CELULE LIMFOIDE

CUPRINS

INTRODUCERE

CAPITOLUL I

CELULE LIMFOIDE

1. LIMFOCITUL B

1.1. Morfologie

1.2. Ontogeneză

1.3. Semnalizarea prin receptorul de antigen al limfocitului B

1.3.1. Semnalizarea intracelulară prin CD19

1.3.2. Semnalizarea intracelulară prin CD20

1.3.3. Semnalizarea intracelulară prin CD23

1.3.4. Semnalizarea intracelulară prin CD40

1.3.5. Semnalizarea intracelulară prin CD45

1.3.6. Semnalizarea intracelulară prin CD81

1.4. Activarea limfocitelor B

1. Activarea prin antigene timo-dependente

2. Activarea prin antigene timo-independente

2. LIMFOCITUL T

2.1. Morfologie

2.2. Ontogeneză

2.3. Activarea limfocitelor T CD4+

2.3.1. Limfocitul T CD4+ și celulele NK

2.4. Activarea limfocitelor T CD8+

3. CELULELE NK

3.1. Morfologie

3.2. Funcție

4. MECANISME DE TRANSMITERE A SEMNALULUI PRIN INTERMEDIUL RECEPTORULUI PENTRU ANTIGEN DE PE LIMFOCIT

4.1. Structurile implicate în transmiterea semnalului

4.2. Baza moleculară a transmiterii semnalului

4.2.1. Rolul protein tirozin kinazei Lck în transmiterea semnalului

4.2.2. Rolul protein tirozin kinazelor din familia Syc/Zap-70 în semnalizare

4.3. Coreceptorii și contribuția lor la transmiterea semnalului

4.4. Evenimentele transmiterii semnalului. Schema mesagerului secundar

CAPITOLUL II

1. Celulele limfoide murine

1. 1. Recoltarea sângelui murin periferic

1. 2. Izolarea limfocitelor din sângele periferic prin centrifugare în gradient de densitate

2. Celule limfoide tumorale

3. Determinarea densității celulare

4. Determinarea viabilității celulare

4.1. Determinarea viabilității cu Tripan Blue

Principiul metodei:

Viabilitatea celulară a fost determinată prin testul excluziei albastrului de tripan. Albastrul de tripan este un colorant vital care difuzează în interiorul celulelor moarte sau a celor care prezintã leziuni ale membranei plasmatice. In consecință, celulele moarte se coloreazã și pot fi distinse de cele vii prin vizualizare la microscopul optic.

4.2. Determinarea viabilității cu MTT (Tiazolil blue)

Principiul metodei:

5. Efectul Ca2+ / depleției Ca2+ asupra viabilității celulelor EL4 și limfocitelor normale

5.1. Efectul calciului asupra celulelor EL4

5.2. Efectul calciului asupra limfocitelor normale murine

6. Determinarea activității enzimatice a Ca2+-ATPazei

6.1. Reacția enzimatică

6.2. Dozarea fosfatului eliberat

6.3. Dozarea de proteine

– Se prepară reactivul:

(A) Coomassie Brilliant Blue G250 100 mg

7. Determinarea activității enzimatice specifice a Ca-ATP-azei în limfocitele normale si tumorale

CAPITOLUL III

1. Celulele limfoide murine

1.1. Recoltarea sângelui murin periferic

1.2. Izolarea limfocitelor din sângele periferic prin centrifugare în gradient de densitate

1.3. Numărarea limfocitelor murine

2. Efectul Ca2+ asupra viabilității limfocitelor normale si tumorale

2.1. Efectul Ca2+ / depleției Ca2+ asupra viabilității celulelor EL4

2.2. Efectul Ca2+ / depleției Ca2+ asupra viabilității limfocitelor normale

3. Determinarea activității enzimatice a Ca2+-ATPazei în celulele limfoide normale și tumorale

3.1. Dozarea fosfatului

3.2. Dozarea proteinelor

3.3. Determinarea timpului de reacție optim al Ca2+-ATP-azei.

3.4. Determinarea pH de reacție optim

3.5. Determinarea activității enzimatice a Ca2+-ATP-azei în funcție de concentrația substratului

3.6. Determinarea activității enzimatice a Ca-ATP-azei în funcție de concentrația Ca2+ din mediul de reacție.

3.7. Determinarea activității enzimatice specifice a Ca2+-ATP-azei în limfocitele normale și tumorale

Activitatea enzimatică specifică

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

INTRODUCERE

Calciul este un semnal intracelular ubiquitar responsabil de controlul a numeroase procese celulare. Caracterul universal al calciului ca mesager secundar depinde de enorma sa versatilitate (6). Celulele posedă un repertoriu molecular extins al componentelor semnalizării calciului, care formează un echipament de semnalizare a Ca2+, care poate fi asamblat în diferite combinații pentru a creea semnale cu profiluri temporale și spațiale foarte variate.

Versatilitatea calciului este exploatată cu scopul de a regla diverse răspunsuri celulare și de a controla procese diverse cum sunt fecundarea, proliferarea, diferențierea, învățarea și memoria, contracția și secreția. Toate aceste lucruri trebuie realizate în condițiile în care, depășirea granițelor temporale și spațiale specifice, duce transformarea caracterului calciului din benefic în toxic și bineînțeles la moartea celulei prin apoptoză sau prin necroză (26).

Efectele concentrației de calciu se răsfrâng în mod direct și nemijlocit asupra viabilității celulelor. De aceea, în această lucrare s-a evaluat viabilitatea celulelor limfoide normale și tumorale sub influența ionilor de Ca2+.

Efectul diferitelor concentrații de Ca2+ asupra celulelor limfoide a presupus studierea unuia dintre principalele mecanisme de echilibrare a concentrației intracelulare a calciului și anume activitatea Ca2+-ATP-azei. In acest scop, am determinat câteva carateristici ale Ca2+-ATP-azei cum sunt timpul și pH-ul optim de reacție și am dozat activitatea specifică a acestei pompe atât în celulele limfoide normale cât și în cele tumorale.

Rezultatele obținute îndreptățesc continuarea studierii efectelor ionilor de Ca2+ asupra celulelor și clarificarea rolului său în fenomenul de apoptoză.

CAPITOLUL I

CELULE LIMFOIDE

Celulele limfoide sunt celule efectoare ale imunității specifice care asigură recunoașterea specifică a antigenelor și atacul direcționat împotriva lor. Principalele tipuri de celule imune specializate sunt limfocitele B și T, la care se adaugă celulele NK (natural killer).

Limfocitele sunt celulele efectoare esențiale ale răspunsului imun. Aceste celule sunt stocate și educate la nivelul țesuturilor și organelor limfoide pentru a deveni imunocompetente. O celulă limfocitară imunocompetentă prezintă receptori specifici față de un antigen pe care îl pot recunoaște și față de care răspund prin proliferare, diferențiere și răspuns imun.

Toate structurile limfocitare alcătuiesc sistemul limfoid care este substratul morfologic și funcțional al sistemului imun. Principalele funcții biologice ale celulelor limfoide imunocompetente sunt recunoașterea specifică a antigenului și dezvoltarea de reacții specifice prin care antigenul e anihilat și eliminat (26).

1. LIMFOCITUL B

Numele de limfocit B vine de la sediul ontogenezei acestor celule la păsări – Bursa lui Fabricius. La specia umană se numesc limfocite B (echivalentul celulelor bursale) și sunt generate și se maturează în măduva osoasă hematogenă. Limfocitele B au capacitatea de a sintetiza și secreta un vast repertoriu de imunoglobuline capabile să interacționeze specific cu o paletă largă de antigene. Limfocitele B mature prezintă la suprafața celulară imunoglobuline membranare cu specificitate unică care funcționează ca receptori de antigen. In urma contactului cu epitopii antigenului, limfocitele B se activează și se diferențiază în celule efectorii.

Funcția principală a limfocitelor B constă în producția de imunoglobuline secretate cu aceeași specificitate antigenică ca și imunoglobulinele membranare care intră în componența receptorului de antigen al limfocitului B. Limfocitul B funcționează ca celulă prezentatoare de antigen prin endocitarea antigenului cuplat cu receptorul limfocitului B. Antigenul este procesat și apoi prezentat pe suprafața limfocitului B în asociere cu moleculele complexului major de histocompatibilitate clasa II.

1.1. Morfologie

Limfocitul B este o celulă mică și rotundă, cu un diametru de 7-9 m. Prezintă un nucleu mare și o bandă subțire de citoplasmă cu aspect reticulat care conține numeroși ribozomi și un număr redus de lizozomi și mitocondrii. Membrana celulară prezintă numeroase microvilozități.

Limfocitul B matur poate fi găsit în măduva osoasă, în organele limfoide secundare: splină, formațiuni ganglionare, diferite țesuturi și în sângele periferic, unde reprezintă între 6-24% din limfocitele circulante ale adultului.

Stimularea antigenică determină activarea limfocitului B de repaus și transformarea blastică a acestuia cu apariția limfoblastului B care este o celulă mare cu diametrul de aproximativ 12-15 m care se divide rapid și evoluează fie în direcția plasmocitului, fie în celulă B de memorie.

Plasmocitul, celula secretantă de imunoglobuline, este o celulă mare cu diametrul de circa 20 m, cu citoplasmă abundentă care conține numeroși ribozomi necesari sintezei proteice. Prezintă un nucleu excentic, caracteristic, în “spiță de roată”. Plasmocitul poate produce circa 5000-10000 de molecule de imunoglobuline într-o secundă și are o durată de viață de câteva zile. Se găsește în principal în organele limfoide periferice: splină, formațiuni ganglionare, diferite țesuturi și este rar întâlnit în sângele periferic.

Celula B de memorie este mică și foarte asemănătoare morfologic cu limfocitul B de repaus. Asupra limfocitului B cu memorie planează multe controverse, atât în ceea ce privește originea cât și funcționalitatea sa. (1)

1.2. Ontogeneză

Limfocitul B provine din celula stem pluripotentă (celula șușă) care este precursorul comun pentru toate liniile celulare hematopoietice (limfocite, monocite-macrofage, granulocite, eritrocite, trombocite).

Evoluția celulei B din celula stem pluripotentă trece printr-o suită de etape intermediare de dezvoltare, caracterizate prin faze succesive de reorganizare genetică, care asigură sinteza de imunoglobuline și prin achiziționarea anumitor markeri specifici de suprafață. Cele mai importante stadii de diferențiere sunt:

celula stem (multipotentă)

celula pro-B (celula B angajată)

celula pre-B (cu stadiile pre-BI și pre-BII)

limfocitul B imatur

limfocitul B matur

limfoblastul B

plasmocitul

limfocitul B cu memorie

La rândul lor, cele 8 stadii de dezvoltare au fost împărțite în 2 etape:

Etapa antigen-independentă,

Se desfășoară la nivelul măduvei osoase hematogene, în urma căreia se generează limfocite B mature de repaus.

De-a lungul acestei etape, în absența stimulării antigenice iau naștere precursori care trec prin etape progresive de maturare până la limfocitul B.Din celula stem pluripotentă, sub acțiunea IL-3 se orientează celula cap de serie-celula stem limfoidă. Etapele intermediare prin care trece celula stem limfoidă sub acțiunea IL-3 și IL-7 sunt: celula progenitor pro-B, celula precursor pre-B, celula B imatură, celula B matură de repaus. La mamifere acest proces se declanșează încă din perioada intrauterină, la nivelul sacului vitelin, al ficatului fetal și al măduvei osoase, pentru ca după naștere, măduva osoasă să reprezinte locul principal de generare a limfocitelor B.

In cursul fazei antigen-independentă multe celule ce urmează această cale de diferențiere mor printr-un proces de apoptoză, numai o treime din celulele precursoare reușesc rearanjarea lanțurilor grele și ușoare pentru a da naștere la celule B mature de repaus. Celulele cu rearanjamente neproductive devin apoptotice și sunt eliminate de macrofagele măduvei osoase.

Etapa antigen-dependentă

Se desfășoară la nivelul organelor limfoide secundare, prin care iau naștere consecutiv stimulării antigenice, plasmocite și celule B de memorie.

Această etapă se desfășoară la nivelul organelor limfoide secundare în prezența antigenului. In absența antigenului celulele B mature de repaus ajunse în organele limfoide secundare au o durată de viață scurtă, de câteva zile, după care mor prin apoptoză. Cuplarea antigenului de receptorul celulei B (BCR) determină activarea acesteia și transformarea în limfoblast și apoi în plasmocit sau celulă B de memorie (26).

1.3. Semnalizarea prin receptorul de antigen al limfocitului B

Receptorul de antigen al limfocitului B (BCR) aparține unei clase de receptori de membrană care include și TCR (receptorul pentru antigen al limfocitului T) și Fc-receptorii. Acești receptori sunt complexe heteroligomerice formate din subunități capabile să recurul de circa 20 m, cu citoplasmă abundentă care conține numeroși ribozomi necesari sintezei proteice. Prezintă un nucleu excentic, caracteristic, în “spiță de roată”. Plasmocitul poate produce circa 5000-10000 de molecule de imunoglobuline într-o secundă și are o durată de viață de câteva zile. Se găsește în principal în organele limfoide periferice: splină, formațiuni ganglionare, diferite țesuturi și este rar întâlnit în sângele periferic.

Celula B de memorie este mică și foarte asemănătoare morfologic cu limfocitul B de repaus. Asupra limfocitului B cu memorie planează multe controverse, atât în ceea ce privește originea cât și funcționalitatea sa. (1)

1.2. Ontogeneză

Limfocitul B provine din celula stem pluripotentă (celula șușă) care este precursorul comun pentru toate liniile celulare hematopoietice (limfocite, monocite-macrofage, granulocite, eritrocite, trombocite).

Evoluția celulei B din celula stem pluripotentă trece printr-o suită de etape intermediare de dezvoltare, caracterizate prin faze succesive de reorganizare genetică, care asigură sinteza de imunoglobuline și prin achiziționarea anumitor markeri specifici de suprafață. Cele mai importante stadii de diferențiere sunt:

celula stem (multipotentă)

celula pro-B (celula B angajată)

celula pre-B (cu stadiile pre-BI și pre-BII)

limfocitul B imatur

limfocitul B matur

limfoblastul B

plasmocitul

limfocitul B cu memorie

La rândul lor, cele 8 stadii de dezvoltare au fost împărțite în 2 etape:

Etapa antigen-independentă,

Se desfășoară la nivelul măduvei osoase hematogene, în urma căreia se generează limfocite B mature de repaus.

De-a lungul acestei etape, în absența stimulării antigenice iau naștere precursori care trec prin etape progresive de maturare până la limfocitul B.Din celula stem pluripotentă, sub acțiunea IL-3 se orientează celula cap de serie-celula stem limfoidă. Etapele intermediare prin care trece celula stem limfoidă sub acțiunea IL-3 și IL-7 sunt: celula progenitor pro-B, celula precursor pre-B, celula B imatură, celula B matură de repaus. La mamifere acest proces se declanșează încă din perioada intrauterină, la nivelul sacului vitelin, al ficatului fetal și al măduvei osoase, pentru ca după naștere, măduva osoasă să reprezinte locul principal de generare a limfocitelor B.

In cursul fazei antigen-independentă multe celule ce urmează această cale de diferențiere mor printr-un proces de apoptoză, numai o treime din celulele precursoare reușesc rearanjarea lanțurilor grele și ușoare pentru a da naștere la celule B mature de repaus. Celulele cu rearanjamente neproductive devin apoptotice și sunt eliminate de macrofagele măduvei osoase.

Etapa antigen-dependentă

Se desfășoară la nivelul organelor limfoide secundare, prin care iau naștere consecutiv stimulării antigenice, plasmocite și celule B de memorie.

Această etapă se desfășoară la nivelul organelor limfoide secundare în prezența antigenului. In absența antigenului celulele B mature de repaus ajunse în organele limfoide secundare au o durată de viață scurtă, de câteva zile, după care mor prin apoptoză. Cuplarea antigenului de receptorul celulei B (BCR) determină activarea acesteia și transformarea în limfoblast și apoi în plasmocit sau celulă B de memorie (26).

1.3. Semnalizarea prin receptorul de antigen al limfocitului B

Receptorul de antigen al limfocitului B (BCR) aparține unei clase de receptori de membrană care include și TCR (receptorul pentru antigen al limfocitului T) și Fc-receptorii. Acești receptori sunt complexe heteroligomerice formate din subunități capabile să recunoască specific antigenul și subunități care transmit semnalul intracelular.

In cazul BCR, porțiunea care recunoaște și leagă antigenul este imunoglobulina de suprafață (sIg) formată din 4 lanțuri polipeptidice: 2 lanțuri grele H și 2 lanțuri ușoare L. Lanțurile grele se continuă cu secvențe scurte de aminoacizi transmembranare și intracitoplasmatice, care ancorează întreaga moleculă sIg de membrana celulară. sIg aparține oricărei clase de imunoglobuline: IgM, IgG. IgA, IgE, IgD, dar mai frecventă este sIgM.

Structura care asigură transmiterea semnalului intracelular este reprezentată de 2 lanțuri polipeptidice Ig și Ig, legate între ele prin punți disulfidice.

Structura BCR diferă în funcție de stadiul de maturare al limfocitului B. Limfocitul B matur prezintă BCR format din sIg asociat doar cu Ig și Ig, într-un raport sIg/complex Ig și Ig de 1/1 sau 2/1.

Rolul moleculelor Ig și Ig pare să fie legat de capacitatea acestora de a semnaliza intracelular legarea unor antigene de sIg asociat. Procesul este asemănător cu cel din limfocitele T unde TCR (moleculele , , și ) este receptorul propriu-zis, iar molecula asociată CD3 este transductorul de semnale. Lanțurile Ig și Ig au o regiune intracitoplasmatică capabilă să transmită semnale intracelular care conține o secvență de 26 aminoacizi numită ARH1 (Antigen Receptor Homology motif 1), ARAM sau TAM. Această regiune poate fi fosforilată datorită prezenței unor resturi tirozinice care se găsesc într-o secvență conservată de 6 aminoacizi (D/E-X7-D/E-X2-Y-X2-L/I-X7-Y-X2-L/I). Acest motiv este capabil să inițieze o serie de procese cum ar fi activarea unor protein tirozin kinaze, mobilizarea calciului intracelular, producția de IL2, endocitoza. Evenimentul principal în procesul de semnalizare este fosforilarea celor 2 resturi tirozinice din componența ARAM. Inlocuirea celor 2 tirozine cu fenilalanina nu abolește capacitatea de semnalizare intracelulară, însă aceasta e mai puțin eficientă. Utilizarea șoarecilor transgenici knock-out pentru genele Ig sau Ig s-a demonstrat că BCR poate funcționa cu o singură moleculă transductor, mai importantă fiind Ig. (3).

Semnalizarea via BCR a fost studiată cu ajutorul anticorpilor monoclonali anti-IgM care prin legare de BCR mimează efectul produs de antigenul specific. S-a observat la circa 5 secunde dupa cross-legarea BCR cu anticorpi anti-IgM o creștere a fosforilării tirozinice a mai multor proteine citoplasmatice. Până în prezent au fost identificate 4 tirozin kinaze din familia Src localizate în vecinătatea secvenței ARAM. Acestea sunt proteinele p55blk, p59fyn, p56lck, p53/56lyn, dar și p72syk care nu aparține familiei Src. Capacitatea moleculelor Ig și Ig de a interacționa cu protein tirozin kinazele din familia Src este atribuită unor secvențe de câte 4 aminoacizi: DCSM și QTAT din regiunea ARAM. Cross-legarea BCR cu anticorpi specifici este urmată de fosforilarea reziduurilor tirozinice dim motivele ARAM și o creștere de circa 20 de ori a afinității față de protein tirozin kinazele Src, pe care le leagă prin motivele SH2 (6).

In figura 1 este prezentat schematic BCR și relația spațială și funcțională a acestuia cu moleculele CD19, CD21, CD81, Leu-13, CD45

Figura 1 (Drugarin, Imunologie moleculară, 1998)

Fosforilarea rapidă a p72syk consecutivă legarii BCR, sugerează rolul acesteia în semnalizarea prin receptorul de antigen. S-a demonstrat că p72syc leagă motivul ARH1 fosforilat. In mod asemănător protein tirozin kinaza ZAP-70, care prezintă omologie cu p72syk, recunoaște motivul ARH1 din componența TCR. Foarte probabil p72syk este implicată în semnalizarea BCR la 2 nivele, primul realizat cu participarea regiunii citoplasmatice sIg, iar al doilea prin intermediul motivului ARH1 (27).

