Cercetari Privind Posibilitatea Introducerii Unor Tehnici de Biologie Moleculara In Diagnosticul Prenatal Neinvaziv Si Invaziv
Cercetări privind posibilitatea introducerii unor tehnici de biologie moleculară în diagnosticul prenatal neinvaziv și invaziv
TEZA DE DOCTORAT
CUPRINS
INTRODUCERE
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE TEZEI
PARTE GENERALA – STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII
1. Introducere
2. Strategii în diagnosticul prenatal
3. Metodologia diagnosticului prenatal invaziv
4. Metodologia diagnosticului prenatal neinvaziv
4.1. Analiza celulelor fetale liber circulante în sangele matern
4.2. Acizii nucleici fetali liber circulanți în sângele matern
PARTE SPECIALĂ – CAPITOLUL 1
CERCETĂRI PRIVIND POSIBILITATEA INTRODUCERII UNOR TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ ÎN DIAGNOSTICUL PRENATAL INVAZIV
Diagnosticul prenatal rapid al trisomiilor 13, 18, 21 și al aneuploidiilor
cromozomilor de sex prin tehnica QF-PCR
1. MATERIALE ȘI METODE
1.1. Pregatirea probelor pentru extracția ADN fetal
1.1.1. Vilozități coriale
1.1.2. Lichid amniotic
1.1.3. Produs de concepție în sarcinile oprite din evoluție
1.1.4 Sânge fetal
1.2. Extracția ADN
1.2.1. Extracția ADN cu kit-ul DNA IQ System™, Promega
1.2.2. Extracția ADN cu kitul QIAamp® DNA Mini Kit
1.2.3. Extracția ADN în sistem automat utilizând
aparatul Maxwell® 16 Research System
1.2.4. Extracția ADN cu kitul QuickExtract™
DNA Extraction Solution, Epicentre
1.3. Reacția de amplificare
1.3.1. Prezentarea generală a kit-urilor PCR
1.3.2. Aneufast™ kit (Genomed Ltd, UK)
1.3.3. Devyser Compact
1.3.4. Metoda QF-PCR LAB
1.4. Electroforeza capilară
2. REZULTATE
2.1. Evaluarea electroferogramelor
2.1.1. Evaluarea peak-urilor de fluorescentă asociate cu alelele unui marker STR
2.1.2. Evaluarea artefactelor de tehnică
2.1.2.1. Evaluarea artefactelor rezultate in urma reactiei de amplificare
2.1.2.1.1. Benzile stutter
2.1.2.1.2. Amplificarea preferentială
2.1.2.1.3. Polimorfismul situsului de legare al primerului și alelele nule
2.1.2.1.4. Extensie finală incompletă
2.1.2.2. Evaluarea artefactelor rezultate din migrarea electroforetică
2.1.2.2.1. Spike-urile electroforetice
2.1.2.2.2. Arterfactele “bleeds through” sau “pulled-up”
2.1.2.2.3. Artefactele “dye blobs” sau “free-dye peaks”
2.2. Interpretarea și formularea rezultatelor
2.2.1. Contaminarea cu celule materne
2.2.2. Rezultate normale
2.2.3. Rezultatele anormale
2.2.3.1. Polimorfismele submicroscopice
2.2.3.2. Mutațiile microsateliatare somatice
2.2.3.3. Anomaliile cromozomului 21
2.2.3.4. Anomaliile cromozomului 18
2.2.3.5. Anomaliile cromozomului 13
2.2.3.6. Anomaliile cromozomilor de sex
2.2.3.7. Mozaicismele cromozomiale
2.2.3.8. Triploidia
2.3. Avorturile spontane și anomaliile cromozomiale
2.4. Analiza cromozmomilor 15, 16 și 22 prin metoda QF-PCR
3. DISCUȚII
4. CONCLUZII
PARTE SPECIALĂ – CAPITOLUL 2
CERCETĂRI PRIVIND POSIBILITATEA INTRODUCERII UNOR TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ ÎN DIAGNOSTICUL PRENATAL NEINVAZIV
Introducere
Obiective generale
Obiective specifice
1. Detecția neinvaziva a genotipului RHD fetal prin analiza unei probe de sange periferic matern
Introducere
1.1. Materiale și metode
1.1.1. Designul experimental și prezentarea pacienților
1.1.2. Procesarea probelor de sânge
1.1.3. Extracția ADN total extracelular plasmatic
1.1.4. Reacțiile de amplificare a secventelor țintă cu origine fetala – PCR multiplex
1.1.4.1. Selecția primerilor specifici genei RHD
1.1.4.2. Pregatirea amestecului de reacție pentru PCR
1.1.4.3. Programul PCR
1.1.4.4. Analiza produșilor de amplificare
1.1.5. Interpretarea rezultatelor
1.2. Rezultate
1.3. Discuții și concluzii
2. Determinarea neinvazivă a sexului genetic fetal prin analiza ADN fetal liber circulant în sangele matern
Introducere
2.1. Materiale și metode
2.1.1. Designul experimental și prezentarea pacienților
2.1.2. Procesarea probelor de sânge
2.1.3. Extracția ADN total extracelular plasmatic
2.1.4. Reacțiile de amplificare a secventelor țintă cu origine fetală – PCR multiplex
2.1.4.1. Selecția primerilor pentru detecția sexului genetic fetal
2.1.4.2. Pregătirea amestecului de reacție pentru PCR
2.1.4.3. Programul PCR
2.1.4.4. Analiza produșilor de amplificare
2.1.5. Interpretarea rezultatelor
2.2. Rezultate
2.3 Discuții și concluzii
CONCLUZIILE FINALE ALE TEZEI
BIBLIOGRAFIE
ANEXA 1 – Listă lucrări publicate în domeniul tezei
INTRODUCERE
Malformatiile congenitale reprezinta cauza principala a mortalitatii infantile, fiind prezente in apoximativ 2-3% dintre nou-nascuti si in 20-30% din cazurile de moarte intrauterina (Stevenson R.E., Hall J.G., 2006). Cauzele producerii malformatiilor congenitale pot fi intrinseci sau genetice (anomalii cromozomiale sau monogenice), extrinseci sau de mediu, precum afectiuni ale mamei, afectiuni placentare sau generate de actiunea teratogenica a unor substante, multifactoriale rezultate din actiunea cumulata a celor doua cauze anterioare sau cu etiologie necunoscuta (Stevenson R.E., Hall J.G., 2006; Bui T.H., 2006). Cumulat cu implicarea in etiologia malformatiilor congenitate, anomaliile cromozomiale sunt responsabile de aproximativ 50% dintre cazurile de avort spontan, de 6% dintre cazurile de moarte intrauterina, 5% dintre pierderile recurente ale sarcinii si, de asemenea, se detecteaza la aproximativ 0,5% dintre nou-nascuti, iar in cazul gravidelor cu varsta mai mare de 35 de ani procentul creste pana la 2% dintre sarcini (Luthardt W.F., Keitges E., 2001).
Strategia de preventie a bolilor cu componenta genetica include o serie vasta de masuri ce include evitarea sau minimizarea actiunii unor factori externi, depistarea purtatorilor de mutatii genetice cu risc de transmitere ereditara in descendenta si nu in ultimul rand, actiuni de diagnostic precoce, prenatal si postnatal (Khoury M.J. et al., 1993; King A.R. et al, 2002; Covic M. et al., 2011; Popovici C. et al., 2011).
Diagnosticul prenatal se impune in prezent ca unic serviciu cu actiune profilactica a anomaliilor cromozomiale, utilizand resurse multidisciplinare in evaluare, diagnostic si consiliere (Popovici C. et al., 2011). Stategiile procedurale utilizate in vederea obtinerii unui diagnostic timpuriu in sarcina include o serie de metode deja clasice cu caracter invaziv, dar si metode de ultima generatie cu caracter neinvaziv (Elias S. et al., 2002; Aitken D.A. et al, 2002; Zimmermann B. et al, 2005; Lo Y.M. et al, 2007; DiMaio M.S. et al., 2010; Chiu R.W.K. et al, 2011).
SCOPUL ȘI OBIECTIVELE TEZEI
In prezent nu exista un test genetic care sa garanteze nasterea unui copil sanatos, insa din momentul efectuarii primului cariotip fetal (Steele M.W., Breg W.R., 1966) si pana in prezent, tehnicile utilizate in diagnosticul prenatal au avut o evolutie dinamica, in speranta cresterii capacitatii de detectie a testelor si a minimizarii riscurilor la care sunt expusi atat fatul cat si mama prin procedurile standard de recoltare (Bianchi D.W., 1995; Lo Y.M. et al., 1997, 1998, 1999).
Scopul acestei teze a fost de a cerceta posibilitatile de aplicare a unor tehnici de biologie moleculara in diagnosticul prenatal invaziv si neinvaziv. Tematica acestui studiu a reprezentat o premiera pentru Romania in 2007. Avand in vedere ca cercetarile efectuate in domeniul detectiei prenatale a anomaliilor genetice s-au desfasutat in doua directii, si anume diagnostic prenatal invaziv si diagnostic prenatal neinvaziv, lucrarea a fost structura in doua capitole. Metodologia de lucru aplicata in aceasta lucrare utilzeaza tehnici moleculare si citogenetice moleculare, respectiv multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction), QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction), MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) sau electroforeza capilara cu sopul de a facilita procesul de diagnostic.
Subiectul primului capitol a fost detectia rapida a anomaliilor cromozomilor 13, 18, 21, X si Y prin tehnica QF-PCR prin analiza produsului fetal recoltat prin procedee invazive. Obiectivele urmarite au fost:
Testarea si evaluarea performantelor acestei tehnici comparativ cu metoda standard citogenetica a diagnosticului prenatal (cariotipul fetal);
Implementarea acestui test in domeniul diagnosticului prenatal din Romania.
Subiectul celui de-al doilea capitol al lucrarii a fost diagnosticul prenatal neinvaziv prin care se analizeaza ADN fetal liber circulant in sagele matern.
Obiectivele urmarite au fost:
Genotiparea neinvaziva a genei RHD fetala in vederea imbunatatirii procesului de gestionare a incompatibilitatii materno-fetale de Rh in sistemul medical din Romania;
Determinarea neinvaziva a sexului genetic fetal cu aplicabilitate in screeningul sarcinilor cu risc pentru boli legate de cromozomul X.
PARTE GENERALĂ – STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII
1. Introducere
In ultimii douazeci de ani, la nivel mondial, s-a remarcat o crestere marcanta a varstei la care o femeie naste primul copil (Sobotka T., 2004; Mathew T.J., Hamilton E.B., 2009; Wiebe E. et al, 2012). Studii efectuate la nivel populational in Europa, Canada, Australia, Noua Zeelanda, Statele Unite ale Americii au evidentiat cresterea varstei mamei la nasterea primului copil ca rezultat al unui fenomen socio-economic si cultural complex. Intre anii 2005 si 2006 au fost elaborate diverse studii asupra varstei medii a femeii la nasterea primului copil, aceasta fiind calculata la aproximativ 28-29 de ani pentru Canada, Franta, Marea Britanie (Wiebe E. et al, 2012), Finlanda, Danemarca, Olanda, Japonia, Elvetia, 27 de ani pentru Australia si 25 ani in Stalele Unite (Mathew T.J., Hamilton E.B., 2009). Acest fenomen se pare ca este rezultatul influentei cumulate al unei serii de factori precum globalizarea, cerinta de personal inalt specializat corelat cu dezvoltarea sistemului educational si prelungirea perioadei studiilor, dorinta cladirii unei cariere, instabilitatea locului de munca in context economic si nesiguranta materiala (Sobotka T., 2004). Un alt factor important in aparitia acestui fenomen a fost controlul femeii asupra momentului in care va naste primul copil (Johnson J.A. et al., 2012) ca rezultat al modificarii legislatiei privind avortul la cerere (Boland R., Katzive L., 2008; Wiebe E. et al, 2012) si totodata a dezvoltarii unor metode de contraceptie sigure si accesibile. S-a evidentiat de asemenea scaderea mortalitatii gravidelor care optau pentru interventii ilegale, iar Romania este un exemplu al acestui fenomen intrucat in decembrie 1989 s-a abrogat legea din 1966 ce interzicea avortul si contraceptia (Stephenson P. et al., 1992). Aceasta libertate de decizie a femeii din ultimii douazeci de ani s-a manifestat si asupra relationarii intre cele doua sexe. Transformarile parteneriatului clasic bazat pe casatorie in relatii mai putin conventionale de coabitare si instabilitatea acestora pentru conceperea unui copil sunt factori decisivi in amanarea nasterii (Sobotka T., 2004; Wiebe E. et al, 2012).
Cumulat cu aceasta crestere a varstei femeii la nasterea primului copil, Romania este caracterizata de o rata a natalitatii in scadere si totodata de o crestere a fluxului de emigrare al populatiei tinere, raportul public din 2011 al Institutului National de Statistica punand in evidenta cresterea mediei de varsta la 39,7 ani in 2010 comparativ cu 39 de ani in 2007 (Ciuchea A. et al., 2011). Romania se incadreaza in tendinta mondiala a cresterii varstei materne la primul copil ceea ce conduce la necesitatea adoptarii unor noi stategii de cresterea a natalitatii corelate in acelasi timp cu modalitati de preventie a complicatiilor sarcinilor asociate cu varsta inaintata a mamei.
Femeile care doresc un copil dupa varsta de 30 – 35 de ani sunt supuse unor riscuri multiple precum sarcina ectopica, oprirea sarcinii in evolutie, anomalii cromozomiale, anomalii congenitale, placenta praevia, diabet gestational, preeclampsie sau nastere inainte de termen (Cleary-Goldman J. et al., 2005; Best Start: Ontario’s Maternal, Newborn and Early Child Development Restic.
Subiectul primului capitol a fost detectia rapida a anomaliilor cromozomilor 13, 18, 21, X si Y prin tehnica QF-PCR prin analiza produsului fetal recoltat prin procedee invazive. Obiectivele urmarite au fost:
Testarea si evaluarea performantelor acestei tehnici comparativ cu metoda standard citogenetica a diagnosticului prenatal (cariotipul fetal);
Implementarea acestui test in domeniul diagnosticului prenatal din Romania.
Subiectul celui de-al doilea capitol al lucrarii a fost diagnosticul prenatal neinvaziv prin care se analizeaza ADN fetal liber circulant in sagele matern.
Obiectivele urmarite au fost:
Genotiparea neinvaziva a genei RHD fetala in vederea imbunatatirii procesului de gestionare a incompatibilitatii materno-fetale de Rh in sistemul medical din Romania;
Determinarea neinvaziva a sexului genetic fetal cu aplicabilitate in screeningul sarcinilor cu risc pentru boli legate de cromozomul X.
PARTE GENERALĂ – STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII
1. Introducere
In ultimii douazeci de ani, la nivel mondial, s-a remarcat o crestere marcanta a varstei la care o femeie naste primul copil (Sobotka T., 2004; Mathew T.J., Hamilton E.B., 2009; Wiebe E. et al, 2012). Studii efectuate la nivel populational in Europa, Canada, Australia, Noua Zeelanda, Statele Unite ale Americii au evidentiat cresterea varstei mamei la nasterea primului copil ca rezultat al unui fenomen socio-economic si cultural complex. Intre anii 2005 si 2006 au fost elaborate diverse studii asupra varstei medii a femeii la nasterea primului copil, aceasta fiind calculata la aproximativ 28-29 de ani pentru Canada, Franta, Marea Britanie (Wiebe E. et al, 2012), Finlanda, Danemarca, Olanda, Japonia, Elvetia, 27 de ani pentru Australia si 25 ani in Stalele Unite (Mathew T.J., Hamilton E.B., 2009). Acest fenomen se pare ca este rezultatul influentei cumulate al unei serii de factori precum globalizarea, cerinta de personal inalt specializat corelat cu dezvoltarea sistemului educational si prelungirea perioadei studiilor, dorinta cladirii unei cariere, instabilitatea locului de munca in context economic si nesiguranta materiala (Sobotka T., 2004). Un alt factor important in aparitia acestui fenomen a fost controlul femeii asupra momentului in care va naste primul copil (Johnson J.A. et al., 2012) ca rezultat al modificarii legislatiei privind avortul la cerere (Boland R., Katzive L., 2008; Wiebe E. et al, 2012) si totodata a dezvoltarii unor metode de contraceptie sigure si accesibile. S-a evidentiat de asemenea scaderea mortalitatii gravidelor care optau pentru interventii ilegale, iar Romania este un exemplu al acestui fenomen intrucat in decembrie 1989 s-a abrogat legea din 1966 ce interzicea avortul si contraceptia (Stephenson P. et al., 1992). Aceasta libertate de decizie a femeii din ultimii douazeci de ani s-a manifestat si asupra relationarii intre cele doua sexe. Transformarile parteneriatului clasic bazat pe casatorie in relatii mai putin conventionale de coabitare si instabilitatea acestora pentru conceperea unui copil sunt factori decisivi in amanarea nasterii (Sobotka T., 2004; Wiebe E. et al, 2012).
Cumulat cu aceasta crestere a varstei femeii la nasterea primului copil, Romania este caracterizata de o rata a natalitatii in scadere si totodata de o crestere a fluxului de emigrare al populatiei tinere, raportul public din 2011 al Institutului National de Statistica punand in evidenta cresterea mediei de varsta la 39,7 ani in 2010 comparativ cu 39 de ani in 2007 (Ciuchea A. et al., 2011). Romania se incadreaza in tendinta mondiala a cresterii varstei materne la primul copil ceea ce conduce la necesitatea adoptarii unor noi stategii de cresterea a natalitatii corelate in acelasi timp cu modalitati de preventie a complicatiilor sarcinilor asociate cu varsta inaintata a mamei.
Femeile care doresc un copil dupa varsta de 30 – 35 de ani sunt supuse unor riscuri multiple precum sarcina ectopica, oprirea sarcinii in evolutie, anomalii cromozomiale, anomalii congenitale, placenta praevia, diabet gestational, preeclampsie sau nastere inainte de termen (Cleary-Goldman J. et al., 2005; Best Start: Ontario’s Maternal, Newborn and Early Child Development Resource Centre et al., 2007). Se considera ca aproximativ 20% dintre gravide au peste 35 de ani, iar 50% dintre aceste sarcini prezina trisomie 21 (Nicolaides K.H., 2011). Acest fenomen induce o presiune in dezvoltarea medicinii reproductive prin necesitatea implementarii unor metode de screening si diagnostic prenatal din ce in ce mai complexe, corelata totodata cu cresterea cererii in domeniul reproducerii asistate (Johnson J.A. et al., 2012).
Desi anomaliile cromozomiale sunt in general incompatibile cu supravietuirea si mai mult de jumatate dintre avorturile spontane timpurii sunt de cauza genetica, anual, aproximativ 2-3% dintre nou-nascuti sunt diagnosticati cu malformatii congenitale, acest procent crescand catre 3-4% pana la varsta de 1 an (Bui T.H., 2006; Shahar S.B. et al, 2006). Considerand faptul ca aproximativ 30% dintre cazuri sunt de cauza genetica (Bui T.H., 2006), diagnosticul prenatal poate fii privit ca “o prevenire” a bolilor genetice intrucat in prezent este singura masura profilactica in privinta anomaliilor genetice.
In ultimii 15 ani diagnosticul prenatal a cunoscut o dezvoltare intensa, urmand o strategie de dezvoltare bazata pe criterii precum minimizarea riscurilor, certitudine si rapiditate (Bianchi D.W. et al., 2002; Hann S., Holzgreve W., 2006). Urmand aceste criterii, evolutia diagnosticului prenatal a devenit tot mai dinamica si in ultimii 10 ani diagnosticul prenatal rapid a cunoscut o popularizare generala, iar perspectiva caracterului neinvaziv a fost sustinuta prin studii complexe efectuate in centre de cercetare si diagnostic prenatal in Asia, Europa si Statele Unite, fiind in prezent alternativa la diagnosticului prenatal clasic, invaziv (Chiu R. et al., 2008; Fann H.C. et al., 2008, 2010, 2011; Palomaki E.G, et al., 2011, 2012; Chen E.Z. et al., 2011; Jiang F. et al., 2012; Sparks B. et al. 2012; Liao J.W.G. et al., 2012; Zimerman B. et al., 2012).
2. Strategii în diagnosticul prenatal
Frecventa ridicata a anomaliilor genetice in populatia umana aduce in prim plan diagnosticul prenatal ca unica metoda profilactica. Studii internationale au evidentiat faptul ca cele mai frecvente anomalii cromozomiale sunt reprezentate de cele numerice, in special trisomiile autozomilor 13, 18, 21 si aneuploidiile heterozomilor (Cuckle H.S., Arbuzova S., 2006). Aneuploidia cu frecventa cea mai ridicata in populatia umana este trisomia 21 sau sindromul Down (Dierssen M. et al., 2009) prezinta o incidenta in populatia generala de 1/700 de nou-nascuti vii si o prevalenta globala de 1,42 la 1000 de nou-nascuti (Severin E. et al., 2002; Gorduza V. et al, 2011).
Indicatiile diagnosticului prenatal sunt specifice sarcinilor cu risc pentru anomalii genetice. Selectia cuplurilor cu recomandare pentru diagnosticul prenatal se face luand in considerare urmatoarele aspecte: examinarea ecografica cu depistarea malformatiilor si a markerilor sugestivi pentru aneuploidii fetale, screening biochimic pozitiv in primul si in al doilea trimestru de sarcina si nu in ultimul rand antecedente familiale pozitive pentru boli genetice (Drugan A., Evans M.I., 2006; Popovici C. et al, 2011).
Ecografia fetala este cea mai folosita metoda de diagnostic prenatal, utilizata inca din anii 70’. Informatiile obstetricale furnizate sunt corelate cu varsta sarcinii, insa, conditioanate de rezolutia aparatului (Popovici C. et al, 2011). Aceasta metoda de rutina permite insa detectia in intervalul 18-20 saptamani de sarcina a majoritatii anomaliilor anatomice fetale, in special a defectelor de tub neural (Gurewitsch E.D., Chervenak F.A., 2006; Evans M.I. et al., 2006). Evaluarile ecografice au evidentiat doi markeri ecografici cu valoare de diagnostic in aproximativ 70-75% din cazurile cu trisomie 21, si anume translucenta nucala ingrosata si absenta osului nazal (Nicolaides K.H., 2004). Examinarea ecografica impreuna cu analizele de screening biochimic matern corelate cu varsta materna ofera o imagine predictiva asupra starii de sanatate fetale (Nicolaides K.H., 2011). Asocierea intre sarcinile cu anomalii genetice, in special aneuploidii, si modificarile in concentratia sangvina a produsilor feto-placentari precum free β-hCG (subunitatea beta a gonadotrofinei corionice), PAPP-A (proteina plasmatica A asociată sarcinii), AFP (alfa-fetoproteina), uE3 (estriolul neconjugat) si inhibina A, a condus la dezvoltarea metodelor de screening biochimic matern in primul si al doilea trimestru de sarcina (Evans M.I. et al., 2006; Nicolaides K.H., 2011).
Figura 1. Prezentarea schematica a tehnicilor utilizate in diagnostic prenatal
Aceste metode de screening prenatal, corelate cu markeri ecografici precum dimensiunea translucentei nucale in primul trimestru de sarcina, prin utilizarea unor programe de calcul statistic, au capacitatea de detectie a unei sarcini cu trisomie 21 cu o rata de 85-95% si o rata de 5% de fals-pozitivitate (Nicolaides K.H., 2011). Aceasta strategie de diagnostic prezinta avantajul oferit de caracterul neinvaziv al metodelor, insa prezinta o rata destul de inalta de emitere a rezultatelor fals-pozitive. Ulterior obtinerii unui rezultat cu risc pentru anomalii cromozomiale, gravidele sunt consiliate pentru efectuarea testelor invazive de diagnostic prenatal.
3. Metodologia diagnosticului prenatal invaziv
Testele de diagnostic prenatal implica analiza materialului biologic fetal obtinut prin proceduri invazive de recoltare: biopsie de vilozitati coriale, amniocenteza sau cordocenteza.
Biopsia de vilozitati coriale (CVS – chorionic villus sampling) se efectueaza in intervalul 10 – 12 saptamani de gestatie pe cale transvaginala sau transabdominala. Vilozitatile coriale sunt structuri de origine embrionara ce deriva din trofoblast (Nanu D., et al., 2008) si sunt analizate in vederea diagnosticului de prim trimestru de sarcina.
Amniocenteza este procedura de recoltare a lichidul amniotic si se efectueaza in trimestrul II de sarcina, incepand cu saptamana 15 de sarcina. Se poate efectua si mai devreme in evolutia sarcinii, intre 11 si 14 saptamani, insa riscul de afectare fetala este mai mare, iar cantitatea de celule amniotice este relativ mica pentru diagnostic (Wilson R.D., 2006). Luand in considerare aspectele prezentate anterior, pentru diagnosticul prenatal timpuriu se recomanda biopsia de vilozitati coriale.
Cordocenteza este procedura de recoltare a sangelui fetal. Procedura se recomanda dupa 20 de saptamani de sarcina, desi se poate efectua incepand din a douasprezecea saptamana de sarcina, insa riscul de oprire a sarcinii din evolutie este mai mare de 5% (Weiner C.P., 2006). Recomandarea cordocentezei este legata in special de confirmarea mozaicismelor cromozomiale restrictionate la tesuturile extraembrionare sau confirmarea infectiei fetale intrauterine cu diversi agenti patogeni precum Toxoplasma gondii (Henderson K.G. et al., 1996; Kalousek D.K.,Vekemans M., 1996; Weiner C.P., 2006).
Alegerea uneia dintre procedurile de recoltare si cantitatea de produs biologic fetal necesara, se face in functie de indicatiile de diagnostic pentru efectuarea unor teste genetice specifice cu capacitate de detectie a anomaliilor suspectate si bineinteles corelat cu varsta sarcinii.
Analizele genetice de diagnostic disponibile in prezent utilizeaza thenici de citogenetica clasica, citogenetica moleculara si de diagnostic molecular.
Cariotipul fetal, analiza standard a diagnosticului prenatal, are capacitatea de a detecta anomaliile numerice si structurale ale intregului complement cromozomial precum deletii, insertii, duplicatii, inversii si translocatii, prin tehnici de bandare Giemsa, cu o rezolutie 4-5Mb (Mann K. et al., 2001, 2004; Hulten A.M. et al., 2003; Nicolini U. et al, 2004; Donnenfeld A.E., Lamb A.N., 2006). Cariotipul efectueaza prin analiza celulelor cu origine fetala, si anume celule trofoblastice, amniocite si limfocite sangvine. Procedura de lucru include cultivarea in vitro a celulelor fetale in medii de cultura speciale pentru un numar variat de zile in functie de tipul celular testat: 11-14 zile pentru amniocite si vilozitati coriale si 72 de ore pentru limfocitele fetale. De asemenea, pentru vilozitatile coriale se poate efectua analiza directa fara cultivare in prealabil. Etapa de cultivare celulara este critica in obtinerea unui rezultat concludent. Se recomanda mentinerea unor conditii de maxima sterilitate in procesare, incubare si utilizarea unor medii speciale de cultura ce limiteaza riscul dezvoltarii infectiilor bacteriane si/sau fungice (Wenzel F., 1999).
Tehnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) utilizeaza sonde oligonucleotidice marcate fluorescent pentru detectia anomaliilor cromozomiale din celule fetale in interfaza sau metafaza. Sistemul de marcare FISH s-a dezvoltat foarte mult in ultimii ani prin crearea unor noi sonde utilizate in diagnostic precum: CEP FISH, LSI FISH (single locus), WCP (whole chromosome painting), SKY (spectral karyotyping), M-FISH (multicolor FISH), PRINS (primed in situ labeling), MicroFISH (FISH following microdissection), CGH (Comparative Genomic Hybridization), Multi-Telomere FISH, Fiber FISH, FICTION (Combined Immunophenotyping and FISH) si altele (Fan Y.S., 2002; Gadji M. et al., 2008). Dintre tehnicile FISH descrise anterior, cea mai utilizata este FISH cu sonde centromerice (CEN) in vederea detectiei anomaliilor numerice ale cromozomilor 13, 18, 21, X si Y (Weise A., Liehr T., 2008). Sondele unice LSI FISH (single locus) reprezinta o alta categorie frecvent utilizata in diagnosticul prenatal al microdeletiilor cromozomiale ce produc diverse sindroame precum Prader-Willi si Angelman (regiunea 15q11–q13), sindromul DiGeorge (deletia 22q11), Williams (7q11.23), Miller-Dieker (deletia 17p13.3), Smith-Magenis (deletia 17p11.2) (Schwartz S., Graf M.D., 2002).
O categorie importanta a tehnicilor FISH o reprezinta metodele ce marcheaza si analizeaza intreg complementul cromozomial: WCP (whole chromosome painting), SKY (spectral karyotyping), M-FISH (multicolor FISH), PRINS (primed in situ labeling) sau CGH (Comparative Genomic Hybridization). Aceste tehnici permit detectarea simultana a cromozomilor utilizand sonde marcate distinct cu mai multi fluorocromi sau prin combinarea acestora (Daniely M., 1998; Mergenthaler-Gatfield S. et al., 2008).
CGH Array (microarray-based comparative genome hybridization) este o metoda de rezolutie inalta ce detecteaza pierderi sau aditii de ADN in genomul uman (Beheshti B. et al., 2002; Kashork C.D. et al., 2008). Aceasta tehnologie a fost utilizata in diverse domenii medicale, inclusiv in diagnosticul prenatal pentru detectia anomaliilor structurale sub limita de detectie a cariotipului clasic, interesand, mai ales, interpretarea variantelor genetice de tip CNV (Shaw-Smith C. et al., 2004; Shaffer L.G., Bui T.H., 2007; Paola E. et al., 2010; Lichtenbelt K.D. et al., 2011; Kearney H.M. et al., 2011).
Tehnica QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction -PCR cantitativ fluorescent) a fost de curand aplicata in domeniul diagnosticului prenatal pentru detectia aneuploidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X si Y (Mansfiend E., 1993; Pertl B. et al., 1994, 1996, 1999a,b; Mann K. et al, 2001, 2003; Cirigliano V. et al. 2001a,b, 2002; Hulten A.M. et al., 2003; Nicolini U et al., 2004). QF-PCR reprezinta o varianta a reactiei PCR in care amplificarea in vitro utilizeaza primeri (amorse) marcati fluorescent (Sandovici I. et al., 2011) si determina cantitativ dozajul alelic pentru fiecare marker prin electroforeza capilara (Shaffer L.G, Bui T.H., 2007; Mann K. et al., 2008). Prin aplicarea acestei metode se obtine un rezultat in maximum 5-6 ore de la primirea probei, utilizand cantitati de produs fetal mult reduse fata de tehnicile prezentate anterior (1-1,5 ml lichid amniotic, 1-3 mm vilozitate corială sau 5 µl sange fetal).
Tehnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) este o metoda citogenetica moleculara care utilizeaza aproximativ 40 – 45 de sonde monocatenare specifice si poate determina numarul de copii a acestora intr-o singura reactie PCR multiplex, utilizand un singur set de primeri (Schouten J.P. et al., 2002; Schouten J., Galjaard R.J., 2008). Prin thnica MLPA se pot detecta prenatal aneuploidiile cromozomilor 13, 18, 21, X si Y (Shaffer L.G, Bui T.H., 2007; Opstal D.V. et al., 2008), dar si deletii si duplicatii sindromice precum DiGeorge (Schouten J., Galjaard R.J., 2008).
Spectrometrie de masa MALDI-TOF (matrix-associated laser desorption / ionization time-of-flight) are capacitatea de a detecta diferente de masa de o singura nucleotida si a fost aplicata cu succes in detectiei SNP-urilor (Huang D. et al., 2008). Aceasta metoda include tehnologia PCR multiplex iPLEXTM (Sequenom), extensia primerilor utilizand procedura MassEXTEND® (Sequenom) si analiza comparativa a ariilor peak-urilor generate. Metodologia a fost aplicata cu succes in testarea probelor de origine fetala precum lichid amniotic si vilozitati coriale, oferind masuratori semicantitative despre polimorfismele cromozomiale. Extrapoland rezultatele analizei acestor SNP-uri, metoda MALDI-TOF a fost implementata cu succes in detectia prenatala a trisomiei 21 (Huang D. et al., 2006, 2008).
Diagnosticul molecular prenatal se recomanda in general pentru bolile monogenice pentru care genitorii sunt purtatori (Traeger-Synodinos J. et al., 2008). Strategia de diagnostic presupune analiza genitorilor si detectarea mutatiei specifice si apoi diagnostic prenatal tintit. Metodele de diagnostic molecular utilizate prenatal au la baza tehnologia PCR (polymerase chain reaction): Real-Time PCR, ARMS-PCR (amplification refractory mutation system) (Dragomir C. et al, 2011), PCR cu analiza ampliconilor prin ASO (allele-specific oligonucleotide hybridization, restrictie enzimatica sau electroforeza capilara si nu in ultimul rand, secventiere directa ADN (Kanavakis E. et al., 1997; Bugert P. et al., 2003; Traeger-Synodinos J. et al., 2008).
In prezent nu exista un test cu valoare absoluta in diagnosticul prenatal. Fiecare dintre metodele prezentate anterior are limite de detectie distincte legate de rezolutie, restrictionarea rezultatului la anumiti cromozomi sau segment cromozomial, iar alegerea acesteia se face in corelare cu scopul testarii.
In diagnosticul prenatal, consultul genetic este deosebit de important in evaluarea pacientilor, recomandarea testelor genetice si corelarea rezultatelor, avand ca finalitate, sfatul genetic (Covic M. et al., 2011).
4. Metodologia diagnosticului prenatal neinvaziv
Diagnosticul prenatal clasic implica analiza materialului biologic fetal obtinut prin proceduri invazive de recoltare: biopsie de vilozitati coriale, amniocenteza sau cordocenteza (Popovici C. et al., 2011). Aceste proceduri de recoltare comporta un risc de inducere a avortului in proportie de 1-5%, la care se adauga riscul aparitiei unor complicatii precum sangerari, scurgeri mici de lichid amniotic, contractii, febra, infectii bacteriene, lezarea fatului (detresa respiratorie, deformari ortopedice benigne) si nu in ultimul rand disconfort psihic al gravidei (Snijders R., Nicolaides K., 2004; Drugan A., Evans M.I., 2006; Evans M.I. et al., 2006). De asemenea procedurile invazive de recoltare a celulelor fetale nu sunt recomandate gravidelor pozitive pentru infectii virale din cauza riscului crescut de infectie fetala prin transfer transplacentar (Weber C., Kovac C., 2006; Dickinson J.E., Gonik B., 2006). Un aspect important pentru diagnosticul prenatal invaziv il reprezinta sarcina cu incompatibilitate de Rh (Evans M.I. et al., 2006). Ulterior procedurii de recoltare a produsului fetal, in cazul in care nu a avut loc aloimunizarea, se va recomanda profilaxia izoimunizarii in sistem Rh sau in cazul sarcinilor imunizate cu risc de a dezvolta boala hemolitica se va monitoriza titrul anticorpilor anti D) si evaluarea starii fetale prin ecografie Doppler (Bianchi D.W., 1995; Societatea de Obstetrica si Ginecologie din Romania, 2007).
