Cercetari Privind Utilizarea Antibioticelor din Grupa Beta Lactamine la Animale

CUPRINS

REZUMAT

S-au efectuat cercetări în vederea depistării precoce a mamitelor la vaci în vederea aplicării unor tratamente eficace și a luării de măsuri profilactice corespunzătoare. Au fost efectuate examene clinice și au fost prelevate probe de lapte de la 15 vaci. La cele 25 probe s-a efectuat testul rapid pentru identificarea infecțiilor glandei mamare cu R-Mastitest, s-a determinat numărul total de celule somatice, numărul total de germeni mezofili aerobi, examene bacteriologice de izolare și identificare pentru Staphylococus aureus, teste de patogenitate „in vivo” și „in vitro” și antibiograma. Din cele 25 probe lapte recoltate 15 probe au prezentat modificări organoleptice. Din probele analizate 12 probe au fost pozitive la testul R-Mastitest, numărul de celule somatice a fost cuprins între 250.000 și 6.500.000 celule/ml lapte, din 6 probe s-a izolat Staphylococcus aureus coagulază pozitiv, din 12 tulpini izolate 3 au fost rezistente la ampicilină și amoxicilină, 8 la penicilina și 7 la eritromicină. Prin acest studiu s-a identificat în fermă prezența unor tulpini Staphylococus aureus rezistente la 3 antibiotice de elecție din grupa Beta lactamine și la unele antibiotice cu spectru larg frecvent utilizate în practica terapeutică în ferme de vaci.

SUMMARY

They conducted research to early detection of mastitis in cows in the application of effective treatments and preventive measures taken accordingly. Clinical examinations were performed and samples were taken from 15 dairy cows. In the 25 samples was performed rapid test to identify breast infections with R-Mastitest, was determined the total number of somatic cells, total aerobic mesophilic bacteria, bacteriological examinations of Staphylococcus aureus isolation and identification, pathogenicity tests "in vivo" and "in vitro" and antibiograms. Of the 25 samples collected 15 milk samples had organoleptic changes. Out of 12 samples were analyzed samples test positive R-Mastitest, somatic cell count was between 250,000 and 6,500,000 cells / ml milk, 6 samples isolated from coagulase positive Staphylococcus aureus, 12 isolates were resistant 3 ampicillin and amoxicillin, 8 penicillin and 7 to erythromycin. This study has identified Staphylococcus aureus strains firm presence of antibiotic resistant 3 Beta lactams group of choice to some broad-spectrum antibiotics commonly used in therapeutic practice in dairy farms.

INTRODUCERE

Laptele ca produs alimentar a fost și va rămâne pentru toate categoriile de consumatori un produs de bază, atât în forma sa naturală, cât și ca produs prelucrat. Sănătatea și integritatea lui este asigurată de sănătatea animalului și a mamelei care-l produce în primal rând și a condițiilor de procesare și valorificare în al doilea rând. Calitatea laptelui ca aliment și depistarea precoce a modificărilor acestuia în caz de mamită și alte boli ale ugerului cu caracter general, care produc perturbări ale lactației, au constituit și va continua să constituie dezideratul major pentru toate studiile medicale veterinare într-o strânsă colaborare cu domenii adiacente. Întreaga preocupare are scopul de a elabora teste de mare sensibilitate, care prin investigarea rapidă a unei cantități mici de lapte să ofere informații certe privind salubritatea acestuia, respectiv precizarea diagnosticului precoce în caz de mamită sau alte stări anormale ale mamelei și a laptelui. Dintre afecțiunile infecțioase prezente la vacile de lapte, mamitele se situează pe primul loc, atăt prin incidența lor crescută, dar mai ales prin pagubele economice pe care le produc. Impactul economic pe care aceste afecțiuni îl determină se soldează cu scăderea fecundității, scăderea natalității, creșterea prețurilor de producție, intensificarea efortului uman depus pentru tratarea lor, dar și cu eliminarea prin reformă a unor animale valoroase sub aspect genetic, creșterea mortalității femelelor, dar mai ales a vițeilor prin consum de lapte infectat. De aceea se impune cu stringență inițierea unor ivestigații complexe, care să reducă pe cât posibil frecvența apriției mamitelor la vaci și să ofere specialiștilor și crescătorilor particulari un program optim de combatere a lor. Până în prezent, cercetările efectuate au stabilit că apariția lor este influențată de numeroși factori dintre care amintim: condițiile de întreținere și exploatare, retenția placentară, factorii de microclimat, tipul de adăpost și caracteristicile constructive ale acestuia. În acest sens în prezenta lucrare, ne-am propus să studiem incidența, particularitățile clinice, precum și existența unor eventuale corelații privind mamitele într-o unitate de creștere a vacilor de lapte.

CAPITOLUL 1. ANTIBIOTICE DIN GRUPA BETA LACTAMINE

După spectrul de activitate antibacteriană penicilinele au fost împărțite în următoarele grupe: benzilpenicilina, fenoximetilpenicilina și fenacetina. Sunt antibiotice cu spectru antimicrobian relativ îngust, care cuprinde majoritatea cocilor Gram-pozitivi, cocilor Gram-negativi și bacililor Gram-pozitivi, actinomicete, spirochete și leptospire. Penicilinele anti-stafilococice, cum sunt meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina și nafcilina au spectrul antibacterian asemănător benzilpenicilinei, dar sunt eficace și față de majoritatea stafilococilor rezistenți la benzilpenicilină (3,4). Din grupa penicilinelor care au spectru lărgit fac parte ampicilina, amoxicilina si hetacilina. Ele acționează asupra germenilor Gram-pozitivi și a bacililor Gram-negativi. Din grupa penicilinelor cu spectru lărgit active față de Pseudomonas, amintim carbenicilina, ticarcilina și piperacicilina. Din grupa penicilinelor cu spectru îngust care sunt active față de bacterii din familia Enterobacteriaceae amintim mecilinam.

Penicilinele au proprietăți bactericide de tip degenerativ. Efectul toxic se exercită numai asupra celulelor bacteriene aflate în diferite faze de multiplicare. La concentrații mici de peniciline se observă încetarea diviziunii și apariția de forme alungite, filamentoase, iar la concentrații mari formarea de tumefacții la nivelul corpului celular și liză bacteriană. In cazul unor bacili la anumite peniciline s-a observat apariția de forme sferice, urmată apoi de liză celulară.

Acțiunea bactericidă se produce prin tulburări metabolice ireversibile, cu acțiune letală asupra germenilor microbieni la concentrațiile minime inhibitorii de antibiotic. Efectul se instalează în 2-3 ore uneori in 6 ore, perioadă de timp care corespunde la aproximativ 6-10 generații de germeni, timp în care populația microbiană se reduce cu mai mult de 99,9%. Cinetica acțiunii bactericide este de tip exponențial si permite supraviețuirea unui număr mic de germeni. Fenomenul de persistență bacteriană este favorizat în principal de subdozare. Pentru a scade acest fenomen trebuie ca bacteriile sensibile să fie menținute sub influența unor concentrații mari un timp minim aproximativ 4-8 ore din 24 ore pentru pneumococi și stafilococi și 20 de ore din 24 ore pentru streptococi.

Mecanismul de acțiune al penicilinelor și al altor compuși beta-lactamici la nivel molecular este parțial cunoscut. Până în prezent au fost descrise: legarea antibioticului de anumite proteine membranare specifice; inactivarea unor enzime (transpeptidaze) care intervin în formarea celulelor bacteriene; activarea unor enzime autolitice (autolizine, mureinhidrolaze). Penicilinele favorizează funcția unor enzime autolitice, posibil prin înlăturarea unui mecanism inhibitor, ca urmare a acționării proteinelor membranare receptoare. Peretele deficitar și procesul litic fac ca celulele bacteriene aflate în mediul izoton să devină vulnerabile le forțele osmotice, ceea ce explică acțiunea bactericicdă. În mediul hiperton bacteriile, transformate în forme L (protoplști sau sferoplaști) pot să supraviețuiască pentru o perioadă scurtă de timp. Bacilii Gram-negativi posedă o membrană fosfolipidică suplimentară situată la suprafața exterioară a peretelui celular, care constituie o barieră pentru pătrunderea penicilinelor clasice până la receptorii de pe membrana citoplasmatică. Penicilinele cu spectru lărgit – ampicilină, carbenicilină, amoxicilină au molecula hidrofilă și pot să traverseze porii apoși din peretele celular, fiind eficace și față de bacilii Gram-negativi.

Rezistența la peniciline a unor stafilococi la meticilină se poate datora inaccesibilității sau modificării structurii unor receptori specifici. Unele tulpini de pneumococi prezintă proteine membranare receptoare modificate, care nu mai pot lega antibioticul. Bacteriile înglobate de fagocite și cele din interiorul altor celule nu pot să fie atacate de peniciline deoarece nu ajung în cantitate suficientă în aceste celule din organismul gazdă.

Farmacocinetica la beta-lactamine prezintă deosebiri pentru diferitele peniciline, dar au și multe caracteristici comune. Biodisponibilitatea pentru absorbție după administrarea pe cale orală este diferită în funcție sensibilitatea sau rezistența moleculelor la acțiunea acidului clorhidric din stomac. Din acest punct de vedere, există peniciline active după administrare pe cale orală cum sunt de exemplu fenoximetilpenicilina, oxacilina, amoxicilina și peniciline care sunt active numai dacă se injectează cum sunt: benzilpenicilina sau carbenicilina. Deasemenea, trebuie să se țină cont de fapul că penicilinele se leagă în parte de proteinele alimentare, de aceea disponibilitatea după administrarea pe cale orală este mai mică și în special atunci când se administrează pe stomacul plin. Legarea de proteinele plasmatice diferă printre peniciline. Astfel oxacilina sau cloxacilina se leagă în proporție mai mare, benzilpenicilina și ampicilina se leagă în proporție mai mică. Distribuția tisulară este largă și interesează compartimentul extracelular. Astfel, în lichidul pleural, peritoneal, sinovial se realizează concentrații eficace bactericide. Concentrația în lichidul cefalorahidian este mică, dar este crescuta la bolnavii cu meningită care la doze de 12g/zi (20 milioane UI/zi) se realizează concentrații de 0,2 μg/ml ceea ce face ca injectarea intrarahidiană să nu fie necesară. Concentrația penicilinelor în creier, lichidul intraocular și în lichidul prostatic este mică.

Pentru majoritatea penicilinelor eliminarea se face mai ales pe cale renală, predominant prin secreție tubulară. Cantități mici se elimină și prin bilă, unde se realizează concentrații eficace din punct de vedere terapeutic.

Principalele reacții adverse provocate de peniciline sunt de natură alergică, aceste antibiotice fiind în prezent cauza cea mai importantă a unor asemenea fenomene iatrogene. Frecvența semnalată este cuprinsă între 1 și 10% dintre oamenii tratați cu diferite peniciline. Unul din 10 cazuri au prezentat reacții alergice grave, iar cele manifestatate prin șoc anafilactic tipic sunt rare. Reacțiile alergice sunt declanșate de administrarea antibioticului la 10-15% dintre persoanele cu antecedente alergice la peniciline față de mai puțin de 1% în cazul celor fără asemenea antecedente. Benzilpenicilina este foarte antigenică, posibil și datorită asocierii în preparatele farmaceutice a unor impurități proteice. Penicilinele semisintetice sunt, în general, mai puțin sensibilizante, cu excepția ampicilinei care produce frecvent erupții cutanate. Riscul de a face alergie crește la doze mari și tratament prelungit.