Mecanismul exact prin care BCR induce activitatea protein tirozin kinazelor și semnalizarea intracelulară sunt încă sub incidența speculațiilor, două modele fiind mai plauzibile.(28)

1. Modelul activării prin fosforilare

Presupune activarea protein tirozin kinazelor datorită fosforilării motivelor ARH1 din componența Ig și Ig. După legarea BCR, prima care se activează este p72syk, iar procesul implica regiunea citoplasmatică a sIg. Legarea BCR cu un ligand specific conduce la autofosforilarea p72syk, care activează protein tirozin kinaze Src, care la rândul lor vor fosforila domeniile ARH1 care fosforilează mai departe alte protein tirozin kinaze Src și p72syk, procesul autoamplificându-se.

2. Modelul activării prin defosforilare

Susține că prima fază a activării constă în îndepărtarea unor grupări fosfat cu funcție inhibitotie din structura protein tirozin kinazelor Src. Rolul principal în acest proces revine proteinei CD45, care are activitate protein tirozin fosfatazică. CD45 este o glicoproteină transmembranară, exprimată din abundență pe limfocitele B și T. Experimental s-a observat că, prin tratarea limfocitului B cu anticorpi monoclonali anti-CD45, este inhibat răspunsul acestuia la stimularea cu antigene specifice. A fost investigată capacitatea celulelor de plasmocitom J558 de a răpunde prin mobilizare de Ca2+ la cross-linkarea BCR. Aceste celula prezintă pe suprafață sIgM, fiind lipsite de CD45. Stimularea lor cu antigene specifice sau anticorpi monoclonali anti-IgM nu determină apariția unui influx de Ca2+. După transinfecția genei pentru CD45 și reconstituirea membranară a tirozin fosfatazei, administrarea de anticorpi monoclonali anti-IgM este urmată de apariția unui influx de Ca2+. Aceste experimente atestă implicarea CD45 în semnalizarea în limfocitul B. Recent s-a demonstrat că CD45 are ca substrat și regiuni intracitoplasmatice din structura Ig și Ig. Incubarea celor două proteine cu CD45 conduce la o rapidă defosforilare a acestora, iar tratarea limfocitelor B cu un inhibitor de tirozin fosfataze induce o hiperfosforilare a Ig și Ig.

Figura 2: Modelul activării prin defosforilare și rolul protein tirozin fosfatazei CD45. (Drugarin, Imunologie moleculară, 1998, 28)

1.3.1. Semnalizarea intracelulară prin CD19

CD19 este o glicoproteină de circa 95kDa exprimată doar pe suprafața limfocitului B și a celulelor dendritice foliculare. Acest marker apare încă din cele mai timpurii stadii de dezvoltare a limfocitului B și poate fi pus în evidență începând de la celula pro-B și până la stadiul de limfocit B activat.

Molecula CD19 face parte din superfamilia imunoglobulinelor și este formată din 3 segmente. Segmentul extracelular,de dimensiune mică, conține 2 domenii Ig-like (asemamătoare imunoglobulinelor) despărțite de o buclă scurtă, stabilizată de 2 punți disulfidice. Porțiunea transmembranară este scurtă, iar domeniul intracitoplasmatic are o lungime apreciabilă fiind format din 240 aminoacizi.

Funcția probabilă a secvenței intracelulare este aceea de transductor de semnale, generată prin interacția cu diverși liganzi. De altfel, studii recente indică faptul că domeniul intracitoplasmatic este conectat la un sistem de transducție reprezentat de protein kinaze și fosfolipaza C (PLC). Secvențializarea porțiunii intracelulare a moleculei a evidențiat motive structurale de tip SH2 (Src Homology region-2) și 9 reziduuri tirozinice, dintre care unele sunt localizate în regiunea SH2. Au mai fost identificate 2 secvențe tip pYXXM, cunoscute ca receptori ai subunității p85 non-catalitice a PI3-kinazei (fosfatidilinozitol–3-OH kinaza). Secvențele pYXXM se află în 2 locusuri în apropierea capătului carboxiterminal al moleculei, în pozițiile 428YEDM și 513YENM, aceste regiuni mediind legarea directă a PI3-kinazei de CD19. In afară de subunitatea p85 non-catalitică, PI3-kinaza mai conține o subunitate catalitică p110 care mediază transferul grupărilor fosfat. Alte regiuni tirozinice fosforilabile ale CD19 au o mare afinitate pentru domeniile SH2 ale protein tirozin kinazelor p59fyn și o afinitate mai scazută pentru PCL-1, proteina G și p62yes. Mecanismele de semnalizare prin CD19, încă necunoscute în detaliu, presupun o interacțiune directă sau indirectă a CD19 cu protein kinazele membranare. Cross-legarea CD19 pe suprafața limfocitului B este însoțită de fosforilarea reziduurilor tirozinice din secvențele pYXXM și SH2, consecutiv activării protein tirozin kinazelor. Este activată și PI3-kinaza, fie direct prin asocierea CD19 cu subunitatea p85, fie indirect prin intermediul protein tirozin kinazelor p59fyn și p53/56lyn. Are loc și activarea PLC, care clivează PIP2 (fosfatidilinozitol difosfat) la DAG (diacil-glicerol) și IP3 (inozitol trifosfat). DAG leagă direct și activează PKC (protein kinaza C), în timp ce IP3 induce eliberarea intracelulară de Ca2+. O parte din acești mesageri secundari sunt influențați și de alte molecule de pe membrana limfocitului B, cum ar fi BCR și CD45, acest lucru explicând efectele sinergice observate în cazul legării simultanea acestor markeri (27).

1.3.2. Semnalizarea intracelulară prin CD20

CD20 este o proteină transmembranară exprimată pe suprafața limfocitelor B și a celulelor dendritice foliculare. Pe limfocitul B, această moleculă apare în stadiul de celulă pro-B și până în stadiul de limfocit B activat, dispărând însă de pe suprafața plasmocitului. Studii biochimice au relevat că CD20 există în 3 forme distincte de 33kDa, 35kDa și 37kDa, cu grade de fosforilare diferite, formele de masă moleculară mare sunt rezultatul fosforilării formei de bază de 33kDa.

Structura acestui marker este complexă și cuprinde 4 regiuni hidrofobe care străbat membrana plasmatică. Ambele capetele amino și carboxiterminale se află situate în interiorul celulei. Regiunile citoplasmatice ale CD20 umane sunt bogate în reziduuri serină și treonină fosforilabile, dar sunt lipsite de reziduuri tirzinice.

Se pare că CD20 face parte dintr-un complex de membrană multimolecular. Activarea limfocitului B este însoțită de o intensă fosforilare a domeniilor citoplasmatice ale moleculei CD20 concomitent cu o creștere marcantă a nivelului intracelular de Ca2+. Astfel de variații ale nivelului intracelular de Ca2+ au fost evidențiate și la alte tipuri de celule după transfecția acestora cu gena pentru CD20. Fosforilarea intensă a domeniilor citoplasmatice este rezulatatul activității PKC, a cazein kinazei II (CK II) și a calciu/calmodulin kinazei II (CaM-kII). Cu mare probabilitate secvența activării moleculei CD20 este următoarea: receptorul BCR este stimulat în urma interacțiunii cu antigenul specific. Secundar acestei interacțiuni au loc modificări confomaționale în structura BCR, modificări semnalizate intracelular de moleculele transductor Ig și Ig. Acestea vor activa pe de o parte sistemul de protein kinaze asociate, iar pe de altă parte PLC care va acționa asupra substratului specific reprezentat de fosfatidil-inozitol (PtdIns). Fosfatidil-inozitolul va fi hdrolizat la DAG și inozitol 1, 4, 5-trifosfat (IP3). DAG activează PKC care va determina fosforilarea unor regiuni citoplasmatice ale CD20. IP3 mobilizează Ca2+ din reticulul endoplasmatic. Ca2+ va activa prin legare calciu/calmodulin kinaza II care va fosforila alte situsuri ale CD20. In urma acestor fosforilări molecula CD20 va facilita transportul transmembranar de Ca2+, creșterea nivelului intracitoplasmatic al acestuia va duce în final la potențarea activării limfocitului B (27).

Legarea cu diferiți anticorpi monoclonali anti-CD20, induce cel mai adesea, pe lângă o creștere a fosforilării moleculei, expresia unor oncogene (c-myc și B-myb). Efectul legării anticorpilor monoclonali anti-CD20 asupra nivelului intracelular de Ca2+ este variabil și depinde de anticorpul monoclonal anti-CD20 folosit (1F5 determină după legare o creștere rapidă a Ca2+ intracelular, anticorpii monoclonali anti-B1 prin legarea unui alt epitop de pe molecula de CD20 nu are un efect imediat asupra nivelului de Ca2+ intracelular), cu toate aceste incubarea de lungă durată a limfocitelor B cu anticorpii monoclonali anti-B1 poate induce creșterea nivelului de Ca2+ intracelular (atât cel bazal cât și cel indus de activitatea celulară). Celulele B din leucemia cu celule păroase, caracterizate printr-un nivel ridicat de fosforilare a moleculelor CD20, prezintă o concentrație ridicată a Ca2+ intracelular. Mecanismul exact prin care CD20 modulează transportul transmembranar și nivelul de Ca2+ intracelular nu e bine înțeles. Dintre toate ipotezele, cea mai acceptată este aceea că molecula CD20 formează ea însăși un canal ionic de Ca2+.

Există date care arată implicarea markerului celular CD20 în controlul ciclului celular. Tratarea cu anticorpi monoclonali anti-CD20 poate inhiba diviziunea celulară și blocarea ciclului în faza G0, chiar după stimularea cu mitogeni (PWM-Pokweed Mitogen) sau tratarea cu virusul Epstein-Barr (EBV). Trecerea celulelor din faza G0/G1 în faza S a ciclului celular este dependentă de scăderea nivelului de Ca2+ intracelular și este evident că fosforilarea moleculei de CD20, care induce creșterea concentrației de Ca2+, va împiedica diviziunea celulară (43).

1.3.3. Semnalizarea intracelulară prin CD23

CD23 a fost detectată pe limfocitele B, limfocitele T, macrofage, eozinofile, trombocite, celule NK, celule foliculare dendritice, celule Langerhans, celule epiteliale din măduvă osoasă și timus. Pentru limfocitul B, CD23 este considerat un marker de activare și un marker specific limfocitelor B imortalizate cu EBV.

CD23 este singurul receptor de imunoglobuline care nu aparține superfamiliei imunoglobulinelor. Această moleculă a fost inclusă în familia lectinelor, fiind o selectină Ca2+ dependentă.

Structural, CD23 este formată dintr-un buchet de 3 -helixuri, care prezintă extracelular un domeniu globular C-lectinic, de tip MBP (Manose Binding Protein). La acest nivel molecula umană de CD23 conține un situs de legare pentru Ca2+ (la șoarece sunt prezente 2 astfel de situsuri).In aceeași porțiune se află regiunea de legare pentru IgE și manoză, astfel explicându-se de ce legarea IgE este dependentă de Ca2+. Regiunile carboxiterminale sunt flancate de secvențe tip RGD (arginină, glicină, acid aspartic) inversate responsabile pentru adeziunea celulară. Porțiunea extracelulară a CD23 este urmată de un fragment transmembranar și de o scurtă secvență citoplasmatică.

Au fost identificate, în afara formei membranare, fragmente CD23 solubile, rezultate din proteoliza domeniului extramembranar.

La om, au fost identificate două izoforme ale CD23, diferite doar prin lungimea secvenței citoplasmatice. CD23a conține un singur situs tirozinic citoplasmatic și se găsește constitutiv pe suprafața limfocitelor B și pe celule foliculare dendritice. CD23b este indusă de IL-4 în condiții de activare celulară.

Mecanismul transducției prin CD23 este încă obscur, iar legarea CD23 cu anticorpi monoclonali poate avea efecte opuse. La om, stimularea cu IL-4 și cu anticorpi monoclonali anti-CD23 determină un influx de Ca2+, ceea ce implică inducția PLC prin tirozin kinaze, cu activarea metabolismului fosfoinozitidelor. Date recente sugerează stimularea unei tirozin kinaze din familia Src (p59fyn), asocată izoformei CD23a.

Cele două forme au în comun abilitatea de a determina generarea de cAMP, dar numai CD23a este cuplat cu hidroliza PtdIns(4,5)P2 dependentă de PLC. Supoziția existenței unui mecanism distinct de semnalizare pentru cele douã izoforme de CD23 este sugerată de faptul că CD23a, dar nu și CD23b mediază endocitoza IC-IgE. Functionarea lui CD23b pe limfocitele B este neclarã, el fiind implicat în activitãti IgE dependente (fagocitoza particulelor acoperite cu IgE, eliminarea citokinelor si generarea superoxizilor). Orice diferențiere în schema de semnalizare cuplată cu CD23a si CD23b trebuie asociatã primilor 6,7 AA din portiunea aminoterminală a domeniului citoplasmatic, restul secvențelor fiind identice în cele două izoforme. S-a semnalat prezenta Tyr 6 si Ser 7 din portiunea citoplasmatică a CD23a în timp ce în izoforma CD23b acești aminoacizi lipsesc. Aminoacizii semnalați pot reprezenta un situs pentru fosforilare si sulfatare. Modificãrile post translationale a acestor situsuri furnizeazã baza structuralã pentru cele douã forme izomere de CD23, care pot angaja cascade distincte de semnalizare.

Molecula CD23 apare ca fiind cuplată cu schema nitric oxide sinthetase (NOS) în monocitele umane. ( 43)

1.3.4. Semnalizarea intracelulară prin CD40

CD40 este un marker de citodiferențiere prezent pe limfocitele B tinere, limfocitul B matur, linii celulare B stabilizate, limfocite B maligne (limfoame non-Hodgkin) și limfocitele B din centrii germinali. Structural CD40 face parte din superfamilia receptorilor TNFR (tumor necrosis factor receptor). Ligandul natural al acestei molecule este molecula CD40L, de pe suprafața limfocitelor T helper.

Rolul acestei proteine diferă de la o subpopulație de celule B la alta. S-a constatat că legarea markerului CD40 cu anticorpi monoclonali specifici duce la:

Activarea limfocitelor B mature

Activarea și proliferarea limfocitelor B maligne din CLL

Apoptoza limfocitelor B maligne din limfoame

Prevenirea apoptozei limfocitelor B din centrii germinali

La nivel molecular, fixarea CD40 prin anticorpi monoclonali induce modificări intracelulare cu o oarecare specificitate celulară. In cazul limfocitelor B preactivate s-a constat o creștere a activității protein tirozin kinazelor, o accelerare a turn-overului fosfoinozitidic și activarea unui număr însemnat de serin/treonin kinaze. In linia celulară B Daudi s-a observat activarea unor protein tirozin kinaze din familia Src, cum ar fi p53/56lyn, implicate de asemenea în transducția pe calea BCR, activarea PLC-2 și a PI3-kinazei. Cross-legarea CD40 de pe limfocitele B din centrii germinativi determină o creștere a activității protein tirozin kinazelor intracelulare și previne apoptoza (28).

1.3.5. Semnalizarea intracelulară prin CD45

CD45 este o glicoproteină transmembranară abundent exprimată pe suprafața tuturor limfocitelor. Studii recente au demonstrat că CD45 are un important rol reglator în procesele de activare ale limfocitul B, în mod particular în activarea asociată receptorului pentru antigen. Legarea moleculei CD45 cu anticorpi monoclonali se traduce la nivel molecular printr-o inhibare a influxului intracelular de Ca2+, care apare secundar legării BCR.

Activitatea moleculei CD45 este legată de sa capacitatea protein tirozin fosfatazică, localizată la nivelul domeniului intracelular. Substratul acestei fosfataze pare să fie reprezentat de protein tirozin kinaze din familia Src, asociate BCR, până în prezent fiind dovedită activitatea fosfatazică asupra p53/56lyn, conectată la Ig și Ig. In plus, în limfocitele B CD45 deficiente s-a observat o activitate slabă a MAP-kinazelor și a PLC, nefiind încă clar dacă procesul este legat direct sau indirect de CD45 (47).

1.3.6. Semnalizarea intracelulară prin CD81

CD81 este o moleculă de circa 26kDa exprimată pe un număr mare de tipuri celulare: limfocitul B, celule NK, timocite, eozinofile, unele monocite, melanocite, fibroblaști, celule epiteliale și endoteliale. CD81 face parte din familia proteinelor tetraspan (alături de CD9, CD37, CD63 și CD82) care sunt implicate în procesele de creștere, motilitate și semnalizare intracelulară. Limfocitul B exprimă markerul CD81 în toate stadiile de dezvoltare, densitatea acestora fiind variabilă și având un maxim de exprimare pe limfocitul B activat.

Biochimic, CD81 este formată din 4 -helixuri hidrofobe care străbat membrana celulară, ambele capete amino și carboxiterminale se află situate în intacelular. Secvențele de aminoacizi cuprinse între -helixurile 1 și 2, respectiv 3 și 4 sunt situate extracelular și interacționează cu liganzii.

Molecula CD81 coprecipită alături de CD19, CD21, MHC-II și Leu-13. Cross-legarea CD81-BCR cu anticorpi imobilizați pe suport solid induce activitatea tirozin kinazică și accelerează procesul de activare celulară, pe când legarea cu anticorpi solubili inhibă proliferarea limfocitului B (28).

1.4. Activarea limfocitelor B

Activarea limfocitelor B depinde de o multitudine de factori, un rol foarte important revenind antigenului. Antigenele capabile să activeze limfocitul B și să inducă producția de imunoglobuline au fost clasificate în 2 mari categorii: antigene timo-dependente și antigene timo-independente.

Activarea prin antigene timo-dependente

Antigenele timo-dependente sunt în cea mai mare parte de natură proteică și necesită pentru activarea limfocitului B ajutorul limfocitului T helper.

Antigenele timo-dependente se subîmpart în 2 subcategorii:

Antigenele timo-dependente solubile

Aceste antigene sunt în mare parte monovalente, fiind capabile să lege imunoglobulinele de membrană ale limfocitului B fără a le cross-linka (legarea concomitentă a mai multor receptori aflați unul în apropierea celuilalt). Ele nu reușesc să inducă activarea limfocitului B decât în prezența limfocitului T helper. Ajutorul limfocitului T helper este de 2 feluri:

interacționează direct (prin contact fizic) cu limfocitul B

secreția de citokine necesare dezvoltării limfocitul B, cel mai important factor solubil produs este IL-4.

Antigenele timo-dependente fiind monovalente au capacitea de a lega o singură moleculă sIg. Complexul sIg-antigen este internalizat de limfocitul B și ajunge în endozomi unde atât antigenul captat cât și sIg sunt degradate de enzimele proteolitice. Peptidele rezultate sunt asociate moleculelor MHC-II în reticulul endoplasmatic, iar complexul format este transportat și expus pe suprafața celulară, în vederea prezentării acestuia limfocitului T helper. In acest caz limfocitul B funcționează ca celulă prezentatoare de antigen.

Interacțiunea limfocitul B cu limfocitul T helper este inițiată de contactul direct TCR-MHC-peptid, ceea ce induce activarea limfocitului T. Acesta va produce o serie de factori solubili, cei mai importanții fiind IL-2 și IL-4. Interleukinele este activat limfocitul B (trece din faza G0 în G1), dar nu începe producția de anticorpi.

In afară de interacțiunea TCR-MHC-peptid, esențială pentru inducerea transducției intracelulare este interacțiunea lui CD40 de pe limfocitul B cu CD40L de pe limfocitul T helper. Această interacțiune asigură supraviețuirea și proliferarea îndelungată a limfocitelor B, precum și o creștere a capacității de prezentare a antigenului.

