Caracterizarea fizico-chimică şi evaluarea potenţialului terapeutic al amestecurilor fitochimice şi al altor fracţii extrase din diferite plante… [307874]
Investește în oameni!
FONDUL SOCIAL EUROPEAN
Programul Operațional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013
Axa prioritară 1 – „Educația și formarea profesională în sprijinul creșterii economice și dezvoltării societății bazate pe cunoaștere”
Domeniul major de intervenție 1.5 – „Programe doctorale și postdoctorale în sprijinul cercetării”
Numărul de identificare al contractului: POSDRU/159/1.5/S/133391
Titlul proiectului: „[anonimizat], Mediului și Pământului”
[anonimizat]: [anonimizat]-CRISTINA MARINAȘ
COORDONATOR ȘTIINȚIFIC: Prof. Dr. VERONICA LAZĂR
2015
CUPRINS
Listă de abrevieri……………………………………………………………………………………………………… 4
Introducere……………………………………………………………………………………………………………… 6
Cap. I Caracterul invaziv al unor specii de plante alohtone din România…………………… 9
I.1. Impactul plantelor invazive la nivel național și internațional…………………… 12
I.2. Fitoterapia și plantele invazive din România…………………………………………… 18
I.2.1. Plante alohtone cu grad de invazivitate masivă………………………………. 19
I.2.2. Plante alohtone cu grad de invazivitate moderată…………………………… 27
I.2.3. Plante alohtone cu grad minim de invazivitate……………………………….. 34
I.2.4. Caracterul fitotoxic al plantelor invazive……………………………………….. 34
Cap. II Biosinteza și principalele proprietăți biologice ale terpenelor și compușilor polifenolici specifici plantelor invazive…………………………………………………………………….. 39
II.1. Biosinteza și activitătile biologice ale terpenelor și terpenoidelor……………. 41
II.1.1. Uleiuri volatile…………………………………………………………………………. 43
II.1.1.1. Monoterpene și monoterpenoide……………………………………. 43
II.1.1.2. Sesquiterpene și sesquiterpenoide………………………………….. 45
II.1.1.3. Principalele proprietăți biologice…………………………………… 46
II.1.2. Caroteni și carotenoide………………………………………………………………. 51
II.2. Biosinteza și activitățile biologice ale agliconilor heterozidelor fenolice…… 54
II.2.1. Acțiunea antimicrobiană a compușilor fenolici…………………………….. 56
II.2.2. Activitatea antioxidantă a compușilor fenolici………………………………. 58
II.2.3. Efectul imunomodulator al compușilor polifenolici………………………… 62
II.3. Biosinteza și activitățile biologice ale agliconilor heterozidelor betalainice.. 66
Cap. III Contribuții originale privind studiul proprietăților terapeutice ale unor plante invazive considerate medicinale în țările native……………………………………………………….. 70
Scopul și obiectivele studiului………………………………………………………………………………….. 70
III.1. Materiale și metode……………………………………………………………………………………….. 71
III.1.1. Extracția amestecurilor fitochimice obținute din organele vegetative și de reproducere ale unor speciilor invazive…………………………………………………………………… 71
III.1.1.1. Materiale vegetale……………………………………………………………………………. 71
III.1.1.2. Extracția principiilor active din speciile de plante invazive…………………… 71
III.1.1.2.1 Extracte alcoolice obținute prin ultrasonicare…………………………. 71
III.1.1.2.2. Izolarea uleiurilor volatile……………………………………………………. 72
III.1.2. Caracterizarea fizico-chimică a amestecurilor fitochimice……………………………. 73
III.1.2.1. Determinarea conținutului total de polifenoli………………………………………. 73
III.1.2.2. Determinarea conținutului total de flavonoide…………………………………….. 73
III.1.2.3. Determinarea conținutului total de betalaine……………………………………….. 74
III.1.2.4. Determinarea compoziției chimice a extractele alcoolice prin HPLC……… 74
III.1.2.5. Determinarea compoziției chimice a uleiurilor volatile prin GC-MS……… 75
III.1.2.6. Dozarea carotenoidelor…………………………………………………………………….. 76
III.1.3. Caracterizarea capacității fitotoxice a plantelor invazive studiate…………………. 76
III.1.3.1. Determinarea macroscopică a efectului alelopatic……………………………….. 77
III.1.3.2. Corelarea statistică a efectului fitotoxic……………………………………………… 77
III.1.3.3. Determinarea microscopică a efectului fitotoxic………………………………….. 78
III.1.4. Evaluarea activității antimicrobiene a amestecurilor fitochimice………………….. 79
III.1.4.1. Tulpini microbiene………………………………………………………………………….. 79
III.1.4.2. Screening-ul calitativ al activității antimicrobiene………………………………. 80
III.1.4.3. Determinarea acțiunii sinergice dntre antibiotice și extractele alcoolice asupra sensibilității/rezistenței tulpinilor bacteriene…………………………………………… 80
III.1.4.4. Evaluarea cantitativă a efectului antimicrobian……………………………………. 82
III.1.4.4.1. Determinarea concentrației minime inhibitorii……………………….. 82
III.1.4.4.2. Determinarea posibilului mecanism de acțiune al uleiului volatil de A. fruticosa asupra levurilor…………………………………………………………………. 82
III.1.4.4.2.1. Tehnica dinamicii efectului microbicid……………………….. 82
III.1.4.4.2.2. Determinarea viabilității celulelor levurice prin marcarea cu iodura de propidiu……………………………………………………………………… 83
III.1.4.4.2.3. Determinarea influenței uleiului volatil asupra activității pompelor de eflux……………………………………………………………………… 83
III.1.4.4.2.4. Cuantificarea modificărilor expresiilor genice ale genelor cdr1, cdr2 și mdr1 prin RT-PCR…………………………………………………………… 83
III.1.5. Studiul influenței extractelor vegetale asupra expresiei unor factori de virulență microbieni……………………………………………………………………………………………………………… 85
III.1.5.1. Evidențierea producerii factorilor de virulență solubili…………………………. 85
III.1.5.2. Evidențierea capacității de aderență microbiană la substrat inert – Testul poducerii de slime………………………………………………………………………………………….. 87
III.1.5.3. Influența amestecurilor fitochimice asupra biofilmelor mature preformate, dezvoltate pe substrat inert……………………………………………………………. 87
III.1.5.4. Influența extractelor vegetale asupra aderenței tulpinilor bacteriene la substrat celular………………………………………………………………………………………………. 91
III.1.6. Activitatea antioxidantă și imunomodulatoare a fitoamestecurilor studiate…… 92
III.1.6.1. Prelucrarea amestecurilor fitochimice obtinute din diferite plante invazive……………………………………………………………………………………………………….. 92
III.1.6.2. Evaluarea citotoxicității amestecurilor fitochimice………………………………. 92
