CERCETARI PRIVIND ETIO-EPIDEMIOLOGIA, DIAGNOSTICUL SI CONTROLUL UNOR HEMOPARAZITOZE LA CARNIVORE [309928]
[anonimizat], DIAGNOSTICUL SI CONTROLUL UNOR HEMOPARAZITOZE LA CARNIVORE
Cuprins
INTRODUCERE………………………………………………………………………………………………..2
Capitolul 1. BOLI TRANSMISE DE ȚANȚARI
1.1.Dirofilarioza …………………………………………………………………………………………..4
Capitolul 2. BOLI TRANSMISE DE FLEBOTOMI………………………………………………..8
2.1 Leishmanioza………………………………………………………………………………………….8
Capitolul 3. BOLI TRANSMISE DE PURICI ……………………………………………………….28
3.1 Hemoplasmoza………………………………………………………………………………………28
3.2 Bartoneloza……………………………………………………………………………………………33
Capitolul 4. BOLI TRANSMISE DE CAPUSE ……………………………………………………..41
4.1 Anaplasmoza…………………………………………………………………………………………41
4.2 Borelioza………………………………………………………………………………………………52
4.3 Ehrlichioza…………………………………………………………………………………………..68
4.4 Hepatozoonoza………………………………………………………………………………………80
4.5 Babesioza …………………………………………………………………………………………….88
Introducere ……………………………………………………………….3
1. Scopul lucrării………………………………………………………….8
2.Metode si mijloace………………………………………………………8
2.1 Animale luate in studiu……………………………………………….8
2.2. Metode de lucru………………………………………………………9
2.2.1. Evaluarea hematologică………………………………………9
2.2.2. Evaluarea biochimică………………………………………..10
2.2.3. Diagnosticul citomorfologic…………………………………11
2.2.4. Evaluarea serologică…………………………………………13
3. Rezultate si discuții……………………………………………………17
3.1.Rezultate ………………………………………………………17
3.2. Discuții………………………………………………………..23
4. Direcții ulterioare de cercetare………………………………………35
Bibliografie………………………………………………………………37
Bibliografie…………………………………………………………………………………………………….103
Introducere
PARTEA I
[anonimizat] o largã rã[anonimizat], producând efecte negative atât asupra sãnãtã[anonimizat] sãnãtãții oamenilor (Peter G. Irwin, 2009).
Printre numeroșii paraziți cu localizare sanguinã, [anonimizat], [anonimizat], Cytauxzoon, Dirofilaria, Ehrlichia, Mycoplasma , Hemoproteus, Leukocytozoon și Trypanosoma.
[anonimizat]:
[anonimizat]
• [anonimizat]
• [anonimizat] (Mycoplasme hemotropice)
– Bartoneloza
• [anonimizat]
– Borelioza
– Ehrlichioza
– Hepatozoonoza
– Babesioza
Aceste boli prezintã interes în cercetarea medicalã deoarece unele dintre ele reprezintã factori patogeni crescuți pentru câini și pisici, iar de multe ori diagnosticul și controlul acestora este dificil. Semnele clinice sunt variate și de puține ori patognomonice ,apãrând dupã o lungã perioadã de incubație, animalele având rol de rezervor prin infecția persistentã.Unele dintre acestea reprezintã importante zoonoze, de exemplu: borelioza, leishmanioza, ricketsioza, bartoneloza și dirofilarioza.
Schimbãrile climatice și de ecosistem, precum și creșterea numãrului de animale de companie ce cãlãtoresc alãturi de stãpâni dintr-o țarã în alta au influențat ariile de rãspândire epidemiologicã ale bolilor transmise de vectori, astfel cã boli care erau considerate rare, au crescut în frecvențã în anumite zone non-endemice.
CAPITOLUL 1. BOLI TRANSMISE DE ȚÂNȚARI
1.1. DIROFILARIOZA
Dirofilarioza este o helmintoză ce afecteazã în special carnivorele, determinatã de prezența paraziților din genul Dirofilaria în țesuturi și în spațiile tisulare, în arterele pulmonare, atriul drept, ventricul drept, vena cavă cât și în țesutul conjunctiv subcutanat Leidy,
1856). Este întâlnitã mai frecvent la canide și feline, dar a fost deasemenea semnalată și la dihor, castor, iepure, căprioară, urs, cal, pisică, maimuță și om (A. Furtado, 2010).
D. repens, care cauzeaza dirofilarioza subcutanatã, este cea mai importantă dintre speciile responsabile pentru infecțiile zoonotice în Europa (Genchi C. et al., 2005).
Taxonomie
Regnul : Animalia
Încrengătura: Nemathelmintes
Clasa: Nematoda
Subclasa: Spiruria
Ordinul: Spirurida
Familia: Filariidae
Subfamilia: Filariidae
Genul: Dirofilaria
Specii: D.immitis (Leidy 1856)
D.repens (Raillet și Henry 1911)
Etiologie
• Genul Dirofilaria este divizat în două subgenuri:
– Subgenul Dirofilaria care include D. corynodes (Linston, 1889), D. immitis (Leidy, 1856), D. magnilarvatum (Prince, 1959), D. striata (Molin, 1858), D. tenuis (Chandler, 1942), D. ursi (Yamaguti, 1941)
– Subgenul Nochtiella care include N. (Dirofilaria) repens (Railliet and Henry, 1911).
• Genul Dipetalonema
– D. (Achantocheilonema) reconditum, D. (Achantocheilonema) drancunculoides, D. (Cercopithifilaria) grassi
Morfologia și ciclul biologic al speciilor de Dirofilaria parazite la carnivore
Nematodele genului Dirofilaria sunt reprezentați de helminți subțiri iar stadiile larvare se gasesc de obicei în gazda definitivă, fiind la distanță de locul de unde provin.
Microfilariile se dezvoltă în uterul femelei adult și sunt înconjurați de membrana oului. Femelele sunt ovivipare și elimină microfilariile în circulția sanguină, unde devin disponibile vectorilor hematofagi. Microfilariile sunt capabile să reacționeze la modificările fiziologice ale gazdei și pot abunda în circulația periferică la un anumit moment al zilei sau al nopții, putând chiar lipsi din aceasta. Ele prezintă o structură ce permite trecerea lor prin peretele capilar precum și prin trompa îngustă și peretele intestinal al artropodelor (L.M. Ortega-Mora, et al., 1989).
Fig. 1. Ciclul biologic Dirofilaria spp. (http://www.cdc.gov/parasites/dirofilariasis/biology_d_immitis.html)
Nematodele subgenului Dirofilaria sunt filarii mari fără creastă cuticulară, cu excepția suprafeței ventrale a extremității caudale a masculului; papila caudală a masculului prezintă o ușoară asimetrie în număr și distribuție. Nematodele subgenului Nochtiella sunt filarii relativ mici ce prezintă cuticulă longitudinală, papila caudală a masculului prezentând o asimetrie distinctivă în număr și distribuție (Canestri Trotti et al., 1997).
Paraziții sunt transmiși de un artropod care acționează deopotrivă ca o gazdă intermediară dar și ca vector. Ambele specii de Dirofilaria sunt transmise de diferite tipuri și genuri de țânțari. Cele mai prevalente specii la câine și la pisică sunt D. immitis și D.repens, ultima reprezentând agentul etiologic al dirofilariozei cutanate.
Adultii speciei Dirofilaria sunt helminți alungiți, filiformi, cu extremitatea cefalică subțire și ușor alungită. Deschiderea orificiului rostral este circulară, fără buze și vestibul bucal, înconjurată de 4 perechi de papile cefalice de dimensiuni reduse și 2 laterale. Esofagul este divizat în două porțiuni: porțiunea musculară și porțiunea glandulară fără o delimitare clară între acestea două. Papilele cefalice au o structură filamentoasă, cu baza mai alungită decât vârful, și cu o concavitate longitudinală. Vârful prezintă trei ramificații. Suprafața corpului prezintă fine striații transversale. Striațiile cuticulare sunt dispuse la nivelul extremității cefalice în jurul papilei cefalice, papilelor laterale și ale deschiderii rostrale precum și la nivelul extremității distale a femelei (phasmids lângă papilele caudale). Striațiile transversale lipsesc de la nivelul papilelor cefalice, deschidrea vulvară și anus. (Furtado, A. 2010)
Ciclul biologic este diheteroxen, realizându-se cu participarea țânțarilor, gazde intermediare, care se infestează, ingerând microfilariile în momentul hrănirii cu sânge de la animalele bolnave. Contaminarea G.I. este favorizată de biologia microfilariilor: se acumulează în circulația sanguină periferică și prezintă un bioritm circadian, cu creșterea densității lor în sângele periferic, seara și noaptea, precum și diminuarea matinală.
În tubii Malpighi ai culicidelor (Anopheles, Culex, Aedes), microfilariile se dezvoltă, ajungând larve infestante L3 în aproximativ 14 zile, când revin la nivelul trompei (Noế, 1901, Taylor,1960, citați de Bussieras și Chermette,1995); durata dezvoltării crește în cazul temperaturilor sub 26°C. Infestarea canidelor are loc prin înțepătura de țânțar: larvele L3 părăsesc labiumul țânțarului și pătrund activ în tegumentul animalului, în momentul înțepăturii; timp de 70 de zile se dezvoltă în țesutul conjunctiv sau mușchi, realizând două năpârliri, apoi, pe cale venoasă, ajung în cordul drept , unde în aproximativ 3-4 luni devin adulți, capabili de reproducere. Perioda prepatentă este de 6 luni, ciclul integral realizându-se în 8-9 luni. Longevitatea adulților ajunge la 3-6 ani, faza reproductivă, cu prezența larvelor în circulația sanguină, fiind de 2-3 ani (Hiepe,1985, Bauer,1987). Longeviatea microfilariilor în sângele canidelor, determinată după îndepărtarea chirurgicală a viermilor adulți din cord, a fost de 3-5 luni, uneori chiar mai mult.
Practic toți câinii sunt susceptibili la infecția cu dirofilaria și majoritatea larvelor stadiul L3 se dezvoltă în adulți. Dihorii sunt gazde sensibile de asemenea, însă felinele sunt oarecum mai rezistente. Un procent mic de pisici expuse la dirofilarioză dezvoltă boala cu dirofilarii adulte, în număr de maxim 3 viermi. Altă dovadă de relativă rezistență a pisicilor este timpul scurt de supraviețuire a larvelor L5 în arterele pulmonare, viermii adulți supraviețuitori nu rezistă mai mult de 2 ani.
Rãspândirea geograficã a dirofilariozei este neuniformã, etiologia fiind strict legatã de existența concomitentă sau succesivă a gazdelor definitive și a celor intermediare în aceeași zonă, mai des intalnita in zonele tropicale, subtropicale si temperate.
Sursele de infestație sunt reprezentate de carnivorele domestice și sălbatice, mai ales de către câini, care pot avea până la 30.000 microfilarii/ml de sânge. Populațiile de țânțari din zonele endemice constituie surse importante de paraziți. Infestarea se realizeazã prin intepatura de tantar; prezenta ocazionala a microfilariilor la catei nou nascuti, arata ca acestea pot traversa placenta. Receptivitatea este dependentă de specie, cel mai receptiv este cainele urmat apoi de vulpe, alte canide prezentand forme latente ale bolii. Câinii reprezintă principala gazdă definitivă a Dirofilariei immitis, cu toate că a fost descrisă și la lupi, câinii dingo, coioți, vulpi, diverse tipuri de feline (inclusiv pisica domestică), mustelide (ex.dihori), urși, urșii Panda, castori, iepuri, căprioare, cai, primate și la om. Numeroase din aceste infecții sunt sporadice și microfilaremia poate fi absentă.
Procesele patogenetice, determinate atat de helminti adulti, cat si de microfilarii, depind de gradul de infestatie. Tabloul clinic este polimorf, cel mai adesea boala evoluand cu semne clinice sterse sau dimpotriva simptome grave exprimate printr-un sindrom de insuficienta cardiaca, sindrom nervos sau sindrom cutanat.
Diagnosticul epidemiologic are în vedere existența de zone endemice, folosind:
• Diagnosticul clinic – dificil datorita polimorfismului semiotic
• Diagnosticul radiologic, electrocardiografic și angiografic se constată creșterea în volum a ventriculului drept și distensia arterelor pulmonare.
• Diagnosticul serologic se poate face prin IFAT, ELISA
• Diagnosticul microscopic
-Knott modificată
-colorarea imunohistochimică cu fosfataza acidă
-picatura directã, examen ob.x10, lama/lamelã
În teritoriile unde prevalența dirofilariozei este mare, câinii infestați cu Dirofilaria pot să nu prezinte microfilarii, mai ales câinii tratați preventiv cu lactone macrociclice (milbemicină și avermectină). Luând în considerare acest lucru, majoritatea câinilor cu microfilarii circulante pot fi depistați prin examinarea unei probe de sânge proaspăt pentru microfilarii sau prin mișcarea celulară indusă de acestea. Un aspect staționar, mai degrabă decât unul dinamic și migratoriu indică prezența dirofilariei, aproape întotdeauna D.immitis. Poate fi vizibilă mișcarea și într-un tub de microhematocrit sub stratul leucotrombocitar. Oricum acestea sunt metode insensibile de examinare a sângelui în care este prezent un număr scăzut de microfialrii(50-100/ml). Prin urmare, cel puțin 1 ml de sânge ar trebui examinat folosind metoda Knott modicatã pentru a stabili prezența sau absența microfilariilor.
CAPITOLUL 2. BOLI TRANSMISE DE FLEBOTOMI
2.1. LEISHMANIOZA
Leishmanioza este produsã de protozoare flagelate din genul Leishmania, ce afectează mamiferele (inclusiv omul) și reptilele, care se localizeazã și paraziteazã specific în macrofage și alte celule ale sistemului reticulo-endotelial, transmiterea infestației realizându-se de flebotomide.
Leishmaniozele sunt un grup de zoonoze transmise omului și animalelor prin înțepătura flebotomilor din categoria musculițelor de nisip. Aceste zoonoze sunt numite după Sir William Boog Leishman, Director General al Serviciilor Medicale între anii 1923- 1926. Leishmaniozele sunt cauzate de protozoare parazitare intracelulare. În toată lumea, acestea constituie un grup de boli transmise de vectori foarte importante.
Taxonomie
Etiologie:
• Grupul de leishmanii cu afinități dermotrope:
– Leishmania major – Orientul Mijlociu, Asia centrală, China meridională, Africa; g.d.-rozătoare, om; g.i.- Phlebotomus papatasi și Ph. duboscqui.
– L. tropica (L. minor)-distribuție ca precedenta; g.d.-om și câine; g.i.-Ph. sergenti;
– L. aetiopica-Etiopia, Yemen, Kenia; g.d.- om; g.i.-Ph. longipes și Ph. podifer.
– L. enrietti-g.i.- cobai; g.i.- Ph. spp;
– L. mexicana-Mexic, Venezuela, Brazilia; g.d.- om și rozătoare; g.i.- flebotomi din genul Lutzomyia;
– L. brasisliensis-Brazilia, Columbia, Ecuador, Peru; g.d- mamifere sălbatice și om; g.i.- Lutzomyia spp.
• Grupul de leishmanii viscerotrope:
– L. donovani-Asia; g.d.- om (provoacă “boala neagră” sau “Kala-Azar”; g.i.- Ph. argentipes;
– L. archibaldi (L. nilotica)-Africa Orientală; g.d.- rozătoarele și carnivorele sălbatice; g.i.- Ph. spp;
– L. infantum – bazinul mediteraneean, Orientul Apropiat și Mijlociu; g.d.- carnivorele domestice și sălbatice, rozătoarele și omul; g.i.-Ph. spp. și Lutzomyia spp.
Leishmania prezinta douã forme de existențã:
-forma amastigotã- întalnitã în macrofage și celulele SRE (ușor ovoidã,dimensiuni de 2-5µm și prezintã rizonema)
-forma promastigotã- întalnitã în corpul vectorului (ovoidalã, mai alungitã, cu dimensiuni de pana la 15µm și prezintã un flagel posterior)
Epidemiologie
• răspândire: bazinul mediteraneean, Asia, Africa, America Centrală și de Sud;
– caracter endemic al bolii (evoluția bolii legată de prezența parazitului, vectorilor-g.i. și g.d.;
– în România: cazuri de import;
• receptivitate: – variabilă cu specia, rasa, vârsta, factorii genetici și imunitari;
– specia: – boala semnalată la: om, câine, pisică, oaie, capră, cal, cămilă, vacă, maimuță, carnivore sălbatice, urs, rozătoare și reptile;
– rasele: Doberman și Ciobănesc german sunt mai receptive;
– vârsta: câinii tineri fac forme mai grave; incidența bolii este mai ridicată la câinii adulți; factorii genetici și imunitari: -contactul anterior→stare imună protectivă sau reacție hiperergică; – imunosupresia terapeutică (corticoterapie) sau patologică → evoluție gravă;
Sursele de infectie sunt reprezentate de: câini, alte animale receptive domestice și sălbatice (dermul acestor animale conțin leishmanii); speciile de la mamifere nu sunt patogene pentru reptile și invers; omul nu este sursă de infecție→leishmaniile nu se localizează în derm; cobaiul se infectează numai cu specia proprie (L. enrietti), saliva, jetajul și lacrimile →surse de infecție pentru toate speciile receptive;
Simptome
La câine, ȋntalnim forma cronică sau generalizată (asocierea simptomatologiei cutaneo-mucoase cu cea viscerală); per de incubație 1-15 luni, cu simptome generale precum apatia, hipertermie, anemie, piele flască, amiotrofie generală si simptome locale precum depilații circumscrise sau difuze pe cap, gât, coate, jarete, coadă; paracheratoza (furfură) generalizată; hipercheratoză în anumite zone (bot, marginile urechilor, coate); noduli dermici duri (formă și dimensiuni variabile); deformarea unghiilor (răsucire și alungire); ulcere pe cap, membre, cuzineții plantari, mucoasa bucală, digestivă; ulcerele sângerează, epistaxis; limfonodurile superficiale – hipertrofiate și nedureroase.
La examenul clinic, la palpație splina este hipertrofiată și dureroasă, sunt prezente tulburări oculare: cheratită, ulcere corneene, conjunctivită, blefarită; tulburări nervoase motorii: pareze și paralizii ale trenului posterior; tulburări nervoase senzitive: hipo- și hiperestezie; simptome articulare: tumefacții dureroase și șchiopături; uremia și enterita hemoragică → moarte.
Perioada de evoluție a bolii este de câteva luni pana la 2 ani.
Se recomandã diagnosticul diferențial fațã de: dermatoze pruriginoase (râile); dermatoze nepruriginoase; boli ce evoluează cu epistaxis (aspergiloză nazală, erlichioză, ancilostomoză); adenopatii (leucoză, ancilostomoză);
Pot fi identificate 2 tipuri: 1. Leishmanioza zoonoticã, la care rezervoarele gazdã sunt animalele sălbatice, gazde comensale sau animalele domestice, și 2. Leishmanioze antroponotice, pentru care rezervorul este omul. Manifestările clinice ale bolii depinde de tipul patogenului, și deci de tipul leishmaniozei. Se poate transforma într-o infecție fatală (forma visceralã), alături de leziuni cutanate cronicizate (forma cutanatã), sau poate deriva în complicații metastatice, cauzând deformări faciale (forma mucoasã).
În domeniul veterinar dintre toate animalele domestice, câinele este principalul rezervor pentru L. infantum ce produce forma viscerala de leishmanioza la om, dar și animalul domestic este afectat foarte grav de către parazit în sine. În țările endemice leishmaniozei, tratamentul veterinar de multe ori este inaccesibil ca preț, în timp ce în zone precum bazinul Marii Mediteraneene, câinii bolnavi de leishmanioza sunt pacienți tratați în mod frecvent.
Datorită importanței lor, leishmaniozele au fost studiate intensiv în ultimii ani. Punctele de subliniat au inclus:
– Câinele ca rezervor;
– Purtătorii asimptomatici
Prevalenta
Infecțiile în țări non-endemice
Transmiterea non-vectorialã
Apecte generale
Leishmanioza canină (CanL) este provocată de protozoarul L. infantum.
Câinii sunt cele mai importante rezervoare ale patogenului și sunt responsabili pentru persistenta CanL, precum și a leishmaniozei viscerale umane în regiunile Palearctice și Neotropicale. Gazde infectate natural s-au dovedit a fi și vulpile, pisicile, rozătoarele și caii, sau serologic pozitive, dar sunt puține șansele ca acestea să fie rezervoare eficiente pentru transmitere. Câinele este cea mai bună gazdă pentru L. infantum deoarece: – există o perioadă de incubare a infecției
O concentrație înaltă de amastigote de protozoar în derm
Un procent ridicat de recurente alături incertitudinea dispariției complete a parazitului în urma tratamentului
Purtători asimptomatici
Mai mult de 50% dintre câinii ce s-au dovedit existența infecției sunt în mod aparent sănătoși clinic (asimptomatici). Fie trec de perioada de incubare fără manifestarea semnelor clinice pentru perioade lungi de timp (chiar și pe viață), sau manifesta vindecare spontană; ultimele grupuri sunt privite ca rezistențe.
Perioadă lungă a incubării aduce cu sine un număr mare de câini asimptomatici; ei fiind apți pentru a infecta vectorul de transmitere (mulsculita de nisip). În funcție de răspunsul imunologic celular, câinii pot să nu arate vreun semn clinic sau să dezvolte noduli cutanați la locul inoculării. Probabilitatea de infectare a musculiței de nisip s-a observat că este posibilă și de la purtătorii latenți și de la restul animalelor cu diferite grade de boală, deși s-a demonstrat că rata de infectare a musculițelor de nisip a crescut odată cu apariția și severitatea semnelor clinice. Aproape jumătate din câinii seropozitivati identificați în studii de teren au fost asimptomatici.
Prevalența
În general se poate face o distincție între condițiile endemice stabile și instabile ale CanL. CanL stabilă este văzută ca o situație endemică în care transmiterea de la câine la câine a Leishmaniei și de aici apar invariabil noi cazuri în fiecare sezon.
În Europa, o transmitere stabilă se manifestă în mod obișnuit din Mai-Iunie până în Septembrie – Octombrie și este asociată cu următoarele condiții ecologice:
Mediul rural și peri-urban
Teritorii deluroase cu expunere sudică;
Altitudini de la 0 la 6-900 m;
Lipsa condițiilor extreme de clima (vânturi puternice, absența vegetației etc.)
Formă instabilă este definită ca o situație endemică în care cazuri autohtone, deobicei un număr mic, apar sporadic sau periodic, dar nu în fiecare an. Sunt în general întâlnite la granița cu zonele endemice de răspândire stabilă. Pentru prevalențã, studiul serologic rămâne metoda aleasă pentru monitorizarea câinilor la scalã înaltă. Folosind această metodă, nu toate infecțiile sunt detectate astfel că rezultatul studiilor de seroprevalenta reprezintă doar o parte din toți câinii infectați. Ratele de prevalențã nu sunt uniforme în nici unul dintre teritoriile investigate. Ca atare există variații mari între populațiile de câini aflați la câțiva km depărtare unii de ceilalți, o situație de înțeles datorată cerințelor ecologice stricte pentru transmiterea Leishmaniozei.
Infecțiile în țări non-endemice
Raportările a numeroase cazuri și comunicări personale au descris infecții cu Leishmania la câini în America de Nord și Europa de Nord. În Germania, există organizații care au calculat un cumul de 20.000 de câini infectați. Aceste animale sunt de cele mai multe ori importate, dar și multe dintre animale au călătorit cu stăpânii lor în zone endemice.
Cazuri strict locale de CanL în zone non-endemice au fost raportate în Elveția, Germania, Anglia, Belgia, Olanda și SUA. Cazurile fără istoric de călătorie sau de infecție din alte surse și cu identificare a vectorului în ce privește SUA au fost raportate în statele: Texas, Ohio, Oklahoma și Maryland.
Transmiterea non-vectorialã
Slappendel și Teske (1999) au ajuns la ipoteza că preluarea amastigotelor prin tractul gastrointestinal este discutabilă, dar se presupune că este posibil ca macrofagele să preia amastigotele ingerate pătrunse prin leziuni ale mucoasei sau plaga mușcată.
Au susținut faptul că transmisia de la un câine la altul în absența flebotomilor nu este doar o teorie și poate apărea mai des decât în zonele recunoscute ca endemice, dar posibilitatea ca oamenii să fie direct infectați de câini este o idee neglijabilă, rezistenta imunologică dobândită este normală. În ce privește contactul unui câine infectat cu copii și oameni purtători de HIV, cu imunodeficiențe în general, se cere evitarea interacțiunii.
De la mamă la făt – transmiterea infecției la nașterea unui cățel a fost descrisă sau presupusa. Și la om a fost raportată o astfel de transmitere intrauterină la un copil din Sudan.
Prin contactul cu sângele infectat – transmiterea prin sânge de transfuzie infectat a fost deja raportat. La persoanele consumatoare de droguri, se poate transmite folosit în comun ace.
Prin alte secreții corporale – au fost izolate leishmanioze în lichid seminal și urină de câine, în urină și saliva unor pacienți din India diagnosticați cu leishmanioza viscerală (kala azar), cu amastigote de Leishmania detectabile.
Prin înțepătura altor insecte – contaminarea mecanică prin înțepătura altor flebotomi decât musculița de nisipi, dar nu există încă dovezi concrete despre acest tip de transmitere la nivel echivalent cu cel al vectorului principal. Au fost suspectate căpușele pentru transmiterea leishmaniozei, deoarece tractul lor gastrointestinal este capabil de adăpostire a promastigotelor infecțioase, rolul lor în transmitere este îndoielnic datorită ciclului lor de viață.
Fig. 2. Lutzomya whitmani transmite leishmanioza în regiunea Braziliei
(http://link.springer.com/article/10.1186%2F1756-3305-1-25/fulltext.html)
Patogenitate
Genul Leishmania este divizat în două subgenuri pe baza dezvoltării în cadrul flebotomilor. Creșterea speciilor din subgenurile Leishmania este constrânsa doar în anumite părți ale tractului alimentar al vectorului principal, anterior pilorului, la trecerea de la intestinul subțire spre finalul tranctului, în timp ce la specii din subgenul Viannia apare în ambele locații.
Mare parte dintre speciile de Leishmania notate până astăzi au fost descrise inițial pe fondul aspectelor clinice, epidemiologice și biologice. Subgenul Leishmania include specii de relevanță medicală ale „Lumii Vechi” (L. tropica, L. aethiopica, L. major, L. infantum și L. donovani), două specii fără importanță medicală (întâlnită la șoarecele de deșert –gerbil), de importanta medicală dintr-un grup restrâns de origine mexicană (L. mexicană, L. amazonensis, L. venezuelensis, L. pifanol) și câteva specii Neotropicale fără importanță medicală. Subgenul Viannia este întâlnit doar în America Centrală și America de Sud.
Cele mai importante specii sunt L. braziliensis, L. guyanensis, L. panamensis și L. peruviana toate cauzatoare de leishmanioza umană.
Fig.3. Forme amastigote de Leishmania spp. în citoplasmă în frotiu colorație Giemsa
(http://www.cvbd.com/)
Ciclul biologic
L. infantum, agentul infecțios al leishmaniozei canine, este un parazit care are obligatoriu cel puțin o gazdă pentru a supraviețui, două gazde pentru a se dezvolta, o gazdă vertebrată și una insectă. În gazda vertebrată parazitul este întâlnit intracelular în amastigote.
La gazda insectă, L. infantum este găsit extracelular în intestin ca și promastigota.
Amastigotele sunt întâlnite în celulele reticuloendoteliale. Se multiplică prin fisiune binară asexuala formând „cuib de celule” . Membrana celulei gazdă se rupe iar paraziții sunt mai apoi preluați de macrofagele circulante. În funcție de specia parazitului, amastigotele fie rămân în țesuturile superficiale, continuându-și ciclul reproductiv sau stau în macrofage profund în organele sistemului reticuloendotelial precum limfocentrii, măduva osoasă, splina și ficat. O singură înțepătura poate fi deajuns pentru a cauza infecția gazdei vertebrate.
Amastigotele din macrofagele aflate în derm sau circulația periferică sunt preluate în momentul în care musculița de nisip se hrănește de pe o gazdă infectată. În interiorul gazdei insectă se produce o conversie în promastigote la stocarea în intestine. Urmează multiplicarea și translocarea la nivel esofagian. De acolo, în timpul hrănirii musculiței, se transmit gazdei vertebrate.
Fig.4. Imagini schematice ale promastigotei si amastigotelor de Leishmania spp. si transformãrile prin care trece aceasta de la o gazdã insectã la una vertebratã.
(http://www.plospathogens.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.ppat.1003594)
Temperatura și susceptibilitatea gazdei insectă determina ciclul din interiorul musculiței de nisip. La un minim de 10 ᵒ C, aceasta își inițiază ciclul de evoluție iar la creșterea temperaturii utomat se scurtează timpul completare al fazei de insectă, cu cel puțin 6 zile în cazul L. infantum.
Morfologie
O amastigota este o celulă rotundă, de 1,5 la 3×3 până la 6,5 µm, depinzând de specie.
Deține un singur nucleu și un kinetoplast sub formă de bețișor. Nu există flagel liber, ci doar un rudiment al acestuia. Reproducerea acestei forme se face prin diviziune binară longitudinală. Amastigotele pot fi cultivate doar în culturi celulare apropiate.
Promastigotele variază de la 16 la 40 um lungime și 1.5 cu 3 um lățime. Promastigotele sunt mai alungite decât amastigotele, cu un nucleu central și un kinetoplast anterior și un flagel mult mai dezvoltat, care ajuta în propulsarea sau atașarea proprie. Promastigotele pot fi cultivate pe diferite medii, mai ales cu sânge defibrinogenizat și ser inactivat.
Fig. 5. Aspecte morfologice ale promastigotelor de Leishmania spp., L. aethiopica și amastigote cultivate axial. Promastigote evoluate și forme de amastigote fixate în formaldehidă, și văzute cu microscop cu faza de contrast Zeiss Axioskop.
Fotografii cu Olympus-2 cu ulei de imersie și mărire de x1000. Săgețile indică promastigote care se divid.
(http://www.biomedcentral.com/1471-2210/3/6/figure/F4?highres=y)
(http://www.biolib.cz/en/image/id17375/)
Fig. 6. L. donovani amastigote si ciclul biologic
(http://cal.vet.upenn.edu/projects/parasit06/website/lab2.htm)
Răspândirea geografică
Leishmanioza canină este endemicã în peste 70 de țări din lume. Poate fi întâlnită în regiuni din sudul Europei, Africa, Asia, America de Sud și Centralã, cazuri apărute recent în SUA. Leishmanioza canină este o problemă de interes și pentru țările non-endemice unde importul bolii poate constitui o problemă medicală veterinară și nu numai.
Ratele de seroprevalețã găsite în studii conduse în Bazinul Mediteranean se încadrează între 10 și 37%, și ajunge la 7% în urma aplicării metodei PCR pentru detecția ADN-ului Leishmaniei. În urma studiilor de seroprevalenta s-a estimat un efectiv de 2.5 milioane de câini în Franța, Italia, Portugalia și Spania pozitivati cu CanL.
În America deasemenea sunt estimate câteva milioane, mai mult în zona Braziliei și Venezuelei.
Fig. 7. Harta de răspândire a leishmaniozei canine în Europa. (http://www.therottweilerclub.co.uk/leishmaniosis-alert/)
Patogeneza și transmiterea bolii – mecanisme biologice
În condiții naturale, musculița de nisip transmite prin hrănire în jur de 100 până la 1000 de promastigote, suficiente pentru a induce infecția în câini neimunizati. Interesant este faptul că flebotomul este cunoscut că se hrănește cu sânge de la diferite animale.
În consecință, aceasta consumã o cantitate mică de sânge de la un singur vertebrat și ca atare atacã în continuare și alte mamifere, răspândind parazitul Leishmania si cãtre alte gazde.
O mare parte din paraziți sunt distruși de mecanismele de apărare ale gazdei, dar o parte supraviețuiesc folosind diferite strategii. Promastigotele adera la celule recrutate sau rezidente ale sistemului monocit-macrofagic. Adeziunea dependenta de complement este urmată de internalizarea prin fagocitozã. În interiorul fagolizozomilor, promastigotele se transmforma în amastigote non-mobile, acompaniate de o scădere a pH-ului până la ~ 5.
La o gazdă susceptibilă, diseminarea de la nivelul pielii la limfocentrii, splinã și măduva osoasã are loc în primele ore de la contaminare. La animalele rezistente, paraziții rămân localizați în piele sau cel mai probabil în limfocentrii locali.
Răspunsul imun de apărare presupune prezentarea antigenului de cãtre celulele prezentatoare de antigen (APC-uri, macrofage, celule dendritice și Langerhans cele mai importante în leishmaniozã), inducerea și expresia limfocitelor CD4+ Th1 și activarea macrofagelor pentru distrugerea eficientă a parazitului. Superoxidul (O2-) și oxidul nitric (NO) sunt 2 mecanisme efectoare pentru eliminarea parazitului Leishmania.
Tipul de răspuns imun (Th1 sau Th2) este determinat de citokinele in-situ pe care celulele T le întâlnesc la prima interacțiune cu antigenul, IL-4 fiind cea mai importantă.
Reglarea timpurie a IL-4 se poate observa la animalele susceptibile inducând neresponsivitate din partea lui IL-12. Elementul central decisiv în dezvoltarea unei predispoziții sau rezistenței la apariția infecției cu Leishmania este determinat de persistenta răspunsului celulelor CD4+T la IL-12 în cazul în care se păstrează expresia receptorului IL-12 mai mult de 48 de ore de la infectare. La câinii susceptibili în timpul infectării, regiunile cu limfocite T sunt anihilate și proliferează regiunile cu limfocite B.