Antigenele timo-dependente corpusculare

Aceste sunt antigene proteice mari sau fixate pe o suprafață și au capacitatea de a cross-linka mai multe molecule sIg învecinate. La nivel intracelular, cross-linkarea se traduce printr-o inducție sinergică aunor mesageri intracelulari, care prin sumare declanșează un semnal prag.

Deosebirea majoră față de modelul antigenelor solubile constă în principal în:

incapacitatea limfocitului B de a endocita și prezenta astfel de antigene corpusculare limfocitului T helper

în acest caz ajutorul limfocitului T helper se reduce la producția unor citokine, fără a necesita un contact intracelular.

Limfocitul B leagă prin intermediul BCR antigenul (primul semnal), macrofagele îl fagocitează, îl prelucrează și îl prezintă limfocitului T helper care, activat pe această cale, va secreta citokinele necesare limfocitului B (al doilea semnal).

Se pare că antigenele timo-dependente corpusculare necesită prezența unor citokine diferite în comparație cu antigenele solubile pentru activarea limfocitul B. Toate antigenele timo-dependente solubile necesită prezența IL-4 pentru activarea limfocitelor B spre deosebire de cele corpusculare care au nevoie de IL-2 și INF-. Citokinele au efecte diferite: unele au rol în proliferare, altele în diferențiere și schimbarea izotipului, efectele diferitelor citokine pot fi sinergice (IL-2 și INF-) sau antagonice (IL-4 și INF-).

Mecanismul de activare a limfocitul B este secvențial, fiecare stadiu fiind controlat de combinații de citokine specifice. Inițierea activării limfocitelor B ca răspuns la antigenele solubile depinde de IL-2, iar proliferarea este absolut dependentă de prezența: IL-4, IL-2, IL-5 și IL-6. In cazul antigenelelor timo-dependente corpusculare, activarea limfocitului B este mai puțin dependentă de citokine (28, 52).

2. Activarea prin antigene timo-independente

Antigenele timo-independente sunt capabile să inducă un răspuns imun umoral în absența oricărei contribuții din partea limfocitelor T.

Antigenele timo-independente se subîmpart în:

Antigenele timo-independente de tip I

Majoritatea antigenelor din această categorie sunt activatori policlonali ai limfocitelor B; prin urmare ele pot activa un număr mare de clone de limfocite B care secretă masiv anticorpi, cei mai mulți fără nici o specificitate față de antigenul care le-a stimulat. Un exemplu de astfel de antigen este LPS (lipopolizaharidele) din peretelen bacterian.

Antigenele timo-independente de tip II

Aceste antigene au drept caracteristică structurală prezența determinanților antigenici repetitivi. Exemple de astfel de antigene sunt: polizaharide de tipul dextranului, ficolului și polizaharidul din capsula pneumococului. S-a constatat necesitatea prezenței a minim 12-16 determinanți antigenici per antigen pentru a putea induce o activare eficientă a limfocitului B. Se consideră că astfel de antigene, având și o flexibilitate moleculară adecvată pot lega concomitent mai multe sIg de pe suprafața limfocitului, iar fenomenul de cross-linkare a sIg, prin efecte sinergice, va reuși inițializarea cascadei de mesageri secundari și activarea consecutivă a limfocitului B (52).

2. LIMFOCITUL T

Limfocitul T este asemănător cu limfocitul B, de care nu poate fi diferențiat prin tehnicile de microscopie optică. Limfocitele T au fost prima dată identificate prin testul de rozetare cu eritrocite de oaie, care cuplează prin intermediul receptorului membranar CD2 aceste limfocite. Această caracteristică poate servi la identificarea lor comparativ cu limfocitele B.

Populația de limfocite T se împarte în două subpopulații majore: limfocitele T helper sau CD4+CD8- care joacă un rol primordial în reglarea răspunsului imun specific (limfocitele T helper activate au rolul de a secreta citokine care favorizează dezvoltarea diferitelor tipuri de răspuns imun) și limfocitele T citotoxice/supresoare sau CD8+CD4- ce prezintă un rol important în citotoxicitatea mediată celular antigen specifică.

Limfocitul T își are originea în celula stem pluripotentă localizată în măduva osoasă la adult și în ficatul și splina fetală. Dezvoltarea limfocitelor T este un proces foarte complex și se realizează pentru majoritatea acestor celule cu ajutorul timusului, de unde și numele de limfocite T sau timo-dependente (28).

2.1. Morfologie

Limfocitele T reprezintă 25-35% din populația leucocitară. Dimensiunile sale variază între 6-12 m. Nucleul mare, unic este bogat în heterocromatină. Citoplasma este redusă, slab bazofilă și conține granulații azurofile și enzime lizozomale. Pe suprafața membranară există un număr redus de microvili.

2.2. Ontogeneză

Dezvoltarea limfocitului T are loc în trei etape succesive:

Pretimică

Are loc în măduva osoasă hematogenă. Din celula stem pluripotentă se diferențiază celula progenitor (pro-TI) care prezintă markerul CD7, primul marker de diferențiere în linia celulară T. In acest stadiu celula nu este încă angajată pe linia limfocitară T, având capacitatea de a evolua spre oricare din liniile celulare hematopoetice.

Timică

Celulele pro-T migrează din măduvă în cortexul extern al timusului unde are loc proliferarea și formarea de limfoblași. După faza proliferativă celulele devin timocite cu aspectul limfocitelor de repaus care urmează fazele de maturare imunologică. In micromediul din timus contactul cu celulele epiteliale timice și substanțele de tip hormonal: timopoetina, timozina și tisplenina precum și citokinele de tipul IL-7 definitivează maturarea timică prin achiziționarea markerilor de suprafață specifici limfocitului T.

Din celula pro-T I CD7+ se va diferenția în celula pro-T II care achiziționează markerii CD2, CD5 și CD3 intracitoplasmatic. Celula pro-TII se diferențiază în celula pre-T (prin rearanjamentul lanțurilor , și ale receptorului de antigen) care prezintă moleculele membranare CD1, CD2, CD5, CD7 și molecula CD3 intracitoplasmatică. Rearanjamentul nefuncțional al lanțurilor ale receptorului de antigen induce moartea prin apoptoză a celulelor ajunse în acest stadiu. Dacă rearanjamentul este funcțional, lanțurile se asamblează cu lanțurile sub forma complexului receptor TCR-CD3 pe suprafața celulară. Timocitele pre-T urmează în acest caz o nouă etapă de diferențiere spre maturare și migrează în medulara timusului unde se transformă în celule T dublu negative CD4-CD8-. Molecula CD3 exprimată membranar se asociază cu receptorul de antigen rezultând astfel complexul receptor funcțional.

Celulele T dublu negative care interacționează efectiv cu moleculele MHC sunt selectate pozitiv și se formează celulele T dublu pozitive care prezintă pe suprafață molecule CD4 și CD8, alături de complexul receptor TCR-CD3. In acest stadiu este exprimat markerul CD5.

Celulele T dublu pozitive sunt ținta unui proces selectiv care stabilește repertoriul specificităților receptorului de antigen. Celulele specifice pentru moleculele MHC complexate cu peptide non-self vor suferii o transformare spre fenotipul de celule T simplu pozitive, care exprimă fie CD4, fie CD8.

Intratimic au loc două selecții în cursul cărora sunt eliminați precursorii necorespunzători. Inițial are loc selecția pozitivă în cadrul căreia sunt eliminate celulele care nu pot recunoaște moleculele MHC proprii. In cursul celei de a doua selecții vor fi îndepărtate celulele care recunosc antigene proprii organismului și care ar putea declanșa reacții ce autoimunitate (28).

Matură

Limfocitele T migrează din medulara timusului spre periferie și populează țesuturile limfoide periferice unde supraveghează orice invazie antigenică. In prezența antigenului limfocitele T de repaus proliferează, se transformă în limfoblaști și în final se diferențiază în limfocite T efectoare și limfocite T de memorie.

2.3. Activarea limfocitelor T CD4+

Celulele T CD4+ (helper) joacă un rol cheie în inducerea și dezvoltarea unui răspuns imun.

Activarea celulelor T CD4+ necesită 2 semnale: primul este reprezentat de complexul molecular format din antigen în asociație cu moleculele MHC II, iar al doilea este reprezentat de IL-1.

Limfocitele T CD4+ recunosc fragmente de antigen asociate cu produșii MHC și exprimate sub formă de complex pe suprafața celulelor prezentatoare de antigen (APC) deoarece receptorul pentru antigen al limfocitelor T (TCR) necesită o dublă interacție pentru a induce activarea: una cu peptidul antigenic și alta cu moleculele MHC II.

Celulele prezentatoare de antigen profesioniste sunt: macrofagele, celulele dendritice și limfocitele B prezentatoare de antigen. Trăsatura cea mai importantă a acestor celule este că ele pot internaliza și procesa antigenul. Antigenul este desfăcut în fragmente de mici dimensiuni care sunt ulterior cuplate în reticulul endoplasmatic cu molecule MHC de clasă II. Complexul astfel format este expus pe membrana celulară într-o formă ce poate fi recunoscută de limfocitul T helper. Este cunoscut faptul că antigenul este convertit într-o formă care se poate adapta în situsul format la nivelul moleculei MHC de clasă II între domeniile 1 și 1.

Cel de-al doilea semnal de activare a T CD4+ este reprezentat de IL-1. Interleukina 1 există sub 2 forme: și care îndeplinesc aceleași funcții și se leagă la același receptor cu afinități similare. Aceste interleukine sunt produse de celulele ce pot prezenta antigenul în timpul răspunsului imun și ele acționează ca molecule reglatoare, afectând limfocitele B și limfocitele T, inducând în același timp producerea unor citokine, cum ar fi TNF, IL-6 și factori de stimulare a coloniilor. IL-1 se leagă la receptorii de pe limfocitele T atunci când acestea au fost stimulate de complexul antigen-MHC II la schimbări biochimice care au avut loc în timpul sintezei proteice. Astfel celulele reactive intră în ciclul celular, trecând de la faza G0 la faza G1, iar în urma acestui proces celulele încep să exprime receptori pentru IL-2 (factor de creștere a celulelor T care determină dezvoltarea populațiilor de limfocite T reactive) pe care o și produc (28).

2.3.1. Limfocitul T CD4+ și celulele NK

Celulele NK reprezintă un subset de limfocite prezent atât în sângele periferic cât și în formațiunile limfoide care au rolul de a elimina celulele infectate viral și celulele tumorale, printr-un mecanism nerestrictat de MHC. Modul în care celula NK recunoaște și distruge ținta nu este încă bine precizat. Fenotipic, ea se caracterizează prin lipsa markerului CD3, dar au fost evidențiate pe suprafața lor membranară lanturile și ale complexului CD3 asociatemoleculei CD16. Deși activarea NK este MHC nerestrictată și nu necesită un contact prealabil cu antigenul, ea este totuși puternic influențată de anumite citokine. S-a constatat că limfocitul T helper 1(TH1), prin IL-2, INF- și TNF activează celulele NK și potențează activitatea lor citotoxică, pe când TH2 prin IL-10 și IL-4 are efecte inhibitorii.

2.4. Activarea limfocitelor T CD8+

Limfocitelor T CD8+ reprezintă un subset important de limfocite T, cunoscut și sub denumirea de limfocite T citotoxice/supresoare. Activarea lor este restrictată de recunoașterea antigenului doar în asociere cu molecule MHC I. Având în vedere faptul că toate celulele nucleate din organism exprimă pe suprafața lor molecule MHC I, înseamnă că oricare dintre aceste celule pot prezenta antigene limfocitelor T CD8+.

Limfocitele T citotoxice/supresoare necesitã douã semnale pentru a fi activate. Complexul antigen-MHC I este primul semnal, iar producerea de interleukină 2 de cãtre celulele CD4+, reprezintă al doilea semnal. Sub influența celor doi stimuli, limfocitele T CD8+ nestimulate (naïve) proliferează și se activează devenind LT CD8+ citotoxice (CTL) capabile să recunoască antigenul și să dezvolte activități citotoxice. Activarea limfocitelor T CD8+ citotoxice (CTL) este indusă cel mai adesea de cross-linkarea TCR-antigen. Antigenul este recunoscut de TCR, iar atașarea de celula țintă se realizează prin molecule accesorii. Ulterior activării are loc eliberarea enzimelor citotoxice prin exocitoză în zona de contact cu celula țintă. Primele eliberate sunt perforinele care polimerizează în membrana celulei țintă formând pori care induc liza osmotică și facilitează pătrunderea enzimelor citocide care vor activa mecanismele apoptotice în celula țintă.

3. CELULELE NK

Celulele NK reprezintă o subpopulație limfocitară care provine dintr-un precursor medular comun cu limfocitul T. Celulele mature sunt prezente în sânge și în organele limfoide centrale și periferice.

3.1. Morfologie

NK sunt celule mari, având un diametru de 16-20 m și un nucleu zimțat. Citoplasma conține granulații mari, înconjurate de membrană, care au în interior mediatori chimici: perforină, granzime, TNF. Aceste granulații mari citoplasmatice diferențiază celulele NK de limfocitele B și T și le conferă denumirea de limfocite mari granulare (LGL).

3.2. Funcție

Celulele NK prezintă citotoxicitate spontană față de celulele infectate cu virus și celulele tumorale. Nu prezintă specificitate antigenică prin absența unui receptor specific de antigen și nici memorie imunologică. Deasemenea nu are nici capacitate fagocitară sau restricție MHC.

Celulele NK pot fi activate de diferite citokine (în special IL-29) care determină proliferarea și creșterea capacității citotoxice, devenind limfocite killer activate de citokine (LAK).

La suprafața celulelor NK există două tipuri de receptori specifici acestei populații, receptori de tip imunoglobulinic și receptori din familia lectinelor C. Acești receptori au rolul de a recunoaște moleculele MHC clasa I și mediază activarea sau inhibarea limfocitului NK.

Celulele NK mediază citotoxicitatea celulară anticorp dependentă (ADCC). Celula NK prezintă receptori pentru fragmentul Fc al IgG, iar celula țintă prezintă pe suprafață antigenul de care se fixează IgG, IgG fiind puntea de legătură între celula citotoxică și celula țintă. După stabilirea contactului cu celula țintă, celula NK eliberează perforină și granzime care distrug celula țintă.

Pe lângă rolul lor în mecanismul de citotoxicitate, celulele NK mai îndeplinesc și alte funcții. Astfel, în urma activării, celulele NK secretă diferite citokine, care includ INF, TNF și GM-CSF (28).

4. MECANISME DE TRANSMITERE A SEMNALULUI PRIN INTERMEDIUL RECEPTORULUI PENTRU ANTIGEN DE PE LIMFOCIT

4.1. Structurile implicate în transmiterea semnalului

Limfocitele prezintă o diversitate de receptori care recunosc o multitudine de forme antigenice și care inițiază evenimente de transmitere intracelulară a semnalului. In ciuda acestei diversități, evenimentele cascadei de semnalizare declanșată de legarea antigenului de receptor sunt foarte asemănătoare.

In ajutorul receptorilor pentru antigen vin și alte molecule de suprafață care funcționează pe post de coreceptori (CD4, CD8, CD19/21) și care, pe de o parte contribuie la mărirea afinității în interacțiile cu antigenul sau cu celula prezentatoare de antigen, iar pe de altă parte induc transmiterea unui semnal separat care influențează răspunsul celular. Coreceptorii contribuie la formarea unui complex cu receptorul pentru antigen mărind sensibilitatea interacțiunii și având un rol important în inițierea semnalului.

Receptorii pentru antigen de pe limfocitele B și limfocitele T au situsuri de legare a antigenului separate de module de transmitere a semnalului. Subunitățile de legare a antigenului pot fi exprimate independent pe membrana plasmatică, dar în acest caz trebuie să formeze un complex cu lanțurile Ig și Ig , respectiv lanțurile markerului CD3 responsabile de funcționarea receptorului ca element de transmitere a semnalului (58).

In cazul limfocitelor T, subunitatea Ti a TCR este asociată necovalent cu lanțurile receptorului CD3 (, , , ) constituind dimeri sau heterodimeri împreună cu lanțurile sau chiar cu lanțurile receptorului FcRIg. Se presupune că subunitatea Ti este asociată cu CD3 și CD3, dar o idee precisă privind stoechiometria lanțurilor și a receptorului nu este cunoscută. Domeniul citoplasmatic al lanțurilor constante este format din 4 până la 11 resturi de aminoacizi, dar în cazul receptorului TCR doar 5 resturi de aminoacizi din lanțurile și sunt responsabile de cuplarea acestui receptor de mașinăria de semnalizare.

In cazul limfocitelor B, imunoglobulina de suprafață reprezintă practic receptorul pentru antigen. Aceasta cuprinde pe lângă componenta clonotipică reprezentată de sIg și molecule accesorii de transmitere a semnalului: CD79a și CD79b. Ele sunt structural înrudite cu familia imunoglobulinelor. Ig și Ig care sunt de fapt moleculele accesorii de transmitere a semnalului formează un complex stabil cu molecula sIg prin intermediul legăturilor disulfidice. Numărul heterodimerilor asociați cu fiecare subunitate de membrană imunoglobulinică a BCR nu este cunoscut. Pe lângă formele menționate este posibilă existența unei molecule accesorii Ig care prezintă modificări față de Ig în porțiunea carboxiterminală.

Asemănător cu CD3, subunitatea , lanțurile Ig și Ig au un domeniu citoplasmatic mai extins decât subunitatea Ti care conține situsul de legare a antigenului, ajutând la cuplarea TCR la mecanismele de semnalizare.

Funcționarea acestor lanțuri a fost explicată prin prezența unui domeniu citoplasmatic comun format dintr-o secvență de aminoacizi la care se cuplează protein tirozin kinazele. Segmentul minim de funcționare al acestui domeniu constă într-o pereche de tirozine și leucine în consens cu următoarea secvență: D/EXXYXXL(X)6-8YXXL denumită ARAM sau ARH-1. Una din trăsăturile specifice receptorilor antigenici de pe celulele hematopoietice constă în separarea modulului care conține ARH-1 și care inițiază transmiterea semnalului în funcție de felul de cuplare a ligandului. Este cunoscut faptul că organizarea ARAM în cazul lanțurilor care deservesc receptorii TCR, BCR, FcR este asemănătoare (dovadă a originii evolutive comune a acestor lanțuri). Se pare că multimerizarea secvenței ARAM produce o amplificare a semnalului, dar nu se știe dacă diferitele situsuri tirozinice semnalate au o semnificație numai cantitativă sau și calitativă.

Producerea unui răspuns celular eficient în cazul limfocitelor T se realizează printr-un număr redus de receptori și de aceea se presupune că răspunsul este amplificat prin sistemele intracelulare de transmitere a semnalului. In cazul limfocitelor B, cele 2 lanțuri Ig și Ig au segmente distincte de transmitere a semnalului: Ig este capabil să activeze o protein tirozin kinază care să determine exprimarea IL-2. Răspunsul apare calitativ diferit, deși ambele lanțuri sunt capabile să medieze mobilizarea calciului. Funcția de semnalizare este mediată prin intermediul ambelor lanțuri, dar rolul preponderent îl deține Ig . Această concluzie a fost trasă în urma studiilor pe linii celulare deficiente în exprimarea lui Ig ; aceste celule prezintă un deficit de semnalizare datorat înlocuirii tirozinei cu fenil-alanina din lanțurile ce au rol în transmiterea semnalului. Datorită acestor mutații are loc o activare a familiei de kinaze Src, dar cu o eficiență mult mai mică decât în cazul liniilor normale. In cazul înlocuirii ambelor lanțuri de tirozină din Ig a BCR a fost observată inactivarea receptorului.

4.2. Baza moleculară a transmiterii semnalului

Primele fenomene care apar în urma agregării receptorilor pentru antigen sunt date de o creștere a fosforilării proteinelor pe resturile tirozinice. Aceste efecte sunt generate de activarea unei familii de protein tirozin kinaze. TCR și BCR nu au subunități intrinseci de protein tirozin kinaze și protein tirozin fosfataze funcționale, dar secvența ARAM este suficientă pentru inducerea protein tirozin fosforilării în limfocitele T și B. Tirozinele din ARAM vor induce activitatea protein tirozin kinazelor, în același timp fiind fosforilate și de protein tirozin kinazele celulare. Deci ARAM funcționează ca substrat pentru protein tirozin kinazele citoplasmatice, permițându-se recrutarea unui efector suplimentar la receptorul stimulat prin intermediul domeniului SH2 de interacțiune cu fosfotirozinele.