Luand in considerare riscurile la care sunt expusi atat mama cat si fetusul prin procedurile invazive de prelevare, cercetatorii din domeniul medical si-au indreptat atentia asupra perfectionarii unei metode neinvazive de diagnostic prenatal. Detectia celulelor fetale si a acizilor nucleici fetali liber circulanti in sangele matern a reprezentat fundamentul stiintific al unei noi directii in diagnosticul prenatal – diagnostic prenatal neinvaziv (Bianchi D.W. et al., 1990, 1997; Lo Y.M., 1994, 1997).
4.1. Analiza celulelor fetale liber circulante în sângele matern
Ipoteza privind existenta unui trafic fetomaternal a fost sugerata inca din anul 1893, insa primele studii in vederea optimizarii unei metode de diagnostic prenatal neinvaziv au demarat un secol mai tarziu. In cadrul unei autopsii, patologul german Georg Schmorl semnaleaza prezenta unei celule sincitiale (trofoblast) in tesutul pulmonar al unei paciente gravide decedate in urma eclampsiei (Schmorl G., 1893; Hahn S., Holzgreve W., 2006). In 1959 Douglas si colaboratorii semnaleaza prezenta celulelor trofoblastice in sangele matern in vascularizatia uterina imediat dupa nastere (Douglas G.W.et al., 1959), insa confirmarea acestei ipoteze s-a realizat prin dectectia si sortarea limfocitelor fetale ce contin cromozom Y in circulatia materna (Walknowska J. et al., 1969; Herzenberg L.A. et al., 1979). Potentialul aplicativ in diagnostic al detectiei si analizei celulelor fetale liber circulante in sangele matern a fost intens studiat incepand cu anii ’90, concomitent, de catre mai multe echipe de cercetatori (Bianchi D.W. et al., 1990; Lo Y.M., 1994; 1995; Holzgreve W. et al, 1992; De Alba R. et al, 1999; Bischoff F.Z. et al., 2002). Avand in vedere faptul ca celulele fetale se gasesc in numar redus in sangele matern, un eritroblast raportat la 105-109 celule nucleate materne (Ganshirt-Ahlert D. et al., 1990, 1998) sau 1-2 celule fetale la 1 ml sange matern (Bianchi D.W. et al, 1998), s-au derulat studii privind identificarea, marcarea si sortarea eritroblastilor fetali. S-au utilizat tehnologii precum FACS (fluorescence activated cell sorting) si MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) de creare a unor complexe anticorpi monoclonali-particule fluorescente si respectiv magnetice in vederea analizei eritroblastilor fetali prin tehnica FISH sau single-cell PCR (Herzenberg L.A. et al., 1979; Bianchi D.W. et al., 1990; Price J.O. et al., 1991; Ganshirt-Ahlert D. et al., 1992; Bianchi D.W. et a., 1997; Oosterwijk L.C. et al., 1998). In 2002 Diana W. Bianchi et al. publica studiul NIFTY (National Institutes of Health Fetal Cell Study) care are ca scop detectia, concentrarea si analiza celulelor fetale circulante in sangele matern in vederea diagnosticului prenatal. Cu toate acestea, eforturile depuse in implementarea unei stategii eficiente de analiza a celulelor fetale au esuat intrucat s-a demonstat ca odata ajunse in circulatia materna, celulele fetale sufera modificari fiziologice care conduc la rezultate suboptime prin analizele citogenetice moleculare (Babochkina T. et al., 2005a). Un alt aspect negativ a fost reprezentat de posibiliatatea persistentei celulelor fetale in sangele matern dupa nastere pe perioade mari de timp, chiar ani (Bianchi D.W. et al., 1996).
In 1997, Dennis Lo si coloboratorii pun in evidenta prezenta ADN-ului fetal liber circulant in sangele matern, prin analiza caruia, diagnosticul prenatal neinvaziv al aneuploidiilor cromozomiale a devenit o realitate (Chiu R. et al., 2008; Fann C. et al., 2008, 2010, 2011; Palomaki E.G. et al., 2011, 2012; Chen E.Z. et al., 2011; Jiang F. et al., 2012; Sparks B. et al. 2012; Liao J.W.G. et al., 2012; Bianchi D.W. et al. 2012; Zimmerman B. et al., 2012).
4.2. Acizii nucleici fetali liber circulanți în sângele matern
In ultimii zece ani au fost elaborate tot mai multe studii de diagnostic prenatal neinvaziv prin detectia si analiza acizilor nucleici liber circulanti in sangele matern sau a celulelor fetale. Cele doua directii ale diagnosticului prenatal neinvaziv au evoluat in paralel pana in momentul in care s-au demonstrat avantajele tehnice ca material de studiu ale ADN-ului fetal liber circulant in sangele matern fata de celulele fetale circulante.
Un prim avantaj considerat a fost cantitatea materialului fetal, intrucat ADN-ul fetal eliberat in circulatia materna reprezinta aproximativ 3,4% si 6,2% din totalul ADN plasmatic matern in sarcina timpurie si respectiv in ultimul trimestru de sarcina (Lo Y.M. et al., 1998), cu o crestere semnificativa in cazuri de patologie fetala precum aneuploidii cromozomiale, preeclampsia (toxemia gravidica) sau moarte fetala intrauterina (Lo Y.M. et al., 1999; Bischoff F.Z. et al., 2002; Farina A. et al. 2002; Spencer K. et al., 2003). Persistenta materialului fetal in circulatia materna este o conditie esentiala pentru acuratetea rezultatului obtinut prin excluderea analizarii materialului fetal dintr-o sarcina anterioara. In 2005, Birch mentioneaza in studiile sale ca ADN-ul fetal este detectabil incepand cu a cincea saptamana gestationala (Birch L. et al., 2005), iar eliminarea din circulatia materna se produce intr-un interval de timp ce variaza de la cateva minute in cazul pacientelor cu sarcina fara elemente patologice (Lo Y.M. et al., 1999), pana la maximum 2 ore de la nastere pentru sarcini cu manifestari ca preeclampsia sau nasterea prematura (Lau T.W. et al., 2002). Comparativ, in cazul celulelor fetale exista studii conform carora, in functie de originea celulelor, acestea pot persista pana la 27 de ani in circulatia materna post-partum (Bianchi D.W. et al, 1996). Au fost efectuate si studii in legatura cu marimea secventelor ADN extracelular matern de origine fetala si s-a demonstrat ca acestea sunt mai mici decat cele de origine materna (Chan K.C.A. et al., 2004).
Desi analiza ADN-ului fetal liber circulant in sangele mamei reprezinta solutia pentru diagnosticul prenatal neinvaziv exista insa un aspect esential in dezvoltarea unei metodologii eficiente, si anume lipsa unui marker ADN specific fatului indeferent de sexul acestuia. Majoritatea studiilor s-au concentrat asupra detectiei si analizei secventelor ADN cu origine fetala mostenite pe linie paterna, intrucat acestea fie sunt absente, fie sunt distincte fata de genotipul matern (Bianchi D.W. , 2004). Astfel cele mai importante aplicatii in diagnosticul prenatal a abordarii neinvazive au fost determinarea sexului genetic fetal prin detectia unor secvente specifice cromozomului Y in circulatia materna (Lo Y.M. et al., 1997; Rijnders R.J. et al., 2003; Johnson K.L. et al., 2004; Zimmermann B. et al., 2005; Martinhago C.D. et al., 2006; Scheffer P.G. et al, 2010, Akolekar R. et al., 2010; Devaney S.A. et al., 2011) si genotiparea RHD la gravidele Rh negativ cu parteneri Rh pozitivi heterozigoti (Lo Y.M. et al., 1998; Faas BH et al., 1998; Zhong X.Y. et al., 2000, 2001; Hromadnikova I. et al., 2005; Legler T.J. et al., 2007; Daniels G. et al., 2007; Avent N.D., 2008; Bombard A.T. et al., 2011, Szczepura A. et al., 2011). De asemenea s-au demarat cercetari privind detectia prenatala neinvaziva a bolilor monogenice mostenite pe linie paterna. Cateva exemple de studii care au avut ca obiectiv testarea neinvaziva a unor boli specifice sunt: detectia prenatala neinvaziva a fibrozei chistice (Bustamante-Aragonés A, et al., 2008, 2012), a talasemiei (Papasavva T. et al., 2008; Li et al., 2009) sau a acondroplaziei (Li Y. et al., 2007).
In cautarea unui marker ADN universal pentru diagnosticarea noninvaziva prenatala, au fost cercetate diferentele epigenetice dintre fat si mama (Poon L.M.L. et al., 2002; Papageorgiou E.A. et al., 2011). Markerii epigenetici propusi au fost gena supresor tumoral maspin (SERPINB5) (Dokras A. et al., 2002; Chan K.C.A. et al., 2005) si promotorul genei supresor tumoral RASSF1A (Chan K.C.A. et al., 2005; Maddocks D.G. et al., 2009). Ambele gene prezinta modificari in metilarea ADN in functie de origine: in placenta gena maspin este hipometilata, iar in celulele materne este hipermetilata, iar RASSF1A este hipermetilata in placenta si hipometilata in celulele materne.
Analiza ARN fetal liber circulant in sangele matern a reprezentat o alta strategie in incercarea de a optimiza un protocol de diagnostic prenatal neinvaziv (Poon L.M. et al, 2000). Rezultatele au fost promitatoare deoarece s-a pus in evidenta stabilitatea ARN plasmatic extracelular, desi instabilitatea moleculelor ARN este documentata (Ng E.K.O. et al, 2003; Lo Y.M., 2005). In continuare, au fost derulate diverse studii ce analizeaza ARN mesager derivat din placenta, cum ar fi detectia prin PCR digital a ARNm al SNP-ului A/G rs8130833 localizat in gena PLAC4 (Lo Y.M., 2005).
In aceste studii prezentate au fost utilizate diferite metode de detectie si analiza bazate pe tehnologia PCR: end-point PCR, Real-Time PCR, RT PCR, digital PCR, imunoprecipitare ADN metilat (MeDiP) si qPCR, secventiere ADN directa, secventiere ADN paralela masiva si secventierea SNP-urilor (Single Nucleotid Polymorphysm).
Metode utilizate in diagnosticul prenatal neinvaziv al aneuploidiilor cromozomiale
Secventierea masiva paralela “shotgun” (MPSS). Aceasta metoda a fost utilizata pentru detectia prenatala a trisomiei cromozomilor 21, 18 si 13, prin secventierea directa de tip “shotgun” urmata de cartografierea cromozomiala a secventelor obtinute. In prezent, aceasta tehnologie permite secventierea masiva paralela a zeci de milioane de secvente scurte intr-o singura reactie, fara a fi nevoie de o diferentiere intre secventele de origine fetala si cele materne (Fan C. et al., 2008); masurand cantitatea relativa a haplotipurilor genitorilor in plasma materna se poate deduce modelul de transmitere la fat si implicit constitutia genomului fetal prin programe bioinformatice (Chiu R. et al., 2011; Palomaki E.G. et al., 2011, 2012; Fan C. et al., 2012).
Analiza digitala a unor regiuni selectate (DANSR – digital analysis of selected regions) prin secventierea ADN. Aceasta metoda a demonstrat o acuratete buna pentru detectia trisomiei 21 si a trisomiei 18. Se realizeaza analiza simultana intr-o singura reactie a mai multor loci polimorfici si nepolimorfici si se estimeaza raportul cantitativ intre fractia fetala si numarul cromozomilor (Sparks B. et al., 2012 a, 2012 b).
Secventiea masiva paralela a SNP-urilor precedata de o etapa de concentrare a acestora utilizand sistemul SureSelect Target Enrichment (Agilent) a fost propusa ca metoda de diagnostic prental neinvaziv a aneuploidiilor cromozomiale (Liao J.W.G. et al., 2012). Secventele ADN obtinute din plasma materna (cu origine fetala si materna) sunt comparate bioinformatic cu un genom de referinta si se va determina numarul copiilor fetale per cromozom (Liao J.W.G. et al., 2012).
Singura metoda cu specificitate si sensibilitate de 100% pentru detectia neinvaziva a trisomiei 13, 18, 21 si a aneuploidiilor cromozomilor de sex este Parental SupportTM (PS) (Zimmerman B. et al., 2012). Analiza se efectueaza in doua etape: una virtuala bioinformatica si respectiv etapa de analiza ADN. Prima etapa realizeaza alinierea virtuala a secventelor genomice ale genitorilor cu un altgoritm specific denumit Parental SupportTM (PS) (Rabinowitz M. et al., 2012); se determina probabilistic toate variante genetice care ar putea rezulta in urma imperecherii SNP-urilor genitorilor creandu-se atat genotipuri ipotetice normale cat si anormale (disomice, trisomice si monosomice). In etapa urmatoare se efectueaza analiza ADN liber circulant plasmatic prin secventiere tintita a 11000 de SNP-uri. Inaintea emiterii unui rezultat, Parental SupportTM (PS) efectueaza un test al calitatii ADN din proba, iar daca fractia fetala este mai mica de 4%, rezultatul este neconcludent si se recomanda repetarea recoltarii probei (Zimmerman B. et al., 2012).
PARTE SPECIALĂ – CAPITOLUL 1
CERCETĂRI PRIVIND POSIBILITATEA INTRODUCERII UNOR TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ ÎN DIAGNOSTICUL PRENATAL INVAZIV
Diagnosticul prenatal rapid al trisomiilor 13, 18, 21 și al aneuploidiilor cromozomilor de sex prin tehnica QF-PCR
1. MATERIALE ȘI METODE
In perioada 2007 – 2012 s-au analizat 3552 de probe biologice fetale (vilozitati coriale, lichid amniotic, sange fetal, produs de conceptie) prin tehnica QF-PCR cu scopul diagnosticarii prenatale rapide a aneuploidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X si Y. Suplimentar, pacientele au putut opta pentru detectia prenatala a mutatiilor implicate in hipoacuzia nonsindromica prelinguala, del35G in gena GJB2 si deletiile D13S1830 si D13S1854 in gena GJB6, dar si pentru detectia mutatiei delF508 din gena CFTR implicata in fibroza chistica.
Pacientele carora li s-au efectuat procedurile de diagnostic prenatal in cadrul Genetic Lab au fost informate asupra caracteristicilor metodei de diagnostic si au semnat un consimtamant aprobat de conducerea laboratorului. Recoltarea probelor s-a realizat in cadrul spitalelor si cabinetelor medicale colaboratoare, iar rezultatele au fost obtinute intr-un interval de 24 – 48 de ore de la receptia probei in laborator.
1.1. Pregătirea probelor pentru extracția ADN fetal
Recoltarea si pregatirea probelor pentru analiza rapida a aneuploidiilor celor cinci cromozomi prin QF-PCR prezinta un rol esential in obtinerea unui rezultat valid in concordanta cu prevederile ghidurilor internationale de citogenetica si genetica moleculara clinica (QF-PCR for the diagnosis of aneuploidy best practice guidelines, v2.01 din 2007 si v3.01 din 2012). Astfel, se impune o aboradare distincta in pregatirea probelor pentru extractia ADN si implicit a extractiei in functie de tipul si calitatea produsului biologic fetal de testat. Au fost analizate probe de vilozitati coriale, lichid amniotic, sange fetal si produs de conceptie in sarcinile oprite din evolutie. Pentru fiecare proba s-a completat o fisa de lucru in care s-au notat caracteristicile acesteia ce pot influenta procesul de testare: tipul probei, volumul, aspectul si prezenta contaminarii cu celule materne.
1.1.1. Vilozități coriale
Vilozitatile coriale se recolteaza prin biopsie (CVS – chorionic villus sampling), in general in intervalul 9 – 12 saptamani de sarcina (Nanu D. et al., 2008). Cantitatea de vilozitati recoltata se coreleaza cu tipul si numarul testelor de diagnostic ulterioare. In situatia testarii prenatale suplimentare pentru diverse boli genetice, se va recolta o cantitate mai mare de vilozitati pentru a furniza cantitatea de ADN recomandata de specificatiile tehnice pentru obtinerea unui rezultat. De asemenea, prin biopsia de vilozitati se pot recolta si celule din decidua materna si se recomanda indepartarea acestora pentru a evita un rezultat eronat; cand cantitatea de produs fetal este foarte mica (1 – 3mm) selectia tesutului fetal nu mai este posibila, existand riscul obtinerii de rezultate neconcludende ca urmare a contaminarii cu celule materne. Pentru a identifica un posibil rezultat eronat, pentru toate cazurile de vilozitati coriale se va recolta si analiza in paralel o proba de sange periferic matern. Analiza comparativa a profilelor ADN fetal si matern va indica un rezultat conform sau o posibila contaminare cu ADN matern. In cazul obtinerii unui rezultat evidentiat de a fi de origine materna se va recomanda repetarea procedurii de recoltare a vilozitatilor sau, mai tarziu in sarcina, a lichidului amniotic.
Procedura de lucru recomanda analiza a doua segmente distincte vilozitare pentru a putea evalua corespunzator cazurile cu anomalii cromozomiale, deoarece aproximativ 2% din cazurile de mozaicism detectate, sunt limitate la tesutul extraembrionic (Kalousek and Dill, 1983; Kalousek K.D., Vekemans M., 1996). Probele sunt transferate imediat dupa recoltare in recipiente sterile ce contin mediu special pentru pastrarea viabilitatii celulare in vederea cultivarii. Pentru analiza rapida prin QF-PCR se va efectua un procedeu de spalare cu apa deionizata sterila, apoi, prin examinarea microscopica si cu ajutorul unor ace sterile se vor indeparata: decidua materna, fragmentele atipice, cele de dimensiuni mici (~1mm) si cele atasate de decidua materna.
Figura 2. Aspect proba de vilozitati coriale recoltate in cantitate optima pentru diagnostic prenatal (11 saptamani de sarcina)
1.1.2. Lichid amniotic
Lichidul amniotic (LA) se recolteaza prin procedura denumita amniocenteza, in al doilea trimestru de sarcina. Aceasta procedura de recoltare a celulelor fetale se efectueaza cu o frecventa mai ridicata comparativ cu biopsia de vilozitati coriale, intrucat riscurile procedurale la care sunt supusi atat fatul cat si mama sunt mai reduse (Drugan A., Evans I.M., 2006). Cantitatea de lichid amniotic recomandata pentru testarea prenatala rapida prin QF-PCR este de minimum 1,5 – 2 ml LA, insa, avand in vedere ca numarul amniocitelor este corelat cu varsta sarcinii, se pot utiliza volume cuprinse intre 0,5 – 6 ml LA. Inainte de a procesa proba, se apreciaza aspectul LA (normal: galben opalescent sau contaminat cu celule sangvine: rosiatic) si se noteaza in fisa de lucru (vezi Figura 3).
Se transfera 1,5 ml lichid amniotic intr-un tub Eppendorf de 1,5 ml si se noteza numarul probei si tipul analizei. Prima etapa in procesarea probelor de LA este sedimentarea amniocitelor prin centrifugare timp de 10 min la 14000 RPM. Se arunca supernatantul, lasand 200 µl lichid amniotic peste sedimentul de celule; in cazul in care sedimentul de amniocite este mic si exista lichid amniotic suplimentar, se repeta aceasta etapa. Se evalueaza aspectul sedimentulului final de celule si se noteaza in fisa de lucru prezenta sau absenta de celule rosii sangvine sau alte modificari (vezi Figura 4).
Figura 3. Aspect probe de lichid amniotic (de jos in sus): aspect normal, contaminat intermediar cu celule sangvine si respectiv contaminat masiv
De asemenea exista si situatii in care sedimentul are un aspect maroniu sau verzui ce indica o sangerare anterioara recoltarii sau suferinta fetala (Mann K. et al., 2001).
Figura 4. Aspect sediment de amniocite fara si respectiv cu contaminare cu celule sangvine, dupa centrifugare
Contaminarea cu celule materne in sedimentul de amniocite poate prezenta grad diferit: contaminare minora, intermediara sau majora. In aceasta situatie se va opta pentru o etapa de spalare a celulelor cu apa deionizata sterila pentru indepartarea hemoglobinei cu posibil efect inhibitor asupara reactiei de amplificare. Procedura de spalare include adaugare peste sedimentul celular a 1000µl H2O deionizata sterila, vortexare 15 secunde (pana la omogenizarea sedimentului), incubare la temperatura camerei 1 minut si centrifugare la 10000 RPM, 2 minute. Procedeul se poate repeta in cazul probelor ce prezinta contaminare masiva, pana cand sedimentul devine opalescent (vezi Figura 5). Se recomanda alegerea unui numar optim de procedee de spalare pentru a nu pierde amniocite in urma transferurilor repetate.
Figura 5. Aspect sediment de amniocite dupa etapa de spalare
In paralel cu proba de lichid amniotic se va analiza si o proba de sange matern pentru a evalua gradul real de contaminare cu ADN de origine materna in profilul genetic fetal.
1.1.3. Produs de concepție în sarcinile oprite din evoluție
Analiza prin metode moleculare a produsilor de conceptie rezultati din sarcini oprite in evolutie reprezinta de multe ori singura optiune de testare. Cultivarea tesutului fetal este dificila din cauza riscului de infectie cu fungi si bacterii. Inaintea testarii prin metoda QF-PCR, probele de produs de conceptie sunt examinate pentru selectia a cel putin doua fragmente pentru extractia ADN. Tesutul selectat este spalat cu apa deionizata sterila pentru indepartarea sangelui matern. Se recomanda cautarea fragmentelor vilozitare fara cheaguri de sange care pot contamina proba fetala cu ADN matern (vezi Figura 6).
Figura 6. Aspectul unui produs de conceptie si selectia fragmentului de analizat
In paralel, se va analiza o proba de sange matern pentru a putea confirma originea profilului ADN in cazul in care rezultatul indica un fat cu sex genetic feminin. Pentru probele conservate pe perioade lungi in formol sau alta solutie fixatoare, nu s-au obtinut reazultate concludente, intrucat reactia PCR este inhibata de modificarile chimice induse de acestea in structura ADN (complexe ADN-proteine) (Shi S.R. et al., 2002).
1.1.4. Sânge fetal
Analiza sangelui fetal recoltat prin cordocenteza a fost un eveniment rar in acest studiu comparativ cu probele de lichid amniotic sau vilozitatile coriale. Cordocenteza este o procedura dificila, recomandata dupa varsta de 20 de saptamani de sarcina, in cazurile in care se impune confirmarea rezultatului biopsiei de vilozitati sau amniocentezei (Weiner C.P., 2006). Pentru analiza rapida a trisomiilor cromozomilor 13, 18, 21 si a aneuploidiilor heterozomale se analizeaza intre 25 – 200µl sange fetal recoltat in recipiente cu anticoagulant. Tipul anticoagulantului se alege in functie de specificatiile tehnice ale metodei utilizate pentru extractia ADN: EDTA, heparina, citrat, etc. In paralel se va analiza o proba de sange matern pentru a confirma recoltarea sangelui fetal in cazul in care sexul genetic fetal este feminin.
1.2. Extracția ADN
Extractia ADN genomic fetal este o etapa importanta in procedura de lucru, iar din 2007 pana in prezent au fost evaluate diverse proceduri si kit-uri comerciale cu scopul de a eficientiza protocolul de lucru. Intre etapele de extractie si cea de amplificare exista o relatie directa prin recomandarile testelor QF-PCR in legatura cu puritatea si concentratia ADN fetal. Trusele de extractie ADN utilizate in analiza QF-PCR au fost:
DNA IQ System™, Promega si modulul Tissue and Hair Extraction Kit – sistem manual;
QIAamp® ADN Mini Kit, Qiagen – sistem manual;
Extractia ADN automata cu aparatul Maxwell® 16 Research System – se utilizeaza kit-uri distincte in functie de tipul probei: Maxwell® 16 Cell LEV DNA Purification Kit, Maxwell® 16 Tissue DNA Purification Kit, Maxwell® 16 Blood DNA Purification Kit;
QuickExtract™ DNA Extraction Solution, Epicentre.
1.2.1. Extracția ADN cu kit-ul DNA IQ System™, Promega
Kit-ul DNA IQ System™ este un produs recomandat extractiei ADN din diverse probe biologice precum sange, limfocite, raclaj bucal/endocervical/uretral, diverse fluide (lichid amniotic, lichid cefalorahidian, urina, etc.) si tesuturi.
Metoda de extractie are la baza o tehnologie inovatoare denumita MagneSilTM Paramagnetic Particles. Tehnologia include particule cu un invelis pe baza de dioxid de siliciu (SiO2) care capteaza selectiv moleculele de ADN din solutie si un miez magnetic de oxid de fier (Fe3O4), activ in momentul aplicarii unui camp magnetic extern (Otto P., 2002).
Protocolul de lucru este facil in intelegere si manipulare. In functie de tipul de proba analizata vor aparea modificari in prima etapa de extractie, si anume liza celulara si nucleara (vezi Tabel 1).
Tabel 1. Prezentarea schematica a etapei de liza a membranelor celulara si nucleara in functie de tipul de produs analizat
Ulterior acestei etape, indifereant de tipul probei se va urma acelasi protocol descris in tabelul si figura de mai jos.
Tabel 2. Prezentarea schematica a etapelor extractiei ADN utilizand kit-ul DNA IQ System™, Promega.
Figura 7. Prezentarea schematica a etapelor extractiei ADN utilizand kit-ul DNA IQ System™, Promega. Imaginea este preluata de pe site-ul Promega (http://www.promega.com)
1.2.2. Extracția ADN cu kitul QIAamp® DNA Mini Kit
Kit-ul QIAamp® DNA Mini este un produs recomandat extractiei ADN din diverse probe biologice precum sange, plasma, ser, limfocite, fluide variate (urina, lichid cefalorahidian), culturi de celule, raclaj bucal/endocervical/uretral si tesuturi. Kit-ul utilizeaza coloane captusite cu o membrana de dioxid de siliciu care capteaza selectiv ADN-ul din solutie, ulterior etapei de liza a membranelor. Aceasta membrana permite trecerea proteinelor si a altor contaminati pentru reactia de amplificare. In functie de tipul de proba analizat vor aparea modificari in prima etapa de extractie, si anume liza celulara si nucleara (vezi Tabel 3).
Tabel 3. Prezentarea schematica a etapei de liza a membranelor celulara si nucleara in functie de tipul de produs analizat
Ulterior acestei etape, indiferent de tipul probei se va urma acelasi protocol descris in tabelul si figura de mai jos.
Tabel 4. Prezentarea schematica a etapelor extractiei ADN utilizand kit-ul QIAamp® DNA Mini Kit, Qiagen.
Figura 8. Prezentarea schematica a etapelor extractiei ADN utilizand kit-ul QIAamp® DNA Mini Kit, Qiagen. Imaginea este preluata de pe site-ul Qiagen (http://www.qiagen.com)
1.2.3. Extracția ADN în sistem automat utilizând aparatul Maxwell® 16 Research System
Maxwell® 16 Research System este un sistem de extractie automata a acizilor nucleici ce utilizeaza kit-uri distincte in functie de tipul probei testate: pentru lichid amniotic se utilizeaza Maxwell® 16 Cell LEV DNA Purification Kit, pentru sange fetal si matern se utilizeaza DNA IQTM Reference Sample Kit pentru Maxwell® 16, iar pentru vilozitati coriale sau produs de conceptie se utilizeaza Maxwell® 16 Tissue DNA Purification Kit (vezi Tabel 5). Acest sistem de reactie utilizeaza tehnologia MagneSilTM Paramagnetic Particles asemeni kit-ului DNA IQ System™, insa reactivii sunt plasati in cartuse individuale pentru o singura proba. Aparatul are capacitatea de a procesa 16 probe in 20 – 40 minute.
Figura 9. Aparatul Maxwell® 16 Research System – pregatirea trusei de reactie
Tabel 5. Prezentarea truselor de extractie automata Maxwell in functie de tipul de proba testata
1.2.4. Extracția ADN cu kitul QuickExtract™ DNA Extraction Solution, Epicentre
Kit-ul de extractie QuickExtract™ DNA Extraction Solution, Epicentre dezvoltat de Illumina, ofera o solutie rapida de extractie ADN, insa utilizabil doar pentru probele de lichid amniotic. De asemenea, considerand faptul ca performanta kit-ului de extractie este corelata cu cea a reactiei de amplificare, extractia pentru probe cu sediment mic de amniocite nu este recomandata in cazul utilizarii metodei QF-PCR LAB (singura metoda disponibila in laborator la momentul achizitionarii acestui produs).
QuickExtract™ DNA Extraction Solution are la baza o tehnologie ce presupune extractia directa a ADN celular (liza celulara, precipitare proteine) fara o purificare suplimentara a acestuia. Peste sedimentul de amniocite se transfera 100 – 150 µl solutie QuickExtract™ si se incubeaza timp de 6 minute la 650C si respectiv 980C.
Figura 10. Schematizarea extractiei ADN utilizand kit-ul comercial QuickExtract™ DNA Extraction Solution, Epicentre (imaginea este preluata de pe site-ul http://www.epibio.com )
1.3. Reacția de amplificare
QF-PCR este o tehnica de biologie moleculara ce are la baza reactia de polimerizare in lant (PCR – polimerase chain reaction) ce utilizeaza primeri (amorse) marcati fluorescent (Sandovici I. et al., 2011). Reactia are la baza principiul conform caruia in etapa de amplificare exponentiala timpurie, cantitatea ampliconului este direct proportionala cu secventa tinta din proba initiala, insa cu evaluarea atenta a concentratiei ADN initiala in corelare cu numarul de cicluri in reactie. Reactia QF-PCR este o reactie multiplex ce are ca tinta secvente ADN inalt polimorfice si stabile din genomul uman denumite STR (Short Tandem Repeats – secvente scurte repetate in tandem – microsateliti) (Mansfiend E., 1993; Hulten A.M. et al., 2003). Rezultatul fiecarui marker STR va fi extrapolat pentru cromozomul de origine (Mansfiend E., 1993; Pertl B. et al., 1999; Mann K. et al, 2001; Cirigliano V. et al. 2004). Fiecare marker STR heterozigot va prezenta doua alele reprezentate in electroferograma de doua peak-uri de fluorescenta caracterizate de o arie si o inaltime specifica (Profesional guidelines for clinical cytogenetics and clinical molecular genetics, 2007, 2009). Raportul ariilor/inaltimilor dintre alelele fiecarui marker STR va fi analizat conform recomandarilor internationale. Un raport alelic de aproximativ 1:1 va indica un marker disomic normal, iar prezenta a trei alele in raport de 1:1:1 sau a doua alele in raport de 2:1 sau 1:2, corespunde unui marker trisomic (Ciriglianao V. et al., 2004). Un marker STR homozigot va prezenta un singur semnal fluorescent ce nu poate fi cuantificat si va fi exclus din procedura de interpretare sub denumirea de marker neinformativ (Mann K. et al, 2008).
1.3.1. Prezentarea generală a kit-urilor PCR
Pentru realizarea acestei etape de lucru in care markerii STR selectionati au fost amplificati, am utilizat trei kit-uri distincte: The Aneufast™ QF-PCR Kit (Genomed Ltd, UK), Devyser Compact (Devyser AB, Suedia) si un kit de reactie dezvoltat si validat in cadrul laboratorului Genetic Lab bazat pe datele prezentate de o echipa de cercetare internationala formata din Kathy Mann, Erwin Petek si Barbara Pertl (Mann K. et al., 2008). Celor trei kit-uri au la baza reactia PCR cu primeri marcati fluorescent, pentru detectia unui anumit numar specific de markeri STR din structura cromozomilor 13, 18, 21, X si Y. Denumirea markerilor STR este reprezentata in general ca un cod cu informatii despre acel marker. De exemplu, denumirea codificata a markerului D21S1437 semnifica: “D” este un marker ADN, “21” este numarul cromozomului, “S” se refera la faptul ca acest marker este in copie unica (Single copy marker) si numarul “1437” reprezinta ordinea in care acest marker a fost descoperit, deci este al 1437-lea marker din cromozomul 21 (Butler J.M., 2005). Uneori, denumirea markerului coincide cu initialele genei din care face parte, precum SRY – Sex-determining region Y, SBMA – Spinal and Bulbar Muscular Atrophy sau HPRT – hypoxanthine phosphoribosyltransferase.
Pe parcursul a cinci ani de practica de laborator in domeniul diagnosticului prenatal rapid prin QF-PCR, strategia de implementare si dezvoltare a acestui test a fost sa ofere un produs inalt calitativ pacientului, cu efort si cost minim din partea laboratorului.
Urmand introducerii kit-ului de diagnostic rapid prin QF-PCR, Aneufast™ QF-PCR Kit, in laboratorul Genetic Lab au fost testate diverse variante comerciale cu acelasi specific, cu scopul de a eficientiza procedura de lucru si a reduce costurile fara a afecta calitatea si competenta. Au fost testate kit-uri precum Elucigene QST*R Kits (GenProbe, SUA), QF Complete Chromosome kit (EuroClone, Italia), Devyser Compact (Devyser AB, Suedia) si Devyser Extend (Devyser AB, Suedia). Kit-ul comercial Devyser Compact a prezentat avantaje procedurale comparativ cu kit-urile mentionate anterior, dar si cu Aneufast™ QF-PCR Kit. Ulterior acestei etape de testare, kit-ul Aneufast™ QF-PCR Kit este inlocuit cu Devyser Compact. In continuare, in scopul eficientizarii acestei analize, in anul 2010 in cadrul departamentului de biologie moleculara a fost elaborat un kit de amplificare bazat pe date publicate international (Mann K. at al., 2008). Ulterior dezvoltarii acestei truse de reactie PCR denumita intern QF-PCR LAB, a fost realizata validarea metodei si datorita avantajelor oferite (numar superior de STR-uri, corectitudine in detectie si costuri reduse), QF-PCR LAB inlocuieste kit-ul comercial Devyser Compact in practica de laborator. Analiza comparativa a celor trei truse de amplificare QF-PCR este schematizata in tabelul de mai jos (vezi Tabel 6).
Tabel 6. Comparatie intre cele trei truse de amplificare QF-PCR utilizate in studiu
La nivel tehnic, diferentele existente intre cele trei truse sunt nesemnificative intrucat se utilizeaza aceleasi aparate de amplificare si analiza de fragmente ADN. Diferentele majore ce au condus si la optarea pentru unul din ele pe parcursul celor cinci ani sunt legate de numarul de STR analizati, includerea acestora in una sau doua reactii si costurile.