Se produce un întreg haos deoarece de aici înainte sunt observate cantități mari de complexe imune circulante (CIC). Au fost raportate de atac al autoanticorpilor asupra eritrocitelor, trombocitelor și proteinelor nucleare.
Imunologie
Cu macrofagul că tip celular vizat pentru promastigotele parazitului, acesta se pare că a ales exact celula care în mod normal deține un rol foarte important în inducerea și expresia unui răspuns imun.
Încă nu este lămurit mecanismul prin care parazitul reușește să supraviețuiască și să folosească această celulă.
După perioade diferite de incubare (2-12 luni) câinii pot dezvolta semne clinice care de multe ori sunt fatale sau pot dezvolta rezitenta la infecție.
Ultima s-a dovedit a fi asociată cu un răspuns imun celular specific și destul de puternic față de prezența parazitului, cu producție de citokine precum Il-2 și TNF.
Câinii pot dezvolta infecții izolate și tranzitorii, deasemenea se pot transforma instant din seropozitivi în negativi, sau nu dezvolta anticorpi deloc.
Răspunsul imunologic la prezența Leishmaniei poate rezulta într-o polarizare a activității celulelor T către un fenotip distinct de celule T helper. Citokinele produse pot activa mecanisme efectoare care rezultă fie într-o imunitate protectivă fie în exacerbarea bolii (Pinelli și co. 1999). Macrofagele infectate se bazează cel mai mult pe producerea de oxid nitric ca mecanism de distrugere a Leishmaniei. Parazitul inhiba mecanismul și este capabil de a se multiplica în vacuolele parazitofore. Într-un final membrana macrofagului cedează și amastigotele sunt preluate de noi celule fagocitare. Celulele macrofage și dendritice prezintă antigenele de Leishmania celulelor T, urmând să apară fie un răspuns imun celular eficient (model Th1) fie un răspuns imun umoral ineficient (model Th2). Deși există câțiva factori ce influențează dezvoltarea subsetului de celule T helper, mult mai importantă este apariția citokinelor la expunerea timpurie (Pinelli și co. 1999).
Diagnosticul
Diagnosticul clinic (incluzând analize paraclinice de laborator) nu sunt de încredere deoarece:
-mai mult de 50% dintre câini cu infecție pozitivatã sunt în mod aparent cu diagnostic clinic sănătoși (asimptomatici). Fie sunt în progresul fazei de incubare, rămân asimptomatici pentru o perioadă îndelungată (unii chiar pe viață), sau se vindecă spontan, ultimii fiind catalogați că rezistenți.
-cand sunt prezente, semnele clinice pot fi variabile și imita semnele altor boli.
-exista forme atipice raportate la câini.
Pentru un diagnostic de certitudine există 3 tipuri de teste:
-metode de parazitologie ce țintesc strict pe detectarea parazitului;
-metode serologice pentru detecția anticorpilor anti-Leishmania în sânge
-tehnici de biologie molecularã precum PCR-ul, ce detectează ADN-ul parazitului în țesuturile gazdei după multiplicare.
Nu există încă un consens asupra eficienței maxime a vreunei dintre diferitele metode de diagnostic existente deoarece nici una nu are specificitate și nici sensibilitate de 100%.
Parametrii se stabilesc în funcție de materialele folosite (mediu de cultură, antigenul, oligonucleotidele alese) și metoda de lucru (tehnica serologică, protocol PCR).
Abordările multiple de diagnostic ar trebui urmate ,deoarece nici una dintre tehnici nu identificã toate animalele infectate din probe aleatorii.
Quinnell și co. (2001) au înregistrat o sensibilitate crescută pentru infecția imediată prin metoda PCR (88%), această sensibilitate scăzând la 50% în următoarele luni. În ceea ce privește serologia, sensibilitatea acesteia s-a dovedit a fi joasă (41%) la începutul infecției ,dar crescută mai târziu (93-100%). Deci PCR-ul este mai bun în detecția fazelor timpurii ale infecției și pentru cele tranzitorii și izolate per individ, în timp ce tehnica serologică este mai sigură în ce privește detecția fazelor cronicizate ale infecției, atât la câini simptomatici cât și asimptomatici, (deși unele cazuri seropozitive se pot converti în seronegative pe perioada infecției).
Diagnosticul parazitologic
Metodele parazitologice dețin o specificitate de 100%, dar nu au sensibilitate deloc.
Frotiul
Biopsia cu ac fin din măduva osoasă sau limfocentrii este ideală pentru colorația MGG. Se examinează la OB x 100 cu lentile pentru ulei de imersie. Paraziții (amastigotele) sunt mici, corp oval (1.5 cu 3×3 cu 6.5 µm) cu nucleu întunecat și un kinetoplast mic în poziție verticală. Nu există o corelație clinică între numărul de Leishmanii găsite în preparatele citologice cu starea animalului (Denerolle, 1996). De multe ori parazitul poate fi găsit într-o amprentă cutanată sau o puncție a unui nodul cutanat. Sensibilitatea citologiei este însă mult prea mică pentru a stabili un diagnostic de certitudine; frotiurile biopsice din măduva osoasă sunt pozitive la 50-70% din cazurile de câini infectați, din limfocentrii în jur de 30%.
Competența examinatorului și timpul alocat examinării lamei sunt decisive pentru ca metodă să fie eficientã.
În lamele de măduvă osoasă, Leishmania este întâlnită doar în macrofage, în timp ce în preparatele citologice din limfocentrii se găsesc mai mult extracelular. Macrofagele infectate adesea se sparg în momentul etalării sângelui pe frotiu.
Cultură
Cultivarea Leishmaniei se execută la 26-28 ᵒ C pe mediu Novy – MacNeal – Nicolle (NMN). Culturile pozitive vor avea promastigote vizibile în 2 săptămânii.
Diagnosticul serologic
Seroprevalența, văzută ca o măsură intermediară între boala și prevalenta infecției, este influențată, pe de o parte, de faptul că poate releva un număr mare de purtător latenți asimptomatici ce reprezintă cam jumătate dintre animalele seropozitive, iar pe de altă parte limitări datorate unor perioade lungi de latență a bolii.
Anticorpii pot fi adesea detectați doar în primele luni de la infectare. O parte dintre câinii seropozitivati devin în mod spontan negativi sau nu dezvolta anticorpi specifici deloc (Acedo – Sanchez și co. 1998). Cea mai eficientă metoda cu maxim de sensibilitate s-a dovedit a fi IFAT care ajunge abia la 80% și doar în primele luni de la expunerea la Leishmania cu un sezon în urmă.
Pot fi folosite câteva tehnici pentru detectarea anticorpilor antileishmania. Există pe piața teste IFAT, Dot-ELISA și DAT (testul de aglutinare directă). Acestea dețin specificitate și sensibilitate mare (80-100%), dar nu se recomandã folosirea doar a acestor metode pentru diagnostic cert. Alte tehnici ar fi ELISA competitivă, K39 – ELISA, Western Blot (WB) și testul Latex. În mod ideal se face repetare la 6-8 săptămâni datorită posibilității unor rezultate fals pozitive sau negative (Noli, 1999). Nu există încă o corelație între manifestările clinice ale bolii și titrul de anticorpi. Serologia nu este folositoare pentru monitorizarea tratamentului pentru că anticorpii rămân activi mult timp după recuperarea clinică.
IFAT
Metoda de bază, recunoscută la nivel înalt, este testul de imunofluorescența indirectă (IFAT), ca cel mai specific și sensibil test. Este însă considerat nepractic pentru examinarea unui lot mare de seruri și nu există o convenție pentru diluții ale serului pentru care încă se consideră un rezultat pozitiv. Pragul raportat al titrului variază între 1/20 până la 1/60. Este metoda de bază recomandată de manualul OIE (Oficiul Internațional al Epizotiilor, 2000).
Diagnosticul PCR
Prin tehnica de biologie molecularã PCR, a fost dezvoltată o metodă cu specificitate și sensibilitate înalte pentru diagnosticul leishmaniozei. Pot fi detectate după multiplicare ADN-ul kinetoplastului parazitului în ficat, splină, din biopsii din măduva sau limfocentrii.
Pot fi examinate probe proaspete sau fixate în prealabil în parafină.
PCR-ul este în general apropiat metodei standard ca valoare de diagnostic, dar nu pote fi folosit pentru monitorizarea în masă în cazul studiului epidemiologic de leishmaniozã cutanată (cu 31% pozitive cu PCR și 81% prin ELISA) (Reithinger și co., 2003).
A fost dezvoltată metoda PCR cu primeri specifici pentru detectarea ADN-ului Leishmaniei în serul câinilor. Alvar și co.(2002) au descris PCR-ul nested (țintit), pentru gena sSSUrRNA (LnPCR) cu o specificitate și sensibilitate foarte înalte, ideal pentru diagnostic, monitorizarea cu succes a tratamentului și prevederea reapariției la om, dar mai puțin sensibilã la câine.
Xenodiagnostic
Este o tehnică prin care vectorul artropod este folosit pentru detecția și izolarea patogenului. Această tehnică nu poate fi folosită în mod obișnuit ca test de rutină, dar poate fi implicat în rezolvarea unor dileme precum rolul în statusul clinic și tratamentul medicamentos al leismaniozei caninã.
Semnele clinice la câini
Infecțiile naturale cu L.infantum la câine pot rămâne asimptomatice pentru lungi periaode de timp înainte că semnele de boala să fie vizibile.
Dar odată ce boală se activează, progresia este de obicei rapidă și de multe ori fatală într-un timp de la săptămâni până la luni. Câinii cu manifestări clinice de obicei pot releva de la 1 la 9 semne clinice principale: 1. Leziuni cutanate; 2. Slăbire și inapetenta; 3. Limfoadenopatie locală sau generalizată; 4. Leziuni oculare; 5. Epistaxis; 6. Șchiopături; 7. Anemie; 8; insuficientă renală; 9. Diaree.
Nu există predispoziție de vârstă, rasa sau sex, dar Ferrer (1999) a sugerat că din date epidemiologice există și rase care dezvoltă rezistenta la această boală, în general metiși de rase sportive sau autohtone spaniole.
Există și forme atipice de leishmanioza cu probleme de hemostaza, probleme cardiovasculare, respiratorii și musculo-scheletal sistemice, colie cronice și insuficiență renală (fără alte semne).
La câinii rezistenți
În funcție de tipul de răspuns imun celular, unii câini nu manifestă semne clinice ci dezvoltã doar noduli cutanați la locul inoculării, uneori se folosește termenul de „șancru de inoculare”.
Sunt de obicei localizați pe nas sau urechi, locuri tipice pentru înțepătura musculiței de nisip, noduli de 1-3 cm, alopecie, cu ulcerații și cruste, nepruriginosi și doar ușor dureroși. În mod obișnuit acestea dispar spontan în 1-6 luni la un câine sănătos (Ferrer, 1999).
La câinii susceptibili
Perioada de incubare poate varia între o lună și câțiva ani. În acest timp paraziții diseminează în organe cu predilecție spre sistemul circulator sanguin și limfatic: măduva osoasă, limfocentrii, splina și ficat. Gradul de deterioare cauzată de parazit depinde de:
-efectul direct asupra țesutului, cauzând leziuni infectate non-purulente cutanate, la nicel hepatic, intestinal, renal, oftalmic și osos.
-efectul indirect datorită depozitarii complexelor imune în încheieturi și membranei bazale a rinichilor, vaselor de sânge și ochi, cauzând vasculitã, glomerulonefritã, poliartritã și uveitã.
În afară de SNC, foarte multe organe pot fi afectate, cu simptome precum slăbirea forței fizice, activitate fizică redusă, pierderea în greutate și leziunile/alterările cutanate.
Prima fază se manifestă cu limfoadenopatie generalizată și deteriorarea robei animalului, coexistente cu seroconversia și prezența parazitului în sistemul reticuloendotelial. Severitatea leziunilor dermice par să fie dependente de statusul imunitar al animalului infectat.
Pacienții bolnavi arăta mult mai îmbătrâniți mai mult datorită unei distrofii musculare accentuate. Complexele imune depuse în rinichi, ce produc glomerulonefritã, sunt întâlnite la 32% din cazurile clinice, demulte ori asociate cu proteinurie. Nefropatiile și simptomatologia asociată reprezintă cauza principală a decesului la populația canină infectată.
Leishmanioza cutanată la câini
Leziunile cutanate sunt cele mai comune manifestări ale leishmaniozei la câinii internați pentru tratament datorită bolii (Ciaramella și co., 1997; Koutinas et al. 1999). Acestea pot fi întâlnite alături de alte semne clinice și modificări clinicopatologice, fie că singura modificare prezentã sau singura absențã. Au fost descrise câteva forme dermatologice (Ferrer și co. 1998; Koutinas și co. 1992):
1) dermatită exfoliativă nepruriginoasã cu și fără alopecie ce poate fi generalizată sau localizată la nivelul feței, urechilor și membrelor,
2) dermatită ulcerativă deasupra proeminențelor osoase, articulațiilor mucocutanate, labe, urechi;
3) dermatită nodulară focalã și multifocalã;
4) dermatită proliferativă mucocutanatã;
5) dermatită papuloasã (Ordeix și co. 2005; Bottero și co. 2006)
Pe lângă aceste leziuni cutanate asociate infecției cu L. infantum/ L. chagasi, câinii se pot infesta și cu agenții patogeni ai leishmaniozei cutanate (om). În general, L. braziliensis, L. peruviana și L. panamensis sunt adesea întâlnite la câine ca o infecție cutanată non-fatalã (Miles și co. 1999). L. braziliensis este principalul agent patogen al leishmaniozei cutanate la câinii din America de Sud (Reithinger și Davies, 1999). Majoritatea câinilor infectați cu L. braziliensis trăiesc în zone rurale iar semnele clinice sunt limitate strict la nivel de leziuni cutanate sau ale mucoaselor (Madeira și co.2005).
Probabil pe fondul unui status imunitar celular depreciat câinii infectați de multe ori suferă și de alte boli asociate precum râia demodecticã sau dermatofitoze. Concomitent infestației cu alți ectoparaziți, mai ales căpușe, se transmit și alți patogeni (ehrlichioza). Alte boli concomitente pot fi hepatozoonozele și criptococcozele. În general, co-infecțiile pot altera dramatic semnele clinice, durata bolii și șansele unui tratament eficient (Roura, 2007; Oliva, 2007).
CAPITOLUL 3. BOLI TRANSMISE DE PURICI
3.1. Haemobartonella spp. = Mycoplasma spp. (Mycoplasma haemocanis/ Mycoplasma haemofelis)
3.2. Bartonella spp. = Bartoneloza
3.1. Hemoplasmoza este o boală ce afectează mai ales pisicile, cu evoluție acută, manifestată clinic prin febră, anemie și slăbire pronunțată, cunoscută în trecut ca haemobartoneloza, transmisă de căpușe (uneori de purici). Hemoplasmozele țintesc celulele roșii. La pisici, determina anemie infecțioasa felină sau micoplasmoza hemotropica felină. Nu au fost raportate cazuri la om, deși au fost întâlnite forme asemănătoare micoplasmelor hemotropice la oameni cu sisteme imunitare supresate.
Patogeni
Se credea inițial ca infecția câinelui se produce cu Hemobartonella canis, un microorganism transmis de Rhiphicephalus sanguineus. Paraziți ai eritrocitelor, cunoscuți anterior ca Haemobartonella și Eperythrozoon și anterior clasificate ca ricketsii au fost reclasificate în urma analizei secvențiale a ARN-ului genei 16S ribozomale, care a arătat că sunt filogenetic mai strâns legate de membri genului Mycoplasma. În consecință, ele au fost redenumite micoplasme hemotropice, cu denumirea Candidatus adăugata pentru organismele descrise incomplet.
Fig. 8. Clasificarea științifică Mycoplasma spp.
(http://en.wikipedia.org/wiki/Mycoplasma)
Hemoplasmoza la câine este asociată cu Mycoplasma haemocanis și Mycoplasma Candidatus haematoparvum, în timp ce la pisici este asociată cu Mycoplasma haemofelis (denumită și Ohio sau forma mare), cu Mycoplasma haemominutum (cunoscută și drept California sau forma mică) și cu Mycoplasma Candidatus turicensis. Speciile de micoplasme hemotropice (anterior Hemobartonella canis și Hemobartonella felis) sunt bacterii gram negative ce nu au perete celular și nu pot fi cultivate în laborator, făcând dificilă izolarea și testarea lor serologica.
Aceste organisme infectează o gamă largă de vertebrate, inclusiv omul, atacând hematiile, pe suprafața cărora pot fi observate uneori în frotiurile de sânge colorate.
Răspândirea geografică
Răspândirea micoplasmelor este aproape necunoscută, multe dintre speciile menționate au fost izolate la câini din Europa și din SUA. Căpușa vector pentru patogeni micoplasme se găsește în Europa, SUA și Australia. În Franța, au fost pozitivati 71 din 460 de câini cu ADN de la cel puțin unul dintre microorganisme. Este posibil ca Mycoplasma haemocanis să fie mult mai comună în cazul câinilor crescuți în canisă.
Patogenitate și transmitere
Puricii și căpușele se infectează cu micoplasmele hemotropice prin hrănirea de pe un animal infectat și pot transmite mai departe patogenul către următoarele lor surse de hrană.
Studii au arătat că acestea sunt transmise prin intermediul înțepăturii de căpușe la câini și prin înțepătură de purici la pisici. Hemoplasmele pot fi transmise deasemenea prin transferul de sânge infectat (transfuzii de sânge sau utilizarea de ace contaminate, instrumente chirurgicale); transmiterea verticală de la mamă la făt a fost raportată la pisici, porci, și camelide. Transmiterea directă asociată cu luptele intre pisici este susținuta de studii ce au raportat prezența ADN-ului hemoplasmelor în salivă, pe gingii, și pe pernuțele ghearelor pisicilor infectate.
Nu au fost raportate cazuri de transmitere a micoplasmelor de la cățea la cățeii nou-născuți.
Diagnosticul
Uneori microorganismul poate fi detectat în frotiuri din sângele integral localizate în interiorul hematiilor. Dar numărul patogenilor în sângele periferic poate fluctua foarte mult, ca atare examinarea frotiului poate da rezultate fals negative în peste 50% din cazuri.
Detecția anticorpilor anti – M. haemocanis
Ca o dovadă indirectă a prezenței M. haemocanis, s-au folosit probe de sânge pentru testarea serologică. Deoarece M. haemocanis are reacție încrucișată cu Rickettsia conori, serul a fost supus testării indirecte cu imunofluorescența a anticorpilor în care R. conori a fost folosit ca antigen (Rickettsia conori – Spot IF, bioMerieux, Lyon, Franța).
Metoda FITC a anticorpilor IgM și IgG anti-caine marcați cu hematii de capră (KPL, Gaitthersburg, Md., SUA) au fost folosiți pentru a detecta prezența anticorpilor anti- Mycoplasma haemocanis IgG și IgM cu ajutorul microscopului cu imunofluorescența.
Testarea PCR specifică
Identificarea microorganismelor cu ajutorul metodei standard, datorită sensibilității crescute a testării PCR, aceste teste au fost folosite pentru diagnosticarea certă a Mycoplasmozei la câine.
A fost extras AND din 2 ml de sânge integral prin tratament standard cu proteinaza K. Tehnica a fost descrisă recent ca fiind capabilă de a determina prezenta M. haemocanis la câine și Mycoplasma haemofelis la pisica, folosind o secvență genică reprezentativă congruenta cu variații minore ale ambelor subspecii (Sykes Jane, et al., 2007). A fost ales pentru identificarea parazitului segmentul de 667 pb din gena 16S din ARNr.
Real-time PCR-ul este folosit pentru a cuantifica AND-ul hemoplasmei și poate fi folosită pentru monitorizarea răspunsului la tratament. Testarea sângelui prin metoda PCR s-a răspândit în întreaga lume, detecția micoplasmelor hemotropice fiind mult mai ușoară astfel.
Semne clinice
Semnele clinice ale bolii depind de gradul de anemie, faza de infecție și de statusul imunitar al pacientului. Niciunul dintre microorganismele speciei nu este patogenic cu precădere doar pentru câine. În mod obișnuit, boala este inaparenta clinic, decât dacă animalul este splenectomizat sau imunosupresat. Mycoplasma haemocanis evolueaza deobicei asimptomatic la cainii sanatosi. Cainii splenectomizati manifestă hemoliză acută.
Astfel o activare a unei infecții latente va determina anemia hemoliticã.
Semnele clinice acute pot include apatie, inapetenta, pierdere în greutate și febra. În cazuri grave, poate fi letală. Forma cronică a bolii a fost raportată rar și poate cauza slăbiciune moderată, un apetit crescut și pot dobândi un sindrom de pică.
Deoarece căpușele sunt vectori pentru diverse tipuri de patogeni, astfel unul sau mai mulți agenți pot fi transmiși în timpul înțepăturii și hrănirii căpușei (cauzând hemoplasmoza, ehrlichioza, babesioza). Aceste co- infecții cu mai mult de un agent patogen este des întâlnită.
Co-infecția cu Ehrlichia sp. și o depreciere asociată a statusului imunitar al câinelui pot cauza hemoplasmoza acută clinică.
3.2. Bartoneloza
Numărul speciilor de Bartonella identificate ca patogeni zoonotici a crescut considerabil în ultimele decenii. Animalele de companie în general au fost recunoscute ca rezervoare naturale de Bartonella sp., iar în ce privește pisicile sunt considerate principalul rezervor pentru infecția la om cu Bartonella henselae, Bartonella clarridgeiae și Bartonella koehlerae. Boli importante declanșate de specii de Bartonella la om sunt Febra Oroya (Boala Carrions, cauzată de Bartonella bacilliformis), boala zgârieturii de pisică (B. henselae) cu pisică domestică ca și rezervor natural.
Au fost observați câinii infectați cu Bartonella spp. cu manifestări similare pacienților umani subliniind rolul de santinelă al câinelui pentru infecția omului. Rolul câinelui în infecția umană este mai puțin clar decât cel al pisicii.
Patogenul
Bartonella spp. sunt bacterii gram-negative din cadrul familiei Batonellaceae transmise în general de vectori. O caracteristică a acestor bacterii este aderenta și invazia eritrocitelor.
Bartonella este un parazit intracelular facultativ, extrem de adaptabila mamiferelor gazdă, cărora le induce o bacteriemie intraeritrocitara durabilă.
Fig. 10. Clasificarea științifică Bartonella spp.
(http://en.wikipedia.org/wiki/Bartonella)
Aceste particularități ajuta numeroasele specii de Bartonella să se adapteze la un număr mare de mamifere gazda acest fapt a condus la expansiunea genului Bartonella către un număr apropiat de 30 de specii și subspecii. Multe dintre speciile de Bartonella s-au adaptat pentru a-și asigura o supraviețuire îndelungată la gazda fără a provoca semne clinice.
Pisicile sălbatice sunt considerate principalul rezervor mamifer pentru multe dintre speciile importante de Bartonella (Bartonella henselae, B.koehlerae și B.clarridgeiae), rolul câinilor în schimb că rezervor important este mai puțin înțeles. Dovezi recente indica prezența speciei Bartonella vinsonii subsp berkhoffii la canidele domestice și sălbatice (coioți, vulpile gri).
Tot la animale precum vulpea roșie și gri, câine, ratoni și coioți, precum și puricii prelevați de pe vulpea gri, s-a constatat prezenta B. rochalimae (cunoscută că B. clarridgeiae –like), fapt ce arata ca animalele carnivore sălbatice funcționează și ele ca rezervoare naturale pentru speciile zoonotice de Bartonella, cu puricele ca vector principal.
Nu se știe încă dacă pentru câine Bartonella este patogen primar sau oportunistic.
Asociate cu cazuri clinice sunt speciile prezente la câine B. vinsonii subsp. berkhoffii, B. henselae, au însă raportate și cazuri cu B. clarridgeiae, B. washoensis, B. elizabethae, B. khohlerae și B. quintana.
Ca patogeni zoonotici au fost subliniate speciile B. henselae și B. vinsonii subsp. berkhoffii.
Fig. 11. Alte exemple de rezervoare includ vitele, pentru specia B. bovis și omul pentru specia B. quintana. Arborele speciilor și subspeciilor de patogeni și gazdele lor (http://en.wikipedia.org/wiki/BH11960)
Fig.12. Fotografie de microscopie electronică cu flagelii unipolari al B. clarridgeiae. Flageli prezintă și B. bacilliformis, restul speciilor nu dețin flageli.
(http://biofabnet.com/magazin/wissenschaft/archiv_2007/index.html?lang=en&artikelid=/artikel/02561/index.html)
Fig. 13. BadA văzute la microscopul electronic. Proteine de adeziune ale B. henselae ce mediază prinderea bacteriei la proteinele matricei extracelulare și la declanșatorii celulari HIF -1 ale gazdei ca răspuns la medicație (Photo: Institute of Medical Microbiology and Hygiene, Tübingen)
(http://cmr.asm.org/content/25/1/42/F8.expansion.html)
Fig. 14. B. bacilliformis – imagini de microscopie
(http://gefor.4t.com/concurso/parasitologia/bartonellabacilliformis5.jpg)
Fig.15. Bartonella elizabethae – (http://peggymunson.blogspot.ro/2010/05/strays-part-iii-late-spring-2008-eight.html)
Răspândire
Bartonella spp. are o răspândire la nivel global, cu specii variabile prezente în țări din America de Nord și Sud, Europa, Africa, Asia și Australia. Seroprevalentele sunt diferite depinzând de speciile de Bartonella și de țară.
Studii conduse pentru determinarea importanței pisicilor ca rezervoare pentru B. henselae, au arătat că prevalenta infecțiilor variază considerabil intre populațiile de pisici. Ratele scăzute ale prevalentei au fost detectate în zone cu climat rece, iar rate crescute în one cu climat cald și umed.
În infecțiile câinilor cu B. vinsonii subsp. berkhoffii, este presupusa o răspândire globală. Situațiile epidemiologice sunt diferite între diversele zone tropicale, unde în urma studiilor a fost relevata o prevalență înaltă a anticorpilor – mai ales la câinii comunitari – și în unele regiuni nordice, unde o rata joase a prevalentei a fost detectată la câini de companie, domestici.
Patogeneza și tansmitere
Puricii sunt vectorul de bază în transmiterea Bartonellei, mai ales la feline (B. henselae).
Datorită naturii lor ascunse cu abilitatea de a se răspândi transportați de animale, aceștia constituie un risc mondial pentru pisici și câini de a se infecta cu Bartonella sp.
Au fost identificați și alți vectori cu potențial de transmitere a Bartonellei, precum unele căpușe și flebotomi.
Deoarece exista câini seropozitivati cu B. vinsonii subsp. berkhoffii sunt deseori seropozitivati și cu Ehrlichia canis și/sau Babesia canis în același timp, s-a sugerat faptul că vectorul celor din urmă de transmitere, Rhipicephalus sanguineus, să fie responsabil și de transmiterea bartonelozei.
Au fost raportați diverși vectori artropode pentru diferite specii de Bartonella spp. Cei confirmați au fost puricele pisicii (Ctenocephalides felis) pentru B. henselae, B. clarridgeiae, B. koehlerae, musculița de nisip (Lutzomyia verrucarum) pentru B. bacilliformis, păduchele omului (Pediculus humanus humanus respectiv Pediculus humanus corporis) pentru B. quintana și puricele șobolanului (Xenopsylla cheopis) pentru B. elizabethae.
Alți vectori suspectați de transmiterea bartonelozei cuprind alte specii de purici, musculițe de nisip, ploșnițe, flebotomi și muște.
Înafară de transmiterea prin hematofagie a artropodelor, mecanismul de transmitere a Bartonellei spp. include și mușcăturile și zgarieturile pentru infectarea omului, boala numindu-se și “boala zgârieturii de pisică”.
Bartonella spp. infectează eritrocitele, celule endoteliale și macrofage, adesea conducând spre infecții persistente începând de la etapa de hematopoeza sanguină. Localizarea în eritrocite și în celulele endoteliului vascular se crede că protejează Bartonella de agenții antimicrobieni. Omisiunea sistemului imunitar de localiza inserțiile intracelulare, rearanjamentele genetice frecvente și alterarea proteinelor extramembranare, sunt elemente considerate importante în această ipoteză.
La câini, B. vinsonii subsp. berkhoffii produce infecții cronice prin stabilirea intracelulară în hematii și celule endoteliale, scăpând de răspunsul de apărare imunitară mediata celular a gazdei.
Infecția cu această specie poate induce un anumit grad de imunosupresie cronică ce predispune câinele la infecții oportuniste cu alți agenți patogeni, rezultând o întreagă paletă de manifestări clinice la câinii infectați natural
Diagnostic
Diagnosticul infecțiilor cu Bartonella pot fi confirmate prin detecția anticorpilor serici, prin analize imunohistochimice din biopsii tisulare (limfocentrii, piele, ficat sau din alte organe), prin detecție moleculară a AND-ului Bartonellei prin metoda PCR sau folosind o combinație de mediu de cultură Bartonella alpha Proteobacteria, urmată de PCR. Ultima este sugerata datorită sensibilității ei dovedite de detecție a infecției cu Bartonella la câine.
O metodă obișnuită de diagnostic de laborator al infecțiilor cu Bartonella este serologia, prin tehnica imunofluorescenței indirecte. Testele serologice precul IFAT pot fi folosite pentru diagnosticul bartonelozei prezente sau latente. În anumite condiții, câinii infectați natural pot rămâne seronegativi. Reacțiile încrucișate între diferitele specii, și între alte genuri precum Coxiella și Chlamydia pot fi observate, iar în infecția cronică intracelulară, titrul anticorpilor tinde să scadă până la nivele la care nu mai au valoare de diagnostic. Serologia poate fi folosită ca test de monitorizare pentru detecția expunerii anterioare în populații. Testul cu imunofluorescența indirectă a anticorpilor este considerat standard pentru diagnosticul serologic.
Detecția Bartonellei spp. prin cultură pe plăcute cu agar este posibilă, dar este consumatoare de timp, iar în infecțiile cronice patogenul este foarte greu de izolat din hematii datorită bacteriemiei scăzute. Sunt anumite specii foarte greu de cultivat, precum B. vinsonii subsp. berkhoffii.
A fost conceput de curând un lichid modificat chimic pentru mediul de cultură propice pentru creșterea Bartonellei (Bartonella/alpha- Proteobacteria growth media, BAPGM) ce suportă creșterea a câtorva specii de Bartonella. Combinația dintre cultură pe BAPGM și testarea PCR a fost dezvoltată special pentru diagnostic cert, pentru a aprecia cantitativ infecția cu Bartonella în probele de sânge.
Examinarea microscopică a frotiului colorat este eficientă doar pentru vizualizarea eficientă a B. bacilliformis, singurul patogen uman pentru America de Sud. Alte specii nu pot fi observate pe frotiuri. La izolarea pe mediul cu agar, coloniile pot fi descrise ca fiind albe, lucioase, netede sau rugoase, cu aparentă mucoida.
Co-infecțiile
Câinii pot fi co-infectați și cu alți patogeni precum Ehrlichia, Babesia sau Rickettsia spp.
S-a observat deseori co-infecția cu alți patogeni transmiși de aceiași vectori comuni, de Rhipicephalus sanguineus, la câini, cuplate cu risc mare de infecție cu B. vinsonii subsp. berkhoffii transmise de căpușa respectivă. AND-ul Bartonella spp. a fost izolat și în alte specii de căpușe precum Ixodes pacificus sau Ixodes ricinus.
Co-infectia cu două specii de patogen despre care se știe că sunt transmise de vectori diferiți este deja obișnuința, precum Borrelia spp. cu Babesia spp.
La câini, co-infecția cu Bartonella spp. se presupune că ar influența patogeneza altor boli iar datorită efectelor de imunosupresie datorate cronicizării infecției cu Bartonella, câinii sunt predispuși și la infecții secundare, oportuniste.
Semne clinice
În funcție de specia de Bartonella pot apărea o paletă întreagă de modificări patologice la câine asemănătoare cu cele întâlnite la om: manifestările clinice pot varia de la infecții asimptomatice, până la boala severă și moarte subită. Există iarăși variații în durata efectivă a bolii.
La câinii infectați cu B. vinsonii subsp. berkhoffii aceasta s-a dovedit a fi o cauză importantă a endocarditei și a fost asociată cu aritmii cardiace, miocardite, rinite granulomatoase, uveite anterioare și corioretinite.
Semnele clinice pentru infecția cu Bartonella spp. la câine sunt:
Endocardite;
Miocardite;
Anemie;
Hepatită;
Poliartritã
Uveite, coroidite
Pierderea în greutate
Epistaxis
În prima fază a infecției naturale cu Bartonella spp., pisicile sunt asimptomatice, sunt purtătoare latente de Bartonella henselae. Bartoneloza felină poate provoca ocazional episoade febrile, izolate, tranzitorii, ce pot dura în de 48-72 de ore. Semnele clinice ale unei infecții mai puternice, deși rare, include febră, voma, letargie, ochi roșii, limfocentrii reactivi și scăderea sau creșterea apetitului. Bacteriemia poate persista pentru luni întregi cu semnele clinice aparente doar în cazurile în care pisica suferă de vreun stress, operație sau trauma, sau infecția concura și se activează pe fondul activării altor boli.
CAPITOLUL 4. BOLI TRANSMISE DE CĂPUȘE
4.1. Anaplasmoza este o rickettsioză transmisă prin intermediul căpușelor, cu localizare în neutrofile și trombocite, cu manifestari clinice grave la animale si om; exista două tipuri de infecție: anaplasmoza granulocitară si anaplasmoza trombocitară.
