CERCET ĂRI ASUPRA MECANISMELOR CELULARE ȘI MOLECULARE ALE APOPTOZEI ERITROCITARE. APLICA ȚII ÎN PATOLOGIE, TRANSFUZIA SANGUIN Ă, TOXI- ȘI… [625844]

UNIVERSITATEA DE VEST „VASILE GOLDI Ș” DIN ARAD

FACULTATEA DE ȘTIIN ȚE ALE NATURII

ANA-MARIA GHEORGHE

CERCET ĂRI ASUPRA MECANISMELOR CELULARE ȘI
MOLECULARE ALE APOPTOZEI ERITROCITARE.
APLICA ȚII ÎN PATOLOGIE, TRANSFUZIA SANGUIN Ă,
TOXI- ȘI ECOTOXICOLOGIE

Rezumatul tezei de doctorat

Conduc ător știin țific:
Prof. univ. dr. Aurel ARDELEAN

– ARAD 2011 –

CUPRINS

INTRODUCERE 9

CAPITOLUL I.
CONSIDERA ȚII GENERALE ASUPRA ERITROCITULUI 12

I.1. ASPECTE MORFOLOGICE, STRUCTURALE ȘI DE FIZIOLOGIE A
ERITROCITULUI ANUCLEAT (UMAN) 13
I.1.1. Structura membranei eritrocitare umane: de l a extrac ție și purificare spre analiza
proteomic ă complet ă 13
1.1.1.1. Proteinele membranare 14
I.1.1.1.1. Glicoproteinele integrate 15
I.1.1.1.2. Proteinele periferice ale citoscheletulu i 19
I.1.1.2. Lipidele membranare 20
I.1.1.2.1. Colesterolul 20
I.1.1.2.2. Fosfolipidele 20
I.1.1.2.3. Glicolipidele 21
I.1.1.3. Aspecte ale interac țiunii proteine-lipide în forma și integritatea eritrocitelor 22
I.1.1.4. Permeabilitatea membranei, transportul de substan țe nutritive și reglarea
volumului eritrocitar 25
I.1.2. Structura și func ția hemoglobinei 30
I.1.3. Metabolismul eritrocitar 31
I.1.3.1. Rolul catabolismului glucozei 32
I.1.3.2. Șuntul raportului 32
I.1.3.3. Calea pentozo-fosfat 33
I.1.3.4. Metabolismul nucleotidelor cu adenin ă 34
I.1.3.5. Utilizarea altor componente 34
I.1.3.6. Metabolismul glicogenului 35
I.1.3.7. Metabolismul glutationului 35
I.1.3.8. Sistemul de reducere al methemoglobinei 35
I.1.3.9. Alte enzime 36
I.1.3.10. Metabolismul fierului 36
I.1.3.11. Hemoliza și metabolismul hemoglobinei 37
I.2. ASPECTE MORFOLOGICE, STRUCTURALE ȘI DE FIZIOLOGIE A ERITROCITELOR
NUCLEATE 38
I.2.1. Banda marginal ă a eritrocitelor nucleate 39
I.2.2. Propriet ăț ile morfologice și mecanice ale eritrocitelor nucleate 40
I.2.3. Hemoliza eritrocitelor nucleate 41
I.2.4. Caracteristicile eritrocitelor din Familia Ranidae, Genul Rana 41
I.3. CARACTERISTICILE ÎMB ĂTRÂNIRII ȘI APOPTOZEI ERITROCITARE ÎN CONTEXTUL
APOPTOZEI CELULARE CLASICE 44
I.3.1. No țiuni generale de apoptoz ă 44
I.3.1.1. Caracteristicile celulelor apoptotice 45
I.3.1.2. C ăile de derulare a apoptozei 46
I.3.1.3. Activarea fenomenului de apoptoz ă celular ă 47
I.3.1.4. Molecule implicate în apoptoz ă 48
I.3.2. Apoptoza eritrocitar ă 50
I.3.2.1. Îmb ătrânirea hematiilor – mai mult decât o asem ănare superficial ă cu fenomenul
de apoptoz ă 50
I.3.2.1.1. Diminuarea progresiv ă a taliei prin emisia de vezicule/modific ări
morfologice ale hematiei 50
I.3.2.1.2. Alterarea citoscheletului prin ac țiunea unor proteaze sau calpaine care
conduc la modific ări ale morfologiei celulelor 51
I.3.2.1.3. Desialilarea și capturarea hematiilor de c ătre macrofage 52

I.3.2.1.4. Pierderea asimetriei de membran ă a dublului strat lipidic și externalizarea
fosfatidilserinei 53
I.3.2.1.5. Activarea caspazelor -3 și -8 54
I.3.2.1.6. Activarea calpainelor 56
I.3.2.1.7. Eliminarea de corpi apoptotici și fagocitarea de c ătre macrofage 56
I.3.2.1.8. Recunoa șterea hematiilor senescente de c ătre macrofage 57
I.4. ASPECTE GENERALE PRIVIND PATOLOGIA ERITROCITULUI: A NEMII ȘI PROLIFER ĂRI
MALIGNE 63
I.4.1. Anemiile 63
I.4.1.1. Aspecte generale și hematologice în boala Gaucher 64
I.4.1.1.1. Aspecte generale ale bolii Gaucher 64
I.4.1.1.2. Aspecte hematologice în boala Gaucher 66
I.4.2. Sindroame proliferative (poliglobulii) 67
I.4.2.1. Policitemia vera 68

CAPITOLUL II.
TRANSFUZIA SANGUIN Ă ȘI PROBLEMELE EI ACTUALE. PERSPECTIVE 69

II.1. NO ȚIUNI GENERALE DESPRE TRANSFUZIA SANGUIN Ă ȘI PROBLEMELE EI ACTUALE 69
II.2. DIREC ȚII DE CERCETARE PENTRU AMELIORAREA CONDI ȚIILOR DE PRELEVARE ȘI
STOCARE A HEMATIILOR DESTINATE TRANSFUZIEI 72
II.2.1. Autotransfuzia la sportivii de performan ță 72

CAPITOLUL III.
APLICA ȚII ALE APOPTOZEI ERITROCITELOR ÎN TOXI- ȘI ECOTOXICOLOGIE 74

III.1. TENDIN ȚE MODERNE ÎN TOXICOLOGIA ȘI ECOTOXICOLOGIA MOLECULAR Ă;
INTRODUCEREA DE BIOMARKERI ȘI TESTE CELULARE PE BAZ Ă DE ERITROCITE 74
III.1.1. Fenomenul de apoptoz ă celular ă și relevan ța acestui fenomen în ecotoxicologie 75

CAPITOLUL IV.
MATERIALE ȘI METODE UTILIZATE ÎN CADRUL CERCET ĂRILOR PROPRII 77

IV.1. MATERIALE ȘI PRODUSE BIOLOGICE 77
IV.1.1. Produse chimice 77
IV.1.2. P roduse biologice 78
IV.2. METODE APLICATE ÎN REALIZAREA P ĂRȚII EXPERIMENTALE 78
IV.2.1. Prepararea pungilor de conservare a hematiilor 78
IV.2.2. Prepararea pungilor de conservare a hematiilor cu inhibitori de apoptoz ă 79
IV.2.3. Prepararea pungilor de conservare a hematiilor pent ru studiul ac țiunii radia țiilor
laser asupra viabilit ăț ii hematiilor stocate în mediul SAGM 80
IV.2.4. Prepararea pungilor de conservare a sângelu i pentru elaborarea unui test de
depistare a autotransfuziei la sportivi 81
IV.2.5. Evaluarea in vitro a toxicit ăț ii și ecotoxicit ăț ii unor nanoparticole (nanomateriale)
pe baz ă de apoptoz ă a eritrocitelor nucleate 83
IV.2.6. Metode biochimice de analiz ă 84
IV.2.6.1. Dozarea ATP-ului 84
IV.2.6.2. Dozarea hemoglobinei 84
IV.2.7. Metode de analiz ă bazate pe citometrie în flux 85
IV. 2.7.1. No țiuni generale de citometrie în flux 85
IV.2.7.2. Analiza și prezentarea datelor ob ținute prin citometrie în flux 87
IV.2.7.3. Estimarea modific ărilor de morfologie celular ă prin m ăsurarea absorb ției și
difuziei luminii (FSC/SSC) prin cito metrie în flux 89
IV.2.7.4. Aprecierea viabilit ăț ii eritrocitare prin m ăsurarea activita ții esterazelor
intracelulare cu Calcein-AM 90

IV.2.7.5. Studiul fenomenului de apoptoz ă celular ă prin citometrie în flux 92
IV.2.7.6. Analiza nivelului de desialilare a glicoc onjugatelor de membran ă eritrocitar ă 93
IV.2.7.7. Eviden țierea simultan ă a condrocitelor viabile, în apoptoz ă sau necroz ă, prin
dublu marcaj Anexin ă V-FITC/Iodur ă de Propidiu 94
IV.2.7.8. Determinarea activit ăț ii caspazelor -8 și -3 95
IV.2.7.9. Determinarea markerului de antirecunoa ștere CD47 96
IV.2.8. Metode de analiz ă pe baz ă de microscopie 97
IV.2.8.1. Analiza prin microscopie în lumin ă direct ă 97
IV.2.8.2. Analiza prin microscopie electronic ă 97