Funcționarea TCR și BCR se pare că este determinată de 2 clase de protein tirozin kinaze citoplasmatice, aparținând familiilor Src și Syk/Zap-70. Aceste clase de protein tirozin kinaze diferă între ele prin modul în care se fixează de receptor, de aici rezultând și funcția lor distinctă.

Familia Src are un domeniu aminoterminal mic în care se găsește o glicină miristilată în poziția 2 care este responsabilă de asocierea la membrană, precum și un situs S terminal care reglează negativ tirozin fosforilarea. In limfocitele B au fost identificate următoarele enzime aparținând acestei familii: p55blk, p59fyn, p56lck, p53/56lyn etc.

In contrast cu familia Src, kinazele familiei Syc/Zap70 nu sunt miristilate și ca urmare sunt localizate, probabil neconstitutiv, în membrană. Familia Syc/Zap70 are două domenii SH2 aminoterminale și un domeniu catalitic carboxiterminal, în schimb lipsesc domeniul SH3 și situsul S terminal caracteristic Src kinazelor ( 22).

Studii realizate pe limfocitele B au demonstrat că una dintre cele mai importante consecințe ale legării BCR este legarea kinazelor Src cu abilități diferite de cele două lanțuri Ig și Ig . Acest lucru se datorează unei secvențe de 4 aminoacizi DCSM pentru lanțul Ig și QTAT pentru Ig . Prin intermediul acestor secvențe se determină legarea kinazelor Src la receptorii aflați în repaus, iar consecința legării receptorului este fosforilarea secvențelor YEGLN și YEDY care determină o creștere de 20x a activității de legare a familiei de kinaze Src și, în același timp, activarea țintită a acestora. Creșterea asocierii se face prin intermediul domeniului SH2 kinazic la regiunea ARAM care prezintă resturi fosforilate; sunt legate concomitent 10 resturi aminoterminale. Tirozin fosforilarea indusă antigenic de segmentul ARAM pare să conducă la o reorientare spațială a receptorului asociat cu familia de kinaze Src și astfel are loc o schimbare a legării de la porțiunea aminoterminală la domeniul SH2. Acestă reorientare a legării generează un mecanism de represie și activare a acestor kinaze (60).

4.2.1. Rolul protein tirozin kinazei Lck în transmiterea semnalului

In limfocitele T sunt exprimate 3 membre ale familiei de kinaze Src: Lck, Fyn și Yes, aceste enzime găsindu-se la nivelul tuturor subpopulațiilor T. Cele mai multe date se referă la rolul pe care îl are kinaza Lck. Această protein tirozin kinază interacționează stoechiometric cu domeniul citoplasmatic al coreceptorilor CD4 și CD8. In urma stimulării TCR rezultă o creștere a activității Lck urmată de legarea încrucișată a CD4 sau CD8. Atunci când CD4 sau CD8 coangajează moleculele MHC cu TCR în timpul recunoașterii antigenului, kinaza Lck ar putea determina o blocare a ARAM din TCR, având ca rezultat probabil fosforilarea sa. Este interesant de semnalat că, deși legarea încrucișată a moleculelor CD4 de TCR determină o tirozin fosforilare a proteinelor celulare, Lck pare să fie capabilă să interacționeaze cu TCR independent de CD4 sau CD8.

In celulele NK, enzima Lck poate interacționa cu lanțul al FcRIII.

Se presupune că Lck are o abilitate intrinsecă în a interacționa și cu lanțul al CD3, acesta putând funcționa ca substrat pentru această kinază. In mod alternativ, legarea încrucișată a TCR poate induce agregări inter sau intra moleculare și/sau schimbări alosterice în ARAM, oferind astfel mai multe substraturi accesibile pentru kinaza Lck asociată de membrană.

Agregarea TCR în absența coreceptorilor angajați poate schimba echilibrul dintre Lck și fosfatazele celulare care acționează pe ARAM, favorizând fosforilarea tirozinei în acest domeniu. Fosforilarea în ARAM poate duce la recrutarea altor molecule implicate în tramsmiterea semnalului cum ar fi Zap-70.

Semnificația funcțională a Lck în tramsmiterea semnalului prin TCR este mai clar conturată prin studiile efectuate pe șoareci și linii celulare mutante. Deficitul de Lck sau exprimarea unei gene dominant negative opresc de timpuriu dezvoltarea limfocitelor, iar în liniile celulare deficiente în Lck, mai devreme sau mai târziu, evenimentele asociate cu tramsmiterea semnalului prin intermediul TCR sunt abrogate. Putem deci afirma că Lck joacă un rol important în inițierea tramsmiterii semnalului prin intermediul TCR.

Activitatea altor kinaze a fost detectată în fracțiunile imunoprecipitate ale TCR prin tehnici de solubilizare blândă cu detergenți. Dintre acestea, enzima Fyn pare să fie una dintre cele mai importante. Se pare că asocierea acestei enzime se face mai puțin stoechiometric decât în cazul Lck, ea având un rol important în inițierea tramsmiterii semnalului prin intermediul TCR în dezvoltarea restrictivă a compartimentului celulelor T.

Câteva dintre kinazele familiei Src prezente în limfocitele T au fost semnalate ca fiind asociate și cu BCR în cazul limfocitelor B. Asemănarea dintre kinazele cu activitate dominantă pe cei doi receptori este dată de modul de formare al interacțiunii între membrii familiei de protein tirozin kinaze Src și substratul lor reprezentat de tirozinele din ARAM sau de interacțiunea dintre domeniul SH2 al protein tirozin kinazelor și o mică porțiune din ARAM care poate fi tirozin fosforilată (22, 62).

4.2.2. Rolul protein tirozin kinazelor din familia Syc/Zap-70 în semnalizare

Interacțiunea dintre kinazele Syc sau Zap-70 pe receptori TCR și BCR prin intermediul ARAM este mai bine cunoscută.

Zap-70 este o protein tirozin kinază de 70 kDa și este exprimată exclusiv pe celulele T și NK. Zap-70 nu este asociată cu TCR, dar este rapid recrutată la lanțurile ale CD3 în urma stimulării receptorului pentru antigen. Asocierea are loc numai prin intermediul formelor fosforilate ale lanțului și de aceea trăsăturile structurale necesare funcționării ARAM sunt în același timp elemente necesare pentru asocierea kinazei Zap-70. Se pare că domeniul SH2 al enzimei este responsabil de asocierea acestei kinaze la structura ARAM tirozin-fosforilată. Domeniul SH2 al Zap-70 interacționează cu CD3 și lanțurile fosforilate, aceasta sugerând că TCR interacționează cu 2 protein tirozin kinaze. Prima aparține familiei Src și fosforilează ARAM, iar această fosforilare are ca rezultat recrutarea celei de-a doua kinaze Zap-70, recrutare care se face prin intermediul SH2 la complexul receptorului membranar. Aceste concluzii au fost trase în urma studiilor realizate pe sisteme de culturi celulare COS unde asocierea Zap-70 la lanțul al unui receptor modificat necesită prezența a două kinaze: Lck și Fyn.

Kinaza Syc este o protein tirozin kinază cu greutatea moleculară de 72kDa și este exprimată preferențial pe limfocite B, celule mieloide și timocite. Această kinază poate interacționa cu complexul BCR într-o manieră analoagă cu interacțiunea dintre Zap-70 și TCR.

In cazul celulelor B, importanța kinazei Syc, notată și p72syc, în tramsmiterea semnalului este dată de asocierea sa cu complexul receptorului odihnit sau în repaus, urmată de fosforilarea imediată a receptorului legat. Datele experimentale sugerează că fosforilarea are loc pe resturile tirozinice din ARAM de pe lanțurile Ig și Ig de care se leagă foarte puternic enzima p72syc. Situsurile predilecte de legare a kinazei Syc prin intermediul domeniului SH2 sunt secvențele fosforilate Y-X-X-I/L. Asemănător semnalizării prin intermediul TCR, kinaza Syc poate fi implicată în două moduri în propagarea semnalului. Primul presupune legarea la receptorii odihniți prin intermediul regiunii citoplasmatice al sIg, iar al doilea mod este dat de implicarea domeniului SH2 urmat de legarea la lanțurile Ig și Ig fosforilate ( 6, 22, 73)

4.3. Coreceptorii și contribuția lor la transmiterea semnalului

Coreceptorii limfocitelor T

Studiile mecanismelor de bază ale amplificării semnalului au concluzionat că glicoproteinele de membrană CD4 și CD8 sunt implicate în mod direct în transmiterea semnalului. Cei doi markeri sunt exprimați amândoi pe celula imatură, unul dintre ei fiind eliminat pe măsură ce limfocitul se maturează: limfocitele CD4+ au TCR cu specificitate pentru moleculele MHC de clasă II, iar cele CD8+ recunosc molecule MHC de clasă I.

Markerii CD4 și CD8 au două elemente cheie care determină proprietățile necesare funcționării lor pe post de coreceptori. Primul element se referă la segmentul extracelular de legare a moleculelor MHC de pe celula prezentatoare de antigen: CD4 se leagă la segmentul 2 al moleculei MHC II, iar CD8 se leagă de segmentul 3 al moleculei MHC I. Al doilea element se referă la faptul că atât CD4 cât și CD8 se leagă de o protein tirozin kinază citoplasmatică Lck printr-un segment conținând cisteină.

Studii recente sugerează că protein kinaza Lck are două funcții distincte în activarea celulelor T.

Lck poate funcționa independent de coreceptorii CD4 și CD8, ea localizându-se în apropierea TCR după ce a fost activată. Se consideră că ea funcționează de timpuriu în schema de semnalizare în care sunt incluse CD3 și lanțul , fosforilând aceste molecule în ARAM. Disponibilitatea enzimei Lck de a interacționa cu TCR poate determina reactivitatea receptorului. In cazul anumitor limfocite T, numărul de molecule Lck poate fi limitat și din acest motiv ea poate fi sechestrată de TCR în urma interacțiunii cu CD4 sau CD8. In aceste circumstanțe, stimularea TCR în absența angajării coreceptorilor are ca rezultat diminuarea răspunsului. La șoarecii cu timocite deficiente în Fyn apare o diminuare a răspunsului prin TCR, fapt ce reflectă o incapacitate a Lck de a acționa datorită blocării CD4 și CD8. Kinaza Fyn, în comparație cu Lck determină o mărire a gradului de asociere de membrană a enzimelor din familia Src. Kinaza Fyn poate ataca ARAM atunci când TCR este stimulat în absența angajării coreceptorilor.

A doua funcție enzimei Lck în ceea ce privește activarea limfocitelor T prin intermediul coreceptorilor constă în coordonarea interacțiunii dintre TCR și coreceptor în urma citirii MHC. Asocierea CD4 cu TCR necesită un domeniu intact al CD4 care să lege Lck, interacțiunea între cele două proteine fiind mediată de domeniul SH2 al markerului CD4 la care se atașează protein tirozin kinaza Lck. S-a observat că epuizarea completă a domeniului catalitic al CD4 la care se asociază Lck are ca rezultat o mărire a activității coreceptorului. Toate observațiile experimentale au dus la concluzia că domeniul SH2 al CD4 asociat cu Lck are un rol important, dar el este mascat de prezența domeniului catalitic, probabil datorită interacțiunilor intramoleculare mediate de tirozinele din porțiunea carboxiterminală.

In concluzie, domeniul SH2 al Lck, atunci când este accesibil, poate interacționa cu componentele fosforilate sau elementele citoscheletale ale TCR, rezultând ancorarea lui CD4 și stimularea TCR cu ajutorul complexelor oligomerice. Cele două funcții ale Lck fiind activitatea kinazică prin care participă la inițierea evenimentelor de activare a TCR prin intermediul fosforilării ARAM și funcția de stimulator al complexului TCR (73).

Coreceptorii limfocitelor B

Funcționarea coreceptorilor în cazul limfocitor B nu este pe deplin înțeleasă, dar este clar că ei determină un mecanism de amplificare a semnalului declanșat prin intermediul BCR.

Coreceptorii implicați în amplificarea transmiterii semnalului sunt complexul CD19/CD21, proteinele TAPA-1 sau CD81 și lectinele CD23 și CD72.

Stimularea complexului format din cele 3 molecule de suprafață CD19, CD21 și CD81 cu anticorpi monoclonali a evidențiat producerea unei serii de modificări biochimice care conduc la creșterea tirozin fosforilării proteinelor citoplasmatice și membranare. S-a semnalat în același timp o activare a PLC, o mobilizare a Ca2+, stimularea protein kinazelor serin specifice, inclusiv a PKC (protein kinaza C) și activarea NF-kB. Studiile au demonstrat că cea mai importantă în ceea ce privește transmiterea semnalului este CD19 și că ea este fosforilată pe resturile de tirozină în urma legării sIg, sugerând existența unei protein tirozin kinaze asociată cu această moleculă. Domeniul intracitoplasmatic al CD19 conține 9 resturi de tirozină, unele fiind localizate în SH2, altele în motivul YXXM. Secvențele regiunii YXXM au funcția de legare a domeniului SH2 al subunității p85 a PI-3 kinazei de pe receptorii pentru factorii de creștere.

Legarea lui CD19 pe celulele B are ca rezultat asocierea unei protein tirozin kinaze la CD19 care va induce fosforilarea în secvența YXXM și pe alte domenii potențiale de legare a SH2 pe CD19. Rezultatul asocierii lui CD19 cu subunitatea p85 a PI-3 kinazei conduce la activarea acestei enzime și la generarea fosfatidil inozitolului.

Protein tirozin kinazele p53/56lyn și p59fyn care sunt activate prin angajamentul lui CD19 se pot lega la subunitatea p85 a PI-3 kinazei și amplifica activitatea kinazică. Ambele enzime menționate se leagă la subunitatea p85 a PI-3 kinazei prin intermediul unui mecanism independent de fosfotirozine, asemănător cu mecanismul de legare al domeniului SH3 la o regiune bogată în prolină de pe regiunea p85.

In același timp, angajarea CD19 are ca rezultat activarea PLC cu generarea pe de o parte a DAG care activează PKC și pe de altă parte a inozitol trifosfatului Ins(1,4,5)P3 care va induce eliberarea intracelulară a calciului. Acest proces este reglat de CD45 care este o protein tirozin fosfatază și care controlează receptorul sau fosforilarea kinazelor. Când este stimulată sIg, se declanșează activarea familiei Src de kinaze asociate la CD79: p55blk, p53/56lyn, p59fyn și p72syc care contribuie la declanșarea cascadei de semnalizare. In momentul legării încrucișate a CD19 și sIg, semnalul indus prin fiecare receptor va produce o puternică stimulare care va avea drept rezultat proliferarea limfocitelor B.

In ceea ce privește coreceptorii CD23 și CD72 s-a constatat că numai anumiți anticorpi monoclonali provoacă un semnal progresiv la nivelul limfocitelor B, urmat de intrarea în faza G1 a ciclului celular și producerea unei creșteri rapide a concentrației Ca2+ ca urmare a generării Ins(1,4,5)P3 în urma hidrolizei PtdIns(4,5)P2 dependentă de PLC. Legarea moleculei CD72 a limfocitelor B aflate în repaus conduc la o tirozin fosforilare rapidă și de mare amploare a unui număr mare de proteine. In urma stimulării CD72, acesta colaborează cu CD19 și împreună generează un semnal puternic de fosforilare (28).

4.4. Evenimentele transmiterii semnalului. Schema mesagerului secundar

Date biochimice și genetice sugerează că stimularea receptorului pentru antigen mediază o inducere a activității PLC care are loc prin tirozin fosforilarea PLC1. Inhibitorii protein tirozin kinazelor previn atât tirozin fosforilarea izoformelor fosfolipazei C, cât și inducerea activării PLC . In cazul liniilor de celule T mutante care nu au capacitatea de a induce activarea PLC prin TCR, PLC1 nu este tirozin fosforilată. Stimularea TCR induce tirozin fosforilarea PLC1, iar BCR induce tirozin fosforilarea lui PLC1 și a lui PLC2 ( 12).

Cel mai bine caracrerizat răspuns care apare în urma stimulării TCR este activarea transcripțională a genelor pentru IL-2. Rezultatele experimentale atribuie unui rol important fosfatidilinozitolui (PI) în inducerea transcripției acestor gene, includ efectul stimulator al elementelor care produc creșterea concentrației Ca2+ și activarea PKC, dar și cel inhibitor al chelatorilor de Ca2+ și al inhibitorilor PKC, precum și capacitatea de inducere a transcrierii genelor IL-2 prin intermediul proteinei G heterologă cuplată la receptorii care activează schema fosfatidilinozitolului. S-a mai observat abilitatea formelor activate de PKC sau a calcineurinei de a se intersecta cu schema secundară de semnalizare pentru inducerea transcripției genelor IL-2 (59, 60).

Mecanismul prin care receptorul pentru antigen fosforilează PLC1 nu este încă bine cunoscut. In cazul limfocitelor T, receptorul pentru factorii de creștere este unul cu activitatea protein tirozin kinazică, el interacționând cu PLC1 și recrutând enzimele prin intermediul domeniului SH2 la receptorii tirozin fosforilați. Se pare că PLC1 poate coimunoprecipita cu Lck și, chiar dacă interacțiunea Lck cu domeniul SH2 al PLC1 a fost demonstrată, activarea Lck în urma stimulării CD4 este insuficientă pentru inducerea asocierii cu PLC1 sau este incapabilă să să inducă fosforilarea lui PLC1. Concluzionând, fosforilarea și activarea PLC1 necesită funcționarea kinazei Lck, interacțiunea lor putând fi și indirectă (13)

Fosfolipaza C (PLC) clivează membrii familiei de fosfolipide membranare fosfatidilinozitol (PI). Cel mai important membru al acestei familii este derivatul fosforilat PIP2 (fosfoinozitol difosfat) care este localizat pe fața internă a membranei și poate reprezenta până la 10% din lipidele inozitolice și 1% din toate fosfolipidele membranare.

Figura 3: Schema tramsmiterii semnalului (Alberts, 1994).

In timpul transmiterii semnalului, PIP2 este clivat de PLC în doi produși: inozitol trifosfat Ins(1,4,5)P3 (în figura 3 este notat IP3) și diacilglicerol DAG (1, 9).

Inozitol trifosfatul Ins(1,4,5)P3 este o moleculã mică hidrosolubilă care părăsește membrana plasmatică si difuzeazã rapid în citosol. Aici induce eliberarea Ca2+ din RE prin legarea sa de canalele de eliberare a Ca2+ dependente de Ca2+. Aceste canale sunt practic receptorii intracelulari care fixează Ins(1,4,5)P3 și eliberează Ca2+ din RE (6, 23).

Receptorul pentru Ins(1,4,5)P3 (InsP3R) este format din 4 subunități, care conțin fiecare 7 domenii transmbranare după cum se poate observa în figura 4.

Figura 4: Structura receptorului InsP3R (Hall, 1992)

Fiecare subunitate are câte un situs de fixare a Ins(1,4,5)P3 în domeniul aminoterminal. In structura subunităților există un domeniu de reglare a canalului compus din situsuri reglatoare care pot fi fosforilate de PKA. Acest receptor este reglat printr-un mecanism de feed-back pozitiv, Ca2+ eliberat din RE putându-se fixa de canalul care l-a eliberat. Fiecare ion de Ca2+ legat de canal persistă un anumit timp, după care este eliberat și în situsul respectiv se fixează un alt ion, în acest mod menținându-se canalul deschis. Activitatea canalului este oprită prin 2 mecanisme:

1. Defosforilarea Ins(1,4,5)P3 de fosfataze specifice care duce la eliberarea sa din situsul receptorului. Trebuie menționat că nu toată cantitatea de Ins(1,4,5)P3 este defosforilată: o parte va fi fosforilată, formând 1,3,4,5 tetrainozitol fosfatul (IP4) ce poate media răspunsuri mai lente și mai prelungite în celulă și/sau poate determina refacerea depozitelor intracelulare de Ca2+ din lichidul intracelular. Enzima care catalizează producția IP4 este activată prin creșterea Ca2+ citosolic indusă de Ins(1,4,5)P3, realizând astfel o formă de reglare prin feed-back negativ a nivelurilor Ins(1,4,5)P3 (51,).

