Celule Stem Amniotice

PARTEA GENERALĂ

ASPECTE GENERALE ALE CELULELOR STEM

Celulele stem sunt celule nespecializate care se pot reînnoi pe perioade îndelungate și se pot diferenția în celule mature, specializate din punct de vedere funcțional.

În funcție de capacitatea de diferențiere, celule stem pot fi:

Omnipotente: se pot diferenția spre orice tip celular. Un exemplu de celulă omnipotentă este ovulul fertilizat, zigotul.[1]

Pluripotente: se pot diferenția spre oricare din tipurile celulare care derivă din cele trei straturi embrionare: ectoderm, mezoderm și endoderm. Trebuie precizat că pluripotența este relativă, existând celule stem complet sau incomplet pluripotente, cele din urmă având capacitatea de a forma toate straturile germinale dar nu prezintă toate proprietățile celulelor stem pluripotente complete.[2]

Multipotente: celulele progenitoare; au capacitatea de a se diferenția doar spre anumite linii celulare. De exemplu, celula stem hematopoietică mieloidă sau limfoidă poate genera limfocite, monocite, neutrofile, dar nu și celule nervoase sau osoase.

Oligopotente: se pot diferenția spre un număr mic de tipuri celulare. Exemple de celule stem oligopotente sunt cele limfoide sau mieloide. Cele limfoide pot genera limfocite T sau B, dar nu și alte celule sanguine, cum ar fi eritrocitele.[3]

În funcție de origine, există două mari categorii de celule stem:

Celulele stem embrionare, izolate din masa celulară internă a blastocistului. Celulele stem embrionare au un potențial terapeutic mai mare decât cele adulte, deoarece se pot diferenția spre oricare linie germinală, însă există riscul formării de teratoame, precum și o serie de restricții de ordin etic, recoltarea acestor celule fiind de cele mai multe ori însoțită de distrugerea embrionului.[4]

Celule stem adulte. Acestea pot fi hematopoietice, izolate din măduva osoasă hematogenă, care se pot diferenția doar pe linie hematologică, sau mezenchimale, care sunt mai puțin diferențiate.[6] Cercetările ultimilor ani au evidențiat celule stem hematopoetice de tip somatic sau adult în majoritatea organelor corpului. Fiecare an aduce noi descoperiri privind aceste celule stem și potențialul lor la nivelul organismului. Celulele stem adulte prelevate din măduva osoasă sau cordon ombilical sunt folosite cu succes în terapia leucemiei, limfomului și mielomului multiplu. Există studii clinice care utilizează celule stem adulte în tratamentul unor afecțiuni precum cardiopatia ischemică, leziuni medulare, boala Parkinson, boala Huntington, diabetul zaharat de tip 1. Inconvenientul lor este că sunt rare, dificil de identificat și izolat, și sunt adesea angajate pe o anumită linie celulară germinală.[4]

Proprietățile celulelor stem sunt:

Starea de nediferențiere. Una dintre proprietățile fundamentale ale celulelor stem este aceea că nu prezintă structuri celulare specifice unui țesut, care să le permită să îndeplinească funcții specializate. Celulele stem nu pot funcționa ca celule nervoase sau cardiace, dar pot da naștere acestor tipuri de celule.[5]

Capacitatea de diviziune și reînnoire pe perioade îndelungate. Spre deosebire de celulele musculare, sanguine, sau nervoase, care nu se divid în mod normal, celulele stem se pot multiplica de nenumărate ori. Această capacitate de proliferare face ca celulele stem să poată fi cultivate în laborator în număr mare.[5]

Capacitatea de diferențiere. Celulele stem pot da naștere unor celule specializate, precum celule nervoase, cardiace, musculare, etc. Acest proces este controlat de către factori interni, genetici, și de către factori care țin de mediul extern, precum contactul fizic cu celule învecinate, substanțe chimice eliberate de alte celule, particularități ale matricei extracelulare.[5]

Există două mecanisme prin care se asigură menținerea unei populații adecvate de celule stem care să poată da naștere unor celule specializate:

Diviziune asimetrică. Astfel, din diviziunea unei celule stem ia naștere o celulă stem identică celulei mamă și o celulă care se va diferenția spre o anumită linie celulară. Așadar, ia naștere o celulă cu aceeași potență ca a celulei mamă, și o celulă angajată, cu potență redusă. Cu toate acestea, în perioade de creștere sau când este necesară regenerarea unui țesut, celulele stem se pot divide și simetric, dand naștere la două celule cu potență egală.

Diferențiere stocastică. Atunci când o celulă stem dă naștere la două celule fiice diferențiate, o alta celulă stem dă naștere prin diviziune la două celule fiice identice cu celula mamă.

Studiul celulelor stem este extrem de important, deoarece aceste celule ar putea fi utilizate în viitor în terapia celulară și ingineria tisulară. Din momentul în care aceste celule au fost identificate și s-a înțeles potențialul pe care îl au în procesele de regenerare și refacere ale organismului, în medicină s-a dezvoltat o nouă ramură, medicina regenerativă. Medicina regenerativă se bazează pe înțelegerea proceselor biologice implicate în funcționarea normală a țesuturilor și reproducerea acestor fenomene prin utilizarea celulelor stem. Medicina regenerativă bazată pe metodologia terapiei celulare și a ingineriei tisulare este un domeniu multidisciplinar în curs de dezvoltare, care implică biologie, medicină și manipulare genetică. Acest tip de terapie are ca scop menținerea, restaurarea sau sporirea funcției țesuturilor și organelor, ajutând astfel la tratatmentul unor boli umane cu severitate variabilă, de la situații cronice la cele care pun viața în pericol. În bolile care evoluează cu compromiterea funcției țesuturilor sau organelor, cercetarea celulelor stem promite să ofere o cale eficientă spre terapia regenerativă. Totuși, aplicarea acestor cercetări în tratamentul bolilor umane nu este posibilă fără o cunoaștere aprofundată a proprietăților biologice a tuturor tipurilor de celule stem. În contextul unei anumite boli, trebuie hotărât în primul rând care este cel mai bun tip de celulă stem, cea embrionară sau cea de tip adult. Este de asemenea necesar să identificăm o sursă de celule stem care să fie accesibile în număr mare și să nu genereze preocupări etice. [6],[7]

Medicina regenerativă cuprinde:

Ingineria tisulară – se bazează pe utilizarea unor substitute biologice obținute in vitro

Terapia celulară – presupune transplantarea celulelor stem în vederea vindecării unei palete diverse de afecțiuni.

Pentru a putea fi identifica și separa celulele stem, se utilizează tehnica numită citometrie de flux. Această tehnică presupune marcarea celulelor stem cu anticorpi fluorescenți care se fixează de antigeni de pe suprafața membranei, și apoi separarea celulelor marcate cu ajutorul unui câmp electric. Însă, pentru a putea utiliza această tehnică trebuie cunoscuți markerii specifici celulelor stem.

Celulele stem embrionare pot fi recunoscute prin diferite clase de markeri[8]:

Markeri de pluripotență de suprafață: Oct-4 și Nanog au fost primele proteine descoperite, cu rol important în dezvoltarea embrionară și în menținerea pluripotenței celulelor stem embrionare. Alți factori necesari pentru pluripotență cuprind Sox2, Sall4, Dax1, Essrb, Tbx3, Tcl1, Rif1, Nac1 și Zfp281.

TRA-1-60 și TRA-1-81 sunt antigeni găsiți inițial pe celulele tumorale din carcinoamele embrionare și ulterior și pe celulele stem embrionare. Se folosesc pe larg pentru a identifica și izola celulele stem embrionare, dar și pentru a evalua statusul de pluripotență indusă.

Stage-specific embryonic antigens (SSEA). În timpul ovogenezei și embriogenezei se exprimă SSEA-3 și SSEA-4. Deși sunt exprimate atât pe celulele germinale, cât și pe celulele stem din teratocarcinoame și celulele stem embrionare, în prezent se consideră că SSEA-3 și SSEA-4 caracterizează celulele stem embrionare nediferențiate umane.