III.1.6.2.1. Metoda Tripan blue……………………………………………………………. 92
III.1.6.2.2. Metoda MTT……………………………………………………………………… 92
III.1.6.3. Determinarea acțiunii uleiurilor volatile asupra ciclului celular prin citometrie în flux…………………………………………………………………………………………… 93
III.1.6.4. Obținerea și determinarea activității tirozinazei…………………………………… 93
III.1.6.5. Determinarea activității antioxidante a extractelor polifenolice prin metoda TEAC………………………………………………………………………………………………………….. 93
III.1.6.6. Determinarea activitatii antioxidante a uleiurilor volatile prin metoda DPPH…………………………………………………………………………………………………………… 94
III.1.6.7. Evaluarea stresului oxidativ prin microscopie de fluorescență………………. 95
III.1.6.8. Analiza profilului citokinic al celulelor THP-1 prin tehnica ELISA……….. 95
III.2. Rezultate și discuții………………………………………………………………………………………… 97
III.2.1. Caracterizarea fizico-chimică a amestecurilor fitochimice……………………………. 98
III.2.1.1. Conținutul total de polifenoli și flavonoide din extractele vegetale corelate cu rezultatele obținute prin HPLC……………………………………………………………………. 98
III.2.1.2. Conținutul total în betalaine……………………………………………………………. 102
III.2.1.3. Caracterizarea compoziției chimice a uleiurilor volatile prin GC-MS…… 103
III.2.1.4. Conținutul total de carotenoide………………………………………………………… 108
III.2.2. Caracterizarea capacității fitotoxice a amestecurilor fitochimice studiate……. 109
III.2.2.1. Caracterul fitotoxic evidențiat macroscopic………………………………………. 109
III.2.2.2. Caracterul fitotoxic evidențiat microscopic……………………………………….. 120
III.2.3. Activitatea antimicrobiană a amestecurilor fitochimice………………………………. 128
III.2.3.1. Carcaterizarea activității antimicrobiene a amestecurilor fitochimice și a principalilor compuși identificați…………………………………………………………………… 128
III.2.3.2. Influența extractelor alcoolice asupra sensibilității tulpinilor bacteriene la antibiotice…………………………………………………………………………………………………… 134
III.2.3.3. Determinarea posibilului mecanism de acțiune antifungică a uleiului volatil de A. fruticosa prin citometrie în flux…………………………………………………………….. 142
III.2.4. Influența extractelor vegetale asupra expresiei unor gene de virulență ale microorganismelor și al efectului antipatogenic……………………………………………………… 146
III.2.4.1. Influența amestecurilor fitochimice asupra exprimării factorilor de virulență solubili……………………………………………………………………………………………………….. 146
III.2.4.2. Influența amestecurilor fitochimice asupra aderenței microbiene la substrat inert……………………………………………………………………………………………………………. 152
III.2.4.3. Influența amestecurilor fitochimice asupra dezvoltării biofilmelor preformate………………………………………………………………………………………………….. 156
III.2.4.4. Influența amestecurilor fitochimice asupra aderenței bacteriene la substrat celular………………………………………………………………………………………………………… 166
III.2.5. Studiul efectelor imunomodulator și antioxidant pentru amestecurile fitochimice studiate………………………………………………………………………………………………………………… 172
III.2.5.1. Citotoxicitatea și influența amestecurilor fitochimice asupra ciclului celular………………………………………………………………………………………………………… 172
III.2.5.2. Capacitatea de neutralizare a radicalilor liberi…………………………………… 175
III.2.5.3. Demonstrarea experimentală a efectului imunostimulator și anti-inflamator pe modele in vitro………………………………………………………………………………………… 183
III.3. Concluzii generale………………………………………………………………………………………… 189
Lista de lucrări publicate pe parcursul elaborării tezei………………………………………….. 194
Bibliografie………………………………………………………………………………………………………….. 196
Anexe…………………………………………………………………………………………………………………… 213
Listă de abrevieri
12-HETE = acid 12-hidroxieicosatetraenoic
4CL = coumarat coenzimă A ligază
5-HETE = acid 5-hidroxieicosatetraenoic
AA = acid arahidonic
Abc = Acinetobacter baumannii
ABTS = 2,2-azinobis-(3-etil-benzotiazolinic-6-sulfonic)
ACT = genă care codifică pentru actină
ADS = amorfadienă sintază
AHL = homoserin lactonă acetilată
AM = amoxicilina
AMO = amorfadienă oxidază
AP-1 = proteină activatoare 1
ATP = adenozin trifosfat
AZM = aztreonam
BC = conținut în betalaine
Bs = Bacillus subtilis
C = cloramfenicol
C3’H = chinat-3’hidroxilază
C4H = cinamat 4-hidroxilază
Ca = Candida albicans
cAMP = adenozin monofosfat ciclic
CDR = Candida Drug Resistance
CEC = cefaclor
Cf = Candida famata
CG = galat-(-)-catechina
cGMP = guanozin monofosfat ciclic
CHI = calcon izomerază
CHS = calconsintază
CIP = ciprofloxacin
CL = colistin
CLSI = Clinical and Laboratory Standards Institute
CMH = complex major de histocompatibilitate
CMI = concentrație minimă inhibitorie
CN = cefalexin
COX = ciclooxigenază
CPR = citocrom P450 reductază
CRO = ceftriaxone
CTX = cefotaxim
Cu = Candida utilis
DAISIE = Delivering alien invasive species inventories for Europe
DFR = dihidroflavanon reductază
DMAPP = dimetilalil-pirofosfat
DMSO = dimetil-sulfoxid
DPPH = 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
E = eritromicina
Ec = E. coli
ECG = galat-(-)-epicatechina
EGC = (-)-epigalocatechina
EGCG = galat-(-)-epigalocatechina
ELISA = enzyme linked immuno-sorbent assay
eNOS = oxid nitric sintetază
EPPO = European and mediterranean plant protection organization
ERNAIS = European research network on aquatic invasive species
F/M = nitrofurantoin
F3’5’H = flavonoid 3’,5’-hidroxilază
F3’H = flavonoid 3’-hidroxilază
F3’H = flavonon-3’-hidroxilază
F3H = flavonon-3-hidroxilază
Fec = Enterococcus fecalis
FFL = fosfomicin
FITC = fluoresceină
FLC = fluconazol
FPP = farnesil-pirofosfat
GAE = gallic acid equivalent
GC = (-)-galocatechina
GC-MS = cromatografie de gaze cuplata cu spectrometrie de masă
GGPP = geranil-geranil pirofosfat
GGPPS = geranil-geranil pirofosfat sintază
GPP = geranil-pirofosfat
HEp 2 = Human Epithelioma, linie celulara standardizata
HpETEs = acizi hidroperoxieicosatetraenoici
ICAM = intercellular adhesion molecule (molecule de adeziune intercelulară)
IFN-γ = interferon-γ
II = indice de inhibiție
IIDBP = indice de inhibiție al dezvoltării biofilmului pre-format
