hipertrofie și hiperplazie a timusului, iar administrarea de glucocorticoizi alterează structura timusului și a bursei lui Fabricius și involuția acestora.

Studiile noastre structurale și ultrastructurale au inclus și ficatul șobolanilor Wistar, investigat în cele două condiții experimentale, cu scopul de a surprinde eventualele proprietăți stimulatoare ale extractelor vegetale asupra ficatului normal sau hepatoprotectoare în urma administrării de ciclofosfamidă. În acest sens, datele din literatura de specialitate ne relevă faptul ca ciclofosfamida prezintă o formă de transport inactivă, metabolizarea și implicit activarea ei realizându-se predominant la nivel hepatic sub acțiunea enzimelor microzomale, eliberând compuși activi în sens chimic și biologic (Crăciun C. și colab., 1994). Deducem ca efectul acestui citostatic este strict dependent de starea funcțională a ficatului, perturbarea acesteia contribuind în mod semnificativ la diminuarea acțiunii antitumorale a ciclofosfamidei.

În concluzie, studiile noastre experimentale prezentate în capitolele următoare ale tezei, au fost realizate în speranța descifrării mecanismelor intime de acțiune ale extractelor vegetale de Calendula officinalis și Calendula arvensis asupra structurii și funcțiilor principalelor organe ale sistemului endocrino-limfatic atât în condiții normale, cât și în condiții de imunosupresie indusă experimental. Considerăm ca în urma investigațiilor noastre experimentale, cele două extracte vegetale ar putea fi utilizate ca potențiali agenți imunostimulatori ai unor funcții din unele organe ale sistemului endocrino-limfatic dereglat de administrarea unor citostatice cu largă utilizare în practica chimioterapiei antitumorale.

II.2. MATERIALE ȘI METODE

II.2.1. MATERIALE ȘI METODE EXPERIMENTALE ÎN CONDIȚII NORMALE

Experimentul a fost organizat cu scopul de a urmări efectul adminstrării celor două extracte de Calendula (Calendula officinalis și Calendula arvensis) asupra unor parametri structurali, ultrastructurali și fiziologo-biochimici din timus, splină și măduvă roșie hematogenă la șobolani Wistar în condiții normale.

În experiment au fost utilizați șobolani albi din rasa Wistar crescuți în condiții standard de crescătorie, de același sex și aproximativ aceeași greutate, în număr relevant/lot pentru a putea elimina valorile aberante și pentru a putea interpreta statistic rezultatele.

Îndeplinirea acestor condiții experimentale a fost absolut necesară obținerii unor rezultate reale, influențate doar de extractele de testat.

Extractele alcoolice de Calendula officinalis și Calendula arvensis au fost diluate cu apă distilată la o concentrație corespunzătoare administrării a 5 g/kg corp/zi. Administrarea extractelor s-a realizat prin gavaj intragastric pe o perioadă de 10 zile.

Loturile de animale au fost organizate după cum urmează:

Lot de animale martor (M)

Lot de animale căruia i s-a administrat extract alcoolic obținut din C. arvensis prin gavaj intragastric timp de 10 zile (5g/kg corp/zi)

Lot de animale căruia i s-a administrat extract alcoolic obținut din C. officinalis prin gavaj intragastric timp de 10 zile (5g/kg corp/zi)

Sacrificarea animalelor s-a făcut după terminarea tratamentului. Animalele au fost inanițiate 10 ore înainte de sacrificare, iar sacrificarea a fost făcută prin dislocare cervicală în condiții de anestezie, conform nomelor în vigoare. Pentru determinările biochimice și histologice s-au recoltat probe de timus, splină și măduvă roșie hematogenă. Determinările enzimatice s-au făcut din omogenat de țesuturi obținut în sucroză 0,32 M, utilizând un omogenizator Potter cu pistil de sticlă.

S-au realizat următoarele determinări:

greutatea relativă și absolută a organelor (timus, splină, suprarenală)

colesterolul seric (metoda Kovacs, 1956)

Fosfataza alcalină din ser și omogenat de țesut: splină și timus (metoda Bergmayer, 1962)

Fosfataza acidă din omogenat de țesut: splină și timus (metoda Bergmayer, 1962)

Studii histologice din măduvă osoasă, timus, splină

Studii electronomicroscopice din timus, splină

Rezultatele obținute în urma testelor biochimice au fost prelucrate statistic prin metoda Chauvenet, pentru eliminarea datelor aberante, iar pentru stabilirea semnificației statistice, a fost utilizat testul “t” al lui Student.

II.2.2. MATERIALE ȘI METODE EXPERIMENTALE ÎN ADMINISTRAREA DE CICLOFOSFAMIDĂ

Experimentele au fost realizate pe șobolani albi Wistar, masculi, cu greutate de 170-180 g, menținuți în regim și condiții standard de crescătorie. Ciclofosfamida (CFA), produsă de Jenapharm, Ankerwerk-Germania, a fost dizolvată în prealabil în soluție NaCl fiziologică (0,9%) sterilă, și injectată intraperitoneal animalelor pe o perioadă de 3 zile.

Extractele alcoolice de Calendula officinalis și Calendula arvensis, au fost diluate cu apă distilată la o concentrație corespunzătoare administrării a 5 g/kg corp/zi. Administrarea extractelor s-a realizat prin gavaj intragastric pe o perioadă de 10 zile, după administrarea ciclofosfamidei.

Loturile de animale au fost organizate după cum urmează:

Lot de animale martor (M)

Lot tratat cu Ciclofosfamidă (40 mg/kg corp/zi) administrată prin injecții intraperitoneale timp de 3 zile.

Lot de animale tratat cu Ciclofosfamidă timp de 3 zile, după care a fost tratat cu extract de C. arvensis (5g/kg corp/zi) timp de 10 zile.

Lot de animale tratat cu Ciclofosfamidă timp de 3 zile, după care a fost tratat cu extract de C. officinalis (5g/kg corp/zi) timp de 10 zile.

Sacrificarea animalelor s-a făcut după terminarea tratamentului, la 14 zile de la administrarea primei doze de Ciclofosfamidă. Animalele au fost inanițiate 10 ore înainte de sacrificare, iar sacrificarea a fost făcută prin dislocare cervicală, în condiții de anestezie, conform normelor în vigoare. Pentru determinările biochimice s-au recoltat probe de sânge integral. Determinările enzimatice s-au făcut din ser sanguin obținut după centrifugarea sângelui.

Pentru studiile structurale și de microscopie electronică s-au prelevat probe din timus, splină și măduva roșie hematogenă.

II.2.3. TEHNICI DE LABORATOR UTILIZATE

Tehnici de histologie

Tehnica histologică cuprinde totalitatea operațiunilor care se efectuează în scopul aducerii unei probe biologice (un mic fragment de țesut sau organ) la stadiul de preparat microscopic. Pentru ca un preparat microscopic să fie corespunzător, el trebuie să fie pe de o parte suficient de transparent pentru a putea fi străbătut de lumină, iar pe de altă parte să ofere suficiente contraste, care să permită observarea celor mai fine detalii structurale.

Astfel, prepararea țesuturilor recoltate s-a realizat urmând succesiv cele 8 etape ale tehnicii histologice: recoltarea, fixarea, spălarea, includerea, secționarea, colorarea, montarea, etichetarea. Fixarea fragmentelor de organe s-a efectuat în formol, după care piesele au fost incluse în parafină și secționate la microtom. Pentru colorarea secțiunilor s-a urmat tehnica de colorare hematoxilină-eozină (Mureșan et al., 1974).

După montare și etichetare, studierea preparatelor la microscop și efectuarea microfotografiilor s-a realizat la un microscop optic Olympus cu expunere automată.

Tehnici de microscopie electronică

Microscopia electronică reprezintă mijlocul de investigație căruia îi datorăm întrega cunoaștere ultrastructurală a ființelor vii, cu descifrarea celor mai intime detalii celulare. Prin microscopie electronică se pot evidenția nu numai structuri, molecule sau atomi, ci se poate stabili compoziția în anumite elemente a unei zone dată din celulă. În cercetările pe secțiuni ultrafine, se pot urmări procesele de biosinteză ale unor molecule și de asamblare a acestora în structuri, mai mult, există posibilitatea de localizare a unor procese enzimatice, a proceselor de imunogeneză, a reacțiilor antigen-anticorp (Ploaie et al., 1979).

Tehnicile utilizate în microscopia electronică sunt în mare măsură similare acelora utilizate în microscopia optică, însă cu modificări la fiecare treaptă, deoarece structurile mult mai fine care pot fi observate la microscopul electronic, trebuie să fie conservate prin procedee preparative adecvate.

