Caracterizarea Unor Alimente Prin Spectrometrie de Masă Cuplată

Universitatea Babeș-Bolyai Cluj-Napoca

Facultatea de Fizică

Caracterizarea unor alimente prin

spectrometrie de masă cuplată cu

cromatografie gazoasă

Coordonator științific: Absolvent:

Prof.Dr.Univ.Culea Monica Friciu Sorin Marcel

Cluj-Napoca

2016

Cuprins

Capitolul 1. Spectrometria de masă 4

1.1 Bazele Spectrometriei de masă 4

1.2 Elementele spectrometrului de masă 7

1.3 Tipuri de spectrometre de masă 8

1.4 Sisteme de introducere a probelor………………………………………………..11

1.5 Producerea ionilor.Surse de ioni…………………………………………………14

1.6 Analizori de masă…………………………………………………………………17

1.7 Tipuri de ioni în spectrometria de masă………………………………………….22

1.8 Detecția ionilor.Sensibilitatea spectrometrului………………………………….. 27

1.9 Înregistrarea si prelucrarea datelor MS………………………………………….. 28

Capitolul 2.Cromatografia de gaze……………………………………………………..32

2.1 Principiul cromatografiei în faza gazoasă………………………………………. .34

2.2 Faza mobilă……………………………………………………………………… 36

2.3 Suportul fazei staționare………………………………………………………… .36

2.4 Faza staționara lichidă…………………………………………………………… 37

2.5 Faza staționara solidă……………………………………………………………… 37

2.6 Coloane cromatografice………………………………………………………… 37

Capitolul 3. Cuplajul GC/MS…………………………………………………… 39

Capitolul 4.Metoda experimentală……………………………………………… 42

4.1.Introducere……………………………………………………………………… 42

4.2 Scopul lucrării…………………………………………………………………………………………. 42

4.3 Mentă,Busuioc,Salvie……………………………………………………………………………….. 42

4.4 Procedura de extracție a aminoacizilor………………………………………………………….43

4.5 Procedura de extracție pentru activitatea antioxidantă……………………………………45

4.6 DPPH………………………………………………………………………………………………………45

4.7 Aminoacizi si acizi grași…………………………………………………………………………….46

4.8 Rezultate si discuții……………………………………………………………………………………48

4.9 Concluzii………………………………………………………………………………………………….49

1.SPECTROMETRIA DE MASĂ

1.1 Bazele Spectrometriei de masă

Spectrometria de masă se poate defini ca o tehnică importanta de determinare a masei atomilor si moleculelor folosindu-se pentru acest scop mișcarea ionilor într-un câmp magnetic sau electric.Aceasta a fost concepută inițial ca un instrument pentru detectarea ionilor atomici, devenind apoi una din tehnicile cele mai puternice ale spectrometriei moleculare pentru identificarea substanțelor necunoscute și realizarea de studii structural în chimie,biologie, sau știința materialelor.În ultimele decenii,dezvoltarea metodelor de ionizare,noile analizatoare capabile să crească specificitatea prin spectrometrie tandem (MS/MS), măsurători de masă exacta alături de cuplajul cromatografie-MS au condus la cercetări interesante în controlul alimentelor si medicină.

J.J.Thomson în anul 1912 a studiat pentru prima data spectrometria de masă,după care s-a continuat cu studiul volatilelor prin apariția cuplajului cromatograf de gaze-spectrometru de masa (GC/MS) în anul 1958. Anul 1980 aduce cu el și revoluționarea în studiul nevolatilelor (fosfolipide, acizi biliari, peptide, oligozaharide).

Ionii, a căror mișcare este urmărită într-un spectrometru de masă, pot să provină fie de la atomi, fie de la molecule sau de la fragmente moleculare. Toate aceste specii au sarcină electrică care permite separarea lor în vederea detecției folosind câmpuri electrice și/sau magnetice. Separarea și detecția se realizează pe baza raportului m/z (unde m este masa ionului iar z sarcina sa). În consecință, informația obținută se referă la masa ionilor atomici sau moleculari care sunt detectați.Ca atare, spectrometria de masă este utilizată pentru determinarea cantitativă a atomilor sau moleculelor și de asemenea pentru determinări chimice și informații structurale despre molecule. Moleculele au căi de fragmentare distincte care dau informații structurale pentru identificarea componenților. Analizorii cei mai utilizați sunt cei care folosesc câmp electric sau magnetic pentru a aplica o forță asupra particulelor încărcate (ioni). Relația dintre forță, masă și câmpul aplicat se poate rezuma la aplicarea legii a doua a lui Newton și a forței Lorentz.

F=m*a ( Legea a doua a lui Newton );

F=e*(E+vxB) ( Legea forței Lorentz );

unde: F- forța aplicată ionului,

m = masa ionului.

a = accelerația,

e=sarcina ionului,

E = câmpul electric

v x B = vectorul produs de viteza ionului și câmpul magnetic aplicat

Din legea a doua a lui Newton se vede că forța cauzează o accelerație dependentă de masă, iar legea forței Lorentz indică tot o dependență a forței aplicate față de sarcina ionului. Așadar, spectrometrele de masă separă ioni în funcție de raportul masă-pe-sarcină (m/z) și nu doar în funcție de masă.

Spectrometria de masă este una din cele mai importante metode fizice de analiză. Ea se bazează pe ionizarea și fragmentarea moleculelor, ca urmare a unei acumulări de energie ce provoacă ruperea legăturilor interatomice. Fragmentele care se formează (ionii) sunt accelerate în interiorul unui câmp care le separă în funcție de raportul m/z. Ionii astfel formați ajung la detector unde sunt transformați în semnale electrice proporționale cu numărul de ioni de fiecare fel, permițând înregistrarea spectrului de masă caracteristic fiecărei substanțe organice.

Spectrometria de masă este o metodă care permite obținerea ionilor, separarea acestora în funcție de raportul dintre masă și sarcină (m/z), și înregistrarea lor, obținăndu-se spectrele de masă ale unor molecule complexe. Aplicațiile analitice ale spectrometriei de masă sunt foarte generale, analize structurale complexe, studiul căilor de fragmentare, identificarea și analiza cantitativă a compușilor unui amestec complex, analize cantitative și calitative de mare precizie, aplicabile la cantități foarte mici de probă, în urme (trace analysis).

Această tehnică de analiză ce aplică legile fizicii pentru caracterizarea materiei, s-a născut Ia începutul secolului al douăzecilea și a deservit în primele decenii fizica: determinări de masă exactă a atomilor, potențiale de ionizare, măsurători izotopice. Termenul de spectrometrie de masă a apărut în literature științifică în anul 1920 când F.W. Aston a raportat prima dată masa atomică exactă a neonului-20 și a neonului-22. Acest fapt venea după ce Wien, în 1898 a vizualizat deflexia razelor pozitive în câmp electric și magnetic, iar Sir J.J. Thomson a descoperit în 1912 izotopii neonului, comfirmând ceea ce F. Soddy sugerase ceva mai devreme. Aceste descoperiri au avut ca rezultat un premiu Nobel punând astfel bazele unui nou domeniu al științei.

Spectrometria de masă s-a făcut simțită încă de la început și în chimie, contribuind astfel la. catalogarea izotopilor elementelor; măsurarea maselor exacte ale elementelor; determinarea potențialelor de ionizare, a potențialelor de apariție, a energiilor de legătură; determinarea structurii moleculelor.

Dezvoltarea spectroscopiei UV, IR, RMN, a defavorizat spectrometria de masă, care era mai complexă, mai scumpă, mai greu de utilizat. Totuși, acuratețea și sensibilitatea ridicată a spectrometriei de masă au făcut ca aceasta să fie utilizată în continuare mai ales în analize cantitative de urme și în determinarea izotopilor stabili. Compararea rezultatelor obținute prin spectrometrie de masă cu cele obținute prin alte metode spectroscopice arată că spectrometria de masă nu suplinește alte tehnici spectroscopice, ci le completează. Tehnica nu indică ce grupe funcționale sunt prezente sau lipsesc în moleculă – informații obținute ușor din UV, IR – ci mai degrabă care sunt și cum se leagă grupările funcționale în moleculă.

În timpul celui de-al doilea război mondial cerințele de combustibil, în special în aviație, au condus la nevoia unui control riguros al compoziției chimice a produselor petrochimice. Spectrometria de masă a fost capabilă să dea răspunsuri precise și rapide privind analiza calitativă și cantitativă a amestecurilor de volatile petrochimice.

După 1950 au început să se analizeze compuși cu greutăți moleculare mai mari. Următorul pas a fost apariția cromatografului de gaze și mai ales a cuplajului cromatograf de gaze – spectrometru de masă (GC/MS), tehnică modernă de analiză cantitativă și calitativă, sensibilă și selectivă, care și-a găsit un număr mare de aplicații în foarte multe domenii: fizică, chimie, biologie, medicină, farmacie, geologie, ecologie, toxicologie, criminalistică, arheologie. Tehnicile de marcare a compușilor cu izotopi stabili au permis utilizarea trasorilor izotopici și analiza lor a cerut o tehnică capabilă să măsoare concentrații cât mai mici. Tehnica GCYMS permite analiza concentrațiilor de ordinul pg/ml și chiar mai mici. Un aspect deosebit de important al spectrometriei de masă este cantitatea mică de probă necesară pentru obținerea spectrului de masă și putem spune că aceasta tehnică dă cea mai mare cantitate de informații specifice per microgram comparative cu alte metode experimentale. De asemenea, spectrometria de masă pune în evidență părțile constituente ale moleculei, fiind o metodă unică datorită furnizării informațiilor despre modul în care se leagă grupările funcționale ale moleculei. Există totuși un mic dezavantaj: în cazul izomerilor, pentru a putea identifica substanțele e nevoie să apelăm la o alta metodă: UV, IR, RMN sau cromatografia.

Limita cea mai importantă a spectrometriei de masă (EI) este necesitatea evaporării probei, care elimină posibilitatea analizei unor componenți polari și greu volatili. Sunt

accesibile analizei substanțe care au presiunea de vapori de cel puțin 10 Torr la temperature de până la 300°C. Acest dezavantaj a condus la dezvoltarea instrumentației, a tehnicilor auxiliare de evaporare prin încălzirea probei în sisteme de introducere, conversia chimică a componenților nevolatili în componenți mai volatili, prin derivatizare, și mai nou la diferite tehnici inovatoare de ionizare (surse de ioni).

Elementele spectrometrului de masă

Sistemul de introducere al probei, unde proba este introdusă în forma și cantitatea potrivită;

Sursa de ioni, unde se produce un fascicul de ioni din substanța de analizat adusă sub formă de vapori;

Analizorul, care separă ionii în funcție de masă ( în funcție de raportul masă-pe- sarcină: m/z);

.Detectorul, care înregistrează abundența relativă sau intensitatea în funcție de masă;

Un computer care procesează datele, produce spectrul de masă în forma potrivită și controlează instrumentul; Anumite aplicații pot impune dezvoltarea etapei (3) în sensul îmbunătățiri cantității

de informație care poate fi extrasă din procesul de ionizare, și în consecință, o creștere

corespunzătoare a selectivității. Secvența de operații dintre parantezele drepte din figură

alternativa de mai sus poate fi repetată de un număr de ori (n).

