CERCETĂRI PRIVIND INCIDENȚA UNOR TULPINI BACTERIENE CU REZISTENȚĂ LA ANTIBIOTICE IZOLATE DE LA PACIENȚI CU INFECȚIE DE TRACT URINAR [305764]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE

ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI

FACULTATEA DE AGRICULTURĂ

SPECIALIZAREA BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Îndrumător Științific:

Prof.univ.dr. Petruța Călina CORNEA

Absolvent: [anonimizat]

2018

SPECIALIZAREA BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

CERCETĂRI PRIVIND INCIDENȚA UNOR TULPINI BACTERIENE CU REZISTENȚĂ LA ANTIBIOTICE IZOLATE DE LA PACIENȚI CU INFECȚIE DE TRACT URINAR

Îndrumător Științific:

Prof.univ.dr. Petruța Călina CORNEA

Semnătura …………………………….

Absolvent: [anonimizat]

2018

CUPRINS

MOTIVAȚIA

Această lucrare de licență în care am abordat cercetările cu privire la incidența unor tulpini bacteriene ce opun rezistență antibioticelor izolate de la pacienții cu infecție a [anonimizat].

[anonimizat] „S.C. MED LOVE” S.R.L. în cadrul județului Teleorman.

Motivația alegerii temei este aceea a [anonimizat].

[anonimizat]-genitale.

[anonimizat]-genitale, totuși eliminarea acestora se va putea face în urma urinării. [anonimizat], izolarea și identificarea acestora.

[anonimizat]: [anonimizat], Streptococcus spp. și Candida spp.. Conform statisticilor FAO (www.fao.org), în aproximativ 90% [anonimizat] e Escherichia coli.

[anonimizat], nu au cum să prevină sau să trateze aceste tipuri de infecții. Așadar, [anonimizat], totodată și controversat.

[anonimizat] a [anonimizat] a [anonimizat] a [anonimizat].

INTRODUCERE

Microorganismele urmărite reprezintă o [anonimizat]-patogeni, oportuniști din mediul înconjurător a [anonimizat]-genitale.

[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], microscopică, imunologică și genetică.

[anonimizat], [anonimizat].

În natură, patogenii umani uro-genitali sunt de rang primar – enterobacterii, de rang secundar – bacterii hemolitice (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, etc.); fungii (Candida spp., Blastomyces dermatitidis, dimatiacei, etc.) având rang terțiar, acționează ca oportuniști, iar patogenii cu transmitere pe cale uro-genitală au rang cuaternar.

La nivel de gazdă umană, dominanții populațiilor microbiene și fungice produc modificări biochimice semnificative – acidoză metabolică, modificări de compresie vasculară cu impact asupra oxigenării tisulare și repercusiuni fizio-patologice.

S-au efectuat cercetări de laborator ce au urmărit izolarea, caracterizarea și identificarea principalilor reprezentanți microbieni și fungici ca patogeni și oportuniști de nivel II de biosecuritate în condițiile furnizate de Laboratorul de Analize Medicale al Centrului de Medicină Uro-Genitală „S.C. MED LOVE” S.R.L..

Pornind de la aceste considerente, scopul prezentei Lucrări de Licență este de a reprezenta o cercetare meta analitică pe durata unui an calendaristic, cu parte practică ce urmărește tehnicile de bază de cultivare, izolare și identificare a germenilor de la pacienții cu afecțiuni uro-genitale, în județul Teleorman și contribuie la actualizarea datelor despre sănătatea umană, microbiologie, ecologie, educație, cercetare biologică locală în județ agricol și totodată, în mod convergent, reprezintă o bază de cerere și implementare a unor politici de susținere a adaptării și optimizării condițiilor de muncă, viață și sanogeneză a populației în vederea unui viitor sigur la nivel național și internațional pentru a beneficia de înalt respect pentru agricultură.

PARTEA I

STUDIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII

CAPITOLUL I

DATE GENERALE ASUPRA SPECIILOR DE ENTEROBACTERII CERCETATE

Bacteriile de tip gram-pozitive sunt foarte răspândite în aproape orice mediu ce prezintă viață. Au în componența lor bacterii ca și Escherichia coli, dar și diverse bacterii patogene ca Pseudomonas aeruginosa și Klebsiella sp.. Numeroase clase de antibiotice au ca și țintă bacteriile gram-negative.

Există numeroase caracteristici alocate bacteriilor gram-negative, dintre care amintim:

prezintă: o membrană celulară internă (citoplasmatică) cu un strat subțire de peptidoglican; o membrană exterioară cu lipopolizaharide în partea exterioară și fosfolipide în cea interioară;

porii din membrana exterioară acționează ca niște pori specifici doar anumitor molecule;

între membrana exterioară și cea citoplasmatică se află un spațiu ce este umplut cu o substanță concentrată ca și gel ce poartă denumirea de perplasmă;

stratul S este bine atașat de membrana exterioară, în timp ce de stratul de peptidoglican nu este foarte bine atașat;

flagelii ce sunt prezenți au patru inele de sprijin;

acizi lipoteicoici ori teicoici ce sunt specifici bacteriilor gram-pozitive lipsesc;

lipoproteinele sunt atașate de coloana polizaharidelor;

unele bacterii gram-pozitive pot conține lipoproteinele Braum;

majoritatea bacteriilor gram-pozitive nu formează spori.

Escherichia coli

Escherichia coli ce mai este cunoscută și sub denumirea de E. coli este mai studiat organism procariot și care face parte din seria de specii cele mai studiate în domeniile biotehnologiei și microbiologiei, acolo unde a servit ca și gazdă pentru diverse lucrări cu ADN recombinat.

E. coli este o bacterie coliformă, gram-negativă, anaerobă ce se prezintă sub formă de tijă de aproximativ 2,0 µm și diametrul de 0,25-1,0 µm.

Bacteria posedă fimbrii adezivi și un perete celular ce este alcătuit dintr-o membrană externă ce are în componența sa lipopozaharide, spațiul pleriplasmatic, un strat peptidoglican și o membrană citoplasmatică internă.

