Cataliza Enzimatica Utilizata In Obtinerea Unor Compusi Indolizinici cu Proprietati Bioactive

INTRODUCERE

Alegerea temei „Cataliza enzimatică utilizată în obținerea unor compuși indolizinici cu proprietăți bioactive” este justificată de importanța pe care o are în zilele noastre eliminarea poluanților chimici utilizați drept catalizatori, precum și numeroasele posibilități de utilizare a compușilor indolizinici.

Biocataliza este un factor important pentru arsenalul chimic pe care chimia organică o poate utiliza să realizeze sinteze de intermediari importanți, produse farmaceutice și alte componente comerciale. În majoritatea proceselor biocatalitice se utilizează enzime naturale și microorganisme. Cu toate acestea, pentru mulți cercetători astfel de reactivi catalitici nu sunt o opțiune din cauza limitelor datorate importului.

Enzimele sunt biocatalizatori care măresc viteza de reacție a reacțiilor chimice care fac posibilă viața așa cum o știm. Existența și menținerea unui set de enzime complet și echilibrat sunt esențiale pentru: metabolizarea nutrienților în vederea obținerii de energie și de o serie întreagă de metaboliți, pentru asamblarea proteinelor, acizilor nucleici, membranelor, celulelor și țesuturilor, pentru utilizarea energiei în motilitatea celulară și contracția musculară. [18, 46]

Studii recente indică faptul că utilizarea de legume disponibile la nivel local poate oferi o alternativă importantă pentru țările respective, pentru a investiga resursele locale în desfășurarea eficientă a transformărilor sintetice. Enzimele sunt utilizate în multe domenii de activitate incluzând cercetarea medicală și farmaceutică, diagnoza clinică, industria (farmaceutică, chimică, a polimerilor, alimentară sau textilă), epurarea apelor reziduale. [4]

Din cauza necesității mari de medicamente chirale derivate din precursori prochirali, interesul în utilizarea enzimelor pentru astfel de transformări a crescut constant în industria farmaceutică și agrochimică. [27, 28]

Au fost catalogate mai bine de 2000 enzime până în 1980 și 3700 până în prezent (recunoscute de Uniunea Internațională de Biochimie și Biologie Moleculară (IUBMB)). [31, 32]

Lucrarea intitulată „Cataliza enzimatică utilizată în obținerea unor compuși indolizinici cu proprietăți bioactive” este structurată în 4 capitole și presupune analiza unor procese de sinteză a unor compuși indolizinici în condiții apropiate de cele naturale. Sistemele chimice analizate acoperă o arie largă de aplicabilitate în industria alimentară, agricultură, medicină și controlul calității mediului.

Primul capitol cuprinde nomenclatura și clasificarea enzimelor, scurt istoric privind evoluția studiului enzimelor și avantajele dar și dezavantajele utilizării enzimelor.

Al doilea capitol cuprinde structura, specificitatea enzimelor, cinetica enzimatică și surse de enzime.

Al treilea capitol descrie compușii bioactivi numiți indolizine care reprezintă intermediari cheie pentru sinteza indolizidinelor, bisindolizinelor, ciclofanilor, ciclazinelor și a altor compuși cu importanță biologică. De asemenea, sunt importante în sinteza unor compuși heterociclici organofosforici, fluorurați, cu un rol important în domeniul chimiei medicinale și agricole. Datorită importanței deosebite pentru biologie, farmacologie și industrie a heterociclilor cu fluor, cercetările s-au orientat și spre sinteza de noi derivați fluorurați ai indolizinelor.

În al patrulea capitol este descrisă partea experimentală în care am realizat sinteza unor compuși heterociclici cu azot prin reacții de cicloadiție catalizate de enzime extrase din materiale vegetale, de enzime pure comerciale extrase din hrean (HRP) și de enzime produse în procesul de germinare al plantelor și studiul estimativ al eficienței catalitice. O utilizare largă o are peroxidaza din hrean (HRP), care este eficientă în numeroase reacții precum polimerizarea fenolului, a anilinei și a derivaților acestora, chiar și în prezența unor cantități mari de substanțe poluante. HRP este cunoscută ca fiind activă în mai mulți solvenți organici sau în amestecuri apoase de solvenți.

În finalul acestei lucrări sunt prezentate concluziile care reies din studiile efectuate în domeniul biocatalizatorilor enzimatici extrași din diverse specii vegetale și în domeniul compușilor indolizinici.

CAPITOLUL 1. NOMENCLATURA ȘI CLASIFICAREA ENZIMELOR

1.1 SCURT ISTORIC

Biocatalizatorul (enzima, hormonul sau vitamina) este o substanță care provoacă sau grăbește o reacție chimică în organismele vii. [1]

Totalitatea reacțiilor biochimice de degradare și sinteză care determină metabolismul organismului viu sunt catalizate de molecule specializate numite enzime. Enzimele (“en”-în, “zima”-drojdie) sunt biomolecule proteice cu proprietăți catalitice însemnate, care determină desfășurarea, coordonarea și autoreglarea transformărilor metabolice din organism.

Enzima este un compus organic de natură proteică, prezent în celule vii, care dirijează procesele de sinteză și de degradare din organismele animalelor, plantelor și microorganismelor, producând și păstrând energie. [1]

Enzimele au fost denumite inițial fermenți (Van Helmont, 1600) din latinescul fermento are = a fermenta. Denumirea de enzimă a fost dată în 1878 de către Kȕhne, fiind un termen mai general ce include și fermenții. [20]

Prima teorie generală a catalizei chimice, publicată de J. J. Berzelius în 1835, conținea și un exemplu de ceea ce se cunoaște astăzi ca enzimă, și anume diastaza din malț, subliniindu-se că hidroliza amidonului este catalizată mai eficient de diastază decât de acidul sulfuric. Faptul că Eduard Bȕchner a reușit în 1897 să extragă din celulele de drojdie enzimele care catalizează fermentația alcoolică, a constituit un moment crucial în istoria studiului enzimelor. Prin realizarea lui Bȕchner s-a demonstrat că aceste enzime importante, ce catalizează o cale metabolică majoră, furnizoare de energie, pot funcționa independent de structura celulară. Mulți ani mai târziu, J. B. Sumner a reușit să izoleze o enzimă în stare pură, cristalină, iar în 1926 a izolat ureaza din extractele de fasole jack (Canavalia ensiformis). Abia în anii 1930-1936, când J. Northrop a cristalizat enzimele pepsină, tripsină si chimotripsină, s-a acceptat definitiv natura proteică a enzimelor. [38]

Conform definiției lui Haldane, ”enzima este un catalizator organic, solubil și coloidal produs de celula vie”. Prin urmare, enzimele sunt prezente în toate celule țesuturilor, organelor. Organismele vii trebuie să fie capabile să-și sintetizeze singure enzimele de care au nevoie pentru desfășurarea normală a activității vitale. Biosinteza enzimelor este similară cu cea a proteinelor fiind dirijată de acizii nucleici și de substanțele specifice din fiecare organism.

Enzimele își pot exercita acțiunea lor atunci când sunt extrase din organism și în afara acestuia, deși sinteza lor se face numai în interiorul organismului. [48]

În prezent, enzimele reprezintă un subiect important pentru cercetările științifice.

1.2 AVANTAJELE ȘI DEZAVANTAJELE UTILIZĂRII ENZIMELOR

Ca biocatalizatori, enzimele prezintă următoarele caracteristici generale:

sunt cei mai eficienți catalizatori cunoscuți (deși acționează la concentrații foarte mici manifestă o activitate extrem de intensă); [33, 52]

nu modifică starea finală de echilibru a reacțiilor, ci măresc numai viteza cu care se realizează acest echilibru; [33]

pot fi modificate pentru a crește selectivitatea, stabilitatea, precum și activitatea lor; [33]

se caracterizează printr-o specificitate remarcabilă a funcției catalitice, determinând atât mecanismele de producere a unui anumit tip de reacție, cât și capacitatea de recunoaștere numai a unui anumit substrat (chemo-selectivitate, regio-selectivitate, diastereo-selectivitate, și enantio-selectivitate); [33, 39]

unele enzime au proprietăți reglatoare (respectiv pot discerne și decide inițierea, desfășurarea sau stoparea unei reacții sau succesiuni de reacții biochimice).

nu se consumă și nu se transformă în reacțiile pe care le catalizează;

sunt substanțe care micșorează semnificativ energia de activare a moleculelor asupra cărora acționează (numite substrat S ), pe care le transformă în produși de reacție (P) datorită interacțiunii enzimă-substrat; [4, 39]

acționează în condiții mai blânde de reacție (de obicei într-un interval al pH-ului de 5-8, presiune normală și într-un interval de temperatură de 20-40 ͦC) decât catalizatorii chimici; [33, 39]

sunt prietenoase mediului (complet degradate în mediu) și transformă procesele care decurg în mai multe etape procese care decurg într-o singură etapă (one-pot reactions); [33, 39]

catalizează numai reacțiile termodinamic posibile;

catalizează reacții care sunt foarte greu sau nu pot fi catalizate prin metode chimice; [4, 39, 52]

utilizarea materialelor vegetale intacte transformă substanțe ieftine în produși mai valoroși. Atât enzimele izolate cât și materialele întregi („whole cell”), pot fi utilizate ca biocatalizatori. Enzimele izolate oferă mai multe avantaje printre care se enumeră: aparatură de reacție mai simplă, randamente de reacție mai mari și purificarea mai simplă a produșilor de reacție; [15, 33, 39]

Dezavantajele utilizării enzimelor:

reacțiile de biotransformare (inclusiv izolarea produșilor de reacție) decurg mai lent decât cele catalizate chimic și cu randamente mai mici; [39]

de obicei, solventul utilizat este apa (punctul de fierbere ridicat și căldura de vaporizare pot influența activitatea enzimei); [33]

se găsesc în natură sub forma unui singur enantiomer; [33]

limitează domeniul de lucru (de obicei, enzimele sunt denaturate la temperatură înaltă și valori mari ale pH-ului); [39]

pot provoca reacții alergice. [33]

1.3 NOMENCLATURA ENZIMELOR

În prezent, în jur de 3700 de enzime sunt recunoscute de Uniunea Internațională de Biochimie și Biologie Moleculară (IUBMB), [31] însă în natură există în jur de 25.000 de enzime astfel încât cea mai mare parte din acest vast rezervor de biocatalizatori rămâne să fie descoperită și utlizată. Oricum, doar o mică parte din enzimele deja investigate (~10%) sunt disponibile în comerț, acest procent fiind în continuă creștere. [16]

Primele enzime descoperite au fost denumite după criterii întâmplătoare, fiind utilizată, cel mai adesea, adăugarea sufixului –ază la numele substratului a cărei transformare o catalizează (urează, amilază, protează etc.).

Clasificarea actuală și nomenclatura enzimelor au la bază principiile și regulile stabilite de Comisia de Enzime (EC) a Uniunii Internaționale de Biochimie (IUB), implicând un sistem numeric codificat, criteriul esențial de clasificare reprezentându-l tipul de reacție chimică catalizată de o anumită enzimă. Identitatea fiecărei enzime este stabilită printr-un număr de cod și un nume sistematic fiind caracterizată printr-un număr de cod de forma: [EC A. B. C. D] în care:

EC – Comisia de Enzime a Uniunii Internaționale de Biochimie;

A – clasa enzimatică de apartenență;

B – subclasa enzimatică – numărul general al grupului de substrate asupra cărora acționează enzima;

C – numărul substratului specific sau al cofactorului enzimatic;

D- numărul de ordine al enzimei.

Al doilea și al treilea număr de cod descriu, în general, tipul reacției catalizate. Nu există o regulă generală deoarece semnificațiile acestor numere de cod sunt definite pentru fiecare din cele șase clase de enzime. [45]

Enzimele ce catalizează reacții similare dar nu identice au primele trei numere de cod identice, al patrulea număr de cod făcând distincția între ele. Cu toate acestea, izoenzimele (enzime diferite ce catalizează reacții identice) prezintă cele patru numere de cod identice. De exemplu, în corpul uman lactat dehidrogenaza prezintă cinci izoenzime diferite care au același cod.

În concluzie, numărul de cod asigură doar baza pentru o identificare unică a enzimelor, izoenzima particulară și sursa acesteia încă trebuie să fie specificate. [45]

Numele sistematic al enzimelor indică natura substratului, natura acceptorunzimei.

Al doilea și al treilea număr de cod descriu, în general, tipul reacției catalizate. Nu există o regulă generală deoarece semnificațiile acestor numere de cod sunt definite pentru fiecare din cele șase clase de enzime. [45]

Enzimele ce catalizează reacții similare dar nu identice au primele trei numere de cod identice, al patrulea număr de cod făcând distincția între ele. Cu toate acestea, izoenzimele (enzime diferite ce catalizează reacții identice) prezintă cele patru numere de cod identice. De exemplu, în corpul uman lactat dehidrogenaza prezintă cinci izoenzime diferite care au același cod.

În concluzie, numărul de cod asigură doar baza pentru o identificare unică a enzimelor, izoenzima particulară și sursa acesteia încă trebuie să fie specificate. [45]

Numele sistematic al enzimelor indică natura substratului, natura acceptorului și tipul de reacție catalizată. [16]

De exemplu, enzima cu numărul de cod EC 2.7.3.2 are numele sistematic ATP creatin fosfotransferaza în care: 2 – Clasa enzimatică 2 (transferaze); 7 – denumirea subclasei (fosfotransferaze); 3- sub-subclasa (fosfotransferaze cu o grupare acceptoare conținând azot); 2 – numărul de ordine al enzimei (creatin kinaza). [34]

Denumirea substratului trebuie să fie în acord cu recomandările IUPAC pentru scrierea izomerilor, poziția substituenților și prescurtările convenționale de cofactori (ATP, GTP, NAD, NADP, FAD etc.). Când enzima provoacă două modificări în substrat, a doua funcție se trece în paranteză. Adeseori în denumire se precizează sursa din care s-a izolat enzima (țesut animal, vegetal, origine microbiană). [20]

Precursorii enzimatici denumiți zimogeni, se denumesc cu prefixul pro (prorennină, protrombină) sau sufixul ogen (tripsinogen, chimotripsinogen etc.).

EC a admis și denumiri uzuale sau nomenclatură de lucru, în care se renunță la terminologia IUPAC pentru substrat și se folosesc denumiri adecvate: tautomerază, kinază, dehidrogenază. Când substratul este ionizat se folosește sufixul at nu ic, (lactat și nu lactic dehidrogenaza). [20]

Uneori, pe lângă denumirea sistematică și proveniență se indică și locul de plasare în subunități celulare: microzomial, citoplasmatic, mitocondrial etc. Enzimele slab legate de celulă sunt lipoenzime, iar celelalte, desmoenzime. [20]

În literatură încă se folosesc cu predilecție denumirile triviale ale enzimelor deși sunt mai numeroase avantajele oferite de sistemul de clasificare IUB. [18]

1.4 CLASIFICAREA ENZIMELOR

În funcție de natura reacțiilor pe care le catalizează, enzimele au fost clasificate în șase clase, conform sistemului de nomenclatură al Uniunii Internaționale de Biochimie și Biologie Moleculară (IUBMB), fiecare clasă fiind divizată în subclase enzimatice delimitate de natura substratului și coenzimelor implicate în reacție:

oxidoreductaze – catalizează reacțiile de oxido-reducere care implică transfer de electroni, atomi de hidrogen sau oxigen. [4, 45, 16]

transferaze – catalizează transferul unor grupări specifice de la un substrat donor la un substrat acceptor. [4, 45, 16]

hidrolaze – catalizează reacțiile de hidroliză a moleculelor de substrat sub acțiunea apei. [4, 45]

liaze – catalizează scindarea legăturilor chimice nonhidrolitice. [4, 16]

izomeraze – catalizează reacțiile de rearanjare intramoleculară a atomilor sau grupărilor funcționale din molecula substratului. [4, 16]

ligaze – catalizează reacțiile de formare a unor legături chimice cu consum de ATP. [4, 45]

Aplicațiile industriale reprezintă mai mult de 80% din piața mondială a enzimelor.

Fig. 1.1 Utilizarea relativă a claselor de enzime în industrie [15, 33]

După cum este ilustrat și în fig. 1.1, majoritatea enzimelor care au fost utilizate în industrie drept biocatalizatori sunt hidrolazele (63%), chiar dacă oxidoreductazele sunt catalizatori mult mai utili decât acestea. Utilizarea industrială a clasei de enzime depinde de importanța comercială a produșilor de reacție obținuți, accesibilitatea enzimelor și caracteristicile enzimelor cum ar fi stabilitatea, activitatea, selectivitatea.

Tabelul 1.1 Clasificarea sistematică a enzimelor conform EC [34, 22]

1.4.1 Oxidoreductaze

Oxidoreductazele catalizează reacțiile de transfer a atomilor de H, de O sau a electronilor de la un substrat la altul.

