CERCETĂRI PRIVIND INCIDENȚA INFECȚIILOR CU BORRELIA ÎN PERIOADA 2016-2017 ÎN ROMÂNIA [306507]

CERCETĂRI PRIVIND INCIDENȚA INFECȚIILOR CU BORRELIA ÎN PERIOADA 2016-2017 ÎN ROMÂNIA

Coordonator Absolvent: [anonimizat]

2017

INTRODUCERE

În Uniunea Europeană (UE), prin programul European Concerted Action on Lyme Borreliosis (EUCALB), s-a luat o [anonimizat]. Acest program finanțat de UE își propune sa finanțeze și să promoveze programe de cercetare și diagnosticare a [anonimizat].

Începând cu anul 2006 [anonimizat] – Boala Lyme este actualizat astfel încât să existe o [anonimizat]-se, [anonimizat]. A existat o activitate importată din partea grupurilor de sprijin pentru pacienți și a [anonimizat]. [anonimizat]. Acest fapt a determinat o evaluare a recomandărilor din Europa comparativ cu cele din SUA.

Boala Lyme are o complexitate ce depășește caracteristicile enunțate de Munderloh și Kurtti[1], având mai mult de 1500 de secvențe de gene. [anonimizat] 132 de gene funcționale. [anonimizat], [anonimizat] 22 de gene funcționale. Totodată, Borrelia conține 21 de plasmide, 9 circulare și 12 liniare, adică cel mai mare număr de plasmide găsite în orice baterie cunoscută. Numărul mare de gene plasmide se presupune că oferă o [anonimizat] o creștere a patogenității[2].

Pentru a [anonimizat] a [anonimizat][3]. [anonimizat], [anonimizat], fie datorită celulelor „camuflate” [anonimizat]-o [anonimizat]. Această strategie de camuflare a [anonimizat]. [anonimizat] a citochinelor (acțiunea autocrină a acestora) după ce au fost în stare latentă o perioadă mare de timp[4]. Studiile au indicat că Borrelia burgdorferi utilizează gena numită luxS pentru a regla înmulțirea, genă care este utilizată și de alte bacterii în același scop. Este prima dată când acest proces a fost identificat la o spirochetă[5].

Prin urmare, combinația genetică atât de complexă, localizarea intracelulară, evitarea sistemului imunitar și autoreglarea face din Borrelia burgdorferi un agent infecțios formidabil. Cu toate aceste informații complexe despre Borrelia burgdorferi indicate până în prezent, există în mediul clinic o apreciere des întâlnită că boala Lyme se poate trata și vindeca în 2-4 săptămâni, utilizând antibiotice. Această percepție poate fi adevărată în cazul infecțiilor acute tratate prompt. Însă, în cazul afecțiunilor cronice care permit mecanismelor fiziopatologice complexe ale Borrelia burgdorferi să acționeze și care conduc la o invazie perseverentă a țesuturilor, tratamentul și eradicarea bolii este extrem de dificilă[6].

Pentru a îmbunătăți abordarea clinică a bolii Lyme de către medicii din România, trebuie să existe o înțelegere mai bună a complexității fiziopatologice a Borrelia burgdorferi. Astfel, trebuie să fie înțeleasă importanța existenței unui protocol de diagnostic și de analiză în laboratoare specifice, utilizând metodele Western Blot și Imunofluorescența, metode utilizate atat în fazele incipiente cat și cele cronice ale ale bolii, urmate de un tratament adecvat.

CONSIDERAȚII TEORETICE

I.1. GENUL BORRELIA

Borrelia burgdorferi aparține genului Borrelia, familia Spirochetaceae. Această bacterie a fost izolată atât de la pacienți (sânge și țesuturi), de la căpușe vector, cât și de la o multitudine de animale și păsări ce constituie o sursă de infecție. Alte borrelii sunt incriminate în etiologia altor îmbolnăviri (febre recurente)[7].

Studiile epidemiologice au arătat că răspândirea borreliilor în lume s-a realizat de pe continentul nord-american, în special prin migrația păsărilor și altor animale parazitate de căpușe[8]. Totodată, s-a demonstrat existența unor diferențe de tropism tisular între diferite genospecii de Borrelia burgdorferi. Astfel, Borrelia burgdorferi determină frecvent artropatii, Borrelia garinii determină frecvent neuropatii, iar Borrelia afzelii determină frecvent acrodermatită cronică atrofiantă[8].

Heterogenitatea Borrelia burgdorferi din regiuni diferite ale lumii poate explica anumite diferențe observate în prezentarea clinică a Borreliozei Lyme în SUA și Europa.

Ordinul Spirochetales are două familii:

Spirochetaceae

Leptospiraceae

și numai 6 genuri:

Serpulina

Spirochaeta

Cristispira

Treponema

Borrelia

Leptospira

Specii patogene pentru om și animale se cuprind în genurile Borrelia, Leptospira și Treponema[9].

I.1.1. Habitat vectori – Particularități epidemiologice ale vectorilor

Borrelia burgdorferi este un endoparazit care nu poate trăi decât în interiorul unui organism. Borrelia burgdorferi este transmisă de căpușele din genul Ixodes ricinus, figura 1. Aceste căpușe sunt artropode parazite temporar, parazitism datorat modului de hrănire realizat pe seama animalelor[12].

În partea de NV și centrală a SUA, vectorul de transmitere al Borrelia burgdorferi este Ixodes dammini, iar în partea de V a SUA, vectorul de transmitere este Ixodes pacificus[7].

În Europa, Ixodes ricinus este principalul vector de transmitere a bolii. Doar căpușele Ixodes sunt implicate în transmiterea bolii la oameni[4]. Aceste căpușele se hrănesc o sigură dată în fiecare dintre cele 3 etape ale ciclului lor de viață de 2 ani de zile. În SUA, nimfele și larvele de Ixodes dammini se hrănesc din șoareci, iar căpușele adulte se hrănesc din mamiferele mari, în special căprioarele și urși (de aceea ele se mai numesc și căpușe de căprioară sau căpușe de urs). La șoareci spirochetele nu determină niciun fel de condiție patologică, aceștia prezentând spirochetemie pe parcursul verii. Cum larvele de căpușă se hrănesc din șoarecii care sunt infectați, ele sunt infectate la rândul. Aceste spirochetele rămân în tractul digestiv al căpușei până vara care urmează, atunci când, ajunsă la stadiul de nimfă se atașează pe o altă gazde. Din acest moment, se produce o migrare a spirochetelor către glandele salivare ale căpușei, fiind inoculate gazdei în momentul hrănirii din aceasta. Prin urmare, căpușele aflate în stadiul de nimfă sunt responsabile de majoritatea transmiterilor. În urma studiilor realizate s-a observat că transmiterea experimentală la rozătoare implică o perioadă de minim 24 de ore de la momentul de atașării căpușei până la transmiterea eficientă a spirochetelor[13].

În acest ciclu de viață, persistența spirochetelor este dependentă major de gazdă ( de mamifere mici), în timp ce căprioarele par a avea un rol important doar în supraviețuirea formei adulte și la menținerea ciclului de viață al căpușelor[7]. Din punct de vedere al patologiei umane doar 3 specii de Borrelia – burgdoferi sensu stricto, garinii și afzelli sunt importante. Celelalte specii întâlnite frecvent, Borrelia valaisiana, Borrelia lusitanea și Borrelia japonica nu par a avea o importanță clinică la fel de accentuată. Căpușele din genul Argas și Boophilus transmit borelioza aviară și bovină. Speciile de Borrelia sunt de asemenea asociate cu febra recurentă la oameni. Astfel, căpușele moi aparținând genului Ornithodorus transmit Borrelia hermsii, iar Borrelia recurrentis este transmisă de către păduchi[9].

Speciile de căpușe europene Ixodes pot adăposti simultan chiar și patru specii diferite de Borrelia. În general, cea mai prezentă formă este Borrelia afzelii, în Marea Britanie și Irlanda cea mai întâlnită este Borrelia valaisiana. În unele zone din Europa și Asia apare și Borrelia garinii. Trebuie menționat că, chiar și atunci când un anumit genotip de Borrelia predomină, pot apărea infecții cu alte

tulpini de patogenitate variată[5].

Căpușele din genul Ixodes ricinus transmit Borrelia burgdorferi. Vectorii primari sunt Ixodes scapularis (dammini), (N-V SUA), Ixodes pacificus (V SUA) și Ixodes ricinus (Europa)[7]. Este puțin probabil ca alte artropode să aibă un rol în transmiterea spirochetei la gazdele animale, iar transmiterea non-vectorială nu a fost pe deplin lămurită, la fel ca și cea a transmiterii transplacentare[4].

I.1.2. Taxonomie și nomenclatură

Genul Borrelia aparține familiei Spirochaetaceae, tabelul 1., și are aproximativ 20 de specii. Acestea sunt asociate cu febra recurentă și sunt transmise de căpușe moi aparținând speciilor Ornithodoros sau Argas, sau de păduchi ce transmit Borrelia recurrentis. Începând din anii 1980 a existat un mare interes față de Borrelia burgdorferi, agentul cauzal primar al Boreliozei Lyme, agent patogen care este transmis prin căpușe dure aparținând genului Ixodes[10].