Numarul markerilor STR a fost crescator, pornind de la Aneufast ce contine markeri STR si Devyser Compact cu 22, iar QF-PCR LAB cu 26 markeri STR. Recomandarea standard este de a testa un numar minim de patru markeri pentru fiecare cromozom, localizati pe toata lungimea acestuia (vezi Tabel 7). Urmarind tabelul comparativ al markerilor STR din cele trei kit-uri observam ca desi kit-ul Devyser este intermediar celorlalte doua, acesta are capacitatea de a detecta cu certitudine monosomia X prin prezenta markerului paralog 7X (vezi Tabel 8). In reactia QF-PCR LAB se adauga ulterior in scopul detectiei monosomiei X, un marker paralog TAF9L (Xq21.1/3p24.2) (Deutsch S. et al., 2004).
Un alt aspect luat in considerare, desi cu importanta mai mica, a fost numarul de reactii pentru fiecare test. Kit-ul Devyser Compact amplifica toti cei 22 de markeri STR intr-o singura reactie si implicit se utilizeaza o cantitate mai mica de ADN si se injumatatea si timpul de migrare electroforetica.
In 2010, QF-PCR LAB inlocuieste kit-ul Devyser Compact. Kit-ul QF-PCR LAB ofera avantaje importante prin numarul superior de markeri STR analizati si prin costurile reduse, fara a afecta corectitudinea testarii.
Tabel 7. Markerii STR din structura cromozomilor 13, 18 si 21 inclusi in kit-urile Aneufast™ kit (Genomed Ltd, UK), Devyser Compact (DevyserAB) si QF-PCR LAB;*versiunea 7-A006-En **versiunea 7-A018-En
Tabel 8. Markerii STR din structura cromozomilor 13, 18 si 21 inclusi in kit-urile Aneufast™ kit (Genomed Ltd, UK), Devyser Compact (DevyserAB) si QF-PCR LAB
1.3.2. Aneufast™ kit (Genomed Ltd, UK)
Kit-ul Aneufast include 17 markeri STR in doua amestecuri de reactie distincte denumite S1 si S2. In aceeasi trusa exista patru seturi suplimentare specifice fiecarui cromozom testat – M21, M18, M13 si MXY. Aceste seturi suplimentare se utilizeaza pentru a confirma un rezultat incert (vezi Tabel 9). Fiecare tub de reactiv se conserva la -20 oC, iar in momentul utilizarii se va dezgheta treptat la 4 oC. Tuburile se vortexeaza timp 15 secunde pentru omogenizarea amestecului de reactie ce contine perechile de primeri marcati fluorescent, enzima de polimerizare Hot Start, cationi si tampon de reactie.
Tabel 9. Markerii STR inclusi in seturile standard si suplimentare ale kit-ului Aneufast™
* markeri STR din seturile standard, utilizati drept control in seturile suplimentare
In tabelul de mai jos este prezentata schema de reactie a etapei de amplificare (vezi Tabel 10). Pentru o proba se vor prepara doua amestecuri distincte, specifice pentru seturile standard de reactie: S1 si S2.
Tabel 10. Schematizarea prepararii amestecului de reactie
conform manualului de utilizarea a kit-ului Aneufast™
Programul PCR
Tabel 11. Prezentarea schematica a programului PCR pentri kit-ul Aneufast™
* Se produce activarea enzimei Hot Start Taq
1.3.3. Devyser Compact
Devyser Compact este un kit comercial destinat diagnosticului pre si postnatal al anomaliilor cromozomilor 13, 18, 21, X si Y. Are capacitatea de analiza a 22 de markeri STR din structura celor cinci cromozomi, intr-un singur amestec de reactie (vezi Tabel 12). Amestecul de reactie se prepara in momentul deschiderii kit-ului prin adaugarea a 1000µl Devyser Compact mix intr-un tub intreg de PCR Activator II si se omogenizeaza prin pipetare succesiva. Acest amestec este stabil la 4ºC timp de 7 zile sau la -18ºC timp de 30 de zile. Se recomanda evitarea ciclurilor repetate de inghet/dezghet.
Tabel 12. Markerii STR inclusi in kit-ul Devyser Compact
In tabelul de mai jos este prezentata schema de reactie a etapei de amplificare.
Tabel 13. Schematizarea prepararii amestecului de reactie
conform manualului de utilizare a kit-ului Devyser Compact
Programul PCR
Tabel 14. Prezentarea schematica a programului PCR pentru kit-ul Devyser Compact
* Se produce activarea enzimei Hot Start Taq
1.3.4. Metoda QF-PCR LAB
Kit-ul de reactie QF-PCR LAB elaborat in cadrul laboratorului contine 26 seturi de primeri marcati fluorescent (Mann K. et al., 2008). Secventele oligonucleotidice ale primerilor marcati fluorescent sunt comandate de la Applied Biosystems, iar cele nemarcate de la BioBasic Inc sau Integrated DNA Technologies (IDT). Primerii sunt livrati in forma liofilizata. Pentru rehidratare se utilizeaza apa distilata sterila, iar volumul se calculeaza in functie de numarul specific de nm (nano moli) pentru fiecare primer. Numarul de nm per primer este in concordanta cu scala de sinteza; s-a utilizat o scala cuprinsa intre 25 si 80 nm. Exemplu: primer cu 25,3 nm → se adauga 253 µl apa distilata sterila in tubul cu oligonucleotide liofilizate. Amestecul se omogenizeaza si se obtine o concentratie stoc de 100µM. Din aceste stocuri se vor efectua esantioane de lucru cu concentratie de 10µM ce vor fi utilizate la obtinerea amestecului de amplificare multiplex conform celor doua tabele de mai jos. Cei 26 markeri STR sunt impartiti in doua seturi distincte: reactia A (LAB A) cuprinde 16 markeri STR din structura autozomilor analizati (13, 18, 21), iar reactia B (LAB B) contine 10 STR-uri specifice heterozomilor.
Tabel 15. Prezentarea secventelor primerilor utilizati in reactia QF-PCR LAB B
(dupa Mann K. et al., 2008)
Tabel 16. Prezentarea secventelor primerilor utilizati in reactia QF-PCR LAB A
(dupa Mann K. et al., 2008)
Pentru reactia de amplificare multiplex se utilizeaza kit-ul comercial QIAGEN Multiplex PCR (Qiagen), ce contine o enzima de polimerizare HotStart Taq, nucleotide, cationi si tampon de reactie. In tabelul de mai jos este prezentata schema de reactie a etapei de amplificare.
Tabel 17. Schematizarea prepararii amestecului de reactie pentru metoda QF-PCR LAB
Programul PCR
Tabel 18. Prezentarea schematica a programului PCR pentri kit-ul QF-PCR LAB
* Se produce activarea enzimei Hot Start Taq
1.4. Electroforeza capilară
Rezultatul reactiei de amplificare multiplex a markerilor STR inclusi in cele trei kit-uri prezentate anterior este un cumul de secvente ADN de marimi diferite ce au incorporat 4 fluorocromi – 6FAM™, VIC®, NED™ si PET®. Separarea, vizualiazarea si identificarea produsilor de amplificare (ampliconi) se realizeaza prin electroforeza capilara utilizand analizorul genetic ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (vezi Figura 11).
Metoda prezinta o specificitate de detectie de o baza pana la marimea de 250 pb (deviatie standard 0,15) si cu doua baze in intervalul de marime 250 – 350 pb (deviatie standard 0,3).
Figura 11. Aspect analizor genetic ABI PRISM 310
Analizorul prezinta un capilar cu lungimea de 47 cm si diametru intern de 50μm ce contine o solutie vascoasa denumita polimer (POP-4™ – Performance Optimized Polymers) ce actioneaza ca agent de separare de inalta rezolutie; capetele capilarului sunt imersate alaturi de doi electrozi, intr-o solutie 1X Genetic Analyzer Buffer with EDTA, realizandu-se astfel un circuit prin care se va forma un camp electric. Injectia probei se produce electrokinetic, iar separarea ampliconilor se va realiza datorita incarcaturii electrice negative (anioni) a moleculeleor ADN ce vor migra spre anod (+). Ampliconii vor migra in capilar si cand ajung in dreptul ferestrei capilarului plasata in fata ferestrei laserului, acesta din urma (laserul) excita fluorocromii ampliconilor, acestia emit fluorescenta de diferite lungimi de unda ce va fi transmisa camerei de citire (CCD – Charge-Coupled Device), de un sistem de lentile.
Camera de citire colecteaza emisiile de fluorescenta in diferite arii de citire denumite filtre virtuale, specifice fiecarui set de fluorocromi. De asemenea, pentru fiecare set de fluorocromi se va realiza o calibrare spectrala ce va corecta automat suprapunerile spectrale. Pentru analiza QF-PCR s-a utilizat filtrul G in corelare cu kit-ul de calibrare Matrix Standard Set DS-33 pentru fluorocromii 6FAM™ (albastru/blue), VIC® (vedere/green), NED™ (galben/yellow), PET® (red/rosu) si LIZ® (portocaliu/orange) de la Applied Biosystems.
Probele sunt migrate in paralel cu un marker de marime, GeneScan™ -500 LIZ® Size Standard (vezi Figura )
Figura 12. Aspect electroferograma pentru markerul de marime GeneScan™ -500 LIZ®
Markerul GeneScan™ -500 LIZ® contine 16 fragmente monocatenare marcate fluorescent (LIZ®) cuprinse intre 35 si 500 pb: 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490 si 500. In corelare cu citirea acestui marker de marime se va determina marimea alelelor amplificate. Inaintea electroforezei, probele se pregatesc astfel: in 20µl din amestecul de migrare pregatit anterior (200µl agent denaturant HI-DI™ formamide + 0,7µl marker GeneScan™ 500LIZ™) se adauga 3µl amplicon (volumul se poate ajusta in functie de concetratia probei: 1 – 5µl) si se transfera in placa pentru probe a aparatului.
Pentru analiza de fragmente se fac urmatoarele setari in programul 310 Data Collection Software Version 3.1.0. Se creaza o foaie de lucru (GeneScan Smpl Sheet 96 tube) corespunzatoare detectiei a cinci culori, se introduc notatiile probelor in pozitia corespunzatoare placii de probe si se salveaza. Ulterior, se creaza o lista de injectie (GeneScan Injection List) care va avea la baza o metoda de lucru (“GS STR POP4 (1ml) G5.md5”) cu parametrii specifici:
Timp de injectie: 5sec (1 – 10sec) – se poate modifica in functie de concetratia probei;
Voltajul injectiei: 15kV (5-15kV) – se poate modifica in functie de concetratia probei;
Voltajul migrarii: 15 kV;
Temperatura de migrare: 60 oC ;
Timpul de migrare: 28 min.
2. REZULTATE
2.1. Evaluarea electroferogramelor
Analiza electroferogramelor obtinute in etapa anterioara, electroforeza capilara automata, se realizeaza cu diferite programe precum GeneMapper ID v.3.2. Se importa rezultatele brute furnizate de analizorul genetic si se selecteaza urmatorii parametrii: metoda de interpretare, seturile predefinite de markeri STR inclusi in test, markerul de marime si calibrarea spectrala.
Figura 13. Aspect electroferograma ce prezinta datele brute obtinute pentru o reactie QF-PCR si markerul de marime GeneScan™ -500 LIZ®
Ulterior acestei procesari, pentru fiecare electroferograma, se vor afisa imagini ale semnalelor fluorescente pentru fiecare canal: albastru (6FAM™), verde (VIC®), galben (NED™), rosu (PET®) si portocaliu (LIZ®). In cazul in care o proba prezinta semnale prea puternice rezultate dintr-o concentratie prea mare de ADN in reactie, se va repeta migrarea electroforetica cu scaderea timpului de injectie sau a curentului. Ulterior obtinerii electroferogramei, se analizeaza atent fiecare semnal fluorescent si se selecteaza peak-urile corespunzatoare fiecarui marker STR, eliminand semnalele artefactelor de tehnica.
2.1.1. Evaluarea peak-urilor de fluorescență asociate cu alelele unui marker STR
Evaluarea peack-urilor de fluorecenta corespunzatoare fiecarui marker se face in concordanta cu recomandarile ghidurilor ACC CMGH (Association for Clinical Cytogenetics and Clinical Molecular Genetics Society) pentru QF-PCR (QF-PCR for the diagnosis of aneuplidy best practice guidelines, v2.01 din 2007 si v3.01 din 2012) si de asemenea respestand instructiunile oferite de producatorii autorizati de kit-uri comerciale. Peak-urile de fluorescenta sunt expresia alelelor unui marker STR. Prin echivalenta intre numarul peak-urilor si cel al alelelor unui marker, se stabileste statusul normal sau anormal al probei. (vezi Figura 14).
Figura 14. Prezentarea electroferogramei celor patru aspecte ale markerilor STR: A. dialelic normal, B. neinformativ (homozigot sau monosomic), C. trialelic trisomic, D. dialelic trisomic
Un peak adevarat este deosebit de artefactele de tehnica prin aspectul lui ascutit la varf, cu baza usor lata si inaltime superioara limitei de 150-200 RFU (unitati relative de fluorescenta). Peak-urile sunt caracterizate de o anumita arie, inaltime si marime in perechi de baze. Un marker poate prezenta un aspect heterozigot sau homozigot.
Pentru evaluarea statusului unui marker heterozigot cu doua peak-uri se aplica un model de calcul international prin care se calculeaza raportul ariilor sau/si inaltimii celor doua peak-uri; se imparte aria/inaltimea alelei mai mici la cea a alelei mai mari. Valoarea acestui raport este interpretata conform unei grile de marimi pentru identificarea numarului real de alele pentru un anumit marker testat (vezi Tabel 19).
Tabel 19. Intervalele de referinta ale raportului alelic in interpretarea unui rezultat QF-PCR
Markerii heterozigoti trialelici sunt specifici cazurilor cu trisomie. Markerii homozigoti nu sunt considerati informativi intrucat alelele identice produc semnale fluorescente ce se suprapun si nu se poate determina numarul real al acestora.
Peak-urile de fluorescenta specifice alelelor cu modificari produse de artefacte de tehnica vor fi analizate cu atentie si se va decide asupra excluderii acestora din interpretarea finala ca in cazul suprapunerii spike-urilor sau a dye-blobs-urilor.
Pentru fiecare cromozom inclus in test se analizeaza un numar minim de patru markeri STR pentru a asigura existenta a cel putin doi markeri heterozigoti informativi, aspect esential in emiterea unui rezultat. In cazul in care exista un singur marker informativ se poate emite un rezultat doar cand raportul alelic este normal, insa este recomandat sa se confirme rezultatul printr-o analiza suplimentara; pentru un raport anormal se impune efectuarea unei analize suplimentare.
In situatia in care pentru un anumit cromozom se detecteaza exclusiv markeri homozigoti, se impune efectuarea unei analize suplimentare precum FISH sau cariotip. Ocazional, intr-un profil QF-PCR se pot evidentia atat markeri normali cat si anormali; rezultatul trebuie urmarit cu atentie deoarece poate reprezenta un caz cu semnificatie clinica sau poate fi un polimorfism genetic.
2.1.2. Evaluarea artefactelor de tehnică
In urma analizei STR-urilor pot apare o serie de artefacte rezultate din reactia de amplificare, dar si din electroforeza. Aceste artefacte pot interfera in procesul de interpretare al alelelor si de aceea se recomanda identificarea si excluderea acestora inaintea procesului de interpretare a rezultatelor.
2.1.2.1. Evaluarea artefactelor rezultate în urma reacției de amplificare
2.1.2.1.1. Benzile stutter sunt recunoscute ca artefacte in analiza STR-urilor rezultate din “alunecarea” inainte sau inapoi a Taq polimerazei in procesul de amplificare si apar ca peak-uri cu arie si inaltime redusa cu o unitate repetitiva mai mica decat alela adevarata (Butler J.M., 2005) (vezi Figura 15).
Figura 15. Aspect al electroferogramei indicand doi markeri STR cu raport alelic normal:
A. marker ce prezinta benzi “stutter”, B. marker fara benzi “stutter”
Proportia ariei benzii stutter comparativ cu alela reala variaza, insa nu depaseste in general 15% din aria acesteia din urma. Pentru reducerea acestui tip de artefact se recomanda evitarea includerii in teste a STR-urilor cu motiv repetitiv de 2 nucleotide, preferandu-se markerii cu motiv repetitiv de 3-6 perechi de nucleotide (Buttler J.M., 2005). Benzile stutter pot fi incluse in calculul raportului alelic, cu exceptia situatiei cand cele doua alele difera intre ele cu mai putin de o repetare in perechi de baze. In situatia in care un marker este dinucleotidic, iar alelele difera intre ele cu mai mult de 2 pb, benzile stutter pot fi incluse in calcul. In cazul in care cele doua alele difera intre ele cu mai putin de 2pb, atunci banda stutter a alelei mai mari va fi incorporata in aria alelei mai mici, iar calculul nu se mai poate efectua.
Benzile stutter pot reprezenta un factor de incertitudine in interpretarea profilelor ce contin un mix alelic ca in cazul probelor contaminate cu celule materne.
2.1.2.1.2. Amplificarea preferentială a alelei mai mici (perechi de baze), este un fenomen intalnit in situtia in care cele doua alele ale unui marker difera intre ele cu mai mult de 20-25 de perechi de baze (vezi Figura 16). In aceasta situatie raportul alelic poate varia foarte mult, insa in cazul obtinerii unui raport mai mare de 1,55, analiza acelui marker se va interpreta ca neconcludenta pentru diagnostic.
Figura 16. Aspect comparativ intre profilul a trei markeri normali care difera intre ei prin distanta interalelica
O intensitate mai mare a acestui fenomen se observa la probele cu concentratie mare de ADN, iar ca recomandare de lucru, fie se repeta amplificarea cu o cantitate mai mica de ADN, fie se reduce numarul ciclurilor de amplificare (PROFESSIONAL GUIDELINES FOR CLINICAL CYTOGENETICS PRENATAL DIAGNOSIS BEST PRACTICE GUIDELINES, v1.00, 2009)
2.1.2.1.3. Polimorfismul situsului de legare al primerului și alelele nule. Acest fenomen este rezultatulul diferentei de secventa intre primer si regiunea complementara din genomul uman care va conduce la o hibridizare defectuoasa sau absenta in reactia de amplificare (Buttler J.M., 2005). Rezultatul apare fie ca lipsa amplificarii unei alele, fenomen denumit “alela nula” sau apare ca amplificare partiala a unei alele. In prima situatie, intr-un caz cu trisomie, acel marker va avea doua alele in raport normal, iar in a doua situatie se obtine un raport trisomic dialelic sau neconcludent.
Figura 17. Aspect al electroferogramei indicand un marker STR cu raport alelic anormal la temperatura de atasare a primerilor de 58 ºC (sus) si aspect normal la 53ºC (jos)
Ambele situatii pun probleme importante in interpretare, iar recomandarea imediata este repetarea reactiei de amplificare cu o temperatura de atasare a primerilor mai mica cu 4-5ºC pentru a reduce stringenta de atasare a primerului la situsul polimorfic (Mann K. et al., 2008) si a diferentia intre acest artefact si o duplicatie microsatelitara. De asemenea, markerul ce prezinta acest fenomen se va exclude din interpretarea finala.
2.1.2.1.4. Extensie finală incompletă. In reactia de amplificare, Taq polimeraza adauga in etapa de elongare finala o adenina suplimentara la capatul 3’ al secventei. Acest fenomen se mai numeste si adenilare sau “+A”, iar in cazul reactiei QF-PCR este favorizat de elongatia finala extinsa, de 20-30 minute la 60-72ºC. In prezenta unei concentratii ridicate de ADN in proba se produce aditia incompleta de adenina care face ca alelele sa apara taiate in doua peak-uri ce difera printr-o singura baza (vezi Figura 18).
Figura 18. Aspect al electroferogramei indicand un marker STR cu raport alelic normal si prezenta “-A/+A”
In interpretarea finala acest artefact poate fi depasit prin insumarea ariilor celor doua peak-uri corespunzatoare unei alele si includerea in raportul alelic.
2.1.2.2. Evaluarea artefactelor rezultate din migrarea electroforetică
2.1.2.2.1. Spike-urile electroforetice sunt peak-uri false, cu un aspect de ascutit si ingust ce apar in toate canalele de fluorescenta si sunt rezultatul bulelor de aer, a cristalelor de uree, prafului sau modificarilor de voltaj. Acest artefact de migrare nu interfera in general cu interpretarea rezultatelor si poate fi inlaturat usor prin reinjectarea probelor.
Figura 19. Aspect al electroferogramei indicand “spike-uri” de curent prin cele patru canale alaturi de peak-uri alelice
2.1.2.2.2. Arterfactele “bleeds through” sau “pulled-up” sunt rezultatul unei calibrari spectrale de calitate scazuta ce conduce la incapacitatea de detectie corespunzatoare a semnalelor fluorescente. Suprapunerea spectrala duce la aparitia de peak-uri ce trec prin doua sau mai multe canale de fluorescenta. Aceste peak-uri se exclud in interpretarea unui rezultat, insa recomandarea principala este de a se reface calibrarea spectrala si de a repetarea analizei electroforetice.
Figura 20. Aspect al electroferogramei indicand “bleeds through”: A. artefact ce nu afecteaza interpretarea, B. Artefact “bleeds through” incorporat in aria unui peak al unui marker trisomic ce nu poate fi inclus in interpretare
2.1.2.2.3. Artefactele “dye blobs” sau “free-dye peaks” sunt rezultatul desprinderii si migrarii independente a moleculelor fluorescente de la nivelul primerilor. Apar ca peak-uri mici si largi la baza, specifice unui canal de fuorescenta si se elimina din interpretarea finala. Aparitia acestor artefacte poate fi minimizata prin utilizarea la prepararea ampliconilor de formamida deionizata pastrata la -20 ºC si de asemenea prin reducerea etapelor succesive de dezghet – inghet (recomandat la -20 ºC) al amestecul de reactie. Aceste mici semnale de fluorescenta se exclud in interpretarea finala, iar in cazul in care sunt incorporate in semnalul specfic unui marker, acesta din urma va fi exclus.
Figura 21. Aspect al electroferogramei indicand “free-dye peaks” (marcat cu sageata) si modul in care poate altera aspectul peak-urilor alelice: A. aspect peak alterat, B. aspect peak nealterat
2.2. Interpretarea și formularea rezultatelor
2.2.1. Contaminarea cu celule materne
Contaminarea cu celule materne a produsului fetal, ca rezultat al procedurii de recoltare, este un aspect sensibil al diagnosticului prenatal intrucat in situatii precum amniocenteza in placenta praevia sau placenta acreta/precreta nu poate fi evitata. De asemenea, la probele de vilozitati coriale se impune o separare inaintea procesarii intre tesutul cu origine embrionara si decidua materna recoltate simultan. Cum am mentionat si in capitolul anterior, etapa de recoltare si apoi cea de pregatire a produsului fetal sunt esentiale in obtinerea unui rezultat concludent. Aproximativ o treime din probele de lichid amniotic testate au prezentat diferite nivele de contaminare cu sange matern detectate macroscopic, observate inainte sau dupa sedimentarea amniocitelor. Din totalul probelor de vilozitati coriale si produsi de conceptie, pentru sapte probe s-a confirmat prezenta exclusiv a profilului ADN matern. 15 probe de lichid amniotic au prezentat o contaminare mai mare de 50% ceea ce a condus la emiterea unui rezultat neconcludent ce recomanda retestarea dintr-o alta proba sau efectuarea unei analize suplimentare ce poate depasi acest impediment, precum cariotipul fetal. In toate cazurile s-a putut identifica cu acuratete sexul fetal.
4,75% dintre profilele QF-PCR au evidentiat diferite grade de contaminare a profilului fetal cu ADN matern; toti markerii STR specifici celor cinci cromozomi testati vor prezenta fie o alela suplimentara, fie o modificare a raportului alelic in intervalele de neconcludenta sau anormalitate. Pentru a putea face distinctia intre alelele celor doua genotipuri suprapuse, indiferent de sexul genetic al fatului, se analizeaza o proba de sange matern si se realizeaza o analiza comparativa a celor doua profile: profilul fetal contaminat si cel matern. In cazul fetusilor masculini se poate stabili profilul dominant prin analiza markerului nepolimorfic amelogenina (AMXY, AMEL) care evidentiaza raportul ariilor/inaltimilor markerului AMXY (nepolimorfic) intre secventele specifice cromozomilor X si Y (vezi Figura 22).
Figura 22. Aspect electroferograma fetus de sex masculin indicand raportul alelic pentru markerul AMEL: A. aspect anormal fara contaminare cu ADN matern; B, C, D. aspect anormal ce indica diverse grade de contaminare cu ADN matern
In cazul probelor puternic contaminate (30-40%) se realizeaza un calcul alelic de tip A+B=C conform ghidului Societatii de genetica mleculara clinica CMGS pentru QF-PCR, unde A este alela fetal mostenita de la tata, B este alela mamei si C este alela mostenita de la mama (vezi Figura 23). In cazul in care din calculul alelic se obtin rezultate neconcludente, atunci rezultatul final nu poate fi eliberat.
In trei cazuri de vilozitati coriale a existat o neconcordanta intre rezultatul QF-PCR si cariotip intrucat in procesul de cultivare a tesutului fetal este documentata posibilitatea ca tesutul de origine materna sa se dezvolte in defavoarea celui de origine fetala conducand la un rezultat eronat, inclusiv la determinarea incorecta a sexului genetic fetal (Winsor E.J. et al., 1996; Waters J.J. et al., 2007).
Figura 23. Aspect compartiv profil matern/profil fetal contaminat si prezentarea modelului de selectie a alelelor: A. alela fetala mostenita de la tata, B. alela materna contaminanta, C. alela fetala mostenita de la mama
Pentru 22 de cazuri nu s-a putut obtine un rezultat concludent prin metoda QF-PCR din cauza contaminarii masive cu sange matern si implicit prezinta unui profil genetic matern dominant.
2.2.2. Rezultate normale
Din totalul de 3552 probe analizate, 93,1% (n=3307) au prezentat rezultat normal, disomic, pentru cei cinci cromozomi analizati.
Pentru fiecare autozom testat s-a detectat un numar minim de doi markeri heterozigoti cu raport alelic de aproximativ 1:1. Pentru testarea heterozomilor se utilizeaza markeri polimorfici (pseudoautozomali, specifici cromozomului X si respectiv Y) si nepolimorfici.
Figura 24. Aspect al electroferogramei reprezentand profilul markerilor specifici cromozomilor de sex: A. fetus de sex masculin; B. fetus de sex feminin
In emiterea unui rezultat normal pentru un fat de sex feminin, markerii specifici cromozomului Y – SRY, DYS448 si AMEL Y (Yp11.2) sunt absenti, iar pentru cromozomul X se aplica regula generala de minimum doi markeri (specifici X sau pseudoautozomali) heterozigoti normali. Pentru un fat de sex masculin se impune un raport normal 1:1 pentru markerul nepolimorfic AMEL si prezenta SRY si a lui DYS448, (acesta din urma doar cand se include in analiza); markerii specifici cromozomului X sunt in copie unica si vor prezenta profil neinformativ (peak unic), iar markerul peseudoautozomal, atunci cand este heterozigot, va prezenta un raport normal de 1:1. (vezi figura de mai sus).
Pentru sase cazuri s-a identificat un singur marker heterozigot normal si s-a emis un rezultat, insa cu recomandarea confirmarii printr-o analiza complementara (FISH sau cariotip fetal) pentru a exclude existenta polimorfismelor situsului de legare a primerului si aparitia alelelor nule. Exterm de rar, s-a detectat un profil homozigot neinformativ pentru toti markerii inclusi in test pentru un anumit cromozom. In acesta situatie se impune efectuarea unei analize suplimentare pentru eliminarea suspiciunii de monosomie. O astfel de situatie a fost detectata pentru 3 cazuri legate de cromozomul 21 si un caz pentru cromozomul 18, insa rezultatul cariotipului a evidentiat un rezultat normal.
2.2.3. Rezultatele anormale
Din totalul de 3552 de cazuri analizate, 6,89% (n=245) au prezentat un rezultat anormal ce include trisomia 21, trisomia 18, trisomia 13, trisomia XXX, trisomia XXY, trisomia XYY, monosomia X, triploidie, mozaicisme cromozomiale si nu in ultimul rand modificari ale unui singur marker (polimorfisme submicroscopice si mutatiile microsatelitare somatice) (vezi Figura 25). Pentru emiterea rezultatului s-a aplicat metoda de interpretare descrisa anterior, avand minim doi markeri informativi ce indica acelasi diagnostic.
Figura 25. Reprezentarea grafica procentuala a cazurilor distincte cu rezultat anormal raportat la numarul total de cazuri anormale detectate ( n=245)
2.2.3.1. Polimorfismele submicroscopice
Polimorfismele submicroscopice reprezinta variante ale numarului de copii (deletii, duplicatii), inversii si translocatii cu marimea cuprinsa intre o kilobaza (103 nucleotide) si cateva megabaze (106 nucleotide), detectate exclusiv prin tehnici de genetica/citogenetica moleculara (Popovici C. et al., 2011). Aceste polimorfisme, in special variatiile numarului de copii (CNV – copy number variants) au fost intes dezbatute din punct de vedere clinic odata cu dezvoltarea testarii prin hibridizare genomica comparativa cu microretele (Microarray-based comparative genomic hybridization / array CGH) (Kearney H.M. et al., 2011) intruct detectia acestora trebuie asociata cu un raspuns favorabil sau nu.
Metoda QF-PCR are capacitatea de a detecta variatiile numarului de copii (CNV) ale markerilor STR. Aceste CNV pot fi duplicatii sau deletii si apar ca markeri unici cu raport anormal intr-un profil QF-PCR normal (disomic). Desi variatiile numarului de copii sunt considerate sursa principala de variatie genetica printre indivizii umani (Popovici C. et al., 2011), iar duplicatiile intracromozomiale pot incadra puncte fierbinti mutationale (Sharp A.J. et al., 2005), detectia unui marker unic anormal pentru un anumit cromozom ridica urmatoarea problema: are sau nu relevanta clinica?. Conform ghidului ACMG (American College of Medical Genetics) de interpretare si raportare postnatala a CNV-urilor, trebuie sa se specifice clar daca un CNV este normal sau anormal si daca este reprezentat de o duplicatie sau deletie (Kearney H.M. et al., 2011).
Figura 26. Aspectul markerului dialelic trisomic D13S631 cu evidentierea modelului de transmitere a alelei duplicate de la mama la fat: (A) fat si (B) mama
In diagnosticul prenatal rapid prin QF-PCR, detectia unui singur marker anormal poate indica o anomalie cromozomiala detectabila citogenetic sau un polimorfism submicroscopic, iar includerea acestora in rezultatul final trebuie sa fie bine documentata (Mann K. et al., 2008).
Intr-o prima etapa, pentru cazurile ce prezinta un singur marker cu rezultat dialelic trisomic sau neconcludent, se impune diferentierea de artefactul de tehnica discutat anterior, si anume polimorfismul situsului de legare a primerului. Localizarea marker-ului in structura cromozomului respectiv este analizata, intrucat conform ghidurilor ACC CMGH un marker cu rezultat anormal flancat de markeri normali este putin probabil sa nu reprezinte un CNV. De asemenea, este documentat faptul ca anumiti markeri inclusi in testul QF-PCR pot prezenta CNV-uri.
Recomandarea principala este de a testa genitorii si in majoritatea cazurilor se demonstreaza transmiterea familiala si se clasifica drept CNV fara semnificatie clinica. In cazul in care analiza parintilor indica aparitia “de novo” la fat a acestei duplicatii submicroscopice, atunci se recomanda efectuarea cariotipului fetal, pentru a elimina suspiciunea existentei unei anomalii cromozomiale neechilibrate (Mann K. et al, 2008).
Din totalul probelor analizate 15 au prezentat un marker unic cu raport anormal, restul incadrandu-se in intervalul de disomie. Markerii ce au prezentat acest patern au fost identificati pentru toti cei cinci cromozomi testati.
Un caz aparte este reprezentat in imaginea de mai jos pentru singurul marker anormal D21D1446 al cromozmului 21 ce prezinta un raport alelic de aproximativ 3:1. Prin analiza probelor parintilor s-a putut stabili ca alela de 221pb cu deletie a fost transmisa fatului de la mama (vezi Figura 27). Rezultatul final este considerat normal intrucat ceilalti markeri specifici cromozomului 21 au prezentat raport alelic de 1:1.
Figura 27. Aspectul electroferogramei ce prezinta un caz familial de transmitere a mutatiei markerului D21S1446: A. mama – marker anormal, B. fat – marker anormal, C. tata – marker normal
2.2.3.2. Mutatiile microsateliatare somatice
Mutatiile microsateliatare somatice (SMM-Somatic Microsatellite Mutation) sau mozaicismele alelice au fost identificate in celule somatice normale, desi fenomenul de instabilitate microsatelitara a fost semnalat in celule canceroase sau celulele cultivate in vitro (Mann K. et al., 2003). Conform ghidului ACC CMGH pentru QF-PCR, un marker STR considerat SMM prezinta un aspect trialelic inegal (vezi Figura 28): suma ariilor alelelor cu inaltime mai mica (alelele rezultate din procesul mutational) este egala cu aria alelei mai inalte.
Figura 28. Markerul D21S1435 tetranucleotidic cu aspect SMM rezultat prin contractie alelica
Figura 29. Markerul D13S305 tetranucleotidic cu aspect SMM rezultat prin expansiune alelica
Aspectul trialelic este prezent doar pentru un singur marker din cei 4-5 testati pentru un anumit coromozom, ceilalti avand un raport alelic incadrat in intervalul de normalitate. Aparitia de novo a alelei suplimentare este pusa pe seama erorilor de replicare ADN si a mecanismelor de corectie, ca expansiune sau contractie alelica de marimea uneia sau a mai multor unitati repetitive specifice STR-ului respectiv (Mann K. et al., 2003). Se recomanda analiza genitorilor si compararea profilelor markerului cu SMM la fat. In cele doua imagini de mai jos sunt reprezentate doua cazuri de SMM in regiunea 13q21.32 si respectiv D21S435 ca rezultat al expansiunii alelice cu o unitate repetitiva de 4pb.
Figura 30. Aspect comparativ mama (a), fat (b), tata (c): A. markerul 13B (13q21.32) cu expansiunea alelei de 399pb la fat; B. markerul D21S435 cu expansiunea alelei de 183pb la fat
In lotul de pacienti analizati am identificat 32 cazuri de SMM. Dintre cazurile cu SMM detectate, 19 s-au identificat in probe de CVS, iar 13 in probe de LA. Numarul SMM mai mare in probele de vilozitati coriale se explica prin frecventa ridicata a erorilor de replicare ADN in dezvoltarea embrionara si citotrofoblastica timpurie (Mann K. et al., 2003). Markerii unici ce prezinta aceasta forma de instabilitate genetica sunt considerati fara relevanta clinica, iar interpretarea rezultatelor se realizeaza pe baza celorlalti markeri (Cirigliano V. et al., 2009).
2.2.3.3. Anomaliile cromozomului 21
Din lotul de 3552 pacienti, 111 au prezentat anomalii cromozomiale legate de cromozomul 21: 108 cazuri cu trisomie 21 si 3 cazuri cu mozaicism de cromozom 21.