O parte din tulpini sunt pliate și pot accepta să realizeze transfer de plasmidă la și de la alte bacterii. Această proprietate îi permite bacteriei E. colii să reziste la diverse condiții de stres. În marea lor majoritate, tulpinile de E. coli sunt inofensive.

Tulpinile inofensive se regăsesc în flora normală a intestinului, iar gazdele acestora primesc avantajul de a se produce vitamina K2 dar și prevenția colonizării intestinului cu diverse bacterii patogene. Așadar, E. coli și gazda pot avea o relație de simbioză.

Eliminarea bacteriei în exterior se realizează prin procesul de expulzare în materiile fecale. Astfel, bacteriile vor crește semnificativ în materiile fecale proaspete în condiții aerobe pe o perioadă de 3 zile. Apoi numărul acestora va scădea. Din aceste afirmații putem concluziona că Escherichia coli poate să supraviețuiască în afara gazdei pe o perioada limitată de timp.

Escherichia coli prezintă un cromozom circular de ~4600 kb (4300 de secvențe, care se pot codifica), care uneori se poate afla împreuna cu o plasmidă circulară. Cromozomul, în proporție de 70% este compus din gene monocistronice, iar 6% este policistronic. Aproximativ 30% din ferestrele de citire deschise secventiale ar putea fi considerate gene de codificare a proteinelor, însă funcțiile acestora nu au fost încă descoperite.

Una dintre principalele cauze întâlnite ale infecțiilor de tract urinar este specia Uropathogenic Escherichia coli (UPEC).

Familia Enterobacteriaceae

Enterobacteriile fac parte din familia Enterobacteriaceae și cuprind multe bacterii gram negative. Bacilii pot fi mobili cu cili peritrichi (Salmonella sp., Proteus sp.) sau imobili (Shigella sp., Klebsiella sp.). De asemenea, unele specii sunt capsulate (Klebsiella sp.) sau necapsulate.

Aceste bacterii gram-negative includ, pe lângă numeroși simbionți inofensivi, mulți dintre agenții patogeni mai cunoscuți, cum ar fi Salmonella, Escherichia coli, Klebsiella sp..

Bacilii din această familie au un spectru larg de răspândire, întâlnindu-se în natură (ape, sol, plante, alimente), dar și în tractul intestinal al omului și animalelor, incluzând 110 specii și 30 de genuri, majoritatea comensale, dar și patogene, producând infecții pierorenale și cistouretale, diaree, adenite mezenterice, febra septicemica, iar la sugar chiar și meningite.

Bacteriile gram negative se dezvoltă ușor pe medii de cultură simple, aerobe, facultativ anaerobe, fără agenți nutritivi și fermentează glucoza cu sau fără producere de gaz, oxidează negativ, reduc nitrații (NO3) la nitriți (NO2).

Acestea au capetele rotunjite având diferite dimensiuni 0,4-0,6 µ grosime și 1-4 µ lungime.

Enterobacteriaceele au o structură antigenică complexă și produc o mare varietate de toxine. La tulpinele de Escherichia coli s-au identificat mai mult de 100 de variante ale antigenului termolabil K (polizaharid capsular), peste 150 de variante ale antigenului termostabil (LPS – lipopolizaharidic) și mai mult de 50 de variante ale antigenului H (flagelar).

Marea familie a enterobacteriilor cuprinde 20-25 de specii importante din punct de vedere clinic:

Escherichia coli – infecții ale tractului urinar, intestinal, meningita neonatală;

Shigella sp. – dezinterie;

Salmonella sp. – febra tifoidă;

Klebsiella sp., Citrobacter sp.;

Yersinia pestis – agentul ciumei bubonice.

CAPITOLUL II

DATE GENERALE ASUPRA SPECIILOR DE COCI GRAM POZITIVI CERCETAȚI

Bacteriile gram pozitive sunt bacterii care dau un rezultat pozitiv în testul de coloratie gram, care este utilizat în mod tradițional pentru a clasifică rapid bacteriile în două categorii largi, în funcție de peretele lor celular.

Bacteriile gram pozitive preiau pata de cristal violet utilizată în test, iar apoi vor avea culoare violetă la vizualizarea la microscop. Acest lucru se întâmplă întrucât stratul de peptidoglican gros din peretele celular bacterian păstrează pata de cristal violet după ce este îndepărtată de restul probei(acest lucru se realizează în faza de decolorare a testului).

Bacteriile gram-negative nu pot reține pete violete după etapa de decolorare. Alcoolul utilizat în această etapă degradează membrana exterioară a celulelor gram-negative, făcând peretele celular mai poros și incapabil să rețină pate de cristal violet.

Stratul lor de peptidoglican este mult mai subțire și este întărit între o membrană a celulei interioare și o membrană externă bacteriană, determinându-i să preia contra colorantul (safranin sau fucsină) și să apară pete roșii sau roz.

În ciuda stratului peptidoglican mai gros, bacteriile gram-pozitive sunt mai receptive la antibiotice decât cele gram-negative, datorită absenței membranei exterioare.

În general, în bacteriile gram-pozitive sunt prezente următoarele caracteristici:

Membrana lipidică citoplasmatică;

Stratul peptidoglican gros este prezent în acizi și lipoizi teicoici, formând acizi lipoteicoici care servesc ca agenți de chelatizare și pentru anumite tipuri de aderență.

Doar câteva specii au o capsulă care constă, de obicei, din polizaharide. De asemenea, doar unele specii sunt flagelite, iar când au flagel, au doar două inele bazale pentru a le susține (gram-negative au patru). Ambele bacterii gram-pozitive și gram-negative au în mod obișnuit un strat de suprafață numit un strat S. În bacteriile gram-pozitive, stratul S este atașat la stratul peptidoglican. Specific pentru bacteriile gram-pozitive este prezența acizilor teichoici în peretele celular.

În sensul clasic, șase gene gram-pozitive sunt de obicei patogene la oameni. Două dintre acestea, Streptococcus și Staphylococcus, sunt cocci (în formă de sferă). Organismele rămase sunt bacili (în formă de tijă) și pot fi subdivizate pe baza capacității lor de a forma spori.