IKK = kinaza proteinei IkB
IL = interleukina
IPM = imipenem
IPP = izopentenil-pirofosfat
IRF-1 = interferon regulatory factor 1
ITC = itraconazol
IκBα = inhibitorul α al factorului de transcriere NF-kB
K = kanamicină
KPN = Klebsiella pneumoniae
KTC = ketoconazol
LAR = leucocianidin reductază
LC-MS = cromatografie de lichide cuplata cu spectrometrie de masă
LOX = lipooxigenaza
LPS = lipopolizaharide
MATH = microbial adhesion to hydrocarbon
MCP-1 = macrophage chemotactic protein-1
MDR = Multi Drug Resistance
MEM = meropenem
MEP = 2-C-metil-d-eritritol-4-fosfat
MIP-1α = macrophage inflammatory protein
MRSA = S. aureus meticilino-rezistent
MTT = bromida de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu
MVA = mevalonatului
NA = acid nalidixic
NADPH = nicotin-adenin-dinucleotidul fosfat redus
NDPS1 = neril difosfat sintază 1
NF-kB = factorul nuclear de transcriere
NOBANIS = North European and Baltic network on invasive aien species
NOR = norfloxacin
NPP = neril difosfat
OFX = ofloxacin
OMS = Organizația Mondială a Sănătății
OX = oxacilina
P = penicilina
PAL= fenilalanin-amoniu ligază
PB = polimixin B
PBP = penicillin binding protein
PBS = tampon fosfat salin
PGE2 = prostaglandinei E2
PGs = prostaglandine
PHA = fitohemaglutinină
PHS1 = felandren sintază 1
PLA2 = fosfolipază A2
PMA = forbol-12-miristat-13-acetat
PPO = polifenol oxidază
PRL = piperacilina
PS = fitoen desaturază
Ps = Pseudomonas aeruginosa
QE = quercetin equivalent
QS = quorum sensing
RD = rifampin
RI = Indici Kovats
RMN = rezonanță magnetică nucleară
ROS = specii de oxigen reactive
RP-HPLC = cromatografie de lichide de înaltă performanță – de faza inversă
RT = timpul de retentie
RT-PCR = real-time polymerase chain reaction
Sa = Staphylococcus aureus
STAT = signal transducers and activators of a transcription
SXT = trimetroprim-sulfametoxazol
TEAC = trolox equivalent antioxidant activity
TEC = teicoplanin
TEG = trietilen glicol
TGF = transforming growth factor
TIM = ticarcilina – acid clavulanic
TNF-α = factor de necroza tumorală α
TP = polifenoli totali
TS = taxadien sintază
TSB = tryptic soy broth
TXA2 = tromboxan A2
TZP = piperacilina-tazobactam
UFC/ml = unități formatoare de colonii / mililitru
UGT = glucuronozil transferază
VA = vancomicina
VCAM = vascular cell adhesion molecules (molecula de adeziune celulară vasculară)
Introducere
Plantele au fost utilizate pentru tratarea sau vindecarea diferitelor afecțiuni încă din cele mai vechi timpuri. Studiul efectelor benefice ale plantelor medicinale asupra sănătății omului cu metodele specifice cercetării contemporane este absolut necesar pentru stabilirea fundamentelor științifice ale observațiilor empirice precedente. Odată cu progresul științei, o parte din cunoștințele asupra remediilor populare au suferit schimbări semnificative, descoperindu-li-se noi proprietăți și odată cu acestea și noi utilizari, compușii naturali cu acțiune terapeutică devenind materie primă sau modele structurale pentru industria farmaceutică modern (Temelie, 2005).
Conform Organizației Mondiale a Sănătății (OMS), remediile din plante sunt folosite de 65-80% din populația lumii pentru îngrijirea medicală primară; în același timp, aproape jumătate din medicamentele folosite în prezent sunt de semisinteză, având ca materii prime fitocomponente specifice, iar un sfert din ele conțin extracte din plante sau compuși chimici activi, obținuți direct din plante (Chopra și colab., 1997).
Având în vedere utilizarea la scară largă a plantelor în medicina complementară și alternativă din ultimii ani (Rios, 2005), în întreaga lume sunt cercetați noi compuși izolați din plante sau extracte totale, care ar putea sta la baza unor noi medicamente (Cowan, 1999).
Pe lângă speciile autohtone ce compun diferite asociații fitocenologice specifice diferitelor ecosisteme, specialiștii în taxonomie vegetală au identificat și specii alohtone sau adventive.
Conform Sîrbu (2011), plantele adventive sunt acei taxoni vegetali a căror prezență într-un anumit areal se datorează introducerii lor accidentale sau intenționate, în special ca rezultat al activității umane. La rândul lor, plantele adventive se clasifică în:
Plantele ocazionale – care pot înflori și se pot reproduce ocazional într-un nou areal, dar care nu formează populații care să se poată auto-susține mai multe generații; persistența este asigurată de reîmprospătarea periodică a populației;
Plantele naturalizate – care se reproduc masiv în locul unde au fost introduse, formând populații capabile să se autosusțină mai multe generații, fără intervenția omului;
Plantele invazive sunt considerate plante naturalizate care prezintă capacitatea de a se răspândii la mari distanțe față de locul de introducere (Richardson, 2000).
Introducerea unei specii se poate realiza, direct sau indirect, din zona sa naturală într-un nou areal. Cenușerul (Ailanthus altissima), spre exemplu, a fost introdus în Europa în mod intenționat pentru calitățile sale ornamentale. În schimb, ambrosia (Ambrosia artemisiifolia) a fost introdusă în mod neintenționat. Unele specii ajunse departe de zona de origine, nu supraviețuiesc foarte mult în noile condiții, altele se obișnuiesc destul de repede producând urmași viabili ce le asigura supraviețuirea timp de mai multe generații, aceste specii fiind considerate invazive (Anastasiu, 2007).
Plantele invazive (invadatoare) sunt plante adventive naturalizate capabile să se răspândească la mari distanțe față de populațiile parentale sau acestea sunt considerate plante adventive (non-native) în ecosistemul considerat, a căror introducere cauzează în mod real sau potențial pagube mediului sau sănătății umane (Dihoru, 2004). O plantă este considerată invazivă dacă îndeplinește anumite criterii, și anume: prezintă mijloace rapide de răspândire, produce anual mulți germeni, reproducerea se realizează vegetativ, au talie mare și organe subterane puternice, nu sunt consumate de animalele fitofage (Sîrbu, 2010).