Oxidoreductazele catalizează reacții de tipul:

S1redS1ox + n•e-

S2ox + n•e-S2red

S1red + S2ox S1ox + S2red

Al doilea număr de cod al oxidoreductazelor indică donorul echivalenților reducători ( H sau electroni) implicați în reacție. [45]

Al doilea număr de cod Donor de hidrogen sau electroni

1 alcool (>CH-OH)

2 aldehide sau cetone (>C=O)

3 grupări >CH-CH<

4 amine primare (-CH-NH2 )

5 amine secundare (>CH-NH-)

6 NADH sau NADPH (doar atunci când alt

catalizator redox este acceptor)

11 peroxid de hidrogen (H2O2)

Al treilea număr de cod se referă la acceptorul de H sau electroni, astfel:

Al treilea număr de cod Acceptorul de H sau electroni

1 NAD+ sau NADP+

2 Fe3+ (ex. citocromii)

3 O2 [45]

Exemple:

Oxidoreductaze ce acționează asupra grupărilor >CH-OH ale donorilor

cu NAD+ sau NADP+ ca acceptori:

alcool dehidrogenaza (E.C. 1.1.1.1, alcool: NAD oxidoreductază) catalizează reacția:

Alcool + NAD+Aldehidă (cetonă) + NADH + H+

lactatdehidrogenaza catalizează reacția:

.

L-lactat: lactat dehidrogenaza (E.C. 1.1.1.27) catalizează reacția:

Oxidoreductaze ce acționează asupra unor grupări aldehidice sau cetonice ale donorilor:

Cu NAD+ sau NADP+ ca acceptori:

Aldehido-dehidrogenaza catalizează reacția:

Etanal Acid acetic

Cu O2 ca acceptor:

Aldehidoxidaza catalizează reacția:

Etanal Acid acetic

Oxidoreductaze care acționează asupra unor grupări >CH-NH2 ale donorilor:

Cu NAD sau NADP ca acceptori:

Alanindehidrogenaza catalizează reacția:

alanina Acid piruvic

Glutamatdehidrogenaza catalizează reacția:

1.4.3 Cu O2 ca acceptor:

L-aminoacidoxidaza catalizează reacția:

alanina Acid piruvic

Catalaza și peroxidaza ale căror denumiri sistematice sunt H2O2 : H2O2 oxidoreductaza (E.C. 1.11.1.6) și respectiv donor : H2O2 oxidoreductaza (E.C. 1.11.1.7) catalizează reacțiile de descompunere a apei oxigenate libere (catalaza) și respectiv de oxidare a substratului cu ajutorul oxigenului din peroxizi (apa oxigenată):

Peroxidazele pot cataliza un număr larg de reacții separate. Cu câteva excepții, majoritatea lor sunt hemproteine care se găsesc în plante, mucegaiuri, bacterii și drojdii. Cinetica activității enzimatice variază în funcție de sursă. În general, peroxidazele sunt definite ca enzime ce catalizează reacții de dehidrogenare.

1.4.2 Transferaze

Transferazele catalizeză reacții de tipul (dar exclude reacțiile de hidroliză și redox):

În general, EC recomandă ca denumirea transferazelor să fie de tipul ”X-transferaze”, unde X este gruparea transferată, dar și denumirile de tipul ”trans-X-ază” sunt acceptate. Subclasele acestui tip de enzime indică natura acestei grupări X transferată: metil, carbonil, acil, glucozil, amino etc. [13, 45]

Cel de-al doilea număr de cod descrie tipul grupării transferate. De exemplu:

Al doilea număr de cod Gruparea transferată

1 grupare cu un atom de C

2 resturi de aldehide sau cetone

3 grupe acil

4 grupe glicozil

6 grupare ce conține azot

7 grupare ce conține fosfor

8 grupare ce conține sulf [13, 45]

În general, al treilea număr de cod descrie gruparea transferată.

E.C. 2.1.1 metiltransferaze (transferă –CH3);

E.C. 2.1.2 hidroximetiltransferaze, formiltransferaze și transferaze a unor compuși înrudiți;

E.C. 2.1.3 carboxil- sau carbamoil- transferaze (transferă –COOH sau –CO–NH2);

E.C. 2.1.4 amidinotransferaze.

Pentru transferaze, la această regulă generală, apar excepții în cazul în care se transferă gruparea fosfat deoarece nu poate fi descrisă mai departe, astfel încât se poate indica acceptorul. [45]

E.C. 2.7.1 fosfotransferaze cu o grupare alcool ca acceptor

E.C. 2.7.2 fosfotransferaze cu o grupare carboxil ca acceptor

Fosfotransferazele de obicei au nume uzuale cu sufixul –kinază. [45]

Exemple:

2.2 Transferaze ce catalizează transferul de resturi cetonice sau aldehidice (transcetolaze, transaldolaze):

a) transcetolaza (gliceralaldehido-transferaza) catalizează transferul unui rest de glicolaldehidă de pe sedoheptuloză-7-P (cetoheptoză) pe gliceralaldehidă-3-P, conducând la formare de riboză-5-P și xiluloză-5-P:

b) transaldolaza (dihidroxiacetono-transferaza) catalizează transferul unui rest de dihidroxi-acetonă tot de pe sedoheptuloză-7-fosfat pe gliceralaldehidă-3-fosfat cu formare de D-eritroză-4-fosfat și D-fructoză-6-fosfat:

2.1 Transferaze ce catalizează transferul de grupări cu un atom de carbon:

a) Metiltransferaza (transmetilaza): betaino-homocisteino-metiltransferaza catalizează reacția:

b) Hidroximetiltransferazele:

-serinohidroximetiltransferaza catalizează trecerea unei grupări hidroximetil de pe serină pe acidul tetrahidrofolic, formându-se intermediar acidul 10-hidroximetiltetra-hidrofolic; în paralel se obține glicocol din serină:

2.3 Transferaze ce catalizează transferuri de resturi acil (aciltransferaze sau transacilaze): glucozamino-acetiltransferaza catalizează transferul unui grup acil de pe acetil-ScoA pe glucozamină:

2.6 Transferaze ce catalizează transferul de grupări ce conțin azot:

L-aspartat : 2-oxoglutarat aminotransferaza (E.C. 2.6.1.1) cu denumirea veche glutamat oxaloacetat transaminaza (GOT) catalizează reacția:

2.7 Transferaze ce catalizează transferul de grupări ce conțin fosfor pe:

a) acceptori cu grupare alcoolică  sau hexokinaza catalizează reacția:

b) acceptori cu grupări azotat: creatin-ATP-fosforiltransferaza sau creatinkinaza catalizează reacția:

1.4.3 Hidrolaze

Aceste enzime catalizează reacții de tipul:

Subclasele acestui tip de enzime au fost realizate în funție de tipul legăturii asupra căreia acționează enzima (legături eterice, esterice, legături C-N, C-C, C-S etc.).

Al doilea număr de cod Legătura hidrolizată

1 esterică

2 glicozidică

3 eterică

4 peptidică

5 legături C-N (altele decât cele peptidice)

Al treilea număr de cod descrie tipul legăturii hidrolizate.

E.C. 3.1.1 hidrolazele esterilor carboxilici (-CO-O-)

E.C. 3.1.2 hidrolazele tiolesterilor (-CO-S-)

E.C. 3.1.3 hidrolazele fosfomonoesterilor ( [13, 45]

Nomenclatura hidrolazelor e formată din numele substratului și sufixul –ază. În această clasă de enzime sunt cuprinse amilazele, enzime care acționează asupra legăturilor glicozidice din polizaharide (3.2.1), celulaza (denumire sistematică β-1,4-glucan glucanohidrolaza, cod E.C. 3.2.1.4), enzimele proteolitice pepsina (E.C. 3.4.4.1), tripsina (E.C. 3.4.4.4), papaina (E.C. 3.4.4.10), bromelaina (E.C. 3.4.4.24). [45] Majoritatea enzimelor din subclasa 3.4 care acționează asupra legăturilor peptidice nu au o denumire sistematică deoarece natura și mecanismul reacțiilor enzimatice catalizate de aceste enzime sunt încă neclare. [13]

Exemple:

3.1 Hidrolaze ce catalizează hidrolize de esteri:

a) Carboxilesteraze:

-colinesteraza catalizează reacția:

-lipaza cu denumirea sistematică glicerol: ester hidrolaza (E.C. 3.1.1.3), catalizează reacția:

Triacilglicerol + H2O Diacilglicerol + acid gras

Această reacție este importantă în degradarea lipidelor.

b) Fosfoesteraze:

-fosfomonoesteraze: glucozo-6 fosfataza catalizează reacția:

Reacția este importantă în metabolismul glucidelor (eliberare de glucoză).

-fosfodiesteraze: glicerofosforilcolindiesteraza catalizează reacția:

Reacția prezintă interes în degradarea lipidelor.

3.2 Hidrolaze care acționează asupra glicozizilor:

--glucozidaza catalizează reacția:

-β-glucozidaza catalizează reacția:

3.4 Hidrolaze care acționează asupra legăturilor peptidice:

-peptidil-peptido-hidrolaze catalizează hidroliza legăturilor peptidice între părți care au cel puțin două resturi de aminoacizi (peptide):

Din această categorie fac parte: pepsina, tripsina, chimotripsina. Aceste enzime participă la digestia proteinelor.

-dipeptidazele (dipeptidohidrolazele): glicil-glicino-hidrolaza catalizează reacția:

3.5 Hidrolaze care acționează asupra legăturilor C-N, diferite de cele peptidice:

-ureea-amido-hidrolaza (ureaza) catalizează reacția:

1.4.4 Liaze

Aceste enzime catalizează reacțiile nehidrolitice de îndepărtare a unei grupări de la substrat cu formare de duble legături de cele mai multe ori. [45]

Liazele catalizează reacții în care are loc ruperea legăturilor dintre doi atomi (C-C, C-heteroatom). Această clasă este divizată în subclasele: C-C liaze (4.1), C-O liaze (4.2), C-N liaze (4.3), C-S liaze (4.4), C-halogen liaze (4.5) etc. [13]

Al doilea număr de cod Legătura scindată

1 C-C

2 C-O

3 C-N

4 C-S

Al treilea număr de cod se referă la tipul grupării îndepărtate.

Astfel, pentru liazele C-C:

Al treilea număr de cod Gruparea îndepărtată

1 gruparea carboxil

2 gruparea aldehidică

3 grupare oxoacid

Din această clasă fac parte decarboxilazele (4.1.1), aldolazele (4.1.2), carnonic anhidraza (E.C. 4.2.1.1) etc. [13, 45]

Exemple:

4.1 Liaze C-C:

-piruvatdecarboxilaza catalizează reacția:

-izocitrat-glioxilat-liaza (E.C. 4.1.3.1) catalizează reacția:

După scindarea legăturii C-C are loc o rearanjare care conduce la oxidarea alcoolului secundar la aldehidă.

4.2 Liază C-O:

-carbonat-hidroliaza (carbonic-anhidraza) catalizează reacția:

Reacția prezintă interes în desfacerea și refacerea H2CO3.

4.3 Liază C-N:

-aspartat-amoniac-liaza catalizează reacția:

acid aspartic acid fumaric

1.4.5 Izomeraze

Aceste enzime catalizează reacții de izomerie și se clasifică în funcție de tipul reacției catalizată.

Izomerazele catalizează reacții în care au loc rearanjări intramoleculare :

Al doilea număr de cod Tipul reacției

racemizare sau epimerizare (inversia la un atom de carbon asimetric)

2 izomerizare cis-trans

3 oxidoreducere intramoleculară

4 reacții de transfer intramolecular

Al treilea număr descrie tipul moleculelor supuse izomerizării. Astfel, pentru racemizări și epimerizări:

Al treilea număr Substrat

1 aminoacizii și derivații lor

2 hidroxiacizii și derivații lor

3 hidrații de carbon și derivații lor

Exemple:

5.1 Racemază: alanin-racemaza (E.C. 5.1.1.1) ce catalizează reacția:

L-alanină D-alanină

5.2 Epimerază: aldoza 1-epimeraza (E.C. 5.1.3.3) catalizează reacția:

α-D-glucopiranozăβ-D-glucopiranoză

Alte enzime din categoria izomerazelor care prezintă interes sunt oxidoreductazele intramoleculare:

-trifosfat izomeraza ce catalizează trecerea gliceraldehidei-3-fosfat în dihidroxiacetonă-fosfat:

-ribozo-fosfat izomeraza catalizează trecerea 5-fosfat-ribozei în 5-fosfat-ribuloză:

Ambele enzime sunt implicate în metabolismul glucidelor.

1.4.6 Ligaze sau sintetaze

Aceste enzime catalizează formarea de noi legături utilizând energia eliberată în urma scindării hidrolitice a ATP-ului sau a altor trifosfat-nucleozide.

Reacțiile sunt de forma:

X + Y + ATP X – Y + ADP + Pi

sau X + Y + ATP X – Y + AMP + (PP)i

Al doilea număr de cod indică tipul legăturilor formate.

Al doilea număr de cod Legătura sintetizată

1 C-O

2 C-S

3 C-N

4 C-C

Al treilea număr descrie legătura formată. [45]

În această clasă sunt incluse enzimele aminoacil-tARN-sintetaza implicate în procesul de biosinteză a proteinelor, acetil-CoA sintetaza (E.C. 6.2.1.4) care se utilizează pentru sinteza succinil-CoA energia înglobată în molecula macroergică a GTP etc.

Exemple:

Ligaze ce catalizează formarea legăturilor C-C:

-piruvat carboxilaza (E.C. 6.4.1.1) catalizează reacția inversă celei catalizate de piruvat-decarboxilaza (liază):

Ligaze ce catalizează formarea legăturilor C-O:

-alanil t-ARN-sintetaza catalizează reacția:

Reacția este importantă în biosinteza proteinelor.

Ligaze ce catalizează formarea legăturilor C-S:

-acil-CoA-sintetaza catalizează reacția:

Reacția este importantă în metabolismul lipidelor.

Ligaze ce catalizează formarea legăturilor C-N:

-glutaminosintetaza catalizează reacția:

Reacția prezintă interes în metabolismul proteic.

CAPITOLUL 2. DESCRIEREA CATALIZATORILOR ENZIMATICI

2.1 NATURA ȘI STRUCTURA ENZIMELOR

Spre deosebire de catalizatorii chimici obișnuiți care sunt substanțe anorganice sau organice cu moleculă mică, enzimele sau biocatalizatorii sunt substanțe organice cu moleculă mare și de natură proteică, produse în organismele vii.

Din punct de vedere structural, enzimele se împart în două categorii:

enzime de natură exclusiv proteică, constituite în întregime din proteine;

enzime de natură heteroproteică formate din două părți: una proteică, numită apoenzimă, și una neproteică, numită coenzimă. [46]

Enzime de natură exclusiv proteică

Enzimele sunt biocatalizatori de natură proteică și au un grad înalt de structurare posedând o structură primară, imprimată de secvențializarea aminoacizilor în catena polipeptidică fundamentală, o structură secundară, o structură terțiară și o structură cuaternară, determinate de modul în care catenele polipeptidice se pot plia și asocia între ele. [48]

Enzimele sunt alcătuite dintr-un număr foarte mare de aminoacizi dispuși într-o configurație spațială determinată specific pentru activitatea catalitică a enzimei. Un exemplu de enzimă constituită integral din proteină este ribonucleaza. Această enzimă catalizează hidroliza acizilor ribonucleici (ARN) eliberând mononucleotidele componente. [46]

Centrul activ al enzimei (situsul activ)

În interacțiunea dintre enzimă și substratul său, enzima participă cu o porțiune limitată din structura sa. Pe această porțiune există grupări reacționale capabile să atragă și să fixeze molecula substratului într-o poziție privilegiată și într-un loc strict determinat. Ansamblul acestor grupări chimice și al încărcărilor electrice constituie centrul activ al enzimei sau centrul catalitic ce ia parte efectivă la reacție fie legând direct substratul, fie prin intermediul cofactorilor.

Toate datele de structură justifică rolul determinant al ordonării tridimensionale a proteinelor enzimatice în efectuarea actului catalitic prin centrul activ și al procesului de control și autoreglare prin situsul allosteric, asupra căreia acționează un efector allosteric (inhibitor sau activator) care se leagă de acesta, modulând activitatea enzimatică din fiecare reacție separată, dar și în ansamblu.

La enzimele holoproteice, centrul activ este constituit din radicalii unor aminoacizi care pot intermedia reacția. Dintre enzimele holoproteice fac parte ribonucleaza (scindează acizi nucleici), lizozimul (scindează legături -glicozidice din pereții celulari ai bacteriilor, distrugându-le). [48, 20]

În cazul enzimelor care nu necesită pentru activitatea lor catalitică prezența unui cofactor, acest centru activ este reprezentat de o secvență de aminoacizi și este condiționat de configurația tridimensională a moleculei. Eficacitatea centrului activ nu depinde numai de grupările funcționale ce se combină cu substratul ci de integritatea configurației moleculei proteice care determină pozițiile spațiale relative ale acestor grupări funcționale. Acest fapt subliniază importanța structurii terțiare a proteinei pentru activitatea enzimatică. Pentru acest tip de enzime centrul activ coincide cu zona, denumită situs catalitic, unde se găsește secvența de aminoacizi implicați în activitatea catalitică.

În cazul enzimelor care conțin cofactori enzimatici, centrul activ include situsul catalitic și regiunea din moleculă la care este atașat cofactorul (coenzima, metalul), adică:

centru activ = situs catalitic + cofactor [48]

Enzime de natură heteroproteică

Numeroase enzime au o structură binară formată dintr-o componentă proteică, denumită apoenzimă și una sau mai multe componente neproteice, denumite cofactori. Complexul este denumit holoenzimă și este activ din punct de vedere catalitic. Prin îndepărtarea cofactorului, rămâne componenta proteică inactivă în forma liberă. [48]

În structura holoenzimei, cofactorul imprimă specificitate de acțiune, respectiv determină tipul și viteza reacției catalizate, în timp ce apoenzima imprimă specificitate de substrat, respectiv determină substanța asupra căreia acționează enzima.