CAPITOLUL V.
CERCET ĂRI PRIVIND IMPLICAREA FENOMENULUI DE APOPTOZ Ă ÎN PATOLOGIA
ERITROCITULUI 99

V.1. STUDII DE EVIDEN ȚIERE A APOPTOZEI ERITROCITARE ÎN ANEMII 99
V.1.1. Analiza și caracterizarea eritrocitelor în maladia Gaucher 99
V.1.1.1. Analiza modific ărilor de morfologie 100
V.1.1.1.1. Analiza direct ă prin citometrie în flux în sistem FSC/SSC 100
V.1.1.1.2. Analiza prin microscopie electronic ă de baleiaj (SEM) 102
V.1.1.2. Analiza viabilit ăț ii celulare a hematiilor în Maladia Gaucher 105
V.1.1.3. Analiza citometric ă a markerilor de eritrofagocitoz ă 106
V.1.1.3.1. Aprecierea gradului de desializare a gli coconjugatelor 106
V.1.1.3.2. Eviden țierea gradului de externalizare a resturilor de fo sfatidilserin ă
la suprafa ța celular ă 107
V.1.1.3.3. Determinarea markerului de antirecunoa ștere CD47 107
DISCU ȚII 109
CONCLUZII 111
V.2. STUDII DE EVIDEN ȚIERE A APOPTOZEI ERITROCITARE ÎN SINDROAME
PROLIFERATIVE 112
V.2.1. Analiza și caracterizarea eritrocitelor în policitemia vera 112
V.2.1.1. Analiza eritrocitelor din policitemia vera înainte și dup ă tratament 113
V.2.1.1.1. Analiza prin citometrie în flux a modifi c ărilor de morfologie în sistem
FSC/SSC 113
V.2.1.1.2. Eviden țierea modific ărilor de morfologie prin microscopie optic ă în faz ă
invers ă 114
V.2.1.1.3. Eviden țierea modific ărilor de morfologie prin microscopie de scanare 115
V.2.1.1.4. Aprecierea gradului de desializare a gli coconjugatelor ca marker de
captur ă în eritrofagocitoz ă 116
V.2.1.1.5. Analiza viabilit ăț ii celulare cu Calcein-AM 118
V.2.1.1.6. Externalizarea de fosfatidilserin ă 119
V.2.1.1.7. Eviden țierea prin analiza de citometrie în flux a gradului de activare
pentru caspaza -8 ini țiatoare și caspaza -3 efectoare în fenomenul de
apoptoz ă 119
DISCU ȚII 120
CONCLUZII 122

CAPITOLUL VI.
CERCET ĂRI PRIVIND IMPLICAREA FENOMENULUI DE APOPTOZ Ă ȘI MODULAREA
ACESTUIA ÎN CONSERVAREA SÂNGELUI DESTINAT TRANSFUZ IEI PENTRU
AMELIORAREA CALIT ĂȚ II ACESTUIA 123

VI.1. CARACTERIZAREA PRIN CITOMETRIE ÎN FLUX A CALIT ĂȚ II SÂNGELUI ÎN ACTUALELE
CONDI ȚII DE PRELEVARE ȘI CONSERVARE DIN CENTRELE DE TRANSUZII 124
VI.1.1 Analiza calit ăț ii sângelui conservat în centrele de transfuzii pe baza criteriilor
clasice de viabilitate 124
VI.1.1 1. Testul de determinare a ATP-ului 124
VI.1.1 2. Determinarea hemolizei 125

VI.1.2. Analiza calit ăț ii sângelui conservat în centrele de transfuzii pe baz ă de noi criterii
de viabilitate prin citometrie în flux 126
VI.1.2.1. Criteriul morfologic determinat prin anal iza modific ărilor în sistem FSC/SSC 126
VI.1.2.2. Testul cu Anexin ă V-FITC de eviden țiere a externaliz ării fosfatidilserinei 129
VI.1.2.3. Test de viabilitate cu Calc ein-AM 130
DISCU ȚII 131
CONCLUZII 134
VI.1.3.Încerc ări de ameliorare a stoc ării sângelui prin utilizarea de inhibitori de apopt oz ă 135
VI.1.3.1. Criteriul morfologic 135
VI.1.3.2. Determinarea modific ării asimetriei membrane cu Anexin ă V-FITC
(externalizare de fosfatidilserin ă) 135
DISCU ȚII 139
CONCLUZII 139
IV.1.4.Studiul ac țiunii radia țiilor laser asupra viabilit ăț ii eritrocitelor stocate în
mediu SAGM 140
VI.1.4.1. Eviden țierea modific ărilor morfologice prin citometrie în flux și
microscopie electronic ă de baleiaj 140
VI.1.4.2. Eviden țierea prin citometrie în flux a asimetriei de membr an ă cu
Anexin ă V-FITC 142
VI.1.4.3. Aprecierea viabilit ăț ii celulare prin citometrie în flux cu Calcein-AM 1 43
DISCU ȚII 145
CONCLUZII 148
VI.2. UTILIZAREA APOPTOZEI ERITROCITARE CA FUNDAMEN T PENTRU ELABORAREA
UNUI TEST DE DEPISTARE A AUTOTRANSFUZIEI LA SPORTIV I 149
VI.2.1. Aprecierea viabilit ăț ii celulare cu Calcein-AM 149
DISCU ȚII 150
CONCLUZII 151

CAPITOLUL VII.
APLICA ȚII ALE APOPTOZEI ERITROCITELOR NUCLEATE ÎN TOXI- ȘI
ECOTOXICOLOGIE 152

VII.1. EVALUAREA IN VITRO PE MODEL EXPERIMENTAL DE LABORATOR A EFECTULUI
TOXIC ȘI ECOTOXICOLOGIC INDUS DE NANOPARTICOLE ASUPRA ERI TROCITELOR
NUCLEATE DE BATRACIAN 152
VII.1.1. Analiza prin citometrie în flux în sistem FSC/SSC a modific ărilor de morfologie 153
VII.1.2. Eviden țierea fenomenului de apoptoz ă celular ă indus ă de nanoparticole și testarea
toxicit ăț ii celulare pe eritrocite prin tehnici de microsco pie 155
VII.1.2.1. Analiza prin microscopie optic ă 155
VII.1.2.2. Analiza prin microscopie electronic ă de scanare (SEM) 155
VII.1.2.3. Analiza prin microscopie electronic ă de transmisie (TEM) 157
VII.1.3. Eviden țierea influen ței porfirinelor asupra viabilit ăț ii celulare determinat ă prin
citometrie în flux cu Calcein-AM 169
VII.1.4. Eviden țierea influen ței porfirinelor asupra mor ții celulare utilizând dublul marcaj
Anexin ă V/Iodur ă de propidiu 172
VII.1.5. Determinarea activit ăț ii caspazelor -8 și -3 sub ac țiunea porfirinelor 174
DISCU ȚII 177
CONCLUZII 179

CONCLUZII GENERALE 180
BIBLIOGRAFIE 183
LISTA LUCR ĂRILOR ȘTIIN ȚIFICE REALIZATE ÎN CADRUL TEZEI DE DOCTORAT 202

CAPITOLUL I.
CONSIDERA ȚII GENERALE ASUPRA ERITROCITULUI

Hematia, descoperit ă în secolul al 17-lea de c ătre Swammerdam (1658) și perfect
descris ă de Leeuwenhoek care a pus în eviden ță regularitatea formei sale discoidale și a
estimat diametrul s ău la 8 µm, r ămâne celula cel mai intens studiat ă datorit ă u șurin ței cu
care poate fi ob ținut ă și importan ței sale fiziologice de a transporta oxigen și dioxid de
carbon.
Durata de via ță a eritrocitelor este programat ă și variaz ă în propor ții mari de la o
specie la alta. Conform cercet ărilor lui Clark, 1988, durata de via ță a eritrocitelor unui cal
este de 150 zile, pentru om de 120 zile, pentru pis ici și soareci 40 zile, etc. Precizia
asem ănătoare unui ceas fiziologic, a intrigat de foarte m ult ă vreme cercet ătorii și a condus la
apari ția multor studii cu scopul de a identifica markerii membranari ai mor ții celulare
programate pentru aceste celule.
Ultimii zece ani au generat teme noi de cercetare l egate de fenomenul de apoptoz ă
eritrocitar ă, în special cu aplicabilitate direct ă în ameliorarea condi țiilor de p ăstrare a
sângelui în centrele de transfuzii (Bratosin et al., 2002a), dar și pentru eventuala implicare a
acestui fenomen în multe boli hematologice (Lang et al ., 2008).

CAPITOLUL II.
TRANSFUZIA SANGUIN Ă ȘI PROBLEMELE EI ACTUALE. PERSPECTIVE

Transfuzia de sânge reprezint ă unul din pu ținele tratamente folosite pentru
restaurarea oxigen ării țesuturilor atunci când se impune suplimentarea cant it ăț ii de oxigen.
Ea este larg folosit ă în zilele noastre în cazul pacien ților care au suferit pierderi acute de
sânge, a celor la care se manifest ă o producere inadecvat ă la nivel de maduv ă osoas ă sau
atunci când apare un fenomen de distrugere sporit ă a eritrocitelor. Înainte de a fi transfuzate,
eritrocitele pot fi stocate în condi ții controlate o perioad ă de pân ă la 42 zile, îns ă în timpul
stoc ării apar numeroase modific ări ca urmare a unei îmb ătrâniri accelerate. În mod generic
acestea au fost denumite „leziuni de stocare”, ce p ot altera func ția biologic ă a eritrocitelor
(Tinmouth et al., 2006). În țelegerea leziunilor de stocare este înc ă incomplet ă, Hogman et
al., (2006) sugerând c ă aten ția cercet ătorilor ar trebui s ă fie focusat ă pe conservarea
func ționalit ăț ii eritrocitelor în timpul stoc ării. În acest sens, introducerea de noi teste
sensibile și rapide de control a calit ăț ii sângelui destinat transfuziilor s-a impus cu nec esitate
(Mitrofan – Oprea et.al., 2007), la fel ca și ameliorarea condi țiilor de prelevare și conservare
a sângelui în centrele de transfuzie.

CAPITOLUL III.
APLICA ȚII ALE APOPTOZEI ERITROCITELOR ÎN TOXI- ȘI
ECOTOXICOLOGIE

Apoptoza este ast ăzi de un interes major în toxicologia molecular ă, jucând un rol
central în ac țiunea multor substan țe toxice, ceea ce îi confer ă un rol important în studiul
poten țialului lor toxicologic. În aceste condi ții, g ăsirea unor biomarkeri celulari de apoptoz ă,
sensibili, care furnizeaz ă informa ții mult mai obiective asupra gradului de poluare ac vatic ă,
poate conduce la imaginarea unor biosenzori celular i extrem de performan ți (Leung et al.,
2008). Eritrocitele nucleate de pe ști și batracieni, pot fi considerate pe de o parte, ad ev ăra ți
biosenzori celulari pentru studiul ecotoxicologic a l amestecurilor complexe de poluan ți, iar
pe de alt ǎ parte, un sistem alternativ pentru monitorizarea e cologic ǎ a mediului acvatic, în
perfect ă armonizare cu legisla ția în vigoare (Bratosin et al., 2007a). Astfel, ansamblul datelor
actuale pledeaz ă pentru utilizarea mai multor biomarkeri, afla ți la diferite nivele de
organizare biologic ă în sânul unui individ (molecular, celular, tisular ) sau la nivel de individ
în ansamblul s ău (biomarkeri fiziologici). În schimb, utilizarea b iomarkerilor ca instrumente
de previziune a riscului ecologic deschide pentru d eceniile viitoare un vast câmp de cercetare
și aplica ții.

