Caracterizarea Radicalilor

Caracterizarea radicalilor

Radicalii sau cum mai sunt numiți „radicali liberi” sunt o specie chimică care posedă un electron nepereche în învelișul extern al moleculei, motiv pentru care sunt foarte reactivi chimic.

Figura 1: Structura radicalului liber

Clasificarea radicalilor se poate face după diverse criterii, o clasificare care să includă marea majoritate a radicalilor ar fi următoarea :

· Radicali liberi ai oxigenului

· Radicali liberi ai azotului

· Compuși aromatici

· Compuși de tip chinonic și semichinonic

· Acizi nucleici

· Radicalul thiil

Generarea radicalilor liberi în sisteme biologice are loc ca urmare a acțiunii unor factori

interni și externi și pe care mecanismele naturale ale entității biologice nu le pot controla. Sursele interne de radicali liberi sunt:

– procesele metabolice din organism

– procesele ce însoțesc perturbările metabolice asociate diferitelor tipuri de patologii (stres metabolic).

Sursele externe de radicali liberi includ:

– radiațiile ionizante,

– radiațiile UV și microundele,

– metalele toxice (ex. Al și Cd din apa potabilă),

– smogul,

– aditivii alimentari chimici,

– fumul de țigară,

– poluanții atmosferici (în special compușii cu plumb).

Figura2:

Surse generatoare de radicali liberi

(http://www.thefoodadvicecentre.co.uk/reference/free-radicals/ )

Procesele generatoare de radicali liberi sunt următoarele:

1. Homoliza

Prin scindarea homolitică a unei legături covalente, o moleculă este fragmentată în două,

fiecare fragment păstrând unul dintre electronii pereche. Scindarea homolitică apare mai puțin

frecvent în sistemele biologice, deoarece necesită o cantitate mare de energie, sursa fiind fie

lumina ultravioletă, fie căldura sau radiațiile ionizante. Homoliza, poate fi termică, cuplată sau prin transfer electronic.

2. Fotoliza și radioliza

Radiațiile ionizante precum și absorbția luminii favorizează producerea unor mari cantități

de radicali liberi, în funcție de doza de radiații absorbite și de timpul de expunere. Radicalii liberi sunt formați cel mai adesea, prin fotoliza legăturilor chimice ca urmare a absorbției unui foton, și trecerii moleculei într-o stare excitată de singlet sau triplet.

Radiațiile ionizante produc radicali și după încetarea expunerii prin efect indirect, datorită

radiolizei apei din țesuturi. Radioliza apei depinde de natura și energia radiației precum și de

prezența oxigenului, deoarece în lipsa oxigenului, radiațiile X și γ nu descompun apa.

3. Reacțiile enzimatice

Enzimele numite și fermenți, sunt substanțe naturale produse doar de către celulele vii

îndeplinind rolul de biocatalizatori. Reacțiile enzimatice din organism dau naștere la radicali liberi intermediari ce reacționează între ei sau cu alte substanțe formând compuși stabili.

4. Metabolizarea

Metabolismul reprezintă totalitatea transformărilor biochimice și energetice ce au loc în

țesuturile organismelor vii. Compușii chimici „străini” aflați în organism, numiți xenobiotice

(medicamente, poluanți, pesticide ș.a.), sunt metabolizați, produșii secundari ai metabolizării fiind radicalii liberi.

5. Radicali liberi existenți în natură

Azotul și mai ales oxigenul existenți în atmosferă formează destul de ușor radicali liberi

specifici. Deși ozonul (O3) existent în natură, nu este un radical liber, este un agent oxidant foarte puternic. De asemenea, NO și NO2 existenți în natură, sunt radicali liberi stabili în concentrații relativ mici (0,2 ppm NO2 în smog). Flavin chinonele reprezintă o grupă din marea clasă a semichinonelor (SQ), care pot forma radicali liberi intermediari între formele oxidate și cele reduse ale chinonelor.