Anaplasmoza granulocitară
Etiologie
Anaplasma phagocytophilum este o bacterie Gram negativă, obligatoriu intracelulară, sub formă de morulă în citoplasma neutrofilelor, dimensiuni variabile între 1,5 și 6 μm, caracter zoonotic.
Anaplasmoza trombocitară
Etiologie – Anaplasma platys, denumită inițial Ehrlichia platys, cunoscută si ca trombocitopenia infecțioasă ciclică a câinelui.
Boala a fost semnalată pentru prima oară în SUA în 1978, în frotiurile de sânge colorate Giemsa. În prima semnalare bacteriile au fost descrise ca incluzii bazofilice în trombocitele câinilor cu trombocitopenie. Acest agent patogen este unic prin faptul că este singurul organism intracelular infecțios descris în trombocite.
Epidemiologie
Cel mai frecvent boala se întâlnește la câine, însă au fost raportate cazuri și la pisici, oi și impala. Transmiterea bolii se face prin intermediul înțepăturii căpușelor dar, poate fi posibilă transmiterea prin transfuzie sau alte căi adiționale. ADN-ul A. platys a fost amplificat, până în acest moment din corpul căpușelor din genul Dermacentor și Rhipicephalus. Distribuție largă – multe țări ale Europei, Asiei și Americii de sud.
Semne clinice și morfopatologice
In faza acută apare la 1-3 săptămâni de la înțepătura unei căpușe infectate. Primele semne clinice sunt letargia, febra, inapetența, ataxia și hiperkinezia. Deasemenea limfonodurile apar mărite în volum.
In faza subacută, semnele clinice regresează însă elementele infectante se acumulează în splină ducând la apariția splenomegaliei. Câinii pot rămâne în această fază mai multe luni sau chiar ani. La examenul hematologic apare trombocitopenia și un nivel crescut al globulinelor;
Faza cronică apare în urma fazei subclinice si constă în reapariția semnelor clinice. Apar sângerările anormale datorită numărului redus de trombocite si se poate observa înroșirea pielii, hematurie, epistaxis și alte semne clinice care pot apărea ca urmare a trombocitopeniei.
Diagnostic
Hematologic, se observa scăderea numărului de trombocite (< 20,000/μl.) și uneori a eritrocitelor.
În preparatele din sânge colorate Giemsa pot fi observate morule de dimensiuni mici, ȋnsă, deoarece boala are o natură ciclică și este caracterizată prin trombocitopenie, observarea morulelor în interiorul trombocitelor poate fi dificilă.
Examenul serologic foloseste tehnica munoflourescenței indirecte, cea mai sigură metodă de identificare a infecției în stadiul acut este PCR-ul.
Anaplasma phagocytophilum este o bacterie gram negativă, oligatoriu intracelulara, de dimensiuni situate între 0.2-2.0 um și are o formă coccoidala. Aceasta bacterie este cauza anaplasmozei granulocitare canine în zonele temperate ale lumii. Sinonime ale acestei boli au fost “ febra transmisă de vectori’ sau “pasture fever”. În Europa, vectorul de transmisie predominant este Ixodes ricinus, în timp ce Ixodes scapularis și Ixodes pacificus sunt vectorii de transmitere pentru Nordul Americii.
Adesea apar coinfectii cu alte boli transmise de căpușe ceea ce poate schimba evoluția clinică a bolii, s-a demonstrat că Anaplasma phagocytophilum și Borellia spp. au ca vector comun de transmitere Ixodes ricinus, la fel pentru speciile A. platys și Ehrlichia canis (vector comun Rhipicephalus sanguineus).
Clasificare
Speciile de Anaplasma sunt înrudite cu Genul Ehrlichia, ambele aparținând aceleași familii – Anaplasmataceae, Ordinul Rhickettsiales. Speciile din genul Anaplasma produc boli, atât la câini și pisici, cât și la rumegătoare, cai și oameni.
Tabel I – Răspândire endemică a diferitelor specii de hemoparaziti.
(http://www.cvbd.com/)
Fig.16. Harta de răspândire a bolilor transmise de vectori pe glob
Răspândire România – detaliu
(http://www.cvbd.com/)
Familia Anaplasmataceae cuprinde genurile de importanta medicală Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia și Aegyptianella. Cu nivel înalt de patogenitate de relevanță medicală din genul Anaplasma sunt A. phagocytophilum, A. platys și A. bovis. A. bovis aparține genului/senogruparii II monocitotropic, A. phagocytophilum aparține genului/senogruparii ÎI granulocitotropic, iar A. platys aparține genului/senogruparii ÎI trombocitotropic. Datorită caracteristicilor filogenetice și fenotipice, reprezentații cu valoare patogenică Ehrlichia phagocytophila, E. equi și agentul cauzator de ehrlichioza/anaplasmasmoza granulocitara la om, au fost reclasificați în 2001 în speciile A. phagocytophilum, care de altfel este mult mai reprezentativ.
Arborele de înrudire filogenetică între speciile de Anaplasma și Ehrlichia.
Fig.17. Arborele filogenetic cu secvența comună a genei 16S rARN a speciilor cunoscute ca Ehrlichia. Numerele de accesare ale genelor în ază de date GenBank sunt indicate în paranteză.
(http://www.cvbd.com/)
Genul cel mai apropiat de Anaplasma, Ehrlichia, a fost clasificat în funcție de celule sanguine infectate în mod obișnuit (granulocit, limfocit, monocit, trombocit) iar patologiile produse au fost denumite ehrlichioza granulocitara (sau granulocitotropica), monocitara (sau monocitotropica), trombocitara, dar această denumire a creat confuzie în momentul în care au fost întâlnite și în alte tipuri celulare, în plus, pot fi mai mult de o specie ce poate determina ehrlihioza „granulocitarã” și „ monocitarã”.
Patogenitate și transmitere
Anaplasmele sunt transmise de vectori căpușe de specii diferite. Ixodes ricinus este principalul vector de transmitere pentru A. phagocytophilum în Centrul și Nordul Europei, în timp ce Ixodes scapularis și I. pacificus sunt cei mai importanți vectori de transmitere din Nordul Americii. A. platys este transmisă de Rhipicephalus sanguineus și Dermacentor spp.
Patogenitate
A.phagocytophilum este o bacterie obligatoriu intracelulară ce atacă inițial neutrofilul granulocitar dar și eozinofilele diferitelor specii, incluzând câinele, pisica, vaca, oaia, capra, calul, căprioară, rozătoare și păsări. Monocitele și limfocitele pot fi celule gazde secundare.
Particula microorganica primară o constituie faza de infecție și este inserată în gazda prin fagocitoza. Aceste particule primare sunt chiar bacteria luată ca individ de aprox. 1 µm în diametru și în mod obișnuit de forma coccoidalã sau elipsoidã.
Ciclul biologic
Fig.18. Ciclul de diseminare Anaplasma/Ehrlichia spp. – morule
(http://www.nature.com/nrmicro/journal/v8/n5/fig_tab/nrmicro2318_F5.html)
(file:///C:/Users/Tracker/Desktop/MEGACOR%20Diagnostik%20GmbH.htm)
Fig. 19. Expresia proteinelor PleC and PleD in culturi simultane de A. phagocytophilum. (A) Culturi simultane de A. phagocytophilum. Ap, celula gazda izolata de
A. phagocytophilum inoculată; coloratie Diff-Quik. Test de viabilitate celulara a celulei gazda izolata de A. phagocytophilum; verde, viabila; rosie, neviabila. (0 to 72) Culturi simultane de A. phagocytophilum în celule HL-60 folosind celula gazda izolata a A. phagocytophilum; coloratie Diff-Quik
Fig. 20. A. phagocytophilum modulează mecanismul de control celular al celulei gazdă
(http://www.medscape.com/viewarticle/766614_2)
(http://www.medscape.com/viewarticle/766614_4)
(http://jb.asm.org/content/191/3/693/F4.large.jpg)
Ciclul biologic
Odată ingerată în fagozomi, patogenii se replică prin fisiune binară, formând familii de particule strâns înglobate. Creșterea suplimentară și replicarea conduc la formarea de microcolonii, numite morule, configurație tipică genului. Apoptoza celulelei gazda produce dizolvarea morulei astfel încât bacteriile sunt eliberate în sânge și sunt apte să infecteze mai departe noi celule. În plus, bacteriile pot fi eliberate și prin exocitoza.
Infecția cu A. phagocytophilum este asociată în mod obișnuit cu dezvoltarea unei tromocitopenii, precum și alte citopenii, incluzând neutropenia, limfopenia și anemie.
Impactul patogenic al A. platys la câine nu este bine definit. Respectiva specie infectează trombocitul producând anormalități în hemostază. Au fost descrise diferențe în severitatea bolii în funcție de originea geografică a tulpinii de A. platys. Deoarece au fost făcute puține studii pe această temă, se poate că variabilitatea semnelor clinice de boala diferă în funcție de statusul imunitar, condiții de stres, rasa etc. Mai mult, detecția A. platys la câini co-infectati mai ales cu E. canis poate duce la o înțelegere greșită a impactului patogenic real al agenților infecțioși (Shaw SE et al., 2001).
Diagnostic
Criteriile de diagnostic pentru anaplasmoza umană granulocitarã confirmată sunt semnele clinice și investigațiile de laborator sugestive pentru anaplasmoza granulocitarã alături de:
1) detecția morulelor în neutrofile (rareori eozinofile) în frotiuri de sânge periferic combinată cu un rezultat pozitiv în urma testării titrului de Ac anti-A. phagocytophilum (sau un rezultat PCR pozitiv).
2)creșterea alternată cu scăderea titrului de anticorpi de cel puțin 4 ori în decurs de 4 săptămâni;
3)un rezultat pozitiv al testării PCR folosind primeri specifici A. phagocytophilum
4)izolarea A. phagocytophilum din sânge integral.
Aceste criterii de detecție în vederea diagnosticării pot fi aplicate și pentru câine, izolarea nu este însă folosită în mod obișnuit în diagnostic.
Testarea anticorpilor se poate face folosind tehnica IFAT (testare anticorpi prin imunofluorescența indirectă) sau prin metoda ELISA. Deoarece seroprevalena este ridicată în zonele endemice, nu se poate pune un diagnostic pe un singur titru pozitiv (care poate releva o expunere anterioară). În timpul fazei acute de boală, anticorpii pot rămâne de nedetectat. 4 testări pozitive sau un titru constant înalt al anticorpilor sunt esențiale în confirmarea diagnosticului. Probe de ser verificate în duplicat luate la 2, 3 sau la mai multe săptămâni distanță sunt cele mai folositoare pentru evaluare.
Pot apărea reacții încrucișate ale anticorpilor cu cei ai altor Anaplasma, Ehrlichia și unor specii de Neorickettsia (Carrade DD et al., 2009).
Testele de PCR convențional și Real Time PCR au fost concepute pentru detecția ADN-ului A. phagocytophilum în sângele periferic, leucocitoconcentrat, măduva osoasă, lichid cerebrospinal sau țesut splenic. Țintele acestor teste au fost fie gena 16S r ARN, de pe suprafața proteinei msp 2 codificate de gena. Testele bazate pe identificarea genei msp2 sunt specifice A. phagocytophilum, în timp ce testele bazate pe identificarea genei 16S rARN pot detecta și alte specii de Anaplasma sau chiar alte bacterii. PCRul poate detecta o infecție atunci când microscopia iese negativă. La câinii infectați experimental, testele PCR din sânge integral au fost pozitive pentru 6-8 zile înainte ca morulele să apară în neutrofile pe frotiu, și încă 3 zile după. Se poate pune diagnostic pentru A. platys prin detecția directă a microorganismului în sângele integral sau prin leucocitoconcentrat, la microscop, colorat MGG sau Diff Quick (Fisher M, McGarry J, 2006).
Datorită parazitemiei ciclice, patogenul poate fi asbsent sau prezent în număr mic. Se face detecția anticorpilor prin IFAT din ser (posibila reacție încrucișată cu A. phagocytophilum) și au fost dezvoltate testări specifice PCR.
Referințe:
4.2.Borelioza (Boala Lyme) a fost semnalată pentru prima dată în 1975, de către Dr. Allen Steere la oameni ca urmare a unui episod misterios de artrită reumatoidă juvenilă, în apropiere de comunitatea Lyme, Connecticut, SUA. Este o zoonoză transmisă de căpușe din genul Ixodes si evoluează cu un tablou clinic complex în care predomină febra, letargia, limfadenopatia, poliartrita. Boala Lyme este o boală inflamatorie transmisă de vectori și indusă de spirochete
Etiologie
Borrelia burgdorferi, descrisă pentru prima dată de Willy Burgdorfer în anul 1982, face parte din: Clasa Spirochaetes, Ordinul Spirochaetales, Familia Spirochaetaceae, Genul Borrelia.
Cercetările bazate pe analiza genetică a AND-ului au determinat reconsolidarea taxonomică a etiologiei acestei boli, cuprinzand mai mult de 10 specii, B. burgdorferi sensu stricto – caracter zoonotic, B. garinii, B. valaisiana, B. lusitaniae, B. afzelii.
Epidemiologie
Borelioza este o zooantroponoză cu focalitate naturală, prezenta la multe specii de animale domestice, sălbatice, unele specii de păsări și reptile. A fost identificată atât clinic, cât și serologic, la câine si pisică, dar sunt receptive și cabalinele, bovinele și ovinele.
Animalele sălbatice (ierbivore, canide) și rozătoarele (șoareci, șobolani) sunt considerate rezervoare în circuitul boreliilor în natură. Boala este vehiculată prin intermediul căpușelor (vectori) din genul Ixodes. Odată infectate, căpușele rămân purtătoare pentru tot restul vieții.
Alte artropode hematofage, respectiv alte specii de căpușe, țânțari și purici, au fost găsite infectate cu B. burgdorferi, rolul lor în transmiterea infecției este unul minor si pot fi considerate importante rezervoare de germeni patogeni. Transmiterea bolii Lyme între câini este posibilă prin transfuzii de sânge, însămânțări artificiale sau transplacentar.
Seroprevalența pe glob este cuprinsă între 0 și 85%, diferit de la zonă la zonă. Pisicile sunt mai rezistente decât câinii. La feline supravegherile epidemiologice se rezumă doar la câteva studii de caz. La câini, infecția este des întâlnită în regiunile cu clima moderată ale emisferei nordice; prevalenta câinilor infectați în anumite regiuni, poate ajunge până la 85%, dar în cea mai mare parte ar oscila între 3 și 10 %.
Pentru răspândirea boreliozei trebuie să se manifeste cel puțin 3 elemente: 1) prezența bacteriei Borrelia burgdorferi cauzatoare de boala Lyme; 2) vectorii de transmitere ai patogenului, adică prezenta căpușelor Ixodes spp.; 3) mamifere (șoarece, căprioară) ce reprezintă rezervoare de hrană pentru respectivele căpușe în diferite lor stadii de viață.
Deși o mare parte dintr câini sunt pozitivati pentru anticorpi specifici în zonele endemice, nu toate animalele infectate dezvolta semne clinice. Ca atare, diagnosticul trebuie să fie pus atât în funcție de semnele clinice, cât și în urma testării serologice.
Tabloul clinic, la mamifere, curpinde: artrite, dermatite, tulburări nervoase, renale, cardiace, gravitatea sau formă de manifestare variază în funcție de specie și individ.
La câine, boala poate apărea de la două până la cinci luni din momentul inoculării agentului patogen. În faza de debut, intalnim hipertermia (39,5-40,5°C), letargie, anorexie, apatie.
La locul înțepăturii se poate observa o maculă roșie destul de discretă.
Tabloul clinic complex cuprinde șchiopătura intermitentă sau alternantă, poliartrite și dureri articulare localizate, în special, la articulația carpului și tarsului prezența șchiopăturii recurente de grad redus la o singură articulație, fără febră, poate fi reprezentarea unei infecții cornice, limfadenita limfonodulilor prescapulari și poplitei agravează starea generală.
Tulburările renale, de asemenea, sunt frecvente și în general sunt fatale, pierderi masive de proteine, datorită nefropatiei, uremie, hiperfosfatemie, edeme periferice, slăbire progresivă.
Localizările cardiace sunt rare. Forma nervoasă poate evolua prin paralizie facială și accese de furie sau agresivitate.
Leziuni.
Boala Lyme este o afecțiune inflamatorie multisistemică ce afectează sistemele: reticuloendoteliale, cardiovascular, nervos, central si osos.
Patogenitate
Clasificare
Genul Borrelia este inclus în familia Spirochaetaceae, din ordinul Spirochaetales. Spirochetele izolate din căpușe și de la oameni au fost identificate ca fiind Borrelia descoperită de W. Burgdorfer, și co. ȋn 1982. În Europa, semnele clinice în borelioza umană au fost descrise mai întâi de către Afzelius în 1910 și Lipschutz în 1913.
Înafară de genul Borrelia, fam. Spirochaetaceae conține și genurile Spirochaeta, Treponema și Cristispira. Genul Borrelia este heterogen și include un complex de specii ce pot fi cuprinse șu denumirea de borelioza cu fera recurenta, precum B. recurrentis (cu febra recurenta, prezenta la om)., B. lonestari (asociată cu zone de roaseata și mâncărime) și B. anserina (spirochete prezente la păsările de curte) (Krupka și Straubinger, 2010).
Toate borreliile transmise de Ixodes sunt asociate cu infecțiile cu borelioza și sunt grupate în B. burgdorferi sensul larg, care în acest moment cuprinde 16 specii. Pentru câteva dintre aceste specii din acest grup, care au fost identificate de curând după izolarea din căpușele din America de Nord, patogenitatea la om și animale nu a fost încă dovedită.
Pentru alte specii ce cauzează boala Lyme, este o problemă complicată încă distribuția la nivel mondial, precum și efectele acestei boli (Krupka și Straubinger, 2010).
În Nordul Americii, doar specia de B. burgdorferi sensul restrâns au fost identificată ca fiind patologică pentru om și câine. În schimb, în Europa Centrală, Scandinavia și părți din Asia, au fost identificate cel puțin 3 specii că produc borelioza cu semne clinice aparente la om; B. burgdorferi s.s, B. garinii și B. afzelii. Dovadă experimentală ca infecțiile naturale cu B. afzelii și B. garinii apare la câini, încă lipsește, dar s-a găsit ADN-ul acestor specii în câinii infectați (Hovius et al., 1999; Speck et al., 2001) B. spielmanii și B. lusitaniae au fost izolate din leziuni dermice găsite la oameni, ca atare se crede că și acestea sunt agenți cauzatori de borelioza Lyme.
Borelioza canina este cauzată de B. burgdorferi s.l. care este transmisă de căpușele din genul Ixodes, precum Ixodes ricinus. În Nordul Europei, zona de răspândire a boreliozei se extinde datorită răspândirii vectorilor parazitului. Căpușele de I. ricinus infectate sunt ușor de găsit în zonele urbane.
Fig. 21. Filiația grupului Borrelia spp.
(http://en.wikipedia.org/wiki/%27The_All-Species_Living_Tree%27_Project)
Microorganismul
Borrelia este o bacterie veche din punct de vedere filogenetic care nu poate fi clasificată nici că Gram-negativa dar nici că Gram-pozitiva. Bacteria boreliozei ce include B. burgdorferi sunt celule bacteriene helicate flexibile, cu o lungime de 10-25 um cu un diametru de 0.2-0.3 um, formată dintr-un cilindru protoplasmatic, cu o creastă laterală cu o zonă liera numită spațiul periplasmatic și prevăzut cu 7-10 flageli periplasmatici (fibrile sau endoflageli). Celulele sunt învăluite într-o membrană celulară, cu perete celular – membrana externă și un strat de mucoasa. Sub anvelopa externă se extind filamente axiale de-a lungul celulelor. Filamentele axiale se presupune că sunt responsabile pentru mișcările de deplasare precum un „tirbușon”.
Fig. 22. B. burgdorferi sunt bacterii helicate cu o lungime de 10-25 um (microscopie în câmp întunecat).
(http://www.cvbd.org/en/tick-borne-diseases/lyme-borreliosis/pathogens/)
Fig. 23. Diagrama schematică a secțiunii transversale a spirochetei de B. burgdorferi, cu filamente axiale.
( http://www.cvbd.org/en/tick-borne-diseases/lyme-borreliosis/pathogens/)
Două dintre proteinele de membrana OspA și OspB (Osp = outer surface protein), sunt antigenice și sunt folositoare în diferențierea acestor microorganisme dintre alte specii de spirochete. Membrana externă a B. burgdorferi și a altor Borrelia spp., este unicată deoarece genele ce codifică aceste proteine sunt localizate în plasmidele liniare; aceste gene extracromozomale determină identitatea antigenică a acestor microorganisme și se presupune că ajută bacteria în adaptarea sa și supraviețuirea îndelungată în gazda căpușă și mai departe în gazdele mamifere.
Cultura bacteriană
B. burgdorferi poate fi cultivată din vectorii lor artropode șu din gazdele vertebrate pe mediu Kelly modificat numit mediu Barbour – Stoenner – Kelly (BSK II). Au fost cultivate cu succes, pe mediu BSK, probe prelevate din căpușa sau biopsica de piele, rareori din sânge integral sau lichid cerebrospinal de la pacienții pozitivati cu boala Lyme.
BSK solidificat cu 1,3 % agaroza permite creșterea unor colonii izolate de microorganisme. B. burgdorferi crește încet în comparație cu alte bacterii. Fiecare spirochetă se divide în alte două celule după incubare pentru 12 până 24 ore.
Cultivarea B. burgdorferi este foarte dificilă, pentru că trebuie alocat un timp îndelungat culturii timp de 6-8 săptămâni iar mediul poate suporta și dezvoltarea de alte bacterii și ciuperci, cu posibilitatea de a reduce saub bloca creșterea Borreliei. Folosirea unei tehnici cât mai sterile este de mare importanță.
Răspândire geografică
Agenții patogeni ai boreliozei Lyme sunt răspândiți în special în Emisfera Nordică, B. burgdorferi s.s este răspândită din SUA, spre Europa, până în Asia, în timp ce B. afzelii, B. garinii și se presupune că și B. lusitaniae sunt endemice doar regiunii Eurasiei.
Borelioza Lyme este întâlnită în Germania, Elveția, Republica Ceha, Slovacia, Austria, Franța, Portugalia, Marea Britanie, Irlanda, Scandinavia și multe zone din Europa de Est, incluzând Rusia. A fost confirmată și în zone din Asia (China, Japonia, Coreea) dar este puțin probabil că aceasta să fie prezentă și în Australia, unde căpușele din complexul Ixodes persulcatus nu sunt încă prezente. În Eurasia și Nordul Africii, principalii vectori sunt I. ricinus și I. persulcatus.
Ratele de infecție ale lui I. ricinus sunt mai ridicate (până la 36%) în unele populații europene, dar mult mai mici decât ale I. scapularis în SUA. În Marea Britanie și Irlanda rata de infecție este mică.
Fig. 24. Harta de răspândire a I. ricinus și I. persulcatus în Eurasia și Africa de Nord
(http://www.cvbd.org/en/tick-borne-diseases/lyme-borreliosis/distribution/)
Gradul de incidență tinde să crească în unele zone endemice, precum și răspândirea B. burgdorferi în zone noi. Răspândirea principalului vector în SUA pentru borelioză (menționat în literatura din 1907 până în 1996) releva o incidență crescută și subliniază zone calamitate, cu potențial mare de infectare. O posibilă explicație pentru creșterea numărului de infecții cu borelioza ar fi și reducerea activității de vânat al rezervoarelor de gen căprioară, raton, oposum, păsări, la fel cum stabilirea gazdelor om și animal în zone de suburbie sau aproape de păduri și sălbăticie, precum și petrecerea timpului liber în astfel de zone.
Deasemenea răspândirea vectorilor de transmitere se datorează și păsărilor migratoare ce poartă cu sine larve și nimfe în urma hrănirii cu astfel de căpușe.
Răspândirea sezonieră
Riscul infectării cu borelioza depiinde de activitățile sezoniere ale căpușelor ce transmit boala în respectivele regiuni. I. ricinus este activ din primăvara până în toamna cu mai mică intensitate în lunile de vară călduroase și uscate, I. scapularis are vârf de acțiune exact în aceste luni, Iunie și Iulie.
Fig. 25. Histograma comparativă a datelor sezoniere de răspândire (a boreliozei la om – eritema migrans: EM) și activitatea sezonieră a nimfelor de I. scapularis, vector principal al Americii de Nord
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC385417/figure/F2/)
Rezervoarele naturale
Căpușele, rozătoarele mici și alte animale verterate , toate servesc ca rezervoare pentru B. burgdorferi s.l: bacteria poate trăi și se dezvoltă în aceste gazde fără a cauza boala fatală. Larvele și nimfele căpușei se infectează B. burgdorferi când se hrănesc de pe animale purtătoare de bacterie primăvară și vara. Agenții patogeni rămân în căpușa în timpul metamorfozei din larvă în nimfa și din nimfa în adult, mai târziu în vara sau la începutul toamnei. Nimfele infectate transmit bacteria B. burgdorferi rozătoarelor mici și altor mamifere prin înțepătura și hematofagie, toate în timpul comportamentului normal de hrănire.
Borrelia spp. Se multiplică în șoarece, deși șoarecele nu dezvolta boala și nici nu arată semne clinice severe. În Europa, șoarecele cu gât galben (Apodemus flavicoliis), șoarecele de lemn (A. sylvaticus) și vola (Clethrionomys glareolus), până la cele mai comune specii, toate pot funcționa ca rezervoare.
Pentru I. scapularis adulte, cea mai una gazdă sunt căprioarele, în SUA; în Europa, căprioara comună (Capreolus capreolus), precum și alte mamifere incluzând omul și câinele sunt considerate gazde accidentale ale boreliozei.
Se pare că există o specificitate pentru fiecare dintr diferitele specii de Borrelia: B. burgdorferi s.s și B. afzelii e.g prefera ca rezervor rozătoarele, în timp ce B. garinii și B. valaisiana apare mai ales la păsări.
Mai departe, gazdele căpușelor se pare că au competențã diferită ca rezervor pentru Borrelia. În caz de prevalențã înaltă de gazde necompetente în zonă, riscul general de infecție este mult mai redus.
Patogeneza și transmitere
Căpușele se infectează cu bacteria Borrelia burgdorferi prin hrănirea cu sangele gazdei infectate, precum rozătoarele mici. În stadii înaintate, aceste căpușe transmit patogenul bolii Lyme altor gazde, incluzând câinele și omul, în timpul procesului de hrănire. Bacteria este localizată în țesuturile gazdei.
Spirochetele se transmit prin înțepătura căpușelor din speciile de Ixodes. Patogenii sunt localizați în intestinul vectorului, unde sunt capabili să adere la peretele intestinal în urma expresiei genice a proteinei de suprafață A (OspA). Atașarea căpușei la dermul temperat al gazdei și influxul de sânge în intestinul căpușei ar trebui să schimbe structura de suprafață a bacteriei Borrelia sp. Se consideră că o expresie crescută a proteinei OspC ajuta bacteria să pătrundă în peretele intestinal al căpușei și să migreze prin hemolimfa în glandele salivare ale acesteia. De aici patogenul poate fi transmis prin salivă în timpul hrănirii căpușei.
Pe lângă OspC, plasminogenul gazdei și activatorii săi joacă un rol în timpul transmiterii. Modificarea structurii de suprafață a spirochetei și migrarea către glandele salivare ale căpușei durează de la 24 până la 48 de ore. Această transmitere rapidă a fost raportată la infectarea nimfelor de I. ricinus cu B. burgdorferi, inducând infectarea după 16.7 ore (Kahl et al. 1998). Eficiența transmiterii crește cu cât durata de hrănire a căpușei este mai îndelungată, un fapt observat la diferite căpușe Ixodes și la diferite tulpini de Borrelia. Timpul de transmitere depinde se pare și de specia de vector și de borrelia transmisă.
Transmiterea transovariana nu apare său apare într-un procent foarte mic, nu este de importantă pentru transmiterea în natură. S-a constatat că ouăle și larvele nu sunt în mod obișnuit infectate cu Borrelia. Hrănirea de pe o gazdă infectată va infecta și larvă.
În general, 10-25% din populația de nimfe este infectată.
Orice altă hrănire a nimfei poate transmite spirochetele către o nouă gazdă mamifer sau pasăre; pe de altă parte poate cauza o infectare cu Borrelia a nimfelor încă neinfectate sau o suprainfectare cu o serie nouă de spirochete. La căpușele adulte, o proporție destul de mare de gazde pot fi infectate de o singură formă, de două forme săi chiar forme triple de infecție cu o varietate de specii de Borrelia.
Diseminarea Borreliei burgdorferi
B. burgdorferi intra prin derm prin locul înțepăturii de căpușa. Infecția se poate răspândi în limfă, producând adenopatie generalizată. De la locul pătrunderii, spirochetele se răspândesc mai departe către țesuturi sugerând că majoritatea manifestărilor infecției sunt prezente datorită răspunsului imunologic al gazdei decât datorită distructiei provocate de parazit.
Fig. 26. Reprezentarea schematică a răspunsului imun la infecția cu B. burgdorferi
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC385417/?tool=pmcentrez/
http://www.bio.davidson.edu/people/sosarafova/assets/bio307/meprasse/page03.html)
Deși majoritatea câinilor aflați în zone endemice pot fi seropozitivi, doar foarte puțini au raportat semne clinice, precum febră și letargia. Au fost suliniate câte mecanisme incriminatorii ale problemelor apărute la nivelul articulațiilor la câini.
Producția mediatorului inflamator oxid nitric este controlat de ÎL – 8, o citokină ce recrutează neutrofile în membranele inflamate ale cavității sinoviale.
Manifestările neurologice apar în anumite cazuri de borelioza, boli cutanate sau cardiace și rar, și nu au fost prezente în cazul câinilor infectați experimental și confirmați cu borelioză.
Diagnostic
Borelioza poate imita semnele clinice ale altor boli, și este destul de dificil diagnosticul cert al acesteia.
Nu există încă un test de laborator cu o specificitate și o acuratețe de 100% pentru diagnosticul boreliozei. Culturile bacteriene din biopsiile de piele, pot fi folosite pentru cultura Borreliei dar sunt consumatoare de timp ( Appel MJG, 2002).
Diagnosticul se poate suspiciona pe baza datelor anamnetice și a manifestărilor clinice dar, confirmarea se face numai prin examen de laborator.
Prin metoda directă: examenul microscopic după colorare prin impregnare argentică, izolarea boreliilor pe medii speciale din probe biologice, cutanate, rinichi, seroase (pericard, peritoneu), meninge, sinovie și glande.
Prin metodele indirecte se evidențiază anticorpii: imunofluorescență indirectă, ELISA (identifică anticorpi IgG și IgM), hemaglutinare pasivă, Testul Western blot. Tehnica reacției în lanț a polimerazei (PCR).
La examenul paraclinic se remarca prezența a 50000-100000 de celule în lichidul sinovial sau cerebrospinal dintre care peste 95% neutrofile.
Investigații clinice
Diagnosticul bolii Lyme este bazată mai ales pe semnele clinice. Deoarece în general câinii nu dezvolta leziuni dermatologice caracteristice (eriteme migrans) așa cum dezvolta omul, diagnosticul este mult mai dificil. Mai mult, mulți dintre câini sunt pozitivati cu infecția dar nu dezvolta semnele clinice.
Teste de laborator
-Testarea serologica poate aduce informații care să susțină un diagnostic pe lângă semnele clinice dezvoltate. Atunci când se recomandă testarea serologică, se începe mai întâi cu un test primar sensibil, fie de ELISA sau prin tehnica fluorescentei indirecte (IFA), urmate de testarea mult mai specifică priin metoda Western-blot pentru a corobora testarea echivocă sau rezultatele pozitive obținute din prima serie de teste. Deși tratamentul cu antibiotice în faza timpurie localizată a bolii poate fi fără răspuns favorabil și poate anula răspunsul anticorpilor, poate fi observată o reacție serologică puternică în timpul stadiilor timpurii ale diseminării sau fazele târzii ale bolii, demonstrând în urma testării cu WB cu amplificarea IgG căi de legare pentru diagnosticul antigenelor Borreliei burgdorferi.
În ce privește sistemul de testare standard acesta cuprinde:
A.Prima generație de teste: IFA este un sistem de testare simplu, dar datorită faptului că persoana care aplica metodă este subiectivă în privința cantității de fluoresceina folosită, de aceea trebuie aplicată doar de persoane avizate în domeniu. Iar testul în sine este ușor evaziv și nu trebuie folosit ca unică metodă de diagnostic.
B.A doua generație de teste: ELISA este foarte sensibilă, dar nu este și la fel de specifică. În cazul folosirii unui lizat de Borrelia că antigen, nu este posibilă diferențierea anticorpilor detectați. Adeseori anticorpii dintr-o infecție nu pot fi diferențiați de cei vaccinali.
Rezultatele ELISA slab pozitive și câinii vaccinați ar trebui monitorizați prin ELISA în combinație cu WB.
C. A treia generație: peptida C6 este detectată prin ELISA în urma unei reacții timpurii și foarte specifice dintre anticorpi și suprafața acestei peptide. Testul deține 3 mari avantaje: câinii vaccinați nu dezvolta complexe anticorpi- peptida C6, după antibioterapie complexele anticorp-C6 scad în număr iar infecția cu toate cele 3 specii poate fi determinată cu același test.
Fig. 27. Testare prin serodiagnostic: Western Blot (IgG). Linie 1, anticorpi monoclonali ce definesc antigenele selective ale B. burgdorferi B31 separate în gel linear SDS-PAGE . Linia 2, ser uman reactiv pe (IgG) cu cele 10 antigene marcate specific după criteriile recomandate pentru recunoaștere blot.