În experimentele noastre, imediat după sacrificarea fiecărui animal, s-au prelevat fragmente de organe, care au fost prelucrate după cum urmează. Fixarea s-a făcut într-o soluție de glutaraldehidă 2,7% în tampon fosfat 0,15 M, pH 7,2 și într-o soluție de acid osmic 1% în tampon fosfat 0,1 M, pH 7,2. Deshidratarea probelor s-a realizat în soluții de concentrații crescătoare de acetonă, iar infiltrarea și includerea, într-o rășină poliesterică de tip estapol W. Secțiunile ultrafine s-au executat la un microtom de tip LKB III, după care acestea au fost dublu contrastate cu acetat de uranil și citrat de plumb și apoi examinate la un microscop TESLA BS-500.

Tehnica și modul de lucru expuse mai sus au fost adaptate după lucrările consacrate în domeniul microscopiei electronice (Kay, 1967; Ploaie și Petre, 1979; Weakley, 1981).

II.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII

II.3.1. EFECTUL ADMINISTRĂRII EXTRACTELOR DE CALENDULA ASUPRA STRUCTURII UNOR ORGANE HEMATO- ȘI LIMFOPOIETICE, ÎN CONDIȚII NORMALE

Posibilele proprietăți imunomodulatoare exercitate de cele două extracte de Calendula, le-am investigat în primul rând prin studii structurale efectuate la nivelul măduvei hematogene, ca organ furnizor de celule, la nivelul timusului, ca reprezentant al organelor limfoide centrale și la nivelul splinei ca reprezentant al organelor limfoide periferice. În urma analizei rezultatelor obținute, am sperat să avem un tablou cât mai complet privind mecanismele intime de acțiune la nivel celular ale celor două extracte testate asupra unor organe hemato și limfopoietice la șobolani Wistar normali, în lipsa administrării unor agenți experimentali imunosupresori.

A. Studii histologice ale măduvei hematogene la șobolani tratați cu extracte de Calendula

Măduva osoasă hematogenă se prezintă la martor ca un organ foarte bine vascularizat, cu vase având pereți foarte subțiri în raport cu lumenul. Rețeaua reticulară prezintă un aspect normal. Sunt prezente puține celule adipoase.

Parenchimul apare cu aspect punctat, polimorf și policrom. Densitatea celulelor este mare iar polimorfismul lor este deosebit atât ca dimensiuni cât și ca aspect și afinitate tinctorială (Fig. II-1). Megacariocitele apar pe secțiuni ca celule mari, cu nuclei înmuguriți. Atât aspectul cât și numărul acestor celule sunt în limite normale.

Aceste aspecte demonstrează că procesele de hematopoieză se află în plină derulare, celulele observate fiind precursori ai elementelor figurate, aflate în diferite stadii de diferențiere și maturare.

În cazul loturilor tratate cu extracte de Calendula officinalis și Calendula arvensis, se remarcă densitatea celulară mare și polimorfismul accentuat, uneori mai evidente decât în cazul martorului (fig. II-2, II-3). Între cele două loturi nu s-au înregistrat diferențe notabile.

Aceste constatări sugerează faptul că populațiile celulare ale măduvei hematogene se află în plin proces de proliferare, diferențiere și maturare. Uneori hematopoieza se desfășoară la un nivel mai ridicat, comparativ cu martorul.

B. Studii histologice ale timusului șobolanilor tratați cu extracte de Calendula

Timusul animalelor martor prezintă lobi voluminoși, fiecare lob fiind învelit de o capsulă fină de țesut conjunctiv lax din care pleacă spre interior septe conjunctive însoțite de vase sanguine, septe care subdivid fiecare lob în lobuli de formă poligonală.

Lobulii timusului șobolanilor martor prezintă cele două zone, corticala și medulara, foarte bine exprimate, aflate în raport de 3:1 în favoarea corticalei (fig. II-4). Trecerea de la corticală la medulară se face net, motiv pentru care cele două zone pot fi bine evidențiate.

Comparativ cu medulara, corticala timică apare cu timocite mai numeroase și mai dens împachetate și cu un număr relativ mare de celule aflate în mitoze (fig. II-5) ceea ce demonstrează că la nivelul corticalei se derulează procese active (intense) de proliferare a timocitelor.

Timusul loturilor tratate cu extracte de Calendula officinalis și Calendula arvensis, prezintă o structură comparabilă cu a lotului martor. Nu se constată diferențe semnificative structurale nici între cele două loturi tratate cu cele două extracte și nici între acestea și lotul martor. Ambele loturi prezintă timusuri cu aspect normal, raportul corticală/medulară fiind de 3/1 (fig. II-6, II-7), corticala cu număr mare de timocite, multe aflate în diviziune(activitate mitotică intensă) (fig. II-8, II-9).

C. Studii histologice ale splinei șobolanilor tratați cu extracte de Calendula

În splina șobolanilor lotului martor se evidențiază o structură clară a celor două componente: pulpa albă și pulpa roșie (fig. II-10). Foliculii splenici sunt mari, centrați pe arteriole și majoritatea prezintă centru germinativ bine evidențiat. Sinusurile splenice sunt bine încărcate cu hematii și celule limfoide. Pe suprafața de secțiune se observă foarte rare megacariocite dispuse izolat și de dimensiuni relativ mici.

În cazul loturilor tratate cu extracte de Calendula officinalis și Calendula arvensis se remarcă acțiunea stimulatoare a celor două extracte vegetale asupra splinei, manifestată prin hiperplazia foliculilor splenici (fig. II-11) și a tecilor limfoide perivasculare, cât și o înmulțire vădită a numărului limfocitelor mici la nivelul pulpei roșii. Deși frecvența foliculilor cu centrii germinativi este mai mare în splina animalelor tratate cu extracte vegetale, structura acestora precum și indicele mitotic nu pare a fi cu nimic deosebit comparativ cu animalele lotului martor (fig. II-12). Aceste rezultate nu sunt surprinzătoare ținând seama de faptul că potrivit cercetărilor efectuate la majoritatea mamiferelor, celulele centrilor germinativi ai foliculilor splenici se caracterizează prin cele mai scurte intervale de timp ale perioadei S necesară pregătiri pentru diviziune. Acțiunea este comparabilă pentru ambele preparate administrate și testate.

II.3.2. EFECTUL ADMINISTRĂRII EXTRACTELOR DE CALENDULA ASUPRA ULTRASTRUCTURII UNOR ORGANE HEMATO- ȘI LIMFOPOIETICE, ÎN CONDIȚII NORMALE

În cadrul acestui experiment am urmărit și modificările care se produc la nivel ultrastructural în timusul, splina și măduvă roșie hematogenă a șobolanilor Wistar ca urmare a administrării timp de 10 zile consecutiv a extractelor de Calendula officinalis, respectiv Calendula arvensis, comparativ cu lotul martor. Aceste studii ultrastructurale sunt necesare în scopul lărgirii sferei de cunoaștere asupra modului de acțiune a extractelor vegetale studiate la nivel celular, precum și a elucidării mecanismelor sale de acțiune la nivel celular și subcelular în condiții normale.

A. Studii ultrastructurale ale timusului șobolanilor tratați cu extracte de Calendula

Lotul martor (fig. II-13 – II-30)

Aspectul caracteristic dominant al corticalei timusului șobolanilor din lotul martor, îl reprezintă conținutul său în numeroase timocite, dens împachetate (fig. II-13), cunoscând faptul că în corticală se găsesc aproximativ 95% din totalul timocitelor din timus (timocite mari, medii și mici).

Timocitele mari sunt dispuse preponderent la periferia lobulilor timici, în zona subcapsulară și au un diametru evident mai mare decât al celor medii și mici. Diametrul lor este în medie de 6-6,5µm din care nucleul ocupă aproape întreg volumul celular. Nucleul are un diametru de aproximativ 5µm, astfel că citoplasma ocupă doar zona îngustă în jurul nucleului. Atât forma celulei cât și forma nucleului este de regulă penta sau tetragonală (fig. II-14).

În citoplasma timocitelor mari se observă relativ numeroși ribozomi agregați de regulă în poliribozomi, câteva mitocondrii având cristele evidente, un complex Golgi, alcătuit din 3-4 saci aplatizați și puține microvezicule, centru celular și câteva profile scurte și înguste de reticul endoplasmic.

