Cefalosporine

CUPRINS

I. CEFALOSPORINE

I.1. STRUCTURǍ ȘI CLASIFICARE

I.2. Determinarea impurităților din antibiotice

I.2.1. Metode oficinale pentru analiza antibioticelor. Exemple selecționate.

II. NANOBIOTEHNOLOGII

II.1. Noutăți în nanomedicină

II.2. Nanoparticule în terapie

II.3. Evaluarea pericolelor și riscurilor la om

PARTEA PRACTICĂ

III. PROCEDEUL DE SINTEZĂ ȘI FUNCȚIONALIZARE AL SUPORTULUI NANOSTRUCTURAT

III.1. Sinteza ansamblelor nanostructurate

III.2. Metode de caracterizare ale suportului nanostructurat

III.2.1. Caracterizarea nanosuportului cu ajutorul spectrofotometriei în IR

III.2.2 Caracterizarea nanosuportului cu ajutorul microscopiei electronice de înaltă rezoluție

IV. TESTE MICROBIOLOGICE PENTRU EVIDENȚIEREA PROPRIETĂȚILOR ANTIBACTERIENE ALE DIFERITELOR TIPURI DE NANOSTRUCTURI

IV.1. Test de susceptibilitate pentru nanoparticulele provenite din materii prime organice

IV.1.1. Testarea activitǎții anti-microbiene a nanoparticulelor C-Metal cu proprietăți magnetice

IV.1.2. Testarea activitǎții anti-microbiene a nanoparticulelor C-Metal fǎrǎ proprietati magnetice

IV.2. Test de susceptibilitate pentru nanoparticulele provenite din materii prime anorganice

IV.2.1. Testarea activitǎții anti-microbiene a nanoparticulelor Fe3O4/oleic acid – core/shell

IV.2.2. Testarea activitǎții anti-microbiene a nanoparticulelor CoFe2O4 /oleic acid – core/shell

IV. 3. Testarea aderenței celulare pentru nanoparticulele provenite din materii prime anorganice

IV.3.1. Testarea aderenței celulare pentru nanosisteme de tip Fe3O4 /oleic acid – core/shell și CoFe2O4 /oleic acid – core/shell

IV.4. Testarea activității antimicrobiene a sistemelor de tip core / shell – C-Fe / antibiotic și core/shell/extra-shell – ferită/acid oleic/antibiotic

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

I. CEFALOSPORINE

I.1. STRUCTURǍ ȘI CLASIFICARE

Antibioticele sunt o grupă importantă de medicamente, foarte utilizate în terapia umană și veterinară. Prin definiție, structurile antibioticelor sunt de origine naturală sau sunt produse de sinteză, sub forma unui analog structural al unui antibiotic natural. Chimia antibioticelor este așa de variată, încât o clasificare chimică este dificil de realizat.

Cefalosporinele sunt antibiotice β-lactamice, care au ca nucleu de bază acidul 7-aminocefalosporanic, care cuprinde un inel dihidrotiazinic condensat cu un inel β-lactamic. De asemenea, sunt cele mai folosite dintre antibiotice, fiind structural și farmacologic înrudite cu penicilina.

Caracteristic cefalosporinelor este prezența unui sistem biciclic condensat (4+6), format dintr-un ciclu dihidrotiazinic și unul de azetidin – 2 – onă (sistem denumit cefem). Conform Chemical Abstracts, cefalosporinele sunt grupate ca derivați de 5-tiaazabiciclo-(4, 2, 0)-oct-2-en.

Actualmente, se folosesc cefalosporine de semisinteză, obținute prin adăugarea unor catene laterale, în poziția 7 a inelului β-lactamic și în poziția 3 a inelului dihidrotiazinic (1). În clasa cefalosporinelor se întâlnesc un număr mare de compuși, cu proprietăți fizice și chimice asemănătoare, dar care se deosebesc semnificativ prin activitatea și spectrul antibacterian și mai ales prin proprietățile farmacocinetice.

Figura 1. Structura chimică generală a cefalosporinelor

Cefalosporinele se clasifică în patru generații, în funcție de spectrul de activitate, iar caracteristica substanțelor din ultima generație este un timp de înjumătățire mai mare, ceea ce duce la o frecvență scăzută a administrării.

Fiecare nouă generație de cefalosporine este caracterizată de o activitate antimicrobiană mai mare față de germenii gram negativi, decât generațiile anterioare, în cele mai multe cazuri scăzând acțiunea față de germenii gram pozitivi (2, 3).

Clasificarea cefalosporinelor, după calea de administrare cuprinde două clase4:

cefalosporine parenterale: generația I: cefalotina, cefazolina, cefatrizin, cefapirina; generația a II-a: cefuroxim, cefamandol, ceforamid, cefonicid, cefotetan, ceftizoxim, cefoxitin; generația a III-a: cefotaxim, cefoperazona, cefpiron, ceftazidina, ceftriaxona, moxalactam, latamoxef; generația a IV-a: cefepima.

cefalosporine orale: cefalosporine orale „vechi”: generația I: cefalexina, cefadroxil, cefradina; generația a II-a: cefaclor. Cefalosporine orale „noi”: cefuroxim-axetil, ceftibuten, cefprozil, cefotaxim-hexetil, cefetamet, cefpodoxim, cefteram pivoxil.

În partea practică a acestei lucrări vor fi analizate sisteme nanostructurate pe care au fost depuse cefalosporine din generația a II-a și a III-a, unele din cele mai folosite în practica medicală.

Dintre cefalosporine din generația a II-a amintim cefaclorul, cefuroxima, ce au un spectru antibacterian destul de larg și o bună toleranță, dar sunt totuși antibiotice de a doua intenție de administrare, în funcție de rezultatele antibiogramei. Este vorba, în general, de molecule rezervate uzului intraspitalicesc.

Spectru antibacterian – este larg, cefuroxima și cefaclorul fiind active împotriva germenilor gram negativi, Haemophilus influenzae, E. coli, Proteus mirabilis, Klebsiellae pneumoniae, etc. Cel mai adesea sunt folosite în tratamentul infecțiilor respiratorii grave produse de Klebsiellae pneumoniae, dar sunt inactive împotriva Serratia marcescens și B. fragilis, prezintă activitate scăzută față de germenii gram pozitivi.

Cefaclor – acid (6R,7R)-7-{[(2R)-2-amino-2-fenilacetil]amino}-3-cloro-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo [4.2.0] oct-2-en- 2-carboxilic

Cefaclor are absorbție orală bună, dar care este scăzută în prezența alimentelor. De asemenea difuzează bine în țesuturi, excepție făcând LCR și se elimină în forma activă renal și biliar. Poate fi folosit în tratarea infecțiilor respiratorii. Cefaclorul este activ împotriva germenilor ca: coci gram pozitivi (stafilococi, cu excepția celor rezistenți la meticilină, streptococi, pneumococi); coci gram negativi (meningococi, gonococi, bacili gram pozitiv: difteric, clostrii); bacili gram negativi: H. influenzae, E. coli, Klebsiella, Proteus mirabilis, Shigella. Este indicat în infecții ORL, urinare, se leagă în proporție de 25% de proteinele plasmatice și se administrează oral 750 mg la 8 ore (4, 5).

Cefuroxima – acid (6R,7R)-3-{[(aminocarbonil)oxi]metil}-7-{[(2E)-2-(2-furil)-2-(metoxiimino)acetil]amino}-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxilic

Cefuroxima prezintă un spectru antibacterian larg și are efect bactericid. Este activă pe bacili gram negativ, inclusiv unele tulpini rezistente de E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus indol-pozitiv, H. influenzae rezistent la ampicilină, bacili gram negativ anaerobi, inclusiv Bacteroides fragilis, coci gram pozitiv ca streptococi, pneumococi, stafilococi. Cefuroxima este indicată în infecții cu stafilococi sensibili, H.influenzae (6), pneumonii produse de K. pneumoniae, infecții urinare, infecții cu enterobacteriacee, infecții chirurgicale. Oral se administrează cefuroximă axetil 125 – 500 mg de 2 ori/zi, dar se poate administra și i.v. în soluție sau i.m. în suspensie (7).

Cefalosporine din generația a III-a: cefoperazonă, cefotaximă, ceftriaxonă, sunt numite și cefalosporine cu spectru extins. Comparativ cu generațiile anterioare de cefalosporine, cele din a III-a generație au un spectru mai larg și o activitate mai pronunțată asupra microorganismelor gram negative, incluzând cele mai importante enterobacterii. Activitatea lor împotriva germenilor gram pozitiv este mai scazută decât a cefalosporinelor din prima generație, dar sunt foarte active pe streptococi. Deoarece au o bună penterabilitate în SNC, cefalosporinele din generația a III-a sunt utile în tratarea menigitelor produse de pneumococi, meningococi, în sepsis de cauză necunoscută (8, 9).

Spectru antibacterian – sunt mai puțin active față de germeni gram pozitiv, dar sunt eficace față de mulți bacili gram pozitiv, îndeosebi enterobacterii, inclusiv tulpini multirezistente, de exemplu: Serratia marcescens, Proteus indol – pozitiv.

Cefoperazona este activă față de Pseudomonas aeruginosa. In vivo, aceste cefalosporine au slabe acțiuni asupra bacililor izenterici și salmonelozelor, deoarece sunt hidrolizate de β-lactamaza cromozomială produsă de acestea. Cefalosporinele din generația a III-a, asociate sau nu cu aminoglicozide, pot fi folosite în infecții severe produse de germeni ca: Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Providencia, Serratia, specii de Hemophilus și în tratamentul meningitei, septicemiei, la bolnavi imunocompromiși, neutropenici, etc. Reacțiile adverse ale acestei clase sunt comune cefalosporinelor și în plus pot produce hemoragii, frecvent diaree, vomă, creșterea enzimelor hepatice, durere la locul injecției i.m., flebită locală la administrare i.v., etc.

Ceftriaxona – acid (6R,7R)-7-{[(2Z)-2-(2-amino-1,3-tiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetil] amino}-3-{[(2-metil-5,6-dioxo-1,2,5,6-tetrahidro-1,2,4-triazin-3-il)tio]metil}-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxilic

Ceftriaxona este inactivă după administrare orală. Prezintă o distribuție bună în țesuturi inclusiv în LCR. Concentrațiile active se mențin 24 ore. Eliminarea renală se face sub formă activă 60% și prin bilă 40% (10). Este o cefalosporină cu spectru de acțiune larg: bacterii gram negativ și pozitiv aerobe și unele bacterii anaerobe. Pseudomonas aeroginosa este afectat doar la concentrații mari. Se folosește în tratamentul unor infecții respiratorii, ale pielii, oaselor, urinare, intraabdominale, meningite, septicemii. Poate da tulburări dispeptice, litiază biliară, hiperbilirubinemie (11), neutropenie, rar la nou născuți poate induce anemie hemolitică (12) (13) (14), etc. Se administrează i.m. sau i.v. 1 – 2 g o dată pe zi, iar durata tratamentului este de 4 – 14 zile (15) (16).

Ceftriaxona într-o singură doză injectabilă de 250 mg și cefixima o singură doză administrată oral de 400 mg sunt tratamentul de elecție în gonoree, cu tulpini rezistente la penicilină.

Cefoperazonǎ – acid (6R,7S)-7-{[2-[(4-etil-2,3-dioxo-piperazin-1-carbonil)amino]-2-(4 hidroxifenil)acetil}amino]-3-[(1-metiltetrazol-5-il)sulfanilmetil]-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo [4.2.0]oct-2-en-2-carboxilic

Cefoperazona este inactivă după administrare orală. Nu trece în LCR. Se elimină predominant prin bilă. Specru antibacterian este asemănător ceftriaxonei, dar mai puțin activă pe Enterobacteriaceae (17). Se folosește în infecții cu bacili gram negativ la bolnavi cu insuficiență renală, în infecții cu Pseudomonas aeruginosa în asociere cu aminoglicozide, în tratarea pneumoniilor cu germeni gram negativ. Poate produce hemoragii, caz în care se administrează vitamina K și se controlează timpul Quick, frecvent produce diaree. Se administrează i.m. sau i.v. 1 – 2 g la 12 ore.

Cefotaxim – acid (6R,7R,Z)-3-(acetoximetil)-7-(2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)

acetamido)-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxilic

Cefotaxim – prezintă efect bactericid, nu se absoarbe oral, dar prezintă difuziune bună în țesuturi și lichide biologice (ascitic, din urechea medie), inclusiv ochi și LCR. Ca spectru antibacterian este mai activ pe germeni gram negativ.