Plantele invazive reprezintă o amenințare majoră pentru conservarea biodiversității la nivel mondial, cauzând dispariția speciilor indigene și în unele cazuri, chiar a funcțiilor ecosistemelor. Succesul invaziei depinde de atributele biologice ale invadatorului, disponibilitatea resurselor și habitatul invadat (Anastasiu, 2008).
De altfel, multe plante non-native, după ce au fost introduse ca plante ornamentale au devenit în cadrul ecosistemului în care au fost introduse, mai devreme sau mai tarziu, o adevarată amenințare ecologică, acestea fiind considerate poluanți biologici. Daunele aduse de plantele invazive non-native pot fi ireversibile, iar problemele cauzate de plantele alohtone pot afecta viețile noastre prin reducerea randamentului culturilor, producerea de daune structurale asupra drumurilor și caselor dar și prin creșterea riscului de inundații (Pemberton, 2002).
Puține țări au un sistem legal legiferat și instituțional dezvoltat care să fie capabil să soluționeze problema efectivă dată de invazia acestor plante, invazia speciilor străine putând fi amplificată de puținele informații asupra potențialului pericol al noilor specii introduse (Dihoru, 2004).
Cu privire la plantele invazive, la nivel european există câteva studii asupra anumitor specii straine, însă numai câteva state au reușit să realizeze o listă de control a acestora referitoare la componența florei lor străine: Austria (Essl, 2002), Republica Cehă (Pyšek, 2002), Germania (Kühn, 2003), Irlanda (Reynolds, 2002) și Marea Britanie (Preston, 2004).
În România s-au realizat diferite proiecte cu scopul de a stopa și eradica plantele invazive, identificându-se peste 600 de astfel de plante, însă un număr de 98 specii îndeplinesc criteriile necesare apartenenței la această categorie, atât în privința capacității lor de răspândire în natură (lărgire a arealului), cât și în privința impactului asupra ecosistemelor, economiei și sănătății umane (Sîrbu, 2009-2011; Sărățeanu, 2007-2010; Cogălniceanu, 2007-2010). În plus, există opinii contradictorii în ceea ce privește recunoașterea și definirea speciilor invazive.
Invazia speciilor este recunoscută, ca fiind unul dintre principalele riscuri ce amenință real biodiversitatea (Pauchard, 2004) și implicit structura și funcțiile ecosistemelor (Stinson, 2006), conservarea arealurilor protejate (Pauchard, 2004) și determină costuri suplimentare enorme în agricultură, silvicultură, piscicultură și alte ramuri economice, precum și în sănătatea umană (Pimentel, 2000). Pe de altă parte, extractele din plante oferă un potențial nelimitat din punct de vedere profilactic sau curativ. Rolul acestora în elaborarea formulărilor medicamentoase este fie de a furniza baze fitochimice sau modele structurale pentru principiile active din preparatele farmaceutice industriale sau oficinale, fie de a fi utilizate direct în tratarea diverselor afecțiuni prin metode ale medicinei alternative (Reynolds, 2002).
Valorificarea potențialului terapeutic al plantelor invazive ar putea reprezenta o soluție economică, dar și un factor de control al răspândirii acestora, protejând biodiversitatea locală. Literatura de specialitate menționează câteva studii pentru demonstrarea potențialului terapeutic al câtorva dintre aceste plante în țările în care acestea nu sunt considerate plante invazive.
Astfel, în dorința de a oferi o alternativă viabilă pentru abordarea practică a acestui fenomen, în cadrul acestei teze s-au demonstrat proprietățile terapeutice pentru câteva astfel de specii, în vederea fundamentării științifice a introducerii lor în practica farmaceutică. Prin urmare, scopul studiului de față a constat în extracția, caracterizarea fizico-chimică și evaluarea potențialului terapeutic (antimicrobian, imunomodulator și antioxidant) al amestecurilor fitochimice obținute prin exploatarea unor plante invazive.
CAPITOLUL I
Caracterul invaziv al unor specii de plante alohtone din România
De mii de ani, natura a servit drept un veritabil depozit de plante medicinale, un număr impresionant de medicamente moderne au la bază diferite principii active izolate din surse naturale, în special de origine vegetală, astfel, utilizarea plantelor în medicina complementară și alternativă crescând foarte mult în ultimii ani (Rios, 2005). De cele mai multe ori, plantele invazive sunt incluse în categoria generală a așa-numitelor ierburi, fiind nedorite și asociate cu un anumit impact negativ real sau potențial pe care îl au sau l-ar putea avea asupra biodiversității floristice, asupra structurii și funcției ecosistemelor din patria adoptivă sau asupra producției agricole.
Plantele componente ale covorului vegetal cuprind atât specii autohotone, cât și adventive. Plantele adventive, sunt acele specii prezente într-un anumit teritoriu a căror prezență se datorează introducerii, intenționate sau accidentale, ca rezultat al activității umane sau animale. Aceste plante cresc obișnuit în habitate antropogene și prezintă capacitatea de a prospera și de a se reproduce, într-un anumit areal, fără a forma populații de înlocuire sau sunt naturalizate (produc populații care pot să dureze mai mult de un ciclu de viață, fără intervenția directă a omului sau chiar contrar intervenției omului). Dintre aceste specii adventive, o parte devin invazive (Dihoru, 2004; Richardson, 2000).
Pentru plantele adventive sunt menționate două clasificări principale în literatura de specialitate (Dihoru, 2004). Prima se bazează pe taxonomia și perioada introducerii în noul areal (Kornas, 1978):
A. Apophyta – speciile native, care cresc în habitate antropogene (Urtica dioica L.);
B. Antropophyta – speciile introduse din flore îndepărtate, care in functie de perioada introducerii sunt:
I. Archaeophyta – introduse până la sfârșitul secolului al XV-lea;
II. Kenophyta – introduse după secolul al XV-lea, până în zilele noastre. Acestea se impart după modul stabilizării în:
1. Plante bine stabilizate în flora locală:
a. Agryophyta – plante stabilite în comunități naturale sau seminaturale:
a1. Holoagriophyta – plante instalate în comunități naturale;
a2. Hemiagriophyta – plante instalate în comunități seminaturale;
b. Epoecophyta – plante stabilite în habitate antropogene.
2. Plante nestabilizate permanent:
c. Ephemerophyta – plante introduse pentru scurtă durată din regiuni îndepărtate
d. Ergasiophygophyta – plante scăpate din cultură, însă incapabile să se mențină spontan (Dihoru, 2004).