Apoenzima este macromolecula proteică a enzimei care stabilește legătura enzimei cu substratul și manifestă grade diferite de afinitate pentru cofactor. [48]

Cofactorii enzimatici sunt micromolecule neproteice cu structuri chimice diferite, indispensabile pentru manifestarea activității catalitice. [48]

După natura chimică și modul de legare la apoenzimă, cofactorii se clasifică în: coenzime, grupări prostetice, ioni metalici.

Coenzimele sunt compuși organici ușor disociabili, care se atașează temporar la apoenzimă prin legături necovalente. Ele pot trece ușor de la o apoenzimă la alta, putând astfel participa la transformarea altor molecule de substrat după terminarea unei anumite reacții. Dintre acestea fac parte: NAD+, NADP+, ATP, CTP, acidul lipoic etc. [48]

Tabelul 2.1 Coenzime și reacțiile de transfer caracteristice [20]

În tabel sunt prezentate atât coenzime cu rol de cosubstrat (CoA, NAD, NADP, coenzima Q etc.) cât și coenzime cu grupări prostetice (FAD, FMN, lipoamida, piridoxal-5-fosfatul etc.). [20]

Categorii de coenzime:

coenzime provenite din vitamine hidrosolubile

În majoritatea cazurilor, mici transformări ale moleculelor de vitamine hidrosolubile sunt suficiente pentru constituirea de coenzime cu roluri metabolice importante.

Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) și nicotinamidadenindinucleotidfosfat (NADP) sunt coenzime pentru un număr mare de dehidrogenaze care au capacitatea de a cataliza dehidrogenarea diverselor substrate ce se oxidează în lanțul respirator. Transferul hidrogenului are loc la nivelul nucleului piridinic.

Tabelul 2.2 Vitaminele hidrosolubile și coenzimele corespunzătoare [46]

NAD-ul și NADP-ul se află în toate celulele vii, însă NAD-ul predomină. Flavinmononucleotidul (FMN) și flavinadenininucleotidul (FAD) sunt coenzimele flavinenzimelor, mult răspândite în țesuturile animale și vegetale.

Structura coenzimei FAD

Structura CoA

Structura coenzimei NAD

coenzimele tetrapirolice au structură foarte asemănătoare cu cea a hem-ului din hemoglobină. Aceste coenzime cuprind și ioni metalici, în special Fe. Exemple de coenzime tetrapirolice: citocromii, catalaza și peroxidaza.

coenzimele metalice.

Numeroase enzime cuprind un metal angajat într-un complex disociabil din care poate fi detașat în stare de ion. Principalele coenzime metalice sunt polifenoloxidazele (conțin cupru), fosfatazele (conțin magneziu), arginaza (cu mangan). Rolul metalului în sistemele enzimatice este adesea de element de legătură prin formarea unui complex între proteina enzimatică și substrat. De exemplu, Mg este necesar pentru fixarea ATP-ului pe kinaze.

Grupările prostetice sunt substanțe organice mici fixate pe molecula apoenzimei și care disociază greu deoarece sunt legate prin legături covalente.

Pot fi seaparte de proteina enzimatică doar prin denaturare, scindare hidrolitică sau alte mijloace chimice energice. Dintre acestea fac parte: FAD, FMN, TPP, hemul, piridoxalfosfatul. Gruparea prostetică imprimă mecansimul unor procese enzimatice ca: transportul de electroni, de grupări –NH2, acetil etc.

Cele mai multe grupări prostetice provin din vitamine la care se adaugă alte structuri organice specifice (de exemplu restul heminic). [20]

Ionii metalici sunt indispensabili pentru exercitarea funcției catalitice a unor enzime, participând în calitate de cofactori sau de componente structurale ale acestora. Aceste enzime se mai numesc și metal-enzime iar printre ionii care îndeplinesc rol de cofactor fac parte: Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Mo2+. Unele enzime pot conține doi ioni metalici. [48]

Tabelul 2.3 Enzime ce conțin sau necesită ioni metalici în biocataliză [20]

Organizarea structurală a enzimelor

Enzimele se încadrează în următoarele grupe principale în funcție de organizarea lor structurală ca molecule proteice:

monomere cu un singur lanț polipeptidic în care este inclus situsul catalitic, nu pot fi disociate în subunități și posedă mase moleculare relativ mici (13.000 – 35.000). [20, 48]

oligomere cu două sau mai multe catene polipeptidice în structură unitară, compactă, legate prin punți disulfură și/sau prin ioni metalici în complecși polidentați și posedă mase moleculare mari, cuprinse între 35.000 și câteva sute de mii. Majoritatea enzimelor care catalizează diferite reacții biochimice ale metabolismului sunt enzime oligomere. [20, 48]

izoenzimele reprezintă forme moleculare multiple ale unei enzime care catalizează aceeași reacție, au originea în aceeași celulă, țesut sau lichid biologic, dar diferă ca structură (configurație spațială) și proprietăți fizico-chimice (pH optim de acțiune, cinetică de reacție, mobilitate electroforetică). Izoenzimele apar datorită diferențelor la nivelul structurilor cuaternare, respectiv combinărilor variate ale unor subunități structurale de natură polipeptidică. [48]

Acestea se deosebesc prin:

-dimensiuni și mase moleculare;

-structură primară dată de secvențele de aminoacizi, de care depinde orientarea conformațională în structura secundară și terțiară;

-numărul lanțurilor peptidice dintr-o moleculă;

-modul de agregare în structură cuaternară a enzimelor heteroproteice;

-mecanismul reacțiilor enzimatice și specificitate;

-natura centrilor activi și a situsului allosteric (centrul de autoreglare). [48]

Structura enzimelor

Enzimele au secvențe unice de aminoacizi și sunt determinate genetic:

Deși doar o mică parte din aminoacizii din cadrul unei enzime poate lega reactantul, este nevoie de toți constituenții enzimei pentru a realiza activitatea catalitică.

Structura primară a enzimelor

Cea mai simplă structură a enzimelor este structura covalentă sau structura primară. Cel mai important aspect în cadrul acestei structuri este secvența de aminoacizi. [38, 2]

Fig. 2.1 Structura primară a enzimelor

Structura secundară a enzimelor

Structura secundară a proteinelor se referă la aranjamentul spațial al axului catenei polipeptidice. Cele mai frecvente conformații sunt:

-helix

-foaie pliată

Structurahelix

Conformația elicoidală a enzimei este generată de legăturile de hidrogen între gruparea –NH- a unui rest de aminoacid și oxigenul grupării –CO– a altui rest de aminoacid din cadrul aceluiași lanț polipeptidic. Grupările catenei laterale sunt poziționate pe partea exterioară a helixului. [38, 2]

Fig. 2.2 Structurahelix

Structura-foaie pliată

Conformația enzimei este generată de legăturile de hidrogen între gruparea -NH- a unui rest de aminoacid și oxigenul grupării –CO– a altui rest de aminoacid care fac parte din lanțuri polipeptidice diferite. [2, 38]

Fig. 2.3 Structurafoaie pliată

Toate legăturile peptidice participă la această legare încrucișată conferind structurii o mare stabilitate iar grupurile catenei laterale sunt poziționate deasupra sau sub planul foilor pliate. [2, 38]

Structura terțiară a enzimelor

Structura tridimensională completă a unei proteine ​​se numește structură terțiară. Este o combinație de -helix, -foaie pliată și secvențe nerepetitive, care este guvernată de interacțiuni necovalente. În timp ce legăturile covalente (peptidice și disulfurice) definesc structura primară, interacțiunile necovalente determină structura terțiară a enzimelor​​: legături de hidrogen, interacțiuni Van der Waals, interacțiuni electrostatice. [2, 38]

Structura terțiară este stabilizată de patru legături diferite și interacțiuni:

legături disulfurice – unde două resturi de cistină se găsesc împreună și o legătură puternică (S – S) se formează între atomii de sulf ai acestora.

legături ionice care se formează între două grupări "R" încărcate cu sarcini diferite (sarcină pozitivă și sarcină negativă) care se găsesc aproape una de cealaltă.

legături de hidrogen.

interacțiuni hidrofobe și hidrofile. Într-un mediu apos, o proteină globulară își va orienta componentele sale astfel: cele hidrofobe spre centrul său și cele hidrofile spre margini. [2, 38]

Fig. 2.4 Structura terțiară este stabilizată de legături diferite și interacțiuni

Structura cuaternară a enzimelor

Multe enzime sunt formate din mai multe lanțuri polipeptidice și, uneori, cu componentă anorganică (de exemplu, hemul) care se aranjează pentru a conferi activitate catalitică. În unele enzime subunitățile sunt identice, iar în altele diferă secvența de aminoacizi sau structura. Descrierea aranjamentului subunităților în astfel de enzime se numește structură cuaternară. [2, 38]

Fig. 2.5 Structurile terțiară și cuaternară ale enzimelor

2.2 SPECIFICITATEA ENZIMELOR

Enzimele sunt folosite ca instrumente importante de diagnosticare și investigare mai ales datorită proprietății de specificitate manifestată față de reacțiile pe care le catalizează. [48]

Specificitatea enzimelor se manifestă în raport cu substratul, cu reacția și cu structura sterică.

Enzimele pot prezenta specificitate:

redusă, când atacă mai multe covalențe din diferite substraturi;

de grup, când scindează o legătură influențată de vecinătăți strict determinate (de exemplu tripsina și chimotripsina în cazul reacțiilor proteolitice);

absolută, când atacă numai un substrat printr-o reacție unică;

stereospecificitate față de izomerii optici și geometrici (izomeri sterici).

Specificitatea de substrat

Specificitatea de substrat se referă activitatea pe care o manifestă enzimele față de anumite substrate. [48]

Studiile asupra specificității de substrat a enzimelor arată că moleculele de substrat reflectă structura situsului activ al enzimelor prin două trăsături structurale fundamentale:

substratul trebuie să posede o legătură chimică susceptibilă la atacul enzimei;

de obicei, substratul prezintă și alte particularități structurale, necesare legării lui la situsul activ al enzimei, probabil de orientare a moleculei de substrat într-o poziție geometrică propice atacului asupra legăturii susceptibile. [20]

Deși enzimele sunt în general foarte specifice, comparativ cu catalizatorii sintetici, ele diferă prin gradul de specificitate. Enzimele prezintă:

specificitate absolută pentru un substrat și nu acționează nici asupra moleculelor cu structură asemănătoare. [20, 48]

De exemplu ureaza hidolizează numai ureea, nu și derivatul său metilat:

specificitate de grup prezentată de enzimele care acționează asupra unei clase de substanțe cu structură chimică asemănătoare, dar vor ataca cu viteze diferite. Astfel, pepsina atacă toate tipurile de proteine; amilaza atacă amidonul, dextrinele, glicogenul. [38, 20, 48]

Specificitatea de reacție

Specificitatea de reacție se referă enzimele care acționează asupra unui anumit tip de reacție. Există și enzime care acționează asupra mai multor reacții. De exemplu enzimele proteolitice au acțiune peptidazică, amidazică și esterazică, provocând hidroliza proteinelor, peptidelor, amidelor și esterilor cu participarea aceluiași centru activ. [20, 48]

Specficitatea de substrat este subordonată specificității de reacție. Asupra acidului lactic acționează 4 enzime, fiecare catalizând o anumită reacție în raport cu proteina si cosubstratul (NAD sau oxalilacetat):

Stereospecificitatea

Stereospecificitatea se referă la capacitatea enzimelor de a diferenția între ei izomerii optici și geometrici. În reacții se transformă numai unul dintre izomeri, ceilalți regăsindu-se nemodificați. [20, 48]

Astfel, fumaraza acționează numai asupra acidului fumaric și este inactivă asupra izomerului său cis, acidul maleic:

Acid fumaric Acid malic

În cazul substanțelor optic active, enzimele manifestă o acțiune specifică față de o anumită formă stereoizomeră a substratului. De exemplu, L-aminoacid-oxidazele nu recunosc decât L-aminoacizii iar pentru transormarea D-aminoacizilor este necesară prezența D-aminoacid-oxidazelor. Unele enzime fac distincție între conformațiile α și β din legăturile glicozidice. Maltaza hidrolizează numai legătura (1 4) α glicozidică din molecula de maltoză și nu atacă legătura (14) β glicozidică din celobioză. [20, 48]

2.3 CINETICA ENZIMATICĂ

Enzimele sunt biocatalizatori ce catalizează conversia unuia sau a mai multor compuși (substrat) în unul sau mai mulți compuși diferiți (produși), crescând viteza tuturor reacțiilor chimice în interiorul celulelor de cel puțin 106 față de reacțiile corespunzătoare necatalizate. [18]

În absența catalizei enzimatice majoritatea reactiilor biochimice sunt atât de lente încât, în condiții blânde de temperatură și presiune, nu ar avea loc. [25]

Enzimele măresc vitezele unor asemenea reacții de mai bine de un million de ori deci reacțiile care ar dura ani în absența catalizei ar putea apărea în fracțiuni de secundă dacă sunt catalizate de enzima potrivită. Celulele conțin mii de enzime diferite iar activitatea acestora determină care din multitudinea de reacții chimice posibile pot avea loc chiar în cadrul celulei. Enzimele sunt caracterizate de două proprietăți fundamentale: cresc viteza reacțiilor chimice fără să fie consumate sau modificate și nu modifică echilibrul chimic dintre reactanți și produși. [18]

Cinetica enzimatică este o parte a biochimiei care studiază modurile de determinare cantitativă a vitezei reacțiilor catalizate enzimatic precum și factorii care influențează aceste viteze.

Analizele cinetice permit determinarea numărului și ordinului etapelor individuale prin care enzimele transformă substraturile în produși. [18]

Reacțiile spontane în care unul sau mai mulți reactanți se transformă instantaneu în produși sunt extrem de rare. Deoarece starea energetică finală a produsului P este mai joasă decât a substratului, reacția are loc în sens direct. Ca să aibă loc reacția, substratul trebuie să treacă mai întâi printr-o stare energetică de tranziție(energia de activare). Energia de activare (E) exprimă diferența finită între nivelul de energie al stării de tranziție a moleculelor activate și nivelul de energie al moleculelor aflate în stare inițială. Ea desemnează cantitatea de energie necesară pentru ca toate moleculele dintr-un mol de substanță să atingă o stare activată. Energia necesară atingerii stării de tranziție reprezintă o barieră în progresul reacției și astfel determină viteza la care are loc reacția. În prezența unui catalizator (enzimă), energia de activare este micșorată și reacția are loc cu o viteză mai mare. [25]

Fig. 2.6 Diagrama energiei reacțiilor catalizate și necatalizate

Într-un proces enzimatic enzima (E) formează cu substratul (S) un produs intermediar, foarte reactiv dar cu o durată de viață foarte scurtă (ES) în care substratul se află în stare activată. Atât timp cât se află în această formă de produs intermediar activ, ES, substratul suferă unele modificări. Acestea sunt efectuate în interacțiunea substratului cu centrul activ al enzimei.

Datorită modificărilor, ES devine EP iar după modificare se elimină imediat produșii de reacție (P) și totodata, se eliberează centrul activ al enzimei (E) care va fixa alte molecule de substrat. Se observă că E apare nemodificat în ambele părți ale ecuației, astfel încât echilibrul nu este afectat. Procesul se reia, în mod ciclic, producându-se cu o viteză foarte mare. [46, 5] Mecanismul poate fi schematizat astfel:

Deoarece transformarea ES EP se face practic instantaneu și pentru că reacția finală enzimatică de transformare a produșilor E și P în EP este nulă (K6=0) (enzima este specifică pentru substrat și nu și pentru produse), relația (1) devine:

Fig. 2.7 Diagrama variației energiei în reacțiile catalizate chimic sau enzimatic

Viteza reacțiilor enzimatice crește proporțional cu concentrația substratului până la o anumită valoare a acesteia (se înregistrează viteza maximă a reacției enzimatice (vmax)). Concentrațiile mai mari de această valoare nu mai modifică viteza reacției, aceasta rămâne constantă, factorul care limitează viteza fiind numai concentrația enzimei. Pentru toate reacțiile catalizate enzimatic este valabilă relația:

v = k[E]

unde: v este viteza reacției enzimatice; k-constantă de proporționalitate; [E]-concentrația enzimei în mediul de reacție.

În 1913, L. Michaelis și M. L. Menten au dezvoltat o teorie generală asupra acțiunii și cineticii enzimatice, care mai târziu a fost extinsă de G. E. Briggs și J. B. S. Haldane. Această teorie, care este fundamentală pentru analiza cantitativă a tuturor aspectelor cineticii și inhibiției enzimatice, este cel mai bine dezvoltată pentru cazul simplu de reacție cu un singur substrat. [13]

La concentrații mici ale substratului, reacția este de ordinul întâi în raport cu substratul (ordinul al doilea general: ordinul întâi în rapot cu S și de ordinul întâi în raport cu E). Forma curbei vo în funcție de [S] este o hiperbolă. [38, 46]

Fig. 2.8 Curba vitezei de reacție în funcție de concentrația substratului, [S]

Ecuația de viteză pentru o hiperbolă de acest tip este:

unde: a este asimptota la curbă ( valoarea lui y la o valoare infinită a lui x) și b este punctul de pe axa x care corespunde la o valoare a lui yinfinit /2. Se poate obține ecuația de viteză pentru reacția bimoleculară:

Prin substituirea celor patru termeni ai cineticii enzimatice în ecuația generală pentru o hiperbolă obținem y = vo, x = [S], a = vmax. Al patrulea termen b în ecuația generală este constanta Michaelis, Km, care reprezintă concentrația substratului când vo este egală cu jumătatea a vmax. [18, 38, 46]

Fig. 2.9 Curba vitezei de reacție în funcție de [S]

Ecuația completă de viteză:

Aceasta se numește ecuația Michaelis-Menten unde:

vmax = viteza reacției atunci când se folosește un exces suficient de mare de substrat; Km = este egală cu concentrația substratului [S] pentru care v0 = vmax/2;

[S] = concentrația substratului.