Tabel 20 . Prezentarea rezultatelor anormale pentru cromozomul 21
Trisomia 21 reprezinta anomalia genetica cu ponderea cea mai mare din totalul probelor detectate cu rezultat anormal, ceea ce este in concordanta cu statistica internationala conform careia trisomia 21 ce produce sindromul Down are o incidenta in populatia generala de 1/700 de nou-nascuti vii (Severin E. et al., 2002).
Markerii STR analizati din structura cromozomului 21 sunt repartizati in regiunea critica pentru sindromul Down (DSCR – Down syndrome critical region) 21q21–21q22.3, iar rezultatele QF-PCR ce au indicat trisomia 21 evidentiaza atat markeri trialelici cat si dialelici trisomici specifici originii meiotice sau mitotice a nondisjunctiei cromozomiale (Antonarakis R. et al., 1992; Covic M. et al., 2011) (vezi Figura 32).
Figura 31. Reprezentarea schematica a markerilor STR analizati pentru cromzomul 21; ideograma cromozomului 21 (preluare de pe site-ul NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps)
Figura 32. Aspectul electroferogramei ce prezinta un caz de trisomie 21 cu markeri trialelici trisomici
2.2.3.4. Anomaliile cromozomului 18
Trisomia 18 (sindromul Edwards) are o incidenta de 1/5000-1/8000 de nou-nascuti vii si produce sindromul Edwards (Severin E. et al., 2002). Incidenta trisomiei 18 este insa mult mai mare dar aproximativ 95% dintre embrionii cu aceasta anomalie genetica sunt eliminati spontan pe parcursul sarcinii (Covic M. et al., 2011). Pentru cromozomul 18 s-au analizat 12 secvente STR distincte separate in reactii de cate 5-6 markeri in functie de kit-ul de reactie utilizat (vezi figura 33).
Figura 33. Reprezentarea schematica a markerilor STR analizati pentru cromozomul 18; ideograma cromozomului 18 (preluare de pe site-ul NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps)
In lotul de 3552 de pacienti, trisomia 18 a fost identificata in 31 de cazuri, dintre care 2 cazuri au prezentat mozaicism (vezi Tabel 21).
Tabel 21. Prezentarea rezultatelor anormale pentru cromozomul 18
Rezultatele QF-PCR ce indica trisomia 18 au evidentiat atat markeri trialelici cat si dialelici trisomici specifici originii miotice sau mitotice (vezi Figura 34).
Figura 34. Aspectul electroferogramei ce prezinta un caz de trisomie 18 cu markeri trialelici trisomici si dialelici trisomici
2.2.3.5. Anomaliile cromozomului 13
Trisomia 13, responsabila de aparitia sindromului Patau, are o incidenta de aproximativ 1/10000-1/20000 de nou-nascuti vii, desi, asemeni trisomiei 18, incidenta este mult mai mare la conceptie dar se corecteaza prin eliminarea spontana a fetusilor pe parcursul sarcinii (Covic M. et al., 2011). Din totalul de 3552 de cazuri analizate au fost identificate 11 cazuri de trisomie 13 (vezi Tabel 22).
Tabel 22. Prezentarea rezultatelor anormale pentru cromozomul 18
Rezultatele QF-PCR ce indica trisomia 13 au evidentiat atat markeri trialelici cat si dialelici trisomici specifici originii mitotice au meiotice (vezi Figura 35).
Figura 35. Reprezentarea schematica a markerilor STR analizati pentru cromozomul 13 si alaturi ideograma cromozomului 13 (preluare de pe site-ul NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps)
Figura 36. Aspectul electroferogramei ce prezinta un caz de trisomie 13 cu markeri trialelici trisomici si dialelici trisomici
2.2.3.6. Anomaliile cromozomilor de sex
Din totalul probelor analizate, 21 au prezentat anomalii heterozomale: trisomia cromozomilor de sex (XXX, XXY, XYY), monosomie X sau mozaicisme. Incidenta aneuploidiilor cromozomilor de sex (1/400-500 de nou-nascuti vii) este considerabil mai ridicata comparativ cu cele autozomale din cauza fenotipului mai putin sever (Nussbaum RL et al, 2002). Pentru analiza heterozomilor se utilizeaza urmatoarele categorii de markeri: nepolimorfici, polimorfici pseudoautozomali, polimorfici specifici X si respectiv Y, nepolimorfici paralogi. Markerii nepolimorfici inclusi in testarea prenatala rapida prin QF-PCR sunt AMXY sau AMEL si SRY. AMXY/AMEL este un marker inclus in gena amelogenina responsabila de sinteza unei proteine din smaltul dintilor. Aceasta gena este localizata atat in structura cromozomului X (Xp22.1-22.31) cat si in cromozomul Y (Yp11.2); primerii specifici acestui marker amplifica o secventa a intronului 1 care prezinta o deletie de 6 pb in cromozomul X (Buttler J.M., 2005). Rezultatul va indica raportul dintre cei doi heterozomi, prin produsii de amplificare cu marimi diferite de 103-106 pb pentru cromozomul X si de 109-112 pb pentru Y. Exista si situatii rare in care markerul AMXY/AMEL va fi exclus din analiza; astfel se poate identifica un rezultat AMXY/AMEL anormal produs de mutatia situsului de legare a primerilor sau lipsa ampliconului specific Y ca rezultat al deletiei genei (Kao L.G. et al., 2007; Cirigliano V. et al, 2009). In situatiile descrise anterior este important sa corelam rezultatele celorlati markeri specifici heterozomilor.
Figura 37. Variante ale aspectului markerului AMXY/AMEL ca rezultat al mutatiei situsului de legare a primerilor
SRY este un marker specific cromozomului Y (Yp11.2-11.31), in copie unica, iar detectia acestuia va indica prezenta sau absenta cromozomului Y. Pentru cazurile cu monosomie X se recomanda analiza prezentei SRY intrucat se estimeaza ca aproximativ 12% dintre cazuri sunt Y-pozitive sub limita de detectie a miscroscopiei (Bianco B. et al., 2008). Markerii polimorfici pseudoautozomali sunt localizati in regiunile omoloage ale heterozomilor: PAR1 si PAR2 (Xq21.3/Yp11.31 si Xp28/Yq). Aceasta categorie de markeri sunt importanti in identificarea raportului numeric intre cromozomii de sex, insa fara a clarifica originea ampliconilor.
O alta categorie este reprezentata de markerii polimorfici specifici fiecarui cromozom de sex. Acesti markeri furnizeaza informatii despre raportul numeric intre cromozomii X (Xp22.3, Xq11.2-12, Xq12-12.33, Xq13.1, Xq21.33, Xq26.1, Xq26.2, Xq28) si respectiv prezenta sau absenta cromozomului Y prin markerul DYS448 (Yq11.223). Pentru markerul DYS448 au fost semnalate si modificari precum un aspect dialelic ca rezultat al unei duplicatii submicroscopice sau absenta unui semsemnalului ca rezultat al mutatiei situsului de legare al primerilor. Absenta markerului DYS448 a fost semnalata pentru 2 cazuri: primul caz este discutat in sectiunea mozaicisme cromozomiale si prezinta un rezultat al cariotipului 45,X/46,XY,del(Y), iar cel de-al doilea caz a fost asociat cu o mutatie a situsului de legare al primerului.
Markerii nepolimorfici paralogi sunt localizati in secvente cu structura similara si localizare distincta in genomul uman, ce au aparut ca urmare a unui eveniment de duplicatie (Bina M., 2006). Markerii paralogi utilizati au fost 7X (Xq13/7q34), TAF9L (Xq21.1/3p24.2) si T2 (Xq23/2p23.2). Acestia raporteaza numarul copiilor cromozomului X la cel al autozomilor 7, 3, respectiv 2, in functie de markerul selectat, si sunt esentiali in diagnosticul monosomiei X intrucat exista probabilitatea ca toti markerii polimorfici specifici X si pseudoautozomali sa fie homozigoti, deci neinformativi.
Din totalul de 245 de cazuri anormale detectate in lotul de pacienti studiati, 24 de probe au prezentat anomalii ale cromozomilor de sex, inclusiv 5 cazuri de mozaicism care vor fi discutate ulterior.
Tabel 23. Prezentarea rezultatelor anormale ce implica cromozomii de sex
Trisomiile cromozomilor de sex precum trisomia XXY responsabila de aparitia sindromului Klinefelter, trisomia XYY si trisomia X sau sindromul triplo X au fost identificate prenatal in noua cazuri.
Monosomia X sau sindromul Turner a fost identificata in sapte cazuri. Pana la introducerea in testarea QF-PCR a markerilor paralogi, nu s-a putut pune diagnosticul cu certitudine de monosomie X intrucat exista posibilitatea ca toti markerii specifici cromozomului X sa prezinte homozigotie. Toate rezultatele cu suspiciune de monosomie X au fost confirmate prin analize suplimentare precum cariotipul fetal sau FISH, cu o singura exceptie cand desi toti markerii specifici cromozomului X erau homozigoti/neniformativi, cariotipul a indicat un rezultat normal 46,XX.
Prin includererea markerilor paralogi in analiza QF-PCR a fost posibila detectarea cu certitudine a monosomiei X. Primul marker paralog testat a fost 7X (Xq13/7q34) din kit-ul comercial Devyser Compact, marker ce raporteaza numarul copiilor cromozomului X la cel al copiilor cromozomului 7 (vezi Figura 38).
Figura 38. Aspectul electroferogramei ce reprezinta markerul 7X:
A. fetus de sex femin, B. fetus de sex masculin sau fetus cu monosomie X
In momentul in care s-a trecut de la utilizarea kit-ului Devyser Compact la metoda QF-PCR LAB a fost necesara introducerea unui marker similar lui 7X pentru elucidarea cazurilor cu suspiciune de monosomie X. Analiza markerului nepolimorfic paralog TAF9L (Xq21.1/3p24.2) a rezolvat aceasta problema prin capacitatea de a raporta prin extrapolare a numarului de copii ale cromozomului X la numarul de copii ale cromozomului 3 (Deutsch S. et al., 2004) (vezi Figura 39).
Figura 39. Aspectul electroferogramei ce reprezinta markerul TAF9L: fetus de sex femin (sus) si fetus de sex masculin sau cu monosomie X (jos)
Reactia de amplificarea a markerului TAF9L a fost elaborata pe baza publicarii secventelor de primeri de catre Deutsch et al.: F 6-FAM-TGCCTAATGTTTTGTGATT si R-GACCCAAAACTACCTGTC (Deutsch S. et al., 2004). Cele doua secvente paraloge amplificate din structura cromozomilor X si respectiv 3 nu sunt polimorfice si difera intre ele prin 2pb. Astfel, prin analiza electroferogramei markerului TAF9L se pot evidentia profile normale disomice atat pentru cromozomii de sex cat si pentru cromozomul 3, dar si aneuploidii precum momosomie X, trisomie XXX sau XXY si bineinteles trisomie sau monosomie 3 (vezi Tabel 24).
Tabel 24. Sumarizarea rezultatelor raportului alelic obtinute la analiza markerilor paralogi 7X, TAF9L si T2
Markerul paralog T2 (Xq23/2p23.2) inclus in kit-ul Devyser Extent ce testeaza aneuplidiile cromozomilor 13, 15, 16, 18, 21, 22, X si Y a fost utilizat in procedura de evaluare a performantei kit-ului pentru cazuri normale si pentru cazuri cu suspiciune de triploidie.
Figura 40. Aspectul markerul T2 (Xq23/2p23.2) intr-un caz de monosomie X
2.2.3.7. Mozaicismele cromozomiale
Mozaicismul cromozomial este caracterizat prin prezenta a doua sau mai multe linii celulare diferite cromozomial la un individ (Severin E. et al., 2002).
Metoda QF-PCR aplicata in domeniul diagnosticului prenatal are capacitatea de a detecta mozaicismele cromozomilor 13, 18, 21, X si Y cu o limita de detectie de minimum 15% a liniei celulare suplimentare raportata la cea stabila in prezenta markerilor trisomici trialelici si de 20% cand sunt prezenti markeri trisomici dialelici (Donaghue C. et al., 2005).
In emiterea unui rezultat cu mozaicism cromozomial se recomanda o deosebita atentie intrucat, de cele mai multe ori, este dificil sa determinam prin tehnica semicantitativa QF-PCR, tipul si raportul dintre liniile celulare prezente, iar rezultatul poate fi similar unuia normal (Cirigliano V. et al., 2009). Recomandarea generala este ca in cazurile cu suspiciune de mozaicism sa se efectueze suplimentar cariotipul fetal. Evaluarea mozaicismelor detectate prenatal din vilozitati coriale sau lichid amniotic impune efectuarea cariotipului din sange fetal pentru confirmare, intrucat aproximativ 2% din sarcinile viabile manifesta mozaicism limitat la placenta (Henderson G.K. et al., 1996; Popovici C. et al., 2011). S-a remarcat faptul ca in aproximativ 50% din cazuri mozaicismul nu se confirma, anomalia cromozomiala avand origine extraembrionara (Drugan A., 2006) sau se poate manifesta fenomenul de “embrio rescue” cu aparitia disomiei uniparentale (Diego-Alvarez D. et al., 2005; Evans I.M., 2006). In cazul vilozitatilor coriale frecventa mozaicismelor cromozomiale este mai mare comparativ cu analiza lichidului amniotic, insa studii recente au evidentiat ca aproximativ 90% dintre acestea sunt mozaicisme limitate la placenta (Drugan A., 2006). Explicatia este oferita de structura celulara a vilozitatilor coriale: o masa celulara interna centrala mezenchimala vascularizata si un invelis trofoblastic constituit dintr-un strat intern citotrofoblastic si dintr-un strat extern sincitiotrofoblastic multinucleat (Evans I.M., 2006). Stratul citotrofoblastic are o rata de diviziune foarte mare si de cele mai multe ori poate prezenta anomalii ce nu se regasesc la nivelul mezenchimului. Insa chiar si anomaliile mezenchimale necesita confirmare prin analiza suplimentara a lichidului amniotic sau a sangelui fetal (Donnenfeld A.E. et al., 2006). In practica de laborator s-au identificat doua cazuri de mozaicism limitat la tesutul extraembrionar, mozaicism ce a disparut in dezvoltarea fatului. Primul caz este un mozaicism al cromozomului 21 detectat in lichid amniotic atat prin QF-PCR cat si prin cariotip, care insa nu s-a mentinut in sangele fetal (analiza sangelui fetal prelevat prin cordocenteza). Cel de-al doilea caz (vilozitati coriale) a evidentiat citogenetic un mozaicism 46,XY/47,XY,+17 (rezultatul QF-PCR a fost normal), care la o analiza ulterioara citogenetica, cariotipul a prezentat un rezultat normal si a confirmat limitarea mozaicismului la placenta.
Din totalul probelor analizate s-au identificat 12 cazuri de mozaicism: trei cazuri pentru cromozomul 21, doua cazuri pentru cromozomul 18, cinci cazuri pentru heterozomi si doua cazuri in care au fost implicati cromozomii 13, 18, 21 si X. Aspectul markerilor specifici cromozomilor in mozaic se prezinta atat ca markeri normali cu raport alelic de 1:1, cat si anormali: trialelici trisomici, trialelici inegali, dialelici trisomici sau dialelici cu raport anormal (vezi Figura 41).
Figura 41. Aspect QF-PCR mozaic cromozom 18 confirmat prin cariotip (46,XX/47,XX+18) si FISH (XX normal; mozaicism cromozom 18: 80% – normal, 20% – trisomie)
S-au recoltat si analizat probe de sange matern pentru fiecare caz in vederea excluderii posibilei contaminari cu ADN matern.
In vederea evaluarii capacitatii de detectie a anomaliilor cromozomilor de sex si implicit a mozaicismelor, s-au testat prin metoda QF-PCR doua probe de sange periferic provenite de la paciente cu suspiciune de sindrom Turner. Pentru acest caz s-a realizat in paralel si analiza cromozomilor (cariotip) din sange. Pentru primul caz rezultatul QF-PCR a indicat X, SRY+, AMEL anormal, iar cariotipul un rezultat 45,X/47,XYY. Cel de-al doilea caz a prezentat un rezultat X, DYS448+ la QF-PCR si 46,X+marker/45,X la cariotip. Pe baza rezultatelor celor doua teste s-a putut observa ca in cazul mozaicismelor cromozomilor de sex detectate prin metoda semicantitativa QF-PCR, profilele markerilor STR analizati au prezentat o diversitate mare, iar interpretarea acestora, desi a condus catre suspiciunea prezentei mozaicismului, nu a permis emiterea unui rezultat de diagnostic. Cele cinci cazuri de mozaicism ale cromozomilor de sex detectate prenatal au fost atent evaluate si s-a recomandat confirmarea rezultatului prin analize suplimentare.
Primul caz de mozaicism este prezentat in imaginea de mai jos.
Figura 42. Electroferograma QF-PCR reprezentand markeri specifici cromozomilor de sex cu aspect anormal
Analiza QF-PCR din lichid amniotic a pus in evidenta rapoarte anormale pentru toti markerii specifici cromozomului X si pentru markerul pseudoautozomal DXYS267 (Xq21.31/Yp11.31). Nu s-au identificat semnale pozitive pentru markerii specifici cromozomului Y. Pentru acest caz a fost disponibil cariotipul fetal al carui rezultat a pus in evidenta doua linii celulare distincte 45,X/47,XXX.
Cel de-al doilea caz a prezentat doi markeri neinformativi, unul specific cromozomului X si unul pseudoautozomal, doi markeri specifici cromozomului X cu raport dialelic anormal, iar markerii specifici cromozomului Y au fost negativi. In acest caz a fost disponibila analiza markerului paralog 7X care a prezentat un raport de aproximativ 2:1, rezultat concludent pentru prezenta unui singur cromozom X.
Figura 43. Electroferograma QF-PCR reprezentand markeri specifici cromozomului X cu aspect anormal si markerul paralog 7X ce confirma monosomia X
Proba de lichid amniotic a fost analizata si prin tehnica FISH care a evidentiat un rezultat 45,X. Acest rezultat nu exclude mozaicismul cromozomial X, intrucat markerii analizati prin QF-PCR sunt localizati pe toata lungimea cromozomului X comparativ cu sonda unica utilizata in tehnica FISH.
Al treilea caz identificat ca mozaicism al cromozomilor de sex a prezentat un raport al markerului AMEL de 3:1 intre cromozomii X si Y, sase markeri specifici X neinformativi, un marker pseudoautozomal in raport normal de 1:1 si doi markeri specifici Y cu rezultat pozitiv (vezi Figura 44).
Figura 44. Aspectul electroferogramei QF-PCR pentru un caz cu mozaicism al cromozomilor de sex: markerul AMEL prezinta un raport anormal
Cel de-al patrulea caz a pus in evidenta urmatorul profil QF-PCR: cinci markeri dialelici cu raport anormal dintre care trei specifici X si doi pseudoautozomali (Xp22.32/Yp11.3 and Xp28/Yq). Markerii specifici Y au fost absenti. In acest caz a fost diponibil rezultatul FISH interfazic din lichid amniotic care a confirmat mozaicismul cromozomial: 46, XX/47,XXX (12% / 88%).
Cel de-al cincilea caz a prezentat un rezultat al cariotipului cu doua linii celulare distincte 45,X/46,XY,del(Y). Rezultatul QF-PCR a evidentiat un aspect normal XY pentru cei sase markeri specifici X, AMEL si SRY. Markerul pseudoautozomal DXYS267 a prezenta un raport anormal de 0.61, iar semnalul fluorescent pentru markerul DYS448 (Yq11.223) nu a fost prezent (vezi Figura 45).
Figura 45. Aspectul electroferogramei QF-PCR pentru un caz de mozaicism 45,X/46,XY,del(Y); markerul AMEL cu raport normal 1:1, markerul pseudoautozomal DXYS267 raport alelic anormal (0,61) si markerul DYS448 este absent
2.2.3.8. Triploidia
Triploidia rezulta, in general, din fecundarea unui ovul haploid de catre doi spermatozoizi haploizi, insa in marea majoritate a cazurilor, produsul de conceptie se opreste din evolutie in primul sau al doilea trimestru de sarcina (Drugan A., 2006).
Din cele 245 de cazuri anormale detectate prin metoda QF-PCR, aproximativ 9% (n=22) au prezentat triploidie. Rezultatul final s-a emis pe baza detectiei aspectului trisomic pentru toti cei cinci cromozomi analizati: trisomie 13, 18, 21 si trisomie XXX sau XXY. Ulterior implementarii analizei cromozomilor 15, 16 si 22, s-au testat probe cu triplodie din baza de probe Genetic Lab si rezultatul a fost confirmat: trisomie 15, 16 si 22.
2.3. Avorturile spontane și anomaliile cromozomiale
Etiologia avorturilor spontane este complexa, iar evaluarea acestora recomanda investigatii genetice, anatomice, imunologice, endocrine si de natura infectioasa (Dubey S. at al., 2005). Se estimeaza ca aproximativ 15% (10-20%) din sarcinile declarate se opresc din evolutie in primul trimestru de sarcina (Bruyère H. et al., 2002; Diego-Alvarez D. et al., 2005; Michaels H.S. et al, 2006; Drugan A., 2006; Brent R.L. et al, 2006; Shahar S.B. et al, 2006). Suplimentar, se considera ca 10-20% dintre sarcini se soldeaza cu avort spontan inainte de a fi confirmate (pre sau postimplantatie), iar cumulate cu cele confirmate conduc catre un procent considerabil de pierdere a produsilor de conceptie in populatia umana (Mattison R.D., 2006).
Mai mult de jumatate din totalul sarcinilor oprite in evolutie sunt de cauza genetica, iar aproximativ 90% dintre acestea prezinta aneuploidii (Diego-Alvarez D. et al., 2005; Drugan A., 2006; Brent R.L. et al, 2006; Shahar S.B. et al, 2006).
Trisomiile autozomale reprezinta aproximativ 3% dintre toate sarcinile si sunt responsabile de 25% dintre avorturile spontane. Dintre acestea, cele mai frecvente sunt trisomiile 13, 14, 15, 16, 18, 21 si 22 (Rubio C. et al., 2003; Vorsanova G.S. et al., 2005; Zou G. et al., 2008); in cazul in care fetusii afectati se nasc vii, acestia prezinta malformatii severe, retard de crestere si mental, decesul survenind la scurt timp. Cele mai frecvente trisomii autozomale detectate in avorturile de prim trimestru sunt trisomia 16 (15% din totalul acestora), trisomia 22 si trisomia 15 (Wolsteholme J., 1995; Sepulveda W, et al., 2003).
Monosomiile cromozomiale sunt embriologic letale, singura exceptie fiind monosomia X. Se estimeaza ca 95 -99% dintre produsii de conceptie cu monosomie X sunt eliminati, reprezentand 18% din toate cazurile de avort spontan in primul trimestru (Rubio C. et al., 2003, Shahar S.B. et al, 2006).
Poliploidia reprezinta 20% din totalul anomaliilor cromozomiale cele mai frecvente fiind triploidia (7% – 16% dintre avorturile spontane recunoscute clinic) si tetraploidia (2% – 5% dintre avorturile spontane) (Drugan A., 2006 ; Shahar S.B. et al., 2006).
In lotul de 3552 probe analizate in intervalul 2007-2012, au fost incluse 119 probe de tesut fetal provenite din sarcini oprite in evolutie. Pentru evaluarea profilului ADN fetal obtinut s-a analizat suplimentar o proba de sange matern. 85 de probe au prezentat un rezultat normal pentru cromozomii 13, 18, 21, X si Y. Pentru 25 probe s-a detectat un rezultat anormal: triploidie (n=10), trisomie 18 (n=4), trisomie 21 (n=2), trisomie 13 (n=2), trisomie partiala X (n=1), monosomie X (n=2) si sarcina molara (n=4). Pentru trei dintre probele de produs de conceptie cu suspiciune de sarcina molara s-a detectat un aspect de mozaicism pentru toti cei cinci cromozomi testati si rezultatul QF-PCR a sustinut diagnosticul de mola partiala – rezultatul fecundarii unui ovul haploid de catre doi spermatozoizi haploizi (RCOG Green-top Guideline, 2010). Al patrulea caz de sarcina molara a evidentiat un profil monosomic de origine exclusiv paterna si concludent pentru diagnosticul de mola completa – rezultatul fecundarii unui ovul anucleat de catre un spermatozoid haploid (RCOG Green-top Guideline, 2010) (vezi Figura 46).
Din cei 119 produsi de conceptie, pentru 8 probe s-a detectat profil genetic exclusiv matern, iar pentru o proba conservata in formol nu s-a obtinut un rezultat. Esecul de amplificare QF-PCR in cazul produsului de conceptie formolizat este rezultatul inhibitiei reactiei din cauza modificarilor chimice in structura ADN si a proteinelor (Shi S.R. et al., 2002). Prin comparatia intre profilul ADN al produsului de conceptie si cel matern s-a exclus disomia uniparentala pentru cei cinci cromozomi.
Avand in vedere ca aneuploidiile si poliploidiile cromozomiale sunt cauza principala a avorturilor spontane, rezultatele noastre recomanda o strategie noua in analiza produsilor de conceptie opriti in evolutie prin includerea in testarea rapida QF-PCR a unor cromozomi suplimentari precum 15, 16 si 22, cromozomi asociati frecvent cu oprirea sarcinilor in evolutie (Diego-Alvarez D. et al., 2005).
Figura 46. Aspectul comparativ al profilului QF-PCR mama/fat/tata intr-un caz de mola completa: A. Mama, B. Fatul – profil monosomic cu origine paterna, C. tatal
2.4. Analiza cromozmomilor 15, 16 și 22 prin metoda QF-PCR
S-a utilizat kit-ul comercial Devyser Extend care analizeaza 40 de markeri STR din structura cromozomilor 13, 15, 16, 18, 21, 22, X si Y inclusi in trei amestecuri de reactie: Devyser Extent I, Devyser Extent II si Devyser Extend III. Kit-ul include doi markeri paralogi ce analizeaza si cromozomii 2 si 7: T2 (Xq23/2p23.2) si 7X (7q34/Xq13).
Tabel 25. Markerii STR din structura cromozomilor 15, 16 si 22 analizati cu kit-ul Devyser Extend
Figura 47. Aspectul electroferogramei ce prezinta un caz de triploidie analizat cu markerii STR specifici cromozomilor 15, 16 si 22; rezultat cu markeri trisomici trialelici si dialelici
Pentru analiza produsilor de amplificare s-a utilizat filtrul D in corelare cu kit-ul de calibrare compus din Fluorescent Amidite Matrix Standards pentru fluorocromii 6FAM™, TET, HEX, TAMRA™, ROX™ si NED™ Matrix Standard de la Applied Biosystems; markerul de marime utilizat este GeneScan™-500 ROX Size Standard. Pentru evaluarea acestui kit s-au utilizat probe cu rezultat normal si probe cu rezultat de triploidie. Probele utilizate au fost testate anterior prin analiza standard QF-PCR pentru cromozomii 13, 18, 21, X si Y cu confirmare prin cariotip fetal.
Pentru testarea celor trei cromozomi suplimentari, 15, 16 si 22, s-a dezvoltat si o metoda in laboratorul nostru ce analizeaza 10 markeri STR din structura acestor cromozomi. Secventele primerilor au fost preluate din literatura de specialitate (Diego-Alvarez D. et al., 2005) (vezi Tabel 26).
Tabel 26. Prezentarea secventelor primerilor utilizati in reactii QF-PCR pentru cromozomii 15, 16 si 22 (dupa Diego-Alvarez D. et al., 2005)
Analiza cuprinde cele trei etape de reactie specifice QF-PCR: extractie ADN, amplificare si electroforeza capilara. Markerii sunt amplificati in reactii monoplex ce utilizeaza primeri marcati cu fluorocromul 6-FAM, iar migrarea electroforetica utilizeaza markerul de marime GeneScan™ -500 LIZ Size Standard.
Analiza markerilor suplimentari pentru cromozomii 15, 16 si 22 nu este inca disponibila pentru pacienti intrucat se lucreaza la optimizarea unei reactii multiplex. De asemenea, nu excludem suplimentarea markerilor analizati si extinderea analizei pentru alti cromozomi, in studii ulterioare.
3. DISCUȚII
Diagnosticul prenatal rapid al aneuploidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X si Y prin QF-PCR a fost introdus ca analiza de laborator in Romania in anul 2007, desi cercetari in aceasta directie au fost efectuate inca din anul 2003 in laboratorul Genetic Lab (Romania) (Badila M. et al., 2004).
Avantajele principale oferite sunt acuratetea rezultatelor, utilizarea unei cantitati mici de proba fara a avea recomandari limitative legate de transport si conservare comparativ cu cariotipul fetal si nu in ultimul rand, rapiditatea emiterii unui raspuns in maximum 24 de ore de la recoltare. Desi in prezent metoda QF-PCR este limitata la detectia anomaliilor numerice pentru anumiti cromozomi selectati fara a putea identifica modificarile structurale, avantajele metodei in domeniul diagnosticului prenatal au condus la implementarea acesteia ca analiza standard in unele state din Europa inca din anul 2000 (Mann K. et al, 2001). In anul 2007, in regiunea Londrei, sistemul de sanantate oferea gratuit analiza QF-PCR pentru cromozomii 13, 18, 21 , X si Y ca unica metoda de diagnostic prenatal pentru sarcinile cu risc de trisomie 21, iar cariotipul se efectua doar in prezenta detectiei modificarilor ecografice sau la cerere (Hills A. et al., 2010).
Avantajele tehnice QF-PCR comparativ cu analiza citogenetica standard precum cantitatea si calitatea probei analizate, conditiile de procesare si rapiditatea obtinerii unui rezultat au fost sumarizate in tabelul de mai jos.
De asemnea, ca avantaje ale tehnicii moleculare QF-PCR se impune si capacitatea de detectie a disomiilor uniparentale si nu in ultimul rand a determinarii originii trisomiei, aspect cu importanta majora in consultul genetic.
Comparativ cu metoda standard citogenetica de detectie a anomaliilor genetice care necesita celule vii prelevate in conditii de sterilitate maxima pentru cultivarea in vitro, tehnica moleculara QF-PCR s-a dovedit superioara in testarea probelor in cantitati reduse de lichid amniotic, vilozitati coriale, sange fetal sau tesut fetal din sarcini oprite in evolutie. Extractia ADN din tesut fetal se poate realiza si ulterior conservarii pe perioade lungi de timp, perioada ce poate varia de la cateva zile la cativa ani. Totodata, prin analiza markerilor STR este eliminat riscul de emitere al unui rezultat eronat la probele contaminate cu celule materne unde acestea sunt selectate in defavoarea celulelor fetale prin cultivarea in vitro (Diego-Alvarez D. et al., 2005).
Tabel 27. Prezentarea comparativa a aspectelor tehnice dintre metoda QF-PCR si cariotip
Prin analiza unei probe de sange matern si obtinerea profilului ADN se pot compara cele doua profile ADN si emite un rezultat sigur. In practica de laborator, prin cultivarea in vitro a trei probe de vilozitati coriale si a patru probe de tesut fetal din sarcini oprite in evolutie s-a remarcat cresterea celulelor materne in defavoarea celor fetale prin compararea rezultatului la cariotip cu cel prin QF-PCR. Desi rezultatele au fost normale in toate cele sapte cazuri, s-a observat discrepanta in determinarea sexului genetic fetal prin cele doua analize. In testarea produsilor de conceptie, metoda QF-PCR s-a dovedit superioara cariotipului intrucat rata de succes pentru obtinerea unui rezultat citogenetic este estimata la 40%, fiind direct influentata de conditiile de recoltare (sterilitate, mediu de transport), de tipul si cantitatea materialului biologic primit in laborator, de varsta sarcinii, de numarul zilelor de la oprirea sarcinii din evolutie. Din lotul de 3552 de probe analizat, 27 cazuri nu au primit un rezultat la cariotip din cauza esecului de cultivare; probele au fost testate prin QF- PCR si dintre acestea, patru cazuri prezentau anomalii cromozomiale: trisomie 21, trisomie 13, monosomie X si triploidie.
Procedeul comparativ intre profilul genetic fetal si cel matern poate fi ghidat in directia detectiei disomiei uniparentale, anomalie cromozomiala ce nu poate fi detectat citogenetic, cu foarte putine exceptii de heteromorfism cromozomial (Kondo Y et al., 2004). Acest protocol de analiza comparativa se aplica in special sarcinilor care au fost detectate cu trisomie sau mozaicism vilozitar, deoarece, desi un rezultat negativ pentru prezenta aneuploidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X si Y la analiza lichidului amniotic ne poate conduce catre suspiciunea de restrictie a anomaliei cromozomiale la structurile extraembrionare, se recomanda evaluarea disomiei uniparentale ca rezultat al fenomenului de “salvarea” embrionului (trisomy rescue) (Evans M.I. et al, 2006).
Un alt avantaj al analizei markerilor STR este de a putea evalua originea anomaliei genetice in cazurile de trisomie sau triploidie (Antonarakis S.E. et al., 1992).
Figura 48. Aspect comparativ intre profilele ADN QF-PCR matern (A) si fetal (B): trisomia 21 fetala este de origine materna intrucat fatul mosteneste ambele alele materne
In imaginea urmatoare, se poate observa aspectul comparativ dintre profilul ADN al unui probe fetale cu trisomie 21 si cel matern. Rezultatul compararii celor doua profile ADN demonstreaza faptul ca markerii fetali trisomici trialelici sunt mosteniti matern si sunt considerati rezultatul unei erori in prima diviziune meiotica.
Inaintea efectuarii acestui test ca metoda de diagnostic prenatal in laboratorul nostru, s-a realizat o evaluare a performantei kit-ului Aneufast™ kit (Genomed Ltd, UK) pe un lot de 200 de probe de la paciente care au solicitat cariotip fetal in cadrul laboratorului. Parametrii urmariti au fost specificitatea si sensibilitatea metodei raportata la analiza standard de analiza cromozomiala, cariotipul fetal. Gravidele au fost informate asupra acestui studiu si au semnat un consimtamant si au beneficiat de aceasta analiza gratuit. Din cele 200 de probe analizate s-au detectat 7 rezultate anormale, confirmate prin cariotip fetal. Din cele 193 probe cu rezultat normal prin analiza QF-PCR, 1 singura proba a prezentat rezultat anormal la cariotip: 46,XY,del(2p2-3). Datele prezentate au demonstrat ca metoda QF-PCR are o specificitate de 100% si o sensibilitate de 88%.
Rezultatele obtinute in laboratorul nostru prin testarea QF-PCR a 3552 de probe de lichid amniotic, vilozitati coriale, tesut fetal in sarcini oprite in evolutie si sange fetal in intervalul 2007 – 2012, au confirmat acuratetea in diagnostic si rapiditatea metodei.
Dintre acestea, 1630 de probe au fost analizate concomitent prin cariotip si s-au putut reevalua parametrii de performanta ai acestui test (Mattocks J.C. et al., 2010).