Markeri de ectoderm: Otx2, p63/TP73L, FGF-8, Pax2. FoxJ3, Pax6, GBX2, SOX1, nestină, β-tubulină.

Markeri de endoderm: formarea endodermului depinde de două bucle secvențiale de feedback pozitiv mediate de Cripto și Bmp4/Wnt3 activate de către Nodal matur sau neclivat.

Celulele stem adulte sunt de numeroase tipuri și prezintă diferiți markeri individuali, din care vom aminti câțiva[8]:

Celule stem hematopoietice: CD34, CD38, CD133, SCA-1

Celule stem canceroase: CD44, CD133, CD24, CD90

Celule stem cardiace: FLK1, Nkx2.5

Celule stem osteoprogenitoare: TGF-β, bFGF, BMP-2

Precursori miogeni: CD56, UEA-1R, CD146

Celule stem neurale: CD133, CD15, CD24

Celule stem mezenchimale: CD10, CD13, CD73, CD105, CD271

Celule stem epidermale: K15, CD34, nestina, p63

Celule stem derivate din țesut adipos: CD44, ICAM-1/CD45

Celule stem intestinale: Lgr5, Bmi1, Tert, Lrig1

Pornind de la neajunsurile pe care le prezintă utilizarea celulelor stem embrionare și adulte, cercetătorii s-au orientat spre identificarea unor surse alternative de celule stem, reprezentate de anexele fetale, respectiv placenta, cordonul ombilical și lichidul amniotic.

LICHIDUL AMNIOTIC ȘI IMPORTANȚA SA CLINICĂ

În săptămâna a doua de dezvoltare embrionară, blastocistul se localizează la nivelul stromei endometriale. Trofoblastul este format din două straturi: citotrofoblast și sincițiotrofoblast. Embrioblastul este format, de asemenea, din două straturi: unul adiacent cavității blastocistului, format din celule cubice – hipoblastul, și un strat de celule înalte, columnare, care delimitează cavitatea amniotică – epiblastul.

La embrionii umani nu s-au putut observa cele mai timpurii stadii ale formării amnionului. La cel mai tânăr embrion studiat, amnionul era deja prezent sub forma unei cavități închise. Plafonul cavității este format dintr-un singur strat de celule aplatizate, ectodermale, numit ectodermul amniotic. Planșeul cavității este reprezentat de celulele columnare epiblastice care alcătuiesc împreună cu hipoblastul discul embrionar bilamelar. Continuitatea dintre planșeu și plafon se realizează la marginea discului embrionar.[9]

La începutul formării sale, amnionul se găsește în contact cu corpul embrionar, dar începând cu săptamâna a 4-5-a, se acumulează lichid amniotic în interior. Cantitatea acestuia crește pe parcursul sarcinii până în luna a 6-7-a, după care cantitatea se reduce ușor, astfel încât la finalul sarcinii există în jur de un litru de lichid amniotic.[10]

Lichidul amniotic are un rol important în dezvoltarea fetală. El conține numeroși factori nutritivi, factori de creștere, are rol antimicrobian și de protecție mecanică pentru făt, și permite stabilirea gradului de maturitate fetală și diagnosticul precoce al unor afecțiuni.

Lichidul amniotic este un mediu complex, al cărui volum și compoziție se modifică pe parcursul sarcinii. În timpul embriogenezei, volumul său crește mai repede decât volumul embrionului. În acest stadiu, compoziția lichidului amniotic este similară cu cea a plasmei fetale, având loc schimburi directe prin intermediului tegumentului fetal nekeratinizat. Apa din lichidul amniotic (98%) provine din plasma maternă, prin difuzie conform gradientului osmotic și gradientului de presiune hidrostatică.[10]

Odată cu finalizarea procesului de keratinizare a tegumentului fetal (25 săptămâni), volumul de lichid amniotic este condiționat de echilibrul dintre producție, prin excreția urinară fetală, secreția de lichid oral, nazal, traheal și pulmonar (din care o parte sunt înghițite), și eliminare, predominant prin înghițirea sa de către făt.[10]

Lichidul amniotic conține carbohidrați, proteine și peptide, lipide, lactat, piruvat, electroliți, enzime și hormoni. Înainte de keratinizarea tegumentului fetal, aceștia pot difuza cu usurință în circulația fetală. Lichidul amniotic este bogat în taurină, glutamină – precursor esențial pentru sinteza de acizi nucleici, și arginină – se metabolizează în poliamine cu rol reglator în angiogeneza placentară, creșterea trofoblastică și embrionară. El conține și factori de creștere, precum factorul de creștere epidermal (EGF) și transforming growth factor α (TGF-α), care stimulează sinteza componenților surfactantului, transforming growth factor β1 (TGF-β1), factorul de creștere insulin-like 1 (IGF-1), eritropoietina (EPO), și factorul de stimulare a coloniilor granulocitare (G-CSF), care par să aibă rol în dezvoltarea intestinului fetal.[10]

Amniocenteza este o procedură prin care se extrage lichid amniotic (de obicei 20ml) printr-o puncție eco-ghidată transabdominală sau transvaginală în scopul diagnosticării unor malformații cromozomiale fetale. Amniocenteza se poate efectua începând cu săptămâna a 15-16-a de sarcină. Amniocenteza precoce, înainte de săptămâna a 14-a este asociată cu risc de picior varus equin congenital și nu trebuie efectuată decât în situații excepționale.[11]

Amniocenteza este propusă femeilor care au cel puțin 35 de ani la momentul nașterii sau care prezintă alți factori de risc pentru anomalii cromozomiale. De asemenea, se recomandă amniocenteza când unul din ceilalți copii prezintă o anomalie cromozomială, când unul din părinți prezintă o boală autozomal recesivă, sau când mama prezintă o boală cu transmitere X-linkată. Analiza lichidului amniotic este utilă și în diagnosticul prenatal al defectelor de tub neural și într-o gamă largă de defecte congenitale hematologice, metabolice sau genetice. Tot din lichidul amniotic se poate doza bilirubina pentru a determina severitatea hemolizei fetale în sarcini cu incompatibilitate de grup sanguin Rh.[11]

Printre afecțiunile genetice diagnosticate prin cariotiparea celulelor din lichidul amniotic se numără: trisomia 21, trisomia 13, trisomia 18, sindromul X fragil, fibroza chistică, hemofilia A, α-talasemia și β-talasemia, rinichiul polichistic de tip adult, anemia falciformă, boala Tay-Sachs, tulburări metabolice rare, defecte de tub neural – anencefalie, spina bifida.[11]

ISTORICUL ȘI PROPRIETĂȚILE CELULELOR STEM AMNIOTICE

Lichidul amniotic conține celule care au proprietăți de celule stem. În 2003, Prusa et al. identifică celule care exprimă markerul Oct-4. În 2004, Tsai et al. descoperă celule care coexprimă Oct-4, CD44, CD105. În 2007, De Coppi et al. izolează o populație celulară CD117 (c-Kit) pozitivă, care reprezintă 1% din celulele obținute din amniocenteză. Aceste celule stem din lichidul amniotic exprimă markerul de “stemness” Oct-4 și markerul de celule stem embrionare SSEA-4. Ele exprimă markeri caracteristici pentru celule stem mezenchimale și neurale: CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, și nu exprimă markeri de celule stem hematopoietice, CD34 și CD133.[12]