CAPITOLUL IV.
MATERIALE ȘI METODE UTILIZATE ÎN CADRUL CERCET ĂRILOR PROPRII

Cercet ările întreprinse în cadrul prezentei teze de doctorat s-au înscris pe direc ția
complet ării și aprofund ării cuno știn țelor privind descifrarea fenomenului de apoptoz ă
eritrocitar ă și g ăsirea de modalit ăț i pentru modularea acestui fenomen, constituind un aport
la crearea bazelor unor noi terapii în bolile hemat ologice, precum și în ameliorarea
condi țiilor de prelevare și stocare a sângelui în centrele de transfuzie. De asemenea, ținând
cont de tendin ța actual ă din toxicologie și ecotoxicologie, care se bazeaz ă din ce în ce mai
mult pe înlocuirea testelor pe animale cu teste cel ulare, ne-am propus totodat ă utilizarea
eritrocitului și a fenomenului s ău de apoptoz ă în aceste domenii, ca o prioritate absolut ă,
pentru înlocuirea culturilor celulare, costisitoare și greu de intre ținut.

IV.1. MATERIALE ȘI PRODUSE
Sângele uman folosit în experien țe a fost ob ținut de la donatori s ănăto și și furnizat de
Centrul de Transfuzii al Armatei sau Centrul de Tra nsfuzie al Municipiului Bucure ști, iar
pentru maladiile luate în studiu a fost ob ținut de la Institutul Clinic Fundeni, Centrul de
Hematologie și Transplant Medular „ Șt. Berceanu’’, Bucure ști. Recuperarea eritrocitelor de

la bolnavii cu boala Gaucher s-a f ăcut pe sânge colectat pe heparin ă iar pentru studiul
eritrocitelor de la bolnavi cu policitemia vera, sâ ngele a fost recoltat pe citrat. În ambele
cazuri sângele a fost prelucrat la maximum 1 h dup ă colectare. S-a utilizat de asemenea
sânge de batracieni ( Rana sp. ), colectat sub anestezie, pe heparin ă.
Eritrocitele umane sau de batracian au fost sedi mentate prin centrifugare (1000 g, 4°
C, 5 min) pentru eliminarea plasmei, leucocitelor și plachetelor sanguine prin aspirare
împreun ă cu o mic ă cantitate de hematii. Sedimentul eritrocitar a fos t ulterior sp ălat de 3 ori
cu o solu ție tampon fosfat salin Dulbecco pH 7,4 și supus analizelor.

IV.2. METODE APLICATE ÎN REALIZAREA P ĂRȚII EXPERIMENTALE
Prepararea pungilor pentru conservarea hematiilor s-a realizat conform protocoalelor
aplicate în centrele de prelevare și conservare a sângelui pentru transfuzii. Sângele a fost
prelevat prin punc ționarea clasic ă în urm ătoarele condi ții: 450 ml de sânge au fost recolta ți în
63 ml de solu ție anticoagulant ă CPD (Citrat – Fosfat – Dextroz ă) de pH 5,5.
Dup ă 24 ore la 20°C, suspensiile eritrocitare au fost c entrifugate iar concentratul
globular ob ținut deleucocitat prin trecerea printr-un filtru Le ucoflex LST (Brevet
MacoPharma) a fost introdus la un hematocrit de 60% într-o solu ție de conservare SAGM
de pH 5,1 ± 0,3. Pungile au fost apoi p ăstrate la 4°C timp de maxim 6 s ăpt ămâni.
Pentru experien țele referitoare la tentativa de ameliorare a calit ăț ii și condi țiilor de
stocare a hematiilor în centrele de transfuzii , sângele a fost prelevat și conservat conform
procedurii detaliate anterior, dup ă care pungile au fost repartizate în alte pungi fab ricate
special de Laboratoarele MacoPharma, mai mici, con ținând inhibitori de apoptoz ă, respectiv
Ac-DEVD-cmk, Ac-DEVD-CHO , Ac-YVAD-fmk și Ac-Leu-Leu-Arg-CHO (leupeptin), cu o
concentra ție variind între 200 µM și 3 mM. Pentru ob ținerea mai rapid ă de rezultate am
procedat la o inducere accelerat ă a îmb ătrânirii hematiilor prin incubare la 37°C în prezen ță
sau în absen ță de inhibitori.
Experimentele pentru studiul efectului de reîntinerire exercitat de radia țiile laser
asupra hematiilor conservate în mediu SAGM s-au efectuat pe hematii provenind de la 2
donatori, conservate în pungi special confec ționate de c ătre MacoPharma, con ținând
eritrocite (ob ținute prin centrifugarea și deleucocitarea sângelui total) și păstrate în mediu
SAGM, la 4°C pentru o perioad ă de pân ă la trei s ăpt ămâni. Pentru a defini cele mai bune
condi ții de iradiere în ceea ce prive ște doza și durata expunerii, dou ă serii a câte 10 pungi au
fost iradiate la doze variind treptat de la 0,1 la 1 J x cm -3 pentru λ = 465 nm și de la 0,2 la 1,8
J x cm -3 pentru λ = 660 nm la 11, 14 și 21 de zile dup ă colectare. La un interval de 12 ore de
la iradiere eritrocitele au fost analizate prin cit ometrie în flux și tehnici complementare.

Pentru protejarea datelor ce fac obiectul unei cere ri de brevet, condi țiile de lucru și
rezultatele privind experien țele de punere la punct a unui test de depistare a autotran sfuziei
la sportivi, nu vor fi facute publice în prezentul rezumat, ele fiind cuprinse doar în teza de
doctorat.
Pentru studiile de toxicitate și ecotoxicitate în care am dorit s ă utiliz ăm un nou model
celular, respectiv eritrocitul de batracian, ne-am propus s ă luam în studiu mai multe
nanoparticole pe baz ă de porfirine și hibrizi ai acestora care au fost activate cu UV t imp de
10 minute și incubate ulterior în ser fiziologic pentru 24 de ore. Supernatantele au servit la
ob ținerea unor dilu ții seriale, variind între 0,008 și 0,0005 g/ml, în pl ăci cu godeuri pentru
culturi celulare. Eritrocitele nucleate de Rana sp . au fost incubate în aceste dilu ții pentru 24h,
la 20°C și analizate pentru investigarea efectului toxic pro dus de nanoparticole.

IV.2.7. METODE DE ANALIZ Ă BAZATE PE CITOMETRIE ÎN FLUX
Analizele de citometrie în flux (CMF) au fost reali zate cu un citofluorimetru
FACScan Becton Dickinson (San Jose, USA), achizi ția și analiza rezultatelor fiind efectuate
cu un soft CellQuest Pro. Toate studiile au fost re alizate de cel pu țin 3 ori și analizate în
triplicat de fiecare dat ă.

IV.2.7.3. Estimarea modific ărilor de morfologie celular ă prin m ăsurarea
absorb ției și difuziei luminii (FSC/SSC) prin citometrie în fl ux
Ținând cont de caracteristicile celulelor în apoptoz ă, respectiv de diminuarea taliei și
de cre șterea densit ăț ii și a con ținutului celular/granulozitate putem discrimina cel ulele viabile
de cele în apoptoz ă sau moarte, acestea având o pozi ționare pe citogram ă de tipul low FSC
(forward scatter)/high SSC (side scatter).
Mod de lucru: 100 µl de suspensie celular ă (10 5 celule) au fost transfera ți într-un tub
de analiz ă pentru FACS (Citometrul FACScan Becton Dickinson) și s-au adaugat 900 µl
PBS. Celulele au fost analizate în sistem linear F SC/SSC.

IV.2.7.4. Aprecierea viabilit ăț ii eritrocitare prin m ăsurarea activita ții
esterazelor intracelulare cu Calcein-AM
Viabilitatea celular ă s-a determinat conform protocolului elaborat de Br atosin et al.,
(2005b).
Mod de lucru: a fost preparat ă o solu ție stock 10 mM de Calcein-AM în DMSO
(dimetilsulfoxid) (1mg în 100 µl DMSO) care s-a con servat la -20° C și apoi s-a preparat
extemporaneu o solu ție de lucru 100 µM în tampon PBS, pH 7,4. Celulele (4 x 10 5 în 200 µl

tampon PBS) au fost incubate cu 10 µl de solu ție de lucru Calcein-AM (concentra ția final ă a
calceinei fiind de 5 µM), timp de 45 minute, la înt uneric. Înaintea analizei prin citometrie în
flux s-a ad ăugat 0,5 ml de tampon PBS. Achizi ția și analiza celulelor s-a realizat în sistem
linear pentru FSS/SSC și în sistem logaritmic pentru FL1.

IV.2.7.6. Analiza nivelului de desialilare a glicoc onjugatelor de membran ă
eritrocitar ă
În studiul modific ărilor glicoconjugatelor membranare sau în studiul r eceptorilor de
membran ă, lectinele sunt mult utilizate. Lectinele utilizat e de noi au fost specifice pentru
acid sialic sau pentru resturi de ß-Gal care puteau rezulta din desialilarea glicoconjugatelor,
cu o specificitate și mai exact ă, a șa cum este prezentat în Tabelul 3.

Tabelul nr. 3.
Lectinele utilizate în studiul nivelului de desiali lare al glicoconjugatelor
membranare
LECTINA ABREVIERE SPECIFICITATEA DE GLUCID Ă
Maackia amurensis MAA NeuNAc( Gal
Agglutinin, RCA 120 RCA ß-Gal
Sambucus nigra SNA NeuNAc( Gal/GalNAc
Triticum vulgaris WGA (GlcNAc)2, NeuNAc

Pentru fiecare lectin ă folosit ă s-au testat concentra ții optime subaglutinante, variind
între 0 și 50 mM, efectuându-se o analiz ă comparativ ă de apreciere a nivelului de fixare al
lectinei pe structurile glucidice specifice, prin compararea mediei (MFI) de fluorescen ță.
Mod de lucru: În vederea eviden țierii nivelului de desialilare al glicoconjugatelor
membranei eritrocitare, legarea lectinelor fluoresc ente s-a f ăcut prin incubarea în tuburi de
FACS a 50 µl de suspensie celular ă con ținând 2×10 6 hematii cu 100 µl dintr-o solu ție de
lectin ă marcat ă cu FITC (de concentra ții diferite în func ție de lectina utilizat ă), în tampon
PBS, pH 7,4. Dup ă incubarea pentru 1 h la 4 ° C s-au ad ăugat înca 350 µl PBS și celulele au
fost analizate prin CMF.