Fenomenele alergice pot să fie evidențiate încă din primele zile după naștere, în cazul în care nou născutul a fost sensibilizat prin administrarea de antibiotice la femela gestantă. Antigenitatea penicilinelor se datorează moleculelor de antibiotic nemodificate, dar mai ales unor metaboliți, care acționează ca haptene, legându-se covalent de proteine.

Alergia la peniciline se carcacterizeaza prin prezența de imunoglobuline de tip E (IgE) legate de celule. Uneori intervin și molecule de tip IgG cum se întâmplă în cazurile de anemie hemolitică.

Urticaria și eritemul cutanat constituie manifestările cele mai frecvente ale alergiei față de peniciline. La persoanele care manipulează peniciline pe perioade mai lungi, se poate produce o dermatită de contact, iar la cei care distribuie medicamentele din această grupă sub formă de aerosoli poate să apară bronhospasm cu mecanism de producere anafilactic. Reacțiile de tip boala serului au fost relativ rare, iar mecanismul lor patogenetic este mai curând de natură idiosincrazică decât de natură alergică. Hipersensibilitatea la peniciline este greu de diagnosticat în absența unor antecedente clinice clare. Reacțiile alergice pot să apară și la persoane care aparent nu au fost în contact prealabil cu antibioticul și pot să apară atunci când bolnavul a fost tratat cu peniciline fără să știe, a consumat lapte, carne, ouă de la animale tratate cu peniciline aflate în interiorul perioadei de așteptare.

Apariția reacțiilor alergice la peniciline impune, de regulă, oprirea trtamentului, acesta fiind urmat deseori de dispariția simptomelor. În situații deosebite, la bolnavii la care viața este pusă în pericol, tratamentul cu peniciline poate să fie continuat cu grijă, chiar dacă a apărut erupție cutanată maculopapulară. În majoritatea cazurilor, sunt însă disponibile pe piață antibiotice alternative.

Alergia la peniciline se tratează, după caz, cu substanțe antihistaminice, adrenalină și hormoni glucocorticoizi. În șocul anafilactic este necesară injectarea intravenoasă, cu prudență a 0,1-0,3 mg adrenalină în soluție diluată și injectarea intravenoasă de hemisuccinat de hidrocortizon în doză mare.

Toxicitatea penicilinelor. Dozele foarte mari de benzilpenicilină, de 40-80 milioane UI penicilină/zi administrată pe cale intravenoasă la bolnavii cu insuficiență renală poate să provoace o stare de confuzie, tresăriri musculare, chiar convulsii, fenomene care sunt favorizate de leziunile sistemului nervos central și de hiponatremie. Alte reacții toxice sunt granulocitopenia care poate să apară după administrarea de meticilină sau de nafcilină mai ales la copii; hepatită după administrarea de oxacilină; nefrită după administrarea de meticilină, hemoragii după administrarea de carbenicilină; acțiune antiagregregantă plachetară după administrarea de carbenicilină.

După administrarea pe cale orală a unor doze mari poate să apară ocazional greață, vomă și diaree care sunt mai frecvente la penicilinele cu spectru larg cum sunt ampicilina și amoxicilina.

Penicilinele administrate pe cale orală pot să favorizeze apariția de enterite, în mod deosebit ca urmare a modificării florei bacteriene normale de la nivelul intestinului. Dezvoltarea excesivă a unor microorganisme rezistente la peniciline cum ar fi: stafilococi, Pseudomonas, Proteus, Candida pot să fie cauza enteritei. Au fost înregistrate și cazuri de colită pseudomembranoasă cu Clostridium difficile.

Antibiorezistența la peniciline. Cel mai important mecanism de rezistență bacteriană la peniciline și alte antibiotice β-lactamice printre care și amoxicilina este inactivarea enzimatică.

Betalactamazele secretate de bacteriile Gram-pozitive sunt în general excretate în mediul exterior ca exoenzime. Tulpinile de stafilococi sunt în principal bacterii Gram-pozitive în care se dezvoltă rezistența la β-lactamaze foarte repede. Betalactamazele produse de bacteriile Gram-negative sunt în general heterogene, sunt reținute în interiorul spațiului periplasmic, sunt produse în cantități mici. Bacteriile Gram-negative sunt capabile să devină rezistente ca rezultat al producției de betalactamaze și au fost detectate la: Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas și Salmonella spp. Rezistența se poate instala într-o perioadă de timp lungă la unele dintre aceste tulpini microbiene. Tulpinile microbiene producătoare de betalactamaze sunt destul de răspândite în natură. În domeniul veterinar, aproximativ 50-60% dintre tulpinile de Staphylococcus și 40-70% dintre tulpinile de Escherichia coli sunt rezistente la penicilina G, iar 15-40% dintre tulpinile de Escherichia coli.

AMOXICILINA

Caracterizare fizico-chimică. Amoxicilina este o aminopenicilină cu spectru antimicrobian asemănător ampicilinei. Amoxicilina trihidrat este un acid si se prezintă sub formă de pulbere cristalină, de culoare albă sau aproape albă, practic fără miros și cu gust amar. Este rezistentă la acidul clorhidric și se absoarbe din intestin mai bine decât ampicilina, aproximativ 93% din doza administrată pe cale orală ajunge în circulația sanguină. După administrarea a 250 mg nivelul plasmatic maxim, realizat după 2 ore este de aproximativ 4μg amoxicilină/ml dublu fata de ampicilină. Difuzează mai bine în secrețiile traheobronhice. Timpul de înjumătățire mediu este de 1,7 ore. Se elimină prin urină în proporție de 86% în formă neschimbată.

Asociația amoxicilină-clavulanat de potasiu conține sarea potasică a acidului clavulanic un antibiotic beta-lactamic produs de Streptomyces clavulagerus. Acidul clavulanic este slab activ ca antibacterian, dar este un inhibitor eficace al betalactamazelor secretate de stafilococi și o parte dintre betalactamazele secretate de unele bacterii Gram-negative.

Amoxicilina este o aminopenicilină semisintetică cu spectru larg activă și față de tulpinile microbiene penicilină rezistente producătoare de betalactamaze. Este foarte eficace în tratamentul infecțiilor produse de bacterii din genurile Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Clostridium, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pasteurella, Erysipelothrix, Haemophilus, Brucella, Fusobacterium, Bacillus, Serpulina, Leptospira și Borellia. Acționează atât prin împiedicarea formării peretelui celular la bacterii, cât și prin denaturarea integrității acestuia făcându-l instabil din punct de vedere osmotic.

După administrare pe cale orală, amoxicilina are o bună biodisponibilitate și atinge concentrația plasmatică maximă după 2 ore de la administrare. După absorbție amoxicilina este bine distribuită în toate țesuturile și lichidele organismului. Bariera hematoencefalică, placentară, mamară sau a prostatei sunt traversate de amoxicilină numai dacă sunt inflamate. Concentrații mari se asigură în ficat, bilă, rinichi, intestin, mușchi și pulmoni. Concentrații mici se gasesc în cornee, secreții bronhice, cartilaje și oase. În infecțiile respiratorii trece rapid prin mucoasele inflamate și ajunge în secrețiile pulmonare unde acționează direct asupra agenților etiologici. Amoxicilina acționează atât local la nivelul tractusului intestinal, cât și sistemic după absorbție. Se elimină din organism, în principal, pe cale urinară, biliară și prin fecale.

Incompatibilități majore. Aminopenicilinele formează cu alcoolul o soluție coloidală care se gelifică în timp. Nu se asociază în aceeași seringă cu clorhidrați cum ar fi tetraciclină, oxitetraciclină, clorpromazină, sulfat de gentamicină și etilsuccinat de eritromicină. Se colorează în galben cu clorhidratul de hidralazină. Nu se va dilua cu soluție de glucoză și nu se va asocia cu alte substanțe dizolvate în ser glucozat. Nu se va asocia cu hemisuccinat de hidrocortizon, în soluție de glucoză deoarece acestea grăbesc degradarea amino-penicilinelor.

Proprietățile farmacologice ale amoxicilinei. Amoxicilina este o aminopenicilină semisintetică cu spectru larg activă și față de tulpinile microbiene penicilino-rezistente producătoare de beta-lactamaze. Este foarte eficace în tratamentul infecțiilor produse de bacterii din genurile Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Clostridium, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pasteurella, Erysipelothrix, Haemophilus, Brucella, Fusobacterium, Bacillus, Serpulina (Treponema), Leptospira și Borellia. Acționează atât prin împiedicarea formării peretelui celular la bacterii, cât și prin denaturarea integrității acestuia făcându-l instabil din punct de vedere osmotic.

După administrare pe cale orală, amoxicilina are o bună biodisponibilitate și atinge concentrația plasmatică maximă după 2 ore de la administrare. După absorbție amoxicilina este bine distribuită în toate țesuturile și lichidele organismului. Barierele hematoencefalică, placentară, mamară sau a prostatei sunt traversate de amoxicilină numai dacă sunt inflamate. Concentrații mari se asigură în ficat, bilă, rinichi, intestin, mușchi și pulmoni. Concentrați mici se distribuie în cornee, secreții bronhice, cartilaje și oase. În infecțiile respiratorii trece rapid prin mucoasele inflamate și ajunge în secrețiile pulmonare unde acționează direct asupra agenților etiologici. Amoxicilina acționează atât local la nivelul tractusului intestinal, cât și sistemic după absorbție. Se elimină din organism, în principal, pe cale urinară, biliară și fecale.

Incompatibilități majore. Aminopenicilinele formează cu alcoolul o soluție coloidală care se gelifică în timp. Nu se asociază în aceeași seringă cu clorhidrați: tetraciclină, oxitetraciclină, clorpromazină, sulfat de gentamicină și etilsuccinat de eritromicină. Se colorează în galben cu clorhidratul de hidralazină. Nu se va dilua cu soluție de glucoză și nu se va asocia cu alte substanțe dizolvate în ser glucozat. Nu se va asocia cu hemisuccinat de hidrocortizon, în soluție de glucoză deoarece acestea grăbesc degradarea amino-penicilinelor.

CAPITOLUL 2. MAMITELE BACTERIENE LA VACI

Mamitele sunt procese inflamatorii care interesează epiteliul secretor, mucoasa canalelor și sinusul galactofor sau țesutul interstițial și care sunt produse de o floră microbiană variată. Mamitele se gasesc la toate speciile de animale domestice, dar au o frecvență mai mare la vacă. Importanța acestei afecțiuni este deosebită, atât din punct de vedere economic, cât și igienic. Mamitele produc pierderi importante prin alterarea laptelui în compartimentul bolnav și scăderea cantitativă în celelalte ca și în sfertul afectat după vindecare, ca urmare a distrugerii țesutului glandular.

Mamitele sunt procese inflamatorii ale epiteliului secretor, mucoasei canalelor lactifere, sinusului galactofor și stromei glandei mamare, cauzate de acțiunea diferiților factori nocivi dintre care cei microbieni sunt preponderenți. Glanda mamară sănătoasă se caracterizează prin lipsa germenilor patogeni din secreția sa, în condițiile în care la examenele clinice ale ugerului și examenele caracterelor organoleptice și fizico-chimice ale secreției mamare, nu se depistează modificări caracteristice proceselor inflamatorii.

Infecțiile mamare latente care se caracterizează prin prezența germenilor patogeni în secreția mamară, care își pastrează normale proprietățile organoleptice și fizico-chimice, inclusiv concentrația în celule somatice, iar semnele clinice caracteristice procesului inflamator lipsesc.

Mamite subclinice sunt stări inflamatorii ale glandei mamare caracterizate prin prezența germenilor patogeni în secreția mamară, însoțită de modificări ale unor proprietăți fizico-chimice, creșterea concentrației în celule somatice și absența semnelor clinice caracteristice procesului inflamator mamar.