Cefotaxim este rezistent la β-lactamază, iar în infecții cu anaerobi are acțiune moderată. Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter, Serratia sunt rezistenți (18) (19). Dintre posibilele efecte adverse amintim: diaree, aritmie la injectare rapidă, urticarie, rash, eozinofilie. Se metabolizează parțial hepatic și se elimină renal, parțial nemodificată. Trece în laptele matern, fără a avea efecte adverse asupra nou-născutului (20). Se administrează injectabil i.m. sau i.v. Doza pentru adulți este 1- 2 g/zi fracționat la 8 – 12 ore, până la maxim 12 g/zi (21).

I.2. Determinarea impurităților din antibiotice

I.2.1. Metode oficinale pentru analiza antibioticelor. Exemple selecționate.

Din moment ce majoritatea antibioticelor sunt obținute prin fermentare sau prin semi-sinteză din produși naturali, cantitatea totală de impurități prezentă poate fi chiar mare, deoarece comce în LCR. Se elimină predominant prin bilă. Specru antibacterian este asemănător ceftriaxonei, dar mai puțin activă pe Enterobacteriaceae (17). Se folosește în infecții cu bacili gram negativ la bolnavi cu insuficiență renală, în infecții cu Pseudomonas aeruginosa în asociere cu aminoglicozide, în tratarea pneumoniilor cu germeni gram negativ. Poate produce hemoragii, caz în care se administrează vitamina K și se controlează timpul Quick, frecvent produce diaree. Se administrează i.m. sau i.v. 1 – 2 g la 12 ore.

Cefotaxim – acid (6R,7R,Z)-3-(acetoximetil)-7-(2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)

acetamido)-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2-en-2-carboxilic

Cefotaxim – prezintă efect bactericid, nu se absoarbe oral, dar prezintă difuziune bună în țesuturi și lichide biologice (ascitic, din urechea medie), inclusiv ochi și LCR. Ca spectru antibacterian este mai activ pe germeni gram negativ.

Cefotaxim este rezistent la β-lactamază, iar în infecții cu anaerobi are acțiune moderată. Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter, Serratia sunt rezistenți (18) (19). Dintre posibilele efecte adverse amintim: diaree, aritmie la injectare rapidă, urticarie, rash, eozinofilie. Se metabolizează parțial hepatic și se elimină renal, parțial nemodificată. Trece în laptele matern, fără a avea efecte adverse asupra nou-născutului (20). Se administrează injectabil i.m. sau i.v. Doza pentru adulți este 1- 2 g/zi fracționat la 8 – 12 ore, până la maxim 12 g/zi (21).

I.2. Determinarea impurităților din antibiotice

I.2.1. Metode oficinale pentru analiza antibioticelor. Exemple selecționate.

Din moment ce majoritatea antibioticelor sunt obținute prin fermentare sau prin semi-sinteză din produși naturali, cantitatea totală de impurități prezentă poate fi chiar mare, deoarece compușii asociați, de asemenea formați în timpul procesului de fermentare, sunt de obicei foarte greu de îndepărtat. Din moment ce calea biosintezei urmărită în timpul fermentării nu este întotdeauna înțeleasă pe deplin, și reacțiile secundare nu sunt întotdeauna cunoscute, substanțele asociate nu sunt ușor de identificat. Acest lucru face ca identificarea și determinarea impurităților din antibiotice (sau alte substanțe de origine naturală) să fie atât de diferite față de cele ale produșilor pur-sintetici, unde calea sintezei și reactivii sunt perfect cunoscuți și intermediarii pot fi izolați și purificați de fiecare dată când este necesar. Anumite antibiotice există sub forma unui amestec de componenți cu activități diferite. Pentru acestea este interesantă determinarea compoziției amestecului.

Metodele oficinale de determinare a purității antibioticelor, sau a altor medicamente, sunt descrise în farmacopee. Farmacopeea Europeană (Ph. Eur.) și Farmacopeea Statelor Unite (USP) sunt cele mai folosite (22, 23). Dacă monografiile oficinale prescriu determinarea substanțelor asociate, folosirea tehnicilor de separare este aproape întotdeauna utilizată. Numărul de exemple în care impuritățile sunt determinate prin reacții chimice, precum reacțiile de culoare, este oarecum limitat și scade în favoarea tehnicilor de separare.

Un exemplu tipic de reacție de culoare este determinarea streptomicinei în dihidrostreptomicină (Ph. Eur.). Același lucru se aplică tehnicilor fizice precum analiza UV directă a unei soluții.

Un exemplu tipic este determinarea bacitracinei F în bacitracină (Ph. Eur.) sau determinarea tetraenelor în amfotericină B (Ph. Eur.). Astfel de metode nu vor fi discutate în continuare în acest subcapitol.

Pentru antibioticele mai complexe, testarea microbiologică rămâne la latitudinea fiecăruia de a alege o metodă. Se poate observa faptul că tehnica GC este doar rar folosită, tendința cea mai probabilă fiind de a o înlocui cu HPLC. TLC este rar utilizată în USP și mult mai frecventă în Ph. Eur. TLC nu a fost niciodată populară în USP, în timp ce în Ph. Eur. a fost metoda dorită pentru determinarea impurităților. Cu toate acestea, și TLC tinde să fie înlocuită de HPLC în Ph. Eur.

HPLC este clar metoda cea mai bună în monografiile oficiale. Ea permite deseori verificarea simultană a substanței active și determinarea impurităților. Astfel, atunci când HPLC este folosită pentru testare în Ph. Eur., este de asemenea utilizată pentru determinarea impurităților într-un test separat de substanțe înrudite. Numărul impurităților care sunt permise să apară la un anumit nivel (%) poate fi limitat la fel ca și suma totală de impurități. În cazul din urmă este indicat un nivel de desconsiderație, sub care peak-urile nu trebuie luate în considerație. Acesta este de obicei stabilit la 0.05% sau la 0.1%. În USP, astfel de teste de substanțe asociate sunt deseori absente.

Desigur, atunci când o metodă HPLC selectivă este folosită pentru verificare, impuritățile sunt limitate indirect de limita de conținut. Cu toate acestea, este doar o indicație pentru cantitatea totală de impurități și nu oferă nici o informație despre impuritățile individuale. Practica analitică modernă cere o determinare separată a impuritaților. O altă diferență între monografiile Ph. Eur. și USP este că prima prezintă o listă cu potențialele impurități ce pot fi limitate. În monografiile vechi, această informație lipsește.

USP menționează rareori numele unei impurități limitate de un test. În majoritatea cazurilor, nu este specificat care dintre impurități poate fi limitată prin metodele analitice prescrise. Aceasta înseamnă că utilizatorul unei astfel de metode nu are nici o informație despre selectivitatea și despre nivelul de validare a specificității ei. În general, se poate afirma că există informații foarte puține sau chiar deloc despre statusul de validare a metodelor farmacopeice, numai dacă sunt bazate pe metode publicate sau dacă astfel de informații sunt publicate în Farmeuropa (23) sau în forumul farmacopeic, caz care este foarte rar.

Electroforeza capilară (CE) este o altă tehnică foarte puternică de separare, dar aplicarea ei în monografiile farmacopeice este foarte rară. Acest lucru se poate datora faptului că majoritatea laboratoarelor sunt bine echipate cu instrumente HPLC și au dobândit suficiente cunoștinte despre tehnica HPLC. Este posibil faptul ca să nu fie urgentă instalarea unei alte tehnici de separare și astfel, mai puține metode noi sunt dezvoltate folosind CE.

De cele mai multe ori, impuritățile sunt identificate prin comparație cu substanțele de referință. Ar trebui subliniat faptul că aceeași entitate chimică ar putea purta un nume diferit atunci când apare în antibiotice diferite. Se poate concluziona că în mod sigur pentru antibioticele mai complexe sunt multe lucruri care rămân de facut.

Cefalosporinele sunt antibiotice β-lactamice semisintetice, înrudite cu penicilinele. În afara produșilor secundari care pot apărea în timpul semisintezei, produși de degradare variați pot fi de asemenea formați deoarece cefalosporinele sunt relativ instabile.

S-a raportat separarea cefalexinei din șase dintre substanțele ei înrudite folosind HPLC cu perechi de ioni pe o coloana C8 (24). Din moment ce fazele staționare C8 și C18 nu au prezentat o bună reproductibilitate a selectivității înspre cefalosporine, o metodă HPLC cu trapă ionică în regim izocratic folosind poli-(stiren-divinilbenzen) (PSDVB) ca fază staționară a fost dezvoltată, permițând separarea cefalexinei de nouă impurități potențiale. Rezultatele cantitative pentru standardele oficiale, probele în masă și formele de dozare farmaceutică au fost incluse. Peak-urile au fost identificate prin comparație cu compușii de referință ai potențialelor impurități și prin detecția în ordinea fotodiodelor (25). Aceeași tehnică de detectare a fost utilizată de asemenea, într-o altă metodă HPLC, pentru a oferi mai multe informații despre identitatea impurităților. Această metodă, ce folosește gradient de eluare, permite separarea cefalexinei de opt potențiale impurități (26).

O metoda HPLC în regim izocratic ce foloseste PSDVB ca fază staționară a fost descrisă pentru separarea cefradinei de impuritățile ei. Cea mai importantă substanță înrudită, mereu prezentă în cefradină, este cefalexina, care de asemenea generează produși de degradare. Aplicabilitatea metodei pentru analiza probelor în masă și a formelor de dozare farmaceutică a fost demonstrată. O impuritate cu identitate necunoscută a fost izolată prin HPLC, și structura ei a fost elucidată prin RMN și MS ca fiind 4’, 5’-dihidrocefradina (27).

Cefadroxilul a fost separat de nouă compuși rezultați din descompunerea lui și produși secundari, folosind o metoda HPLC cu pereche de ioni în regim izocratic, pe PSDVB. Metoda a fost utilizată pentru compararea standardelor oficiale și pentru a analiza un număr de probe comerciale (28). MECC s-a demonstrat a fi corespunzatoare pentru determinarea a zece substanțe asociate în cefalexină, precum și în cefadroxil, și a prezentat o selectivitate mai bună și un timp de analiză mai scurt decât în HPLC.

Două metode HPLC cu fază inversă în regim izocratic au fost comparate pentru analiza cefalotinei. Din moment ce nici una dintre cele două metode nu au fost pe deplin satisfăcătoare, cea mai bună metodă a fost adaptată înaintea introducerii în Ph. Eur.

Trei metode HPLC cu fază inversă în regim izocratic au fost examinate pentru capacitatea lor de a separa cefazolina de substanțele ei asociate și de produșii de descompunere. Metoda USP a dat cele mai bune rezultate.

O altă determinare a impurităților legate de proces și a produșilor de degradare a cefaclorului a folosit HPLC cu gradient de eluare. Metoda a fost aplicată în studii de stabilitate, în realizarea profilelor impurităților și analiza formulărilor farmaceutice. Metoda HPLC a fost de asemenea combinată cu detecția MS și ordinea fotodiodelor pentru identificarea unor impurități. Alte impurități au fost izolate prin cromatografie preparativă și structurile au fost determinate prin MS și RMN.

Prin analiza HPLC cu fază inversă a cefoxitinei și a componenților ei asociați folosind gradient de eluare au fost determinați patru compuși secundari.

O comparație între cefotaxima MECC și HPLC și impuritățile sale asociate a condus la rezultate concordante pentru ambele metode. Metoda MECC, care a permis determinarea a șapte impurități cunoscute și trei necunoscute în cefotaxima, a fost preferată, deoarece este mai rapidă și mai economică.

II. NANOBIOTEHNOLOGII

Ceea ce nanotehnologiile au în comun este faptul că acestea produc materiale cu cel puțin o dimensiune, care măsoară mai puțin de 100 nanomeri (nm), sau materiale cu cel puțin 2 din trei dimensiuni măsurând mai puțin de 100 nm.

Schimbarea proprietăților fizico-chimice, ce se produce atunci când dimensiunea unui material este redus la scară nanometrică deschide un domeniu imens de cercetare fundamentală și aplicată, numit nanoștiință. Potențialele aplicații și utilizări ale acestor materiale și a proceselor estimate să rezulte din ele au determinat o investire masivă în dezvoltarea de “nanotehnologii”, în cele mai diverse domenii (inclusiv în medicină, telecomunicații, electronică și transport). Predicțiile impactului economic și social par a fi extraordinare.

Figura 2. Gradul de mărime comparativ al nano-moleculelor

(Sursa: http://www.nanoprotex.ca/en/nanotechnology.html)

Fundația Națională pentru Știință din SUA precizează că impactul economic al nanotehnologiilor din întreaga lume va depăși un trilion de dolari până în 2015 și va genera mai mult de 2 miloane de locuri de muncă. Aceste perspective economice justifică eforturile substanțiale de cercetare și dezvoltare în domeniul nanotehnologiilor.