Modul în care v0 depinde de [S] și de Km poate fi ilustrat prin interpretarea ecuației Michaelis-Menten în trei situații:

Când [S] este mult mai mic decât Km , termenul Km + [S] este aproximativ egal cu Km și rezultă:

Unde ~ „înseamnă aproximativ egal cu”. Deoarece atât vmax cât și Km sunt constante, și raportul lor este constant. Altfel spus, când [S] este considerabil mai mică decât Km, viteza inițială de reacție este proporțională cu concentrația substratului (reacție de ordinul I). [18]

Când [S] este mult mai mare decât Km, termenul Km + [S] este aproximativ egal cu [S] și rezultă:

Când [S] depășește cu mult valoarea Km, viteza de reacție este maximă și nu mai este afectată de creșterea concentrației de substrat (reacție de ordinul 0). [18]

Când [S] = Km, viteza de reacție este jumătate din viteza maximă.

Din ecuație reiese că valoarea lui Km reprezintă valoarea concentrației de substrat la care viteza de reacție este jumătate din viteza maximă. [18]

2.3.1 Mecanismele catalizei enzimatice

Legarea unui substrat de centrul activ al unei enzime este o interacțiune foarte specifică. Centrele active sunt gropițe sau canale pe suprafața unei enzime de obicei compuse din aminoacizi din diferite părți ale lanțului polipeptidic care sunt aduse împreună în structura terțiară a proteinei pliate. Substraturile inițiale se leagă de centrul activ prin legături necovalente, inclusiv legături de hidrogen, legături ionice și interacțiuni hidrofobe după care mai multe mecanisme pot accelera transformarea în produsul de reactie. Cele mai multe reacții biochimice implică interacțiuni între două sau mai multe substraturi diferite. [25]

De exemplu, formarea unei legături peptidice implică alăturarea a doi aminoacizi iar pentru astfel de reacții, legarea a două sau mai multe substraturi la centrul activ în poziția și orientarea corectă, accelerează reacția.

Enzima oferă un șablon pe care reactanții sunt aduși împreună și orientați corect pentru a favoriza formarea stării de tranziție în care aceștia interacționează:

Fig. 2.10 Cataliza enzimatică cu formarea complexului ES și trecerea in produși de reacție și eliberarea enzimei

Cel mai simplu model de interacțiune enzimă – substrat este modelul lacăt-cheie (A), în care substratul se potrivește perfect în centrul activ. În multe cazuri atât configurația enzimei cât și a substratului sunt modificate de legarea substratului – proces numit fixare indusă (B). În astfel de cazuri conformația substratului este modificată astfel încât să se asambleze cât mai bine. [16]

Fig. 2.11 Modele de interacțiune enzimă -substrat

La începtul secolului trecut, Emil Fischer a comparat înalta specificitate enzimă-substrat cu relația lacăt-cheie. Modelul lacăt-cheie explică foarte bine înalta specificitate a reacțiilor enzimă – substrat, dar nu poate explica schimbările dinamice care însoțesc procesul catalitic. Acest neajuns a fost îndepărtat de Daniel Koschland, care a elaborat modelul potrivirii induse. Acest model postulează că atunci când substraturile se apropie și se leagă de enzimă induc o modificare conformațională analogă introducerii mâinii (substratul) într-o mănușă (enzimă).

Enzima induce schimbări reciproce în substraturi, utilizând energia eliberată în timpul legării pentru a facilita transformarea substratului în produși. [16]

Modelul potrivirii induse a fost confirmat de studii biofizice asupra motilității enzimelor în timpul legării de substrat. [16]

Enzimele utilizează mecansime multiple pentru a facilita cataliza reacțiilor biochimice. În mare, există patru mecanisme care ilustrează capacitatea enzimelor de a realiza creșteri esențiale ale vitezei reacțiilor biochimice.

Cataliza prin proximitate

Moleculele trebuie să se apropie la distanțe de ordinul lungimilor legăturilor chimice ca să reacționeze. Cu cât concentrația reactanților este mai mare, cu atât moleculele lor se vor ciocni mai frecvent și prin urmare viteza de reacție va fi mai mare. Când o enzimă leagă o moleculă de substrat în situsul său activ, ea creează o regiune cu o concentrație locală mare de substrat, în același timp făcând posibilă și o orientare spațială a moleculelor favorabilă interacțiilor chimice. [18]

Cataliza acido-bazică

Grupările ionizabile ale anumitor aminoacizi din situsul activ și (atunci când este cazul) grupările ionizabile ale grupării prostetice contribuie la cataliză ca acizi sau baze. Cataliza acido-bazică poate fi atât de specifică, cât și generală. Prin ”specifică” se înțelege cataliză numai prin intermediul H3O+ și HO-. În cataliza specific acidă sau cataliza specific bazică, viteza de reacție depinde de modificări ale contrațiilor ionilor H3O+ independent de concentrațiile altor acizi (donori de protoni) sau baze (acceptori de protoni) prezenți în soluție sau în situsul activ. În cataliza general acidă sau cataliza general bazică viteza de reacție este influențată de toți acizii și bazele prezente. [18, 10]

Cataliza prin constrângere

Enzimele care catalizează reacțiile litice, care presupun ruperea unei legături covalente, de regulă leagă substratul într-o conformație ușor defavorabilă pentru legătura care va suferi clivarea. Rezultă o tensiune care întinde sau distorsionează legătura țintă, slăbind-o și făcând-o vulnerabilă la rupere. [18]

Cataliza covalentă

Procesul de cataliză covalentă presupune formarea unei legături covalente între enzimă și substraturi, după care enzima modificată devine reactant. Cataliza covalentă introduce o cale nouă de reacție care este mai favorabilă energetic, și prin urmare și mai rapidă decât reacția necatalizată. Această modificare covalentă a enzimei este însă tranzitorie și la terminarea reacției enzima revine la starea inițială, rolul său rămânând catalitic. Cataliza covalentă reprezintă mecanismul cel mai des întâlnit în cazul reacțiilor care presupun transferuri de grupări funcționale. Aminoacizii care participă la cataliza covalentă sunt de regulă cisteina, serina și ocazional, histidina. De multe ori, cataliza covalentă se face printr-un mecanism „ping-pong”, în care primul substrat este legat și produsul său eliberat înainte de legarea celui de-al doilea substrat. [18, 10]

Mecanism ping-pong în cazul transaminării E-CHO și E-CH2NH2 reprezintă complexele enzimă-piridoxalfosfat, respectiv enzimă-pridoxamină.

Ala = alanină, Pyr = piruvat, KG =cetoglutarat, Glu = glutamat.

2.3.2 Factorii care influențează viteza reacțiilor catalizate de enzime

Temperatura

Creșterea temperaturii determină creșterea vitezei unei reacții, atât catalizate cât și necatalizate, datorită creșterii energiei cinetice și frecvenței de ciocniri a speciilor participante la reacție. În cazul reacțiilor enzimatice se observă o temperatură optimă când reacția decurge cu viteza cea mai mare. Depășirea acestei temperaturi duce la o scădere rapidă a vitezei procesului enzimatic deoarece sunt distruse legăturile necovalente care mențin conformația tridimensională a enzimei iar lanțul polipeptidic se depliază sau se denaturează. [18, 38, 45, 46]

Fig. 2.12 Denaturarea proteinei enzimatice sub acțiunea temperaturii

Intervalul de temperatură în care o enzimă își menține o conformație stabilă depinde de celula și organismul de proveniență al enzimei, de obicei fiind puțin mai mari decât temperatura fiziologică. Enzimele umane, de exemplu, sunt în general stabile până temperaturi de 40-45 ͦC. Enzimele izolate din microorganismele termofile, care trăiesc în izvoarele termale sau în gropile hidrotermale, pot fi stabile până la temperaturi de 100 ͦC. Temperaturile optime pentru enzimele plantelor sunt cuprinse între 20-30 ͦC. [18, 38, 45, 46]

Factorul cu care viteza unei reacții crește la ridicarea temperaturii cu 10 ͦC se numește coeficient de temperatură (Q10).

unde: kt este viteza la temperatura t, iar kt+10 este viteza la temperatura t + 10 ͦC.

Valoarea Q10 pentru reacțiile enzimatice este cuprinsă între 1 și 2, fiind mai mică decât pentru reacțiile necatalizate (3-4). Relația este valabilă până la temperatura optimă, pentru care viteza de reacție atinge valoarea maximă. La organismele cu „sânge rece” (batracieni, reptile) aceste modificări ale vitezei de reacție cu temperatura reprezintă modul lor de supraviețuire atunci când temperatura mediului ambiant variază drastic. În cazul mamiferelor sau a altor organisme homeoterme schimbările vitezelor de reacție cu temperatura au semnificație biologică numai în cazurile de febră sau hipotermie. [18, 46, 19]

Fig. 2.13 Influența temperaturii asupra vitezei de reacție

Se observă că optimile de temperatură ale enzimelor sunt de fapt optime aparente, rezultate din concurența dintre două procese: cel de creștere a activității enzimei (a) și cel de distrugere prin denaturare a enzimei (b). [18, 46]

Influența pH-ul-ului

Influența pH-ului asupra activității enzimelor este mult mai complexă și mai variată. Enzimele sunt active într-un domeniu limitat de pH, de obicei efectul catalitic este maxim la o anumită valoare de pH, numit pH optim de acțiune și acestea sunt reale și nu aparente ca în cazul temperaturii. În general, activitatea enzimelor este optimă întrun interval de pH cuprins între 5 și 9 și reprezintă chiar pH-ul normal al mediului în care își îndeplinesc funcția catalitică. Există și enzime care prezintă activitate optimă la o valoare a pH-ului în afara acestui interval (de exemplu, pepsina are pH optim=1,5). [38, 18, 20, 45, 46]

Fig. 2.14 Influența pH-ului asupra activității enzimelor

Relația activitate-pH reflectă echilibrul dintre denaturarea enzimelor la pH mare sau mic, precum și efectele asupra încărcăturii electrice a enzimei și a substratului.

Variațiile ionizării acestor grupări determină schimbări conformaționale moleculare care duc la variații ale capacității enzimei de a se combina cu substratul. [19, 38, 45]

În fiecare celulă există un amestec complex de enzime, deci se poate considera că pH-ul intra- și extracelular poate constitui un factor important de reglare a proceselor metabolice. Acidul lactic (factorul de oboseală rezultat în urma unei activități musculare intense) duce la starea de epuizare prin acidifierea citoplasmei și blocarea sintezei de ATP, deoarece sunt inhibate enzimele din tot fluxul glicolitic. [20, 18, 46]

Influența potențialului redox

Potențialul redox al mediului influențează starea grupărilor care pot suferi oxidări sau reduceri și care intră în constituția enzimelor. Această influență se exercită în special asupra grupărilor –SH.

Acest gen de modificări determină schimbări conformaționale ale enzimei și antrenează astfel modificări ale activitătii enzimatice. [18, 46]

În general, oxidarea grupărilor –SH duce la inactivarea enzimelor și, de aceea, pentru menținerea activității se adaugă uneori în mediu reductori convenabili, cum ar fi cisteina sau glutationul care reduc puntea disulfurică S-S a enzimei iar reductorul se oxidează trecând în forma disulfurică:

Radiațiile ionizante (raze X, unde radioactive sau  în doze mici formează specii oxidante care pot inactiva enzimele, în special pe cele care conțin grupări –SH în situsul activ. Efectul acestor radiații poate fi și direct, prin producere de ionizări la nivelul moleculei de enzimă. [18, 38, 45, 46]

Vibrațiile sonore și ultrasunetele provoacă reacții multiple în moleculele enzimelor cum ar fi oxidarea nucleelor aromatice, liza grupărilor –SH, depolimerizarea. [18, 46]

Acțiunea presiunilor înalte

Presiunile mai mari de 10.000 de atmosfere determină modificări ale gradului de ionizare al componentei proteice, ale structurii și gradului de ionizare al mediului ce înconjoară enzima. [18, 46]

Influența ionilor

Ionii aflați în mediul de reacție influențează activitatea enzimelor deoarece determină, de obicei, fixarea apei în măsură mai mare sau mai mică pe moleculele proteice ale enzimelor. Hidratarea proteinei enzimatice influențează conformația moleculelor iar aceasta influențează activitatea enzimei. [18, 46]

Activatori ai enzimelor

Activatorii sunt substanțe care măresc activitatea enzimelor. Acest proces are loc prin stimularea directă a enzimelor sau prin îndepărtarea unor inhibitori din sistem. [40]

Principalele tipuri de activatori:

care acționează prin deblocarea centrilor activi din molecula enzimelor. În unele cazuri, enzimele sunt secretate sub formă inactivă numite proenzime. Sub influența unor factori sau a altor enzime proenzimele trec în enzime active. De exemplu, acidul clorhidric determină trecerea pepsinogenului (proenzimă) în pepsină (enzima activă). [40]

care acționează asupra enzimei prin înlăturarea din sistem a unor inhibitori enzimatici. Substanțele adăugate în sistem pentru protejarea enzimelor de factorii care o inactivează sau o deanaturează se numesc protectori. De exemplu, proteinele activează ureaza prin captarea ionilor inhibitori din sistem.

care sunt componente ale enzimelor sau care stimulează direct activitatea acestora. De exemplu, amilaza salivară este activă doar în prezența ionilor de clor. [40]

Inhibitori ai enzimelor

Substanțele care micșorează activitatea enzimelor se numesc inhibitori.

Inhibitorii care acționează numai asupra anumitor enzime se numesc specifici iar cei care acționează asupra mai multor enzime se numesc nespecifici.

După mecanismul prin care se realizează inhibarea enzimatică se cunosc două tipuri de inhibiție : competitivă și necompetitivă.

Inhibarea competitivă se produce când inhibitorul are o structură moleculară asemănătoare cu substratul. Cantitatea de enzimă care se combină cu substratul se micșorează datorită faptului că o parte din aceasta se combină cu inhibitorul și scade viteza de reacție. [19, 40]

Inhibarea necompetitivă are loc atunci când inhibitorul nu are o structură asemănătoare cu substratul. În acest proces, inhibitorul reacționează cu enzima, cu complexul enzimă – substrat și rar cu substratul. [19, 40]

Inhibarea unei reacții depinde de cantitatea inhibitorului și de cantitatea enzimei, acțiunea inhibitorului putând fi redusă prin creșterea concentrației enzimei.

2.4 SURSE DE ENZIME

Enzimele sunt catalizatorii responsabili de metabolismul celulelor. Celulele diferitelor surse sunt principala sursă de enzime. Enzimele pot fi produse din orice organism viu sau prin extracția lor din celule. [4]

Țesuturile plantelor și organelor animale precum și sursele microbiale sunt cele mai importante surse de enzime utilizate în biotehnologie. [4]

Marea majoritate a enzimelor utilizate pentru biotransformările în chimia organică sunt utilizate într-o formă brută și sunt relativ ieftine. Preparatele, de obicei, conțin doar aproximativ 1-30% enzime propriu-zise, restul fiind proteine ​​inactive, stabilizatori, săruri tampon, sau carbohidrați din amestecul de fermentare, din care acestea au fost izolate. De reținut este faptul că preparatele brute sunt de multe ori mai stabile decât enzimele pure. [4]

Principalele enzime pentru biotransformări sunt:

– proteaze și lipaze produse în cantități uriașe în industria de detergenti. Acestea sunt în mare parte utilizate ca aditivi pentru detergenți, să efectueze hidroliza impurităților proteinogene și acizii grași în procesul de spălare. [16, 8, 53]

– proteaze si lipaze utilizate în industria alimentară pentru procesarea cărnii și a brânzei și pentru ameliorarea grăsimilor și uleiurilor. [50] Glicozidazele și decarboxilazele sunt angajate predominant în industria berii și a panificației. [16]

– numeroase enzime pot fi izolate din deșeuri de sacrificare sau din organele ieftine ale mamiferelor, cum ar fi rinichi sau ficat. [16, 8, 53]

– sursele cele mai bogate și cele mai convenabile ale enzimelor sunt microorganismele. Numere impresionante de biocatalizatori sunt derivate de origine bacteriană și fungică din fermentații ieftine. [16, 8, 53]

– numai o proporție mică de enzime utilizate în biotransformări este obținută din surse vegetale, cum ar fi fructele (de exemplu papaya, ananas) și legume (de exemplu tomate, cartofi). Întrucât culturile sensibile de celule de plante au fost folosite în trecut, enzimele din plante sunt în prezent clonate într-un microorganism rezistent pentru producție. [16, 8, 53]

Enzimele pure sunt, de obicei, foarte scumpe și sunt, astfel, în cea mai mare parte vândute pe unitate, în timp ce preparatele brute sunt adesea transportate în cantități mari (kg). [16]

Bogate în enzime sunt semințele în stare de germinație, plantulele, frunzele, țesuturile meristematice, fructele etc.