A doua clasificare mult mai veche (Holub, 1967), însă a fost recent reactualizată (Pyšek, 2002) având drept criteriu de clasificare modul de pătrundere în noul habitat:
I. Hemerophytes- plante introduse deliberat:
1. Ergasiophytes – plante stabilite numai în cultură;
2. Ergasiophygophytes – plante păstrate în cultură și ocazional scăpate;
3. Ergasiolipophytes – plante cultivate cândva, dar care au persistat în arealul respectiv, fără să fi fost necesară intervenția omului;
II. Xenophytes – plante introduse accidental:
1. Archaeophytes – plante introduse înainte de secolul al XV-lea;
2. Neophytes – plante introduse după secolul al XV-lea:
a. Ephmerophytes – se găsesc temporar în habitatele antropogene;
b. Epecophytes – sunt stabilizate în habitate antropogene, putând deveni invazive;
c. Neoindigenophytes – sunt stabilizate în areal, în habitate antropogene de unde pot scăpa în habitate naturale, naturalizate sau invazive (Dihoru, 2004).
Consecințele introducerii plantelor adventive în noile teritorii, departe de patria lor de origine, au condus la adevărate “explozii ecologice” – soldate cu creșteri neobișnuite ale numărului indivizilor unei speciei, care au condus adesea la adevărate catastrofe ecologice și economice (Pauchard, 2006).
O specie adventivă este considerată invazivă dacă prezintă populații naturalizate capabile să se răspândească la mari distanțe într-un teritoriu considerat. În acest sens, a fost propus ca indicator pentru determinarea caracterului invaziv al unei specii, extinderea arealului invaziv al acesteia: >100m/50 ani pentru taxonii care se răspândesc prin semințe și peste 6m/3 ani pentru taxoni care se răspândesc pe cale vegetativă (Richardson, 2000). În literatura de specialitate, termenul de plantă invazivă ține cont și de impactul produs asupra mediului sau a economiei umane: o specie invazivă este o specie a cărei introducere cauzează în mod real sau potențial pagube mediului sau sănătatii umane (Lovell, 2005).
Printre cauzele invaziilor vegetale se pot menționa: fenomenul de globalizare, dezvoltarea comerțului, transportului și turismului, acestea furnizând oportunități necesare răspândirii accidentale sau deliberate a speciilor de plante, practicile incorecte utilizate în horticultură și silvicultură ce au condus la degradarea habitatelor naturale, ecosistemelor și câmpurilor agricole din întreaga lume, lipsa dușmanilor naturali în noile ecosisteme, schimbarea climatică globală, un factor decisiv ce contribuie la răspandirea și stabilirea speciilor invazive străine. Pe parcursul ciclului de dezvoltare speciile alohtone pot avea un moment de apogeu și unul de regres (Anastasiu, 2007).
Plantele invazive concurează cu plantele autohtone pentru spațiu și factorii ecologici (lumină, apă, și substanțe nutritive), conducând de cele mai multe ori la suprimarea sau hibridarea florei indigene; uneori pot reduce cantitatea de lumină și căldură pentru creșterea florei autohtone, modificând circuitul nutrienților; prin acest efect plantele pot afecta și rețeaua trofică a unui ecosistem (Pemberton, 2002; Booth, 2003).
În întreaga lume, îndepărtarea acestor specii invazive se realizează prin diferite metode ce constau în combaterea manuală și mecanică (acoperire/sufocare, inelare, excavare, smulgere, cosire, incendiere), combatere biologică (eliberarea unor insecte care se hrănesc exclusiv cu plantele țintă) sau combaterea chimică (aplicarea erbicidelor) (Gherardi, 2007).
La nivel global, invazia speciilor alohtone este recunoscută ca fiind una dintre cele mai mari amenințări la adresa diversității biologice și a economiei (Gherardi, 2007). Rezultatul final al acestui proces a fost și este că flora și fauna specifice unor zone cu biodiversități unice, au fost iremediabil și definitiv alterate de intervenția inconștientă a omului. Mai mult, fauna și flora autohtonă din unele zone continentale sunt în prezent dominate de alte specii (Skolka, 2004).
Pentru a se integra rapid în noul habitat, o specie neofită trebuie să îndeplinească anumite condiții, în lipsa cărora, chiar dacă reușește să se mențină pentru un timp, în final va fi eliminată de conjunctura factorilor de mediu biotici și abiotici din noul habitat. Astfel, în continuare sunt redate câteva caracteristici esențiale ale unor specii alohtone pentru ca acestea s fie considerate invazive: să aibă un areal larg; să fie abundente în zonele de origine; să prezinte capacitatea de a produce un număr mare de descendenți, cât și o durată crescută de viață în noul habitat, creșterea taliei, capacitate adaptativă mare, organizarea complexă; să aibă talia mai mare decât a speciilor înrudite din ecosistemul invadat; să posede o largă plasticitate ecologică; concurență agresivă pentru resurse (apă, lumină) (Skolka, 2004).
Trasaturi specifice ale ecosistemelor în care s-au stabilit speciile invazive sunt: lipsa unor adaptări speciale ale speciilor indigene; lipsa unor specii competitoare și prădători între speciile indigene; lipsa agenților paraziți patogeni în noile habitate (Skolka, 2004).
Speciile invazive pot avea un impact negativ asupra ecosistemelor prin mai multe modalități, după cum urmează:
modificarea ciclurilor naturale ale nutrienților și a apei în arealul invadat;
afectarea fungilor micorizanți (scăderea vitalității speciilor micorizante);
schimbarea compoziției chimice a solurilor (eliberarea substanțelor alelopatice etc.), cu efect de schimbare a structurii comunităților vegetale;
deteriorarea habitatelor locale;
reducerea nutrientilor pentru fauna și flora autohtonă;
modificări în succesiunea fitocenozelor;
creșterea incidenței unor agenți fitopatogeni și apariția unor boli exotice (Sîrbu, 2011).
I.1. Impactul plantelor invazive la nivel național și internațional
Speciile invazive au fost raportate în toate cele șapte regiuni geografice (Europa, Africa, Australia, America de Nord, America de Sud, Pacific și Asia). Cei mai multi arbori invazivi au ca zona de origine Africa (87 specii) fiind urmati deAsia (14 specii) și Europa (12 specii). Cu toate acestea, majoritatea speciilor invazive prezinta acest caracter doar in una din cele șapte regiuni. Cele mai multe specii invazive perene auca zona de origine Asia (Haysom, 2003).
La nivel international, plantelor adventive invazive li se acordă o deosebită atenție, acestei probleme fiindu-i dedicate manifestări științifice europene și mondiale precum: International Conference on Biological Invasions,International Conference on the Ecology and Management of Alien Plant Invasions; European Veed Research Society Symposium; World Conference on Biological Invasions and Ecosystem Functioning, scopul întrunirilor constând în reducerea amenințărilor asupra ecosistemelor naturale și asupra speciilor native pe care acestea le conțin, prin sporirea cunoștințelor despre speciile de plante invazive și despre mijloacele de prevenire, combatere și de eradicare a acestora. (http://www.issg.org/about_is.htm).
