Cercetari Privind Incidenta Agentilor Bacterieni Ce Produc Infectii Urinare

Cuprins

INTRODUCERE

Omul trăiește într-un mediu populat de o imensitate de microorganisme, fiind el însuși purtătorul unora dintre ele. Dimensiunile lor reduse au făcut ca ele să scape mult timp observației, dar rezultatele activității lor au fost sesizate încă din antichitate.

Semnificația practică și teoretică de mare actualitate a microorganismelor în biologie și numeroase alte domenii științifice are ca premisă implicațiile lor în mediul înconjurător și în primul rând în viața omului. Conviețuim cu microorganismele încă de la naștere și până la moarte. Suntem într-un continuu contact cu această lume aparte a microorganismelor a cărei implicare a schimbat și schimă într-un mod permanent viața noastra și fără de care existența pe Terra nu ar putea fi posibilă; o lume aseptică nu numai că n-ar fi de dorit, ci ar fi chiar neconfortabilă.

Microorganismele reprezintă o parte substanțială a biomasei totale. Se estimează ca fiecare individ uman este purtător a 1014 bacterii, un număr care depășește chiar totalul celulelor din care este alcătuit.

Rolul microorganismelor în etiologia bolilor infecțioase a fost descoperit doar în a doua jumătate a secolului trecut, cu toate că de-a lungul timpului mulți cercetători au sugerat această eventualitate.

Subiect paramedical la începuturile ei, microbiologia devine o știință de sine stătătoare la sfârșitul secolului XIX-lea în urma descoperirilor lui Pasteur, precedate de multe secole de observații și cercetări. Ea se ocupă cu studiul organismelor microscopice.

Astăzi microbiologia este o știință foarte vastă, cu multe ramuri cum sunt: microbiologia medicală (umană și veterinară), microbiologia plantelor, microbiologia solului, etc.

Infecțiile tractului urinar au fost descrise din timpuri străvechi, prima descriere fiind documentată chiar înaintea erei noastre. Egiptenii descriau boala ca „senzația de fierbințeală care iese din vezică”. Tratamentul eficace nu a apărut decât după apariția antibioticelor în anul 1930.

Infecțiile urinare se asociază pe tot globul cu morbidități ridicate, reprezentând chiar și în prezent o problemă gravă de sănătate publică.

Frecvența crescută, varietatea etiologică, eventualitatea evoluției cronice, a recidivelor, a instalării unor complicații severe, dificultățile de terapie datorate rezistenței la antibiotice indică importanța în patologie a acestor infecții.

Frecvența infecțiilor urinare este foarte mare, ocupând locul doi în cadrul infecțiilor generale, după infecțiile respiratorii.

I. CONSIDERAȚII TEORETICE

I.1. Agenți bacterieni implicați în infecții ale aparatului urinar

Infecțiile aparatului urinar sunt determinate de variați germeni, a căror acțiune trebuie privită în strânsă legătură cu căile de infecție și acțiunea importantă a factorilor favorizați.

Sursa cea mai cunoscută este flora fecală (care infectează uretra distală) și flora introitului vaginal; au importanță, de asemenea, infecțiile genitale, bacteriile, septicemiile, etc.

Germenii care participă cel mai des sunt următorii: E. coli, Aerobacter aerogenes, Alkalescens dispar, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae¸ Staphylococcus spp. (inclusiv coagulazonegativi), Streptococus fecalis (enterococ), Bacteroides spp. (mai rar Monilia albicans).

Din statisticile făcute, rezultă predominanța bacililor gram-negativi, a căror rezistență la antibiotice este cunoscută.

Alte microorganisme care pot produce infecții urinare sunt Chlamydia și Mycoplasma. Aceste infecții însă tind să se autolimiteze la uretră și tractul gential. Spre deosebire de E. coli, Chlamydia și Mycoplasma se pot transmite pe cale sexuală.

I.1.1. Genul Escherichia

Genul Escherichia este considerat genul tip al familiei Enterobacteriaceae și reunește specii prezente în intestinul uman și evidențiat pentru prima oară în anul 1885 de către germanul Theodor Escherich în onoarea căruia s-a dat numele genului. Au fost considerate bacterii comensale ale intestinul gros până în 1935 când s-a demonstrat rolul etiologic al unei tulpini de Escherichia coli implicată într-un episod de diaree la nou-născuți.

Genul Escherichia conține germeni comensali, constituenți ai florei normale intestinale la om și animale, dar care în anumite condiții pot manifesta caractere de patogenitate; se găsesc ubicuitar răspândiți în mediul extern (aer, apă, sol etc). În intestinul omului, germenii au un rol important în sinteza unor vitamine din grupul B.

Genul Escherichia este alcătuit din bacili gram negativi care pot fi mobili sau imobili, care pot utiliza acetatul, dar nu utilizează citratul, ca sursă unică de carbon; glucoza și alți carbohidrați sunt fermentați cu producere de piruvat ulterior convertit în acizi lactic, acetic și formic; o parte din acidul formic este desfăcut de un sistem enzimatic complex (hidrogenliaza) în cantități egale de CO2 și H2 (Ley – 1962).

Anumite tulpini sunt anaerogene. Lactoza este fermentată de majoritatea tulpinilor, dar reacția poate fi întârziată sau absentă.

Conținutul în G + C al ADN-ului variază între 50-51 moli %.

Specia tip este reprezentată de către Escherichia coli (Migula) Castelani și Chalmers 1919, 1941.

Denumirea de Escherichia provine de la numele lui Theodor Escherich cel care a izolat specia tip a genului (1885).

I.1.1.1 Taxonomie și habitat

Genul cuprinde bacili drepți sau ușor curbați cu dimesiuni cuprinse între 1-3 µ lungime/0,4-0,7 µ grosime (Fig. I.1.); uneori prezintă forme filamentoase (8 µ lungime), iar alteori forme cocobacilare; sunt mobili datorită cililor peritrichi sau imobili; în general la izolarea din organism prezintă o mobilitate redusă; unele tulpini prezintă capsule sau structuri similare mai puțin dezvoltate (microcapsule); multe tulpini prezintă fimbrii (pili); pe baza reacției de hemaglutinare directă sau pe diferențele morfologice, tulpinile de E. coli pot fi clasificate în mai multe tipuri fimbriale (Duguid 1955, Brinton – 1965).

Fig.I.1. Escherichia coli – Microscopie electronică (URL-1)

Genul este grupat în șase specii: Escherichia coli, E. blattae¸ E. fergusonii, E. hermannii, E. vulneris și E. albertii. Cu excepția speciei E. blattae, izolată de la insecte, toate celelalte specii de Escherichia fiind izolate din prelevate umane.

Habitatul natural al E. coli este tractul gastrointestinal al animalelor cu sânge cald și al oamenilor. În intestinul uman E. coli reprezintă flora dominantă a acestuia (intestinul gros), având un rol important în menținearea fiziologiei normale a acestuia.

Colibacilii sunt răspândiți în mediul înconjurător. Numărul acestor germeni pe unitate de volum (în apă și alimente) reprezintă indicele coli, care este un criteriu de apreciere a gradului de poluare a apei, mediului și alimentelor, cu materii fecale. În standardele de stat sunt prevăzute valorile indicelui coli, care permit ca o sursă de apă să fie considerată potabilă, sau un aliment bun pentru consum.

Studii făcute în ultimii ani indică însă o mult mai mare complexitate a populației genului Escherichia, ai căror membrii pot circula și persista autonom, în afara tractului gastrointestinal, fiind prezenți în rezervoare secundare din mediul ambiant.