În general, plantele tinere au un conținut mai ridicat de enzime decât plantele bătrâne. Puterea catalitică a enzimelor din organismele în creștere este mai mare decât a celor din organismele bătrâne. [8, 53]

La începutul studierii reacțiilor catalizate de enzime din plante s-a utilizat morcovul. Părți din rădăcini de morcov (Daucus carota), au fost pur și simplu mărunțite cu un cuțit de bucătărie iar substratul a fost adăugat la o suspensie amestecată de rădăcini. După 50 h, amestecul racemic 2-metilciclohexanonă a fost redus și după 54 h amestecul racemic 2-hidroxiciclohexanonă a fost redus de asemenea. Acest studiu a determinat investigații cu privire la utilizarea plantelor proaspete, intacte, ca reactiv mai degrabă decât sistemele de celule, în suspensie sau imobilizate sau orice enzime derivate. Invenția a fost legată de deschiderea inelulului epoxidic și reducerea cetonelor folosind părți de plante sau organe de animale. [24]

Mai târziu a fost utilizată rădăcina de morcov pentru a efectua în mod direct reducerea enantioselectivă a unei varietăți de cetone alifatice și aromatice și -cetoesteri.

Tabelul 2.4 Materii vegetale utilizate în reacții chimice organice [24]

Tabelul 2.4 unde:

a =numai preparate din plante întregi; b =reacții; B: Deracemizare de alcool; C: Deracemizare de esteri; D: hidroliza esterilor; E: Reducerea de către o aldehidă la un alcool primar; F: Oxidarea unui alcool la un carbonil; G: Reducerea unei R, a- cetone nesaturate la un alcool alilic; H: Reducerea de azidocetone; I: Reducerea unei legături duble; J: reducerea chirală a unei cetone; K: reducerea chirală a unei cetone aromatice; L:Reducerea chirală a unei cetone de un cetoester; c =tentativă – rezultat slab.

Mai recent a apărut un studiu mai sistematic în ceea ce privește utilizarea mai multor legume pentru a realiza reducerea unei serii de cetone și oxidarea a trei amestecuri racemice ale derivaților 1-feniletanolului. Materialele folosite au fost rădăcină de plante de brusture (Arctium lappa L.), tuberculi dulci de cartofi albi (Ipomeoa batatas (L.) Lam.), tuberculi dulci de cartofi rosii (Ipomeoa batatas (L.) Lam.), tuberculii de cartofi (Solanum tuberosum), rădăcini de sfeclă (Beta vulgaris L.), tuberculi de ignamă (Dioscorea alata L.), bulbi de arpagic (Allium shoenoprasum L.), rădăcini de coriandru (Coriandrum sativum L.), rădăcini de ghimbir (Zingiber officinale Roscoe), rădăcini de taro (Colocasia esculenta (L.) Schott), rădăcini de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.), rădăcini de manioc (Manihot esculenta Crantz), rădăcini de arracacha (Arracacia xanthorrhiza Bancroft), rădăcini de napi (Brassica rapa L.), rădăcini de ridiche (Raphanussativus L.), și rădăcini de yacon – „mărul de pământ” (Polymnia sonchifolia Poepp.). [24]

CAPITOLUL 3. INDOLIZINE

Indolizina (*) a fost descoperită în 1890 de Angeli și preparată pentru prima dată de Scholtz, în 1912, din 2-picolină și anhidridă acetică. [34, 35, 36]

În literatura de specialitate, acest compus (*) a fost denumit pirindol, pirodină, piricolină, dar cea mai utilizată denumire este indolizina.

Numerotarea ciclului este următoarea:

Indolizinele sunt sisteme heterociclice cu azot de importanță fundamentală. Sistemul este izoelectronic cu indolul și reprezintă o serie de compuși heterociclici care sunt relaționate structural cu purinele (din ADN, ARN). Prin urmare, pot fi considerate sisteme 10-π electronice. Indolizinele prezintă importanță pentru studiul heteroanalogilor azulenelor. Indolizinele și derivații lor parțial hidrogenați constituie structura de bază a numeroși alcaloizi naturali: (-)slaframina, (-)dendroprimina, coniceina etc. De asemenea, indolizinele reprezintă intermediari cheie pentru sinteza indolizidinelor, bisindolizinelor, ciclofanilor, ciclazinelor și a altor compuși cu importanță biologică. [34, 36, 37]

Indolizinele și derivații lor prezintă numeroase aplicații biologice, farmacologice și medicinale (prezintă proprietăți fluorescente, antimicrobiene, antibacteriene; potențial antioxidant; sunt utilizate în tratamentele antitumorale, antituberculozice, pentru prevenirea și tratarea cancerului, pentru hipertensiune și boli de inimă). [37, 29]

Nucleul indolizinic a fost sintetizat cel mai frecvent prin N-cuaternizarea secvențială urmată de reacții de ciclocondesare intramoleculară sau reacții de cicloadiție ale sărurilor de N-acil/alchil piridiniu. [34, 35, 36]

Sinteza indolizinelor prin reacții de cicloadiție

Cicloadiții dipolare

Cicloadiția 1,3-dipolară este una dintre cele mai importante metode de obținere a indolizinelor.

În literatura de specialitate există numeroase exemple de cicloadiții intramoleculare și intermoleculare ce implică 1,3-dipoli ca: nitroxizi, nitrilimine, azide, nitrone și azot-ilide cu diferiți dipolarofili. [11, 12, 26, 49, 54]

Piridiniu-metililidele, datorită particularităților structurale, pot da reacții de cicloadiție [3+2] dipolară cu agenți dienofili, acetilenici sau olefinici activați, conducând la derivați indolizinici. [35, 36]

Piridiniu-ilidele carbanion monosubstituite dau cu dipolarofili 1,2-acetilenici activați, cicloaducți cu structură indolizinică. Aductul (a) format inițial prezintă o tendință pronunțată de aromatizare, trecând în indolizina (b) prin transfer de hidrogen către excesul de dipolarofil, sau prin disproporționare, în unele cazuri se utilizează și catalizatori de dehidrogenare ca Pd/C. [36, 36]

Derivați indolizinici se obțin din reacția piridiniu-ilidelor carbanion disubstituite cu derivații acetilenici (de exemplu DMAD). În acest caz aromatizarea se realizează prin eliminarea uneia din grupările electronice ale carbanionului, cu hidrogenul din poziția α a nucleului piridinic. [35, 36, 47]

Sarkunam și Nallu au realizat sinteza de 7-dimetilamino-indolizine (c), utilizând N,N-dimetilamino-piridină cuaternizată cu 2-bromo-acetofenone, urmată de o reacție de cicloadiție 1,3-dipolară cu DMAD în mediu bazic. [34, 42, 47]

Padwa și colaboratorii au studiat reacțiile de cicloadiție [3+2] dipolare ale alchinelor activate cu piridiniu-metilide-metiltiosubstituite (din reacția derivaților piridinici substituiți corespunzători), cu α-diazoacetofenona, în prezența catalizatorilor complecși de rodiu. La tratarea α-diazoacetofenonei cu 2-(metiltio)-piridina (d), în prezență de DMAD în exces, se obține 3-benzoil-1,2-dicarbometoxi-3,5-dihidro-5-(metiltio)-indolizina (e). [42, 47]

Prin reacția bromurilor de 2-cloro-1-fenacil-piridiniu (f) cu acetilen-dicarboxilatul de dimetil (DMAD), în prezența trietilaminei, Babaev și colaboratorii au realizat recent sinteza derivaților de 5-clorindolizină (g).

Reacțiile de cicloadiție [3+2] dipolare ale piridiniu-ilidelor cu dipolarofili cu triplă legătură conduc, de multe ori, la obținerea unor clase de compuși heterociclici cu importanță practică deosebită, greu de sintetizat pe altă cale.

Delattre și colaboratorii au studiat reacțiile de cicloadiție 1,3-dipolară a 4-piridiniu-ilidelor cu propiolatul de 4-nitrofenil și respectiv cu propinamido-β-ciclodextrina. Aceștia au obținut noi piridino-indolizine substituite (i) cu aplicații la obținerea de β-ciclodextrine fluorescente (j). [11]

Reacția de ciclizare, în cazul dipolarofililor olefinici, conduce la produși tetrahidroindolizinici (k), care se izomerizează sau se descompun cu eliminarea nucleului piridinic sau se dehidrogenează la cicloaductul indolizinic final (m), în funcție de natura și poziția substituenților. [47]

Un grup de cercetători chinezi, au stabilit procedeul de sinteză pentru două clase de agrochimicale importante, indolizin-3-carboxamidele (p) și indolizin-3-carbonitrilii (q), prin tratarea bromurilor de N-ciano-metil-piridiniu (n) cu dipolarofili olefinici (dimetil-maleat, dietil-maleat, acrilonitril, acrilat de metil).

Plecând de la sărurile de N-carboximetil-piridiniu (r) la tratare cu olefine activate, în prezență de catalizatori MnO2, în mediu bazic, s-au putut sintetiza și noi indolizine-3-nesubstituite (s), cu importanță deosebită datorită densității electronice mărite din poziția 3 a nucleului indolizinic, care permite realizarea cu ușurință a substituției electrofile în această poziție, în scopul obținerii a unei clase de compuși heterociclici cu interesante aplicații. [37, 47]

Heterociclii cu fluor prezintă o importanță deosebită pentru biologie, farmacologie și industrie.

Astfel, cercetările s-au orientat și spre sinteza de noi derivați fluorurați ai indolizinelor. Zhu a realizat reacția 4-etoxi-1,1,1-trifluorobut-3-en-2-onei cu N-ilide, care conduce la obținerea de heterocicli trifluorosubstituiți. [37, 47, 54]

Wu și Wang au sintetizat indolizine și benzo-indolizine monofluorurate, prin reacția de cicloadiție 1,3-dipolară a vinil-tosilatului fluorurat cu piridiniu- și izochinoliniu-N-ilide generate in situ din sărurile corespunzătoare (mediu bazic). [17]

CAPITOLUL 4. OBȚINEREA EXPERIMENTALĂ A INDOLIZINELOR

4.1 OBIECTIVELE LUCRĂRII

Scopul lucrării a fost de a utiliza enzimele de proveniență vegetală pentru a cataliza reacții chimice organice. Am utilizat extracte vegetale de conopidă, varză, praz, ridiche, hrean, țelină, cartof dulce, păstârnac, rădăcină de pătrunjel, bob (germeni), soia (germeni), dovlecel (germeni), leurdă pentru a cataliza reacțiile de obținere a indolizinelor.

Obiectivele lucrării presupun parcurgerea următoarelor etape:

Obținerea biocatalizatorilor enzimatici;

Obținerea pe cale clasică a indolizinei;

Sinteza indolizinelor prin reacții biocatalizate;

Analiza compușilor obținuți.

4.2 MATERIALE ȘI METODE

Specii vegetale utilizate în laborator

În literatura de specialitate se găsesc foarte multe exemple de reacții chimice catalizate de enzime de proveniență vegetală. Foarte multe materiale vegetale conțin complexe enzimatice foarte active, printre acestea enumerându-se: hreanul, soia, păstârnacul, morcovul, varza.

În cele ce urmează, sunt descrise principalele caracteristici ale materialelor vegetale utilizate în biosinteza realizată în laborator.

Hreanul

Cea mai importantă caracteristică a rădăcinilor de hrean constă în puternica activitate peroxidazică. Peroxidaza hreanului în stare înalt purificată a fost studiată cu mulți ani în urmă sub aspectul compoziției și al factorilor care îi influențează activitatea.

Pentru a oferi o imagine asupra intensității activității, exprimată în unități convenționale, la ceapă, ardei, ridichi și țelină se întâlnesc valori până la 8.000, la sparanghel până la 120.000, iar la rădăcinile de hrean valorile ajung 560.000. Activitatea peroxidazei din rădăcinile de hrean este de aproape 10 ori mai intensă decât cea a verzei și castraveților. În rădăcini s-au urmărit numeroase alte enzime cum sunt glucoprotein-uridindifosfat-N-acetilglucozamintransferaza, invertaza, lipaza, proteaze, amilaza, malicodehidrogenaze și sulfataze. [14, 23]

Unele studii au ca obiect influența factorilor externi asupra compoziției chimice a rădăcinilor. Temperatura foarte scăzută de -20 ͦC, la care sunt ținute rădăcinile timp de 30 minute, scade activitatea peroxidazei cu 13%. Privitor la tratamentul cu insecticide, s-au determinat reziduurile și s-a stabilit că Malathionul inhibă, iar Diclorfossul activează peroxidaza rădăcinilor. [14, 23]

Bobul (germeni)

În frunzele de bob și germeni s-a cercetat activitatea unei serii de enzime, cum sunt D-galactozil-1-fosfat, catalaza, peroxidaza, polifenoloxidaza, nitratreductaza, RNA-sintetaza și carboxilaza ribulozo-difosfatului. [14]

Cartoful dulce

Din compoziția chimică a cartofului dulce s-au identificat următoarele enzime: polifenoloxidază, peroxidază, poligalacturonază, pirofosfat-mevalonat-decarboxilază, acetat CoA-ligază, fenilalaninamoniu-liază, citocrom-oxidoreductază, invertază și enzime pentru sinteza izopentenil-pirofosfatului. [14]

Conopida

În compoziția chimică a inflorecenței s-au studiat enzimele de oxidoreducere (peroxidază, catalază, lipoxidaza, α-ceto-glutarat-dehidrogenaza, malat-dehidrogenaza și ascorbinoxidază), sintetaze (RNA-polimeraza II, dependentă de DNA) și hidrolaze (pectinesteraza, poligalact-uronaza). Activitatea peroxidazei, mai slabă decât la varza albă, este similară cu cea a verzei roșii. [14]

Dovlecelul

În cercetările științifice, în studiul compoziției chimice a dovlecelilor, i s-a acordat o atenție deosebită peroxidazei. Alte enzime identificate în dovlecel sunt: α-galactozidaza, polifenoloxidaza, indolilaceticoxidaza, lipoxidaza.

Păstârnacul (rădăcină)

Enzimele identificate în compoziția chimică a păstârnacului sunt: peroxidaza, polifenoloxidaza, ascorbinoxidaza. [14]

Pătrunjelul (rădăcină)

În cercetările științifice, activitatea enzimatică a rădăcinilor de pătrunjel a fost urmărită în cazul glutation-reductazei și malic-dehidrogenazei la rădăcini. [14]

Praz

Activitatea enzimatică a prazului a fost urmărită în cazul peroxidazei, acetil-CoA-sintetaza, malonil-CoA-sintetaza, stearil-CoA-sintetaza.

Ridichi negre (rădăcini)

Activitatea enzimatică a fost urmărită în cazul lipoxidazei și peroxidazei. Activitatea peroxidazei din ridichile de iarnă este de aproape 3 ori mai mică decât la ridichile timpurii. [14]

Soia (germeni)

Enzimele a căror activitate a fost cercetată sunt peroxidaza și lipoxidaza. [14]

Țelină (rădăcină)

Enzimele cercetate din compoziția chimică a țelinei sunt peroxidaza, polifenoloxidaza și lipoxidaza. [14]

Varză albă (frunze)

Una dintre enzimele a cărei activitate a fost cercetată mai mult la varză este peroxidaza însă s-a mai urmărit și activitatea lipoxidazei. [14]

Metodele de lucru utilizate pentru realizarea obiectivelor lucrării

Metode de separare: extracția cu solvenți

Extracția cu solvenți a fost utilizată pentru separarea biocatalizatorilor enzimatici perecum și pentru separarea produsului de reacție, indolizina.

Extracția este una din operațiile de bază ale practicii chimiei organice fiind una din principalele metode de separare și purificare a substanțelor organice. Extracția este operația prin care unul sau mai mulți componenți ai unei faze (lichide sau solide) sunt transferați într-o altă fază (lichidă), nemiscibilă sau parțial miscibilă, adusă în contact cu prima. Alegerea solventului este esențială pentru eficiența procesului de extracție și se ține cont de:

selectivitatea pentru componenta de extras;

modificarea solubilității se poate face schimbând temperatura, pH-ul;

solventul trebuie să fie cât mai pur pentru a nu modifica valoarea coeficientul de repartiție a lui Nernst;

solventul să nu reacționeze cu substanța de extras și să nu fie afectat de modificările de pH, substanțele organice, viteza de circulație etc.

În practică, în funcție de modul de repartizare a componentei de extras în solvent, se folosesc două procedee de extracție:

Extracția simplă, în care solventul vine o singură dată în contact cu substanța de extras, în timp ce rafinatul poate fi extras de mai multe ori cu solventul proaspăt;

Extracția multiplă, în ambele faze vine în contact repetat solventul cu substanța de extras, fiecăruia corespunzându-i o nouă repartiție la echilibru.

2. Metode cromatografice

Metodele cromatografice au fost utilizate pentru urmărirea procesului enzimatic și identificarea și separarea produșior de reacție.

Metodele cromatografice se bazează pe repartiția componentelor dintr-un amestec între două faze: una staționară și alta mobilă.

Faza staționară poate fi un solid adsorbant cu structură microcapilară (cromatografie de adsorbție), un lichid depus pe suport solid (repartiție), un schimbător de ioni (schimb ionic) sau un gel (cromatografie de excluziune sterică). [21] Faza mobilă poate fi gaz (Ar, He, N2) sau lichid (solvent sau amestecuri de solvenți de înaltă puritate, soluții tampon și mai recent CO2 in condiții supercritice). La intrarea în coloana cromatografică, faza mobilă poartă numele de eluent sau developant, iar la ieșire se numește efluent sau eluat.