Atunci când a fost descrisă inițial, Borrelia Burdorferi a fost asociată ca fiind singura cauza a bolii Lyme. Însă, în ultimii ani, datorită hibridizării reciproce a unui număr foarte mare de tulpini, s-a demonstrat ca diversitatea genetică a acestei specii este mai mare decât se credea. De aceea, astăzi se menționează ca sursă a bolii Borrelia burgdorferi sensu lato (sl), care este formată din mai multe genospecii[10].

Borrelia burgdorferi sensu lato se poate împărți în 17 genospecii: Borrelia burgdorferi sensu stricto (ss), care este prezenta în Europa, SUA, Rusia (rar) și aparent absentă în Asia; Borrelia afzelli, Borrelia bavarensis, Borrelia garinii, Borrelia valaisiana, Borrelia spielmanii, Borrelia lusitaniae și Borrelia bissettii în Eurasia; Borrelia japonica, Borrelia. tanukii și Borrelia turdae limitat la Japonia; Borrelia sinica în China, și Borrelia andersonii, Borrelia californiensi și Borrelia carolinensis în SUA. Această clasificare este prezentata în tabelul 2.

Prima tulpină izolată de Borrelia burgdorferi a fost denumită B31 și are două proteine de suprafață externă dominante având greutățile moleculare și (). Aceste proteine de suprafață externă se mai numesc și proteine A și B sau OspA și OspB. Proteinele de suprafață exterioară a Borrelia burgdorferi ajută, cel mai probabil, la adaptarea spirochetei pentru a supraviețui în medii semnificativ diferite, de exemplu căpușele și mamiferele cu sânge rece[11].

Au mai fost identificate și alte antigene imunodominante. De aceea, exista o dependență între testarea serologică și modul de detectare a legării anticorpilor specifici. În continuare se fac eforturi pentru a se identifica și alte componente antigenice ale Borrelia burgdorferi[7].

I.1.3. Caractere morfologice și structură

La bază Borrelia are un cilindru protoplasmic alcătuit dintr-un strat de peptidoglicani, membrană citoplasmatică, prezentând flageli periplasmici între cilindrul protoplasmaic și cilindrul extern. Flagelii periplasmici sunt atașați subterminal la fiecare extremitate a cilindrului protoplasmic și se extind către extremitatea opusă a celulei, figura 2 a, b și c.

Aceasta are o lungime de 10-30 µm, având 3-10 spire laxe, cu helixul de stânga (se rotește antiorar). Pasul spiralei este de 2-4 µm, iar celulele se deplasează prin mișcări de rotație și torsiune. Aceste bacterii sunt Gram-negative, chemoheterotrofe, mobile, spiralate, fine[14]. Mobilitatea stil „tirbușon” este conferită de endoflageli, fiind o adaptare la mișcarea în medii vâscoase (de exemplu, mucoasa bucală, gastrointestinală, sedimente, etc.). În medii solide, endoflageli determină mișcări de flexare și îndoire a celulei bacteriene ce au ca

rezultat o deplasare prin alunecare. În plus, sunt capabile de staționare în mediu lichid, deși mediul curge[14]. Acestea sunt evidențiate foarte bine cu ajutorul microscopului în câmp întunecat[11].

Borrelia se poate cultiva pe medii fluide cu sânge, ser sau fragmente de țesut și în oul embrionat. După trecerea repetată in vitro, aceasta își pierde repede virulența si este foarte sensibilă la uscăciune, fiind complet dependente de gazdă[14]. În vitro Borreliile se tapetează cu un strat mucos amorf, alcătuit din componente ale gazdei. Proteinele majore ale membranei externe asigură variabilitatea antigenică a agentului patogen, dar aceste proteine de suprafață diferă în funcție de mediul în care se găsește bacteria.

Multiplicarea in vitro este lentă, având o durată de 8 – 15 ore, iar pasajele repetate pe mediul artificial modifică structura antigenică și celulele își pierd infecțiozitatea[14]. Fiecare multiplicare induce populații distincte antigenic, deoarece acestea induc sinteza anticorpilor specifici neutralizanți. Întotdeauna rămâne o populație mică de celule bacteriene viabile, rezistente la acțiunea anticorpilor, deoarece sunt variante antigenice distincte de populația parentală[4]. Aceasta este cauza inexactității testelor serologice, care pot fi atât fals-pozitive (prin interfețe) cât și fals-negative.

Antigenul major al celulelor de Borrelia este o proteină majoră a membranei cu caracter variabil (VMP), codificată de o familie de gene. Comutarea expresiei genelor acestei familii permite apariția, în timpul infecției, a unei mici populații de celule, care prin multiplicare va reface noua variantă antigenică – serotipică de Borrelia, rezistentă la efectul anticorpilor[4]. Proteina majoră a membranei are un rol important în localizarea tisulară a bacteriilor, de exemplu, Borrelia hermsii având potențialul de a genera 40 de serotipuri diferite de VMP.

Proteina majoră de virulență prezintă variante distribuite în clase de molecule mari () și mici ()[4].

Borrelia burgdorferi este un germen gram-negativ cu dimensiuni cuprinse între , cu diametrul de . Flagelii de la extremități îi asigură mobilitatea, iar flageli pliați sub membrana externă generează contorsiunile din timpul deplasării[8]. Analiza Borrelia burgdorferi la microscopul electronic a relevat că aceasta este alcătuită dintr-o membrană externă trilaminară care înconjoară spațiul periplasmatic în care se găsesc 7-11 flageli și cilindrul periplasmatic, figura 3. In vitro, celula este tapetată de un strat mucos amorf, acesta fiind alcătuit din componente ale gazdei. Membrana externă care are o structură trilaminară este alcătuită din proteine, lipide și glucide. In vitro în prezența anticorpilor specifici și a complementului, membrana externă formează vezicule[10].

Flagelii sunt așezați paralel cu axul lung, au inserție subterminală, bipolară la cilindrul protoplasmatic al Borrelia. burgdorferi și se suprapun în zona de mijloc a celulei. Flagelina este singurul tip de moleculă proteică care alcătuiește filamentele flagelare de B. burgdorferi. În toate stadiile infecției anticorpii antiflagelină au titru crescut, dar nu sunt protectori[14].

I.1.4. Caractere antigenenice și de patogenitate

În cazurile clinice ale Bolii Lyme sunt implicate Borrelia burgdorferi ss, Borrelia garinii, Borrelia bavariensis (o rudă apropiată a Borrelia garinii), Borrelia afzelii și Borrelia spielmanii (o rudă apropiată a lui Borrelia afzelii). Rezultatele oferite de PCR și din rezultatele serologice de la pacienți se obțin dovezi considerabile că Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l) are o implicație majoră în patogenitate pentru om și mamifere cu implicații clinice majore. Astfel, Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.) este cel mai adesea asociată cu artrita, în special în America de Nord, caz în care aceasta a și fost denumită Boala Lyme, în urma manifestărilor clinice din ținutul Lyme. Borrelia garinii este asociată cu simptome neurologice și Borrelia afzelii cu acrodermatita cronică atrofică cutanată (ACA)[6].

Datorită suprapunerii acestor specii patogene s-a produs o varietate bogată a manifestărilor clinice, iar la debutul infecției apare eritem migrans (EM), de intensități diferite, ce poate fi considerat un simptom precoce patognomonic. În Europa, există dovezi că acest simptom precoce apare mai frecvent în infecțiile cu Borrelia afzelii, mai ales la femei, decât în cele cauzate de Borrelia garinii, la care apare un eritem migrans non-inelar și sunt mai frecvente simptomele sistemice[15].

În lista agenților patogeni care nu generează boala Lyme se găsește Borrelia valaisiana, și Borrelia lusitaniae. Însă, Borrelia valaisiana a fost detectată în lichidul cefalorahidian prin PCR și Borrelia lusitaniae a fost izolat de la un caz de vasculită[6].

Informațiile disponibile despre Borrelia bissettii, o specie întâlnită în California, arată că o tulpină aparținând acestei specii a fost izolată de la un pacient uman în SUA, iar în Europa a fost raportat recent un caz în care Borrelia bissettii a fost izolat din țesutul endotelial al valvulei cardiace la om[13].

Progresele în identificarea patotipurilor în cadrul genospeciilor au înregistrat progrese mici până în prezent. Cu toate acestea subgrupuri mici, de Borrelia burgdorferi s.s. și Borrelia afzelii, au fost raportate a fi deosebit de invazive pentru om[13].