Nanobiotehnologia este un domeniu nou de cercetare, constiuind interfața dintre științele vieții și nanotehnologie. Acest domeniu propune exploatarea calități biomoleculelor și a proceselor pe care le implică pentru dezvoltarea unor materiale sau dispozitve cu activitate certă în medicină.

Cu toate acestea, cheltuielile sunt în contrast izbitor cu caracterul extrem de limitat al studiilor de impact al nanotehnologiilor asupra sănătății si cu finanțarea insuficientă pentru acest tip de investigații. Aceste tehnologii nu afectează doar sănătatea umană, dar de asemenea, ridică probleme sociale și etice. Din punct de vedere al sănătății tocmai proprietățile avantajoase ale nanoparticulelor pot ridica probleme.

Posibilele consecințe ale punerii în aplicare a nanotehnologiilor sunt la fel de imprevizibile precum cele legate de dezvoltarea computerelor personale sau internetului atunci când au început. Nanotehnologiile pot, de exemplu, facilita foarte mult procesul de separare a izotopilor radioactivi. Prin urmare, se poate presupune că fabricarea de arme nucleare va fi simplificată. Nanoparticulele, din cauza dimensiunii lor foarte mici, pot induce reacții biologice prezentând astfel pericol.

Deși nu există în prezent suficiente date pentru a evalua riscul real pentru sănătatea umană sau, impactul asupra ființelor vii și biosistemelor, mai multe argumente indică existența unei reactivitățti speciale a nanoparticulelor, reactivitate ce este legată de dimensiunea lor foarte mică în comparație cu reactivitatea observată la particule cu aceeași compoziție, dar de dimensiuni micrometrice sau mai mari.

Această reactivitate tisulară și celulară poate constitui un pericol pentru sănătatea oamenilor, dacă sunt expuși la aceste particule (inhalare, ingestie sau absorbție transcutanată).

II.1. Noutăți în nanomedicină

Noțiunea de nanomedicină a fost introdusă pentru prima dată de un laureat al premiului Nobel, fizicianul Richard P. Feynman și apoi în anii 1980-1990 de către Drexler și Freitas în anii 1990-2000 (29) (30).

Sfera de acțiune a bionanotehnologiei și eficacitatea privind posibilele utilizări ale nanomateriale în terapie se extinde, astfel nanotehnologia moleculară va putea dezvolta rapid tratamente medicale eficace, cu risc, cost și invazivitatea semnifcativ scăzute (31).

Noua ramură a nanotehnologiei, bionanotehnologia permite fabricarea personalizată, biofarmaceutică și biotehnologică a medicamentelor pentru a învinge problemele asociate cum ar fi (31):

solubiltatea scăzută

stabilitate chimică slabă după administre in vivo și in vitro

timp de înjumătățire scurt

biodisponibiltate slabă

potențiale efecte secundare.

Aplicațile de pionierat ale nanobiotehnologiei au dat posibiltatea reformulării unor condiționări în formule sigure și mult mai eficiente. Astfel nano-formulările din prima generație au inclus (32):

► nanoparticulele de tip albumin-bound

► chelați (gadoliniu)

► nanoparticule oxido-feroase

► nanoparticule din argint

► restorative (în stomatologie)

► lipozomi.

Ferofluidele (fluidele magnetice) sunt considerate a fi printre primele aplicații ale nanoștiințelor, verificate în practică medicală, de exemplu folosirea fluidelor magnetice în tratamentul SIDA (32).

Nanodispozitvele (nanocariers) sunt capabile să maximizeze activitatea terapeutică, să minimizeze efectele toxice secundare, să țintească celule specifice și nu țesuturile depășind astfel o serie de dezavantaje. Pentru a crește solubilitatea, pentru o penetrare facilă a membranelor celulare, pentru creșterea imunocompatibiltăți, pentru favorizarea asimilării celulare, pentru stabilirea cu certitudine a destinației finale a farmaconului sunt atașate pe nanodispozitive numeroase grupări funcționale.

Interesul crescut al cercetătorilor către nanotehnologie și posibilele aplicați medicale a dus la aparița unei noi discipline cunoscute ca nanomedicină. Datorită proprietăților fizico-chimice unice, dimensiunilor comparabile cu ale proteinelor, nanomateriale anorganice cu răspuns la câmpul magnetic pot fi, de asemenea, considerate ca viitoare molecule terapeutice. Această idee este relativ nouă și mai multe laboratoare de cercetare lucrează la explorarea aplicării terapeutice a nanomaterialelor anorganice (29).

Înțelegerea și dezvoltarea nanotehnologiei se bazează pe elucidarea proceselor biologice la nivel nanometric (33). Pentru a interacționa cu o țintă biologică, pe suprafața nanoparticulelor, care formează mijlocul nanobiomaterialelor se atașază un strat biologic sau molecular, de exemplu: anticorpi, biopolimeri (colagenul, diferite monostraturi de molecule care fac nanoparticula biocompatibilă), antibiotice, substanțe citostatice, etc. Ideal ar fi ca nanoparticulele să aibă și un strat fluorescent sau unul care își schimbă proprietățile optice.

Nanomaterialele compozite, cel mai adesea formate din magnetită și maghemită, dispersate în polimeri, biopolimeri sau matrice anorganice, controlabile prin acțiunea unui câmp magnetic extern, pot include structuri variate, cum ar fi: nanotuburi, nanofire, pelicule subțiri (nanofilme), fluide magnetice (ferofluide), fluide magnetoreologice, polimeri magnetici, materiale anorganice magnetice, structurile biologice modificate magnetic, particule magnetice funcționalizate cu diferite biomolecule (34).

Moleculele de legare sunt liniare și au grupări reactive la ambele capete – unul pentru a se atașa de nanoparticulă, iar celălalt pentru atașarea diverselor grupări biocompatibile (anticorpi, fluorofori în funcție de aplicație) și formează un strat adițonal la suprafața nanoparticulelor, pentru ca acestea să devină funcționale (33).

În bioaplicații medicale au fost utilizate cu succes, nanoparticule sintetice magnetice noi dezvoltate dar și particule magnetice biologice (magnetozomi produși de o bacterie magnetotactică).

Calitățile unui nanomaterial pentru a putea fi folosit în nanoformulări trebuie să fie (32):

inert chimic

fără impurități filtrabile

îmbătranire minimă

ușor procesabil

structură adecvată.

Pantarotto D. și colab. au arătat că nanoparticulele transportoare au fost dezvoltate ca o soluție pentru a depăși problemele legate de livrarea și eliberarea substanțelor medicamentoase cu solubiltate diferită: nanocristale funcționalizate cu substanțe medicamentoase, nanoparticule solide de lipide (SLN), transportoare lipidice nanostructurate (NLC), nanoparticule din conjugate medicament-lipid (LDC) (35).

Punctul cuantic (Quantum Dot) poate oferi posibilitatea ieftină și ușoară de verificare a unei probe de sânge, pentru stabilirea prezenței în același timp a difertelor tipuri virusuri și pentru observarea schimbărilor celulare complexe și evenimentelor asociate cu boala, furnizând indici valoroase pentru dezvoltarea viitoarelor produse farmaceutice și terapeutice.

II.2. Nanoparticule în terapie

Unul din factorii cheie în creșterea și răspândirea celulelor tumorale este procesul de angiogeneză, care reprezintă dezvoltarea de vase sanguine în condiții normale sau patologice (36). Vasele de sânge se provizionează cu oxigen și alte elemente nutritive celulele tumorale, permițându-le să crească, să migreze și să metastaze la diferite organe. Angiogeneza tumorii este declanșată în principal de factori mitogeni specifici endoteliali, cum ar fi factorul endotelial de creștere vascular (VEGF), factorul de crestere al fibroblastilori primari (bFGF), factorul de creștere derivat plachetar (PDGF) și transformarea factorului de crestere-beta (TGF-β). Spre deosebire de vasele sanguine normale, vasele de sange tumorale sunt hemoragice și foarte permeabile pentru plasmă (37).

Încă din anul 1971, Dr. Judah Folkman a propus ideea de angiogeneză și rolul său în creșterea tumorii, inițiând ideea de tratare a cancerului cu ajutorul agenților antiangiogenici (37). Există numeroase molecule anti-angiogenice în diferite faze ale studiilor clinice; multe dintre ele au fost aprobate ca terapie pentru cancer (38). Din păcate, unele dintre aceste medicamente au prezentat semne de toxicitate.

În literatura de specialitate a fost raportat și faptul că nanoparticulele de aur pot inhiba proliferarea celulelor endoteliale mediate VPF/VEGF-165 in vitro și pot reduce acumularea in vivo. In vitro, fosforilarea, eliberarea de calciu intracelular și activarea RhoA au fost reduse în mod substanțial prin inhibarea VEGF165 de către NP de aur.

In vivo, NP de aur au fost administrate pe o ureche de șoarece mascul, care a fost infectat în prealabil cu adenovirus. Rezultatele tratamentului cu NP de aur au demonstrat reducerea angiogenezei și formarea de edeme.

Mielomul multiplu (MM) este o tulburare a celulelor plasmatice, iar experimentele cu NP de aur au arătat o inhibare, a proliferării celulelor în mielomul multiplu (39). Mulți factori de creștere (VEGF, insulina ca factor de crestere-I (IGF-I) și TNF-α) au fost raportati ca fiind responsabili pentru creșterea celulelor de mielom multiplu și proliferarea acestora.

NP de aur au fost, de asemenea, utilizate în studiul tratamentelor pentru MM, iar rezultatele studiilor au condus la oprirea ciclului celular în faza G-1, urmat de reglarea în p21 și p27, inhibând astfel proliferarea celulelor (40).

În alte studii, aurul conjugat cu anticorpi anti-VEGF (AbVF) au indus apoptoza dependentă de doză, în comparație cu NP de aur sau AbVF singure folosite pentru tratamentul leucemiei limfocitare cronice-B (LLC-B) (41).

II.3. Evaluarea pericolelor și riscurilor la om

Este necesar să se efectueze teste de toxicitate, ce pot determina rapid efectele toxice ale nanoparticulelor, trebuie să se realizeze studii asupra mecanismelor prin care NP acționează asupra organismului. Relațiile doză-răspuns trebuie să integreze diverși indicatori care contează pentru aceste mecanisme. Aceste studii trebuie să includă studii pe animale pentru a analiza efectele tisulare și sistemice. Din cauza dimensiunii și suprafeței nanoparticulelor trebuie să fie evaluate in mod sistemic. Teste toxicologice standardizate trebuie să fie efectuate în mod sistematic in timpul punerii in aplicare a tuturor noilor tipuri de nanoparticule fabricate.

Efecte toxice

Indiferent de forma lor, particulele vor fi depuse în căile respiratorii în funcție de diametrul lor aerodinamic mediu, Da, care corespunde dimensiunilor unei particule sferice cu o densitate relativă de 1 și un comportament aerodinamic identic cu cel al unei particule considerate.

Eficiența depunerii în sistemul respirator crește atunci când dimensiunea particulelor scade de la 0.1 la 0.01 µm. La 1nm, 80% din particule sunt oprite în nas (și pot migra apoi spre creier).

În general, este probabil ca procesele generatoare de nanomaterialele în fază de gaz sau utilizarea sau producerea de nanomateriale sub formî de pulberi sau suspensii soluții să prezinte cel mai mare risc pentru eliberarea de nanoparticule.

Toxicitatea NP asupra florei și faunei este practic necunoscutî. Agregate coloidale de nano-C60 blocheazî creșterea în mediul de cultură a bacteriilor Ecsherichia Coli și Bacilis subtilis la concentrații mai mici de 0.4 mg/l.

Creșterea rădăcinii de la 5 soiuri de plante (porumb, castreveți, fasole , varză, morcovi) este afectată de o expunere scurtă la NP de alumină. Această inhibiție poate fi evitată dacă NP sunt încărcate cu fenantren, iar moleculele ocupă potențiale situri de legare.

Experiențele foarte rare cu animale acvatice confirmă existența unor diferențe importante între toxicitatea nanomaterialelor în aceeași familie în funcție de tratamentul chimic sau prezența impurităților.

Supraviețuirea unui estuary zooplankton este redusă cu 20% la concentrații de 1.62 ppm a nanotuburilor de carbon cu un singur perete în timp ce același material purificat prin dializă nu este toxic. Efecte subletale au fost observate la un pește de apa dulce, bas negru (Micropterus salmoides) expus treptat la 0.5 ppm fulerenă, timp de 48 de ore. Comparativ cu lotul martor, peroxidarea lipidelor cerebrale a crescut în mod semnificativ în timp ce a scăzut în branhii și ficat; nivelul total de glutation a scăzut în branhii.

Mecanismul prin care NP redox-active pot fi pătrunde în creierul de pește este probabil similar cu cel observat la unele mamifere, unde pătrunderea se face prin transport selective, prin nervul olfactiv la bulbul olfactiv. Cu toate acestea, ele arată că unele NP traversează membranele celulare și trebuie să fie considerate a avea potențial biocumulativ.