2.1. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus este o bacterie gram-pozitivă. Aceasta are formă rotundă, fiind un membru al Firmicutes. Bacteria se găsește frecvent în nas, în tractul respirator și pe piele. Este adesea pozitiv pentru reducerea catalazei și a nitratilor și este un anaerob facultativ care poate crește fără necesitatea de oxigen.

Deși Staphylococcus aureus nu este întotdeauna patogen, este o cauza obișnuită a infecțiilor cutanate, incluzând abcese, infecții respiratorii cum ar fi sinuzita și otrăvirea alimentelor.

Tulpinile patogene promovează adesea infecțiile prin producerea de factori de virulență, cum ar fi toxinele proteice puternice, și expresia unei proteine de suprafață celulară, care leagă și inactivează anticorpii.

Apariția tulpinilor de Staphylococcus aureus rezistente la antibiotice (de exemplu Staphylococcus aureus cu rezistență la meticilină) reprezintă o problemă la nivel mondial în medicină. În ciuda multor cercetări și dezvoltări, nu există un vaccin aprobat pentru Staphylococcus aureus.

Staphylococcus aureus poate provoca o serie de boli, de la infecții minore ale pielii, cum ar fi coșuri, sindromul pielii apoase și abcese, la boli amenințătoare de viață (cum ar fi pneumonia, infectie de tract urinar, sindromul șocului toxic, bacteremia și sepsisul). Bacteria reprezintă una dintre cele cinci cele mai frecvente cauze ale infecțiilor dobândite în spital și este adesea cauza infecțiilor la răni după o intervenție chirurgicală.

2.2. Streptococcus spp.

Streptococcus reprezintă genul de bacterii gram-pozitive de coci (sferici) aparținând filumului Firmicutes și a ordinului Lactobacillales (bacterii de acid lactic).

Diviziunea celulelor din acest gen se întâlnește pe o singură axă în aceste bacterii, crescând astfel în lanțuri sau perechi, de unde și numele – de la streptos din greacă streptos, adică ușor îndoit sau răsucite, ca un lanț (lanț răsucit).

Cele mai multe dintre bacterii sunt oxidază-negativă și catalază-negativă, iar multe sunt anaerobe facultative. În prezent, există peste 50 de specii cunoscute în acest gen, care a fost găsit a fi parte a microbiomei salivare.

Multe specii streptococice nu sunt patogene și fac parte din microbiota umană comensală a gurii, pielii, intestinului și tractului respirator superior. Specii de Streptococcus sunt clasificate pe baza proprietăților lor hemolitice. Tipurile de α-hemolitic provoacă oxidarea fierului în moleculele de hemoglobină din celulele roșii din sânge, dând o culoare verzui pe agar de sânge. Specii β-hemolitice provoacă o ruptură completă a celulelor roșii din sânge. Pe agar de sânge, aceasta apare ca zone largi de celule sanguine din jurul coloniilor bacteriene. Specii gama-hemolitice nu produc hemoliză. Streptococii β-hemolitic sunt clasificați ulterior prin gruparea Lancefield, o clasificare serotipică. În mediul medical cele mai importante grupuri sunt streptococii α-hemolitic Streptococus pneumoniae și grupul Streptococus viridans și streptococi β-hemolitic ai grupurilor Lancefield A și B (cunoscuți și sub denumirea de "Streptococul A" și "Streptococul B" ).

Streptococcus pneumoniae sau pneumococul este o bacterie gram pozitivă, alfa-hemolitic (în condiții aerobe) sau β-hemolitic (în condiții anaerobe), membru facultativ anaerob din genul Streptococcus. Ca o bacterie patogenă umană semnificativă, S. pneumoniae a fost recunoscută ca o cauză majoră a pneumoniei la sfârșitul secolului al XIX-lea și este subiectul multor studii imunitare umorale.

Streptococcus pyogenes este o specie de bacterie gram-pozitivă. Aceste bacterii sunt aerotolerante și o extracelulare, alcătuite din cocci non-motil și non-sporiți. Este specia predominantă care găzduiește antigenul grupului A din grupul Lancefield și se numește adesea streptococul grupului A. Grupurile A de streptococi, crescute pe geloză sânge, produc în mod obișnuit zone mici de β-hemoliză, o distrugere completă a celulelor roșii din sânge. Streptococcus pyogenes poate fi cultivat pe plăci cu agar sa nguin. În condiții ideale, are o perioadă de incubație de 1 până la 3 zile.

Streptococcus viridans este un grup mare de specii de bacterii gram-pozitive streptococice comensale, care sunt fie α-hemolitice, producând o colorare verde pe plăcile de geloză sânge (de aici numele "viridans", din latină "vĭrdis", verde) sau nehemolitice. Termenul pseudo-taxonomic "Streptococcus viridans" este adesea folosit pentru a se referi la acest grup de specii.

CAPITOLUL III

DATE GENERALE ASUPRA SPECIILOR DE FUNGI CERCETAȚI

Fungii sunt microorganisme eucariote, uni sau pluricelulare, heterotrofe, care conțin chitină în peretele celular.

Pentru clasificarea fungilor, criteriul morfologic este cel mai cunoscut și acceptat în micologia medicală. Acesta permite împărțirea fungilor în trei tipuri principale:

filamentosi – microorganisme pluricelulare, cu talul alcătuit din filamente tubulare ce pot fi septate, denumite hife;

levuriformi – microorganisme unicelulare, de formă rotundă sau alungită ce se multiplică în principal prin burjeonare;

dimorfici – o categorie aparte de microorganisme, care pot apărea sub 2 forme, în funcție de condițiile de mediu: formă de levuri se găsește în țesuturile organismelor parazitate sau la 37˚C in vitro, iar formă filamentoasă apare când sunt cultivate la temperatura camerei sau la 30˚C, pe medii uzuale.

Infecțiile fungice și în special cele determinate de levuri au crescut semnificativ în ultimii ani.

3.1. Candida spp.

Candida este un gen de drojdii și este cea mai frecvența cauza a infecțiilor fungice la nivel mondial. Multe specii sunt comensale inofensive sau endosimbionte de gazde, inclusiv oameni. Totuși, atunci când barierele mucoasei sunt întrerupte sau sistemul imunitar este compromis, acestea pot invada și cauza boală.