Momentan, patogeneza Bolii Lyme este puțin cunoscută. Rolul activ al căpușelor a fost demonstrat, convenindu-se că aceasta este modalitatea uzuală de transmitere. Astfel, acestea au rol și în multiplicarea agenților patogeni, pe lângă vehicularea lor de la animalul bolnav la unul sănătos. Boreliile traversează peretele intestinal al căpușelor și ajung în hemolimfă. De aici acestea ajung în glandele salivare ale parazitului, după care sunt injectate împreună cu saliva virulentă în dermul și subdermul celui parazitat. Cercetătorii consideră că multiplicarea boreliilor continuă la locul de inoculare și apoi la locurile de elecție spre care migrează[16].

Borrelia burgdorferi nu produce toxine, dar este un imunomodulator puternic. Efectele Borrelia burgdorferi asupra celulelor locale poate duce la supresia răspunsului imun local. Leziunile sunt rezultatul interacțiunii complexe a celulelor sistemului imun și a factorilor umorali, cum ar fi interleukinele, factori imuni circulanți, prostaglandinele sau colagenazele[15].

După penetrarea structurilor pielii, spirochetele se răspândesc local și produc eritem migrator. În plus, acestea vor disemina pe calea sângelui și vor afecta alte organe. Plasminogenul și urokinaza din sângele gazdei vor favoriza diseminarea hematogenă, iar boreliile au capacitatea de a adera la suprafața celulelor organismului infectat, prin legarea de anumiți receptori de suprafață. Boreliile care produc Boala Lyme prezintă afinitate atât pentru celulele de la nivelul tegumentului, cât și pentru celulele de la nivelul sistemului nervos, sau pentru celulele de la nivelul articulațiilor. În foarte multe situații, ADN-ul bacterian a fost detectat în produsele biologice prelevate din zonele pentru care patogenii prezintă afinitate[6]. În anumite zone endemice ale Bolii Lyme, 70-90% din populația de animale sensibile la infecția cu Borrelia burgdorferi este seropozitivă[17]. Însă, doar un mic procent dintre aceste animale suferă modificări morfofuncționale suficient de importante pentru a determina manifestări clinice, respectiv starea de boală[16].

Manifestările cronice cât și cele tardive diseminate ale bolii pot fi considerate rezultatul unei combinații a patologiei infecțioase și autoimune, sau numai a mecanismelor autoimune. Interacțiunea complexă dintre celulele sistemului imun și factorii umorali, ca de exemplu inteleukinele, factorii imuni circulanți, prostaglandinele sau colagenozele, pot fi răspunzătoare pentru leziunile tisulare și manifestările clinice ale bolii. Leziunile viscerale apar datorită inflamației produse de interacțiunea factorilor celulari și umorali ca răspuns la componentele antigenice ale boreliilor[9]. Prin urmare, starea de boală este mai curând consecința reacției inflamatorii a organismului la prezența și activitatea germenului, decât rezultatul acțiunii directe a microorganismului[16].

Deoarece limfocitele T și B proliferează într-o mare varietate de organe, infiltrarea limfocitară poate fi asociată cu acumularea de macrofage, celule imune dendritice și mastocite tisulare. Leziunile viscerale se datorează inflamației produse de interacțiunea factorilor celulari și umorali ca răspuns la componentele antigenice ale spirochetelor[6]. Diminuarea hematogenă poate fi corelată cu activarea specifică a plasminogenului în plasmină, care la rândul ei lizează fibronectina și alte proteine structurale membranoase și activează colageneza latentă[6].

Borrelia burgdorferi aderă la receptorii de membrană și apoi penetrează unele celule. Acest proces este urmat de lezarea celulei direct și indirect prin două mecanisme aparent distincte: stimularea mecanismelor de apărare ale gazdei (dar Borrelia Burgdorferi este rezistentă la acțiunea anticorpilor specifici); un răspuns imun la autoantigene cross-reacting cu unele antigene spirochetale (reacția încrucișată cu mielina perioscanală normală). Răspunsul imun al gazdei împotriva acestei infecții se produce progresiv. Astfel, după câteva săptămâni de la infecție, se constată o creștere a imunoglobulinelor serice de clasa IgM, sintetizate specific împotriva antigenelor bacteriene. Tot în această perioadă se poate evidenția și creșterea concentrației complexelor imune circulante (legătura dintre antigen și anticorp). După 21 de zile de la declanșarea infecției concentrația de anticorpi specifici circulanți este maximă. După câteva luni de la producerea infecției apar în circulație anticorpii de clasă IgG, iar creșterea titrului acestor anticorpi, este corelată cu apariția simptomelor de artrită. Boreliile au capacitatea de a stimula puternic producerea de factori proinflamatori – interleukina beta și factorul alpha de necroză tumorală. Prezența unui infiltrat inflamator format din limfocite și plasmocite este relevat la analiza histologică a țesuturilor infectate. De asemenea, mai pot fi decelate leziuni locale de vasculită[6].

Spirochetele nu sunt distruse de sistemul imunitar al organismului gazdă, acestea persistând un timp îndelungat în țesutul epitelial, articulații, sistem nervos, celulele sistemului de apărare și chiar în sânge și urină[5].

Având în vedere persistența clinică a Borrelia burgdorferi la pacienții cu Boala Lyme în ciuda tratamentului adecvat cu antibiotice, investigațiile in vitro ale variantelor morfologice și ale formelor atipice de Borrelia burgdorferi, au fost întreprinse într-o încercare de a afla mai multe despre variația acesteia și rolul formelor atipice în Boala Lyme. S-au izolat borrelii de la pacienți tratați sau netratați, cu diagnosticul de Boala Lyme confirmat. În plus, a fost analizată degenerarea borreliilor izolate în timpul expunerii la penicilina G, in vitro[15].

Analiza morfologică de câmp întunecat și scanare prin microscopie electronică a relevat modificări diverse. Bacteriile „supraviețuitoare” de la un număr mare de pacienți (60-80%), după tratamentul cu antibiotice au dezvoltat o formă atipică[15]. Astfel, au fost descrise modificări morfologice ale Borrelia burgdorferi în culturile cu penicilina G ce s-au dezvoltat treptat pe durata perioadei de incubație. Pleomorfismul, prezența de forme alungite și structuri sferice, incapacitatea celulelor de a se reproduce, perioada lungă de adaptare și coloniile asemănătoare celor de Mycoplasma sugerează faptul că Borrelia burgdorferi produce forme de sferoplaste[15]. Aceste forme care nu au perete celular pot fi un posibil motiv pentru care borrelia supraviețuieste în organism pentru o perioadă lungă de timp și titrurile anticorpilor dispar și emerg după revenirea la forma inițială[18].

I.2. BORRELIOZA

I.2.1. Istoricul borreliozei

Determinarea exactă a originii unei boli este dificilă, mai ales în situația în care aceasta ne-a însoțit de milenii, cum sunt de exemplu, sifilisul sau ciuma. De aceea, descoperirea exactă a originii Boreliozei – Boala Lyme este dificilă.

În anul 1883, doctorul german Alfred Buchwald, din Breslau, descrie o afecțiune a pielii similară cu cea produsă de Boala Lyme. În prezent, această boală este denumită „dermatită atrofică cronică”. Un medic suedez, Arvid Afzelius, în anul 1920, a raportat Societății De Dermatologie din Suedia despre o iritație a pielii care se extinde, despre care a presupus că este cauzată de căpușa unei oi, din genul Ixodes[20].

Între anii 1920 și 1930 au fost raportate din nou situații în care sau observat iritații roșii are se extind, numite eritem migrant (EM), însoțită de apariția unor simptome care, mai târziu, vor fi asociate Boreliozei. Însă, La momentul respectiv, aceste simptome observate nu erau atât de evidente încât sa poată fi asociate unei noi boli. În plus, numărul de cazuri observate a fost foarte mic.

În jurul anului 1940, cazuri de umflare a genunchilor au fost raportate În Long Island, New York, SUA, foarte mulți dintre pacienți fiind din regiunea Montauk Point. De aceea, acest fenomen a fost numit „Montauk knee”. În anul 1960 un medic din Wisconsin a recunoscut un caz de eritem migrant la un pacient, pe care l-a tratat cu succes utilizând penicilină. Totuși, nimeni nu a presupus că este vorba de o boală nouă.

În anul 1975, Judith Mench din localitatea Old Lyme, Connecticut, figura 4, și-a dus fiica de 8 ani la medic, deoarece aceasta prezenta simptom de genunchi umflat. Doctorii au presupus că este osteomielită, o infecție bacteriană a oaselor. Copilul a început un tratament cu antibiotice, însă testele de laborator nu au indicat nici o infecție virală, astfel încât tratamentul a fost întrerupt. Medici i-au prescris aspirină, recomandată în tratamentul artritei reumatoide la copii. Părinții copilei au pus la îndoiala acest diagnostic deoarece nu exista în istoria medicală a

familiei această afecțiune, în plus aceleași simptome mai existau și la alți copii. din vecinătate și cunoșteau că artrita nu este o boala contagioasă. Astăzi, se cunoaște că boala de care suferea copilul este Borelioză – Boala Lyme.