2. Scăderea concentrației de Ca2+ din celulă datorită activității pompelor de Ca2+ din membrană ceea ce duce la încetarea feed-back-ului pozitiv ( 54).

Concentrația Ca2+ intracelular este mai mică sau egală cu 10-7 și în general valoarea concentrației nu depășește 6 x 10-6, chiar dacă celula este supusă la un influx de calciu, ea păstrându-și concentrația Ca2+ între aceste limite. Angajarea receptorului pentru antigen induce o creștere inițială rapidă a Ca2+ urmată de o fază susținută de concentrații de Ca2+ intermediare. Spike-ul inițial de Ca2+ necesită hidroliza PIP2 (atașat de membrană) de către PLC1 pentru a produce DAG și Ins(1,4,5)P3. Acest lucru se întâmplă în timpul eliberării depozitelor de Ca2+ din lumenul reticulului endoplasmatic pe calea canalelor de eliberare a Ca2+ dependente de Ca2+ și golirea acestor depozite determină deschiderea canalelor de Ca2+ din membrana plasmatică (60,).

In figura 5 se poate observa cuplarea conformațională a canalelor de calciu din membrana plasmatică și din cea a reticulului endoplasmatic în timpul semnalizării calciului. Ca răspuns la creșterea concentrației de Ins(1,4,5)P3 calciul este eliberat din RE. Golirea depozitelor din RE este detectată de InsP3R care suferă o modificare conformațională care este transmisă canalelor SOC (store operated channel) pentru a induce pătrunderea ionilor Ca2+ necesari în celulă (64).

Figura 5 (Nature Reviews, 2000)

Ionii de Ca2+ pătrunși în citosol se leagă și activează molecule citoplasmatice cum sunt troponina, calmodulina, permițând celulei să răspundă adecvat stimulilor care s-au legat de receptori de suprafață .

Ca2+ este unul din reglatorii cheie ai proliferării, funcționând în corelație cu alte căi de semnalizare cum sunt cele reglate prin MAPK și fosfatidilinozitol 3-OH kinaza (PI(3)K) (48). Funcționarea Ca2+ este cel mai bine ilustrată în limfocitele care răspund la antigen, el comportându-se aici ca un factorul de creștere. Trebuie menționat că PLC1 produce Ins(1,4,5)P3 și DAG pentru o perioadă de cel puțin 2 ore înaintea proliferării deoarece este nevoie de o perioadă de semnalizare mai lungă pentru inițierea proliferării limfocitelor.

Având în vedere capacitatea limitată a depozitelor de Ca2+, o perioadă prelungită a inducerii Ca2+ de Ins(1,4,5)P3 depinde de influxul de Ca2+ din exterior prin canale SOC, controlate de câteva mecanisme modulatorii. Primul mecanism este un exemplu de încrucișare între căi de semnalizare și privește capacitatea căilor de semnalizare ale PI(3)K de stimulare a PLC1 pentru menținerea aprovizionării cu Ins(1,4,5)P3. Un al doilea mecanism este activarea canalelor de K+ care vor hiperpolariza membrana pentru a crește influxul de Ca2+ din exterior. Canalele SOC sunt sensibile la o acțiune inhibitorie indusă de Ca2+, dar această cale de feed-back negativ este redusă de mitocondrii care absorb Ca2+ prin canale (29). Există posibilitatea ca mitocondriile să poată redistribui Ca2+ prin eliberarea lui adânc în interiorul celulei (75).

Desfășurarea evenimentelor ce au loc în timpul proliferării în limfocitul T este redată în figura 6:

Figura 6: Funcția calciului în timpul proliferării limfocitelor. Antigenul interacționează cu receptorul TCR și este recrutată PLC1 care generează atât DAG cât și Ins(1,4,5)P3. Producția de Ins(1,4,5)P3 este menținută pe calea PI(3)K (fosfatidilinozitol 3-OH kinaza) care generează PtdIns(3,4,5)P3 (fosfatidilinozitol 3, 4, 5 trifosfat). Acesta stimulează un non-receptor tirozin kinazic Btk (Burton’s tyrosin kinase) care rândul său fosforilează și activează PLC1. Ins(1,4,5)P3 eliberează Ca2+ din reticulul endoplasmatic prin receptorii Ins(1,4,5)P3 tip 1 (InsP3R1). Golirea acestui depozit activează canalele SOC (canale operate de depozite). Acestea din urmă sunt menținute deschise de canalele de potasiu care hiperpolarizează membrana și de mitocondrii care reduce efectul feed-back-ului negativ al Ca2+ asupra canalelor SOC (60). Ca2+ inițiază respunsul proliferativ prin stimularea de factori transcripționali variați cum sunt NF-kB, NF-AT și CREB. Acțiunea stimulatorie a Ca2+ asupra complexului calmodulin (CAM)-calcineurin (CN) care defosforilează NF-AT este inhibată de imunosupresori: ciclosporina A (CsA) și FK506.

Figura 6 (Nature Reviews, 2000)

Calmodulina este formată dintr-un lanț proteic unic format dintr-o secvență de circa 150 aminoacizi și are 4 situsuri pentru fixarea Ca2+ care se găsesc în domenii globulare. Prezența celor 2 capete globulare legate între ele printr-o structură helix conferă calmodulinei formă de halteră. In domeniul globular există secvențe de câte 12 aminoacizi care cuprind resturi de acid aspartic și acid glutamic care formează legături ionice cu Ca2+. Situsurile de legare a Ca2+ din domeniul carboxiterminal au o constantă de afinitate de 10 ori mai mare decât cele din domeniul aminoterminal.

Figura 7: Activarea unei proteine țintă de complexul Ca2+-calmodulină (Alberts, 1994).

Legarea Ca2+ determină o modificare alosterică a calmodulinei care permite acesteia să se lege și să activeze proteina țintă.

Complexul molecular Ca2+-calmodulină este implicat la rândul său în alte căi de semnalizare, el își modifică structura și este capabil să se fixeze pe o proteină țintă (care are o structură capabilă să fixeze acest complex molecular). Complexul molecular Ca2+-calmodulină nu are activitate enzimatică dar poate servi ca subunitate reglatoare permanentă a unui complex proteic enzimatic. Tintele reglate de acest complex sunt: pompe de calciu: Ca2+-ATPaza din membrana plasmatică și o serie de kinaze: CaM kinaze (33, 57).

Ințelegerea evenimentelor care depind de creșterea concentrației Ca2+ s-a realizat mai bine după descoperirea a două substanțe cu efect imunosupresor: ciclosporina A (CsA) și FK506. Aceste substanțe blochează funcționarea sistemului imun prin inhibarea transcripției mai multor gene pentru limfokine din limfocitele T. Ambele substanțe se leagă de proteine citoplasmatice (imunofiline) cu care formează complexe ce îndeplinesc noi funcții biologice. Dintre funcțiile acestui complex, cea mai imporatantă este interacțiunea de mare afinitate cu calcineurina, o serin fosfatază dependentă de Ca2+-calmodulină.

Activitatea imunosupresoare a substanțelor medicamentoase se corelează cu abilitatea de a inhiba activitatea calcineurin fosfatazică.

Calcineurina este exprimată la un nivel relativ scăzut, acest lucru explicând în mare parte specificitatea relativă a imunosupresorului în limfocitele T. Se știe că cel puțin unul din evenimentele importante din calea descendentă de reglare a Ca2+ este activat de calcineurină. Funcționarea calcineurinei a fost stabilită în urma experimentelor ce priveau genele de reglare a exprimării IL-2. Complexele proteice nucleare sunt sensibile la CsA și FK506, ele legându-se la situsuri importante din regiunea IL-2 în cazul celulelor T activate. Aceste situsuri se numesc elementul 1 de răspuns al receptorului antigenic (ARRE-1 antigen receptor respons element 1) sau NF-IL2A și ARRE-2 sau NF-AT pot funcționa independent, direcționând transcripția pentru promotorii heterologi din celulele T activate. Inducerea activității ambilor factori implică o etapă dependentă de Ca2+, care este în același timp sensibilă la imunosupresori.

Supraexprimarea calcineurinei în tipurile sălbatice de celule oferă posibilitatea unui răspuns transcripțional mai rezistent la imunosupresori și, în plus, dependența de Ca2+ poate fi abrogată în urma exprimării unei subunități dereglatoare a calcineurinei. Aceste rezultate sugerează că activitatea fosfatazică a calcineurinei poate contribui direct la activarea acestor factori de transcripție (14).

NF-AT este format dintr-o componentă CsA sensibilă și una CsA insensibilă. Componenta sensibilă este o proteină citoplasmatică translocată în nucleul activat. Studiile au arăta că proteina citoplasmatică este o fosfoproteină de 110-140 kDa, iar forma sa nucleară este considerabil mai mică, consecință a activității fosfatazice a calcineurinei citoplasmatice.

Cea de-a doua componentă a NF-AT necesită inducerea protein tirozin kinazică și este sintetizată de novo, părând să fie un heterodimer din familia factorilor transcripționali Fos și Jun. Această componentă CsA insensibilă pare să fie activată de o schemă în care sunt implicate Ras și o proteină de 21 kDa de legare a GTP cu activitate GTP-azică.

Concluzionând, acțiunea Ca2+ este de a stimula fosfataza dependentă de calciu, calcineurina, în vederea defosforilării NF-AT care va intra în nucleu. O dată cu încetarea semnalizării Ca2+, kinazele fosforilează rapid NF-AT în nucleu, pe care îl părăsește, iar transcrierea genelor care depind de acest factor transcripțional încetează. O periodă prelungită de semnalizare a Ca2+ care este necesară pentru menținerea activă a lui NF-AT, iar întreruperea cascadei de semnalizare în câteva faze descrește transcrierea genelor. Transcrierea este inhibată de imunosupresorii ciclosporina A și FK506 care opresc transcrierea prin inhibarea calcineurinei (53).

CREB este un alt factor transcripțional asupra căruia se poate observa influența calciului. In contrast cu NF-AT, CREB este un factor transcripțional nuclear de răspuns la Ca2+ și este fosforilat de CAMKII și CAMKIV. Activitatea Ca2+ în nucleu este responsabilă și de stimularea coactivatorului factorului transcripțional CBP (CREB binding protein). O peptidă CAM inhibitorie atrasă în nucleu poate bloca sinteza ADN și progresia ciclului celular, accentuând importanța semnalului nuclear de Ca2+ pentru proliferarea celulară (69).

Acești factorii transcripționali dependenți de Ca2+ activează numeroase gene țintă: unele codifică factori ca IL-2 responsabili pentru declanșarea sintezei ADN, în timp ce altele produc elemente ce declanșează apoptoza (de exemplu Fas și liganzii Fas), declanșând astfel fie proliferare, fie apoptoză (65).

Odată ce Ca2+ și-a îndeplinit funcțiile de semnalizare, el este rapid îndepărtat din citoplasmă prin pompe și schimbători ionici. Pompele de tip Ca2+-ATPaza membranară (PMCA) și schimbătorii Na+/Ca2+ expulzează Ca2+ la exterior, în timp ce pompele Ca2+-ATP-azice din RE readuc Ca2+ în depozitele interne (66).

Pompa de calciu a fost descoperită de către Schatzmann în 1966, prin studii pe eritrocite. Ea reprezintă o componentă obligatorie a membranei plasmatice a eucariotelor și ajută la realizarea funcției de mesager secundar a calciului, jucând un rol cheie în controlul fin al concentrației Ca2+ liber citoplasmatic și asigurând transportul ionilor de Ca2+ prin membrană. Pompele de calciu aparțin clasei ATP-azelor de tip P.

Secvența de aminoacizi a pompei de Ca2+ a fost determinată din secvența ADNc. Ca2+-ATP-aza din membrana plasmatică și cea din reticulul endoplasmatic sunt formate dintr-o singură catenă polipeptidică, dar structurile lor primare sunt foarte diferite, între ele existând o slabă identitate de secvență. Pompa din membrana plasmatică conține 1220 resturi de aminoacizi, cu aproximativ 220 resturi de aminoacizi mai mult decât pompa din reticul (pompa de Ca2+ fiind cea mai mare ATP-ază transportoare cunoscută).

In ciuda acestor diferențe, cele două pompe, precum și alte ATP-aze de tip P, sunt similare în ceea ce privește distribuția regiunilor puternic hidrofobe în porțiunea C terminală.

Pompa prezintă 10 segmente transmembranare care reprezintă aproximativ 80% din masa pompei. Aceste segmente sunt unite prin secvențe scurte loop.

Cuplarea hidrolizei ATP cu translocarea Ca2+ se realizează la nivelul unui segment format dintr-un -helix și o -structură antiparalelă care conține resturi de Gly conservate și care formează o structură hairpin. Unul dintre helixurile din structura enzimei conține un domeniu responsabil pentru interacțiunea cu fosfolipidele.

Un alt domeniu este constituit din -structuri paralele întrerupte de porțiuni de -helix. Acesta conține un situs pentru aspartil-fosfat, iar în regiunea dinspre capătul carboxiterminal există o regiune "hinge" formată din 2 -helixuri în jurul unui ax, care conlucrează pentru a aduce domeniul de fosforilare lângă domeniul de legare a ATP.

Domeniul de legare al calmodulinei pare să înconjoare pompa, formând un fel de pod între prima și a doua unitate, limitând în acest fel accesul substratului la situsul catalitic.

Domeniul C terminal conține o secvența de legare a calmodulinei, flancată de 2 -helixuri acide strâns unite care au fost denumite "canale" de Ca2+ pentru acest situs catalitic. Aici există situsurile de fosforilare ale PKA și PKC (67).

Pompa de Ca2+ este stimulată prin acțiunea directă a calmodulinei. Legarea calmodulinei la monomerii Ca2+-ATP-azei induce modificarea conformațională în calmodulină care alterează afinitatea ei pentru Ca2+ și induce modificarea conformațională în Ca2+-ATP-ază ce are ca rezultat activarea sa. Concluzionând: creșterea Ca2+ în citosol duce la formarea complexului Ca2+-calmodulină care se leagă de Ca2+-ATP-aza din membrana plasmatică. Aceasta se activează și pompează Ca2+ în exteriorul celulei, favorizând astfel revenirea la normal a concentrației Ca2+ citosolic.

Mitocondria este un alt component important al mecanismului de restabilire a nivelului normal al calciului intracelular, ea sechestrând rapid Ca2+ în timpul acțiunii semnalului de Ca2+ și ulterior eliberându-l lent în timpul stadiului de recuperare. Mitocondria elimină protoni (H+) pentru a creea gradientul electrochimic care permite sinteza ATP. Același gradient este folosit pentru a conduce Ca2+ printr-un mecanism uniport care are o sensibilitate scăzută la Ca2+ (13). Această sensibilitate mică înseamnă că mitocondriile acumulează Ca2+ mai mult atunci când sunt în apropierea canalelor de eliberare a Ca2+. Aici se formează o quasi-sinapsă permițându-le să sesizeze direct concentrația locală crescută de Ca2+, care se formează în vecinătatea canalelor de Ca2+ InsP3R deschise (46). Se pare că există interacții între cele două organite: RE furnizează Ca2+ care intră în mitocondrie, aceasta din urmă modifică mecanismele de feed-back ale Ca2+ care reglează eliberarea acestuia din RE (15). Proteine variate cum ar fi preseniline și proteine reglatoare ale apoptozei (Bcl-2) modulează felul în care cele două organite folosesc Ca2+. Presenilinele localizate în membrana RE au funcție de procesare a proteinei precursoare -amyloidă, dar modulează și semnalizarea Ca2+. Mutațiile presenilinelor au ca rezultat supraîncărcarea RE și generarea multor semnale de Ca2+ care determină scăderea capacității de intrare a acestuia în celulă.

Mitocondriile au o capacitate enormă de a acumula Ca2+, iar matrixul mitocondrial conține bufferi care previn creșterea prea mare a concentrației Ca2+. Odată ce această concentrație a revenit la nivelul de repaus, schimbătorul de ioni mitocondrial Na+/Ca2+ pompeză cantitatea mare de Ca2+ încărcată înapoi în citoplasmă, de unde, aceasta ori se întoarce în RE, ori este scoasă din celulă. Ca2+ poate părăsi mitocondria printr-un por de tranziție permeabil (PTP) care are toate caracteristicile principiului “Ca induce eliberarea de Ca” pentru că formarea sa este declanșată de creșterea concentrației de Ca2+ din matrixul mitocondrial (8). Acest por PTP are probabil două stări funcționale. O stare cu conductanță scăzută care poate funcționa reversibil permițând mitocondriei să devină excitabilă și acest lucru poate contribui la generarea de unde de Ca2+. Cealaltă stare funcțională prezintă o conductanță mare și o funcționare ireversibilă, având un efect marcant asupra mitocondriei în cadrul căreia se prăbușește potențialul transmembranar, acest lucru determinând eliberarea citocromului c și inițierea apoptozei (20, 24, 56).

Ca2+ este deci un element central al sistemelor de semnalizare care permit limfocitelor să decidă dacă se divid sau mor (44).

CAPITOLUL II

Materiale si metode

1. Celulele limfoide murine

1. 1. Recoltarea sângelui murin periferic

Sângele a fost recoltat prin puncție venoasă pe mediu anticoagulant heparină. Fiecare ml de sânge s-a recoltat pe 200 l mediu de culturã mediu Eagle minim modificat (Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM) continand 10 UI de heparinã.

1. 2. Izolarea limfocitelor din sângele periferic prin centrifugare în gradient de densitate

Separarea limfocitelor pe gradient de Percoll

Principiul metodei:

Prin centrifugare în gradient de densitate, limfocitele din sângele periferic pot fi separate de o serie de alte elemente celulare sanguine (trombocite, polimorfonucleare, monocite, hematii etc.) pe baza densității lor. Pe baza acestui principiu, celulele cu densitate mică vor rămâne la extremitatea superioară a coloanei de gradient, iar celelalte tipuri de celule cu densitate mai mare vor străbate mai repede câmpul gradientului de densitate. Intregul spectru de celule prezente în sânge se pot separa pe un gradient de Percoll.

Percoll are o presiune osmotica scazută și, pentru a se obține o soluție izoosmotică, se folosesc soluții saline sau mediu de cultură concentrat. In cazul nostru am folosit urmatoarea solutie:

9 parti (v/v) Percoll + 1 parte mediu de cultura 10 x.

Mod de lucru:

Tuburile de centrifugă au fost sunt umplute cu 10 ml 70% Percoll (v/v) în NaCl 0,15M (=1,086g/ml) și gradientul preformat prin centrifugare la 20.000 g, într-un rotor cu unghiul de 14o, 15 minute. Din soluția de Percoll care realizează gradientul s-au îndepărtat 2 ml de la fundul tubului cu ajutorul unei seringi și s-au adăugat 2 ml sânge heparinat 50% în soluție de NaCl 0,15M.

Sângele diluat s-a pus ușor pe suprafața gradientului autogenerat de Percoll și s-a centrifugat 5 minute la 400 g. Stratul de plasmă care conține trombocite s-a îndepărtat și s-a înlocuit cu o soluție salină. S-a centrifugat în continuare la 800 g, timp de 15 minute și s-au obținut benzi de celule mononucleare (limfocite și monocite), polimorfonucleare și eritrocite.

S-a folosit o metodă rapidă de separare a limfocitelor de monocite descrisă de Giddings care se bazează pe faptul că monocitele sunt mai puțin dense decât limfocitele și deci se pot separa pe baza densităților lor.

S-a folosit un gradient autogenerat de Percoll pornind de la densitatea de 1,07 g/ml. După centrifugarea la 300 g, timp de 20 minute, s-au obținut doua benzi distincte, cea de la suprafață conținând mai mult de 95% monocite, iar banda a doua prezentând peste 90% limfocite.

Figura 1. Schematizarea metodologiei utilizate pentru obținerea limfocitelor prin centrifugări succesive pe gradient de Percoll.