I.1.1.2. Caractere de cultură și coloniale

Genul Escherichia nu prezintă germeni pretențioși. Aceștia se dezvoltă bine pe medii simple de cultură; pe geloză (Fig I.2) se pot dezvolta :

– colonii “S”(smooth) : convexe, umede, lucioase (Fig.I.3.), rotunde, lacto-pozitive (Fig.I.4), cu marginile netede, ce se emulsionează facil cu ser fiziologic;’

– colonii “R”(rough) : uscate, cu margini crenelate, care se emulsionează greu cu ser fiziologic;

– colonii intermediare între “S” și ”R”;

– colonii “M” (mucoide).

– colonii colonii uleioase, mucoase, sub acțiunea unor bacteriofagi sau antibiotice (Ciucă și colab. 1920).

Fig. I.2. Escherichia coli- geloză lactozată (URL-2)

Fig. I.3. Escherichia coli- Mediu Levine – colonii cu luciu metalic (URL-3)

Fig I.4. E. coli- mediu MacConkey, colonii lactozo-pozitive (URL-4)

I.1.1.3 Caractere biochimice

Germenii sunt aerobi și facultativi anaerobi, se dezvoltă între limite largi de temperatură și pH cu un optimum de 37˚ și la pH=7,2-7,8. Capacitatea germenilor de a fermenta lactoza permite diferențierea E. coli de alte Enterobacteriaceae (Salmonella, Shigella, Proteus etc.) cu toate ca unele specii fermentează tardiv acest zahăr sau deloc.

Ei posedă un bogat echipament enzimatic; pot fermenta lactoza, produc indol, nu descompun ureea, nu lichefiează gelatina și pot avea o activitate hemolitică și dermonecrotică.

Capacitatea majorității tulpinilor de E. Coli de a fermenta lactoza este utilă în diferențierea de alte enterobacterii (ex. Salmonella, Shigella). Tipic, tulpinile de E. Coli testate pe medii de identificare biochimică precum TSI, MIU și/sau MILF nu produc H2S, produc indol și lizindecarboxilază, dar nu ureează și fenilalanindezaminază. În plus, E. Coli nu poate crește pe un mediu care are ca sursă unică de carbon citratul, acest caracter metabolic este foarte important în diferențierea de alte enterobacterii.

Fig. I.5. E. coli – caractere biochimice pe medii diferențiale (URL-5)

TSI: G+, L+, Z+, H2S-

SIM: H2S-, I+, M+

Uree:-

Simmons

I.1.1.4. Caractere antigenice și de patogenitate

Germenii ce se găsesc în genul Escherichia se disting printr-o variată heterogenitate antigenică, datorită multiplelor fracții antigenice flagelare și somatice cât și variatelor antigene de înveliș și capsulare. Antigenele prezintă în general caracteristicile comune ale antigenelor germenilor din familia Enterobacteriaceae.

Antigenul „O” este un antigen de suprafață, termostabil, ce este prezent în toate formele „smooth” („S”) ale enterobacteriaceae-lor.

Este de natură glucido-lipido-polipeptidică, rezista aproximativ 2 ore și jumătate la o temperatură de 100°C păstrându-și proprietățile imunogene, aglutinante și de legare cu anticorpii. Rezistă la acțiunea alcoolului, formolului, și acidului clorhidric.

Antigenul „O” reprezintă polizaharidul „O” specific al lipopolizaharidului (LPS) peretelui celular: acelea care și-au pierdut specificitatea O sunt formele „R”. Până în anul 1980 s-au descris aproximativ 165 fracții antigenice „O”. S-au evidențiat relații antigenice între antigenele „O” ale E. coli și antigenelor „O” ale altor Enterobacteriaceae (Shigella, Salmonella, Klebsiella, Citrobacter) și antigenul „O” al V. cholerae; antigenul E. coli O88 prezintă relații antigenice cu antigenul de grup sanguin B și cu unele antigene de suprafață ale celulelor de mamifere.

Antigenul „H” este un antigen termolabil de natură proteică, prezent în flagelii bacteriilor mobile (alcătuiți dintr-o proteină numită flagelină). Acesta rezistă la acțiunea formolului și este inhibat de alcool în activitatea sa aglutinantă și în capacitatea de adsorbție a aglutininelor. Prezintă sensibilitate la acțiunea acidului clorhidric. Conținutul lor în aminoacizi și secvența în care aceștia apar în flagelină, condiționează specificitatea fiecăreia dintre numeroasele fracții antigenice.

Antigenul „K” este reprezentat de fapt de trei factori antigenici (antigene „L”, „A” și „B”); în general o tulpină de E. coli are un singur antigen K cu toate că Orskov (1961) a descris tulpini de E. coli care aveau 2 antigene „K” (B și L).

După natura lor chimică, antigenele ,,K” se împart în două categorii (Orskov, 1977): antigene K de natură polizaharidică și antigene ,,K” de natură proteică (fimbriale). S-a demonstrat astfel că antigenele K83 (Stirm, 1967) și K99 (Jackson, 1977) sunt de natură proteică, ambele produc aglutinarea hematiilor de cobai (K88) și de cal (K99) fără ca reacția să fie inhibată de D-manoză. Ambele antigene se transmit prin plasmide și pot fi găsite împreună cu celelalte antigene ,,K’’ determinate cromozomial.

S-a demonstrat că antigenele K88 și K99 sunt responsabile de aderențe in vivo și in vitro a bacteriilor de celulele epiteliale ale intestinului subțire (Burows, 1976), (Jackson, 1978), spre deosebică, prezent în flagelii bacteriilor mobile (alcătuiți dintr-o proteină numită flagelină). Acesta rezistă la acțiunea formolului și este inhibat de alcool în activitatea sa aglutinantă și în capacitatea de adsorbție a aglutininelor. Prezintă sensibilitate la acțiunea acidului clorhidric. Conținutul lor în aminoacizi și secvența în care aceștia apar în flagelină, condiționează specificitatea fiecăreia dintre numeroasele fracții antigenice.

Antigenul „K” este reprezentat de fapt de trei factori antigenici (antigene „L”, „A” și „B”); în general o tulpină de E. coli are un singur antigen K cu toate că Orskov (1961) a descris tulpini de E. coli care aveau 2 antigene „K” (B și L).

După natura lor chimică, antigenele ,,K” se împart în două categorii (Orskov, 1977): antigene K de natură polizaharidică și antigene ,,K” de natură proteică (fimbriale). S-a demonstrat astfel că antigenele K83 (Stirm, 1967) și K99 (Jackson, 1977) sunt de natură proteică, ambele produc aglutinarea hematiilor de cobai (K88) și de cal (K99) fără ca reacția să fie inhibată de D-manoză. Ambele antigene se transmit prin plasmide și pot fi găsite împreună cu celelalte antigene ,,K’’ determinate cromozomial.

S-a demonstrat că antigenele K88 și K99 sunt responsabile de aderențe in vivo și in vitro a bacteriilor de celulele epiteliale ale intestinului subțire (Burows, 1976), (Jackson, 1978), spre deosebire de antigenele,,K’’ de natură polizaharidică care nu prezintă această proprietate. În afară de antigenele K de suprafață descrise mai sus, Evans (1975) și Ryder (1976), Thomas (1982), Darfeuille (1983) descriu „factorii de colonizare antigenică” (colonization factor antigen) CFA I, CFA II și E. 8775, CFA III, 987P (987 pili), specifice pentru serotipurile de E. coli enterotoxigene izolate de la om. Prin proprietățile lor de aderare de celulele epiteliale ale intestinului uman, factorii de colonizare reprezintă atribute de virulență ale E. coli. Dintre antigenele K de natură polizaharidică cel mai bine studiat a fost antigenul K, compus din acid N- acetylneuraminic (Darry și colab., 1957); este identic sau poate fi asemănător în compoziție chimică și caracteristicile imunologice cu antigenul capsular al N. meningitidis tip B (Grados și colab., 1970; Kaijser și colab., 1973).