( http://www.cvbd.com/)
Anticorpii rămân prezenți pentru luni întregi sau chiar ani chiar dacă infecția este tratată cu succes sau nu. În general, nici rezultatele pozitive ale testărilor serologice și nici istoricul unei borelioze vechi nu asigura individului o imunitate protectivă pentru o infectare ulterioară, au fost documentate infecții cu B. burgdorferi repetate (Straubinger RK et al., 2002).
Cultura bacterianã: folosirea acestei metode de diagnostic este limitată deoarece este nevoie de un mediu special de cultură (BSK – II) și un timp îndelungat de studiu al culturii.
Durează 6-8 săptămâni pentru creșterea suficientă. Există grad mare de contaminare a culturilor, recoltarea și însămânțarea trebuie făcute cât mai steril posibil. Iar pentru rezultate relevante, analiza se face în laboratoare specializate.
Microscopia în câmp întunecat: S-a folosit în special pentru diagnosticul infecție cu Borrelia , dar tehnică nu este nici specifică și nici sensibilă. Din multitudinea de spirochete, Borrelia în acest caz este foarte greu de identificat.
PCR: Aceasta este o metodă foarte sensibilă și specifică. Pe lângă multitudinea de protocoale și primeri specifici, tehnica este limitată de tipul de probă folosită și de numărul de bacterii prezente în proba respectivă. A fost folosită pentru amplificarea genomului ADN a B. burgdorferi s.l. din piele, sânge, lichid cerebrospinal și lichid sinovial. Au fost dezvoltate tehnici complexe de PCR pentru detecția diferitelor specii și PCR Real time pentru identificarea cantitativă a patogenilor. Datorită limitărilor menționate deja, un rezultat negativ nu exclude o infecție.
Microscopia electronică releva
Fig. 28. Spirochete de B. burgdorferi din intestine de nimfă de căpușă I. scapularis. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC385417/figure/F1/)
Fig. 29. Prezentare schematicã a testelor necesare diagnosticului boreliozei
(http://www.cdc.gov/lyme/)
Semnele clinice
Deși majoritatea câinilor pot fi seropozitivi în zone endemice, nu toți manifestă semnele clinice. Apar eriteme destul de rar la câine și sunt greu de identificat după aparentă.
Cele ce apar totuși sunt localizate și trecătoare.
Perioada de incubare pentru câinii infectați natural nu este cunoscută. În model experimental, răspunsul imun umoral apare în 4-6 săptămâni iar semnele clinice sunt episoadele febrile și scădere a forței de mers pe trenul posterior care se dezvoltă în 2-5 luni. Fără tratament mersul împleticit a durat 3-4 zile dar reapare la intervale de 2-4 săptămâni pentru 60% din câini. Recurenta apare în mod obișnuit episodic, apoi încetează manifestările. Examinarea histologică a probelor de țesut a arăt prezența unor leziuni datorate răspunsului inflamator (poliartrita ușoară) la mai mult de un an după infectare.
Semnele clinice acute apărute includ febră, șchiopături, letargie, limfoadenopatie, stare generală depreciata. Mai mult, câteva simptome clinice pot fi recunoscute precum poliartrita și nefrita cu pierdere de proteină. Alte simptome includ cardite și modificări neurologice. Șchiopătura este un semn clinic comun al boreliozei canine, artrită cronică neresponsiva la antibioterapie precum așa cum se întâlnește la om, la câine nu este întâlnită.
4.3. EHRLICHIOZA
Ehrlichioza este cauzată de specii de bacterii din genul Ehrlichia.
Principalii vectori ai transmiteri acestor patogeni sunt Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma americanum și Dermacentor variabilis.
Deși cursul clinicopatologic poate varia în funcție de specia de Ehrlichia care produce boală, aceasta este caracterizată de o reducere acută a elementelor celularitatii sanguine, cel mai des cu trombocitopenie.
Ehrlichioza caninã monocitarã este cauzată de Ehrlichia canis și caracterizată prin 3 faze clinice. Agentul infecțios este răspândit în zonele cu climat cald și produce simptome clinice severe la câinii infectați. Ciclul biologic al E. canis implică vectorul căpușă și gazda mamifer. În general toți membrii familiei Canidae pot servi ca gazde în timp ce doar anumite specii de vectori sunt considerați patogeni.
Sinonime pentru ehrlichioza caninã de-a lungul timpului au fost rickettsioza canină, tifus canin, pancitopenia tropicală canina, sindromul hemoragic idiopatic, febra hemoragică caninã etc.
Patogenitate
Ehrlichia spp. este o bacterie obligatoriu intracelulară, gram – negativă, de dimensiunic mici. Acestea sunt transmise de vectori în care se replica (căpușa sau tremtod) și infectează celulele sanguine ale animalelor și oamenilor. În genogrupul E. canis, vectorii sunt în general căpușele. Pentru gazdele vertebrate, patogenii arata un tropism către celulele albe.
Clasificare
Ordinul Rickettsiale, familia Anaplasmataceae sunt incluse 4 genuri de importanțã medicală: Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia și Aegyptianella.
Analiza genetică a genelor ARNr 16S, a proteinelor de șoc și a celor de suprafață, a reorganizat clasificarea genului Ehrlichia. În acest moment, genul Ehrlichia cuprinde speciile E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris și E. (Cowdria) ruminantium.
Fig. 30. Clasificare științifică a ehrlichiozei
(http://en.wikipedia.org/wiki/Ehrlichia_canis)
Membrii ai grupului E. canis sunt patogeni pentru câinii, pisici, rumegătoare, cai și oameni.
Tabel II. Diferite specii pot cauza forme diferite de ehrlichioză
Ehrlichia a fost inițial încadrată în funcție de tipul de celulă sanguină infectată în mod obișnuit (granulocit, limfocit, monocit, trombocit) și clasele de boalã denumite după același criteriu în „ehrlichioza granulocitarã sau granulocitotropicã”, sau „ monocitarã sau monocitotropicã”.
Acest tip de clasificare poate fi îndoielnică deoarece unele specii de Ehrlichia au fost întâlnite și în alte celule decât cele țintite în mod obișnuit. Pe de altă parte, se poate că mai multe specii să fie responsabile de aceeași categorie de ehrlichiozã, granulocitarã sau monocitarã.
Ehrlichia canis este responsabilă de răspândirea globală a ehrlichiozei canine monocitare în zonele tropicale și temperate. Răspândirea ei coincide cu migrarea vectorului de transmitere Rhipicephalus sanguineus. Recent au fost identificate, prin metoda PCR, speciile E. chaffeensis și E. ewingii la câinii infectați natural, cu sau fără semne clinice tipice ehrlichiozei.
Ambii patogeni au fost raportați și în Africa și Asia (Korea) departe de zonele inițial raportate (America și Europa).
E. chaffeensis infectează inițial leucocitele monocleate (monocite și macrofage), dar pot fi văzute ocazional și în granulocitele unor pacienți cu formă gravă de boală. Este agentul patogen pentru ehrlichioza monocitara umană și poate fi detectată prin PCR la câinii infectați natural chiar dacă animalul manifesta sau nu semne de boală la momentul testării.
E. ewingii infectează inițial neutrofile și ocazional eozinofilele și produce o boală asemănătoare cu ehrlichioza și anaplasmoza granulocitara umană. Majoritatea pacienților cu acest patogen au de obicei și o altă afecțiune ce cauzează imunosupresie (HIV, splenectomie, transplant, medicamente imunosupresoare).
Infecțiile cu Ehrlichia ewingii induc câinilor poliartrite și ocazional boli neurologice.
E. (Cowdria) ruminantium este agentul patogen al hidrotoraxului la rumegătoare în Africa și Caraibe. După analiza amplificării secvențiale a ADN-ului prin PCR, E. ruminantium a fost identificat în probe de sânge de la câini și oameni cu HIV în Sudul Africii.
O nouă specie de Ehrlichia transmisă de Amblyomma americanum a fost descoperită recent în Panola Mountain State park, Georgia, SUA. PME Ehrlichia este înrudită îndeaproape cu E. ruminantium și produce episoade febrile tranzitorii, urmate de o infecție cronică latentă la capre. Patogenul a fost identificat și la om într-un caz și la căprioară cu coada albă, că posibile rezervoare vertebrate în SUA.
Manifestările clinice produse de diversele specii de Ehrlichia ce afectează câinii și oameni pot fi de nedelimitat și pot varia diverse tulpini în patogenitate.
Ehrlichioza severă letală se poate manifesta cu infecția persistenta cu E. canis, cu rezultanta ireversibilă a distrugerii măduvei osoase. Co-infecțiile, răspunsul imun în funcție de rasă și variații între tulpini, toate pot avea un rol în manifestările bolii și în patologie la câinii cu infecție cronică.
Microorganismul Ehrlichia spp.
Ehrlichiile sunt bacterii mici, obligatoriu intracelulare, gram-negative ce invadează inițial leucocitele, aceleași celule ce dețin rolul de a lupta cu boala și de a distruge orice microorganism non-self ce pătrunde în organismul gazdei respective. Ehrlichiile tipice apar ca niște bacterii mici și rotunde (cocci), de aproximativ 1 um în diametru. În leucocite, ehrlichia se divide prin fisiune binară, dezvoltând corpusculi inițiali până la colonii vacuolare cunoscute sub denumirea de morulae (plural de la morula, cuvântul Latin pentru mura, deoarece are acest aspect în momentul diviziunii). Formarea morulaei este definitorie pentru acest grup de patogeni.
Fig. 31.Imagine electronomicroscopică a unei morulae în leucocit din biopsie medulară de la om. Săgețile indică ehrlichii individuale/ (http://www.cvbd.com/)
Fig. 32. Ehrlichia chaffeensis cu infectarea leucocitelor mononucleate (monocite/macrofage), morulae în citoplasmă unui monocit
(http://www.cvbd.com/)
Fig. 33. Ehrlichia ewingii infectează neutrofilele și ocazional eozinofilele și sunt descrise ca agent patogen pentru ehrlichioza granulocitară canină. Morulae în citoplasma unui neutrofil. (http://www.cvbd.com/)
Răspândire
Ehrlichioza monocitarã caninã datorată E. canis este o boală globală răspândită mai ales în zonele tropicale și temperate ale lumii, precum SUA, Europa (Mediteraneană) și Africa. Răspândirea geografică a E. canis s-a extins odată cu răspândirea vectorului căpușa, Rhipicephalus sanguineus care își parcurge toate cele 3 etape din ciclul de viață în gazda sa câinele.
E. chaffeensis și E. ewingii au fost diagnosticați la câini doar din SUA. Ambele specii au fost identificate la câini ce trăiesc în zonele sudice. Recent și în Africa și Coreea.
Rezervoare naturale
Căpușa R. sanguineus este principalul vector de transmitere al E. canis. În SUA Dermacentor variabilis este considerat vector adițional, dar importanta lui epidemiologica este încă neclară.
Caninele, și domestice și sălbatice, sunt susceptibile și reprezintă rezervoare pentru acest microorganism.
Căpușa Amblyomma americanum este vectorul principal pentru transmiterea E. chaffeensis și E. ewingii în SUA. Căprioarele sunt un rezervor important pentru ambele microorganisme și transmiterea către câine și om este posibilă în zone unde există și o populație mare de căprioare. Pentru E. chaffeensis a fost raportat că vector și Dermacentor variabilis.
Nu este confirmată încă o transmitere transovariana pentru E. canis, căpușele nu sunt considerate rezervoare adevărate, în timp ce mamiferul constituie un rezervor reprezentativ. La câinii infectați, E. canis poate persistă și ani.
Rolul zoonotic al câinelui că rezervor pentru infecția umană nu a fost stabilită clar pentru nici o specie de Ehrlichia. În America de Sud au fost înregistrate cazuri în care E. canis a fost cauza ehrlichiozei monocitare la om, câinele fiind posibil rezervorul principal.
Înafară de căprioare, rozătoarele și alte mamifere mici pot fi rezervoare importante pentru speciile de Ehrlichia, câinele având un rol minor în întreținerea microorganimsului într-o locație geografică dată.
Patogenitate și transmitere
Transmiterea transstadiala al E. canis apare în căpușa vector R. sanguineus, în timp ce transmiterea transovariana nu a fost încă dovedită. Toate stadiile căpușei pot fi infectate în timpul hrănirii cu sângele câinelui infectat. După hrănire acestea se desprind, cad și rămân dorminde până întâlnesc o nouă gazdă canină. Căpușele se pot infecta cu E. canis doar dacă hrănirea se face în faza acută de boală a câinelui.
Stadiile de nimfã și adult ale căpușei sunt capabile de transmitere a E. canis pentru cel puțin 155 de zile post desprindere de pe gazda infectată. Dacă respectiva căpușã întâlnește o gazdă neinfectată și deține o cantitate suficientă de microorganisme, infectarea noii gazde este posibilă. Nu este cunoscut timpul de hrănire necesar pentru transmiterea microorganismului.
Datorită apartenenței la același ordin cu Rickettsiile, perioada aferentã transmiterii patogenului se presupune a fi identicã cu cea a patogenilor rickettsii, și anume de la 4-48 ore (încadrate alături de A. phagocytophilum, E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, R. rickettsii, R. conori și alte rickettsii provocatoare de febre după Nicholson și co., 2010). Câinii infectați din zone endemice pot călători către zone non-endemice, dar dacă le lipsesc vectorii specifici, nu reprezintă un pericol pentru câinii locali.
Folosind vectorul căpușa americană Dermacentor variabilis pentru transmiterea experimentală a E. canis către nimfe și tot experimental, transmiterea din D. variabilis, forme adulte infectate către gazda finală, s-a dovedit a fi un real succes.
În cele din urmă, E. canis poate fi transmisă câinilor susceptibili în urma transfuziilor de sânge.
Diseminarea Ehrlichiei
Corpusculii elementari sunt faza de infecție și pătrund în monocite și alte tipuri de leucocite prin fagocitoză. Aceștia sunt ehrlichii individuale de 1 µm în diametru, de forma coccoidala sau uneori elipsoidala. Odată capturați în fagozomi, patogenul se replică prin fisiune binară, formează clustere împachetate de astfel de corpusculi, numite corpusculi inițiali. Creșterea ulterioară și continuă replicare conduce către formarea morulaei specifice, configurație ce definește genul. Spargerea celulei gazdă eliberează corpusculii elementari pentru a infecta și alte celule.
Diagnostic
Infecțiile cu Ehrlichia spp. reprezintă o provocare în diagnosticare atât pentru clinicieni, cât și pentru laboranți, iar disponibilitatea testelor pentru confirmarea diagnosticului este limitată.
Astfel, deciziile medicamentoase se bazează pe indicii clinice și epidemiologice și nu trebuie întârziat cât se așteaptă confirmarea.
Înțelegerea semnelor clinice, simptomatologiei și epidemiologiei bolii sunt esențiale în cererea pentru analiza și testare a ehrlichiozei, precum și în interpretarea rezultatelor testelor (Nicholson WL et al., 2010).
Diagnosticul diferențial trebuie făcut față de alte rickettsioze, boala Carre, leucemia limfoidă cronică, mielomul multiplu, bruceloză, borrelioză, babesioză, leishmanioza viscerală, trombopenii mediate imun, lupus eritematos sistemic.
Testele de laborator
Testele ce indică infecția cu Ehrlichia includ o hemoleucogramă cu leucopenie, trambocitopenie și o biochimie cu enzime hepatice elevate.
Pancitopenia, anemia aplastica sau trombocitopenia devin indici ai infecției cu E. canis. Microorganismele pot fi prezente în frotiu, LCT, aspirate din măduva osoasă și aspirate din splina după colorare cu Diff-Quick și Giemsa. Dar microscopia este eficientă doar în faza acută a bolii și este influențată de tipul de probă folosit. Confirmarea în laborator a ehrlichiozei se face prin metode serologice, moleculare sau pe bază de cultură.
Fig.34. E. canis. Morulă de Ehrlichia canis din aspirat din măduva osoasă a unui câine infectat natural
(http://link.springer.com/article/10.1186%2F1756-3305-1-25/fulltext.html)
Fig. 35. E. chaffeensis, coloratie Diff- Quick
(http://www.cvbd.com/)
Testare prin Imunofluorescența Indirectă
Diagnosticul serologic folosind IFAT este recomandată că metoda standard de diagnostic al expunerii la E. canis. Anticorpii din ser se leagă la microorganismul vizat pe un godeu și pot fi detectați prin conjugatul marcat cu fluoresceina folosit de metodã. Deși IFAT rămâne principală metodă de diagnostic pentru detecția infecției cu ehrlichia, nu există antigen standard, conjugat sau convenție prin care s-a stabilit ce constituie rezultat pozitiv în rândul tuturor testelor de laborator. Fiecare laborator își stabilește referințele proprii. Testul deține sensibilitate înaltă, dar nici o certitudine a unei infecții acute sau cronice, sau a unei infecții anterioare în care microorganismul să fie eliminat terapeutic sau imunologic. Alt dezavantaj este reacția încrucișată a diferitelor specii de Ehrlichia și deci specificitate scăzută.
Probele sanguine prelevate într-o fază târzie a bolii reprezintă probele perfecte pentru analiză.
Există puține date ce descriu mecanismele de detecție a anticorpilor de Ehrlichia.
Fiind descoperită prea recent, pentru specia E. ewingii încă nu a fost conceput un IFAT.
Câinii devin în general seronegativi după 3 până la 9 luni după tratament adecvat, deși pentru unii boala persistă și titrul de anticorpi rămâne stabil pentru mulți ani.
Fig. 36. IFA pentru E. chaffeensis în celule DH82, 40x/
(http://www.cvbd.com/)
Anticorpii reactivi pentru o specie de Ehrlichia pot avea reacție încrucișată și pentru alte specii de Ehrlichia.
PCR
A doua metodă recomandată este PCRul pentru amplificarea ADN-ului Ehrlichiei, cea mai des folosită pentru detecția infecției și confirmarea eliminării în urma terapiei.
Testele PCR rămâne nestandardizatã, iar sensibilitatea și specificitatea analizei poate varia în rândul testelor individuale. Sângele periferic recoltat pe EDTA pentru PCR trebuie recoltat fie înainte fie după terapia cu antibiotice.
Izolarea și cultură
Izolarea directă a microorganismului rămâne standard pentru confirmarea diagnosticului, dar este și cea mai dificilă și consumatoare de timp abordare. De exemplu, E. chaffeensis a fost izolată din sângele pacienților cu faza acută de boala folosind o varietate de linii celulare, cel mai des DH82 canine. Izolarea E. canis din monocite a fost realizată cu succes după 2 zile de la infectare. Dezavantajul tehnicii este costul ridicat, disponibilitatea unui laborator standard și timpul alocat analizei (14-34 de zile). Deci metoda nu este folositoare ca test de rutină. Pentru confirmarea unei terapii adecvate după medicația cu antibiotice, metodă este folositoare datorită unei sensibilități înalte.
Sângele tratat cu EDTA este proba obișnuită pentru încercarea izolării, la fel și pentru analiza mai frecventă prin metoda PCR.
Probele trebuie lucrate cât mai repede, deoarece după 1 săptămână de congelare, ehrlichiile își pierd din viabilitate.
DoT-ELISA
Metoda Dot-ELISA ce detectează antigenul circulant arată o sensibilitate redusă și reacții încrucișate, asemănătoare IFAT, ca atare testul este foarte rar folosit.
Se lucrează la noi tehnici, ce includ teste imunologice folosint antigeni recombinați de Ehrlichia și PCR fluorimetric, că în viitor aceste teste să fie aplicate în laboratoare la scară largă (Breitschwerdt EB et al., 1998).
Semnele clinice
Manifestările bolii cauzate de membrii ai genogrupului E. canis (E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii) ce infectează câinii nu sunt ușor detectabile și pot fi variații de tulpini în patogenitate.
După studii experimentale, ehrlichioza manifesta 3 faze: acută, subclinică și cronică.
Faza acută urmează perioadei de incubare de 1-3 săptămâni și este caracterizată prin febră, anorexie, pierdere în greutate, scurgeri oculo-nazale, limfoadenopatie, trompocitopenie, leucopenie, anemie și hipergamaglobulinemie. În această fază, microorganismele se divid și se răspândesc în circulația sanguină a gazdei prin celulele mononucleate. Alte semne clinice includ: depreciere, pierderea forței fizice, dispnee și edeme ale membrelor și scrotului.
Pot apărea și semne neurologice ce includ hiperestezia, tremur muscular și deficite de nervi cranieni datorită inflamării și sângerării în meninge. Aceste semne clinice ale fazei acute ale ehrlichiozei sunt asemănătoare cu cele ale anaplasmozei, febra Munților Stâncoși sau Distemperul canin. Faza acută se remite spontan în una sau două zile, chiar și fără tratament.
După alte 2 până la 4 săptămâni, se dezvoltă faza subclinică fără simptome clinice și cu trombocitopenie, ce durează de la 40-120 de zile până la ani, timp în care animalul este în continuare infectat. Animalele cu un status imunitar bun pot elimina complet parazitul în această perioadă.
Alte animale, în schimb pot dezvolta așa-numita faza cronică a infecției cu manifestări clinice severe și fatale.
Faza cronică este caracterizată prin diverse grade de depreciere, febră și pierdere în greutate.
Există o combinație de episoade hemoragice, paloare datorată anemiei, sensilibilitate ambdominala, uveita anterioară, hemoragii retiniene și semne neurologice asemănătoare meningoencefalitei, indicii clare ale prezenței infecției cronice cu Ehrlichia sp.
Adeseori se complică datorită unei infecții secundare bacteriene.
Imunosupresia s-a dovedit a fi oportună infecției cu E. canis la câini; dar nu este o cerință obligatorie pentru infecție. Epistaxisul, odată considerat marcă a prezenței bolii, apare frecvent la câini și poate fi atribuită infecției concurente cu Bartonella spp. sau alți agenți infecțioși.
Ehrlichioza este mai severă la anumite râse (Ciobănesc german) și la animalele tinere.
Co-infecțiile, statusul imunitar și variația tulpinilor pot avea un rol în determinarea tipului de manifestări ale bolii și în severitatea patologiei fiecărui individ.
Ehrlichioza felină merită o menționare separată față de cea canină.
Pisicile au fost infectate experimental cu E. risticii sau E. equi producând fie o infecție subclinică sau o manifestare ușoară a bolii. Aceste pisici au prezentat diferite semne clinice precum febra, anorexie, artropatii, semne gastrointestinale și indispoziție generală.
Până când o imagine clară a importanței clinice a ehrlichiozei feline este dezvoltată, ehrlichioza ar trebui să rămână la pisici o boală cu semne clinice variabile și inexplicabile. Diagnosticul se bazează pe excluderea altor cauze.
4.4. HEPATOZOONOZA
Hepatozoonoza este boală transmisă de căpușe, întâlnită la carnivorele sălbatice și domestice, produsă de specii ale protozoarului din genul Hepatozoon.
Hepatozoonoza caninã este cauzată de specii ale parazitului Hepatozoon spp., care parazitează leucocitele animalului-gazdă. Spre deosebire de alte boli transmise de vectori, Hepatozoon spp. sunt transmise animalului nou prin ingerarea unei căpușe infectate. Pisicile pot fi infectate cu Hepatozoon spp., dar nu există încă o înțelegere completă a speciilor implicate.
Etiologie, epidemiologie, transmitere
H. canis este transmis cainelui, de Rhipicephalus sanguineus.
H. americanum prezent în America de Nord, transmis de căpușa Coastei Golfului (Gulf Coast tick), Amblyomma maculatum (Baneth G, 2002).
Manifestări clinice și morfopatologice
H. canis poate evolua asimptomatic la câini aparent sănătoși si poate determina apariția unor simptome diverse, cum ar fi letargie, cahexie sau anemie. Infecția cu H. canis evoluează, în general, sub o formă asimptomatică sau ușoară de boală, cu o parazitemie redusă, de 1-5%.
La câinii cu parazitemie severă, apropiată de 100% din neutrofilele sângelui periferic, simptomele sunt foarte grave, iar neutrofilia depășește 150.000 leucocite/μl de sânge.
H. americanum prezintă, întotdeauna, o simptomatologie severă: febră, tulburări de mers, cu dureri musculate generate de miozită, atrofii musculare generalizate, secreții oculare mucopurulente; durerea poate fi generalizată sau localizată la nivel cervical, lombar sau la nivelul articulațiilor; hiperestezia severă și durerea în regiunea paraspinală sunt simptome comune ale examinării fizice și se manifestată prin pareza membrelor posterioare, ataxie, precum și prin rigiditate cervicală sau generalizată, cu incapacitatea de a păstra poziția patrupedală.
Forma tisulară a protozoarului determină o inflamație piogranulomatoasă.
HEPATOZOONOZA
(http://en.wikipedia.org/wiki/Hepatozoon)
Ciclul biologic
Fig. 37, 38. Ciclul biologic al Hepatozoon spp.
(http://www.scielo.br/img/revistas/rbpv/v20n3/a02fig04.jpg)
Patogenitate
Hepatozoonoza canină este o boală transmisă de vectori cauzată de speciile ale parazitului intraleucocitic Hepatozoon spp., un protozoar apicomplex din familia Haemogregarinidae. Hepatozoon sp. este transmis prin ingerarea căpușei infectate. Paraziții sunt de forma elipsoidala și au dimensiuni de 11 x 4 um.
Hepatozoon canis infectează câinii din regiuni tropicale și subtropicale din întreaga lume prin înțepătura căpușei Rhipicephalus sanguineus, că vector principal. Anumite semne și manifestări clinice sugerează că o specie diferită transmisă de Amblyomma maculatum produce boala în Sudul SUA, cu denumirea de Hepatozoon americanum.
Răspândire
Hepatozoon canis afectează în mod obișnuit câinii din regiunile calde și temperate ale Africii, Sudul Europei (Spania, Portugalia, Franța, Italia și Grecia), Orientul Mijlociu, Asia și deasemeni SUA, reflectând răspândirea geografică a principalului ei vector Rhipicephalus sanguineus,.
Alți vectori de transmitere sunt Ixodes canisuga și se presupune că și Haemaphysalis longicornis și H. flava.
Hepatozoon canis este deseori asociată cu alte patologii sau co-infecții, mai ales ehrlichioza, leishmanioza și babesioza în zonele endemice, zone din care sunt raportate cazuri clinice.
Patogenitate și transmitere
Căpușa ingera patogenul în urma hrănirii de pe o gazdă infectată. Apare transmiterea transstadială de la stadiul de nimfă, la cel de adult, dar nu și transmiterea transovariană.
Nu a fost documentat încă un transfer salivar al acestui parazit. Odată ingerate, microorganismele sunt eliberate în intestinul câinelui, pătrunde prin peretele intestinal, invadează celulele mononucleare și sunt purtate prin fluxul sanguin sau prin sistemul limfatic către diferite organe.
Patogeneza este destul de complexă, H. canis infectează în principal țesuturile hemolimfatice și organe hematopoetice incluzând splină, măduva osoasă și limfonodurile. Pot fi infectate și ficatul, pulmonii și rinichii. În diferite organe patogenul se dezvoltă în continuare, trecând prin stadii diferite de transformare, numite și meronti. Prima generație de meronti sunt înalt patogenici, cauzând infiltrații inflamatorii și multiple leziuni în toate organele infectate, dar mai ales în ficat și în măduva osoasă. Apare a doua generație de meronti care infectează leucocitele, în care sunt generați așa numiții gamonti. Aceștia pot fi identificați în examinarea frotiului sanguin.
Hepatozoon americanum infectează în prima fază mușchiul cardiac și musculatura scheletică și induce miozită și slăbire. În mușchi, patogenii formează chiști cu caracteristică particulară cu o structură asemănătoare foilor de ceapă.
Fig. 39. Chist de Hepatozoon spp. – aspectul de „foi de ceapă”
(http://www.studyblue.com/notes/note/n/exam-2/deck/6188345)
H. canis se adaptează foarte bine la câinele gazdă și este detectată deseori abia la necropsie sau în frotiuri din sânge integral periferic din întâmplare. În opoziție, H. americanum induce o formă mult mai severă de boală atât în infecțiile experimentale, cât și în cele naturale.
Fig. 39. Stadii de dezvoltare ale Hepatozoon spp. ȋn splină. Preparate colorate Giemsa din splină de caine.
(http://www.scielo.br/img/revistas/rbpv/v20n3/a02fig02.jpg)
Diagnostic
Adeseori boala se poate dovedi a fi letală, înainte că faza sanguină să poată fi vizibilă pentru diagnostic. Odată ce parazitul apare în sângele periferic, faza patogenică a bolii a și trecut și leziunile primare se vindecă.
Infecția cu Hepatozoon canis este de obicei diagnosticată prin identificare microscopică a H. canis intracelular în frotiuri de sânge periferic colorate. Se găsesc în citoplasmă neutrofilelor și monocitelor, au forma elipsoidală, formă de cărămidă și dimensiune de 11×4 µm.
La examenul microscopic al sângelui periferic se observa prezenta gamonților, situați în citoplasma neutrofilelor sau monocitelor, având formă elipsoidală și dimensiuni de 11 x 4 μm. Meronții identificați în țesuturile infestate au o formă rotundă și conțin micromerozoiți elongați dispuși circular în jurul unui centru clar. Această dispunere a fost asemănată cu forma unei „roți cu spițe”.
Tabloul hematologic prezinta: leucocitoza neutrofilică, anemia, ușoară până la moderată, de tip normocitar, normocrom și nonregenerativ, cu numărul trombocitelor crescut.
Tabloul biochimic prezenta o ușoară creștere a fosfatazei alcaline și hipoalbuminemie, hipoglicemie severă ca rezultat al intensificării metabolismului glucidic ca urmare a creșterii numărului leucocitelor.
La examenul radiologic se observa reacții periostale la oricare os, cu excepția craniului, în special la oasele lungi ca rezultat al unui răspuns inflamator din partea organismului gazdă.
Diagnosticul cert se face prin vizualizarea gamonților în neutrofile sau monocite, prin tehnica colorarii clasice MGG, prin teste hispatologice, si a chiștilor ovali, meronți si/sau a miozitei piogranulomatoase ȋn urma biopsiei musculare.
Diagnosticul serologic evidențiază prezența anticorpilor.
Fig. 40. Imagine gamont Hepatozoon canis în neutrofilul din sângele unui câine infectat natural
(http://en.wikipedia.org/wiki/Hepatozoon)
(http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1984-29612011000300002&script=sci_arttext)
H. americanum apare rar în sânge și parazitemia nu depășește 0,1 %. Confirmarea infecției cu H. americanum este deobicei stabilită în urma biopsiei musculare și demonstrării prezenței chistilor sau granuloamelor.
Testele serologice pentru infecțiile cu H. canis și H. americanum au fost concepute pentru detecția anticorpilor anti- H. canis și anti – H. americanum.
Semnele clinice
Spectrul de semne ale infecției cu Hepatozoon canis merge de la faza suclinicã, fără manifestări, până la forma severă posibil letală. Prezentarea obișnuită a infecției este forma asimptomatica până la ușoară asociată cu un nivel scăzut al parazitemiei cu H. canis (1-5%), în timp ce faza severă a bolii este prezentă la câinii cu parazitemie ce atinge 100% în neutrofilele sângelui periferic. Rate înalte ale unei parazitemii sunt deseori acompaniate de neutrofilie extremă, H. canis este adeseori asociat cu o co-infectii cu alte boli, mai ales cu ehrlichioza, leishmanioza și babesioza în zonele endemice și sunt prezente manifestări clinice precum: febră, emacierea, letargia, limfoadenopatia, mucoase palide asociate cu anemie și dureri musculare.
Infecția cu H. americanum este aproape întotdeauna o boală severă care conduce spre debilitate și moarte. Majoritatea câinilor manifesta eprisoade febrile, anormalități de mișcare (înțepenire, pareza pe tren posterior, ataxie și incapacitatea de se ridică) și dureri musculare induse de miozitã, atrofie musculară generalizată și scurgeri oculare mucopurulente. Durerile pot fi generalizate sau localizate în zonele lombară și cervicală ale coloanei vertebrale sau în încheieturi. O neutrofilie marcantă este indiciul principal în investigațiile hematologice. Modificări biochimice serice apar în privința fosfatazei alcaline a cărei activitate este crescută și cu hipoalbuminemie.
4.5. Babesioza
Babesioza este o boală cu caracter zoonotic produsă de protozoare endoglobulare din genul Babesia, care evoluează clinic prin acces febril și sindrom hemolitic, transmisă de căpușele Ixodidae.
Etiologie
Speciile genului Babesia fac parte din încregătura Apicomplexa, clasa Sporozoa, ordinul Piroplasmida, familia Babesiidae, genul Babesia.
Taxonomia
(http://en.wikipedia.org/wiki/Babesia)
Babesioza canină este cauzată de paraziții intraeritrocitarii aparținători ai genului Babesia ce conține specii de dimensiuni mari precum B. canis, B. vogeli, B. rossi și specii mai mici precum B. gibsoni care își extinde tot mai mult arealul de răspândire (Birkenheuer AJ et al., 2005).
Diferențierea dintre specii s-a făcut pe baza dimensiunilor lor în timpul parazitarii eritrocitelor: microorganismele de ordin mare din genul Babesia au în jur de 2×5 um în faza intraeritrocitară, singulară sau în pereche în cadrul unei hematii, și cele mici cu dimensiuni de 1×3 um, aproximativ 1/8 din mărimea hematiei, apar fie singure cu formă rotundă sau ovală, sau în pereche în cadrul hematiei parazitate.
Inițial, Babesia spp. patogenă mare era reprezentată de complexul Babesia canis cu B. canis canis, B. canis vogeli, B. canis rossi, dar s-a considerat necesar să fie individualizate ca subspecii în B. canis, B. vogeli, B. rossi. Babesiile de dimensiuni mari, cele mai frecvent întâlnite sunt transmise de: Dermacentor, Haemaphysalis și Rhipicephalus.