Timocitele mici constituie marea majoritate a corticalei timusului șobolanilor martor, ele rezultând în urma proliferării continue ce are loc mai ales în zona corticală subcapsulară. Ele apar dens împachetate și dispuse în grupe sau colonii celulare caracteristice (fig. II-15). Diametrul acestor celule este mai mic decât al timocitelor mari (4,5-5µm). Nucleul conține o cantitate mult mai mare de heterocromatină condensată în blocuri mari, fie dispusă izolat, fie tinde să formeze o bandă heterocromatinică continuă de-a lungul membranei interne a nucleului.

Citoplasma conține de asemenea numeroși poliribosomi, ceea ce îi conferă o electronodensitate crescută (fig. II-16). Caracteristic este însă faptul că citoplasma este în cantitate mai mică decât la timocitele mari, din care cauză organitele celulare sunt restrânse într-o zonă cu mai multă citoplasmă aflată într-o mică depresiune a nucleului. Astfel, în această zonă și în imediata apropiere se observă câteva mitocondrii (fig. II-16), cei doi centrioli, un mic complex Golgi, câteva microvezicule și rareori câte un profil de reticul endoplasmic.

Timocitele de mărime medie observate pe preparate, prezintă caractere ultrastructurale intermediare între cele două forme descrise mai sus în ceea ce privește diametrul lor și aspectele nucleului și cromatinei nucleare (fig. II-17).

Pe lângă aceste trei tipuri de timocite, în corticală se mai observă numeroase alte tipuri de timocite pe cale de alterare, fie picnozate sau chiar moarte, având dimensiuni mici și nucleul total sau aproape total condensat, fenomen ce însoțește procesul de apoptoză existent, inclusiv la nivelul timusului tânăr, normal (fig. II-18). Acestea sunt timocitele care în urma procesului de selectare s-au dovedit a nu poseda receptori specifici recunoașterii antigenilor străini, fapt pentru care ele se află pe cale de eliminare prin fagocitarea lor de către macrofage, fiind cunoscut faptul că aproximativ 98% dintre timocitele corticalei timusului vor avea această soartă în urma procesului de diferențiere-selectare-maturare.

Se remarcă prezența a numeroase timocite aflate în diferite faze ale diviziunii mitotice (fig. II-15, II-19, II-22), știut fiind că la nivelul corticalei timice au loc intense procese de proliferare.

De asemenea se observă rețeaua tridimensională a celulelor epiteliale reticulare (fig. II-20), în ochiurile căreia se găsesc timocitele, ce reprezintă populația celulară mobilă, majoritară în corticala timusului. Aceste celule se învecinează, la nivelul cortexului, cu numeroase timocite printre care își trimit prelungirile citoplasmatice cu care le înconjoară. Aceste prelungiri, la locul de întâlnire cu prelungirile celulelor reticulare învecinate, se leagă între ele prin desmozomi, asigurând astfel stabilitatea rețelei tridimensionale pe care o formează.

Nucleul celulelor epiteliale reticulare este relativ voluminos, eucromatic, fără blocuri de heterocromatină condensată, având 1 sau 2 nucleoli cu structură reticulară. În citoplasma acestor celule se observă relativ puține mitocondrii și ribosomi, un complex Golgi și scurte profile de reticul endoplasmic granular (fig. II-21).

De asemenea, este caracteristică prezența unor formațiuni granulare electrondense și a relativ puține vezicule (fig. II-21), despre care s-a crezut că ar fi formațiuni lizosomale, dar, din ce în ce mai mulți autori consideră că ele ar reprezenta un produs de secreție al acestor celule reticulare și în special al acelora aflate în zona cortico-medulară. Acest produs de secreție este posibil să reprezinte seria de proteine și polipeptide care au fost extrase din timus, izolate și caracterizate drept hormoni timici (timozina, timopoietina, timulina, timostimulina, timodulina și alți factori solubili) care acționează pentru a promova diferențierea și maturarea timocitelor.

În timusul animalelor martor se observă prezența ambelor tipuri de macrofage descrise recent în literatura de specialitate. Astfel, macrofagele propriu-zise, care au rol fagocitic, se regăsesc în tot timusul, pe când cele cu rol imunologic, care au fost descrise sub denumirea de celule reticulare interdigitate sau celule dendritice, se găsesc localizate în primul rând în regiunea cortico-medulară și apoi în cea medulară a timusului.

În corticala timusului lotului martor, am depistat, așa cum era de așteptat, numai macrofage. Aceste celule sunt mari, cu nucleul de cele mai multe ori neregulat ca formă, de electrondensitate variabilă (fig. II-22). Heterocromatina nucleară este granulară și dispusă de regulă perinuclear.

Macrofagele conțin un bogat echipament enzimatic și sunt responsabile de captarea și distrugerea timocitelor degenerate și necorespunzătoare din punct de vedere imunologic, fiind deci distruse la nivelul corticalei, fără a li se mai permite migrarea către medulară (fig. II-23).

Zona cortico-medulară se caracterizează atât printr-o abundență a septelor conjunctive, cât și a unei rețele de capilare sanguine însoțitoare, mult mai extinse decât cea din zona corticală. Populația de timocite este mai rară, datorită în primul rând reduceri lor numerice din cauza intensului proces de degenerare și fagocitare a lor la nivelul corticalei.

Se remarcă prezența la nivelul acestei zone a celulelor reticulare interdigitale, celule de tip macrofagic, dar cu rol preponderent imunologic, celule descrise mai întâi sub denumirea de celule de tip special și ulterior ca celule reticulare dendritice (fig. II-24).

Existența și prezența acestor celule în zona cortico-medulară contribuie la asigurarea microcondițiilor de selectare negativă și pozitivă a timocitelor în procesul diferențierii, maturării și conferirii capacității imunologice a acestora. Aceste celule, ca și macrofagele, nu se leagă prin desmozomi de celulele învecinate și nici nu posedă tonofilmente în citoplasmă. Se poate remarca forma lor neregulată, cu marginile sinuoase și numeroase expansiuni digitiforme care înconjoară celulele adiacente sau mai îndepărtate. Ele posedă o citoplasmă mai clară cu un moderat număr de organite, adesea dispuse în zona perinucleară, precum și foarte puțini lizozomi primari și incluziuni dense. Adesea se mai pot observa mici vezicule și microtubuli, totdeauna dispuse în centrul citoplasmei. Nucleul este dispus excentric, foarte neregulat ca formă. Cromatina este fin granulară și foarte rar concentrată în blocuri perinucleare. Citoplasma periferică (ectoplasma) apare clară și lipsită de organite celulare.

Zona medulară se caracterizează atât printr-o abundență mai mare de vase sanguine, cât și printr-o rețea cu ochiuri mici alcătuită din numeroase celule epiteliale reticulare având prelungiri citoplasmatice scurte (fig. II-25).

Nu toate ochiurile rețelei reticulare sunt la fel de populate cu timocite. În unele ochiuri acestea sunt foarte rare, pe când în altele timocitele sunt dispuse în grupuri. Sunt prezente și timocite pe cale de degenerare (fig. II-26).

În secțiuni favorabile, se poate constata că timocitele zonei medulare prezintă o citoplasmă mai abundentă decât timocitele zonei corticale și că au, de regulă, mai multe mitocondrii.

Mastocitele sunt dispuse în grupuri de 3-5 celule, preferențial în jurul vaselor și de-a lungul septelor conjunctive (fig. II-27).

Rareori apar eozinofile și polimorfonucleare neutrofile (fig. II-28).

Se observă și plasmocite cu nucleu caracteristic și reticul endoplasmic rugos bine reprezentat (fig. II-29).

În medulara timică situată în imediata vecinătate a zonei cortico-medulare, se observă o rețea de celule reticulare interdigitate care, prin prelungirile lor aflate în contact, se pare că realizează o adevărată barieră de control a timocitelor la acest nivel.

De asemenea, în medulară se mai găsesc relativ numeroase macrofage care prezintă aspecte structurale și funcționale diferite, ceea ce atestă o intensă activitate de înlăturare a timocitelor necompetente (fig. II-30).

Loturile tratate cu extracte de Calendula officinalis și

Calendula arvensis (fig. II-31 – II-36)

Analiza electronomicroscopică a timusului șobolanilor din cele două loturi tratate cu extracte vegetale ne indică faptul că cele două extracte de Calendula nu induc alterări ultrastructurale la nivelul timusului, ci din contră ambele extracte s-au dovedit a avea un efect stimulator asupra procesului de proliferare celulară de la nivelul corticalei lobulilor timici.

Afirmația este susținută în primul rând de existența unui număr mare de celule aflate în diviziune mitotică (fig. II-31, II-32), numărul acestora fiind mai mare decât la lotul martor.