În anul 1975, Departamentul de sănătate Publică din Connecticut, a primit sesizări de la mai mulți pacienți, în majoritatea cazurilor copii din localitatea Old Lyme, care aveau simptome asociate artritei și iritații endemice roșii. Epidemiologii s-au concentrat pe zona orașelor Lyme, Old Lyme și East Haddam, Connecticut, unde era localizată boala, pentru a studia mai în detaliu aceste cazuri. Au studiat similaritatea dintre cazuri, adică perioada de raportare a bolii, figura 5, vârsta și sexul persoanelor afectate, precum și factorii ereditari. În plus, aceștia au investigat și flora și fauna zonei de interes, precum si topografia zonei.

Descoperirile făcute în perioada 1975 – 1976 pot fi asociate cu descoperirea Boreliozei – Boala Lyme. Însă, în această perioada nu a fost identificat nici un agent infecțios are sa producă aceasta boală. În Europa, unii medici au reușit cu succes să trateze pacienții ce prezentau eritem migrator, utilizând anumite antibiotice. Cercetările realizate pentru identificarea bacteriei cate cauzează boala s-au intensificat și, la începutul anilor 1980, Willy Burgdorfer, un expert de renume în studiul căpușelor, cerceta febra pătată din zona Rocky Mountain, care la momentul respectiv era pe primul loc în bolile cauzate de mușcătura de căpușe în SUA. În anul 1981, acesta a primit pentru studiu căpușe din zona New York pe care, analizându-le la microscop, a observat bacterii răsucite, lungi și zvelte, din categoria spirochetelor. Burgdorfer cunoștea că spirochetele nu au fost niciodată asociate cu căpușele din genul Ixodes scapularis. În plus, cunoștea că responsabilă pentru febra pătată era bacteria Rickettsia, care nu era o spirochetă. De asemenea, acesta era la curent cu epidemia de artrită care a apărut in zona de unde au fost prelevate căpușele și că antibioticele erau, în general, eficiente împotriva spirochetelor. La puțin timp după descoperirile lui Burgdorfer, Allen Steere, un cercetător de la Universitatea Yale, a reușit să izoleze același tip de bacterie de la pacienții cu artrită din zona Lyme. Spirochetele, agenți etiologici pentru artrita Lyme, au fost denumite Borrelia burgdorferi în onoarea lui Willy Burgdorfer.

I.2.2. Epidemiologia borreliozei

Metodele științifice utilizate de epidemiologi au avut un rol important în descoperirea Bolii Lyme. Epidemiologia reprezintă studiul incidenței, transmiterii și răspândii bolii. Aceasta disciplină are în continuare un rol important în monitorizarea Bolii Lyme în lume. Atunci când este implementata o soluție are sa împiedice la răspândirea bolii, ca de exemplu vaccinarea sau ingineria genetică, epidemiologii sunt chemați pentru a găsi soluția cu cea mai mare eficiență.

Boala Lyme a fost raportată pe toate continentele, cu excepția Antarcticii. Aceste date au fost obținute din culturile de sânge pozitive sau din rezultatele clinice medicale, din testele pozitive ale anticorpilor sau din analiza păsărilor purtătoare ale bolii. Totuși, Boala Lyme are o incidență mai mare în zonele temperate, pe când în zonele tropicale sau deșertice nu s-a Cazuri anuale de Boala Lyme în Europa Cazuri anuale de Boala Lyme în Europa evidențiat existența Bolii Lyme. Incidența cea mai mare a bolii este în SUA (Coasta de Est și de Vest), respectiv în Nordul Europa ei și Asiei, figura 6.

În figura 7 sunt prezentate datele raportate în SUA, datele fiind furnizate de Centrul de Control și Prevenire al Bolilor din SUA, pentru fiecare stat și regine, pe perioada 1982-2012. În figura 8 sunt prezentate datele pentru Europa, datele fiind furnizate de Organizația Mondială a Sănătății. Deși datele curente sunt importante, epidemiologi utilizează date mai vechi deoarece acestea au fost analizate un timp mai îndelungat și, prin urmare, sunt mai precise.

Din punct de vedere epidemiologic este important să se găsească o definiție standard pentru Boala Lyme, definiție care să poată fi utilizată oriunde în lume. Definiția clinica utilizată de Centrul de Control și Prevenire al Bolilor din SUA este următoarea: 1. fie eritem migrant (EM) sau cel puțin o manifestare cardiovasculară sau musculo-scheletală; 2. infecția trebuie confirmată de un laborator clinic, inclusiv izolarea bacteriei Borrelia burgdorferi de la pacienți clinici, detecția anticorpilor specifici în ser sau fluidul cerebral, ori testul de determinare al anticorpilor prin imunoflorescența sau imunotestare cu ajutorul enzimelor senzitive, urmate de un test Western Blot care poate identifica cu precizie bateria Borrelia burgdorferi în sistemul pacientului.

Utilizând aceasta definiție a Bolii Lyme, aceasta poate fi raportată cu precizie. Din anul 1982, în SUA au fost raportate peste 145000 de cazuri, ceea ce face ca această boală să devină un vector important în bolile din SUA și cuprinde mai mult de 95% din toți vectorii de boală din aceasta țară.

În Europa puține țări au făcut publice rezultatele investigațiilor privind prevalența Bolii Lyme, boală cu notificare obligatorie. Prin urmare, este posibil să se facă doar estimări legate de incidența acesteia în Europa, deoarece este realizată o raportare cu privire la numărul de pacienți identificați a fi pozitivi la testări, de regulă, prin intermediul laboratoarelor de diagnostic. Această metodă implică mai multe neajunsuri pentru estimarea incidenței Bolii Lyme în Europa, existând un pericol de sub-raportare datorată mai multor cauze: modele diferite de referințe de testare, diferite criterii de serodiagnostic și seropozitivitate legate de expunerea realizată în trecut. Pentru a obține informații utile și reale de la sistemele individuale ale țărilor europene și realizarea de comparații anuale, în termen de țări și de date, este necesar să se găsească o practică unitara de raportare[13].

Studiile estimative care au ca punct de plecare datele clinice dau informațiile cele mai exacte asupra incidenței bolii. Însă, acestea sunt mult mai costisitoare ca resurse și timp decât metodele indirecte, care pot reprezenta singurele mijloace de desfășurare a anchetelor în anumite domenii. Aceste metode indirecte pot să includă: măsurarea abundenței într-un areal a căpușelor Ixodes ricinus, prevalența Borrelia burgdorferi în căpușe infectate și studii de seroprevalență. Toate aceste măsurători indirecte au puncte slabe ca indicatori de Boala Lyme, dar în prezent studiile de seroprevalență pentru populația umană reprezintă, probabil, cea mai bună metodă de a obține date epidemiologice în Europa. Daca se ia în considerare limitările metodelor de seroprevalență, este clar că BL prezintă un gradient de incidență în creștere de la Vest la Est, cele mai frecvente cazuri regăsindu-se în Europa Centrală și de Est. De asemenea, a fost remarcat un gradient de descreștere a incidenței de la Sud la Nord, în Scandinavia și de la Nord la Sud, în Italia, Spania și Grecia[13].

Prezența Boreliozei Lyme și ratele de incidență au crescut în anumite grupuri profesionale, de exemplu, în cazul lucrătorilor forestieri, a grupurilor de recreere (cercetași și turiști) aflați în zonele endemice. Totuși, identificarea grupurilor cu risc ridicat nu este întotdeauna corect realizată și există factori de confuzie. De exemplu, ghizii turistici din Suedia, care se presupune a fi expuși regulat la mușcături de căpușe, s-au dovedit a avea seroprevalențe similare cu cele ale populației în general. Acest fapt se petrece deși prevalența bolii în această țară este relativ ridicată[6].

Și genul pare să influențeze seroprevalența și ratele de incidență a bolii. De exemplu, mai multe studii raportează rate mai ridicate de pozitivitate în cazul pentru bărbaților. Acest lucru se presupune a fi datorat riscurilor profesionale și activităților de agrement în aer liber. Însă, este interesant de remarcat faptul că într-un studiu suedez recent privind reapariția eritemului migrant (4% din toate cazurile), majoritatea au fost înregistrate la femeile de vârstă mijlocie[15]. Unele rapoarte sugerează că incidența Boreliozei Lyme este, în general, mai mare la copii decât la adulți, în zonele endemice Lyme. Acest fapt este datorat tendinței crescute a copiilor de a fi în contact cu căpușele în habitatul lor natural[13].

În România prevalențe semnificative crescute au fost observate la lucrătorii silvici precum și diagnosticate prin metode de examinare directe prin microscopie la examenul direct al sângelui recoltat de la donatorii onorifici. În figura 9 este prezentată o hartă explicativă a incidenței borreliozei Lyme în țara noastră[8].

I.2.3. Manifestări clinice

Din cele spuse până în prezent, Boala Lyme prezintă mai multe manifestări specifice care se regăsesc la nivelul pielii (eritem migrator), la nivel musculo-scheletic sau manifestări cardiovasculare sau neurologice. în cele ce urmează, sunt prezentate aceste manifestări clinice ale Boreliozei – Boala Lyme.