Babesiile de dimensiuni mici sunt recunoscute sub trei specii distincte genetic și morfologic: Babesia gibsoni (transmisă de căpușa Rhipicephalus sanguineus, Babesia conrade și Babesia annae (transmisă de Ixodes hexagonus).
Fig.41. Faza intraeritrocitară a speciilor mari de Babesia spp. Original – EuroStar EUROIMMUN – OB X40, colorație MGG
În urma unor studii efectuate la nivel molecular au fost identificate și noi babesii de mărimi mici ce infectează câinii. A fost descoperită și izolată, în peninsulă Iberică, o formă înrudită cu piroplasma rozătoarelor B. microti (B. microti – like piroplasma/ izolat spaniol) și uneori numită și Theileria annae, și o altă piroplasma mică a fost numită de curând B. conradae și este întâlnită la câini în California. A fost deasemenea descrisă și o a patra formă de Babesia sp. la câinii din Carolina de Nord, nenumită încă și a rămas Babesia sp. (Lehtinen LE et al, 2008). Odată cu aceste descoperiri au fost identificate încă 3 specii de Theileria la un grup mic de canide în Europa (Theileria (Babesia) equi și Theileria annulata) și la anumiți câini în Africa de Sud, încă rămasă nenumitã Theileria sp. .
Patogenitatea variază între diferitele specii: B. rossi, tulpina originară din Africa de Sud, este cauzatoare de o manifestare severă a bolii clinice; B.canis, principala cauză a babesiozei din întreaga Europă, este mai puțin patogena, dar poate fi însoțită și de forma severă (Criado-Fornelio A et al., 2003). Infecția cu B.vogeli dezvoltã simptomatologie moderată ca efecte, în toată lumea. Importanta relativă a speciilor de căpușe transmițătoare de babesioza canina variază din punct de vedere geografic. B. gibsoni se consideră a fi un agent cu patogenitate ridicată.
Speciile de Babesia canis nu transmit boala la om. În SUA, B. microti este cauza comună pentru diferite forme de babesioze la om; iar patogenul B. divergens, transmis de căpușele Ixodes, este cauza babesiozei clinice severe la om în unele părți al Europei.
Fig. 42. Ciclul biologic
(http://en.wikipedia.org/wiki/Babesia)
Fig. 43. Ciclul evolutiv
(http://www.vetres.org/articles/vetres/full_html/2009/02/v09047/F1.html)
Distribuție geografică:
Hărțile de distribuție ale bolilor transmise de vectori ale câinilor, sunt în continuă schimbare deoarece sunt descoperite în mod continuu informații noi legate de infecțiile parazitare și de limitele de infestare la nivel geografic.
În general, sunt de luat în considerare doau nivele regionale de prevalenta și incidenta pentru anumite boli specifice; acele regiuni unde parazitul specific se manifestă cu precădere și este clinic recunoscut; în acele regiuni unde s-au raportat infecții sporadice autohtone sau cazuri asociate cu câini care au călătorit dintr-o zonă în alta.
Tabel III. – Specii de piroplasme întâlnite la câini:
(http://www.cvbd.com/)
Stabilirea limitelor de răspândire a fost deja etalatã în Tabel; sunt disponibile în acest moment, și la zi, hărți de răspândire ale bolilor transmise de vectori la canine, ale Europei, Asia de Sud și Est. Așa cum este de așteptat, distribuția geografică a acestor organisme este lărgită ca arie datorită zonelor de viețuire ale vectorilor de transmitere. În mod interesant, acest lucru nu poate fi aplicat și în cazul Babesiei gibsoni, a cărei dispersie recentă a fost pusă pe baza transmiterii în urma interacției directe dintre câini, chiar și fără implicarea unui vector.
Babesia vogeli este cea mai răspândită piroplasma datorită naturii cosmopolite a gazdei sale, căpușa maro a câinelui Rhipicephalus sanguineus (Tabel ). Babesia vogeli deține o răspândire la nivel global de la regiunile tropicale și subtropicale, până la zone mai reci și pot apărea sub forme altele decât știute ce pot fi confuzionate cu alte Babesia sp. Babesia canis (propriu-zisă) este transmisă de Dermacentor spp. și a fost recunoscut adeseori în cazuri apărute în Europa Centrală, când a fost considerată a fi specifică Franței.
Babesia rossi este o altă Babesia africană (alături de B. vogeli și B. gibsoni); inițial recunoscută doar în Africa de Sud, dar raportată ca prezența și în alte regiuni ale continentului african, incluzând Nigeria și Sudan unde vectorii acesteia de transmitere sunt enzootici (Haemaphysalis spp.).
Piroplasma canina mică cu cea mai vastă distribuție geografică este fără îndoială B. gibsoni. Clasificarea tipologică o încadrează în “tulpina asiatică”, identificarea originii ei moleculare făcându-se în mai multe țări sudice, estice și din sud-estul Asiei.
În ultimii 10 ani însă, a fost raportat și un număr semnificativ de cazuri dinafară Asiei, predominant la Pitbullii Terrieri Americani, dovedind clar o transmitere în urma zgârieturilor și mușcăturilor din timpul luptelor dintre animalele infectate sau neinfectate. În urma studiului secvenței genetice a B. gibsoni s-a ajuns la ipoteza că acesteia îi lipsește diversitatea genetică deoarece aceasta nu este aptă de a se reproduce în timp ce parazitează căpușa; cu alte cuvinte, o clonare a unei singuri tulpini este posibilă doar la gazdele susceptibile. Ca atare, câinii în sine sunt un rezervor de B. gibsoni, mai ales câinii de luptă, și nu una dintre speciile endemice de căpușe (Kjemtrup AM et al., 2000).
Trei dintre speciile mici de piroplasme la câine, apar în vestul SUA, mai ales în California (B. conradae), sudul Africii (Theileria spp.) și Pen. Iberica (Theileria annae), sunt transmise de Ixodes hexagonus. Vectori pentru B. conradae și Theileria sp. sud-africanã, nu au fost identificați înafara unui caz raportat în SUA de Theileria annae, aceste piroplasme nu au fost identificate înafara acestor zone limitate geografic.
Fig. 44. Distribuția geografică a bolilor transmise de vectori
(http://www.cvbd.org/en/occurrence-maps/world-map/)
Fig. 45. Rãspândirea diverșilor patogeni pentru zona României
(http://www.cvbd.org/en/occurrence-maps/world-map/)
Diagnosticul babesiozei
Microscopia rămâne testul cel mai simplu și cel mai accesibil de diagnostic pentru majoritatea veterinarilor iar în timpul unei infecții acute, microscopia rămâne fidelă în a releva prezența unor hemoparaziti intraeritrocitari în frotiuri colorate MGG. Diferențierea dintre speciile mari și cele mici de piroplasma este destul de ușoară. Mai mult, microscopia rămâne singură opțiune viabilă la îndemână veterinarului în multe zone ale lumii unde babesioza este endemica. Cu speciile mari de Babesia, mai ales, este ușor ca dintr-o probă de sânge recoltata din patul capilar și din examinarea celulelor din stratul de hematocrit, să se poată identifica prezența unor paraziți.
Diagnosticul piroplasmozelor la câinii infectați cronic și cei purtători latenți, rămâne totuși o provocare majoră datorită lipsei parazitemiei, de multe ori intermitentă. Nereușita neidentificarii pe frotiu a parazitului Babesia/Theileria la animalul ce se prezintă cu anemie hemoliticã și trombocitopenie, a dus la un diagnostic incorect în multe cazuri, la fel și în cazurile în care nu există nici măcar suspiciune de babesioză. Datorită posibilității de a se transmite direct pe orizontală a B. gibsoni, medicii veterinari ar trebui să se asigure că acei câinii nu au fost mușcați de alți câini într-o perioadă de 4-8 săptămâni, indiferent de rasă.
Diagnostic molecular – PCR-ul convențional și alte metode
Deși PCR-ul a crescut cu mult sensibilitatea și specificitatea detecției parazitului și este potrivit pentru studii epidemiologice și filogenetice, este încă limitat accesul la tehnicile moleculare pentru diagnosticul clinic de rutină în babesioza caninã și se practică doar în câteva laboratoare specializate din lume.
Genele ribozomale ARN 18S, 5.8S, 28S și secvența de spacing intern de transcriere au fost folosite în PCR-ul convențional, dar anumiți cercetători și-au ales alți loci în analiza lor precum p18/BgTRAP. Deoarece o speciație clară pe morfologia parazitului nu este bine conturată, pentru diferențierea rapidă a speciilor de piroplasme au fost folosite modificările apărute în urma folosirii tehnicii PCR; PCR- RFLP și nested PCR au diferențiat în Australia B. vogeli și B. gibsoni, între speciile mari de Babesia spp., precum și B. gibsoni în zone endemice (Solano-Gallego L et al., 2008).
Deși se face o diferențiere geografică în incidenta acestor infecții, mulți dintre câinii gazda pentru infecția cu B.canis sunt câini care au fost în excursii de vânătoare în Estul Europei.
O atenție sporită a fost acordată designului primerilor care au separat anumiți ampliconi ai unor fragmente țintite: 342bp, 546pb și 746bp ale B. canis rossi, B. canis vogeli respectiv B. canis canis. În urma folosirii metodei de amplificare izotermalã buclat-mediatã (LAMP) au fost subliniate avantaje în sensibilitatea și specificitatea detecției B. gibsoni în Japonia și hibridizarea prin reverse-line blot (RLB) a fost folosită în studii epidemiologice ale vectorilor hemopatogeni artropode ale câinilor și pisicilor în Trinidad și ale câinilor din Africa. Real – time PCR permite cuantificarea nivelelor de patogenitate în probele de sânge și țesut; cantitatea finală de produs PCR poate fi folosită în deducerea numărului numărul de pornire al moleculelor ținta și de scădere a nivelului parazitar într-o gazdă. PCR –ul Cantitativ (qPCR) a fost folosit ca metodă de detecție în infecția experimentală a 3 câini cu B. gibsoni, studiu ce a concluzionat că metologia poate fi adaptată în determinarea vaccinării și a eficacității chimioterapiei sau în elucidarea răspunsului imunologic.
În timp ce limită de detecție a parazitemiei cu ajutorul microscopului cu câmp întunecat este de 0.001%, PCR-ul este capabil să detecteze încărcătura parazitara la aproximativ 50 microorganisme/ml și 9 paraziți/ul. În ciuda sensibilității lui extraordinare, PCR-ul nu va detecta ADN atunci când în proba nu vor exista microorganisme. Rezultate “Fals negativ’ pot apărea în babesioza cronică și este foarte important să fie recunoscute aceste limite de detecție, mai ales în cazul screeningului pacienților purtători latenți și a altor câini asimptomatici în cazul donatorilor de sânge. A fost investigată capacitatea PCR-ului de a detecta câinii infectați în aceste situații, cu și fără tratament. Într-un studiu au fost monitorizați parametrii clinici, hematologia, titrul serologic (prin IFAT) precum și identificarea ADN-ului Babesiei timp de câteva zile la câini infectați experimental. Toți cei 3 câini și-au revenit complet, după verificarea tuturor criteriilor clinice, fără splenomegalie, cu o hemogramă normală și cu absența piroplasmelor la examinarea microscopică până la a 30-50 a zi după vârful parazitemiei. În timpul acestei perioade de normalitate clinică, ADN-ul Babesiei fost slab detectabil și deseori neconcludent, acest fapt sugerând o parazitemie slabă și fluctuantã la acești câini, probabil analoagã fazei de infecție cronică, natural asimptomaticã.
Abilitatea PCR-ului de a detecta ADN-ul parazitului la animalele infectate cronic poate fi îmbunătățit prin testarea repetată în ocazii diferite, dar este recomandată testarea serologică ca alternativă, ca test complementar de diagnostic.
Testarea serologică – IFAT și ELISA
Testarea prin imunofluorescența a anticorpilor s-a dovedit a fi cel mai răspândit mod de diagnostic serologic și cel mai des folosit în diagnosticarea babesioze în ultimii 30 de ani.
Dar există și pentru acesta factori de limitare în detecție datorită sensibilității scăzute cauzate de reacțiile de încrucișare dintre speciile de Babesia spp. și alți paraziți apicomplecsi, subiectivitatea în operare și neadecvarea screeningului la o scară mai largă.
Studii recente s-au concentrat pe identificarea unor antigene imunodominante ale Babesiei gibsoni pentru a le folosi în tehnica ELISA cu recombinare de proteine și posibili potențiali candidați pe viitor. Proteinelor de adeziune înrudite cu trombospondina (TRAP) sunt un grup de proteine funcționale înalt conservate identificate în paraziții apicomplecsi, dezbătuți ca fiind asociați cu motilitatea și posibilitatea de invazie a unor merozoiti, capabili de a induce un răspuns imun. Tehnica ELISA cu proteine recombinate BgTRAP este mult mai sensibilă decât omoloaga să ELISA ce folosește antigene precum rBGP50, rBgSA1 și rBgP32, iar ELISA BgTRAP a fost folosită de Konchi și co. (2008) în testarea a 1206 câini verificați la întâmplare în Japonia pentru expunerea la B. gibsoni. Acești cercetători au raportat o rata mai mare de infectare în vestul Japoniei, ajungând la concluzia că dacă au exclus din studiu câinii de luptă, o expunere în prealabil la căpușa Haemaphysalis longicornis a reprezentat un factor mare de risc în detecția anticorpilor anti-babesioza, demonstrând astfel 2 tipuri de epidemiologie distincte ale infecției cu B.gibsoni în această țară. O a doua limitare în detecție a testelor serologice o constituie este lipsa abilități de a distinge între o infecție acută și una cronică, iar interpretarea unui titru pozitiv este cumva problematica pentru clinicienii ce muncesc în zonele endemice babesiozei. Pentru SUA și Australia, IFAT pentru detecția B. gibsoni, destul de rară în zonele acestea, este un test folositor în diagnosticul câinilor infectați, mai ales dacă se combină cu PCR-ul.
Etiopatogeneza
Severitatea babesiozei la câini și pisici, pleacă de la infecția subclinică, dezvoltarea unei anemii moderate către înmulțirea diseminată până la scăderea funcționalității viscerelor și moarte.
Determinanții de bază ai acestei patogeneze variabile sunt speciile de piroplasme, dar și alți factori precum vârsta și statusul imunitar al gazdei și infecțiile concurente și bolile deja instalate dețin un rol major. Toate speciile pot cauza febră, anorexie, splenomegalie, anemie și trmbocitopenie. Deteriorarea hematiei indusă direct de parazit, fragilitate osmotică crescută a celulelor infectate, leziuni mediate imun ale membranei eritrocitare de natură oxidativă apar în combinație cu hemoliza intra și extravascularã.
Cu alte cuvinte există un acord în urma căruia cea mai puțin patogenica dintre totate speciile de piroplasme este B. vogeli, mai ales la câinii adulți, iar cea mai virulenta este B. rossi în Africa.
În infecțiile cu B. rossi o populație destul de mare de câini dezvolta complicații, dintre ele hepatopatii, hemoliza mediată imun pot fi tratate corespunzător și înafara spitalizării pacientului, depășesc zona de risc, în timp ce cu alte semne clinice precum hemoconcentratie, semne neurologice, insuficiență renală acută și edem pulmonar, se presupune o instalare a unei terapii intensive mai agresive și cu toate acestea încă prognosticul rămâne rezervat.
În opoziție, B. vogeli are o formă subclinica în general (mai puțin la căței de 3-4 luni, la care infecția poate fi fatală).; este observată ocazional în examenul citomorfologic al sângelui periferic canin cu alta boala primară sau aflați sub tratamente (imunosupresoare sau chimioterapie) sau cu intervenție chirurgicală (splenectomia), iar la acești indivizi imunocompromisi apariția parazitului poate avea efecte nesemnificative și nu merită tratament.
Patogenitatea B. canis, B. gibsoni, T. annae și B. conradae poate avea formă de la moderat la sever la câine, dar trebuie subliniat din nou că există o varietate de semne clinice de severitate diferită depinzând de fiecare individ în parte. B. conradae este considerată a fi mai patogenică decât B. gibsoni, rezultând parazitemii mai grave cu anemie mai severă.
În Spania, infecția cu T. annae este asociată cu hemoliza severă și azotemie (Birkenheuer AJ, 2009).
Nenumita Babesia sp. din Nordul Carolinei a fost asociată cu semne atipice bolii precum letargie/anorexie, pigmenturie și febră ușoară mai ales la câinii splenectomizati.
Cercetările au arătat că include anemie și trmbocitopenie severe la fel ca în infecțiile cu B. vogeli.
Potențialul implicării rinichilor în babesioza caninã a primit o atenție sporită în ultimii ani cu hipoxemie, nefropatie hemoglobinurinica și glomerulornefrita considerate mecanisme posibile și dovedite prin studii histologice. Un studiu clinicopatologic al infecției cu T. annae în Nord-Vestul Spaniei, a raportat că 36% din câini pozitivati (n=58) erau azotemici la momentul diagnosticului, acești câini având un risc de 10 ori mai mare de mortalitate din cauza piroplasmozei decât cei care nu erau azotemici. Din păcate nici densitatea specifică urinarã, nici osmolalitatea urinarã nu au fost subliniate la acești câini, dar s-a remarcat o creștere a proteinei din urina: raportul cu creatininã urinarã, hipoalbuminemie și hipercolesterolemia la câinii afectați au condus la ideea că s-a produs o leziune glomerulară și că insuficiență renală a fost produsă de infecția cu Theileria annae. Studiul azotemiei în infecția cu B. rossi, în schimb, au concluzionat că urea și creatinina nu au constituit indicatori de bază în sublinierea deteriorii renale și a insuficientei renale acute în babesioza acută. Mortalitatea în infecția cu B. rossi a fost asociată cu Cortizol crescut și concentrații mari de ACTH cu concentrații joase de T4 și T4 liber într-un studiu recent asupra influenței markerilor endocrini în babesioza.
Consecințele clinice ale infecției cronice cu Babesia sp. sunt încă neclare și deși unii câini aratã că ar tolera această stare de construcție a unei oarecare imunități cu puține semne clinice, teoretic încă rămâne un factor de risc în dezvoltarea unor complicații imun-mediate și reapariție a bolii clinice (și a parazitemiei) dacă animalul este imuncompromis mai târziu. Infecția cronică poate rămâne nesemnificativă pentru unii câini și poate deveni chiar benefică pentru gazdele ce trăiesc în zonele endemice protejându-le pe acestea de o îmbolnăvire ulterioară.
PARTEA A II A
CERCETARI PERSONALE
CAP. STUDII DE DIAGNOSTIC IN UNELE HEMOPARAZITOZE LA CÂINI DIN BUCUREȘTI ȘI ZONELE LIMITROFE
1.Scopul studiului
Studiul de față are ca scop un screening parțial al cazurilor ce s-au prezentat la Clinica Facultății de Medicină Veterinară din București, precum și a celor evaluate în urma trimiterilor de la cabinete din teritoriu, adăposturi și câini utilitari. Evaluarea tabloului sanguin al acestora s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Analize Medicale Veterinare al Facultății de Medicină Veterinară din București.
Beneficiile unui screening al bolilor transmise de vectori, depășesc evaluarea bunăstării unui singur individ și duc la conștientizarea și la o mai bună înțelegere a acestor boli în rândul proprietarilor, cât și al medicilor practicieni.
2.MATERIALE ȘI METODE
2.1.Animale incluse în studiu
Un numar total de 161 de câini au fost luați în calcul în studiul de față. Vârsta câinilor a variat între 4 luni și 16 ani, câinii provenind din București și zonele limitrofe.
2.2. Metode de lucru
Metodele de screening folosite pentru câinii luați în studiu au fost: evaluarea hematologică prin hemoleucograme 3 diff sau 5 diff, examenul citomorfologic sânge periferic, examenul citologic direct lamă/lamelă pentru depistarea microfilariilor și testul serologic Snap 4Dx Plus®.
2.2.1.Evaluarea hematologică
Au fost recoltate probe sanguine de la cei 163 de câini și li s-a verificat profilul hematologic, folosind sânge recoltat pe anticoagulant EDTA, analizat cu analizoarele hematologice VetAutoread ® (3 diff) și Lasercyte Dx ® (5 diff) și au fost determinați următorii parametrii: Numărul total de eritrocite (RBC), Hematocrit (Ht), Hemoglobina (Hb), Volumul eritrocitar mediu (MCV), hemoglobina eritrocitară medie (MCH), concentrația în hemoglobină eritrocitară medie (MCHC), coeficientul de variație a dimensiunii eritrocitelor (RDW), numărul de leucocite (WBC), procentul de neutrofile (NEU %), limfocite (LYM %), monocite (MONO %), eozinofile (EOS%) și bazofile (BASO%), numărul de trombocite (PLT).
Fig 1. Analizoare hematologice 5diff Lasercyte Dx® Idexx automat și 3diff VetAutoread ® Idexx semiautomat
2.2.2. Evaluare biochimică
S-au folosit probe sanguine recoltate pe Li-Heparina, centrifugate și analizate prin metoda biochimiei uscate (dry slide technology), cu ajutorul analizorului VetTest 8008® Idexx. S-a urmărit evaluarea funcțiilor principalelor organe: rinichi, ficat.
Fig. 4. Analizor biochimie uscată VetTest ®8008 Idexx
2.2.3.Diagnosticul citomorfologic
Microscopia rămâne testul cel mai simplu și cel mai accesibil de diagnostic pentru majoritatea veterinarilor iar în timpul unei infecții acute, microscopia rămâne fidelă în a releva prezența unor hemoparaziti intraeritrocitari în frotiuri colorate MGG.
Executarea frotiului: Frotiul de sânge reprezintă modalitatea de studiere a morfologiei elementelor celulare sangvine, orientează asupra cantității de hemoglobină, a numărului de leucocite și a numărului de trombocite cât și a prezenței paraziților sanguini.
Se folosește sânge venos recoltat pe anticoagulant EDTA-K3.
Se dezinfectează locul cu un tampon îmbibat cu alcool 70% și uscarea locului cu material steril;
Puncționarea se face cu ac steril cu o adâncime suficientă pentru a efectua puncția.
După puncționare se aplică pansament steril.
Reactivi
Soluție May-Grunwald;
Soluție Giemsa
Apa distilată neutră (ph= 7-7,2)
Ulei de cedru.
Tehnica de lucru:
Se aplică o picătură de sânge, capilar sau venos din vacutainer agitat, la capătul lamei și se întinde rapid, cât mai subțire și uniform, cu ajutorul lamei șlefuite ținută ușor înclinată (sub un unghi de 45 de grade) ce i se imprimă o ușoară mișcare de translație în lungimea lamei.
Se usucă foarte repede prin agitare în aer (acest moment reprezintă o primă fixare);
Un frotiu bun este întins subțire, uniform are două laturi paralele și se sfârșește cu franjuri.
Colorația May Grunwald-Giemsa
Acesta colorație folosește un amestec de coloranți acizi, bazici și neutri, toate componentele celulelor sanguine se vor colora în funcție de afinitățile lor tinctoriale (colorație panoptica).
Soluția May Grunwald colorează citoplasma granulocitelor și granulocitele respective și nu colorează bine nucleul, eritrocitul și granulocitele azurofile.
Soluția Giemsa, colorează nucleul și granulocitele azurofile și evidențiază și parazatii sanguini.
Tehnica de colorare:
-se așează lamele pe suportul de colorare;
-se acoperă lamele cu soluție May Grunwald timp de 2-3 minute. În acest moment lamele sunt fixate;
-peste lamele acoperite cu soluție May Grunwald se pune aceeași cantitate de apă distilată. Se lasa 2 minute;
-se face extemporaneu soluție Giemsa diluata (1-2 picături la 1 ml apa distilată);
-se varsa de pe lame soluție May Grunwald și apoi se acoperă lamele cu soluție Giemsa diluata. Se lasa 25-30 minute;
-se șterg pe dos lamele cu apă distilată și se usucă pe stativul de lame.
După colorare, frotiurile au fost examinate la microscop mai întâi la obiectiv de 10x pentru identificarea prezenței microfilariilor, apoi, succesiv cu ob 40X și 100X – imersie, pentru identificarea celorlalți posibili hemoparaziti intracelulari.
Diferențierea dintre speciile mari și cele mici de piroplasma este destul de ușoară. Mai mult, microscopia rămâne singură opțiune viabilă la îndemână veterinarului în multe zone ale lumii unde babesioza este endemicã. Cu speciile mari de Babesia, mai ales, este ușor ca dintr-o probă de sânge recoltată din patul capilar și din examinarea celulelor din stratul de hematocrit, să se poată identifica prezența unor paraziți.
Ulterior examenelor citomorfologice și identificarea paraziților au fost folosite metode serologice de depistare a altor eventuali patogeni, cât și a confirmării antigenului de Dirofilaria immitis cu ajutorul testului imunoenzimatic Snap 4Dx®.
2.2.4 Evaluarea serologica
Snap 4Dx® Plus reprezintă un test ELISA imunoenzimatic calitativ pentru detecția antigenului de Dirofilaria immitis, anticorpilor față de Anaplasma phagocytophilum/ platys, anticorpilor față de Borellia burgdorferi, față de Ehrlichia canis/ ewingii în probe de ser, plasma său sânge integral de câine.
Fiecare kit conține un flacon de 7 ml cu conjugat specific și un dispozitiv pentru reagenți, pipete de transfer, tuburi pentru probe și dispozitive Snap. Fiecare dispozitiv Snap conține 0,4 ml soluție de spălare și 0,6 ml soluție substrat. Probele de sânge se aduc la temperatura camerei, la fel și componentele kitului (15 -25 °C) înainte de a efectua testul.
Se pot utiliza probe de ser, plasma său sânge integral proaspete sau stocate la 2-8 °C până la o săptămână, probele hemolizate sau lipemice nu influențează rezultatul analizei. Sensibilitatea și specificitatea testului este foarte înaltă (98-99%), dar pot apărea rezultate fals negative în perioada prepatenta. Acest test permite detecția antigenului produs de D. immitis în prezența femelelor adult.
Metoda de lucru. Pentru efectuarea testului SNAP 4Dx Plus, s-au folosit 3 picături de sânge integral, recoltat pe EDTA, folosind pipeta conținută de kit într-un tub Eppendorf de 2 ml peste care s-au adăugat 4 picături de conjugat, s-a omogenizat proba de 2-3 ori. Dispozitivul Snap s-a plasat orizontal apoi s-a adăugat amestecul de probă și conjugat în godeul special destinat probei. Aceasta a migrat până la cercul activator al testului, odată ajunsă proba în cercul activator, dispozitivul a fost activat.
Tehnologia SNAP pe principiul ELISA pentru probe sanguine:
Procedura de testare
1. Dacă kitul a fost ținut în frigider, se lasă la temperatura camerei (15-25 0C) să se echilibreze; componentele kitului nu se încălzesc.
2.Utilizând o pipeta din kit, se pun 3 picături de probă în tubul de reacție ;
3.Ținând flaconul vertical, se adaugă 4 picături de conjugat în tubul de reacție;
4. Se închide tubul și se amestecă prin inversarea acestuia de 3-5 ori;
5. . Se așează dispozitivul SNAP pe o suprafață orizontală. Se adăugă tot conținutul tubului în godeul pentru proba, având grijă să nu se verse conținutul tubului înafara godeului pentru probă;
Proba va migra către fereastră pentru rezultat în cercul activator în 30-60 de secunde.
6. La prima apariție a culorii în cercul activator se apasa activatorul ferm până când acesta este la nivelul întregului dispozitiv SNAP.
7. Testul se citește după 8 minute sau cu cititor Snapshot Dx®
Interpretarea rezultatelor
Rezultat pozitiv
Culoarea ce se dezvoltă în spot înafară de spotul de control, reprezintă o reacție pozitivă la una dintre boli ( un spot = o boală)
Rezultat negativ
Pe dispozitiv nu apare decât spotul de control .
Snapul poate fi citit cu ajutorul analizorului Snapshot Dx® Idexx.
3. Rezultate și discuții
3.1. Rezultate proprii
Cazurile evaluate hematologic au fost date în lucru înainte sau după celelalte forme de diagnostic discutate pentru verificarea severității stadiului de boală mai ales în ce privește gradul avansat de anemie dată în mod deosebit de Babesia spp.sau de nivelul de celularitate reactiva pe linia imunitară în prezența hemoparaziților (reacții leaucemoide).
Prevalența cazuisticii a înclinat în favoarea hemopatogenului Babesia spp., care în funcție de stadiul avansat și de gradul de infestație a determinat abordări terapeutice diferite, uneori mortalitatea fiind inevitabilă.
Hemoleucogramele efectuate au dat indiciile necesare astfel încât certitudinea statusului pacientului a fost de cele mai multe ori relevantă.
În diversitatea extrem de mare a stărilor patologice, atât din punct de vedere etiologic cât și patogenetic, modificările cantitative și calitative ale leucocitelor (leucocitoza, leucopenie,apariția de forme imature, forme cu structuri alterate) oglindesc diferite faze ale luptei și adaptării organismului la acțiunea agenților patogeni.
În babesioză, severitatea semnelor clinice este strâns legată de gradul de replicare al parazitului în eritrocitele gazdei, de liza celulară produsă, precum și patogenitatea tulpinii de Babesia spp.
Din punct de vedere hematologic, în infecțiile cu Babesia spp. s-au constatat prezența anemiei hipocrome normocitare, policromaziei, neutropeniei, anizocitozei, monocitozei, limfopeniei și trombocitopeniei.
La analiza hemogramei, s-au constatat prezenta anemiei hemolitice regenerative, scăderea volumului celular total și trombocitopenie.
Severitatea anemiei a variat în linii foarte largi, în unele cazuri a fost necesară chiar transfuzia. După administrarea tratamentului, la câteva zile, s-a constatat o creștere a numărului de trombocite, a hematocritului și a numărului total de leucocite.
QBC
Fig. 2. Hemoleucograma 3diff în caz de Dirofilaria spp. cu reacție inflamatorie și trombocitemie.
Fig. 3. Hemoleucograma 5 diff – citometrie în flux în caz cu Babesia spp. cu leucopenie și trombocitopenie
Din punct de vedere biochimic s-a observat prezența azotemiei renale, creșterea ALT, bilirubinei totale, ureei precum și tulburări acido-bazice în babesioza severă cu prezența acidozei metabolice și a alcalozei respiratorii. Deasemenea, s-a mai constatat prezenta anemiei hemolitice imun-mediate și a hemoglobinuriei.
În majoritatea cazurilor evaluate, febra a fost un indicator foarte important întâlnit la 80% din câini (20 /25 de cazuri). Deasemenea, majoritatea câinilor s-au prezentat la Clinica Facultății de Medicină Veterinară cu semne clinice precum: febră, letargie, inapetență, uneori hemoglobinurie.
Fig. 5.Panel preanestezic în caz cu Babesia spp. cu uremie și proteinemie
În cazul anaplasmozei, de exemplu, modificările apărute în analizele de laborator pot varia în faza acută a bolii. Acestea se pot dovedi a fi normale în cazul infecției persistente, în cazul purtătorilor latenți.
Cea mai comună modificare hematologică remarcată în cazul câinilor cu anaplasmoză ar fi trombocitopenia severă, apărută în cazul a mai mult de 80% dintre câinii infestați. În plus, câinii vor prezenta inițial și limfocitopenie care mai târziu se va transforma în limfocitoza reactivă.
Rareori apare și neutropenia. Uneori pot fi observate în neutrofilele circulante vacuolele intracitoplasmatice ale microorganismelor legate la membrana (morulae), și poate uneori și în eozinofile în cazuri acute. Poate apărea unoeri și o anemie ușoară aregenerativă.
În ce privește modificările biochimiei serice, acestea includ creșterea activității enzimatice a fosfatazei alcaline, precum și hipoalbuminemie și hiperfibrinogenemie.
De obicei, hipoalbuminemia se poate reface odată ce animalul este afebril.
În cazul ehrlichiozei, prognosticul câinilor infestați în stadiul cronic, este grav.
Shipov et al. (2008) au cercetat indicatorii prognosticului de mortalitate și de supraviețuire în ehrlichioza cainina. Au subliniat faptul că pancitopenia (WBC < 4 x 103 /uL; PCV <25%; precum și PLT <50 x 103 /uL) a constituit un factor de risc major în mortalitate. În același studiu, au subliniat că leucopenia (WBC <0,93 x 103 /uL), anemia severă (PCV <11, 5%), timpul de coagulare prelungit al tromboplastinei activate parțial (APTT > 18,25 s) și hipokalemia (K <3.65 mmol/L) putea fiecare să prevadă mortalitatea cu o probabilitate de 100%.
În mod opus, un WBC >5.18 x 103 /uL; PLT >89,5 x 103/uL; PCV >33,5%, APTT <14,5 s sau K >4,75 mmol/ L fiecare prevăd o probabilitate de 100% de supraviețuire.
Atunci când răspunsul clinic nu este rapid în cazul anaplasmozei și a ehrlichiozei canine, sau când semnele clinice persistă după tratamentul cu doxiciclină, câinele trebuie reexaminat pentru alte boli infecțioase sau boli cu aceleași semne clinice (neoplazii sau boli mediate imun).
Diagnosticul piroplasmozelor la câinii infectați cronic și cei purtători latenți, rămâne totuși o provocare majoră datorită lipsei parazitemiei, de multe ori intermitentă.
Evaluarea citomorfologică
Au fost testați 161 de câini, cărora li s-a făcut examenul citomorfologic din sânge integral și au fost identificați pozitiv cu Babesia spp., 102 câini, dintre care 6 câini au prezentat coinfectie cu Dirofilaria spp.
În urma examinării probelor de sânge integral din picătură lama/lamela au fost identificate microfilarii la 58 de câini din 161 de câini testați.
