Cercetari Experimentale Privind Factorii Care Influenteaza Amprentarea Profilului Polifenolic In Procesul DE Elaborare Si Maturare A Vinurilor Rosii

RAPORT DE CERCETARE ȘTIINȚIFICĂ PENTRU DOCTORAT

CERCETARI EXPERIMENTALE PRIVIND FACTORII CARE INFLUENTEAZA AMPRENTAREA PROFILULUI POLIFENOLIC IN PROCESUL DE ELABORARE SI MATURARE A VINURILOR ROSII

Numele doctorandului: PALADE M. O. LAURENȚIU MIHAI

Conducător de doctorat: Prof. univ. dr. ing. MONA ELENA POPA

Facultatea de: BIOTEHNOLOGII

Domeniul de doctorat: BIOTEHNOLOGII

Cuprins

Introducere.

Compusii fenolici

Fenolii reprezintă o grupă mare și foarte complexă de compuși, ce prezintă importanță semnificativă pentru atributele calității vinurilor. Sunt importanți și în cazul vinurilor albe, însă există în concentrații mai mici.

Fenolii și compușii derivați afectează aspectul, gustul, aroma și proprietățile antimicrobiene ale vinului.

În ultimii ani au fost realizați pași importanți în întelegerea naturii chimice a fenolilor din vin, în principal a taninurilor și pigmenților roșii. Totuși, dinamica producției, concentrației, relevanței individuale și stabilității lor este în continuare neînțeleasă în totalitate (Jackson, 2014b).

Diversitatea grupei de compuși fenolici necesită, pentru a fi clasificată cu folos, asocierea de substanțe pe familii ce prezintă similitudine structurală. Atunci cand este studiată această grupă, se recurge la numeroase forme de clasificare generală bazată pe complexitatea structurilor. Astfel se începe cu acizii fenolici, ajungându-se în final la taninurile condensate. Compușii fenolici se pot clasifica în funcție de proveniența lor, sau în funcție de originea botanică a plantelor ce îi produc în cantități importante. Pentru a fi cât se poate de completă și a ține cont de definiția compușilor fenolici prezentată mai sus, vom alege o clasificare dublă bazată în același timp pe complexitatea structurală și pe originea biosintetică (Vivas, 2007).

În ciuda diferențelor în a înțelege chimia compușilor fenolici și semnificația lor senzorială în vinuri, un efort considerabil este depus pentru furnizarea unor măsuri practice pentru evaluarea prezenței lor (Jackson, 2014a).

Compușii fenolici joacă un rol important în enologie. Aceștia sunt responsabili pentru diferențele dintre vinurile albe și cele roșii, în special pentru culoarea și aroma vinurilor roșii. Posedă proprietăți interesante, sănătoase, ce sunt responsabile pentru “paradoxul franțuzesc”. Posedă de asemenea proprietăți bactericide, antioxidante și furnizează vitamine ce protejează, aparent, consumatorul în fața bolilor cardiovasculare.

Aceste molecule provin din diferite părți ale strugurilor și sunt extrase în timpul producerii vinului. Structura lor variază mult atunci când vinul este învechit în butoaie sau în sticle, în funcție de condițiile date, dar aceste modificări nu au fost încă explicate în totalitate (Ribereau-Gayon et al., 2006).

Flavonoizii prezintă interes ridicat în producerea vinurilor deoarece sunt prezenți într-o varietate mare de forme structurale. Dintre fenolii non-flavonoizi, acizii hidroxicinamici reprezintă cea mai mare grupă ce există în struguri și vinuri.

Următorii compuși fenolici sunt prezenți în concentrațiile cele mai ridicate:

Taninurile, care sunt responsabile pentru astringența vinurilor roșii și influențează în același timp și culoarea

Antocianii, care sunt responsabili pentru culoarea strugurilor și vinurilor roșii dar sunt absenți în soiurile de struguri albi

Acizii fenolici, care trebuie luați în considerare la producerea vinurilor albe

Flavonolii și dihidroflavonolii

Stilbenii, care nu influențează caracteristicile senzoriale dar sunt importanți din perspectiva sănătății

Materiale si metode

Dozarea continutului total de polifenoli

Metoda Folin-Ciocalteu

Pentru fiecare eprubeta cu proba, s-a adaugat:

0,795 ml apa distilata

5 µl proba – se obtine prin macerare 2-3 zile in methanol 75% la intuneric cu agitare intermitenta la interval de 6-8 ore

50µl reactive Folin-Ciocalteu

150µl carbonat de sodium + o proba martor = aceleasi componente, dar fara proba de analizat:

0,795 ml apa distilata

5 µl metanol

50µl reactive Folin-Ciocalteu

150µl carbonat de sodiu (saturat – 20%)

Eprubetele au fost apoi incubate timp de 2 ore la intuneric dupa care continutul lor a fost masurat spectrophotometric, la 765 nm.

Realizarea curbei etalon

Pentru determinarea polifenolilor s-a realizat o curba de etalonare, pornind de la solutii standard de acid galic. Rezultatele au fost exprimate in mg de acid galic (GAE/L).

Etapa 1:

Pentru prepararea solutiei stoc, din care s-au realizat dilutii pentru gama etalon, s-au adaugat: 0,5g acid galic intr-un balon cotat de 100ml, 10 ml etanol si se completeaza cu apa distilata.