Deoarece spectrometria de masă are ca scop caracterizarea fragmentelor

moleculare ionice produse de către analit în condiții controlate, și că aceste fragmente

ionice sunt sau încărcate cu sarcină electrică pozitivă sau cu sarcină electrică negativă,

maniera de lucru în condiții reale va trebui să definească în mod univoc semnul sarcinii

ionilor analizați (+) MS sau (-). În spectrometrele moderne de masă, analiza ionilor

pozitivi și negativi poate fi realizată alternativ, pe durata aceluiași proces, dar niciodată

într-o manieră simultană.

Va trebui de asemenea menționat faptul că formarea, separarea și caracterizarea

fragmentelor ionice trebuie realizate într-un mediu lipsit de interferențe de orice natură, cu

alte cuvinte, spectrometrul de masă va trebui să opereze în condiții de vacuum avansat

(funcție de caracteristicile constructive ale analizorului de masă, nivelul vidului poate varia în intervalul 10-5 și 10-12 torri).

Tipuri de spectrometre de masa

Criteriul după care vom analiza spectrometrele de masă este mai general decât altele care grupează un număr de aparate destinate unui anumit gen de aplicații ca de exemplu analize izotopice, cercetări spațiale anlize solide, deși în unele cazuri pentru o anume aplicație se potrivește o anume configurație sau cel mult câteva configurații optice. Cazul extrem este desigur analiza de solide prin scânteie cu colectare pe placă fotografică pentru care scop este adecvată (dublă focalizare Mattauch – Herzog). Deci vom căuta să prezentăm geometriile concrete ce corespund unor aparate construite așa cum rezultă acestea pe baza particularizării unor soluții de optică ionică.

Spectrometre de bază cu focalizare unghiulară și câmpul magnetic omogen

Un astfel de spectrometru de masă este alcătuit din următoarele părți constructive, o sursă de ioni cu bombardament electronic, ionizare termică sau fotoionizare, un sistem de vid principal și unul axial afectat, sistemul de introducere, un magnet deflector, colectorul și unitățile electronice (stabilizatoare de current, tensiune, unități de explorare a spectrului, system de detecție a curentului ionic, amplificare, înregistrare, eventual prelucrare a informației).

În ceea ce privește analizatorul magnetic, cel mai frecvent în spectrometria de masă se folosesc magneții cu jug în formă de C. Utilizarea electromagneților permite acoperirea unui domeniu de masă de ordinul miilor de unități atomice de masă, la energii ale ionilor superioare de obicei valorii de 1 KW.

Acest gen de aparate permite explorarea întregului domeniu de mase cerut pentru aplicații incluzând analiza unor substanțe organice. în unele aplicații particulare, utilizarea magneților permanenți este de interes aducând o economie de greutate și simplificare prin lipsa unității de alimentare stabilizată a electromagnetului.

Spectrometre de masă cu focalizare unghiulară,deflector cu câmp magnetic omogen

Principalul avantaj al spectrometrelor de masă cu câmp neomogen și axa fasciculului ionic circulară, este dispersia mărită. Pentru spectrometrele cu câmp magnetic neomogen n=l, focalizarea fasciculului facându-se datorită intrării și ieșirii oblice a fasciculului, rezoluția se poate exprima:

Spectrometrul de masă MC 62[Rh] permite efectuarea de analize izotopice pe domeniul de mase de 1-500 pg la o rezoluție superioară valorii 500 la 1% din înălțimea vârfului, cu o sensibilitate ce depășește 10-30% cu tensiuni acceleratoare de 1 și 2,5 KV.

Spectrometre de masă cu focalizare unghiulară în tandem

Pentru eliminarea din fascicul a ionilor difuzați neelastic, pentru mărirea sensibilității la concentrații izotopice mici, s-au imaginat spectre de masă alcătuite din mai mulți analizatori tandem.

Un spectrometru tandem este alcătuit din 2 trepte cu câmp omogen, raza traiectoriei centrale fiind de 15 inci în ambele repte, a servit la analize de uranium, proba cea mai mică fiind de cca. 10 13g[30], Aparatul este operant la energii ale ionilor de 15 KV la rezoluția de 1200, peak-urile prezentând platouri

Filtrele Wien și Spectro met rele de masă cicloidale

Utilizarea filtrelor Wien ca spectrometru de masă a fost sporadică. Două cauze au concurat la aceasta: aberația unghiului mare pentru aceste filtre precum și necesitatea creșterii întrefierului pentru a se crea câmpul electrostatic omogen. Ambele dezavantaje pot fi eliminate prin utilizarea unor plăci profilate.

Spectrometrele de masă cicloidale asigură dublă focalizare și performanțe reale ale aparatelor electrice și magnetice încrucișate, axa fasciculului trohială, diferă mult de cele precalculate în presupunerea că aceste câmpuri sunt perfect omogene.

Spectrometre de masă cu dublă focalizare cu analizori în tandem

Acestea pot fi asociate cu toate tipurile de surse de ioni existente. Ele sunt în special recomandate în cazurile când fasciculul ionic prezintă o mare împrăștiere de energie ( surse cu scânteie, ioni rezultați prin pulverizarea ionică ). Un spectrometru cu dublă focalizare trebuie să cuprindă cel puțin 2 analizatori diferiți: deflector magnetic, deflector electrostatic, filtru Wien, oricare perechi de analizatori dintre acestea putând fi calculată pentru a asigura dubla focalizare. Dintre spectrometrele de masă cu dublă focalizare distingem spectrometrul cu imagine intermediară și fără.

Spectrometre de masă cu dublă focalizare cu filtru Wien

Spectrometre de masă dinimice. din marea varietate de spectrometre dinamice vom aminti numai acele tipuri, puține la număr față de totalitatea construcțiilor realizate: spectrometre de masă cu radiofrecvență, spectrometre de masă cvadrupolare și monopolare răspândite în cercetări spațiale, spectrometre de masă cu timp de zbor având un spațiu de zbor de cca. 20 cm ( ating o rezoluție de 200[84] ).

Spectrometrele de masă ce analizează ionii folosind un câmp magnetic omogen și un câmp electric sinusoidal sunt cunoscute sub denumirea de omegatroane.

1.4 Sisteme de introducere a probelor

Spectrometria de masă este o metodă fizică de analiză strict legată de practică. Reamintim ca fenomenele fizice care stau la baza spectrometriei de masă sunt: interacțiunea particulelor încărcate cu substanța poliatomică (molecula) și deviația în câmp a ionilor încărcați.

în cazul spectrometrelor de masă cu bombardament electronic (El), compușii în stare de vapori care sunt admiși în camera de ionizare a spectrometrului de masă sunt bombardați cu electroni care, având energie suficientă ciocnesc substanța; în urma aceste interacțiuni, substanța se ionizează, se supraexcită și disociază, formând ioni moleculari și ioni fragment. Spectrul de masă este reprezentarea (înregistrarea) abundenței relative a ionilor în funcție de masa lor (raportul m/z).

Problema spectrometrului este determinarea structurii moleculare prin interpretarea fragmentelor moleculare (corelare cu structura). Proba trebuie sa ajungă în sursa de ioni în stare de vapori. Concentrația probei în sursă trebuie păstrată constantă în perioada înregistrării probei.

Introducerea directă a probei. Sistemul de introducere este partea instrumentului conținând rezervorul, căile de introducere a probei și pompele de vid necesare pentru îndepărtarea probei din rezervor după analiză.

Sistemele de introducere pentru gaze (fig 1.2) utilizează rezervoare de capacitate de câțiva litri, încălzite sau reci, iar proba trece în spectrometru printr-o duză, gazele putând fi determinate cantitativ prin măsurarea presiunii. între abundența ionilor citiți în spectrul de masă și presiunea vaporilor din sistemul de introducere există relația:

Ii= Si Pi (1.1)

Unde (Ii-înălțimea peak-ului corespunzător componentului i) (Si-factorul de sensibilitate al componentului I) (Pi- presiunea componentului i)

Determinarea cantitativă a componenților unui amestec se face cunoscând presiunile parțiale ale acestora în sistemul de introducere al spectrometrului. Concentrațiile se vor calcula cu relația:

unde Pi – presiunea componenților din sistemul de introducere.

Presiunile parțiale se obțin din relația (1.1) cunoscând coeficienții de sensibilitate. Coeficienții de sensibilitate se obțin introducând componenții puri și măsurând intensitatea ionilor respectivi:

În cazul lichidelor proba trebuie trecută prin vapori, prin încălzire și introdusă în sursa de ioni. Sistemele de introducere pentru lichide (fig 1.3) se utilizează de obicei pentru introducerea probelor de referință și de aceea se mai numesc sisteme de referință. Capacitatea lor este de cca. 30 ml. Sistemele de introducere indirecte se caracterizează prin existența unui rezervor auxiliar din care proba curge printr-o conductă mică ( capilar, duză, robinet de regrare) în sursa de ioni a spectrometrului. Pentru reglarea scurgerii este necesară o presiune de vapori de cel puțin 10 3 torr.

In cazul analizelor izotopice de precizie devine importantă natura curgerii probei din rezervor în sursa de ioni. în curgerea moleculară (liber parcurs > dimensiunile conductei) fluxul moleculei izotopice ușoare este favorizat. Pentru a avea o compoziție stabilă în timpul măsurătorii în rezervor, se utilizează curgerea vâscoasă a probei din rezervor, iar precizie maximă se obține prin utilizarea unui sistem de introducere dublu, cu măsurarea alternativă a probei și a unui standard.

Probele solide se introduc foarte aproape de sursa de ioni cu o tijă prevăzută cu creuzet din material inert (aur sau uneori sticlă rezistentă la temperatură), cu posibilitate de încălzire termostatată (până la 400° C ). Se numesc sisteme de introducere directă (fig 1.4). Pe această cale se pot anliza substanțe greu volatile cu presiune de vapori de cel puțin IO-6 torr. Aceste sisteme de introducere se utilizează în special pentru analiza calitativă a unor compuși puri, de exemplu compuși de sinteză. Există și posibilitatea analizei cantitative a unui component de interes prin introducere directă și programare a temperaturii tijei, utilizând un standard intern adecvat, iar analiza se face pe ioni selectați (SIM), ai substanței de interes și ai unui standard cunoscut.

In cazul amestecurilor componenții probei trebuie mai întâi separați și în acest caz se utilizează cromatograful de gaze ca sistem de introducere.

Cantitatea de probă. Metoda spectrometriei de masă se caracterizează prin sensibilitate ridicată. Pentru introducerea indirectă sunt necesare cantități de ordinul 0,05-1 mg probă, pentru introducerea directă 0,5-100pg probă, iar pentru cuplajul GC/MS 5ng-10pg probă.