Fig. 6. Microscop optic EuroImmun EuroStar III Plus – ob 10x, 20x, 40x si 100x – imersie
Fig. 7.Microfilarii de Dirofilaria spp. – A.ob 10x picatură sânge lamă/lamelă; B. ob 40x frotiu sânge integral colorat MGG
Fig. 8. Hemoparaziții A.Ehrlichia spp. si B. Babesia spp. frotiuri citomorfologice sânge integral ob 100x – imersie.
Fig. 9. Frotiu citomorfologic sânge integral colorație MGG , ob 100x – imersie, coinfecție Dirofilaria spp. și Babesia spp.
În urma testării serologice a celor 161 de probe, cu ajutorul testului Snap 4Dx® Plus, s-au obținut 58 de probe pozitive la antigenul de D. immitis, dintre care o probă Ehrlichia canis anticorpi coinfecție cu D. immitis și o probă Anaplasma spp. anticorpi coinfecție cu D. immitis. Deasemenea s-a obținut o probă pozitivă doar pentru Ehrlichia canis anticorpi.
3.2. DISCUȚII
Ehrlichia canis este rickettsia responsabilă de ehrlichioza monocitară la câine la nivel mondial. Transmisă prin vectorul Riphicephalus sanguineous, aceasta căpușă se hrănește și inoculează boala. Microorganimele se replică în celulele sistemului fagocitar monocitar și pot fi întâlnite în limfocite, monocite sau macrofage. (Mylonakis et al., 2003).
Morulaele de E. ewingii pot fi găsite în mare parte, în neutrofile și arareori în eozinofile. Acestea sunt asemănătoare cu cele ale E. canis, deși uneori structura ei apare „împachetată” față de structură granulară punctată tipică a E. canis.
In cazul ehrlichiozei canine, diagnosticul în timpul infecției de fază acută, este dat de parazitemia prezentă la examenul frotiului de sânge integral sau din leucocitoconcentrat.
Ehrlichiile pot fi identificate și în neutrofilele prezente în probele de lichid sinovial de la câinii cu poliartrită.
Nu există un test serologic specific pentru E. ewingii, dar dă reacții încrucișate în serologie cu E. canis, detectabile la comun cu Snap 4Dx ®Plus.
Diferențierea celor două subspecii de Ehrlichia spp. din probele seropozitive se realizează cu ajutorul metodei PCR, metodă recomandată și în verificările ulterioare după terminarea tratamentului.
Anaplasmoza dată de microorganismele genului Anaplasma infectează eritrocitele producând anemie hemolitica (A. marginale), granulocitele (A. phagocytophilum și/sau plachetele (A. platys). Pentru varietatea din urmă, anemia nu este un semn clinic definitoriu al infecției.
Semnele clinice manifestate la câine nu sunt specifice și includ febră, anorexia, apatie, limfoadenopatie și splenomegalie. Unii câini pot manifesta poliartrita neutrofilica sau semne neurologice acute, incluzând crize epileptiforme.
Apare trombocitopenia, în tabloul hematologic, modificarea principală în majoritatea cazurilor. Poate apărea o anemie usoară sau aregenerativă. Morulaele sunt asemănătoare cu cele de la E. ewingii și pot fi observate în neutrofile în cazul parazitemiei apărute în timpul fazei acute a infecției.
Anaplasmoza canină neutrofilica se produce sindrom de febrilitate acută ce prezintă trombocitopenie, neutropenie și anemie, este atribuită Anaplasma phagocytophilum, în timp ce anaplasmoza trombocitara, caracterizată prin trombocitopenie ciclică, este produsă de A. platys.
Metodele serologice rapide nu fac diferențiere între anaplosmoza neutrofilică și cea trombocitară, iar clinicienii se bazează mai mult pe originea endemică pentru stabilirea abordării terapeutice: A. phagocytophilum în regiunile nordice și A. platys în regiunile sudice. Testarea serologică (IFA) folosind antigen de cultură de A. phagocytophilum există la îndemână în diverse laboratoare. IFA în schimb nu este disponibilă și pentru A. platys decât dacă se folosește antigen din sângele câinilor infectați deja. Ȋn testarea cu Snap 4 Dx® Idexx, creat pentru detectarea anticorpilor de E. canis, A. phagocytophilum sau A. platys, B. burgdorferi, precum și antigenului anti D. immitis, diverse studii serologice au aratat că anumite peptide derivate sintetic nu au specificitate mare de specie. Peptidele A. phagocytophilum vor interacționa cu serul câinilor infectați cu A. platys. Trebuie subliniat faptul că un rezultat negativ pe PCR, nu garantează că animalul este lipsit complet de infecția cu respectivul microorganism. În concluzie, PCRul este folositor pentru monitorizarea câinilor tratați pentru aceste boli, deorece surprinde prezența ADNului patogenului, indiferent de titrul serologic al anticorpilor. Testarea PCR pentru speciile de Anaplasma folosind genele tinta 16SrARN, GroEl sau p44, poate fi utilizată în detectarea ADNului Anaplasmei în sângele integral al animalelor infestate. După terminarea terapiei cu doxiciclina, testarea cu metoda PCR oferă clinicianului încrederea că terapia a fost eficientă și ideea că acel câine nu intra în etapa subclinică. Trebuie subliniat faptul că un rezultat negativ pe PCR, nu garantează că animalul este lipsit complet de infecția cu respectivul microorganism. Există 2 scopuri în vederea testării prin PCR la câteva săptămâni după terminarea tratamentului.Unul ar fi minimizarea probabilității de a obține un rezultat fals- negativ, datorită efectelor antibioticului asupra bacteriemiei. Al doilea ar fi minimizarea șansei de a detecta ADNul patogenilor morți care continua să circule în timpul perioadei de tratament. În concluzie, PCRul este folositor pentru monitorizarea câinilor tratați pentru aceste boli, deorece surprinde prezenta ADNului patogenului, indiferent de titrul serologic al anticorpilor. Deși această tehnică este mai sensibilă decât serologia în confirmarea unei infecții, eficiența sa poate fi limitată în detectarea patogenilor în faza subclinică la câinii infestați, deoarece microorganismul poate circula intermitent în sângele periferic. Ca atare, analiza cu PCR nu ar trebui considerată metodă definitivă în excluderea infecției subclinice la câinii clinic sănătoși ce rămân seropozitivi după tratament.
O prevalența a A. phagocytophilum (0.74 %) a fost întâlnită la căpușele Ixodes din Marea Britanie(Smith and Wall, 2013); ca urmare, au fost raportate și cazuri clinice. (Bexfield et al, 2005)
Sursa: D. D., Foley, J. E., Borjesson, D. L., & Sykes, J. E. (2009). Canine granulocytic anaplasmosis: a review. Journal of veterinary internal medicine,23(6), 1129-1141.
Borrelioza își regăsește numele din Connecticut, Statele Unite, unde simpotomele de poliartrita infecțioasă au fost descrise pentru prima dată la începutul anilor ’70.
De atunci, spirochetele de B. burgdorferi au fost identificate ca fiind agentul patogen al Bolii Lyme, fiind înregistrată ca producătoare de boală la diferite specii de animale.
Semnele clinice clasice pentru Boala Lyme apar în urma hrănirii căpușei, semne precum febră sau letargie, urmate de scădere al tonusului pe membre. Din păcate aceste semne nu sunt observate întotdeauna la timp și pot fi întâlnite și în alte boli, ceea ce îngreunează diagnosticul timpuriu al Bolii Lyme.
B. burgdorferi este asociată cu glomerulonefrita și semne neurologice, întâlnite într-un stadiu deja avansat al bolii. Semnele apar în aprozimativ o lună de la înțepătura și hrănirea căpușei; iar în cazurile experimentale a fost nevoie de o perioadă de 6 luni până la dezvoltarea respectivelor semne clinice.
În Marea Britanie, vectorul comun este Ixodes ricinus; B. burgdorferi a fost în schimb izolată și din alte specii de Ixodes spp., D reticulatus și Rhipicephalus sanguineus.
Primul caz documentat de Boala Lyme în Marea Britanie a fost raportat în 1990 (May et al, 1990); studiile pe PCR ale căpușelor păstrate la Muzeul de Istorie Națională atestă că prezența B. burgdorferi în căpușe datează din anii 1880, sugerând faptul că boala a fost prezenta cu multă înainte de a fi recunoscută (Hubbard et al, 1998).
Seropozitivitatea este mai mare în zonele rurale în comparație cu animalele ce locuiesc în zone urbane, precum și la animalele cu istoric cu mușcătură de căpușe (May et al, 1991).
În ciuda seropozitivizarii, foarte puține animale au dezvoltat semne clinice. Proporția exactă a animalelor ce dezvolta boala este necunoscută, dar se crede a fi un procentaj între 5 și 10% (Greene și Straubinger, 2006). O proporție mai mare este întâlnită la om, cu aproximativ 90% din oamenii cu Lyme dezvolta și semnele clinice (Litman et al, 2006).
Sursă: Bhide, M., Travnicek, M., Curlik, A., & Stefancikova, A. (2004). The importance of dogs în eco-epidemiology of Lyme borreliosis: a review.Veterinarni Medicina-UZPI (Czech Republic).
Testarea serologică dovedește expunerea la B. burgdorferi, dar dată fiind seropozitivitatea înaltă la animalele asimptomatice, un titru înalt trebuie stabilit cu repetarea analizei serologice la 2 și la 4 săptămâni mai târziu, sau prin folosirea metodei PCR pentru a stabili prezența parazitului în organism și nu doar expunerea la un anumit moment dat.
Deoarece spirochetele prefera invadarea unui organism prin țesuturi mai mult decât în fluxul sanguin, PCRul este specific, dar are sensibilitate joasă pentru a stabili un diagnostic cert.
Ca timp de transmitere a spirochetelor de la căpușă la individ, aceasta apare abia după 24 de ore de la inserția căpușei, dacă în acest timp este extrasă transmisia Borreliei este stopată.
În țările cu risc mare de expunere la căpușe există disponibile vaccinuri contra boreliozei la animale.
Babesioza
Babesioza canină este cauzată de paraziții intraeritrocitarii aparținători ai genului Babesia ce conține specii de dimensiuni mari precum B. canis, B. vogeli, B. rossi și specii mai mici precum B. gibsoni care își extinde tot mai mult arealul de răspândire (Birkenheuer A. et al., 2005).
Testarea serologică cu ajutorul kitului de imunofluorescență (IFAT) sau ELISA nu s-a dovedit a fi utilă, mai ales in timpul fazei acute a infestației cu Babesia spp. din cauza reacțiilor încrucișate ce pot aparea intre diferitele specii și subspecii de babesii.
Sunt studiate noi metode de diagnostic immunologic ce se bazează pe tehnologia antigenelor recombinate cu specificitate înaltă. (Irwin PJ, 2009).
Testele serologice în babesioză îsi găsesc utilitatea în formele cronice ale bolii, atunci când paraziții pot lipsi din frotiurile de sânge, sau sunt prezenți într-un număr foarte mic, citomorfologia rămânând testul cel mai simplu și cel mai accesibil pentru diagnosticul hemoparaziților intraeritrocitari în frotiuri colorate MGG/ DiffQuick Rezultatele infestării cu Babesia pot varia printr-o paletă de semne clinice ce pot varia și în fuctie de tulpina prezentă. Majoritatea semnelor reies în urma anemiei hemolitice sau în urma răspunsului sistemic inflamator sau insuficiente multiple ale organelor interne.
Diagnosticul babesiozei canine este dat cu certitudine demonstrând prezența organismelor ce infestează hematiile, în cazul B. canis formând perechi de organisme piriforme.
Recoltarea de sânge făcută din patul capilar (lobul urechii, pernița falanga), ajuta la identificarea unui număr mai mare de microorganisme. PCRul este cel mai sensibil și specific mod pentru diagnosticul infecției, permite deasemeni și determinarea speciilor prezente în fluxul sanguine.
Un studiu PCR a 742 de căpușe recoltate din diferite zone ale Marii Britanii a relatat prezenta ADNului Babesiei gibsoni în 11 căpușe I. ricinus (Smith and Wall, 2013).
Această descoperire este totuși surprinzătoare deoarece B. gibsoni este rar întâlnită în cazuistica europeană și nu s-a mai înregistrat prezența ei în populația de căpușe de pe teritoriul Marii Britanii.
Teritoriul ei se extinde, cu 2 cazuri de B. gibsoni raportate în Germania (Hartelt et al, 2007).
Dirofilarioza
În România, prevalența speciei Dirofilaria immitis a fost și este diferită în funcție de autorii studiilor, fiind cuprinsă între 23,07 și 65 %. Astfel sunt citate următoarele răspândiri geografice: Olteanu, în anul 1996, a redat o prevalență de 65%, Coman și colaboratorii, în anul 2007, 23,07%, Tudor și colaboratorii, în anul 2008 atestă o prevalență de 29.31%, iar în vestul țării Ilie și col., Ciocan și col., Godeanu, raportau 4,25%-8%.
În Italia, D. immitis este endemică în nord, dar s-a răspândit în toată țara, ceea ce arata o continua expansivitate a prezenței parazitului, fapt regăsit în multitudinea de cazuri de infecție cu dirofilarioaza la câine și pisica raportate mai ales în Sudul Italiei. (Otranto et al., 2009; Traversă et al., 2010). În timp ce ultimele studii au arătat prevalența cu precădere în zona de nord endemica a Italiei (6.12%; Piccini and Carreri, 2010), focare de dirofilarioza canina erau descrise și în zona centrală implicând Toscana și Umbria, considerate în prima instanță ne-endemice până în 1999 (Piergilli- Fioretti et al., 2003; Mortarino et al., 2008). Ulterior și aceste zone au devenit endemice (Piergilli – Fioretti et al., 2003; Mortarino et al., 2008; Magi et al., 2011). În Umbria, zona centrală, limitele de prevalența se încadrau între 5 și 15%. În Toscana, s-a raportat o prevalență de 12,5%. (Mortarino et al., 2008, Magi et al., 2011).
Ulterior, D. immitis a fost detectată la câini din zone ne-endemice precum Abruzzo, în apropiere de Umbria și Lazzio (Paoletti et al, 2008), cu o prevalență de 2,3 și 0.3% la câini și pisici autohtoni. Într-un alt studiu, au fost recoltate probe de sânge din diferite zone sudice ale Italiei, în Aquila având o prevalență de 0.24 și 2.57% în timp ce în regiunea Calabriei, prevalența a fost de 3, 43% (Otranto et al., 2009). În Sardinia, unde prevalența era totuși redusă în trecut (<2%), s-a înregistrat o creștere de până la 17 % în centrul vestic al insulei (Scala et al, 2004).
Infecțiile cu D. immitis la pisici au fost diagnosticate mai ales în nordul Italiei unde prevalența se încadrează între 7 și 24%, depinzând de localizare, în zona hiperendemica Valea râului Po (Kramer and Genchi, 2002; Genchi et al., 2008). În centrul Italiei este raportată o prevalență de 23,5% în rândul pisicilor din Toscana (Magi et al., 2002). Tot aici, studiile epidemiologice au raportat prezenta în formă adultă a D. immitis între 6.06 și 7.1% în rândul vulpilor studiate (Magi et al., 2008, 2009).
Pentru prima dată, a fost descris primul diagnostic de infecției cu forma adultă a filariilor de D. immitis și prezența microfilariilor la o felină exotică (Panthera pardus pardus) în nord-estul Italiei (Mazzariol et al.2010). Un alt caz de dirofilarioza a fost raportat la un lup în sudul Italiei (Pascucci et al., 2007).
În Spania, un studiu epidemiologic din 2006, raportează o prevalență destul de mare pe coasta mediteraneană (18% în Alicante, 9% în Murcia) și pe insula Ibiza (39%;Rodes, 2006), în timp ce în Mallorca abia de curând a fost raportat un caz de dirofilarioza la un câine ce a călătorit dinafară insulei (Makowski et al., 2010).
Alt studiu arata o prevalență de 2% în Barcelona, 0,85% în Tarragona și 0,3% în Mallorca (Solano- Gallego et al., 2006). În centrul Peninsulei Iberice, prevalența de 8% se remarcă în Aganda del Rey, 24% Azuqueca de Henares și 10% în Guadalajara, zone influențate de prezența râurilor Henares, Jarama și Tajuna (Gomez- Bautista și Ortega – Mora, 2002).
Într-un studiu condus în Salamanca între anii 2009 și 2009, s-a observat o prevalență de 29.08%, similară situația cu cea raportată acum 20 de ani (Morchon et al., 2011). Deasemeni, pentru prima dată prevalente semnificative ale D. immitis au fost remarcate în 2 provincii din Nord: 12% în La Rioja și 4,2% în La Coruna (Simon et al.,2009; Morchon et al, 2010).
Pe insula Gran Canaria, prevalența câinilor cu dirofilarioza a scăzut de la 23,87% în 2002 (Sosa et al., 2002) la 19,2% în 2010 (Montoya – Alonso et al., 2011).
Pe insula Tenerife, prevalența rămâne constantă de la 22,3% în 2001 la 21% în 2006 (Morales et al., 2001; Montoya et al., 2006). În ce privește dirofilarioza felină, în Gran Canaria 2 studii seroepidemiologice au arătat o creștere a prevalentei de la 18,3% la 33% între anii 2004 și 2011 (Morchon et al., 2004; Montoya – Alonso et al.,2011).
În 2006, este descris primul diagnostic de infecție cu D. immitis la un leu african (Panthera leo) născut și crescut în Alicante (Ruiz de Ybanez et al., 2006).
Deasemeni un alt diagnostic de D. immitis a fost raportat la o vulpe din nord-estul Spaniei (Mânaș et al., 2005).
Un alt studiu condus pe vidră europeană (Lutra lutra), 48 de vidre luate în studiu din diferite regiuni ale Peninsulei Iberice au fost examinate, rapostandu-se o prevalență de 2,1% a prezenței D.immitis (Torres et al., 2004).
În Portugalia, în 2011 prevalența cazurilor canine în nordul și centrul nordic a fost de 2,1% (Balreira et al., 2011), cu cele mai mari prevalente în Aveiro (6,8%) și Coimbra (8,8%).
Încă nu a exista raportate în literatura de specialitate cazuri în sudul Portugaliei pe câini, dar la 2 vidre europene (L. lutra) din Alentejo, s-a găsit D. immitis (Torres et al., 2004). La feline, un studiu tot pe regiunea de nord și central nordică a Portugaliei, se raportează o seroprevalența de 17.51% (Viera et al., 2011).
În Franța, în 2009, se raportează o prevalență pe canide de 0,22% într-un studiu condus pe aproape întreg teritoriul, rezultate pozitive au venit din Corsica și Boches – du – Rhone, în sudul Franței; prevalența locală în regiunea Bouches du Rhone este de 2,1% și chiar mai mare la nivel local în Corsica (12,5%; Pantchev et al., 2009).
În același timp, un alt studiu s-a desfășurat pe câinii cu simptomatologie tipică infecției cu D. immitis. În acest grup, D. immitis este confirmat la 6,78% dintre câini. Dintre aceștia, majoritatea au fost din sudul Franței, cu o prevalență locală de 27,3% în Corsica și 22,2% în Bouches- du- Rhone, și doua 2 cazuri pozitive din părțile nordice ale țării venite dinafară granițelor; unul adus din Martinica și altul din Guyana Franceza (Pantchev et al., 2009). Autorii acestui studiu au sugerat faptul că o expansiune a endemiei D.immitis nu s-a înregistrat între partea sudică spre cea nordică a Franței, deasemenea indicând faptul că în zonele din sudul țării, toți câinii prezintă risc înalt de infestare cu D. immitis.
În Grecia, deși în 2001, prevalența găsită în regiunea Attiki, în sudul țării, era de 0,7% (Diaku, 2001), alte studii conduse în 2003, au raportat infecții cu D. immitis într-un procent de 13,1% pe studii din diverse medii și zone ale Atenei, în provincia Attiki (Jensen et al., 2003). Până atunci, boala era considerată endemica doar în părțile de sud ale țării. Lafkaditis și Koukeri (2005) au raportat faptul că dirofilarioza este o boală parazitara comună în Thessaloniki și un alt studiu recent arata că există o prevalență de 17,9% a D. immitis la canidele ce trăiesc în estul mai joase ale Muntelui Olimp în nordul Greciei (Lefkaditis et al., 2010).
În Turcia, boala este foarte răspândită arătând prevalente între 1% și 27%. În Istanbul, infecția afectează 1,52% dintre câini (Oncel and Vural, 2005), 2% în zona Gemlik a Bursei (Civelek et al., 2007), 9,6% în provincia Kayseri (Yildirim et al., 2007) și 26% în provincia Hatay. Un studiu condus de Simsek et al. (2008) raportează prevalente de 14,8% în Ankara, 12,3% în Sakarya, 10,5% în Mersin și 18,3% în Kocaeli.
Deasemeni, în zona Kirikkale au fost relatate cazuri pozitive (58% dintre câinii infectați prezentau microfilarii și 27,46% dintre ei nu prezentau microfilarii; Yildiz et al., 2008).
În Germania, s-a rapostat un număr în continuă creștere a câinilor infestați, cele mai multe cazuri importate din zone endemice. Între 2005 și 2006, prevalența era de 1,2% (5.483 probe de sânge au fost incluse în studiu; Hirsch and Pantchev, 2008), între 2008 și 2010 a fost de 1,49% (8.545 de probe incluse în studiu), dintre care 30% au prezentat microfilarii, între 2009 și 2010, prevalența era de 2,6% (Pantchev et al., 2009, 2011). Nu este considerată o țară endemica, deoarece toate cazurile pozitive raportate au fost pe animale importate, multe dintre ele venite din Corfu, Sardinia, Bulgaria, Ungaria și Insulele Canare.
În Marea Britanie sunt diagnosticate cazuri izolate. Un caz a fost diagnosticat ca fiind pozitiv, dar nu a fost înregistrat ca fiind autohton pentru că nu se știe dacă a călătorit în una dintre zonele endemice apropiate (Traversa et al., 2010).
În Bulgaria, între anii 2001 și 2006, 6,6% dintre câinii studiați au fost pozitivi, dintre care 8,62% cu prezența de microfilarii în sângele circulant (Kostadinov, 2007). În această țară, dirofilarioza canină este considerată boala endemică. În mod excepțional, a fost raportată prezenta D. immitis la vulpi (3%) și șacali (8,9%; Kirkova et al., 2007).
În Ungaria, doua studii publicate au raportat 2 câini infestați, unul constitue primul caz autohton diagnosticat, fapt ce trece Ungaria în rândul țărilor endemice (Farkas, 2003; Jacso et al., 2009).
În Croația și Serbia, câteva studii demonstrează prezenta dirofilariozei ca și boala endemică în aceste țări cu risc de răspândire. În Serbia, între anii 2006 și 2007 prevalența raportată era de 7,2%, cu precădere în regiunile Vojvodina și Branicevo cu 7,2, respectiv 3,17% (Zivicnjak et al., 2006; Dimitrijevic et al., 2007; Tasic et al., 2008). În regiunea Belgradului, câțiva ani mai târziu, era de 22,01%, studiu ce relevă și co-infectia într-un procent de 3,97% cu D. repens. În Kosovo, prevalența era de 9%, iar în regiunile nordice ale țării crește către 6,57% atingând și 16,1% în anumite zone (Lazri et al., 2008).
În peninsula Istria prevalența dirofilariozei atinge 16 și 8% în zonele din sud. În sudul Slovaciei, între anii 2007 și 2008, doua studii arata infecții cu D. immitis la 10 câini co-infectați cu D.repens (Miterpakova et al., 2010).
În Republica Ceha, Svobodova et al. (2002) releva primul caz autohton de dirofilarioza canina, atestând intrarea în rândul țărilor endemice. Doi ani mai târziu, au fost diagnosticați 89 de exmplare pozitive, dintre care unul singur importat dintr-o zonă endemică (Svobodova and Misonova, 2005). Dobesova et al. (2007) raportează o prevalență de 6,7%, iar coinfecție cu D. repens de 2,7% dintre câinii testați, probe recoltate de la câini din apropierea Austriei și Slavaciei.
În Albania, între anii 2007 și 2008, prevalența era de 3% în zona Tiranei și 7% în probele recoltate intre Albania și Kosovo (Lazri et al., Hamlet et al., 2009).
În Rusia, dirofilarioza este considerată încă în plină descoperire și creștere a numărului de cazuri. Numeroase cazuri au apărut în centrul țării și în zonele de sud.
În regiunea Moscovei, dirofilarioza canina a fost raportată în 33 districte, toate în co-infectie cu D. repens (Supriaga et al., 2011) și în regiunea Rostov (sudul Rusiei), între anii 2002 și 2009, 6,1% dintre exemplarele canine studiate prezentau D. immitis, 5% dintre ei cu co-infectie cu D. repens și prezența de microfilarii (Kartashev et al., 2011); în prezent, Rostov este considerată zonă endemică.
4. Direcții ulterioare de cercetare
Directiile ulterioare ale cercetarii vizeaza caracterizarea prin metode de biologie moleculara a speciilor identificate anterior prin tehnicile de serologie si imunoenzimatice.
Diagnostic molecular – PCR-ul convențional și alte metode
Reacția PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacție de Polimerizare în Lanț) este o metodă de amplificare enzimatică în vitro a unei anumite secvențe de ADN, constând în generarea rapidă a unor copii multiple a unei secvențe nucleotidice țintă( ADN sau ARN) dintr-o genă de interes sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode. Numărul de copii ale secvenței țintă crește exponențial cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare secvență nucleotidică nou sintetizată constituie o matriță pentru noua copie. Produsul PCR care reprezintă o copie a ADN/ARN țintă original este numit amplicon. Această metodă permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentrații foarte scăzute ale secvenței țintă.
În etapa următoare a studiului se vor folosi metode de diagnostic molecular utilizând probele prelucrate serologic, hematologic și citologic, stocate la -20 °C.
Deși PCR-ul a crescut cu mult sensibilitatea și specificitatea detecției parazitului și este potrivit pentru studii epidemiologice și filogenetice, este încă limitat accesul la tehnicile moleculare pentru diagnosticul clinic de rutină în babesioza caninã și se practică doar în câteva laboratoare specializate din lume.
Abilitatea PCR-ului de a detecta ADN-ul parazitului la animalele infectate cronic poate fi îmbunătățit prin testarea repetată în ocazii diferite, dar este recomandată testarea serologică ca alternativă, ca test complementar de diagnostic.
Testarea serologică – IFAT
În continuare, se va urmări și un screening al prezenței hemoparazitilor la pisici, urmând a fi folosite metode de imunofluorescența pentru depistarea Mycoplasmei haemofelis și Bartonella spp., cât și Mycoplasma haemocanis și a Bartonella spp. la câine.
CLINICO-PATHOLOGICAL FINDINGS IN VECTOR-BORNE PATHOGEN
CO-INFECTIONS IN DOGS, FROM BUCHAREST AREA
Abstract
Canine Vector Borne Diseases (CVBD) have a worldwide impact as some are of zoonotic concern and they lead to a variety of serious infections mostly classified by their vectors. The pathogens co-infecting the dogs are linked to their associated vector agents and with their natural habitat. Dogs with clinical signs compatible for VBDs should be tested for more than one pathogen as the signs may be often non- specific and they may vary from one individual to another. Co-infections may potentiate the disease pathogenesis, thereby changing clinical manifestations associated with singular infections. Seven cases were selected among dogs referred in the Veterinary Clinic, Faculty of Veterinary Medicine of Bucharest during of 2016, showing clinical signs compatible with VBD. They were serologically-positive for more than one pathogen. The seroreactivity revealed co-infections in dogs with four arthropod-borne pathogens: Dirofilaria immitis + Anaplasma spp. (3 dogs), D. immitis + Erlichia canis (2 dogs), E. canis + Borelia burgdorferi (1 dog ) and E. canis + Anaplasma spp. (1 dog). One dog, serological positive for D. immitis and A. phagocytophilum, was also positive for Babesia canis, detected in the blood smear.
The present study emphasizes the chalenge of the diagnostic, therapeutics and management of co-infected dogs and illustrates the correlation between clinical aspects that the dogs are first presented with and the full panel of paraclinical investigations like imagistical (radiography, ultrasonography) and the blood analyses (haematology, biochemistry, citology and serology).
Keywords: Co-infection, canine vector borne diseases, dogs.
INTRODUCTION
According to WHO, there are more than 200 emergent and re-emergent zoonoses, of which almost 10 canine vector borne diseases (CVBDs), including Lyme disease, that appears to be the most common in Europe (WHO, 2014).
Climate change, together with increasing movement of dogs across , have caused an increase in the geographical range of more vector borne diseases (Genchi, 2011b).
Among the vectors transmitting disease-causing pathogens, ticks play an important role as they can harbore multiple disease causing agents, sometimes completely different pathogens (Shaw et al., 2001).
The risk of exposure to ticks, mosquitoes and fleas is bigger for dogs. They can be infested with hundreds of ticks and sometimes with different tick species in the same time, therefore concurrent infections with multiple vector borne pathogens may occur (Otranto et al., 2009a).
Dogs are reservoir hosts for several arthropod-borne pathogens, some of which are of major zoonotic concern (Beugnet, 2009) and they can be infected with a large number of vector-borne pathogens such as Hepatozoon canis, Ehrlichia canis, Anaplasma platys, A. phagocytophilum, Babesia canis, B. vogeli, Bartonella spp, Borrelia burgdorferi, Leishmania infantum, Dirofilaria repens and D. immitis (de Caprariis et al.,2011).
Some arthropods are competent vectors of more than one pathogen. Thus, dogs might be exposed to vectors infected with single pathogens at different points in time or to vectors concurrently infected with multiple pathogens, favoring the occurrence of co-infections (Otranto et al., 2009b).
Studies regarding seroprevalence, revealed that dogs from are potentially at risk of major canine vector-borne diseases because of the relatively high prevalence rates of both mosquito and tick-borne pathogens in dogs (Ionita et al., 2012; Mircean et al., 2012).
The diverse tick fauna as well as the abundance of tick populations in Romania represent potential risks for both human and animal health (Ionita et al., 2016).
Anamnesis and search for specific clinical signs, along with laboratory results (biochemistry and hematology) are the key for aproaching an accurate diagnostic. These findings can be modified by the presence of a co-infection.
Therefore, in this study clinico-pathological findings from CVBDs co-infected dogs are described.
MATERIALS AND METHODS
The study describes clinical and hematological findings in seven dogs that were presented in the Veterinary Clinic, Faculty of Veterinary Medicine of Bucharest during of 2016 and were positive for more than one vector borne pathogen.
Dogs showing clinical signs compatible for VBDs were subjected for routine clinical examination, followed by blood analysis (biochemical, hematological and serological investigations), radiography and ultrasonography.
Whole blood EDTA samples were collected and tested for some selected CVBDs using blood smears and serological tests (SNAP®4Dx® Plus from Idexx Laboratories). Li-heparine tubes were used for collecting blood and biochemistry analysis was performed from plasma.
The SNAP 4Dx Plus test is an in-clinic enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) commercial kit for the detection of Dirofilaria immitis antigen and antibodies for Anaplasma phagocytophilum / Anaplasma platys, Ehrlichia canis, Ehrlichia ewingii, and Borrelia burgdorferi.
RESULTS
Serological evaluation revealed co-infections in seven dogs with four different arthropod-borne pathogens: D. immitis + Anaplasma spp. (3 dogs), D. immitis + E. canis (2 dogs), E. canis + B. burgdorferi (1 dog) and E. canis + Anaplasma spp. (1 dog). One dog, serological positive for D. immitis + A. phagocytophilum, Babesia canis was also positive, detected in the blood smear (Figure 1).
Dogs included in the study, displayed clinical signs compatible with VBDs, with the exception of one dog, presented for screening as a blood donor. The age ranged from 6 years to 14 years old. There were 5 mixed breed dogs, 1 Labrador Retriever and 1 Golden Retriever; among them, 4 were females and 3 were males.
Clinical signs in the dogs referred, included depression (2/7), fever (1/7), anorexia (2/7), weight loss (1/7), weakness (3/7), exercise intolerance (2/7), pale mucous membranes (1/7), lameness (1/7), coughing (3/7), respiratory difficulties (1/7), vomiting (2/7) and diarrhea (2/7).
The following laboratory abnormalities were registered: anemia, leucopenia, leucocytosis granulocytosis, trombocytopenia, eosinophilia, elevated liver enzymes, high blood urea nitrogen and high blood creatinine levels. (Table 1.)
Hematological parameters were determined, thus anemia and trombocytopenia were found in four dogs of seven, leucocitosis with neutrofilia in two dogs, eosinophilia in one dog and leucopenia in anoher two. Microfilaremia associated with D.immitis was present in three dogs of five serological positive, from the total seven.
In dogs with Ehrlichia spp. serological positive detected, quantitative and qualitative changes regarding leucocytes were observed as an inflammation response and antigenic stimulation (WBC >17 K/uL with Grans >13 K/uL).
Thrombocytopenia was present in four out of seven dogs, as a result of the development of anti-platelet antibodies in E. canis infections (three dogs) and in one dog co-infected with Anaplasma spp and D. immitis (PLT<175 K/uL).
The presence of triple infection, with D. immitis, A. phagocytophilum, and B. canis (fig. 1), was detected in one dog, mixed breed, male, 14 y.o with severe respiratory simptoms, anemia, leucopenia, and elevated liver enzymes.
One of the 7 dogs included in the study, was a 4 years old female, Labrador Retriever in a late stade of gestation, serological positive to Ehrlichia spp. and Anaplasma spp.
Dogs co-infected with E. canis, B. burgdorferi and A. platys / A. phagocytophilum were treated with doxycycline (10 mg/kg/day /PO) for more than 21 days.