IV.2.7.7. Eviden țierea simultan ă a condrocitelor viabile, în apoptoz ă sau
necroz ă, prin dublu marcaj Anexin ă V-FITC/Iodur ă de Propidiu
Marcarea simultan ă cu Anexin ă V și PI ofer ă posibilitatea discrimin ării între celulele
aflate în apoptoz ă și cele în necroz ă sau în fazele târzii de apoptoz ă care conduc la moartea
celulei. Astfel, celulele necrotice vor fixa atât A nexina V cât și Iodura de Propidiu,
fluorocrom care p ătrunde în celul ă și se fixeaz ă de nucleu, în timp ce celulele apoptotice vor
fixa doar Anexina V care se leaga de resturile de f osfatidilserin ă.

Mod de lucru: 100µl de suspensie celular ă (2 x 10 5 celule) resuspenda ți în 1X
tampon de legare HEPES calcic (10 mM HEPES/NaOH, 14 0 mM NaCl, 2,5 mM CaCl 2, pH
7,4) au fost incuba ți cu 5 µl Anexin ă V-FITC și 10 µl PI timp de 30 minute la temperatura
camerei, în condi ții de obscuritate. Înainte de analiz ă s-au ad ăugat 400 µl de 1X tampon de
legare, iar suspensia a fost analizat ă prin citometrie în flux, în sistem biparametric FL 1/FL2
(fluorescen ța verde FITC/fluorescen ța ro șie PI) prin tehnica cadranelor.

IV.2.7.8. Determinarea activit ăț ii caspazelor -8 și -3
Determinarea activit ății caspazelor -3 și -8 s-a realizat cu reactivi con ținând inhibitori
specifici de caspaze marca ți cu fluorocromi, precum reactivii CaspGlow (FITC-D EVD-fmk
pentru caspaza -3 și FITC-IETD- fmk pentru caspaza -8).
Mod de lucru: 100 µl de suspensie celular ă (10 5 celule) au fost transfera ți într-un tub
de analiz ă pentru citometrie în flux și incuba ți cu 1 µl FITC-DEVD-fmk pentru caspaza -3
sau 1 µl FITC-IETD-fmk pentru caspaza -8, timp de 1 h la 37° C în atmosfer ă de 5% CO 2.
Dup ă incubare, suspensia celular ă a fost sp ălat ă de trei ori cu 0,5 ml tampon de sp ălare
furnizat în kit și celulele au fost analizate prin citometrie în fl ux utilizând fie canalul FL 1
(pentru fluorescen ța în verde) fie canalul FL 2 (pentru fluorescen ța în ro șu), în func ție de
fluorescen ța reactivului folosit.

IV.2.7.9. Determinarea semnalului de antifagocitoz ă CD47 ( „don’t eat me”)
Mod de lucru: În vederea determin ării semnalului de antirecunoa ștere CD47, 100 µl
de suspensie celular ă (10 5 celule) în tampon fosfat salin (PBS: 10 mM Na2H PO 4, 1,8 mM
KH2PO4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl) cu 1% albumin ă seric ă uman ă și 0,1% NaN 3 au fost
incuba ți cu 10 µl anti-CD47-PE (phycoerythrin) sau cu IgG1-PE pentr u martorul negativ
(martor de verificare a marc ării nonspecifice datorat ă eritrofiliei fa ță de anticorpi), la
temperatura camerei și la intuneric timp de 30 minute. Celulele au fost apoi sp ălate de trei ori
și resuspendate în 0,5 ml PBS dup ă care au fost analizate prin citometrie în flux în sistem
monoparametric FL2 (fluorescen ța ro șie a PE).

IV.2.8. METODE DE ANALIZ Ă PE BAZ Ă DE MICROSCOPIE
Pentru studiul microscopic, s-au utilizat metode d e analiza prin microscopie în
lumin ă direct ă și analiza de microscopie electronic ă.

IV.2.8.1. Analiza prin microscopie în lumin ă direct ă
Analiza prin microscopie în lumin ă direct ă s-a realizat cu ajutorul unui microscop
optic inversat model MCX1600 fabricat în Austria și camera Micro Publisher RTV 3 mp cu
răcire.
Mod de lucru: Pentru vizualizare, 100 µl de suspensie celular ă (10 6 celule) de
analizat s-au transferat într-o pl ăcu ță de cultur ă cu godeuri și s-au diluat prin ad ăugarea a 900
µl PBS. Celulele s-au vizualizat în suspensie.
IV.2.8.2. Analiza prin microscopie electronic ă
a) Microscopia electronic ă de scanare sau baleiaj (Scanning Electron Microsco py –
SEM)
Mod de lucru: Eritrocitele au fost fixate pentru 4 h cu o solu ție de 1,25%
glutaraldehid ă în tampon cacodilat de sodiu 0,1 M pH 7,2 și post-fixate timp de 4 h în
tetraoxid de osmiu 1% în acela și tampon. Suspensiile au fost apoi filtrate pe filt re Anodisc
de 0,2 µ, deshidratate în etanol, uscate cu dioxid de carbo n prin metoda punctului critic dup ă
care a avut loc vizualizarea probelor la SEM.
b) Microscopia electronic ă de transmisie (Transmission Electron Microscopy –
TEM)
Mod de lucru: Eritrocitele au fost supuse unei fix ări ini țiale cu glutaraldehid ă 2,5%
în tampon cacodilat 0,14 M timp de 30 de minute. Ce lulele au fost apoi postfixate timp de 15
minute în tetraoxid de osmiu 1%. Dupa osmificare, p robele au fost colorate în bloc cu uranil
acetat 2% timp de 15 minute, deshidratate, incluse în Epon 812 și polimerizate la 60° C timp
de 48 de ore. La final, eritrocitele au fost sec ționate la ultramicrotom la 60 nm și contrastate
cu acetat de uranil și citrat de plumb.
Microscopia electronic ă de transmisie s-a realizat cu un microscop Carl Ze iss EVO
LS15 și Philips EM 2008S, iar microscopia electronic ă de scanare s-a realizat cu diferite
microscoape de baleiaj, respectiv: Carl Zeiss EVO L S15, Carl Zeiss Sigma VP și JEOL35
CF.

CAPITOLUL V.
CERCET ĂRI PRIVIND IMPLICAREA FENOMENULUI DE APOPTOZ Ă ÎN
PATOLOGIA ERITROCITULUI

O prim ă direc ție de cercetare abordat ă în cadrul prezentei teze de doctorat a fot
investigarea existen ței unui posibil fenomen de apoptoz ă în patologia eritrocitului. Am luat
în studiu dou ă boli, și anume boala Gaucher și policitemia vera.

În cazul bolii Gaucher, bazându-ne pe cuno știn țele actuale și pe faptul c ă aceste
procese nu au fost înc ă investigate în aceast ă boal ă, am emis ipoteza c ă eritrocitele pot avea
propriet ăți anormale ceea ce poate favoriza și accelera fagocitarea lor.
Cercet ările noastre au vizat un studiu de caracterizare pr in citometrie în flux și tehnici
complementare de microscopie electronic ă de baleiaj, pentru investigarea unor biomarkeri de
apoptoz ă eritrocitar ă posibil implica ți într-o apoptoz ă accelerat ă având drept consecin ță
direct ă un mecanism de eritrofagocitoz ă masiv ă și ca urmare apari ția anemiei. Au fost lua ți
în studiu 7 pacien ți, numerota ți cu G1 pân ă la G7 și diagnostica ți cu boala Gaucher de tip 1.
Pacien ții G6 și G7 au fost analiza ți atât înainte cât si dup ă tratament. Rezultatele ob ținute pot
fi sintetizate astfel:
Analiza prin citometrie în flux a ar ătat modific ări morfologice semnificative ale
eritrocitelor Gaucher în cazul pacien ților netrata ți (Figura 40). Valorile pentru XGeoMean
(cell side scatter) propor ționale cu diametrul celular, au variat de la 157 (p acientul G2) la
354 (pacientul G6a) comparativ cu valorile eritroci telor normale, i.e. 313 ± 28. În acea și
manier ă, valorile pentru YGeoMean, valoare propor țional ă cu granularitatea intern ă, au
variat de la 213 (pacientul G2) la 301 (pacientul G4) comparativ cu valorile eritrocitelor
normale, i.e. 298± 25. Dup ă un tratament de nou ă luni cu enzim ă de substitu ție aceste
modific ări morfologice nu au mai fost observate la pacien ții G6 și G7, a șa cum se observ ă și
în Figura 40 (G6b și G7b).
Analiza SEM a eviden țiat pentru to ți pacien ții lua ți în studiu, prezen ța a numeroase
celule agregate și o mare varietate de eritrocite dismorfice care nu au fost g ăsite în
eșantioanele martor, confirmând, prin urmare, datele ob ținute prin analiza de citometrie.
Multe dintre celulele observate prezentau caracteri sticile morfologice ale echinocitelor,
schistocitelor, ovalocitelor și dacriocitelor (celule lacrimi), fiind observate și alte eritrocite
cu forme foarte ciudate, inclusiv unele celule apar ent cu trei fe țe asem ănătoare knizocitelor
(Figura 43). Cu toate acestea, nu au fost g ăsite dacriocite la pacien ții G4 și G5. Aceast ă
tendin ță spre poikilocitoz ă nu a mai fost observat ă la nou ă luni dup ă începerea ERT la
pacien ții G6 și G7.

Fig. 40 . Reprezentarea bidimensional ă (A) și tridimensional ă (B) a analizelor dot-plot în
sistem FSC/SSC, a eritrocitelor normale (N) și și a eritrocitelor Gaucher netratate (G1 la G5) și de la
pacien ții G6, G7 înainte (G6a-g7a) și dup ă (G6b-G7b) nou ă luni de tratament ERT (enzyme
replacement therapy). Abcisa și x: forward scatter (dimensiunea celulei); ordonat ă și y: side scatter
(densitatea celular ă); z: num ărul de celule.

Fig. 43 . Analiza prin microscopie electronic ă de baleiaj a unor forme de eritrocite
dismorfice întâlnite în maladia Gaucher. Anumite fo rme au fost anterior descrise în eliptocitoza
ereditar ă și în mielofibroza cu metaplazie mieloid ă ca: eliptocite sau ovalocite (11,16), dacriocite s au
celule în lacrim ă (16,20), schistocite sau fragmente de RBCs (7,10, 17), eritrocite în form ă de
triunghi (9,21) knizocite (8, 19, 24), în form ă de casc ă (11), crenellate (6 și 7) sau alte forme
(2,14,22,25).