103 probe cu rezultat normal la analiza QF-PCR au fost detectate cu modificari citogenetice. Dintre acestea 89% au fost reprezentate de heteromorfisme para si pericentromerice ale cromozomilor 1, 9 si 16, dar care au fost considerate fara implicatii majore fenotipice, desi se pare ca aceste variante joaca un rol important in infertilitatea umana (Madon P.F. et al., 2005 ; Hong Y. et al., 2011 ; Dávila-Rodríguez M.I. et al., 2011).
In calculul sensibilitatii QF-PCR raportata la analiza citogenetica standard au fost incluse 14 cazuri reprezentate in tabelul de mai jos (vezi Tabel 28).
Utilizand metoda QF-PCR a fost posibila detectia in proportie de 100% a probelor cu trisomie omogena a cromozomilor 13, 18, 21, X si Y, inclusiv a triploidiilor.
Tabel 28. Prezentarea anomaliilor cromozomiale detectate prin cariotip fetal la pacienti cu rezultat normal prin QF-PCR
Rata de detectie a fetusilor fara anomalii genetice (rezultat negativ) prin metoda QF-PCR a fost calculata pentru lotul de 1630 de probe analizate si prin cariotip. Astfel probabilitatea ca un rezultat normal prin QF-PCR sa fie confirmat prin cariotip a fost de 99.2%. Metoda QF-PCR a demonstrat o specificitate de 100% si o sensibilitate de 81,4% (Mattocks J.C. et al., 2010). Evaluarea parametrilor de performanta pentru metodei QF-PCR raportati la metoda standard de diagnostic prenatal este prezentata in tabelul urmator.
Tabel 29. Prezentarea parametrilor de performanta analizati perntru tehnica QF-PCR
Analiza rezultatelor obtinute prin QF-PCR pentru cele 1630 de cazuri ce au fost testate in paralel si prin cariotip, a confirmat posibilitatea alegerii acestei analize ca unica metoda de diagnostic in sarcinile atent monitorizate, in special la cele care doresc sa afle daca rezultatele cu risc la testele de screening prenatal se confirma sau nu.
4. CONCLUZII
Tehnica QF-PCR a fost implementata cu succes in domeniul diagnosticului prenatal din Romania si in prezent este considerata o metoda standard de diagnostic, alaturi de cariotip si FISH.
Rezultatele celor 3552 de probe prezentate in studiul de fata demonstreaza ca metoda QF-PCR este eficienta in emiterea unui rezultat in maximum 24 de ore din momentul recoltarii, reducand anxietatea gravidei in asteptarea unui raspuns. Desi la inceputul acestui studiu (2007 – 2008) majoritatea gravidelor impreuna cu ginecologii optau pentru efectuarea in paralel a analizei rapide QF-PCR si a cariotipului fetal, acest lucru s-a schimbat in urmatorii ani (2009 – 2011) (vezi Figura 49). Se poate observa ca desi in anul 2008 analiza QF-PCR era solicitata preponderent impreuna cu cariotipul fetal, acest aspect se inverseaza anul urmator si se mentine pana in prezent. De remarcat este si faptul ca odata cu disponibilitatea analizei rapide prin QF-PCR in anul 2008, numarul cererii pentru cariotip in anii urmatori (2009 – 2010) a fost mai mic, desi numarul total de analize in cei trei ani a fost crescator. Putem concluziona ca avantajele diagnosticului prenatal rapid prin QF-PCR au condus la inversarea balantei in favoarea acestuia.
Figura 49. Distributia analizelor prentale QF-PCR, cariotip si FISH
in intervalul 2008-2011
Totodata, pe parcursul celor patru ani integrali de studiu 2008-2011, s-a remarcat o crestere a interesului general pentru diagnosticul prenatal, observandu-se o dublarea a numarului de probe testate intre 2008 si 2012.
Avand in vedere ca mai mult de 90% dintre gravidele care efectueaza analize de diagnostic prenatal invaziv sunt incadrate in categoria de sarcina cu risc crescut pentru trisomia 21 si 18 la testele biochimice de screening prenatal din primul si cel de-al doilea trimestru de sarcina, din experienta noastra consideram ca metoda QF-PCR poate inlocui cu succes cariotipul fetal in sarcini atent monitorizate.
PARTE SPECIALĂ – CAPITOLUL 2
CERCETĂRI PRIVIND POSIBILITATEA INTRODUCERII UNOR TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARA ÎN DIAGNOSTICUL PRENATAL NEINVAZIV
Introducere
In prezent, domeniul medical dispune de o serie vasta de tehnici si tehnologii cu capacitatea de a diagnostica anomaliile genetice fetale, insa, acestea au la baza exclusiv proceduri invazive de recoltare. Biopsia de vilozitati coriale, amniocenteza si cordocenteza, desi se efectueza de aproximativ 45 de ani, sunt proceduri invazive si comporta un risc de inducere a avortului in proportie de 1-5%, alaturi de alte manifestari clinice.
Studii vaste din ultimii douazeci de ani s-au axat pe cercetarea transferului fetomaternal de celule si acizi nucleici, iar detectia si analiza acestora au deschis calea unui nou domeniu medical, si anume diagnosticul prenatal neinvaziv.
Obiective generale
Elaborarea unui protocol eficient de detectie neinvaziva a genotipului RHD fetal prin analiza unei probe de sange periferic matern.
Elaborarea unui procol eficient de detectie neinvaziva a sexului genetic fetal cu aplicabilitate in screeningul bolilor recesive legate de cromozomul X.
Obiective specifice
Optimizarea unei metode de extractie a ADN extracelular din sangele gravidelor in vederea analizei ulterioare a secventelor ADN de origine fetala.
Optimizarea reactiilor de amplificare si identificarea secventelor tinta cu origine fetala – PCR monoplex si PCR multiplex.
Identificarea produsilor PCR prin electroforeza capilara de rezolutie inalta.
Asigurarea calitatii rezultatelor
1. Detectie neinvaziva a genotipului RHD fetal prin analiza unei probe de sange periferic matern
Introducere
Sistemul Rh (Rhesus) este al doilea ca importanta in medicina transfuzionala dupa sitemul de grup ABO si prezinta un polimorfism genetic inalt asociat cu capacitate imunogenica ridicata (Avent N.D., Reid M.E., 2000). In cadrul sistemului Rh sunt incluse in prezent 49 de antigene distincte dintre care cele mai cunoscute sunt D, C, c, E si e, cel mai imunogenic fiind factorul D (Flegel W.A., 2007).
Locusul RH, localizat in cromozomul 1p34-36, este alcatuit din doua gene omoloage in proportie de 96%, RHD si RHCE, separate de o secventa ADN de 30 kb ce contine gena SMP1 cu functie necunoscuta. Gena RHD este flancata de doua casete “rhesus box” de 9 kb cu omologie de secventa de 98%, implicate in fenomenul crossing-over inegal, responsabil de aparitia genotipului RHD-negativ (Rouillac-LeSciellour C. et al., 2007) (vezi Figura 50).
Figura 50. Reprezentarea schematica a locusului RH (dupa Rouillac-LeSciellour C. et al., 2007; Avent N.D., 2008)
Incompatibilitatea materno-fetala de Rh este cel mai comun mecanism al incompatibilitatii RH. Femeile Rh negative cu parteneri Rh pozitivi sunt expunse riscului de imunizare la prima sarcina intrucat in timpul sarcinii cat si in timpul nasterii, hematiile fetale pot trece in circulatia materna si pot produce raspuns imun in organismul mamei, care sintetizeaza anticorpi IgM anti-D, apoi IgG anti-D (Mihaescu G., 2001) (vezi Figura 51).
Figura 51. Evolutia imunizarii in incompatibilitatea de Rh materno-fetala: A si B – Imunizarea in prima sarcina cu aparitia Ac IgM anti-D; C – Incompatibilitatea de Rh in cazul imunizarii anterioare a gravidei si transferul transplacentar al Ac IgG anti-D materni. (Imaginile sunt preluate de pe site-ul UPMC Life Changing Medicine (http://www.upmc.com/health-library/Pages/ADAM.)
Imunizarea gravidei poate fi prevenita prin administrarea imediat dupa nastere a vaccinului gama-globulinei anti-Rh (anti-D), care neutralizeaza celulele fetale Rh+. La o a doua sarcina cu incompatibilitate de Rh, exista riscul ca fatul sa dezvolte boala hemolitica caracterizata prin anemie, icter si edem (Daniels G. et al., 2009). Mecanismul de aparitie a bolii hemolitice a noului nascut are la baza raspunsul imun anti-D, cand Ac IgG traverseaza placenta si se fixeaza pe suprafata eritrocitelor fetale si le distrug prin mecanismul de hipersensibilitate de tip citotoxic (Mihaescu G., 2001).
In populatia generala procentul persoanelor Rh negative variaza destul de mult: aproximativ 15% dintre caucazieni, 8% dintre afro-americani, 4% dintre africani si mai putin de 1% dintre asiatici (Arraut A. et al., 2011). Luand in considerare faptul ca dintre persoanele Rh pozitive 55% sunt heterozigote, s-a constatat ca aproximativ 10% dintre sarcini in populatia caucaziana prezinta incompatibilitate de Rh (Arraut A. et al., 2011; Szczepura A. et al., 2011). In prezent sarcinile cu incompatibilitate de Rh primesc indicatie pentru vaccinare anti-D in scop profilactic, desi s-a constatat ca aproximativ 40% dintre gravidele Rh negativ sunt insarcinate cu fetusi Rh negativ si vaccinarea este inutila (Daniels G. et al., 2007). Din acest motiv a aparut necesitatea genotiparii RHD fetale prenatale ca modalitate de selectie a sarcinilor pentru vaccinarea anti-D (Maddocks D.G. et al., 2009). Desi statusul RHD fetal se poate realiza prin analiza celulelor fetale recoltate invaziv (Lo Y.M., 2005), aceasta strategie nu se recomanda decat in cazurile cu risc asociat pentru anomalii genetice (Daniels G. et al., 2009). De asemenea in cazul gravidelor imunizate anterior exista posibilitatea ca procedura de recoltare invaziva sa intensifice severitatea aloimunizarii si implicit a hemolizei fetale (Bombard A.T. et al., 2011).
De asemenea, genotiparea RHD fetala este deosebit de importanta in cazul sarcinilor cu incompatibilitate de Rh cand se efectueaza amniocenteza sau biopsia de vilozitati coriale in scopul detectiei anomaliilor cromozomiale, intrucat adminstrarea vaccinului se face la maximum 72 de ore dupa efectuarea procedurilor invazive de recoltare a materialului fetal, daca genotipul RHD fetal este pozitiv.
Abordarea neinvaziva a genotiparii RHD fetale a devenit metoda recomandata de centrele internationale odata cu detectia acizilor nucleici fetali liber circulanti in sangele mamei (Lo Y.M. et al., 1997).
1.1. Materiale și metode
1.1.1. Designul experimental și prezentarea pacienților
Studiul de fata a fost desfasurat in doua etape. Prima etapa a inclus dezvoltarea si validarea metodei de determinare a genotipului RHD fetal prin analiza ADN fetal liber ciculant in sangele matern, utilizand recomandarile standardelor internationale SR EN ISO 15189:2007) si SR EN ISO/CEI 17025:2005 pentru acreditarea laboratoarelor de analize medicale si respectiv laboratoare de incercari si etalonari De asemenea, desfasurarea acestui studiu s-a realizat conform recomandarilor initiativei STARD (STAndards for the Repoting of Diagnostic accuracy studies).
In cea de-a doua parte a studiului s-a aplicat aceasta metoda de detectie prenatala neinvaziva cu scopul optimizarii managementul vaccinarii anti-D pentru gravidele RhD-negative cu parteneri RhD pozitivi, ce nu prezinta indicatii de sarcina cu risc genetic.
.
Figura 52. Prezentarea schematica a persoanelor incluse in studiul de
detreminare a genotipului RHD fetal din sangele matern
Toti participantii inclusi in acest studiu au fost informati despre caracteristicile acestuia si au semnat un consimtamant aprobat de comisia de etica a laboratorului Genetic Lab. Pentru dezvoltarea si validarea acestei metode au fost selectate urmatoarele grupe de participanti: indivizi sanatosi de ambele sexe cu un istoric medical fara boli precum diabet sau transplant medular, si gravide cu sarcina unica confirmata ecografic. Persoanele incluse in acest studiu au fost impartite in trei categorii: femei fara sarcina in momentul recoltarii probei, barbati si gravide RhD pozitive cu parteneri RhD pozitivi (vezi figura 52). Ulterior, toti participantii au fost testati serologic pentru certificarea statusului Rh inaintea analizei genetice.
1.1.2. Procesarea probelor de sânge
Pentru optimizarea acestei etape s-au utilizat informatii preluate din literatura de specialitate care recomanda separarea plasmei in doua etape (Lo Y.M. et al., 1998; Chan K.C.A. et al., 2004; Li Y. et al., 2004; Legler T.J. et al., 2007).
S-au recoltat cate doisprezece mililitri de sange de la fiecare persoana in vacutainere cu EDTA. In maximum 24 de ore de la recoltare probele au fost procesate pentru obtinerea plasmei prin centrifugare in doua etape. Prima etapa de centrifugare s-a efectuat la o viteza mica de 2200xg timp de 30 de minute; supernatantul a fost transferat intr-un tub nou fara a deranja inelul de limfocite format intre sedimentul celular si plasma si a fost supus unei etape de centrifugare la viteza mare de 14000xg timp de 30 de minute. Supernatantul este transferat intr-un tub nou si se depoziteaza la -80ºC pana in momentul extractiei. In procesul de inghetarea a plasmei a fost inclusa o etapa intermediara de temperatura, la -20ºC.
1.1.3. Extracția ADN total extracelular plasmatic
Inainte de extractia ADN, probele de plasma se dezgheata gradat de la -80ºC la temperatura camerei si apoi sunt centrifugate la 14000xg timp de 10 minute pentru a elimina crioprecipitatii formati. Extractia ADN extracelular a fost optimizata pentru volumul de 1ml plasma. S-a utilizat kitul comercial QIAamp® DSP Virus kit (Qiagen), insa protocolul standard a fost modificat datorita volumului dublu de plasma utilizat, fata de recomandarile protocolului standard.
Tabel 30. Reprezentarea schematica a etapelor protocolului de extractie ADN plasmatic;*TC= temperatura camerei
Proba de ADN obtinuta se utilizeaza in imediat in reactia de amplificare si nu se va depozita la congelator intrucat fragmentele de ADN fetal sunt sensibile deteriorarii.
1.1.4. Reacțiile de amplificare a secventelor ținta cu origine fetală – PCR multiplex
S-au dezvoltat doua reactii de amplificare multiplex distincte, in vederea detectiei genotipului RHD fetal, utilizand un aparat Veriti® Thermal Cycler (Applied Biosystems).
1.1.4.1. Selecția primerilor specifici genei RHD
Reactia de genotipare a genei RHD a fost optimizata pe baza informatiilor furnizate in cadrul cursului de specializare “SAFE Practical Workshop on Non Invasive Prenatal Diagnosis” sustinut de catre reteaua SAFE (Special Non-Invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation) in centrul “V.A.McKusick & G.Levi Euro-Mediterranean Center for Genetics & Medicine” in Bolonia, Italia.
Secventele de nucleotide ale primerilor utilizati au fost descrise de catre Legler si colaboratorii in 2007 (Legler T.J. et al., 2007).
Tabel 31. Secventele primerilor utilizati in reactiile PCR pentru genotiparea RHD
Reactia de amplificare a avut doua tinte distincte: exonul 5 si exonul 7 din structura genei RHD in concordanta cu recomandarile SAFE NoE, intrucat testarea combinata a celor doi exoni asigura detectia unei pseudogene RHD, varianta genetica intalnita in special in populatia Africana (Avent N.D., 2008) (vezi Tabel 32).
Tabel 32. Model schematic de intrepretare a genotiparii RHD
In paralel cu cei doi exoni RHD, in reactiile de amplificare a fost inclusa si analiza unei secvente din gena β-globina (Bon M.A.M. et al., 2000), utilizata drept control intern al reactiei. Acest control intern va amplifica atat ADN de origine fetala cat si materna, insa va monitoriza atat eficienta etapei de extractie ADN cat si a amplificarii. Sinteza primerilor s-a realizat prin comanda la Integrated DNA Technologies (IDT) (http://eu.idtdna.com/site).
Reactiile de amplificare monoplex au fost analizate initial bioinformatic utilizand programul (motorul de cautare) UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/) (vezi Figurile 53, 54, 55).
UCSC In-Silico PCR
Figura 53. Reactia virtuala “in silico” pentru exonul 7 al genei RHD
UCSC In-Silico PCR
Figura 54. Reactia virtuala “in silico” pentru exonul 5 al genei RHD
UCSC In-Silico PCR
Figura 55. Reactia virtuala “in silico” pentru gena β-globina
1.1.4.2. Pregătirea amestecului de reacție pentru PCR
Cei doi exoni testati pentru genotiparea RHD au fost amplificati in doua reactii distincte, iar fiecare in cate trei replici. Amestecul de reactie pentru amplificarea secventelor tinta ADN s-a realizat intr-un volum final de 25µl si a inclus master mix comercial 1x concentrat (Qiagen Multiplex PCR kit) ce contine ADN polimeraza HotStarTaq, primeri specifici pentru genele tinta si 10,9µl ADN plasmatic total proaspat extras.
Tabel 33. Schematizarea prepararii amestecului de reactie pentru amplificarea exonului 7 al genei RHD
Tabel 34. Schematizarea prepararii amestecului de reactie pentru amplificarea exonului 5 al genei RHD
1.1.4.3. Programul PCR
Tabel 35. Schematizarea conditiilor de reactie; *pentru reactia de amplificare a exonului 7 al genei RHD se aplica o temperatura de atasare a primerilor de 57 ºC
Reactia de amplificare a fost optimizata pentru a elimina amplificarea preferentiala a unui anumit locus. Pentru a evalua sensibilitatea metodei s-a analizat ADN genomic de la o persoana de sex feminin cu RhD pozitiv, fara sarcina in momentul recoltarii. Pentru proba de ADN s-au realizat dilutii seriale de la concentratia de 50ng pana la 6pg de ADN, iar ulterior au fost procesate conform protocolului de amplificare descris anterior. Utilizand aceasta metoda s-a realizat genotiparea RHD plecand de la o concentratie ADN echivalenta cu 1 genom (6,6pg ADN) (Lo Y.M. et al., 1998; Johnson K.L. et al., 2004). S-a evaluat repetabilitatea testului prin efectuarea analizei in zece replici intr-o singura reactie, iar reproductibilitatea s-a realizat prin repetarea testului timp de zece zile consecutiv. Fiecare replica de concentratie 0,006ng/µl a fost detectata ca RHD pozitiv pentru ambii exoni, indicand astfel o sensibilitate de 100%. De asemenea s-au validat urmatoarele controale: controlul intern al reactiei, proba control negativ (ADN de aceeasi concentratie cu RHD negativ) si proba martor fara ADN.
In vederea testarii aplicabilitatii acestei metode la analiza ADN liber ciculant plasmatic, s-au analizat in triplicat probe de sange de la indivizi de ambele sexe, iar rezultatele au fost cele asteptate (vezi Tabel 56).
Figura 56. Schematizarea categoriilor de persoane incluse in faza de testare a metodei de genotipare RHD
1.1.4.4. Analiza produșilor de amplificare
Ampliconii au fost analizati prin electroforeza capilara de rezolutie inalta utilizand analizorul automat QIAxcel (Qiagen) si kitul QIAxcel DNA High Resolution (Qiagen). Acest sistem utilizeaza un cartus cu gel care permite separarea ampliconilor cu o rezolutie de 3-5 perechi de baze si o sensibilitate de 0, 1 ng/µl ADN in probe nediluate. Acest sistem de electroforeza capilara ofera rezultate robuste plecand de la cantitati reduse de ADN. In vederea detectiei marimii fragmentelor ADN, in migrarea electroforetica sunt utilizati doi markeri de marime:
Markerul de aliniere a ampliconilor: QX DNA Alignment Marker 15 pb/1 kb (1.5 ml); acesta contine urmatoarele fragmente ADN: 15 pb si 1 kb;
Markerul de marime al ampliconilor: QX DNA Size Marker pUC18/HaeIII (50 μl); acesta contine urmatoarele fragmente ADN: 80, 102, 174, 257, 267, 298, 434, 458 si 587 pb; concentratia 100 ng/μl.
Figura 57. Electroferograma reactiei de amplificare a exonului 7 al genei RHD: A01- QX DNA Size Marker pUC 18/Hae III marker; A02 – control RHD pozitiv; A03 – control RHD negativ, A04 si A05 – rezultate RHD positiv; A06 – proba martor
Toate reactiile au fost monitorizate atent pentru eliminarea unei eventuale contaminari. Astfel, etapele de extractie ADN, pregatirea amestecului de reactie PCR, amplificarea si electroforeza, au fost efectuate in camere separate si s-au utilizat varfuri de pipeta cu filtru. De asemenea au fost incluse probe martor pentru fiecare etapa cheie: extractia ADN si amplificarea specifica.
1.1.5. Interpretarea rezultatelor
Interpretarea s-a realizat prin aplicarea unui model de evaluare ce combina rezultatele pentru cei doi exoni analizati din gena RHD (exon 5 si respectiv 7) si secventa de control β-globina. Validarea unei reactii presupune in primul rand obtinerea unor rezultate negative pentru probele martor ale extractiei si amplificarii, apoi prin obtinerea unor rezultate pozitive pentru β-globina in probele ce contin ADN. In cazul in care aceste doua cerinte nu se respecta, reactia este invalida si se recomanda retestarea.
Un rezultat este considerat “genotip RHD pozitiv” cand se obtin semnale pentru ambele secvente RHD incluse in test. In cazul in care doar exonul 7 este pozitiv suspectam prezenta genotipului RHD denumit pseudogena care in general, este intalnit la indivizii cu origine africana (Avent N.D., 2008). Pentru eliberarea unui rezultat negativ, ambele secvente specifice genei RHD vor fi absente, iar controlul β-globina va fi prezent.
In cazul in care pentru cei doi exoni analizati se obtin rezultate distincte, testul va fi neconcludent si se recomanda retestarea.
Figura 58. Electroferograma genotiparii RHD: A01- control pozitiv exon 7; A02 – control negative exon 7; A03 – proba RHD exon 7 pozitiv, A04 – proba martor; A05 – control pozitiv exon 5; A06 – control negativ exon 5; A07 – proba RHD exon 5 pozitiv, A08 – proba martor.
Pentru fiecare pacient reactia se efectueaza in triplicat, iar un rezultat este considerat pozitiv cand cel putin doua dintre reactii sunt pozitive. De asemenea, un rezultat este considerat neconcludent cand doar unul dintre cele trei teste este pozitiv. In aceasta situatie se recomanda retestarea dintr-un alt esantion de plasma. Un rezultat negativ se va emite cand toate cele trei replici sunt negative.
1.2. Rezultate
In faza a doua a studiului, ulterior dezvoltarii si validarii metodei, s-au analizat 136 probe de plasma provenite de la gravide Rh negative cu parteneri Rh pozitivi, prin metoda neinvaziva de detectie a genotipului RHD fetal. Din lotul de 136 de probe testate, 104 gravide au efectuat diagnostic prenatal invaziv pentru detectia anomaliilor cromozomiale, iar rezultatele genotiparii neinvazive au putut fi confirmate si invaziv prin utilizarea ADN extras din vilozitati coriale sau lichid amniotic (vezi Figura 59).
Figura 59. Schematizarea rezultatelor obtinute prin testarea a 136 de persoane prin metoda neinvaziva de genotipare RHD
29 de probe au fost testate doar prin metoda neinvaziva: 11 probe din primul trimestru de sarcina, 5 probe din al doilea si 13 probe din al treilea trimestru de sarcina. In trei cazuri recoltate foarte devreme in sarcina, intre a cincea si a saptea saptamana de sarcina, s-au obtinut rezultate neconcludente intrucat controlul intern nu s-a validat. Cele trei paciente au fost retestate dupa 9 saptamani de sarcina. Intr-un singur caz de diagnostic neinvaziv sarcina s-a oprit in evolutie, iar rezultatul nu a putut fi confirmat.
1.3 Discuții și concluzii
Metoda de detectie prenatala neinvaziva a genotipului RHD dezvoltata in laboratorul nostru reprezinta o oportunitate de imbunatatire a managementului incompatibilitatii materno-fetale de Rh in sistemul medical din Romania. Studiul nostru a avut ca scop implementarea unui test rapid, sigur, fara riscuri si costuri reduse de detectie neinvaziva a genotipului RHD fetal. Aceasta metoda a demonstrat capacitatea de a elimina aproximativ 40% dintre administrarile inutile ale vaccinului anti-D inainte si dupa nastere sau dupa procedurile invazive de recoltare a produsului fetal (biopsie de vilozitati si lichid amniotic) (Freeman K. et al., 2008).
Desi primele noastre experimente au fost indreptate spre metoda de amplificare Real-Time PCR, aceasta s-a dovedit mai costisitoare. Utilizarea tehnicii PCR si a electroforezei capilare de rezolutie inalta are capacitatea de a detecta concentratii de pana la 6pg de ADN, ceea ce coincide cu recomandarile internationale privind limita de detectie a unei metode neinvazive de diagnostic genetic. In procesul de selectie a regiunilor tinta in gena RHD s-au utilizat recomandarile echipei internationale Special Non-Invasive Advances in Fetal and Neonatal Evaluation Network of Excellence (SAFE NoE) care sustin testarea a cel putin doua secvente tinta pentru genotiparea corecta a genei RHD. Desi exonul 7 este considerat cel mai robust dintre cei 10 exoni ai genei RHD, se recomanda testarea in paralel si a exonului 5 care are capacitatea de detectie a pseudogenei RHD. Adaugarea secventei din β-globina in amestecul de amplificare pentru monitorizarea reactiei a adus un plus de informatie in rezultat. Testarea metodei in primul trimestru de sarcina a indicat faptul ca rezultatele sunt sigure dupa varsta de 9 saptamani. Desi prin analize suplimentare in care s-au utilizat markeri multi-locus, precum DYS14 din structura cromozomului Y, a fost posibila detectia ADN fetal la 5 saptamani de sarcina, repetabilitatea testarii nu a fost concludenta.
Utilizarea celor doi markeri specifici genei RHD, analizarea probelor in triplicat si interpretarea rezultatelor prin modelul de punctaj prezentat in aceasta lucrare, asigura corectitudinea evaluarii noninvazive a genotipului RHD fetal.
Determinarea neinvaziva a sexului genetic fetal prin analiza ADN fetal liber circulant in sangele matern
Introducere
Determinarea timpurie a sexului fetal este un aspect cu importanta maxima in sarcinile cu risc pentru boli recesive legate de cromozomul X (Scheffer P.G. et al., 2010). Identificarea unui fetus de sex masculin indica statusul acestuia de hemizigotie pentru cromozomul X (Severin E. et al., 2011) si implicit riscul de a mosteni boli precum distrofiile musculare Duchenne si Becker, hemofilie sau sindrom X-fragil in situatiile in care mama este purtatoare (Davalieva K. et al., 2006; Severin E. et al., 2011; Bembea et al., 2011). Desi sexul fetal se poate determina prin ecografie, aceasta abordare nu este sigura inainte de saptamana a 13-a de sarcina intrucat dezvoltarea organelor genitale externe nu este completa (Scheffer P.G. et al., 2010; Devaney S.A. et al., 2011). In practica medicala, pentru sarcinile cu risc de a mosteni o boala legata de X se recomanda biopsia de vilozitati coriale (CVS) in vederea determinarii sexului fetal (Scheffer P.G. et al., 2010) Aceasta procedura invaziva de recoltare a celulelor fetale prezinta un risc de avort spontan de aproximativ 1% (Mujezinovic F., Alfirevic Z., 2007) si nu poate fi efectuata inainte de saptamana a 11-a de sarcina (Wright C.F., Burton H., 2009). Luand in considerare riscurile procedurale ale biopsiei de trofoblast, se recomandarea doar in cazul in care fatul prezinta sex masculin.
Detectia ADN-ului fetal liber circulant (ADNflc) in plasma materna de catre Dennis Lo in anul 1997 a deschis noi posibilitati de dezvoltare a procedurilor de diagnostic prenatal (Lo Y.M. et al., 1997). Fragmentele de ADNflc deriva din celulele sincitiotrofoblastice ale corionului (Lo Y.M. et al., 2005) si pot fi detectate incepand cu saptamana a cincea de sarcina (Rijnders R.J. et al., 2003; Martinhago C.D. et al., 2006) iar concentratia acestora creste proportional cu varsta sarcinii intr-un interval de 3,4%-6,2% din concetratia totala a ADN plasmatic (Lo Y.M.D. et al., 1999c). Timpul de injumatatire a ADNflc in circulatia materna este de 16,3 minute si in aproximativ doua ore de la nastere este nedetectabil in circulatia materna (Lo Y.M.D. et al., 1998), acesta reprezentand un caracter esential intrucat se poate exclude persistenta ADNflc dintr-o sarcina anterioara.
Scopul acestui capitol este de a dezvolta si valida un protocol de detectie neinvaziva a sexului genetic fetal prin analiza sangelui matern si a implementa aceasta analiza ca metoda de screening a sarcinilor cu risc de a avea o boala recesiva legata de cromozomul X si de a exclude biopsia de vilozitati in sarcinile cu fetusi de sex feminin.
2.1. Materiale și metode
2.1.1. Designul experimental și prezentarea pacientilor
Studiul de fata a fost desfasurat in doua etape. Prima etapa a inclus dezvoltarea si validarea metodei de determinare a sexului genetic fetal prin analiza ADN fetal liber ciculant in sangele matern. Asemeni studiului anterior privind genotiparea RHD fetala, s-au utilizat recomandarile standardelor internationale SR EN ISO 15189:2007 si SR EN ISO/CEI 17025:2005 si a initiativei STARD. In cea de-a doua parte a studiului s-a aplicat aceasta metoda de detectie prenatala neinvaziva in managementul sarcinilor cu risc pentru distrofia musculara Duchenne si Becker.
Toti participantii au fost informati despre natura studiului si au semnat un consimtamant aprobat de comisia de etica a laboratorului Genetic Lab.
Persoanele incluse in acest studiu au fost selectate pe baza urmatoarelor criterii:
Persoane de sex masculin sanatoase fara afectiuni imporatante in trecut;
Persoane de sex feminin sanatoase fara afectiuni imporatante in trecut si care nu sunt gravide in momentul recoltarii probelor de sange;
Gravide fara afectiuni importante in trecut si care nu au efectuat proceduri de transplant medular; sarcina a fost confirmata ecografic;
Gravide purtatoare de mutatii in gena distrofinei care vor efectua diagnostic prenatal invaziv in situatia detectiei unui fat de sex masculin.
In vederea validarii protocolului laboratorului nostru s-au testat 15 probe de sange recoltate de la persoane de sex feminin (fara sarcina in momentul recoltarii), 15 probe de la persoane de sex masculin si 45 de probe de la gravide cu varsta sarcinii cuprinsa intre 9 si 16 saptamani. Gravidele incluse in acest studiu s-au adresat laboratorului nostru in vederea efectuarii testelor de screening biochimic in primul si cel de-al doilea trimestru de sarcina (vezi Figura 60).
Figura 60. Tabel sistematic al persoanelor incluse in studiul de
determinare a sexului genetic fetal din sangele matern
2.1.2. Procesarea probelor de sânge
S-au recoltat cate doisprezece mililitri de sange de la fiecare persoana in vacutainere cu EDTA, iar procesarea in vederea obtinerii plasmei s-a realizat in maximum 24 de ore de la recoltare. S-a aplicat aceeasi metoda de separare a plasmei prin centrifugarea in doua etape ca in protocolul pentru genotiparea RHD neinvaziva. Supernatantul este transferat intr-un tub steril si se depoziteaza la -80ºC pana in momentul extractiei.
2.1.3. Extracția ADN total extracelular plasmatic
Pentru extractia ADN extracelular plasmatic s-a utilizat kitul comercial QIAamp® DSP Virus kit (Qiagen) cu modificarile protocolului standard prezentat anterior in capitolul de genotipare neinvaziva RHD. Elutia s-a realizat in 45µl AVE, iar proba de ADN s-a utilizat in maximum 2 ore in reactia de amplificare.
2.1.4. Reacțiile de amplificare a secvențelor țintă cu origine fetală – PCR multiplex
S-au dezvoltat doua reactii de amplificare multiplex distincte, in vederea determinarii sexului genetic fetal, utilizand un aparat Veriti® Thermal Cycler (Applied Biosystems).
2.1.4.1. Selecția primerilor pentru detecția sexului genetic fetal
Reactia de amplificare a avut doua secvente ADN tinta distincte din structura cromozomului Y: SRY care se gaseste in copie unica si DYS14 care se gaseste in copii multiple.
Tabel 36. Secventele primerilor utilizati in reactiile PCR
pentru determinarea sexului genetic
Alaturi de cele doua secvente specifice cromozomului Y, in reactia de amplificare s-a adaugat o secventa din gena GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) ce monitorizeaza atat reactia de extractie cat si cea de amplificare. Pentru detectia celor doua secvente s-au realizat doua reactii PCR multiplex distincte. Primerii utilizati au fost preluati din literatura de specialitate, iar secventele oligonucleotidice au fost comandate de la Integrated DNA Technologies (IDT) (http://eu.idtdna.com/site).
Reactiile de amplificare monoplex au fost analizate initial bioinformatic utilizand programul UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/) (vezi Figurile 61, 62, 63).
UCSC In-Silico PCR
Figura 61. Reactia virtuala “in silico” pentru gena SRY
UCSC In-Silico PCR
Figura 62. Reactia virtuala “in silico” pentru gena multilocus DYS14
UCSC In-Silico PCR
Figura 63. Reactia virtuala “in silico” pentru gena GAPDH
2.1.4.2. Pregătirea amestecului de reacție pentru PCR
Detectia celor doi markeri specifici cromozomului Y se realizeaza in doua reactii distincte, iar fiecare in cate trei replici distincte. Amestecul de reactie include master mix comercial 1x concentrat (Qiagen Multiplex PCR kit) ce contine ADN polimeraza HotStarTaq, primeri specifici pentru genele tinta si ADN plasmatic total proaspat extras.
Tabel 37. Schema prepararii amestecului de reactie pentru amplificarea genei SRY
Tabel 38. Schema prepararii amestecului de reactie pentru amplificarea genei DYS14
2.1.4.3. Programul PCR
Tabel 39. Schema conditiilor de reactie in reactia de detectie a sexului genetic fetal;
*40 de cicluri pentru reactia de amplificarea secventei DYS14
2.1.4.4. Analiza produșilor de amplificare
Ampliconii au fost analizati prin electroforeza capilara de rezolutie inalta utilizand analizorul automat QIAxcel (Qiagen) si kitul QIAxcel DNA High Resolution (Qiagen).