Speciile de plante care au invadat Statele Unite au provocat o gamă largă de daune ecosistemelor naturale. Cele mai multe plante exotice stabilite în Statele Unite ale Americii au fost introduse in scop alimentar, industrial si ornamental. Aproximativ 5000 de plante din cele 17.000 de specii de plante indigene din SUA au scăpat din cultura și acum există în ecosistemele naturale (Morse, 1995). În Florida, din cele aproximativ 25.000 de plante exotice importate în principal ca plante ornamentale, mai mult de 900 au devenit invazive in ecosistemele naturale. Multe specii de plante introduse si stabilizate, au un efect negativ asupra parcurilor naționale. Spre exemplu, in Great Smoky Mountains National Park, 400 din aproximativ 1500 de specii de plante vasculare sunt exotice, și 10 dintre acestea prezinta un caracter invaziv-agresiv care amenință alte specii native (Hiebert, 1993). În Insulele Hawaii au fost identificate aproximativ 2690 de specii de plante, dintre care 946 sunt specii exotice. Aproximativ 800 de specii native și mai mult de 200 de specii endemice sunt considerate a fi pe cale de dispariție din cauza unor specii alohtone. Se estimează că aproximativ 138 de specii de arbori și arbuști străinicare au invadat ecosistemele native din SUA (ex. Tamarix pendantra, Eucalyptus sp., Schinus erebinthifolius, Melaleuca australian). Unii dintre acești arbori au redus talia altor arbori, arbuști precum și a altor tipuri de vegetație indigenă sau chiar au deplasat populații ale unor specii de animale autohtone (Pimentel, 2005).
Pe langă impactul ecologic, în SUA plantele alohtone au determinat o reducere de aprox. 12% din recolte. În termeni economici s-a condus la o pierdere de aprox. 24 miliarde dolari în producția de vegetale anuală. În plus, aprox. 4 miliarde de dolari sunt consumați pentru erbicide, dintre care aprox. 3 miliarde de dolari sunt utilizați pentru controlul buruienilor invazive. Prin urmare, costurile totale pentru eradicarea acestor specii în SUA este de aprox. 27 miliarde de dolari anual (Pimentel, 2005).
Unele dintre cele mai cunoscute specii invazive din Asia de Sud-Est și care sunt capabile de a modifica un ecosistem sunt plantele vasculare; de exemplu, Mimosa pigra, un arbust din America tropicală, care a fost introdus în Thailanda în 1947 a devenit larg distribuit de-a lungul râului Mekong și în zonele învecinate, putând concura cu vegetația nativă, mecanismul de invazie constând în capacitatea mare de diseminare, o singură plantă în condiții optime putând produce până la 12.000 de semințe anual (Peh, 2010). Evaluările economice asupra speciilor invazive sunt rare sau chiar nu există în unele țări din Asia, însă se estimează pierderi anuale mari asupra agriculturii de ordinul miliardelor de dolari (MacKinnon, 2002). Global datele asupra invaziei speciilor alohtone arată că invadatorii biologici se găsesc în toate țările din Asia; de exemplu, Indonezia adăpostește un număr de aprox. 78 specii, iar pentru Brunei s-au raportat aprox. 6 specii (Peh, 2010).
Pierderile economice cauzate de speciile alogene invazive în China au fost evaluate la 19847,59 milioane RMB în 2000. Frunze de Liriomyza sativae, Ambrosia artemisiifolia, Rattus norvegicus, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Eupatorium adenophorum au cauzat pierderi mai mari de 1 miliard de RMB. Pierderile economice cauzate de speciile alogene invazive din China reprezintă 1,36% din PIB (Xu, 2006).
În Africa de Sud arborii alohtoni precum pinul (nativ Europei) si eucaliptul (nativ Australiei) ocupa aproximativ 1,5 milioane ha. Beneficiile acestor plantații au constat în dezvoltarea economică, prin exportul de material lemnos. Din păcate însă, aceste plantații au fost asociate cu efecte negative considerabile asupra biodiversității și a funcționării ecosistemelor (Le Maitre et al., 2002).
În Australia speciile invazive au condus la reducerea cantității și calității produselor forestiere agricole și horticole, care afectează atât industria, cât și consumatorii. Se estimează că pierderile au condus la o suma de aprox. 1,5 miliarde dolari pe an, în activitățile de combatere a acestor specii și încă 2,5 miliarde dolari pe an pentru pierderile din producția agricolă. Aproape toate comunitățile de vegetație nativă din Australia au fost invadate sau sunt vulnerabile la invazia cu specii exotice care ar putea duce la schimbări în structură, compoziția de specii, frecvența și abundența comunităților indigene. Astfel, la nivel național, plantele invazive reprezintă aprox. 15% din flora (Page, 2006).
La nivel european se estimeaza costuri colosale pentru eradicarea și controlul acestor specii, precum și pierderile generate de daunele aduse agriculturii, silviculturii, pescuitului comercial și infrastructurii. Costurile de eradicare și control ale plantelor invazive în Europa, au ajuns în urma unei estimări realizate în anul 2008 la o cifră cuprinsă între 9600 și 12700 milioane €/an, luându-se în calcul cheltuielile curente de eradicare și control ale speciilor invasive, incluzând și efectele economice, însă în prezent, datorită extinderii fenomenului, precum și a faptului că unele țari nu au început sa conștientizeze și să înregistreze aceste cheltuieli, se crede că valoarea reală a costurilor financiare aferente va fi mult mai mare (Kettunen, 2008).
Impactul plantelor invazive asupra ecosistemelor europene este una dintre cele mai dificile probleme din domeniul conservării biodiversității in zilele noastre. Unele specii de plante exotice invadatoare au capacitatea de a provoca pagube economice enorme. Spre exemplu: s-a estimat că aprox. 1,6 miliarde GBP s-au alocat pentru a eradica specia Fallopia japonica în Marea Britanie și peste 150 GBP sunt cheltuite anual, pentru control. În Mallorca și Menorca (Spania), pentru eradicarea speciilor Carpobrotus edulis și C. acinaciformis se consuma anual sute de mii de euro, aceste specii prezintă o amenințare majoră asupra florei native endemice (Heywood, 2013).
Conform unui proiect desfășurat la noi în țară de cărte Sîrbu și colab. săi, finalizat în 2009, s-a constatat că în Europa au fost identificate aprox. 5789 specii de plante vasculare adventive, dintre care 2843 specii sunt specii alohtone, celelalte fiind de origine europeană, dar considerate adventive în unele regiuni din afara arealului nativ. Aprox. 65% dintre aceste specii sunt deja naturalizate, însă în ultimele decenii s-a observat un influx continuu de specii adventive în Europa (Hejda, 2009).