Anul 2007 a fost marcat de studiile publicate de Anthony Atala de la Universitatea Wake Forest privind izolarea de celule stem din lichidul amniotic obținut prin proceduri de amniocenteză de rutină. Aceste celule puteau fi crescute cu usurință pe medii de cultură și păreau stabile din punct de vedere genetic și fenotipic. O proprietate specială a acestor celule este că și după 250 de dublări de populație, telomerele acestora se mențineau lungi. Dintre markerii mai importanți de pe suprafața celulară amintim Oct-4, sugerând un statut intermediar între celulele stem embrionare pluripotente și cele adulte cu proprietăți restrânse de diferențiere, c-Kit și SSEA-4. Atala a reușit să inducă diferențierea celulelor stem amniotice pe 6 linii: adipogenă, osteogenă, miogenă, endotelială, neurogenă și hepatică, așadar către lineaje aparținând tuturor celor 3 straturi germinale embrionare.[13]

În anul 2010, Da Sacco et al. analizează profilul celulelor stem amniotice recoltate între săptămânile gestaționale 15 și 20. Studiul arată că markerii c-Kit, Oct-4, și markerii de ectoderm se exprimă în mod constant pe parcursul sarcinii, în timp ce markerii de endoderm și mezoderm se exprimă mai abundent la începutul sarcinii și tind să dispară după săptămâna a 17-18-a. În acest timp încep să se exprime markerii de organe.[12]

Prin urmare, lichidul amniotic conține o populație heterogenă de celule, fie diferențiate, fie cu proprietăți de celule stem. În plus, ele pot fi izolate cu ușurință din lichidul amniotic recoltat cu ocazia unei amniocenteze.

Celulele stem amniotice prezintă pe suprafață antigenul c-Kit (CD117), care este receptorul pentru factorul de celule stem, și sunt pozitive pentru o serie de markeri de celule stem mezenchimale/neurale – CD29, CD44, CD73, CD90, CD105; pentru SSEA-4 și factorul de transcripție Oct-4, care a fost asociat cu menținerea stării de pluripotență. Celulele stem amniotice sunt negative pentru markerii de linie hematopoietica (CD45) și de celulă stem hematopoietică (CD34, CD133), cât și pentru markerii de celulă stem embrionară sau celulă germinală.[13]

Lichidul amniotic reprezintă o sursă atractivă de celule stem din mai multe motive: sunt ușor de obținut și nu necesită o procedură invazivă adițională pentru extragerea lor, deoarece se izolează din lichidul amniotic extras la o amniocenteză de rutină, sunt ușor de izolat și cultivat, având o capacitate de proliferare crescută, au caracter de celule stem multipotente, și ca atare se pot diferenția spre orice tip celular, recoltarea lor nu pune probleme etice, au trăsături intermediare între celulele stem embrionare și cele adulte și nu au în comun dezavantajele celor două tipuri de celule stem, anume că cele embrionare generează teratoame și cele adulte nu sunt de obicei pluripotente și sunt rare și dificil de obținut în cantități semnificative.

Celulele stem amniotice reprezintă de fapt o populație heterogenă de celule. Ele au în comun originea epitelială și provin fie de la embrionul în curs de dezvoltare, fie de pe suprafața internă a membranei amniotice. Cele din urmă sunt denumite celule stem derivate din membrana amniotică.[14]

Celule stem derivate din lichidul amniotic. În funcție de morfologie, creștere, și proprietăți biochimice, aceste celule se încadrează în trei mari tipuri. Celulele epiteloide (E-type) sunt celule cubice sau cilindrice și provin din tegumentul și urina fetală. Celulele din lichidul amniotic (AF-type) își au originea în membranele fetale. Celulele fibroblastice (F-type) provin predominant din țesutul conjunctiv fibros. Tipurile F și AF au o morfologie fibroblastică. Tipul de celule stem AF pare să fie cel majoritar. În urma procedurilor de izolare și cultivare, celulele obținute dezvoltă un fenotip mezenchimal multipotent și au o rată de proliferare mai mare decât a celulelor stem adulte.[14]

Celule stem derivate din membrana amniotică. Aceste celule stem se împart în două subcategorii: celule epiteliale amniotice (cu origine epitelială) și celule mezenchimale din membrana amniotică (cu origine mezenchimală). Cele epiteliale au o morfologie scuamoasă, iar cele mezenchimale sunt asemănătoare fenotipic cu cele obținute de la adult. La fel ca celulele stem din lichidul amniotic, acestea prezintă o rată de proliferare mai mare decât cea a celulelor stem adulte și un status multipotent, având capacitate de evoluție spre oricare din cele trei linii germinale.[14]

Celulele stem amniotice prezintă în plus proprietăți imunomodulatoare și antiinflamatoare. Există studii preclinice în care celule stem derivate din membrana amniotică au fost integrate cu succes în țesuturile unor animale imunocompetente fără a provoca un răspuns imun, ceea ce sugerează că aceste celule nu sunt imunogene.[15]

În urma unor studii in vitro, s-a ajuns la concluzia că celulele stem amniotice își exercită proprietățile imunomodulatoare prin trei mecanisme interdependente[15]:

Celulele stem derivate din membrana amniotică sunt hipoimunogene și blochează generarea și maturarea celulelor prezentatoare de antigen.

Pot modula fenotipul limfocitelor T, modulând astfel răspunsul imun, și în mod particular pot inhiba proliferarea limfocitelor.

Suprimă producția de citokine inflamatorii și asftel produc imunosupresie în mediul local.

Aceste celule nu își exercită în mod spontan proprietățile imunomodulatoare, ci doar atunci când sunt activate prin citokine inflamatorii. Astfel, ele secretă IL-10, TGF-β, IDO și PGE-2, citokine antiinflamatorii.[15]

Prin urmare, aceste celule sunt tolerate imun de către organismul gazdă și au capacitatea de a reduce reacțiile inflamatorii și recrutarea de fibroblaști la locul leziunii, ceea ce permite o regenerare tisulară mai eficientă, cu mai puțin țesut cicatricial în organe precum măduva spinării, ficat sau plămân.[15]

Prima metodă de izolare și cultivare a celulelor stem a fost concepută în 2004 de Tsai et al., care propune o tehnică de cultivare în doi pași, dar se obțin culturi heterogene din punct de vedere al populațiilor celulare. În 2006, Tsai et al. stabilește un protocol adițional pentru a genera populații celulare de puritate înaltă prin utilizarea unei singure celule stem amniotice pentru a produce o linie clonală. În 2007, Kim et al. prezintă un nou protocol de derivare a celulelor stem amniotice, bazat pe culturi succesive până la obținerea unei populații omogene. Tot în 2007, De Coppi et al. demonstrează că celulele stem amniotice se pot izola prin imunoselecție. Metoda sa poate produce o populație de puritate înaltă, dar folosește xeno-anticorpi; ca atare, acele celule nu pot fi folosite în scop terapeutic.[16]

O metodă de izolare și cultivare a celulelor stem amniotice care pot fi utilizate terapeutic a fost investigată în 2010 de Tatsanee et al. Cerințele care trebuie îndeplinite de celulele stem pentru a putea avea uz terapeutic clinic sunt: populație pură de celule stem, calitate celulară adecvată, lipsa contaminării cu produse animale, rată mare de proliferare clonală. Tehnica propusă în acest studiu presupune inițial centrifugarea lichidului amniotic și apoi cultura celulelor din acea probă. Ulterior sunt selectate celulele stem din cultură pe baza aderenței. O astfel de celulă se numește “starter cell” și va fi utilizată pentru a genera o linie clonală, cu avantajul unei omogenități mai mare a culturilor de celule stem față de alte metode. Pentru a selecta celulele starter se utilizează acele celule din cultură care se divid în mod activ. Ele au o masă celulară mai mare deoarece au două seturi de organite celulare și ADN, și aderă de vasul de cultură încă din primele zile. Această metodă a fost concepută pentru a se evita heterogenitatea populațiilor celulare din culturi. Astfel, celulele stem obținute au o rată de profilerare înaltă, cu un timp de dublare a populației de 0.8 zile, de 2.5 ori mai mare decât timpul de dublare raportat de De Coppi et al. și Kim et al. în 2007.[16]

Celulele stem amniotice c-Kit pozitive sunt pluripotente și au fost diferențiate cu succes in vitro spre oricare din cele trei linii germinale și de acolo mai departe spre celule progenitoare endoteliale, hepatice, neurogene, adipogene sau miogene. Cu toate acestea, nu se cunoaște cu precizie potențialul lor in vivo, acesta depinzând de funcționalitatea lor în urma interacțiunii cu structurile organismului gazdă.[12]

1. Sistemul hematopoietic. Celule stem amniotice CD117 pozitive și Lin negative au potențial hematopoietic. Aceste celule pot evolua pe linie eritroidă, mieloidă și limfoidă in vivo și in vitro.