Candida albicans este specia cea mai frecvent izolată și poate provoca infecții (candidoza) la om și la animale. Multe specii se găsesc în flora intestinală, incluzând Candida albicans în gazdele de mamifere, în timp ce altele trăiesc ca endosimbionti în gazdele de insecte. Genomul mai multor specii de Candida a fost secventiat. În timp ce femeile sunt mai susceptibile la infecții genitale de drojdie, bărbații pot fi de asemenea infectați. Anumiți factori, cum ar fi utilizarea prelungită a antibioticelor, cresc riscul atât pentru bărbați, cât și pentru femei. Persoanele cu diabet sau afectarea sistemului imunitar, cum ar fi cele cu HIV, sunt mai susceptibile la infecții cu drojdie.

Candida albicans este un tip de drojdie care este utilizat în mod obișnuit ca organism de model pentru biologie. Este în general menționată ca o ciupercă dimorfica, deoarece crește atât ca drojdie cât și în celule filamentoase.

Candida albicans prezintă o gama largă de fenotipuri morfologice diferite datorită comutării fenotipice și trecerii la tranziție hifă.

Candida tropicalis este o specie de drojdie din genul Candida. Este un patogen comun în gazde neutropaenice, în care se poate răspândi prin fluxul sanguin la organele periferice. Cercetările recente (din septembrie 2016) sugerează că Candida tropicalis, care lucrează sinergic cu Escherichia coli și Serratia marcescens, poate provoca sau contribui la boală Crohn.

Candida krusei este un agent patogen nou, care apare în primul rând la pacienții imunocompromisi și cei cu malignități hematologice. Mortalitatea datorată fungemiei Candida krusei este mult mai mare decât cea mai comună de Candida albicans. Alte specii de Candida care se potrivesc de asemenea acestui profil sunt Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida tropicalis.

Candida krusei crește la o temperatura maximă de 43°C-45°C. Numai Candida krusei poate crește în medii fără vitamine. Cu toate acestea, din speciile Candida care sunt importante din punct de vedere medical, Candida krusei este probabil singură specie care crește pe agar de dextroză de Sabouraud ca o colonie cu o mata sau o suprafață galbenă albă, în contrast cu coloniile convexe ale altor specii de Candida spp. Această caracteristică, împreună cu aspectul "orezului de lungă durata" pe microscopie, ajută la identificarea definitivă a speciilor. O varietate complexă de acizi grași a fost demonstrată ca metaboliti atunci când cultură Candida krusei este cultivată în medii de cultură care conțin lactoză, este de asemenea capabilă să producă un număr de acizi carboxilici cu catenă scurtă când se cultivă în salivă suplimentată cu glucoză; Acestea includ acetat, piruvat, succinat, propionat, formiat și lactat. Rolul biologic al acestora, dacă există, este încă necunoscut.

Candida parapsilosis este o specie fungica a familiei de drojdii, care a devenit o cauza pricipală a sepsisului și a infecțiilor de răni și țesuturi la pacienții imunocompromisi. Spre deosebire de Candida albicans și Candida tropicalis, Candida parapsilosis nu este un agent patogen uman, fiind izolat din surse non-umane, cum ar fi animale domestice, insecte sau sol. Există mai mulți factori de risc care pot ajută Candida parapsilosis să colonizeze gazdă umană. Persoanele imuno-compromise și pacienții chirurgicali, în special cei care au o intervenție chirurgicală a tractului gastro-intestinal, prezintă un risc crescut de infecție cu Candida parapsilosis. În prezent, nu există un consens cu privire la tratamentul candidozei invazive cauzate de Candida parapsilosis, deși abordarea terapeutică include în mod obișnuit extracția oricărui corp străin detașabil și administrarea unui antifungic sistemic.

3.1. Cryptococcus sp.

Cryptococcus (gr. "sfera ascunsă") este un gen de ciuperci. Aceste ciuperci cresc în cultură ca drojdii. Formele sexuale sau teleomorfele speciilor Cryptococcus sunt ciuperci filamentoase din genul Filobasidiella. Numele Cryptococcus se utilizează atunci când se face referire la stările de drojdie ale ciupercilor.

Cryptococcus neoformans este o drojdie încapsulată și o ciupercă aerobă obligatorie, care poate trăi atât în plante, cât și în animale. Teleomorful său este Filobasidiella neoformans, o ciupercă filamentoasă aparținând clasei Tremellomycetes. Acesta se găsește adesea în excrementele de pasăre. Cryptococcus neoformans este un organism fungal încapsulat și poate provoca boală în gazdele aparent imunocompetente, precum și imunocompromise.

Cryptococcus neoformans crește ca o drojdie (unicelulară) și se multiplică prin înmugurire. Face hifele în timpul împerecherii și în cele din urmă creează bazidiospori la sfârșitul hifelor înainte de a produce spori. În condițiile gazdei, incluzând scăderea glucozei, a serului, a dioxidului de carbon de 5% și a fierului scăzut, printre altele, celulele produc o capsulă polizaharidica caracteristică.

Recunoașterea ciupercii Cryptococcus neoformans în frotiuri colorate gram ale exudatelor purulente poate fi împiedicată de prezența capsulei gelatinoase mari care aparent împiedică colorarea definitivă a celulelor asemănătoare drojdiei. În astfel de preparate colorate, acestea pot apărea fie ca celule rotunde cu incluziuni gram-pozitive granulare impresionate pe fondul citoplasmatic al levandei palide sau ca corpuri lipoidale gram-negative. Când este crescută ca drojdie Cryptococcus neoformans are o capsulă proeminentă compusă mai ales din polizaharide. Sub microscop, pată de cerneală din India este utilizată pentru vizualizarea ușoară a capsulei în fluidul cerebral spinal. Particulele de pigment de cerneală nu intră în capsulă care înconjoară celulă de drojdie sferică, rezultând o zonă clară în jurul celulelor. Această permite identificarea rapidă și ușoară a Cryptococcus neoformans. Formele morfologice neobișnuite sunt rareori văzută. Pentru identificarea în țesut, petele de mucicarmina asigura o colorare specifică a peretelui celular polizaharidic în Cryptococcus neoformans.