Observăm că această proprietate contrazice faptul general acceptat că substanțele chimice cu o masă moleculară mai mare de 700 Daltoni nu sunt biocumulative. Aceastăobservație confirmă faptul că evalurile riscului de mediu pentru NP nu pot fi realizate în conformitate cu modelele acceptate pentru substanțele chimice.

Cu toate acestea, rezultatele testelor de laborator, efectuate în conformitate cu metodele utilizate pentru substanțele chimice, nu ne determină să credem că organismele vii (microorganisme, nevertebrate, vertebrate, plante) pot fi afectate de expunerea la nanomateriale.

Nanotehnologiile trebuie să fie dezvoltate într-o manieră sigură și responsabilă. Principiile etice aplicabile trebuie să fie respectate și de asemenea, riscurile posibile pentru sănătate, securitate și mediu înconjurator.

PARTEA PRACTICĂ

III. PROCEDEUL DE SINTEZĂ ȘI FUNCȚIONALIZARE AL SUPORTULUI NANOSTRUCTURAT

Sinteza și caracterizarea ansamblelor nanostructurate s-a realizat prin parcurgerea următoarelor etape:

Sinteza nucleului nanostructurat a presupus obținerea unor nanostructuri cu diametre cuprinse între 5 și 20 nm, aceasta fiind realizată prin procesare în plasmă pentru varianta metal-carbon și prin precipitare în mediu apos pentru ferite.

Funcționalizarea primară a avut drept scop obținerea învelișului (shell) nepolar al nanoparticulei (pentru ferite), ce permite dispersarea acestora în solvent nepolar sau slab polar (polaritatea solventului este legată de polaritatea restului hidrocarbonat al acidului oleic, existența unei duble legături permițând interacția cu solvenți mai polari ca solvenții hidrocarbonați – spre exemplu eteri). În acest scop a fost ales acidul oleic datorită polarității grupării carboxil, ce permite interacția cu nanoparticula nefuncționalizată și a restului hidrocarbonat cu număr mare de atomi de carbon, ce permite formarea unui înveliș protector nepolar la o distanță suficient de mare de nucleu (distanța mare față de nucleu favorizează accesul difuzional al moleculelor adsorbite pe suprafața nepolară).

Caracterizarea suportului nanostructurat a fost realizată prin spectrometrie în infraroșu și microscopie electronică de înaltă rezoluție – metode ce permit evidențierea formării shell-ului precum și vizualizarea efectivă a ansamblelor nanostructurate, cu posibilitatea estimării dimensiunilor acestora.

III.1. Sinteza ansamblelor nanostructurate

Pentru nanoparticulele metal-carbon etapele de prelucrare ce urmează procesului de obținere în plasmă implică următoarele operații (42):

răcirea amestecului de reacție primar;

separarea suspensiei: magnetic sau prin microfiltrare la vid, spălare preliminară, uscare la 50oC;

extracție la Soxhlet a masei de reacție brute cu benzen

separare compuși hidrocarbonați;

uscare la 105oC;

extracție la Soxhlet a produsului cu diclormetan

separare compuși grei;

uscare la 105oC;

extracție la Soxhlet a produsului cu o-diclorbenzen

separare fracție fulerenică;

uscare la 250oC;

spălare cu cloroform, uscare la 250oC;

tratare cu amestec fierbinte, concentrat, de HCl/HNO3 în raport 3:1;

spălare finală cu apă ultrapură, uscare la 250oC.

Nanoparticulele de tip metal-carbon obținute pe această cale au fost utilizate direct pentru adsorbția substanțelor active pentru obținerea complecșilor nanostructurați.

Pentru nanoparticulele pe bază de ferită etapele de prelucrare implică următoarele operații (43) (44):

prepararea soluțiilor de clorură ferică, sulfat feros și hidroxid de sodiu;

precipitarea nanoparticulelor de ferită din soluție apoasă de clorură ferică și sulfat feros cu hidroxid de sodiu;

separarea magnetică și spălare de 3 ori (cu separare magnetică intermediară) cu apă ultrapură;

separare magnetică finală și uscare la 105oC;

funcționalizare cu acid oleic în soluție apoasă la reflux în cuptor de microunde;

separare magnetică și spălare de 3 ori cu apă ultrapură (cu separare magnetică intermediară);

spălare cu solvent polar (metanol) de puritate HPLC, separare magnetică și uscare la 105oC;

dispersare în cloroform;

separare magnetică pentru eliminarea materialului nedispersat;

evaporare la vid pentru eliminarea completă a solventului de dispersare;

uscare la 105oC.

În urma prelucrărilor prezentate au fost obținute materiale pe bază de nanoparticule de ferită cu înveliș nepolar, dispersabile complet în solvenți cu polaritate mică și medie (nanoparticulele se consideră a fi complet dispersate în momentul obținerii unei soluții clare – similar dizolvării – fără reziduu de produs solid, dispersia obținută este stabilă nedefinit în prezența sau absența unui cânp magnetic exterior). Materialul obținut pe această cale a fost utilizat în etapele ulterioare de fixare a substanțelor active.

III.2. Metode de caracterizare ale suportului nanostructurat

Caracterizarea suportului nanostructurat a fost realizată cu ajutorul a două tehnici moderne și precise de caracterizare a nanostructurilor, spectrofotometrie în infraroșu (IR) și microscopie electronică de înaltă rezoluție (HRTEM).

Prin metoda spectrofotometrică în infraroșu a fost pusă în evidență formarea învelișului (shell-ului) nepolar pentru ferite, toate acestea realizându-se prin comparație între spectrul IR al acidului oleic, spectrul IR al feritei fără înveliș și spectrul IR al feritei dispersate.

Ulterior s-a realizat o comparație între spectrele IR ale feritei dispersate cu spectrele IR ale ansamblului nanostructurat final, cu scopul de a evidenția fixarea compusului activ.

Pentru variantele metal-carbon au fost comparate spectrele IR ale materialului inițial cu acela al nanomaterialului cu substanța activă depusă.

III.2.1. Caracterizarea nanosuportului cu ajutorul spectrofotometriei în IR

Tehnica de lucru folosită pentru analiza suportului nanostructurat prin spectrometria IR:

Spectrometria FT-IR – spectrele FT-IR au fost obținute cu ajutorul unui spectrometru Thermo Electron 6700 cuplat cu modul Raman cu laser de excitare de tip YAG la 1064 nm (datorită lungimii de undă mai mari se reduce fluorescența, un element ce poate pune probleme înregistrării spectrelor), cu putere reglabilă între 0 și 1.5W.

Pentru înregistrarea spectrelor FT-IR a fost utilizat un dispozitiv ATR cu simplă reflexie de tip Smart Performer, cu presarea controlată a probei pe un cristal de ZnSe, condițiile de analiză: rezoluție 4 cm-1, mediere pe 32 scan-uri, viteza oglinzii mobile 0.6 cm/sec (spectrometrul FT-IR utilizat folosește un interferometru tip Michelson pentru producerea interferogramei), background-ul fiind procesat în aceleași condiții de analiză. Pentru dispozitivul ATR de introducere a probei folosit, cantitatea de probă necesară nu este mai mare de 5 mg datorită unui diametru mic a cristalului ZnSe (2 mm), parcursul prin probă fiinde de 1 µm. Proba se introduce direct pe cristal fără nici o prelucrare suplimentară.

Figura 3. Spectrul FT-IR al suportului C-Fe (B-A)

Figura 4. Spectrul FT-IR al suportului Fe3O4 cu shell de acid oleic

Figura 5 Spectrul FT-IR al suportului C-Fe (T)

Figura 6. Spectrul FT-IR al acidului oleic

Spectrele FT-IR pentru substratul nanostructurat C-Fe (B-A) și C-Fe (T) arată o absorbție continuă și nespecifică în infraroșu, dependentă de tipul de dispozitiv specific utilizat pentru introducerea probei. Utilizând ATR, ca și pentru substanțele de referință, au fost obținute spectrele din figurile 3 și 5. Deși nu au putut fi evidențiate picuri specifice, informația spectrală este utilă datorită evidențierii picurilor specifice cefalosporinelor în cazul analizelor probelor funcționalizate.

De asemenea, este semnificativă lipsa picurilor specifice carbonului amorf, fapt ce confirmă faptul că materialul carbonic practic nu conține decât forme de carbon legat în structuri de tip grafenic sau nanotuburi. Acest fapt este determinat de oxidarea completă a carbonului amorf la tratarea cu amestec de acizi puternic oxidant, la cald, în etapele de purificare a materialului carbonic.

Pentru materialul nanostructurat pe bază de Fe3O4, funcționalizat cu acid oleic, se poate observa, prin comparație cu spectrul acidului oleic de referință, prezența benzilor specifice de absorbție mai intense în spectrul compusului funcționalizat (figurile 4 și 6), ~2800 respectiv ~2900 cm-1 pentru vibrațiile C-H și ~1700 cm-1 pentru C=O (pentru banda carbonil, scăderea în intensitate a fost asociată cu interacția puternică între oxigen și nanoparticula de ferită, ce conduce la modificarea constantei de forță a legăturii).

III.2.2 Caracterizarea nanosuportului cu ajutorul microscopiei electronice de înaltă rezoluție

O altă metodă avansată de caracterizare folosită a fost microscopia electronică prin transmisie, metodă ce a permis evidențierea unor detalii structurale specifice pentru materialele utilizate. În figurile 7, 8 sunt prezentate imagini TEM si HR-TEM ale nanoparticulelor metal-carbon, respectiv în figura 9 sunt prezentate imagini pentru ferită.

Analizele de microscopie electronică au fost realizate cu un microscop de transmisie electronică de înaltă rezoluție Tecnai G2 F30 S-TWIN echipat cu detector detector dispersiv în energie – EDS și detector de pierdere de energie de electroni EELS. În modul de oprerare în transmisie microscopul functionează la 300kV, rezoluția liniară fiind de 1Ä iar cea punctuală de 2 Ä.

Pentru analiză, probele au fost pregătite astfel: pulberile au fos suspendate în alcool etilic absolut, au fost ultrasonicate timp de 5 minute pentru a dispersa particulele aglomerate și depuse pe o grilă de cupru acoperită cu un strat de grafit, conductor.

În figura 8 pot fi identificate morfologii de tip 1D care sunt caracteristice pentru nanotuburile de carbon. Dimensiunea medie a nanotuburilor de carbon este în diametru de 7-8 nm și o lungime medie de 300-400 nm. La rezoluție mare se poate evidentia natura nanotubului de C, nanotuburile obținute fiind de tipul multiwall.

În cazul figurii 9 pot fi identificate atât nanoparticulele metalice cât și nanoparticulele de C. Este de menționat faptul că nanoparticulele metalice, cu diametru mediu de 10-12 nm, este încastrat în matricea carbonică de tip “onion like carbon”, cu diametru de aproximativ 30 nm.

În cazul feritelor obținute, în imaginile TEM și HR-TEM, figura 9, pot fi puse în evidență particule nanometrice având formă sferică și dimensiuni de 2-5 nm, cu o distribuție gaussiană.

Figura 7. Imagini TEM și HR-TEM ale nanotuburilor de carbon la diferite nivele de mărire.

Figura 8. Imagini TEM și HR-TEM ale nanoparticulelor metal-carbon la diferite nivele de mărire.

Figura 9. Imagini TEM și HR-TEM ale nanoparticulelor pe bază de ferită.

IV. TESTE MICROBIOLOGICE PENTRU EVIDENȚIEREA PROPRIETĂȚILOR ANTIBACTERIENE ALE DIFERITELOR TIPURI DE NANOSTRUCTURI

Pentru evidențierea efectului eliberării controlate a cefalosporinelor și a avtivității antibacteriene ale acestora din complexele nanostructurate sintetizate de tipul: C-Metal – C-Fe(hexan), C-Fe(toluen), C-Fe(benzen-anilinǎ), C-Cu(hexan), C-Al(hexan), C-C(hexan) -, au fost conduse o serie de teste microbiologice descrise în cele ce urmează.

Au fost constatate efecte ponderabile pentru toate variantele de adsorbție a substanței active pe suportul nanostructurat, precum și pentru unele tipuri de suport ca atare.

IV.1. Test de susceptibilitate pentru nanoparticulele provenite din materii prime organice

Metoda folosită pentru efectuarea antibiogramei a fost metoda difuzimetrică. Dacă pe suprafața de geloză însămânțată uniform cu germenul de cercetat, se plasează într-un punct un disc care conține o cantitate fixă de nanoparticule, acestea din urmă vor difuza în geloză, concentrația de nanoparticule în mediu scăzând proporțional cu distanța de la punctul de plecare (de la disc), nu în raport aritmetic, ci logaritmic.