Figura 64. Aspect electroferograma digitala obtinuta cu analizorul QIAxcel (Qiagen)
Pe toata perioada desfasurarii analizei s-au luat masuri de precautie pentru evitarea posibilei contaminari intre probe, precum separarea ariilor de lucru pentru fiecare etapa sau utilizarea varfurilor de pipeta sterile cu filtru. Monitorizarea contaminarii incrucisate se verifica si prin utilizarea probelor martor.
2.1.5. Interpretarea rezultatelor
Protocolul de determinare a sexului genetic fetal s-a realizat cu succes intr-o singura zi. Rezultatele se considera pozitive pentru prezenta cromozomului Y cand se detecteaza benzi ADN specifice pentru ambele secvente amplificate: SRY si DYS14. Un rezultat negativ corespunzator sexului genetic feminin este raportat in absenta benzilor specifice cromozomului Y si semnal pozitiv pentru gena control GAPDH. Exista si posibilitatea obtinerii unui rezultat incert cand markerul multi-locus DYS14 prezinta un semnal pozitiv, iar markerul SRY este negativ. Pentru a monitoriza posibila contaminare se includ in fiecare serie de amplificare, probe martor ce nu contin ADN (vezi Figura 65).
Figura 65. Electroferograma digitala a ampliconilor pentru detectia sexului genetic: A01. control pozitiv SRY pozitiv si GAPDH pozitiv; A02. Control negativ SRY negativ si GAPDH pozitiv; A03. Proba martor (fara ADN) – negativa pentru amplificarea specifica; se observa primeri neconsumati; A04. Control pozitiv – DYS14 pozitiv si GAPDH pozitiv; A05. Control negativ – DYS14 negativ si GAPDH pozitiv; A06. Proba martor (fara ADN) – negativa pentru amplificarea specifica; se observa primeri neconsumati; A07. Markerul de marime QX DNA Size Marker pUC18/HaeIII;
Interpretarea rezultatelor s-a realizat aplicand un model de evaluare ce combina rezultatele pentru ambii markeri SRY si DYS14. Validarea reactiei se realizeaza prin obtinerea unui semnal pozitiv pentru controlul intern GAPDH si un rezultat negativ pentru proba martor.
Avand in vedere faptul ca probele se lucreaza in cate trei replici distincte, pentru reactia genei SRY, un rezultat este considerat pozitiv cand cel putin doua dintre acestea sunt pozitive; de asemenea, in cazul in care doar o singura reactie este pozitiva, rezultatul va fi neconcludent si se recomanda retestarea dintr-o alta proba de plasma. Un rezultat este raportat negativ cand toate cele trei replici sunt negative. Pentru markerul DYS14 un rezultat este considerat pozitiv cand toate cele trei replici sunt pozitive si neconcludent cand doar una dintre cele trei reactii este negativa. Acest model de interpretare diferit pentru cele doua secvente este explicat prin faptul ca DYS14 este prezent in mai multe copii in structura cromozomului Y si este considerat mai robust comparativ cu SRY care este prezent in copie unica.
Ulterior procesului de stabilire a rezultatului pentru fiecare marker separat, se va aplica un sistem de interpretare combinat pentru cei doi markeri (vezi Tabel 40).
Tabel 40. Modelul de interpretare a determinarii sexului genetic fetal prin analiza combinata a markerilor SRY si DYS14
2.2. Rezultate
Rezultatele obtinute in faza de testare a metodei au coincis cu sexul genetic al persoanelor testate. Prin analiza celor 45 de probe de plasma provenite de la gravidele incluse in studiu, s-au obtinut urmatoarele rezultate: 24 de probe au fost pozitive pentru prezenta SRY, iar pentru DYS14 s-au detectat 26 de probe pozitive. Cele doua cazuri cu rezultate neconcordante au fost declarate cu sex genetic masculin la o noua testare dintr-un esantion distinct de plasma. Pentru un singur caz s-a obtinut un rezultat neconcludent pentru markerul DYS14 si s-a cerut repetarea recoltarii probei de plasma. Rezulatele au fost confirmate fie ecografic, fie in urma diagnosticului prenatal invaziv.
Utilizarea detecției neinvazive a sexului genetic fetal din sângele mamei în sarcini cu risc pentru distrofia musculară Duchenne
Metoda de detectie a sexului fetal din sangele matern, elaborata in cadrul acestui studiu, a fost aplicata pentru testarea a 2 cazuri cu risc pentru distrofia musculara Duchenne. In primul caz, femeia insarcinata era purtatoare a deletiei heterozigote a exonilor 51-55. Aceasta avea un fiu cu varsta de cinci ani ce mostenise cromozomul X anormal si era diagnosticat cu distrofie musculara (vezi Figura 66).
Figura 66. Aspect comparativ al profilelor MLPA evidentiind transmiterea ereditara mama-copil a deletiei exonilor 51-55 in gena DMD cu kit-ul SALSA MLPA kit P034-A2/P035-A2 DMD/BECKER (MRC Holland)
Recoltarea probei de sange matern s-a realizat in saptamana a 9-a de sarcina. Prin aplicarea testarii neinvazive s-a detectat sexul genetic fetal ca feminin, iar gravida nu a efectuat biopsia de vilozitati in vederea diagosticului DMD. Mai tarziu in sarcina, rezultatul a fost confirmat atat ecografic cat si in urma efectuarii amniocentezei pentru diagnostic prenatal cromozomial.
In cel de-al doilea caz, gravida era purtatoare a deletiei heterozigote a exonilor 30 – 43 in gena DMD. Analiza neinvaziva in saptamana a 9-a de sarcina a detectat un fat de sex masculin. In saptamana a 11-a s-a efectuat biopsia de vilozitati coriale in vederea diagnosticului prenatal. Pentru detectia mutatiilor mari in gena distrofinei s-a utilizat kit-ul SALSA MLPA kit P034-A2/P035-A2 DMD/BECKER (MRC Holland) (vezi Figura 67).
Figura 67. Aspect comparativ al profilelor MLPA evidentiind absenta transmiterii ereditare mama-fetus a deletiei exonilor 30-43 in gena DMD
Testul utilizeaza metoda MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) si are capacitatea de detectie a deletiilor si duplicatiilor celor 79 de exoni ai genei DMD si a regiunii promoter DP427c. Ulterior etapelor de hibridizare si amplificare are loc separarea ampliconilor prin electroforeza capilara utilizand analizorul genetic CEQ™ 8800 Genetic Analysis System, Beckman Coulter. Markerii de control specifici cromozomilor de sex au fost analizati pentru eliminarea suspiciunii de contaminare a probei primare cu ADN matern. Rezultatul testarii genei DMD prin MLPA a fost negativ pentru deletia exonilor 30 – 44.
2.3. Discuții și concluzii
Detectia neinvaziva a fragmentelor ADN liber circulante in sangele matern ofera noi posibilitati de dezvoltare a medicinei prenatal, iar scopul acestui studiu a fost sa dezvolte o metoda de determinare timpurie a sexului genetic fetal in sarcini cu risc pentru boli legate de cromozomul X. Metoda propusa in aceasta lucrare este rapida, sigura si se poate realiza incepand cu a 9-a saptamana de sarcina, perioada in care determinarea ecografica nu este concludenta. Amplificarea celor doua secvente specifice cromozomului Y asigura obtinerea unui rezultat concludent. Reactia ce amplifica markerul DYS14 prezinta o sensibilitate mai mare comparativ cu cea pentru SRY, intrucat amplifica un marker prezent in copie multipla, insa cumulat, cei doi markeri demonstreaza o crestere a specificitatii testului. Avand in vedere faptul ca detectia fetusilor de sex feminin se stabileste in lipsa semnalelor pozitive pentru markerii cromozomului Y, deoarece nu s-a putut detecta pana in prezent un marker specific fetal, se recomanda emiterea cu precautie a rezultatelor pentru sarcini mai mici de 9 saptamani. De asemenea cantitatea mare de ADN matern face dificila selectia unui control intern al reactiei de extractie si amplificare a ADN de origine fetala. Desi includerea genei GAPDH nu ofera un control al prezentei ADN fetal in proba, se demonstreaza astfel eficienta reactiei de amplificare.
Un alt aspect important al metodei propuse este utilizarea electroforezei de rezolutie inalta cu o sensibilitate de 0,1ng/µl in produsul PCR nediluat.
Determinarea sexului genetic prin analiza plamei materne utilizand cele doua reactii pentru detectia DYS14 si SRY in combinatie cu secventa control GAPDH este caracterizat de acuratete si rapiditate. Modelul de interpretare bazat pe punctajul cumulat din analiza in triplicat a celor doi markeri exclude rezultatele fals-negative si fals-pozitive.
Rezultatele obtinute in acest studiu confirma acuratetea testului si concluzionam ca se poate implementa ca metoda de screening pentru sarcinile cu risc pentru anomaliile legate de cromozomul X, putand elimina aproximativ 50% din procedurile invazive inutile. Aplicarea metodei in doua cazuri concrete in care gravidele erau purtatoare de mutatii in gena DMD, a reprezentat un prim pas in imbunatatirea managementului bolilor legate de cromozomul X in sistemul medical din Romania.
CONCLUZIILE TEZEI
Obiectivele propuse in cadrul acestei lucrari au fost indeplinite prin cercetarile intreprinse si au condus la urmatoarele rezultate originale:
1. Aplicarea metodei QF-PCR in domeniul diagnosticului prental a evidentiat mai multe avantaje tehnice fata de cariotipul fetal si tehnicia FISH precum cantitate mica de produs fetal analizat, procesare facila, obtinerea unui rezultat in maximum 6 ore de la receptia probei si capacitatea de detectie a contaminarii profilului genetic fetal cu ADN matern si a mozaicismelor cromozomiale. Acestea, cumultate cu aspectul psihologic favorabil de reducere a anxietatii gravidei prin rapiditatea dignosticului prin QF-PCR, recomanda aceasta metoda ca fiind una dintre cele mai performante tehnici de biologie moleculara utilizate in diagnosticul prenatal.
2. Prin efectuarea studiului comparativ intre tehnica QF-PCR si tehnica citogenetica standard (cariotip) pentru lotul de 1630 de probe s-a evidentiat acuratetea inalta a metodei QF-PCR pentru detectia rapida a aneuploidiilor cromozomilor 13, 18, 21, X si Y. De asemenea, analiza markerilor STR are capacitatea de a evalua originea anomaliei genetice cu importanta deosebita in vederea formularii sfatului genetic.
3. Avand in vedere ca mai mult de 90% dintre gravidele care efectueaza analize de diagnostic prenatal invaziv sunt incadrate in categoria de sarcina cu risc crescut pentru trisomia 21 si 18 la testele biochimice de screening prenatal din primul si cel de-al doilea trimestru de sarcina, evaluarea rezultatelor obtinute prin QF-PCR pentru cele 3552 de cazuri incluse in acest studiu, a confirmat capacitatea acestei analize de a inlocui cu succes cariotipul fetal in sarcini atent monitorizate.
4. Cercetarile privind posibilitatea introducerii unor tehnici de biologie moleculara in domeniul diagnosticului prenatal neinvaziv au confirmat faptul ca aceste determinari asupra genotipului fetal sunt fezabile pentru diagnostic si sigure pentru sanatatea fatului si a mamei. De asemenea, abordarea neinvaziva a diagnosticului prenatal a fost introdusa in sistemul sanitar din Romania datorita avantajelor oferite:
determinarea genotipului RHD fetal prin analiza sangelui matern a fost implementata cu succes in sistemul medical din Romania in vederea optimizarii managementului incompatibilitatii materno-fetale de Rh; prin aplicarea acestei analize s-a putut elimina imunizarea inutila a gravidelor Rh negative cu fetusi Rh negativ, si de asemenea, a determinarilor periodice de verificare a aparitiei anticorpilor anti-D.
determinarea sexului genetic fetal prin analiza sangelui matern a fost implementata cu succes ca metoda de screening timpuriu in cazul sarcinilor cu risc pentru distrofiile musculare Duchenne si Becker; aceasta metoda poate fi aplicata si pentru alte anomalii legate de cromozomul X, putand astfel elimina aproximativ 50% din procedurile invazive de determinare a sexului genetic fetal.
BIBLIOGRAFIE
Aitken David A, Crossley Jennifer A, Spencer Kevin, Prenatal screening for neural tube defects and aneuploidy, in Emery and Rimoin's Principles and Practices of Medical Genetics, Harcourt Publishers Limited, editia 4, vol 2, 2002
Akolekar Ranjit, Farkas Daniel H., VanAgtmael Anna L., et al., Fetal sex determination using circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) at 11 to 13 weeks of gestation, Prenat Diagn; 30: 918-923, 2010
Antonarakis Stylianos E., Petersen Michael B., McInnis Melvin G., et al., The Meiotic Stage of Nondisjunction in Trisomy 21: Determination by Using DNA Polymorphisms, Am. J. Hum. Genet. 50:544-550, 1992
Arraut A, Tran SH, Caughey AB., Erythrocyte Alloimmunization and Pregnancy, Medscape, 2011
Avent ND, RHD genotyping from maternal plasma: guidelines and technical challenges. Methods Mol Biol.:185-201, 2008
Avent ND, Reid ME., The Rh blood group system: a review. Blood, 95: 375-387, 2000
Babochkina, T., S. Mergenthaler, G De Napoli, et al., Numerous erytroblasts in maternal blood are imprevious to fluorescent in situ hybridization analysis, a feature related to a dense compact nucleus with apoptotic character, Haematologica, 90: 740-745; 2005a
Babochkina, T., S. Mergenthaler, T. M. Dinges, et al., Direct detection of fetal cells in maternal blood: a reappraisal using a combination of two different Y chromosome-specific FISH probes and a single X chromosome-specific probe, Arch. Gynecol Obstet. 1-4, 2005b
Badila M., Ofiteru A., Savu L., et al., Detection of trisomy 21 by quantitative fluorescence polymerase chain reaction, BJMG: vol 7, Number 1&2, 2004
Beheshti Ben, Park Paul C., Braude Ilan, et al., Microarray CGH, From: Methods in Molecular Biology, Vol. 204: Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications Edited by: Y. S. Fan © Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2002
Bembea Marius, Covic Mircea, Pop Victor, et al., Transmiterea informatiei ereditare, 2011 in Genetica medicala editia a II-a, Polirom,p179-239, 2011
Best Start: Ontario’s Maternal, Newborn and Early Child Development Resource Centre and the Halton Region Health Department, REFLECTING ON THE TREND:Pregnancy After Age 35, 2007
Bianchi, DW, Flint AF, Pizzimenti MF et al., Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A 87:3279-3283, 1990
Bianchi DW, Prenatal diagnosis by analysis of fetal cells in maternal blood. J Pediatr. Dec;127(6):847–856, 1995
Bianchi, D.W., Zickwolf, G.K., Weil, et al., Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 705-708, 1996
Bianchi DW, Circulating Fetal DNA: Its Origin and Diagnostic Potential-A Review Placenta, 25, Supplement A, Trophoblast Research, Vol. 18, S93-S101, 2004
Bianchi DW, Simpson JL, Jackson LG, et al., Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study. Prenat Diagn. Jul; 22(7):609-15, 2002
Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, et al., Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing, MatErnal Blood IS Source to Accurately diagnose fetal aneuploidy (MELISSA) Study Group. Obstet Gynecol; 119:890-901, 2012
Bianchi, D.W., Williams, J.M., Sullivan, et al., PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies. Am. J. Hum. Genet., 61, 822-829, 1997
Bianco B, Lipay M.V., Guedes A.D., et al., Clinical implications of the detection of Y-chromosome mosaicism in Turner’s syndrome: report of 3 cases. Fertility and Sterility, 90(4), 2008
Birch Lyndsey, English Claire A., O’Donoghue Keelin, et al., Accurate and Robust Quantification of Circulating Fetal and Total DNA in Maternal Plasma from 5 to 41 Weeks of Gestation, Clinical Chemistry 51:2, 312-320, 2005
Bischoff FZ, Sinacori MK, Dang DD, et al., Cell-free fetal DNA and intact fetal cells in maternal blood circulation: implications for first and second trimester non-invasive prenatal diagnosis. Hum Reprod Update. 8(6):493-500, 2002
Bina Minou, Identification and Mapping of Paralogous Genes on a Known Genomic DNA Sequences in Methods in Molecular Biology, Gene Mapping, Discovery, and Expression: Methods and Protocols, edited by Minou Bina, Humana Press Inc, Totowa, NJ, vol. 338, 2006
Boland Reed, Katzive Laura, Developments in Laws on Induced Abortion: 1998–2007, International Family Planning Perspectives, 34(3):110-120, 2008
Bombard AT, Akolekar R, Farkas DH, et al., Fetal RHD genotype detection from circulating cell-free fetal DNA in maternal plasma in non-sensitized RhD negative women. Prenat Diagn; 31(8):802-8, 2011
Bon M.A.M., van Oeveren-Dybicz A., van den Bergh F.A.J.T.M, Genotyping of HLA-B27 by Real-Time PCR without Hybridization Probes, Clinical Chemistry 46, No. 7, 2000
Bugert P., Lese A., Meckies J., et al., Optimized sensitivity of allele-specific PCR for prenatal typing of human platelet alloantigen single nucleotide polymorphisms. BioTechniques 35:170-174, 2003
Bui The-Hung, SYNDROME: AN APPROACH TO FETAL DYSMORPHOLOGY in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.57-62, 2006
Bustamante-Aragonés Ana, Rodríguez de Alba Marta, Perlado Sara, et al., Non-invasive prenatal diagnosis of single-gene disorders from maternal blood, Gene 504, 144–149, 2012
Bustamante-Aragones A, Gallego-Merlo J, Trujillo-Tiebas MJ, et al., New strategy for the prenatal detection/exclusion of paternal cystic fibrosis mutations in maternal plasma. J Cyst Fibros., 7(6):505-10, 2008
Butler John M., FORENSIC DNA TYPING: BIOLOGY, TECHNOLOGY, AND GENETICS OF STR MARKERS, Second edition, Elsevier, 2005
Brent Robert L., Fawcett Lynda, Beckman David A., Principles of teratology in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p. 79-112, 2006
Bruyère Hélène, Rajcan-Separovic Evica, Kalousek Dagmar K., Molecular Cytogenetics in Reproductive Pathology From: Methods in Molecular Biology, Vol. 204: Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications Edited by: Y. S. Fan© Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2002
Chan K.C.A., Zhang J, Hui A B.Y., et al., Size Distributions of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma. Clinical Chemistry 50:1, 88-92, 2004
Chan KC Allen, Ding Chunming, Gerovassili Ageliki, et al., Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis, Clinical Chemistry, 52(12):2211-8, 2006
Chen Eric Z., Chiu Rossa W. K., Sun Hao, et al., Noninvasive Prenatal Diagnosis of Fetal Trisomy 18 and Trisomy 13 by Maternal Plasma DNA Sequencing, PLoS ONE 6(7), 2011
Chiu Rossa W K, Akolekar Ranjit, Zheng Yama W L, et al., Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study, BMJ;342:c7401, 2011
Chiu Rossa W. K., Chan K. C. Allen, Gao Yuan, et al., Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma, PNAS, vol. 105, no. 51, 2008
Ciuchea Adriana, Badea Doina, TRICÃ Stefan, et al., ROMANIA IN FIGURES 2011, Population,pg.10, NATIONAL INSTITUTE OF STATISTICS, 2011
Cleary-Goldman Jane, Malone Fergal D., Vidaver John, et al., Impact of Maternal Age on Obstetric Outcome, The American College of Obstetricians and Gynecologists, vol. 105, no. 5, part 1, 2005
Cirigliano V., Voglino G., Canadas M.P., et al., Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR. Assessment on 18 000 consecutive clinical samples. Mol. Hum. Reprod, 10(11): 839-846, 2004
Cirigliano V, Lewin P, Szpiro-Tapies S, et al., Assessment of new markers for the rapid prenatal detection of aneuploidies by quantitative fluorescent PCR (QF-PCR). Ann Hum Genet 65, 421-427, 2001a
Cirigliano V, Ejarque M, Canadas MP, et al., Clinical application of multiplex quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) for the rapid prenatal detection of common chromosome aneuploidies. Mol Hum Reprod 7, 1001-1006, 2001b
Cirigliano V, Ejarque M, Fuster C and Adinolfi M, X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies. Mol Hum Reprod 8, 1042-1045, 2002
Cirigliano V, Voglino G, Ordoñez E, Marongiu A, Cañadas M P, Ejarque M, Rueda L, Lloveras E, Fuster C, Adinolfi M – Rapid prenatal diagnosis of common Chromosome aneuploidies by QF-PCR, results of 9 years of clinical experience. Prenat Diagn; 29: 40-49, 2009
Colegiul Medicilor din România, Conduita în sarcina cu incompatibilitate în sistem RH / Societatea de Obstetrica si Ginecologie din România, Comisia de Obstetrica si Ginecologie, Ministerul Sanatatii Publice. Comisia Consultativa de Obstetrica si Ginecologie. Buzau: Alpha MDN, Bibliogr.ISBN 978-973-139-004-8, 2007
Covic Mircea, Bembea Marius, Popovici Cornel, et al., Consultul si sfatul genetic, in Genetica medicala editia a II-a, Polirom, p345-381, 2011
Cuckle Howard S., Arbuzova Svetlana, Epidemiology of aneuploidy in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.19-32, 2006
Daniels G, Finning K, Martin P, et al., Fetal RhD genotyping: a more efficient use of anti-D immunoglobulin. Transfus Clin Biol; 14(6): 568-71, 2007
Daniels G, Finning K, Martin P, et al., Noninvasive prenatal diagnosis of fetal blood group phenotypes: current practice and future prospects. Prenat Diagn., 29(2):101-7, 2009
Daniely M., Aviram-Goldring A., Barkai G. et al., Detection of chromosomal aberration in fetuses arising from recurrent spontaneous abortion by comparative genomic hybridization, Human Reproduction vol.13 no.4 pp.805-809, 1998
Davalieva K, Dimcev P, Efremov GD, et al., Non-invasive fetal sex determination using real-time PCR. The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine; 19(6): 337-342, 2006
Dávila-Rodríguez M.I., Gutiérrez E.I. Cortés, Flores R.M. Cerda, et al., Constitutive heterochromatin polymorphisms in human chromosomes identified by whole comparative genomic hybridization, European Journal of Histochemistry; volume 55:e28, 2011
De Alba M. Rodríguez, Palomino P, Jurado A, et al., Prenatal diagnosis on fetal cells obtained from maternal peripheral blood: report of 66 cases, Prenat Diagn. 19(10):934-40, 1999
Deutsch S., Choudhury U., Merla G., et al., Detection of aneuploidies by paralogous sequence quantification. J Med Genet, 41:908-915, 2004
Devaney SA, Palomaki GE, Scott JA, et al., Noninvasive Fetal Sex Determination Using Cell-Free Fetal DNA: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA; 306 (6): 627-636, 2011
Diego-Alvarez Dan, Garcia-Hoyos Maria, Trujillo Maria Jose, et al., Application of quantitative fluorescent PCR with short tandem repeat markers to the study of aneuploidies in spontaneous miscarriages, Human Reproduction Vol.20, No.5 pp. 1235-1243, 2005
Dickinson Jan E., Gonik Bernard, Viral agents and reproductive risks, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p154-168, 2006
Dierssen M, Herault Y, Estivill X, Aneuploidy: From a Physiological Mechanism of Variance to Down Syndrome, Physiol.Rev.89:887-920, 2009
DiMaio Miriam S., Fox Joyce E., Mahone Maurice J. Prenatal Diagnosis: Cases and Clinical Challenges, John Wiley & Sons, 2010
Douglas GW, Thomas L, Carr M, et al. Trophoblasts in the circulating blood during pregnancy. Am J Obstet Gynecol.;58:960-973, 1959
Donnenfeld Alan E., Lamb Allen N., Cytogenetics and molecular cytogenetics, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division,p473-484, 2006
Dokras A, Gardner LM, Kirschmann DA, et al., The tumour suppressor gene maspin is differentially regulated in cytotrophoblasts during human placental development. Placenta. 23(4):274-80, 2002
Donaghue C, Mann K, Docherty Z et al. Detection of mosaicism for primary trisomy in prenatal samples by QF-PCR and karyotype analysis. Prenat Diagn; 25(1): 65-72, 2005
Dragomir Cristina, Stan Adriana, Stefanescu Dragos T., et.al., Prenatal Screening for the 35delG GJB2, Del (GJB6-D13S1830) and Del (GJB6-D13S1854) Mutations in Romanian Population, Genet Test Mol Biomarkers;15(11):749-53. Epub 2011
Drugan Arie, Principles of “CLASSIC” genetics, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.3-18, 2006
Drugan Arie, Evans Mark I., Amniocentesis, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division,c34, p415-422, 2006
Dubey S., Chowdhury M. R., Prahlad B., et al., Cytogenetic causes for recurrent spontaneous abortions – an experience of 742 couples (1484 cases), Indian Journal of Human Genetics, Volume 11, Issue 2, 2005
Elias Sherman, Leigh Simpson Joe, Shiman P. Lee, Techniques for prenatal diagnosis, Harcourt Publishers Limited, in Emery and Rimoin's Principles and Practices of Medical Genetics, editia 4, vol 2, 2002
Evangelidou Paola, Sismani Carolina, Ioannides Marios, et al., Clinical application of whole-genome array CGH during prenatal diagnosis: Study of 25 selected pregnancies with abnormal ultrasound findings or apparently balanced structural aberrations, Molecular Cytogenetics, 3:24 doi:10.1186/1755-8166-3-24, 2010
Evans MI, Galen S. Robert, Drugan Arie – BIOCHEMICAL SCREENING in prenatal, in Prenatal Diagnosis, The McGraw-Hill Companies, pp. 433-442, 2006
Evans MI, Rosner Guy, Yaron Yuval et al., Chorionic Villus sampling, Copyright © by The McGraw-Hill Companies DOI: 10.1036/0838576826, pp.433- Prenatal Diagnosis, 2006
Faas BH, Beuling EA, Christiaens GC, et al., Detection of fetal RHD specific sequences in maternal plasma, Lancet. 352:1196, 1998
Fan H. Christina, Blumenfeld J. Yair, Chitkara Usha, et al., Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood, PNAS, 2008
Fan H. Christina, Quake R. Stephen, Sensitivity of Noninvasive Prenatal Detection of Fetal Aneuploidy from Maternal Plasma Using Shotgun Sequencing Is Limited Only by Counting Statistics, PLoS ONE 5(5):e10439, 2010
Fan H. Christina, Gu Wei, Wang Jianbin, et al., Non-invasive prenatal measurement of the fetal genome,Journal name: Nature, YeaDOI:doi:10.1038, nature11251, 2012
Fan Yao-Shan, Molecular Cytogenetics in Medicine, An Overview, Edited by: Y. S. Fan, Humana Press Inc., Totowa, NJ, Methods in Molecular Biology, Vol. 204: Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, 2002
Farina A., Caramelli E., Concu M., et al., Testing normality of fetal DNA concentration in maternal plasma at 10±12 completed weeks' gestation: a preliminary approach to a new marker for genetic screening, Prenat. Diagn., 22, 148-152, 2002
Flegel WA, The genetics of the Rhesus blood group system, Blood Transfus, 5: 50-57, 2007
Freeman K, Szczepura A, Osipenko L. Non-invasive fetal RHD genotyping tests: a systematic review of the quality of reporting of diagnostic accuracy in published studies. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. Feb;142(2):91-8. 2009; Epub 2008
Ganshirt-Ahlert, Pohlschmidt D. M., Gal, P. A., et al., Ratio of fetal to maternal DNA is less than 5000 at different gestational ages in maternal blood, Clin. Genet., 38:38-43, 1990
Ganshirt-Ahlert, Smeets D., Dohr F.W., et al., Enrichment of fetal nucleated red blood cells from the maternal circulation for prenatal diagnosis: experiences with triple density gradient and MACS based on more than 600 cases, Fetal Diagn. Ther., 13, 276-286, 1998
Gorduza V., popovici C., Scrypnick C. et al., Bolile cromozomiale in Genetica medicala editia a II-a, Polirom,p. 384-415, 2011
Gurewitsch Edith D., Chervenak A. Frank, OVERVIEW OF THE COMPREHENSIVE ULTRASOUND EXAMINATION: AN APPROACH TO DIAGNOSIS AND MANAGEMENT OF FETAL ANOMALIES, in Prenatal diagnosis, 2006
Gadji Macoura, Kada Krabchi, Ju Yan, Règen Drouin, Application of Multi-PRINS to Simultaneously Identify Chromosomes 18, X, and Y in Prenatal Diagnosis, in Prenatal, Methods in molecular biology, vol. 444, Humana press, pp. 49-58, 2008
Hahn Sinhue, Holzgreve Wolfgang, PRENATAL DIAGNOSIS USING FETAL CELLS FROM MATERNAL BLOOD, Copyright © by The McGraw-Hill Companies DOI: 10.1036/0838576826, cap.45, pp.505- Prenatal Diagnosis, 2006
Henderson G. Karen, Shaw E. Tracey, Barrett J. Irene, et al., Distribution of mosaicism in human placentae, Hum Genet., 97:650-654, 1996
Hills A, Donaghue C, Waters J, et al., QF-PCR as a stand-alone test for prenatal samples: the first 2 years' experience in the London region. Prenat Diagn. 30(6):509-17. 2010
Herzenberg LA, Bianchi DW, Schroder J, et al., Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichment by fluorescenceactivated cell sorting, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,76:1453–1455, 1979
Holzgreve W, Garritsen HS, Ganshirt Ahlert D., Fetal cells in the maternal circulation, J Reprod Med., 37:410-418,1992
Hong Y., Zhou Y.-W., Tao J., et al., Do polymorphic variants of chromosomes affect the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer treatment?, Human Reproduction, Vol.0, No.0 pp.1-8, 2011
Hromadnikova Ilona, Vechetova Lenka, Vesela Klara, et al., Non-invasive Fetal RHD and RHCE Genotyping Using Real-time PCR Testing of Maternal Plasma in RhD-negative Pregnancies, Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Volume 53(3): 301-305, 2005
Huang Dorothy J., Nelson Matthew R., Zimmermann Bernhard et al., Reliable detection of Trisomy 21 using MALDI-TOF mass spectrometry, Genetics in Medicine, vol. 8, no.11, 728-734, 2006
Huang Dorothy J., Matthew R. Nelson, Wolfgang Holzgreve, MALDI-TOF mass spectrometry for trisomy detection, in Methods in molecular biology, vol. 444, Humana press, 2008
Hulten A. Maj, Dhanjal Seema, Pertl Barbara, Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF–PCR, Reproduction, 126, 279-297 Review, 2003
Jiang Fuman, Ren Jinghui, Chen Fang, Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies, BMC Medical Genomics, 5:57 doi:10.1186/1755-8794-5-57, 2012
Johnson Jo-Ann, Tough Suzanne, Wilson R. Douglas, et al., Delayed Child-Bearing, J Obstet Gynaecol Can 34(1):80–93, 2012
Johnson KL, Dukes KA, Vidaver J, et al., Interlaboratory comparison of fetal male DNA detection from common maternal plasma samples by real-time PCR, Clin Chem. 50(3):516-21, 2004
Kalousek Dagmar K, Michel Vekemans, Confined placental mosaicism, JMed Genet; 33:529-533, 1996
Kao Li-Gi, Tsai Li-Chin, Chun-I Lee James, et al., Controversial cases of human gender identification by amelogenin test, Forensic Science Journal 6 (2): 69-71, 2007
Kanavakis E., Traeger-Synodinos J., Vrettou C., et al., Prenatal diagnosis of the thalassaemia syndromes by rapid DNA analytical methods, Molecular Human Reproduction, Vol.3 no.6, pp.523-528, 1997
Kashork D. Catherine Theisen A., Shaffer LG., et al., Prenatal diagnosis using array CGH, Methods Mol Biol. 2008;444:59-69, 2008
Kearney Hutton M., Erik C. Thorland, Kerry K et al., American College of Medical Genetics standards and guidelines for interpretation and reporting of postnatal constitutional copy number variants, Genetics In Medicine, 2011
Khoury J. Muin, Beaty H. Terri, Cohen H. Bernice, Fundamentals of Genetic Epidemiology, Oxford University Press, p. 383, Vol. 22, 1993
King A. Richard, Rotter I. Jerome, Motulsky G. Arno, The Genetic Basis of Common Diseases, Oxford University Press, 2002
Kondo Yuko, Tsukishiro Sami, Tanemura Mitsuyo, et al., Maternal uniparental disomy of chromosome a case of spontaneous abortion, J Hum Genet 49:177-181, 2004
Lau TW, Leung TN, Chan LYS, et al., Fetal DNA Clearance from Maternal Plasma Is Impaired in Preeclampsia, Clinical Chemistry 48:12, 2141-2146, 2002
Legler TJ, Liu Z, Mavrou A, et al., Workshop report on the extraction of fetal DNA from maternal plasma, Prenat Diagn., 27(9):824-9, 2007
Li Y, Di Naro E, Vitucci A, et al., Size fractionation of cell-free DNA in maternal plasma improves the detection of a paternally inherited β-thalassemia point mutation by MALDI-TOF mass spectrometry, Fetal Diagn Ther, 25:246-249, 2009
Li Y, Page-Christiaens GC, Gille JJ,et al., Non-invasive prenatal detection of achondroplasia in size-fractionated cell-free DNA by MALDI-TOF MS assay, Prenat Diagn., 27(1):11-7, 2007
Li Ying, Bernhard Zimmerman, Corinne Rusterholz, et al., Size Separation of Circulatory DNA in Maternal Plasma Permits Ready Detection of Fetal DNA Polymorphisms, Clinical Chemistry 50, No. 6, 2004
Liao J. W. Gary, Allen Chan K. C., Jiang Peiyong, et al., Noninvasive Prenatal Diagnosis of Fetal Trisomy 21 by Allelic Ratio Analysis Using Targeted Massively Parallel Sequencing of Maternal Plasma DNA, PLoS ONE 7(5): e38154. doi:10.1371/journal.pone.0038154, 2012
Lichtenbelt KD, Knoers NV, Schuring-Blom GH, From karyotyping to array-CGH in prenatal diagnosis, Cytogenet Genome Res. 135(3-4):241-50, Epub: 2011