PARTEA II

CERCETARI PERSONALE

CAPITOLUL IV

MATERIALE ȘI METODE

4.1. Obiective

Lucrarea de față este rezultatul unui studiu statistic retrospectiv efectuat în perioada 01.01.2015-31.12.2015 pe un număr total de 651 probe de urină ale pacienților cu infecție de tract urinar din Centrul de Medicină Uro-Genitală SC MED LOVE SRL din Alexandria, județul Teleorman. Din cele 651 probe de urină, 200 au provenit de la pacienți de sex feminin și 300 de la pacienți de sex masculin.

Pentru a izola speciile de microorganisme din probele de urină ale pacienților cu infecție de tract urinar s-au utilizat tehnici specifice, precum examen microscopic (coloratia Gram), urocultură (pe mediu BA și CLED) și antibiogramă.

Metodele de diagnostic folosite pentru aceste cazuri au fost examenele microscopice, culturi pe mediu BA și CLED și antibiogramele.

În acest studiu retrospectiv am urmărit o serie de corelații ale următoarelor microorganisme și datele personale ale pacienților (mediul de proveniență, vârstă, sex): Escherichia coli, Haemophilus sp., Klebsiella spp. (Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella sp.), Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. (Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans), Candida spp. (Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida tamata, Candida sp.).

4.2. Materialul studiat

Prin funcția de excreție a urinii, rinichiul intervine în reglarea metabolismului hidroelectric, în menținerea echilibrului acido-bazic și în eliminarea produșilor metabolismului general.

Urina constituie un produs biologic cu o compoziție complexă, prin intermediul căreia se poate explora starea funcțională a rinichilor și cailor de excreție a urinii.

Un examen de urină complet, interpretat corect, poate oferi informații importante pentru evaluarea stării de sănătate. Evaluarea unei analize depinde de eșantionul recoltat, tehnică de recoltare, rapiditatea cu care s-a efectuat analiză, competență laboratorului. Analiză urinii se poate face din examen sumar, examen fractionat sau examen al urinii din 24 ore. Un examen obișnuit de urină implică examen macroscopic, fizico-chimic, microscopic și bacteriologic.

4.3. Tehnici de identificare a bacteriilor în laborator

Microorganismele studiate în laborator au dimensiuni foarte mici, de ordinul micronilor, astfel încât pentru exameninarea lor este necesară o mărire de circa 1.000. există diferite tehnici prin care se poate pune în evidență prezența unor microorganisme însă, de mare utilitate este examenul microscopic care se poate adresa unor preparate microscopice proaspete (umede, între lamă și lamelă) sau examen mcarsocopic sau al unor frotiuri fixate și colorate în funcție de suspiciunea diagnosticată etc.

Uneori examenul microscopic este decisiv pentru diagnostic, alteori are un rol orientativ.

Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecții trebuie că dintr-un produs recoltat de la pacient să obținem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru că ulterior să i se poată studia caracterele fenotipice sau genotipice. Cultivarea este esențială și pentru determinarea sensibilității la antibiotice și chimioterapice.

Metodele de cultivarea a bacteriilor sau fungilor urmăresc trei obiective: obținerea unei populații microbioene suficiente cantitativ pentru investigațiile propuse, prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin și izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în culturi monomicrobiene denumite „culturi pure”. Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărui organism.

Termenul de „însămânțare” definește operația de introducere a unei cantități de germeni într-un mediu de cultură artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă embrionare și mai ales animale de experiență se folosește termenul „inoculare”.

Cultivarea se realizează prin însămânțarea microorganismelor pe medii de cultură. Mediile solide sau lichide care asigura nutrienții și condițiile fizico-chimice necesare creșterii și multiplicării se numesc medii de cultură. Totalitaea microorganismelor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură se numește cultură (bacteriană, fungica etc.).

Cultivarea prelevatului de urină se numește „urocultură” și se poate face pe diferite medii de cultură.

Include mai ales determinarea cantitativă a germenilor urinări nespecifici, completată cu antibiogramă urinară. Urină pentru examinare se recoltează într-un recipient steril, obișnuit din mijlocul jetului urinar, după o prealabilă toaletă a organelor genitale.

Există o varietate foarte mare de medii de cultură. Mediile de cultură se pot clasifică după mai multe criterii. În funcție de conținutul în celule vii, ele sunt clasificate astfel:

medii necelulare (artificiale, medii de cultură);

medii celulare (care includ celule vii) și anume animalele de laborator, ouă de găină embrionate sau culturi de celule.

Mediile de cultură artificiale sunt ieftine și se pot prepară ușor, fiind cele mai frecvent utilizate în practică microbiologică.

4.3.1. Examenul microscopic (Colorația Gram)

Colorația gram este o metodă de colorare utilizată pentru a diferenția speciile bacteriene în două mari grupe: gram-pozitive și gram negative. Numele acestei metode provine de la bacteriologul danez Hans Christian Gram, care a dezvoltat tehnică în timp ce lucra cu Carl Friedländer în morgă spitalului de la Berlin din 1884. Gram nu a conceput tehnică pentru a distinge un tip de bacterie de altul, ci pentru a face bacteriile mai vizibile în secțiunile colorate ale țesutului pulmonar. Acesta a publicat metodă în 1884 și a inclus în raportul sau observația că bacilul tifos nu a reținut pată.

Metodă diferențiază bacteriile prin proprietățile chimice și fizice ale pereților lor celurari și detectarea peptidoglicanului, care este prezent în peretele celular ale bacteriilor gram pozitive. Celulele gram negative conțin, de asemenea, peptidoglican, dar un strat foarte mic se dizolvă atunci când se adaugă alcoolul.