Pentru a obține o zonă de inhibiție dublă, concentrația din disc trebuie să fie de 4 ori mai mare sau germenul cercetat să fie de 4 ori mai sensibil.

Germenul însămânțat nu crește în aria concentrației de antibiotic când se depășește concentrația minimă inhibitorie. Aceasta din urmă corespunde cu limita zonei de inhibiție.

Aflarea indirectă a concentrației minime inhibitorii se bazează pe premiza că există o relație liniară între dimensiunea zonei de inhibiție și concentrația minimă inhibitorie. Pentru aceasta s-a determinat, pe un număr mare de germeni, concomitent, dimensiunea zonelor de inhibiție în milimetri, obținută cu discuri cu conținut fix de complex nanostructurat.

Metoda difuzimetrică în suprafață este cel mai ușor de executat și permite obținerea de informații semnificative, asupra sensibilității unui germen, față de mai multe tipuri de complex nanostructurat.

Materiale utilizate pentru determinarea activitǎții antimicrobine: cutii Petri cu fund perfect plan, rotunde sau pătrate, cu latura de 150 mm, curate și sterile. Acestea au fost utilizate în scopul preparării mediului specific pentru antibiogramă.

Mediul de cultură trebuie să conțină calități constante, de la un lot la altul, să fie liber de substanțe inhibitoare. A fost utilizat mediul Mueller – Hinton original, fără glucoză și cu un pH riguros determinat înainte de utilizare, cuprins între 7,2 – 7,4.

Germenii martori de referință – pe plan internațional se recomandă germenul staphylococcus A.T.C.C. 25923. Sensibilitatea acestui germen la antibiotice, în condiții de conservare corespunzătoare este relativ fixă și CMI corespunzătoare antibioticelor nu va varia pentru determinări repetate, cu mai mult de 0,01g/mL, pentru penicilină, 0,1g/mL pentru cefalotină și cu cel mult 0,4g/mL carbenicilină.

Discurile impregnate cu cantități fixe de nanoparticule au 6,3 mm diametru, așa cum prevăd recomandările O.M.S. Se folosesc discuri, de preferință, de hârtie absorbantǎ, neutră, biologic inactivă și fără impurități, care ar putea influența acțiunea nanoparticulelor sau creșterea diverșilor germeni. Discurile trebuie să fie marcate clar, pe ambele fețe, cu simbolul antibioticului respectiv. Discurile trebuie să conțină o cantitate bine precizată de nanoparticule, pe care să o elibereze în mod uniform și constant.

Standardul turbidimetric de sulfat de bariu – pregătirea suspensiilor microbiene se face separat pentru fiecare germen de referință și pentru fiecare germen "sălbatic" de cercetat. Suspensiile microbiene sunt lăsate să se dezvolte – eventual agitate – la 35°C, timp de 3-6 ore, până se observă o ușoară turbiditate, după care vor fi ajustate turbidimetric (fie prin diluție, fie prin prelungirea perioadei de incubare) față de standardul de sulfat de bariu. Astfel, suspensiile microbiene conțin germeni, care se află toți în aceeași fază de creștere și anume în faza de multiplicare logaritmică. Suspensiile microbiene, odată ajustate, se folosesc în decurs de 15 minute.

Rigla cu dimensiuni milimetrice sau un șubler se folosește pentru măsurarea diametrelor zonelor de inhibiție, produse de diferitele antibiotice față de germenii de referință.

Discurile conținând cantități determinate de nanoparticule sunt dispuse pe plăci cu mediul Mueller – Hinton, însămânțate cu un inoculum cu densitate standard din tulpina de testat.

Se măsoară cu atenție diametrele zonelor de inhibiție obținute pentru fiecare disc cu nanoparticule, față de germenul de cercetat. În funcție de dimensiunea zonelor de inhibiție se exprimă rezultatul obținut: sensibil, rezistent sau intermediar. Erorile posibile de tehnică din antibiograma difuzimetrică sunt eficient corectate prin utilizarea concomitentă a tulpinilor de referință, ca martori de sensibilitate.

Microcomprimatele de cefalosporine folosite au fost procurate de la firma HiMedia Laboratories. Aceste microcomprimate sunt strict standardizate, au o încarcatură de antibiotic conformă cu normele stabilite de către NCCLS, USA.

Pentru efectuarea corectă a antibiogramelor prin metoda difuzimetrică s-a procedat astfel: pe suprafața unui mediu gelozat nutritiv Mueller Hinton, turnat într-o cutie Petri și însămânțat uniform cu suspensia bacteriană Staphylococcus Aureus și Escherichia coli – aflate în faza de creștere exponentială, au fost depuse microcomprimatele pe hârtie imbibată cu o cantitate cunoscutǎ de antibiotic.

Au fost însămânțați germeni martori de referință, Staphylococcus aureus ATCC 25923 și Escherichia Coli ATCC 25922. Microcomprimatele au fost scoase de la frigider, înainte cu 1-2 ore, pentru a se echilibra termic. Distanța minimă între microcomprimate și marginea cutiei Petri a fost de 15 mm, iar între centrele a două discuri vecine de 30 mm. Antibiogramele au fost incubate la o temperatura de 37o, timp de 24 de ore.

După acest interval s-au citit rezultatele antibiogramelor, măsurându-se cu ajutorul unei rigle gradate în mm diametrul zonelor de inhibiție complete, din jurul fiecărui microcomprimat/godeu cu pulbere nanostructurată.

IV.1.1. Testarea activitǎții anti-microbiene a nanoparticulelor C-Metal cu proprietăți magnetice

Diametrele zonelor de inhibiție (mm) obținute pentru nanoparticulele C-Metal cu proprietăți magnetice sunt prezentate în tabelul nr. 1.

Tabel 1. Diametrele zonelor de inhibiție pentru nanoparticule C-Metal cu propietăți magnetice

IV.1.2. Testarea activitǎții anti-microbiene a nanoparticulelor C-Metal fǎrǎ proprietati magnetice

Diametrele zonelor de inhibiție (mm) obținute pentru nanoparticulele C-Metal lipsite de proprietăți magnetice sunt prezentate în tabelul nr. 2 (45).

Tabel 2. Diametrele zonelor de inhibiție pentru nanoparticule C-Metal lipsite de propietăți magnetice

Testarea activitǎții anti-microbiene a nanoparticulelor C-C

Diametrele zonelor de inhibiție (mm) obținute pentru nanoparticulele C-C sunt prezentate în tabelul nr. 3.

Tabel 3. Diametrele zonelor de inhibiție pentru nanoparticule C-C

Concluzii

Diametrul crescut al zonei de inhibiție pentru particulele C-Cu este probabil datorat transferului ionului de Cu transmembranar ca urmare a interacției suprafeței nepolare de carbon cu membrana fosfolipidică a celulei bacteriene.

Prin metoda difuzimetrică a fost demonstratǎ citotoxicitatea nanoparticulelor de tip C-Metal cu sau fǎrǎ proprietǎți magnetice dar și de tip C-C.

Corelarea ariilor de inhibiție cu calea de sinteză a nanoparticulelor (de exemplu C-Fe / hexan sau C-C / hexan) arată o dependență puternică de tipul metalului și polaritatea reactivului.

Cei doi germeni se comportă diferit la acțiunea sistemelor nanostructurate: E. Coli nu este sensibil, iar S. Aureus este foarte sensibil. Un comportament diferit se observă la nanoparticulele C-Fe în solvenți diferiți, acestea prezintă citotoxicitate diferită pentru cei doi germeni (tabelul nr. 1). Folosind două medii de reacție diferite (hexan, toluen sau benzen – anilină) în procesul de sinteză în plasmă, nanoparticulele rezultate prezintă o structură distinctă, confirmată de analiza HR-TEM, ceea ce duce la o acțiune antibacteriană diferită.

IV.2. Test de susceptibilitate pentru nanoparticulele provenite din materii prime anorganice

Tulpini microbiene

Activitatea antimicrobiană a nanoparticulelor provenite din materii prime anorganice de tip core-shell, Fe3O4 / acid oleic, CoFe2O4 /oleic acid, a fost testată împotriva tulpinilor bacteriene și fungice recent izolate din probe clinice, precum și tulpini de referință, care fac parte din genurile și speciile următoare: bacterii gram pozitive (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis), bacterii gram-negative (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa) și fungul Candida albicans.

Tulpinile microbiene au fost identificate cu ajutorul sistemului automat Vitek I. Cardurile de identificare și testele de sensibilitate (GNS-522) au fost inoculate și incubate în conformitate cu recomandările producătorului. Rezultatele au fost interpretate prin utilizarea versiunii software-ului AMS R09.1.

În experimentele realizate, au fost utilizate suspensii bacteriene 1.5×108 UFC / mL sau 0,5 McFarland obținute în 15 – 18 ore de la culturi bacteriene dezvoltate pe mediu solid. Activitatea antimicrobiană a fost testatǎ pe mediu Mueller-Hinton recomandat pentru tulpini bacteriene și mediu de drojdie-pepton-glucoză (YPG) pentru fungul C. albicans.

Analiza cantitativǎ a activitǎții anti-microbiene

Pentru stabilirea concentrației minime inhibitorii s-a folosit metoda microdiluțiilor. În acest scop, câteva diluții binare ale nanoparticulelor studiate (cu măsuri între 1000 și 1,9 µg/mL) au fost testate într-un volum de 200 μL cu substanțe nutritive, iar fiecare a fost însămânțată cu 50 μL inocul microbian. Plăcile au fost incubate timp de 24 ore, la 37oC și apoi au fost citite concentrațiile minime inhibitorii.

IV.2.1. Testarea activitǎții anti-microbiene a nanoparticulelor Fe3O4/oleic acid – core/shell

Comportamentul microbian a fost diferit în prezența celor două tipuri de nanoparticule testate. Nanoparticulele de Fe3O4 arată un efect inhibitor general la rata de creștere microbiană, dar fără nici o corelare cu efectul unei doze, inhibarea a început să fie observată pentru toate cele 10 diluții duble a suspensiei nanoparticulelor – figura 11.

Aceste rezultate pot fi extrapolate pentru un spectru larg al activității antimicrobiene a nanoparticulelor testate, împotriva celulelor crescute în suspensie (stare planctonică), putând fi utilizate în dezvoltarea de noi strategii antimicrobiene, sau proiectarea unor noi dispozitive cu proprietăți antimicrobiene, cu aplicații în medicină, industrie sau ecologie.

Studiile asupra activităților antimicrobiene au scos în evidență că bacteriile de tip gram negativ (Escherichia coli și Proteus vulgaris) dar și gram pozitiv (Bacillus megaterium si Staphylococcus aureus) sunt inhibate. Efectul antimicrobian este mai intens împotriva celor de tip gram negativ, superior nanoparticulelor de Ag și chiar antibioticelor cunoscute în prezent.

Această activitate antimicrobiană îmbunătățită a fost atribuită stabilității coloidului în mediu precum și afinității nanoparticulelor pentru membrana cu grad mai ridicat de hidrofobicitate, pătrunderea transmembranară putând conduce la inhibarea sintezei proteice bacteriene.

Nanoparticulele de tip core / shell – Fe3O4 / acid oleic au avut un efect similar inhibitor asupra tulpinilor de tip gram pozitiv și negativ, probabil datorită dimensiunilor mici și caracterului nepolar, favorizând, de asemenea, difuzia liberă prin peretele celular al bacteriei.

IV.2.2. Testarea activitǎții anti-microbiene a nanoparticulelor CoFe2O4 /oleic acid – core/shell

În privința nanoparticulelor de CoFe2O4, acestea au fost active la o doză ce depinde de efectul stimulator al creșterii microbiene în cazul tulpinilor K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. faecalis și C. albicans și un efect inhibitor asupra S. aureus, observat la concentrații mari a nanoparticulelor testate (primele 5 dilutii dublate).

Aceste rezultate indică faptul că nanoparticulele de tip core/shell – CoFe2O4 / acid oleic interacționează cu tulpinile microbiene, obținându-se rezultate comparabile cu nanoparticulele de tip core / shell – Fe3O4 / acid oleic.

Figura 10. Antibiograma cu zonele de inhibiție produse de nanoparticulele de ferită funcționalizate cu cefalosporine asupra germenului E. coli

Concluzii

Nanoparticulele de tip core / shell – Fe3O4 / acid oleic aratǎ un spectru larg de activitate antimicrobiană împotriva bacteriilor gram negative și gram pozitive, precum și a tulpinilor fungice.

Rezultatele obținute pot fi extrapolate pentru un spectru larg al activității antimicrobiene a nanoparticulelor testate, împotriva celulelor crescute în suspensie (stare planctonică), putând fi utilizate în dezvoltarea de noi strategii antimicrobiene, sau proiectarea unor noi dispozitive cu proprietăți antimicrobiene, cu aplicații în medicină, industrie sau ecologie.