1.5 Producerea ionilor. Surse de ioni

Producerea ionilor. Ionii sunt accelerați către sistemul analizor și sunt separați în câmp în funcție de raportul masă/sarcină (m/z). Fasciculele de ioni sunt detectate la colector după ce au fost selectate prin variația câmpului magnetic sau tensiunii de accelerare a ionului. Abundența relativă a ionilor este direct legată de intensitatea relativă a ionilor sau altfel spus de înălțimile sau ariile de peak înregistrate după amplificarea curentului ionic de la colector. Pentru analiza cantitativă este necesară reproductibilitatea analizei. Ajustările spectrometrului de masă privesc focalizarea și centrarea fasciculului de ioni, astfel încât să se obțină un peak simetric și reproductibil în intensitate de la un baleaj la altul.

Presiunea unui compus în sursa de ioni trebuie sa fie de cca. 10 4torr, iar temperatura sursei de ioni este de obicei 200° C.

“Sensibilitatea” compusului se definește prin raportul înălțimii de peak și cantitatea de probă (care in cazul gazelor se exprimă prin presiunea compusului în rezervorul în care se introduce).În cazul amestecurilor în care compușii nu interferă, analiza cantitativă în % molare se poate efectua măsurând înălțimile de peak și utilizând sensibilitățile de răspuns ale compușilor respective. în cazul în care spectrul amestecului nu are peak-uri monocomponent (spectrele compușilor interferă) se pot rezolva ecuații simultane pentru contribuțiile la diferite peak-uri ale compușilor (deconvoluție).

Când compușii de interes sunt în cantitate mică este necesar ca proba să se concentreze înainte de înregistrarea spectrului de masă. Cele mai comune moduri de concentrare sunt distilarea, extracția în solvenți, cromatografia.

Surse de ioni

Sursa de ioni constituie, după analizor, cea mai importantă parte a unui spectrometru de masă, fiind locul unde moleculele neutre se transformă în ioni pozitivi și negative, alături de particule neutre. Domeniul de aplicabilitate a surselor de ioni este foarte vag, ele putând fi utilizate și în alte scopuri: la acceleratorii de particule, la studiul proceselor de ciocnire, la separatori electromagnetici etc. în funcție de scopul urmărit, sursa de ioni produce fascicule de ioni de intensități diferite, precum și de tipuri diferite de ioni. Astfel pentru sursele spectrometrelor de masă, intensitatea fasciculului ionic este de cca. 10 -16A, deci are o intensitate redusă.

Modul de producere a ionilor afectează foarte mult calitatea datelor spectrometrice de masă obținute. Metoda de ionizare se alege în funcție de proprietățile fizico-chimice ale analitului de interes (volatilitate, masa moleculară, labilitate termică, complexitatea matricei în care este conținut analitul).

Există câteva cerințe care trebuie să fie satisfăcute de către sursele de ioni:

– Intensitatea fasciculului ionic trebuie să fie suficient de mare (în funcție de detector) pentru a permite măsurători corecte. în acest sens se definește sensibilitatea sursei de ioni ca și raportul dintre curentul de ioni obținut și presiunea în sursa de ioni (A/torr). în general este indicat ca intensitatea totală a fasciculului ionic să nu fie mai mică de 10 .

Este necesar ca energia ionilor să fie cât mai omogenă cu putință. Puterea de rezoluție a spectrometrului de masă este direct legată de uniformitatea energiei ionilor. In consecință fluctuațiile în accelerarea ionilor trebuie reduse la minimunx, mai ales la instrumentele cu simplă focalizare.

Fasciculul ionic trebuie să fie suficient de stabil în timp din punct de vedere al intensității. Datorită naturii procesului de ionizare această condiție nu poate fi satisfăcută în toate cazurile.

Ionii datorați gazelor reziduale (fond) trebuie să fie produși în cantitate cât mai mică. în acest sens de o mare importanță este o viteză de pompaj ridicată a gazelor reziduale din sursă și posibilitatea unei bune decontaminări prin degazarea sursei între analizele unor probe de compoziție diferită.

Este important ca o cât mai mare parte din atomii introduși în sursă să se ionizeze, mai ales dacă proba de analizat este mică. Eficiența de ionizare depinde de detaliile de construcție a sursei și de natura substanței de ionizat.

Trebuie ca efectele de memorie între probele succesive să fie eliminate sau reduse la minimum. între altele și reducerea fondului contribuie în mod substanțial la eliminarea efectelor de memorie.

Sursa de ioni trebuie astfel concepută ca să necesite un număr cât mai mic de prelucrări chimice a probelor înainte de analiză. Fiecare fază de prelucrare introduce în mod inevitabil erori. Este de preferat să se aleagă o sursă potrivită cu materialul de analizat decât acesta să fie transformat printr-un număr mare de operații chimice.

In cele ce urmează o sa prezint câteva caracteristici ale celor mai utilizate surse de ioni. Caracterizarea sursei de ioni E.I.( ionizare prin impact electronic )

Poate fi utilizată în sisteme GC/MS și tehnici de introducere directă.

Produce spectre de compuși “clasice” care se pot cauta/interpreta cu biblioteci de spectre.

Sunt utile pentru identificarea și/sau elucidarea structurală.

Spectrele E I. sunt relative ușor de obținut.

Tehnica de ionizare este fiabilă și sensibilă.

Poate fi folosită pentru analiza compușilor sensibili la aer și la umezeală.

Analiții trebuie sa fie sub formă de vapori deoarece există anumite probleme cu degradadea termică.

Caracteristicile sursei de ioni C.I. (ionizare chimică )

Dă informație de masă moleculară.

Analiza cantitativă se face doar cu standard intern.

Constituenții monomerici și dimerii legați covalent nu dau diferențe

C.I. poate fi utilizată ca metodă de ionizare GC/MS

Gazele de reacție utilizate sunt : metanul, izobutanul și amoniacul

Alte metode de ionizare cu aplicații speciale sunt: desobție de câmp (F.D.);

-ionizarea cu bombardament de ioni ( utilă în studiul suprafețelor);

ionizarea prin bombardament cu atomi rapizi (F.A.B), utilizată în analiza biomoleculelor;

-termoionizarea ( evaporarea sub formă de ioni de pe un filament metallic încălzit) permite măsurarea rapoartelor izotopice la elemente solide (metale);

-ionizarea într-o descărcare în plasmă la presiune înaltă cuplată inductive (I.C.P) pentru analiza la solide (amestecuri)

-ionizare într-o descărcare electrică în scânteie sau cu descărcare luminiscentă pentru analiza de solide

-fotoionizare (cu laser)la presiunea atmosferică, pentru analize de amestecuri (AP.PI)

-ionizare electrospray (E S I)

-ionizare chimică la presiune atmosferică (A P.C.I)

-ionizare prin desorbție de pe matricea asistată de laser (M.A.L.D.I)

Analizatori de masă

Din momentul formării în sursă și până în momentul neutralizării la colector, mișcarea ionilor în spectrometrul de masă este determinată de câmpurile electrice și magnetice al căror rol este de a analiza și focaliza fasciculul ionic. Odată ionizate, moleculele probei și fragmentele acestora pot fi separate pe baza raportului masă / sarcină (m/z).

Principalele mărimi care caracterizează performanța unui analizor de masă sunt sensibilitatea și rezoluția. Sensibilitatea ne indică ce curent ionic vom putea colecta pentru o anume presiune parțială în sursa de ioni sau ce sarcină electrică pentru o anumită cantitate de substanță introdusă în sursă. Sensibilitatea se exprimă uzual:

în raportul dintre curentul colectat pentru o specie ionică dată, măsurat în amperi, și presiunea parțială a gazului din a cărui ionizare provine, în torr, presiune măsurată în camera de ionizare (A/torr),

prin specificarea curentului colectat la o presiune în sursă dată în microni coloană de mercur pentru un curent de electroni ionizați exprimat în microamperi, (A/p, Hg/pA),

prin cantitatea de sarcină electrică exprimată în coulombi transportată de toți ionii de o specie dată produși de la un nanogram de substanță (C/ng).

Rezoluția caracterizează capacitatea spectrometrului de masă de a separa ionii de diferite rapoarte m/z.

Dacă se consideră două peak-uri adiacente de intensități egale, corespunzătoare ionilor cu mase ml și m2, puterea de rezoluție necesară pentru a separa cei doi ioni este dată de raportul mx / Am, unde Am-m2 -mx. Atunci când se indică puterea de rezoluție ml Am a unui aparat se dă și valoarea AHIH, adică înălțimea relativa a văii dintre două peak-uri rezolvate. Acest mod de exprimare a rezoluției este cel mai des utilizat atunci când spectrul se înregistrează în scopuri calitative. Dacă spectrul este înregistrat în scopuri cantitaive este foarte important să se poată aprecia contribuția fiecărui ion la înălțimea peak-ului vecin, adică gradul de interferență a celor două peak-uri.

Rezoluții de câteva sute sunt denumite rezoluții joase și permit determinarea masei nominale ca număr întreg. Rezoluții de ordinul miilor sau mai mari reprezintă rezoluții înalte și permit măsurarea masei cu precizie de ordinul miliunităților sau mai bună.

În sistemele GC/MS se folosesc analizori de masă cu sector magnetic și analizori cuadrupolari. Pe lângă aceștia mai există analizori de masă cu "timp de zbor" și cu sector electrostatic.

Spectrometrul de masă cu sector magnetic

Analizorul magnetic constă dintr-un tub vidat (10 6 -10 ' torr) curbat după un arc de cerc, situat între polii unui magnet ce produce un câmp extrem de uniform.

Fasciculul de ioni accelerați proveniți din camera de ionizare este deviat de câmpul magnetic situat perpendicular și descrie în tubul analizorului o traiectorie circulară a cărei rază este dată de ecuația.

Prin varierea continuă fie a câmpului magnetic B, fie a potențialului accelerator V, se realizează condiția ca ionii de toate mărimile m/z să focalizeze și prin fanta de ieșire să ajungă la detector. Fiecare dintre aceste două procedee are avantaje și dezavantaje.

Prin varierea câmpului magnetic se poate acoperi un interval de masă mai larg, întrucât la potențial accelerator constant masa ionilor focalizați este proporțională cu pătratul intensității câmpului magnetic. însă, pe de o parte, varierea continuă a câmpului magnetic este practic mai greu de realizat, iar pe de altă parte, modificarea câmpului magnetic influențează negativ funcționarea corectă a sursei de ioni. Din punct de vedere practic este mult mai ușor de realizat varierea potențialului accelerator și menținerea constantă a câmpului magnetic. în acest fel, sursa de ioni fiind în vecinătatea unui câmp magnetic constant, va suferi o influență constantă tot timpul înregistrării spectrului. Acest procedeu este limitat totuși de faptul că la potențiale de accelerare scăzute (când focalizează ionii mai grei) se face simțită contribuția energiei termice și cinetice a ionilor, ceea ce duce la o slabă focalizare a ionilor mai grei și deci la o scădere față de valoarea reală a intensității relative a picurilor corespunzătoare.