Etapa 2:

In 5 baloane cotate s-au adaugat cate un volum de 1,2,3,5 si respective 10 ml din Solutia stoc; se completeaza pana la semn cu apa distilata si se realizeaza dilutiile (50 mg/l, 100 mg/l, 150 mg/l, 250 mg/l si 500 mg/l).

Etapa 3:

Aplicarea metodei Folin-Ciocalteu pentur cele 5 dilutii.

In fiecare eprubeta s-au adaugat:

0,795 ml apa distilata

5 µl solutie (din fiecare balon cu solutii diluate)

50 µl reactive Folin-Ciocalteu

150 µl carbonat de sodium

Eprubetele au fost apoi incubate timp de 2 ore la intuneric dupa care continutul lor a fost masurat spectrophotometric, la 765 nm, iar masuratorile au fost folosite pentru realizarea curbei etalon.

Concentratia de polifenoli raportata in echivalenti de acid galic a fost calculata conform relatiei:

TP(mg/L GAE) = (A750-0.0016) / 0.0011

A765 – absorbanta la 765 nm

GAE – concentratia in echivalenti de acid galic in mg/l

Metoda DPPH

Capacitatea antioxidantă a fost determinată prin evaluarea efectului de eliminare a radicalilor liberi („Free Radical Scavenging effect”) asupra radicalului 1,1-dipheny l-2- picrylhydrazyl (DPPH).

Efectul activității antioxidante DPPH a fost estimat în conformitate cu procedura descrisă de Villaño, Fernández-Pachón, Moyá, Troncoso si García-Parrilla în 2007, cu unele modificări. Pentru a obține soluția de DPPH (60 µM), 2.36 mg DPPH au fost diluați în 100 ml etanol. Probele au fost preparate prin macerarea în metanol (75%) timp de 2-3 zile la întuneric și temperatura camerei. Toate măsurătorile au fost realizate de câte trei ori. Petru fiecare măsurătoare au fost folosiți câte 0.5 ml probă și 1.95 ml DPPH soluție etanolică (60 µM). Acestea au fost vortexate și incubate la temperatura camerei, în întuneric pentru 30 de minute (Gülçin et al., 2010). După 30 de minute, a fost masurată absorbanța probelor la lungimea de undă de 515 nm, comparativ cu soluția de DPPH singura (aceasta reprezentând momentul zero t=0 min). Calibrarea a fost făcută prin măsurarea a șase concentrații diferite de quercitină (100-3.125 µM).

Cromatografia de lichide de intalta performanta cuplata cu spectrometria de masa

Determinarea polifenolilor:

Cromatografia de lichide de inalta performanta cuplata cu spectrometria de masa (HPLC-MS) a fost aleasa ca fiind tehnica analitica selectiva, sensibila, rapida si precisa, realizand un compromis intre costuri, caracteristici de performanta ale metodelor, posibilitatea de analiza simultana a unui amestec complex de principii active si timp de analiza total, dupa comparari ale rezultatelor obtinute pentru metoda HPLC-MS cu cele electrochimice si spectrometrice.

Tehnica utilizata a fost HPLC-PDA-MS, datorita domeniului de concentratii de interes pentru compusi polifenolici si analiza a 8 compusi polifenolici din 12 extracte obtinute din 3 specii diferite de struguri cultivate in Romania (Feteasca Neagra, Cabernet Sauvignon si Merlot).

Pentru determinarea compusilor polifenolici s-a folosit o metoda HPLC publicata anterior de Cristea et al.. Masuratorile cromatografice au fost realizate folosind un sistem complet HPLC SHIMADZU si utilizand o colana C18 Nucleosil 3.5, 4.6x50mm, Zorbax. Sistemul a fost cuplat cu un detector MS, LCMS-2010 detector, echipat cu o sursa de ionizare tip electrospray ESI. Probele au fost filtrate inainte de injectare in sistemul HPLC prin celule de ultra filtrare Syringe Driven Filter Unit 0.2 µm (Macherey-Nagel). Coloana a fost echilibrata timp de 1 ora cu faza mobila, inainte de injectarea probelor si apoi 20 μL de proba au fost injectati in sistemul HPLC cuplat cu MS. Pentru analiza probelor prin HPLC-MS s-a folosit o faza mobila compusa din acid formic in apa (pH=3, solvent A) si acid formic in acetonitril (pH=3, solvent B) si s-a folosit urmatorul gradient: 0.01-20.00 minute 5-30% solvent B; 20.00-40 minute 30% solvent B; 40.01-50.00 minute 30-50% solvent B; 50.01-52.00 minute 50-5% solvent B; 52.01-70.00 minute 5% solvent B. S-a folosit pentru realizarea analizelor urmatorul debit al fazei mobile: 0.01-5.00 minute 0.1 mL/min; 5.01-15 minute 0.2 mL/min; 15.01-35 minute 0.1 mL/min; 35.01-60 minute 0.2 mL/min; 60-70 minute 0.1 mL/min. Experimentele au fost realizate la o temperatura constanta a coloanei de 200C iar timpul necesar efectuarii unei analize este de 70 de minute. Apoi coloana a fost re-echilibrata, timp de 15 minute, cu faza mobila, folosind un debit al fazei mobile de 0.1 mL/min (Cristea et al., 2009).