2. Creier. S-a încercat diferențierea spre neuroni dopaminergici, însă aceștia exprimau doar markeri specifici neuronilor dopaminergici imaturi, și nu s-a reușit diferențierea completă.

3. Os. Celule stem cultivate într-un mediu osteogen dezvoltă caracter de osteoblaste, secretă fosfatază alcalină și depun calciu, inclusiv in vivo, transplantate într-un șoarece imunodeficient.

4. Rinichi. S-a dovedit că în rinichiul embrionar, celulele stem amniotice se pot diferenția atât spre structuri tubulare cât și spre structuri glomerulare, și exprimă markeri renali caracteristici. În plus, dacă sunt injectate în rinichi după o leziune acută, au proprietăți antiinflamatoare și antiapoptotice și permit regenerarea epiteliului lezat.

5. Plămân. Aceste celule se încorporează în plămânul embrionar de șoarece și, în cazul existenței unei leziuni, se cantonează preferențial în apropierea acesteia, pe când într-un plămân sănătos se răspândesc pe o suprafață mai mare.

6. Inimă. S-a reușit ingineria de valve cardiace, însă acestea nu au putut funcționa decât sub un regim presional scăzut, din cauză că erau sărace în colagen. De asemenea, în infarctul miocardic acut reduc apoptoza miocitelor, aria infarctului și se diferențiază spre celule endoteliale și miocardice.

În concluzie, ușurința și relativa neinvazivitate prin care se obțin, existența unor tehnici de cultivare și obținere de populații pure, omogene de celule stem, caracterul pluripotent al acestora, capacitatea lor de diferențiere spre numeroase tipuri celulare, posibilitatea de transplant autolog, faptul că nu dezvoltă teratoame, și nu în ultimul rând faptul că sunt acceptate din punct de vedere etic fac din lichidul amniotic o sursă alternativă foarte atractivă de celule stem, cu deosebit potențial terapeutic în viitor, și din aceste considerente merită un studiu aprofundat.

PARTEA SPECIALĂ

INTRODUCERE

Medicina regenerativă este o ramură nouă a medicinei, care își bazează principiile terapeutice pe reînnoirea, restaurarea funcției unor țesuturi și organe degradate din punct de vedere biologic, sau chiar înlocuirea acestora în totalitate.[6],[7] Medicina regenerativă este un domeniu de mare importanță practică, deoarece ea promite nu doar să trateze, ci și să vindece afecțiuni acute sau cronice care sunt incurabile utilizând terapiile clasice. În acest context, celulele stem sunt utilizate în cadrul terapiei celulare și a ingineriei tisulare.

Pentru a putea avea încredere în eficacitatea și siguranța tratamentelor ce utilizează celule stem, trebuie aleasă cu atenție sursa acestora de proveniență. Celulele stem embrionare și cele adulte sunt grevate de o serie de inconveniente. Cele embrionare generează teratoame in vivo și utilizarea lor este restricționată din considerente etice, pe când cele adulte au adesea capacitate de diferențiere restrânsă și sunt foarte rare, ceea ce face dificilă obținerea lor într-un număr suficient pentru a fi utilizate în terapii celulare. Mai nou, s-au realizat cercetări asupra celulelor stem cu pluripotență indusă, care se obțin prin reprogramarea genetică a celulelor stem adulte, fiind propuse ca o potențială sursă de celule stem pentru medicina regenerativă.[17],[18] Cu toate acestea, utilizarea celulelor stem cu pluripotență indusă întâmpină o serie de probleme, cum ar fi instabilitatea lor genomică.[19],[20]

Din cauza tuturor acestor dezavantaje, cercetările în domeniu s-au orientat spre descoperirea unor noi surse de celule stem, care pot fi utilizate cu mai mare ușurință în cadrul medicinei regenerative. Astfel, izolarea de celule stem din lichidul amniotic și membranele fetale a fost o realizare importantă, deoarece aceste celule pot fi recoltate și cultivate cu ușurință, sunt acceptate din punct de vedere etic, și au fost demonstrate a fi multipotente sau pluripotente, multipli autori realizând diferențierea acestora spre lineaje aparținând tuturor celor trei straturi germinale embrionare.

Datorită numeroaselor avantaje oferite de utilizarea celulelor stem amniotice, am considerat că ele merită un studiu aprofundat. Scopul acestei lucrări este de a oferi o sinteză a cunoștințelor actuale din literatură cu privire la markerii ce caracterizează aceste celule. Prin analizarea rezultatelor expuse în studii multiple, urmăresc să elaborez concluzii cu aplicabilitate pe scară largă referitor la prezența sau absența markerilor specifici pe celulele stem amniotice luate ca un întreg, cât și să realizez o comparație între cele trei varietăți ale acestor celule (epiteliale, mezenchimale, și din lichidul amniotic), pentru a scoate la lumină asemănările și deosebirile în expresia antigenilor stem mezenchimali, embrionari, a markerilor de pluripotență, endoteliali, hematopoietici și imunologici.

MATERIALE ȘI METODE

Studii eligibile (criterii de includere și excludere)

Am stabilit ca eligibile acele studii experimentale, originale, publicate după data de 1/1/2007, în care se evaluează celule stem provenite din lichidul amniotic și celule stem provenite din membrana amniotică. Este obligatoriu ca originea acestor celule să fie umană.

Pentru a fi incluse în analiza sistematică, studiile trebuie să evalueze prezența următorilor markeri: markeri de pluripotență sau de celule stem embrionare – cKit (CD117), Oct4, Nanog, Sox2, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Rex-1, hTERT; markeri de celule stem mezenchimale – CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166.

Recoltarea probelor biologice s-a realizat cu consimțământ informat, în modul următor: pentru lichidul amniotic, acesta trebuie să fie prelevat prin amniocenteză prin puncție transabdominală eco-ghidată, între săptamămânile de sarcină 15 și 20; pentru membrana amniotică, aceasta trebuie să provină din sarcini la termen, finalizate prin operație cezariană sau prin naștere pe cale naturală.

Un alt element important de includere a studiilor îl constituie metoda de izolare și cultivare a celulelor stem, care trebuie să fie standardizată:

Pentru celulele stem mezenchimale din lichidul amniotic:

mediul α-MEM (alpha modified Eagle’s medium), suplimentat cu ser bovin fetal (FBS) 15% sau cu ser bovin fetal certificat pentru cultură de celule stem embrionare (ES-FBS) 15%, mediu Chang B 18% și Chang C 2%, glutamină 1%, 1% penicilină și streptomicină.

mediul DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) cu conținut redus de glucoză sau crescut de glucoză, suplimentat cu FBS sau ES-FBS 15-20%, glutamină sau L-glutamină 1% sau 4mM, 1% penicilină și streptomicină.

Pentru celulele stem mezenchimale din membrana amniotică:

digestie enzimatică utilizând tripsină și colagenază.

mediul DMEM simplu sau cu conținut redus de glucoză, suplimentat cu FBS 10-20%, 1-2% penicilină și streptomicină.

Pentru celulele stem epiteliale din membrana amniotică:

digestie enzimatică utilizând tripsină

mediul DMEM/F12 suplimentat cu FBS 10%, 1% penicilină și streptomicină.