Puterea de rezoluție a spectrometrului de masă cu sector magnetic crește o dată cu creșterea razei de curbură r a analizorului și cu ridicarea potențialului accelerator V, însă din motive de ordin practic acești parametri nu pot fi măriți nelimitat, astfel că puterea de rezoluție a acestui aparat nu depășește 10 . Atingerea unei puteri de rezoluție mai ridicate este posibilă cu ajutorul spectrometrelor de masă cu dublă focalizare

Analizorul electrostatic. Spectrometre de masă cu dublă focalizare

In mod obișnuit, ionii cu același raport m/z posedă energii diferite la părăsirea camerei de ionizare. Diferența de energie provine din faptul că, pe de o parte, moleculele au energii termice diferite înainte de ionizare, iar pe de altă parte, nu toți ionii se formează pe suprafețe riguros echipotențiale. Datorită acestei diferențe de energie, ionii care au același raport m/z vor focaliza pe o suprafață mai mare (și nu într-un punct cum ar fi ideal), fapt ce limitează rezoluția analizorului magnetic. Dacă s-ar reuși obținerea fasciculelor de ioni de aceeași energie, focalizarea acestora ar fi mult îmbunătățită. în practică, ioni monoenergetici se pot obține trecând un flux de ioni printr-un câmp electrostatic radial în așa-numitul analizor electrostatic.

Raza de curbură a traiectoriei unui ion în câmp electrostatic este dată de relația.

unde E este diferența de potențial aplicată între plăcile radiale ale analizorului, iar V este tensiunea plăcilor acceleratoare ale sursei de ioni.

După cum rezultă din ecuație, traiectoria unui ion nu depinde de masa acestuia ci numai de energia sa prin intermediul lui V. în acest fel, ionii de energie egală, vor descrie aceeași traiectorie și vor focaliza împreună.Prin combinarea analizorului electrostatic (focalizare de viteză) cu un analizor magnetic (focalizare de direcție) se obține un fascicul de ioni dublu focalizați, iar aparatele construite pe acest principiu se numesc spectrometre de masă cu dublă focalizare. Puterea de rezoluție a acestor aparate atinge 70000.

Analizorul cu "timp de zbor”

Realizează separarea ionilor pe un principiu complet diferit de cele amintite anterior și anume, dacă se accelerează mai mulți ioni ce posedă aceeași energie, cei cu mase mai mici vor dobândi viteze mai mari. Astfel, dacă se stabilește o distanță fixă de parcurs, "timpul de zbor" necesar ionilor va varia în funcție de masa lor, cei mai ușori străbătând distanța mai repede.

In mod practic, prin acțiunea electronilor în intervale de timp foarte scurte și repetate asupra moleculelor în stare gazoasă, se obțin pulsuri de ioni de aceeași energie. Aceste pulsuri de ioni sunt apoi accelerate de un câmp electric și lăsate să "zboare" printr-un tub evacuat cu lungimea de aproximativ 1 m, la capătul căruia este plasat detectorul de ioni. Ionul cel mai ușor va sosi primul la detector, iar ceilalți vor fi înregistrați treptat în ordinea crescătoare a masei. Pulsurile ionice sunt emise în tub cu o astfel de frecvență, încât ionul cel mai greu al unui puls să nu se suprapună cu cel mai ușor al pulsului următor.

Puterea de rezoluție a acestui tip de analizor este limitată de lungimea tubului. Aparatele bine reglate ating totuși rezoluția de 1500. Deși puterea de rezoluție este relativ scăzută, spectrometrele de masă cu "timp de zbor" au o serie de avantaje cum ar fi: dimensiuni reduse, o bună reproductibilitate a spectrului, timp foarte scurt de înregistrare.

Analizorul cuadrupolar

Filtrele de masă cuadrupolare se crează alternând câmpul electric într-o arie patratică a patru electrozi prin combinarea radio frecvenței (V) și tensiunii continue (U) aplicată pe perechile adiacente de electrozi. Ionii din sursa de ioni sunt introduși în filtru de-a lungul axei barelor printr-o tensiune mică și suferă o traiectorie oscilantă de amplitudine crescândă, fiind în final colectați pe electrozi. La tensiunile selectate ale barelor o masă particulară este transmisă prin filtru.

Raportul U/V este menținut constant și V crește în amplitudine pentru a permite maselor mari să treacă prin filtru. Traiectoria ionilor prin analizor este în realitate foarte complicată. Figura de mai jos ilustrează o versiune simplificată a acesteia:

(a)

Domeniul de masă și rezoluția instrumentului depind de lungimea și diametrul electrozilor, dar, în general, puterea de rezoluție se situează în intervalul 1000-2000. Avantajele acestui analizor constau în cost mai scăzut și posibilitate de control prin computer. Aceste instrumente pot fi baleiate foarte rapid și sunt potrivite aplicațiilor în modul de lucru pe ioni selectați (SIM). Tensiunea joasă de accelerare necesară în filtrul cuadrupolar (10-20 V) are dezavantaje în detecția ionilor de mase mari.

Tipuri de ioni in spectrometria de masă

Marea majoritate a surselor de ioni întrebuințate în spectrometria de masă folosesc drept agent ionizant un fascicul de electroni de energie 50-70 eV. Această energie este cu mult mai mare decât primul potențial de ionizare al tuturor moleculelor (rareori mai mare de 15 V și niciodată mai mare de 25 V). Ca urmare a unui astfel de bombardament electronic, asupra moleculelor constituind proba, în sursa de ioni a spectrometrului de masă se produce pe lângă ionizare și o disociere a ionilor moleculari. Ionii obținiți pot primi în acest proces o cantitate mai mare sau mai mică de energie internă de excitație vibrațională sau rotațională sau de excitație electronică.

Această energie de excitație poate să determine la rândul ei disocieri întârziate ale ionilor, produse fie spontan, fie ca urmare a ciocnirii lor cu molecule neutre ale gazului rezidual din camera de analiză sau din sursa de ioni. întrucât secțiunea eficace de ionizare este mică, numai o mică parte din moleculele probei vor fi ionizate, în sursa de ioni coexistând ioni și molecule neutre. între acești parteneri apar forțe de interacțiune ion-dipol indus și ca urmare a acestora se produc reacții ion-moleculă, asemănătoare cu reacțiile chimice, dar cu viteze de reacție mult mai mari. Aceste reacții dau naștere la ioni a căror masă poate fi mai mare decât masa ionului molecular provenit din ionizarea moleculei neutre din probă.

Reprezentarea grafică a cantităților relative a acestor tipuri de ioni, în funcție de raportul m/z, reprezintă spectrul de masă al probei. în plaja de energie 50-120 eV pentru electronii ionizați, natura calitativă a spectrului de masă rămâne aproape întotdeauna neschimbată, iar natura cantitativă a spectrului de masă este numai în mică măsură dependentă de energia electronilor.

Ioni părinte

Ionii părinte (ionii moleculari părinte) sunt produși prin îndepărtarea unui singur electron din molecula neutră a probei.

M+e >M' +2e

Din această relație este ușor de văzut că masa ionului părinte M diferă numai foarte puțin de masa moleculei neutre M Astfel, determinând valoarea m/z a ionului părinte, se poate determina masa moleculară a probei. Este posibil ca din cauza energiei electronilor ionizanți fragmentarea să fie atât de intensă încât în spectrul de masă să nu apară deloc ioni părinte. Aceasta poate duce la erori atunci când se urmărește determinarea greutății moleculare a unui compus. în acest sens se recomandă ca la măsurători vizând determinarea greutății moleculare să se recurgă la energii ale electronilor ionizanți de ordinul a 10-15 eV și chiar și la aceste energii trebuie manifestată prudență pentru a nu confunda ionul părinte cu un fragment. Pe măsură ce crește complexitatea moleculei într-o serie dată, fragmentarea devine tot m intensă ceea ce face ca ionul părinte să aibă în spectrul de masă o pondere relativ mai mică.

Ioni fragment

Ionii fragment sunt ionii produși prin diferite procese de rupere a legăturilor în ionul părinte. Dacă acești ioni prezintă și rearanjări ale atomilor față de poziția lor în ionul părinte ei primesc denumirea de ioni de aranjare.

Exemple de procese de fragmentare:

Când se produce disocierea, fragmentele ce rezultă apar cu o anumită cantitate de enerj cinetică relativă. Aceasta este de obicei mică, dar în anumite cazuri poate să fie de 1 eV sau chiar mai mult.

Ioni metastabili

In urma impactului electronic o parte a moleculelor primesc o cantitate de energie suficient de mare pentru ca ionul rezultat să se fragmenteze. Ionul părinte, aflat pe un nivel vibrațional excitat care poate duce la fragmentare, poate avea o viață medie suficient de lungă pentru a părăsi cam de ionizare a sursei, înainte ca fragmentarea să se fi produs. Un astfel de ion poate să disocieze pentru a da ioni mai ușori în regiunea de accelerare a sursei sau undeva pe traiectoria sa între fanta de ieșire a sursei și colector.

Fie m masa ionului părinte, mx masa ionului care apare prin fragmentarea ionului părinte tensiunea de accelerare a sursei de ioni a spectrometrului, B inducția magnetică în analizorul magnetic și V tensiunea de accelerarea sursei de ioni a spectrului.

Raza de curbură r a traiectoriei mediane în câmpul magnetic va fi:

Spectrometrul de masă are în cazul metodelor electrice de detecție a ionilor o rază de curbură fixă, dată de construcția aparatului, fasciculele ionice fiind rând pe rând aduse pe traiectoria corectă care atinge colectorul prin modificarea concontinuă a valorii B sau V.

Presupunând că disocierea are loc undeva între fanta de ieșire a sursei de ioni și limita câmpului magnetic, fragmentul m} apărut din disocierea lui m nu va mai avea energia eV ci o altă energie:

adică acest fragment străbate analizorul ca și când ar fi accelerat la tensiunea V1. Pentru ca acesta să se înscrie pe traiectoria corectă de rază r trebuie ca inducția magnetică B să aibă valoarea:

Deci fragmentul va atinge colectorul ca și când ar avea masa:

Acești ioni sunt în general numiți ioni metastabili iar m* se numește masă aparentă. Denumirea este improprie pentru că de fapt la colector ajung ionii produs ai disocierilor metastabile.

Din expresia inducției magnetice rezultă că în spectrul de masă acești ioni vor fi colectați și la numere de masă neîntregi.

Nu toți ionii colectați la masa aparentă m* provin din disocieri metastabile propriu- zise. Posibil de asemenea și se întâmplă adesea ca ionii aflați pe nivele vibraționale stabile să primească un plus de energie internă în urma ciocnirii cu o moleculă neutră din probă sau din gazul rezidual și în felul acesta să ajungă pe un nivel de disociere. Acestea sunt așa numitele disocieri induse prin ciocnire. Intensitatea curenților ionici dați de produșii acestor disocieri este funcție de presiunea spectrometrului de masă.

De obicei fragmentul neutru care părăsește ionul în timpul unei tranziției metastabile este o moleculă stabilă sau un radical. In tabelul următor sunt date câteva grupări de atomi care sunt foarte frecvent pierdute din ioni complecși, prin disociații metastabile.În tabelul urmator sunt date câteva grupări de atomi care sunt foarte frecvent pierdute prin ioni complecsi prin disociații metastabile

Descifrarea peak-urilor metastabile din spectrele de masă este foarte utilă în scopuri analitice în studiul structurii unor molecule complexe sau în analiza amestecurilor pentru a stabili dacă doi ioni aparțin spectrului de masă al aceluiași component.