Antigenul „M” sau acidul colanic este comun la mai multe Enterobacteriaceae; acest antigen produce caracterul mucos al unor tulpinii de E. coli (Orskov, 1971).

Antigenul „R”. Mutantele „R” care pot apare spontan din formele „S” sau care pot fi obținute în laborator prin tratamentul cu substanțe mutagene au un LPS căruia îi lipsește polizaharidul O specific (regiunea 3). Acești LPS poartă denumirea de antigene „R”. Tulpinile de E. coli K12, B și C sunt forme „R” la care formele parentale „S” nu sunt cunoscute. E. coli K12 este un mutant „R” (rfb) cu core complet, iar E. coli B este un mutant (rfa) cu core incomplet (Schmidt, 1973).

Patogenitatea tulpinilor E. coli izolate din infecțiile entrale sau extraentrale este datorată unor factori de virulență sau toxici.

Trebuie precizat faptul că cei mai muți colibacili nu sunt patogeni. Virulența și toxicitatea bacteriilor patogene sunt legate de prezența antigenului K și a unor toxine (enterotoxină, neurotoxină, etc.), precum și de producerea hemolizei și a dermonecrozei.

Tulpinile patogene de E. coli produc factori de virulență, care afecteaza variatele procese desfășurate la nivelul celulelor gazdei (ex. sinteza de proteine, funcția citoscheletului, diviziunea celulară, secreția de ioni, funcția mitocondriilor, apoptoza etc.). Acești factori de virulență sunt codificați de structuri genetice localizate în cromozom sau pe plasmide și intervin în mecanismele de patogenitate folosite de bacterie pentru a învinge sistemele de apărare ale gazdei.

Adezinele sunt structuri de aderență aflate pe fimbrii/pili (ex. fimbriile P din tulpinile de E. coli uropatogene, factorii de colonizare CFA din tulpinile de ETEC, etc.) sau la suprafața membranei externe (ex. adezinele afimbriale Afa din tulpinile de DAEC) bacteriene. Ele reprezintă factori de virulența importanți, care permit bacteriei să colonizeze zone din organismul uman (ex. intestin subțire, tract urinar, vagin), in care nu rezidă în mod normal.

Factorii de aderență sunt reprezentanți de antigenele K88, K99.

Factorii de colonizare antigenică sunt grupări filamentoase ce prezintă caractere morfologice și biologice asemăntoare cu cele ale antigenelor K88 și K99. Acești factori sunt proteine codificate de plasmide.

Antigenele de suprafață (K) sunt un factor important de virulență (Kaijer 1972, 1977). Germenii, având capsula polizaharidică, sunt mai puțini sensibili față de mecanismele de apărare ale gazdei (fagocitoză sau acțiune litică). O consecință importantă a factorilor de suprafață asupra celulei bacteriene este reprezentată de capacitatea acestora de a adera la celulele epiteliale. S-a observat că propietatea de a adera la uroepiteliul uman al bacteriei E. coli are legătură cu capacitatea acesteia de a induce infecții ale tractului urinar.

Factorii de toxicitate sunt reprezentați de: antigenul O, hemolizine și enterotoxine.

Antigenul somatic O protejează germenii față de posibilitatea de apărare ale gazdei.

Hemolizinele sunt codificate de un plasmid (Hly) cu acțiune litică asupra hematiilor ce provin de la diferite specii de animele. Unele tulpini de E. coli sunt hemolitice.

E. coli produce cel puțin două enterotoxine cunoscute:

– enterotoxina termolabilă (LT) ce are o greutate moleculară mare de aproximativ 85 000 daltoni, antigenică, este asemănătoare cu toxina holerică din punct de vedere structural, funcțional;

– enterotoxina termostabilă (ST) de natură polipeptidică ce prezintă o greutate de mică cuprinsă între 1500-5000 daltoni, neantigenică.

În anul 1979 Clements și Finkelstein au reușit să purifice și sa descrie enterotoxina termolabilă, LT, observând ca aceasta se disociază în timpul unei operații de filtrare prin gel, în prezența guanidinei 5 M, în subunități ce au fost denumite A și B. S-au evidențiat cinci subunități B, fiecare având o greutate moleculară de 11780 daltoni cu rolul de a lega toxina de receptorii de pe enterocite. Este prezentă doar o singură subunitate A ce prezintă o greutate moleculară între 25 500-30 000 daltoni, aceasta pătrunde în enterocit unde activează adenilatciclaza astfel crescând nivelul AMP-ciclic.

În urma acestor acțiuni ce au loc la nivelul enterocitului lumenul intestinal secretă un lichid bogat în electroliți.

Enterotoxina termostabilă produsă de tulpinile ETEC umane, este strâns înrudită, dar diferită de aceea secretată de tulpinile ETEC porcine dar ambele sunt însă înrudite imunologic cu toxina holerică. În timpul filtrării prin gel a enterotoxinei termolabile la un pH=6,5 și la temperatura camerei s-a pus în evidență un toxoid al acesteia, analog choleragenoidului, acesta primind denumirea de „coligenoid”.

Mecanismul de acțiune al enterotoxinei termostabile prezentă la tulpinile ETEC umane nu este pe deplin cunoscut , necunoscându-se modul în care aceasta se leagă sau pătrunde în enterocite, ceea ce se știe este însă faptul că enterotoxina termostabilă activează guanilatciclaza, acest nucleotid ciclic alterând funcția membranei enterocitului, conducând la secreția de lichid în lumenul intestinal.

Enterotoxina termostabilă prezintă la tulpinile ETEC umane, metanol solubilă, produce acumulare de lichid în intestinul șoarecelui sugar, fiind denumită STA sau STI pentru a putea fi diferențiată de enterotoxina termostabilă, metanol insolubilă, prezentă la tulpinile ETEC patogene pentru proci (Burgess, 1978); aceasta a fost denumită STB sau STII și produce acumulare de lichid numai în ansa intestinală a purceilor sugari.

Numai STA prezintă importanță pentru patologia umană (Levine-1983).

Există tulpini de E. coli LT+/ST+; LT+/ST-; LT-/ST+.

Producerea de enterotoxină este codificată de un plasmid denumit Ent, relativ ușor transferabil tulpinelor receptoare.

Nu există medii selective sau teste enzimatice care să permită diferențierea tulpinilor enterotoxigene de cele neenterotoxigene, dar s-au descris o serie de teste biologice sau imunologice ce permit evidențierea producerii, cât și a diferențierii enterotoxinelor (Tabel I.1.).

Tabelul I.1.

Teste biologice pentru punerea în evidență a tulpinilor de E. coli enterotoxigene

(Grupul de studiu, OMS, 1980)

E. coli poate produce infecții enterale sau extraenterale.

Infecțiile enterale sunt produse de trei grupe de E. coli.

E. coli enterotoxigen (ETEC), aceasta formează enterotoxine (LT, ST sau LT/ST); boala evoluează de la forme ușoare la forme foarte grave, cu deshidratare asemăntoare cu cea din cazul holere; enterotoxina acțiunează prima oară prin legarea cu un receptor specific, ce este similar cu gangliozidele, de pe celulele sensibile iar după aceea interferează cu metabolismul celular, inducând astfel alterări în producerea de lichid și de electroliți. Toxina ce este legată de celulele sensibile acționează ca și toxina holerică prin activarea adenilciclazei intestinale crescând astfel nivelul de CAMP (cyclic-adenosine-5-monophosphate) ce acționează asupra pierderii de apă și electroliți. Boala se transmite prin intermediul apei și al alimentelor și chiar de la om la om, existând chiar purtători asimptomatici care pot fi considerați rezervorul major de germeni.