În ultimii ani, pe plan european, s-a derulat un proiect susținut de Comisia Europeană, intitulat Delivering Alien Invasive Inventories for Europe (DAISIE), având ca obiective:
– crearea unui inventar al speciilor adventive care amenință ecosistemele terestre și acvatice din Europa, inventar care să stea la baza acțiunilor de prevenire și control a speciilor invazive prin înțelegerea tuturor factorilor implicați (de mediu, economici etc.);
– identificarea amenințărilor asupra mediului, sănătății umane și activităților economice datorate celor mai larg răspândite și invazive specii adventive din Europa;
– utilizarea bazelor de date cu specii adventive (European Alien Species Database) și a rețelei de experți (European Alien Species Expertise Registry), în vederea semnalării timpurii și prevenirii unor noi invazii etc. (http://www.europe-aliens.org/aboutDAISIE.do).
Însă plantelor adventive, la nivel european este intens studiate prin diferite organizații și manifestări (conferințe, congrese) regionale în scopul de a actualiza periodic așa zisa “listă neagră” a speciilor invazive și de a monitoriza eventualele pagube. Cele mai cunoscute organizații sunt: NOBANIS (North European and Baltic Network on Invasive Alien Species) (http://www.nobanis.org); EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization) (http://www.eppo.org/); ERNAIS (European Research Network on Aquatic Invasive Species) (http://www.zin.ru/projects/invasions/gaas/ernaisdb.asp).
Cele mai comune specii de plante adventive din Europa conform site-ului http://www.europe-aliens.org/speciesSearch.do în ordine descrescătoare a frecvenței sunt următoarele: Conyza canadensis, Amaranthus retroflexus, Galinsoga parviflora, Helianthus tuberosus, Xanthium strumarium, Lepidium virginicum, Oenothera biennis, Robinia pseudoacacia, Panicum miliaceum, Veronica persica, Ailanthus altissima, Amaranthus albus, Erigeron annuus, Fallopia japonica, Medicago sativa, Amaranthus blitoides, Lepidium sativum, Papaver somniferum, Solidago canadensis, Acer negundo, Chenopodium ambrosioides, Elodea canadensis, Juncus tenuis, Panicum capillare, Phalaris canariensis, Vicia sativa etc.
Unele dintre speciile de plante adventive în Europa sunt incluse pe lista neagră a celor mai agresive 100 de specii din lume (Robinia pseudoacacia, Ailanthus altissima, Fallopia japonica, Ambrosia artemisiifolia, Heracleum mantegazzianum etc.) (http://www.europe-aliens.org/speciesSearch.do). Plantele invazive prezintăun potențial negativ asupra infrastructurilor prin proprietatea lor de dislocare sau prin intermediul sistemului lor radicular; astfel, sistemul radicular al cenușarului (Ailanthus altissima) poate distruge pavaje, vestigii arheologice și ziduri; de asemenea, speciile invazive pot să obstrucționeze desfășurarea activităților de transport prin blocarea căilor navigabile (Call, 2005).
Consecințele speciilor invazive asupra mediului pot fi grave, cu impact atât asupra speciilor native cât și la nivel de ecosistem, spre exemplu specia Carpobrotus a înlăturat speciile de plante autohtone din diferite țări de pe țărmul Mediteranei, dar și din Germania, Marea Britanie și Irlanda; schimbările ecosistemelor cauzate de colonizarea dunelor de nisip cu Acacia spp (native din Australia) în Portugalia; invazia habitatelor riverane din Franța, Germania și Elveția cu Fallopia spp. (Heywood, 2013).
În marea lor majoritate, speciile alohtone prezente în Europa au fost introduse intenționat datorită proprietatilor ornamentale. De la începutul secolului al XX-lea, utilizarea acestora în agricultură, silvicultură, acvacultură, maricultură și horticultură, ca plante ornamentale sau în scopuri recreative a crescut treptat (Skolka, 2004). De altfel, multe plante non-native, după ce au fost introduse ca plante ornamentale au devenit în cadrul ecosistemului în care au fost introduse, mai devreme sau mai târziu, o adevarată amenințare ecologică, acestea fiind considerate „poluanți biologici”. Daunele aduse de plantele invazive non-native pot fi ireversibile, iar problemele cauzate de plantele alohtone pot afecta viețile noastre prin reducerea randamentului culturilor, cauzarea de daune structurale asupra drumurilor și caselor, dar și prin creșterea riscurilor de inundații (Pemberton, 2002).
Se pare că și schimbările climatice prezintă un impact major asupra distribuției acestora, iar supraviețuirea și extinderea speciilor invazive se datorează iernilor mai blânde și verilor mai calde din Europa ultimului deceniu. Însă, plantele ornamentale nu devin o problemă dacă rămân în zone special amenajate (Masters, 2010).
Primele notificari aspura plantelor invazive adventive din România datează din secolul al XIX-lea (Prodan, 1957; Grecescu 1876; Grecescu, 1909, etc.). Date referitoare la flora generală a României se găsesc în diferite lucrări (Ciocârlan, 2000; Oprea, 2005), precum opere sintetice asupra așa-numitelor buruieni din culturile agricole (Chirilă et al., 2002 etc.).
Introducerea plantelor alohtone s-a realizat treptat de către agricultori, comercianți, navigatori, misionari, iubitori de flori, coloniști, în același timp cu extinderea zonelor agricole, extinderea localităților urbane și progresele înregistrate în grădinărit. Din secolul al XIX-lea, introducerea acestor specii a căpătat un curs accelerat. Odată cu formarea primei Grădini Botanice din România, după 1856 la Iași, introducerea plantelor alohtone în România s-a efectuat într-un ritm mai accelerat. Astfel, până în anul 1870, au fost cultivate aprox. 2350 de plante vasculare, 50% dintre acestea fiind de proveniență alohtonă (Sîrbu, 2011).
În prezent, procesul de expansiune al acestor plante se află într-un progres continuu, fiind introduse plante alogene de ordinal miilor și păstrate în cultură în diferite colecții didactice și științifice (grădini botanice, loturile experimentale ale unor universități, institute de cercetare) (Sîrbu, 2011).