I.2.3.1. Manifestări cutanate

Eritemul migrator (EM), figura 10 este cel mai ușor de asociat cu Boala Lyme EM apare în jurul zonei unde s-a produs mușcătura căpușei și este cel mai adesea lipsită de dureri[16]. Această leziunea debutează normal ca o papulă (o leziune superficială a pielii, caracterizată printr-o mică ridicătură roșiatică sau neagră, dură, care apare în unele boli de piele) și ca o zonă de expansiune a eritemului, pe o perioadă de câteva zile. De cele mai multe ori leziunea este plată și lipsită de algii sau de senzația de mâncărime, însă prezintă caracter hipertermic la atingere. Cele mai frecvent afectate regiuni sunt zona inghinală, coapsele și axilele, însă leziunea se poate manifesta pe tot corpul, dispare, de regulă, după 3-4 săptămâni, dar există și cazuri în care această perioadă este mai mare. Diagnosticul diferențial se face față de infecția fungică superficială, afecțiuni cutanate medicamentoase și eritemul anular.

Acrodermatita cronică atrofică este leziunea cutanată cronică asociată cu Borrelia burgdorferi, această patologie fiind mai frecvent observată în Europa decât în SUA. Această boală debutează cu o leziune roșu-albăstruie care devine sclerotică și atrofică. S-au înregistrat cazuri în care Borrelia burgdorferi a fost izolată din această manifestare cutanată cronică chiar și la 10 ani după debutul acesteia[4].

I.2.3.2. Manifestări musculo-scheletice

Manifestările musculo-scheletice sunt raportate la 2 săptămâni sau chiar după câțiva ani de la infecție. Crizele de artritice pot dura câteva săptămâni, după care se remit pentru a recidiva. Odată cu trecerea timpului, chiar și în absența terapiei instituite, doar 10% dintre pacienții care manifestă artrită vor intra în faza cronică a acesteia și sub 5% din cazuri vor dezvolta artrită erozivă. Aspiratul de lichid sinovial arată între , în care predomină leucocite polimorfonucleare (leucocitele polimorfonucleare din sânge sunt un indicator al stării de apărare a organismului). Sunt prezente complexele imune și Borrelia burgdorferi a fost izolată din lichidul sinovial[9].

I.2.3.3. Manifestări neurologice

Simptome asemănătoare unei iritații meningeale apar frecvent în perioada timpurie a infecției cu Borrelia burgdorferi. În această etapă a bolii, nu există niciun deficit neurologic și LCR se prezintă normal[6].

Una dintre cele mai frecvente manifestari neurologie a borreliozei Lyme în Europa este sindromul Bannwarth. Acesta se manifestă prin pleiocitoză limfocitară, fără migrene, fără dureri nevritice și uneori paralizii ale nervilor cranieni. LCR tipic prezintă limfocite, o sinteză elevată a anticorpilor pentru Borrelia burgdorferi și uneori benzi oligoclonale. Studiile recente au asociat și alte sindroame nervoase cu evoluția Borrelia burgdorferi: encefalomielita progresivă, encefalita subacută, demența și cele de demielinizare. Gradul de implicare al acestor sindroame nu este pe deplin cunoscut si necesită cercetări în continuare[6].

I.2.3.4. Manifestări cardiace

Aproximativ 80% dintre pacienții cu diagnosticați cu borelioză Lyme în SUA manifestă afecțiuni cardiace, care apar la câteva săptămâni de la debutul infecției. Formă comuna de anormalitate cardiacă este sub forma unui blocaj atrioventricular, fluctuant și de diverse grade, cel mai adesea de scurtă durată. Pot apare și blocaje cardiace complete, însă acestea rar persistă mai mult de 7 zile. Utilizarea unui pacemaker permanent nu este implicit necesară, chiar și în situația în care problema cardiacă poate reveni. Un număr mic de pacienți manifestă miopericardită, disfuncții ventriculare sau cardiomegalie[4].

I.2.3.5. Alte sisteme

Deși borelioza Lyme se manifestă cel mai frecvent la nivelul pielii, al nervilor, al articulațiilor sau asupra cordului, și alte sisteme de organe pot fi implicate. De exemplu, pentru ochi s-au raportat cazuri de conjunctivită, iritită sau panoftalmie[6].

I.2.4. Prognoză și tratament. Diagnostic de laborator

Diagnosticul se stabilește pe baza datelor anamnetice și a manifestărilor clinice, iar confirmarea acestuia se realizează prin teste complexe de laborator. .[20]. Detecția bacteriei prin culturi, citologie sau PCR pot fi dificile, costisitoare și greu implementabile în practică. Organismul patogen este rar descoperit în urină, sânge, lichid sinovial sau lichid cefalo-rahidian fiind mai frecvent descoperit în țesutul conjunctiv, sinovial, piele sau fibroblaste. Acesta este dificil de pus în cultură și sunt necesare colorații speciale sau microscopie în câmp întunecat pentru vizualizare. ADN-ul plasmidic sau cel genomic cromozomial al B. burgdorferi poate fi amplificat prin tehnica PCR[21].

Rezultatele pozitive la PCR nu demonstrează faptul că Borrelia burgdorferi este viabila în organism și poate fi un rezultat al resturilor neviabile ale acesteia[21]. De asemenea, Borrelia burgdorferi poate exista și sub alte forme (sferoplaști)[4].

Serodiagnosticul este cea mai practică si uzuala metodă de a oferi un diagnostic clinic, dar nu este încă pe deplin standardizat[15]. În diagnosticul serologic sunt folosite teste ELISA și IFA (immunofluorescence assay). Insa, problematica rezultatelor fals-pozitive când se folosesc ambele metode (IFA și ELISA), în special la pacienții care manifestă semne clinice atipice, din zone neclasificate ca fiind endemice pentru Boala Lyme, a avansat necesitatea dezvoltării unui test serologic mult mai specific, Western-blot-ul. Acest test, deși este mai costisitor, are specificitatea cea mai mare[4]. Dacă analiza este efectuată corespunzător, rezultatele negative de la testarea Western blot (nu la un pacient proaspăt infectat) par să excludă prezența anticorpilor anti – Borrelia burgdorferi, cu un grad înalt de fiabilitate. Determinarea a ceea ce constituie un rezultat pozitiv al testului rămâne încă în dezbatere, un consens în acest sens nefiind prezent. Rezultate fals-negative pot apărea timpuriu în cursul infecției, atunci când nu s-au format niveluri detectabile de anticorpi. Terapia cu antibiotice instituită timpuriu poate, de asemenea, să întârzie sau să elimine un răspuns în anticorpi.

Nu există modificări hematologice sau biochimice specifice Bolii Lyme, dar pot apărea modificări inflamatorii în lichidul cefalorahidian, lichidul sinovial sau în urină[7].

Metodele de diagnostic de laborator sunt de două tipuri:

Metodele directe:

– cultura din sânge, lichid cefalorahidian, lichid sinovial, piele;

– determinarea antigenelor specifice prin imunohistologie (pe fragmente de țesut) sau metode de „captură” a antigenelor;

– detectarea ADN prin PCR, hibridizare, etc.

Metodele indirecte:

– serologia – imunofluorescență, ELISA, Western blot

– stadiul proliferării limfocitelor T[8].

Serologia nu are valoare diagnostică absolută și nici valoare prognostică din cauza persistenței anticorpilor la pacienții vindecați prin tratament corect și a multitudinii de antigene ale borreliei. Există riscul unor rezultate fals pozitive sau fals negative ce nu țin de calitatea reactivilor, ci de particularitățile imunologice ale pacienților.

Diagnosticul serologic atinge trei mari limite:

1. Diagnosticarea infecției precoce poate avea o sensibilitate redusă datorită răspunsului umoral lent;

2. Din cauza reacțiilor încrucișate cu alte bacterii, testele pot avea o specificitate redusa;

3. Pot apărea dificultăți în deosebirea infecțiilor recente față de cele cronice din cauza persistenței anticorpilor, atât în cazurile tratate cât și în cele evolutive. [8].

Din aceste motive se recurge la aprecierea valorii predictive a testelor serologice (pozitivă sau negativă), adică la aprecierea șanselor ca rezultatele de laborator să coincidă sau nu cu datele sugestive clinic (epidemiologice, anamnetice și clinice propriu-zise). Din punct de vedere epidemiologic este semnificativă frecvența testelor pozitive în populația din zona respectivă; anamnetic trebuie să se evite cercetarea de laborator în absența unei expuneri la înțepătura de căpușă sau a manifestărilor precoce; iar din punct de vedere clinic să se recurgă la cercetarea serologică doar pornind de la o simptomatologie cu mare probabilitate diagnostică[8].

Studiul diferențelor antigenice dintre tulpinile izolate în America și Europa a permis recunoașterea implicării în patologie a trei genospecii care alcătuiesc complexul Borrelia burgdorferi sensu lato: Borrelia. burgdorferi sensu stricto (ce cuprinde toate tulpinile izolate în America de Nord), Borrelia. garinii și Borrelia afzelii. În Europa circulă toate cele trei genospecii, dar predomina Borrelia garinii și Borrelia afzelii[6].