Determinarea antocianilor:

Masurarile cromatografice au fost realizate folosind un sistem complet HPLC SHIMADZU si utilizand o coloana C18. Sistemul HPLC-PDA a fost cuplat cu un detector MS, LCMS-2010 detector, utilizand o interfata de ionizare de tip electrospray ESI si folosind, datorita specificitatii compusilor de interes, modul de ionizare pozitiv. Faza mobila folosita a fost compusa din 5% acid formic in apa (solvent A) si 5% acid formic in metanol (solvent B). Pentru separarea compusilor a fost utilizat o elutie in gradient cu un debit de flux de 0.15 mL/min. Experimentele au fost realizate la o temperatura constanta a coloanei de 400C iar timpul necesar efectuarii unei analize este de 47 de minute (Cristea et al., 2009).

Diferentierea pe baza analizei compusilor volatile – Nasul Electronic

Au fost analizate trei probe de must: must Caberne Sauvignon, must Feteasca Neagra si must Merlot folosind sistemul multisenzor pentru controlul calitatii alimentelor α-Prometheus (nas electronic).

S-a cantarit cate 1 ml de must in fiecare fiola si s-au analizat 3 fiole din aceeasi proba, pentru repetabilitate. Probele au fost incalzite si agitate in cuptor la 350C timp de 300 secunde, cu agitare de 500 rpm. Partea volatila generata (1000 µl) a fost injectata in sistemul cu 18 senzori pentru înregistrarea amprentei volatile.

Pentru analizei PCA (analiza componentului principal), au fost alesi senzori care sunt sensibili si reactioneaza la anumiti compusi din vin (in paranteza sunt trecute substantele la care sunt sensibili):

LY2/AA (alcooli, acetona, amoniu)

LY2/Gh (amoniu, amine)

LY2/gCTI (hidrogen sulfurat)

T30/1 (compusi polari)

P10/1 (compusi nepolari: hidrocarburi, amoniu)

P10/2 (compusi nepolari: metan, etan)

PA2 (etanol, amoniu, amine)

P30/1 (hidrocarburi, amoniu, etanol)

P30/2 (hidrogen sulfurat, cetone)

TA2 (etanol)

Cromatografia de gaze cuplata cu spectrometria de masa

Pentru realizarea analizei gaz-cromatografice am folosit un gaz-cromatograf, echipat cu coloană cromatografică (Thermo Scientific Trace GOLD GC Column), cu o lungime de 30 m, diametrul interior de 0.25 mm, iar faza staționară 5% fenil metilpolisiloxan, cu o grosime de 0.25 µm. Faza mobilă a fost reprezentată de heliu, cu un debit de 1 ml/min. Temperatura inițială a fost de 40 ◦C, mentinuta timp de 5 minute, dupa care a fost ridicata la 250 ◦C, cu o rampă de 10 ◦C / minut (izotermic). Temperatura de injectare a fost de 200⁰C, iar temperatura sursei ionice a fost de 220⁰C. Volumul de probă introdus a fost de 1µl, in modul “split”, vaporizarea acesteia realizându-se în aproximativ 20 minute. Identificarea compusilor volatili a fost realizata prin compararea spectrelor de masa cu cele prezente in baza de date “NIST2.0 MS library Database”.

Rezultate si discutii

Factorii care influențează amprentarea profilului polifenolic în procesul de elaborare și maturare a vinurilor roșii

Difuzia compușilor fenolici din coajă începe odată cu zdrobirea și continuă în timpul presării, ce se foloseste pentru extracția vinului în cazul procesului de vinificație al vinurilor roșii. Difuzia depinde de un număr de factori, cum ar fi conținutul de sulf, temperatura, și concentrația de etanol. (Moreno and Peinado, 2012c).

În concordanță cu definiția etichetelor PDO și PGI, determinarea localității de origine și atribuirea unei identități regionale definite unui produs alimentar este unul din pașii obligatorii în lanțul trasabilității. Pașii ulteriori sunt controlul tratamentelor post-recoltă, condițiile de stocare și procesare, și prepararea produsului alimentar. Polifenolii au fost folosiți ca metodă de trasabilitate pentru toți acești pași, inclusiv pentru vin.

În ultimii 20 de ani au fost realizate numeroase studii în ceea ce privește compoziția polifenolică a strugurilor și produselor derivate din struguri, inclusiv vinul (Xu et al., 2011; Downey et al., 2006); motivul pentru un interes atât de persistent este atât valoarea comercială a vinului ca produs cât și recunoscutul rol benefic al polifenolilor prezenți în struguri. Aceștia includ flavonoizi (flavanoli, flavanone, izoflavone, flavonoli, și antociani), chinone, dar și acizi cinamici, acizi fenolici, taninuri hidrolizabile și stilbeni (Xu et al., 2011). S-a demonstrat în variate rânduri că, așa cum s-a realizat pentru alte specii, conținutul de polifenoli și compoziția din struguri variază de la specie la specie dar și între diferite soiuri din aceeași specie, sunt puternic afectate de condițiile de mediu cum ar fi compoziția solului și climatul, și prezintă variații specifice în ceea ce privește manevrarea post-recoltă, procesare și condiții de păstrare (Downey et al., 2006; Minussi et al., 2003; Kallithraka et al., 2006; Mazza et al., 1999; Radovanović et al., 2010).