În general se constată că aspectele ultrastructurale descrise pe larg la lotul martor se regăsesc și la cele două loturi tratate cu extractele respective. Timocitele sunt numeroase și dens împachetate (fig. II-33), puține dintre ele aflându-se în stare degenerativă.

Celulele reticulare sunt normal conformate, prelungirile lor printre timocite fiind evidente (fig. II-34, II-35). Uneori în citoplasma acestora se evidențiază chiști.

De asemenea, se constată prezența macrofagelor fagocitare cu aspecte ultrastructurale similare martorului (fig. II-36).

B. Studii ultrastructurale ale splinei șobolanilor tratați cu extracte de Calendula

Lotul martor (fig. II-37 – II-49)

În cazul lotului martor, aspectele structurale întregistrate la nivelul pulpei albe și roșii splenice se regăsc în studiile electronomicroscopice ale splinei șobolanilor normali.

Astfel, pulpa albă (fig. II-37, II-38) apare populată normal cu populații limfocitare de dimensiuni variate dispuse la nivelul tecilor limfoide periarteriale și foliculilor limfatici splenici.

Zona tecilor limfoide periarteriale prezintă o populație limfocitară normală, dispusă în jurul arteriolelor, cu numeroase limfocite mici și medii, de dimensiuni reduse și citoplasmă electrondensă cu puține organite celulare, greu de identificat (fig. II-38).

În pulpa albă a splinei lotului martor se observă numeroase limfocite aflate în diviziune mitotică, știut fiind că la nivelul pulpei albe au loc intense procese de proliferare (fig. II-39).

Limfocitele mari (fig. II-40) sunt predominante în centrul germinativ al foliculilor limfatici și prezintă un nucleu voluminos cu cromatină fin granulară și nucleol evident, astfel că citoplasma ocupă doar zona îngustă în jurul nucleului. În citoplasma acestora se observă relativ numeroși ribozomi agregați de regulă în poliribozomi, câteva mitocondrii având cristele evidente, un complex Golgi, alcătuit din 3-4 saci aplatizați, puține microvezicule și câteva profile scurte și înguste de reticul endoplasmic.

Limfocitele mici sunt numeroase, dar mai puține comparativ cu cele medii și mari (fig. II-41). Limfocitele mici au un diametru mai mic decât limfocitele mari. Nucleul conține o cantitate mult mai mare de heterocromatină condensată în blocuri mari, fie dispusă izolat, fie tinde să formeze o bandă heterocromatinică continuă de-a lungul membranei interne a nucleului. Citoplasma conține de asemenea numeroși poliribosomi, ceea ce îi conferă o electronodensitate crescută. Caracteristic este însă faptul că citoplasma este în cantitate mai mică decât la limfocitele mari, din care cauză organitele celulare sunt restrânse într-o zonă cu mai multă citoplasmă aflată într-o mică depresiune a nucleului. Astfel, în această zonă și în imediata apropiere se observă câteva mitocondrii, cei doi centrioli, un mic complex Golgi, câteva microvezicule și rareori câte un profil de reticul endoplasmic.

Limfocitele de mărime medie observate pe preparate, prezintă caractere ultrastructurale intermediare între cele două forme descrise mai sus în ceea ce privește diametrul lor și aspectele nucleului și cromatinei nucleare (fig. II-42).

Între celulele populației limfocitare se observă celule reticulare stelate, cu numeroase prelungiri, ce înconjoară grupuri de limfocite (fig. II-43).

Zona marginală pulpei albe prezintă o bună coeziune celulară și un aspect normal din punct de vedere al compoziției (fig. II-44, II-45).

Această zonă conține, așa cum era de așteptat, mai multe limfocite și plasmocite decâ restul pulpei roșii. Plasmocitele prezintă un nucleu caracteristic și reticul endoplasmic rugos bine reprezentat, numeroase fiind în diviziune (fig. II-46, II-47).

Această proporție celulară este normală, deoarece zona marginală splenică este responsabilă de contactul dintre antigeni și celulele imunocompetente, precum și de recirculația limfocitelor.

Tot în zona marginală se găsesc numeroase macrofage cu un bogat echipament enzimatic, fiind responsabile în fagocitarea și îndepărtarea resturilor antigenice (fig. II-48).

Pulpa roșie a splinei șobolanilor martor apare normală, cu sinusuri venoase normal structurate și spații interstițiale populate în special de hematii, mai rar macrofage migrate, monocite, limfocite, plasmocite (fig. II-49).

Loturile tratate cu extracte de Calendula officinalis și Calendula arvensis (fig. II-50–II-56)

În cazul splinei șobolanilor tratați numai cu extracte de Calendula, aspectele de hipertrofie și hiperplazie a pulpei albe înregistrate la examenul microscopic obișnuit, apar și mai evidente în studiul electronomicroscopic.

Astfel, în toate zonele studiate apare pregnantă creșterea densității celulare pe seama populației limfocitare, comparativ cu aspectele înregistrate în cazul animalelor lotului martor (fig. II-50, II-51).

Ceea ce atrage de asemenea atenția este predominanța în splina animalelor tratate, a limfocitelor tinere (fig. II-52, II-53) cu nuclei mari, eucromatici, nucleoli proeminenți și citoplasmă bogată în organite celulare, în special a elementelor reticulului endoplasmic rugos. Limfocitele mici, cu nuclei picnotici și citoplasmă puțină și electronodensă, sunt mult mai puțin întâlnite, comparativ cu martorul.

Deși greu de apreciat din punct de vedere cantitativ, raportul stabilit între limfocitele T și limfocitele B pare a fi sub influența extractelor vegetale, influențat în favoarea limfocitelor aparținând liniei celulare B. Astfel, se remarcă apariția mai frecventă a limfocitelor ce prezintă caracteristicile ultrastructurale ale liniei limfocitare B și chiar a plasmocitelor, identificându-se și o frecvență sporită a mitozelor acestui tip limfocitar (fig. II-54, II-55).

Extractele de Calendula se pare că exercită însă o acțiune stimulatoare și asupra celulelor stromei concretizată prin hiperplazia și hipertrofia celulelor reticulare, a fibroblastelor și macrofagelor splenice (fig. II-56).

II.3.3. EFECTUL EXTRACTELOR DE CALENDULA ASUPRA STRUCTURII UNOR ORGANE HEMATO- ȘI LIMFOPOIETICE, DUPĂ ADMINISTRARE DE CICLOFOSFAMIDĂ

Deoarece acțiunea citostaticelor și implicit a ciclofosfamidei nu este selectivă, ele acționând atât la nivelul celulelor tumorale cât și la nivelul celulelor sănătoase, efectele secundare ale acestor medicamente sunt extrem de complexe. Efectele nocive vor interesa cu precădere țesuturile ale căror celule se divid rapid și continuu, în particular cel germinativ, hematopietic. Aceste perturbări induse de administrarea citostaticului sunt strâns corelate cu instalarea unor grave perturbări structurale și funcționale la nivelul structurilor limfopoietice centrale și periferice. De aceea, studiile noastre histologice se vor axa în special pe urmărirea modificărilor structurale care apar la nivelul măduvei hematogene, timusului și splinei șobolanilor carora li s-a administrat ciclofosfamidă.

Aceleași organe au fost investigate din punct de vedere structural în cazul loturilor cărora li s-a administrat ulterior extract de Calendula officinalis, respectiv Calendula arvensis, comparativ cu martorul și lotul tratat doar cu ciclofosfamidă. Aceste investigatii au fost realizate cu scopul de a surprinde eventualele proprietăți imunostimulatoare ale celor două extracte vegetale testate, materializate prin atenuarea efectelor imunosupresoare exercitate de ciclofosfamidă, respectiv prin diminuarea alterărilor apărute în structura organelor hemato și limfopoietice.

A. Studii histologice ale măduvei hematogene la șobolani tratați cu Ciclofosfamidă și extracte de Calendula

Lotul tratat cu ciclofosfamidă

La 24 de ore de la ultima administrare a citostaticului, măduva osoasă hematogenă apare deosebit de congestionată iar numărul celulelor este scăzut drastic (fig. II-57), fără a putea face diferențe notabile între liniile celulare de la acest nivel. Practic citostaticul a acționat brutal asupra tuturor linilor celulare de la nivelul măduvei osoase, stopând proliferarea și diferențierea celulelor angajate atât în granulocitopoieză cât și în monocitopoieză, limfocitopoieză și trombocitopoieză.