Diagnosticul Boreliozei Lyme este stabilit prin recunoașterea clinică a eritemului migrator în timpul primului stadiu al infecției, corelata cu testele de laborator. [2].

Diagnosticul de laborator al Bolii Lyme, tabelul 3, se realizează prin:

• Microscopia directă pe secțiuni tisulare

• Microscopia în câmp întunecat (MCÎ) pe probe proaspăt recoltate

• Culturi bacteriene

• Tehnici moleculare

• Reacții serologice ce pun în evidență răspunsul imun –Western Blot (W.B.), Imunofluorescență indirectă (I.F.)

• Testul de transformare limfoblastică (LTT)

Microscopia directă este o metodă folosită mai frecvent în depistarea speciilor de Borrelia ce determină Febra recurentă (Borrelia recurrentis, Borrelia hispanica, Borrelia caucasica). Borrelia burgdorferi poate fi vizualizată pe secțiuni tisulare după colorare prin impregnație argentică. Numărul de spirochete în sânge la pacienții cu BL este în general sub limita de detecție microscopică[11].

Culturile bacteriene: sunt laborioase și costisitoare, frecvent de competența laboratoarelor de referință. Produsele patologice cultivabile sunt: sânge, piele, LCR, lichid sinovial sau chiar căpușa care a determinat mușcătura. Mediul de cultură mai frecvent folosit este mediul Barbour- Stoenner-Kelly (BSK) II cu incubare la 30-33°C, în microaerofilie, pozitivitatea urmărindu-se prin microscopie în câmp întunecat, cel puțin 4-6 săptămâni[22].

Microscopia în câmp întunecat este o metodă folosită în screening-ul probelor de sânge recoltate de la pacienți aflați în prima fază a evoluției bolii, fiind însă dificilă chiar imposibilă uneori diferențierea diferitelor tipuri de spirochete, iar numărul acestora în sânge la pacienții cu BL este în general redus.

Produsele patologice recomandate în diagnosticul de laborator al bolii Lyme sunt diferite, în funcție de stadiul bolii[11].

Tehnicile moleculare se bazează pe amplificarea unei regiuni specifice a genomului bacterian.

Au o sensibilitate mai mare decât cultura în cazul prelevanțelor bioptice, a sângelui și a lichidului articular, spre deosebire de LCR și urină unde rezultatele studiilor nu au fost satisfăcătoare, tabelul 4[22].

Există laboratoare care folosesc această tehnică pentru extragerea materialul genetic al Borreliei direct din căpușa care a determinat mușcătura, precizând dacă aceasta a fost infectată sau nu. Un rezultat negativ nu exclude infecția cu Borrelia, în timp ce un rezultat pozitiv în afara contextului clinic, nu confirmă diagnosticul[22].

Reacțiile serologice detectează anticorpii specifici anti-Borrelia de tip IgM și IgG și sunt cele mai folosite teste în diagnosticul Bolii Lyme. Pentru a crește acuratețea rezultatelor serologice, CDC (Centers for Disease Control and Prevention) a propus încă din 1994 un algoritm de diagnostic compus din doua etape[11]:

1. În prima etapă se folosește un test IFA (immunofluorescence assay). Aceste teste au o sensibilitate crescută, ceea ce conferă siguranță ca la un rezultat negativ probabilitatea ca pacientul să fie afectat este foarte mică. La pacienții suspecți de Boala Lyme în faza inițială a bolii cu serologie negativă, evidențierea infecției se poate obține prin testarea în pereche a serurilor din perioada acută și de convalescență a bolii prin test IFA[22]. Dacă rezultatul acestei etape este pozitiv sau echivoc, se continuă cu etapa a doua, pentru confirmarea rezultatului.

2. Etapa a doua constă în efectuarea testului Western Blot. Acest test are o specificitate mare, tabelul 5, ceea ce înseamnă că va fi pozitiv doar la persoanele care sunt într-adevăr infectate.

Rezultatele la Western Blot sunt comunicate pozitiv sau negativ. În cazul în care rezultatul este negativ dar există suspiciune de boală se recomandă repetarea recoltării după câteva săptămâni.

Pentru diagnosticul neuroboreliozei se recomandă detecția producerii intratecale de anticorpi anti Borrelia. Acest lucru se realizează prin testarea în pereche a LCR-ului și serului obținute prin recoltarea în aceeași zi. Prezența unui titru de anticorpi mai mare în LCR decât în ser se stabilește calculând un index și certifică diagnosticul de neuroborelioză[11].

Limitele și interferențele testelor serologice:

Rezultate fals negative pot fi obținute când testarea se efectuează la debutul bolii, iar titrul de anticorpi este încă redus. Antibioticoterapia administrată în primul stadiu al infecției, timpuriu, poate supresa producerea de anticorpi[22]. La pacienții cu imunosupresie imunodeprimate rezultatele obținute sunt dificil de interpretat.

Rezultate fals pozitive pot fi obținute la pacienții cu alte boli produse de spirochete (febra recurentă, leptospiroză), boli autoimune[23].

Rezultatele pozitive ale pacienților care au primit transfuzii de sânge în ultimele luni se recomandă a fi interpretate cu prudență[22]. În Boala Lyme diagnosticul de laborator trebuie folosit pentru a sprijini diagnosticul clinic, care se bazează pe date clinice și anamneză, figura 11.

Diagnosticul Boala Lyme rămâne o provocare în cazurile ambigue clinic, cu serologie indeterminată și PCR negativ. Aceste cazuri au suscitat interesul cercetătorilor care, în decursul anilor ’90 au pus la punct o nouă metodă folosind răspunsul imun specific al organismului:

Testul de transformare limfoblastică (LTT). Metoda a fost validată în Europa și este folosită cu aplicații în diagnosticul agenților infecțioși, alergii medicamentoase sau alimentare. Testul se bazează pe principiul diviziunii celulare limfocitare induse de contactul cu antigenul „specific”. O reacție pozitivă la LTT demonstrează existența limfocitelor antigen-specifice (celule cu memorie) în sângele pacientului. Intensitatea reacției LTT este evaluată cu ajutorul indexului de stimulare (SI)[34].

Un test LTT pozitiv arată expunerea actuală a sistemului imun la patogeni și prin aceasta o infecție activă. După tratament antibiotic valorile scad, sau reacția LTT devine negativă reprezentând astfel un instrument important în monitorizarea eficienței terapiei[34].

CERCETARE PERSONALĂ

II.1. Scopul și obiectivele cercetării

Scopul acestei lucrări este acela de a evidenția incidența infecțiilor cu borrelia provocate de speciile Borrelia burgdorferi , Borrelia. garinii și Borrelia afzelii în România, în perioada 01.01.2016 – 31.01.2017.

Boala Lyme (infecția cu Borrelia) a devenit supravegheată de Sistemul de Sănătate Publică din cauza numărului de cazuri raportate și a numărului crescut de vectori. Se presupune că încălzirea globală și migrarea vectorilor din Nord-Vest-ul Europei către Est Europei au contribuit la răspândirea Bolii Lyme în România[35]. S-a observat că Boala Lyme este din ce în ce mai răspândită în România, fapt rezultat din raportarea obligatorie a bolii.

Este important să fie relevate către Autoritățile de Sănătate Publică și Epidemiologie a cunoștințelor și măsurilor care sunt necesare pentru determinarea cât mai exactă a răspândirii și incidenței bolii Lyme.

Principalul obiectiv al studiului realizat este stabilirea incidentei infecțiilor cu Borrelia prin studiul efectuat în cadrul Laboratorului Borrelia Centrum din București, în perioada 1.01.2016 – 31.01.2017, care a urmărit:

incidența infecției cu borrelia în lotul de pacienți studiat;

incidența în funcție de specie (Borrelia burgdorferi, Borrelia. garinii și Borrelia afzelii);

incidența în funcție de sexul pacienților;

incidența în funcție de vârsta pacienților;

incidența în funcție de regiunea din care provin pacienții.

II.2. Materiale și metode

II.2.1. Loturi de pacienți

În studiul realizat, rezultatele au fost obținute în urma analizei a 595 pacienți de sex feminin și masculin, cu domiciliul în mediul urban sau rural, având vârstele cuprinse în intervalul , tabelul 12.

Pentru prelucrarea statistică a datelor, pacienții au fost grupați în 5 grupe de vârstă, conform tabelului 12.

II.2.2. Metode folosite

II.2.2.1. Metoda Western-Blot

Principiul testului

Testul utilizează benzi de membrană care conțin extracte de antigen separate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă în prezență de sodium dodecil sulfat (SDS) și transferate ulterior electroforetic pe o membrană de nitroceluloză. Poziția antigenelor pe benzi depinde de masele lor moleculare. Situsurile de legare libere de pe o membrană sunt saturate cu o soluție de proteine, după care matricea este spălată și tăiată în stripuri.