Natura nucleului nanostructurat influențează activitatea antimicrobiană, studiile ulterioare urmând a utiliza diferite tipuri de suport nanostructurat anorganic pentru stabilirea corelațiilor aferente.

Un alt aspect al utilizării nanoparticulelor drept suport pentru substanțe biologic active este legat de studierea nanotoxicității asociate sistemelor carrier utilizate, elemente ce vor fi extinse în studii de viitor.

Natura sistemului shell și interacția core-shell este de mare importanță pentru modularea acțiunii antimicrobiene, pentru studiile efectuate fiind utilizate sisteme cu shell nepolar. Este de așteptat ca modificarea polarității și dimensiunii shell-ului să poată fi utilizată pentru direcționarea acțiunii nanoparticulelor funcționalizate.

IV. 3. Testarea aderenței celulare pentru nanoparticulele provenite din materii prime anorganice

Studiu de aderențǎ celularǎ pe linie celularǎ HeLa (Metoda Cravioto adaptatǎ)

Celulele HeLa au fost crescute într-un mediu minim esențial de tip Eagle (Eagle MEM) cu un supliment de 10% ser inactivat la căldură (30 minute la 56°C), ser fetal de bovină (Gibco BRL), 0,1 mM aminoacizi neesențiali (Gibco BRL) și 0,5 mL gentamicină (50µg/mL) (Gibco BRL). Apoi au fost incubate în 5% CO2 atmosferă umedă, la 37°C pentru 24 ore.

Monostraturile celulelor HeLa crescute în 6 multistraturi de plastic au fost folosite la 80 -100% confluență. Tulpinile bacteriilor unor culturi de noapte cu 2% nutrient agar în Eagle MEM cu nici un antibiotic au fost ajustate la o densitate finală de 107 CFU/mL.

Monostraturile celulelor HeLa au fost spălate de 3 ori cu fosfat (PBS) și apoi inoculate cu 2 mL de suspensie bacteriană. Plăcile inoculate au fost incubate timp de 3 ore, la 37°C. După incubare, monostraturile au fost spălate de 3 ori cu PBS în etanol rece (3 minute), cu o soluție Giemsa și incubate pentru 30 de minute.

Plăcile au fost spălate și uscate fiind menținute la temperatura camerei peste noapte. Examinarea la microscop, (mărită până la 2500 de ori), s-a realizat cu obiectiv de imersie (IO), fotografiile fiind realizate cu o camera Contax adaptată pentru microscopul Zeiss.

Trei factori distincți de aderență au fost investigați în cadrul acestui studiu: aderența localizată (LA), caz în care bacteria se atașează și se formează microcolonii în anumite regiuni; aderența difuză (DA), caz în care bacteria aderă la toată suprafața celulei și un agregat aderent (AggA), când bacteria agregată se atașează celulei într-un aranjament tip cărămidă.

Indexul de aderență a fost exprimat ca raportul între un anumit număr de celule eucariote și aderența bacteriană: au fost numărate 100 de celule eucariote.

Studiul de aderențǎ celularǎ la substrat

Cele 96 de multiplăci din plastic cu diluții binare ale compușilor testați, într-un volum final de 200 µL au fost inoculate cu 50 µL suspensii microbiene de 107 CFU/mL, preparate în săruri sterile, inoculate și incubate pentru 24 ore la 37°C. După incubare, microcomprimatele au fost spălate de 3 ori cu PBS, iar celulele bacteriene care au aderat la pereții de plastic, au fost tratate cu 1% soluție de cristal violet timp de 15 minute.

Biofilmul colorat a fost fixat cu metanol rece timp de 5 minute și resuspendat cu 33% soluție de CH3COOH. Soluția albastră de tip A490 a fost măsurată folosind cititorul ELISA. Valorile obținute sunt proporționale cu numărul celulelor bacteriene aderate.

IV.3.1. Testarea aderenței celulare pentru nanosisteme de tip Fe3O4 /oleic acid – core/shell și CoFe2O4 /oleic acid – core/shell

Tulpinile bacteriene implicate în patologia infecțioasă umană, folosesc un număr mare de factori virulenți pentru a combate funcțiile celulare atacate, având abilitatea de a adera la celulele epiteliale pentru a iniția procesul infecțios, pentru a coloniza gazda și a învinge mecanismele naturale de apărare.

Cele mai frecvente microorganisme implicate în formarea biofilmelor asociate infecțiilor cu patogeni de tip gram pozitiv sunt Staphylococcus sp. și Enterococcus sp., respectiv gram negativ, incluzând Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli pe lângă tulpini de fungi precum C. albicans.

Biofilmele microbiene se pot dezvolta pe țesuturi de tegumente și mucoasă, intacte sau deteriorate, dinți, oase, generând un spectru larg de infecții cronice greu de tratat. Folosind un model simplu de tratat, celule de tip Hep-2, a fost studiată influența nanoparticulelor de tip core/shell asupra aderenței tulpinilor patogene la celulele epiteliale (46).

În tabelul nr. 4 sunt notate valorile indicelui și patternului de aderență pentru cele 6 tulpini testate, iar în figura 13 sunt ilustrate imagini de microscopie optică ale patternurilor de aderență ale Fe3O4 / oleic acid – core/shell observate la cele 6 probe.

Tabel 4. Influența nanosistemelor de tip core/shell provenite din materii prime anorganice asupra biofilmelor bacteriene – (Fe3O4 /oleic acid – core/shell ) Indicele și patternul de aderență pentru fiecare tulpină testată

Figura 13. Patternuri de aderență ale Fe3O4 / oleic acid – core/shell observate la Klebsiella Pneumonia (1), Candida albicans (2), Staphylococcus aureus (3), Escherichia coli (4), Pseudomonas aeruginosa (5), Enterococcus faecalis (6) (imagine de mciroscopie optică, x 2500, coloratie Giemsa)

În tabelul nr. 5 sunt notate valorile indicelui și patternului de aderență pentru cele 6 tulpini testate, iar în figura 14 sunt ilustrate imagini de microscopie optică ale patternurilor de aderență ale CoFe2O4/acid oleic – core/shell observate la cele 6 probe.

Tabel 5. (CoFe2O4 /oleic acid – core/shell) Indicele și patternul de aderență pentru fiecare tulpină testată

Figura 14. Patternuri de aderență ale CoFe2O4 / oleic acid – core/shell observate la Klebsiella pneumoniae (1), Candida albicans (2), Staphylococcus aureus (3), Escherichia coli (4), Pseudomonas aeruginosa (5), Enterococcus faecalis (6) (imagine de microscopie optică, x 2500, colorație Giemsa)

Figura 15. Indicii de aderență obținuți pentru tulpinile microbiene testate în prezența nanoparticulelor magnetice

În figura 15 se observă că cele trei tulpini microbiene E. coli, P. aeruginosa și E. faecalis au arătat un comportament asemănător în relația cu cele 2 tipuri de nanoparticule testate. Efect inhibitor puternic la aderența substratului celular a fost observat în cazul S. aureus și Candida albicans. Deși intensitatea procesului de aderență nu a fost influențată semnificativ în cazul E. coli, P. aeruginosa și E. faecalis, totuși o mică stimulare a fost observată în cazul P. aeruginosa în prezența ambelor tipuri de nanoparticule, similar s-a constatat aderență slabă în cazul tulpinii E. coli, indusă de CoFe2O4.

Aceste rezultate demonstrează specificitatea interacțiilor moleculare stabilite între componenții peretelui microbian și nanoparticulele testate. Nanoparticulele Fe3O4 induse schimbă tipul de aderență a tulpinilor bacteriene, exemplu localizarea tipului în cazul E. coli și S. aureus, precum și tip agregat în cazul tulpinii P. aeruginosa. Biofilmele microbiene se pot dezvolta pe substraturi acelulare, incluzând suprafața dispozitivelor medicale (terapeutice sau exploatate).

Aderența in vitro a microorganismelor la suprafețele biomaterialelor a fost mult studiată, fiind responsabilă pentru crearea de interacții nespecifice reversibile, dar și interacții specifice ireversibile. Atașamentele inițiale, dar și adeziunea reversibilă a microorganismelor ce aderă la suprafața biomaterialelor, depind de caracteristicile fizice ale microorganismelor, ale biomaterialelor și a mediului implicat.

Aderarea ireversibilă a microorganismelor la biomateriale implică adeziunea microbiană către receptorii filmului condiționat. În modelul experimental folosit la testarea tulpinilor microbiene pentru capacitatea de aderență și dezvoltare a biofilmului la pereții de plastic ai microcomprimatelor, biofilmele formate pe perete au fost fixate și au dobândit o anumită culoare, iar intensitatea culorii a fost cuantificată prin măsurarea absorbanței la 492 nm, valoarea obținută fiind proporțională cu intensitatea creșterii bacteriene în faza aderentă. Au fost obținute rezultate semnificative la tulpinile gram pozitive, ( S. aureus și E. faecalis), care au arătat o aderență mai bună la un substrat de plastic în prezența CoFe2O4, în timp ce abilitatea C. albicans pentru a coloniza substraturile inerte a fost mărită în prezența nanoparticulelor de Fe3O4 – figura 16.

Figura 16. Influența Fe3O4 și CoFe2O4 asupra abilității tulpinilor microbiene de a dezvolta biofilme pe substrat de plastic

Concluzii

Nanoparticulele magnetice de CoFe2O4 și Fe3O4/acid oleic de tip core/shell influențează specific abilitatea diferitelor tulpini microbiene de a coloniza substratul celular și inert. De asemenea, stimulează sau inhibă virulența microbiană în funcție de compoziția nanoparticulelor și de tulpinile testate. Se poate menționa un efect puternic inhibitor al ambelor tipuri de nanoparticule pentru aderența substratului celular al tulpinilor S. aureus și C. albicans, germeni patogeni frecvent implicati în patologia umană și în etiologia biofilmelor asociată infecțiilor. Aceste rezultate conduc la ipoteza că nanoparticulele magnetice pot fi folosite pentru dezvoltarea de materiale antimicrobiene sau biofilme medicale.

IV.4. Testarea activității antimicrobiene a sistemelor de tip core / shell – C-Fe / antibiotic și core/shell/extra-shell – ferită/acid oleic/antibiotic

Metoda difuzimetricǎ a fost utilizată pentru determinarea activității antibacteriene. Metoda difuzimetrică în suprafață este ușor de executat și permite obținerea de informații semnificative, asupra sensibilității unui germen față de mai multe antibiotice; permite obținerea de indicații asupra concentrației minime inhibitorii și concentrației minime bactericide, a unor antibiotice luate separat sau combinate câte două, față de germenul studiat.

Pentru stabilirea unui tratament corect cu antibiotice se impune efectuarea testării rezistenței diferiților germeni la antibiotice, fapt ce permite obținerea unor informații corecte privind nivelul de eficiență a inhibitorului și nivelul de eficiență bactericidă.

Dacă pe suprafața unei geloze însămânțate uniform cu germenul de cercetat, se plasează într-un punct un disc, care conține o cantitate fixă de antibiotic, acesta din urmă va difuza în geloză, iar concentrația de antibiotic în mediu scade pe măsură ce se mărește distanța de la punctul de plecare (de la disc), în raport logaritmic. Pentru a obține o zonă de inhibiție dublă, concentrația din disc trebuie să fie de 4 ori mai mare sau germenul cercetat să fie de 4 ori mai sensibil.

Germenul însămânțat nu crește în aria concentrației de antibiotic când se depășește concentrația minimă inhibitorie. Aceasta din urmă corespunde cu limita zonei de inhibiție. Aflarea indirectă a concentrației minime inhibitorii se bazează pe premisa că există o relație liniară între dimensiunea zonei de inhibiție și concentrația minimă inhibitorie.

Pentru aceasta s-au determinat, pe un număr mare de germeni, în mod concomitent, dimensiunile zonelor de inhibiție în milimetri, obținute cu ajutorul discurilor cu conținut fix de antibiotic și concentrația minimă inhibitorie în µg/mL, prin metoda diluțiilor.

Punctele aflate au fost plasate pe o diagramă semilogaritmică cu diametrul zonelor de inhibiție marcate pe scara aritmetică și concentrația minimă inhibitorie pe scara logaritmică. Curba de regresiune, trasată prin aceste puncte constituie curba de concordanță între diametrelor de inhibiție și CMI.

Folosind aceste diagrame (câte una pentru fiecare antibiotic), se poate afla, plecând de la dimensiunea zonei de inhibiție, obținută cu discuri stass, față de un oarecare germen, care este concentrația minimă inhibitorie respectivă.