E. coli enteroinvaziv (ECEI) are propietatea de a invada țesuturile determinând astfel o simptomatologie asemănătoare cu cea produsă de către Shigella.

E. coli enteropatogen (ECEP), prezintă antigen de suprafață B.

Infecțiile extraenterale, infecțiile tractului urinar, sunt produse frecvent de către anumite serogrupe de E. coli printre care: 01, 02, 04, 05, 06, 07, 09, 011, 018, 039, 050, 075.

Patogenitatea acestor tulpini se datorează mai ales prezenței antigenului K1.

Receptorii celulelor uroepiteliale umane de care tulpinile de E. coli pielonefritogene aderă, sunt glicosfingolipide, înrudite cu sistemul de grup sanguin uman P.

Acești receptori, glicosfingolipidele, apar și pe eritrocitele umane, de aceea majoritate tulpinilor pielonefritogene de E. coli aglutinează etritrocitele umane, hemaglutinare rezistentă la D-manoză.

Pentru a stabili localizarea infecției urinare (superioară sau inferioară) se pot evidenția anticorpii serici (prin reacția de hemaglutinare pasiviă și prin tehnica ELSA), astfel obținându-se titruri crescute în infecțiile urinare localizate la nivel superior cât și prin folosirea tehnicii de imunofluorescență pentru demonstrarea germenilor din urină înveliți cu anticorpi ce sunt prezenți și în infecția localizată la nivelul rinichiului.

Germenii din genul Escherichia pot produce de asemenea leziuni supurative ale tractului digestiv (colecistite, enterite, colite, etc), infecții ale căilor aeriene superioare, septicemii, toxiinfecții alimentare.

I.1.1.5. Sensibilitatea la factori externi

Bacilii coli rezistă timp îndelungat în mediul exterior. Ei sunt omorâți prin încălzire la 60°C, în timp de 40-60 minute. Sunt sensibili la acțiunea substanțelor dezinfectate: cloramină, fenol, formol, sublimat, etc. De asemenea, sunt sensibili la acțiunea streptomicinei, cloramfenicolului, la unele sulfamide, etc., dar nu sunt afectați de penicilină. Pot sintetiza substanțe care distrug alte specii bacteriene, dând naștere la fenomene de antagonism microbian.

Sunt sensibili la acțiunea antisepticelor uzuale: fenol, sublimat, cloramină etc. Clorul în concentrația de 0,5 – 1/1 000 000 este folosit pentru purificarea apei, datorită acțiunii sale bactericide asupra germenilor. Sunt sensibili față de acțiunea unor coloranți (verde brillant, verde de malahit), care introduși în medii de cultură inhibă în mare măsură dezvoltarea coloniilor de E. coli.

Alte substanțe cu acțiune bacteriostatică (clorura de litiu, sărurile de seleniu, teluritul de K, tetrationatul etc.) sunt folosite în același scop. Sensibili de asemenea față de o serie largă de antibiotice: betalactamine (ampicilina); oligozaharide (Streptomicina); antibiotice cu spectru de „tip streptomicinic” (Neomicină, Kanamicină, Gentamicină, polimixina B, Colimicină) ;

antibiotice cu „spectru larg” (Tetraciclină, Cloramfenicolul); sulfamide (Nitrofurantoinul, Furazolidonul); chimioterapice urinare (ac. nalidixic, Cotrimoxazolul). Rezistența tulpinilor de E. coli față de antibiotice și chimioterapice este în creștere, unele dintre tulpini purtând plasmide R. Germenii sunt sensibili la acțiunea bacteriofagilor; unele tulpini sunt lizogene.

Tulpinile de E. coli pot sesiza prezența sau absența unor substanțe chimice sau gaze în mediul de viață iar cu ajutorul cililor se pot apropia sau îndepărta de acestea. Acestea pot devenii chiar imobile și pot produce fimbrii de adeziune care să le permită aderarea de substratul specific.

Ca răspuns la modificările de temperatură sau de osmolaritate acestea își modică dimensiunea porilor prin modificarea porinelor constituente ale membranei externe.

Posedă un mecanism complex de reglare a metabolismului celulei bacteriene care îi permite să iși asigure o viață ușoară: sintetizează doar acele enzime necesare utilizări compușilor din mediu.

Tulpinile de E. coli pot dezvolta rezistență față de substanțele antibacteriene prin elaborarea de enzime care hidrolizează betalactaminele sau prin mutații care afectează porinele devenind astfel rezistente față de aminozide.

I.1.2 Genul Klebsiella

Microorganismele din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate, caracterizate printr-o imensă activitate metabolică asupra hidraților de carbon pe care îi hidrolizează cu producerea de acizi și uneori de gaz.

Habitat

Klebsiella pneumonice este larg răspândită în natură ( sol,apă ), dar și în intestinul omului și animalelor, în mediul spitalicesc se selectează tulpini multirezitente ce pot coloniza tractul urinar sau respirator la adult, sau tractul intestinal la copil, mai ales după terapia cu aantibiotice cu spectru larg.

Caractere de cultură

Se cultivă cu ușurință pe medii uzuale fără cerințe nutritive speciale.Pe medii gelozate s-au descris mai multe tipuri de colonii, cel mai frecvent fiint tipul mucos (M) : colonii mari, apalescente, uneori cenușii, cu suprafață umedă care după o incubare prelungită prezintă tendință la confluare si “curgere’’ pe suprafața mediului. Pe mediile lactozate sunt lactozo pozitive.

Caractere biochimice

Pe mediile multitest, germenii au următoarea comportare enzimatică: pe mediul TSI sunt glucozo pozitivi și uneori fermentează glucoza cu producere de gaz, sunt lactozo pozitivi, nu produc hidrogen sulfurat; pe mediul MIU sunt imobili, indol negativi și urează pozitivă, pot crește pe medii avand citrat drept unică sursă de carbon.

Structura antigenică

Particularitățile morfologice ale klebsielelor se reflectă în structura antigenică. Au fost descrise antigene somatice O specifice de grup și antigene capsulare polizaharidice K, specifice de tip. Există peste 80 de tipuri antigenice, identificabile de exemplu prin reacția de umflare a capsulei.

Caractere de patogenitate

Klebsiella pneumoniae este un microorganism condiționat patogen, care poate fi implicat în patologia umană prin multiplicare și invazivitate.

Factorii de patogenitate sunt reprezentați de capsula care îi conferă rezisteță față de fagocitoză și de endoxina (antigenul O) eliberată după distrugerea bacteriei.

Fig.I.6. Klebsiella pneumoniae- pe mediu TSI (URL-6)

I.1.3 Genul Proteus

Genul Proteus este format din germeni pleomorfi,foarte mobili, gram negativi, care nu fermentează lactoza, produc urează, sunt nesporulați, necapsulați. Există două specii principale, Proteus mirabilis și Proteus vulgaris (P. morganii a devenit Morganella maoganii, iat P.rettgeri a devenit Providencia rettgeri) (Mircea și Gabriela 2004).

Habitat

Germenii din genul Proteus sunt răspândiți în natură ubicvitar, se pot identifica în materiile organice în putrefacție, în alimente. Fac parte din flora untestinală umană.