Ioni de rearanjare

Se observă în spectrul de masă al unor compuși anumiți ioni de masă mai mică decât ionul molecular părinte, a căror apariție nu poate fi atribuită unei simple rupturi a unei legături. Aceștia apar prin rearanjarea unor atomi sau unor grupări de atomi, care în ionul părinte ocupau altă poziții față de întregul complex.Această rearanjare însoțește fragmentarea mai cu seamă în moleculele mari.Există compuși pentru care procesele de rearanjare sunt atât de importante încât în spectrul de masă ionii de rearanjare sunt cei mai abundenți. Este foarte important să se aibă în vedere posibilitatea apariției ionilor de rearanjare atunci când se încearcă stabilirea structurii moleculare unui compus prin spectrometrie de masă.

Ioni multiplu încărcați

lonizarea multiplă poate fi reprezentată prin relația:

R + e->Rn+1 +(n + 1)e

Ionii poliatomici multiplu încărcați nu au în general o contribuție semnificativă în spectrele de masă.

Ioni negativi

În sursa de ioni cu impact electronic apar pe lângă ioni pozitivi și ioni negativi. Există două căi principale pentru obținerea acestor ioni:

captură de electroni: YZ +e —> YZ~ —>Y + Z

formarea de perechi: YZ+e->Y++Z~+e

întrucât câmpurile electrice și magnetice din spectrometrele de masă standard nu permit ionilor negativi să ajungă la colector, aceștia nu vor fi observați în spectrele de masă.

Ioni produs ai reacțiilor ion-moleculă

Din cauza coexistenței în sursa de ioni a moleculelor neutre ale probei și a ionilor formați prin impact electronic, există condiții ca reacțiile ion-moleculă să se producă. Intensitatea curenților ionici produși de reacțiile ion-moleculă, în spectrometrele de masă standard, este mică și depinde de pătratul presiunii existente în sursa de ioni a spectrometrului. Excepții sunt cazurile în care reacțiile ion-moleculă implică extracția unui proton de la molecula neutră și apariția unui ion de masă M+l (M masa ionului părinte). Acest proces este deosebit de intens în cazurile în care ionul părinte are o mică stabilitate și fragmentează ușor, în timp ce ionul produs prin adiție de proton este foarte stabil.

Izotopii în spectrele de masă

Izotopii elementelor diferă prin numărul de neutroni din nucleul lor, de aceea vor da naștere la ioni de mase diferite. înălțimile relative ale peak-urilor din spectrul de masă, corespunzând valorilor m/z ale acestor ioni sunt o măsură a raportului abundentelor acestor izotopi în probă. Cunoașterea modului de repartiție al izotopilor la diferitele numere de masă din spectrul de masă al compusului este foartă importantă atunci când scopul măsurătorilor este analiza izotopică a probei.

Ioni reziduali

Urmele de aer din spectrometrul de masă produc întotdeauna într-o măsură mai mare sau mai mică semnale ionice care se suprapun peste spectrul de masă al probei. Acesta este așa numitul spectru de fond și este un element care stânjenește munca analistului. El trebuie măsurat înainte de introducerea probei și contribuția sa scăzută din spectrul de masă al compusului studiat. Există totuși un avantaj în aceea că spectrul de fond conține peak-uri puține a căror poziție și configurație este ușor de recunoscut după puțină practică.

Detecția ionilor. Sensibilitatea spectrometrului

Fasciculul de ioni trece prin analizorul de masă și apoi este detectat și transformat într- un semnal util de către detector.

Există diferite tipuri de detectori, care se pot clasifica în două categorii. Placa fotografică și cușca Faraday permit măsurarea directă a sarcinilor care ajung la detector, în timp ce detectorii cu multiplicator de electroni sau fotoni și detectorii cu aranjare (array) cresc intensitatea semnalului.

Un detector ideal de ioni ar trebui sa răspundă următoarelor cerințe.

-să asigure o corespondență perfectă între numărul de ioni incidenți și impulsurile de ieșire;

-impulsurile de ieșire să fie de o amplitudine suficient de mare în comparație cu toate impulsurile de zgomot;

-ar trebui sa existe o posibilitate de discriminare între ionii aând același raport m/z; să existe -posibilitatea de control simultan a cel puțin două mase ; să dea un răspuns liniar pe mai multe ordine de mărime în intensitate.

Înregistrarea si prelucrarea datelor MS

Spectrul de masă reprezintă înregistrarea abundenței ionilor unui compus în funcție de masă (raportul m/z) și este specific substanței, caracterizând-o. Spectrul de masă reprezintă "amprenta" unei substanțe și de aceea spectrometrul de masă reprezintă un detector ideal pentru compușii separați prin cromatografie de gaze.

Un computer (calculator) dedicat spectrometrului de masă înregistrează datele obținute de spectrometru și le convertește fie în valori de mase și intensități de picuri sau în curent de ioni total, temperaturi, valori de potențiale de accelerare, etc.

Cu calculatorul se pot calcula compoziții posibile de ioni la o masă dată, ținând cont de elementele din formula moleculară; se pot compara spectre de masă obținute cu cele din biblioteca de spectre. Computerul poate controla spectrometrul de masă introducând valorile și variațiile diferiților parametrii.

Deoarece computerul tratează date digitale unde spectrometrul de masă produce și primește date analogice, este necesară o interfață care să convertească un tip de date în altele.

Interfața primește, condiționează și digitalizează semnalul analogic (dat de fascicul, curent ionic, temperaturi, tensiuni) la ieșirea din spectrometru și le trimite la computer. Este convertorul analog-digital (ADC). Convertorul digital-analog (DAC) transmite spectrometrului tensiunile necesare pentru funcționare, determinate de computer funcție de valorile date de operator.

Computerul utilizează programe pentru controlul secvenței operațiilor. Softul transmite instrucțiunile tastate de operator și le convertește în limbaj mașină.

Intensitatea picului este dată fie de Vmax, fie de aria peak-ului. Dacă nu se produc trei semnale digitale consecutive peste linia de bază semnalele sunt eliminate print-o rutină de recunoaștere a peak-urilor.

Conversia datelor.

Poziția peak-ului este dată de valoarea timpului (sau o valoare a tensiunii Hali la analizoare magnetice sau o valoare a tensiunii în cuadrupol) care trebuie convertită în valoare de masă. Aceasta presupune o calibrare preliminară cu substanțe cunoscute (PFK, PFTBA.etc). Compușii de referință trebuie să dea ioni care să nu interfere cu ionii probei. Masele furnizate de substanțele de calibrare sunt înmagazinate de computer. Spectrele sunt date în tabel sau grafic, normate la 100 față de intensitatea picului de bază. Computerul dă de asemenea date funcție de timp (curentul de ioni total, temperaturii, tensiuni).Picurile spectrului de masă ale compusului necunoscut se pot utiliza pentru determinarea structurală a acestuia. Prin corelarea structurii moleculare cu configurația spectrului de masă, spectrometria de masă dă informații privind natura si numărul atomilor care compun molecula (formula brută), existența unor grupări funcționale și modul în care sunt așezate. Studiul căilor de fragmentare ale compusului utilizând tehnicile de măsură a maselor exacte în înaltă rezoluție și măsurarea ionilor metastabili (cu spectrometre de masă cu dublă focalizare se pot măsura individual ionii metastabili) dau informații și mai precise asupra structurii, mecanismelor de fragmentare și formare a ionilor, tăriei legaturilor compusului de analizat.

Una din informațiile importante oferite de spectrul de masă este masa moleculară. însă nu toate moleculele au ion molecular. Compușii aromatici se caracterizează prin prezența ionului molecular, în timp ce alcoolii, de exemplu, dau informația de masă moleculară prin prezența ionului M-18. Noile spectrometre de masă prezintă computer care controlează operarea instrumentului și achiziția de date.

Prelucrarea datelor MS. Prima etapă în prelucrarea datelor de achiziție este identificarea masei de calibrare. Computerul prelucrează o listă de mase de referință baleind un compus de calibrare utilizat pentru stabilirea valorilor maselor ionilor probei.

Se utilizează de obicei o scară de timp sau, așa cum s-a menționat la instrumente cuadrupolare, masele de referință sunt legate de o scară de tensiune derivată de la tensiunea barelor cuadropolului. Similar, o sondă Hali plasată în câmpul magnetic poate da o tensiune pentru corelarea cu peak- urile de referință.

Studiul căilor de fragmentare ale compusului utilizând tehnicile de măsură a maselor exacte în înalta rezoluție și măsurarea ionilor metastabili (cu spectrometre de masă cu dublă focalizare se pot măsura individual ionii metastabili) dau informații și mai precise asupra structurii, mecanismelor de fragmentare și formare a ionilor ca și tăria legăturilor compusului de analizat.

Una din informațiile importante oferite de spectrul de masă este masa moleculară. Moleculele ce conțin fluor (M= 18,9984), datorită defectului de masă rezultat și pentru ionii ce conțin fior, sunt utile ca standard pentru măsurători de masă exactă. Fig. 1.7 prezintă spectrul de masă al perflorokerosenului. o hidrocarbură în care hidrogenul a fost înlocuit cu fior iar Fig. 1.8 prezintă spectrul de masă al perflorotributilaminei, PFTBA, subtanțe utilizate pentru calibrare și focalizare

In Fig. 1.7 este prezentat un detaliu din spectru de masă al atrazinei (intervalul

cuprins între 197 și 220 Da). Maniera de prezentare de tip profil spectral presupune o

rezoluție dată,caracteristică pentru analizorul de masă utilizat, pe când maniera de

reprezentare de tip linie spectrală reprezintă un mod idealizat, prin care sunt figurate

intensitățile doar pentru valorile întregi ale rapoartelor m/z. Ionul cu cea mai mare

abundență în spectrul de masă se va numi ionul major (este acel ion cu cea mai mare

stabilitate și probabilitate de a se obține). Raportarea abundențelor individuale a tuturor

celorlalți ioni la abundența ionului major va conduce la măsurători de abundență relativă

(RA%) în lungul axei Oy.

Interpretarea spectrului de masă poate fi utilizată la identificarea structurii unui

compus organic investigat prin această tehnică. Identificarea structurală presupune de

regulă compararea unui spectru de masă experimental cu spectre MS dintr-o librărie

spectrală, stocată în memoria sistemului de procesare a datelor cu care este dotat

2.CROMATOGRAFIA DE GAZE

Cromatografia este o metodă de separare a amestecurilor multicomponente. Ea se bazează pe repartiția diferită a componentelor unui amestec între o fază mobilă și una staționară (nemiscibile), având ca urmare deplasarea cu viteză diferită a componentelor purtate de faza mobilă de-a lungul fazei staționare. Cele două faze sunt o fază staționară imobilă cu o suprafață mare și una mobilă care curge într-o direcție și poate fi gazoasă sau lichidă.