6. Generarea SRO în organismele vii

Radicalii cei mai relevanți apăruți în procesele de reglare biologică sunt superoxidul

(O2·) și oxidul nitric (NO·). Procesul de formare al anionului superoxid este fie mediat de enzime, cum ar fi NAD(P)H oxidaza și xantin oxidaza, sau fie nonenzimatic cu compuși redox reactivi, cum ar fi compusul semi-ubiquinonă al lanțului mitocondrial de transport de electroni.

Superoxid dismutazele (SODs) convertesc superoxidul enzimatic în peroxid de hidrogen .În

prezența metalelor de tranziție reducătoare (de exemplu, ioni de fier sau cupru), peroxidul de

hidrogen pot fi redus la o specie radicalică foarte reactivă, radicalul hidroxil.

Figura 3:

Căile de producere și înlăturare a SRO în organismele vii

Caracterizarea compușilor antioxidanți

1 Tipuri de antioxidanți

Pentru a preveni oxidarea și daunele provocate de concentrațiile în exces de radicali liberi

generați în sistemele biologice, există mai multe grupuri de agenți antioxidanți dintre care

amintim: antioxidanții enzimatici (enzimele), antioxidanții neenzimatici și compușii exogeni.

2 Stresul oxidativ

Radicalii liberi în general și speciile reactive ale oxigenului (SRO), azotului și clorului în

particular, se crede că au o contribuție majoră în dezvoltarea mai multor boli legate de vârstă, și în procesul de îmbătrânire în sine, prin provocarea "stresului oxidativ" și a "deteriorării oxidative".

Speciile reactive în organism

Speciile reactive sunt produse in organismele vii fie cu un scop bine definit, fie datorită unor evenimente accidentale. Scopul acestor molecule este de a produce răspunsuri rapide (uciderea organismelor invazive, favorizarea vasodilatației), dar pot fi de asemenea dăunatoare organismului. Cu alte cuvinte, aceste specii reactive in funcție de cantitatea generată, timpul de acțiune și condițiile schimbului celular reprezintă o sabie cu două tăișuri. Conform literaturii de specialitate, aceste enzime sunt capabile să își adapteze comportamentul astfel încat "homeostazia redox" să nu aibă de suferit. Atunci cand apar deficințe ale enzimelor aparării sistemului antioxidant acesta nu mai este capabil să se adapteze generând repercusiuni asupra homeostaziei redox și drept urmare trebuie avută în vedere utilizarea de medicamente care să restabileasca acest echilibru.

Generarea speciilor reactive

-Radicalii (sau radicalii liberi) sunt specii foarte reactive care posedă un singur electron nepereche în orbitalii exteriori și care sunt capabili să existe independent.Aceștia au capacitatea de a extrage electroni de la orice moleculă vecină cu scopul de a-și completa proprii orbitali.Moleculele mici și rapide sunt foarte eficiente in activitatea oxidativă, oxigenul si azotul fiind potrivite pentru generarea de specii reactive.

-Pe lângă oxigen si azot mai sunt și metalele de tranziție care, de asemenea, posedă un singur electron nepereche in orbitalii exteriori. Dar ei nu se comportă precum radicalii liberi (deoarece în majoritatea cazurilor sunt legați de proteine), însă sunt capabili să transfere electroni și prin urmare să producă radicali liberi.

-Există două grupuri principale de radicali liberi: ROS sau specii reactive de oxigen și RNS sau specii reactive de azot. Ambele specii pot acționa concomitent cauzând deteriorarea celulelor și stress nitrozativ. Prin urmare, aceste două specii sunt adesea denumite colectiv ca ROS / RNS.

Generarea superoxidului

Punctul de plecare în speciile reactive de oxigen este generarea de radicali superoxid din oxigen. Astfel, molecula de oxigen are doi electroni deteriorați avand același spin in orbitalul exterior, iar atunci cand primește un electron de la orice strubstat oxigenul devine un radical foarte reactiv numit ”superoxid”.

Figura 4: Structura chimică a oxigenului și a radicalului superoxid

Superoxidul poate genera, la rândul său, alte specii puternice care pot fi fie radicali, fie non-radicali.