Caractere de cultură

Cresc pe medii simple inclusiv pe medii peptonate lichide cu degajarea unui miros xaracteristic de putrefacție. Suportă mari variații de temperatură și pH. Pe mediile diferențiale (cu lactoză) nu se pot obșine colonii izolate, descriindu-se fenomenul de invazie sau migrare. Cultura se întinde pe toată suprafața plăcii sau tubului în strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri niliare, tiosulfat de sodiu etc.

Dacă pe o placă cu mediu solid se cultivă doua tulpini diferite, în doua puncte opuse, acestea se vor dezvolta invadând până la un punct în apropierea liniei de îmtâlnire, unde se va crea o linie de demarcație între cele două tulpini (fenomenul liniei de demarcație)

Cultivarea uniu produs patologic în lichid de condens al uniu tub cu geloză înclinată incubat în poziție vertocală va conduce ( în cazul in care produsul patologic contine tuplina de Proteus spp) la obținerea în 24 de ore a unei culturi pure de Proteus, datorită mobilității acestor microorganisme (fenomenul de ‘’cățărare’’).

Structura antigenică

Prezintă antigenul O specific de grup. După constatarea că serul bolnavilor de tifos exantematic aglutinează cu o tulpină de Proteus s-a demonstrat că genul include o serie de tulpini (OX-2, OX-19, OX-K) care au inrudiri antigenice cu microorganisme aparținând genului Rickettsia.

Antigenul flagelar, proteic, H este comun la mai lulte tulpini.

Caractere de patogenitate

Proteus poate deveni patogen prin multiplicare și invazivitate, în condițiile speciale( părasirea habitatului natural, colonizarea unor gazde cu deficiențe ale sistemului imunitar).

La fel ca și ceilalți germeni gram negativi eliberează de la nivel parietal după distrugere, endotoxina (antigenul O).

Mobilitatea deosibită îi permite invadarea tractului urinar.

Producerea de urează alcalinizează irina și favorizează formarea de calculi.

Rezistența la antibiotice si chimioterapice este remarcabilă.

Genul Citrobacter

Acest gen cuprinde trei specii C.amalonaticus , C.diversus, C.freundii care se diferenșiază prin caracterele biochimice. Numele genului este dat de proprietatea acestor bacterii de a utiliza citratul de amoniu ca unică sursă de carbon.

I.2. Infecțiile urinare

Sistemul urinar este format din cei doi rinichi, căile urinare intrarenale și extrarenale. Partea glandulară a rinichiului coafează sinusul, o mare cavitate adiacentă hilului renal. Sinusul conține bazinetul renal, țesut conjunctiv lax și țesut adipos prin care trec și dinspre porțiunea glandulară nervii, arterele, respectiv venele și vasele limfatice.

Bazinetul renal se continuă la nivelul hilului cu ureterul prin care urina ajunge în vezica urinară, de unde este eliminată periodic prin uretră. În bazinet se deschid calicele mari, care reunesc calicele mici.

Uretra masculină are 18-20 cm lungime pe când cea feminină are doar 2,5-3 cm lungime.

Nefronul este unitatea secretorie a rinichiului.

Infecțiile urinare se definesc prin prezența bacteriilor la nivelul tractului urinar, însoțită de un răspuns din partea gazdei.

Eliminarea microorganismelor în urină se numește bacteriurie.

Infecțiile urinare se realizează cel mai frecvent, pe cale ascendentă, din căile urinare inferioare și mai rar pe cala descendentă hematogenă.

În producerea și persistența lor pot intervenii o serie de factori favorizanți.

O importanță majoră o reprezintă factorii care împiedică fluxul fiziologic al urinii și produc o stază retrogradă a urinii: litiaza renală, hidronefroza, tumorile aparatului renal, traumatismele renale cu cheaguri sanguine, stenozele uretrale, megaureterul, procesele tumorale sau inflamatorii din bazin (genitale sau rectale), care pot comprima căile urinare.

Sarcina se însoțește frecvent de bacteriurie, dintre gravidele cu bacteriurie multe prezintă o pielonefrită, deseori asimptomatică. Infecția urinară este favorizată de modificările anatomice importante din bazin, care adesea evidențiază o infecție anterioară localizată la rinichi.

Un factor important în realizarea infecțiilor urinare este cateterismul uretral și vezical explorator.

Alți factori favorizanți ai infecților urinare sunt anumite boli metabolice (diabet, cistinurie, aldosteronism), precum și stări de rezistență scăzut pe lângă care mai intervin probabil, și alți factori, ca starea unor mecanisme de apărare: fagocitoza, imunitatea celulară, răspunsul deficitar în formarea de anticorpi locali, ca și formarea de anticorpi față de antigenul K al E. coli. Starea de pH-ului urinar favorizează dezvoltarea anumitor bacterii; astfel alcalinizarea urinii favorizează infecția cu Proteus.

Stările generale grave, cu retenții urinare, paraplegii, paralizii vezicale de cauze variate sunt alte condiții favorizante. La diabetici, infecțiile urinare survin cu o frecvență de 10-20%.

La femei, incidența infecțiilor urinare este mai mare, ceea ce se explică prin infecția frecventă a uretrei cu bacterii introitus, de unde se cultivă enterobacterii la 58% din femeile sănătoase. Scurtimea uretrei constituie, de asemenea, un factor favorizant, precum și lipsa de igienă după raporturi sexuale.

La bărbați, infecțiile devin mai frecvente după 50 de ani.

La copii, infecțiile urinare sunt favorizate de defectele anatomice ale aparatului excretor și de alte cauze, care produc un reflux vezico-ureteral.

In infecțiile descendente, hematogene, multiplicarea bacteriană începe în interstițiul parenchimului renal și în capilare, propagându-se apoi și la tubii renal. Având în vedere acest mecanism patogenic și aspectul histologic rezultat, se consideră că termenul de nefrită interstițială nu este cel mai potrivit, deoarece sunt interesați tubii distali și căile urinare superioare, ceea ce face ca termenul de pielonefrită sa fie cel mai adecvat.

I.2.1. Clasificare

Cadrul amplu al infecțiilor urinare conține atât infecțiile segmentelor superioare (nefronii, papilele, calicele, bazinetul, ureterele) cât și segmentele inferioare ale tractului urinar (vezica, uretra și anexele). În numeroase cazuri, aceste segmente sunt afectate doar ele, pe cale hematogenă sau retrogradă. Deși infecțiile parenchimului renal sunt mult mai grave decât acelea ale căilor urinare inferioar, totuși, în numeroase cazuri, defectele anatomice ale căilor excretoare urinare contribuie la infecție.

După localizări aceste infecții pot fi: nefrite, pielonefrite, cistite, uretrite.

Infecțiile urinare se mai pot clasifica și în: necomplicate, complicate și recurente.

Cele necomplicate cuprind: cistita, pielonefrita și bacteriuria asimptomatică. Cele complicate intră în relație cu factori favorizanți: obstructivi (litiaza urinară, corpi străini, aednom de prostată, etc) sau cu alti factori (diabet zaharat, sarcină, boli metabolice, etc).

Infecțiile recurente se caracterizează prin episoade simptomatice ce se intercalează cu cele asimptomatice.

Infecțiile urinare mai pot fi clasificate și astfel:

– acute sau cronice;

– asimptomatice sau simptomatice;

– ascendente sau descendente.

În cazul în care infecția urinară este însoțită de o stare septică aceasta este denumită urosepsis.

xxxxxxxxxxxxx

I.2.3. Prognostic și tratament

Tratamentul unei infecții urinare trebuie diferențiat în funcție de agentul etiologic și de tipul de infecție urinară (superioară sau inferioară, asimptomatică, recidivantă, la gravide).