Tabel 4.1 Principalele tehnici cromatografice folosite la analiza compușilor organici

Pentru efectuarea separărilor și analizelor cromatografice se parcurg următoarele etape: pregătirea probelor (extracție, purificare etc.), separarea cantitativă din curentul fluidului de transport (eluție) și detecția (developarea sau identificarea) componentelor prin metode fizico-chimice adecvate. [21]

O analiză cromatografică se rezumă în general la următoarele concepte fundamentale:

proba este dizolvată în faza mobilă;

faza staționară este, cel mai frecvent, un lichid adsorbit la suprafața unor particule de solid utilizate pentru a împacheta coloana;

faza mobilă este trecută peste faza staționară nemiscibilă (aceasta se numește eluție);

solutul care are o mare afinitate față de faza mobilă se va mișca prin coloană foarte încet;

componenții probei se vor separa în benzi discrete vizibile la detector, și rezultă cromatograma.

Cromatografia este utilizată pentru:

analiză: examinarea amestecului, a componentelor sale și relațiile dintre acestea.

identificare: determinarea unui amestec sau componente pe baza unor componente deja cunoscute

purificare: separarea componentelor pentru a izola unul dintre ele ce prezintă interes pentru studii ulterioare

cuantificare: determinarea cantității amestecului și/sau a componentelor prezente în probă.

Cromatografia lichidă separă probe de lichid cu un solvent lichid (faza mobilă) și cu o coloană compusă din microsfere solide (faza fixă). [21]

Cromatografia gazoasa separă probe de vapori cu un gaz transportor (faza mobilă) și o coloană de microsfere lichide sau solide (faza fixă). [21]

Cromatografia pe hârtie separă probe de lichide uscate cu un solvent lichid (faza mobilă) și o bandă de hârtie (faza fixă). [21]

În cromatografia pe coloană, faza staționară (CaCO3, SiO2, Al2O3, celuloză, poliamidă etc.) este depusă într-o coloană de diverse dimensiuni. Eluentul preia proba injectată la intrarea în coloană și o distribuie pe toată lungimea ei. La ieșirea din coloană, în eluent se regăsesc, treptat, componenții în ordinea crescătoare a retenției lor pe faza staționară. Detectorul dă un semnal preluat de computer și afișat sub formă de cromatogramă. [21]

Fig.4.1 Principiul constructiv și funcțional al cromatografelor

Cromatografele sunt prevăzute cu sisteme de alimentare cu fază mobilă de debit perfect controlat, valvă pentru injecția probei, coloană cromatografică termostatată la temperatura separării, detector de componente eluate, sistem computerizat de preluare și prelucrare a semnalelor detectorului și de afișare a cromatogramei. [21] Cromatograma simplificată din figură prezintă picuri a căror suprafață este proporțională cu concentrația componentelor separate. Fiecare pic apare după un timp de retenție în coloană a componentei și este o caracteristică importantă în condiții standard.

În concluzie, cromatografia, în toate variantele sale, permite determinări calitative și cantitative de compuși organici din amestec.

Cromatografia în strat subțire (TLC)

În cromatografia pe hârtie și în strat subțire (cu fază staționară: SiO2, Al2O3, poliamide, celuloze modificate etc., depusă pe plăcuțe de sticlă sau metalice), faza mobilă este un amestec de solvenți bine aleși. După distribuirea componenților de către eluent și reținerea în funcție de afinitatea lor față de suport, se realizează developarea cu reactivi specifici. Raportul dintre distanța parcursă de fiecare compus din start și cea de migrare a solventului reprezintă Rf-ul, o constantă de identificare a componentelor separate în condiții standard. [21]

O picătură de probă este aplicată peste o bucată de hârtie sau sticlă având faza staționară impregnată. Capătul suprafeței de hârtie sau sticlă este apoi scufundată într-o cantitate de solvent, care servește că fază mobilă. Solventul migrează de-a lungul fazei staționare, separând componenții probei în lungul drumului său. Când solventul ajunge în vecinătatea părții superioare, este înlăturată cantitatea suplimentară de solvent și este lăsat să se usuce.

Cromatografia în strat subțire (TLC), rapidă și foarte flexibilă, este utilizată pentru o gamă largă de substanțe. Metodele TLC, indiferent dacă sunt manuale sau automate (TLC de înaltă performanță [HPTLC]), oferă o serie de avantaje: reduc costurile, elimină instrumentele complicate și etapa de pregătire a probelor, sunt ușor de reprodus și permit utilizarea de probe multiple în condiții identice. Mai mult, metodele TLC pot fi transpuse ușor la scala preparativă (cromatografie preparativă în strat subțire).

Modul de lucru:

Hârtia cromatografică se decupează la dimensiunile cerute de bacul cromatografic și de numărul de spoturi care urmează a fi depuse (plăcile pentru strat subțire sunt pregătite în prealabil și activate). Ele au dimensiuni standard, iar adsorbantul se alege după natura componenților și amestecul de solvent pentru eluție. Amestecul de solvent se introduce în camera de cromatografie și se atașează capacul pentru a ajunge la saturație de vapori.

Proba de analizat, dizolvată în general într-un solvent se aplică la baza plăcii cromatografice la 10-20 mm de margine. Probele aplicate pe placi trebuie să conțină minim 0,01% concentrație din componentele de separate, însă nu trebuie să fie foarte concentrate, deoarece la concentrații mari separarea va deveni difuză. După aplicarea probelor, locurile de depunere trebuie uscate foarte bine. După evaporarea solventului de extracție, placa cromatografică se introduce în camera de developare care conține faza mobilă. După ce developantul a atins distanța de deplasare prevăzută pe placa sau hârtia cromatografică, se scoate, se usucă și se trece la detecția componenților.

Fig.4.2 Etapele analizei TLC

Cromatografia HPLC

Cromatografia de lichide de înaltă performanță cuprinde cele mai frecvente și aplicabile metode moderne de analiză cromatografică bazate pe repartiția lichid –lichid, pe adsorbția lichid-solid, pe schimbători de ioni și pe procesele de excludere-difuzie. [50]

Cromatografia HPLC pe coloană este cea mai utilizată în prezent pentru separări, detecții și mai ales pentru determinări cantitative și cuprinde 2 metode:

cromatografia HPLC de adsorbție – tehnică relativ puțin utilizată; se practică pe faze staționare de silicagel și de alumină, mai frecvent utilizat silicagelul deoarece are o capacitate mai mare, putând fi folosit într-o varietate mai mare de condiționare. [50]

cromatografia HPLC de repartiție – este cea mai utilizată dintre tehnicile cromatografice în fază lichidă și se poate practica sub forma cromatografiei HPLC lichid-lichid și HPLC lichid-fază grefată. [50]

În varianta lichid–lichid, faza staționară se fixează prin adsorbție fizică, în timp ce în varianta cu fază legată este vorba de legaturi covalente. Varianta lichid –lichid are mai puține aplicații practice, mult mai utilizată fiind cromatografia HPLC pe fază legată chimic. [50]

În cromatografia HPLC de repartiție se disting două procese în funcție de polaritatea fazelor staționară și mobilă:

-cromatografia pe „fază staționară normală”, foarte polară (apă, trietilglicol etc.) în care ca fază mobilă se utilizează un solvent practic nepolar (sau foarte slab polar) cum este n-hexanul sau eter izopropilic;

-cromatografia pe „fază inversă”, în care faza staționară este nepolară (hidrocarburi lichide), iar faza mobilă este relativ polară. [50]

În planul practic se observă că în cromatografia pe fază normală a unui amestec de analiți, primul care se eluează este analitul mai puțin polar, iar creșterea polaritații fazei mobile reduce timpul de eluție al acestuia. În cromatografia pe fază inversă este eluat mai întâi analitul cel mai polar, iar creșterea polarității fazei mobile prelungește timpul de eluție al acestuia. [50]

În cromatografia de repartiție există două tipuri de faze staționare în funcție de modul lor de imobilizare:

-faze staționare impregnate formate din particule solide foarte fin divizate, care pot fixa pe suprafața lor sau în porii lor o cantitate de lichid (faza staționară propiu zisă) suficient de mare. Fazele staționare solide utilizate în cromatografia de adsorbție, pot fi utilizate în stare poroasă ca support pentru lichidele utilizate ca fază staționară în cromatografia de repartiție. [50]

-faze staționare grefate sunt legate chimic, proces prin care se mărește stabilitatea lor pe support acestea se prepară prin eterificarea grupelor silanol cu molecule de polioli, obținându-se ansambluri de lanțuri polare răsfirate pe care se produce repatiția analiților. [50]

Ca regulă generală, pentru realizarea de separări cromatografice bune și eficiente, în majoritatea cazurilor polaritatea fazei staționare trebuie să fie asemanătoare cu cea a analitului, în timp ce polaritatea fazei mobile trebuie să fie diferită. Dacă faza mobilă are o polaritatea apropiată de aceea a analitului, dar foarte diferită de aceea a fazei staționare, eficacitatea separării este mult mai mică. Nu este de dorit nici cazul în care polaritatea fazei staționare și analitului sunt foarte apropiate. Tot ca regulă generală pentru cromatografia de repartiție, alegerea fazei mobile și condițiile ei de utilizare sunt oarecum similare celor privitoare la cromatografia de adsorbție și anume:

-faza mobilă trebuie să aibă o mare putere de dizolvare dar să nu interacționeze chimic cu analiții din probe;

-să fie compatibilă cu sistemul de detecție;

-să nu dizolve faza staționară și să nu interacționeze chimic cu aceasta; această condiție este mai greu de îndeplinit deoarece este practic imposibil să se obțină o miscibilitate perfectă între două faze lichide. Acest inconvenient se poate rezolva prin saturarea reciprocă a celor două faze, una cu alta înaintea separării cromatografice, sau trecând faza mobilă printr-o precoloană încărcată cu faza staționară lichidă. [50]

Trebuie făcute încă două precizări și anume:

-în cromatografia clasică de repartiție pe coloană, faza staționară este de regulă apa, iar faza mobilă este formată din solvenți organici mai puțin polari, între care n-butanul, cloroformul sau toluenul.

-în cromatografia de lichide de înaltă performanță -HPLC- faza staționară este de regulă un lichid polar vâscos cum este polietilena, etilenglicolul, iar faza mobilă este formată din solvenți nepolari sau puțin polari cum sunt:

-unele hidrocarburi lichide pure precum pentanul, ciclohexanul, hexanul, heptanul, izooctanul, uneori acestora li se pot adăuga mici cantități de cloroform sau metanol;

-dioxanul, eter butiric, nitrometan.

În cromatografia pe fază inversă, faza staționară este nepolară, iar faza mobilă este polară, fiind formată din apă, metanol, acetonitril sau din amestecuri în diferite proporții ale acestora. Odată separate, diversele substanțe supuse analizei HPLC sunt detectate cu ajutorul unuia dintre detectorii înscriși în tabel în care sunt date și unele performanțe analitice ale acestora. Așa cum se poate observa din cest tabel, în HPLC nu exisă detectori universali atât de sensibili ca cei utilizați în gaz cromatografie. Dintre detectorii mai frecvent utilizați sunt cel UV și cel electrochimic. [50]

Tabel 4.2 Detectorii HPLC

Cromatografia HPLC de repartiție are numeroase aplicații practice la separarea, detecția și dozarea a numeroase tipuri de substanțe organice inclusiv medicamentoase, între care:

-antibiotice, sedative, steroizi, analgezice;

-aminoacizi, proteine, hidrați de carbon, lipide;

-edulcoranți artificiali, antioxidanți, aditivi, aflatoxine;

-stupefiante, otrăvuri, alcool în sânge;

-acizi biliari, metaboliți ai medicamentelor, estrogeni, extracte din urină;

-pesticide, erbicide, fenoli;

– surfactanți, coloranți, combustibili. [50]

Pentru analizele realizate a fost utilizat un aparat Finnigan Surveyor Thermo Scientific, echipat cu sistem de detecție cu diode și autosampler. Coloana analitică folosită a fost o coloană BDS HYPERSIL C18 (150 x 4,6 mm2, porozitate 5µm), iar eluentul a fost acetonitril, metoda utilizată permițând un debit de 0,7 mL/min. Din fiecare probă s-au injectat 10 µL.

3. Metode spectrofotometrice ( UV-VIS )

Metode spectrale au fost utilizate pentru identificarea produșilor de reacție.

Spectrele rezultate la absorbția radiațiilor cu = 1201000 nm sunt numite spectre electronice și pentru că lungimea de undă aparține domeniului ultraviolet (UV) cu = 120-195 nm, numit de vid și = 195-400 nm, ultraviolet de cuarț, respectiv, vizibil (VIS) cu = 400-800 nm, spectrele din întregul domeniu se mai numesc generic spectre UV-VIS. [21]

Spectrele de absorbție din domeniul vizibil și ultraviolet implică tranzițiile electronilor între starea fundamentală și o stare electronică excitată a moleculelor, fiind permise tranzițiile între orbitale moleculare de același tip și care au loc cu conservarea spinului electronic. Intensitatea benzilor de absorbție depinde de probabilitatea producerii tranzițiilor electronice implicate în absorbția energiei. Pe lângă conservarea spinului, există anumite reguli de selecție, tranzițiile permise de aceste reguli conducând la absorbții caracterizate prin coeficienți molari de extincție, ε, cu valori cuprinse între 104 – 105. Coeficientul molar de extincție se deduce din legea Lambert – Beer:

unde: I0 este intensitatea fascicolului incident și I a celui transmis, c reprezintă concentrația molară (mol/L) și l reprezintă dimensiunea cuvei (cm). [21]

Tranzițiile σ → σ* au loc la absorbția radiațiilor luminoase din domeniul ultravioletului de vid, domeniu greu accesibil din punct de vedere experimental.

Tranzițiile π → π* sunt caracteristice legăturilor delocalizate, benzile corespunzătoare acestor tranziții sunt relativ intense și sunt puternic influențate de mărimea porțiunii conjugate a moleculei. [21]

Tranzițiile n → σ* și cele n → π* sunt situate la lungimi de undă mai mari decât benzile σ → σ* , respectiv π → π* și sunt de intensitate mai mică deoarece corespund tranzițiilor electronice teoretic interzise. Ele sunt mai puțin influențate de dimensiunea moleculei, orbitalele n, corespunzătoare electronilor neparticipanți, fiind localizate pe heteroatomi. [21] Numai compușii care au legături π vor prezenta benzi de absorbție în UV-VIS.

Spectrele electronice sunt cele mai complexe spectre, tranzițiile electronice implicând și tranziții între nivele de rotație și vibrație, spectrele având un caracter de bandă.

Poziționarea benzilor de absorbție și intensitatea acestora este influențată atât de natură substituenților (grupărilor funcțională) prezenți în moleculă cât și de solventul în care este dizolvat compusul. Introducerea anumitor grupări funcționale în molecule poate determina următoarele efecte:

Efect batocrom-deplasarea maximelor de absorbție spre lungimi de undă mai mari;

Efect hipsocrom-deplasarea maximelor de absorbție spre lungimi de undă mai mici;

Efect hipercrom-creșterea intensității de absorbție;

Efect hipocrom-scăderea intensității de absorbție.

Fig. 4.3 Efectele determinate de introducerea anumitor grupări funcționale în molecule

Substituenții care fac ca absorbția să aibă loc în UV-VIS sunt grupări cromofore și sunt în general grupările cu electroni π care pot interacționa cu sistemul de electroni π din restul moleculei, extinzând în felul acesta delocalizarea: -NO2, -NO, -CHO, -COOH.

Substituenții care alături de cromofori produc atât modificarea poziției cât și intensitatea absorbției sunt grupări auxocrome. Acestea sunt grupări saturate de atomi de tipul -OH, -NH2, -Cl.

Spectrele electronice UV – VIS deși mai puțin caracteristice, oferind informațiile generale privind structura moleculară a compușilor referitoare la prezența sau absența în moleculă a unor grupări cromofore, joacă totuși un rol important în studiul și elucidarea structurii compușilor organici.

Cu ajutorul spectrelor electronice se pot obține informații cu privire la natura cromoforilor și la poziția lor relativă față de alte elemente structurale, se pot formula concluzii cu privire la stereochimia moleculelor, la existența legăturilor de hidrogen, a efectelor de conjugare, la influența solvenților. Pe baza comparării a numeroase spectre a unor serii de structuri similare s-a dezvoltat o spectrometrie UV-VIS empirică, ce oferă o serie de informații cu caracter general privind natura compușilor.

Marele avantaj și aport al spectroscopiei UV-VIS este acela că oferă o metodă comodă, dar în același timp modernă și performantă, ce se dovedește de a fi de o mare utilitate în studiile analitice, în studiul vitezelor de reacție și a echilibrelor chimice, în elucidarea mecanismelor de reacție și a interacțiilor intermoleculare.

Obținerea clasică a indolizinei

Reacția de cicloadiție clasică, fără biocatalizator, are loc în două etape, obținerea sărurilor cuaternare de amoniu și transformarea sărurilor cuaternare de amoniu în prezența propiolatului de etil într-un compus fluorescent, indolizina:

Fig. 4.3 Obținerea unui compus florescent dintr-o sare cuaternară de amoniu

Ecuațiile reacțiilor chimice de obținere a compușilor heterociclizi cu azot:

Mod de lucru

Am realizat experimental sinteza unor compuși heterociclici cu azot prin reacții de cicloadiție și am utilizat următoarele substanțe chimice: propiolat de etil, sare cuaternară de amoniu, trietilamină, N-metilpirolidină, ținând cont de tabelul de mai jos.