Mamitele clinice sunt stări inflamatorii ale glandei mamare caracterizate prin prezența germenilor patogeni în secreția mamară, însoțită de modificări ale caracterelor organoleptice, fizico-chimice și de creștere a concentrației de celule somatice din secreția mamară, însoțite de prezența semnelor clinice locale caracteristice procesului inflamator. Spre deosebire de alte specii de animale domestice, la vacă se înregistrează o incidență foarte crescută a mamitelor. Incidența mamitelor la vaci, într-un ciclu de lactație poate varia de la 35 la 55% și se poate considera că la un caz de mamită clinică îi corespund 15-40 de cazuri de mamită subclinică. Această incidență a fost înregistrată în condițiile exploatării intensive și a folosirii mulsului mecanic, factori care au contribuit la creșterea riscului de dereglare a funcțiilor glandei mamare și la instalarea procesului patogen. De aceea, importanța mamitelor la vaci este deosebită atât din punct de vedere economic, cât și igienico-sanitar.

ETIOLOGIA MAMITELOR

Mamitele la vaci, ca procese inflamatorii ale glandei mamare, sunt provocate de diferiți agenți cauzali, capabili să inducă astfel de procese în marea majoritate a cazurilor; astfel de agenți sunt microbieni și se pot clasifica în 3 grupe:

Germeni specifici, care produc exclusiv mamite: Streptococcus
agalactiae s.a.

Germeni care produc boli generale și forme localizate la nivelul
glandei mamare : bacilul tuberculozei, bacilul brucelozei s.a.

Germeni ocazionali care pot produce mamite: streptococi,
stafilococi, enterobacterii s.a.

În etiologia mamitelor, germenii ocazionali prezintă peste 80 de specii microbiene și constituie agenți etiologici infecțioși preponderenți ale acestor afecțiuni: Streptococcus agalactia, Clostridium perfringens, Streptococcus dysgalactiae, Arcanobacterium pyogene, Streptococcus uberis, Corynebacterium bovis, Streptococcus zooepidemicu, Nocardia asteroides, Streptococcus bovis, Pasteurella multocida, Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa,Candida albicans, Candida tropicali, Candida parapsilosi, Cryptococcus neoformans, Staphylococcus aureus, Pichia farinosa, Staphylococcus epidermiti, Trichosporon cutaneu, Escherichia col, Mycoplasma bovi, Enterobacter aerogene,Mycoplasma bovigenitalium, Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma alkalescen, Candida pseudotropicalis, Mycoplasma canadensis.

Incidența izolării diferitelor specii microbiene implicate în etiologia mamitelor este variabilă în funcție de mai mulți factori între care condițiile de exploatare, terapia aplicată și perioada fiziologică a glandei mamare care prezintă importanță deosebită.

În unitățile în care s-au aplicat programe de combatere a mamitelor care au inclus și terapia cu antibiotice, Streptococcus agalactiae aproape că nu a mai fost izolat în timp ce în celelalte ferme frecvența izolării acestei specii a fost de circa 28%. De asemenea, frecvența izolarii stafilococilor a atins 44%, iar cea a celorlalți patru streptococi a fost de 30%.

Alte observații au arătat că glanda mamară în lactație are receptivitate crescută față de Streptococcus agalactiae și Staphylococcus aureus în timp ce Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae și Arcanobacterium pyogenes afectează mai frecvent glanda aflată în repaus mamar.

Incidența izolării principalelor specii microbiene de la vaci cu mamite și căteva date epidemiologice corelate cu aceasta, sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Incidența izolării principalelor specii microbiene de la vaci cu mamite

FACTORII DE RISC

Mamita este rezultatul mai multor factori interactivi cum ar fi de exemplu: practici deficitare de muls, igiena, deficiente nutritionale (incluzând micronutrienți), practici de management deficitar, predispoziția animalelor la mamite. Foarte rar un singur factor provoacă boala, așadar prevenirea poate fi înbunătățită ținând sub control mai mulți factori de risc decât unul.

CELULELE SOMATICE ȘI RELAȚIA LOR CU MAMITELE

Celulele somatice provin, după Rotaru și Ognean (14), din fondul celular al organismului și sunt clasificate din punct de vedere morfofuncțional în patru tipuri principale: macrofage – cu rol primordial în menținerea stării igienice a laptelui, prin acțiunea fagocitară în principal și în pregătirea reacției imunitare specifice, favorizând contactul limfocitelor cu agenții patogeni. Sunt celule bine reprezentate în lapte, limfocite, în principal limfocitele T, care eliberează limfokine cu au rol în inițierea afluxului leucocitar prin chimiotactism, leucocitele polimorfonucleare neutrofile cu funcție de fagocitare microbiană și celule somatice, provenite din descuamări ale epiteliului glandular, fără rol activ în compoziția laptelui. Noțiunea de celule somatice, adică celule care provin din patrimoniul celular propriu al organismului se definește ca totalitatea celulelor existente la un moment dat într-un anumit volum de lapte, indiferent de structura, forma și originea lor. În această categorie sunt incluse nu numai celulele de origine mamară ci și cele care ajung în lapte prin diapedeză. Se exclud formele celulare total străine laptelui (microbi, levuri, miceți, paraziți). Numărarea celulelor somatice este o metodă de bază în programele de control al calității laptelui.

FORME DE EVOLUȚIE A MAMITELOR

Procesul patogenetic instalat la nivelul glandei mamare induce modificări care diferă în funcție de specia microbiană, patogenitatea sa, de receptivitatea individuală a gazdei și de influența factorilor favorizanți. Principalele modificări pot fi încadrate în tipul de inflamație seroasă, catarală sau purulentă.

Mamită stafilococică acută apare de regulă în primele zile după fătare și este însoțită de stare toxiemică, abatere, hipertermie, decubit prelungit, mers greoi. Local se observă inflamații ale sferturilor mamare afectate însoțite de căldură și creșterea sensibilității dureroase. La baza mamelonului și în parenchimul mamar se formează zone de indurație care se extind la tot sfertul afectat. Secreția mamară are aspect de lichid sero-fibrinos, galben-cenușiu, cu granule de puroi sau striuri sanguinolente. După o evoluție de 1-2 zile, secreția capătă caracter purulent, iar în sferturile de uger neafectate se instalează hipogalaxia. Evoluția este de 8-10 zile după care simptomele generale se remit, se reia secreția lactată în sferturile mamare neafectate, iar boala trece în formă catarală cronică. Aceasta se caracterizează prin apariția de noduli în compartimentele afectate și transformarea lor în abcese care pot fistuliza.

Mamita seroasă este denumită și mamită interstițială și se caracterizează prin inflamația seroasă a țesutului conjunctiv subcutanat și interstițial al glandei mamare, însoțit de infiltrația cu exsudat seros, bogat în limfocite, fibroblaste și leucocite polimorfonucleare neutrofile. Exsudatul poate să pătrundă și în spațiile interlobulare sau chiar în spațiile intraacinoase, reducând activitatea secretorie. Boala apare ca o infecție descendentă, limfatică sau hematogenă, de la nivelul plăgilor, al focarelor de endometrită, enterite sau ca urmare a traumatismelor. Secreția lactată scade cantitativ, iar odată cu afectarea acinilor devine seros și cu flocoane de cazeină. Procesul este însoțit de edematierea compartimentului afectat, creșterea temperaturii locale, a sensibilității devenind dureros, scăderea producției de lapte, hipertermie, depresie și diminuarea apetitului. Prin cronicizare se produce indurarea ugerului datorită procesului de sclerozare.

Mamită catarală reprezintă cea mai frecventă formă de mamită la vaci. Infecția se produce pe cale ascendentă, iar flora de bacterii patogene implicată în etiologie este foarte largă. Odată ajunși în sinusul galactofor și în canalele galactofore, germenii se multiplică și produc procese de fermentare și coagulare a laptelui, urmate de reacția inflamatoare a mucoasei sinusului și a canalelor galactofore. Coagulii formați pot bloca canalele galactofore, iar infecția difuzează la nivelul acinilor secretori glandulari, alterând funcțiile acestora și favorizează apariția hipogalaxiei sau a agalaxiei. Procesul este însoțit de congestie și diapedeză, tumefierea compartimentului care devine cald, dureros, nu-și micșorează volumul după muls și poate să prezinte focare indurate. Starea generală este alterată, iar laptele devine apos și se separă în zer și sediment cazeos, cu flocoane și coaguli. În formă cronică, starea generală a vacilor nu este afectată, iar local compartimentul de uger afectat, prezintă infiltrări conjunctive localizate sau difuze în țesutul glandei mamare care se manifestă ca indurații nodulare în partea distală a mamelei sau în regiunea cisternei glandulare a mameloanelor. Procesul poate să evolueze către hipertrofia sau atrofia mamară și este însoțit de scăderea producției de lapte și prezența de flocoane în componenta acestuia.

Mamita purulentă evoluează ca urmare a formelor catarale sau seroase, netratate sau tratate necorespunzator. Semnele generate sunt prezente în formă acută și lipsesc în cea cronică. Procesul patogen se caracterizează printr-un aflux leucocitar sporit în lapte și prin infiltrații leucocitare difuze sau nodulare în țesutul mamar. Secreția mamară este apoasă, cu coaguli și flocoane, devenind purulentă dupa 3-4 zile de evoluție. Compartimentul mamar afectat este cald, tumefiat și sensibil. Mameloanele sunt indurate și îndepărtate, iar limfonodulii retromamari sunt măriți în volum și sensibili. În formă cronică, focarele purulente pot să conflueze și să dea naștere la abcese sau pot difuza, dând naștere la necroze ale țesutului conjunctiv subcutanat și interstițial, care reprezintă flegmonul mamar. Dintre complicațiile procesului inflamator mamar, amintim proliferarea ireversibilă a țesutului conjunctiv urmată de atrofia parenchimului mamar și gangrena mamară.

PREVENIREA ȘI COMBATEREA MAMITEI LA VACA

Prin studiul mecanismului patogenetic al mamitelor s-a stabilit necesitatea realizării celor doua etape distincte, pentru declanșarea procesului inflamator al glandei mamare: 1) expunerea mamelei la surse de infecție și penetrarea germenilor patogeni în principala poartă de intrare care este orificiul canalului papilar și 2) multiplicarea germenilor patogeni pătrunși în glanda mamară cu declanșarea procesului inflamator. Mecanismele naturale de protecție antiinfecțioasă pentru glanda mamară au o eficiență scăzută, astfel că jumătate din efectivele de vaci de lapte prezintă procese infecțioase mamare, manifestate sau nu din punct de vedere clinic. Ca urmare, măsurile de prevenire și combatere a mamitelor trebuie să aibă în vedere îndeplinirea următoarelor deziderate principale: asigurarea stării de sănătate a glandei mamare; limitarea surselor de infecție și a posibilităților de expunere a ugerului la acestea și creșterea capacității de apărare antiinfecțioasă a glandei mamare. Factorii mediului înconjurator (climă, adăpost, așternut, stres, fond genetic). Factorii nutriționali. Factorii de apărare naturală, etiologici și umani.

SUPRAVEGHEREA STĂRII DE SĂNĂTATE A GLANDEI MAMARE la vacă

Primul aspect este reprezentat de implementarea programelor de prevenire și combatere a mamitelor care constă în diagnosticarea bolii atât individual, cât și la nivelul grupurilor de vaci. Aprecierea integrității morfofuncționale a glandei mamare se face prin examen clinic, care se completează cu metode particulare de punere în evidență a modificărilor patologice ale secreției lactate, prin teste care pun în evidență aceste modificări înainte de apariția semnelor clinice și cu teste de laborator.