Factori de influență intrinseci dependenți de compoziția recoltei:

solul;

Conceptul de terroir este o abordare complexă a creșterii viței și producerii vinului incluzând factori de mediu, dar, în același timp, și aspectele socioeconomic și istoric ale unei zone date. În regiuni viticole cu climat rece, condițiile de mediu diferite pot produce efecte semnificative asupra calității vinurilor pentru o zonă relativ restrânsă. (Deloire et al., 2005; van Leeuwen and Seguin, 2006; Zsófi et al., 2009).

condițiile climatice;

Flavonoidele au un rol important de fotoprotectori ceea ce explică dependența lor față de expunerea la soare. Temperatura reprezintă și ea un factor important în formarea lor. Este sugerat faptul că în zonele cu climă caldă, temperatura strugurilor poate ajunge frecvent la nivele ce inhibă formarea de antociani și astfel se reduce culoarea strugurilor (Downey et al., 2006). Cohen et al. (2008) a arătat că atenuarea fluctuațiilor de temperatură dinurnă duce la creșterea ratelor de maturare și la concentrații mai mari de antociani la recoltare. Pe lângă conținutul total de antociani, au fost descrise de asemenea modificări de compoziție prin asocierea sezoanelor calde cu formarea ridicată de derivați cumaroil ai malvidinei, petunidinei și delfinidinei (Downey et al., 2006). Tarara et al. (2008); Nicholas et al. (2011).

clona ca element agrobiologic determinant.

Factorii genetici din populațiile de cultură pot avea efecte importante asupra conținutului fenolic, cel mai mult observate modificări fiind cantitative. Ca rezultat, răsadurile cu un profil fenolic foarte interesant au fost identificate, pe baza compoziției și concentrației (Gómez-Plaza et al., 2008); Hernández-Jiménez, et al. (2009); (Ruiz-García and Gómez-Plaza, 2013).

Factori de influență extrinseci dependenți de condițiile tehnologice:

Stadiul recoltării.

Antocianii sunt acumulați în coajă dupa véraison, în timpul maturării strugurilor, în timp ce flavanolii sunt formați cu mult înainte, în semințe, coajă și, în cantități mai mici, în pulpă. Cele mai mari concentrații de flavanoli sunt în timpul véraison, după care scad treptat până aproape de maturitate, după care rămân relativ constante. (Olle et al., 2011; Verries et al., 2008). Cadot, et al. (2012) a observat că momentul recoltării diferențiază profilul senzorial și tipicalitatea vinurilor.

Temperatura;

Durata;

Tehnicile de vinificație.

Caracterizarea compușilor polifenolici din struguri, musturi și vinuri roșii ce contribuie la amprenta autenticității și tipicității soiului și arealului viticol de proveniență

Dozarea continutului total de polifenoli

Tabel 1. Continutul total de polifenoli din probele individuale de struguri

Metoda DPPH

Tabel 2. AAR (activitatea antioxidanta) din probele individuale de struguri exprimata in echivalenti acid galic pe litru (GAE/L)

Cromatografia de lichide de inalta performanta cuplata cu spectrometria de masa

Determinarea polifenolilor: – pentru probele de struguri

Au fost stabilite caracteristicile de performanta ale metodei HPLC-PDA-MS pentru 8 compusi polifenolici, rezultatele obtinute fiind prezentate in tabelul 3. Pentru stabilirea domeniului de liniaritate a raspunsului s-au realizat calculul curbei de calibrare si al coeficientului de corelatie. Curbele de calibrare au fost obtinute pentru 7 puncte diferite masuratorile fiind realizate in triplicat. Din ecuatiile dreptelor de calibrare se observa o buna liniaritate intre aria picului si concentratia analitului, pe un domeniu de concentratii de un ordin si jumatate.

Tabel 3. Unele caracteristici de performanta ale metodei HPLC-PDA-MS.

Utilizand caracteristicile de performanta obtinute dupa verificarea conformitatii metodei, a fost evaluat profilul polifenolic a 12 probe de extracte din struguri. Rezultatele obtinute pentru determinarea cantitativa a compusi polifenolici identificati in extractele sunt prezentate in tabelul 4 asa cum au fost determinate prin interpolare pe curba de calibrare, tinand seama de caracterisiticile de masa/sarcina (m/z) pentru fiecare dintre compusi (in cazul analizei HPLC-MS), spectrelor de absorbtie UV/Vis (HPLC-PDA) si de timpii de retentie specifici.

Tabel 4 Valorile obtinute in urma analizei HPLC-PDA-MS pentru evaluarea profilului polifenolic.

In figura 1 sunt prezentate cateva cromatograme HPLC-MS obtinute pentru evaluarea profiului polifenolic a 3 specii diferite de struguri.

Figura 1. Cromatogramele HPLC-MS obtinute pentru probele de must (1-epicatechin, 2- quercetin 3-β-D-glucozida, 3-rutin; A-Feteasca Neagra, B-Cabernet Sauvignon, C-Merlot).