La început, cromatografia presupunea separarea pigmenților din plante în benzi discrete colorate. Termenul "cromatografie" (scriere colorată) a devenit o denumire generică pentru o gamă largă de științe ce se ocupă cu separarea substanțelor. Faza mobilă este gazoasă, faza staționară poate fi lichidă sau solidă. Separarea este realizată prin diferențele în distribuția componenților individuali ai probei între faza mobilă și staționară, cauzând mișcarea componenților prin coloană cu diferite viteze.

Principala deosebire a cromatografiei de celelalte metode de separare constă în faptul ca una dintre faze este staționară. De aici rezultă următoarele consecințe:

– tehnica de lucru este foarte simplă, faza staționară putând fi fixată fie în coloane de dimensiuni reduse, sub formă de umplutură sau pe pereții interiori ai unor tuburi capilare, fie pur și simplu pe hârtie de filtru sau pe un strat subțire dintr-un alt material;

imobilitatea fazei staționare permite dispunerea ei în straturi de grosime foarte mică, ceea ce asigură o suprafață de contact mare și un transfer de masă rapid între cele două faze și, deci, o eficacitate ridicată de separare,

posibilitatea folosirii unor cantități de probă extrem de mici și realizarea separării într-un timp foarte scurt.

Diferența între viteza de migrare a fazei mobile și cea a componentului este specifică pentru natura chimică a acestuia din urmă. Astfel că, o dată separate componentele, pentru detectarea lor se pot folosi metode nespecifice, universale, fapt care simplifică considerabil analiza calitativă și cantitativă a unui amestec de substanțe.

Posibilitatea de a utiliza o gamă largă de faze staționare și mobile, eficacitatea și simplitatea tehnicii de lucru, la care se adaugă viteza mare de separare și ușurința de detectare a unor cantități foarte mici de probă, sunt principalele calități datorită cărora cromatografia constituie, alături de metodele spectroscopice, cea mai importantă metodă de analiză. Principalul domeniu de aplicație al cromatografiei este microanaliza amestecurilor multicomponente.

Secvența operațiilor în analiza cromatografică:

proba este evaporată și introdusă în coloana cromatografică;

analiții vor călători cu faza mobilă;

analiții vor interacționa cu faza staționară, sunt întârziați individual și sunt separați;

Cerințele pentru analit ca să fie supus analizei comatografice sunt ca transferul de masă să aibă loc în stare gazoasă, ceea ce cere ca analitul să fie în fază gazoasă sau de vapori tară a se descompune (trebuie să fie stabil termic până la 300°C), sau trebuie să fie un compus nevolatil care să fie transformat în derivați volatili prin reacție chimică sau trebuie să fie o substanță care poate fi supusă descompunerii controlate.

Avantajele cromatografiei de gaze sunt:

viteza analizei;

eficiența separării;

sensibiliatea;

automatizarea;

Există mai multe tipuri de cromatografie, în funcție de tehnica, modul de lucru și proprietățile fizico-chimice ale fazelor. Cea mai importantă clasificare este după starea de

agregare a fazei mobile, în cromatografie în fază gazoasă și cromatorafie în fază lichidă. Tehnica de lucru diferă atât de mult în aceste două grupe încât se lucrează în două direcții distincte cu o aparatură și literatură de specialitate proprie.

2.1 Principiul cromatografiei în fază gazoasă

Cromatografia în fază gazoasă prin eluare presupune injectarea probei în curentul fazei mobile, numită eiuent, care o poartă de-a lungul fazei staționare.

Schema de principiu a unui cromatograf de gaze este reprezentată în figura de mai jos.

Fig 2.0 Schema bloc a unui cromatograf dc gaze: l-coloană; 2-detector; 3-sursă de eiuent; 4-dispozitiv de reglare și măsurare a debitului; 5-dispozitiv de introducere a probei; 6-termostat; 7-înregistrator.

Elementele lui principale sunt coloana și detectorul. La acestea se mai adaugă următoarele anexe; o sursă de eiuent, un dispozitiv de măsurare și reglare a debitului, un dispozitiv de introducere a probei, un termostat și un instrument de înregistrare a semnalelor furnizate de detector.

Eluentul trece prin dispozitivul de introducere a probei, preia proba de analizat și o introduce în coloana cromatografică. Din cauza interacțiunii moleculelor probei cu faza staționară componentele rămân în urma eluentului. în funcție de diferențele care există între echilibrele lor de repartiție între cele două faze, se produce o diferențiere a vitezelor lor de migrare și, în final, separarea.

Eșalonate astfel în timp, componentele sunt purtate de eiuent după ieșirea din coloană în detector. Acesta transformă diferența unei proprietăți fizice între component și eluent într-un semnal electric, proporțional cu concentrația componentului în fază gazoasă.

Reprezentarea grafică a semnalului detectorului în funcție de timp, obținută cu ajutorul înregistratorului, se numește cromatogramă. Semnalele obținute sub forma unor vârfuri numite peak-uri corespund componentelor probei.

Timpul la care apare maximul unui peak, măsurat din momentul introducerii probei, se numește timp de reținere, tR, și este caracteristica calitativă a componentului respectiv, înălțimea peak-ului, h, sau aria suprafeței lui, A, constituie parametrul cantitativ, proporțional cu cantitatea de component. Se notează cu tM timpul în care eluentul și componentele care nu inter acționează cu faza staționară parcurg distanța până la detector.

Performanțele aparaturii gaz-cromatografice și condițiile de lucru variază între limite largi, în principiu se pot analiza prin cromatografie în fază gazoasă toate gazele, precum și toate substanțele lichide sau solide care pot fi evaporate fără descompunere la presiuni parțiale de câțiva mm Hg. Pot fi analizate și substanțe solide prin descompunerea lor termică în condiții controlate (piroliză), urmată de separarea cromatografică a produșilor de descompunere.

Teoria talelelor teoretice.

Separarea cromatografică a componentelor în coloană are loc printr-o succesiune de procese elementare de repartiție a componentelor între cele două faze. Lungimea de coloană pe care se realizează un echilibru de repartiție este numită înălțimea echivalentă unui taler teoretic, H. Pe o coloană de lungime totală L se realizează deci L/H=N echilibre sau talere teoretice. Numărul de talere teoretice pe un metru de coloană se numește performanța coloanei și se notează: N-N/L. Teoria talelelor teoretice introduce prin urmare un parametru important, înălțimea talerului teoretic, H, cu ajutorul căruia se poate evalua lățimea unei zone și deci eficacitatea coloanei de separare.

Faza mobilă

Avantajele cromatografiei în fază gazoasă față de celelalte metode cromatografice se datoresc transferului de masă foarte rapid în fază gazoasă. Ca eluenți se utilizează de obicei H2,N29,Ar, He, C02. Alegerea eluentului într-un caz particular dat se face în funcție de sensibilitatea detectorului, de eficacitatea separării și de interacțiunea eluentului cu componentele probei și cu faza staționară. Influența eluentului asupra eficacității separării se manifestă prin intermediul vâscozității acestuia. La alegerea eluentului trebuie să se țină seama și de posibilitatea reacției acestuia cu unele din componentele probei, mai ales dacă faza staționară este un adsorbant cu proprietăți catalitice și dacă se lucrează la temperaturi înalte. Din acest punct de vedere impuritățile reactive din eluent (de exemplu oxigenul), sunt supărătoare.

Suportul fazei staționare

Suportul solid are rolul de a reține faza staționară lichidă într-un mod cât mai eficace, permițând formarea unei interfețe mari eluent-fază staționară, dar fără să interacționeze cu componentele probei. Pentru aceasta sunt adecvate materiale care îndeplinesc următoarele condiții: inerție chimică, suprafață mare pe unitatea de volum, rezistență mecanică și stabilitate termică bună, rezistență cât mai mică la curgerea eluentului. Se cunoaște un număr apreciabil de astfel de suporturi care îndeplinesc destul de bine condițiile amintite.

Pentru a micșora efectele negative pe care le poate avea suportul asupra eficacității separării în coloană, acesta este supus la o serie de tratamente mecanice și chimice premergătoare aplicării fazei staționare. Se începe cu alegerea granulației dorite prin sortare sau sedimentare. Se utilizează granulații între 0,05 și 1 mm, în funcție de diametrul interior al coloanei. Suprafața specifică a suportului poate varia în limite largi. Valoarea minimă este de aproximativ 1 mg. Utilizarea unor suporturi cu suprafață specifică mare este dezavantajoasă din cauza efectului pronunțat de adsorbție a componentelor: apar peak-uri asimetrice. în ceea ce privește porozitatea suportului, este importantă uniformitatea acesteia. Cele mai avantajoase sunt umpluturile cu diametrul porilor în jur de 0,5-IO-4 -1,5-IO-3 mm.

La diametre mai mari sau prea mici ale porilor, eficacitatea separării este afectată de înecarea porilor cu fază lichidă. în cazul coloanelor capilare rolul suportului îl joacă pereții capilarelor, care în funcție de natura lor chimică se pot trata ca și umpluturile. O practică întrebuințată frecvent este depunerea unui strat subțire de suport solid pe pereții capilarelor, care ulterior sunt impregnați cu faza lichidă; aceasta pentru a asigura o suprafață mare și o bună adeziune a fazei staționare lichide.

Faza staționară lichidă

Succesul separării unui amestec depinde în esență de doi factori: alegerea adecvata a fazei staționare și eficacitatea coloanei. In vederea stabilirii unui criteriu practic de alegere a fazei staționare este utilă clasificarea fazelor staționare lichide după polaritatea lor, definită ca interacțiunea dipolilor permanenți ai substanței.

La alegerea unei faze staționare optime pentru separarea unui amestec foarte complex de substanțe se procedează în felul următor: se examinează posibilitatea unei eventuale simplificări a problemei prin separarea prealabilă a amestecului în clase de substanțe unitare din punct de vedere chimic. Dacă acest lucru nu este posibil, atunci se alege o fază staționară lichidă cât mai puțin selectivă, utilizabilă pentru toate componentele amestecului și care va separa componentele de obicei în ordinea punctelor lor de fierbere. Dacă, însă, amestecul de separat este format numai din două clase de substanțe, cu un. interval nu prea mare de puncte de fierbere, atunci este convenabil să se aleagă o fază stationaxă puternic selectivă, pe care se vor elua întâi componentele uneia din cele două clase, apoi ale celeilalte. Dacă nu se cunoaște compoziția amestecului de separat, se recomandă utilizarea mai multor faze lichide, de exemplu una nepolară și una polară. în cazuri mai complexe este foarte utilă cuplarea mai multor coloane cromatografice diferite sau folosirea unor amestecuri de diferite faze staționare. La separarea termenilor unei serii omoloage se folosește o fază înrudită chimic cu componentele probei. Calitatea separării depinde atunci mai ales de eficacitatea coloanei din punct de vedere dinamic.