S-au efectutat antibiograme cu microcomprimate impregnate cu cantitățti cunoscute de antibiotice și antibiograme cu antibiotice depuse pe nanoparticule (magnetice) din clasa cefalosporinelor din generația a II-a (cefaclor și cefuroxima) și a III-a (cefatoxim, cefoperazona, ceftriaxona).

Pentru cefalosporinele folosite, concentrația în substanță activă a fost de 30 µg/disc pentru cefaclor, cefuroxim, cefotaxim, ceftriaxona, iar pentru cefoperazonă de 75 µg/disc.

Microcomprimatele folosite au fost procurate de la firma HiMedia Laboratories. Aceste microcomprimate sunt strict standardizate, având o încărcătură de antibiotic conformă cu normele stabilite de către NCCLS, USA.

Pentru efectuarea corectă a antibiogramelor prin metoda difuzimetrică s-a procedat astfel: pe suprafata unui mediu gelozat nutritiv Mueller-Hinton turnat într-o cutie Petri și însămânțat uniform cu suspensia bacteriană Staphylococcus Aureus și Escherichia coli – aflate în faza de creștere exponențială – au fost depuse microcomprimatele de hârtie îmbibate cu o cantitate cunoscută de antibiotic. Au fost însămânțați germeni martori de referință, Staphylococcus aureus ATCC 25923 și Escherichia Coli ATCC 25922.

Microcomprimatele au fost echilibrate termic în prealabil. Distanța minimă între microcomprimate și marginea cutiei Petri a fost de 15 mm, iar între centrele a două discuri vecine de 30 mm. Antibiogramele au fost incubate la o temperatură de 37o, timp de 24 de ore, măsurându-se cu ajutorul unei rigle gradate în mm diametrul zonelor de inhibiție complete, din jurul fiecărui microcomprimat/godeu cu pulbere nanostructurată.

Antibiogramele cu nanoparticule (magnetice) pe care au fost depuse aceleași 4 substanțe active din clasa cefalosporinelor, în aceleași concentrații au fost efectuate după același principiu. Diferența în efectuarea antibiogramelor cu nanoparticule a fost legată de introducerea acestora în godeuri cu diametre egale cu cele ale microcomprimatelor, pentru o justă apreciere a diametrelor zonelor de inhibiție.

Rezultatele antibiogramelor cu germeni de referințǎ Staphylococcus aureus și Escherichia coli, (diametrele zonelor de inhibiție) sunt prezentate în tabelul nr. 6.

Tabel 6. Diametrul zonei de inhibiție pe Staphylococcus aureus și Escherichia coli

Activitatea antimicrobianǎ a nanoparticulelor magnetice este prezentată în tabelul nr. 7.

Tabel 7. Activitatea antimicrobiană pentru nanoparticulele testate

Diametrele zonelor de inhibiție (mm) obținute pentru C-Fe (toluen)/cefalosporine – core/shell pe aceeași germeni de referințǎ sunt prezentate în tabelul nr. 8.

Tabel 8. Diametrul zonelor de inhibitiție pentru C-Fe (toluen)/ cefalosporine – core/ shell

Diametrele zonelor de inhibiție (mm) obținute pentru nanoparticulele magnetice C-Fe (benzen/anilinǎ)/cefalosporine – core/shell sunt prezentate în tabelul nr. 9.

Tabel 9. Diametrele zonelor de inhibiție pentru nanosistemul C-Fe(benzen-anilinǎ)/cefalosporine – core/shell

Comparând diametrele zonelor de inhibiție ale celor douǎ nanosisteme de tip C-Fe/cefalosporine cu datele furnizate de NCCLS pentru cei doi germeni de referințǎ Staphylococcus aureus ATCC 25923 și Escherichia Coli ATCC 25922 se poate concluziona cǎ atât nanoparticulele de tip C-Fe, cât și nanosistemele de tip core/shell prezintǎ activitate antimicrobianǎ.

Rezultate obținute în urma efectuării antibiogramei pentru cefalosporine și nanoparticule pe bază de ferită pe cei doi germeni de referințǎ Staphylococcus aureus și Escherichia Coli sunt prezentate în tabelele nr. 10-11, iar valorile diametrelor zonei de inhibiție obținute pentru sistemele Fe3O4/acid oleic/sustanță activă sunt prezentate în tabelul nr. 12 (47).

Tabel 10. Diametrul zonei de inhibiție pentru cefalosporine

Tabel 11. Diametrul zonei de inhibiție pentru Fe3O4 /oleic acid (core/shell)

Tabel 12. Diametrul zonei de inhibiție pentru Fe3O4 / cefalosporine – core/shell

Ferofluidele au prezentat o activitate bacteriostatică asupra germenilor E. coli și S. aureus. A fost observat că în același interval de timp, diametrul zonei de inhibiție pentru cefalosporine este mai mare decât cel pentru nanofluide/cefalosporine. Acest lucru duce la concluzia că nanofluidul se comportă ca un purtător pentru antibiotic.

Totuși, excepția este dată de faptul că, ferofluidelor funcționalizate cu acid oleic/ceftriaxona și respectiv cefotaxim, au prezentat o zonă de inhibiție mai mare.

CONCLUZII

Substanțele active utilizate pentru a fi grefate pe două categorii distincte de nanoparticule: Fe3O4 respectiv metal-carbon au fost 5 compuși cu activitate biologică din clasa cefalosporinelor (cefuroximă, cefotaxim, cefoperazonă, cefaclor și ceftriaxonă), iar activitatea biologică a fost demonstrată pentru toate variantele de suport.

Nanoparticulele de tip core / shell – Fe3O4 / acid oleic aratǎ un spectru larg de activitate antimicrobiană împotriva bacteriilor gram negative și gram pozitive, precum și a tulpinilor fungice. Rezultatele obținute pot fi extrapolate pentru un spectru larg al activității antimicrobiene a nanoparticulelor testate, împotriva celulelor crescute în suspensie (stare planctonică), putând fi utilizate în dezvoltarea de noi strategii antimicrobiene, sau proiectarea unor noi dispozitive cu proprietăți antimicrobiene, cu aplicații în medicină, industrie sau ecologie.

Un alt aspect al utilizării nanoparticulelor drept suport pentru substanțe biologic active este legat de studierea nanotoxicității asociate sistemelor carrier utilizate. Natura sistemului shell și interacția core-shell este de mare importanță pentru modularea acțiunii antimicrobiene, pentru studiile efectuate fiind utilizate sisteme cu shell nepolar. Este de așteptat ca modificarea polarității și dimensiunii shell-ului să poată fi utilizată pentru direcționarea acțiunii nanoparticulelor funcționalizate.

Nanoparticulele magnetice de CoFe2O4 si Fe3O4/acid oleic de tip core/shell influențează specific abilitatea diferitelor tulpini microbiene de a coloniza substratul celular și inert. De asemenea, stimulează sau inhibă virulența microbiană în funcție de compoziția nanoparticulelor și de tulpinile testate. Se poate menționa un efect puternic inhibitor al ambelor tipuri de nanoparticule pentru aderența substratului celular al tulpinilor S. aureus și C. albicans, patogeni frecvent implicați în patologia umană și în etiologia biofilmelor asociată infecțiilor. Aceste rezultate conduc la ipoteza că nanoparticulele magnetice pot fi folosite pentru dezvoltarea de materiale antimicrobiene sau biofilme medicale.

Ferofluidele au arătat o activitate bacteriostatică asupra germenilor E. coli și S. aureus. A fost observat că în același interval de timp, diametrul zonei de inhibiție pentru cefalosporine este mai mare decât cel pentru nanofluide/cefalosporine. Acest lucru duce la concluzia că nanofluidul se comportă ca un purtător pentru antibiotic.

BIBLIOGRAFIE

1. Florey K. Profiles of drug substances, excipients and related methodology: Academic press; 1983.

2. Harman RJ, Mason P. Handbook of Pharmacy Healthcare: Diseases and Patient Advice: Pharmaceutical Press; 2002.

3. Dollery CT. Therapeutic Drugs: Churchill Livingstone; 1999.

4. Wise R. The pharmacokinetics of the oral cephalosporins—a review. Journal of antimicrobial chemotherapy. 1990;26(suppl E):13-20.

5. Sourgens H, Derendorf H, Schifferer H. Pharmacokinetic profile of cefaclor. International journal of clinical pharmacology and therapeutics. 1997;35(9):374-80.

6. Brown N, Bedford K, Holt HA, Mcculloch S, Macgowan A, Reeves D. Cefuroxime resistance in Haemophilus influenzae. The Lancet. 1992;340(8818):552.

7. Scott LJ, Ormrod D, Goa KL. Cefuroxime Axetil. Drugs. 2001;61(10):1455-500.

8. Neu HC. Third generation cephalosporins: safety profiles after 10 years of clinical use. The Journal of Clinical Pharmacology. 1990;30(5):396-403.

9. Fekety FR. Safety of parenteral third-generation cephalosporins. The American journal of medicine. 1990;88(4):S38-S44.

10. Perry TR, Schentag JJ. Clinical use of ceftriaxone. Clinical pharmacokinetics. 2001;40(9):685-94.

11. Bickford CL, Spencer AP. Biliary sludge and hyperbilirubinemia associated with ceftriaxone in an adult: case report and review of the literature. Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy. 2005;25(10):1389-95.

12. Viner Y, Hashkes PJ, Yakubova R, Segal-Kupershmit D, Luder AS. Severe hemolysis induced by ceftriaxone in a child with sickle-cell anemia. The Pediatric infectious disease journal. 2000;19(1):83-5.

13. Seltsam A, Salama A. Ceftriaxone-induced immune haemolysis: two case reports and a concise review of the literature. Intensive care medicine. 2000;26(9):1390-4.

14. Citak A, Garratty G, Ücsel R, Karabocuoglu M, Uzel N. Ceftriaxone‐induced haemolytic anaemia in a child with no immune deficiency or haematological disease. Journal of paediatrics and child health. 2002;38(2):209-10.

15. Lamb HM, Ormrod D, Scott LJ, Figgitt DP. Ceftriaxone. Drugs. 2002;62(7):1041-89.

16. Bijie H, Kulpradist S, Manalaysay M, Soebandrio A. In vitro activity, pharmacokinetics, clinical efficacy, safety and pharmacoeconomics of ceftriaxone compared with third and fourth generation cephalosporins: review. Journal of chemotherapy (Florence, Italy). 2005;17(1):3-24.

17. Clark RB, Bartelt MA, Chan EL, Dalton HP. Multicentre study on antibiotic susceptibilities of anaerobic bacteria to cefoperazone-solbactam and other antimicrobial agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1992;29(1):57-67.

18. Piddock L, Walters R, Jin Y, Turner H, Gascoyne-Binzi D, Hawkey P. Prevalence and mechanism of resistance to'third-generation'cephalosporins in clinically relevant isolates of Enterobacteriaceae from 43 hospitals in the UK, 1990-1991. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1997;39(2):177-87.

19. Gums JG, Boatwright DW, Camblin M, Halstead DC, Jones ME, Sanderson R. Differences between ceftriaxone and cefotaxime: microbiological inconsistencies. Annals of Pharmacotherapy. 2008;42(1):71-9.

20. Drugs AAoPCo. Transfer of drugs and other chemicals into human milk. Pediatrics. 2001;108(3):776.

21. Marshall WF, Blair JE, editors. The cephalosporins. Mayo Clinic Proceedings; 1999: Elsevier.

22. Görög S. Identification and Determination of Impurities in Drugs: Elsevier Science; 2000.

23. Council of Europe S. European Pharmacopoeia, 3rd , and three supplements,1997-2000. 1448-51 p.

24. Nemutlu E, Kır S, Katlan D, Beksac MS. Simultaneous multiresponse optimization of an HPLC method to separate seven cephalosporins in plasma and amniotic fluid: Application to validation and quantification of cefepime, cefixime and cefoperazone. Talanta. 2009;80(1):117-26.

25. Hendrix C, Thomas J, Yun L-M, Roets E, Hoogmartens J. Quantitative analysis of cefalexin by liquid chromatography on poly (styrene-divinylbenzene). Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 1993;16(2):421-45.

26. Olsen B, Baertschi S, Riggin R. Multidimensional evaluation of impurity profiles for generic cephalexin and cefaclor antibiotics. Journal of Chromatography A. 1993;648(1):165-73.

27. Yongxin Z, Hendrix C, Busson R, Janssen G, Roets E, Hoogmartens J. Isolation and structural elucidation of an impurity of cefradine. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. 1994;12(9):1137-40.

28. Hendrix C, Roets E, Roesems S, Busson R, Rozenski J, Janssen G, et al. Synthesis of related substances of cefadroxil. Archiv der Pharmazie. 1994;327(12):805-7.

29. Freitas Jr RA. What is nanomedicine? Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2005;1(1):2-9.

30. Sahoo S, Parveen S, Panda J. The present and future of nanotechnology in human health care. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2007;3(1):20-31.