Am considerat că neîndeplinirea următoarelor condiții obligă la considerarea studiilor ca neeligibile: data publicării înainte de 1/1/2007, lipsa accesului la varianta completă, altă temă decât celulele stem amniotice, review-uri, editoriale și alte studii în afara celor originale, experimentale, studii efectuate pe celule de proveniență animală.

În plus, am considerat că studiile nu pot fi incluse în analiza sistematică dacă nu evaluează markerii de pluripotență sau cei de celule stem mezenchimale, dacă sunt incerte condițiile de recoltare și prelucrare a probelor, dacă celulele folosite provin de la o terță instituție (laboratoare specializate, universități), dacă studiul folosește lichid amniotic de trimestru 3, sau dacă rezultatele sunt prezentate ca referință la alte lucrări (articole anterioare ale acelorași autori sau ale altor autori).

Căutarea studiilor

Am realizat căutarea studiilor în bazele de date Medline și Cochrane folosind termeni primari și secundari. Cei primari sunt: „amniotic”, „stem”, „cells”. Cei secundari sunt: „markers”, „marker”, „immunophenotype”, „immunophenotypic”, „immunophenotypical”, „phenotype”, „phenotypical”, „profile”, „profiling”, „characteristics”, „characterization”. Căutând după toți trei termenii primari și cel puțin un termen secundar („amniotic” AND „stem” AND „cells” AND („markers” OR „marker” OR „immunophenotype” OR …)) am obținut 764 de rezultate, din care, după eliminarea celor publicate înainte de data de 1/1/2007, am ajuns la un număr de 670 de studii potențial eligibile. Data ultimei căutări a fost în 15/7/2015.

Selectarea studiilor și sinteza datelor

Selecția primară a studiilor a fost realizată pe baza titlului și abstractului. Au fost eliminate studiile care nu vizau celulele stem amniotice, cele care foloseau celule de origine animală, review-urile și articolele care nu erau disponibile în variantă completă. În urma acestei selecții am rămas cu 151 de studii.

Acestea au fost ulterior analizate atent, în varianta lor completă, pentru a verifica dacă respectă sau nu criteriile de includere și excludere. Au fost excluse 117 articole. Din cele 34 rămase, pentru a atenua heterogenitatea în ceea ce privește procedee de recoltare a probelor și de cultivare a celulelor, am eliminat 19 studii. În final, s-au dovedit a fi eligibile un număr de 15 studii, cu ajutorul cărora am realizat analiza sistematică, dintre care 7 vizează celulele stem din lichidul amniotic, 3 au ca temă celulele stem epiteliale din membrana amniotică, și 5 studiază celulele stem mezenchimale din membrana amniotică (Tabelul 1).

Celelalte 19 studii au fost excluse pe baza următoarelor criterii:

4 studii au fost excluse din cauză că nu corespund din punct de vedere a vârstei gestaționale la care s-a efectuat amniocenteza în vederea recoltării lichidului amniotic. (Qing Sun, Fang Li, et al. Amniotic fluid stem cells provide considerable advantages in epidermal regeneration: B7H4 creates a moderate inflammation microenvironment to

Tabelul 1. Lista studiilor incluse în analiza sistematică

Tabelul 1. (continuare)

promote wound repair; Jing Bai, Yiru Wang, et al. Human amniotic fluid-derived c-kit(+) and c-kit(-) stem cells: growth characteristics and some differentiation potential capacities comparison; Dongmei Lai, Fangyuan Wang, et al. Human amniotic fluid stem cells have a potential to recover ovarian function in mice with chemotherapy-induced sterility; Jing Bai, Yuan Hu, et al. Comparison of human amniotic fluid-derived and umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stromal cells: Characterization and myocardial differentiation capacity.)

6 studii au fost eliminate din cauză că utilizează procedee de izolare și cultivare a celulelor stem complet diferite de cele stabilite în cadrul criteriilor de includere/excludere. (Rita Romani, Irene Pirisinu, et al. Stem cells from human amniotic fluid exert immunoregulatory function via secreted indoleamine 2,3-dioxygenase1; Peter V. Hauser, Roberta De Fazio, et al. Stem cells derived from human amniotic fluid contribute to acute kidney injury recovery; Ping Zhang, Jason Baxter, et al. Endothelial differentiation of amniotic fluid-derived stem cells: synergism of biochemical and shear force stimuli; Dorthe Schmidt, Josef Achermann, et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source; Meraj Tabatabaei, Nariman Mosaffa, et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: the effect of trypsin; Takao Tsurubuchi, Shunsuke Ichi, et al. Amniotic fluid and serum biomarkers from women with neural tube defect-affected pregnancies: a case study for myelomeningocele and anencephaly: clinical article.)

3 studii au fost excluse din cauza neclarității în precizarea procedeelor de izolare și cultivare a celulelor stem, sau din cauză ca s-au omis detalii importante referitor la acestea. (Zan Teng, Toshiko Yoshida, et al. Establishment of immortalized human amniotic mesenchymal stem cells; T. Pirjali, N. Azarpira, M. Ayatollahi, M. H. Aghdaie, B. Geramizadeh, T. Talai. Isolation and Characterization of Human Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Umbilical Cord Wharton's Jelly and Amniotic Membrane; Valentina Paracchini, Annalucia Carbone, et al. Amniotic mesenchymal stem cells: a new source for hepatocyte-like cells and induction of CFTR expression by coculture with cystic fibrosis airway epithelial cells.)

6 studii au fost excluse din cauza lipsei din componența mediului de cultură a celulelor stem a glutaminei, penicilinei și streptomicinei, fie a glutaminei și a suplimentului cu mediu Chang. (DS Zagoura, O Trohatou, et al.AF-MSCs fate can be regulated by culture conditions; So Young Chun, Deok Hyun Cho, et al.Human amniotic fluid stem cell-derived muscle progenitor cell therapy for stress urinary incontinence; Bum Soo Kim, So Young Chun, et al.Human amniotic fluid stem cell injection therapy for urethral sphincter regeneration in an animal model; Maria G. Roubelakis, Vasiliki Bitsika, et al.In vitro and in vivo properties of distinct populations of amniotic fluid mesenchymal progenitor cells; Liru Li, Dejun Wang, et al.Characteristics of human amniotic fluid mesenchymal stem cells and their tropism to human ovarian cancer; Felipe de Lara Janz, Adriana de Aguiar Debes, et al.Evaluation of distinct freezing methods and cryoprotectants for human amniotic fluid stem cells cryopreservation.)

Din cele 15 studii pe care le-am considerat eligibile pentru a realiza analiza sistematică, am extras datele necesare sub forma unui formular de sumarizare a datelor, după cum urmează:

REZULTATE

În urma procesului de selectare a studiilor, respectând întocmai criteriile de includere și de excludere, am inclus 15 articole în analiza sistematică, cu scopul de a formula concluzii cu aplicabilitate la scară largă cu privire la markerii de suprafață ai celulelor stem amniotice epiteliale din membrana amniotică, celulelor stem mezenchimale din membrana amniotică, și a celulelor stem mezenchimale din lichidul amniotic.

Căutând studii potențial eligibile în bazele de date electronice Medline și Cochrane după termenii primari „amniotic” și „stem” și „cells” și cel puțin unul din termenii secundari „markers”, „marker”, „immunophenotype”, „immunophenotypic”, „immunophenotypical”, „phenotype”, „phenotypical”, „profile”, „profiling”, „characteristics”, „characterization”, am obținut 764 de rezultate, din care doar 670 erau publicate după data de 1/1/2007. Am supus aceste studii unei selecții primare, pe baza titlului și abstractului, și am rămas cu un număr de 151 de studii potențial eligibile. În urma analizei variantei complete a acestor studii și aplicării criteriilor de excludere, am obținut 34 de articole care ar putea fi incluse în analiza sistematică. Pentru a asigura o omogenitate mai mare a tehnicilor folosite în studiile incluse și o aplicabilitate adecvată a rezultatelor, am restricționat adițional aceste studii din punct de vedere al procedeelor de izolare și cultivare a celulelor conform criteriilor menționate la capitolul „Materiale si metode”. În urma acestei filtrări suplimentare, 19 studii au fost excluse (Tabelul 2), numărul total de studii rămase fiind de 15, dintre care: 5 pe celule stem mezenchimale din membrana amniotică, 3 pe celule stem epiteliale din membrana amniotică, și 7 pe celule stem mezenchimale din lichidul amniotic. Procesul de selecționare a studiilor este descris în Figura 1, iar caracteristicile studiilor incluse sunt expuse în Tabelul 3.