Tratamentul antimicrobian trebuie completat cu tratarea sau îndepărtarea factorilor favorizanți.

De când Kass a definit bacteriuria semnificativă în anul 1965 prin izolarea unei germen patogen din urină în cultura pură, s-a putut diferenția o infecție urinară adevărată de o infecție urinară contaminată.

Diferența între o infecție urinară superioară și una inferioară este importantă pentru intensitatea și durata tratamentului antimicrobian: pentru cele superioare este necesar un tratament prelungit, în timp ce infecțiile inferioare necesită un tratament mai scurt.

Tratamentul infecțiilor urinare superioare (pielonefrita acută).

Medicația antimicrobiană trebuie aleasă în funcție de sensibilitatea la antibiotice a germenului respectiv. La început se administrează aproape întotdeauna o sulfamidă sau, mai bine, cotrimoxazol, care s-a arătat net superior sulfamidelor.

Majoritatea bacililor Gram-negativi sunt sensibili la cotrimoxazol, obținându-se o proporție de vindecare mare.

Deosebit de activi sunt derivații fluorați de chinolone, ca ofloxacina și coprofloxacina, care se administrează în 2 reprize de 50 mg la 12 ore.

Dintre antibiotice s-au dovedit utile: ampicilina, kanamicina, carbenicilina, colistina, cefalotina, gentamicina. Dintre antibioticele cu spectrul larg sunt mai adecvate tetraciclinele. Cloramfenicolul nu este indicat deoarece se elimină prin urină, în mare parte, sub formă inactivă.

Infecțiile urinare nozocomiale, survenite în spital, sunt provocate de bacterii rezistente la antibioticele uzuale. În aceste cazuri este necesară antibiograma, chiar strict indicată.

Durata tratamentului în infecții acute este curpinsă între 10 și 14 zile. Tratamentele prelungite de la 3 la 6 săptămâni, nu au dat rezultate mai bune.

Tratamentul infecțiilor urinare inferioare.

Din 1978, numeroase cercetări au demonstrat că, în acest timp de infecții, tratamentul cu o singură doză (maximă) de antibiotice se obțin vindecări într-un procent similar cu tratamentul uzual de 10-14 zile. Se poate folosi o doză unică, administrată odată, de amoxicilină sau de cotrimoxazol dar și gentamicină, cefalotină sau ampicilină, antibiotice ce au dat rezultate mai bune.

Bacteriuriile asimptomatice trebuiesc tratate cu atenție, mai ales la copii și gravide deoarece prezintă riscul dezvoltării unei pielonfrite cronice.

Tratamentul infecțiilor urinare la gravide.

Se recomandă un tratament antimicrobian de 7-14 zile cu o penicilină cu spectru larg: ampicilină, amoxicilină, carbencilină, ureidopeniciline, sau cu o cefalosporină.

În bacteriuriile asimptomatice, tratamentul este același sau cu sulfamide (cu excepția perioadei prenatale) sau cu nitrofurantoină.

Cercetările au arătat rezultate similare cu tratamentul cu o singură doză de ampicilină (4g) sau amoxicilină (3g). În caz de recidive frecvente, se administrează zilnic, până la naștere, nitrofurantoină (50-100mg/zi).

Sunt contraindicate la gravide: tetraciclinele, cotrimoxazolul, aminoglicozidele.

Tratamentul infecțiilor urinare recidivante și cronice.

În afară de corectarea factorilor favorizanți, tratamentul antimicrobian trebuie să se adapteze germenilor izolați și antibiogramei, făcându-se controale bacteriologice repetate.

După rezolvarea cu succes a episodului acut, cu o terapie adecvată de 7-10 zile, se recurge la o chimioprofilaxie de durată (mai multe luni), de regulă cu nitrofurantoină sau cotrimoxazol.

Tratamentul trebuie completat cu: medicații simptomatice, reechilibrare hidroelectrolitică, vitamine, control zilnic al funcției renale. Un regim alimentar alternativ, acid și alcalin, poate fi util.

În funcție de tipul infecției pronosticul este diferit, în cele mai multe cazuri infecțiile urinare evoluând favorabil sub tratament medical.

II. Date experimentale

II.1. Scopul si obiectivele cercetarii

Infecțiile urinare continuă să prezinte în populația umană o incidență destul de ridicată, cu toate eforturile medicale și varietatea antibioticelor folosite.Persoanele care prezinta aceste afecțiuni li se administreaza deseori tratamente de lungă durata pentru sterilizarea focarului infecțios și, cu toate acestea, infecțiile urinare au de multe ori caracter recidivant.

Urina este produs al rinichilor.Aceasta străbate anumite tuburi numite uretre, în drumul ei de la rinichi către vezica urinară ,fiind depozitată temporar.

Analiza de urocultură depistează și identifică bacteriile din urină.Această analiză și antibiograma se efectueaza atunci când pacientul prezintă simptome ce indică posibilitatea unei infecții ale tractului urinar, cum ar fi: dureri și arderi în momentul urinării sau urinarea fecventă.

Cercetarea de față are ca scop și determinarea incidenței infecțiilor urinare la copiii din Spitalul de Pediatrie din județul Argeș si consecințele acestei afecțiuni in viața pacienților cu vârsta intre 0-19 ani cu bacterii din genul Escherichia sau din alte genuri în funcție de sexul, vârsta și proveniența pacientilor.

Lucrarea are ca scop următoarele:

-izolarea tulpinilor de bacterii ale genului Escherichia din probe de urină prelucrate prin urocultură;

-caracterizarea tulpinilor din punct de vedere cultural,colonial și morfologic

-testarea efectului inhibitor al antibioticelor folosite asupra tulpinilor de bacterii izolate.

II.2 Materiale și metode

Studiul de față a fost realizat pe un lot de 976 de pacienți, care s-au adresat

Laboratorului de analize medicale din incinta Spitalului Pediatric din Județul Argeș, în perioada martie-august 2014, cu suspiciune de infecție urinară.

Partea experimentală a lucrării a fost realizată în Laboratorul de analize medicale din Spitalul de Pediatrie din Pitesti, Județul Argeș.

Probele au provenit de la pacienți cu vârste diferite, atât femei cât și bărbați, din mediul urban sau rural.

În tabelul 2 se poate observa participarea la acest studiu în funcție de sexul, grupa de vârstă și mediul de proveniență al pacienților investigați.

Tabelul II.2.

II.2.1. Metode utilizate

Urocultura este metoda prin care se permite, prin cultivarea si analiza probelor de urina, identificarea agentilor patogeni care produc infectii ale tractului urinar. Testul de urocultura este utilizat in laboratoarele de microbiologie clinica, fiind recomandat de medicul specialist pentru a stabili existenta unei infectii a cailor urinare.

Proba de urina folosita pentru urocultura poate fi prelevata in unitatea medicala sau la domiciliul pacientului daca se respecta instructiunile de recoltare.

Recoltarea se face intr-un recipient special – urocultor (Fig.II.1)- de unica folosinta, steril, cu capac etanș, pentru a preveni contaminarea probei.
Volumul de urina necesar unui test uzual este de 10 – 15 ml.

Fig.II.1. Recipient de recoltare- uricult ( URL-7)

Este important ca recoltarea sa se faca inainte de inceperea unui tratament antibiotic. Pentru controlul eficientei tratamentului antibiotic, urina se recolteaza dupa 5 – 7 zile de la ultima doza de antibiotic administrata.
Urina se recolteaza in recipiente sterile procurate de la laborator (urocultoare sterile pentru adulti, pungi sterile de unica folosinta pentru sugari).
Daca proba nu poate fi transportata in maxim 2 ore la laborator, aceasta se pastreaza la temperatura 2 – 8°C.