31. Ernest H, Shetty R. Impact of nanotechnology on biomedical sciences: review of current concepts on convergence of nanotechnology with biology. Journal of Nanotechnology Online. 2005;1:1-14.

32. Chirilă A, Cristina R. About the use of nano-therapeutic means in medicine. Medicamentul Veterinar/Veterinary Drug. 2013;7(2):19-30.

33. Salata OV. Applications of nanoparticles in biology and medicine. Journal of nanobiotechnology. 2004;2(1):3.

34. Saiyed Z, Telang S, Ramchand C. Application of magnetic techniques in the field of drug discovery and biomedicine. BioMagnetic Research and Technology. 2003;1(1):2.

35. Pantarotto D, Partidos CD, Hoebeke J, Brown F, Kramer E, Briand J-P, et al. Immunization with peptide-functionalized carbon nanotubes enhances virus-specific neutralizing antibody responses. Chemistry & biology. 2003;10(10):961-6.

36. Bussolino F, Mantovani A, Persico G. Molecular mechanisms of blood vessel formation. Trends in biochemical sciences. 1997;22(7):251-6.

37. Nyberg P, Xie L, Kalluri R. Endogenous inhibitors of angiogenesis. Cancer research. 2005;65(10):3967-79.

38. Yorozuya K, Kubota T, Watanabe M, Hasegawa H, Ozawa S, Kitajima M, et al. TSU-68 (SU6668) inhibits local tumor growth and liver metastasis of human colon cancer xenografts via anti-angiogenesis. Oncology reports. 2005;14(3):677-82.

39. Hideshima T, Bradner JE, Wong J, Chauhan D, Richardson P, Schreiber SL, et al. Small-molecule inhibition of proteasome and aggresome function induces synergistic antitumor activity in multiple myeloma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005;102(24):8567-72.

40. Hideshima T, Chauhan D, Richardson P, Anderson KC. Identification and validation of novel therapeutic targets for multiple myeloma. Journal of Clinical Oncology. 2005;23(26):6345-50.

41. Mukherjee P, Bhattacharya R, Bone N, Lee YK, Patra CR, Wang S, et al. Potential therapeutic application of gold nanoparticles in B-chronic lymphocytic leukemia (BCLL): enhancing apoptosis. J Nanobiotechnology. 2007;5(4):1-13.

42. Anazawa K, Shimotani K, Manabe C, Watanabe H, Shimizu M. High-purity carbon nanotubes synthesis method by an arc discharging in magnetic field. Applied Physics Letters. 2002;81(4):739-41.

43. Massart R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media. Magnetics, IEEE Transactions on. 1981;17(2):1247-8.

44. Gupta AK, Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(18):3995-4021.

45. Buteică A, Mihaiescu D, Grumezescu A, Vasile B, Popescu A, Călina D, et al. The cytotoxicity of (non) magnetic nanoparticles tested on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 2010;5(3):651-5.

46. Chifiriuc C, Lazar V, Bleotu C, Calugarescu I, Grumezescu A, Mihaiescu D, et al. Bacterial adherence to the cellular and inert substrate in the presence of CoFe2O4 and Fe3O4/oleic acid-core/shell. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 2011;6(1):37-42.

47. Buteică A, Mihaiescu D, Grumezescu A, Vasile B, Popescu A, Mihaiescu O, et al. THE ANTI-BACTERIAL ACTIVITY OF MAGNETIC NANOFLUID: Fe 3 O 4/OLEIC ACID/CEPHALOSPORINS CORE/SHELL/ADSORPTION-SHELL PROVED ON S. AUREUS AND E. COLI AND POSSIBLE APPLICATIONS AS DRUG DELIVERY SYSTEMS. Digest Journal of Nanomaterials & Biostructures (DJNB). 2010;5(4).

BIBLIOGRAFIE

1. Florey K. Profiles of drug substances, excipients and related methodology: Academic press; 1983.

2. Harman RJ, Mason P. Handbook of Pharmacy Healthcare: Diseases and Patient Advice: Pharmaceutical Press; 2002.

3. Dollery CT. Therapeutic Drugs: Churchill Livingstone; 1999.

4. Wise R. The pharmacokinetics of the oral cephalosporins—a review. Journal of antimicrobial chemotherapy. 1990;26(suppl E):13-20.

5. Sourgens H, Derendorf H, Schifferer H. Pharmacokinetic profile of cefaclor. International journal of clinical pharmacology and therapeutics. 1997;35(9):374-80.

6. Brown N, Bedford K, Holt HA, Mcculloch S, Macgowan A, Reeves D. Cefuroxime resistance in Haemophilus influenzae. The Lancet. 1992;340(8818):552.

7. Scott LJ, Ormrod D, Goa KL. Cefuroxime Axetil. Drugs. 2001;61(10):1455-500.

8. Neu HC. Third generation cephalosporins: safety profiles after 10 years of clinical use. The Journal of Clinical Pharmacology. 1990;30(5):396-403.

9. Fekety FR. Safety of parenteral third-generation cephalosporins. The American journal of medicine. 1990;88(4):S38-S44.

10. Perry TR, Schentag JJ. Clinical use of ceftriaxone. Clinical pharmacokinetics. 2001;40(9):685-94.

11. Bickford CL, Spencer AP. Biliary sludge and hyperbilirubinemia associated with ceftriaxone in an adult: case report and review of the literature. Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy. 2005;25(10):1389-95.

12. Viner Y, Hashkes PJ, Yakubova R, Segal-Kupershmit D, Luder AS. Severe hemolysis induced by ceftriaxone in a child with sickle-cell anemia. The Pediatric infectious disease journal. 2000;19(1):83-5.

13. Seltsam A, Salama A. Ceftriaxone-induced immune haemolysis: two case reports and a concise review of the literature. Intensive care medicine. 2000;26(9):1390-4.

14. Citak A, Garratty G, Ücsel R, Karabocuoglu M, Uzel N. Ceftriaxone‐induced haemolytic anaemia in a child with no immune deficiency or haematological disease. Journal of paediatrics and child health. 2002;38(2):209-10.

15. Lamb HM, Ormrod D, Scott LJ, Figgitt DP. Ceftriaxone. Drugs. 2002;62(7):1041-89.

16. Bijie H, Kulpradist S, Manalaysay M, Soebandrio A. In vitro activity, pharmacokinetics, clinical efficacy, safety and pharmacoeconomics of ceftriaxone compared with third and fourth generation cephalosporins: review. Journal of chemotherapy (Florence, Italy). 2005;17(1):3-24.

17. Clark RB, Bartelt MA, Chan EL, Dalton HP. Multicentre study on antibiotic susceptibilities of anaerobic bacteria to cefoperazone-solbactam and other antimicrobial agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1992;29(1):57-67.

18. Piddock L, Walters R, Jin Y, Turner H, Gascoyne-Binzi D, Hawkey P. Prevalence and mechanism of resistance to'third-generation'cephalosporins in clinically relevant isolates of Enterobacteriaceae from 43 hospitals in the UK, 1990-1991. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1997;39(2):177-87.

19. Gums JG, Boatwright DW, Camblin M, Halstead DC, Jones ME, Sanderson R. Differences between ceftriaxone and cefotaxime: microbiological inconsistencies. Annals of Pharmacotherapy. 2008;42(1):71-9.

20. Drugs AAoPCo. Transfer of drugs and other chemicals into human milk. Pediatrics. 2001;108(3):776.

21. Marshall WF, Blair JE, editors. The cephalosporins. Mayo Clinic Proceedings; 1999: Elsevier.

22. Görög S. Identification and Determination of Impurities in Drugs: Elsevier Science; 2000.

23. Council of Europe S. European Pharmacopoeia, 3rd , and three supplements,1997-2000. 1448-51 p.

24. Nemutlu E, Kır S, Katlan D, Beksac MS. Simultaneous multiresponse optimization of an HPLC method to separate seven cephalosporins in plasma and amniotic fluid: Application to validation and quantification of cefepime, cefixime and cefoperazone. Talanta. 2009;80(1):117-26.

25. Hendrix C, Thomas J, Yun L-M, Roets E, Hoogmartens J. Quantitative analysis of cefalexin by liquid chromatography on poly (styrene-divinylbenzene). Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 1993;16(2):421-45.

26. Olsen B, Baertschi S, Riggin R. Multidimensional evaluation of impurity profiles for generic cephalexin and cefaclor antibiotics. Journal of Chromatography A. 1993;648(1):165-73.

27. Yongxin Z, Hendrix C, Busson R, Janssen G, Roets E, Hoogmartens J. Isolation and structural elucidation of an impurity of cefradine. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis. 1994;12(9):1137-40.

28. Hendrix C, Roets E, Roesems S, Busson R, Rozenski J, Janssen G, et al. Synthesis of related substances of cefadroxil. Archiv der Pharmazie. 1994;327(12):805-7.

29. Freitas Jr RA. What is nanomedicine? Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2005;1(1):2-9.

30. Sahoo S, Parveen S, Panda J. The present and future of nanotechnology in human health care. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2007;3(1):20-31.

31. Ernest H, Shetty R. Impact of nanotechnology on biomedical sciences: review of current concepts on convergence of nanotechnology with biology. Journal of Nanotechnology Online. 2005;1:1-14.

32. Chirilă A, Cristina R. About the use of nano-therapeutic means in medicine. Medicamentul Veterinar/Veterinary Drug. 2013;7(2):19-30.

33. Salata OV. Applications of nanoparticles in biology and medicine. Journal of nanobiotechnology. 2004;2(1):3.

34. Saiyed Z, Telang S, Ramchand C. Application of magnetic techniques in the field of drug discovery and biomedicine. BioMagnetic Research and Technology. 2003;1(1):2.

35. Pantarotto D, Partidos CD, Hoebeke J, Brown F, Kramer E, Briand J-P, et al. Immunization with peptide-functionalized carbon nanotubes enhances virus-specific neutralizing antibody responses. Chemistry & biology. 2003;10(10):961-6.

36. Bussolino F, Mantovani A, Persico G. Molecular mechanisms of blood vessel formation. Trends in biochemical sciences. 1997;22(7):251-6.

37. Nyberg P, Xie L, Kalluri R. Endogenous inhibitors of angiogenesis. Cancer research. 2005;65(10):3967-79.

38. Yorozuya K, Kubota T, Watanabe M, Hasegawa H, Ozawa S, Kitajima M, et al. TSU-68 (SU6668) inhibits local tumor growth and liver metastasis of human colon cancer xenografts via anti-angiogenesis. Oncology reports. 2005;14(3):677-82.

39. Hideshima T, Bradner JE, Wong J, Chauhan D, Richardson P, Schreiber SL, et al. Small-molecule inhibition of proteasome and aggresome function induces synergistic antitumor activity in multiple myeloma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005;102(24):8567-72.

40. Hideshima T, Chauhan D, Richardson P, Anderson KC. Identification and validation of novel therapeutic targets for multiple myeloma. Journal of Clinical Oncology. 2005;23(26):6345-50.

41. Mukherjee P, Bhattacharya R, Bone N, Lee YK, Patra CR, Wang S, et al. Potential therapeutic application of gold nanoparticles in B-chronic lymphocytic leukemia (BCLL): enhancing apoptosis. J Nanobiotechnology. 2007;5(4):1-13.

42. Anazawa K, Shimotani K, Manabe C, Watanabe H, Shimizu M. High-purity carbon nanotubes synthesis method by an arc discharging in magnetic field. Applied Physics Letters. 2002;81(4):739-41.

43. Massart R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media. Magnetics, IEEE Transactions on. 1981;17(2):1247-8.

44. Gupta AK, Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(18):3995-4021.

45. Buteică A, Mihaiescu D, Grumezescu A, Vasile B, Popescu A, Călina D, et al. The cytotoxicity of (non) magnetic nanoparticles tested on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 2010;5(3):651-5.

46. Chifiriuc C, Lazar V, Bleotu C, Calugarescu I, Grumezescu A, Mihaiescu D, et al. Bacterial adherence to the cellular and inert substrate in the presence of CoFe2O4 and Fe3O4/oleic acid-core/shell. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures. 2011;6(1):37-42.

47. Buteică A, Mihaiescu D, Grumezescu A, Vasile B, Popescu A, Mihaiescu O, et al. THE ANTI-BACTERIAL ACTIVITY OF MAGNETIC NANOFLUID: Fe 3 O 4/OLEIC ACID/CEPHALOSPORINS CORE/SHELL/ADSORPTION-SHELL PROVED ON S. AUREUS AND E. COLI AND POSSIBLE APPLICATIONS AS DRUG DELIVERY SYSTEMS. Digest Journal of Nanomaterials & Biostructures (DJNB). 2010;5(4).