Faza staționară solidă

Principalele tipuri de adsorbanți utilizați în cromato grafia gaz-solid sunt: cărbunele activ, silicagelul, oxidul de aluminiu și sitele moleculare. Proprietățile adsorbante ale fazei staționare depind în mare măsură de modul lor de preparare, respectiv de activare. \

Cărbunele activ este un adsorbant cu suprafață specifică mare (800-1000 m2/g). Puterea lui de adsorbție depinde de temperatura de activare. Pentru a fi utilizat la separarea gazelor permanente activarea lui se face la 600-700 °C în curent de gaz inert, în timp ce pentru separarea CO2 de CO se poate folosi și cărbune dezactivat de către umiditatea atmosferică. Pentru separarea hidrocarburilor ușoare, cărbunele se usca la 200-250 °C după care se impregnează cu circa 1,5% scalan pentru a se reduce asimetria peak-urilor. Pentru separarea substanțelor puternic polare, se poate utiliza numai cărbune grafitat.

Silicagelul. în funcție de temperatura de activare (maxim 250 °C) conține cantități variabile de apă. Este un adsorbant cu suprafață specifică mare, utilizat în special la analiza hidrocarburilor ușoare și a CO2 la temperatura camerei. Ca și cărbunele activ, silicagelul se poate utiliza impregnat cu 1-2% substanță organică lichidă, însă rezultate mai bune se obțin prin tratarea lui superficială cu silani.

Oxidul de aluminiu este un adsorbant mai puțin activ, cu o suprafață specifică de circa 200 m/g. în stare pură, neimpregnată, alumina se utilizează în mai mică măsură. Deoarece, spre deosebire de fazele staționare lichide, acest adsorbant are presiunea de vapori egală cu zero, este util pentru analize de hidrocarburi în urme.

Sitele moleculare (zeoliți). Sub această denumire este cuprinsă o clasă numeroasă de silicați ue aluminiu cristalini, cu structuri diferite și cu micropori de dimensiuni moleculare. Sitele moleculare se clasifică în patru clase:

clasa A: au diametrul cel mai mare al porilor (10-12 Â);

clasa B: au diametrul porilor de circa 5 Â. Nu absorb izoparafine și hidrocarburi aromatice ale căror diametre moleculare depășesc 5Â și deci nu pot pătrunde în porii sitei. în schimb adsorb cu ușurință substanțe cu dimensiuni moleculare mici;

clasa C: nu absorb hidrocarburi cu mai mult de doi atomi de carbon în moleculă; absorb substanțe cu molecule mici (N2, C02, H20);

clasa D: au diametrul porilor sub 3,8 Â;

În general, proprietățile de separare ale sitelor moleculare se datoresc atât fenomenelor de absorbție superficială a componentelor, cât și efectului propriu-zis de sortare prin sită. în cazul gazelor permanente fenomenul preponderent în procesul de separare este absorbția superficială.

În cromatografia gazoasă sitele moleculare se utilizează în special la separarea gazelor permanente, la diferite temperaturi, cromatogramele remarcându-se prin simetria peak-urilor.

Necesită o activare prealabilă la 350-450°C în curent de gaz uscat (direct în coloană sau în vid). Proprietățile lor pot fi considerabil modificate prin tratarea chimică a suprafeței.

Utilizarea coloanelor capilare lărgește considerabil domeniul de aplicabilitate a cromatografiei gaz-solid. Prin modificarea chimică superficială a pereților interiori ai coloanelor se pot obține suprafețe foarte active, uniforme și cu mare stabilitate, care permit atingerea unor performanțe ridicate atât în ceea ce privește rezoluția, cât și timpul de analiză.

Coloane cromatografice

Coloana este partea esențială (inima) a cromatograf ului. Puterea de rezoluție necesară pentru o separare adecvată depinde de complexitatea amestecului de analizat. Fără puterea sa de separare, spectrele de masă ar fi mult mai greu de interpretat. Coloanele convenționale sunt potrivite pentru amestecuri simple și au timpi de analiză relativ scurți, iar pentru amestecurile complexe sunt necesare coloanele capilare cu timpi de analiză mai lungi.

2.7 Coloanele convenționale

Coloana convențională de separare din metal sau sticlă, are în general o lungime de 0,5-3 m și un diametru interior de 2 mm, umplută cu o umplutură, care poate fi un adsorbant cu granulație de 0,1-0,5 mm sau un material solid, inactiv, numit suport, impregnat în proporție de 5-20% cu un lichid cu volatilitate redusă, faza staționară, de obicei un polimer. Creșterea lungimii coloanei duce la creșterea posibilității de reamestecare a probei, obținându- se astfel picuri mai late. Din cauza acestui efect, limita superioară a lungimii unei coloane convenționale este de 3-4 m.

2.8 Coloanele capilare

Acest tip de coloane nu are material de umplutură. Faza staționară este depusă fie direct pe pereții coloanei (WALLCOT) sau pe un suport material care îmbracă peretele interior (OSCOT) în grosimi de sub lum. Coloanele capilare au o eficiență mai mare decât cele convenționale deoarece gazul curge doar pe o singură cale, fiind îndepărtat efectul de reamestecare a probei și de lărgire a picurilor. Astfel, aceste coloane pot avea lungimi de 25 până la 50 m cu un număr de 4-500 de talere teoretice pe metru. Pentru o interacțiune eficientă între gaz și faza lichidă diametrul interior trebuie să fie mic, de obicei 0,1 mm. Coloanele capilare au o limită scăzută a cantității de solvent și probă pe care o pot transporta, fiin d astfel necesară divizarea probei în injector pentru a preveni distrugerea coloanei. Pentru a se evita pierderea unei cantități de probă au fost studiate și dezvoltate sisteme injectoare fără împărțirea substanței introduse. Timpii de reținere la acest tip de coloane tind să fie lungi, ducând la timpi lungi de analiză, ce pot ajunge la o oră.

3.CUPLAJUL GC-MS

Cromatografia nu este potrivită și pentru determinări calitative deoarece timpul de reținere nu poate duce la identificarea fără echivoc a numărului mare de componenți ce pot elua la aceeași valoare a timpului de reținere.

Cuplajul cromatograf- spectrometru de masă este util atunci când probele de analizat sunt amestecuri de substanțe organice, numărul de componente putând fi peste 100. în cuplaj, cromatrograful realizează separarea completă a componentelor amestecului, iar spectrometrul de masă identifică componentele astfel separate, pe baza spectrelor de masă. Astfel cromatografiil poate fi considerat un sistem special de introducere a probelor pentru spectrometrul de masă.

Principala problemă în realizarea acestui cuplaj este cea a presiunilor de lucru a celor două aparate. în timp ce crornatografele lucrează la presiune atmosferică, în sursele de ioni ale spectrometrelor de masă presiunea este de 10 " torr. Pentru a realiza căderea de presiune necesară se folosesc interfețe special concepute. în cazul coloanelor capilare debitul gazului este scăzut, 0,1-1 ml/min, ceea ce face posibilă conexiunea directă la spectrometrul de masă, fără folosirea unui separator de gaz purtător.

O problemă la coloane convenționale la care cantitatea de gaz purtător este mult mai mare în comparație cu cantitatea mică a componentelor separate. Astfel, interfețele pot cuprinde și separatoare moleculare care realizează o sărăcire e efluentului în eluent, pentru a evita intrarea în sursa de ioni a unei cantități prea mari de gaz purtător.

Utilizarea separatorilor moleculari este necesară în cazul în care spectrometrul de masă nu dispune de un sistem de vidare cu o viteză de pompare suficient de mare sau când domeniul de dinamică (raportul între picul cel mai mare și cel mai mic) este mare. Astfel aceștia măresc raportul între cantitatea de probă și cea de gaz purtător.

Separatorii moleculari se pot baza pe trei fenomene: îmbogățire prin scurgere prin pori fini sau printr-o fantă îngustă, difuzie preferențială a gazului purtător sau al probei printr-o membrană semipermeabilă și fracționarea gazelor într-un jet care se împrăștie. Pentru anumite cazuri particulare de probă sunt indicate anumite tipuri de separatoare.

Ordinea prezentării componenților coincide cu ordinea desfășurării analizei probei în

sistemul GC/MS

1. Port de injectare gaz purtător: cele mai utilizate și recomandate gaze purtătoare: H, He, N2,

permit migrarea probei de-a lungul coloanei și oferă condițiile necesare de presiune

functionării corecte.

2. Dispozitiv de reglare

3. Injector probă: aici proba se volatilizează și gazele rezultate antrenate de fluxul purtător

sunt conduse către coloană

4. Cuptor: programat la temperaturi capabile să mențină proba în stare gazoasă

(până la 400°C)

5. Coloana: segmentul cromatografului în care se desfășoară procesul de separare a

componenților din probă

6. Interfața: după separarea componenților în sistemul GC speciile trebuie transportate la

spectrometrul de masă unde urmează să fie ionizate și detectate.

7. Sursa de ioni: aici, compușii sunt ionizați înainte de a fi anlizați. Ionizarea reprezintă

procesul în care o moleculă este încărcată prin crearea unui cation (impact de electroni) sau

prin asociere sau transfer de sarcină (ionizare chimică, Cl), producându-se ioni.

8. Analizatorul de masă: ionii sunt filtrați apoi în funție de masa lor moleculară.

9. Detectorul: fasciculul de ioni ce se desprinde din analizatorul de masă, trebuie să fie

detectat și transformat într-un semnal utilizabil.

10. Sistem de vid: este necesar ca analiza să se poată desfășura într-un mod previzibil și

eficient

11. Control electronic.

4.Metoda experimentală

4.1 Introducere

Compoziția extractelor volatile din busuioc, mentă și salvie a fost investigată prin spectrometrie de gaz-cromatografică de masă (GC-MS) pentru a identifica compușii responsabili de mirosul lor caracteristic, plăcut sau pentru gusturi,aminoacizi și acizi grași liberi iar compoziția lor a fost comparată. Cele trei specii sunt utilizate în mod tradițional în medicină și la gătit. Cromatografia a fost realizată pe o coloană de fenil-metil 5% utilizat în programele de temperatură corespunzătoare.

4.2 Scopul Lucrării

Scopul investigațiilor a fost de a determina diferențele dintre aceste plante aromatice achiziționate de la Grădina Botanică din Cluj Napoca, România. GC-MS este o tehnică adecvată pentru caracterizarea compușilor din extracte plante. Compușii identificați în plantele studiate sunt caracteristici pentru mirosul sau aroma acestor plante. Optimizarea micronutrienților în produsele alimentare este foarte importantă. Aminoacizii joaca un rol important în alimentația umană. In multe alimente, nivelul de aminoacizi esențiali dicteaza valoarea nutritivă. Aminoacizii liberi au un efect important in aroma alimentelor,și contribuie la formarea de amine și compuși volatili.