In the case of the triple infection with D. immitis, A. phagocytophilum, and B. canis, the dog was treated with imidocarb dipropionate (4 mg/kg in a single dose) and supportive treatment was given to reduce the anemia. Doxycycline (10 mg/kg/day /PO) was also used. For co-infected dogs with D. immitis, a treatment with low dose ivermectine and microfilaricide combination was used.
DISCUSSIONS
Canine tick-borne pathogens have been documented in several European countries and revealed that A. phagocytophilum and Borrelia spp share the same tick vector – Ixodes ricinus (Straubinger et al., 2008). Another example of a shared vector is Rhipicephalus sanguineus, transmitting Babesia spp., Ehrlichia canis, A. platys and Rickettsia conorii, leading to co-infections with vector-borne pathogens in dogs.
In Romania, in a serological survey two cases of co-infection with A. phagocytophilum and E. canis were reported (Mircean et al., 2012). In a similar study, three cases of co-exposure to D. immitis and A. phagocytophilum and one case co-exposed to E. canis and A. phagocytophilum were displayed (Ionita et al., 2012).
In Romania, tick fauna is very diverse, with up to 20 species of hard ticks identified, with the most abundant and frequent species reported Ixodes ricinus, Dermacentor marginatus, Dermacentor reticulatus, Hyalomma marginatum, Rhipicephalus bursa and Rhiphicephalus sanguineus (Mihalca et al.,2015). The tick species found more frequent parasitizing dogs in urban area of Buharest, were reported R. sanguineus, D. reticulatus, and ocassionally I. ricinus (Ionita et al., 2013).
Other vectors responsible for CVBDs are represented by mosquitoes (Aedes spp, Anopheles spp, and Culex spp), implicated in transmitting D. immitis and D. repens.
Therefore, different combinations of vector-borne pathogens and their effect on the host, should be further investigated, as the possibilty of multiple vectorial capacity can occur. Co-infections might put the clinician in difficulty, as their expression vary from sick dogs to clinical healthy ones.
Serological assays do not differentiate between current and previous infections, when it comes for the detection for antibodies; Therefore, other confirmatory test are needed (e.g. PCR). Future studies should add new insights regarding molecular charecterization of vector-borne pathogens occuring in Romania.
The results in the present study supports the geographical expansion of canine vector borne diseases in Romania and that there is a challenge for the practioners when it comes for co-infections with CVB pathogens.
In this study, the hematologic results in infections with Anaplasma spp and E. canis were similar to those in other studies, as Mylonakis et al. reported (2004). Simultaneous infection with E. canis and Anaplasma spp in dogs resulted in a more pronounced anemia (HCT 23 % with HGB 6 g/dL) and thrombocytopenia compared to the single infection with either pathogen.
Also, co-infection with E. canis and Anaplasma spp appeared to result in a more persistent infection (Mylonakis et al., 2004).
A study conducted by Latrofa et al.(2016), sustained vertical transmission of A. platys during the early stages of gestation, and throughout its entire course, thus increasing the importance of screening for CVBDs in dogs.
Previous studies have shown that naturally infected clinically ill dogs, suspected of having either Lyme disease, granulocytic anaplasmosis, or both diseases, were nearly twice as likely to have antibodies to both Borrelia burgdorferi and A. phagocytophilum as compared to healthy dogs from the same region, suggesting that exposure to more than one pathogen may increase the possibility of disease expression (Beall et al., 2008).
Epidemiological studies performed in Europe, evaluated the seroprevalence of A. phagocytophilum in dogs between 3 to 57%, but serological cross-reactivity with other Anaplasma spp. (A. platys) can potentially cause an overestimation of the true seroprevalence (Sainz et al, 2015). In Romania, values regarding seroprevalence for Anaplasma spp varied from 5,5% to 16% (Mircean et al, 2012; Ionita et al., 2012).
More specific diagnostic methods, such as polymerase chain reaction (PCR) are necessary, due to cross-reactivty, particulary among members of the same genus ( Pantchev et al., 2010).
Table 1. Clinical signs, laboratory abnormalities and diagnostic test results in seven dogs co-infected with canine vector borne diseases causing pathogens
Fig.1. Blood smears of dog showing microfilaria and merozoites of large Babesia spp – a case with triple infection (B. canis, D. immitis and Anaplasma spp)
CONCLUSIONS
This study emphasizes the clinical difficulties associated with assigning a specific clinical sign or haematological abnormality to a particular canine vector-borne disease.
Monitoring the response for treatment is very important in dogs with severe hematological abnormalities and multiple infections, to improve the animal clinical status before treating for a specific vector-borne pathogen.
Assigning a specific treatment, needs a complete diagnostic aproach, remainig challenging to distinguish, disease from previous exposure to one or more vector-borne pathogens.
CAPITOLUL 1 – Diagnosticul etiologic al babesiozei canine
1.1. DIAGNOSTIC MICROSCOPIC
Frotiul de sânge reprezintă modalitatea de studiere a morfologiei elementelor celulare sangvine, orientează asupra cantității de hemoglobină, a numărului de leucocite și a numărului de trombocite. Totodată, în anumite situații, acesta reprezintă o modalitate simplă și expeditivă de evidențierea patogenilor cu localizare sanguină, inclusiv a babesiozei.
Materialul biologic necesar pentru analiză este reprezentat de sânge integral recoltat pe anticoagulant (EDTA). Recoltarea probei biologice se execută standard, cu respectarea condițiilor de asepsie și antisepsie. După recoltare sângele se omogenizează cu anticoagulantul prin inversie ușoară de 3-4 ori pentru evitarea coagulării parțiale și/sau totale. Se recomandă analiza cât mai rapidă a probei după recoltare, pentru evitarea generării de artefacte consecutiv hemolizei sau proceselor de autoliză.
1.1.1. Tehnica de lucru:
Se aplică o picătură de sânge (aproximativ 20-50µl), capilar sau venos din vacutainer, la capătul lamei și se întinde rapid, cât mai subțire și uniform, cu ajutorul lamei șlefuite ținută ușor înclinată (sub un unghi de 45 de grade) ce i se imprimă o ușoară mișcare de translație în lungimea lamei. Se usucă foarte repede prin agitare în aer (acest moment reprezintă o primă fixare). Un frotiu bun este întins subțire, uniform, are două laturi paralele și se sfârșește cu franjuri.
Colorația May Grunwald-Giemsa. Aceasta folosește un amestec de coloranți acizi, bazici și neutri, astfel că toate componentele celulelor sanguine se vor colora în funcție de afinitățile lor tinctoriale (colorație panoptică). Soluția May Grunwald colorează citoplasma granulocitelor și nu colorează bine nucleul, eritrocitul și granulocitele azurofile. Soluția Giemsa, colorează nucleul și granulocitele azurofile și evidențiază și paraziții sanguini.
Tehnica de colorare:
-se așază lamele pe suportul de colorare;
-se acoperă lamele cu soluție May Grunwald timp de 2-3 minute. În acest moment lamele sunt fixate;
-peste lamele acoperite cu soluție May Grunwald se pune aceiași cantitate de apă distilată. Se incubează 2 minute;
-se face extemporaneu soluție Giemsa diluata (1-2 picături la 1 ml apa distilată);
-se elimină de pe lame soluția May Grunwald și apoi se acoperă lamele cu soluție Giemsa diluata. Se incubează 25-30 minute;
-se îndepărtează excesul de colorant cu apă distilată și se usucă pe stativul de lame.
După colorare, frotiurile sunt examinate la microscop mai întâi la obiectiv cu rezoluție 40X și ulterior 100X – imersie, pentru identificarea hemoparaziților intracelulari.
1.2. IMPLEMENTAREA UNUI PROTOCOL DE DIAGNOSTIC PRIN REAL TIME PCR ȘI ANALIZĂ CURBE DE TOPIRE
1.2.1. Materialul biologic. Ca și în cazul examenului microscopic, și aici se utilizează sângele integral pe EDTA ca și probă biologică. Recoltarea se efectuează identic cu cea pentru examenul microscopic (de altfel, în practică, se utilizează aceiași probă biologică pentru ambele tipuri de teste). Spre deosebire de examenul microscopic însă, proba biologică nu trebuie să fie analizată imediat, nefiind influențată de procesele de degradare prin factori intrinseci (autoliză) sau extrinseci. Mai mult, se acceptă pentru analiză și probele cu fenomene de coagulare parțială sau/și totală.
1.2.2. Extracția acizilor nucleici. Designul și optimizarea extracției acizilor nucleici s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Moleculară și Analize Genetice al S.C. Farmacia Veterinară FMV S.R.L., fiind ales pentru această etapă un kit comercial – QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Tehnologia utilizată se bazează pe proprietățile de legare selectivă a membranei de silica a acizilor nucleici. Argumentele principale în alegerea acestui kit au fost următoarele:
kit universal extracție acizi nucleici (ADN și ARN viral, ADN bacterian), special conceput pentru diagnosticul veterinar;
bazat pe tehnologia membranei de silica (colonițe) si micro centrifugă pentru varianta manuală;
compatibilitate cu extracția acizilor nucleici dintr-o mare varietate de matrici biologice;
sânge integral (pana la 200µl/proba pentru sânge mamifer, pana la 25µl/proba pentru sânge aviar) stabilizat pe anticoagulanții uzual folosiți (EDTA, heparina sau citrat);
ser, plasma;
fluide cavitare (ex. peritoneal, sinovial, cerebrospinal, epanșamente)
lavaje (ex. bronhoalveolar)
matrici biologice dificile (ex. urină, fecale)
țesuturi
tampoane (ex. nazale, oro-faringiene, cloacale)
protocoale personalizate pentru extracția ARN din țesuturi problematice (ex. creier, pancreas, țesut adipos) si extracția ADN din bacteriile greu de lizat (ex. Gram pozitive)
volumul maxim de proba ce poate fi procesata – 200µl, indiferent de concentrația probei
conține proteinază K pentru digestia enzimatica a probei biologice, stabila la temperatura camerei;
incubarea cu proteinază se efectuează la temperatura camerei (nu este necesara incubarea la temperaturi înalte – pentru a preveni degradarea acizilor nucleici)
volum de eluție flexibil (50 – 150µl)
compatibil cu extracția simultana a unui control intern exogen (pentru ARN si/sau ADN) pentru monitorizarea eficientei extracției
toți reagenții pot fi păstrați la temperatura camerei înainte si după reconstituire
Protocolul de extracție ales a fost unul de tip standard, conform recomandărilor producătorului, cu procesarea de 200µl probă biologică și eluția în 100µl volum final (Tabelul 1)
Tabelul 1
Protocolul de extracție acizi nucleici utilizat
Nucleic acids extraction protocol
1. Pregătire kit extracție
2. Extracție ADN
1.2.3. Alegerea regiunii genice pentru amplificare, designul primerilor. Regiunea genică aleasă pentru amplificare a fost reprezentată de ARN-ul ribozomal 18S, conform datelor din literatură care sugerează pretabilitatea acesteia în identificarea și caracterizarea speciilor de babesia. S-a reușit astfel identificarea unor primeri de gen, care să amplifice toate speciile implicate în patologie la câine (Canis, Vogeli, Gibsoni, Rossi) (Figura 1), cât și identificarea unor primeri specifici pentru identificarea selectivă a fiecărei specii în parte (Figurile 2, 3, 4). Designul tuturor primerilor a ținut cont inclusiv de secvențele românești din băncile de date internaționale (GenBank, SUA), fiind analizate 20 de astfel de secvențe, conform Tabelului 2. Toate analizele au fost efectuate cu programe de bioinformatică dedicate (Clustal W, BioEdit Sequence Editor).
Figura 1 – alinierea primerilor universali cu secvențele de referință pentru B. canis, B. vogeli, B. gibsoni și B rossi
Figure 1 – Universal primers alignment with reference sequences for B. canis, B. vogeli, B. gibsoni and B rossi
Figura 2 – alinierea primerului antisens specific pentru Babesia vogeli cu secvențele de referință pentru B. canis, B. vogeli, B. gibsoni și B rossi. Se constată complementaritatea exclusiv cu secvența de referință pentru B vogeli
Figure 2 – reverse primer for Babesia vogeli alignment with reference sequences for B. canis, B. vogeli, B. gibsoni and B rossi. Exclusive complementarity with B vogeli is shown.
Figura 3 – alinierea primerilor antisens specifici pentru Babesia canis cu secvențele de referință pentru B. canis, B. vogeli, B. gibsoni și B rossi. Se constată complementaritatea cumulată exclusiv cu secvențele de referință pentru B canis
Figure 3 – reverse primers for Babesia canis alignment with reference sequences for B. canis, B. vogeli, B. gibsoni and B rossi. Exclusive cumulative complementarity with B canis is shown.
Figura 4 – alinierea primerului antisens specific pentru Babesia gibsoni cu secvențele de referință pentru B. canis, B. vogeli, B. gibsoni și B rossi. Se constată complementaritatea exclusiv cu secvența de referință pentru B gibsoni
Figure 4 – reverse primer for Babesia gibsoni alignment with reference sequences for B. canis, B. vogeli, B. gibsoni and B rossi. Exclusive complementarity with B gibsoni is shown.
Tabelul 2
Secvențele românești de babesia analizate
Analyzed romanian babesia sequences
1.2.4. Amplificarea, detecția și caracterizarea acizilor nucleici. Designul și optimizarea amplificării acizilor nucleici s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Moleculară și Analize Genetice al S.C. Farmacia Veterinară FMV S.R.L., fiind utilizat un kit comercial – QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Argumentele principale în alegerea acestui kit au fost următoarele:
kit gata de utilizare, toate componentele sunt livrate într-un singur tub (excepție primerii specifici);
temperatura de aliniere primeri universală (60°C), indiferent de temperatura de topire a acestora, astfel ca se poate utiliza un singur protocol de amplificare pentru toate experimentele;
volum final flexibil, inclusiv 20µl (volumul optim pentru aparatura existentă în laborator);
posibilitatea de depozitare la temperaturi de refrigerare (2-8°C) pentru o perioadăde cîteva luni;
compatibil cu protocoale termice de tip standard sau fast
optimizare minimă a diagnosticului.
Profilul termic al reacției utilizat a fost realizat conform recomandărilor producătorului, cu includerea unei etape inițiale de denaturare ADN și activare polimerază (polimerazăde tip hot start), ulterior reacția PCR urmată de efectuarea curbelor de topire și analiză (Figura 5). Componența reacției este redată în Tabelul 3. Pentru amplificare s-a utilizat sistemul LightCycler model 2.0 (Roche Applied Science, Penzberg, Germania – Figura 6) .
Tabelul 3
Efectuaea mixului enzimatic pentru amplificare și caracterizare
PCR mix for amplification and characterization
Figura 5 – profilul termic de amplificare și detecție babesia
Figure 5 – thermal profile for babesia amplification and detection
Figura 6 – Sistem Real Time PCR LightCycler model 2.0
Figure 5 – LightCycler 2.0 RealTime PCR system
1.2.5. Detecția și caracterizarea acizilor nucleici s-a realizat prin utilizarea softului dedicat sistemului de amplificare, analiza fiind efectuată atât în ceea ce privește curbele de amplificare cât și curbele de topire. Rezultatele obținute arată o sensibilitate și specificitate adecvată atât pentru protocolul de detecție Babesia spp. cât și pentru tipizarea și consecutiv identificarea fiecărei specii patogene pentru câine (Figurile 7-9). Rezultatele exprimate cifric sunt prezentate în tabelele 4-6.
Figura 7 – Imaginea superioară = curbele de amplificare pentru protocolul de identificare Babesia spp. (albastru) și Babesia gibsoni (roșu). Imaginea inferioară = curbele de topire pentru protocolul de identificare Babesia spp. (albastru) și Babesia gibsoni (roșu)
Figure 7 – Upper image = amplification curves for Babesia spp. (blue) and babesia gibsoni (red). Lower image = melting curves for Babesia spp. (blue) and babesia gibsoni (red)
Figura 8 – Imaginea superioară = curbele de amplificare pentru protocolul de identificare Babesia canis. Imaginea inferioară = curbele de topire pentru protocolul de identificare Babesia canis
Figure 8 – Upper image = amplification curves for Babesia canis. Lower image = melting curves for Babesia canis
Figura 9 – Imaginea superioară = curbele de amplificare pentru protocolul de identificare Babesia vogeli. Imaginea inferioară = curbele de topire pentru protocolul de identificare Babesia vogeli
Figure 9 – Upper image = amplification curves for Babesia vogeli. Lower image = melting curves for Babesia vogeli.
Tabelul 4
Valorile cifrice obținute pentru curbele de amplificare și curbele de topire
Values obtained for the ampliofication and melting curves
1.3. DIAGNOSTICUL ETIOLOGIC AL BABESIOZEI CANINE
1.3.1. Probe biologice. Probele biologice analizate au fost reprezentate de sânge integral pe EDTA recoltat conform recomandărilor anterioare. Pentru examenul microscopic acestea au fost analizate imediat după recoltare, iar pentru analizele de biologie moleculară probele au fost depozitate în recipientul original la -20°C până la analiză.
1.3.2. Examenul microscopic. A fost efectuat conform protocolului de diagnostic anterior descris. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 5.
Tabelul 5
Rezultatele obținute prin examinarea microscopică
Microscopic examination results
1.3.2. Amplificarea și detecția prin RealTime PCR și analiză curbe topire. A fost efectuat conform protocolului de diagnostic anterior descris. Din moment ce probele au fost pozitive la examenul microscopic, s-a renunțat la detecția prin utilizarea protocolului de gen (babesia spp.) și s-a trecut direct la protocoalele de tipizare pentru Babesia canis și Babesia vogeli. Rezultatele sunt prezentate în Tabelele 6 și 7 și Figurile 10-13.
Tabelul 6
Rezultatele obținute prin utilizarea protocolului de tipizare pentru Babesia canis
Babesia canis typing results
Figura 10 – Curbele de amplificare obținute cu protocolul de tipizare B canis. Probele analizate=albastru, standard B canis=roșu, Standard B vogeli=verde
Figure 10 – Amplification curves for B canis typing protocol. Analyzed samples=blue, B canis standard=red, B vogeli standard=green
Figura 11 – Curbele de topire obținute cu protocolul de tipizare B canis. Probele analizate=albastru, standard B canis=roșu, Standard B vogeli=verde
Figure 10 – Melting curves for B canis typing protocol. Analyzed samples=blue, B canis standard=red, B vogeli standard=green
Tabelul 7
Rezultatele obținute prin utilizarea protocolului de tipizare pentru Babesia vogeli
Babesia vogeli typing results
Figura 12 – Curbele de amplificare obținute cu protocolul de tipizare B vogeli. Probele analizate=albastru, standard B vogeli=roșu, Standard B canis=verde
Figure 12 – Amplification curves for B vogeli typing protocol. Analyzed samples=blue, B vogeli standard=red, B canis standard=green
Figura 13 – Curbele de topire obținute cu protocolul de tipizare B vogeli. Probele analizate=albastru, standard B vogeli=roșu, Standard B canis=verde
Figure 13 – Melting curves for B vogeli typing protocol. Analyzed samples=blue, B vogeli standard=red, B canis standard=green
CAPITOLUL 2 – Diagnosticul etiologic al anaplasmozei canine
2.1. DIAGNOSTIC SEROLOGIC
2.1.1. Materialul biologic necesar pentru analiză este reprezentat de sânge integral recoltat pe anticoagulant (EDTA). Recoltarea probei biologice se execută standard, cu respectarea condițiilor de asepsie și antisepsie. După recoltare sângele se omogenizează cu anticoagulantul prin inversie ușoară de 3-4 ori pentru evitarea coagulării parțiale și/sau totale. Se recomandă analiza cât mai rapidă a probei după recoltare.
2.1.2. Descriere metodă de lucru. Tehnica utilizată pentru identificarea anticorpilor specifici reprezintă o adaptare a tehnicii ELISA clasice, de tip pseudo-sandwich. Așadar, anticorpii din proba biologică analizată (dacă există) se vor cupla specific la nivelul conjugatului (antigen marcat cu peroxidază), ulterior prin migrarea la nivel de dispozitiv SNAP complexul anticorp-conjugat este legat specific la nivelul antigenului fix de pe dispozitiv, rezultând complexul conjugat-anticorp-antigen. Prin adăugarea substratului, reacția enzimatică este inițiată și consecutiv apare reacția de culoare.
2.1.3. Componentele reacției. Fiind vorba de o tehnică de tip ELISA adaptată pentru rapiditate în generarea rezultatelor (test rapid), componentele reacției sunt următoarele:
Conjugatul – reprezintă un antigen specific Anaplasma spp. marcat enzimatic cu peroxidază (HRP – horse radish peroxidaze). În cazul existenței anticorpilor la nivel de probă biologică, acesta se va lega specific de aceștia, cu formarea complexului anticorp-conjugat;
Anticorpii din proba biologică – reprezintă produsul de sinteză generat imun de către organism (de tip IgG);
Dispozitivul SNAP – beneficiază de mai multe roluri în ceea ce privește fluxul de diagnostic și anume reprezintă suportul fizic de desfășurare reacție enzimatică, beneficiază de existența celui de-al doilea antigen anti-Anaplasma spp. fixat la nivel de membrană și de asemenea înglobează cele două rezervoare cu reagenți (pentru spălare și substratul enzimatic pentru generarea reacției de culoare).
2.1.3. Cinetica reacției. Prima etapă în cadrul fluxului de diagnostic o reprezintă cuplarea conjugatului cu anticorpii din proba biologică și generarea complexului anticorp-conjugat. Această etapă este una specifică, fiind vorba de anticorpi sintetizați de organism ca răspuns la agresiunea patogenului.
Cea de-a doua etapă este reprezentată de depunerea complexului la nivel de dispozitiv SNAP, cu migrarea acestuia până la nivelul celui de-al doilea antigen, de data aceasta imobilizat la nivel de dispozitiv. Ca și în prima etapă, și în acest caz este vorba tot de o legare specifică de tip antigen-anticorp, având ca rezultat generarea complexului conjugat-anticorp-antigen.
Ulterior acestei etape are loc activarea dispozitivului, fapt tradus prin perforarea rezervoarelor de spălare și substrat și consecutiv curgerea prin capilaritate a soluției de spălare (cu rol de a îndepărta celelalte componente din proba biologică, excesului de conjugat și potențialii inhibitori din probă) respectiv facilitarea contactului dintre conjugatul marcat enzimatic și substratul enzimatic cu dezvoltarea reacției de culoare.
Procesele anterior descrise sunt prezentate schematic în Figura 1.
Figura 1 – reprezentarea schematică a metodei de detecție SNAP (prelucrare după Idexx)
Figure 1 – schematic representation of SNAP technology (adapted from Idexx)
2.2. IMPLEMENTAREA UNUI PROTOCOL DE DIAGNOSTIC PRIN REAL TIME RT-PCR
2.2.1. Materialul biologic. Proba biologică analizată a fost reprezentată de sânge integral pe EDTA. Recoltarea se efectuează identic cu cea pentru examenul serologic (de altfel, în practică, se utilizează aceiași probă biologică pentru ambele tipuri de teste). Spre deosebire de examenul serologic însă, proba biologică nu trebuie să fie analizată imediat, nefiind influențată de procesele de degradare prin factori intrinseci (autoliză) sau extrinseci. Mai mult, se acceptă pentru analiză și probele cu fenomene de coagulare parțială sau/și totală.
2.2.2. Extracția acizilor nucleici. Designul și optimizarea extracției acizilor nucleici s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Moleculară și Analize Genetice al S.C. Farmacia Veterinară FMV S.R.L., fiind ales pentru această etapă un kit comercial – QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Fluxul de diagnostic și tehnica de lucru au fost descrise anterior (Capitolul 1 – Diagnosticul etiologic al babesiozei canine). Protocolul de extracție ales a fost unul de tip standard, conform recomandărilor producătorului, cu procesarea de 200µl probă biologică și eluția în 100µl volum final (Capitolul 1, Tabelul 1)
2.2.3. Alegerea regiunii genice pentru amplificare, designul primerilor. Regiunea genică aleasă pentru amplificare a fost reprezentată de ARN-ul ribozomal 16S, conform datelor din literatură care sugerează pretabilitatea acesteia în identificarea și caracterizarea speciilor de Anaplasma. S-a reușit astfel identificarea unor primeri și sondă de gen, care să amplifice toate speciile implicate în patologie la câine (Figura 2). Designul primerilor și al sondei a ținut cont de secvențele din băncile de date internaționale (GenBank, SUA), fiind analizate 36 de astfel de secvențe. Toate analizele au fost efectuate cu programe de bioinformatică dedicate (Clustal W, BioEdit Sequence Editor).
2.2.4. Amplificarea acizilor nucleici. Designul și optimizarea amplificării acizilor nucleici s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Moleculară și Analize Genetice al S.C. Farmacia Veterinară FMV S.R.L., fiind utilizat un kit comercial – qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix (QuantaBio, SUA). Argumentele principale în alegerea acestui kit au fost următoarele:
Figura 2 – alinierea primerilor și sondei cu secvențele de referință pentru A platys și A. phagocytophilum
Figure 2 – primers and probe alignment with reference sequences for A platys and A. phagocytophilum
Kit revers-transcriere si amplificare ARN tehnologie one-step
Toți reagenții necesari sunt furnizați sub forma unui singur tub de premix (conține tampon reacție, dNTP, revers-transcriptaza, polimeraza de tip hot start, inhibitor RNaze, stabilizatori), astfel ca timpul necesar efectuării mixului este redus semnificativ
Performantele kit-ului nu sunt influențate de ciclurile de congelare/decongelare, indiferent de numărul acestora;
Nu este necesara adiția de inhibitori de RNaze, aceștia fiind incluși în premix;
Reacția enzimatică nu este influențată de prezenta ADN rezidual si alți inhibitori comuni (hem/hemoglobina, acid humic, melanina etc)
Posibilitate de încărcare a unui volum mare de ARN/proba (de peste 8µl) pentru o sensibilitate maxima a testului;
Compatibilitate cu protocoale de lucru de tip standard sau fast;
Conține un colorant pentru ușurința distribuției mixului enzimatic in tuburile/plăcile PCR
Kit-ul poate fi utilizat in orice tip de aplicații Real Time RT-PCR
Compatibilitate cu toate platformele Real Time consacrate
Profilul termic al reacției utilizat a fost realizat conform recomandărilor producătorului, cu includerea unei etape inițiale revers-transcriere (sinteză ADN copie), ulterior denaturare ADN și activare polimerază (polimerază de tip hot start) și reacția PCR (Figura 3). Fluorescența a fost colectată pe canalul dedicat fluorocromului sondei (FAM). Componența reacției este redată în Tabelul 1. Pentru amplificare s-a utilizat sistemul LightCycler model 2.0 (Roche Applied Science, Penzberg, Germania) .
Tabelul 1
Efectuarea mixului enzimatic pentru amplificare
RT-PCR mix
Figura 3 – profilul termic de amplificare Anaplasma
Figure 3 – thermal profile for Anaplasma amplification
2.2.5. Detecția și caracterizarea acizilor nucleici s-a realizat prin utilizarea softului dedicat sistemului de amplificare, analiza fiind efectuată în ceea ce privește curbele de amplificare. Rezultatele obținute arată o sensibilitate și specificitate adecvată pentru protocolul de detecție Anaplasma spp. (Figura 4).
Figura 4 – curbele de amplificare pentru protocolul de identificare Anaplasma spp.
Figure 4 – amplification curves for Anaplasma spp.
2.3. DIAGNOSTICUL ETIOLOGIC AL ANAPLASMOZEI CANINE
2.3.1. Probe biologice. Probele biologice analizate au fost reprezentate de sânge integral pe EDTA recoltat conform recomandărilor anterioare. Pentru examenul serologic acestea au fost analizate imediat după recoltare, iar pentru analizele de biologie moleculară probele au fost depozitate în recipientul original la -20°C până la analiză.
2.3.2. Examenul serologic. A fost efectuat conform protocolului de diagnostic anterior descris. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2.
Tabelul 2
Rezultatele obținute prin testarea serologică
Serological testing results
2.3.3. Amplificarea și detecția prin Real Time RT-PCR. Au fost efectuate conform protocolului de diagnostic anterior descris. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 3 si Figura 5.
Tabelul 3
Rezultatele obținute prin utilizarea protocolului RT-qPCR Anaplasma spp.
Anaplasma spp. RT-qPCR results
Figura 5 – Curbele de amplificare obținute pentru probele analizate.
Figure 5 – Amplification curves for analyzed samples
CAPITOLUL 3 – Diagnosticul etiologic al ehrlichiozei canine
2.1. DIAGNOSTIC SEROLOGIC
2.1.1. Materialul biologic necesar pentru analiză este reprezentat de sânge integral recoltat pe anticoagulant (EDTA). Recoltarea probei biologice se execută standard, cu respectarea condițiilor de asepsie și antisepsie. După recoltare sângele se omogenizează cu anticoagulantul prin inversie ușoară de 3-4 ori pentru evitarea coagulării parțiale și/sau totale. Se recomandă analiza cât mai rapidă a probei după recoltare.
2.1.2. Descriere metodă de lucru. Tehnica utilizată pentru identificarea anticorpilor specifici reprezintă o adaptare a tehnicii ELISA clasice, de tip pseudo-sandwich. Așadar, anticorpii din proba biologică analizată (dacă există) se vor cupla specific la nivelul conjugatului (antigen marcat cu peroxidază), ulterior prin migrarea la nivel de dispozitiv SNAP complexul anticorp-conjugat este legat specific la nivelul antigenului fix de pe dispozitiv, rezultând complexul conjugat-anticorp-antigen. Prin adăugarea substratului, reacția enzimatică este inițiată și consecutiv apare reacția de culoare.
2.1.3. Componentele reacției. Componentele reacției au fost descrise anterior în cadrul Capitolului 2 – Diagnosticul etiologic al anaplasmozei canine.
2.1.3. Cinetica reacției. Cinetica reacției a fost descrisă anterior în cadrul Capitolului 2 – Diagnosticul etiologic al anaplasmozei canine.
2.2. IMPLEMENTAREA UNUI PROTOCOL DE DIAGNOSTIC PRIN REAL TIME RT-PCR
2.2.1. Materialul biologic. Proba biologică analizată a fost reprezentată de sânge integral pe EDTA. Recoltarea se efectuează identic cu cea pentru examenul serologic (de altfel, în practică, se utilizează aceiași probă biologică pentru ambele tipuri de teste). Spre deosebire de examenul serologic însă, proba biologică nu trebuie să fie analizată imediat, nefiind influențată de procesele de degradare prin factori intrinseci (autoliză) sau extrinseci. Mai mult, se acceptă pentru analiză și probele cu fenomene de coagulare parțială sau/și totală.
2.2.2. Extracția acizilor nucleici. Designul și optimizarea extracției acizilor nucleici s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Moleculară și Analize Genetice al S.C. Farmacia Veterinară FMV S.R.L., fiind ales pentru această etapă un kit comercial – QIAamp Cador Pathogen Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Fluxul de diagnostic și tehnica de lucru au fost descrise anterior (Capitolul 1 – Diagnosticul etiologic al babesiozei canine). Protocolul de extracție ales a fost unul de tip standard, conform recomandărilor producătorului, cu procesarea de 200µl probă biologică și eluția în 100µl volum final (Capitolul 1, Tabelul 1)
2.2.3. Alegerea regiunii genice pentru amplificare, designul primerilor. Regiunea genică aleasă pentru amplificare a fost reprezentată de ARN-ul ribozomal 16S, conform datelor din literatură care sugerează pretabilitatea acesteia în identificarea și caracterizarea speciilor de Ehrlichia. S-a reușit astfel identificarea unor primeri și sondă de gen, care să amplifice toate speciile implicate în patologie la câine (Figurile 1 și 2). Designul primerilor și al sondei a ținut cont de secvențele din băncile de date internaționale (GenBank, SUA), fiind analizate 47 de astfel de secvențe. Toate analizele au fost efectuate cu programe de bioinformatică dedicate (Clustal W, BioEdit Sequence Editor).
2.2.4. Amplificarea acizilor nucleici. Designul și optimizarea amplificării acizilor nucleici s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Moleculară și Analize Genetice al S.C. Farmacia Veterinară FMV S.R.L., fiind utilizat un kit comercial – qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix (QuantaBio, SUA). Argumentele principale în alegerea acestui kit, precum și profilul termic al reacției au fost descrise anterior în cadrul Capitolului 2 – Diagnosticul etiologic al anaplasmozei canine.
Figura 1 – alinierea primerului sens și sondei cu secvențele de referință pentru Ehrlichia spp.
Figure 1 – forward primer and probe alignment with reference sequences for Ehrlichia spp.
Figura 2 – alinierea primerului antisens cu secvențele de referință pentru Ehrlichia spp.
Figure 2 – reverse primer alignment with reference sequences for Ehrlichia spp.
Componența reacției este redată în Tabelul 1. Pentru amplificare s-a utilizat sistemul LightCycler model 2.0 (Roche Applied Science, Penzberg, Germania) .
Tabelul 1
Efectuarea mixului enzimatic pentru amplificare
RT-PCR mix
2.2.5. Detecția și caracterizarea acizilor nucleici s-a realizat prin utilizarea softului dedicat sistemului de amplificare, analiza fiind efectuată în ceea ce privește curbele de amplificare. Rezultatele obținute arată o sensibilitate și specificitate adecvată pentru protocolul de detecție Ehrlichia spp. (Figura 3).
Figura 3 – curbele de amplificare pentru protocolul de identificare Ehrlichia spp.
Figure 3 – amplification curves for Ehrlichia spp.