Lo Y.M., Corbetta N., Chamberlain P.F., Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum, Lancet., 350(9076):485-487, 1997
Lo Y.M., Non-invasive prenatal diagnosis using fetal cells in maternal blood, J Clin Pathol. 47(12): 1060-1065. PMCID: PMC502193, 1994
Lo Y.M., M.R.C.P., Hjelm N. Magnus, Path. F.R.C., Fidler Carrie, Ph.D., et al., Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma, N Engl J Med, 1998;339:1734-1738, 1998
Lo Y.M., Recent advances in fetal nucleic acids in maternal plasma, J Histochem Cytochem, 53(3):293-6, 2005
Lo Y.M., Lun F.M., Chan K.C., et al., Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy, Proc Natl Acad Sci U.S.A., 104(32):13116-21, 2007
Lo Y.M., Tein M.S.C., Lau T.K., et al., Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis, Am J Hum Genet., 62:768–775, 1998
Lo Y.M., Zhang J, Leung T.N., et al., Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma, Am J Hum Genet., 64:218–224, 1999a
Lo Y.M., Lau T.K., Zhang J., Leung, et al., Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying fetuses with trisomy 21, Clin. Chem., 45, 1747-1751, 1999b
Luthardt W. Frederick, Keitges Elisabeth, Chromosomal Syndromes and Genetic Disease, Nature Publishing Group, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES, www.els.net, 2001
Maddocks DG, Alberry MS, Attilakos G, et al., The SAFE project: towards non-invasive prenatal diagnosis, Biochem Soc Trans. 37(Pt 2): 460-5, 2009
Madon PF, Athalye AS, Parikh FR., Polymorphic variants on chromosome probably play a significant role in infertility, Reprod Biomed Online 2005; 11:726-32, 2005
Mann K, Fox SP, Abbs SJ, et al., Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis, Lancet 358, 1057–1061, 2001
Mann K., Donaghue C., Ogilvie C.M., In vivo somatic microsatellite mutations identified in non-malignant human tissue, Hum Genet, 114 : 110–114, 2003
Mann K, Donaghue C, Fox S P, Docherty Z, Ogilvie C M , Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy. European J. of Hum. Genet. 1-9, 2004
Mann K., Petek E., Pertl B., Prenatal Detection of Chromosome Aneuploidy by Quantitative Fluorescence PCR in Prenatal Diagnosis, Methods in Molecular Biology, 444:71- 93, 2008
Mansfield E.S., Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms, Hum Mol Genet, 2:43–50, 1993
Martinhago CD, de Oliveira RM, Tomitão Canas Mdo C,et al., Accuracy of fetal gender determination in maternal plasma at 5 and 6 weeks of pregnancy, Prenat Diagn. 2006; 26(13):1219-23, 2006
Mathew T.J., Hamilton E. Brady, Delayed Childbearing: More Women Are Having Their First Child Later in Life, National Center for Health Statistics, NCHS Data Brief, No. 21, 2009
Mattison R. Donald, CHARACTERIZING THE EFFECT OF ENVIRONMENTAL AND OCCUPATIONAL EXPOSURES ON REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.131-147, 2006
Mattocks J Christopher, Morris A Michael, Matthijs Gert, et al., A standardized framework for the validation and verification of clinical molecular genetic tests, European Journal of Human Genetics, 1–13, 2010
Mergenthaler-Gatfield Susanne, Wolfgang Holzgreve and Sinuhe Hahn Spectral Karyotyping (SKY): Applications in prenatal diagnostics, in Methods in molecular biology, vol. 444, Humana press, 2008
Michaels Heather Shane, Nazareth B. Shivani, Tambini Lorien, PRENATAL GENETIC COUNSELING, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.71-78, 2006
Mihaescu G, Imunologie si imunochimie, Editura Universitatii din Bucuresti, p456, Bibliogr. ISBN 973-575-556-4, 2001
Mujezinovic F., Alfirevic Z., Procedure-related complications of amniocentesis and chorionic villous sampling: a systematic review, Obstet Gynecol 2007;110:687–694, 2007
Nanu Dimitrie, Marinescu Bogdan, Matei Dumitru, et al., Esentialul in Obstetrica: pentru studenti si medici rezidenti obstetrica-ginecologie, Ed. Medicala Amaltea Bucuresti, 2008
Nicolaides H. Kypros, Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks REVIEW, Prenat Diagn 2011; 31: 7–15, 2011
Nicolaides H. Kypros, Nuchal translucency and other first-trimester sonographic markers of chromosomal abnormalities, American Journal of Obstetrics and Gynecology, 191, 45e67, 2004
Nicolini U, Lalatta F, Natacci F, et al., The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Hum. reprod. Updat. 10(6): 541-548, 2004
Ng E.K.O, Tsui N.B.Y, Lau T.K, et al., mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2003;100: 4748-4753, 2003
Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F., Thompson M.W., Thompson & Thompson Genetics in Medicine, p.1400, 2004
Opstal D.V., Boter M., Jong D., et al., Rapid aneuploidy detection with multiplex ligation-dependent probe amplification: a prospective study of 4000 amniotic fluid samples, Eur J Hum Genet., 17(1): 112–121, 2008
Oosterwijk J. C., Knepflé C F, Mesker W E,et al., Strategies for rare-event detection: an approach for automated fetal cell detection in maternal blood, Am J Hum Genet, 63(6): 1783–1792, PMCID: PMC1377651, 1998
Otto Paul, MagneSilTM Paramagnetic Particles: Magnetics for DNA Purification, Journal of Laboratory Automation, 7: 34, 2002
Palomaki E. Glenn, Kloza M. Edward, Lambert-Messerlian M. Geralyn, et al., DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study, Genetics In Medicine, Vol. 13, Nr. 11, 2011
Palomaki E. Glenn, Deciu Cosmin, Kloza M. Edward, et al., DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study, Genet Med 2012:14(3):296–305, 2012
Papageorgiou EA, Karagrigoriou A, Tsaliki E, et al., Fetal-specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21. Nat Med 2011;17:510-3, 2011
Papasavva T, Kalikas I, Kyrri A, et al., Arrayed primer extension for the noninvasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia based on detection of single nucleotide polymorphisms, An n N Y Acad Sci., 1137:302-8, 2008
Pertl B, Yau SC, Sherlock J, et al., Rapid molecular method for prenatal detection of Down’s syndrome. Lancet 343, 1197-1198, 1994
Pertl B, Weitgasser U, Kopp S, et al. Rapid detection of trisomies 21 and 18 and sexing by quantitative fluorescent multiplex PCR. Hum Genet, 98, 55-59, 1996
Pertl B, Kopp S, Kroisel PM, et al., Rapid detection of chromosome aneuploidies by quantitative fluorescence PCR: first application on 247 chorionic villus samples. J Med Genet 36, 300-303, 1999a
Pertl B, Pieber D, Lercher-Hartlieb A, Orescovic et al., Rapid prenatal diagnosis of aneuploidy by quantitative fluorescent PCR on fetal samples from mothers at high risk for chromosome disorders. Mol Hum Reprod 5,1176-1179, 1999b
Price, J. O., Elias S., Wachtel S. S., et al., Prenatal diagnosis with fetal cells isolated from maternal blood by multiparameter flow cytometry, Am. J. Obstet. Gynecol. 165:1731-1737, 1991
Poon L.M. Leo, Leung N. Tse, Lau K. Tze, et al., Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma, Clin Chem 48(1):35-41, PMID 11751536, 2002
Poon L.M. Leo, Leung N. Tse, Lau K. Tze, Presence of Fetal RNA in Maternal Plasma, Clinical Chemistry, vol. 46 no. 11 1832-1834, 2000
Popovici C., Stefanescu D., Mixitch F., et al., Profilaxia bolilor genetice in “Genetica Medicala- editia a II-a”, cap.19, 2011
PROFESSIONAL GUIDELINES FOR CLINICAL CYTOGENETICS PRENATAL DIAGNOSIS BEST PRACTICE GUIDELINES (2009) v1.00, 2009
PROFESSIONAL GUIDELINES FOR CLINICAL CYTOGENETICS AND CLINICAL MOLECULAR GENETICS, QF-PCR for the diagnosis of aneuplidy best practice guidelines, v2.01”, 2007
Rabinowitz M, Ryan A, Gemelos G, et al., Origins and rates of aneuploidy in human blastomeres, Fertil Steril., 97(2):395-401, 2011
Rijnders RJ, Van Der Luijt RB, Peters ED, Earliest gestational age for fetal sexing in cell-free maternal plasma, Prenat Diagn, 23: 1042-1104, 2003
RCOG Green-top Guideline No. 38, Royal College of Obstetricians and Gynaecologists – THE MANAGEMENT OF GESTATIONAL TROPHOBLASTIC DISEASE, 2010
Rouillac-LeSciellour C., V. Sérazin V., Y. Brossard Y., et al., Noninvasive fetal RHD genotyping from maternal plasma: Use of a new developed Free DNA Fetal Kit RhD®, Transfusion Clinique et Biologique, 14, 572-577, 2007
Rubio C., Simon C., Vidal F., et al., Chromosomal abnormalities and embryo development in recurrent miscarriage couples, Human Reproduction Vol.18, No.1 pp. 182-188, 2003
Sandovici I, Covic M, Stanescu H, Analiza structurii si functiei genelor, in Genetica Medicala, editia a II-a, capitolul 5, p152, Editura Polirom, 2011
Scheffer PG, van der Schoot CE, Page-Christiaens GCML, et al., Reliability of Fetal Sex Determination Using Maternal Plasma, Obstet Gynecol, 115, 1:117-126, 2010
Schmorl G, Pathologisch-anatomische Untersuchungen über Publereklampsie, Leipzig Vogel, 1893
Schouten P.J, Galjaard RJ., MLPA for prenatal diagnosis of commonly occurring aneuploidies, Methods Mol Biol., 444:111-22, 2008
Schouten P.J., McElgunn J. Cathal, Waaijer Raymond,et al., Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification, Nucleic Acids Res., 30(12): e57, 2002
Schwartz Stuart, Graf D. Michael, Microdeletion Syndromes Characteristics and Diagnosis, Edited by: Y. S. Fan © Humana Press Inc., Totowa, NJ, in Methods in Molecular Biology, Vol. 204: Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, 2002
Sepulveda Waldo, Be Cecilia, Schnapp Carlos, et al., Second-Trimester Sonographic Findings in Trisomy 22 – Report of 3 Cases and Review of the Literature, J Ultrasound Med, 22:1271-1275, 2003
Severin E., Stefanecsu D, Covic M, et al., Genetica populatiilor in Genetica medicala, editia a II-a, editura Polirom, p.300, 2011
Severin E., Albu C., Ioachim I., Genetica Umana: concepte si aplicatii practice, Bucuresti:Scripta, 2002
Shaffer G. Lisa, Bui The-Hung, Molecular cytogenetic and rapid aneuploidy detection methods in prenatal diagnosis, American Journal of Medical Genetics Part C (Seminars in Medical Genetics), 145C:87–98, 2007
Shahar Shay Ben, Orr-Urtreger Avi, Yaron Yuval, Chromosomal aberrations in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.41-50, 2006
Sharp Andrew J., Devin P. Locke, Sean D. McGrath et al., Segmental Duplications and Copy-Number Variation in the Human Genome, Am. J. Hum. Genet. 77:78–88, 78, 2005
Shaw-Smith C, Redon R , Rickman L ,et al., Microarray based comparative genomic hybridization (array-CGH) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features, J Med Genet 2004;41:241–248, 2004
Shi S-R, Cote RJ, Wu L, et al., DNA Extraction from Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Principle: Heating Under the Influence of pH, J. Histoche. Cytoche., 50: 1005-1011, 2002
Snijders Rosalinde, Nicolaides Kypros, First trimester diagnosis of chromosomal defects, Fetal Medicine Foundation, London, in The 11–13+6 weeks scan, 2004
Sobotka Tomáš, Postponement of Childbearing and Low Fertility in Europe, Dutch University Press, ISBN 90 3619 102 5, NUR 740, 2004
Sparks B. Andrew, Struble A. Craig, Wang T. Eric, et al., Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18, Am J Obstet Gynecol 206:319.e1-9, 2012a
Sparks B. Andrew, Struble A. Craig, Wang T. Eric, et al., Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy, Prenatal Diagnosis, 32, 3–9, 2012b
Spencer K, de Kok JB, Swinkels DW, Increased total cell-free DNA in the serum of pregnant women carrying a fetus affected by trisomy 21, Prenat Diagn., 23(7):580-3, 2003
Steele MW, Breg WR, Chromosome analysis of human amniotic-fluid cells, Lancet, 1(7434);383-5, 1966
Stephenson Patricia, Wagner Marsden, Badea Mihaela et al., Commentary: The Public Health Consequences of Restricted Induced Abortion- Lessons from Romania, American Journal of Public Health, Vol. 82, No. 10, 1992
Stevenson E. Roger, Hall G. Judith, Human Malformations And Related Anomalies, Oxford University Press, 2006
Szczepura Ala, Osipenko Leeza, Freeman Karoline, A new fetal RHD genotyping test: Costs and benefits of mass testing to target antenatal anti-D prophylaxis in England and Wales, BMC Pregnancy and Childbirth, 11:5, 2011
Traeger-Synodinos J, Vrettou C, Kanavakis E., Rapid detection of fetal Mendelian disorders: thalassemia and sickle cell syndromes, Methods Mol Biol., 444:133-45, 2008
Vorsanova G. Svetlana, Kolotii D. Alexei, Iourov Y. Ivan, et al., Evidence for High Frequency of Chromosomal Mosaicism in Spontaneous Abortions Revealed by Interphase FISH Analysis, Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Volume 53(3): 375–380, 2005
Walknowska, J., Conte F. A., Grumbach M. M., Practical and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer, Lancet 1:1119-1122, 1969
Waters, J. J., Mann, K., Grimsley, L., et al., Complete discrepancy between QF-PCR analysis of uncultured villi and karyotyping of cultured cells in the prenatal diagnosis of trisomy three CVS, Prenat Diagn, 27, 4, Wiley Online Library, 332-339, 2007
Weber C, Kovac C., BACTERIAL INFECTIONS AND PREGNANCY, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, pp.149-154, 2006
Weiner P. Carl, Cordocentesis, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, pp.443-447, 2006
Weise Anja, Thomas Liehr, Rapid Prenatal Aneuploidy Screening by Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) in Prenatal, Methods in molecular biology, vol. 444, Humana press, pp49-58, 2008
Wenzel Friedel, Bacterial and/or fungal contamination in Diagnostic Cytogenetics, Springer-Verlag berlin heidelberg, pp.33-36, 1999
Wiebe Ellen, Chalmers Amanda, Yager Holly, Delayed motherhood – Understanding the experiences of women older than age 33 who are having abortions but plan to become mothers later, Can Fam Physician., 58:e588-95, 2012
Wilson R. Douglas, Early amniocentesis: risk assessment, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p423-432, 2006
Winsor EJ, Silver MP, Theve R, et al., Maternal cell contamination in uncultured amniotic fluid, Prenat Diagn. 16(1):49-54., 1996
Wolsteholme J., An audit of trisomy man, Prenat Diagn., 2:109-21, 1995
Wright CF, Burton H, The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis, Hum Reprod Update., 15(1):139-51, 2009
Zimmermann B, El-Sheikhah A, Nicolaides K., Optimized real-time quantitative PCR measurement of male fetal DNA in maternal plasma, Clin Chem., 51(9):1598-604, 2005
Zimmermann Bernhard, Hill Matthew, Gemelos George,et al., Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci, Copyright© by The McGraw-Hill Companies, in Prenatal Diagnosis, Vol. 32, Issue 13, pp.1233–1241, 2012
Zhong, X.Y., Holzgreve, W. and Hahn, S., Detection of fetal Rhesus D and sex using fetal DNA from maternal plasma by multiplex polymerase chain reaction, Br. J. Obstet. Gynaecol., 107, 766-769, 2000
Zhong X. Y., Holzgreve W., Hahn S., Risk free simultaneous prenatal identification of fetal Rhesus D status and sex by multiplex real-time PCR using cell free fetal DNA in maternal plasma, Swiss Med Wkly 131:70-74, 2001
Zou Gang, Zhang Jing, Li W. Xing, et al., Quantitative fluorescent polymerase chain reaction to detect chromosomal anomalies in spontaneous abortion, International Journal of Gynecology & Obstetrics, Volume 103, Issue 3, pp.237-240, 2008
Lista lucrari publicate in domeniul tezei:
Reviste cotate ISI
ADRIANA STAN, Dragomir Cristina, Severin Emilia, Badila Madalina, Daniela Tudor, Iulian Rujan, Attila Ratiu, Ilinca Visanoiu, Stefanescu Dragos, Savu Lorand, Non-invasive fetal sex determination from maternal plasma: impact on Romanian clinical practice of X-linked disorders, Romanian Biotechnological Letters – in curs de publicare
ADRIANA STAN, Cristina Dragomir, Daniela Tudor, Lorand Savu, Emilia Severin, The utility of molecular techniques for better prenatal diagnosis services in Romania, Romanian Biotechnological Letters Vol.17, No.4, 2012, 2012
ADRIANA STAN, Dragomir Cristina, Tudor Daniela, Stefanescu T. Dragos, Severin Emilia and Savu Lorand, Sex Chromosomes Mosaicism Detection by Quantitative
Fluorescent PCR Based Technique, Volume 9, No. 2 (Serial No. 87), pp. 101–106, Journal of US-China Medical Science, ISSN 1548-6648, USA, Feb. 2012
Adrian C. Martin, D. Iliescu, S. Tudorache, A. Comanescu, M. Ioana, A. Cimpoeru, F. Mixich, P. Antsaklis, L. Novac, N. Cernea1, ADRIANA STAN, A. Antsaklis, Morphogenetic assessment of the fetus using ultrasound in the first trimester of Pregnancy. Can we save money and time? Gineco.ro Vol. 8 • No. 29, 3/2012
Adrian Toma, Crenguta Albu, Dinu F. Albu, ADRIANA STAN, Emilia Severin – The MedScape Journal of Medicine – Case of the Week; A Neonate with dysmorphic facial features; Case Study Submission – Fetal valproate syndrome or unknown epilepsy syndrome? www.medscape.com, 2010
Cristina Dragomir, ADRIANA STAN, Dragos T. Stefanescu, Lorand Savu, Emilia Severin, Prenatal Screening for the 35delG GJB2, Del (GJB6-D13S1830), and Del (GJB6-D13S1854) Mutations in Romanian Population, Genet Test Mol Biomarkers. 2011 Nov;15(11):749-53. Epub 2011 Aug 12.
Publicatii in reviste din Romania
Adriana Stan – Determinarea genotipului RHD fetal prin analiza ADN-ului fetal – Saptamana medicala, an VII, nr.144, pagina 6, 2011
Adriana Stan – Testarea prenatala – Saptamana medicala, an IV, nr.101, pagina 6, 2010
Adriana Stan – Diagnosticul prenatal rapid al trisomiilor cromozomilor 13, 18, 21 si al aneuploidiilor cromozomilor de sex prin tehnica QF-PCR – Supliment “Medicina de Laborator”, pagina 13, octombrie 2009
Adriana Stan – Diagnosticul prenatal rapid al trisomiilor cromozomilor 13, 18, 21 si al aneuploidiilor cromozomilor de sex prin tehnica QF-PCR – Supliment “Medicina de Laborator”, pagina 13, iunie 2009
Adriana Stan, Cristina Dragomir, Daniela Tudor, Simona Cazacu, L. Savu – Diagnosticul prenatal rapid al trisomiilor 13, 18, 21 si al aneuplidiilor cromozomilor de sex prin tehnica QF-PCR.” – Revista Română de Laborator Medical”, Anul IV, Nr. 15, Septembrie 2009
Lucrari stiintifice prezentate la conferinte internationale
Adriana Stan, Dragomir C., Savu L, Severin E. – The fetal RHD genotyping and gender determination from cell-free fetal DNA circulating in maternal blood – ICHG Montreal 2011 ASHG 61th Annual Meeting
Adriana Stan, C.Dragomir, E. Severin, L.Savu – The fetal RHD genotyping and gender determination from cell-free fetal DNA circulating in maternal blood – the non-invasive prenatal tests available in Romania – BJMG – Balkan Journal of Medical Genetics, International Journal of Medical Genetics Supplement, 9th BMHG, 2011
Adriana Stan, C.Dragomir, E. Severin, L.Savu – Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR technique in Romania – the report on2615 cases – BJMG – Balkan Journal of Medical Genetics, International Journal of Medical Genetics Supplement, 9th BMHG, 2011
Adriana Stan, C. Dragomir, E. Severin, L. Savu -The fetal RHD genotyping from cell-free fetal DNA circulating in maternal blood – The first non-invasive prenatal test in Romania – ESHG European Journal of Human Genetics, 2011
Adriana Stan, Cristina Dragomir, Emilia Severin, L.Savu – Determining the fetal gender and Rhesus D status by noninvasive prenatal method – a new approach in Romanian prenatal diagnosis field – Poster Presentation, ESHG 2010 – European Journal of Human Genetics, iunie 2010, Vol 18 S1, pag.153
Adriana Stan, C. Dragomir, E.Severin, L.Savu – Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR analysis on 700 cases, rezumat publicat in European Journal of Human Genetics, vol.17, supplement 2, pag.165, May 2009, ISSN: 1018-4813 – Poster Presentation, ESHG 2009, Viena
Lucrari prezentate la conferinte nationale
Adriana Stan, Daniela Tudor, Cristina Dragomir, Emilia Severin, Lorand Savu – "Detectia prenatala a aneuploidiilor cromozomilor 13, 15, 16, 18, 21, 22, X si Y prin metoda QF-PCR" – Simpozionul Institutului Babes 2010, noiembrie 2010
Adriana Stan, D.Tudor, C.Dragomir, E. Severin, L.Savu – DIAGNOSTICUL PRENATAL RAPID PRIN QF-PCR IN 2010 – Al III lea Congres National de Genetica Medicala, Timisoara, Romania, 2010
Adriana Stan, Daniela Tudor, Cristina Dragomir, Emilia Severin, Lorand Savu – DETECTIA PRENATALA A SEXULUI FETAL PRIN ANALIZA ADN-ULUI FETAL LIBER CIRCULANT IN SANGELE MATERN- Al III lea Congres National de Genetica Medicala, Timisoara, Romania, 2010
Adriana Stan, C. Dragomir, E.Severin – Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR analysis. Al 6-lea Simpozion National de Patologie “Patologie celulara si moleculara”, 2009, Bucuresti
Adriana Stan, Daniela Tudor, Cristina Dragomir, D.T. Stefanescu, L. Savu – Diagnosticul prenatal rapid prin QF-PCR. Conferinta Nationala de Genetica Medicala, 2009, Sibiu.
Adriana Stan, Cristina Dragomir, L. Savu – Genotiparea prenatala a genei RHD. Conferinta Nationala de Genetica Medicala, 2009, Sibiu.
Adriana Stan, C. Dragomir, D. Albu, D. Stefanescu, D.Tudor, C. Beldiman, E.Severin, L.Savu – QF-PCR a reliable method for rapid prenatal diagnosis. A IV Conferinta a Societatii Romane de Genetica Medicala, 2008, Craiova
Adriana Stan, C. Dragomir, D. Albu, D. Stefanescu, D.Tudor, C. Beldiman, E.Severin, L.Savu – A rare case of a 45, X0/47, XXY mosaicism detected by QF-PCR based technique. A IV Conferinta a Societatii Romane de Genetica Medicala, 2008, Craiova
Premii internationale:
ESHG 2011 conference fellowship holder – The fetal RHD genotyping from cell-free fetal DNA circulating in maternal blood – The first non-invasive prenatal test in Romania
Top 10 cases in 2010 – Adrian Toma, Crenguta Albu, Dinu F. Albu, Adriana Stan, Emilia Severin – The MedScape Journal of Medicine – Case of the Week; A Neonate with dysmorphic facial features; Case Study Submission – Fetal valproate syndrome or unknown epilepsy syndrome? www.medscape.com, 2010
BIBLIOGRAFIE
Aitken David A, Crossley Jennifer A, Spencer Kevin, Prenatal screening for neural tube defects and aneuploidy, in Emery and Rimoin's Principles and Practices of Medical Genetics, Harcourt Publishers Limited, editia 4, vol 2, 2002
Akolekar Ranjit, Farkas Daniel H., VanAgtmael Anna L., et al., Fetal sex determination using circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) at 11 to 13 weeks of gestation, Prenat Diagn; 30: 918-923, 2010
Antonarakis Stylianos E., Petersen Michael B., McInnis Melvin G., et al., The Meiotic Stage of Nondisjunction in Trisomy 21: Determination by Using DNA Polymorphisms, Am. J. Hum. Genet. 50:544-550, 1992
Arraut A, Tran SH, Caughey AB., Erythrocyte Alloimmunization and Pregnancy, Medscape, 2011
Avent ND, RHD genotyping from maternal plasma: guidelines and technical challenges. Methods Mol Biol.:185-201, 2008
Avent ND, Reid ME., The Rh blood group system: a review. Blood, 95: 375-387, 2000
Babochkina, T., S. Mergenthaler, G De Napoli, et al., Numerous erytroblasts in maternal blood are imprevious to fluorescent in situ hybridization analysis, a feature related to a dense compact nucleus with apoptotic character, Haematologica, 90: 740-745; 2005a
Babochkina, T., S. Mergenthaler, T. M. Dinges, et al., Direct detection of fetal cells in maternal blood: a reappraisal using a combination of two different Y chromosome-specific FISH probes and a single X chromosome-specific probe, Arch. Gynecol Obstet. 1-4, 2005b
Badila M., Ofiteru A., Savu L., et al., Detection of trisomy 21 by quantitative fluorescence polymerase chain reaction, BJMG: vol 7, Number 1&2, 2004
Beheshti Ben, Park Paul C., Braude Ilan, et al., Microarray CGH, From: Methods in Molecular Biology, Vol. 204: Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications Edited by: Y. S. Fan © Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2002
Bembea Marius, Covic Mircea, Pop Victor, et al., Transmiterea informatiei ereditare, 2011 in Genetica medicala editia a II-a, Polirom,p179-239, 2011
Best Start: Ontario’s Maternal, Newborn and Early Child Development Resource Centre and the Halton Region Health Department, REFLECTING ON THE TREND:Pregnancy After Age 35, 2007
Bianchi, DW, Flint AF, Pizzimenti MF et al., Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A 87:3279-3283, 1990
Bianchi DW, Prenatal diagnosis by analysis of fetal cells in maternal blood. J Pediatr. Dec;127(6):847–856, 1995
Bianchi, D.W., Zickwolf, G.K., Weil, et al., Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 705-708, 1996
Bianchi DW, Circulating Fetal DNA: Its Origin and Diagnostic Potential-A Review Placenta, 25, Supplement A, Trophoblast Research, Vol. 18, S93-S101, 2004
Bianchi DW, Simpson JL, Jackson LG, et al., Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study. Prenat Diagn. Jul; 22(7):609-15, 2002
Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, et al., Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing, MatErnal Blood IS Source to Accurately diagnose fetal aneuploidy (MELISSA) Study Group. Obstet Gynecol; 119:890-901, 2012
Bianchi, D.W., Williams, J.M., Sullivan, et al., PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploid pregnancies. Am. J. Hum. Genet., 61, 822-829, 1997
Bianco B, Lipay M.V., Guedes A.D., et al., Clinical implications of the detection of Y-chromosome mosaicism in Turner’s syndrome: report of 3 cases. Fertility and Sterility, 90(4), 2008
Birch Lyndsey, English Claire A., O’Donoghue Keelin, et al., Accurate and Robust Quantification of Circulating Fetal and Total DNA in Maternal Plasma from 5 to 41 Weeks of Gestation, Clinical Chemistry 51:2, 312-320, 2005
Bischoff FZ, Sinacori MK, Dang DD, et al., Cell-free fetal DNA and intact fetal cells in maternal blood circulation: implications for first and second trimester non-invasive prenatal diagnosis. Hum Reprod Update. 8(6):493-500, 2002
Bina Minou, Identification and Mapping of Paralogous Genes on a Known Genomic DNA Sequences in Methods in Molecular Biology, Gene Mapping, Discovery, and Expression: Methods and Protocols, edited by Minou Bina, Humana Press Inc, Totowa, NJ, vol. 338, 2006
Boland Reed, Katzive Laura, Developments in Laws on Induced Abortion: 1998–2007, International Family Planning Perspectives, 34(3):110-120, 2008
Bombard AT, Akolekar R, Farkas DH, et al., Fetal RHD genotype detection from circulating cell-free fetal DNA in maternal plasma in non-sensitized RhD negative women. Prenat Diagn; 31(8):802-8, 2011
Bon M.A.M., van Oeveren-Dybicz A., van den Bergh F.A.J.T.M, Genotyping of HLA-B27 by Real-Time PCR without Hybridization Probes, Clinical Chemistry 46, No. 7, 2000
Bugert P., Lese A., Meckies J., et al., Optimized sensitivity of allele-specific PCR for prenatal typing of human platelet alloantigen single nucleotide polymorphisms. BioTechniques 35:170-174, 2003
Bui The-Hung, SYNDROME: AN APPROACH TO FETAL DYSMORPHOLOGY in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.57-62, 2006
Bustamante-Aragonés Ana, Rodríguez de Alba Marta, Perlado Sara, et al., Non-invasive prenatal diagnosis of single-gene disorders from maternal blood, Gene 504, 144–149, 2012
Bustamante-Aragones A, Gallego-Merlo J, Trujillo-Tiebas MJ, et al., New strategy for the prenatal detection/exclusion of paternal cystic fibrosis mutations in maternal plasma. J Cyst Fibros., 7(6):505-10, 2008
Butler John M., FORENSIC DNA TYPING: BIOLOGY, TECHNOLOGY, AND GENETICS OF STR MARKERS, Second edition, Elsevier, 2005
Brent Robert L., Fawcett Lynda, Beckman David A., Principles of teratology in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p. 79-112, 2006
Bruyère Hélène, Rajcan-Separovic Evica, Kalousek Dagmar K., Molecular Cytogenetics in Reproductive Pathology From: Methods in Molecular Biology, Vol. 204: Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications Edited by: Y. S. Fan© Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2002
Chan K.C.A., Zhang J, Hui A B.Y., et al., Size Distributions of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma. Clinical Chemistry 50:1, 88-92, 2004
Chan KC Allen, Ding Chunming, Gerovassili Ageliki, et al., Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis, Clinical Chemistry, 52(12):2211-8, 2006
Chen Eric Z., Chiu Rossa W. K., Sun Hao, et al., Noninvasive Prenatal Diagnosis of Fetal Trisomy 18 and Trisomy 13 by Maternal Plasma DNA Sequencing, PLoS ONE 6(7), 2011
Chiu Rossa W K, Akolekar Ranjit, Zheng Yama W L, et al., Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study, BMJ;342:c7401, 2011
Chiu Rossa W. K., Chan K. C. Allen, Gao Yuan, et al., Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma, PNAS, vol. 105, no. 51, 2008
Ciuchea Adriana, Badea Doina, TRICÃ Stefan, et al., ROMANIA IN FIGURES 2011, Population,pg.10, NATIONAL INSTITUTE OF STATISTICS, 2011
Cleary-Goldman Jane, Malone Fergal D., Vidaver John, et al., Impact of Maternal Age on Obstetric Outcome, The American College of Obstetricians and Gynecologists, vol. 105, no. 5, part 1, 2005
Cirigliano V., Voglino G., Canadas M.P., et al., Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR. Assessment on 18 000 consecutive clinical samples. Mol. Hum. Reprod, 10(11): 839-846, 2004
Cirigliano V, Lewin P, Szpiro-Tapies S, et al., Assessment of new markers for the rapid prenatal detection of aneuploidies by quantitative fluorescent PCR (QF-PCR). Ann Hum Genet 65, 421-427, 2001a
Cirigliano V, Ejarque M, Canadas MP, et al., Clinical application of multiplex quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) for the rapid prenatal detection of common chromosome aneuploidies. Mol Hum Reprod 7, 1001-1006, 2001b
Cirigliano V, Ejarque M, Fuster C and Adinolfi M, X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies. Mol Hum Reprod 8, 1042-1045, 2002
Cirigliano V, Voglino G, Ordoñez E, Marongiu A, Cañadas M P, Ejarque M, Rueda L, Lloveras E, Fuster C, Adinolfi M – Rapid prenatal diagnosis of common Chromosome aneuploidies by QF-PCR, results of 9 years of clinical experience. Prenat Diagn; 29: 40-49, 2009
Colegiul Medicilor din România, Conduita în sarcina cu incompatibilitate în sistem RH / Societatea de Obstetrica si Ginecologie din România, Comisia de Obstetrica si Ginecologie, Ministerul Sanatatii Publice. Comisia Consultativa de Obstetrica si Ginecologie. Buzau: Alpha MDN, Bibliogr.ISBN 978-973-139-004-8, 2007
Covic Mircea, Bembea Marius, Popovici Cornel, et al., Consultul si sfatul genetic, in Genetica medicala editia a II-a, Polirom, p345-381, 2011
Cuckle Howard S., Arbuzova Svetlana, Epidemiology of aneuploidy in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.19-32, 2006
Daniels G, Finning K, Martin P, et al., Fetal RhD genotyping: a more efficient use of anti-D immunoglobulin. Transfus Clin Biol; 14(6): 568-71, 2007
Daniels G, Finning K, Martin P, et al., Noninvasive prenatal diagnosis of fetal blood group phenotypes: current practice and future prospects. Prenat Diagn., 29(2):101-7, 2009
Daniely M., Aviram-Goldring A., Barkai G. et al., Detection of chromosomal aberration in fetuses arising from recurrent spontaneous abortion by comparative genomic hybridization, Human Reproduction vol.13 no.4 pp.805-809, 1998
Davalieva K, Dimcev P, Efremov GD, et al., Non-invasive fetal sex determination using real-time PCR. The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine; 19(6): 337-342, 2006
Dávila-Rodríguez M.I., Gutiérrez E.I. Cortés, Flores R.M. Cerda, et al., Constitutive heterochromatin polymorphisms in human chromosomes identified by whole comparative genomic hybridization, European Journal of Histochemistry; volume 55:e28, 2011
De Alba M. Rodríguez, Palomino P, Jurado A, et al., Prenatal diagnosis on fetal cells obtained from maternal peripheral blood: report of 66 cases, Prenat Diagn. 19(10):934-40, 1999
Deutsch S., Choudhury U., Merla G., et al., Detection of aneuploidies by paralogous sequence quantification. J Med Genet, 41:908-915, 2004
Devaney SA, Palomaki GE, Scott JA, et al., Noninvasive Fetal Sex Determination Using Cell-Free Fetal DNA: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA; 306 (6): 627-636, 2011