Determinarea polifenolilor: – pentru probele de vinuri – maturate timp de 1 luna

Tabel 5. Valorile obtinute in urma analizei HPLC-PDA-MS pentru evaluarea profilului polifenolic

In continuare sunt prezentate cromatogramele HPLC-MS pentru probele de vin (A-CS, B-FN, C-Merlot):

A

B

C

Figura 2. Cromatogramele HPLC-MS obtinute pentru probele de vin (A-Cabernet Sauvignon, B-Feteasca Neagra, C-Merlot)

Determinarea antocianilor:

Folosind conditiile cromatografice optime s-a observat ca picurile celor 6 antociani au fost rezolvate cu timpi de retentie diferiti (figura 3) iar picurile corespunzatoare fragmentelor de ioni folosind modul de achizitie a datelor SIM (detectorul MS) au fost obtinute in perfecta concordanta cu datele obtinute din cromatogramele HPLC-PDA.

Figura 3 Cromatogramele HPLC-MS obtinute pentru amestecul de standarde (peonidin-verde, delfinidin-negru, genistein-gri, cianidin-roz, pelargonidin-maro si malvidin-albastru, concentratia standardelor 40g/mL)

In continuare, pentru stabilirea domeniului de liniaritate a raspunsului s-au realizat calculul curbei de calibrare si al coeficientului de corelatie. Curbele de calibrare au fost obtinute pentru 7 puncte diferite masuratorile fiind realizate in triplicat. Din ecuatiile dreptelor de calibrare se observa o buna liniaritate intre aria picului si concentratia analitului, pe un domeniu de concentratii de ordinul 1.5. Au fost stabilite caracteristicile de performanta ale metodei HPLC-PDA-MS pentru 5 antociani rezultatele obtinute fiind prezentate in tabelul 6.

Tabel 6. Unele caracteristici de performanta ale metodei HPLC-PDA-MS

Metoda HPLC-PDA-MS a fost aplicata pentru analiza calitativa si cantitativa a antocianilor din 12 extracte diferite (figura 4) iar valoriile obtinute sunt prezentate in tabelul 7.

Figura 4 Cromatogramele HPLC-PDA ale extractului obtinut din coaja strugurelui (Feteasca Neagra-A, Cabernet Sauvignon-B, Merlot-C).

Tabel 7. Valorile obtinute in urma analizei HPLC-PDA-MS pentru determinarea antocianilor

4. Diferentierea pe baza analizei compusilor volatile – Nasul Electronic

Raspunsul senzorilor pentru probele de must este prezentat mai jos:

Figura 5. Comparatie intre raspunsul senzorilor pentru probele de must Caberne Sauvignon (stanga) si Feteasca Neagra (dreapta)

Figura 6. Comparatie intre raspunsul senzorilor pentru probele de

must Caberne Sauvignon (stanga) si Merlot (dreapta)

Figura 7. Comparatie intre raspunsul senzorilor pentru probele de

must Feteasca Neagra (stanga) si Merlot (dreapta)

Se observa ca exista variatii intre curbele afisate de senzori.

Prin analiza PCA (analiza componentului principal) realizata cu soft-ul aparatului, s-a obtinut o diferentiere foarte buna a probelor in jurul valorii de 83, ceea ce demonstreaza ca, din punct de vedere al compozitiei volatile, probele au fost foarte bine separate si sunt diferite.

Figura 8. Analiza PCA pentru cele 3 probe de must analizate.

Cromatografia de gaze cuplata cu spectrometria de masa

Probe de struguri

Cu toate ca analiza headspace este des folosita pentru analiza compusilor volatile din struguri si vinuri, analiza headspace static este insotita de obicei de o senzitivitate scazuta pentru compusii volatile in cantitati sub forma de urme, iar analiza headspace dinamica sufera din cauza interferentelor datorate apei si etanolului.

Unii struguri, cum ar fi Cabernet Sauvignon, prezinta provocari analitice semnificative deoarece compusii de aroma sunt prezenti in concentratii scazute, norisoprenoizii, esterii, alcoolii si aldehidele constituind majoritatea volatililor. Nu au fost realizate multe aplicatii ale HS-SPME (headspace solid phase micro extraction) pentur determinarea profilului compusilor volatile din strugurii de Cabernet Sauvignon (Canuti et al., 2009).

Compusii chimici principali constituent ai probelor individuale de struguri (coaja, pulpa, seminte) pentru cele trei soiuri de struguri au fost determinati prin cromatografie de gaze cuplata cu spectrometrie de masa.

Compusii identificati prin metoda headspace au fost: 1) butanoic acid, methyl ester; 2) tropilidene; 3) 2-ethyl heptanoic acid; 4) 3-ethylhexane; 5) 3-methyl-2-heptanol; 6) 2,4-dimethyl-1-heptene; 7) n-octane; 8) n-nonane; 9) 2-propyl-1-pentanol; 10) tridecane; 11) 3,5-dimathyloctane; 12) n-decane; 13) o-cymene; 14) undecane; 15) c-terpinen; 16) 3-methyldecane; 17) hexadecane; 18) estragole; 19) phenol,2,4-di-tert-butyl.

Dupa cum se poate vedea din Tabelul 8, distributia compusilor identificati este diversificata intre partile diferite ale strugurilor.

Rezultatele sunt in concordanta cu cele raportate de (Doneva-Sapceska et al., 2006), (Nechita, 2010), (Gomez et al., 1994), (Ashok Kumar and Vijayalakshmi, 2011), (Lamorte et al., 2007), (Nirmala and Narendhirakannan, 2011), (Welke et al., 2013), (Tamborra and Esti, 2010).