Tabelul 4.3 Substanțe chimice utlizate

Într-un balon se adaugă: 0,554 g sare cuaternară de amoniu, 0,3037 mL propiolat de etil, 5mL N-metilpirolidină (NMP).

Se agită amestecul.

Fig. 4.5 Agitarea amestecului de reacție

Într-o pâlnie de separare se adaugă 0,4208 mL trietilamina (TEA) și 1mL NMP.

Cu ajutorul pâlniei, se adaugă amestecul în picătură în balon, sub agitare continuă.

Fig. 4.6 Virajul culorii spre violet

Observații experimentale:

După primele 5 minute (la adăugarea a 2 picături amestec) se observă un viraj al culorii de la galben deschis la violet, formarea ilidei, intermediarul amfionic.

După 10 minute (la terminarea adăugării amestecului) se observă un viraj al culorii spre brun foarte închis.

Fig. 4.7 Virajul culorii de la violet la brun foarte închis

Se agită amestecul timp de 7 zile la tcamerei. Dupa 7 zile soluția se filtrează iar filtratul se precipită cu metanol (10mL).

Preciptatul se filtrează și din precipitat se realizează cromatografia pe strat subțire și HPLC (High Performance Liquid Chromatography – Cromatografie lichidă de înaltă performanță). Pentru cromatografia pe strat subțire se utilizează un amestec ciclohexan : acetat de etil 3:1 (v/v).

Se cântărește masa de indolizină (C30H20O2N2, M=440 g/mol ) obținută

(mp = 0,12 g) și se calculează randamentul. Acestea sunt prezentate în tabelul:

Tabelul 4.4 Date experimentale

Obținerea indolizinei prin reacții catalizate enzimatic

Biosinteza indolizinei are loc printr-o reacție de cicloadiție la care participă trei compuși. Spre deosebire de reacția clasică de cicloadiție care are loc în două etape, reacția biocatalizată are loc într-o singură etapă, „one pot”.

Pentru catalizarea reacțiilor am utilizat extracte vegetale de: conopidă, varză, praz, ridiche, hrean, țelină, cartof dulce, păstârnac, rădăcină de pătrunjel, bob (germeni), soia (germeni), dovlecel (germeni), leurdă.

Modul de lucru

Am realizat experimental sinteza unor compuși heterociclici cu azot prin reacții de cicloadiție catalizate enzimatic și am utilizat următoarele substanțe chimice: propiolat de etil, 4, 4’ bipiridil, ω-bromacetofenonă, ținând cont de următorul tabel.

Tabelul 4.5 Substanțe chimice utilizate

Materiile vegetale utilizate: conopidă, varză, praz, ridiche, hrean, țelină, cartof dulce, păstârnac, rădăcină de pătrunjel, bob (germeni), soia (germeni), dovlecel (germeni), leurdă.

Materiile vegetale proaspete, spălate cu apă se mărunțesc.

Se prepară o soluție tampon cu pH~7 format din Na2PO4 (fosfat disodic) și NaHPO4 (fosfat monosodic) astfel: pentru 50 mL soluție se utilizează 0,1873 g NaHPO4, 0,5166 g Na2PO4 și apă distilată.

2 g din fiecare produs vegetal se introduc în 10 mL soluție tampon (pH~7) și se realizează extractele de biocatalizatori care au fost utilizate ulterior în obținerea mai multor probe de reacții enzimatice.

Fig. 4.8 Pregătirea probelor de reacție

Fiecare probă de reacție conține: 2 g produs vegetal, 10 mL soluție tampon și amestecul de reacție: 7,8 mg 4, 4’ bipiridil, 30 mg ω-bromacetofenonă, 17 L propiolat de etil.

Experimentele realizate în laborator sunt ilustrate în următoarele imagini.

Fig. 4.9 Realizarea extractelor enzimatice

Fig. 4.10 Agitarea probelor de reacție

Se agită probele de reacție timp de 7 zile la tcamerei.

Fig. 4.11 Filtrarea probelor

Dupa 7 zile se filtrează probele și se separă fazele prin extracție lichid-lichid cu cloroform.

Fig. 4.12 Se separă fazele prin extracție lichid-lichid cu cloroform

Se separă fazele prin extracție lichid-lichid cu cloroform (10mL) și se realizează cromatografia pe strat subțire (TLC) și HPLC (High Performance Liquid Chromatography – Cromatografie lichidă de înaltă performanță) pentru extractele cloroformice.

Fig. 4.13 Pregătirea probelor pentru analiza cromatografică

Pentru cromatografia HPLC se utilizează câte 1 mL din fiecare extract cloroformic.

Fig. 4.14 Analiza TLC

Pentru cromatografia pe strat subțire se utilizează un amestec ciclohexan : acetat de etil 3:1 (v/v).

Utilizarea indolizinelor ca markeri de fluorescență în germinarea plantelor

Deoarece compușii indolizinici sunt fluorescenți, o utilizare a acestora ar fi ca markeri pentru diverse probe biologice. În acest sens, am pus la germinat boabe de soia și bob în prezența amestecului de reacție utilizat mai sus, pentru a urmări dacă reacția de cicloadiție va avea loc în timpul germinării, știind că, în acest proces, enzimele sunt abundente.

Modul de lucru

Am utilizat experimental sinteza unor compuși heterociclici cu azot prin reacții de cicloadiție catalizate enzimatic în procesul de germinare a plantelor. Am utilizat următoarele substanțe chimice: propiolat de etil, 4, 4’ bipiridil, ω-bromacetofenonă, ținând cont de următorul tabel.

Tabelul 4.6 Substanțe chimice utilizate

Materiile vegetale utilizate: bob, soia.

Fiecare probă de reacție conține: 1 mL apă și amestecul de reacție: 4 mg 4, 4’ bipiridil, 15 mg ω-bromacetofenonă, 8 L propiolat de etil.

Amestecul de reacție se adaugă în mediul de germinare al boabelor de soia și de bob.

Etapele experimentului de laborator sunt ilustrate în următoarele imagini.

Fig. 4.15 Germenii de bob după 22 de zile

Fig. 4.16 Germenii mărunțiți

Fig. 4.17 Filtratele probelor

După 22 de zile am mărunțit germenii, am realizat extracția cu cloroform, după același procedeu, și am realizat analiza TLC și HPLC.

Obținerea indolizinei prin reacții catalizate de enzime comerciale

Biosinteza indolizinei are loc printr-o reacție de cicloadiție la care participă trei compuși. Spre deosebire de reacția clasică de cicloadiție care are loc în două etape, reacția biocatalizată are loc într-o singură etapă.

În urma cercetării plantelor utilizate în etapa anterioară am ajuns la concluzia că enzima comună tuturor plantelor este peroxidaza pe care am utilizat-o în stare pură (provenind din comerț) la biocatalizarea unor reacții de cicloadiție. Reacțiile care au fost realizate cu peroxidaza din hrean, comercială, sunt prezentate mai jos.

Reacția de cicloadiție 1:

Reactanții au fost utilizați ținând cont de următorul tabel:

Tabelul 4.7 Substanțe chimice utilizate

Proba de reacție conține: 3,5 mg peroxidază din hrean (comercială), 1 mL soluție tampon și amestecul de reacție: 13,4 mg C6H6N2O, 19,9 mg ω-bromacetofenonă, 9,6 L propiolat de etil.

Reacția de cicloadiție 2:

Tabelul 4.8 Substanțe chimice utilizate

Proba de reacție conține: 3,5 mg peroxidază pură din hrean (comercială), 1 mL soluție tampon și amestecul de reacție: 7,8 mg bipiridil, 30 mg ω-bromacetofenonă, 17 L propiolat de etil.

Reacția de cicloadiție 3:

Reactanții au fost utilizați ținând cont de următorul tabel 4.9:

Proba de reacție conține: 3,5 mg peroxidază pură (comercială) din hrean, 1 mL soluție tampon și amestecul de reacție: 9,2 mg bispiridiletan, 30 mg ω-bromacetofenonă, 17 L propiolat de etil.

Toate probele s-au lucrat de această dată în eppendorf-uri deoarece cantitățile au fost foarte mici.

Fig. 4.18 Pregătirea probelor de reacție

Fig. 4.19 Prelucrarea probelor de reacție

Se agită probele timp de 7 zile la tcamerei.

Dupa 7 zile am adăugat 5 mL apă distilată soluției, am filtrat probele și am separat fazele prin extracția lichid-lichid cu cloroform (10mL).

Din filtrat am realizat cromatografia pe strat subțire (TLC) și HPLC.

4.3 REZULTATE ȘI DISCUȚII

Identificarea compușilor obținuți s-a realizat utilizând cele două tehnici cromatografice: TLC și HPLC și analiza spectrofotometrică UV-VIS.

Fig. 4.20 Cromatogramele pe strat subțire (analiza TLC) sub iradiere cu lampa UV la =366 nm unde compușii s-au obținut în reacții catalizate de: 1: conopidă, 2: varză, 3: praz, 4: ridiche, 5: hrean, 6: țelină, 7: cartof dulce, 8: păstârnac, 9: rădăcină de pătrunjel, 10: bob (germeni), 11: soia (germeni), 12: dovlecel (germeni), 13: leurdă.

Fig. 4.21 Cromatogramele pe strat subțire sub iradiere cu lampa UV la =366 nm unde: 1, 2, 3, 4: indolizina obținută pe cale clasică, compusul obținut în reacția catalizată de enzimele formate în procesul de germinare al speciilor vegetale de : 5: bob, 6: soia.

În urma analizelor am constatat ca reacția de cicloadiție are loc și în timpul germinării speciilor vegetale folosite (bob, soia), ceea ce înseamnă că numeroasele enzime existente acționează ca și catalizatori ai reacției.

Fig. 4.22 Cromatograma pe strat subțire sub iradiere cu lampa UV la =366 nm, unde: 1, 2, 3: indolizina obținută în reacția catalizată de enzima peroxidază (comercială) din hrean.

În urma analizelor TLC ale probelor, am observat sub iradierea cu lampa UV (la o lungime de undă =366 nm) apariția unor spoturi fluorescente specifice compușilor indolizinici, ceea ce înseamnă că reacțiile de cicloadiție au avut loc în cazul utilizării tuturor extractelor vegetale, a peroxidazei comerciale și în procesul de germinare a plantelor (bob, soia).

Un argument în plus în acest sens ne aduce și cromatografia de lichide de înaltă performanță, HPLC. S-au analizat prin această metodă atât martorii cât și probele rezultate în urma reacțiilor catalizate enzimatic.

Fig. 4.23 Spectrul HPLC al unei probe din timpul biocatalizei

Se observă din cromatogramele HPLC apariția unui nou pic, specific noului compus indolizinic, compus care a fost pus în evidență realizând analiza compusului obținut prin metoda clasică, fără biocatalizator. În figurile de mai jos se poate observa că în reacțiile de cicloadiție catalizate de extractele vegetale apare un nou compus, cu un timp de retenție diferit, ceea ce dovedește că reacția de cicloadiție a avut loc.

De asemenea, am constatat că extractele enzimatice de vegetale catalizează diferit reacția de cicloadiție. Astfel, în cromatograma, tabelul și graficul următoare, se observă că peroxidaza din hrean (HRP) comercială, extractele enzimatice din speciile vegetale dovlecel, țelină și pătrunjel (rădăcină) sunt cele mai active din punctul de vedere al randamentului reacției.

Fig. 4.24 Cromatogramele indolizinelor obținute în reacții biocatalizate de: 1: dovlecel, 2: țelină, 3: pătrunjel

Tabelul 4.10 Concentrația de indolizină în reacțiile biocatalizate de enzime vegetale

Fig. 4.25 Diagrama concentrațiilor de indolizină în reacțiile biocatalizate de enzime vegetale

Realizându-se analiza UV-VIS a probelor obținute în urma reacțiilor de cicloadiție se poate observa că spectrul UV-VIS al compusului nou format este diferit de cel al compușilor de plecare și corespunde noului compus indolizinic fluorescent.

Fig. 4.26 Spectrul UV al mediului de reacție

Fig. 4.27 Spectrul UV al indolizinei obținută prin biocataliză

Toate analizele realizate conduc la concluzia că reacția de cicloadiție, „one–pot”, biocatalizată de enzimele din speciile de vegetale analizate are loc cu formare de indolizine fluorescente care prezintă un profil UV-VIS cu maxime specifice la 277 nm respectiv 411 nm, maxime comparate cu cele din compusul indolizinic martor, obținut prin reacție clasică .

4.4 CONCLUZII EXPERIMENTALE

Din analizele efectuate, reiese concluzia că reacția de cicloadiție, „one–pot”, biocatalizată de extractele enzimatice din speciile de vegetale, de peroxidaza din hrean (HRP) comercială precum și de numeroasele enzime formate în procesul de germinare al plantelor are loc cu formare de indolizine fluorescente.

Am constatat că extractele enzimatice de vegetale catalizează diferit reacția de cicloadiție.

Din analizele realizate am constatat că în reacția catalizată de peroxidaza din hrean (HRP) comercială am obținut cea mai mare concentrație de indolizină (339,25 g/mL).

Extractele enzimatice din speciile vegetale dovlecel (germeni), țelină (rădăcină) și pătrunjel (rădăcină) sunt cele mai active din punctul de vedere al randamentului reacției însă prezintă concentrații de indolizină mult mai mici decât concentrația indolizinei din reacția catalizată de peroxidaza din hrean (HRP) comercială (82,58 g/mL, 79,60 g/mL, 57,48 g/mL).

CONCLUZII ȘI PROPUNERI GENERALE

În această lucrare, am vrut sa evidențiez faptul că utilizarea diverselor specii de vegetale poate conduce la realizarea unor reacții importante datorită obținerii unor compuși valoroși din punct de vedere economic prin metode accesibile, simple și care nu necesită costuri ridicate.

În urma determinărilor realizate în laborator am realizat reacții de cicloadiție cu obținere de indolizine fluorescente în condiții blânde, reacții catalizate de extracții enzimatice din diverse specii vegetale, în apă și la temperatura camerei. Prin urmare, reacțiile biocatalizate se pot realiza cu ușurință în laborator.

Sistemele chimice analizate acoperă o arie largă de aplicabilitate în industria alimentară, agricultură, medicină și controlul calității mediului.

Un factor economic foarte important ar putea fi utilizarea de legume și fructe la nivel local (plante comune) și a deșeurilor produselor naturale pentru biocatalizarea reacțiilor chimice organice de importanță comercială. De asemenea, ar putea oferi noi oportunități pentru extinderea rolului produselor naturale ca produse chimice durabile în defavoarea reactivilor chimici scumpi, neregenerabili, care sunt sunt utilizați în prezent.

O astfel de cercetare ar putea spori valoarea chimiei "verzi" pentru industriile farmaceutice și agricole. Sunt aproximativ 7000 de culturi de legume folosite în produsele alimentare și agricultură din toată lumea.

Sistemele enzimatice extrase din diverse specii de vegetale oferă unele avantaje interesante în defavoarea reactivilor chimici standard. De exemplu, nevoia de cofactori scumpi este eliminată prin utilizarea întregului țesut al plantei, deoarece planta oferă automat această cerință.

Prin utilizarea părților intacte din plante (întregul țesut al plantei), costurile sunt reduse și pregătirea sistemului reactiv este mai ușor de realizat. În plus, există dovezi că aceste sisteme pot fi utilizate în mod repetat (de 5-6 ori) fără pierderea substanțială a activității enzimatice, reducând astfel costurile și mai mult.

Dezavantajele utilizării enzimelor din plante sunt: posibilitatea ca procedura de izolare să fie un pic mai complexă, posibilitatea ca alte procese enzimatice să apară simultan și durata de timp implicată pentru evoluția procesului cere ca produsul să fie stabil. Totuși, avantajele (prezentate în această lucrare) sunt mai multe decât dezavantajele.

Noi progrese în genomică, proteomică și bioinformatică alimentează dezvoltarea biocatalizei ca parte integrantă a catalizei industriale.

Indolizinele și derivații lor prezintă numeroase aplicații biologice, farmacologice, medicinale (prezintă proprietăți fluorescente, antimicrobiene, antibacteriene; potențial antioxidant; sunt utilizate în tratamentele antitumorale, antituberculozice, pentru prevenirea și tratarea cancerului, pentru hipertensiune și boli de inimă) și în industrie (proiectarea unor markeri fluorescenți și a unor senzori în tehnologiile moderne).

Direcții de cercetare ulterioară sunt:

înlocuirea catalizatorilor chimici cu sistemele enzimatice extrase din diverse specii vegetale (ieftine la nivel local) și, astfel, simplificarea sistemelor de reacție;

obținerea de noi compuși indolizinici care prezintă numeroase aplicații (industria alimentară, agricultură, medicină și controlul calității mediului);

valorificarea compușilor indolizinici datorită proprietăților fluorescente ca markeri pentru diverse probe biologice.