Antigenele și masele lor moleculare, fixate pe un strip de Borrelia burgdorferi, sunt prezentate în tabelul 13. (Poziționarea antigenelor pe strip poate fi observată în figura 18.)

Tabelul 13 Specificitatea antigenelor pe stripuri*

Materiale și mod de lucru

1. Proba de sânge recoltat în eprubetă cu gel separator pentru ser, figura 12.

2. Kit pentru detectarea anticorpilor anti-Borrelia Burgdorferi (imunoglobulina IgG) din ser sau plasma, figura 13. Componentele kitului de lucru sunt prezentate în tabelul 14

3. Aparat EURO Blot Master, prezentat în figura 14.

4. Modul de lucru

Pentru detectarea anticorpilor anti-borrelia burgdorferi, stripul pe care sunt fixate antigenele, într-o primă etapă a testului, este incubat împreună cu serul diluat al pacientului, figura 15.

Dacă în ser sunt prezenți anticorpi specifici, aceștia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip.

După o etapă de spălare, stripul este incubat cu un conjugat anti-IgG sau anti- IgM marcat cu peroxidază, în funcție de clasa de anticorpi testată. Conjugatul se va atașa la complexul antigen-anticorp format în prima etapă.

Urmează o etapă de spălare pentru îndepărtarea conjugatului nelegat.

În ultima etapă se adaugă o soluție de substrat care este capabilă să genereze o reacție de culoare. Reacția enzimatică va genera un produs colorat albastru închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpii specifici, figura 16.

5. Evaluarea și interpretarea rezultatelor

Pentru evaluarea stripurilor incubate se folosește software-ul Euro Line Scan. După stoparea reacției cu apă deionizată, stripurile se fixează pe o folie adezivă de pe protocolul de lucru, figura 17 a. După uscare, stripurile sunt scanate și evaluate de soft, figura 17 b.

Fiecare strip conține în partea superioară două benzi de control:

banda controlului de reacție;

banda pentru controlul conjugatului IgG/IgM care servește drept control pentru clasa de anticorpi testată.

Pentru validarea testului trebuie să fie îndeplinite următoarele condiții:

banda controlului de reacție trebuie să aibă o culoare închisă, intensă;

banda pentru controlul conjugatului corespunzător clasei de anticorpi testate trebuie să prezinte o reacție de culoare clară, figura 18.

Antigenele impregnate pe strip pot fi divizate în trei categorii, conform tabelului 15.

Rezultatele testelor Western Blot pentru Borrelia burgdorferi pot fi împărțite în teste negative, teste pozitive și borderline (la limită):

Negative – atunci când nicio bandă nu este colorată sau există semnale slabe pentru anumite antigene din categoriile 1 și 2;

Borderline – atunci când apare o bandă distinctivă din categoria 3 și mai multe semnale distinctive pentru categoriile 1 și 2. În cazul rezultatului borderline, este recomandat să se preleveze o nouă mostră și testul să fie repetat după câteva săptămâni;

Pozitiv – atunci când apare mai mult de o bandă distinctivă din categoria. Suplimentar, și particular în cazul pacienților care se află într-o fază avansata a bolii, benzi distinctive din categoriile 1 și 2 pot fi observate în număr mare.

II.2.2.1. Reacția de imunoflorescență

Metoda se bazează pe evidențierea anticorpilor anti-borrelia (Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii) utilizând o lamă cu godeuri tapetate cu borrelii ca substrat standard și vizualizarea lor cu un pattern fluorescent.…………………………….……………………

Există două modalități de lucru: prin determinări calitative și cantitative. Pentru determinarea calitativă care oferă un rezultat pozitiv/negativ, proba se lucrează la diluție 1/100.

Pentru determinarea cantitativă se realizează diluții succesive începând cu 1/100, 1/1000, până la 1/10 000, valori ce oferă informații asupra mărimii infecției.

Titrul de anticorpi este dat de diluția cea mai mare la care se obține fluorescență. Determinarea cantitativă este utilizată în monitorizarea tratamentului.

În diagnosticul neuroborreliozelor determinarea titrului de anticorpi din LCR împreună cu cel sanguin este de o importanță crucială, determinarea indexului de anticorpi face diferența dintre derivații din sânge și derivații patologici specifici ai creierului.

Materiale și mod de lucru

1. Proba de sânge recoltat în eprubetă cu gel separator pentru ser, figura 19.

2. Kit pentru detectarea anticorpilor anti- Borrelia burgdorferi, afzelii, garinii (imunoglobulina IgG) din ser sau plasmă, figura 20. Componentele kitului de lucru sunt prezentate în tabelul 16

3. Microscop EURO star II Plus, prezentat în figura 21.

4. Modul de lucru

1. Se numerotează tuburile de diluție de la 1 la 3;

2. Se adaugă în fiecare tub de diluție 1000 μl soluție PBS pentru IgG;

3. În tubul notat cu cifra 1 se pun 11.1 μl din proba de analizat pentru IgG;

4. Se fac diluții seriale și am obținut diluțiile 1/100; 1/1000; 1/10000 pentru IgG;

5 Se pun câte30 μl din fiecare diluție în fiecare godeu cu antigen, apoi se adaugă martorul pozitiv și martorul negativ;

6. Lama cu godeuri se incubează timp de 30 de minute la temperatura camerei;

7. După cele 30 minute urmează 5 minute de spălare în cuva cu tampon fosfat salin;

8. În fiecare godeu se pipetează 25 μl de soluție conjugat (flurocrom), după care lama se incubează alte 30 minute în absenta luminii;

9. Urmează din nou o etapa de spălare

10. Se adaugă 2 picături de glicerol pe lamela de acoperire, iar peste aceasta se poziționează lama, după care se examinează la microscop.

Câteva din etapele de lucru sunt prezentate în figura 22.

5. Evaluarea și interpretarea rezultatelor

Dacă în probă sunt prezenți anticorpi anti – B. burgdorferi, afzelii, garinii, se observă o fluorescență marcată a boreliilor, ca în figurile următoare.

Evaluarea calitativă a rezultatelor obținute se realizează conform indicațiilor din tabelul 17.

Titrul de anticorpi este dat de diluția cea mai mare la care se obține fluorescența evidentă, tabelul 18.

II.3. Rezultate și discuții

II.3.1. Incidența infecțiilor cu borrelia în lotul de pacienți studiat

Dintre cele 595 teste de borrelia efectuate în perioada 01.01.2016-31.01.2016 în cadrul Laboratorului Borrelia Centrum București, 77 () au fost pozitive, figura 23.

Testele de confirmare Western Blot și testele de Imunofluorescență au evidențiat prezența tulpinilor de B. afzelii, burgdorferi și garinii.

Testele Western Blot au evidențiat faptul că antigenul OspC, este asociat cu răspunsul imun de tip IgM, în timp ce antigenele p18, p31,p83, p21/22 sunt markeri asociați cu răspunsul imun de tip IgG. Producerea de anticorpi față de VlsE, antigen prezent pe stripul RN-AT, este detectată tot ca un răspuns de tip IgG.

II.3.2. Incidența infecțiilor cu borrelia în funcție de regiunile din care provin pacienții

În figura 24 sunt prezentate rezultatele privind incidența infecțiilor cu B. afzelii, burgdorferi și garinii, în funcție de regiunea de unde au provenit pacienții investigați.

Din figura 24 a, se observă că incidența infecțiilor cu B. afzelii determinată prin evidențierea anticorpilor IgG a fost înregistrată într-un procent mai mare, , în regiunea Transilvania, fiind urmată de regiunea Moldova cu un procent de . De asemenea, se observă un procent scăzut în regiunile Dobrogea (), Banat () și Muntenia (). Analizând figura 24 b, se observă că în regiunea Transilvania, incidența infecțiilor cu B. garinii scade la un procent de În regiunea Moldova procentul rămâne de . De asemenea, din figura 24 c, se observă o scădere a infecției cu B. Burgdorferi tot în regiunea Transilvania () ca și în cazul infecției cu B. garinii.

II.3.3. Incidența infecțiilor cu borrelia în funcție de sexul pacienților

În figura 25 a, b și c sunt prezentate rezultatele privind incidența infecțiilor cu B. afzelii, burgdorferi și garinii, în funcție de sexul pacienților investigați.

Repartizarea pe sexe a indicat faptul că majoritatea pacienților infectați cu borrelia au fost de sex feminin (, însumând 42 de cazuri pozitive din totalul de 77.

Totodată, se observă că incidența cea mai mare a infecțiilor este dată de B. afzelii, care a fost prezentă în proporție de la femei, respectiv la bărbați.

Infecțiile cu B. garinii au fost, de asemenea, mai frecvent întâlnite la femei, , respectiv la bărbați.

În cazul infecțiilor cu B. burgdorferi, a fost mai frecvent întâlnită în cazul pacienților de sex masculin, , respectiv în cazul pacienților de sex feminin.