La 10 zile de la administrarea citostaticului, măduva osoasă hematogenă are aspect foarte diferit în comparație cu situația existentă la 24 de ore. Astfel, vascularizația apare cu aspect comparabil cu martorul (fig. II-58), iar numărul celulelor existente aici este foarte mare, situându-se aproximativ la nivelul martorului. Celulele sunt foarte polimorfe atât ca dimensiune cât și ca formă și afinitate tinctorială, ceea ce demonstrează că hematopoieza se derulează intens pe toate liniile (granulocitară, monocitară, limfocitară și trombocitară).

Loturile tratate cu ciclofosfamidă și extracte de Calendula

În cazul celor două loturi tratate cu extracte de Calendula, la 10 zile de la ultima administrare a citostaticului, măduva osoasă hematogenă este în plină funcționalitate, iar numărul celulelor este atât de mare încât îl întrece pe cel al martorului (fig. II-59).

Extractele vegetale utilizate au avut un efect stimulator asupra hematopoiezei, așa încât la loturile care au primit astfel de preparate aceasta se derulează la 10 zile după adminstrarea citostaticului, la un nivel superior martorului. Acest lucru este foarte important deoarece, prin reducerea drastică a hematopoiezei, s-a creat practic un deficit celular deosebit în reaprovizionarea organismului cu celule efectoare ale sistemului imun, iar prin administrarea extractelor de Calendula se reduce practic perioada în care organismul este descoperit din punct de vedere imunologic.

B. Studii histologice ale timusului șobolanilor tratați cu Ciclofosfamidă și extracte de Calendula

Lotul tratat cu Ciclofosfamidă

În cazul timusului recoltat de la animalele sacrificate la 24 de ore de la ultima administrare de ciclofosfamidă, se constată modificări pronunțate care demonstrează faptul că citostaticul administrat a acționat rapid asupra populației de timocite, în special asupra celor de la nivelul corticalei lobulilor timici. Astfel se constată o atrofie timică patologică materializată prin reducerea suprafeței zonei corticale până la segmentarea acesteia, care pe alocuri are aspect insular. De asemenea, la nivelul corticalei se constată existența în unii lobuli a unor zone de timocitoliză în focar care îi conferă în ansamblu corticalei aspect de cer înstelat. Lobulii timici apar semnificativ mai mici ca dimensiune în comparație cu martorul și mulți dintre ei prezintă formă alungită și nu poligonală cum apare în mod normal (fig. II-60).

Această reducere se datorează în principal depopulării corticalei care apare mult mai subțire decât la martor și cu o reducere drastică a numărului de timocite. Datorită acestui fapt, corticala și medulara nu numai că nu sunt reprezentate procentual ca la martor, dar nici nu pot fi distinse una de cealaltă. În acest context, lobulii timici au tendință de omogenizare structurală (aspect numit „medularizarea lobulilor”). În unii lobuli depopularea corticalei este atât de pronunțată, încât ea apare mai rarefiată decât medulara, dând aspectul cunoscut sub numele de „lobuli inversați” (fig. II-61).

Reducerea dimensiunilor corticalei și a densității timocitelor de la acest nivel, apare ca o consecință a unui proces de depleție celulară rapidă, iar apariția de zone de timocitoliză demonstrează că un număr mare de timocite sunt lizate pe loc la nivelul corticalei. De asemenea, celulele în diviziune nu pot fi evidențiate, ceea ce demonstrează că citostaticul a stopat procesul de proliferare timocitară ce se derulează la nivel ridicat în cazul lotului martor. Depleția timocitară, timocitoliza și stoparea diviziunilor explică aspectul rarefiat (fig. II-62) și pe alocuri chiar fragmentat al corticalei lobulilor timici.

Pe toată suprafața de secțiune a lobulilor timici se constată procese de stază, chiar cu extravazare de hematii ce apar dispersate printre timocite, în unele zone. Staza apare mai pronunțată la nivelul medularei lobulilor timici. Staza este însoțită de edem generalizat, de intensitate moderată. Stază și edem se constată și la nivelul spațiilor interlobulare care apar net îngroșate comparativ cu martorul. Edemul apare net exprimat în spațiile perivasculare, mai ales a celor din interstițiul timic (fig. II-63). La nivelul interstițiului apar zone în care numărul eozinofilelor este semnificativ crescut în comparație cu martorul.

Procesele patologice constatate nu afectează corpusculii Hassall, a căror număr și dimensiuni nu apar modificate în raport cu martorul.

După o perioadă de 10 zile de la administrarea ciclofosfamidei, se constată reluarea parțială a activității specifice a timusului. Lobulii sunt ceva mai mici decât la martor, iar raportul între corticală și medulară este de aproximativ 1:1 (fig. II-64).

Popularea cu timocite a celor două zone este sub nivelul martorului, iar indicele mitotic este scăzut (fig. II-65). Aceste aspecte ne permit observația că la doza de CFA administrată, nu se produc la nivelul timusului fenomene ireversibile, însă reluarea activității se face foarte lent.

Loturile tratate cu ciclofosfamidă și extracte de Calendula

Animalele din cele două loturi care au fost tratate pe lângă citostatic și cu extracte de Calendula, prezintă un timus comparabil cu al lotului martor, atât în ceea ce privește raportul corticală : medulară, cât și în privința densității timocitelor de la nivelul corticalei lobulilor timici (fig. II-66, II-67).

Indicele mitotic la ambele loturi tratate este comparabil cu cel existent în cazul martorilor (fig. II-68, II-69).

În unii lobuli timici densitatea celulelor de la nivelul corticalei pare ușor peste nivelul martorului. La nivelul medularei nu se constată diferențe sesizabile în raport cu martorul. Aspectele constatate sugerează faptul că extractele utilizate în acest experiment au stimulat activitatea proliferativă timocitară de la nivelul corticalei lobulilor timici, după tratamentul cu citostatice, într-un interval mai scurt comparativ cu lotul care după administrare de citostatice nu a primit nici un tratament. Între cele două loturi tratate cu extracte nu s-au semnalat diferențe demne de luat în considerare, ceea ce demonstrează că acțiunea lor este comparabilă, cel puțin în cazul timusului și a citostaticului utilizat în aceste experimente.

Aspectele constatate de noi scot în evidență faptul că după administrare de ciclofosfamidă apar modificări pronunțate la nivelul timusului de șobolan, însă acestea nu au caracter ireversibil. După încetarea efectului citostaticului, timusul intră într-un proces progresiv de refacere, care necesită însă o perioadă mai lungă de timp. Extractele de Calendula sunt în măsură să potențeze aceste procese, scurtând semnificativ perioada necesară refacerii structurale și funcționale a timusului. Dintre cele două extracte testate, efectul stimulator ceva mai semnificativ l-a avut Calendula arvensis.

C. Studii histologice ale splinei șobolanilor tratați cu Ciclofosfamidă și extracte de Calendula

Lotul tratat cu Ciclofosfamidă

Studiile histologice evidențiază la șobolanii tratați cu ciclofosfamidă, la 24 ore, o ușoară îngroșare a capsulei și trabeculilor. Foliculii splenici sunt majoritatea de dimensiuni apropiate de ale martorului dar cu structură mult modificată. La nivelul lor nu se mai constată prezența de centru germinativ și un număr mare de limfocite din structura lor se află în diferite stadii de necrobioză (Fig. II-70). Încărcarea sinusurilor cu eritrocite și celule limfoide este foarte slabă. Modificările constatate scot în evidență faptul că acțiunea citostaticului asupra populației limfocitare din splină este ceva mai lentă în comparație cu situația constatată la nivelul timusului în acest moment al experimentului. Acest lucru este explicabil dacă ținem cont de rata mare de diviziune a timocitelor din corticala timusului și deci de existența unui număr mult mai mare de limfoblaști la nivelul timusului comparativ cu splina.

După o perioadă de 10 zile de la administrarea Ciclofosfamidei asistăm la un început de refacere a structurii foliculilor splenici (fig. II-71). Zona centro-foliculară începe să se contureze, însă foliculii sunt rari și de dimensiuni reduse. Sinusurile splenice sunt relativ bine încărcate cu hematii și celule limfoide. Se constată prezența pe toată suprafața de secțiune, a numeroase megacariocite (fig. II-72) cu un polimorfism accentuat, ceea ce sugerează declanșarea la nivelul organului a unui proces de hematopoieză compensatorie. Această afirmație este susținută și de prezența a numeroase granulocite, atât neutrofile cât și eozinofile, dispuse sub formă de plaje și având structură polimorfă, ceea ce sugerează că ele se află în diferite stadii evolutive (fig. II-73, II-74).