EXAMINAREA GLANDEI MAMARE

Examinarea glandei mamare se realizează prin examen fizic și examen funcțional al acesteia.

Examenul fizic se face prin inspecție și palpație pentru toate componentele mamare: corpul mamar, mameloane și limfonoduli retromamari.

Inspecția se face pe ambele fețe laterale și pe fața posterioară a ugerului vizând forma, volumul, modificările de culoare și integritatea tegumentului, aspectul apexului mamelonar și al orificiului papilar.

Palpația ugerului se face dupa golire, pentru fiecare compartiment, începând de la bază către mamelon. Se apreciază temperatura locală, sensibilitatea, consistența. Limfonodulii retromamari sunt greu de examinat și pot să fie palpați numai în urma proceselor inflamatorii.

Examenul funcțional se face prin proba mulgerii și pune în evidență tulburări de secreție și de ejecție a laptelui ca și funcționarea canalului și sfincterului papilar.

EXAMINAREA LAPTELUI

La examenul caracterelor organoleptice și fizico-chimice se pun în evidență modificări de culoare, miros, gust, vâscozitate, consistență, densitate, coagulare și aciditate. Examenul de laborator care se efectuează în scopul diagnosticului mamitelor subclinice este complex și include examenul citologic. Prin examen citologic se determină aspectele cantitative și calitative ale celulelor somatice din lapte. Determinările numărului de celule și tipurile de celule se pot executa pe frotiuri directe, colorate prin diferite metode sau cu ajutorul aparatelor electronice speciale. Pentru determinarea indirectă a numarului de celule somatice din lapte, au fost concepute teste cu aplicabilitate în fermă: testul Whiteside bazat pe proprietatea NaOH de a coagula leucocitele din lapte, testul californian (Californian Mastitis Test – CMT) bazat pe modificarea vâscozității laptelui ca urmare a formării unui complex proteină – detergent între reactiv și ADN-ul celulelor somatice din lapte.

Determinarea numărului de celule din laptele individual sau din cel de colectură a căpătat cea mai mare extindere, fiind considerată în prezent metoda cea mai precisă, care depistează procesele inflamatorii subclinice ale glandei mamare.

Examenele fizico-chimice efectuate în scopul diagnosticării mamitelor la vaci, se bazează pe determinarea scăderii concentrațiilor de lactoză, a creșterii conductibilității electrice, a prezenței unor enzime (catalaza, reductaza, N-acetil-glucozaminidaza -NAG-aza s.a.).

Examenele bacteriologice din lapte urmăresc izolarea și identificarea germenilor patogeni implicați în etiologia mamitelor. Recoltarea și transportul probelor se efectueaza în condiții speciale, iar examenele de laborator includ și testarea sensibilității germenilor patogeni izolați față de seturile de antibiotice și chimioterapice avizate pentru terapia mamitelor.

EFECTELE PRODUSE DE STAFILOCOCI ASUPRA CALITĂȚII LAPTELUI ÎN MAMITE

Laptele provenit din unități crescătoare de vaci cu un procent ridicat de infecții mamare, poate să prezinte modificări fizice, chimice și bacteriologice. Laptele de la aceste vaci capătă un aspect grunjos, de culoare galbuie, uneori sanguinolentă, gust sărat sau amar asemănător unui exsudat sau secreții purulente, conține cantități mari de materii azotate, leucocite, hematii, bacterii și levuri. Pe măsură ce procesul patologic se cronicizează, modificările fizice se accentuează sau în unele cazuri laptele capătă un aspect normal. Din punct de vedere chimic, laptele mamitic are un procent scăzut de grăsime, cazeină și lactoză. Conținutul de cazeină poate să sufere o reducere de pană la 20% în schimb apar creșteri substanțiale ale cantității de sodiu, clorați și unele proteine. Laptele provenit de la vaci cu infecții mamare, consumat sub formă crudă sau ca produse lactate nepasteurizate poate fi cauza unor toxiinfecții alimentare.

|ELIMINAREA INFECȚIILOR MAMARE

Terapia antiinfecțioasă continuă să joace un rol important în prevenirea și combaterea mamitelor la vaci, în ciuda obținerii de rezultate inconstante, depinzând de specia microbiană implicată și gravitatea procesului patogen. În acest scop se utilizează antibiotice și chimioterapice dintre care cele mai importante sunt: procain-penicilina G, streptomicina, eritromicina, cloxacilina, amoxicilina, novobiocina, tetraciclina, tylosina, sulfometazina.

Penicilina G a rămas antibioticul de elecție pentru terapia mamitelor streptococice. În perioada de lactație, dozele optime utilizate pentru terapia locală au fost de 100.000 U.I repetate de 4-5 ori la intervale de 12 ore. Încercările de folosire a dozelor mai mici sau de reducere a numărului de administrări au scăzut eficacitatea terapeutică, în timp ce folosirea dozelor mai mari au crescut eficacitatea terapeutică în mod nesemnificativ. Eliminarea inconvenientului dat de administrările repetate la intervale relativ scurte de timp, a fost realizată prin includerea antibioticului în solvenți care să asigure efectul retard. S-a obținut astfel dublarea intervalului dintre administrări, însoțită de creșterea eficienței terapeutice. Astfel, folosirea comparativă a acelorași doze de penicillină G cu eliminare lentă față de soluțiile apoase a dus la creșterea efectului terapeutic de la 75-83% la 95-100%. Rezultate asemănătoare au fost obținute prin utilizarea penicilinei G în doză de 1.000.000 U.I. la vaci cu mamite streptococice aflate în perioada de repaus mamar (5).

În cazul mamitelor stafilococice rezultatele obținute atât în perioada de lactație, cât și în cea de repaus mamar sunt inferioare celor obținute în terapia mamitelor streptococice. Eficiența terapeutică a fost evaluată la sub 30% în perioada de lactație și la 47-58% în perioada de repaus mamar. Cauza principală a obținerii acestor rezultate a fost considerată rezistența crescută a multor tulpini de stafilococi, prin producerea de β–lactamază. Introducerea cloxacilinei în terapia mamitelor a dus la creșterea eficienței terapeutice a penicilinelor. Aplicată la vaci în perioada de lactație, în formă de eliminare lentă și în doze de 200-600mg cloxacilină a dus la vindecarea a 75-100% din mamitele streptococice și 43-62% din mamitele stafilococice. În perioada de repaus mamar, cloxacilina aplicată în doză de 500-1000mg a vindecat 90-97% din mamitele streptococice și 75-78% din mamitele stafilococice (5).

Penicilina și streptomicina (100.000-200.000U.I + 100-350mg) aplicate în perioada de lactație, au dus la vindecarea a 65-100% dintre mamitele streptococice și 21-68% dintre cele stafilococice. În perioada de repaus mamar, asocierea a 1.000.000 U.I. penicillină cu 1g de streptomicină au dus la vindecarea a 90-100% din compartimentele mamare cu infecții streptococice și 54-86% din cele cu infecții stafilococice.

Penicilina si neomicina (100.000-200.000 U.I. + 25-200mg) aplicate în perioada de lactație, au dus la vindecarea a 97% dintre compartimentele mamare cu infecții streptococice și 95-100% din cele cu infecții stafilococice.

PREVENIREA TRANSFERULUI DE GERMENI PATOGENI DE LA VACILE BOLNAVE LA CELE SĂNĂTOASE

În procesul patogenetic al mamitelor a fost relevată importanța majoră a transmiterii principalilor agenți infecțioși de la nivelul compartimentelor de uger infectate la cele sănătoase, în timpul procesului de muls. Acest proces vizează în special infecțiile mamare produse de Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae și Streptococcus dysgalactiae, germeni patogeni cu incidență mare în etiologia mamitelor. De asemenea, s-a relevat importanța vectorilor principali: mâinile mulgătorilor, prosoapele comune, cupele aparatelor de muls-care se contaminează ușor în timpul mulsului. Alți agenți patogeni cu rol major în mamitele vacilor: s-a stabilit importanța transmiterii infecțiilor în perioada dintre mulsori, sursele majore de infecții fiind așternutul umed și pielea trenului posterior contaminate cu acești germeni. În ambele situații rolul principal il are contaminarea intensă a apexului mamelonar și penetrarea glandei mamare pe cale ascendentă prin orificiul canalului papilar.

Acest proces se realizează atât prin mobilitatea caracteristică unora dintre germenii patogeni, cât și prin orificiul papilar rămas întredeschis, datorită lezionării fibrelor musculare proprii sau prin aspirarea provocată de funcționarea defectuoasă a instalațiilor de muls. În scopul limitării posibilităților de transmitere a germenilor de la vacile cu mamită la cele sănătoase, au fost promovate diferite măsuri de igienizare a mulsului dintre cele mai importante fiind dovedite: dezinfecția măinilor mulgătorilor; spălarea ugerului înainte de muls; dezinfecția cupelor de muls; dezinfecția mameloanelor după muls.

CAPITOLUL 3. CARACTERE MORFOBIOLOGICE ALE BACTERIILOR DIN GENUL Staphylococcus

Bacteriile din genul Staphylococcus produc infecții denumite generic stafilococii și sunt întâlnite la mai multe specii de animale. În același timp stafilococii pot produce și infecții localizate, cu caracter supurativ sau boli cu mecanism autoimun bine conturate epidemiologic și morfoclinic. Stafilococii pot să intervină și ca agenți etiologici secundari, după unele viroze sau pot fi asociați cu alte bacterii în infecții supurative mixte. Stafilococii sunt bacterii Gram pozitive, rotunde, dispuse izolat, neciliate, nesporulate, care își exercită patogenitatea prin virulență și cu ajutorul unor secreții agresinice sau toxice. Importanța acestor bacterii este deosebită atât din punct de vedere economic, cât și sanitar. Prin infecțiile pe care le produc, la animale se înregistrează pagube economice destul de importante prin scăderea producției, neînregistrarea sporului în greutate scontat, tararea animalelor și cheltuieli cu terapia profilaxia și combaterea.

Stafilococii au fost observați pentru prima dată de catre Billroth în anul 1874, iar Pasteur în anul izolat și cultivat aceste bacterii din secreții purulente umane. Ulterior s-a dovedit că stafilococii pot să fie izolați și de la animale, din procesele supurative diverse, fie singuri, fie în asociație cu alte bacterii piogene. În decursul timpului stafilococii și afecțiunile cauzate de aceste bacterii au preocupat pe numeroși cercetători: Pasteur, Rosenbach, Bang, Meyer, Hajek, Marsalek, Bayrd-Parker. În România, contribuții mai importante la studiul stafilococilor au fost aduse de către Stamatin, Bica-Popii, Monica Cernea, Volintir și alții. Genul Staphylococcus a fost separat din fosta familie Microcacceae, argumentele separării fiind conținutul diferit al bazelor ADN, compoziția peretelui celular, diferențele imunologice ale catalazelor etc. În cadrul genului există specii patogene numai pentru om, pentru om și animale, numai pentru animale și specii nepatogene. Specia tip a acestui gen este considerată Staphylococcus aureus. Stafilococii sunt bacterii de formă sferică cu diametrul cuprins între 0,8 și 2μ, care se divid în planuri succesive perpendiculare rezultând astfel gruparea în ciorchine. Se colorează Gram pozitiv, sunt nesporulați, neciliați, necapsulați însă unele tulpini de Staphylococcus aureus pot forma un glicocalix. Stafilococii se cultivă pe medii uzuale, dar pentru izolarea din materialele patologice se pot utiliza și medii speciale selective (Chapman). Tolerează concentrații de peste 5% chiar 10-15% clorură de sodiu deci sunt bacterii halofile. Cele mai multe specii de stafilococi sunt catalază pozitive și facultativ anaerobe, dar cresc mai bine aerob, cu unele exceptii cum este S. aureus subspecia anaerobius care preferă anaerobioza.