Schema generării speciilor reactive:

Figura 5: Specii reactive rezultate din radicalul superoxid

Aproape toate tipurile de celule și organite intracelulare pot genera anioni superoxid prin două moduri diferite: primul ar fi prin folosirea de complexelor enzimatice din interiorul oricărei celule, iar cel de al doilea prin acțiuni periculoase ce implică utilizarea radiațiilor, xenobioticelor.

Reacția dintre un superoxid si un non-radical nu se poate realiza (spin interzis). Astfel, în sistemele biologice superoxidul reacționează cu el însuși (dismutaza) sau cu un alt radical, cum ar fi oxidul nitric (NO) sau cu metalele de tranziție.

Majoritatea surselor de superoxid sunt radicali:

1. lanțul de transport mitocondrial al electronilor (ETC)

2.xantin citoliza și xantin oxidaza (XO)

3.sintazele oxidului nitric (NOS)

4.oxidazele complexului NADPH asociate membranei (NOx)

5.hemoglobina în eritrocite

6.homocisteina

1. În mitocondrii anionii superoxidului rezultă ca un produs secundar generat de complexele I și III. Superoxidul este produs in mitocondrii în timpul fosforilării oxidative prin transferul unui electron de la ETC la oxigenul molecular.

Se pare că doar 3% din oxigenul total este consumat în lanțul de transport al electronilor pentru a genera radicali superoxid.

Cercetările recente propun o metodă prin care un senzor redox este capabil să captureze superoxidul mitocondrial generat in complexul I. Această metodă oferă noi perspective in ceea ce privește relația producției de energie mitocondrială, generarea ROS și semnalizare.

2. Xantin oxidaza (XO) este o enzimă omniprezentă implicată în numeroase procese fiziologice, dar și fiziopatologice. Aceasta are un rol decisiv în catabolismul purinelor producând acid uric și peroxid de hidrogen, astfel fiind posibilă contribuirea la generarea de alte posibile specii reactive. Tot în cadrul acestui proces xantin oxidaza poate genera, de asemenea, și O2. Capacitatea xantin oxidazei de a produce O2 a fost cercetată în cadrul suferinței ischemie-reperfuzie si a insuficienței cardiace. Tot în condiții de hipoxie, XO mai poate genera un radical NO•. J. O. Lunderg a propus mecanismul producerii de NO• de către xantin oxidază în ischemie.

Figura 6: XO este capabilă să genereze NO2 sau radical superoxid în funcție de condițiile celulare

3. Sintazele oxidului nitric reprezintă o familie de enzime ce catalizează sinteza oxidului nitric (NO•) din L-arginină. În organismul uman se cunosc trei enzime izoforme: nNOS (NOS neuronal sau NOS1), iNOS (NOS inductibilă sau NOS2) și eNOS (NOS endotelial sau NOS3). Propritățile acestor izoforme sunt: NOS1 este implicată în comunicarea celulară, NOS3 în vasodilatație ambele fiind enzime constitutive, pe când NOS2 este o enzimă inductibilă cu rol în răspunsul imun.

Tabel 1: Acțiunile sintazelor oxidului nitric

În urma unor studii recente s-a constatat că NOS endotelial (eNOS) în ″stare necuplată″ poate genera O2 în funcție de disponibilitatea substraturilor sale din interiorul celulei.

Reglarea NOS endotelial se face printr-o combinație de mecanisme care permit acesteia să își adapteze activitatea în condiții fiziopatologice. eNOS include două domenii enzimatice conectate prin calmodulin-binding: o reductză conținând flavină și o oxigenază conținând hem (domeniul Fe3+). Legătura Ca2+ / complexul camodulinului permite electronilor derivați NADPH de reductază să se transfere oxigenazei. Compartimentul oxigenazei al eNOS are în componența sa un ion de fier (Fe3+) care se leagă de oxigen în scopul realizării reducției Fe2+, acest complex fiind responsabil de conversia L-argininei în NO • și L-citrulină.