Celulele vii au fost separate din mediu Percoll prin spălari cu soluție salină fiziologică (5 volume soluție salină la 1 volum suspensie celulară). Operația se repetă de 2-3 ori, celulele fiind colectate între spălări prin centrifugări la 200 g timp de 2-10 minute.

2. Celule limfoide tumorale

In experimentele noastre am folosit linia de celule EL4. Aceasta linie limfocitară tumorală a fost obținută dintr-un limfom indus de 9, 10-dimetil 1,2-benzanthracen în Mus musculus C57BL (șoarece). Această linie de celule prezintă morfologie de limfoblast si exprimă antigenele H-2b si Thy-1.2. O sublinie (EL4.IL-2, ATCC TIB-181) are o producție ridicată de interleukina-2 (IL-2). Linia celulară a fost testată și găsită negativă pentru virusul ectomelia (mousepox).

Celulele sunt rezistente la 0.1 mM cortizol și sensibile la 20 mcg/ml PHA (fitohemaglutinină). Celulele cresc in suspensie în mediu ATCC: DMEM cu 4 mM L-glutamină ajustat să conțina 1.5 g/L bicarbonat de sodiu si 4.5 g/L glucoză, 90%, ser de cal, 10%. Se cresc la o temperatură de 37oC. Culturile se mențin prin adiție sau înlocuire cu mediu proaspat o dată la 2-3 zile. Cultura se pornește de la un număr de 2 x 105 celule/ml și se menține între 1 x 105 si 1 x 106 celule/ml. Congelarea se face în mediu de cultură 95% cu DMSO 5%.

3. Determinarea densității celulare

Celulele se numară cu ajutorul camerelor de numărare Bürger-Türk sau camera hemocitometrică.

Hemocitometrul este format din 2 camere, fiecare fiind împărțită în pătrate de 1 mm. Este acoperită de o lamă lăsând un spațiu de 0.1mm peste aceste pătrate astfel încât volumul total pentru fiecare pătrat să fie 1.0 mm x 0.1 mm sau 10 mm3 sau 10-4 cm3. Având în vedere că 1 cm3 este echivalentul 1 ml, concentrația celulară per ml va fi media numărată per patrat x 104.

Figura 2. Diagrama camerei hemocitometrice. Ariile marcate A, B, C, si D indică 1 mm2. Prin convenție se alege un sens de numărare, incluzând celulele din centru și cele care ating două laturi ale pătratului (celulele marcate cu albastru). Nu se numără celulele care sunt în afara pătratului (celulele marcate în roșu).

4. Determinarea viabilității celulare

4.1. Determinarea viabilității cu Tripan Blue

Principiul metodei:

Viabilitatea celulară a fost determinată prin testul excluziei albastrului de tripan. Albastrul de tripan este un colorant vital care difuzează în interiorul celulelor moarte sau a celor care prezintã leziuni ale membranei plasmatice. In consecință, celulele moarte se coloreazã și pot fi distinse de cele vii prin vizualizare la microscopul optic.

Materiale:

Albastru de Tripan (Sigma) solutie 0.4% preparată în 0.81% NaCl și 0.06% fosfat dibazic de potasiu

Camerã de numãrare a celulelor (Bürger-Türck)

Mod de lucru:

Testul cu albastru de tripan: peste 50 l suspensie de celule se adaugă 50 l albastru de tripan și se omogenizează suspensia. Probele omogenizate se aplică prin capilaritate în camera de numărare Bürger-Türck. Se face numărarea celulelor la microscopul optic. Se numără celulele aflate în cel puțin 3 arii de numărare și se face media aritmetică. Se stabilește concentrația și puritatea suspensiei de celule.

Pentru determinarea numărului total de celule cu acest tip de cameră se aplică următoarea formulă:

Nr. celule necolorate x 104 x 0.5 (factor de dilutie) = Nr.celule vii/ ml

Se stabilește procentul de celule moarte, prin numărarea celulelor care au incorporat Tripan folosind urmatoarea formulă:

Nr.celule colorate x 104 x 0.5 = Nr.celule moarte/ ml

Numărul total de celule este reprezentat de numărul celulelor vii și numarul celulelor moarte.

Nr.celule colorate (moarte) + Nr.celule necolorate (vii) = Nr.celule total

Viabilitatea se poate exprima procentual, aplicând regula de trei simplă. Pentru efectuarea unui experiment corect este necesară o viabilitate a celulelor limfoide izolate de cel puțin 85%.

4.2. Determinarea viabilității cu MTT (Tiazolil blue)

Principiul metodei:

MTT: bromura de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl )-2,5 difenil tetrazoliu se reduce sub acțiunea enzimelor din celulele vii îin formazan a cărui colorație se poate determina spectrofotometric la 540nm.

Figura 3. Structura MTT

Mod de lucru:

Soluția stoc s-a preparat astfel: 5 mg MTT s-au dizolvat în 1 ml tamopn fosfat salin. Soluția se vortexează 5 minute și se filtrează prin filtru de 0.45m. Soluția obținută se păstrează la 4C, ferită de lumină.

Celulele se incubează cu mediu incolor conținând 10% MTT, 2 ore la întuneric. Se solubilizează celulele cu o soluție ce conține 0.1N HCl și 10% Triton X 100 în izopropanol. Se citește densitatea optica la 540nm și 690 nm pentru blank. Se face diferența DO540-DO690 și se calculează viabilitatea.

5. Efectul Ca2+ / depleției Ca2+ asupra viabilității celulelor EL4 și limfocitelor normale

Se urmărește evoluția celulelor EL4 pe medii suplimentate cu Ca2+ și pe medii în care a fost îndepărtat Ca2+, prin chelatare.

5.1. Efectul calciului asupra celulelor EL4

Mod de lucru:

Celulele EL4 conțin lichid de ascită care trebuie îndepartat prin centrifugarea suspensiei celulare la 1500 rpm/10 minute 40C. După centrifugare supernatantul a fost îndepărtat si s-a adăugat mediu TC EAGLE. Celulele au fost spălate prin centrifugare de 4 ori cu îndepărtarea supernatantului. După ultima centrifugare s-au citit celulele la camera de numărare Bürger-Türck și s-a determinat viabilitatea celulară.

S-au distribuit câte 250 l mediu TC EAGLE conținând 100.000 celule în fiecare eprubetă și s-a adăugat gluconat de Ca, obținând, în final, soluții de următoarele concentrații:

100 mM gluconat de Ca

50 mM gluconat de Ca

20 mM gluconat de Ca

In alte eprubete s-a distribuit EGTA peste 250 l de mediu TC EAGLE continând 100.000 celule, obtinând în final urmatoarele concentrații:

100 mM EGTA

50 mM EGTA

20 mM EGTA

Celulele au fost incubate în soluțiile respective timp de 30 minute la 370C după care li s-a determinat viabilitatea.

5.2. Efectul calciului asupra limfocitelor normale murine

Mod de lucru:

Celulele limfoide izolate din sângele murin au fost resuspendate în mediu DMEM incolor și distribuite pe o plăcuța cu 96 godeuri la o concentrație de 50.000 celule /125l /godeu.

Celulele au fost incubate cu o soluție de CaCl2 sau EGTA în tampon fosfat salin după cum urmează:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Viabilitatea celulelor după incubarea 1 oră la 37C cu soluțiile de mai sus a fost determinată prin metoda cu MTT, probele fiind lucrate în triplicat.

6. Determinarea activității enzimatice a Ca2+-ATPazei

6.1. Reacția enzimatică

Activitatea Ca2+-ATPazei a fost deteminată folosind un tampon substrat (TS) care conținea 0.33mM ATP (1,82 mg/10 ml), 1mM CaCl2 (1,11 mg/10ml) în tampon Tris 50 mM pH 8.7.

In eprubete se pipetează 50 l probă și 150l TS și se incubează 30 minute la 37°C. Reacția se stopează prin adăugarea a 50 l acid triclor acetic (TCA) 80%. Preparatul se incubează 10 minute la 4°C, pentru precipitarea proteinelor și apoi se centrifughează 5 minute la 10.000 g. In supernatant se dozează fosfatul eliberat în urma reacției enzimatice:

ATP AMP +PPi

Martorul se prepară astfel: în eprubete se pipetează 50 l probă, 50 l TCA 80% și se incubează 10 minute la 4°C; apoi se adaugă 150l TS. Preparatul se centrifughează 5 minute la 10.000 g, iar în supernatant se dozează fosfatul liber existent în probă.

Activitatea enzimatică se determină astfel:

Se face diferența DOProba-DOMartor și se determină nmoli de fosfat eliberat.

AE (activitatea enzimatică) = nmoli P eliberat/ minut/ ml

Timpul si pH-ul optim de reacție au fost testate prin tatonări:

reacția a fost stopată după 10 – 40 min

tamponul substrat a avut valori ale pH-ului cuprinse între 7 și 9.5.

6.2. Dozarea fosfatului eliberat

Principiul metodei:

Fosfatul eliberat a fost dozat utilizându-se molibdat. Fosfomolibdatul este redus în mediu slab acid la albastru de molibden.

H3PO4 + 12(NH4)2MoO4 + 21 HNO3 (NH4)3H4[P(Mo2O7)6] + 21 NH4NO3 + 10H2O

Soluții necesare:

standard KH2PO4 0.1 mM in TCA 10%

TCA 10%

Acid ascorbic 10%

(NH4)2MoO4 x 4 H2O 0.42 % în H2SO4 1N

Mod de lucru:

Se amestecă 1 parte acid ascorbic cu 6 părti molibdat și se realizează curba etalon.

Probele se incubează 20 minute la 45°C și produsul de reacție de culoare albastră se dozează prin colorimetrie la 600 nm.

6.3. Dozarea de proteine

Dozarea de proteine s-a realizat prin metoda Bradford.

Principiul metodei:

Reactivul Coomassie Brilliant Blue G se leagă de proteine într-un mediu acid-alcoolic. Forma anionică a colorantului se leagă electrostatic prin grupările sulfonice de proteină. Colorantul se leagă de proteine și rezultă o scală de culoare de la roșu-maroniu la albastru. Colorantul absoarbe la 495-595 nm. Coomassie se pare că are o afinitate mai mare pentru arginine și mai mică pentru His, Lys, Tyr, Trp și Phe.

Figura 4: Coomassie Brilliant Blue G-250

Mod de lucru:

– Se prepară o soluție etalon de albumină serică bovină (BSA) 0,1 mg/ml.

– Se prepară reactivul:

(A) Coomassie Brilliant Blue G250 100 mg

(B) Etanol 95 % 50 ml

(C) H3PO4 85% (g/v) 100 ml

– Se amestecă (A) + (B) + (C) și se aduce la 1 l cu H2O;

– Se pastrează la 40C și se filtrează prin hârtie de filtru înainte de folosire.

– Se realizează curba etalon astfel: într-o placă de 96 godeuri se pipetează următoarele volume de soluție de BSA și de apa distilată:

– Intr-un godeu se pun 50 l probă. Proba trebuie diluată astfel încat în 50 l să existe între 0,3 si 5 g.

– Se adaugă 200 l din reactiv în fiecare godeu.

– Se agită la aparatul pentru placi, 30 secunde.

– Se citește după 5 minute la DO 620 nm la aparatul pentru plăci.

– Trebuie știut că în această metodă de dozare a proteinelor interferă tampoane puternic alcaline și cantități mari de detergent (1% Tx100, SDS); în ceea ce privește: Na, K, EDTA, -mercaptoetanolul, fenolii și glicerolul nu interferă.

7. Determinarea activității enzimatice specifice a Ca-ATP-azei în limfocitele normale si tumorale

Reacția enzimatică a Ca2+-ATPazei a fost deteminată folosind un tampon substrat (TS) care conținea 0.33mM ATP (1,82 mg/10 ml), 1mM CaCl2 (1,11 mg/10ml) în tampon Tris 50 mM pH 8.7.

In eprubete s-au pipetat 50 l probă și 150l TS s-a incubat 30 minute la 37°C. Reacția a fost stopată prin adăugarea a 50 l acid triclor acetic (TCA) 80%. După o incubare de 10 minute la 4°C și o centrifugare de 5 minute la 10.000 g, în supernatant a fost dozat fosfatul eliberat utilizându-se molibdat.

Activitatea specifică a fost calculată după formula

AS= AE/concentrație proteică (nmoli P eliberat/ minut/ mg)

CAPITOLUL III

REZULTATE SI DISCUTII

1. Celulele limfoide murine

1.1. Recoltarea sângelui murin periferic

Au fost recoltați câte 2 ml sânge/șoarece, prin puncție venoasă pe mediu anticoagulant heparină și au fost prelucrați imediat după recoltare.

1.2. Izolarea limfocitelor din sângele periferic prin centrifugare în gradient de densitate

Separarea limfocitelor pe un gradient de Percoll

Soluția de Percoll, care este o suspensie de particule, sedimentează cu o rată proporțională cu forța aplicată. Rata de sedimentare este afectată și de proprietățile fizice ale soluției, astfel că la o anumită forță și la o anumită vâscozitate a lichidului, rata de sedimentare va fi proporțională cu mărimea particulelor și cu diferența dintre densitatea sa și cea a mediului înconjurător.

Percoll are în compoziția sa particule coloidale silica de 15-30 nm în diametru care au fost învelite în polivinilpirrolidona (PVP). Percoll poate forma gradienti între 1.0-1.3 g/ml. Are o presiune osmotică scazută și ca urmare formează gradienți care sunt, teoretic, izo-osmotici. Percoll are un pH=9 si o capacitate foarte scazută de tamponare, soluția putând fi adusă la un pH între 5.5-10 fără a i se modifica proprietățile. Vâscozitatea este în funcție de puterea ionică și este mai scăzuta în soluții saline (NaCl 0.15M) decât în apă sau în 0.25M sucroză, ca urmare formarea gradientului este mai rapidă în soluție salină decât în sucroză în condiții de centrifugare identice.

Soluția de Percoll nu este toxică pentru materialul biologic și nu aderă de membrana celulară, drept urmare nu este necesară îndepartarea lui din preparatul purificat.

Marele avantaj al Percoll este că are capacitatea de a autogenera gradienți la o centrifugare medie timp de 10-30 minute. Particulele din Percoll au un nucleu din silica care este foarte dens (=2,2 g/ml) și o medie a moleculelor hidratate de 29 nm în soluție NaCl 0.15M și 35 nm în apă. Când soluția de Percoll este centrifugată la mai mult de 10.000 g particulele de silica acoperite cu PVP vor începe să sedimenteze rezultând o distribuție neuniformă, deci un gradient de densitate. Percoll este făcut izo-osmotic cu ajutorul unei soluții fiziologice saline sau cu mediu de cultură astfel: se pun 9 părti (v/v) Percoll + 1 parte soluție 0.15M NaCl sau mediu de cultură 10x.

Tuburile de centrifugă sunt umplute cu 10 ml 70% Percoll (v/v) în NaCl 0,15M (=1,086g/ml) și gradientul preformat prin centrifugare la 20.000 g, într-un rotor cu unghiul de 14o, 15 minute. Din soluția de Percoll care realizează gradientul s-au îndepărtat 2 ml de la fundul tubului cu ajutorul unei seringi și s-au adăugat 2 ml sânge heparinat 50% în soluție de NaCl 0,15M.

Sângele diluat se pune ușor pe suprafața gradientului autogenerat de Percoll și se centrifughează 5 minute la 400 g, timp în care trombocitele, care sunt cu mult mai mici decât celelalte celule prezente, nu pătrund în gradient. Stratul de plasmă care conține trombocite se îndepărtează și se înlocuiește cu o soluție salină. Se centrifughează în continuare la 800 g timp de 15 minute și se obțin benzi de celule mononucleare (limfocite și monocite), polimorfonucleare și eritrocite (figura1).

Figura 1: Separarea celulelor sanguine murine în gradient de Percoll.

Densitățile sunt determinate cu ajutorul unor markeri de densitate asa cum este ilustrat în figura de mai jos.

Figura 2: Markerii de densitate în gradientul de Percoll: Densitatea (g/ml) în soluție 0.15M NaCl: Albastru 1,016, Roșu 1,033 Verde 1.047, Galben 1.064 Portocaliu 1.076, Verde 1.087, Albastru 1.100, Roșu 1.110, Portocaliu 1.122, Albastru 1.142.

Separarea limfocitelor de monocite s-a realizat folosind un gradient autogenerat de Percoll pornind de la densitatea de 1,07 g/ml. S-a centrifugat la 300 g, timp de 20 minute și s-au obținut două benzi distincte, cea de la suprafață conținând monocite, iar banda a doua limfocite.

Celulele vii au fost separate din mediu Percoll prin spălare cu soluție salină fiziologică (5 volume soluție salină la 1 volum suspensie celulară). Operația s-a repetat de 3 ori, celulele fiind colectate între spălări prin centrifugări la 200 g timp de 10 minute.

Figura 3: Separarea limfocitelor (roșu) de monocite (albastru) prin centrifugare în gradient de Percoll.

1.3. Numărarea limfocitelor murine

Celulele s-au numărat cu ajutorul camerelor de numărare Bürger-Türk. S-au obținut 700.000 celule limfoide/ml sânge recoltat. Testul de viabilitate celulară cu albastru de Tripan a aratat ca 89,87% din celule au fost viabile.

2. Efectul Ca2+ asupra viabilității limfocitelor normale si tumorale

2.1. Efectul Ca2+ / depleției Ca2+ asupra viabilității celulelor EL4

Celulele au fost resuspendate în mediu TC EAGLE și au fost spălate de 4 ori prin centrifugare cu îndepărtarea supernatantului. După ultima centrifugare celulele au fost numărate la camera de numărare Bürger-Türck și au fost găsite 3.87×10 6 celule/ml.

Celulele au fost distribuite în mediu (250 l în fiecare eprubetă) care conținea gluconat de Ca și incubate așa cum s-a arătat la capitolul “Materiale si Metode”. Testul de viabilitate pentru celulele EL4 după termostatare la 370C timp de 1 oră a arătat celulele și-au păstrat viabilitatea după cum se arată în figura 4. Viabilitatea a fost calculată prin numărarea celulelor vii si moarte (colorare cu Tripan), după care a fost calculat raportul celule vii/număr total celule.

Rezultatele pentru diferitele concentrații de Ca2+ sunt următoarele:

1. 100 mM Ca2+: 276 celule vii / 322 celule total x 100 = 85,71%

2. 50 mM Ca2+: 341 celule vii / 382 celule total x 100 = 89,26%

3. 20 mM Ca2+: 328 celule vii / 354 celule total x 100 = 92,65%

4. Martor: 203 celule vii / 214 = 94,85%

Figura 4: Efectul concentrației Ca2+ asupra viabilității celulelor EL4.

Pentru studiul viabilității celulare în absența ionilor de calciu, celulele au fost incubate în soluții de EGTA care este un chelator al calciului.

Rezultatele testelor de viabilitate celulară (figura 5) au aratat că viabilitatea celulară nu a scăzut până la 50mM EGTA, dar la 100mM EGTA se observă o scădere a viabilității, după cum urmează:

1. 100 mM EGTA: 227 celule vii / 307 celule total= 73,94%

2. 50 mM EGTA: 435 celule vii / 477 celule total = 91,19%

3. 20 mM EGTA 300 celule vii / 322 celule total = 93,16%

4. Martor: 203 celule vii / 2145 celule total= 94,41%

Figura 5: Efectul concentrației EGTA asupra viabilității celulelor EL4.

2.2. Efectul Ca2+ / depleției Ca2+ asupra viabilității limfocitelor normale

Celulele limfoide murine, izolate pe gradient de Percoll, au fost resuspendate în 100l DMEM incolor care conținea CaCl2 și incubate așa cum s-a arătat la capitolul “Materiale si Metode”. Testul de viabilitate a fost realizat cu MTT după incubarea celulelor cu Ca2+ (370C timp de 2 ore). Rezultatele au arătat că viabilitatea celulară scade drastic o dată cu creșterea concentrației de Ca2+ așa cum se poate observa în figura 6. Viabilitatea a fost raportată la valoarea martorului (celule incubate în mediu fără adaus de Ca2+)

Figura 6. Efectul concentrației Ca2+ asupra viabilității limfocitelor murine.