Pentru Tabelul 4, Tabelul 5, Tabelul 6 și Tabelul 7 definim „+” ca reacție pozitivă, marker-ul fiind detectat în proporție de peste 10%, „-” ca reacție negativă, cu marker nedetectat sau detectat în proporție de sub 4% și „±” ca reacție slab pozitivă, marker-ul fiind detectat în proporție de 4-10%.

Tabelul 2. Lista studiilor considerate inițial eligibile și apoi excluse din analiza sistematică

Tabelul 2. (continuare)

Tabelul 3. Caracteristicile studiilor incluse în analiza sistematică

Tabelul 3. (continuare)

c-Kit. Reprezintă receptorul pentru factorul de celule stem (stem cell factor) și a fost descris ca și marker al pluripotenței în cazul celulelor stem amniotice.[21] Cu toate acestea, el are o expresie neuniformă, fiind detectat în 50% (n=4) din studiile pe AF-MSC, 100% (n=1) din studiile pe AM-AEC, și 33% (n=3) din studiile pe AM-MSC.

Oct-4, Nanog, Sox2. Aceștia sunt factori de transcripție cheie în menținerea stării de pluripotență. Oct4, alături de Nanog și Sox2 realizează strânse relații de interdependeță, stimulează și mențin expresia genelor implicate în păstrarea stării de pluripotență, suprimând expresia genelor care mediază diferențierea.[22] Oct-4 este exprimat în toate studiile (n=14), indiferent de tipul de celule stem cercetate, în timp ce Nanog este negativ într-un singur studiu (n=9). Sox2 are o expresie variabilă, fiind prezent în 66% (n=6) studiile pe AF-MSC, 100% (n=2) din studiile pe AM-AEC, și 75% (n=3) din studiile pe AM-MSC, expresia lor nefiind studiată pe AF-MSC.

Tabelul 4. Expresia markerilor de celule stem embrionare sau de pluripotență la celulele stem amniotice

SSEA-3, SSEA-4. Acești doi antigeni au fost descoperiți pe suprafața celulelor stem embrionare și au fost asociați apoi cu starea de nediferențiere și pluripotență a acestor celule, expresia lor fiind suprimată odată ce începe procesul de diferențiere.[23],[24] SSEA-4 este pozitiv în toate cele 11 studii în care este evaluat, indiferent de tipul de celulă stem în cauză, în timp ce SSEA-3 a fost găsit pozitiv în 100% (n=1) din studiile pe AM-AEC și 66% (n=3) din studiile pe AM-MSC.

TRA-1-60, TRA-1-81. Acești doi antigeni sunt caracteristici celulelor stem embrionare și reflectă o stare de nediferențiere, asemănător SSEA-3 și SSEA-4.[23],[24] Când au fost căutați, aceștia au fost pozitivi in 50% din cazuri (n=2) pentru TRA-1-60 și 100% (n=2) din cazuri pentru TRA-1-81.

Rex1. Un cunoscut marker de pluripotență găsit pe suprafața celulelor stem embrionare nediferențiate. Are rol în menținerea acestei stări, și expresia lui scade marcat atunci când celula începe să se diferențieze.[25],[26] A fost studiat pe AF-MSC, unde a fost găsit în 100% (n=2) din cazuri, în timp ce pe AM-MSC a fost detectat doar în 50% (n=2) din studii.

hTERT. Acestă enzimă este puternic exprimată în celule care se divid intens, precum celulele stem embrionare sau cele adulte. Un nivel crescut al acestui marker este asociat cu starea de pluri- sau multipotență.[27],[28],[29] Este analizată pe AF-MSC în trei studii, fiind prezentă în două dintre ele (66%).

Tabelul 5. Expresia markerilor de celule stem mezenchimale la celulele stem amniotice

Aceste molecule reprezintă antigeni de suprafață descoperiți pe celule stem mezenchimale, și au fost identificate și pe celulele stem amniotice.[30],[31] Conform datelor prezentate în Tabelul 5, toate cele trei categorii de celule stem amniotice prezintă markeri tipici mezenchimali. Dintre acestea, celulele epiteliale par să îi exprime mai puțin, doar 50% (n=2) pentru antigenul CD44, 66% (n=3) pentru markerul CD90 (Thy-1), și 33% (n=3) pentru CD105.

Tabelul 6. Expresia markerilor endoteliali sau hematopoietici la celulele stem amniotice

Datele expuse în Tabelul 6 dovedesc fără echivoc faptul că celulele stem amniotice nu exprimă markeri specifici endoteliului sau celulelor stem hematopoietice. De asemenea, aceste rezultate infirmă contaminarea sanguină a probelor analizate.

Tabelul 7. Expresia markerilor MHC la celulele stem amniotice

Aceste molecule fac parte din clasa I a complexului major de histocompatibilitate. Rolul lor este de a expune peptidele produse de către celulă pentru a fi verificate de către limfocitele T NK.[32] În studiile incluse în această analiză sistematică, antigenii HLA-ABC au fost detectați în 90% (n=10) din cazuri, fiind absenți într-un studiu pe AM-AEC. HLA-DR a fost negativ în toate cazurile (n=12), un aspect foarte important pentru potențialul de transplantare in vivo al acestor celule. HLA-G au rol în procesul de toleranță materno-fetală, și au fost studiate doar pe celulele stem din membrana amniotică. Aici, au avut o expresie variabilă, fiind negative într-un studiu pe AM-AEC și pozitive în două studii pe AM-MSC.

DISCUȚII

În această analiză sistematică am sumarizat rezultatele a 15 studii efectuate pe celule stem mezenchimale din lichidul amnotic, celule stem epiteliale din membrana amniotică, și pe celule stem mezenchimale din membrana amniotică. Aceste celule au un fenotip intermediar între celulele stem embrionare și cele adulte, și caracter pluripotent sau multipotent. Astfel, cunoașterea markerilor celulelor stem amniotice poate facilita depistarea și izolarea lor, precum și realizarea unei asocieri între antigenii exprimați și proprietățile lor de diferențiere pe lineaje multiple.