Acesta este motivul pentru care celulă își pierde culoarea inițială. Bacteriile gram-pozitive rețin culoarea violet cristal și, prin urmare, sunt colorate violet, în timp ce bacteriile gram-negative nu; după spălare, se adaugă o culoare de contrast (de obicei safranină sau fucsină ) care va colora bacteriile gram-negative în roz. Atât bacteriile gram negative cât și cele pozitive preiau culoarea de contrast. Totuși, pe bacteria gram pozitivă nu se vede culoarea de contrast datorită faptului că violetul de cristal este mai închisă.

Această metodă este aproape întotdeauna primul pas în identificarea preliminară a unui organism bacterian. În timp ce colorarea Gram este un instrument de diagnostic valoroasă în ambele studii clinice și de cercetare, nu toate bacteriile pot fi clasificate definitiv prin această tehnică. Acest lucru da naștere la grupuri gram-variabile și gram-nedeterminate.

Bacteriile gram pozitive au în general o singură membrană (sunt monoderme ) înconjurată de un peptidoglican gros.

Unele bacterii au pereți celulari deosebit de abili în păstrarea petelor de culoare. Acestea vor părea pozitive prin pată gram, chiar dacă nu sunt strâns legate de alte bacterii gram-pozitive. Acestea se numesc bacterii acide rapide și pot fi diferențiate numai de alte bacterii gram-pozitive prin proceduri speciale de colorare.

Bacteriile gram negative, posedă, în general, un strat subțire de peptidoglican între două membrane (sunt diderme). Bacteriile, care după coloratia gram produc un model variabil de culoare (ameste ce celule roz și mov) sunt numite bacterii gram variabile sau nedeterminate.

4.3.2. Cultivarea pe plăci BA (Blood Agar)

Plăcile de geloză sânge conțin substanțe nutritive generale și sânge de ovine de 5%. Acestea sunt utile pentru cultivarea organismelor complexe și pentru determinarea capacităților hemolitice ale unui organism.

Unele bacterii produc exoenzime care lizează celulele roșii din sânge și degradează hemoglobină; acestea sunt numite hemolizine.

Bacteriile pot produce diferite tipuri de hemolizine. β-hemolizină descompune complet globulele roșii și hemoglobină. Acest lucru lasă o zona clară în jurul creșterii bacteriene. Astfel de rezultate se referă la β-hemoliză (hemoliză beta). α-hemolizină descompune parțial celulele roșii din sânge și lasă în urmă o culoare verzuie. Această se numește a-hemoliză (hemoliză alfa).

Culoarea verzuie este cauzată de prezența biliverdinului, care este un produs secundar al defalcării hemoglobinei. Dacă organismul nu produce hemolizine și nu descompune celulele sanguine, nu va avea loc nici o curățare. Această se numește γ-hemoliză (hemoliză gamma).

Hemolizinele produse de streptococi funcționează mai bine într-un mediu anaerob.

4.3.3. Cultivarea pe plăci CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient)

CLED (mediul cu deficit de electroliză la lactoză de cistină) este un mediu valoros de creștere neinhibitor utilizat în izolarea și diferențierea organismelor urinare. Fiind lipsit de electroliți, această împiedică înmulțirea speciei Proteus. Cistina promovează formarea coloniilor pitic dependențe de cistină. Bromothymol albastru este indicatorul utilizat în agar, se transformă în galben în cazul producerii de acid în timpul fermentării lactozelor sau modificări la albastru în cazul alcalinizării. Lactoză-bacterii pozitive construi colonii galbene. Bacteriile care decarboxilizeaza L-cistină determina o reacție alcalină și construiesc colonii albastre.

Se recomandă utilizarea metodelor cantitative pentru cultivarea probelor obținute din urină. Pentru cele mai bune rezultate, mediul trebuie inoculat cu o buclă de 1ul dintr-o urină de urgență proaspăt golită, "curată", cât mai curând posibil după primire. Dacă există o întârziere în introducerea specimenului în laborator, acesta trebuie răcit până când este posibilă inocularea în mediul înconjurător. Incubați suportul la 35 +/- 2 ° C. Timp de 24-48 de ore.

Dacă este disponibil numai un volum mic de urină, poate fi turnată o proba mică (aproximativ 1 ml) direct pe mediu și placă se învârte pentru a acoperi întreagă suprafață pentru inoculare.

Se numără numărul de colonii de pe placă. Se multiplică rezultatul cu numărul corespunzător pentru a converti numărul la numărul de CFU pe ml de proba de urină.

Potențialii contaminanți bacterieni apar de obicei în număr scăzut și variază în morfologie. Agenții patogeni tipici urinări vor produce, de obicei, număr mare, vor avea morfologii uniforme ale coloniilor și ar trebui să fie subculturate direct în medii de rutină pentru teste suplimentare de identificare și susceptibilitate.

4.3.4. Antibiograma

Prin antibiogramă se înțelege testarea sensibilității unei tulpini bacteriene izolate dintr-un produs patologic față de diverse antibiotice. Antibiogramă este una dintre cele mai utile determinări de laborator care aduce informații prețioase privind atitudinea medicului în terapia cu antibiotice. Astfel se caracterizează capacitatea acestora de a opri dezvoltarea microbiană și de a da informații pentru selectarea celui sau celor mai active antibiotice față de microorganismul testat. Termenii de antibiotic și chimioterapic se folosesc că sinonimi.

Introducerea unui antibiotic în terapie este o mare responsabilitate medicală, cerând respectarea unor condiții bine determinate:

Antibiogramă se face după stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea în cultură pură și prin identificarea agentului patogen.

În cazuri de extremă urgență, se poate administra un antibiotic (înainte de efectuarea antibiogramei) dar numai după recoltarea produselor patologice.

Tratamentul se realizează în funcție de rezultatele date de antibiogramă, alegînd antibioticul cel mai eficace, adică față de care bacteria izolată are cea mai mare sensibilitate.

Antibiogramă trebuie repetată dacă tratamentul cu antibiotice este de durata mai lungă; această deoarece agentul patogen poate să cîștige rezistență față de antibioticul utilizat.

Apoi în cursul tratamentului datorită dezechilibrului din populațiile microbiocenozelor, poate să se producă o infecție supraadăugată cu o bacterie din aceste microbiocenoze.