În ceea ce prive ște gradul de desializare a glicoconjugatelor , nu s-a putut eviden ția
cu ajutorul lectinelor utilizate un fenomen de des ialilare urmat de demascarea de resturi de
β-galactozil care s ă induc ă capturarea hematiilor de c ătre macrofagele splenice, de și, teoretic,
aceasta desialilare ar fi fost perfect justificabil ă. Analiza prin citometrie în flux a eviden țiat

MFI-uri identice, atât pentru hematiile martor cât și pentru hematiile pacien ților atin și de
boala Gaucher.
Rezultatele ob ținute din analiza viabilit ăț ii celulare a hematiilor în boala Gaucher au
eviden țiat la to ți pacien ții o descre ștere a MFI pentru calcein ă (Means of Fluorescence
Intensity), ceea ce se traduce printr-o sc ădere a viabilit ății celulare. Aceast ă descre ștere a
variat în procente de la 8% (Pacientul G5) la 42% ( Pacientul G3) cu o medie de 22%.
Aceste rezultate pot fi explicate prin pierderea calceinei intracelulare datorit ă
permeabiliz ării membranelor sau chiar perfor ării acestora a șa cum se eviden țiaz ă în Figura
44.

Fig. 44. A: Suprapunerea histogramelor (un singur parametru) de determinare a activit ăț ii
esterazice (testul de viabilitate celular ă cu Calcein-AM) a eritrocitelor normale (N) și a eritrocitelor
Gaucher (G) provenind de la pacientul G4. MFI-Mean de fluorescen ță . X: FL1 în sistem logaritmic,
reprezint ă fluorescen ța Calceinei, produsul de clivare al Calcein-AM. Y: num ărul relativ de celule.
B: Analiza prin microscopie electronic ă de baleiaj a eritrocitelor Gaucher ce prezint ă membrana
perforat ă.

Analiza comparativ ă a expresiei antigenului CD47 pe suprafa ța hematiilor Gaucher
a ar ătat o diminuare semnificativ ă a valorii MFI, aceasta variind între 1% (Pacientul G6) și
26% (Pacientul G3). În plus, a șa cum se prezint ă și în Figura 47 pentru pacientul G7, s-a
observat o mare diversitate în expresia pe suprafa ța celular ă a receptorului CD47 eviden țiind
din acest punct de vedere mai multe subpopula ții. Propor ția între 2 dintre acestea, ex
regiunile M1 si M2 au prezentat o descre ștere dramatic ă a regiunii cu expresie mare a CD47
și o cre ștere a regiunii care con ține hematii cu un num ăr redus de receptori CD47, celule
susceptibile (prin dispari ția semnalului „ Don’t eat me ”) de a fi fagocitate, generând astfel o
fagocitoz ă accelerat ă urmat ă de anemia cunoscut ă și caracteristic ă acestei boli.

Fig. 47 : Analiza prin citometrie în flux a receptorului de membran ă CD47 („don’t eat me”)
de la eritrocite normale (N) și respectiv eritrocite Gaucher provenind de la paci entul G7. X: FL-2 în
sistem logaritmic reprezint ă fluorescen ța anticorpului anti-CD47-PE; Y: num ărul relativ de
celule. MFI: Mean de fluorescen ță .

În ceea ce prive ște sindroamele proliferative, am luat în studiu boa la policitemia
vera , propunându-ne ca plecând de la cuno știn țele actuale s ă caracteriz ăm și s ă investig ăm
eritrocitele mature provenind de la bolnavi cu poli citemia vera presupunând existen ța unui
mecanism de blocare a mor ții programate la acest nivel, ceea ce ar putea cond uce la o durat ă
de via ță mult mai mare a acestora și în consecin ță la cre șterea volumului total de eritrocite
circulante.
Rezultatele ob ținute pot fi sintetizate astfel:
Analiza direct ă a eritrocitelor prin citometrie în flux în sistem FSC/SSC , respectiv
talie/con ținut celular a eviden țit prezenta unor modific ări de morfologie, a șa cum se poate
constata din compara ția cu martorul sau cu eritrocitele provenind de la un pacient cu
policitemia vera sub tratament (Figura 48). Valoril e pentru XGeoMean și YGeoMean au
fost mult mai mici în cazul hematiilor de policitem ia vera, în special pentru YGeoMean
(densitate celular ă) indicând probabil o cantitate mai mic ă de hemoglobin ă
(YGeoMean=196,87), cantitate ce începe s ă creasc ă dup ă tratament (YGeoMean=222,58).

Fig. 48. Analiza modific ărilor de morfologie în sistem FSC/SSC. M-T0: Martor ; Eritrocitele
de policitemia vera înainte (PV-T0) și dup ă tratament (PVt-T0). Abscisa: forward scatter
(dimensiunea celulei); ordonat ă: side scatter (densitatea celular ă).

Prin analiza de microscopie optic ă morfologia hematiilor în policitemia vera avea apa rent
forma discoidal ă, îns ă un studiu mai fin, de detaliu, ob ținut prin microscopie de scanare, a
demonstrat, dup ă cum se observ ă în Figura 51, în special în Figura 51B, c ă întalnim morfologii
ce se abat de la forma clasic ă, prezentând forma de cup ă sau stomatocite.

Fig. 51. Analiza prin microscopie electronic ă de scanare a eritrocitelor de policitemia vera. A –
vedere de ansamblu; B-detalii de morfologie .

Ne-am propus totodat ă, să evalu ăm cu ajutorul lectinelor specifice de acid sialic și de
resturi de β-Gal, gradul de sialilare al eritrocitelor provenind de la bolnavi de polici temia vera
înainte și dup ă tratament ca baz ă eventual ă de identificare a unui marker de diagnostic.
Evaluarea s-a facut cu lectina WGA-FITC specific ă de β-GlcNAc și de α-NeuAc; MAA-
FITC specific ă de α-2,3-NeuAc; SNA-FITC specific ă pentru α-2,6-NeuAc și RCA-FITC
specific ă pentru resturi de β-Gal.
Rezultatele ob ținute sunt prezentate în Figura 52 sub form ă de histograme comparative,
prin suprapunere pentru fiecare lectin ă în parte. De și teoretic ar fi trebuit sa avem de-a face cu o
hipersialilare, care ar fi explicat men ținerea prelungit ă în circula ție a acestor eritrocite,
rezultatele au fost contrare. Astfel, în cazul lect inei WGA-FITC s-a putut observa o cantitate de
acid sialic comparativ cu martorul (MFI=122,8) mult mai scazut ă, atât în cazul eritrocitelor de
policitemia vera înainte (MFI=86,3) cât și dup ă tratament (MFI=90,67).
Comparativ, în cazul leg ării lectinei MAA-FITC am observat c ă eritrocitele de
policitemia vera provenind de la pacien ți netrata ți au o capacitate foarte redus ă de legare a
lectinei (MFI=23,05), care cre ște (MFI=36,77) dup ă tratament, ceea ce este mult mai apropiat de
capacitatea de fixare a eritrocitelor martor (MFI=4 7,88).

Lectina SNA-FITC s-a fixat de asemenea relativ mai pu țin pe eritrocitele netratate
(MFI=4,86) fa ță de cele tratate (MFI=5,52), Mean-ul de fluorescen ță fiind mult mai apropiat de
cel al martorului (MFI=5,65).
De și normal, în urma aparentei desialil ări dovedit ă prin fixarea lectinelor WGA, MAA și
SNA, ar fi trebuit ca lectina din RCA sa se fixeze mai mult pe eritrocitele de policitemia vera
netratate, MFI de 61,7 fiind mai apropiat de martor (76,73) decât MFI-ul pentru eritrocitele de
PV dup ă tratament (46,31), acest fapt ramânând o enigm ă.

Fig. 52. Analiza prin citometrie în flux a histogramelor de legare pentru lectinele WGA-FITC,
MAA- FITC, SNA-FITC, RCA- FITC pe eritrocite de pol icitemia vera înainte de tratament (PV) și dup ă
tratament (PVt) în compara ție cu eritrocite martor (M). X: FL1 în sistem logar itmic, reprezint ă
fluorescen ța lectinei marcat ă cu FITC. Numerele reprezint ă MFI (Media Intensit ăț ii de fluorescen ță ) Y:
num ărul relativ de celule.

Aplicarea testului de viabilitate celular ă cu Calcein – AM, a șa cum se observ ă din Figura
53, a demonstrat o viabilitate superioar ă, aprroape dubl ă, a eritrocitelor de la pacien ții cu
policitemia vera fa ță de normal, exprimat ă în valoarea intensit ăț ii de fluorescen ță , MFI=160 fa ță
de MFI=81 pentru martor. S-a e observat dup ă tratament o lejer ă diminuare a acesteia, MFI
ajungând la 156. Aceast ă activitate esterazic ă crescut ă în cazul hematiilor de la bolnavi cu
policitemia vera ar putea fi o eventual ă cauz ă a unei durate de via ță mai mari, ceea ce ar
determina și o cre ștere a hematocritului circulant.

Fig. 53. Determinarea prin citometrie în flux a activit ății esterazice (testul de viabilitate celular ă
cu Calcein-AM) a eritrocitelor martor (M-T0) și a eritrocitelor de policitemia vera înainte (PV-T 0) și
dup ă tratament (PVt-T0). X: FL1 în sistem logaritmic, r eprezint ă fluorescen ța Calceinei, produsul de
clivare al Calcein-AM. Y: num ărul relativ de celule.

CAPITOLUL VI.