Unul dintre aspectele importante pe care le-am urmărit a fost expresia markerilor de pluripotențialitate și de celule stem embrionare. Aceștia caracterizează celula aflându-se într-o stare de nediferențiere, neangajată pe un anumit lineaj, și reprezintă cei mai importanți markeri pentru definirea celulelor stem amniotice pluripotente. Primul dintre antigenii investigați este cKit (CD117). În cele trei categorii de celule stem amniotice, acest marker a fost prezent în mod variabil (50% AF-MSC, 100% AM-AEC, 75% AM-MSC). Și în literatură există discordanțe privind acest antigen. Atât De Coppi et al., 2007, Atala et al., 2007, cât și Da Sacco et al., 2010 găsesc acest marker pozitiv, în timp ce alte studii nu îl detectează[33]. Aceste rezultate sugerează că membranele fetale și lichidul amniotic conțin populații de celule stem heterogene, aspect ce poate fi subiectul unor teme de cercetare ulterioare. Oct-4 a fost pozitiv în toate studiile care l-au investigat. Nanog și Sox2 au avut diferențe de exprimare, atât între cele trei tipuri de celule stem, cât și în interiorul aceleiași categorii. Dintre aceștia, Nanog este exprimat cvasiconstant (75%, 100%, 100%), iar Sox2 (66%, 100%, 66%) are o mai mare variabilitate a exprimării pe celulele stem din lichidul amniotic, ceea ce ar putea fi explicat prin prezența în lichidul amniotic a trei subclase distincte de celule – tipul E, F, si LA. Exprimarea relativ redusă a Sox2 poate sugera că celulele stem amniotice au o capacitate de diferențiere mai slabă comparativ cu celulele stem embrionare, și este un aspect interesant, deoarece acest marker este în general prezent pe aceste celule.[34],[35] Exprimarea constantă a SSEA-4, asociat cu o exprimare mai saracă a SSEA-3 (slab pozitiv pentru AM-AEC și 66% pozitiv pentru AM-MSC) constituie încă un argument petru fenotipul intermediar embrionar-adult al celulelor stem amniotice. Rex-1 a fost exprimat în 100% (n=1) din cazuri pe AM-AEC, dar doar în 66% (n=3) din studiile pe AM-MSC, în timp ce hTERT a fost găsit în 100% (n=2) din studiile pe AF-MSC, dar a fost negativ în cazul AM-MSC. Lipsa hTERT poate fi interpretată ca favorabilă sau defavorabilă. Pe de o parte, celulele vor avea o capacitate de reînnoire mai mică, dar în același timp au un risc redus de a genera teratoame in vivo.[36],[37]

Așadar, comparând cele trei grupuri între ele, putem afirma că toate exprimă constant sau cvasiconstant markerii de pluripotență și embrionari Oct4 (100%), Nanog (75-100%), SSEA4 (100%), TRA-1-81 (100%). Variabilitatea cKit (50%, 100%, 33%) dintre categoriile de celule stem este oglindită în literatură. Sox2 (66%, 100%, 66%) pare să fie exprimat mai des pe celulele stem epiteliale amniotice decât pe celelalte două tipuri. În unele cazuri, acești antigeni au fost detectați în cantități mici, si o posibilă explicație poate fi efectul diferențelor în ceea ce privește metodele de cultivare a celulelor.

Cel de-al doilea aspect urmărit în analiza sistematică a fost prezența pe celulele amniotice a markerilor de celule stem mezenchimale. Pentru celulele stem mezenchimale din membrana amniotică și din lichidul amniotic, toți markerii investigați au fost găsiți ca fiind pozitivi, în concordanță cu datele din literatură[30],[33],[35],[37],[38],[39], și întărește concluzia că aceste celule sunt celule stem mezenchimale de origine fetală. În același timp, celulele stem epiteliale prezintă rate reduse de exprimare a markerilor stem mezenchimali: 50% (n=2) pentru CD44, 66% (n=3) pentru CD90 și 33% (n=3) pentru CD105. Aceste rezultate nu sunt suprinzătoare, ținând cont că aceste celule au origine ectodermală. Pentru a stabili dacă diferențele între acești markeri se corelează cu proprietăți diferite de diferențiere este nevoie de cercetare aprofundată.

Un alt set de antigeni investigați sunt cei de linie endotelială și hematopoietică. Pe scurt, toate cele trei varietăți de celule stem amniotice sunt în totalitate negative pentru acești markeri, ceea ce infirmă cu certitudine originea lor hematopoietică sau contaminarea probelor cu sânge. Un singur studiu a detectat CD133, fapt ce ar putea fi explicat prin faptul că acest marker nu este specific numai pentru celulele stem hematopoietice, ci și pentru celulele stem somatice.

Ultima categorie de antigeni evaluați sunt cei aparținând complexului major de histocompatibilitate. Antigenii HLA-ABC au fost prezenți pe suprafața tuturor celulelor studiate, cu excepția unui singur articol. De o importanță practică deosebită este absența markerului HLA-DR în toate studiile unde a fost cercetat. HLA-DR este implicat in reacția de rejet a transplantelor, iar lipsa acestuia indică o imunogenicitate redusă a celulelor stem amniotice, indiferent de subcategorie, și o șansă înaltă de a nu genera reacții imune atunci când sunt transplantate in vivo. HLA-G intervin în toleranța materno-fetală și lipsesc (n=1) de pe suprafața AM-AEC sau sunt slab-pozitivi sau pozitivi în cazul AM-MSC. Aceste date vin în susținerea afirmației că celulele stem amniotice au un status imun privilegiat și un potențial terapeutic bogat în cadrul medicinei regenerative.

Studiile au fost incluse pe baza investigării sau nu a acestor markeri, dar din cauza modalităților diferite de evaluare și de prezentare a rezultatelor, nu am putut realiza o analiză statistică. Unele prezentau rezultatele în mod calitativ, fie ca „pozitiv” sau „negativ”, sau dacă erau exprimate numeric sub formă de procente, nu se preciza deviația standard obținută, sau valoarea lui p. Din aceste motive, prezenta lucrare s-a limitat la o analiză sistematică a datelor din literatură. O altă limitare a analizei a fost marea diversitate în mijloacele de prelucrare a probelor biologice și de izolare și cultivare a celulelor stem. În ciuda unei selecții atente a acelor studii care folosesc proceduri cât mai asemănătoare, au existat numeroase deosebiri privind, spre exemplu, numărul de zile de incubație a celulelor primare, intervalul de zile la care se schimbă mediul de cultură, gradul de confluență la care se face pasajul pe o altă placă de cultură, numărul pasajului la care sunt analizați markerii, etc. Aceste diferențe pot explica o parte din rezultatele discordante obținute, dar în același timp, acestea pot fi urmarea unor diferențe reale între categoriile de celule stem, iar pentru elucidarea acestei probleme ar fi nevoie de implementarea unor metode standardizate de cultivare a celulelor stem amniotice.

CONCLUZII

1. În această analiză sistematică am sumarizat cunosțintele actuale despre markerii ce caracterizează celulele stem din lichidul amniotic și din membrana amniotică. Am comparat rezultatele a 15 studii cu privire la markerii de pluripotență, de celule stem mezenchimale și embrionare, cei endoteliali și hematopoietici, și nu în ultimul rând cei imunologici.

2. Am constatat diferențe în exprimarea markerilor stem embrionari și a celor de pluripotență, celulele epiteliale amniotice exprimându-i în proporția cea mai mare. În același timp, markerii stem mezenchimali au fost exprimați constant pe celulele stem din lichidul amniotic și pe cele mezenchimale din membrana amniotică, fiind decoperiți mai rar pe cele epiteliale. Markerii endoteliali și hematopoietici sunt absenți în mod cert pe aceste celule stem, și toate trei grupurile exprimă antigenii HLA-ABC, dar nu și HLA-DR, aspect cu deosebite implicații clinice în viitor, în transplantarea acestor celule in vivo.

3. Medicina regenerativă reprezintă o ramură a medicinei, apărută odată cu aprofundarea cunoștințelor în domeniul celulelor stem. În cadrul medicinei regenerative se disting două direcții de utilizare a celulelor stem: terapia celulară și ingineria tisulară.

4. Medicina regenerativă nu numai tratează, ci și vindecă diferite afecțiuni apărute prin degradarea structurilor proprii, asigurând astfel îmbunătățirea calității vieții.

5. Ingineria tisulară utilizează combinația intre biomateriale, celule stem și factori de creștere. Ingineria tisulară dezvoltă substitute tisulare, care au ca scop susținerea proceselor endogene de regenerare.

6. Celulele stem embrionare și adulte pot fi utilizate de medicina regenerativă, dar prezintă o serie de dezavantaje. Cele adulte sunt rare, dificil de izolat și cultivat, și au o capacitate de diferențiere restrânse, fiind adesea angajate pe un anumit lineaj, iar cele embrionare generează teratoame in vivo, iar recoltarea și utilizarea acestora întâmpină bariere de natură etică, deoarece în cursul recoltării lor, embrionul este de cele mai multe ori compromis. Acesta este motivul pentru care se caută permanent noi tipuri de celule stem care să fie utilizate în tratament.