Pentru patologia animală cea mai mare importanță o prezintă urmatoarele specii de stafilococi patogeni: Staphylococus aureus cu subspeciile: anaerobius și aureus; Staphylococcus hycus cu subspeciile: hycus și chronogenes și Staphylococcus intermedius.

Staphylococcus aureus este specia bacteriană cu implicația cea mai importantă în etiologia mamitelor la vacă. Sursa principală de infecție o constituie secreția lactată a vacilor infectate. Germenul se dezvoltă în populații bogate și pe pielea ugerului sau în alte zone cutanate piloase și cu umiditate crescută. Tulpinile de Staphylococcus aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii și endotelii ca rezultantă a mai multor caracteristici structurale și biochimice. Existența unor cantități crescute de proteine hidrofobe și a structurilor capsulare polizaharidice de la suprafața peretelui capsular, conferă tulpinilor de Staphylococcus aureus capacitate crescută de colonizare. În același timp, aceste structuri capsulare, împreună cu proteina A prezintă și activitate antifagocitară prin mascarea antigenelor parietale sau prin blocarea imunoglobulinelor și a complementului.

Patogenitatea acestor germeni este asigurată, și printr-un echipament enzimatic și toxigen bogat (tabelul 2, 3).

Dintre produsele extracelulare, coagulaza prezintă corelația cea mai strânsă cu caracterul de patogenitate. La acest stafilococ au fost identificate patru tipuri de hemolizine : alfa, beta, gama si delta.

Hemolizina λ a fost identificată la 59% din tulpinile de Staphylococcus aureus de origine animală, aceasta produce o zonă de hemoliză clară, este activată față de eritrocitele de oaie și iepure și este prezentă mai frecvent la tulpinile de origine umană. Infuzată în mamela de vacă, în doze mici, hemolizina alfa a indus procese inflamatorii grave însoțite de vasoconstricție și necroze ischemice.

Tabelul 2. Enzime elaborate de Staphylococcus aureus

Tabelul 3. Toxine elaborate de Staphylococcus aureus

Hemolizina β prezentă la tulpinile de origine animală, este mai activă față de eritrocitele de oaie și bou și determină o hemoliză de tip «cald-rece», nu este dermonecrotică și enterotoxică, dar este letală pentru iepure.

Hemolizina Υ este activă în special pentru hematiile de iepure în timp ce hemolizina δ este activă pentru hematiile de iepure și de oaie.

Staphylococcus aureus actionează prin virulență și printr-un arsenal de factori de agresivitate (enzime extracelulare) și prin toxicitate. Enzimele extracelulare favorizează difuziunea stafilococilor în țesuturi sau neutralizează mecanismele de apărare ale organismului.

Enterotoxinele sunt toxine stafilococice capabile să producă grave toxiinfecții alimentare. Sunt produse de unii stafilococi coagulază pozitivi, aparținând în special grupului fagic III sau tipului serologic C. Aceste toxine sunt încadrate în trei tipuri distincte prin liză față de hematiile de iepure și oaie. Principalele enzime extracelulare sunt coagulazele, hialuronidaza, fibrinolizina, dezoxiribonucleaza, fosfataza, lipazele și nucleazele care joacă un rol important în penetrarea tisulară a stafilococilor. Toxinele stafilococice au structură proteică, au proprietăți antigenice și provoacă alterări morfologice și funcționale ale țesuturilor. Cele mai importante sunt: hemolizinele, enterotoxinele, leucocidinele, toxina epidermiolitică, exfoliantina și proteina A. Coagulazele stafilococice produc coagularea plasmei și sunt de doua feluri: 1) coagulaza liberă, asemănătoare protrombinei, coagulează plasma
de om, iepure, oaie și bou și se evidențiază prin tehnica în
tuburi. Calificativul de bacterie coagulază pozitivă și coagulază negativă se referă numai la rezultatul testului pentru coagulaza liberă și 2) coagulaza legată care reacționează direct cu fibrinogenul și este evidențiată printr-o tehnică de aglutinare pe lamă.

Majoritatea tulpinilor de Staphylococcus aureus fermentează fără producție de gaz: galactoza, lactoza, maltoza, zaharoza și manitolul. În mod practic se examinează numai activitatea enzimatică față de manitol, pe mediul Chapman. În glanda mamară Staphylococcus aureus produce inflamații catarale sau purulente ale parenchimului precum și microabcese, necroze sau fistule. Staphylococcus aureus are o structură antigenică complexă. Polizaharidul A este prezent în peretele celular la toate tulpinile, conferind astfel o specificitate de specie. Proteina A este un determinant antigenic cu structură proteică fiind prezentă la 90% din tulpinile de Staphylococcus aureus.

Antigenele capsulare sunt de natură polizaharidică și sunt prezente la un numar mic de tulpini. Aceste antigene accentuează virulența tulpinilor de Staphylococcus aureus.

Staphylococcus hycus produce la suine epidermită exsudativă, fiind prezent la porcii sănătoși pe piele și mucoase. Nu fermentează manitolul și maltoza, nu produce pigment dar produce hialuronidază, fosfatază și enterotoxine diferite serologic de enterotoxinele produse de Staphylococcus aureus. Un număr redus de tulpini sunt coagulază pozitive. Are activitate hemolitică numai față de eritrocitele de iepure.

Staphylococcus intermedius a fost propusă după unii autori în clasificările bacteriene ulterioare. Este o bacterie inclusă în flora rezidentă la câini, la care poate produce infecții supurative cu localizări diferite, fermentează tardiv manitolul și maltoza, produce hemoliză, nu conține proteina A și nu produce pigment. Activitatea coagulazică este mai evidentă față de plasma de câine.

Staphylococcus epidermidis este un stafilococ nepatogen comensal la animale și om. Nu produce pigment, este coagulază negativ, nu fermentează manitolul și maltoza, nu produce acetoină și nu conține polizaharidul A și proteina A.

Diferențierea speciilor de stafilococi se poate face pe baza pigmentogenezei, tipului de hemolizina, coagularea plasmei, fermentarea manitolului și a lizotipiei.

Tabelul 4. Caracterele diferențiale ale principalelor specii încadrate în genul Staphylococcus

Legendă: + = >90%tulpini pozitive; – = >90% tulpini negative; D = 11- 89% tulpini pozitive; w = weak reacțion; -w = negative to weak reacțion; +w = pozitive to weak reacțion; ( ) = reacție tardivă; ND = test nedeterminat

Stafilococii sunt bacterii comensale ale pielii și mucoaselor la om și animale dar se pot izola și din apă, sol, aer, fiind răspândiți în mediu. Cu toate că sunt bacterii nesporulate, în mediul exterior au o rezistență remarcabilă, rezistă la antisepticele uzuale, fiind distruși numai de către dezinfectantele puternice. Stafilococii sunt sensibili la numeroși bacteriofagi, lizotipia fiind folosită în mod curent în diagnosticul infecțiilor stafilococice la om.

PARTEA A II- A. CERCETĂRI PROPRII

Capitolul 4. Scop

În cadrul acestei lucrări de licență s-au efectuat cercetări privind caracteristicile morfobiologice ale unor bacterii patogene din genul Staphylococcus sp. izolate din mamite clinice și subclinice de la vaci de lapte.

CAPITOLUL 5. MATERIALE ȘI METODE

În vederea izolării și identificării speciilor bacteriene prezente în mamite la vaci și pentru determinarea sensibilității acestora față de antibiotice, au fost recoltate și prelucrate 25 probe de lapte provenite de la 15 vaci cu mamite clinice și subclinice, din cadrul unei ferme din județul Ilfov.

În tabelul 5 se prezintă sintetic datele referitoare la localizarea procesului infecțios.

Tabelul 5. Probe de lapte recoltate din sferturile afectate pentru examen bacteriologic

RECOLTAREA PROBELOR DE LAPTE

Probele de lapte au fost recoltate în eprubete sterilizate prin autoclavare respectând urmatoarea tehnică: după spălarea mameloanelor de la sferturile afectate cu apa caldă și săpun și uscarea lor cu tifon de unică folosință, s-a îndepărtat prin mulgere primele jeturi de lapte, după care s-a
recoltat în eprubete sterile aproximativ 5-10 ml de lapte sau
secreție respectând regulile de asepsie. După recoltare, fiecare eprubetă a fost individualizată prin notarea numărului matricol al animalului și sfertul afectat și depusă în poziție verticală într-un container cu gheață pentru transportul în condiții de refrigerare (0+4oC) la laboratorul de microbiologie. Prelucrarea probelor s-a făcut în cel mai scurt timp posibil în cursul aceleiași zile sau au fost păstrate la frigider până a doua zi.

Intervalul de timp nu trebuie să depășească 24 ore.

EXAMENUL BACTERIOLOGIC

Pentru izolarea bacteriilor patogene, eventual prezente în probele de lapte recoltate, s-a executat în prealabil un examen organoleptic sumar, înregistrându-se pentru fiecare probă în parte macroscopic, modificările întâlnite, după care probele au fost grupate în funcție de intensitatea acestor modificări. .

În cazul în care probele de lapte evidențiau modificări macroscopice privind culoarea, prezentau coaguli de fibrină sau exprimau un lichid de aspect purulent, s-a executat din fiecare probă în parte frotiuri pentru aprecierea prezenței microorganismelor prin examen bacterioscopic, după colorare prin metoda Gram.

Colorația Gram. Este o colorație foarte utilizată în bacteriologie, deoarece cu ajutorul ei bacteriile pot fi încadrate în două mari categorii: bacterii Gram-pozitive și bacterii Gram negative. Tehinca de lucru: efectuarea frotiurilor (uscare și fixare prin căldură); colorare cu solutie 1% de violet de Gențiana timp de un minut; îndepărtarea colorantului de pe lamă; acoperirea frotiului cu soluție Lugol, timp de 1-2 minute; decolorare cu amestec alcool-acetonă (în părți egale); spălare cu apă de robinet; colorare cu fucsină diluată 1:10, timp de 20-30 secunde; spălare cu apă de robinet uscare și examinare.

Bacteriile Gram-pozitive rezistă la decolorare, rămânând colorate în violet, iar cele Gram-negative sunt decolorate de alcool-acetonă și recolorate în roșu. După finalizarea examenului bacterioscopic, din toate probele de lapte se execută concomitent însămânțări pe medii de cultură uzuale (bulion și agar înclinat) și pe medii speciale (agar-cord-creier cu sânge de berbec).

Însămânțările s-au efectuat cu pipeta Pasteur în cazul probelor în care laptele nu era modificat și cu ansa bacteriologică în celelalte situații.

Tehnica însămânțării cu pipeta – se lucrează cu pipeta gradată, aceasta se scoate din ambalajul steril și se introduce rapid în flacără atât capătul, cât și toată lungimea ei. Se controlează apoi răcirea ei prin flambare. Dacă se lucrează cu pipeta Pasteur, se rupe vârful efilat al pipetei, după care se flambează capătul. Pipeta flambată și răcită se introduce în recipientul cu produsul prelevat și se aspiră de la câteva picături până la 1 sau mai mulți ml, în raport cu materialul de însămânțat și cantitatea de mediu de cultură. Pipeta trebuie manipulată cu grijă pentru a nu uda dopul de vată.

Materialul aspirat în pipetă se însămânțează în recipientul cu mediu nutritiv cu aceleași precauțiuni de flambare a gâtului recipientelor și a dopurilor respective. Pipeta folosită se pune într-un pahar cu amestec sulfo-cromic, aspirându-se din amestec până la aproximativ sub dop. Tampoanele care au servit la recoltarea produselor patologice vor fi descărcate direct în mediu, după care vor fi introduse în tub și puse în găleata de infecte.