II.2.2.1. Urocultura

După examinarea microscopică a urinei are loc realizarea uroculturii. Există două categorii de uroculturi: urocultura cantitativă și calitativă.

A.Urocultura cantitativă

Urocultura în mod uzual al termenului înseamnă determinarea cantitativă a numărului de germeni pe milimetru din proba de examinat, cu precizarea taxonomiei ei. Pentru realizarea uroculturilor cantitative se pot folosi trei metode:

-metoda diluțiilor în placi

-metoda ansei calibrate

-metoda uricult

Metoda diluțiilor

Diluarea: se ia o serie de diluție din mijlocul chimioterapeuticelor adăugându-se fiecărei trepte de diluție aceeași cantitate de bacterii în suspensie. Se incubează fiecare treaptă de diluție și se observă la ce concentrație încetează creșterea bacteriilor.

În acest mod se poate determina sensibilitatea unei tulpini bacteriene la o substanță activă. Dacă la o diluție foarte mare se constată absența cresterii bacteriilor, avem de-a face cu un antibiotic puternic. Deci prin testul de diluție se stabileste concentrația minimală de inhibiție. Testul de diluție este relativ costisitor, dar el oferă rezultate foarte precise.

Metoda ansei calibrate

Se folosesc anse calibrate de 5 mm sau 2,5 mm care vor încărca, prin scufundare în urină, un volum de 0.01 ml. Cu aceste anse se inoculează câte o placă de geloză sânge și una cu agar-albastru de brom tymol-lactoză pentru fiecare diluție.

Fig II.2. Cultură de E.coli pe mediu de cultură AABTL (originală)

B.Urocultura calitativă

În cadrul uroculturii calitative este necesar a se aprecia identitatea agentului microbian care a produs infecția urinară. În acest scop se apreciază caracterele de cultură și cele coloniale ale bacteriilor crescute pe mediile folosite la urocultura cantitativă, dar se folosesc și medii speciale pentru aprecierea caracterelor biochimice ( TSI, MIU, citrat Simmons) sau medii AABTL, după o perioadă de incubare de 48 de ore

Fig.II.3. Cultură de E.coli pe medii de cultură diferențiate

( madiu TSI, madiu Miu și mediu Simmons)

( original)

II.2.2.2. Antibiograma

Antibiograma sau testarea sensibilității unei tulpini bacteriene constituie o investigatie utilă, chiar indispensabilă pentru alegerea tratamentului în infecțiile bacteriene.

Determinarea rezistenței se efectuează pentru a se obține informații privitoare la starea de rezistență sau sensibilitatea a microorganismelor la antibiotice sau mijloace chimice.

Cele mai cunoscute procedee de determinare a rezistenței sunt:

-procedeul de diluare

-procedeul de difuziune

Metoda diluțiilor

Se ia o serie de diluție din mijlocul chimioterapeutic adăugandu-se fiecărei trepte de diluție aceeași cantitate de bacterii în suspensie. Se incubează fiecare treaptă de diluție și se observă la fiecare treaptă de diluție și se observă la ce concentrație înceteză crețterea bacteriilor. În acest mod se poate determina sensibilitatea unei tulpini bacteriene la o substanță activă. Dacă la o diluție foarte mare se constată absența creșterii bacteriilor, avem de-a face cu un antibiotic puternic.

Deci, prin restul de diluție se stabilește concentrația minimală de inhibiție. Testul de diluție este relativ costisitor, dar el oferă rezultate foarte precise.

Metoda difuzimetrică

Metoda are la bază proprietatea substațelor antimicrobiene de a dufuza într-un mediu de cultură solid pe care se însămânțează cultura bacteriană de testat.

Se recomandă urilizarea mediului Muller- Hinton original, fără glucoză, pentru unele bacterii fiind necesari suplimentarea cu sânge de oaie sau ser.

Este obligatoriu ca microbul de testat sa fie în cultură pură, cu o concentrație paropiată de 0,5 pe scala MacFarland. Antibioticele pentru antibiogramă se găsesc sub formă de microcomprimate cu diametru de 6 mm, ce conțin cantitate prestabilită de antibiotic.

Pe o plăcuță de gel de agar injectată cu tulpină bacteriană se pun mici bucăți de hârtie de filtru îmbibate cu difetite suspensii antibiotice.

Substana activă din hârtia de filtru difuzează în gelul de agar, de jur împrejurul fiecprei bucăți de hârtie cu substanță activă constituindu-se o zonă de inhibiție a creșterii bacteriene.

Antibioticul cu cel mai mare spatiu liber de bacterii este cel mai indicat pentru tratament. Doza de aplicație a antibioticul se stabilește prin testul de diluție.

Testul de difuziune pe gel agar se realizează rapid cu cheltuieli reduse și de aceea este frecvent utilizat în diagnosticul clinic.

Un aspect important este cel legat de asigurarea pentru toate antibiogramele a unor condiții optime de creștere, deci existența pe toată suprafața de fel de agar a unor condiții omogene de creștere bacteriană.

Tehnica de lucru:

Se toarnă 25 ml de geloză nutritivă (Muller-Hinton) în plăci Petri în strat uniform de 3-4 mm. Mediul de cultură trebuie sa aibă un pH de 7,2 și o compoziție adecvată creșterii speciei microbiene de testat. Dacă se cercetează germeni mai pretențioși ,mediul mai poate fi îmbogpșit cu 3-5% sânge de oaie sau ser (în cazul streptococilor β hemolitici, pneumococilor, neiseriilor și a unor enterococi).

Pentru testarea hemofiliilor este necesară prepararea unei geloze chocolat cu autalizat proaspăt de drojdie sau mai bine să se suplimenteze cu factor x sau factor v pur. Pentru pestarea sulfamidelor se va folosi de preferință mediu cu 5% sânge lizat de cal.

Geremenul de cercetat

Poare să provină dintr-o cultură în bulion de 18 ore sau poate fi reprezentată de 5-6 colonii dezvoltate pe mediu neselectiv după 20 de ore. Coloniile se suspendă direct, fie în soluție cloruro- sodică tamponată cu pH de 7,2, fie în bulion și se ajustează la turbiditatea standard.

Depunerea inoculului se face fie prin inundarea cu produs, fie cu ajutorul unui tampon de vată steril care se îmbibă cu suspensie bacteriană, eliminandu-se excesul de inocul.

Uscarea plăcilor inoculate se realizeză prin menținerea la temperatura camerei câteva minute înainte de depunerea comprimatelor.

Substanțele antimicrobiene

Fiecare disc sau microcomprimat de 6 mm are notat un simbol ( de exemplu CRO- ceftriaxone). Conservarea microcomprimatelor se face prin ținerea la frigider la 4°C, ferite de umiditate și lumină. După scoaterea de la frigider se lasă la temperatura camerei timp de o ora pentru echilibrare termică.

Pentru infecțiile urinare se va ține seama de concentrațiile de antibiotice ce se pot obține în parenchimul renal și în căile urinare.

Depunerea microcomprimatelor se face după uscarea plăcilor și nu mai târziu de 15 minute de la însămanțare. Aceasta se realizează cu pensa, aplicănd fiecare comprimat pe suprafața gelozei. Este necesar a se păstra o distanță de 15 mm de la marginea plăcii și aproximativ 30 mm între microcomprimate. Incubarea se face la temperatura de 37°C în poziție răsturnată a plăcii, timp de 18-20 de ore.

Interpretarea rezultatelor:

Se face în funție de diametrul zonei de infibiție măsurat cu rigla, incuzând si diametrul microcomprimatelor. Valorile citite in mm se compară cu tablele de interpretare, tulpina bacteriană apreciindu-se ca sensibilă, intermediară sau rezistentă la antibioticul respectiv.