2.3. DIAGNOSTICUL ETIOLOGIC AL EHRLICHIOZEI CANINE
2.3.1. Probe biologice. Probele biologice analizate au fost reprezentate de sânge integral pe EDTA recoltat conform recomandărilor anterioare. Pentru examenul serologic acestea au fost analizate imediat după recoltare, iar pentru analizele de biologie moleculară probele au fost depozitate în recipientul original la -20°C până la analiză.
2.3.2. Examenul serologic. A fost efectuat conform protocolului de diagnostic anterior descris. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2.
Tabelul 2
Rezultatele obținute prin testarea serologică
Serological testing results
2.3.3. Amplificarea și detecția prin Real Time RT-PCR. Au fost efectuate conform protocolului de diagnostic anterior descris. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 3 și Figura 4.
Tabelul 3
Rezultatele obținute prin utilizarea protocolului RT-qPCR Anaplasma spp.
Anaplasma spp. RT-qPCR results
Figura 4 – Curbele de amplificare obținute pentru probele analizate.
Figure 4 – Amplification curves for analyzed samples
Bibliografie
Aboge GO, Jia H, Terkawi MA, Goo Y, Kuriki K, Nishikawa Y, Igarashi I, Suzuki H, Xuan X: A novel 57-kDa merozoite protein of Babesia gibsoni is a prospective antigen for diagnosis and serosurvey of canine babesiosis by enzyme-linked immunosorbent assay.
Acedo-Sànchez, C., F. Morillas-Màrquez, M.C. Sanchìz-Marìn and J. Martìn-Sànchez: Changes în antibody titres against Leishmania infantum în naturally infected dogs în southern Spain. Vet. Parasitol. 75, 1998, 1-8
Agan BK, Dolan MJ: Laboratory diagnosis of Bartonella infections. Clin Lab Med. 2002, 22, 937-62
Alvar, J., I. Cruz, M.A. Morales and C. Cañavate: Molecular biology tools în leishmaniasis diagnosis and epidemiology. În: Killick-Kendrick, R. (ed.): Canine leishmaniasis: moving towards a solution. Proc. 2nd Int. Can. Leishm. Forum, Sevilla, Spain, 2002, Intervet Int., Boxmeer, The Netherlands, 2002, 25-30
Appel MJG: Lyme disease în dogs. Comp Cont Educ Pract Vet. 2002, 24 (Suppl.), 19-23
Baneth G: Hepatozoonosis. Arthropod-borne Diseases. 2002, Sci. Proc. BSAVA Congress, Birmingham, pp 187-9
Bañuls, A.L., M. Hâde and M. Tibayrenc: Molecular epidemiology and evolutionary genetics of Leishmania parasites. Int. J. Parasitol. 29, 1999, 1137-1147
Billeter SA, Levy MG, Chomel BB, et al.: Vector transmission of Bartonella species with emphasis on the potențial for tick transmission. Med Vet Entomol. 2008, 22, 1-15
Birkenheuer AJ, Correa MT, Levy MG, Breitschwerdt EB: Geographic distribution of babesiosis among dogs in the United States and association with dog bites: 150 cases (2000–2003).J Am Vet Med Assoc 2005, 227:942
Birkenheuer AJ, Levy MG, Breitschwerdt EB: Development and evaluation of a seminested PCR for detection and differentiation of Babesia gibsoni (Asian genotype) and B. canis DNA in canine blood samples.J Clin Microbiol 2003, 41:4172-4177.
Birkenheuer AJ, Levy MG, Breitschwerdt EB: Efficacy of combined atovaquone and azithromycin for therapy of chronic Babesia gibsoni (Asian genotype) infections in dogs.J Vet Intern Med 2004, 18:494-498.
Birkenheuer AJ, Neel J, Ruslander D, Levy MG, Breitschwerdt EB: Detection and molecular characterization of a novel large Babesia species in a dog.Vet Parasitol 2004, 124:151-160.
Böhm M, Leisewitz AL, Thompson PN, Schoeman JP: Capillary and venous Babesia canis rossi parasitaemias and their association with outcome of infection and circulatory compromise.Vet Parasitol 2006, 141:18-29.
Bostrom B, Wolf C, Greene C, Peterson DS: Sequence conservation in the rRNA first internal transcribed spacer region of Babesia gibsoni genotype Asia isolates.
Bottero, E., Poggi, M., Viglione, M.: Lesioni papulari indotte da Leishmania spp. în căni giovani. Veterinăria 1, 2006, 33-36
Boulouis HJ, Chang CC, Henn JB, et al.: Factors associated with the rapid emergence of zoonoticBartonella infections. Vet Res. 2005, 36, 383-410
Bowman, D.D., Lynn, R.C. (1995). Georgis’ Parasitology for Veterinarians. Saunders, London. 218–321.
Breitschwerdt EB, Hegarty BC, Hancock ȘI: Sequential evaluation of dogs naturally infected withEhrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii, or Bartonella vinsonii. J Clin Microbiol. 1998, 36, 2645-51
Breitschwerdt EB, Maggi RG, Chomel BB, et al.: Bartonellosis: an emerging infectious disease of zoonotic importance to animals and human beings. J Vet Emerg Crit Care (San Antonio). 2010, 20, 8-30
Breitschwerdt EB, Maggi RG: Comparative medical features of canine and human bartonellosis. Clin Microbiol Infect. 2009, 15, 106-7
Camacho AT, Pallas E, Gestal JJ, Guitiàn FJ, Olmeda AS, Goethert HK, Telford SR:Infection of dogs in north-west Spain with a Babesia microti-like agent.Vet Rec 2001, 149:552-555.
Carrade DD, Foley JE, Borjesson DL, et al.: Canine granulocytic anaplasmosis: A review. J Vet Intern Med. 2009, 23, 1129–41
Carret C, Walas F, Carcy B, Grande N, Précigout É, Moubri K, Schetters T, Gorenflot A:Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis rossi: Differentiation of three subspecies by restriction fragment length polymorphism analysis on amplified small subunit ribosomal RNA genes.J Eukaryot Microbiol 1999, 46:298-303.
Chalifoux L, Hunt RD: Histochemical differentiation of Dirofilaria immitis and Dipetalonema reconditum. J Am Vet Med Assoc. 1971, 5, 601-5
Chomel BB, Boulouis HJ, Maruyama S, et al.: Bartonella spp. în pets and effect on human health. Emerg Infect Dis. 2006, 12, 389-94
Chomel BB, Kasten RW: Bartonellosis, an increasingly recognized zoonosis. J Appl Microbiol. 2010, 109, 743-50
Ciaramella, P., Oliva, G., Luna, R.D., Gradoni, L., Ambrosio, R., Cortese, L., Scalone, A., Persechino, A.: A retrospective clinical study of canine leishmaniasis în 150 dogs naturally infected by Leishmania infantum. Vet. Rec. 141, 1997, 539-543
Conrad P, Thomford J, Yamane I, Whiting J, Bosma L, Uno T, Holshuh HJ, Shelley S:Hemolytic anemia caused by Babesia gibsoni infections in dogs.J Am Vet Med Assoc 1991, 199:601-605.
Criado A, Martinez J, Buling A, Barba JC, Merino S, Jefferies R, Irwin PJ: New data on epizootiology and genetics of piroplasms based on sequences of small ribosomal subunit and cytochrome b genes.Vet Parasitol 2006, 142:238-247.
Criado-Fornelio A, Martinez-Marcos A, Buling-Saraña A, Barba-Carretero JC: Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern Europe Part I: Epizootiological aspects.Vet Parasitol 2003, 113:189-201.
Current Canine Guidelines for the Diagnosis, Prevention and Management of Heartworm (Dirofilaria immitis) Infection in Dogs (revised January, 2012), Executive Board of the American Heartworm Society
Dantas-Torres, F.: Canine leishmaniosis în South America. Parasites & Vectors 2(Suppl 1), 2009, S1 doi:10.1186/1756-3305-2-S1-S1
Dantas-Torres, F.: The role of dogs aș reservoirs of Leishmania parasites, with emphasis on Leishmania (Leishmania) infantum and Leishmania (Viannia) braziliensis. Vet. Parasitol. 149, 2007, 139-146
Denerolle, P.: Leishmaniose canine: difficulté du diagnostic et du traitement. Prat. Méd. Chir. Anim. Comp. 31, 1996, 137-145
Duarte SC, Linhares GFC, Romanowsky TN, Neto O, Borges LMF: Assessment of primers designed for the subspecies-specific discrimination among Babesia canis canis, Babesia canis vogeli and Babesia canis rossi by PCR assay.Vet Parasitol 2008, 152:16-20.
Duncan AB, Maggi RG, Breitschwerdt EB: A combined approach for the enhanced detection and isolation of Bartonella species în dog blood samples: pre-enrichment liquid culture followed by PCR and subculture onto agar plates. J Microbiol Methods. 2007, 69, 273-81
Ferrer, L., Rabanal, R., Fondevila, D., Ramos, J.A., Domingo, M.: Skin lesions în canine leishmaniasis. J. Small Anim. Pract. 29, 1988, 381-388
Ferrer, L.M.: Clinical aspects of canine leishmaniasis. În: Killick-Kendrick, R. (ed.): Canine leishmaniasis: An update. Proceedings of the Int. Can. Leishm. Forum, Barcelona, Spain, Intervet Int., Boxmeer, The Netherlands, 1999, 6-10
Fukumoto S, Xuan X, Shigeno S, Kimbita E, Igarashi I, Nagasawa H, Fujisaki K, Mikami T:Development of a polymerase chain reaction methods for diagnosing Babesia gibsoni infection in dogs.J Vet Med Sci 2001, 63:977-981.
Furtado, Adriano P., et al. "Morphological redescription of Dirofilaria immitis. Journal of Parasitology 96.3 (2010): 499-504
Gabriel MW, Henn J, Foley JE, et al.: Zoonotic Bartonella species în fleas collected on gray foxes (Urocyon cinereo argenteus). Vector Borne Zoonotic Dis. 2009, 9, 597–602
Genchi C, Rinaldi L, Cascone C, et al.: Is heartworm disease really spreading in Europe? Vet Parasitol. 2005, 133, 137-48
Georges K, Ezeokoli CD, Newaj-Fyzul A, Campbell M, Mootoo N, Mutani A, Sparagano OAE:The application of PCR and reverse line blot hybridization to detect arthropod-borne haemopathogens of dogs and cats in Trinidad.Ann N Y Acad Sci 2008, 1149:196-199.
Goethert HK, Telford SR III: What is Babesia microti? Parasitology 2003, 127:301-309.
Goo Y, Jia H, Aboge GO, Terkawi MA, Kuriki K, Nakamura C, Kumagai A, Zhou J, Lee EG, Nishikawa Y, et al.: Babesia gibsoni: Serodiagnosis of infection in dogs by an enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant BgTRAP.Exp Parasitol 2008, 118:555-560. Anderson JF, Magnarelli LA, Sulzer AJ: Canine babesiosis: Indirect fluorescent antibody test for a North American isolate of Babesia gibsoni.Am J Vet Res 1980, 41:2102-2105.
Guptill L: Bartonellosis. Vet Microbiol. 2010, 140, 347-59
Hamel D., Silaghi C., Lescai D., Pfister K., 2012 Epidemiological aspects on vector borne infections in stray pet dogs from Romania and Hungary with focus on Babesia spp. Parasitol Res., 110(4): 1537-1545
Henn JB, Chomel BB, Boulouis HJ, et al.: Bartonella rochalimae în raccoons, coyotes, and red foxes. Emerg Infect Dis. 2009, 15, 1984-7
Henn JB, Gabriel MW, Kasten RW, et al.: Infective endocarditis în a dog and the phylogenetic relationship of the associated "Bartonella rochalimae" străin with isolates from dogs, gray foxes, and a human. J Clin Microbiol. 2009, 47, 787-90
Hovius KE, Stark LA, Bleumink-Pluym NM, et al.: Presence and distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato species în internal organs and skin of naturally infected symptomatic and asymptomatic dogs, as detected by polymerase chain reaction. Vet Q. 1999, 21, 54-8
Ikadai H, Tanaka H, Shibahara N, Matsuu A, Uechi M, Itoh N, Oshiro S, Kudo N, Igarashi I, Oyamada T: Molecular evidence of infections with Babesia gibsoni parasites in Japan and evaluation of the diagnostic potential of a loop-mediated isothermal amplification method.J Clin Microbiol 2004, 42:2465-2469.
Ilie, S.M., Hemoparazitoze transmise de vectori și gestionarea lor, Synevo 2010
Ionita M, Mitrea IL, Pfister K, Hamel D, Buzatu CM, Silaghi C., 2012. Canine babesiosis in Romania due to Babesia canis and Babesia vogeli: a molecular approach. Parasitol Res. 110(5):1659-1664.
Ionita M, Mitrea IL, Pfister K, Hamel D, Silaghi C., 2013. Molecular evidence for bacterial and protozoan pathogens in hard ticks from Romania. Vet Parasitol. 196(1-2):71-76.
Ioniță M. Enăchescu V., Mitrea I.L, 2012 Preliminary date on serological survey of exposure to artropod-borne, pathohens in stray dogs from Bucharest, Romania Scientific Works, C series Veterinary Medicine , LVIII(4): 220-225
Ioniță M., Mitrea I.L., Biologie animală, Ed. Medicală Veterinară, București 2006.
Irwin PJ, Hutchinson GW: Clinical and pathological findings of Babesia infection in dogs.Aust Vet J 1991, 68:204-209.
Irwin PJ: Babesiosis and Cytauxzoonosis. In Arthropod-borne infectious diseases of the dog and cat. Edited by Shaw SE, Day MJ. London: Manson Publishing/The Veterinary Press; 2005:63-77.
Irwin, Peter J.1 "Canine babesiosis: from molecular taxonomy to control." Parasites &Vectors 2.Suppl 1 (2009): S4.
Jacobsen LS: The South African form of severe and complicated canine babesiosis: clinical advances 1994–2004.
Jefferies R, Ryan U, Irwin P: PCR-RFLP for the detection and differentiation of the canine piroplasm species and its use with filter paper-based technologies.Vet Parasitol 2007, 144:20-27.
Jefferies R, Ryan UM, Jardine J, Broughton DK, Robertson ID, Irwin PJ: Blood, bull terriers and babesiosis: further evidence for direct transmission of Babesia gibsoni in dogs.Autsrian Veterinary Journal 2007, 85:459-463.
Jefferies R, Ryan UM, Jardine J, Robertson ID, Irwin PJ: Babesia gibsoni: Detection during experimental infections and after combined atovaquone and azithromycin therapy.Exp Parasitol 2007, 117:115-123.
Killick-Kendrick, R.: The life-cycles of Leishmania în the sand fly and transmission of leishmaniasis by bate. În: Killick-Kendrick, R. (ed.): Canine leishmaniasis: moving towards a solution. Proc. 2nd Int. Can. Leishm. Forum, Sevilla, Spain, Intervet Int., Boxmeer, The Netherlands, 2002, 57-68
Kjemtrup AM, Kocan AA, Whitworth L, Meinkoth J, Birkenheuer AJ, Cummings J, Boudreaux MK, Stockham SL, Irizarry-Rovira A, Conrad P: There are at least three genetically distinct small piroplasms from dogs.Int J Parasitol 2000, 30:1501-1505.
Kjemtrup AM, Wainwright K, Miller M, Penzhorn BL, Carreno RA: Babesia conradae, sp. nov., a small canine Babesia identified in California.Vet Parasitol 2006, 138:103-111.
Koutinas, A.F., Polizopoulou, Z.S., Saridomichelakis, M.N., Argyriadis, D., Fytianou, A., Plevraki, K.G.: Clinical considerations on canine visceral leishmaniasis în Greece: a retrospective study of 158 cases (1989-1996). J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 35, 1999, 376-383
Koutinas, A.F., Scott, D.W., Kontos, V., Lekkas, S.: Skin lesions în canine leishmaniasis (Kala-Azar): a clinical and histopathological study on 22 spontaneous cases în Greece. Vet. Dermatol. 3, 1992, 121-130
Krupka I, Straubinger R: Lyme borreliosis în dogs and cats: background, diagnosis, treatment and prevention of infections with Borrelia burgdorferi sensu stricto. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2010, 40, 1103-19
Lainson, R., Shaw, J.J.: New World leishmaniasis. În: Cox, F.E.G., Kreier, J.P., Wakelin, D. (eds.): Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, Parasitology. 2005, Arnold, London, pp. 313-349
Lappin MR: Bartonella and Haemobartonella în cats and dogs: Current knowledge. În: The Bayer 7th Int. Părăsite Symp., 2006, Proc. BSAVA Pre-Congress Symp., Birmingham, pp 17-25
Lehtinen LE, Birkenheuer AJ, Drolesky RE, Holman PJ: In vitro cultivation of a newly recognised Babesia sp. in dogs in North Carolina.Vet Parasitol 2008, 151:150-157.
Levy MG, Breitschwerdt EB, Moncol DJ: Antibody activity to Babesia canis in dogs in North Carolina.Am J Vet Res 1987, 48:339-341.
Lobetti RG: Canine babesiosis.-Comp Cont Ed Pract Vet 1998, 20:418-431.
Madeira, M.F., Schubach, A.O., Schubach, T.M., Serra, C.M., Pereira, S.A., Figueiredo, F.B., Confort, E.M., Quintella, L.P., Marzochi, M.C.: Îs Leishmania
Matjila PT, Leisewitz AL, Ooshuizen MC, Jongejan F, Penzhorn B: Detection of a Theileriaspecies in dogs in South Africa.
Matsuu A, Ono S, Ikadai H, Uchide T, Imamura S, Onuma M, Okanao S, Higuchi S:Development of a SYBR green real-time polymerase chain reaction assay for quantitative detection of Babesia gibsoni (Asian genotype) DNA.J Vet Diagn Invest 2005, 17:569-573.
Mehlhorn H, Raether W, Schein E, Weber M, Uphoff M: Licht-und elektronenmikroskopische Untersuchungen zum Entwick-lungszyklus und Einfluss von Pentamidin auf die Morphologie der intraerythrocytären Stadien von Babesia microti.
Messick JB: New perspectives about Hemotrophic mycoplasma (formerly, Haemobartonella and Eperythrozoon species) infections în dogs and cats. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2003, 33, 1453-65
Mitrea I. L. ,Parazitologie și boli parazitare , Editura Ceres, București, 2012.
Narasimhan S, Santiago F, Koski RĂ, et al.: Examination of the Borrelia burgdorferi transcriptome în Ixodes scapularis during feeding. J. Bacteriol. 2002, 184, 3122-5
Neer TM, Breitschwerdt EB, Greene RT, et al.: Consensus statement on ehrlichial disease of small animals. J Vet Intern Med. 2002, 16, 309-15
Nicholson WL, Allen KE, McQuiston JH, et al.: The increasing recognition of rickettsial pathogens în dogs and people. Trends Parasitol. 2010, 26, 205-12
Noli, C.: Leishmaniose des Hundes. Waltham Focus 9, 1999, 16-24
OIE: Leishmaniosis. În: Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. 4th edn., Office Internațional Epizooties, Paris, 2000, 803-812
Olmeda-Garcia AS, Rodriguez-Rodriguez JA: Stage-specific development of a filarial nematode (Dipetalonema dracunculoides) in vector ticks. J Helminthol. 1994, 68, 231-5
Ortega-Mora LM, Gomez-Bautista M, Rojo-Vazquez FA: The acid phosphatase activity and morphological characteristics of Dipetalonema dracunculoides (Cobbold, 1870) microfilariae. Vet Parasitol. 1989, 33, 187-90
Oyamada M, Davoust B, Boni M, Dereure J, Bucheton B, Hammad A, Itamoto K, Okuda M, Inokuma H: Detection of Babesia canis rossi, B. canis vogeli, and Hepatozoon canis in dogs in a village of Eastern Sudan by using a screening PCR and sequencing methodologies.Clin Diagn Lab Immunol 2005, 12:1343-1346.
Pappalardo BL, Brown TȚ, Tompkins M, et al.: Immunopathology of Bartonella vinsonii (berkhoffii) în experimentally infected dogs. Vet Immunol Immunopathol. 2001, 83, 125-47
Quinnell, R.J., O. Courtenay, S. Davidson, L. Garcez, B. Lambson, P. Ramos, J.J. Shaw, M. A. Shaw and C. Dye: Detection of Leishmania infantum by PCR, serology and cellular immune response în a cohort study of Brazilian dogs. Parasitol. 122, 2001, 253-261
Reithinger, R., J.C. Espinoza, O. Courtenay and C.R. Davies: Evaluation of PCR as a diagnostic mass-screening tool to detect Leishmania (Viannia) spp. în domestic dogs (Canis familiaris). J. Clin. Microbiol. 41, 2003, 1486-1493
Sánchez-Pérez, Angeles, et al. "Rapid detection of haemotropic mycoplasma infection of feline erythrocytes using a novel flow cytometric approach."Parasites & vectors 6.1 (2013): 158.
Sasaki M, Omobowale O, Tozuka M, Ohta K, Matsuu A, Nottidge HO, Hirata H, Ikadai H, Oyamada T: Molecular survey of Babesia canis in dogs in Nigeria.J Vet Med Sci 2007, 69:1191-1193.
Shaw SE, Day MJ, Birtles RJ, et al.: Tick-borne infectious diseases of dogs. Trends Parasitol. 2001, 17, 74-80
Slappendel, R.J., and E. Teske în: Killick-Kendrick, R. (ed.): Canine leishmaniasis: an update. Proc. Int. Can. Leishm. Forum, Barcelona, Spain, 1999, Intervet Int., Boxmeer, The Netherlands, 1999, 54-59
Solano-Gallego L, Trotta M, Carli E, Carcy B, Caldin M, Furlanello T: Babesia canis canisand Babesia canis vogeli clinicopathological findings and DNA detection by means of PCR-RFLP in blood from Italian dogs suspected of tick-borne disease.Vet Parasitol 2008, 157:211-221.
Speck S, Reiner B, Wittenbrink MM: Isolation of Borrelia afzelii from a dog. Vet Rec. 2001, 149, 19-20
Straubinger RK: Borreliosis, a canine vector-borne disease: Current knowledge on Borrelia spp. În: The Bayer 7th International Părăsite Symposium, Proceedings of the BSAVA Pre-Congress Symposium, Birmingham, 2006, 12-15
Stuen, Snorre, Erik G. Granquist, and Cornelia Silaghi. "Anaplasma phagocytophilum—a widespread multi-host pathogen with highly adaptive strategies." Frontiers in cellular and infection microbiology 3 (2013).
Sykes, Jane E., et al. "Detection of mixed infections with “Candidatus Mycoplasma haemominutum” and Mycoplasma haemofelis using real-time TaqMan polymerase chain reaction." Journal of veterinary diagnostic investigation 19.3 (2007): 250-255.
Tani H, Tada Y, Sasai K, Baba E: Improvement of DNA extraction method for dried blood spots and comparison of four methods for detection of Babesia gibsoni(Asian genotype) infection in canine blood samples.-J Vet Med Sci 2008, 70:461-467.
Trapp SM, Messick JB, Vidotto O, Jojima FS, Autran de Morais HS: Babesia gibsonigenotype Asia in dogs from Brazil.Vet Parasitol 2006, 141:177-180.
Uilenberg G: Babesia – a historical overview.Vet Parasitol 2006, 138:3-10.
Vet Parasitol 2006, 138:126-139.
Vet Parasitol 2008, 152:152-157.
Vet Parasitol 2008, 157:34-40.
Whiteley HE: Your diagnostic protocol for Dirofilaria immitis infection in dogs. Vet Med. 1988, 83, 328-45
WHO: Control of the leishmaniases. Report of a WHO Expert Committee, Tech. Rep. Ser. No. 793, WHO, Geneva, 1990
Yamasaki M, Inokuma H, Sugimoto C, Shaw S, Aktas M, Yabsley MJ, Yamato O, Maede Y:Comparison and phylogenetic analysis of the heat shock protein 70 gene ofBabesia parasites from dogs.Vet Parasitol 2007, 145:217-227.
Yeagley TJ, Reichard MV, Hempstead JE, Allen KE, Parsons LM, White MA, Little SE, Meinkoth JH: Detection of Babesia gibsoni and the small Babesia sp. 'Spanish isolate' in confiscated pit bull terriers.J Am Vet Med Assoc, in press.
Zahler M, Rinder H, Schein E, Gothe R: Detection of a new pathogenic Babesia microti-like species in dogs.Vet Parasitol 2000, 89:241-248.
Zahler M, Schein E, Rinder H, Gothe R: Characteristic genotypes discriminate between Babesia canis isolates of differing vector specificity and pathogenicity in dogs.Parasitol Res 1998, 84:544-548.
Agan BK, Dolan MJ: Laboratory diagnosis of Bartonella infections. Clin Lab Med. 2002, 22, 937-62
Baneth G: Hepatozoonosis. In: Arthropod-borne Diseases. 2002, Sci. Proc. BSAVA Congress, Birmingham, pp 187-9
Bañuls, A.L., M. Hide and M. Tibayrenc: Molecular epidemiology and evolutionary genetics of Leishmania parasites. Int. J. Parasitol. 29, 1999, 1137-1147
Bhide, M., Travnicek, M., Curlik, A., & Stefancikova, A. (2004). The importance of dogs in eco-epidemiology of Lyme borreliosis: a review.Veterinarni Medicina-UZPI (Czech Republic)
Billeter SA, Levy MG, Chomel BB, et al.: Vector transmission of Bartonella species with emphasis on the potential for tick transmission. Med Vet Entomol. 2008, 22, 1-15
Birkenheuer AJ, Levy MG, Breitschwerdt EB: Development and evaluation of a seminested PCR for detection and differentiation of Babesia gibsoni (Asian genotype) and B. canis DNA in canine blood samples.J Clin Microbiol 2003, 41:4172-4177.
Breitschwerdt EB, Hegarty BC, Hancock SI: Sequential evaluation of dogs naturally infected withEhrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii, or Bartonella vinsonii. J Clin Microbiol. 1998, 36, 2645-51
Carrade DD, Foley JE, Borjesson DL, et al.: Canine granulocytic anaplasmosis: A review. J Vet Intern Med. 2009, 23, 1129–41
Criado-Fornelio A, Martinez-Marcos A, Buling-Saraña A, Barba-Carretero JC: Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern Europe Part I: Epizootiological aspects.Vet Parasitol 2003, 113:189-201.
Current Canine Guidelines for the Diagnosis, Prevention and Management of Heartworm (Dirofilaria immitis) Infection in Dogs (revised January, 2012), Executive Board of the American Heartworm Society
D. D., Foley, J. E., Borjesson, D. L., & Sykes, J. E. (2009). Canine granulocytic anaplasmosis: a review. Journal of veterinary internal medicine,23(6), 1129-1141
French TW, Harvey JW. Serologic diagnosis of infectious cyclic thrombocytopenia in dogs using an indirect fluorescent antibody test Am J Vet Res. 1983;44(12):2407-11.
Gaunt S, Beall M, Stillman B, Lorentzen L, Diniz P, Chandrashekar R, Breitschwerdt.: „Experimental infection and co-infection of dogs with Anaplasma platys and Ehrlichia canis: hematologic, serologic and molecular findings”. Parasit Vectors. 2010;3:33.
Genchi C, Rinaldi L, Cascone C, et al.: Is heartworm disease really spreading in Europe? Vet Parasitol. 2005, 133, 137-48
Goodman RA, Hawkins EC, Olby NJ, et al.: “Molecular identification of Ehrlichia ewingii infection in dogs: 15 cases” (1997 – 2001). J.Am Vet Med Assoc 2003;222:1102 – 1107.
Greig B, Asanovich KM, Armstrong PJ, et al.: “Geographic, clinical, serologic, and molecular evidence of granulocytic ehrlichiosis, a likely zoonotic disease, in Minnesota and Wisconsin dogs. J Clin Microbiol 1996; 34:44-48.
Hamel D., Silaghi C., Lescai D., Pfister K., 2012 Epidemiological aspects on vector borne infections in stray pet dogs from Romania and Hungary with focus on Babesia spp. Parasitol Res., 110(4): 1537-1545
Harrus S, Aroch I, Lavy E, Bark H. Clinical manifestations of infectious canine cyclic thrombocytopenia. Vet Rec. 1997;141:247-50.
Hovius KE, Stark LA, Bleumink-Pluym NM, et al.: Presence and distribution of Borrelia burgdorferisensu lato species in internal organs and skin of naturally infected symptomatic and asymptomatic dogs, as detected by polymerase chain reaction. Vet Q. 1999, 21, 54-8
Ionică, Angela Monica, Ioana Adriana Matei, Viorica Mircean, Mirabela Oana Dumitrache, Gianluca D’Amico, Adriana Győrke, Nikola Pantchev et al. "Current surveys on the prevalence and distribution of Dirofilaria spp. and Acanthocheilonema reconditum infections in dogs in Romania." Parasitology research (2014): 1-8.
Ionita M, Mitrea IL, Pfister K, Hamel D, Buzatu CM, Silaghi C., 2012. Canine babesiosis in Romania due to Babesia canis and Babesia vogeli: a molecular approach. Parasitol Res. 110(5):1659-1664.
Ioniță M. Enăchescu V., Mitrea I.L, 2012 Preliminary date on serological survey of exposure to artropod-borne, pathohens in stray dogs from Bucharest, Romania Scientific Works, C series Veterinary Medicine , LVIII(4): 220-225
Irwin, Peter J.1 "Canine babesiosis: from molecular taxonomy to control." Parasites &Vectors 2.Suppl 1 (2009): S4.
Kocan Km, de la Fuente J, Blouin EF, et al.: Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae): recent advances defining host – pathogen adaptations of a tick- borne rickettsia. Parasitology 2004; 129 Suppl:S285 – S300.
Madigan JE. Veterinary infections with granulocytotropic Ehrlichieae (E. phagocytophila and E. equi). In: Smith B, ed. Large Animal Internal Medicine, 3rd ed. St. Louis:Mosby, 2002;1073 – 1074.
Messick JB: New perspectives about Hemotrophic mycoplasma (formerly, Haemobartonella and Eperythrozoon species) infections în dogs and cats. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2003, 33, 1453-65
Messick JB: New perspectives about Hemotrophic mycoplasma (formerly, Haemobartonella andEperythrozoon species) infections in dogs and cats. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2003, 33, 1453-65
Rodrigo Morchón, E. Carretón, J. González-Miguel and I. Mellado-Hernández: „Heartworm Disease (Dirofilaria immitis) and Their Vectors in Europe” New Distribution Trends
Shaw SE, Day MJ, Birtles RJ, et al.: Tick-borne infectious diseases of dogs. Trends Parasitol. 2001, 17, 74-80
Stillman, Brett A., Monn, M., Liu, J., Thatcher, B., Foster, P., Andrews, B., & Chandrashekar, R. "Performance of a commercially available in-clinic ELISA for detection of antibodies against Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, Borrelia burgdorferi, Ehrlichia canis, and Ehrlichia ewingii and Dirofilaria immitis antigen in dogs." Journal of the American Veterinary Medical Association 245.1 (2014): 80-86.
Straubinger RK: Borreliosis, a companion vector-borne disease: Current knowledge on Borrelia spp. In: The Bayer 7th International Parasite Symposium, Proceedings of the BSAVA Pre-Congress Symposium, Birmingham, 2006, 12-15
Whiteley HE: Your diagnostic protocol for Dirofilaria immitis infection in dogs. Vet Med. 1988, 83, 328-45
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3372948/
http://www.vetsonline.com/publications/veterinary-times/archives/n-44-09/canine-vector-borne-diseasesa-a-prevalence-and-prevention.html
http://www.cvm.ncsu.edu/vhc/csds/documents/Anaplasmosis.pdf
http://www.parasitesandvectors.com/content/8/1/75
http://biofabnet.com/magazin/wissenschaft/archiv_2007/index.html?lang=en&artikelid=/artikel/02561/index.html
http://cmr.asm.org/content/25/1/42/F8.expansion.html
http://en.wikipedia.org/wiki/%27The_All-Species_Living_Tree%27_Project
http://en.wikipedia.org/wiki/Babesia
http://en.wikipedia.org/wiki/Ehrlichia_canis
http://en.wikipedia.org/wiki/Hepatozoon
http://en.wikipedia.org/wiki/Hepatozoon
http://gefor.4t.com/concurso/parasitologia/bartonellabacilliformis5.jpg
http://jb.asm.org/content/191/3/693/F4.large.jpg
http://link.springer.com/article/10.1186%2F1756-3305-1-25/fulltext.html
http://peggymunson.blogspot.ro/2010/05/strays-part-iii-late-spring-2008-eight.html
http://www.bio.davidson.edu/people/sosarafova/assets/bio307/meprasse/page03.html
http://www.cdc.gov/lyme/
http://www.cvbd.org/en/occurrence-maps/world-map
http://www.cvbd.org/en/occurrence-maps/world-map/
http://www.cvbd.org/en/tick-borne-diseases/lyme-borreliosis/distribution
http://www.cvbd.org/en/tick-borne-diseases/lyme-borreliosis/pathogens/
http://www.medscape.com/viewarticle/766614_2
http://www.medscape.com/viewarticle/766614_4
http://www.nature.com/nrmicro/journal/v8/n5/fig_tab/nrmicro2318_F5.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC385417/?tool=pmcentrez/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC385417/figure/F1
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC385417/figure/F2
http://www.scielo.br/img/revistas/rbpv/v20n3/a02fig02.jpg
http://www.scielo.br/img/revistas/rbpv/v20n3/a02fig04.jpg
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S19849612011000300002&script=sci_arttext
http://www.studyblue.com/notes/note/n/exam-2/deck/6188345
http://www.vetres.org/articles/vetres/full_html/2009/02/v09047/F1.html
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: CERCETARI PRIVIND ETIO-EPIDEMIOLOGIA, DIAGNOSTICUL SI CONTROLUL UNOR HEMOPARAZITOZE LA CARNIVORE [309928] (ID: 309928)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.