Principiul antibiogramei constă în capacitatea antibioticelor de a împiedică multiplicarea bacteriană, fenomen cunoscut că efect bacteriostatic.

Unele antibiotice au în anumite concentrații și proprietatea de a ucide bacteriile: efect bactericid.

Metoda difuzimetrică (Kirby-Bauer)

Această se efectuează pe medii solide, în plăci Petri, pe care s-a însămânțat în pânză cultură bacteriană; apoi pe suprafață mediului se dispun discuri cu antibiotice astfel că în jurul acestora se va realiza un gradient de concentrație prin difuziunea locală a antibioticului (în imediată vecinătate a discului realizându-se o concentrație mai mare de antibiotic care descrește pe măsură îndepărtării de acesta).

Metodă difuzimetrică, cu toate că nu stabilește concentrația minimă infibitorie (CMI), da informații prețioase asupra sensibilității speciei testate față de antibioticele utilizate și este folosită mai frecvent în laboratorele clinice.

Tehnica de lucru:

Mediul de cultură indicat este geloză Müller-Hinton deoarece are o valoare nutritivă care permite dezvoltarea optimă a unei mari varietăți de bacterii și nu conține inhibitori ai acțiunii unor antibiotice.

Pentru bacterii cu necesități de cultură speciale, se utilizează medii adecvate (de exemplu, pentru Streptococcus pyogenes se folosește geloză sânge).

Coloniile izolate (5 colonii) obținute din produsul patologic, se însămânțează în bulion, care se incubează la 37 °C (~ 5-10 minute), se determină turbiditatea culturii corespunzătoare etalonului 0,5 McFarland (cu ajutorul scării McFarland cu sulfat de bariu sau automat pe densitometru).

Se însămânțează plăcile în maxim 15 minute de la etalonare; se lasă placa însămânțată 3-5 minute (niciodată mai mult de 15 minute) pentru adsorbtia inoculului. Se depun discurile cu substanțe antibicrobiene la distanță de minimum 15 mm de marginea plăcii și 30 mm între centrele a două discuri vecine folosind o pensă sau, mai bine un dispersor automat de discuri.

Se incubează plăcile la 37° C pentru 16-18 ore.

Control de calitate: se testează pe altă placă, în aceleași condiții, tulpină de referință adecvată.

Citirea si interpretarea:

Se măsoară cu șublerul sau cu rigla gradată în mm, diametrul zonelor de inhibiție completă, în lumina reflectată, pe fond negru mat.

În cazul mediilor transparente se măsoară pe spatele plăcilor, iar în cazul mediilor cu sânge pe suprafață agarului. În caz de urgență, se poate citi antibiogramă după 5-6 ore de incubare, cu condiția verificării diametrelor și la 16-18 ore.

Se verifică dacă diametrele zonelor de inhibiție ale fiecărei substanțe antimicrobiene sunt cuprinse în limitele variației admise conform tabelelor de interpretare furnizate împreună cu discurile.

Se interpretează astfel:

sensibil (S);

intermediar (I);

rezistent (R)

în funcție de valorile din tabelele de interpretare.

CAPITOLUL V

CONDIȚIILE GENERALE ÎN CARE S-AU EFECTUAT CERCETĂRILE

5.1. Scurtă prezentare a Centrului de Medicină Uro-Genitală S.C. Med Love S.R.L.

Înființat în anul 2009, în Alexandria, județul Teleorman, Centrul de Medicină Uro-Genitală S.C. MED LOVE S.R.L. este recunoscut în piața serviciilor medicale private prin:

Centrul de Medicină Uro-Genitală MED LOVE, are cu un specific aparte. Are o echipa internațională, o familie cu formare profesională performanță care caută pentru pacienți cu ajutorul înaltei tehnologii atât în cadrul expertizei de laborator cât și în domeniile obstretică-ginecologie, urologie, andrologie, psihologie, tratamentul infertilității cuplului, reproducerea umană asistată, medicină quantică și epidemiologie.

Laboratorul “Med Love“ asigura o paletă largă de investigații de laborator (peste 600), având departamente de hematologie, biochimie, imunologie, microbiologie, virusologie, parazitologie, micologie, citologie, andrologie și toxicologie.

5.2. Zona studiată – județul Teleorman

Județul Teleorman este situat în partea de sud a țării, în mijlocul Câmpiei Române. Teleormanul se numără printre județele mijlocii că întindere, având o suprafață de 5790 km² ceea ce reprezintă 2,4% din suprafață țării (locul 19). În cuprinsul județului Teleorman se află 3 municipii, 2 orașe și 92 de comune cu 231 de sate.

La sud, județul se mărginește cu fluviul Dunărea – limita naturală dintre țară noastră și Bulgaria – apoi cu județele Olt la vest, Argeș și Dâmbovița la nord, Giurgiu la est. Reședința județului este municipiul Alexandria.

Caracterizat prin relief de câmpie, teritoriul județului cuprinde o parte din Câmpia Română — partea vestică a Câmpiei Burnasului și cea sudică a Câmpiei Găvanu-Burdea, precum și lunca Dunării din acest sector. Rețeaua hidrografică include Dunărea și afluenții săi importanți: Oltul, Urlui, Călmățui și Vedea. Zona nord-estică a județului este scăldată de apele râurilor Dâmbovnic, Glavacioc și Călniștea, afluenți ai Neajlovului. Teritoriul județului întrunește condițiile de relief pedoclimatice favorabile pentru practicarea agriculturii cu irigații. Nord-estul județului este bogat în rezerve de țiței și gaze naturale (Blejesti, Siliștea, Trivalea-Moșteni, Ciolanesti, Poeni, Talpă, Videle).

Clima este temperat-continentală, specifică pentru câmpia sudică, având un potențial caloric ridicat, cu amplitudini mari ale temperaturii aerului, cantități reduse de precipitații, cu regim adeseori torențial, (în perioada de vara) însoțite de perioade frecvente de seceta. Poziția centrală a câmpiei face că zona să aibă un climat de tranziție între partea estică – climă mai moderată – și partea vestică, având climat continental.