II.3.4. Incidența infecțiilor cu borrelia în funcție de vârsta pacienților

Pacienții cu testele de Borrelia pozitive au fost încadrați în cinci grupe de vârste: 0-16 ani, 17-35 ani, 36-55 ani, 56-70 ani și >70 ani. Din cele 77 de infecții cu Borrelia confirmate, au provenit de la pacienții cu vârsta cuprinsă între 36-55 ani, urmată de 14.28% pentru categoria 17-35 ani, 6.49% la grupa 56-70 ani, 5.20% pentru pacienții din grupa 0-16 ani, respectiv 2.60% pacienții cu vârsta mai mare de 70 ani, figura 26 a, b și c.

Incidența cea mai mare de infecție cu borrelia a fost înregistrată la pacienții cu vârsta cuprinsă între 36-55 ani.

Incidența cea mai mica a infecției cu borrelia s-a înregistrat la pacienții cu vârsta mai mare de 70 de ani și la pacienții din grup de vârstă 0-16 ani.

II.3.5. Incidența infecțiilor cu Borrelia afzelii, garinii și burgdorferi determinată cu testul recombinat RN-AT

Seroprevalența pentru infecția cu Borrelia afzelii, garinii și burgdorferi determinată cu ajutorul testului recombinat RN-AT, a fost de 5% din numărul total de pacienți testați.

Dacă se raportează la numărul total de cazuri pozitive (77 de cazuri), testul recombinat RN-AT a indicat o seroprevalență pentru infecția cu borrelia de . Acest procent relativ ridicat față de procentele testelor pe specii, ar putea fi datorat prezenței pe stripul RN-AT a proteinelor de suprafață VlsE afzelii, garinii, burgdorferi.

CONCLUZII

Studiul s-a realizat în perioada 2016-2017 pe 595 de pacienți, dintre care 249 pacienți de sex masculin și 346 de pacienți de sex feminin, încadrați în cinci grupe de vârste: 0-16 ani, 17-35 ani, 36-55 ani, 56-70 ani și >70 ani;

Investigarea probelor s-a realizat prin două metode: metoda Western-Blot, respectiv, metoda imunoflorescenței;

Dintre cele 595 teste de borrelia efectuate în această perioadă, în cadrul Laboratorului Borrelia Centrum București, au fost pozitive (77 de pacienți);

Studiul a relevat că incidența infecțiilor cu B. afzelii a fost înregistrată într-un procent mai mare în regiunea Transilvania (23.77%) și într-un un procent scăzut în regiunea Muntenia (1.30%);

Incidența infecțiilor cu B. garinii în regiunea Transilvania se reduce până la 2.60%, în regiunea Moldova procentul rămâne de identic cu cel obținut în cazul infecțiilor cu B. afzelii (5.20%);

Se observă o scădere a infecției cu B. Burgdorferi în regiunea Transilvania (3.40%) ca și în cazul infecției cu B. garinii.

Repartizarea pe sexe a indicat faptul că majoritatea pacienților infectați cu borrelia au fost de sex feminin (62.33%), însumând 42 de cazuri pozitive din totalul de 77;

Incidența cea mai mare a infecțiilor este dată de B. afzelii, care a fost prezentă în proporție de 23.37% la femei, respectiv 16.88% la bărbați;

Infecțiile cu B. garinii au fost mai frecvent întâlnite la femei, 9.09%, respectiv 2.60% la bărbați;

Infecțiilor cu B. burgdorferi au fost mai frecvent întâlnite în cazul pacienților de sex masculin, 5.19%, comparativ cu 3.90% în cazul pacienților de sex feminin;

Din cele 77 de infecții cu Borrelia confirmate, cele mai multe cazuri (36.36%) au provenit de la pacienții cu vârsta cuprinsă între 36-55 ani, iar cele mai puține (2.60%) la pacienții cu vârsta mai mare de 70 ani;

Seroprevalența pentru infecția cu Borrelia afzelii, garinii și burgdorferi determinată cu ajutorul testului recombinat RN-AT, a fost de 5% din numărul total de pacienți testați;

Testul recombinat RN-AT a indicat o seroprevalență pentru infecția cu borrelia de din numărul total de cazuri pozitive (77 de cazuri)..

Bibliografie

3. Craig Greene – Infectious Diseases of the Dog and Cat, 4th Edition, Elsevier Health Sciences, 2013

4. D. S. Samuels, Justin D. Radolf – Borrelia: Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis, Caister Academic Press, Norfolk, UK, 2010

5. European Concerted Action on Lyme Borreliosis (EUCALB). An information resource of the ESCMID study group, ESGBOR. Available at: http://meduni09.edis.at/eucalb.

6. J. Sjöwall – Clinical and Immunological Aspects of Lyme Borreliosis, LiU-Tryck, Linkoping, Sweden, 2011

7. C.E. Green – Infectious Diseases of the Dog and Cat, 4-th edition, Elsevier, Missouri, U.S.A., 2012

8. M. Chiotan – Boli infecțioase, Editura Național, București, 2011

9. S.R. Palmer, Lord Soulsby, D.I.H. Simpson – Zoonoze, Editura Științelor Medicale, București, 2005

10. J.S. Gray, O. Kahl, R.S. Lane, G. Stanek – Lyme Borreliosis–Biology, Epidemiology and Control, CABI Publishing, Wallingford, Oxon, UK, 2004

11. B. Wilske, B. J. B. Johnson, M. E. Schriefer. Borrelia – In:Patrick R. Murray et al. – Manual of Clinical Microbiology, 9th ed., p.971- 986 2007

12. I.L. Mitrea – Parazitologie și boli parazitare, Editura Ceres, București, 2011

13. J. Piesman, T.N. Mather, G.J. Dammin, S.R. Telford III, C. Lastavica, A. Spielman – Seasonal Variation of Transmission Risk of Lyme Disease and Human Babesiosis, American Journal of Epidemiology, Vol 126 (6): p.1187-1189, 1987

14. M. C. Chifiriuc, Gr. Mihăescu, V. Lazăr – Microbiologie și virologie medicală, Editura Universității din București 2011

15. L. Bennet, L. Stjernberg, J. Berglund – Effect of Gender on Clinical And Epidemiologic Features of Lyme Borreliosis, Vector-Borne and Zoonotic Diseases. Vol 7(1): 34-41 2007

16. R.M. Mânzat – Boli infecțioase ale animalelor: bacterioze, Editura Brumar, Timișoara 2001

17. M.P. Littman, R.E. Goldstein, M.A. Labato, M.R. Lappin, G.E. Moore – ACVIM Small Animal Consensus Statement on Lyme Disease in Dogs: Diagnosis, Treatment, and Prevention, J Vet Intern Med; 20:422–434 2006

18. D. Lipsker, B. Jaulhac – Lyme Borreliosis Biological and Clinical Aspects, Karger, 2009

19. L. Yannielli – Deadly Diseases and Epidemics: Lyme Disease, Chelsea House Publisher, Philadelphia, SUA 2004

20. T. Perianu – Tratat de boli infecțioase ale animalelor: bacterioze, Vol. 1, Editura Universității XXI, Iași 2011

21. Y.F. Chang, V. Novosel, C.F. Chang, B. Summers, W.M. Acree, S. Shin., D.H. Lein – Experimental induction of chronic borreliosis in adult dogs exposed to Borrelia burgdorferi-infected ticks and treated with dexamethasone, American Journal of Veterinary Research vol. 62(7): 1104 – 1112 2001

22. E. V. Thon, Ilsemann K., M. Sandkamp – A novel lymphocyte transformation test (LTT-MELISA) for Lyme borreliosis, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, vol 57(1) 27-34 2007

23. E.C. Coipan, A.F. Vladimirescu – Ixodes ricinus ticks (Acari: Ixodidae): vectors for Lyme disease spirochetes in Romania. Exp. Appl. Acarol, 54(3), 293-300, 2011

24. URL 1

[http://www.nhc.ed.ac.uk/index.php?page=24.25.119]

25. URL 2

[http://accessmedicine.mhmedical.com/content.aspx?bookid=375&sectionid=40299165&jumpsectionID=40306167]

26. URL 3

[C.E. Green – Infectious Diseases of the Dog and Cat, 2012]

27. URL 4

[http://www.bestplaces.net/compare-cities/old_saybrook_ct/old_lyme_ct]

28. URL 5

[http://www.businessinsider.com/lyme-disease-ticks-may-cost-billions-with-no-vaccine-2015-7]

29. URL 6

[http://www.businessinsider.com/lyme-disease-ticks-may-cost-billions-with-no-vaccine-2015-7]

30. URL 7

[http://www.doctorulzilei.ro/record-de-romani-cu-boala-lyme-in-2012-atenti-capusele-ies-la-atac-dupa-ploaie]

31. URL 8

[http://www.bayarealyme.org/blog/lyme-disease-bullseye-rash/]

32. URL 9

[http://www.cdc.gov]

33. URL 10

[http://www.umfiasi.ro/Rezidenti/suporturidecurs/, 27]

34. URL 11

http://www.synevo.ro/diagnosticul-de-laborator-al-bolii-lyme

35. URL 12

http://www.mayomedicallaboratories.com

*Protocol kit de lucru EUROIMMUN