Diego-Alvarez Dan, Garcia-Hoyos Maria, Trujillo Maria Jose, et al., Application of quantitative fluorescent PCR with short tandem repeat markers to the study of aneuploidies in spontaneous miscarriages, Human Reproduction Vol.20, No.5 pp. 1235-1243, 2005
Dickinson Jan E., Gonik Bernard, Viral agents and reproductive risks, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p154-168, 2006
Dierssen M, Herault Y, Estivill X, Aneuploidy: From a Physiological Mechanism of Variance to Down Syndrome, Physiol.Rev.89:887-920, 2009
DiMaio Miriam S., Fox Joyce E., Mahone Maurice J. Prenatal Diagnosis: Cases and Clinical Challenges, John Wiley & Sons, 2010
Douglas GW, Thomas L, Carr M, et al. Trophoblasts in the circulating blood during pregnancy. Am J Obstet Gynecol.;58:960-973, 1959
Donnenfeld Alan E., Lamb Allen N., Cytogenetics and molecular cytogenetics, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division,p473-484, 2006
Dokras A, Gardner LM, Kirschmann DA, et al., The tumour suppressor gene maspin is differentially regulated in cytotrophoblasts during human placental development. Placenta. 23(4):274-80, 2002
Donaghue C, Mann K, Docherty Z et al. Detection of mosaicism for primary trisomy in prenatal samples by QF-PCR and karyotype analysis. Prenat Diagn; 25(1): 65-72, 2005
Dragomir Cristina, Stan Adriana, Stefanescu Dragos T., et.al., Prenatal Screening for the 35delG GJB2, Del (GJB6-D13S1830) and Del (GJB6-D13S1854) Mutations in Romanian Population, Genet Test Mol Biomarkers;15(11):749-53. Epub 2011
Drugan Arie, Principles of “CLASSIC” genetics, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.3-18, 2006
Drugan Arie, Evans Mark I., Amniocentesis, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division,c34, p415-422, 2006
Dubey S., Chowdhury M. R., Prahlad B., et al., Cytogenetic causes for recurrent spontaneous abortions – an experience of 742 couples (1484 cases), Indian Journal of Human Genetics, Volume 11, Issue 2, 2005
Elias Sherman, Leigh Simpson Joe, Shiman P. Lee, Techniques for prenatal diagnosis, Harcourt Publishers Limited, in Emery and Rimoin's Principles and Practices of Medical Genetics, editia 4, vol 2, 2002
Evangelidou Paola, Sismani Carolina, Ioannides Marios, et al., Clinical application of whole-genome array CGH during prenatal diagnosis: Study of 25 selected pregnancies with abnormal ultrasound findings or apparently balanced structural aberrations, Molecular Cytogenetics, 3:24 doi:10.1186/1755-8166-3-24, 2010
Evans MI, Galen S. Robert, Drugan Arie – BIOCHEMICAL SCREENING in prenatal, in Prenatal Diagnosis, The McGraw-Hill Companies, pp. 433-442, 2006
Evans MI, Rosner Guy, Yaron Yuval et al., Chorionic Villus sampling, Copyright © by The McGraw-Hill Companies DOI: 10.1036/0838576826, pp.433- Prenatal Diagnosis, 2006
Faas BH, Beuling EA, Christiaens GC, et al., Detection of fetal RHD specific sequences in maternal plasma, Lancet. 352:1196, 1998
Fan H. Christina, Blumenfeld J. Yair, Chitkara Usha, et al., Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood, PNAS, 2008
Fan H. Christina, Quake R. Stephen, Sensitivity of Noninvasive Prenatal Detection of Fetal Aneuploidy from Maternal Plasma Using Shotgun Sequencing Is Limited Only by Counting Statistics, PLoS ONE 5(5):e10439, 2010
Fan H. Christina, Gu Wei, Wang Jianbin, et al., Non-invasive prenatal measurement of the fetal genome,Journal name: Nature, YeaDOI:doi:10.1038, nature11251, 2012
Fan Yao-Shan, Molecular Cytogenetics in Medicine, An Overview, Edited by: Y. S. Fan, Humana Press Inc., Totowa, NJ, Methods in Molecular Biology, Vol. 204: Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, 2002
Farina A., Caramelli E., Concu M., et al., Testing normality of fetal DNA concentration in maternal plasma at 10±12 completed weeks' gestation: a preliminary approach to a new marker for genetic screening, Prenat. Diagn., 22, 148-152, 2002
Flegel WA, The genetics of the Rhesus blood group system, Blood Transfus, 5: 50-57, 2007
Freeman K, Szczepura A, Osipenko L. Non-invasive fetal RHD genotyping tests: a systematic review of the quality of reporting of diagnostic accuracy in published studies. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. Feb;142(2):91-8. 2009; Epub 2008
Ganshirt-Ahlert, Pohlschmidt D. M., Gal, P. A., et al., Ratio of fetal to maternal DNA is less than 5000 at different gestational ages in maternal blood, Clin. Genet., 38:38-43, 1990
Ganshirt-Ahlert, Smeets D., Dohr F.W., et al., Enrichment of fetal nucleated red blood cells from the maternal circulation for prenatal diagnosis: experiences with triple density gradient and MACS based on more than 600 cases, Fetal Diagn. Ther., 13, 276-286, 1998
Gorduza V., popovici C., Scrypnick C. et al., Bolile cromozomiale in Genetica medicala editia a II-a, Polirom,p. 384-415, 2011
Gurewitsch Edith D., Chervenak A. Frank, OVERVIEW OF THE COMPREHENSIVE ULTRASOUND EXAMINATION: AN APPROACH TO DIAGNOSIS AND MANAGEMENT OF FETAL ANOMALIES, in Prenatal diagnosis, 2006
Gadji Macoura, Kada Krabchi, Ju Yan, Règen Drouin, Application of Multi-PRINS to Simultaneously Identify Chromosomes 18, X, and Y in Prenatal Diagnosis, in Prenatal, Methods in molecular biology, vol. 444, Humana press, pp. 49-58, 2008
Hahn Sinhue, Holzgreve Wolfgang, PRENATAL DIAGNOSIS USING FETAL CELLS FROM MATERNAL BLOOD, Copyright © by The McGraw-Hill Companies DOI: 10.1036/0838576826, cap.45, pp.505- Prenatal Diagnosis, 2006
Henderson G. Karen, Shaw E. Tracey, Barrett J. Irene, et al., Distribution of mosaicism in human placentae, Hum Genet., 97:650-654, 1996
Hills A, Donaghue C, Waters J, et al., QF-PCR as a stand-alone test for prenatal samples: the first 2 years' experience in the London region. Prenat Diagn. 30(6):509-17. 2010
Herzenberg LA, Bianchi DW, Schroder J, et al., Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichment by fluorescenceactivated cell sorting, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,76:1453–1455, 1979
Holzgreve W, Garritsen HS, Ganshirt Ahlert D., Fetal cells in the maternal circulation, J Reprod Med., 37:410-418,1992
Hong Y., Zhou Y.-W., Tao J., et al., Do polymorphic variants of chromosomes affect the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer treatment?, Human Reproduction, Vol.0, No.0 pp.1-8, 2011
Hromadnikova Ilona, Vechetova Lenka, Vesela Klara, et al., Non-invasive Fetal RHD and RHCE Genotyping Using Real-time PCR Testing of Maternal Plasma in RhD-negative Pregnancies, Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Volume 53(3): 301-305, 2005
Huang Dorothy J., Nelson Matthew R., Zimmermann Bernhard et al., Reliable detection of Trisomy 21 using MALDI-TOF mass spectrometry, Genetics in Medicine, vol. 8, no.11, 728-734, 2006
Huang Dorothy J., Matthew R. Nelson, Wolfgang Holzgreve, MALDI-TOF mass spectrometry for trisomy detection, in Methods in molecular biology, vol. 444, Humana press, 2008
Hulten A. Maj, Dhanjal Seema, Pertl Barbara, Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF–PCR, Reproduction, 126, 279-297 Review, 2003
Jiang Fuman, Ren Jinghui, Chen Fang, Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies, BMC Medical Genomics, 5:57 doi:10.1186/1755-8794-5-57, 2012
Johnson Jo-Ann, Tough Suzanne, Wilson R. Douglas, et al., Delayed Child-Bearing, J Obstet Gynaecol Can 34(1):80–93, 2012
Johnson KL, Dukes KA, Vidaver J, et al., Interlaboratory comparison of fetal male DNA detection from common maternal plasma samples by real-time PCR, Clin Chem. 50(3):516-21, 2004
Kalousek Dagmar K, Michel Vekemans, Confined placental mosaicism, JMed Genet; 33:529-533, 1996
Kao Li-Gi, Tsai Li-Chin, Chun-I Lee James, et al., Controversial cases of human gender identification by amelogenin test, Forensic Science Journal 6 (2): 69-71, 2007
Kanavakis E., Traeger-Synodinos J., Vrettou C., et al., Prenatal diagnosis of the thalassaemia syndromes by rapid DNA analytical methods, Molecular Human Reproduction, Vol.3 no.6, pp.523-528, 1997
Kashork D. Catherine Theisen A., Shaffer LG., et al., Prenatal diagnosis using array CGH, Methods Mol Biol. 2008;444:59-69, 2008
Kearney Hutton M., Erik C. Thorland, Kerry K et al., American College of Medical Genetics standards and guidelines for interpretation and reporting of postnatal constitutional copy number variants, Genetics In Medicine, 2011
Khoury J. Muin, Beaty H. Terri, Cohen H. Bernice, Fundamentals of Genetic Epidemiology, Oxford University Press, p. 383, Vol. 22, 1993
King A. Richard, Rotter I. Jerome, Motulsky G. Arno, The Genetic Basis of Common Diseases, Oxford University Press, 2002
Kondo Yuko, Tsukishiro Sami, Tanemura Mitsuyo, et al., Maternal uniparental disomy of chromosome a case of spontaneous abortion, J Hum Genet 49:177-181, 2004
Lau TW, Leung TN, Chan LYS, et al., Fetal DNA Clearance from Maternal Plasma Is Impaired in Preeclampsia, Clinical Chemistry 48:12, 2141-2146, 2002
Legler TJ, Liu Z, Mavrou A, et al., Workshop report on the extraction of fetal DNA from maternal plasma, Prenat Diagn., 27(9):824-9, 2007
Li Y, Di Naro E, Vitucci A, et al., Size fractionation of cell-free DNA in maternal plasma improves the detection of a paternally inherited β-thalassemia point mutation by MALDI-TOF mass spectrometry, Fetal Diagn Ther, 25:246-249, 2009
Li Y, Page-Christiaens GC, Gille JJ,et al., Non-invasive prenatal detection of achondroplasia in size-fractionated cell-free DNA by MALDI-TOF MS assay, Prenat Diagn., 27(1):11-7, 2007
Li Ying, Bernhard Zimmerman, Corinne Rusterholz, et al., Size Separation of Circulatory DNA in Maternal Plasma Permits Ready Detection of Fetal DNA Polymorphisms, Clinical Chemistry 50, No. 6, 2004
Liao J. W. Gary, Allen Chan K. C., Jiang Peiyong, et al., Noninvasive Prenatal Diagnosis of Fetal Trisomy 21 by Allelic Ratio Analysis Using Targeted Massively Parallel Sequencing of Maternal Plasma DNA, PLoS ONE 7(5): e38154. doi:10.1371/journal.pone.0038154, 2012
Lichtenbelt KD, Knoers NV, Schuring-Blom GH, From karyotyping to array-CGH in prenatal diagnosis, Cytogenet Genome Res. 135(3-4):241-50, Epub: 2011
Lo Y.M., Corbetta N., Chamberlain P.F., Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum, Lancet., 350(9076):485-487, 1997
Lo Y.M., Non-invasive prenatal diagnosis using fetal cells in maternal blood, J Clin Pathol. 47(12): 1060-1065. PMCID: PMC502193, 1994
Lo Y.M., M.R.C.P., Hjelm N. Magnus, Path. F.R.C., Fidler Carrie, Ph.D., et al., Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma, N Engl J Med, 1998;339:1734-1738, 1998
Lo Y.M., Recent advances in fetal nucleic acids in maternal plasma, J Histochem Cytochem, 53(3):293-6, 2005
Lo Y.M., Lun F.M., Chan K.C., et al., Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy, Proc Natl Acad Sci U.S.A., 104(32):13116-21, 2007
Lo Y.M., Tein M.S.C., Lau T.K., et al., Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis, Am J Hum Genet., 62:768–775, 1998
Lo Y.M., Zhang J, Leung T.N., et al., Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma, Am J Hum Genet., 64:218–224, 1999a
Lo Y.M., Lau T.K., Zhang J., Leung, et al., Increased fetal DNA concentrations in the plasma of pregnant women carrying fetuses with trisomy 21, Clin. Chem., 45, 1747-1751, 1999b
Luthardt W. Frederick, Keitges Elisabeth, Chromosomal Syndromes and Genetic Disease, Nature Publishing Group, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES, www.els.net, 2001
Maddocks DG, Alberry MS, Attilakos G, et al., The SAFE project: towards non-invasive prenatal diagnosis, Biochem Soc Trans. 37(Pt 2): 460-5, 2009
Madon PF, Athalye AS, Parikh FR., Polymorphic variants on chromosome probably play a significant role in infertility, Reprod Biomed Online 2005; 11:726-32, 2005
Mann K, Fox SP, Abbs SJ, et al., Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis, Lancet 358, 1057–1061, 2001
Mann K., Donaghue C., Ogilvie C.M., In vivo somatic microsatellite mutations identified in non-malignant human tissue, Hum Genet, 114 : 110–114, 2003
Mann K, Donaghue C, Fox S P, Docherty Z, Ogilvie C M , Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy. European J. of Hum. Genet. 1-9, 2004
Mann K., Petek E., Pertl B., Prenatal Detection of Chromosome Aneuploidy by Quantitative Fluorescence PCR in Prenatal Diagnosis, Methods in Molecular Biology, 444:71- 93, 2008
Mansfield E.S., Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms, Hum Mol Genet, 2:43–50, 1993
Martinhago CD, de Oliveira RM, Tomitão Canas Mdo C,et al., Accuracy of fetal gender determination in maternal plasma at 5 and 6 weeks of pregnancy, Prenat Diagn. 2006; 26(13):1219-23, 2006
Mathew T.J., Hamilton E. Brady, Delayed Childbearing: More Women Are Having Their First Child Later in Life, National Center for Health Statistics, NCHS Data Brief, No. 21, 2009
Mattison R. Donald, CHARACTERIZING THE EFFECT OF ENVIRONMENTAL AND OCCUPATIONAL EXPOSURES ON REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.131-147, 2006
Mattocks J Christopher, Morris A Michael, Matthijs Gert, et al., A standardized framework for the validation and verification of clinical molecular genetic tests, European Journal of Human Genetics, 1–13, 2010
Mergenthaler-Gatfield Susanne, Wolfgang Holzgreve and Sinuhe Hahn Spectral Karyotyping (SKY): Applications in prenatal diagnostics, in Methods in molecular biology, vol. 444, Humana press, 2008
Michaels Heather Shane, Nazareth B. Shivani, Tambini Lorien, PRENATAL GENETIC COUNSELING, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.71-78, 2006
Mihaescu G, Imunologie si imunochimie, Editura Universitatii din Bucuresti, p456, Bibliogr. ISBN 973-575-556-4, 2001
Mujezinovic F., Alfirevic Z., Procedure-related complications of amniocentesis and chorionic villous sampling: a systematic review, Obstet Gynecol 2007;110:687–694, 2007
Nanu Dimitrie, Marinescu Bogdan, Matei Dumitru, et al., Esentialul in Obstetrica: pentru studenti si medici rezidenti obstetrica-ginecologie, Ed. Medicala Amaltea Bucuresti, 2008
Nicolaides H. Kypros, Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks REVIEW, Prenat Diagn 2011; 31: 7–15, 2011
Nicolaides H. Kypros, Nuchal translucency and other first-trimester sonographic markers of chromosomal abnormalities, American Journal of Obstetrics and Gynecology, 191, 45e67, 2004
Nicolini U, Lalatta F, Natacci F, et al., The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Hum. reprod. Updat. 10(6): 541-548, 2004
Ng E.K.O, Tsui N.B.Y, Lau T.K, et al., mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2003;100: 4748-4753, 2003
Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F., Thompson M.W., Thompson & Thompson Genetics in Medicine, p.1400, 2004
Opstal D.V., Boter M., Jong D., et al., Rapid aneuploidy detection with multiplex ligation-dependent probe amplification: a prospective study of 4000 amniotic fluid samples, Eur J Hum Genet., 17(1): 112–121, 2008
Oosterwijk J. C., Knepflé C F, Mesker W E,et al., Strategies for rare-event detection: an approach for automated fetal cell detection in maternal blood, Am J Hum Genet, 63(6): 1783–1792, PMCID: PMC1377651, 1998
Otto Paul, MagneSilTM Paramagnetic Particles: Magnetics for DNA Purification, Journal of Laboratory Automation, 7: 34, 2002
Palomaki E. Glenn, Kloza M. Edward, Lambert-Messerlian M. Geralyn, et al., DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study, Genetics In Medicine, Vol. 13, Nr. 11, 2011
Palomaki E. Glenn, Deciu Cosmin, Kloza M. Edward, et al., DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study, Genet Med 2012:14(3):296–305, 2012
Papageorgiou EA, Karagrigoriou A, Tsaliki E, et al., Fetal-specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21. Nat Med 2011;17:510-3, 2011
Papasavva T, Kalikas I, Kyrri A, et al., Arrayed primer extension for the noninvasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia based on detection of single nucleotide polymorphisms, An n N Y Acad Sci., 1137:302-8, 2008
Pertl B, Yau SC, Sherlock J, et al., Rapid molecular method for prenatal detection of Down’s syndrome. Lancet 343, 1197-1198, 1994
Pertl B, Weitgasser U, Kopp S, et al. Rapid detection of trisomies 21 and 18 and sexing by quantitative fluorescent multiplex PCR. Hum Genet, 98, 55-59, 1996
Pertl B, Kopp S, Kroisel PM, et al., Rapid detection of chromosome aneuploidies by quantitative fluorescence PCR: first application on 247 chorionic villus samples. J Med Genet 36, 300-303, 1999a
Pertl B, Pieber D, Lercher-Hartlieb A, Orescovic et al., Rapid prenatal diagnosis of aneuploidy by quantitative fluorescent PCR on fetal samples from mothers at high risk for chromosome disorders. Mol Hum Reprod 5,1176-1179, 1999b
Price, J. O., Elias S., Wachtel S. S., et al., Prenatal diagnosis with fetal cells isolated from maternal blood by multiparameter flow cytometry, Am. J. Obstet. Gynecol. 165:1731-1737, 1991
Poon L.M. Leo, Leung N. Tse, Lau K. Tze, et al., Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma, Clin Chem 48(1):35-41, PMID 11751536, 2002
Poon L.M. Leo, Leung N. Tse, Lau K. Tze, Presence of Fetal RNA in Maternal Plasma, Clinical Chemistry, vol. 46 no. 11 1832-1834, 2000
Popovici C., Stefanescu D., Mixitch F., et al., Profilaxia bolilor genetice in “Genetica Medicala- editia a II-a”, cap.19, 2011
PROFESSIONAL GUIDELINES FOR CLINICAL CYTOGENETICS PRENATAL DIAGNOSIS BEST PRACTICE GUIDELINES (2009) v1.00, 2009
PROFESSIONAL GUIDELINES FOR CLINICAL CYTOGENETICS AND CLINICAL MOLECULAR GENETICS, QF-PCR for the diagnosis of aneuplidy best practice guidelines, v2.01”, 2007
Rabinowitz M, Ryan A, Gemelos G, et al., Origins and rates of aneuploidy in human blastomeres, Fertil Steril., 97(2):395-401, 2011
Rijnders RJ, Van Der Luijt RB, Peters ED, Earliest gestational age for fetal sexing in cell-free maternal plasma, Prenat Diagn, 23: 1042-1104, 2003
RCOG Green-top Guideline No. 38, Royal College of Obstetricians and Gynaecologists – THE MANAGEMENT OF GESTATIONAL TROPHOBLASTIC DISEASE, 2010
Rouillac-LeSciellour C., V. Sérazin V., Y. Brossard Y., et al., Noninvasive fetal RHD genotyping from maternal plasma: Use of a new developed Free DNA Fetal Kit RhD®, Transfusion Clinique et Biologique, 14, 572-577, 2007
Rubio C., Simon C., Vidal F., et al., Chromosomal abnormalities and embryo development in recurrent miscarriage couples, Human Reproduction Vol.18, No.1 pp. 182-188, 2003
Sandovici I, Covic M, Stanescu H, Analiza structurii si functiei genelor, in Genetica Medicala, editia a II-a, capitolul 5, p152, Editura Polirom, 2011
Scheffer PG, van der Schoot CE, Page-Christiaens GCML, et al., Reliability of Fetal Sex Determination Using Maternal Plasma, Obstet Gynecol, 115, 1:117-126, 2010
Schmorl G, Pathologisch-anatomische Untersuchungen über Publereklampsie, Leipzig Vogel, 1893
Schouten P.J, Galjaard RJ., MLPA for prenatal diagnosis of commonly occurring aneuploidies, Methods Mol Biol., 444:111-22, 2008
Schouten P.J., McElgunn J. Cathal, Waaijer Raymond,et al., Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification, Nucleic Acids Res., 30(12): e57, 2002
Schwartz Stuart, Graf D. Michael, Microdeletion Syndromes Characteristics and Diagnosis, Edited by: Y. S. Fan © Humana Press Inc., Totowa, NJ, in Methods in Molecular Biology, Vol. 204: Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications, 2002
Sepulveda Waldo, Be Cecilia, Schnapp Carlos, et al., Second-Trimester Sonographic Findings in Trisomy 22 – Report of 3 Cases and Review of the Literature, J Ultrasound Med, 22:1271-1275, 2003
Severin E., Stefanecsu D, Covic M, et al., Genetica populatiilor in Genetica medicala, editia a II-a, editura Polirom, p.300, 2011
Severin E., Albu C., Ioachim I., Genetica Umana: concepte si aplicatii practice, Bucuresti:Scripta, 2002
Shaffer G. Lisa, Bui The-Hung, Molecular cytogenetic and rapid aneuploidy detection methods in prenatal diagnosis, American Journal of Medical Genetics Part C (Seminars in Medical Genetics), 145C:87–98, 2007
Shahar Shay Ben, Orr-Urtreger Avi, Yaron Yuval, Chromosomal aberrations in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p.41-50, 2006
Sharp Andrew J., Devin P. Locke, Sean D. McGrath et al., Segmental Duplications and Copy-Number Variation in the Human Genome, Am. J. Hum. Genet. 77:78–88, 78, 2005
Shaw-Smith C, Redon R , Rickman L ,et al., Microarray based comparative genomic hybridization (array-CGH) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features, J Med Genet 2004;41:241–248, 2004
Shi S-R, Cote RJ, Wu L, et al., DNA Extraction from Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Principle: Heating Under the Influence of pH, J. Histoche. Cytoche., 50: 1005-1011, 2002
Snijders Rosalinde, Nicolaides Kypros, First trimester diagnosis of chromosomal defects, Fetal Medicine Foundation, London, in The 11–13+6 weeks scan, 2004
Sobotka Tomáš, Postponement of Childbearing and Low Fertility in Europe, Dutch University Press, ISBN 90 3619 102 5, NUR 740, 2004
Sparks B. Andrew, Struble A. Craig, Wang T. Eric, et al., Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18, Am J Obstet Gynecol 206:319.e1-9, 2012a
Sparks B. Andrew, Struble A. Craig, Wang T. Eric, et al., Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy, Prenatal Diagnosis, 32, 3–9, 2012b
Spencer K, de Kok JB, Swinkels DW, Increased total cell-free DNA in the serum of pregnant women carrying a fetus affected by trisomy 21, Prenat Diagn., 23(7):580-3, 2003
Steele MW, Breg WR, Chromosome analysis of human amniotic-fluid cells, Lancet, 1(7434);383-5, 1966
Stephenson Patricia, Wagner Marsden, Badea Mihaela et al., Commentary: The Public Health Consequences of Restricted Induced Abortion- Lessons from Romania, American Journal of Public Health, Vol. 82, No. 10, 1992
Stevenson E. Roger, Hall G. Judith, Human Malformations And Related Anomalies, Oxford University Press, 2006
Szczepura Ala, Osipenko Leeza, Freeman Karoline, A new fetal RHD genotyping test: Costs and benefits of mass testing to target antenatal anti-D prophylaxis in England and Wales, BMC Pregnancy and Childbirth, 11:5, 2011
Traeger-Synodinos J, Vrettou C, Kanavakis E., Rapid detection of fetal Mendelian disorders: thalassemia and sickle cell syndromes, Methods Mol Biol., 444:133-45, 2008
Vorsanova G. Svetlana, Kolotii D. Alexei, Iourov Y. Ivan, et al., Evidence for High Frequency of Chromosomal Mosaicism in Spontaneous Abortions Revealed by Interphase FISH Analysis, Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Volume 53(3): 375–380, 2005
Walknowska, J., Conte F. A., Grumbach M. M., Practical and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer, Lancet 1:1119-1122, 1969
Waters, J. J., Mann, K., Grimsley, L., et al., Complete discrepancy between QF-PCR analysis of uncultured villi and karyotyping of cultured cells in the prenatal diagnosis of trisomy three CVS, Prenat Diagn, 27, 4, Wiley Online Library, 332-339, 2007
Weber C, Kovac C., BACTERIAL INFECTIONS AND PREGNANCY, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, pp.149-154, 2006
Weiner P. Carl, Cordocentesis, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, pp.443-447, 2006
Weise Anja, Thomas Liehr, Rapid Prenatal Aneuploidy Screening by Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) in Prenatal, Methods in molecular biology, vol. 444, Humana press, pp49-58, 2008
Wenzel Friedel, Bacterial and/or fungal contamination in Diagnostic Cytogenetics, Springer-Verlag berlin heidelberg, pp.33-36, 1999
Wiebe Ellen, Chalmers Amanda, Yager Holly, Delayed motherhood – Understanding the experiences of women older than age 33 who are having abortions but plan to become mothers later, Can Fam Physician., 58:e588-95, 2012
Wilson R. Douglas, Early amniocentesis: risk assessment, in Prenatal Diagnosis, McGraw-Hill Medical Publishing Division, p423-432, 2006
Winsor EJ, Silver MP, Theve R, et al., Maternal cell contamination in uncultured amniotic fluid, Prenat Diagn. 16(1):49-54., 1996
Wolsteholme J., An audit of trisomy man, Prenat Diagn., 2:109-21, 1995
Wright CF, Burton H, The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis, Hum Reprod Update., 15(1):139-51, 2009
Zimmermann B, El-Sheikhah A, Nicolaides K., Optimized real-time quantitative PCR measurement of male fetal DNA in maternal plasma, Clin Chem., 51(9):1598-604, 2005
Zimmermann Bernhard, Hill Matthew, Gemelos George,et al., Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci, Copyright© by The McGraw-Hill Companies, in Prenatal Diagnosis, Vol. 32, Issue 13, pp.1233–1241, 2012
Zhong, X.Y., Holzgreve, W. and Hahn, S., Detection of fetal Rhesus D and sex using fetal DNA from maternal plasma by multiplex polymerase chain reaction, Br. J. Obstet. Gynaecol., 107, 766-769, 2000
Zhong X. Y., Holzgreve W., Hahn S., Risk free simultaneous prenatal identification of fetal Rhesus D status and sex by multiplex real-time PCR using cell free fetal DNA in maternal plasma, Swiss Med Wkly 131:70-74, 2001
Zou Gang, Zhang Jing, Li W. Xing, et al., Quantitative fluorescent polymerase chain reaction to detect chromosomal anomalies in spontaneous abortion, International Journal of Gynecology & Obstetrics, Volume 103, Issue 3, pp.237-240, 2008
Lista lucrari publicate in domeniul tezei:
Reviste cotate ISI
ADRIANA STAN, Dragomir Cristina, Severin Emilia, Badila Madalina, Daniela Tudor, Iulian Rujan, Attila Ratiu, Ilinca Visanoiu, Stefanescu Dragos, Savu Lorand, Non-invasive fetal sex determination from maternal plasma: impact on Romanian clinical practice of X-linked disorders, Romanian Biotechnological Letters – in curs de publicare
ADRIANA STAN, Cristina Dragomir, Daniela Tudor, Lorand Savu, Emilia Severin, The utility of molecular techniques for better prenatal diagnosis services in Romania, Romanian Biotechnological Letters Vol.17, No.4, 2012, 2012
ADRIANA STAN, Dragomir Cristina, Tudor Daniela, Stefanescu T. Dragos, Severin Emilia and Savu Lorand, Sex Chromosomes Mosaicism Detection by Quantitative
Fluorescent PCR Based Technique, Volume 9, No. 2 (Serial No. 87), pp. 101–106, Journal of US-China Medical Science, ISSN 1548-6648, USA, Feb. 2012
Adrian C. Martin, D. Iliescu, S. Tudorache, A. Comanescu, M. Ioana, A. Cimpoeru, F. Mixich, P. Antsaklis, L. Novac, N. Cernea1, ADRIANA STAN, A. Antsaklis, Morphogenetic assessment of the fetus using ultrasound in the first trimester of Pregnancy. Can we save money and time? Gineco.ro Vol. 8 • No. 29, 3/2012
Adrian Toma, Crenguta Albu, Dinu F. Albu, ADRIANA STAN, Emilia Severin – The MedScape Journal of Medicine – Case of the Week; A Neonate with dysmorphic facial features; Case Study Submission – Fetal valproate syndrome or unknown epilepsy syndrome? www.medscape.com, 2010
Cristina Dragomir, ADRIANA STAN, Dragos T. Stefanescu, Lorand Savu, Emilia Severin, Prenatal Screening for the 35delG GJB2, Del (GJB6-D13S1830), and Del (GJB6-D13S1854) Mutations in Romanian Population, Genet Test Mol Biomarkers. 2011 Nov;15(11):749-53. Epub 2011 Aug 12.
Publicatii in reviste din Romania
Adriana Stan – Determinarea genotipului RHD fetal prin analiza ADN-ului fetal – Saptamana medicala, an VII, nr.144, pagina 6, 2011
Adriana Stan – Testarea prenatala – Saptamana medicala, an IV, nr.101, pagina 6, 2010
Adriana Stan – Diagnosticul prenatal rapid al trisomiilor cromozomilor 13, 18, 21 si al aneuploidiilor cromozomilor de sex prin tehnica QF-PCR – Supliment “Medicina de Laborator”, pagina 13, octombrie 2009
Adriana Stan – Diagnosticul prenatal rapid al trisomiilor cromozomilor 13, 18, 21 si al aneuploidiilor cromozomilor de sex prin tehnica QF-PCR – Supliment “Medicina de Laborator”, pagina 13, iunie 2009
Adriana Stan, Cristina Dragomir, Daniela Tudor, Simona Cazacu, L. Savu – Diagnosticul prenatal rapid al trisomiilor 13, 18, 21 si al aneuplidiilor cromozomilor de sex prin tehnica QF-PCR.” – Revista Română de Laborator Medical”, Anul IV, Nr. 15, Septembrie 2009
Lucrari stiintifice prezentate la conferinte internationale
Adriana Stan, Dragomir C., Savu L, Severin E. – The fetal RHD genotyping and gender determination from cell-free fetal DNA circulating in maternal blood – ICHG Montreal 2011 ASHG 61th Annual Meeting
Adriana Stan, C.Dragomir, E. Severin, L.Savu – The fetal RHD genotyping and gender determination from cell-free fetal DNA circulating in maternal blood – the non-invasive prenatal tests available in Romania – BJMG – Balkan Journal of Medical Genetics, International Journal of Medical Genetics Supplement, 9th BMHG, 2011
Adriana Stan, C.Dragomir, E. Severin, L.Savu – Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR technique in Romania – the report on2615 cases – BJMG – Balkan Journal of Medical Genetics, International Journal of Medical Genetics Supplement, 9th BMHG, 2011
Adriana Stan, C. Dragomir, E. Severin, L. Savu -The fetal RHD genotyping from cell-free fetal DNA circulating in maternal blood – The first non-invasive prenatal test in Romania – ESHG European Journal of Human Genetics, 2011
Adriana Stan, Cristina Dragomir, Emilia Severin, L.Savu – Determining the fetal gender and Rhesus D status by noninvasive prenatal method – a new approach in Romanian prenatal diagnosis field – Poster Presentation, ESHG 2010 – European Journal of Human Genetics, iunie 2010, Vol 18 S1, pag.153
Adriana Stan, C. Dragomir, E.Severin, L.Savu – Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR analysis on 700 cases, rezumat publicat in European Journal of Human Genetics, vol.17, supplement 2, pag.165, May 2009, ISSN: 1018-4813 – Poster Presentation, ESHG 2009, Viena
Lucrari prezentate la conferinte nationale
Adriana Stan, Daniela Tudor, Cristina Dragomir, Emilia Severin, Lorand Savu – "Detectia prenatala a aneuploidiilor cromozomilor 13, 15, 16, 18, 21, 22, X si Y prin metoda QF-PCR" – Simpozionul Institutului Babes 2010, noiembrie 2010
Adriana Stan, D.Tudor, C.Dragomir, E. Severin, L.Savu – DIAGNOSTICUL PRENATAL RAPID PRIN QF-PCR IN 2010 – Al III lea Congres National de Genetica Medicala, Timisoara, Romania, 2010
Adriana Stan, Daniela Tudor, Cristina Dragomir, Emilia Severin, Lorand Savu – DETECTIA PRENATALA A SEXULUI FETAL PRIN ANALIZA ADN-ULUI FETAL LIBER CIRCULANT IN SANGELE MATERN- Al III lea Congres National de Genetica Medicala, Timisoara, Romania, 2010
Adriana Stan, C. Dragomir, E.Severin – Rapid prenatal diagnosis by QF-PCR analysis. Al 6-lea Simpozion National de Patologie “Patologie celulara si moleculara”, 2009, Bucuresti
Adriana Stan, Daniela Tudor, Cristina Dragomir, D.T. Stefanescu, L. Savu – Diagnosticul prenatal rapid prin QF-PCR. Conferinta Nationala de Genetica Medicala, 2009, Sibiu.
Adriana Stan, Cristina Dragomir, L. Savu – Genotiparea prenatala a genei RHD. Conferinta Nationala de Genetica Medicala, 2009, Sibiu.
Adriana Stan, C. Dragomir, D. Albu, D. Stefanescu, D.Tudor, C. Beldiman, E.Severin, L.Savu – QF-PCR a reliable method for rapid prenatal diagnosis. A IV Conferinta a Societatii Romane de Genetica Medicala, 2008, Craiova
Adriana Stan, C. Dragomir, D. Albu, D. Stefanescu, D.Tudor, C. Beldiman, E.Severin, L.Savu – A rare case of a 45, X0/47, XXY mosaicism detected by QF-PCR based technique. A IV Conferinta a Societatii Romane de Genetica Medicala, 2008, Craiova
Premii internationale:
ESHG 2011 conference fellowship holder – The fetal RHD genotyping from cell-free fetal DNA circulating in maternal blood – The first non-invasive prenatal test in Romania
Top 10 cases in 2010 – Adrian Toma, Crenguta Albu, Dinu F. Albu, Adriana Stan, Emilia Severin – The MedScape Journal of Medicine – Case of the Week; A Neonate with dysmorphic facial features; Case Study Submission – Fetal valproate syndrome or unknown epilepsy syndrome? www.medscape.com, 2010
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Cercetari Privind Posibilitatea Introducerii Unor Tehnici de Biologie Moleculara In Diagnosticul Prenatal Neinvaziv Si Invaziv (ID: 111464)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.