Succesiunea acestor evenimente respectă regulile doar atunci când cofactorul tetrahidrobiopterina (BH4) ″prevede/asigură legătura″ dintre cele două domenii. Deficitul de arginină sau BH4 cauzează decuplarea reductazei de oxigenază. În domeniul oxigenazei complexul intermediar Fe2+ – O2 disociază pentru a forma superoxid și grupul original Fe3+ al eNOS. În această situație particulară eNOS funcționeaza in mod ″cuplat″, de unde și numele eNOS în ″stare necuplată″. Astfel, eNOS eliberează O2 în loc de NO.

Figura 7 : Produșii de generare ai eNOS în funcție de substratul celular.

4.NADPH oxidaza este un complex enzimatic asociat membranei ce este alcătuit din șase subunități dintre care una are activitate GTP-ază, iar celelalte cinci activitate oxidază. Una din subunitățile oxidazei este gp91-PHox (recent redenumită NOX2). Subunitățile complexului enzimatic se găsesc în membrana plasmatică, precum și în membranele fagozomilor, unde sunt folosite de neutrofile pentru înlăturarea microorganismelor.

Cercetările ultimului deceniu au demonstrat că principala sursă de ROS din peretele vascular este NAD(P)H oxidază nonfagocitică care utilizează NADH/NADPH ca donator de electroni pentru reducerea oxigenului molecular și pentru a produce O2. Pentru activarea acestei enzime este necesară asamblarea celor două subunități: citosolică și membranară pentru a da naștere unui complex enzimatic funcțional. În vascularizație complexul NAD(P)H oxidază este măcar parțial preasamblat deoarece o proporție importanta de subunități NAD(P)H oxidaza sunt colocalizate intracelular îm celulele endoteliale.

Reacția catalizată de NADP oxidază fagocitică/nonăfagocitică este:

NADPH + 2O2 → NADP + 2O2

5. Oxigenul molecular este transportat de la plămân la țesuturi, aflându-se pentru o scurtă perioadă de timp liber, nelegat. În acest stadiu este ar putea fi predispus să genereze specii reactive. Oxigenul se leagă de hemoglobină la fierul fieros. Statusul feros (Fe2+) este o condiție esențială pentru funcționarea normală a hemoglobinei. Totuși un mic procent de Fe2+ este transformat treptat de O2 în forma feroasă (Fe3+) in methemoglobina rezultată. În sistemul enzimatic, methemoglobina reductază reconversează rapid Fe3+ în Fe2+, reducând methemoglobina înapoi la hemoglobină. Se consideră că oxigenului legat de fierul din hem nu schimbă statusul oxidării metalului. Cu toate acestea hemul oxigenat are câteva caracteristici ale electronilor anionului peroxid Fe3+ – O2.

Este demonstrat de Misra și Fridovich faptul că complexul Fe3 + O2 este capabil să genereze radicali superoxid în timpul transportului oxigenului la țesuturi prin autooxidarea hemoglobinei. În consecință, autooxidarea hemoglobinei este responsabilă de producerea superoxizilor în eritrocite.

Această constatare este confirmată și de alți cercetatori care demonstrează că hemoglobina poate suferi reacții oxidative în timpul procesului de eliberare a oxigenului. Balagopalakrishna și colaboratorii au remarcat că la o presiune intermediară a oxigenului, în cazul în care hemoglobina eliberează parțial oxigen molecular, producția de radical superoxid crește. Ei au arătat că radicalul superoxid este eliberat în pliul hidrofob al hemului. Procesul este unul lent, astfel încât formarea superoxidului a fost urmărită pentru mai mult de 15 minute și detectată prin rezonanță electrică paramgnetică cu temperatură joasă.

6. S-a demonstrat că homocisteina generează radicali superoxid producând vasoconstricție. Lang și colaboratorii au argumentat că efectul inhibitor al homocisteinei in ceea ce privește relaxarea endoteliu-dependentă se datorează unei creșteri intracelulare a nivelurilor de O2 în celula endotelială și poate să furnizeze un posibil mecanism pentru disfuncția endotelială asociată cu hiperhomocisteinemie.