Loturile tratate cu Ciclofosfamidă și extracte de Calendula

La loturile tratate cu ciclofosfamidă și extracte de Calendula (fig. II-75, II-76), fenomenele de refacere a structurii organului sunt mult mai avansate decât la lotul tratat numai cu ciclofosfamidă, însă se găsesc sub nivelul martorilor. La aceste loturi foliculii splenici sunt reprezentați numai de zona germinativă, fără coroană limfocitară periferică. Sinusurile splenice sunt foarte bine încărcate cu hematii și celule limfoide. Numărul megacariocitelor este cu mult mai mic decât la lotul anterior dar este totuși peste nivelul observat la animalele lotului martor. Aspectul sugerează că măduva osoasă începe să facă față nevoilor de celule și hematopoieza compensatorie de la nivelul splinei este aproape stopată. Toate aceste aspecte pledează pentru un efect semnificativ al acestor preparate la nivelul organului în refacere.

II.3.4. EFECTUL EXTRACTELOR DE CALENDULA ASUPRA ULTRA-STRUCTURII UNOR ORGANE HEMATO- ȘI LIMFOPOIETICE, DUPĂ ADMINISTRARE DE CICLOFOSFAMIDĂ

Investigațiile structurale întreprinse asupra unor unor organe hemato și limfopietice, ne-au relevat faptul că sub acțiunea ciclofosfamidei se produc grave perturbări structurale, refacerea structurii acestor organe fiind mult mai rapidă și mai eficientă sub acțiunea extractelor vegetale testate, decât prin refacerea de la sine, fără intervenția altor factori. Dar rezultatele obținute prin studile histologice sunt concludente doar după investigarea acestor organe din punct de vedere ultrastructural.

A. Studii ultrastructurale ale timusului șobolanilor tratați cu ciclofosfamidă și extracte de Calendula

Lotul tratat cu ciclofosfamidă

La 24 ore după administarea primei doze de ciclofosfamidă, timusul apare extrem de afectat, procesele degenerative și alterative evidențiate prin studii structurale la nivelul timusului, fiind confirmate de imaginile electronomicroscopice. Ciclofosfamida acționează rapid și brutal asupra populației de timocite din corticala timusului, majoritatea celulelor prezentând semne de alterare mai discrete sau mai pronunțate (fig. II-77).

Se constată o tendință de condensare a cromatinei în zona periferică a nucleului timocitelor, până la uniformizarea acesteia, ceea ce duce la distrugerea și moartea acestor timocite (hipercromatoză corticală) (fig. II-77, II-78). Modificări pronunțate au fost constatate și la nivelul citoplasmei timocitelor, care apare vacuolizată, cu aspect de edem. Mitocondriile timocitelor devin parțial sau total vacuolizate, lipsite de criste și matrice mitocondrială (fig. II-78).

Distrugerea unui număr mare de timocite, dublată de stoparea diviziunilor, are drept consecință o reducere drastică a numărului de timocite care apar în multe zone distanțate, cu spații mari între ele (fig. II-79). Aceste spații sunt ocupate de edem în care sunt prezente numeroase detritusuri celulare rezultate în urma alterării timocitelor. Reducerea drastică a numărului de timocite va crea cel puțin pentru o perioadă de timp, o situație extrem de dezavantajoasă din punct de vedere al proceselor de supraveghere și apărare la care participă limfocitele T.

Un fapt demn de remarcat îl reprezintă creșterea numărului de macrofage, care sunt răspândite în tot cortexul timic. Macrofagele sunt mari, cu nucleu eucromatic, citoplasma încărcată cu lipide, incluziuni vacuolare și doar rareori cu resturi de limfocite (fig. II-80). În zona cortico-medulară se observă timocite a căror nuclei au contur neregulat, citoplasma ușor rarefiată, cît și o creștere a zonelor ocupate de țesut conjunctiv, în care fibrocitele și fasciculele de colagen sunt evidente (fig. II-81).

În alte porțiuni ale zonei cortico-medulare se constată o depleție accentuată a timocitelor cu evidențierea celulelor epiteliale reticulare care prezintă o citoplasmă vacuolizată (fig. II-82). Timocitele din aceste porțiuni, fie sunt izolate în grupe mici de 3-5 celule ce sunt înconjurate de fascicule de colagen care se pare că se află în continuă proliferare (fig. II-83), fie sunt înconjurate de prelungirile citoplasmatice hipertrofiate ale celulelor reticulare. În cea mai mare parte a medularei se constată o proliferare de colagen care, într-o fază incipientă, induce deformarea timocitelor care se alungesc sau iau forme aberante, concomitent cu degradarea citoplasmei (fig. II-84). Colagenul proliferat invadează mari porțiuni din medulară, cu încorsetarea timocitelor, care suferă procese de liză. Ca urmare apar multe spații goale, lipsite de celule.

La 10 zile după administrarea ultimei doze de CFA, timusul șobolanilor tratați numai cu CFA, apare mult modificat față de 24 ore, în sensul că procesele alterative, deși prezente încă, se derulează la un nivel mult mai redus, ceea ce înseamnă că efectul citostaticului este încă prezent, dar a diminuat foarte mult în intensitate. Reducerea efectului citostaticului crează premizele reluării activității de proliferare celulară specifice corticalei timice. Aspectul este sugerat de prezența mitozelor și refacerea într-o oarecare măsură a populației de timocite, deși numeric acestea sunt mult sub nivelul martorului (fig. II-85). Se constată reluarea parțială a proceselor de proliferare timocitară, dar până la derularea lor la nivelul martorului mai este încă mult.

Loturile tratate cu ciclofosfamidă și extracte de Calendula

În cazul loturilor care pe lângă CFA au primit și extracte vegetale, procesele de refacere se derulează la un nivel semnificativ mai crescut, numărul celulelor în diviziune mitotică fiind net mai mare (fig. II-86, II-87).

Densitatea timocitelor este net superioară (fig. II-88, II-89) comparativ cu lotul tratat numai cu ciclofosfamidă, fiind foarte apropiată de cea a lotului martor, în special la lotul tratat cu extract de Calendula arvensis (fig. II-89).

Aspectele constatate evidențiază clar reluarea diviziunilor, ceea ce ne indică efectul stimulator al acestor extracte.

Acest fapt este deosebit de benefic pentru organismul care a fost supus terapiei cu CFA, întrucât se scurtează semnificativ perioada necesară refacerii structurale și funcționale a timusului cu implicații directe asupra posibilităților de apărare față de eventuali agresori cu care organismul ar putea să se confrunte în perioada cât este supus terapiei cu citostatice.

B. Studii ultrastructurale ale splinei șobolanilor tratați cu ciclofosfamidă și extracte de Calendula

Lotul tratat cu ciclofosfamidă

Ceea ce atrage atenția, de la prima vedere, în studiul structurii fine a splinei șobolanilor supuși terapiei cu ciclofosfamidă, este dilatarea vizibilă a spațiilor intercelulare cu pierderea coeziunii dintre celule, comparativ cu aspectul înregistrat în splina animalelor martor (fig. II-90).

Uneori, dilatarea spațiilor intercelulare este exagerată cu infiltrare masivă de hematii (fig. II-91).

De asemenea, apare cu o frecvență mărită fenomenul de pediculare și fragmentare a citoplasmei limfocitelor, cu acumularea unei cantități mai mici sau mai mari de material amorf în spațiile edemațiate (fig. II-92).

La o analiză mai atentă se remarcă atât la nivelul pulpei albe cât și la nivelul pulpei roșii o predominanță a formelor celulare cu citoplasmă puțină, săracă în organite și cu o electrondensitate mai mare decât la martor (fig. II-93, II-94). Nu se remarcă însă alterări infrastructurale specifice ale organitelor celulare.

Aspectele constatate sugerează o accelerare a proceselor de îmbătrânire și liză celulară.

Loturile tratate cu ciclofosfamidă și extracte de Calendula

În marea majoritatea a cazurilor, structura fină a splinei animalelor tratate cu ciclofosfamidă și extracte de Calendula, apare puțin modificată față de cea a splinei animalelor martor, ceea ce sugerează acțiunea protectoare și limfostimulatoare a acestor două extracte vegetale. Astfel, în cazul ambelor loturi, în prezența tratamentului cu extracte de Calendula, alterările induse sub influența ciclofosfamidei sunt absente în marea majoritate a microfotografiilor electronice. Atât distribuția cât și ultrastructura celulelor reticulare, a fibrocitelor sau a diferitelor categorii de limfocite apar în splina animalelor tratate consecutiv cu ciclofosfamidă și extracte vegetale, apropiate de martor (fig. II-95, II-96, II-97).