Tabel 8. Tentatively identified volatile compounds of the skin, pulp and seeds extracts from Feteasca Neagra, Cabernet Sauvignon and Merlot grapes, respectively

% procente de arie – procentele ariilor picurilor din totalul ariilor picurilor integrate (100%)

Tabel 9. Rapoartele procentelor de arie pentru cele trei soiuri de struguri studiate – coaja

Tabel 10. Rapoartele procentelor de arie pentru cele trei soiuri de struguri studiate – pulpa

Tabel 11. Rapoartele procentelor de arie pentru cele trei soiuri de struguri studiate – seminte

Dupa scanarea GC-MS a profilului compusilor volatili din extracte, aceeasi compusi pentru fiecare dintre cele trei soiuri de struguri au fost selectati. Proportia ariei picului pentru fiecare dintre acesti compusi este prezentata dupa integrare. Aceeasi 4 compusi volatile au fost luati in considerare pentru a reprezenta raportul dintre ei. Din tabele se poate observa ca diferentele dintre rapoarte (exemplu: pentru coaja – raportul dintre butanoic acid, methyl ester si estragole este 2.011 pentru Feteasca Neagra, in comparative cu acelasi raport pentru soiurile Cabernet Sauvignon si Merlot care sunt 11.373 si respectiv 7.572).

Atata timp cat analiza headspace a profilului volatile este una calitativa, si in acelasi timp una semicantitativa, nu se poate pune baza numai pe simpla comparative a compusilor individuali identificati, deoarece diferentele dintre ariile picurilor aceluiasi component detectat in probe separate nu este vizibil si concludent.

Astfel, raportul dintre doi compusi furnizeaza o distinctive mai clara intre soiurile de struguri.

Diferentele dintre rapoarte pot fi folosite cu succes in incercarea de a autentifica vinurile, bazata pe profilul constituentilor volatile.

Tehnica headspace utilizata nu furnizeaza o putere mare de detective pentru compusii volatile din struguri. O metoda SPME-Headspace ar putea acoperi o mai mare gama de compusi si ar putea prezenta o rezolutie ridicata.

Probe de must

Compusii chimici principali pentr probele de must au fost pentru cele trei soiuri de struguri au fost determinati prin cromatografie de gaze cuplata cu spectrometrie de masa.

Compusii identificati prin scanare headspace a probelor au fost: 1) butanoic acid, methyl ester; 2) tropilidene; 3) 2-ethyl heptanoic acid; 4) 2,4-dimethyl heptane; 5) 2,4-dimethyl-1-heptene; 6) 4-methyl octane 7) n-nonane; 8) 2-propyl-1-pentanol; 9) 6-methyl tridecane ; 10) 3,5-dimethyl octane; 11) n-decane; 12) o-cymene; 13) undecane; 14) c-terpinen; 15) linalool; 16) estragole.

Dupa cum se poate observa din Tabelul 12, distributia compusilor identificati este diversificata intre soiurile diferite.

Rezultatele sunt in concordanta cu cele raportate de (Câmara et al., 2006), (Mamede & Pastore, 2006), (Noguerol-Pato et al., 2014), (Bakker & Clarke, 2012).

Figura 9. Cromatograma GC-MS pentru proba de must din soiul Feteasca Neagra

Figura 10. Cromatograma GC-MS pentru proba de must din soiul Cabernet Sauvignon

Figura 11. Cromatograma GC-MS pentru proba de must din soiul Merlot

Tabel 12. Compusii volatili identificati pentru cele trei probe de must

% procente de arie – procentele ariilor picurilor din totalul ariilor picurilor integrate (100%)

Tabel 13. Rapoartele procentelor de arie pentru cele trei probe de must

In urma scanarii GC-MS, unii compusi au fost selectati pentru reprezentarea raportului dintre ei. Din tabel se poate observa diferenta dintre rapoarte (Exemplu: raportul dintre butanoic acid, methyl ester si 2-ethyl heptanoic acid este 2.389 pentru Feteasca Neagra, in comparative cu acelasi raport pentru soiurile Cabernet Sauvignon si Merlot care sunt 4.28 si respectiv 1.388).

Raportul dintre doi compusi prezinta o distinctie mai clara intre probe decat in cazul incare sunt comparate doar ariile picurilor.

Diferentele dintre rapoarte pot fi utilizate cu succes in incercarea de autentifica vinurile, pe baza profilului compusilor volatile din musturi.

Tehnica headspace utilizata nu furnizeaza o putere mare de detective pentru compusii volatile din struguri. O metoda SPME-Headspace ar putea acoperi o mai mare gama de compusi si ar putea prezenta o rezolutie (Flamini & Traldi, 2010).

Bibliografie

Ashok Kumar, K., & Vijayalakshmi, K. (2011). GC-MS analysis of phytochemical constituents in ethanolic extract of Punica granatum peel and Vitis vinifera seeds. International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2, 461–468.