CERCET ĂRI PRIVIND IMPLICAREA FENOMENULUI DE APOPTOZ Ă ȘI
MODULAREA ACESTUIA ÎN CONSERVAREA SÂNGELUI DESTINA T
TRANSFUZIEI PENTRU AMELIORAREA CALIT ĂȚ II ACESTUIA

În cadrul acestei direc ții de cercetare abordate de noi, ne-am propus într- o prim ă etap ă s ă
studiem comparativ calitatea hematiilor aplicând at ât criteriile clasice de studiu, respectiv
determinarea cantit ăț ii de ATP și hemoliza din mediul de conservare, cât și noi criterii bazate pe
analiza prin citometrie în flux, respectiv analiza modific ărilor de morfologie în sistem FSC/SSC,
eviden țierea externaliz ării fosfatidilserinei și determinarea viabilit ăț ii hematiilor.
Dozarea ATP-ului s-a realizat pe sânge conservat timp de 6 s ăpt ămâni. Dup ă cum se
observ ă în curba din Figura 56 cantitatea de ATP descre ște progresiv ajungând de la
concentra ția ini țial ă de 97 µg/dL la o concentra ție de 30 µg/dL dup ă 6 s ăpt ămâni (ceea ce
reprezint ă doar aproximativ o treime din concentra ția ini țial ă).
Paralel cu dozarea ATP-ului s-a urm ărit gradul de hemoliz ă din pungile de sânge ca
expresie a nivelului de moarte celular ă a hematiilor.
S-a constatat c ă gradul de hemoliz ă în primele dou ă s ăpt ămâni este foarte sc ăzut, aproape
inexistent în prima s ăpt ămân ă și cre ște progresiv în s ăpt ămânile 3 și 5, când ajunge la
aproximativ 0,5%. Hemoliza devine mai mare în s ăpt ămâna 5-6 de conservare, nedep ăș ind 1%,
conform graficului din Figura 57, r ămânând deci moderat ă și conform ă cu standardele admise
în practicile transfuzionale.

Fig. 56. Curba de evolu ție a cantit ăț ii de ATP din eritrocitele stocate timp de 6 s ăpt ămâni în
condi țiile de conservare practicate în centrele de transf uzii.

Fig. 57. Curba de evolu ție a gradului de hemoliz ă în timpul conserv ării hematiilor timp de 6
săpt ămâni în condi țiile practicate în centrele de transfuzii.

Dup ă aplicarea criteriilor clasice, am utilizat pentru determinarea calit ăț ii hematiilor
conservate și noile criterii bazate pe analiza prin citometrie în flux. A șa cum se observ ă în
Figura 58, analiza în sistem FSC/SSC (talie celular ă/densitate) pe durata conserv ării sângelui
timp de 6 s ăpt ămâni a ar ătat o diminuare important ă a taliei celulare și o cre ștere a densit ăț ii
acestora, celulele trecând de la forma discoidal ă la cea de sferoechinocite și sferocite netede. La
sfâr șitul celor 6 s ăpt ămâni fenomenul a fost accentuat, predominând sferoc itele netede.
Analiza modific ărilor de morfologie prin citometrie în flux s-a dov edit astfel un test
simplu și extrem de sensibil care poate da informa ții importante despre calitatea hematiilor
conservate, citogramele biparametrice fiind în conc ordan ță cu analiza prin microscopie de
scanare, putând în acest fel s ă substituie o metod ă mult mai laborioas ă. Ea prezint ă în acela și
timp avantajul de a fi statistic ă și cuantificabil ă prin analiza XGeoMean și YGeoMean.

Fig. 58. Analiza bidimensional ă (A) și tridimensional ă (B) în sistem FSC/SSC a hematiilor
conservate în mediu SAGM timp de 6 s ăpt ămâni. Abcisa și x: forward scatter (dimensiunea celulei);
ordonat ă și y: side scatter (densitatea celular ă, granularitate și refractivitate); z: num ărul de celule.

Aceste analize au fost în concordan ță cu determinarea gradului de externalizare de
fosfatidilserin ă, care a r ămas discret ă, nedep ăș ind 3,89 și 6,56% la 3 și 6 s ăpt ămâni de
conservare, iar în ceea ce prive ște media viabilit ăț ii fa ță de martorul ini țial, s-a putut observa o
pierdere a activit ăț ii esterazice dup ă 3 și 6 s ăpt ămâni, ceea ce semnific ă o îmb ătrânire celular ă,
dup ă cum se poate observa în figura 63.

Fig. 63. Studiul comparativ al viabilit ăț ii (test citofluorimetric în FL1 cu Calcein-AM) hem atiilor
conservate în mediul SAGM timp de 3 s ăpt ămâni (3S) și 6 s ăpt ămâni (6S). T: hematii martor la
momentul prelev ării și stoc ării. Numerele reprezint ă MFI (Mean of fluorescence intensity). X: FL1 în
sistem logaritmic, reprezint ă fluorescen ța Calceinei, produsul de clivare al Calcein-AM. Y: num ărul
relativ de celule.

VI.1.2. ÎNCERC ĂRI DE AMELIORARE A STOC ĂRII SÂNGELUI PRIN
UTILIZAREA DE INHIBITORI DE APOPTOZ Ă

În contextul stadiului de cunoa ștere în domeniu, odat ă cu eviden țierea mor ții eritrocitare
ca fenomen de apoptoz ă, s-a demonstrat și posibilitatea bloc ării acesteia cu inhibitori de
apoptoz ă (Bratosin et. al., 2001a), ceea ce ne-a condus la ideea amelior ării condi țiilor de stocare
prin utilizarea acestor inhibitori, cu posibilitate a ulterioar ă de ob ținere a unor noi medii de
conservare pentru centrele de transfuzii. Pentru ac easta, am testat prin citometrie în flux efectul
inhibitorilor de caspaze ( Ac-DEVD-CHO , Ac-YVAD-fmk) și calpaine (Ac-Leu-Leu-Arg-CHO
(leupeptin), cu o concentra ție variind între 200 µM si 3 mM.
Analiza în sistem FSC/SSC (talie celular ă/densitate), a ar ătat c ă inhibitorii utiliza ți
reu șesc s ă împiedice modificarea morfologiei celulare, ceea c e semnific ă inhibarea enzimelor
implicate în apoptoz ă, știut fiind c ă modificarea morfologiei hematiilor se datoreaz ă alter ării
citoscheletului prin atac enzimatic. Dup ă cum se observ ă în Figura 67, nivelul de externalizare a
resturilor de fosfatidilserin ă a fost mai mic, fiind inhibat în prezen ța inhibitorilor de apoptoz ă,
atât pentru caspaze (47,5% și 30,5%) cât și pentru calpain ă (56%) fa ță de 74,9% pentru
hematiile îmb ătrânite în absen ță de inhibitori.

Fig. 67. Analiza comparativ ă prin citometrie în flux a gradului de externalizar e de
fosfatidilserin ă determinat cu Anexin ă V-FITC, a hematiilor conservate în mediu SAGM în a bsen ța (b) și
în prezen ță de inhibitori de apoptoz ă: Ac-DEVD-CHO (c), Ac-YVAD-fmk (d), leupeptin ă (e) și amestec
Ac-YVAD-fmk + leupeptin ă (f). Hematiile la momentul To al conserv ării (a). Conservarea a avut loc la
37°C, îmb ătrânire în sistem accelerat, timp de 4 zile. Concen tra ția de inhibitori a fost de 3mM pentru
fiecare inhibitor. FL1: fluorescen ța Anexinei V-FITC. FL2: autofluorescen ța rosie.

Se observ ă de asemenea c ă mecanismul de moarte eritrocitar ă a fost mult mai bine
inhibat prin utilizarea unui amestec pentru ambele sisteme enzimatice implicate în degradarea
eritrocitului (sistemul caspaze/calpain ă), respectiv prin utilizarea unui amestec în concen tra ții
egale de Ac-DEVD-CHO+ leupeptin ă, unde procentul de celule moarte este de doar 23%.
Utilizarea unor concentra ții crescute de inhibitori nu a m ărit efectul protector și nu a
împiedicat moartea hematiilor. Dintre to ți inhibitorii utiliza ți, s-a constatat c ă Ac-YVAD-fmk
inhib ă mai bine modific ările de morfologie celular ă fa ță de Ac-DEVD-CHO, ceea ce semnific ă
blocarea caspazei 8 ini țiatoare. Protec ția a fost crescut ă în prezen ța amestecului în p ărți egale a
acestui inhibitor cu leupeptin ă.

IV.1.4. STUDIUL AC ȚIUNII RADIA ȚIILOR LASER ASUPRA VIABILIT ĂȚ II
ERITROCITELOR STOCATE ÎN MEDIU SAGM

În scopul amelior ării condi țiilor de conservare a eritrocitelor destinate trans fuziei am
încercat de asemenea o „reîntinerire” a acestora pr in aplicarea unor tehnici de iradiere cu laser
de joas ă frecven ță .
Experimentele s-au efectuat pe sânge provenind de l a 2 donatori iar analiza calit ăț ii
hematiilor s-a bazat pe acelea și teste de citometrie în flux descrise la Capitoul IV, derulate pe o
perioad ă de timp de pân ă la 3 s ăpt ămâni.
Figura 68 și Figura 69 prezint ă, de o manier ă comparativ ă, valorile ob ținute pentru
XGeoMean și YGeoMean rezultate din analiza în sistem FSC/SSC a eventualelor modific ări de
morfologie (FSC) sau de lejera hemoliz ă (SSC) survenite prin iradierea minipungilor de sto care
a hematiilor. Am putut constata c ă fa ță de martorul de hematii la momentul T0 și fa ță de
martorul de conservare f ără iradiere (a1 și b1, pentru ambii donatori) hematiile iradiate nu au
prezentat varia ții semnificative ale XGeoMean-ului, deci de morfolo gie, și nici nu au suferit o
hemoliz ă importan ță, pledând astfel pentru efectul benefic, de reîntin erire al radia țiilor laser
asupra sângelui conservat și iradiat dup ă 21 zile.

Fig. 68. Varia țiile XGeoMean și YGeoMean pentru probele de hematii provenind de l a
donatorul 1 conservate în mediu SAGM timp de 3 s ăpt ămâni și iradiate cu laser de joas ă frecven ță .

Fig. 69 . Varia țiile XGeoMean și YGeoMean pentru probele de hematii provenind de l a Donatorul
2 conservate în mediu SAGM timp de 3 s ăpt ămâni și iradiate cu laser de joas ă frecven ță .

S-a observat de asemenea un efect benefic, de reîn tinerire, al iradierii laser, conform
Figurii 71, unde în sistemul de suprapunere a histo gramelor s-a constatat cre șterea viabilit ăț ii
celulare în cazul e șantioanelor iradiate fa ță de martor (procent de celule viabile de aproximati v
97 % și respectiv 98,8% fa ță de 66% pentru martor).

Fig. 71 . Determinarea viabilit ăț ii cu Calcein-AM a hematiilor neiradiate (M) și iradiate (b9 și
b19) ale donatorului 2. λ: lungimea de und ă a iradierii; M: regiunea de celule fluorescente cu membrana
celular ă intact ă (celule vii) și M2: regiunea de celule nefluorescente cu membrana celular ă alterat ă
(celule moarte). Abscisa: intensitatea fluorescen ței verzi a calceinei (FL-1) în sistem logaritmic.
Ordonat ă: num ărul de celule.