Anionul superoxid a fost pus intr-o lumină nouă de către Pacer, arătând cum acesta acționează ca un agent blând de reducere în condiții fiziologice, luând în considerare faptul că acest potențial de reducere este de aproximativ −0.1 V la un nivel fiziologic al oxigenului.

Reactivitatea chimică limitată a superoxidului este susținută de faptul că în mediul biologic reacția sa cu non-radicali este spin interzisă. Drept urmare, un oxidant mai puternic produs de superoxid a fost propus să fie formarea radicalului hidroxil non-enzimatic. Concentrația hidroxilului generat nu poate avea o semnificație importantă din cauza a trei incertitudini:

– radicalul superoxid care este principalul precursor al hidroxilului (prin peroxidul de hidrogen) este rapid îndepărtat în celula normală de superoxid dismutaza,

– prin generarea de hidroxil reacția Haber-Wiesse (reacția fierului cu peroxid de hidrogen) tinde să aibă constantele de viteză destul de lente,

– radicalul hidroxil este foarte reactiv, aproape că va reacționa cu aproape fiecare moleculă biologică pe o distanță de difuziune foarte scurtă.

Drept urmare, relevanța biologică a hidroxilului este limitată și controversată în ceea ce priveste toxicitatea celulară.

Generarea NO

Oxidul nitric necesită o atenție deosebită deoarece este strâns legat de celelalte specii reactive, precum și de activitatea unor enzime esențiale pentru acești radicali.

Componentele azotului se găsesc în organism fie din surse exogene ca nitriții/nitrații, fie din producția endogenă de oxid nitric.

Grupul derivaților de azot cuprinde:

Tabel 2 : Caracteristicile generale ale derivaților de azot

Derivații de azot se transformă dintr-unul îm altul și invers în condiții de deplasare în interiorul celulelor, astfel:

Figura 8: Transformarea derivaților de azot

Oxidul nitric este un gaz incolor, cu solubilitate scăzută în apă și cu următoarea structură:

Figura 9: Structura oxidului nitric

Fiind hidrofob are o rata mare de difuziune în sistemele biologice, fapt ce permite moleculelor să își atingă scopul în fața degradării.

NO este mesager în mai mult procese fiziologice:

-relaxarea endoteliala a musculaturii netede

-inhibarea agregării plachetare

-neurotransmisie

-citotoxicitate.

NO poate fi produs în condiții fiziologice de sintazele oxidului nitric, iar în situațiile de suferință celulară, cum ar fi hipoxia, de către xantin oxidaza.(fig)

Reacțiile oxidului nitric in vivo sunt diferite față de cele in vitro. In vitro principalul produs de degradare este al oxidului nitric este NO2 (nitrit), pe când in vivo acesta poate interacționa cu alți radicali sau compuși.

Principalele reacții relevante fiziologic pentru oxid nitric sunt cu:

– superoxid O2 din care rezultă ONOO− (peroxinitrat)

– el însuși producându-se N2O3 (trioxid de azot)

– hidroxil rezultând nitriți NO2 (de la acidul azotos HNO2)

– cu hemoglobina din care rezultă methemoglobină și NO3 (nitrat).

Figura 10: Reacțiile chimice in vivo ale oxidului nitric

NO• reacționează într-un mod foarte rapid cu superoxid, reacție din care rezultă un puternic agent de nitrare toxic peroxinitrit (ONOO−). Acesta reacționează la rândul său cu aminoacizii din proteine producându-se nitrosothiols și nitrozamine considerate a fi marker al unui stress oxidativ intens ce poartă denumirea de ″stress nitrozativ″. Proteinele nitrozilate au fost găsite în numeroase procese patologice, dar și în procese de semnalizare.

Date noi arată comportamentul adaptativ în generarea de superoxid pentru mitocondrii și enzimele eNOS și XO.