4.3 Menta,Busuiocul si Salvia

Menta este o plantă ierboasă care crește în culturi.În scopuri medicinale, de la mentã se folosesc frunzele și partea aeriană în totalitate. Atunci când este zdrobită planta degajă un miros aromatic, caracteristic, având un gust înțepător, răcoritor. Frunzele de mentă conțin o cantitate mare de uleiuri volatile, substanțe polifenolice și flavonoizi. Uleiul volatil din mentă este compus din mentol, mentonă, mentofuran, carvacrol, timol. Datorită conținutului său în uleiuri volatile este mult folosit nu doar ca medicament, ci și ca aromatizant în industria cosmetică și alimentară. Mentolul produce o ușoară anestezie a mucoasei gastrice, motiv pentru care preparatele din mentă au acțiune antiemetică. Menta stimulează secreția și eliminarea bilei datoritã prezenței compușilor flavonoizi. Menta mai are proprietãți antifermentative, dezinfectante – datorate în principal taninurilor – precum și proprietăți spasmolitice.

Busuiocul are diferite varietăți de arome datorită faptului că planta conține un număr variabil de uleiuri esentiale (numite și uleiuri volatile sau uleiuri eterice), care sunt combinate în diferite proporții pentru diferite soiuri. Aroma puternică de cuișoare a busuiocului dulce este dată de eugenol, care e aceeași substanță chimică prezentă și în cuișoare.

Frunzele de salvie conțin un ulei volatil reprezentat prin substanțe terpenice, tuionă, tuiol, salven, sabinol. Frunzele mai conțin taninuri, principii amare,vitamina B1,C, săruri de potasiu, glicozide, polifenoli și rășini.

4.4 Procedura de extracție a aminoacizilor

Pentru a extrage aminoacizii din cele 3 plante,menta,salvie si busuioc am utilizat 100 mg de plantă zdrobita a fost sonicată cu 0,6 ml apă / NaCI și 0,8 ml de metanol timp de 1 minut , apoi s-a amestecat cu 0,8 ml de cloroform și apoi au fost puse 3 minute la centrifugare ( 5800 rot / min ). Stratul inferior de extracție a fost colectat și repetat cu 0,4 ml de cloroform . Faza de cloroform inferior care conține acizii grași extrași a fost apoi uscat într-un curent de azot , la temperatura de 60°C .

Lipidele au fost convertite în esteri metilici de acizi grași iar prin esterificarea funcțiilor carboxilici cu 200 µL de metanol : clorură de acetil 4:1 ( v : v ) timp de 20 min la temperatura de 80 ° C . Derivații s-au evaporat la sec într-un curent de azot la temperatura de 60 ° C , și apoi s-a dizolvat în 500 µL diclormetan.10 µL de C11:1 s-au adăugat la fiecare probă pentru cuantificarea GC-MS .

Aparatul folosit in laborator a fost cel din Fig 3.4 care are domeniul spectral cuprins între 190-1100 nm,sursa este o lampa de deuteriu pentru UV și tungsten pentru VIS cu schimbarea automată la 326 nm iar viteza de scanare: 7,5, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 960, 1920 ȘI 2880 nm / min.Ca si detector foloseste o fotodiodă pentru probă si fasciculul de referință iar temperatura este cuprinsă între 15-350°C

Al doilea pas a fost folosind 100 mg de frunze zdrobite și s-au extras cu 1 ml de acid tricloracetic de concentratie 6 % într-o baie cu ultrasunete timp de 5 minute . Amestecul a fost centrifugat timp de 5 minute la 6000 rpm și supernatantul a fost colectat pentru purificare .0.5 Ml de supernatant și 50 µg [15N] glicină ( standard intern) a fost trecut printr-o rășină schimbătoare de Dowex 50W – W8 , coloana 4 x 40 mm ( activat ) . Soluția colectată a fost uscată într -un curent de azot la 60 ° C sau cu ajutorul unei centrifugări cu vid la temperatura de 60 ° C .Metoda de derivatizare a inclus o esterificare a funcției carboxilic utilizând 200µL butanol : clorură de acetil ( 4 : 1 v / v ) , timp de 1 oră la 110oC,urmată de o acetilare a funcției de amină,utilizând 100 µL anhidridă trifluoracetică,timp de 20 min la temperatura de 80 ° C .

4.5 Procedura de extracție pentru activitatea antioxidantă

S-au folosit 100 Mg de plante zdrobite care au fost ultrasonicate iar apoi s-au extras cu 1 ml etanol la 60 ° C timp de 15 minute . Amestecul s-a centrifugat la 13400rpm și supernatantul colectat s-a testat pentru activitatea antioxidantă . Pentru determinarea activității antioxidante a fost utilizat testul antioxidant DPPH .100 µL ( 10 mg / ml plantă ) din fiecare extract a fost folosit pentru a decolora o soluție de 40 µM DPPH .

4.6 DPPH

DPPH este o abreviere comună pentru un compus chimic organic 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl. Este o pulbere cristalină de culoare închisă, compusă din molecule de radicali liberi stabile. DPPH are două aplicații majore, atât în ​​cercetarea de laborator: unul este un monitor de reacții chimice care implică radicali, mai ales că este un test antioxidant comun, iar altul este un standard al poziției și intensitatea semnalelor de rezonanță a electronilor paramagnetici.

DPPH are mai multe forme cristaline care diferă prin punctul zabrele simetrie și de topire. Pulberea comerciaal este un amestec de faze care se topește la ~ 130 ° C. DPPH-I (cu punct de topire 106 ° C) este ortorombic,DPPH-II (punct de topire 137 ° C) este amorfă și DPPH-III (punct de topire 128-129 ° C) este triclinic.DPPH este un bine-cunoscut ("captator"), radical și o capcană pentru alți radicali.

Prin urmare, reducerea ratei unei reacții chimice la adăugarea DPPH este utilizat ca indicator al naturii acestei reacții. Din cauza unei benzi de absorbție puternic centrată la aproximativ 520 nm, radicalul DPPH are o culoare violet profund în soluție, și devine incoloră sau de culoare galben când se neutralizează.

Formula chimică-C18H12N5O6

4.7 Aminoacizi si acizi grași

Aminoacizii numiți și acizi aminați sunt substanțe organice (acizi organici) pe baza cărora, în urma reacțiilor metabolice, de obicei, se construiesc și se degradează proteinele superioare.  Fiind cărămizi de bază pentru construcția proteinelor specifice fiecărui organism, importanța și activitatea biologică a aminoacizilor este legată de metabolismul protidelor. Compușii organici care poartă denumirea de "aminoacizi" au în componența lor cel puțin o grupare aminică (aminată) – NH2 (NH3+  în formă ionică) și una carboxilică (de acid organic) -COOH (COO- sub formă ionică).

Din punctul de vedere al importanței exogene pentru om, există două mari grupe de aminoacizi; cei esențiali (indispensabili) și cei neesențiali (dispensabili). 

Aminoacizii esentiali sunt deosebit de importanti in perioada de crestere (in mod special la sugari). Cei 8 aminoacizi esentiali sunt: Izoleucina (Ile), Leucina (Le), Lizina (Lys), Metionina (Met), Fenilalanina (Phe), Treonina (Thr), Triptofanul (Trp) si Valina (Val). Acestora li se adauga 2 aminoacizi semiesentiali, dar care figureaza adesea alaturi de aminoacizii esentiali in terminologia oficiala: cisteina (Cis) si tirozina (Tyr).

 Acizii grași sunt substanțe organice, cu caracter slab acid, care intră în constituția
 majorității lipidelor. Împreună cu glicerolul, acizii grași formează cele mai răspândite grăsimi din natură; trigliceridele.În natură se cunosc peste 300 de astfel de compuși, care au fost identificați în microorganisme, plante, animale și om.

Substanțele reunite sub denumirea de acizi grași, sunt alcătuite numai din carbon (C), hidrogen (H) și oxigen (O), posedând, ca orice acid organic, gruparea carboxil. Numărul  atomilor de carbon este întotdeauna par. Cei mai mulți acizi grași sunt aciclici (au catena carbonică lineară) și neramificați (acizii grași ramificați apar în microorganisme). Pentru exemplificare, prezentăm mai jos structura chimică a acidului butiric și simbolul său.

4.8 Rezultate si discutii

Metoda a fost validată prin injectarea de soluții standard de aminoacizi respectiv acizi grași, care au urmat aceeași procedură de derivatizare. S-au obținut valori bune pentru liniaritatea, precizia, acuratețea și limita de detecție. A fost utilizat un spectrometru de masă cvadripolar Trace DSQ Thermo Finnigan cuplat cu un Trace GC. Cromatografia în fază gazoasă a fost realizată pe o coloană de fenil-metil 5% utilizat în programele de temperatură corespunzătoare.Coloană capilară RTX-5MS, 30 m 0,25 mm, 0,25 grosime µm comprimate: program de temperatură pentru separarea aminoacizilor: de la 70 ° C, 2 min, 5 ° C / min până la 110 ° C, 10 ° C / min până la 290 ° C, 16 ° C / min la 300 ° C. Programul de temperatură pentru FAME și substanțele volatile de separare a fost: 50 ° C timp de 2 min, în creștere cu o viteză de 8 ° C / min la 310 ° C (8 minute). Heliul a fost folosit ca și gaz purtător la un debit de 1 ml / min. 1 µL din fiecare probă a fost injectat în GC-MS, folosind modul de divizare (10: 1) și un autosampler TriPlus.

Extractele volatile de busuioc au dat majore estragolul cu compozitia (21.16%), linalol (26,13%), cariofilenul (10,13%) limonen (8,18%). În mentă, compușii majori au fost mentol (37,7%), izomentonă (15,97%), eucaliptol (5,44%) și mentofuran (4,8%). Salvia a dat compușii majori alfa-tuionă (25.08%), camfor (20,46%), eucaliptol (13,85%) și β-tuionă (13,37%).

Aminoacizii dominanți identificați în plantele studiate au fost acidul glutamic, acidul aspartic, în busuioc și mentă, în ultima, de asemenea, prolina este mare, iar în salvie acid glutamic și prolină; acidul gamaaminobutiric, valină, alanină și glicină sunt importante cantitativ. Cele mai ridicate cantități de aminoacizi liberi totali au fost observate la mentă și salvie (> 1 mg / g).

Acizii grași au un conținut esențial de omega 3 acid alfa-linolenic (ALA), busuioc> monetăria> salvie. Acizi grași liberi totali au fost mai mari in busuioc (72.8mg / g, mentă (13.3mg / g și salvie 32mg / g).

Toate extractele au prezentat o activitate antioxidantă. Cea mai mare activitate antioxidantă s-au dovedit a avea extractul de salvie, urmat de extract de menta si extract de busuioc, toate avand o activitate antioxidantă comparabilă cu antioxidanți standard.

4.9 Concluzii

GC – MS este o tehnică adecvată pentru caracterizarea compușilor din extracte plante . Compușii identificați în plantele studiate sunt caracteristice pentru mirosul sau aroma acestor plante . Cele mai ridicate aminoacizi liberi total au fost observate la mentă și salvie ( > 5mg / g ) . Prolina este ridicat in menta si salvie . Prezența acidului gras omega 3 este foarte important pentru sănătos ( salvie > busuioc > menta } . Toate cele trei extracte s-au dovedit a avea un nivel ridicat și activitatea antioxidantă comparabilă . Cea mai mare activitate DPPH scaveging a fost găsit în Sage extract ( 81.33 % ) , urmat de mentă Extract ( 74,85 % ) și extract de busuioc ( 63,21 % ) .