În sfârșit, examenul electronomicroscopic a evidențiat un aspect amintit în cadrul descrierii modificărilor citologice și anume cel de creștere a numărului megacariocitelor în splina șobolanilor tratați consecutiv cu ciclofosfamidă și extractele vegetale testate, observându-se totodată și o înmulțire a numărului plachetelor sanguine, ce apar mult mai frecvent în microfotografiile obținute în cazul acestui grup de animale (fig. II-99). De asemenea sunt prezente și numeroase macrofage active în fagocitarea hematiilor (fig. II-98).

Totuși, un număr restrâns de animale prezintă modificări ce amintesc alterările ultrastructurale semnalate în cazul lotului de animale tratate cu ciclofosfamidă, fără protecția tratamentului cu extracte vegetale. Astfel, se remarcă o dilatare a spațiilor intercelulare cu o infiltrare simultană a unui număr sporit de hematii și apariția unui număr mare de celule picnotice. Fenomenul de pediculare și fragmentare al citoplasmei limfocitelor este de asemenea mult mai frecvent la aceste animale, comparativ cu animalele lotului martor. Cu toate acestea, comparativ cu animalele tratate exclusiv cu ciclofosfamidă, la care alterările apar în mod constant și vizibil la toate animalele, adminstrarea extactelor de Calendula previne sau atenuează în mare măsură aceste modificări. În acest context am remarcat dilatarea mai puțin pronunțată a spațiilor intercelulare comparativ cu splina animalelor tratate exclusiv cu ciclofosfamidă.

Ca urmare, putem aprecia că extractele de Calendula s-au dovedit capabile de a acționa ca stimulatoare nespecifice ale celulelor sistemului reticuloendotelial și mai ales ale liniei celulare limfocitare, acțiune care apare evidentă atât la animalele normale cât și la animalele cărora li s-a administrat ciclofosfamidă.

II.3.5. EFECTUL EXTRACTELOR DE CALENDULA ASUPRA UNOR PARAMETRI IMUNOLOGICI DETERMINAȚI DIN SÂNGE, DUPĂ ADMINISTRARE DE CICLOFOSFAMIDĂ

Din realizarea formulei leucocitare la loturile tratate cu Ciclofosfamidă, respectiv cu Ciclofosfamidă și extract de Calendula arvensis, se observă că administrarea de CFA determină o scădere a numărului de neutrofile (grafic II-1) din sângele periferic chiar începând de la 24 de ore de la administrarea CFA, precum și o scădere a numărului de limfocite (grafic II-2) și a numărului de monocite (grafic II-3). După o perioadă de 5-7 zile de la administrarea CFA începe procesul de refacere și de repopulare cu elemente sanguine, iar la animalele care au primit extract de Calendula față de cele netratate, aceste procese sunt reluate la un nivel superior. Aceste date ne sugerează că administrarea extractului a avut un efect de stimulare la nivelul măduvei hematogene a seriei granulocitare, monocitare și limfocitare și procesele de refacere sunt mai accelerate decât în cazul refacerii de la sine.

II.4. CONCLUZII

Administrarea extractelor de Calendula arvensis și Calendula officinalis șobolanilor Wistar în condiții normale pe o perioadă de 10 zile, nu manifestă efecte toxice secundare la nivelul organelor studiate: măduvă hematogenă, timus și splină.

Investigațiile structural-funcționale efectuate, demonstrează faptul că extractele vegetale testate stimulează într-o oarecare măsură proliferarea, diferențierea și maturarea celulelor la nivelul organelor hemato-și limfopoietice.

Administrarea ciclofosfamidei pe o perioadă de 3 zile a determinat o alterare structurală a organelor studiate, precum și o dereglare a unor parametri biochimici ai acestor organe.

Acțiunea toxică a ciclofosfamidei este îndreptată preponderent asupra organelor cu diviziuni celulare intense, cele mai afectate fiind măduva hematogenă, timusul și splina, organe caracterizate printr-o profundă perturbare a componentei celulare cât și a celei vasculare: depleție celulară (prin blocarea diviziunilor mitotice) cu depopulare masivă urmată de fibrozare, stază sanguină și congestie vasculară, edeme perivasculare și uneori focare hemoragice.

Deși au o amploare și o extindere deosebită, modificările structurale și ultrastructurale induse de ciclofosfamidă sunt reversibile, ceea ce dovedește relularea funcționalității organelor studiate. Totuși la 10 zile de la administrarea ultimei doze de citostatic, parametrii morfo-funcționali sunt mult inferiori martorului.

Extractele de Calendula administrate prin gavaj intragastric șobolanilor tratați cu Ciclofosfamidă au determinat o stimulare a proceselor de refacere structurală și funcțională de la nivelul organelor studiate.

Administrarea celor două extracte de Calendula a determinat restabilirea structurală și funcțională a timusului afectat de administrarea citostaticului, care constă în refacerea structurală a lobulului timic (restabilirea raportului corticală/medulară), în stimularea mitozelor în corticala timică la un nivel similar martorului, precum și restabilirea homeostaziei enzimatice (activitatea unor enzime timice este restabilită).

Administrarea extractelor de Calendula șobolanilor tratați cu ciclofosfamidă a determinat la nivelul splinei o accelerare a proceselor de refacere structurală și ultrastructurală, dereglate de administrarea citostaticului.

Fenomenele de refacere au fost observate la nivelul foliculilor splenici care sunt bine reprezentați și cu centru germinativ foarte dezvoltat. Atât distribuția, cât și ultrastructura celulelor reticulare, a fibrocitelor și a diferitelor categorii de limfocite apar în splina loturilor animalelor tratate consecutiv cu ciclofosfamidă și extracte vegetale, apropiate de martor. Parametri biochimici determinanți sunt doar parțial restabiliți.

Administrarea extractelor de Calendula șobolanilor tratați cu ciclofosfamidă a determinat o restabilire parțială a parametrilor biochimici serici. Restabilirea valorilor normale a formulei leucocitare a șobolanilor tratați cu extracte de Calendula față de lotul tratat numai cu citostatic, ne indică reluarea procesului de repopulare sanguină cu elemente figurate, datorată probabil stimulării granulocitopoiezei, limfocitopiezei și monocitopiezei la nivelul măduvei hematogene sub acțiunea extractelor vegetale.

Refacerea structurală și funcțională a organelor afectate de tratamentul cu ciclofosfamidă este mult mai rapidă sub acțiunea extractelor de Calendula comparativ cu refacerea de la sine, ceea ce ne sugerează posibila aplicare a acestor extracte vegetale în chimioterapie ca adjuvante.

BIBLIOGRAFIE

Ardelean A., Miclăuș V., Crăciun C., Pașca C., Crăciun V., Reactivation of the hematopoiesis in the spleen and liver of the adult mice induced by two experimental compounds with an antiinflamatory action, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Crăciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.299-304, 1999.

Ardelean A., Miclăuș V., Crăciun C., Crăciun V., Hermenean A., Histological studies concerning the action of cyclophosphamide on the hematopoietic system of Wistar rats, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.V, C.Crăciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.171-179, 2000.

Bauer and Wagner H, Calendula species as potential immunostimulatory drugs, Econ. Med. Res., 5:253-321, 1991.

Bauer R, Calendula drugs – effects and active ingredients, In:Arytl. Fortbild (Jena), 90(2):111-5, 1996.

Bauer R, Influence of Calendula extracts on phagocitic activity, Zeit. Phytother., 10:43, 1989.

Bauer R, Wagner H, Calendula – Handbuch, Wissnschftliche Verlagsge-sellschaft mbH Stuttgart, 1990.

Bauer VR, Jurcic K, Puhlmann J, Wagner H, Immunologic “in vivo” and “in vitro” studies on Calendula extracts (Published in German), In: Arzneimittelforschung, 38(2): 276-81, 1988.

Barrutia M.G., Torroba M., Fernandez m., Vicente A., Zapata A.G., Macrophages and epithelial cells of the thymus gland, Tissue and Cell, 21, 6781, 1989.

Beuscher N., Bodinet C., Willingmann I., Egert D., Immune Modulating Properties of Root Extracts of Different Calendula Species, Zeitschrift Phytoterapie, 16:157-166, 1995.

Bukovski M, Kostalova D, Magnusova R, Vaverkova S, Testing for immunomodulating effects of ethanol-water extracts of the above-ground parts of the plants Calendula (Moench) and Rudbeckia L. (Published in Slovak), In:Cesk.Farm., 42 (5):228-31, 1993.

Bumbasirevic V., Skaro-Milic A., Arsic D., Djuricic B., Morphology of cell death of mitotically arrested thymocytes, Electron Microscopy, ICEM 14, Cancun, Mexico, p.825-826, 1998.