Însămânțarea cu ansa bacteriologică – ansa cu firul înroșit în flacără se introduce în recipientul ce conține prelevatul, se răcește alipind-o de peretele recipientului, apoi se ia o porțiune din produs. Se scoate dopul recipientului cu mediu și se flambează gura acestuia. Materialul luat pe bucla ansei din prelevat este introdus în mediul din recipientul deschis sub protecția flăcării. Se descarcă ansa pe peretele recipientului, agitând ușor lichidul, se flambează din nou gura recipientului și dopul cu care apoi se astupă recipientul. Dupa însămânțare, ansa se sterilizează din nou prin încalzire la roșu.

După însămânțare, pe fiecare recipient s-a notat numărul probei, data și s-a incubat în condiții de aerobioză, la temperatura de timp de 24-48 de ore, interval după care s-a efectuat examenul primar al culturilor rezultate (macroscopic și cu lupa) și examen bacterioscopic, folosind metoda de colorare Gram. Din fiecare tip de colonie, care se dezvoltă pe suprafața mediilor de cultură solide, s-au efectuat subculturi (transplantări) pe perechi de medii corespunzătoare în vederea separării amestecurilor bacteriene în culturi pure.

Culturile pure obținute au fost conservate la temperatura laboratorului în vederea identificării lor și pentru cercetarea comportării față de unele chimioterapice și antibiotice.

Identificarea speciilor bacteriene s-a făcut pe baza comportării rezultatelor următoarelor grupe de examene:

Examenul condițiilor de cultivare și caracterelor culturale ;

Examenul caracterelor morfologice;

Examenul proprietăților biochimice.

MEDII DE CULTURĂ

Medii de cultură uzuale

Bulion nutritiv (Biokar Diagnosis)

Agar nutritiv (Biokar Diagnosis)

Medii de cultură selective pentru identificarea stafilococilor

Mediu agar cu sânge 10%

Mediu agar Chapman cu manitol (Biokar Diagnosis)

Mediu Agar Baird Parker (Oxoid)

Mediu Vogel Johnson (Biokar Diagnosis)

Medii de cultură pentru confirmarea prezenței stafilococilor

Mediu agar Giolitti-Cantoni (Liofilchem)

Pentru Drojdii și mucegaiuri

Mediu Sabouraud lichid (Liofilchem)

Mediu agar Sabouraud cu cloramfenicol (Liofilchem)

Reagenți

Plasmă citratată de iepure liofilizată (Biokar Diagnosis)

Emulsie de gălbenuș de ou cu telurit de potasiu 3,5% (Liofilchem)

Soluție pentru testarea indirectă a infecțiilor glandei mamare la vaci

Figura 1. Setul R-MASTITEST SN Institutul Pasteur SA

Pentru identificarea unei specii bacteriene, examenul microscopic direct este de cele mai multe ori insuficient, fiind necesară cultivarea agentului patogen pe un complex de substanțe nutritive adecvate care alcătuiesc mediile de cultură. Alegerea mediului de cultură depinde de natura probelor care se însămânțează și de materialului patologic.

Aceste medii de cultură, pentru a fi corespunzatoare, trebuie să îndeplinească câteva condiții: să conțină substanțe plastice și energetice necesare cultivării microbului însămânțat, adică să asigure surse de azot, de hidrați de carbon, de săruri minerale, de apă, de vitamine și factori de creștere necesari dezvoltării și reproducerii celulelor bacteriene, să satisfacă cerințele de aerobioză sau anaerobioză ale agentului ținând cont de faptul că, în timp ce bacteriile aerobe pot folosi oxigenul molecular, cele anaerobe nu se pot dezvolta în prezența oxigenului liber, să aibă o concentrație de ioni de hidrogen (pH) optimă și să fie sterile, pentru a permite izolarea în cultură pură a germenului respectiv.

Pe masura cunoașterii tot mai aprofundate a exigențelor unei bacterii s-a ajuns la ralizarea unor medii de cultură cu o compoziție adecvată și precisă. În unele cazuri chiar s-a ajuns la situația optimă de preparare a unor medii sintetice – standardizate, nemaifiind necesare ingrediente de origine animală sau vegetală a căror compozitie poate varia foarte mult.

Staphylococcus are capacitatea de a se dezvolta atât în prezența, cât și în absența oxigenului, după cum sunt prezente anumite substanțe nutritive în mediu. Acești germeni își pot desfășura procesele respiratorii și cele fermentative cu aceeași intensitate, fie simultan, fie cu precădere, numai unul, în funcție de natura mediului de cultură și de aportul de oxigen. Felul în care microorganismele se comportă față de oxigen este o consecință a tipului de metabolism și din punct de vedere practic, influențează modul de cultivare și compoziția mediului. În general, mediile de cultură se pot prezenta sub forma lichidă (bulion, apă peptonată, etc.) sau solidă (medii în care se încorporează agar). O serie întreagă de germeni necesită pentru dezvoltarea lor, adaos de lichide organice fără de care dezvoltarea fie că nu are loc, fie că este săracă (streptococi, stafilococi, hemofili).

LICHIDE ORGANICE FOLOSITE ÎN PREPARAREA UNOR MEDII DE CULTURĂ

– sânge și derivate din sânge (plasmă, ser, fibrină)

MEDII DE IZOLARE ȘI IDENTIFICARE A STAFILOCOCILOR

Stafilococii sunt coci Gram pozitivi, dispuși intra sau extracelular. În produsele bogate în microorganisme, apar grupați în grămezi, asemănătoare ciorchinilor de struguri. În produsele sărace în microorganisme, apar în lanțuri scurte, perechi sau izolați. Tiamina și acidul nicotinic sunt factori necesari de creștere, iar uracilul este necesar pentru creșterea anaerobă, pH 7,4. O atmosferă de 30% CO2 este favorabilă pentru producerea de toxină stafilococică.

Unele specii cum ar fi S. lentus si S. auricularis cresc într-un timp mai îndelungat, de 24-36 de ore, în aceleași condiții. Pentru observarea caracterelor de cultură ale stafilococilor coagulază-negativi se prelungește incubarea la 48 h.

Unele variante de S.aureus, rare, se dezvoltă numai în prezența bioxidului de carbon sau a altor metabolite (hemina, menadiona etc)

Producerea de pigment care diferențiază stafilococii în S.aureus, S. albus, S. citreus se observă mai bine pe un mediu conținând o substanță hidrocarbonată și după o incubare de 25 de ore la și apoi 1-2 zile la temperatura camerei. Pigmentul nu se produce în anaerobioză și bulion.

Capacitățile metabolice ale stafilococilor variază considerabil de la o tulpină la alta și de aceea reacțiile chimice au o valoare relativă sub aspectul identificării germenului.

Unele tulpini au fost stimulate de biotină și acidul pantotenic iar necesitățile în azot variază în funcție de tulpină. De asemenea, s-a obținut o creștere bună într-un mediu format din 14 aminoacizi, săruri organice și extract de drojdie și pentru producerea de alfa hemolizină, cei mai importanți aminoacizi sunt: arginina, glicina, prolina, fenilalanina și valina.

Se menționează efectul favorabil al glucozei și a unor ioni anorganici – magneziu, fier, iar ionii de calciu au acțiune inhibitoare.

Stafilococii patogeni prezintă o serie de reacții biochimice și metabolice diferite de tulpinile nepatogene și au o activitate metabolică mai intensă.

Tulpinile patogene sunt mai frecvent pigmentate (aurii, citrine), coagulează plasma și fermentează manitolul.

Pornind de la observația că stafilococii patogeni spre deosebire de alți germeni, cresc în prezența unei cantități mai mari de clorură de sodiu, au fost preparate medii cu clorură de sodiu.

AGAR HIPERCLORURAT. La geloza nutritivă se adaugă sare astfel încât să se obțină o concentrație finală de 6,5% clorură de sodiu.

AGAR CHAPMAN. Se prepară din bulion nutritiv 100 ml, NaCL , manită și roșu fenol 0,15%.

Pe acest mediu, stafilococii patogeni virează culoarea indicatorului din mediu spre portocaliu-galben, iar cei nepatogeni spre roșcat (pH 8,4).

Coloniile caracteristice se trec de aici pe medii lichide, se controlează puritatea și apoi se fac celelalte teste de patogenitate (coagularea plasmei, prezența hemolizei).

TESTE BIOCHIMICE COMPLEXE

TESTUL DE HEMOLIZĂ. Unele bacterii prin enzimele lor, dezintegrează globulele roșii ale diferitelor specii animale. Examinarea acestor proprietăți se poate face pe medii lichide sau pe medii solide. Mai frecvent se folosește geloza-sânge, în plăci Petri. Bacteriile în urma multiplicării, pot produce următoarele aspecte: dezvoltare fără schimbare a mediului (bacterii nehemolitice); dezvoltare însoțită de decolorarea mediului pe diferite distanțe în jurul coloniilor, datorită proceselor de hemoliză și hemodigestie (hemoliza beta); dezvoltarea însoțită de colorarea în verde a mediului în dreptul și în dedesubtul coloniilor, corespunzător transformării hemoglobinei în methemoglobină sub acțiunea H2O2 produse de bacterii (viridans-hemoliza-alfa).

Coloniile de Staphylococcus pe agar nutritiv cu adaos de sânge au aspect cremos, sunt rotunde, cu diametrul cuprins între 1-, margini regulate, suprafața netedă, bombată și lucioasă, corespunzător formei “S” de creștere pe mediile solide. Sunt în general opace și pot fi albe, crem, uneori galben sau orange.

Pe mediile cu sânge S.aureus și S. haemolyticus produc în general o zona circulară de hemoliză în jurul coloniei. Pigmentul și hemoliza sunt caractere variabile în funcție de condițiile de creștere și pot lipsi la S. aureus.

Unele specii de stafilococi coagulază negativi pot prezenta pigment și/sau hemoliză.

Dacă frotiul se realizează din cultură în mediu lichid, dispoziția neregulată de ciorchine va fi înlocuită cu cea în lanțuri scurte, perechi sau coci izolați.

TESTUL DE COAGULARE AL PLASMEI CITRATE. Se repartizează în tuburi Wasermann de câte 0,9 ml plasmă (iepure, bou, om) peste care se adaugă 0,1 ml cultură în bulion de 24 de ore sau se însămânțează cu ansă coloniile de pe agar. Tuburile însămânțate se lasă la și se examinează după 1, 3, 6 și 24 de ore. Se pot folosi și cantități mai mici de plasmă 0,5 ml, iar însămânțarea poate să fie făcută cu o ansă de cultură. Viteza de coagulare depinde de originea culturii, doza folosită și originea plasmei. Plasma de câine are aceeași valoare de diagnostic, ca și cea de iepure. Stafilococul poate deveni patogen fie prin multiplicare și invazivitate cauzând procese infecțioase de tip invaziv, fie prin multiplicare și toxigenitate cauzând toxiinfecții. Stafilococii patogeni de origine, coagulează plasma de iepure începând de la 30 de minute de contact, până la 3 ore. Tulpinile care coagulează după un timp mai îndelungat sunt considerate ca nepatogene, dar se pare că tulpinile care au fost mai mult timp sub acțiunea antibioticelor, coagulează plasma mult mai încet. Prelungirea timpului de apreciere până la 24 de ore, va da o interpretare mai exactă a tulpinilor de staflococi.

Prin testul coagulării plasmei, s-au putut evidenția și existența unor deosebiri între tulpinile de stafilococi cu origine diferită.