Fig.II.4. Antibiograma prim metoda difuzimetrică pe tulpină de E.coli (original)

Nu se iau în considerare coloniile foarte mici, sau invazia ulterioară a zonei de inhibiție, prin extinderea in suprafață și nici o creștere mai discretă în interiorul zonei de inhibiție.

Exprimarea rezultatelor în buletinul de analize se face prin notarea antibioticelor în ordinea ariilor se inhibiție a acestora:

de la sensibil cu aria cea mai mare până la cea mai mică

intermediar de la aria cea mai mare corespunzătoare acestei categorii până la cea mai mică

rezistent în cazul antibioticelor cu arie foarte mică de imhibiție sau fără arie de inhibiție în jurul microcomprimatului.

Antibiograma trebuie făcută cu simț de răspundere și cu asigurarea că indicația, recoltarea, transportul și conservarea materialului patologic s-au făcut în condiții bune și că germenul de testat sigur responsabil de ingecția de care suferă bolnavul.

Prezintă o contraindicație absolută efectuarea antibiogramei direct din produse pluricontaminate (exudat faringian, materii fecale ș.a) cât și din microbiota bacteriană mixtă.

În cazurile de urgență se poate efectua antibiograma direct din produs dacă acesta conține un singur tip de germeni și în cantitate suficientă pentru un inocul adecvat.

II.3 Rezultate și discuții

II.3.1. Incidența infecțiilor urinare în lotul de pacienți investigat

Au fost prelevate și prelucrate 976 de probe de urină, în perioada martie-aprilie 2014, provenite de la pacientii care s-au adresat laboratorului de analize medicale din incinta Spitalului Pediatric din Pitești, Județul Argeș, cu diagnosticul clinic de infecție urinară. Pacientii investigați, cu vârste cuprinse inte 0-19 ani, au fost atat de gen feminin cat și de gen masculin, cu proveniență rurala sau urbană.

Dintre probele prelevate, in perioada martie-aprilie 2014, 93 (9,52%) au fost pozitive, prezentând diferite categorii de germeni și confirmând prin teste de laborator diagnosticul de infecție urinară. Acest lucru se poate observa și in Fig.II.5.

Fig.II.5. Incidența infecțiilor urinare în lotul de pacienți studiat

II.3.2. Incidența infecțiilor urinare în funcție de agentul etiologic

În ceea ce privește genurile bacteriene implicate în infecțiile urinare studiate , incidența cea mai mare a fost inregistrată pentru Escherichia coli, urmată de Klessiella sp, Staphylococcus aureus, Citrobacter sp și Proteus sp. cum se poate observa și în Fig II.6.

Fig.II.6. Incidența diferitelor specii bacteriene implicate în infecțiile urinare în

lorul de pacienți studianți

Din datele obținute se poate observa că Escherichia coli deține locul I în etiologia infecțiilor urinare. Celelalte specii sunt si ele destul de frecvente implicate în etiologia infecțiilor urinare.

Incidența infecțiilor urinare în perioara martie-aprilie 2014 a fost apreciată și în funcție de sexul pacienților investigați.

II.3.3. Incidența infecțiilor urinare pe germeni în funcție de sexul pacientilor

Astfel în figura II.7. se poate observa o incidență crescută a acestor afecțiuni la fetițe față de baieți, din totalul de 93 de probe pozitive , 63,44% din probe au fost înregistrate la persoanele de sex feminin, pe când cele la genul masculin au fost inregistrate 36,55% de probe pozitive.

Fig.II.7. Incidența infecțiilor urinare pe germeni în funcție de sexul pacientilor

Dinte cele 93 de uroculturi studiate ce s-au dovedit a fi pozitive, cele mai multe au fost cu E.coli , în numar de 58 de uroculturi.

Dintre cele 58 de uroculturi pozitive cu E.coli, 38 au fost întâlnite la genul feminin, iar restul de 20 întâlnite la persoanele de gen masculin.

Fig.II.8. Incidența infecțiilor urinare cu E.coli în funcție de sexul pacientului

II.3.4. Incidența infecțiilor urinare pe germeni în funcție de vârsta pacientilor

Pacienții aflați in studiu au fost împărțiți în 5 categorii de vârstă cuprinse între: 0-1 an, 2-3 ani, 4-10 ani, 11-16 ani si 17-19 ani.Se poate observa că grupa de vărstă 4-10 ani a prezentat un procent mai mare (´48%) de infecție urinară, comparativ cu celelalte grupe de vârstă.

Fig.II.9. Incidența infecțiilor urinare pe germeni în funcție de vârsta pacientilor

Dintre infecțiile urinare provocate de Escherichia coli , cea mai afectată

grupă de vârstă a fost tot cea cuprinsă inte 4-10 ani, cum putem observa si din Fig.II.10

Fig.II.10. Incidența infecțiilor urinare cu E.coli pe grupe de vârstă

II.3.5. Incidența infecțiilor urinare pe germeni în funcție de proveniența pacientilor

În Fig. II.11 se poate observa că alt criteriu de apreciere al infecțiilor urinare este acela al provenienței pacienților studiați. Pacienții proveneau atât din mediul urban cât și din mediul rural. Incidența infecțiilor urinare pentru pacienții din mediu rural a fost mai crescută decât incidența infecțiilor din mediu urban.

Fig.II.11. Incidența infecțiilor urinare în funcție de mediul de proveniență

Studiul infecțiilor urinare în peroada martie-aprilie 2014, cu tulpină de E.coli în funcție de mediul de proveniență, a evidențiat o incidență mai mare în mediul rural decât la cel din mediul urban

Fig.II.12. Incidența infecțiilor urinare cu tulpină de E.coli în funcție de mediul de proveniență

II.3.6. Rezistența la antibiotice a agentilor bacterieni implicați in infecțiile studiate

Pentru toate probele pozitive de urocultiri s-au efectuat si antibiograme pentru stabilirea rezistenței și sensibilitații la antibiotice a tulpinilor bacteriene implicate. În Fig.II. 13 se poate observa că în funcție de numărul de numărul de agenți bacterieni care au participat la antibiogramă, Ciprofloxacinul este antibioticul cu cea mai mare sensibilitate, urmat de Cefoperazone, în timp ce Biseptolul, Cefaclorul și Acidul nalidixic s-au dovedit a fi rezistente,………………………..

Fig II.13. Clasificarea ariilor de inhibiție a antibioticelor în categoriile

Sensibil , Intermediar ,Rezistent

Antibioticele folosite în cazul antibiogramelor acestiu studiu prezintă diverse variații ale procentelor pentru sensibilitate, pentru sensibilitate intermediară si rezistență.

Concluzii

Lucrarea de față a confirmat incidența crescută a infecțiilor urinare cu Escherichia coli, un cunoscut patogen al aparatului urinar.

În decurs de 6˛luni, din lotul de 976 de probe de urină testate, s-a ajuns la urmatoarele rezultate: 883 de uroculturi au avut rezultat negativ și doar 93 de uroculuri au iesit pozitive având urmatoarele tulpini bacteriene: 58 de probe din cele pozitive prezentau E.coli, 15 cu Staphilococcus aureus, 11 cu Klebsiella, 7 cu Citrobacter și 2 cu Proteus.

În urma cercetărilor, s-a ajuns la concluzia că infecțiile de tract urinar sunt mai frecvente in mediul rural decât in cel urban, iar ca sex, frecvență mai crescută a infecțiilor urinare au avut-o fetițele în detrimentul băieților.