Ciulei I, Grigorescu E, Stănescu Ursula, Plante medicinale, fitochimie și fitoterapie-Tratat de farmacognozie, vol.II, Ed.Medicală, București, 1993.

Collins E., Berkoff N., Calendula and immunity, Prima Publishing, 160 pag., 1999.

Conkling W., Secrets of Calendula, St. Martin’s Paperbacks, 192 pag., 1999.

Crăciun C., Miclăuș V., Studiu electronomicroscopic al timusului la tineretul bovin în vârstă de doi ani, Buletinul Universității de Științe Agricole Cluj-Napoca, Seria Zootehnie și Medicină Veterinară, 1997.

Crăciun C., Ardelean A., Madar J., Tarba C., Sildan N., Crăciun V., Fărcaș T., Ultrastructural studies of the secondary effects induced at the level of thymus by topic application of fluoccinolone-acetonide-N in prepubertal rats, In: Current Problems in Cellular and Molecular Biology (eds. A.Ardelean and C.Crăciun), Ed.Risoprint, Cluj-Napoca, pp.176-136, 1997.

Crăciun C., Tarba C., Madar J., Ardelean A., Sildan N., Fărcaș T., Crăciun V., Study of the secondary effects induced by the topic application of fluoccinolone-acetonide-N in thymus ultrastructure of pubertal rats, In: Current Problems in Cellular and Molecular Biology (eds. A.Ardelean and C.Crăciun), Ed.Risoprint, Cluj-Napoca, pp.187-199, 1997.

Crăciun C., Madar J., Frățilă S., Crăciun V., Miclăuș V., Ardelean A., Ilyes I., Comparative study of thymus ultrastructure, thymolysis and thymus and blood serum lipids in prepubertal rats, treated with topical corticosteroids, In: Current problems in cellular and Molecular Biology, III, Ed. By C.Crăciun, A.Ardelean, ed.Risoprint, Cluj-Napoca, p.200-217, 1998.

Crăciun C., Madar J., Tarba C., Frățilă S., Ardelean A., Crăciun V., Ilyes I., Correlation between ultrastructural thymus modifications, thymolysis, thymus and blood-serum lipids in response to epicutan-applied dermocorticoids in pubertal rats. In: Current problems in cellular and Molecular Biology, III, Ed. By C.Crăciun, A.Ardelean, ed.Risoprint, Cluj-Napoca, p.218-235, 1998.

Crăciun C., Frățilă S., Ultrastructural and biochemical studies concerning the action of some topical dermocorticoids on prepubertal rat thymuses, before and simultaneously with beta-adrenoreceptors blocking, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Crăciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.209-248, 1999.

Crăciun C., Miclăuș V., Pașca C., Kis E., Sandu D., Crăciun V., Papuc I., Munteanu C., Histological and ultrastructural studies of the thymus of the rats inoculated with a single therapeutic dose of cyclophosphamide, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Crăciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.329-337, 1999.

Dorsch W, Critical application of extracts of Calendula officinalis or Calendula arvensis. Critical evaluation of controlled clinical studies, In: Z. Arztl.Forbild (Jena), 90(2):117-22, 1996.

Frățilă S., Miclăuș V., Crăciun C., Benedek F., Crăciun V., Cuparencu B., Histopathological and ultrastructural changes of the rat thymus induced by short treatment with topical glucocorticoids, Current problems in Cellular and Molecular Biology, vol.III, C.Crăciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.236-242, 1998.

Fukomoto T., Precise analysis of the structure of the thymus for establishing details of the mechanism underlying thymocyte proliferation and maturation, Acta Histol.Cytol., 60, 1-8, 1997.

Gaudecker B. von, Ultrastructure of the age-involuted adult human thymus, Cell Tiss.res., 186, 507-525, 1978.

Gaudecker B. von, Functional histology of the human thymus, Anatomy and Embryology, 183, 1-15, 1991.

Gădăleanu V., Crăciun C., Ultrastructural examination of the spleen after respiratory and general antigenic stimulation, Rev. Roum. Morphol. Embryol., Physiol., MORPHOL:-EMBRYOL., XXVII,1, p.67-72, 1981.

Haelst V., von, Light and electronmicroscopic study of the normal and pathological thymus of the rat.II. The acute thymus involution, Z.Zellforsch, 80, 153-182, 1967.

Harborne JB, Baxter H, Phytochemical Dictionary: A Handbook of Bioactive Compounds from Plants. Washington DC: Taylor and Francis, 1993.

Heinzer F, Mensy JP, Chavanne M, Calendula arvensis and Calendula officinalis. Followup of weight development and chemical composition for the first two culture years. 36th Annual Congress of the Society of Medicinal Plant Research, Preiburg, Germany, Sept.12-16, 1988.

Jelea S., Giurgea R., Efectele acetatului de plumb asupra timusului șobolanilor Wistar, ANALELE SNBC, Vol.VII, Nr.1, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, pag.380-386, 2002.

Madar J., C.Crăciun, Giurgea R., Borda D., Roman I.., Crăciun V., Ilyes I., Antiglucocorticoid effects of propranolol on thymolysis and on thymus metabolic and ultrastructural disorders induced by percutan-absorbed hydrocotisone-17-butyrate in young rats, Current problems in Cellular and Molecular Biology, vol.III, C.Crăciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.243-253, 1998.

Melchart D, Linde K, Worku F, Sarkady L, Holzmann M, Jurcic K, Wagner H. Results of five Randomized Studies on the Immunomodulatory Activity of Preparations of Calendula, J. Altern Complement Med., Summer 1 (2):145-60, 1995.

Melchart D, Malther E, Linde K, Brandmaier R, Lersch C. Calendula Root Extracts for the Prevention of Upper Respiratory Tract Infections: A Double-blind, Placebo-controlled Randomized Trial, Arch. Fam. Med., Nov-Dec 7(6):541-5, 1998.

Melchart D., Clemm C., Weber B., Draczynski T., Worku F., Linde K., Weidenhammer W., Wagner H., Saller R., Polysaccarides isolated from Calendula officinalis herba cell cultures to counteract undesired effects of chemotheraphy – a pilot study, Phytother., 16 (2): 138-142, 2002.

Miclăuș V., C. Crăciun, The appearance of cavity formations in rat thymus after treatment with an epicutan-applied dermocorticoid, Current problems in Cellular and Molecular Biology, Vol.IV., A.Ardelean, C.Crăciun Editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, p.288-298, 1999.

Pașca C., Miclăuș V., Ardelean A., Kis E., Sandu D., Crăciun V., papuc I., Structural and ultrastructural aspects of the rat thymus after carboplatin chemotherapy, Current Problems in Cellular and Molecular Biology, vol.V, C.Crăciun, A.Ardelean editors, Ed.Risoprint Cluj-Napoca, pag.276-284, 2000.

Philippart C., Dourov N., Histopathology and ultrastructure of the thymus in OP-OP rats with special focus on thymus macrophages. Effect on bone marrow transplantation, Prath.Res.Pract., 191, 499-505, 1995.

Rusu V.M., Abraham A.D., Puică C., Effects of TROFOPAR on Morphological and Histo-Enzymatical Aspects of Thymus and Spleenin Allyl Alcohol-Intoxicated rats, In: Pathological models in toxicological studies, Industrial Head-Office For Medicinal Drugs and Cosmetics, Bucharest, 339-345, 1985.

See DM, Broumand N, Sahl L, Tilles JG, In vitro effects of Calendula and ginseng on natural killer and antibody-dependent cell citotoxicity in healthy subjects and chronic fatigue syndrome or aquired immunodeficiency syndrome patients, Immunopharmacology, 35(3):229-35, 1997.

Soga H., Nakamura M., Yagi H., Kayaba S., Ishii T., Gotoh T., Itoh I., Heterogeneity of mouse thymic macrophages. I. Immunohistochemical analysis, Arch.Histol.Cytol., 60, 1, 53-63, 1997.

Steinmuller C, Roesler J, Grottrup E, Franke G, Wagner H, Lohmann-Matthes ML, Polyssacharides isolated from plant cell cultures of C. officinalis enhance the resistance of immunosuppressed mice against systemic infections with Candida albicans and Listeria monocytogenes, In: Int.J. Immunopharmacol., 15(5):605-14, 1993.

Wagner H, Jurcic K, Immunologic studies of plant combination preparations. In vitro and in vivo studies on the stimulation of phagocytosis (Published in German), In: Arzneimittelforschung, 41(10):1072-6, 1991.