CAPITOLUL VII.
APLICA ȚII ALE APOPTOZEI ERITROCITELOR NUCLEATE ÎN TOXI – ȘI
ECOTOXICOLOGIE

Cercet ările întreprinse de noi s-au focalizat cu prioritat e pe identificarea efectelor produse
de nanomateriale și pe stabilirea concentra țiilor de risc pentru s ănătate și mediu prin noi metode
de investigare celular ă bazate în special pe tehnici de citometrie în flux corelate cu tehnici de
microscopie optic ă și electronic ă.
Analiza prin citometrie în flux a ar ătat modific ări morfologice semnificative a eritrocitelor
nucleate incubate timp de 24 ore în supernatantele saline ale diferitelor nanomateriale luate în
studiu (P1=Meso-tetra-tolil-porfirin ă; P2=Sol-gel_Meso-tetra-tolil-porfirin ă, cataliz ă acido-
bazic ă, HCl:TEOS=0,02:1; NH3: TEOS=0,0142:1; P3=Zn (II) – meso-tetra-piridil-porfirin ă;
P4=Sol-gel_Zn(II)-meso-tetra-piridil-porfirin ă, cataliz ă acid ă; P5=Sol-gel_Zn (II) -meso-tetra-
piridil-porfirin ă, cataliz ă acido-bazic ă; P6=Meso-tetra-(3,4-dimetoxi-fenil)-porfirin ă meso-
5,10,15,20-tetra(3,4dimetoxi-fenil) porfirin ă; P7=Sol-gel_Meso-tetra-(3,4-dimetoxifenil)-
porfirin ă, cataliz ă acid ă; P8=Sol-gel_Meso-tetra-(3,4-dimetoxifenil)-porfiri n ă, cataliz ă acido-
bazic ă) comparativ cu eritrocitele nucleate incubate doa r în solu ție salin ă izoton ă (T24h),
martorul de control.
Imaginile de microscopie optic ă prezentate în Figura 75 au confirmat în întregime d atele
ob ținute prin analiza citometric ă în sistem FSC/SSC și au ar ătat c ă modific ările morfologice ale
eritrocitelor nucleate au fost asociate cu contrac ția și modificarea formei celulelor (cell
shrinkage) demonstrate prin diminuarea parametrului FSC și cre șterea parametrului SSC, una
dintre tr ăsăturile caracteristice ale fenomenului de apoptoz ă.
Imaginile microscopice ale eritrocitelor nucleate incubate în supernatantele ob ținute prin
preincubarea nanomaterialelor în solu ție salin ă fiziologic ă au eviden țiat schimb ări morfologice
ce nu sunt uniforme pentru toate probele, nici ca i ntensitate și nici ca manier ă de manifestare,
dovedind faptul c ă ele reflect ă în mod corect toxicitatea probabil ă a diferitelor probe.
Modificarea morfologiei elipsoidale la forme rotund e, ne-a dus cu gândul la un fenomen
de apoptoz ă. Aceste modific ări sunt foarte numeroase în cazul probelor P2 și P3, iar atunci când
sunt înso țite de un aspect transparent, dovedesc c ă aceste celule sunt moarte.

Probele P4 și P7 au indus un aspect morfologic nea șteptat, comparabil cu o „roat ă de
biciclet ă”, datorat unui fenomen de hemoliz ă intens ă. Foarte interesant, în proba P5,
nanomaterialul corespunz ător nu a modificat de aceea și manier ă structura celular ă, ci a produs,
și mai bizar, un fel de „mega pori” sau „g ăuri”. Acela și fenomen am putut observa și la proba
P8, dar mai pu țin evident.
Fig. 75. Analiza modific ărilor de morfologie prin microscopie optic ă a eritrocitelor nucleate
normale (To și T24h) și expuse ac țiunii nanomaterialelor (P1-P8) la 0,008 g/ml. S ăgeata neagr ă:
eritrocite cu „mega pori” sau „g ăuri”. S ăge ți albe: eritrocite în form ă de „ro ți de biciclet ă”.

Pentru o analiz ă detaliat ă a modific ărilor de morfologie observate prin microscopie opti c ă
s-a realizat atât o analiz ă prin microscopie de scanare (SEM) cât și microscopie electronic ă de
transmisie (TEM) . Într-o prim ă etap ă ne-am propus s ă compar ăm efectele produse de cele trei
tipuri de nanoparticole P1, P3 și P6.
Modific ările de morfologie eviden țiate prin analiza SEM au fost urmatoarele:
– Expunerea eritrocitelor nucleate la ac țiunea a 0,008 g/ml de prob ă P1 a condus la apari ția
unor pori cu m ărimi ce au variat între 0,71 µm și 2,22 µm precum și la reliefarea nucleelor
rămase central, probabil datorit ă unui fenomen de hemoliz ă. Analiza din Figura 78, ob ținut ă prin
examinarea eritrocitelor nucleate expuse la ac țiunea aceleia și probe (P1), a confirmat hemoliza
prin existen ța a numeroase nuclee proeminente (Figura 78 a și b) precum și existen ța porilor a șa
cum se prezint ă în detaliu în Figura 78 (d, e și f). De asemenea, s-a observat aderarea puternic ă a
nanoparticolelor la suprafa ța celular ă.

Fig. 78. Analiza prin microscopie electronic ă de baleiaj a modific ărilor de morfologie pentru
eritrocitele nucleate expuse ac țiunii probei P1( Meso-tetra-tolil-porfirin ă) la 0,008 g/ml.

– Modific ările de morfologie induse de ac țiunea probei P3 au fost mult mai profunde,
înso țite de schimbarea formei elipsoidale la celule rotu nde și de o puternic ă ata șare a
nanoparticolelor la suprafa ța celular ă (Figura 79).

Fig. 79. Analiza prin microscopie electronic ă de baleiaj a modific ărilor de morfologie pentru
eritrocitele nucleate expuse ac țiunii probei P3 ( Zn (II) -meso-tetra-piridil-porfirin ă) la 0,008 g/ml.

– Sub efectul produs de P6 la 0,008 g/ml, s-au conf irmat observa țiile noastre de
microscopie optic ă, respectiv apari ția unui aspect de „ro ți de biciclet ă” (Figura 80 a și b) care de
fapt se datoreaz ă unei puternici hemolize cu p ăstrarea pozi țion ării centrale a nucleului, fapt
eviden țiat foarte clar prin analiza SEM. De asemenea, s-a u confirmat „mega-porii” observa ți,
precum și ata șarea nanoparticolelor la suprafa ța celular ă. Luând în compara ție deriva ții de
nanoparticole, respectiv probele P2, P4 și P5, am observat efectul net toxic al probei P2 cu
modificarea formei elipsoidale a eritrocitelor la f orme rotunde, precum și aderarea (în toate
cazurile) a nanoparticolelor la suprafa ța eritrocitelor nucleate.

Fig. 80. Analiza prin microscopie electronic ă de baleiaj a modific ărilor de morfologie pentru
eritrocitele nucleate expuse ac țiunii probei P6 ( Meso-tetra-(3,4-dimetoxi-fenil)-porfirin ă meso-
5,10,15,20-tetra(3,4dimetoxi-fenil) porfirin ă) la 0,008 g/ml.

Pentru eviden țierea modific ărilor de ultrastructur ă, eritrocitele nucleate martor și cele
asupra c ărora s-a exercitat efectul toxic al nanoparticolelo r, au fost analizate prin microscopie
electronic ă de transmisie, în special pentru a se confirma (sa u infirma) existen ța mega-porilor
observa ți anterior.
Astfel, rezultatele ob ținute prin microscopie electronic ă de transmisie în sistem direct (f ără
includere și t ăiere în parafin ă) au eviden țiat sub efectul nanoparticolelor din proba P8, o
condensare nuclear ă cu schimbarea pozi ției acestuia, din centrul celulei spre periferie, u mflarea
mitocondriilor și localizarea lor lâng ă membrana celular ă, probabil în vederea unei expulz ări
ulterioare sub form ă de corpi apoptotici precum și numeroase vacuole (Figura 84A).
În Figura 84B și 84C, se poate observa un detaliu ultrastructural al unui „megapor”, cu
talie de aprox. 500 nm, remarcându-se p ăstrarea continuit ăț ii membranare în jurul acestuia.

Fig. 84. Eviden țierea prin microscopie electronic ă de transmisie în sistem de analiz ă direct ă a
porilor ap ăru ți în structura eritrocitelor nucleate sub ac țiunea nanoparticolelor (A și B); C reprezint ă
detaliu de structur ă al unui por. S ăgeata indic ă prezen ța mitocondriilor modificate la marginea celulei.

Observa țiile ob ținute prin microscopie de transmisie efectuate pe s ec țiuni de eritrocite
nucleate înglobate în parafin ă și prezentate în Figura 85, ne-au furnizat detalii s uplimentare ale
modific ărilor morfologice induse de diferitele tipuri de na noparticole, respectiv schimbarea

formei elipsoidale la alte morfologii, inclusiv fo rma rotund ă (a, c, g, j), desprinderea nucleului
de materialul trans-BM (TBM) în vederea expulz ării sub form ă de corpi apoptotici (c, d, f) și
fragmentarea nucleului în vederea elimin ării sub form ă de corpi apoptotici (b și k).

Fig. 85. Eviden țierea prin microscopie electronic ă de transmisie a principalelor modific ări induse
asupra eritrocitelor nucleate prin ac țiunea nanoparticolelor.

În ceea ce prive ște efectul nanomaterialelor asupra viabilit ăț ii eritrocitelor nucleate, a șa
cum se arat ă în Figura 86, num ărul de celule viabile (regiunea M1) a sc ăzut drastic ca o expresie
a toxicit ăț ii nanomaterialelor în special pentru P3 (în jur de 31,5%) sau P2 (aproximativ 43,2%),
comparativ cu popula ția de eritrocite martor (aproximativ 94%). Posibil itatea ob ținerii de curbe
cantitative doz ă-răspuns face din acest test, un test de toxicitate sa u de eco-toxicitate,
permi țându-ne s ă determin ăm EC50.
Pentru a investiga tipul de moarte celular ă indus ă de porfirine, am aplicat apoi un dublu
marcaj cu Anexin ă V și Iodur ă de propidiu (PI), conform protocolului descris la Capitolul IV
Materiale și Metode. Eritrocitele normale precum și cele incubate au fost analizate prin
citometrie în flux pentru a observa expunerea la su prafa ța celular ă de fosfatidilserin ă (PS) cu
ajutorul fix ării de aceste resturi a Anexinei V-FITC și urm ărindu-se în acela și timp
permeabilitatea membranei prin marcare cu PI.
Dup ă cum se poate observa în Figura 89, nanomaterialele pe baz ă de porfirine sau hibrizii
lor au avut in vitro efecte extrem de toxice asupra eritrocitelor nucle ate într-un mod dependent
de doz ă, ceea ce permite calcularea EC50.