Pentru studiul viabilității celulare în absența ionilor de calciu, celulele au fost incubate în soluții de EGTA 20 mM și 50 mM (ca martor s-au folosit celule crescute în mediu fără EGTA). Testul de viabilitate a fost realizat cu MTT. Rezultatele ilustrate în figura 7 au arătat că viabilitatea celulară nu a scăzut semnificativ până la 50mM EGTA.

Figura 7. Efectul concentrației EGTA asupra viabilității limfocitelor murine.

3. Determinarea activității enzimatice a Ca2+-ATPazei în celulele limfoide normale și tumorale

Celulele au fost solubilizate în tampon conținând detergent neionic Triton X-100 1% în tampon Tris 50mM pH 7.5, 20 minute la 4oC cu omogenizare.

Preparatul astfel obținut a fost utilizat pentru dozarea activității Ca2+-ATPazei. A fost utilizat un tampon substrat (TS) care conținea 0.33mM ATP, 1mM CaCl2 în tampon Tris 50 mM pH 8.7. Probele au fost incubate cu TS, 30 minute la 37°C; apoi reacția a fost stopată cu acid triclor acetic (TCA) care a precipitat proteinele. In supernatantul obținut după centrifugare, a fost dozat fosfatul eliberat în urma reacției enzimatice de hidroliză a ATP la AMP.

In martor, proteinele sunt precipitate cu TCA înainte de adăugarea substratului.

Pentru evaluarea activității enzimatice se face diferența DOProbă-DOMartor și se determnină nmoli de fosfat eliberat. AE se exprimă în <nmoli P eliberat/ minut/ ml>.

Pentru determinarea activitatii enzimatice a Ca-ATPazei a fost necesara dozarea fosfatului eliberat.

3.1. Dozarea fosfatului

Fosfatul eliberat a fost dozat utilizându-se molibdat de amoniu. Fosfomolibdatul este redus in mediu slab acid la albastru de molibden.

Probele au fost incubate 20 minute la 45°C și produsul de reacție de culoare albastră a fost dozat prin colorimetrie la 600nm.

S-a realizat curba etalon redată în figura 8:

Figura 8. Curba etalon pentru dozarea PO4

3.2. Dozarea proteinelor

Pentru dozarea proteinelor s-a folosit metoda Bradford. S-a realizat curba de etalonare (figura 9) așa cum este descris mai jos:

Figura 9. Curba etalon pentru dozarea proteinelor.

3.3. Determinarea timpului de reacție optim al Ca2+-ATP-azei.

Pentru aceasta, reacția enzimatică a fost stopată după 10, 20, 30 și 40 minute.

Rezultatele, ilustrate în figura 10 au arătat că evoluția activității enzimatice este lineară până la 30 de minute, după care s-a constatat că activitatea enzimatică nu mai crește, probabil datorită consumului de substrat.

Figura 10: Dependența activității enzimatice de timpul de reacție.

3.4. Determinarea pH de reacție optim

Reacția enzimatică a fost realizată la diferite valori ale pH cuprinse în intervalul 7.00- 9.5. Rezultatele au arătat ca pH-ul optim de reacție este de 8.7, asa cum reiese și din histograma redată în figura 11.

Figura 11: Corelația activității enzimatice cu pH-ul tamponului substrat.

3.5. Determinarea activității enzimatice a Ca2+-ATP-azei în funcție de concentrația substratului

Preparate celulare omogenizate au fost folosite pentru a se determina variația activității enzimatice față de concentrația substratului. Rezultatele au arătat că în limfocitele normale curba se aplatizează la 0.5mM ATP, o valoare mai mică decât cea înregistrată pentru celulele tumorale, așa cum se arată în figura 12.

Figura 12: Dependența activității enzimatice funcție de concentrația substratului.

3.6. Determinarea activității enzimatice a Ca-ATP-azei în funcție de concentrația Ca2+ din mediul de reacție.

Preparate celulare omogenizate au fost folosite pentru a se determina variația activității enzimatice față de concentrația calciului. Preparatele celulare au fost incubate în tampoane substrat conținând diferite concentrații de CaCl2.

Rezultatele prezentate în figura 13 si 14 arată ca deși alura curbelor diferă ușor, ele se aplatizează în jurul valorii de 1mM CaCl2.

Figura 13: Dependența activității enzimatice a Ca2+-ATPazei din limfocite normale funcție de concentrația Ca2+.

Figura 14: Dependența activității enzimatice a Ca2+-ATP-azei din celulele EL4 funcție de concentrația Ca2+.

3.7. Determinarea activității enzimatice specifice a Ca2+-ATP-azei în limfocitele normale și tumorale

Rezultatele obținute sunt următoarele:

AS limfocite normale= 12 x 250 x 1000/30 x 200 x 50 x 0.236 = 42.37 nmoli P/min/mg

AS limfocite tumorale= 15 x 250 x 1000/30 x 200 x 50 x 0.177 = 70.62 nmoli P/min/mg

Activitatea enzimatică specifică

(nmoli P/min/mg)

Figura 15: Activitatea enzimatică specifică a Ca2+-ATP-azei în celulele limfoide normale și tumorale.

CONCLUZII

1. Testele de viabilitate au arătat că celulele limfoide tumorale sunt mai puțin sensibile la concentrații crescute de calciu decât celulele limfoide, probabil datorită ratei metabolice mai ridicate.

2. Depleția calciului vine să confirme necesitatea crescută a celulelor tumorale pentru calciu. Dacă în celulele normale chelatarea calciului nu scade viabilitatea decât până la 85%, în celulele EL4 se observă o scădere a viabilității până la 73%.

3. In ceea ce privește evoluția activității enzimatice a Ca2+-ATP-azei în funcție de timp, aceasta este lineară până la 30 de minute, după care se constată că nu mai crește, probabil datorită consumului de substrat.

4. Experimentele de determinare a pH-lui optim de reacție al Ca2+-ATP-azei au relevat o valoare de 8.7.

5. Variația activității enzimatice în funcție de concentrația substratului a arătat că în limfocitele normale curba se aplatizează la 0.5mM ATP, o valoare mai mică decât cea înregistrată pentru celulele tumorale 1.25mM ATP.

6. In urma determinării activității enzimatice a Ca2+-ATP-azei în funcție de concentrația de Ca2+, s-a observat o dependență a activității enzimatice de concentrația calciului până în jurul valorii de 1mM CaCl2, valoare peste care concentrația ionilor nu mai influențează activitatea enzimei.

7. Experimentele de determinare a activității specifice a Ca2+-ATP-azei au arătat că aceasta este mai mare pentru limfocitele tumorale decât pentru cele normale.

BIBLIOGRAFIE

Year published:

Year published:

ABRAMOFF MD, MAGELHAES PJ, RAM SJ., 2004. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International 11: 36–42,

ALBERTS, B., BRAY, D., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WATSON, J. D. 1994, Molecular Biology of the Cell, Garland Publ. Inc., New York.

Amy N. Anzelon, Hong Wu & Robert C. Rickert, (2003) Pten inactivation alters peripheral B lymphocyte fate and reconstitutes CD19 function; Nature Immunology 4, 287 – 294 .

Andrea Oeckinghaus, Matthew S Hayden & Sankar Ghosh.,2011., Crosstalk in NF-κB signaling pathways., Nature ImmunologVolume: 12,Pages: 695–708Year published:.

APPELBLOM H, NURMI J, SOUKKA T, PASTERNACK M, PENTTILA KE, LOVGREN T & NIEMELA P., 2007 Homogeneous TR-FRET high-throughput screening assay for calcium-dependent multimerization of sorcin. Journal of Biomolecular Screening 12 842–848.

Arthur Weiss Year published:DOI.., 2010., The right team at the right time to go for a home run: tyrosine kinase activation by the TCR., Nature ImmunologyVolume: 11,Pages: 101–104.

ATTWELL, D., BUCHAN, A.M., CHARPAK, S., LAURITZEN, M., MACVICAR, B.A. AND NEWMAN, E.A., 2010, Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature, 468, 232–243.

BERKEFELD H, SAILER CA, BILDL W, ROHDE V, THUMFART JO, EBLE S, KLUGBAUER N, REISINGER E, BISCHOFBERGER J, OLIVER D, KNAUS HG, SCHULTE U, FAKLER B., 2006, BKCa-Cav channel complexes mediate rapid and localized Ca2_-activated K_ signaling. Science 314: 615–620,.

BERRIDGE MJ, BOOTMAN MD & RODERICK HL.,2003 Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology 4 517–529

BERRIDGE MJ., 2008. Smooth muscle cell calcium activation mechanisms. J.Physiol 586: 5047–5061,

BERRIDGE, M. J., 1993, Inositol triphosphate and calcium signalling, Nature 361, 315-325

BERRIDGE, M. J., 1997, Elementary and global aspects of calcium signalling, J. Physiol. 499, 291-306

BERRIDGE, M. J., 2000, The Versatility and Universality of Calcium Signalling, Nature Reviews, vol 1

BOERGESEN M, POULSEN LC, SCHMIDT SF, FRIGERIO F, MAECHLER P & MANDRUP S.,2011 ChREBP mediates glucose repression of peroxisome proliferator-activated receptor alpha expression in pancreatic β-cells. Journal of Biological Chemistry 286 13214

BOERMAN E, JACKSON W., 2008 Ca2_-activated K_ channels are controlled by Ca2_ influx through voltage-gated Ca2_ channels, not the release of Ca2 through ryanodine receptors in arteriolar smooth muscle (Abstract). FASEB J 22: 1142,.

BOOTMAN, M. D., LIPP, P., 1999, Calcium signalling: Ringing changes to the “bell-shaped curve”, Current Biology 9, R876-R878

BORISOVA L, WRAY S, EISNER DA, BURDYGA T., 2009 How structure, Ca2+ signals, and cellular communications underlie function in precapillary arterioles. Circ Res 105: 803–810,.

BOULAY, G., et all, 1999, Modulation of Ca2+ entry by polypeptides of the inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) that bind transient receptor potential (TRP): evidence for roles of TRP and IP3R in store depletion-activated Ca2+ entry, Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14955-14960

BRICAMBERT J, MIRANDA J, BENHAMED F, GIRARD J, POSTIC C & DENTIN R., 2010 Salt-inducible kinase 2 links transcriptional coactivator p300 phosphorylation to the prevention of ChREBP-dependent hepatic steatosis in mice. Journal of Clinical Investigation 120 4316–4331

BUKOSKI RD, BATKAI S, JARAI Z, WANG Y, OFFERTALER L, JACKSON WF, KUNOS G., 2002. CB(1) receptor antagonist SR141716A inhibits Ca2_-induced relaxation in CB(1) receptor-deficient mice. Hypertension 39: 251 257,

BUKOSKI RD, SHEARIN S, JACKSON WF, PAMARTHI MF., 2001. Inhibition of Ca2_-induced relaxation by oxidized tungsten wires and paratungstate. J. Pharmacol Exp Ther 299: 343–350,

BUSTELO, X. R., BARBACID, M., 1992, Tyrosine phosphorilation of Vav proto-oncogene product in activated B cell, Science 256, 1169-1199

COLLINS, T. J., LIPP, P., BERRIDGE, M. J., LI, W., BOOTMAN, M. D., 2000, Inositol 1, 4, 5-triphosphate-induced Ca2+ release is inhibited by mitochondrial depolarization, Biochem. J. 347, 593-600

CRABTREE, G. R., 1999, Generic signals and specific outcomes: Signalling through Ca2+, calcineurin and NF-AT, Cell 96, 611-614

DA SILVA XAVIER G, SUN G, QIAN Q, RUTTER GA & LECLERC I., 2010 ChREBP regulates Pdx-1 and other glucose-sensitive genes in pancreatic β-cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 402 252–257.

DENECHAUD PD, DENTIN R, GIRARD J & POSTIC C., 2008 Role of ChREBP in hepatic steatosis and insulin resistance. FEBS Letters 582 68–73.

Dennis C. Otero and Robert C. Rickert 2003. CD19 Function in Early and Late B Cell Development. II. CD19 Facilitates the Pro-B/Pre-B Transition, Immunol ; 171:5921-5930;

DRUGARIN, D. 1998, Imunologie moleculară, Edit. Mitron, Timișoara

DUBUQUOY C, ROBICHON C, LASNIER F, LANGLOIS C, DUGAIL I, FOUFELLE F, GIRARD J, BURNOL AF, POSTIC C & MOLDES M., 2011 Distinct regulation of adiponutrin/PNPLA3 gene expression by the transcription factors ChREBP and SREBP1c in mouse and human hepatocytes. Journal of Hepatology 55 145–153.

DUCHEN, M. R., 1999, Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signalling and cell death, J. Physiol. 516, 1-17

ERIKA B. WESTCOTT AND WILLIAM F. JACKSON., 2011. Heterogeneous function of ryanodine receptors, but not IP3 receptors, in hamster cremaster muscle feed arteries and arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol 300: H1616–H1630,

EROGLU, C. AND BARRES, B.A., 2010, Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature, 468, 223–231.

ESSIN K, WELLING A, HOFMANN F, LUFT FC, GOLLASCH M, MOOSMANG S. 2007. Indirect coupling between Cav1.2 channels and ryanodine receptors to generate Ca2_ sparks in murine arterial smooth muscle cells. J Physiol 584: 205–219,

FELLNER SK, ARENDSHORST WJ. , 2005.Angiotensin II Ca2_ signaling in rat afferent arterioles: stimulation of cyclic ADP ribose and IP3 pathways. Am J Physiol Renal Physiol 288: F785–F791,

FELLNER SK, ARENDSHORST WJ. 2007, Voltage-gated Ca2_ entry and ryanodine receptor Ca2_-induced Ca2_ release in preglomerular arterioles. Am J. Physiol Renal Physiol 292: F1568–F1572,.

FOYOUZI-YOUSSEFI, R., et all, 2000, Bcl-2 decreases the free Ca2+ concentration within the endoplasmic reticulum, Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 5723-5728

GE Q, NAKAGAWA T, WYNN RM, CHOOK YM, MILLER BC & UYEDA K., 2011, Importin-a protein binding to a nuclear localization signal of carbohydrate response element-binding protein (ChREBP). Journal of Biological Chemistry 286 28119–28127.

GIANLUCA BARTOLOMMEI, FRANCESCO TADINI-BUONINSEGNI, MARIA ROSA MONCELLI, SANDRA GEMMA, CATERINA CAMODECA, STEFANIA BUTINI, GIUSEPPE CAMPIANI, DAVID LEWIS AND GIUSEPPE INESI., 2011, The Ca2+-ATPase (SERCA1) Is Inhibited by 4-Aminoquinoline Derivatives through Interference with Catalytic Activation by Ca2+, Whereas the ATPase E2 State Remains Functional, J. Biol. Chem. 286: 38383-38389.

Grzegorz Chodaczek, Veena Papanna, M Anna Zal & Tomasz Zal. (2012), Body-barrier surveillance by epidermal yδ TCRsNature ImmunologyVolume: 13,Pages: 272–282Year published:.

HAIXIN CHANG AND SUSAN S. SUAREZ., 2011,Two Distinct Ca2+ Signaling Pathways Modulate Sperm Flagellar Beating Patterns in Mice, Biol. Reprod. 85: 296-305.

HARR, M.W. AND DISTELHORST, C.W. 2010, Apoptosis and autophagy:

ISABELLE LECLERC, GUY A RUTTER, GARGI MEUR AND NAFEESA NOORDEEN., 2012 Roles of Ca2+ ions in the control of ChREBP nuclear translocation ,J Endocrinol, 213: 115-122.

Jiyoung Oh, Seol-Hee Kim,Sinae Ahn and Choong-Eun , 2012 Suppressors of Cytokine Signaling Promote Fas-Induced Apoptosis through Downregulation of NF-κB and Mitochondrial Bfl-1 in Leukemic T Cells; J Immunol 189:5561-5571

JOSEPH, S.K. AND HAJNOCZKY, G., 2007. IP3 receptors in cell survival and apoptosis: Ca2+release and beyond. Apoptosis, 12, 951–968.

KASS, G. E. N., ORRENIUS, S., 1999, Calcium signalling and cytotoxicity, Environ. Health Perspect. 107, 25-35

KOWLURU A., 2005 Novel regulatory roles for protein phosphatase-2A in the islet β cell. Biochemical Pharmacology 69 1681–1691.

Kyoko Ochiai, Mark Maienschein-Cline, Malay Mandal, Joseph R Triggs, Eric Bertolino, Roger Sciammas, Aaron R Dinner, Marcus R Clark & Harinder Singh., 2012, A self-reinforcing regulatory network triggered by limiting IL-7 activates pre-BCR signaling and differentiation, Nature ImmunologyVolume: 13,Pages: 300–307

LANGE EJ, BOERMAN EM, SEGAL SS, JACKSON WF., 2010 Differences in expression and function of ryanodine receptors between arteries and arterioles in the mouse (Abstract). FASEB J 24.

LI, C., WANG, X., VAIS, H., THOMPSON, C.B., FOSKETT, J.K. AND WHITE, C. 2007 Apoptosis regulation by Bcl-x(L) modulation of mammalian

LI, W. H., LLOPIS, J., WHITNEY, M., ZLOKARNIK, 1998, Cell-permeant caged InsP3 ester shows that Ca2+ spike frequency canale optimize gene expression, Nature 392, 936-941

MIYAZAKI, S. et all, 1993, Essential role of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor/Ca2+ release channel in Ca2+ waves and Ca2+ oscillations at fertilization of mammalian eggs, Dev. Biol 158, 62-78

MONKS, C. R. F., FRIEBERG, B. A., KUPFER, H., SCIAKY, N., KUPFER, A., 1998, Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells, Nature 395, 82-86

MUFTI R, BRETT S, TRAN C, ABD EL-RAHMAN R, ANFINOGENOVA Y, EL-YAZBI A, COLE W, JONES P, CHEN S, WELSH D., 2010 Intravascular pressure augments cerebral arterial constriction by inducing voltage-insensitive Ca2_ waves. J Physiol 588: 3983–4005,.

PINTON, P., et all, 2000, Reduced loading on intracellular Ca2+ stores and downregulation of capacitative Ca2+ influx in Bcl-2-overexpressing cells, , J. Biol. Chem. 275, 857-862

PINTON, P., GIORGI, C., SIVIERO, R., ZECCHINI, E. AND RIZZUTO, R., 2008, Calcium and apoptosis: ER-mitochondria Ca2+ transfer in the control of apoptosis. Oncogene, 27, 6407–6418.

POSTIC C, DENTIN R, DENECHAUD PD & GIRARD J., 2007 ChREBP, a transcriptional regulator of glucose and lipid metabolism. Annual Review of Nutrition 27 179–192

RONG, Y.P., AROMOLARAN, A.S., BULTYNCK, G., ZHONG, F., LI, X., MCCOLL, K., MATSUYAMA, S., HERLITZE, S., RODERICK, H.L., BOOTMAN, M.D. ET AL., 2008 Targeting Bcl-2-IP3 receptor interaction to reverse Bcl-2’s inhibition of apoptotic calcium signals. Mol. Cell, 31, 255–265.

RONG, Y.P., BULTYNCK, G., AROMOLARAN, A.S., ZHONG, F., PARYS, J.B., DE SMEDT, H., MIGNERY, G.A., RODERICK, H.L., BOOTMAN, M.D. AND DISTELHORST, C.W. ,2009,The BH4 domain of Bcl-2 inhibits ER calcium release and apoptosis by binding the regulatory and coupling domain of the IP3 receptor. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 106, 14397–14402.

SAKIYAMA H, WYNN RM, LEE WR, FUKASAWA M, MIZUGUCHI H, GARDNER KH, REPA JJ & UYEDA K., 2008 Regulation of nuclear import/export of carbohydrate response element-binding protein (ChREBP): interaction of an alpha-helix of ChREBP with the 14-3-3 proteins and regulation by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry 283 24899–24908.

SCHARENBERG, A. M., KINET, J. P., 1998, PtdIns-3,4,5-P3: A regulatory nexus between tyrosine kinases and sustained calcium signals, Cell 94, 5-8

SHIMADA M, MOCHIZUKI K & GODA T., 2011 Feeding rats dietary resistant starch reduces both the binding of ChREBP and the acetylation of histones on the Thrsp gene in the jejunum. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59 1464–1469.