Principalul loc de producere a speciilor reactive de oxigen sunt complexele I și III din timpul transportului de electroni în mitocondrii, în condiții de bună oxigenare, cum ar fi electronii ce migrează din lanțul transportului electronilor la oxigenul molecular în timpul fosforilării oxidative. Dar studii actuale relevă faptul că celulele endoteliale produc ROS în condiții de hipoxie. Creșterea paradoxală a producției de ROS în condiții de proastă oxigenare nu este pe deplin înțeleasă, dar se consideră că speciile reactive de oxigen rezultate în condiții de hipoxie acționează ca agenți de semnalizare care declanșează eritropoietina, factorul endotelial de creștere vasculară și enzimele glicolitice. În mod sistemic, aceste răspunsuri vor intensifica distribuția oxigenului la celule și facilitează producția de ATP glicolitic în loc de cel mitocondrial. Inducerea acestor gene este mediată de factorul inductibil al hipoxiei 1 (HIF-1). Concluzionăm faptul că atunci când mitocondria ″simte″ hipoxia eliberează ROS ca molecule semnal care activează diverse răspunsuri funcționale printre care și activarea expresiei genice responsabile de supraviețuirea celulară. Wei and Dirksen relatează următoarele: o producție scăzută spre moderată a nivelurilor de ROS/RNS și o frecvență a producției dictată de un context celular particular și de statusul metabolic sunt critice reglementarea corespunzătoare a mai multor procese celulare esențiale, printre care expresia genelor și transmiterea semnalului.

Cercetătorul Stroes și colaboratorii săi demonstrează o activitate interesantă doar pentru eNOS cea de a produce simultan oxid nitric și superoxid, chiar în prezența BH4 și L-arginină în condiții fiziologice și nu în ″stare decuplată″. Această activitate neobișnuită se datorează producției de peroxinitrit de către eNOS o moleculă foarte reactivă. Anionul peroxinitrit (ONOO−) este o specie reactivă tot mai des recunoscută pentru contribuția în ceea ce privește leziunile tisulare oxidative. Descoperirile recente despre peroxinitrit au demonstrat că acesta este capabil să traverseze membrana eritrocitară, dar și membrana altor celule prin două mecanisme: în forma anionică prin canalul de schimb anionic, iar în forma protonică prin difuzie pasivă și astfel este influențat răspunsul celular adaptativ.

Aceste constatări sunt în contradicție cu datele prezentate anterior care susțin că generarea de O2 este posibilă doar în starea ″necuplată″ a eNOS.

Balanța dintre cererea substratului (arginină, tetrahidrobiopterina (BH4), nitriți/nitrați) și oxigenarea tisulară poate stabili dacă efectele nete ale activității combinate ale enzimelor menționate sunt benefice sau dăunătoare într-o situație particulară. Astfel, speciile dominante ar putea fi NO, radicalii oxigenului sau produșii lor de reacție.

Superoxid dismutaza

Superoxid dismutaza (SOD) sunt un grup de enzime ce utilizează pe post de cofactor cupru și zinc sau ioni de fier, magnan sau nichel. Sunt trei familii majore de superoxid dismutază în funcție de cofactorul metalic: Cu / Zn (care leagă atât cuprul cât și zincul), Fe și Mn (care se leagă de fier de sau mangan) și ultima care se găsește doar la procariote care leagă nichelul.

Caracteristicile generale are superoxid dismutazelor:

Istoria superoxid dismutazei

În 1969, McCord si Fridovich au publicat un articol în care relatează pentru prima dată faptul că o proteină izolată din eritrocite functionează ca enzimă de tip superoxid dismutaza. De atunci și până în zilele noastre s-au publicat numeroase lucrări despre formarea O2¯ în diferite reactii chimice sau de efectul inhibitorilor produs prin simpla adăugare a SOD in mediul de reacție.

Mult timp s-a știut despre SOD ca ar fi o cuproproteină (în functie de localizarea tisulară, eritrocitară, hepatică și cerebrală), crezându-se că servește la depozitarea cuprului.SOD a reușit performanța în ultimii ani să fie recunoscută drept cea mai importantă enzimă a vieții aerobe, depașind în acest sens citocrom oxidaza, enzima finală în respirația tisulară.