Fig. 86. Analiza comparativ ă a histogramelor de viabilitate ob ținute cu Calcein-AM pentru eritrocite
normale nucleate (To și T24h) și expuse ac țiunii nanomaterialelor (P1-P8) la 0,008 g/ml. M1: r egiunea
de celule fluorescente cu membran ă celular ă intact ă (celule vii) și M2: regiune de celule nefluorescente
cu membrana celular ă alterat ă (celule moarte). Abscisa: intensitatea fluorescen ței verzi a calceinei (FL-1)
în sistem logaritmic. Ordonat ă: num ărul de celule.
Fig. 89. Cubele doz ă-răspuns de calcul a EC-50 conform cu procentul de eri trocite moarte
determinate prin dublul marcaj Anexin ă V-FITC și iodur ă de propidiu. Abscis ă: concentra ția de
nanomateriale. Ordonat ă: % de celule moarte (celulele în apoptoz ă și necroz ă) ob ținut prin
sc ăderea din % de celule totale (100%) a % de celule viabile din cadranul stânga jos din analiza
prin tehnica cadranelor a celulelor marcate cu Anex in ă V-FITC și Iodur ă de propidiu.

Rezultatele noastre au demonstrat c ă eritrocitele nucleate pot reprezenta un model exce lent
de studiu, u șor de folosit, f ără costuri legate de cultivarea și de men ținerea în cultur ă a celulelor
eucariote. 010 20 30 40 50 60 70 80
0 0.0005 0.001 0.002 0.004 0.008
Concentratie (g/ml) % Celule moarte T24h
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8

De asemenea, rezultatele noastre au indicat pe de o parte faptul c ă sensibilitatea
eritrocitelor nucleate la nanomateriale a crescut și mai mult, iar informa țiile ar putea fi utile
pentru dezvoltarea de teste rapide și cu pre ț sc ăzut de ecotoxicitate.
Totodat ă, s-a eviden țiatfaptul c ă apoptoza eritrocitar ă poate fi un biomarker ecotoxicologic
eficient, capabil s ă furnizeze informa ții semnificative referitoare la un stres de mediu, indiferent
care este acesta.

CONCLUZII GENERALE

1. Analiza eritrocitelor din boala Gaucher și din policitemia vera prin citometrie în flux în
sistem FSC/SSC și tehnici de microscopie electronic ă au eviden țiat pentru prima dat ă în
literatur ă modific ări de morfologie importante ce se abat de la forma clasic ă discoidal ă.
2. Reducerea viabilit ăț ii eritrocitelor în boala Gaucher eviden țiat ă prin citometrie în flux cu
Calcein-AM asociat ă și cu o expresie redus ă a receptorului CD47, marker de anti-fagocitoz ă,
poate fi explica ția unei eritrofagocitoze masive și implicit a anemiei caracteristice acestei
boli.
3. Studiul citofluorimetric cu ajutorul unor lectine s pecifice de acid sialic a eviden țiat de
asemenea pentru prima dat ă un grad redus de sialilare a glicoconjugatelor din membrana
eritrocitelor de policitemia vera, care îns ă revine aproape de normal dup ă tratament,
confirmând studii întreprinse prin spectrometrie de mas ă/cromatografie în faz ă gazoas ă,
rezultat ce ar putea constitui un test de depistare și diagnostic u șor de aplicat.
4. Viabilitatea m ărit ă a eritrocitelor din policitemia vera, aproape dubl ă, poate cauza o durat ă
mai lung ă de circula ție a acestora generatoare de hematocrit crescut, ca re se completeaz ă cu
un nivel de externalizare normal al resturilor de f osfatidilserin ă explicând de asemenea
hematocritul crescut.
5. Procentajul de celule caspaz ă-3 activ ă mai mare la eritrocitele din policitemia vera, atâ t
înainte cât și dup ă tratament, demonstreaz ă încercarea organismului de restabilire a unui
hematocrit normal prin activarea mecanismului propr iu de apoptoz ă în vederea asigur ării
homeostaziei organismului.
6. Aplicarea noilor criterii de viabilitate a hematiil or, bazate în principal pe utilizarea
citometriei în flux, au permis o evaluare comparati v ă cu criteriile clasice referitor la
conservarea sângelui destinat transfuziei în mediu SAGM timp de 6 s ăpt ămâni. Acest studiu
a demonstrat în dinamica conserv ării apari ția „leziunilor de conservare” și implicit

necesitatea imperioas ă de ameliorare a condi țiilor de prelevare și stocare a hematiilor în
centrele de transfuzii.
7. Noile criterii aplicate se dovedesc metode simple, statistice și eficiente de apreciere a
calit ăț ii sângelui conservat în centrele de transfuzii ce ar putea fi introduse pentru testarea
pungilor de sânge înainte de practicarea actului tr ansfuzional, în vederea elimin ării riscurilor
transfuzionale, în special la pacien ții politransfuza ți.
8. Utilizarea inhibitorilor clasici de apoptoz ă (Ac-YVAD-fmk pentru caspaza-8, DEVD-CHO
pentru caspaza-3 efectoare dar și leupeptina pentru calpaine) ad ăuga ți în mediul clasic
SAGM a condus la blocarea fenomenului de apoptoz ă eritrocitar ă, dovedit ă prin conservarea
morfologiei discoidale și a bloc ării fenomenului de externalizare a fosfatidilserine i, rezultate
ce deschid perspectiva unor cercet ări aprofundate pentru modularea mor ții hematiilor în
sistemele de conservare a sângelui și în special a identific ării unor inhibitori de origine
vegetal ă accepta ți în terapia transfuzional ă.
9. Supunerea eritrocitelor unui tratament cu laser de joas ă frecven ță a condus, pe baza aplic ării
noilor criterii prin citometrie în flux, la cre șterea spectaculoas ă a viabilit ăț ii hematiilor,
efectele de „întinerire” a hematiilor conservate în mediu SAGM fiind propor ționale cu doza
și timpul de iradiere, cea mai bun ă practic ă dovedindu-se iradierea sângelui chiar înainte de
transfuzie.
10. Cercet ările noastre bazate pe exploatarea unei metode orig inale de apreciere a viabilit ăț ii
hematiilor umane asociat ă cu metoda de studiu ecotoxicologic „stress on stre ss” ne-au
condus la stabilirea condi țiilor pentru elaborarea unui test simplu și sensibil de depistare a
autotransfuziei la sportivii de performan ță .
11. Nanomaterialele porfirinice sau pe baz ă de porfirine au demonstrat in vitro un efect nociv
asupra eritrocitelor nucleate prin inducerea unui f enomen de apoptoz ă iar modific ările
tuturor parametrilor eritrocitari investiga ți sunt puternic corelate cu cre șterea concentra ției de
nanoparticole sau tipul de nanomaterial, ceea ce pe rmite calcularea concentra ției EC 50
12. Determinarea viabilit ăț ii eritrocitelor nucleate prin citometrie în flux p recum și discriminarea
mor ții celulare ar putea oferi un instrument rapid și precis de analiz ă pentru evaluarea in
vitro a r ăspunsurilor biologice la ac țiunea nanoparticulelor, pentru evaluarea toxicit ăț ii și
biosecurit ăț ii nanomaterialelor precum și pentru determinarea nanotoxicit ăț ii mediului, dar și
pentru studiul ac țiunii unor al ți factori poluan ți.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă

1. Benga G., Popescu O., Pop V.I., Holmes R. P., P-(Ch loromercuri) benzenesulfonate
binding by membrane proteins and the inhibition of water transport in human
erythrocytes, Biochemistry , 25, 1535-1538, 1986a.
2. Benga G., Water channel proteins (later called aqua porins) and relatives: past, present
and future (Review), IUBMB Life, 61, 112-133, 2009.
3. Beutler E., Back to the future in RBCs preservation , Transfusion, 40, 893-895., 2000.
4. Bratosin D., Estaquier J., Petit F., Arnoult D., Qu atannens B., Tissier J.P., Slomianny C.,
Sartiaux C., Alonso C., Huart J.J., Montreuil J., A meisen J.C., Programmed cell death in
mature erythrocytes: a model for investigating deat h effector pathways operating in the
absence of mitochondria, Cell. Death. Differ., 8,11 43-1156, 2001a.
5. Bratosin D., Estaquier J., Ameisen J.C., Montreuil J., Molecular and Cellular
Mechanisms of Erythrocyte Programmed Cell Death: Im pact on Blood Transfusion, Vox
Sanguinis 83, 307-310, 2002a.
6. Bratosin D., Estaquier J., Slomianny C., Tissier J- P., Quatannes B., Bulai T., Mitrofan
L., Marinescu A., Trandaburu I., Ameisen J-C., Mont reuil J., On the evolution of
erythrocyte programmed cell death: apoptosis of Ran a esculenta nucleated red blood
cells involves cysteine proteinase activation and m itochondrion permeabilization,
Biochimie, 86, 183-193, 2004.
7. Bratosin D., Mitrofan L., Palii C., Estaquier J., M ontreuil J., A novel fluorescence assay
using calcein-AM for the determination of human ery throcyte viability and ageing,
Cytometry A, 66A, 78-84, 2005b.
8. Griffitt R.J., Weil R., Hyndman K.A., Denslow N.D., Powers K., Taylor D., Barber D.S.,
David S., Exposure to copper nanoparticles causes g ill injury and acute lethality in
zebrafish (Danio rerio), Environ. Sci.Technol. 41, 8178-8186, 2007.
9. Hess J.R., Conventional blood banking and blood com ponent storage regulation:
opportunities for improvement, Blood. Transfus., 8, Suppl 3, s9-s15, 2010.
10. Lang, F., Gulbins E., Lerche H. , Huber S. M., Kem pe D.S., Föller M., Eryptosis, a
Window to Systemic Disease, Cell. Physiol. Biochem. , 22, 373-380, 2008.

LISTA LUCR ĂRILOR ȘTIIN ȚIFICE REALIZATE ÎN CADRUL TEZEI DE DOCTORAT –
cuprinde 12 titluri
ANEXA NR.1 cuprinde List ă Abrevieri