STOLTZMAN CA, PETERSON CW, BREEN KT, MUOIO DM, BILLIN AN & AYER DE., 2008, Glucose sensing by MondoA:Mlx complexes: a role for hexokinases and direct regulation of thioredoxin-interacting protein expression. PNAS 105 6912–6917.

SZALAI, G., KRISHNAMURTHY, R., HAJNOCZKY, G., 1999, Apoptosis driven by IP3-linked mitochondrial calcium signals, EMBO J. 18, 6349-6361

THOMAS, D., LIPP, P., BERRIDGE, M. J., BOOTMAN, M. D., 1998, Hormone-evoked elementary Ca2+ signals are not stereotypic, but reflect activation of different size channel clusters and variable recruitment of channels within a cluster, J. Biol. Chem. 273, 27130-27136

TIAN G, SANDLER S, GYLFE E & TENGHOLM A., 2011 Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes 60 1535–1543.

TIAN G, SANDLER S, GYLFE E & TENGHOLM A., 2011 Glucose- and hormoneinduced cAMP oscillations in alpha- and b-cells within intact pancreatic islets. Diabetes 60 1535–1543.

TSE, F. W., TSE, A., 1999, Regulation of exocytosis via release of Ca2+ from intracellular stores, BioEssay 21, 861-865

W. NATHANIEL BRENNEN, D. MARC ROSEN, HAO WANG, JOHN T. ISAACS AND., 2012, Targeting Carcinoma-Associated Fibroblasts Within the Tumor Stroma With a Fibroblast Activation Protein-Activated Prodrug. JNCI J Natl Cancer Inst 104: 1320-1334

WANG Y, VERA L, FISCHER WH & MONTMINY M., 2009 The CREB coactivator CRTC2 links hepatic ER stress and fasting gluconeogenesis. Nature 460 534–537.

WHITE, C., LI, C., YANG, J., PETRENKO, N.B., MADESH, M., THOMPSON, C.B. AND FOSKETT, J.K., 2005, The endoplasmic reticulum gateway to apoptosis by Bcl-X(L) modulation of the InsP3R. Nat. Cell Biol., 7, 1021–1028.

WILD S, ROGLIC G, GREEN A, SICREE R & KING H., 2004 Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care 27 1047–1053.

WRAY S, BURDYGA T. ,2010 Sarcoplasmic reticulum function in smooth muscle.Physiol Rev 90: 113–178.

Xingguang Liu, Zhenzhen Zhan, Dong Li, Li Xu, Feng Ma, Peng Zhang, Hangping Yao & Xuetao Cao., 2011., Intracellular MHC class II molecules promote TLR-triggered innate immune responses by maintaining activation of the kinase Btk., Nature ImmunologyVolume: 12,Pages: 416–424.

YANG Y, MURPHY TV, ELLA SR, GRAYSON TH, HADDOCK R, HWANG YT, BRAUN AP, PEICHUN G, KORTHUIS RJ, DAVIS MJ, HILL MA., 2009 Heterogeneity in function of small artery smooth muscle BKCa: involvement of the beta1-subunit. J Physiol 587: 3025–3044,.

ZHU, L. P., et all, 1999, Modulation of mitochondrial calcium homeostasis by Bcl-2, J. Biol. Chem. 274, 33267-33273

BIBLIOGRAFIE

Year published:

Year published:

ABRAMOFF MD, MAGELHAES PJ, RAM SJ., 2004. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International 11: 36–42,

ALBERTS, B., BRAY, D., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WATSON, J. D. 1994, Molecular Biology of the Cell, Garland Publ. Inc., New York.

Amy N. Anzelon, Hong Wu & Robert C. Rickert, (2003) Pten inactivation alters peripheral B lymphocyte fate and reconstitutes CD19 function; Nature Immunology 4, 287 – 294 .

Andrea Oeckinghaus, Matthew S Hayden & Sankar Ghosh.,2011., Crosstalk in NF-κB signaling pathways., Nature ImmunologVolume: 12,Pages: 695–708Year published:.

APPELBLOM H, NURMI J, SOUKKA T, PASTERNACK M, PENTTILA KE, LOVGREN T & NIEMELA P., 2007 Homogeneous TR-FRET high-throughput screening assay for calcium-dependent multimerization of sorcin. Journal of Biomolecular Screening 12 842–848.

Arthur Weiss Year published:DOI.., 2010., The right team at the right time to go for a home run: tyrosine kinase activation by the TCR., Nature ImmunologyVolume: 11,Pages: 101–104.

ATTWELL, D., BUCHAN, A.M., CHARPAK, S., LAURITZEN, M., MACVICAR, B.A. AND NEWMAN, E.A., 2010, Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature, 468, 232–243.

BERKEFELD H, SAILER CA, BILDL W, ROHDE V, THUMFART JO, EBLE S, KLUGBAUER N, REISINGER E, BISCHOFBERGER J, OLIVER D, KNAUS HG, SCHULTE U, FAKLER B., 2006, BKCa-Cav channel complexes mediate rapid and localized Ca2_-activated K_ signaling. Science 314: 615–620,.

BERRIDGE MJ, BOOTMAN MD & RODERICK HL.,2003 Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology 4 517–529

BERRIDGE MJ., 2008. Smooth muscle cell calcium activation mechanisms. J.Physiol 586: 5047–5061,

BERRIDGE, M. J., 1993, Inositol triphosphate and calcium signalling, Nature 361, 315-325

BERRIDGE, M. J., 1997, Elementary and global aspects of calcium signalling, J. Physiol. 499, 291-306

BERRIDGE, M. J., 2000, The Versatility and Universality of Calcium Signalling, Nature Reviews, vol 1

BOERGESEN M, POULSEN LC, SCHMIDT SF, FRIGERIO F, MAECHLER P & MANDRUP S.,2011 ChREBP mediates glucose repression of peroxisome proliferator-activated receptor alpha expression in pancreatic β-cells. Journal of Biological Chemistry 286 13214

BOERMAN E, JACKSON W., 2008 Ca2_-activated K_ channels are controlled by Ca2_ influx through voltage-gated Ca2_ channels, not the release of Ca2 through ryanodine receptors in arteriolar smooth muscle (Abstract). FASEB J 22: 1142,.

BOOTMAN, M. D., LIPP, P., 1999, Calcium signalling: Ringing changes to the “bell-shaped curve”, Current Biology 9, R876-R878

BORISOVA L, WRAY S, EISNER DA, BURDYGA T., 2009 How structure, Ca2+ signals, and cellular communications underlie function in precapillary arterioles. Circ Res 105: 803–810,.

BOULAY, G., et all, 1999, Modulation of Ca2+ entry by polypeptides of the inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor (IP3R) that bind transient receptor potential (TRP): evidence for roles of TRP and IP3R in store depletion-activated Ca2+ entry, Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14955-14960

BRICAMBERT J, MIRANDA J, BENHAMED F, GIRARD J, POSTIC C & DENTIN R., 2010 Salt-inducible kinase 2 links transcriptional coactivator p300 phosphorylation to the prevention of ChREBP-dependent hepatic steatosis in mice. Journal of Clinical Investigation 120 4316–4331

BUKOSKI RD, BATKAI S, JARAI Z, WANG Y, OFFERTALER L, JACKSON WF, KUNOS G., 2002. CB(1) receptor antagonist SR141716A inhibits Ca2_-induced relaxation in CB(1) receptor-deficient mice. Hypertension 39: 251 257,

BUKOSKI RD, SHEARIN S, JACKSON WF, PAMARTHI MF., 2001. Inhibition of Ca2_-induced relaxation by oxidized tungsten wires and paratungstate. J. Pharmacol Exp Ther 299: 343–350,

BUSTELO, X. R., BARBACID, M., 1992, Tyrosine phosphorilation of Vav proto-oncogene product in activated B cell, Science 256, 1169-1199

COLLINS, T. J., LIPP, P., BERRIDGE, M. J., LI, W., BOOTMAN, M. D., 2000, Inositol 1, 4, 5-triphosphate-induced Ca2+ release is inhibited by mitochondrial depolarization, Biochem. J. 347, 593-600

CRABTREE, G. R., 1999, Generic signals and specific outcomes: Signalling through Ca2+, calcineurin and NF-AT, Cell 96, 611-614

DA SILVA XAVIER G, SUN G, QIAN Q, RUTTER GA & LECLERC I., 2010 ChREBP regulates Pdx-1 and other glucose-sensitive genes in pancreatic β-cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 402 252–257.

DENECHAUD PD, DENTIN R, GIRARD J & POSTIC C., 2008 Role of ChREBP in hepatic steatosis and insulin resistance. FEBS Letters 582 68–73.

Dennis C. Otero and Robert C. Rickert 2003. CD19 Function in Early and Late B Cell Development. II. CD19 Facilitates the Pro-B/Pre-B Transition, Immunol ; 171:5921-5930;

DRUGARIN, D. 1998, Imunologie moleculară, Edit. Mitron, Timișoara

DUBUQUOY C, ROBICHON C, LASNIER F, LANGLOIS C, DUGAIL I, FOUFELLE F, GIRARD J, BURNOL AF, POSTIC C & MOLDES M., 2011 Distinct regulation of adiponutrin/PNPLA3 gene expression by the transcription factors ChREBP and SREBP1c in mouse and human hepatocytes. Journal of Hepatology 55 145–153.

DUCHEN, M. R., 1999, Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signalling and cell death, J. Physiol. 516, 1-17

ERIKA B. WESTCOTT AND WILLIAM F. JACKSON., 2011. Heterogeneous function of ryanodine receptors, but not IP3 receptors, in hamster cremaster muscle feed arteries and arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol 300: H1616–H1630,

EROGLU, C. AND BARRES, B.A., 2010, Regulation of synaptic connectivity by glia. Nature, 468, 223–231.

ESSIN K, WELLING A, HOFMANN F, LUFT FC, GOLLASCH M, MOOSMANG S. 2007. Indirect coupling between Cav1.2 channels and ryanodine receptors to generate Ca2_ sparks in murine arterial smooth muscle cells. J Physiol 584: 205–219,

FELLNER SK, ARENDSHORST WJ. , 2005.Angiotensin II Ca2_ signaling in rat afferent arterioles: stimulation of cyclic ADP ribose and IP3 pathways. Am J Physiol Renal Physiol 288: F785–F791,

FELLNER SK, ARENDSHORST WJ. 2007, Voltage-gated Ca2_ entry and ryanodine receptor Ca2_-induced Ca2_ release in preglomerular arterioles. Am J. Physiol Renal Physiol 292: F1568–F1572,.

FOYOUZI-YOUSSEFI, R., et all, 2000, Bcl-2 decreases the free Ca2+ concentration within the endoplasmic reticulum, Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 5723-5728

GE Q, NAKAGAWA T, WYNN RM, CHOOK YM, MILLER BC & UYEDA K., 2011, Importin-a protein binding to a nuclear localization signal of carbohydrate response element-binding protein (ChREBP). Journal of Biological Chemistry 286 28119–28127.

GIANLUCA BARTOLOMMEI, FRANCESCO TADINI-BUONINSEGNI, MARIA ROSA MONCELLI, SANDRA GEMMA, CATERINA CAMODECA, STEFANIA BUTINI, GIUSEPPE CAMPIANI, DAVID LEWIS AND GIUSEPPE INESI., 2011, The Ca2+-ATPase (SERCA1) Is Inhibited by 4-Aminoquinoline Derivatives through Interference with Catalytic Activation by Ca2+, Whereas the ATPase E2 State Remains Functional, J. Biol. Chem. 286: 38383-38389.

Grzegorz Chodaczek, Veena Papanna, M Anna Zal & Tomasz Zal. (2012), Body-barrier surveillance by epidermal yδ TCRsNature ImmunologyVolume: 13,Pages: 272–282Year published:.

HAIXIN CHANG AND SUSAN S. SUAREZ., 2011,Two Distinct Ca2+ Signaling Pathways Modulate Sperm Flagellar Beating Patterns in Mice, Biol. Reprod. 85: 296-305.

HARR, M.W. AND DISTELHORST, C.W. 2010, Apoptosis and autophagy:

ISABELLE LECLERC, GUY A RUTTER, GARGI MEUR AND NAFEESA NOORDEEN., 2012 Roles of Ca2+ ions in the control of ChREBP nuclear translocation ,J Endocrinol, 213: 115-122.

Jiyoung Oh, Seol-Hee Kim,Sinae Ahn and Choong-Eun , 2012 Suppressors of Cytokine Signaling Promote Fas-Induced Apoptosis through Downregulation of NF-κB and Mitochondrial Bfl-1 in Leukemic T Cells; J Immunol 189:5561-5571

JOSEPH, S.K. AND HAJNOCZKY, G., 2007. IP3 receptors in cell survival and apoptosis: Ca2+release and beyond. Apoptosis, 12, 951–968.

KASS, G. E. N., ORRENIUS, S., 1999, Calcium signalling and cytotoxicity, Environ. Health Perspect. 107, 25-35

KOWLURU A., 2005 Novel regulatory roles for protein phosphatase-2A in the islet β cell. Biochemical Pharmacology 69 1681–1691.

Kyoko Ochiai, Mark Maienschein-Cline, Malay Mandal, Joseph R Triggs, Eric Bertolino, Roger Sciammas, Aaron R Dinner, Marcus R Clark & Harinder Singh., 2012, A self-reinforcing regulatory network triggered by limiting IL-7 activates pre-BCR signaling and differentiation, Nature ImmunologyVolume: 13,Pages: 300–307

LANGE EJ, BOERMAN EM, SEGAL SS, JACKSON WF., 2010 Differences in expression and function of ryanodine receptors between arteries and arterioles in the mouse (Abstract). FASEB J 24.

LI, C., WANG, X., VAIS, H., THOMPSON, C.B., FOSKETT, J.K. AND WHITE, C. 2007 Apoptosis regulation by Bcl-x(L) modulation of mammalian

LI, W. H., LLOPIS, J., WHITNEY, M., ZLOKARNIK, 1998, Cell-permeant caged InsP3 ester shows that Ca2+ spike frequency canale optimize gene expression, Nature 392, 936-941

MIYAZAKI, S. et all, 1993, Essential role of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor/Ca2+ release channel in Ca2+ waves and Ca2+ oscillations at fertilization of mammalian eggs, Dev. Biol 158, 62-78

MONKS, C. R. F., FRIEBERG, B. A., KUPFER, H., SCIAKY, N., KUPFER, A., 1998, Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells, Nature 395, 82-86

MUFTI R, BRETT S, TRAN C, ABD EL-RAHMAN R, ANFINOGENOVA Y, EL-YAZBI A, COLE W, JONES P, CHEN S, WELSH D., 2010 Intravascular pressure augments cerebral arterial constriction by inducing voltage-insensitive Ca2_ waves. J Physiol 588: 3983–4005,.

PINTON, P., et all, 2000, Reduced loading on intracellular Ca2+ stores and downregulation of capacitative Ca2+ influx in Bcl-2-overexpressing cells, , J. Biol. Chem. 275, 857-862

PINTON, P., GIORGI, C., SIVIERO, R., ZECCHINI, E. AND RIZZUTO, R., 2008, Calcium and apoptosis: ER-mitochondria Ca2+ transfer in the control of apoptosis. Oncogene, 27, 6407–6418.

POSTIC C, DENTIN R, DENECHAUD PD & GIRARD J., 2007 ChREBP, a transcriptional regulator of glucose and lipid metabolism. Annual Review of Nutrition 27 179–192

RONG, Y.P., AROMOLARAN, A.S., BULTYNCK, G., ZHONG, F., LI, X., MCCOLL, K., MATSUYAMA, S., HERLITZE, S., RODERICK, H.L., BOOTMAN, M.D. ET AL., 2008 Targeting Bcl-2-IP3 receptor interaction to reverse Bcl-2’s inhibition of apoptotic calcium signals. Mol. Cell, 31, 255–265.

RONG, Y.P., BULTYNCK, G., AROMOLARAN, A.S., ZHONG, F., PARYS, J.B., DE SMEDT, H., MIGNERY, G.A., RODERICK, H.L., BOOTMAN, M.D. AND DISTELHORST, C.W. ,2009,The BH4 domain of Bcl-2 inhibits ER calcium release and apoptosis by binding the regulatory and coupling domain of the IP3 receptor. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 106, 14397–14402.

SAKIYAMA H, WYNN RM, LEE WR, FUKASAWA M, MIZUGUCHI H, GARDNER KH, REPA JJ & UYEDA K., 2008 Regulation of nuclear import/export of carbohydrate response element-binding protein (ChREBP): interaction of an alpha-helix of ChREBP with the 14-3-3 proteins and regulation by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry 283 24899–24908.

SCHARENBERG, A. M., KINET, J. P., 1998, PtdIns-3,4,5-P3: A regulatory nexus between tyrosine kinases and sustained calcium signals, Cell 94, 5-8

SHIMADA M, MOCHIZUKI K & GODA T., 2011 Feeding rats dietary resistant starch reduces both the binding of ChREBP and the acetylation of histones on the Thrsp gene in the jejunum. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59 1464–1469.

STOLTZMAN CA, PETERSON CW, BREEN KT, MUOIO DM, BILLIN AN & AYER DE., 2008, Glucose sensing by MondoA:Mlx complexes: a role for hexokinases and direct regulation of thioredoxin-interacting protein expression. PNAS 105 6912–6917.

SZALAI, G., KRISHNAMURTHY, R., HAJNOCZKY, G., 1999, Apoptosis driven by IP3-linked mitochondrial calcium signals, EMBO J. 18, 6349-6361

THOMAS, D., LIPP, P., BERRIDGE, M. J., BOOTMAN, M. D., 1998, Hormone-evoked elementary Ca2+ signals are not stereotypic, but reflect activation of different size channel clusters and variable recruitment of channels within a cluster, J. Biol. Chem. 273, 27130-27136

TIAN G, SANDLER S, GYLFE E & TENGHOLM A., 2011 Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes 60 1535–1543.

TIAN G, SANDLER S, GYLFE E & TENGHOLM A., 2011 Glucose- and hormoneinduced cAMP oscillations in alpha- and b-cells within intact pancreatic islets. Diabetes 60 1535–1543.

TSE, F. W., TSE, A., 1999, Regulation of exocytosis via release of Ca2+ from intracellular stores, BioEssay 21, 861-865

W. NATHANIEL BRENNEN, D. MARC ROSEN, HAO WANG, JOHN T. ISAACS AND., 2012, Targeting Carcinoma-Associated Fibroblasts Within the Tumor Stroma With a Fibroblast Activation Protein-Activated Prodrug. JNCI J Natl Cancer Inst 104: 1320-1334

WANG Y, VERA L, FISCHER WH & MONTMINY M., 2009 The CREB coactivator CRTC2 links hepatic ER stress and fasting gluconeogenesis. Nature 460 534–537.

WHITE, C., LI, C., YANG, J., PETRENKO, N.B., MADESH, M., THOMPSON, C.B. AND FOSKETT, J.K., 2005, The endoplasmic reticulum gateway to apoptosis by Bcl-X(L) modulation of the InsP3R. Nat. Cell Biol., 7, 1021–1028.

WILD S, ROGLIC G, GREEN A, SICREE R & KING H., 2004 Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care 27 1047–1053.

WRAY S, BURDYGA T. ,2010 Sarcoplasmic reticulum function in smooth muscle.Physiol Rev 90: 113–178.

Xingguang Liu, Zhenzhen Zhan, Dong Li, Li Xu, Feng Ma, Peng Zhang, Hangping Yao & Xuetao Cao., 2011., Intracellular MHC class II molecules promote TLR-triggered innate immune responses by maintaining activation of the kinase Btk., Nature ImmunologyVolume: 12,Pages: 416–424.

YANG Y, MURPHY TV, ELLA SR, GRAYSON TH, HADDOCK R, HWANG YT, BRAUN AP, PEICHUN G, KORTHUIS RJ, DAVIS MJ, HILL MA., 2009 Heterogeneity in function of small artery smooth muscle BKCa: involvement of the beta1-subunit. J Physiol 587: 3025–3044,.

ZHU, L. P., et all, 1999, Modulation of mitochondrial calcium homeostasis by Bcl-2, J. Biol. Chem. 274, 33267-33273