Bakker, J., & Clarke, R. J. (2012). Wine Flavour Chemistry, Second Edition. Wine Flavour Chemistry, Second Edition. doi:10.1002/9781444346022

Cadot, Y., Caillé, S., Samson, A., Barbeau, G., & Cheynier, V. (2012). Sensory representation of typicality of Cabernet franc wines related to phenolic composition: impact of ripening stage and maceration time. Analytica Chimica Acta, 732, 91–9. doi:10.1016/j.aca.2012.02.013

Câmara, J. S., Arminda Alves, M., & Marques, J. C. (2006). Development of headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry methodology for analysis of terpenoids in Madeira wines. Analytica Chimica Acta, 555(2), 191–200. doi:10.1016/j.aca.2005.09.001

Canuti, V., Conversano, M., Calzi, M. L., Heymann, H., Matthews, M. a., & Ebeler, S. E. (2009). Headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry for profiling free volatile compounds in Cabernet Sauvignon grapes and wines. Journal of Chromatography A, 1216, 3012–3022. doi:10.1016/j.chroma.2009.01.104

Cohen, S. D., Tarara, J. M., & Kennedy, J. A. (2008). Assessing the impact of temperature on grape phenolic metabolism. Analytica Chimica Acta, 621(1), 57–67. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2007.11.029

Cristea, V., Deliu, C., Oltean, B., Butiuc-Keul, A., Brummer, A., Albu, C., & Radu, G. L. (2009). SOILLESS CULTURES FOR PHARMACEUTICAL USE AND BIODIVERSITY CONSERVATION . ACTA HORTICULTURAE, 843(July 2015).

Deloire, A., Vaudour, E., Carey, V., Bonnardot, V., & Leeuwen, C. V. A. N. (2005). GRAPEVINE RESPONSES TO TERROIR : A GLOBAL APPROACH. J. Int. Sci. Vigne Vin, 39(4), 149–162.

Doneva-Sapceska, D., Dimitrovski, A., Milanov, G., & Vojnovski, B. (2006). Free and Potentially Volatile Monoterpenes in Grape Varieties. Bulletin of the Chemists and Technologists of Macedonia, 25(1), 51–56.

Downey, M. O., Dokoozlian, N. K., & Krstic, M. P. (2006). Cultural practice and environmental impacts on the flavonoid composition of grapes and wine: A review of recent research. American Journal of Enology and Viticulture, 57(3), 257–268. Retrieved from http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-33749316344&partnerID=40&md5=ac7475d5f7fcde4c2ea1f6cf4d48a85c

Flamini, R., & Traldi, P. (2010). Mass Spectrometry in Grape and Wine Chemistry. (D. M. Desiderio, Ed.)Mass Spectrometry in Grape and Wine Chemistry. doi:10.1002/[anonimizat]

Gomez, E., Martinez, a, & Laencina, J. (1994). Localization of free and bound aromatic compounds among skin, juice and pulp fractions of some grape varieties. Vitis, 4, 1–4. Retrieved from http://www.vitis-vea.de/admin/volltext/e033240.pdf

Gómez-Plaza, E., Gil-Muñoz, R., Hernández-Jiménez, A., López-Roca, J. M., Ortega-Regules, A., & Martínez-Cutillas, A. (2008). Studies on the anthocyanin profile of Vitis Vinifera intraspecific hybrids (Monastrell × Cabernet Sauvignon). European Food Research and Technology, 227(2), 479–484. doi:10.1007/s00217-007-0744-3

Gülçin, İ., Huyut, Z., Elmastaș, M., & Aboul-Enein, H. Y. (2010). Radical scavenging and antioxidant activity of tannic acid. Arabian Journal of Chemistry, 3(1), 43–53. doi:10.1016/j.arabjc.2009.12.008

Hernández-Jiménez, A., Gómez-Plaza, E., Martínez-Cutillas, A., & Kennedy, J. A. (2009). Grape Skin and Seed Proanthocyanidins from Monastrell × Syrah Grapes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(22), 10798–10803. doi:10.1021/jf903465p

Jackson, R. (2014a). Chemical Constituents of Grapes and Wine. In Wine science (Fourth edition). Academic, San Diego (pp. 347–426). doi:10.1016/B978-0-12-381468-5.00006-3

Jackson, R. (2014b). Vineyard practice. In Wine science (Fourth edition). Academic, San Diego (pp. 143–306). doi:10.1016/B978-0-12-381468-5.00004-X

Kallithraka, S., Tsoutsouras, E., Tzourou, E., & Lanaridis, P. (2006). Principal phenolic compounds in Greek red wines. Food Chemistry, 99(4), 784–793. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.07.059

Lamorte, S. A., Gambuti, A., Genovese, A., & Moio, L. (2007). Volatile components of Vitis vinifera L. cvs. Uva di Troia, Aglianico and Fiano at different stages of ripening. 30th World Congress of Vine and Wine, 1–6.

Mamede, M. E. O., & Pastore, G. M. (2006). Study of methods for the extraction of volatile compounds from fermented grape must. Food Chemistry, 96(4), 586–590. doi:10.1016/j.foodchem.2005.03.013

Mazza, G., Fukumoto, L., Delaquis, P., Girard, B., & Ewert, B. (1999). Anthocyanins, Phenolics, and Color of Cabernet Franc, Merlot, and Pinot Noir Wines from British Columbia†. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(10), 4009–4017. doi:10.1021/jf990449f

Minussi, R. C., Rossi, M., Bologna, L., Cordi, L., Rotilio, D., Pastore, G. M., & Durán, N. (2003). Phenolic compounds and total antioxidant potential of commercial wines. Food Chemistry, 82(3), 409–416. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0308-8146(02)00590-3

Moreno, J., & Peinado, R. (2012). Polyphenols. In Enological chemistry (pp. 53–76). Elsevier Inc. doi:10.1016/B978-0-12-388438-1.00005-4

Nechita, C.-B. (2010). Contributions to the study of VOLATILES COMPOUND OF GRAPES AND wines obtained in Cotnari vineyard.