Temperaturile medii anuale sunt: 11 grade C, cea mai mare temperatura medie anuală 21,5 grade C, cea mai mare temperatura medie lunară în luna iulie, – 27 grade C, cea mai scăzută temperatura în luna ianuarie.

Fiind un județ de câmpie cu o suprafață mare arabilă, județul dispune de un sol cu grad ridicat de fertilitate de cernoziom, brun-roșcat de pădure, fapt ce permite posibilitatea unor investiții deosebit de avantajoase. O altă bogăție o constituie lacurile naturale (Suhaia, Baldovinesti, Belciug) și cele artificiale amenajate pentru piscicultură.

Fluviul Dunărea udă teritoriul județului la limita sudică pe o lungime de 119 km, iar răul Olt pe 20 km, Vedea pe 120 km, Teleormanul pe 89 km și Călmățuiul pe 112 km. Există două porturi pe Dunăre: Turnu Măgurele și Zimnicea.

Vânturile care bat prin acest județ sunt: crivățul, suhoveiurile, Băltărețul, Vântul negru, Zefirul. Crivățul este un vânt de pe teritoriul Moldovei, Dobrogei și partea sud-estică a Munteniei, care suflă mai ales iarnă aducând zăpadă, furtuni de zăpadă și ger, fiind un vânt puternic. Suhoveiurile sunt vânturi care bat vara (foarte uscate) în Podișul Moldovei, Podișul Dobrogei și Bărăgan. Băltărețul este un vânt cald și umed din Muntenia ce aduce ploi. Vântul negru este un vânt care vine din Dobrogea și sudul Munteniei. Acesta este un vânt uscat și fierbinte ce aduce seceta. Zefirul este un vânt slab care suflă din apus.

Se știe faptul că condițiile climatice și mediul de viață afectează bolile oamenilor încă de la sfârșitul secolului al XIX-lea. Perioadele de tranziție, de la iarnă la primăvară, când vremea este instabilă, duc la instabilitatea climei și la circulația generală a vântului. Aceste perioade de tranziție influențează într-o oarecare măsură și infecțiile de tract urinar la populația din județul Teleorman. Fiind o zona irigată de multe ape, acestea contribuie la răspândirea microorganismelor, care pot supraviețui în mediu extern.

CAPITOLUL VI

REZULTATE OBȚINUTE

6.1. Rezultate privind incidenta asupra speciilor de enterobacterii cercetate

6.2. Rezultate privind incidenta speciilor de coci gram pozitivi cercetați

6.3. Rezultate privind incidenta speciilor de fungi cercetați

CONCLUZII GENERALE

BIBLIOGRAFIE

Virella G. T., 1999, Microbiology, immunology, and infectious diseases, Lippincott Williams n Wilkins, 101:112 p, 125:128 p, 133:136 p, 141:147 p, 159:166 p, 335:359 p,

ISBN: 0-683-06235-2.

Buiuc D., Neguț M., 2017, Tratat de microbiologie clinică, Editura Medicală, București, 714:726 p, 742:768 p, 575:589 p, 555:570 p, 529:530 p, 470:498 p, 279:292 p, 46:71 p, 90:91 p, ISBN: 973-39-0398-1.

Fisher F., Cook N.B., 1998, Fundamentals of Diagnostic Mycology, 1e 1st Edition, W. B. Saunders Company, USA, 17:27 p, 29 p, 108 p, 54 p, 123 p, 197:214 p, 234:247 p, ISBN: 0-72-16-5006-6.

Forbes B., Sahm D., Weissfeld A., 2007, Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology

12th Edition, Mosby Elsevier, USA, 187:186 p, 193:198 p, 208:209 p, 211:213 p (ANTIBIOGRAMA), 218:261 p, 341:342 p, 430:433 (BRUCELLA SP.), 463:477 p (ALEGEREA MEDIILOR), 688 p (DIMATIACEI), 807 p (TABEL CORELATIE CU PATOLOGIE), 819:820 p (STREPTOCOCCUL), 900 p (POARTA DE INTRARE), 922 p, 917 p, 921 p, 931 p (ANTIBIOGRAMA), ISBN: 13978-0-323-03-065-6.

Singleton P (1999). Bacteria in Biology, Biotechnology and Medicine (5th ed.). Wiley. pp. 444–454. ISBN 0-471-98880-4.

Acatincăi S., 2003. Etologia. Comportamentul animalelor domestice. Editura Eurobit, Timișoara, 190 p.

Blanc G., B. Delage, 1951. Icterohemorrhagic leptospirosis in Morocco; receptivity to the virus of the Moroccan squirrel Xerus (Atlantoxerus) getulus. Maroc Med. 30 (309): 75-76.

Chișamera G., D. Murariu, P. B. Matei, C. Stanciu, 2010. Preliminary results of the observations on Moroccan mammals. Results of the “Atlas 2007” Expedition. Annual Zoological Congress of “Grigore Antipa” Museum – Book of abstracts: 109, ISBN: 978-606-8015-40-8.

Cociu M., 1999. Etologie. Comportamentul animal. Ed. ALL, București.

Gouat P., I.-E. Yahyaoui, 2001. Reproductive period and group structure variety in the Barbary ground squirrel Atlantoxerus getulus. Preliminary results. Lecture at the University of Paris, 13 : 343-352.

López-Darias M., 2007. Ardilla moruna Atlantoxerus getulus (Linnaeus, 1758). Galemys 19 (2): 59-63.

López-Darias M., J. M. Lobo, P. Gouat, 2008. Predicting potential distributions of invasive species: the exotic Barbary ground squirrel in the Canarian archipelago and the west Mediterranean region. Biol Invasions, 10: 1027-1040.

López-Darias M., A. Ribas, C. Feliú, 2008. Helminth parasites in native and invasive mammal populations: comparative study on the Barbary ground squirrel Atlantoxerus getulus L. (Rodentia, Sciuridae) in Morocco and the Canary Islands. Acta Parasitologica 53 (3): 296-301.

Thorington R. W. Jr., J. L. Koprowski, M. A. Steele, J. F. Whatton, 2012. Squirrels of the World Baltimore, MD: Johns Hopkins University Press. 459 p.