Tulpinile de origine umană, coagulează plasma de iepure în timp scurt, foarte încet plasma de oaie și mult mai încet sau deloc plasma de bou, pe când tulpinile de origine animală și în special tulpinile ovine coagulează ambele plasme în același timp.

Testul coagulării plasmei pe lângă importanța bacteriologică în stabilirea patogenității stafilococilor aduce și unele date folositoare de natură epidemiologică în privința sursei de infecție a glandei mamare. Însămânțările făcute în vederea izolării agentului etiologic, pe medii uzuale și speciale au făcut ca identificarea germenilor izolați să se facă pe baza caracterelor morfologice, culturale și biochimice.

DETERMINAREA COMPORTĂRII TULPINILOR DE Staphylococcus IZOLATE, FAȚĂ DE ANTIBIOTICE

Pentru cercetarea comportării tulpinilor bacteriene izolate față de antibiotice și chimioterapice, s-au folosit numai antibiotice din trusa de uz curent. Pentru efectuarea antibiogramei s-a utilizat metoda difuzimetrică pentru bacterii. Aceasta se bazează pe proprietatea antibioticelor de a difuza în medii solide de cultură realizând concentrații diferite, ce scad treptat de la locul de depunere înspre marginea zonei de difuzie. S-a utilizat următoarea tehnică: din cultura în bulion în vârstă de 24 de ore a bacteriei de examinat, s-a făcut o diluție în bulion nutritiv în proporție de 1:10, după care suspensia astfel obținută s-a însămânțat prin inundare, pe suprafața agarului simplu, sau a agarului cu sânge de berbec în funcție de exigențele nutritive ale bacteriei. După inundarea întregii suprafețe a mediului cu cultură microbiană de examinat, cu pipeta Pasteur s-a îndepartat excesul de lichid, iar plăcile s-au introdus pentru 15 minute la termostat, pe o hârtie de filtru cu mediul însămânțat în sus pentru evaporarea lichidului.

După uscarea suprafeței mediului de cultură, cu ajutorul unui dispensor, se depun microcomprimatele de antibiotice la aproximativ 2 cm de marginea plăcii și la cel puțin 3 cm distanță unele de altele. După depunerea tuturor microcomprimatelor, plăcile se mențin pentru cel puțin 30 de minute la temperatura laboratorului pentru ca antibioticele prezente în microcomprimate să difuzeze în mediul de cultură, apoi se mențin la , pentru cel puțin 24h. Un antibiotic poate să oprească înmulțirea unui microb (efect bacteriostatic) dând posibilitatea organismului să-l distrugă, ori îl poate omorâ (efect bactericid).

Comportarea bacteriilor izolate față de antibiotice a fost apreciată pe baza mărimii diametrului de inhibiție, exprimat în milimetri, după cum urmează: bacterii rezistente (diametrul zonei de inhibiție mai mic de 6mm), bacterii sensibile (diametrul zonei de inhibiție mai mare de 6mm). Interpretarea rezulatelor s-a făcut în funcție de zona de inhibiție din jurul microcomprimatelor, în funcție de aceasta, tulpinile fiind apreciate sensibile, dacă diametrul zonei de inhibiție a fost mai mare de , moderat sensibile dacă zona de inhibiție era cuprinsă între 2 – 5 mm, și rezistente atunci când zona de inhibiție a fost foarte mică (≤ ) sau chiar absentă.

Concentrațiile de antibiotice sunt astfel calculate încât să corespundă gamei de nivele de antibiotice, care se pot realiza în organismul animalului bolnav.

Tulpinile de Staphylococcus aureus izolate din probele de lapte recoltate, au fost testate în ceea ce privește sensibilitatea la antibiotice.

CAPITOLUL 6. REZULTATE ȘI DISCUȚII

S-au efectuat cercetări în vederea depistării precoce a mamitelor la vaci în vederea aplicării unor tratamente eficace și a luării de măsuri profilactice corespunzătoare. Au fost efectuate examene clinice și au fost prelevate probe de lapte de la 15 vaci.

Figura 2. Probe de lapte cu si fara modificări organoleptice

La cele 25 probe s-a efectuat testul rapid pentru identificarea infecțiilor glandei mamare cu R-Mastitest, s-a determinat numărul total de celule somatice, numărul total de germeni mezofili aerobi, examene bacteriologice de izolare și identificare pentru Staphylococus aureus, teste de patogenitate „in vivo” și „in vitro” și antibiograma.

Figura 3. Rezultate la tewstul rapid R-MASTITEST

Figura 4. Rezultate la testul NTGMA drojdii și mucegaiuri

Din cele 25 probe lapte recoltate 15 probe au prezentat modificări organoleptice. Din probele analizate 12 probe au fost pozitive la testul R-Mastitest, numărul de celule somatice a fost cuprins între 250.000 și 6.500.000 celule/ml lapte, din 6 probe s-a izolat Staphylococcus aureus coagulază pozitiv, din 12 tulpini izolate 3 au fost rezistente la ampicilină și amoxicilină, 8 la penicilina și 7 la eritromicină. Prin acest studiu s-a identificat în fermă prezența unor tulpini Staphylococus aureus rezistente la 3 antibiotice de elecție din grupa Beta lactamine și la unele antibiotice cu spectru larg frecvent utilizate în practica terapeutică în ferme de vaci.

OBSERVAȚII CLINICE

Exprimările clinice înregistrate, ca și formele evolutive ale mamitelor au variat în limite foarte largi. În toate cazurile de mamită clinică, secreția glandei mamare a fost modificată. Modificările secreției lactate a fost mai mult sau mai puțin notabilă în funcție de intensitatea procesului inflamator: de la alb-gălbui cu flocoane de cazeină în mamitele catarale, până la roșiatic cu strii purulente sau flocoane de fibrină în mamitele seroase. Investigațiile clinice efectuate în urma inspecției ugerului (formă, volum, culoare, modificări patologice ale pielii) și palpației ugerului (consistență, elasticitatea, formațiuni nodulare, temperatura locală, sensibilitatea, palparea canalului papilar), au evidențiat în toate cazurile de mamită clinică, modificări de consistență ale sfertului afectat, o creștere a temperaturii locale, creșterea sensibilității la palpare, reacții din partea limfocentrilor retromamari aferenți sfertului afectat. În unele cazuri de mamită clinică au fost înregistrate modificări în starea generală a animalelor: diminuarea apetitului, uneori inapetență, hipertermie, stare de prostație și atonie ruminală.

Modificările stării generale la vacile cu mamite interstițiale se datorau acumulării de exsudat în parenchimul mamar, care provocau tulburări circulatorii și excitau terminațiile nervoase din țesutul inflamat, precum și acțiunii toxinelor elaborate de bacteria sau bacteriile care au provocat inflamația.

Pe baza examenului clinic, au fost diagnosticate în totalitate 15 cazuri
mamită clinică. La cele 25 probe s-a efectuat testul rapid pentru identificarea infecțiilor glandei mamare cu R-Mastitest, s-a determinat numărul total de celule somatice, numărul total de germeni mezofili aerobi, examene bacteriologice de izolare și identificare pentru Staphylococus aureus, teste de patogenitate „in vivo” și „in vitro” și antibiograma. Din cele 25 probe lapte recoltate 15 probe au prezentat modificări organoleptice. Din probele analizate 12 probe au fost pozitive la testul R-Mastitest, numărul de celule somatice a fost cuprins între 250.000 și 6.500.000 celule/ml lapte, din 6 probe s-a izolat Staphylococcus aureus coagulază pozitiv, din 12 tulpini izolate 3 au fost rezistente la ampicilină și amoxicilină, 8 la penicilina și 7 la eritromicină. Prin acest studiu s-a identificat în fermă prezența unor tulpini Staphylococus aureus rezistente la 3 antibiotice de elecție din grupa Beta lactamine și la unele antibiotice cu spectru larg frecvent utilizate în practica terapeutică în ferme de vaci.

În 8 din cazurile de mamită clinică au fost înregistrate modificări în starea generală a animalelor, exprimate prin sindrom febril.

Analizând comparativ repartiția pe sferturi a inflamației la cele 15 vaci, s-a constatat că în cazul focarului analizat, nu s-a confirmat ipoteza conform căreia mai frecvent afectate sunt sferturile de la nivelul părții posterioare a ugerului, deoarece acestea ar fi expuse traumatismelor și contaminării prin contactul cu așternutul murdărit cu fecale.

Mamita stafilococică acută apare de regulă în primele zile după fătare și este însoțită de stare toxiemică, abatere, hipertermie, decubit prelungit, mers greoi. Local se observă inflamații ale sferturilor mamare afectate însoțite de căldură și creșterea sensibilității dureroase. La baza mamelonului și în parenchimul mamar se formează zone de indurație care se extind la tot sfertul afectat. Secreția mamară are aspect de lichid sero-fibrinos, galben-cenușiu, cu granule de puroi sau striuri sanguinolente. După o evoluție de 1-2 zile, secreția capătă caracter purulent, iar în sferturile de uger neafectate se instalează hipogalaxia. Evoluția este de 8-10 zile după care simptomele generale se remit, se reia secreția lactată în sferturile mamare neafectate, iar boala trece în formă catarală cronică. Aceasta se caracterizează prin apariția de noduli în compartimentele afectate și transformarea lor în abcese care pot fistuliza (figura 5).

Figura 5. Mamită stafilococică acută la vacă

Mamita seroasă este denumită și mamită interstițială și se caracterizează prin inflamația seroasă a țesutului conjunctiv subcutanat și interstițial al glandei mamare, însoțit de infiltrația cu exsudat seros, bogat în limfocite, fibroblaste și leucocite polimorfonucleare neutrofile. Exsudatul poate să pătrundă și în spațiile interlobulare sau chiar în spațiile intraacinoase, reducând activitatea secretorie. Boala apare ca o infecție descendentă, limfatică sau hematogenă, de la nivelul plăgilor, al focarelor de endometrită, enterite sau ca urmare a traumatismelor. Secreția lactată scade cantitativ, iar odată cu afectarea acinilor devine seros și cu flocoane de cazeină. Procesul este însoțit de edematierea compartimentului afectat, creșterea temperaturii locale, a sensibilității devenind dureros, scăderea producției de lapte, hipertermie, depresie și diminuarea apetitului. Prin cronicizare se produce indurarea ugerului datorită procesului de sclerozare.

Figura 6. Vacă cu mamită acută (seroasă) cu afectarea compartimentului stâng anterior

Mamita catarală reprezintă cea mai frecventă formă de mamită la vaci. Infecția se produce pe cale ascendentă, iar flora de bacterii patogene implicată în etiologie este foarte largă. Odată ajunși în sinusul galactofor și în canalele galactofore, germenii se multiplică și produc procese de fermentare și coagulare a laptelui, urmate de reacția inflamatoare a mucoasei sinusului și a canalelor galactofore. Coagulii formați pot bloca canalele galactofore, iar infecția difuzează la nivelul acinilor secretori glandulari, alterând funcțiile acestora și favorizează apariția hipogalaxiei sau a agalaxiei. Procesul este însoțit de congestie și diapedeză, tumefierea compartimentului care devine cald, dureros, nu-și micșorează volumul după muls și poate să prezinte focare indurate. Starea generală este alterată, iar laptele devine apos și se separă în zer și sediment cazeos, cu flocoane și coaguli. În formă cronică, starea generală a vacilor nu este afectată, iar local compartimentul de uger afectat, prezintă infiltrări conjunctive localizate sau difuze în țesutul glandei mamare care se manifestă ca indurații nodulare în partea distală a mamelei sau în regiunea cisternei glandulare a mameloanelor. Procesul poate să evolueze către hipertrofia sau atrofia mamară și este însoțit de scăderea producției de lapte și prezența de flocoane în componenta acestuia (figura 7).