Nicholas, K. a., Matthews, M. a., Lobell, D. B., Willits, N. H., & Field, C. B. (2011). Effect of vineyard-scale climate variability on Pinot noir phenolic composition. Agricultural and Forest Meteorology, 151(12), 1556–1567. doi:10.1016/j.agrformet.2011.06.010

Nirmala, J. G., & Narendhirakannan, R. T. (2011). in Vitro Antioxidant and Antimicrobial Activities of Grapes ( Vitis Vinifera . L ), 3(4), 242–249.

Noguerol-Pato, R., Sieiro-Sampredro, T., González-Barreiro, C., Cancho-Grande, B., & Simal-Gándara, J. (2014). Effect on the Aroma Profile of Graciano and Tempranillo Red Wines of the Application of Two Antifungal Treatments onto Vines. Molecules, 19(8), 12173–12193. doi:10.3390/molecules190812173

OLLÉ, D., GUIRAUD, J. L., SOUQUET, J. M., TERRIER, N., AGEORGES, A., CHEYNIER, V., & VERRIES, C. (2011). Effect of pre- and post-veraison water deficit on proanthocyanidin and anthocyanin accumulation during Shiraz berry development. Australian Journal of Grape and Wine Research, 17(1), 90–100. doi:10.1111/j.1755-0238.2010.00121.x

P. Ribereau-Gayon, Y. G., Maujean, A., & D. Dubourdieu. (2006). Handbook of Enology Volume 2 The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments 2nd Edition. John Wiley & Sons Ltd.

Radovanović, B. C., Radovanović, A. N., & Souquet, J.-M. (2010). Phenolic profile and free radical-scavenging activity of Cabernet Sauvignon wines of different geographical origins from the Balkan region. Journal of the Science of Food and Agriculture, 90(14), 2455–2461. doi:10.1002/jsfa.4106

Ruiz-García, Y., & Gómez-Plaza, E. (2013). Elicitors: A Tool for Improving Fruit Phenolic Content. Agriculture, 3(1), 33–52. doi:10.3390/agriculture3010033

Tamborra, P., & Esti, M. (2010). Authenticity markers in Aglianico, Uva di Troia, Negroamaro and Primitivo grapes. Analytica Chimica Acta, 660, 221–226. doi:10.1016/j.aca.2009.11.014

Tarara, J. M., Lee, J., Spayd, S. E., & Scagel, C. F. (2008). Berry Temperature and Solar Radiation Alter Acylation, Proportion, and Concentration of Anthocyanin in Merlot Grapes. American Journal of Enology and Viticulture , 59 (3 ), 235–247. Retrieved from http://www.ajevonline.org/content/59/3/235.abstract

Van Leeuwen, C., & Seguin, G. (2006). The concept of terroir in viticulture. Journal of Wine Research, 17(1), 1–10. doi:10.1080/09571260600633135

Verries, C., Guiraud, J.-L., Souquet, J.-M., Vialet, S., Terrier, N., & Ollé, D. (2008). Validation of an Extraction Method on Whole Pericarp of Grape Berry (Vitis vinifera L. cv. Shiraz) to Study Biochemical and Molecular Aspects of Flavan-3-ol Synthesis during Berry Development. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(14), 5896–5904. doi:10.1021/jf800028k

Villaño, D., Fernández-Pachón, M. S., Moyá, M. L., Troncoso, A. M., & García-Parrilla, M. C. (2007). Radical scavenging ability of polyphenolic compounds towards DPPH free radical. Talanta, 71(1), 230–235. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.talanta.2006.03.050

Vivas, N. (2007). Les composés phénoliques et l’élaboration des vins rouges. Bordeaux: Ed. Feret.

Welke, J. E., Manfroi, V., Zanus, M., Lazzarotto, M., & Alcaraz Zini, C. (2013). Differentiation of wines according to grape variety using multivariate analysis of comprehensive two-dimensional gas chromatography with time-of-flight mass spectrometric detection data. Food Chemistry, 141(4), 3897–3905. doi:10.1016/j.foodchem.2013.06.100

Xu, Y., Simon, J. E., Welch, C., Wightman, J. D., Ferruzzi, M. G., Ho, L., … Wu, Q. (2011). Survey of Polyphenol Constituents in Grapes and Grape-Derived Products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(19), 10586–10593. doi:10.1021/jf202438d

Zsófi, Z., GÁL, L., SZILÁGYI, Z., SZŰCS, E., MARSCHALL, M., NAGY, Z., & BÁLO, B. (2009). Use of stomatal conductance and pre-dawn water potential to classify terroir for the grape variety Kékfrankos. Australian Journal of Grape and Wine Research, 15(1), 36–47. doi:10.1111/j.1755-0238.2008.00036.x