BIBLIOGRAFIE

[1] Academia Română, Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan”, Dicționarul explicativ al limbii române, ediția a II-a, Editura Univers Enciclopedic, 1998

[2] Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., Molecular Biology of the cell, 5th edition, Garland Science, 2008

[3] Andrade L. H., Utsunomiya R. S., Omori A. T., Porto A. L. M., Comasseto J. V., Edible catalysts for clean chemical reactions: Bioreduction of aromatic ketones and biooxidation of secondary alcohols using plants, Journal of molecular catalysis B: Enzymatic, vol. 38, Elsevier, 2006, pg. 84-90

[4] Andrès Illanes, Enzyme Biocatalysis. Principles and Applications, Springer, 2008

[5] Bisswanger Hans, Enzyme Kinetics. Principles and Methods, 2nd edition, Wiley-VCH, 2008

[6] Campbell Mary K., Farrell Shawn O., Biochemistry, 6th edition, Thomson Brooks/Cole, 2009

[7] Chai W., Hayashida Y., Sakamaki H., Horiuchi, Journal of molecular catalysis B: Enzymatic, vol. 27, Elsevier, 2004, pg. 55-60

[8] Chaplin M. F., Bucke C., Enzyme Technology, Cambridge University Press, New York, 1990

[9] Chi-Huey Wong, Whitesides G. M., Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, vol.12, Tetrahedron Organic Chemistry series, Elsevier Science Ltd, Langford Lane, 1994

[10] Daniel L. Purich, Enzyme Kinetics: Catalysis & Control, Elsevier, 2010

[11] Delattre F., Woisel P., Cazier F., Decock P., Surpateanu G., Bria M., 1,3-Dipolar cycloaddition reaction of bipyridinium ylides with the propynamido-b-cyclodextrin. A regiospecific synthesis of a new class of fluorescent b-cyclodextrins, Tetrahedron, Elsevier, 2004, pg. 1557–1562

[12] Dumitrașcu F., Drǎghici C., Albulescu A., Dumitrescu D., Noi derivați de pirolo[1,2-] piridazinǎ prin reacții de cicloadiție 1,3-dipolarǎ, Revista de Chimie, 2006

[13] Dumitru I. F., Biochimie, Ed. Didactică și pedagogică, București, 1980

[14] Enăchescu G., Bodea C., Tratat de biochimie vegetală, Partea a II-a, vol.V, Ed. Academiei republicii socialiste România, București, 1984

[15] Faber K., Biotransformations In Organic Chemistry : A Textbook, 3rd edition, Springer-Verlag, Berlin, Germany, 1997

[16] Faber K., Biotransformations In Organic Chemistry, Springer, 6th edition, 2011

[17] Fang X., Wu Y. M., Deng J., Wang S. W., Tetrahedron, vol. 60, 2004 , pg. 5487

[18] Fărcășanu I. C., Gruia M. I., Biochimie Medicală, Ed. Universității din București, 2005

[19] Fessner Wolf-Dieter, Anthonsen Thorleif, Modern Biocatalysis. Stereoselective and Environmentally Friendly Reactions, Wiley – VCH, Weinheim, 2009

[20] Florea Traian, Chimia alimentelor, vol. II, Ed. Academică, Galați, 2001

[21] Florea Traian, Chimie organică, Ed. Academică, Galați, 2003

[22] Garrett R. H., Grisham C. M., Biochemistry, 4th edition, Brooks/Cole, Cengage Learning, Boston, 2010

[23] Gaspar Th., Penel Cl., Thorpe T., Greppin H., Peroxidases, Université De Genève -Centre De Botanique, Genève, 1982

[24] Geoffrey A. Cordell, Telma L. G. Lemos, Francisco J. Q. Monte, Marcos C. de Mattos, Vegetables as Chemical Reagents, Journal of Natural Products, vol. 70, Nr. 3, 2007, pg. 478-492

[25] Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, GM.Sunderland The Cell: A Molecular Approach, 5th edition, Boston University, ASM Press and Sinauer Associates, 2009

[26] Ghiviriga I., El-Dien B., M. El-Gendy, H. Martinez, Fedoseyenko D., Metais E. P., Fadli A., Katritzky A. R., Conformational equilibria and barriers to rotation in some novel nitroso derivatives of indolizines and 3- and 5-azaindolizines – an NMR and molecular modeling study, Organic Biomolecular Chemistry, vol. 8, The Royal Society of Chemistry, 2010

[27] Gross R. A., Birrer G. A., Cromwick Anne-Marie, Giannos S. A., McCarthy S. P., Polymers From Biotechnology : Bacterial Polyesters and y-Poly(glutamic Acid), Biotechnological Polymers : Medical, Pharmaceutical and Industrial Applications, Ed. C. G. Gebelin, Technomic Publishing Co., 1993, pg. 200-213

[28] Gross R. A., Ganesh M., Lu W., Enzyme-Catalysis Breathes New Life into Polyester Condensation Polymerizations, Trends in Biotechnology, Polytechnic Institute of NYU, Six Metro Tech Center, Brooklyn, New York, vol. 28, Nr. 8, Elsevier Ltd, 2010, pg. 435-443

[29] Gundersen L.-L., Charnock C., Negussie A. H., Rise F., Teklu S., Synthesis of indolizine derivatives with selective antibacterial activity against Mycobacterium tuberculosis, European Journal of Pharmaceutical Sciences, vol.30, 2007, pg. 26-35

[30] Hassner A., Synthesis of Heterocycles via Cycloadditions I & II, vol. 12 & 13, Springer – Verlag Berlin Heidelberg, 2008

[31] International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Enzyme Nomenclature, Academic Press, New York, 1992

[32] International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Enzymes Nomenclature, Academic Press, New York, 1979

[33] Johannes T., Simurdiak M. R., Zhao H., Biocatalysis, Encyclopedia of Chemical Processing, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois, Urbana, Illinois, U.S.A, 2006

[34] Khan M.T.H., Bioactive Heterocycles III, Vol. 9, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2007

[35] Khan M.T.H., Bioactive Heterocycles IV, Vol. 10, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2007

[36] Khan M.T.H., Bioactive Heterocycles V, Vol. 11, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2007

[37] Lee M., Heterocyclic Antitumor Antibiotics, Vol. 2, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2006

[38] Lehninger A. L., Biochimie, vol. I, vol. II, Editura Tehnică, București, 1987, reeditat, 1993

[39] Leuenberger H. G. W., Biotransformation – a useful tool in organic chemistry, Pure & Appl. Chem., IUPAC, Central Research Units, Hoffmann – La Roche Ltd., Basel, Switzerland, vol. 62, Nr. 4, 1990, pg. 753-768

[40] Neamțu Gavril, Biochimie alimentară, Ed. Ceres, București, 1997

[41] Nezih Mȕftȕgil, Journal of the Science of Food and Agriculture, vol. 36, 1985, pg. 877-880

[42] Padwa A., Eisenbarth P., Journal of Heterocyclic Chemistry, vol. 22, Wiley, 1985

[43] Padwa A., 1,3-Dippolar Cycloaddition Chemistry, vol. I, Interscience, New York, 1984

[44] Padwa A., Pearson W. H., Synthetic Applications of 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry Toward Heterocycles and Natural Products, Wiley, New York, 2002

[45] Palmer Trevor, Understanding Enzymes, 3rd edition, Ellis Horwood series in biochemistry and biotehnology, Londra, 1991

[46] Popescu A., Cristea E., Zamfirescu-Gheorghiu M., Biochimie medicala, Ed. Medicală, București, 1980

[47] Sarkunam K., Nallu M., Synthesis of some new indolizines, Journal of Heterocyclic Chemistry, vol. 42, 2005, pg. 5-11

[48] Segal Rodica, Biochimia produselor alimentare, Ed. Academică, Galați, 2006

[49] Shang Y., Zhang M., Shuyan Yu, Kai Ju, Cuie Wang, Xinwei He, New route synthesis of indolizines via 1,3-dipolar cycloadditionof pyridiniums and alkynes, Tetrahedron Letters, vol. 50, 2009, pg. 6981–6984

[50] Săndescu R., Bojiță M., Roman L., Oprean R., Analiza și controlul medicamentelor, Ed. Intelcredo 2003

[51] Spradlin J.E., Tailoring Enzymes for Food Processing, ACS Symposium Series, vol. 389, Journal American Chemical Society, Washington D.C., 1989, pg.24

[52] Wandrey C., Liese A., Kihumbu D., Industrial biocatalysis : past, present, and future. Organic Process Research & Devlopement, vol. 4, Nr. 4, Institute of Biotechnology, Jȕlich, Germany, 2000

[53] White J.S., DC Source Book of Enzymes, CRC Press, Boca Raton, 1997

[54] Zhu S. Z., Qin C. Y., Wang Y. L., Chu Q. I., Preparation of 1-trifluoroacetyl indolizines and their derivatives via the cycloaddition of pyridinium N-ylides with 4-ethoxy-1,1,1-trifluorobut-3-en-one, Journal of Fluorine Chemistry, vol. 99, 1999, pg. 183-187

BIBLIOGRAFIE

[1] Academia Română, Institutul de Lingvistică „Iorgu Iordan”, Dicționarul explicativ al limbii române, ediția a II-a, Editura Univers Enciclopedic, 1998

[2] Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., Molecular Biology of the cell, 5th edition, Garland Science, 2008

[3] Andrade L. H., Utsunomiya R. S., Omori A. T., Porto A. L. M., Comasseto J. V., Edible catalysts for clean chemical reactions: Bioreduction of aromatic ketones and biooxidation of secondary alcohols using plants, Journal of molecular catalysis B: Enzymatic, vol. 38, Elsevier, 2006, pg. 84-90

[4] Andrès Illanes, Enzyme Biocatalysis. Principles and Applications, Springer, 2008

[5] Bisswanger Hans, Enzyme Kinetics. Principles and Methods, 2nd edition, Wiley-VCH, 2008

[6] Campbell Mary K., Farrell Shawn O., Biochemistry, 6th edition, Thomson Brooks/Cole, 2009

[7] Chai W., Hayashida Y., Sakamaki H., Horiuchi, Journal of molecular catalysis B: Enzymatic, vol. 27, Elsevier, 2004, pg. 55-60

[8] Chaplin M. F., Bucke C., Enzyme Technology, Cambridge University Press, New York, 1990

[9] Chi-Huey Wong, Whitesides G. M., Enzymes in Synthetic Organic Chemistry, vol.12, Tetrahedron Organic Chemistry series, Elsevier Science Ltd, Langford Lane, 1994

[10] Daniel L. Purich, Enzyme Kinetics: Catalysis & Control, Elsevier, 2010

[11] Delattre F., Woisel P., Cazier F., Decock P., Surpateanu G., Bria M., 1,3-Dipolar cycloaddition reaction of bipyridinium ylides with the propynamido-b-cyclodextrin. A regiospecific synthesis of a new class of fluorescent b-cyclodextrins, Tetrahedron, Elsevier, 2004, pg. 1557–1562

[12] Dumitrașcu F., Drǎghici C., Albulescu A., Dumitrescu D., Noi derivați de pirolo[1,2-] piridazinǎ prin reacții de cicloadiție 1,3-dipolarǎ, Revista de Chimie, 2006

[13] Dumitru I. F., Biochimie, Ed. Didactică și pedagogică, București, 1980

[14] Enăchescu G., Bodea C., Tratat de biochimie vegetală, Partea a II-a, vol.V, Ed. Academiei republicii socialiste România, București, 1984

[15] Faber K., Biotransformations In Organic Chemistry : A Textbook, 3rd edition, Springer-Verlag, Berlin, Germany, 1997

[16] Faber K., Biotransformations In Organic Chemistry, Springer, 6th edition, 2011

[17] Fang X., Wu Y. M., Deng J., Wang S. W., Tetrahedron, vol. 60, 2004 , pg. 5487

[18] Fărcășanu I. C., Gruia M. I., Biochimie Medicală, Ed. Universității din București, 2005

[19] Fessner Wolf-Dieter, Anthonsen Thorleif, Modern Biocatalysis. Stereoselective and Environmentally Friendly Reactions, Wiley – VCH, Weinheim, 2009

[20] Florea Traian, Chimia alimentelor, vol. II, Ed. Academică, Galați, 2001

[21] Florea Traian, Chimie organică, Ed. Academică, Galați, 2003

[22] Garrett R. H., Grisham C. M., Biochemistry, 4th edition, Brooks/Cole, Cengage Learning, Boston, 2010

[23] Gaspar Th., Penel Cl., Thorpe T., Greppin H., Peroxidases, Université De Genève -Centre De Botanique, Genève, 1982

[24] Geoffrey A. Cordell, Telma L. G. Lemos, Francisco J. Q. Monte, Marcos C. de Mattos, Vegetables as Chemical Reagents, Journal of Natural Products, vol. 70, Nr. 3, 2007, pg. 478-492

[25] Geoffrey M. Cooper, Robert E. Hausman, GM.Sunderland The Cell: A Molecular Approach, 5th edition, Boston University, ASM Press and Sinauer Associates, 2009

[26] Ghiviriga I., El-Dien B., M. El-Gendy, H. Martinez, Fedoseyenko D., Metais E. P., Fadli A., Katritzky A. R., Conformational equilibria and barriers to rotation in some novel nitroso derivatives of indolizines and 3- and 5-azaindolizines – an NMR and molecular modeling study, Organic Biomolecular Chemistry, vol. 8, The Royal Society of Chemistry, 2010

[27] Gross R. A., Birrer G. A., Cromwick Anne-Marie, Giannos S. A., McCarthy S. P., Polymers From Biotechnology : Bacterial Polyesters and y-Poly(glutamic Acid), Biotechnological Polymers : Medical, Pharmaceutical and Industrial Applications, Ed. C. G. Gebelin, Technomic Publishing Co., 1993, pg. 200-213

[28] Gross R. A., Ganesh M., Lu W., Enzyme-Catalysis Breathes New Life into Polyester Condensation Polymerizations, Trends in Biotechnology, Polytechnic Institute of NYU, Six Metro Tech Center, Brooklyn, New York, vol. 28, Nr. 8, Elsevier Ltd, 2010, pg. 435-443

[29] Gundersen L.-L., Charnock C., Negussie A. H., Rise F., Teklu S., Synthesis of indolizine derivatives with selective antibacterial activity against Mycobacterium tuberculosis, European Journal of Pharmaceutical Sciences, vol.30, 2007, pg. 26-35

[30] Hassner A., Synthesis of Heterocycles via Cycloadditions I & II, vol. 12 & 13, Springer – Verlag Berlin Heidelberg, 2008

[31] International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Enzyme Nomenclature, Academic Press, New York, 1992

[32] International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Enzymes Nomenclature, Academic Press, New York, 1979

[33] Johannes T., Simurdiak M. R., Zhao H., Biocatalysis, Encyclopedia of Chemical Processing, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois, Urbana, Illinois, U.S.A, 2006

[34] Khan M.T.H., Bioactive Heterocycles III, Vol. 9, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2007

[35] Khan M.T.H., Bioactive Heterocycles IV, Vol. 10, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2007

[36] Khan M.T.H., Bioactive Heterocycles V, Vol. 11, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2007

[37] Lee M., Heterocyclic Antitumor Antibiotics, Vol. 2, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2006

[38] Lehninger A. L., Biochimie, vol. I, vol. II, Editura Tehnică, București, 1987, reeditat, 1993

[39] Leuenberger H. G. W., Biotransformation – a useful tool in organic chemistry, Pure & Appl. Chem., IUPAC, Central Research Units, Hoffmann – La Roche Ltd., Basel, Switzerland, vol. 62, Nr. 4, 1990, pg. 753-768

[40] Neamțu Gavril, Biochimie alimentară, Ed. Ceres, București, 1997

[41] Nezih Mȕftȕgil, Journal of the Science of Food and Agriculture, vol. 36, 1985, pg. 877-880

[42] Padwa A., Eisenbarth P., Journal of Heterocyclic Chemistry, vol. 22, Wiley, 1985

[43] Padwa A., 1,3-Dippolar Cycloaddition Chemistry, vol. I, Interscience, New York, 1984

[44] Padwa A., Pearson W. H., Synthetic Applications of 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry Toward Heterocycles and Natural Products, Wiley, New York, 2002

[45] Palmer Trevor, Understanding Enzymes, 3rd edition, Ellis Horwood series in biochemistry and biotehnology, Londra, 1991

[46] Popescu A., Cristea E., Zamfirescu-Gheorghiu M., Biochimie medicala, Ed. Medicală, București, 1980

[47] Sarkunam K., Nallu M., Synthesis of some new indolizines, Journal of Heterocyclic Chemistry, vol. 42, 2005, pg. 5-11

[48] Segal Rodica, Biochimia produselor alimentare, Ed. Academică, Galați, 2006

[49] Shang Y., Zhang M., Shuyan Yu, Kai Ju, Cuie Wang, Xinwei He, New route synthesis of indolizines via 1,3-dipolar cycloadditionof pyridiniums and alkynes, Tetrahedron Letters, vol. 50, 2009, pg. 6981–6984

[50] Săndescu R., Bojiță M., Roman L., Oprean R., Analiza și controlul medicamentelor, Ed. Intelcredo 2003

[51] Spradlin J.E., Tailoring Enzymes for Food Processing, ACS Symposium Series, vol. 389, Journal American Chemical Society, Washington D.C., 1989, pg.24

[52] Wandrey C., Liese A., Kihumbu D., Industrial biocatalysis : past, present, and future. Organic Process Research & Devlopement, vol. 4, Nr. 4, Institute of Biotechnology, Jȕlich, Germany, 2000

[53] White J.S., DC Source Book of Enzymes, CRC Press, Boca Raton, 1997

[54] Zhu S. Z., Qin C. Y., Wang Y. L., Chu Q. I., Preparation of 1-trifluoroacetyl indolizines and their derivatives via the cycloaddition of pyridinium N-ylides with 4-ethoxy-1,1,1-trifluorobut-3-en-one, Journal of Fluorine Chemistry, vol. 99, 1999, pg. 183-187