Figura 7. Mamită catarală aspect clinic

Mamita purulentă evoluează ca urmare a formelor catarale sau seroase, netratate sau tratate necorespunzator. Semnele generate sunt prezente în formă acută și lipsesc în cea cronică. Procesul patogen se caracterizează printr-un aflux leucocitar sporit în lapte și prin infiltrații leucocitare difuze sau nodulare în țesutul mamar. Secreția mamară este apoasă, cu coaguli și flocoane, devenind purulentă dupa 3-4 zile de evoluție. Compartimentul mamar afectat este cald, tumefiat și sensibil. Mameloanele sunt indurate și îndepărtate, iar limfonodulii retromamari sunt măriți în volum și sensibili. În formă cronică, focarele purulente pot să conflueze și să dea naștere la abcese sau pot difuza, dând naștere la necroze ale țesutului conjunctiv subcutanat și interstițial, care reprezintă flegmonul mamar. Dintre complicațiile procesului inflamator mamar, amintim proliferarea ireversibilă a țesutului conjunctiv urmată de atrofia parenchimului mamar și gangrena mamară (figura 8).

Figura 8. Mamită purulentă

În mediile lichide Staphylococcus aureus a producs o turbiditate intensă cu depozit necaracteristic, iar pe mediile solide a format colonii rotunde, cremoase, netede, lucioase, pigmentate. Pigmentul carotenoid portocaliu sau galben-citrin este o caracteristică relativ constantă a tulpinilor de Staphylococcus aureus, cultivate în aerobioză.

Figura 9. Staphylococcus aureus. Cultură pe agar înclinat. Colonii pigmentate în galben-auriu

La examenul bacterioscopic stafilococii sunt bacterii de formă sferică, mici, care se divid în planuri perpendiculare succesive, grupându-se într-un aspect caracteristic de ciorchine, sunt Gram pozitive, nesporulate, neciliate și necapsulate.

În urma examenului bacteriologic efectuat prin însămânțări din secreția lactată pe medii uzuale (geloză și bulion) au fost izolate în cultură pură colonii de Staphylococcus aureus.

Prin examinarea microscopică a frotiurilor s-au identificat germeni de formă sferică (coci), Gram pozitivi, grupați în grămezi caracteristice (ciorchine) (figura 10).

Figura 10. Aspect frotiu colorat prin metoda Gram din bulion nutritiv

Însămâțările pe mediile speciale (Chapman și geloză cu sânge, au condus la evidențierea patogenității tulpinilor izolate (fermentarea manitolului pe mediul Chapman, testul de hemoliză pe mediile cu sânge și testul catalazei pozitiv).

Figura 11. Staphylococcus aureus. Cultura pe agar cu sânge de oaie, colonii hemolitice

Figura 12. Cultură de Staphylococcus aureus pe agar cu emulsie de galbenuș de ou. Producție de lecitinază

Aceste medii de cultură utilizate pentru izolare, au permis pe baza aspectelor culturale sau a reacțiilor de culoare (Chapman colonii galbene) aprecierea unor proprietăți biochimice sau de patogenitate ale tulpinilor izolate.

Figura 13. Colonii negre de Sa pe mediu selectiv Baird Parker

Cercetându-se patogenitatea tulpinilor izolate prin testele de hemoliză a sângelui de oaie, fermentarea manitolului pe mediu Chapman și coagularea plasmei citratate de iepure și oaie, s-au obținut rezultatele redactate în tabelul 6.   

Tabelul 6. Rezultatul testelor de patogenitate.

. 

       Din analiza rezultatelor obținute prezentate în tabelul 6 rezultă că din cele 12 tulpini de Staphylococcus aureus izolate, 10 au hemolizat sângele de oaie, ceea ce reprezintă 83,33%. În ceea ce privește testul coagulazei, numai 8 (66,66%) au avut o acțiune pozitivă asupra plasmei citratate de iepure la 3 ore.

Activitatea coagulazică asupra plasmei citratate de oaie s-a manifestat la fel cu cea de iepure.

De asemenea,  se observă că acțiunea coagulantă a tulpinilor izolate față de plasma de oaie este mult mai intensă în primele 3 ore după însămânțare, comparativ cu acțiunea tulpinilor față de plasma citratată de iepure.

Tabelul 7. Sensibilitatea la antibiotice a celor 12 tulpini de Staphylococcus aureus izolate  

Din datele prezentate în tabelul 7 rezultă că tulpinile de Staphylococcus aureus izolate de la vaci cu mamită au fost sensibile la penicilină în proporție 33,33 % și de 100% la vancomicină.

    Analizând datele obținute, se poate observa că din cele 12 tulpini cercetate de S. aureus, 4 (33,33%) au fost sensibile la penicilină, fapt ce a determinat utilizarea amoxiciclinei în tratamentul cazurilor de mamită clinică.

Cel mai puțin active pentru tulpinile acestei specii a fost eritromicina deoarece din cele 12 de tulpini examinate, numai 5 au fost sensibile față de acest antibiotic, iar 7 s-au dovedit a fi rezistente.

Sensibilitatea maximă, adică toate cele 33 tulpini au fost sensibile, a fost constatată la vancomicină. De fapt, rezultatele obținute, confirmă datele din literatura de specialitate, unde se afirmă că  vancomicina este aproape singurul antibiotic activ față  de tulpinile de Staphylococcus aureus meticilino-rezistente.

CAPITOLUL 7. CONCLUZII

      În urma investigațiilor de ordin clinic si bacteriologic, efectuate la probele de lapte recoltate de la vaci cu mamită clinică sau subclinică s-a putut formula următoarele concluzii:

Din 25 probe lapte recoltate 15 au prezentat modificări organoleptice

Din 25 probe lapte analizate 12 au fost pozitive la testul R-MASTITEST

Numarul de celule somatice (NCS) a fost cuprins între 250.000 și 6.500.000 celule /ml lapte

Din 6 probe s-a izolat Staphylococcus aureus coagulază pozitiv

Din 6 probe s-a izolat Staphylococcus aureus coagulază pozitiv și hemoliză pozitiv

Din 12 tulpini de Staphylococcus aureus

– 3 au fost rezistente la ampicilina si amoxicilina

– 8 la penicilina

– 7 la eritromicină

Prin acest studiu s-a identificat în fermă prezența unor tulpini de Staphylococcus aureus coagulază pozitive și hemoliză pozitive rezistente la 3 antibiotice de elecție din grupa Beta lactamine și la antibiotice cu spectru larg din grupa macrolide frecvent utilizate în practica terapeutică in fermele de vaci de lapte

CAPITOLUL 8. RECOMANDĂRI

Bacteriile patogene sunt germeni care prezintă pericol pentru sănătatea umană, sursa acestor bacterii sunt mamitele, igiena necorespunzătoare a mulsului și a adăpostului. Mastitele la vacile pentru lapte sunt cele mai importante afecțiuni ale glandei mamare, cu implicații zooeconomice, datorită pierderilor în producția de lapte, reformarea timpurie a animalelor bolnave, precum și prin riscul care îl reprezintă laptele infectat pentru sănătatea publică. Deși s-au înregistrat progrese importante în controlul și terapia acestor afecțiuni, totuși s-a constatat că rezultatele în combaterea acestor afecțiuni sunt subnivelul optim, frecvența acestor mastite fiind în unele efective mare, fapt care are o influență negativă asupra parametrilor de producție și implicit asupra indicilor economici în fermele de vaci cu lapte. Pentru a se reduce cât mai mult pierderile economice prin producția de lapte și prin reformarea animalelor se recomandă:

respectarea următoarelor măsuri sanitar-veterinare de prevenire și combatere a mamitelor:

aplicarea unui tratament cu antibiotice în fiecare sfert de uger imediat după înțărcare. O dată cu planificarea vacilor pentru înțărcare se recomandă să se facă analiza utilizând R-mastitest, pentru a se depista precoce și a se trata manitele subclinice.

izolarea și identificarea microorganismelor implicate

Respectarea regulilor de igienă a mulsului:

dezinfectarea ugerul după mulsoare la toate vacile prin scufundarea mameloanelor dupa muls în dezinfectant, cea ce reprezintă unica modalitate eficientă de oprire a raspândirii mamitelor în efectiv. Acest procedeu este foarte eficient pentru eliminarea de pe mameloane a germenilor patogeni din mediu precum E.coli si Strep.uberis, care se gasesc în mediul înconjurator al vacii

să se mențină curat ugerul vacilor între mulsori, de evitat rănirea ugerului, în special a vârfului sfârcurilor

Pastrarea echipamentelor de muls în stare funcțională optimă, să se reducă la minim intrarea de aer în instalația de muls și a căderii de aparat de pe uger în timpul mulsului, menținerea curata a instalatiei de muls;

Reformarea vacile cu mamite cronice.

Asigurarea în rație a unei cantități adecvate de vitamina E și seleniu.

Pentru depistarea precoce a mamitelor se recomandă examinarea vizuală și fizică zilnică a ugerului.

BIBLIOGRAFIE

AARESTRUP, F.M.; LARSEN, H.D.; JENSEN, N.E.; – Characterization of Staphylococcus simulans strains isolated from cases of bovine mastitis.Veterinary Bulletin; April 1999.

ABDELLA, M. – Bacterial causes of bovine mastitis of Wondogenet, Ethiopia. Veterinary Bulletin; January 1997.

ALI-VEHMANS,T.;WESTPHALEN,P.;MYLLYS,V.; SANDAOLOM, M.; – Binding of Staphylococcus aureus to milk fat globules increases resistance to penicilin- G; Veterinary Bulletin; August 1997.

ANNAEMULLER, C; LAMMLER, C.H.; ZSCHOCK, M. – Genotyping of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. Veterinary Bulletin; January 2000.

BĂRZOI D., APOSTU S. – Microbiologia produselor alimentare, Ed. Risoprint, Cluj- Napoca, 2002, p. 150-155.

BERCEA I., MARDARI AL., MOGA-MÎNZAR R., POPOVICIU A. – Boli infecțioase ale animalelor. Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1981.

CORRALE, J.C.; SANCHEZ, A.; LUENGO, C; CONTRERAS, A.; Variation in mastitis prevalence, aetiology and drug resistance between goat flocks with mastitis control programes. Veterinary Bulletin; November 1999.

GUIRAUD J.P. – Microbiologie alimentaire, Dunod, Paris, 1998.

MADDOX, J.F., C.C.REDDY, R.J.EBERHART and R.W. SCHOLZ. 1991.Dietary selenium effects on milk eicosanoid concentration in dairy cows during coliform mastitis.Prostaglandins, 11:463 – 476.

MOGA MÂNZAT RADU ; – Boli infectioase ale animalelor /bacterioze / – Infecții produse de germenii din genurile STAPHYLOCOCCUS și STREPTOCOCCUS – Nicolae Catana; Octombrie 2001.

OGNEAN, L., Cercetări asupra configurației citologice din secrețiile normale și patologice ale glandei mamare la vacă, 1995, Bul. USAMV-ZMV, vol. 49, pp. 373-571.

ROTARU, O., OGNEAN, L., Morfologia și fiziologia populației celulare din lapte, Ed. Casa Cărții de Știință, Cluj, 1998

VAAMONDE, R.J. AND R.W. ADKINSON. 1989. Somatis cell count score associated with clinical mastitis, number of antibiotic treatments and duration of clinical episode in sinale and multiple trait selected lines of Holstein cattle. Journal of Dairy Science, 72 (supp. 1): 85 – 86.