7. Celulele stem din anexele fetale sunt surse ideale de celule stem, oferind posibilitatea obținerii unui număr mare de celule, cu potențial larg de diferențiere și fără restricții de ordin etic, sau suspiciune de a genera teratoame.

8. Un aspect important de care ar trebui să se țină cont în studiile viitoare este elaborarea unor metode standardizate de izolare și cultivare a celulelor stem amniotice. În acest fel s-ar putea stabili cu precizie sporită capacitatea de proliferare și diferențiere a acestor celule, precum și acei markeri care le caracterizează și le conferă aceste proprietăți.

9. Este extrem de importantă cunoașterea exactă a markerilor acestor celule, precum și standardizarea caracteristicilor celulare, în vederea utilizării acestor celule în vindecarea unor afecțiuni astăzi considerate incurabile.

BIBLIOGRAFIE

1. Mitalipov S, Wolf D. Totipotency, pluripotency and nuclear reprogramming. Advances in biochemical engineering/biotechnology. 2009;114:185-99.

2. Binder M, Hirokawa N, Windhorst U. Encyclopedia of Neuroscience. 1st ed. New York: Springer; 2008.

3. Knoepffler N, Schipanski D, Sorgner S. Human biotechnology as social challenge. 1st ed. Aldershot, England: Ashgate; 2007

4. Tuch BE. Stem cells–a clinical update. Australian family physician. 2006;35(9):719-21.

5. Stem Cell Basics. In Stem Cell Information [Preluat Iunie 2014]. Disponibil la: http://stemcells.nih.gov/info/basics/Pages/Default.aspx

6. Chien KR. Regenerative medicine and human models of human disease. Nature. 2008;453:302–5.

7. Polak DJ. Regenerative medicine. Opportunities and challenges: a brief overview. Journal of the Royal Society Interface. 2010;7:S777–81.

8. Adult Stem Cell and Embryonic Stem Cell Markers. Materials and Methods. [Preluat Iunie 2014] Disponibil la: http://www.labome.com/method/Adult-Stem-Cell-and-Embryonic-Stem-Cell-Markers.html

9. Amnion Development [Preluat Iunie 2014] Disponibil la: https://www.boundless.com/physiology/textbooks/boundless-anatomy-and-physiology-textbook/human-development-and-pregnancy-28/second-week-of-development-262/amnion-development-1291-360/

10. Underwood MA, Gilbert WM, Sherman MP. Amniotic Fluid: Not Just Fetal Urine Anymore. J Perinatol. 2005;25(5):341-8.

11. Gabbe SG, Niebyl JR, Galan HL, Jauniaux ER, Landon MB, Simpson JL, et al. Obstetrics: Normal and Problem Pregnancies. 5th ed. Churchill Livingstone; 2005

12. Carraro G, Garcia OH, Perin L, De Filippo R, Warburton D. Amniotic Fluid Stem Cells, Embryonic Stem Cells – Differentiation and Pluripotent Alternatives. Intech; 2011

13. De Coppi P, Bartsch G, Siddiqui MM, Xu T, Santos CC, Perin L, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potențial for therapy. Nature biotechnology. 2007;25(1):100-6.

14. Roubelakis MG, Trohatou O, Anagnou NP. Amniotic fluid and amniotic membrane stem cells: marker discovery. Stem cells international. 2012;2012:1078-136.

15. Insausti CL, Blanquer M, Garcia-Hernandez AM, Castellanos G, Moraleda JM. Amniotic membrane-derived stem cells: immunomodulatory properties and potențial clinical application. Stem cells and cloning: advances and applications. 2014;7:53-63.

16. Phermthai T, Odglun Y, Julavijitphong S, Titapant V, Chuenwattana P, Vantanasiri C, et al. A novel method to derive amniotic fluid stem cells for therapeutic purposes. BMC cell biology. 2010;11:79.

17. Graf T, Enver T. Forcing cells to change lineages. Nature. 2009;462:587–94.

18. Lengner CJ. IPS cell technology in regenerative medicine. Annals of the New York Academy of Sciences. 2010;1192:38–44.

19. Blasco MA, Serrano M, Fernandez-Capetillo O. Genomic instability in iPS: time for a break. The EMBO Journal. 2011;30(6):991-3.

20. Robinton DA, Daley GQ. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 2012;481:295–305.

21. Cananzi M, De Coppi P. CD117+ amniotic fluid stem cells: State of the art and future perspectives. Organogenesis 2012;8(3):77-88.

22. Kashyap V, Rezende NC, Scotland KB, Shaffer SM, Persson JL, Gudas LJ, et al. Regulation of Stem Cell Pluripotency and Differentiation Involves a Mutual Regulatory Circuit of the Nanog, OCT4, and SOX2 Pluripotency Transcription Factors With Polycomb Repressive Complexes and Stem Cell microRNAs. Stem cells and development. 2009;18:1093-108.

23. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998;282:1145–7.

24. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, Trounson A, Bongso A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 2000;18:399–404.

25. Shi W, Wang H, Pan G, Geng Y, Guo Y, Pei D. Regulation of the Pluripotency Marker Rex-1 by Nanog and Sox2. Journal of Biological Chemistry. 2006;281(33):23319–25.

26. Wang J, Rao S, Chu J, Shen X, Levasseur DN, Theunissen TW, et al. A protein interaction network for pluripotency of embryonic stem cells. Nature. 2006;444(7117):364–8.

27. Cukušic A, Skrobot VN, Sopta M, Rubelj I. Telomerase regulation at the crossroads of cell fate. Cytogenet. Genome Res. 2008;122(3-4): 263–72.

28. Flores I, Benetti R, Blasco MA. Telomerase regulation and stem cell behaviour. Current Opinion in Cell Biology. 2006;18(3):254–60.

29. Tsai CC, Chen CL, Liu HC, Lee YT, Wang HW, Hou LT, et al. Overexpression of hTERT increases stem-like properties and decreases spontaneous differentiation in human mesenchymal stem cell lines. J. Biomed. Sci. 2010;17:64.

30. Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, Hwang SM. Isolation of Human Multipotent Mesenchymal Stem Cells from Second-Trimester Amniotic Fluid Using a Novel Two-Stage Culture Protocol. Human Reproduction. 2004;19(6):1450-6.

31. Sessarego N, Parodi A, Podestà M, Benvenuto F, Mogni M., Raviolo V, et al. Multipotent Mesenchymal Stromal Cells from Amniotic Fluid: Solid Perspectives for Clinical Application. Haematologica. 2008;93(3): 339-46.

32. Davis DM. The Compatibility Gene. How Our Bodies Fight Disease, Attract Others, and Define Our Selves. Oxford: Oxford University; 2014

33. Joo S. Ko IK, Atala A, Yoo JJ, Lee SJ. Amniotic fluid-derived stem cells in regenerative medicine research. Archives of Pharmacological Research. 2012;35(2):271–80.

34. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284(5411):143–7.

35. Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg vang der Keur C, Noort WA, Claas FH, Willemze R, et al. Amniotic fluid as a novel source of mesenchymal stem cells for therapeutic transplantation. Blood. 2003;102(4):1548–9.

36. Heeger PS. Amnion and chorion cells as therapeutic agents for transplantation and tissue regeneration: a field in its infancy. Transplantation. 2004;78(10):1411–2.

37. Ilancheran S, Michalska A, Peh G, Wallace EM, Pera M, Manuelpillai U. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 2007;77(3):577–88.

38. Hennerbichler S, Reichl B, Pleiner D, Gabriel C, Eibl J, Redl H. The influence of various storage conditions on cell viability in amniotic membrane. Cell Tissue Bank. 2007;8(1):1–8.

39. Branski LK, Kulp G, Jeschke MG, Norbury WB, Herndon DN. Amniotic membrane as wound coverage: the effects of irradiation and different processing methods on growth factor content. J Surg Res. 2007;137(2):339.