În flora României s-au identificat în jur de 435 specii de plante adventives conțnând 384 neofite și 51 sunt arheofite, dintre acestea cele mai importante familii de plante din flora adventivă a României sunt: Asteraceae, Brassicaceae și Poaceae (Anastasiu și Negrean, 2007). De asemenea, peste 50% dintre aceste specii adventive sunt anuale; introducerea acestor plante adventive s-a realizat deliberat sau accidental. Arheofitele sunt, în genere, de origine mediteraneană, în timp ce neofitele sunt preponderent de origine americană. Conform bazei de date “Delivering Alien Invasive Species Inventories for Europe” (DAISIE), principalele specii adventive incluse în categoria celor invazive în România sunt următoarele: Acer negundo, Ailanthus altissima, Amaranthus retroflexus, Amorph fructicosa, Conyza canadensis, Echinocystis lobata, Erigeron annuus, Elodea nuttallii, Morus alba, Fraxinus pennsylvanica, Iva xanthiifolia, Helianthus tuberosus, Paspalum paspalodes, Robinia pseudoacacia, Solidago canadensis, Impatiens glandulifera, Reynoutria japonica, Parthenocissus inserta, Xanthium spinosum și Xanthium italicum, acestespecii fiind identificate ca făcând parte din această categorie și de literatura de specialitate locală (Anastasiu, 2005; Anastasiu, 2007, Sîrbu, 2010).
După Chirilă (2002), din 132 de specii de plante advenitive identificate în flora României, următoarele sunt considerate invazive: Amaranthus albus, A. powellii, A. retroflexus, Cuscuta campestris, Conyza canadensis, Galinsoga parviflora, G. ciliata, Veronica persica, Xanthium italicum, X. spinosum, Cyperus difformis, Cannabis sativa subsp. spontanea, Datura stramonium, Portulaca oleracea, Raphanus raphanistrum, Vicia sativa, Aristolochia clematitis, Xanthium strumarium, Phragmites australis.
În alte publicații (Dihoru, 2004) s-a considerat ca doar 61 de specii pot fi considerate invazive dintre plantele adventive ale României. Astfel din datele locale de literatură, diferențele de apreciere privind numărul de plante care ar putea sa fie considerate invazive conduc la concluzia că evaluarea caracterului lor invaziv este în prezent destul de subiectivă, fiind necesare cercetari mai amănunțite asupra monitorizării populațiilor vegetale în ecosistemele care le adăpostesc.
Habitatele ce prezintă un grad mare de umiditate sunt cele mai sensibile la invazia plantelor adventive (Alpert, 2000; Zedler, 2004 etc.). Într-un studiu realizat de Oprea (2006), având ca subiect descrierea flora adventive din lunca Tisei, s-au identificat aprox. 56 specii (majoritatea native din America de Nord), dintre acestea, 33 sunt hemerofite și 23 sunt xenofite. În același studiu s-a constatat că intensitatea presiunii antropice asupra mediului este direct proporțională cu prezența speciilor adventive din flora locală (Oprea, 2006).
I.2. Fitoterapia și plantele invazive din România
De-a lungul istoriei fitoterapia s-a aflat atât în perioade de glorie dar și de declin, actualmente fiind inclusă în cadrul terapiilor neconvenționale și în întreținerea sănătății. În antichitate și evul mediu, singurele leacuri cunoscute pentru tratarea diferitelor afecțiuni au fost plantele, recent fitoterapia a cunoscut un declin considerabil, era substanțelor de sinteză înlocuind aproape în totalitate mijloacele terapeutice tradiționale. Plantele medicinale au fost înlocuite cu medicamentele de sinteză, observându-se în timp multitudinea de efecte adverse și fenomene secundare care au condus la destabilizarea mecanismelor de reglare ale organismului (Capasso, 2003). Astfel, în dorința de a oferi o alternativă viabilă pentru utilizarea plantelor invazive, precum și protejarea mediului înconjurător de aceste specii, se vor prezenta câteva astfel de plante considerate invazive în Romania însă care au utilizări curative tradiționale în țările de origine, în vederea realizării unei baze de determinări științifice, premisă a utilizării lor în practica farmaceutică de pretutindeni.
Fitoterapia prezintă o multitudine de avantaje față de medicamentele de sinteză (Calixto, 2000):
prezintă o gamă largă de efecte curative și sunt potrivite în general pentru tratamentul bolilor cronice;
accesibilitatea;
utilizarea empirică a acestor produse de mii de ani (testarea clinică);
necesita costuri inferioare medicamentelor de sinteza;
tratarea pacientului ca întreg;
acțiunea ușoară și lipsită de efectele adverse, etc.
Principalele dezavantaje ale fitoterpiei (Calixto, 2000), constau în:
principiile active din plante sunt încă necunoscute;
compușii chimici ai plantelor pot să difere în funcție de condițiile climatice, de fenofaze, de la un an la altul, gradul de poluare și mulți alți parametrii geografici și fizico – chimici.
În decursul anilor, plantele considerate invazive au fost împărțite în funcție de abundența și impactul lor față de biodiversitatea locală astfel: plante cu grad de invazivitate masivă, moderată și minimală (Blackburn, 2014).
I.2.1. Plante alohtone cu grad de invazivitate masivă
Speciile alohtone cu grad de invazivitate masivă au o distribuție și abundență semnificativă în comunitățile vegetale naturale sau seminaturale fiind plante extrem de dăunătoare care odată pătrunse într-un ecosistem transformă structura acesteia și înlatură în timp speciile autohtone sau formeaza hibrizi cu acestea conducând în final la extincții genomice. Aceste specii pot produce schimbări ireversibile în compoziția chimică a solului. De regulă, aceste specii prezintă un caracter puternic alergen prin ingestie, inhalare, și alelopat rezultând înlocuirea sau dispariția la nivel local a speciilor indigene (Blackburn, 2014).
Date generale asupra speciei Robinia pseudoacacia
Robinia pseudacacia (salcâmul) este o specie invazivă transformatoare cu o abundență sporită în întreaga Europă fiind inclusă pe lista celor mai periculoase specii invazive (Fig. 1) deoarece prezintă capacitatea de a se raspândi rapid și de a avea un ritm de creștere ridicat, formând grupuri de arbori, păduri monodominante, puține specii tolerând substanțele allelopatice (robetrin, miricetin și quercetin) identificate în extractele etanolice din frunzele de salcâm (Benesperi, 2012; Castro-Diez, 2014). Făcând parte din familia Fabaceae, salcâmul este o specie ce stabilește relații de simbioză cu bacteriile fixatoare de azot, acumulând mari cantităti de azot; cum R. pseudacacia este o specie lemnoasă, iar scoarta sa este foarte rezistentă la biodegradare, azotul fixat va rămnâne mult timp „blocat” înainte de a reintra în circuitul general. Din lipsă de informație științifică, specia este plantată în continuare, se raspândește spontan și invadează tipuri de vegetații importante și valoroase. Specie de origine nord americană, a fost introdusă și plantată în diverse scopuri: ornamental, melifer și forestier, având proprietatea de a stabiliza terenurile erodate aflate pante și nisipoase (Benesperi, 2012).
* http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=504804
Fig. 1 Zone afectate de invazia speciei R. pseudoacacia, hartă furnizată de Comisia Europeana prin intermediul proiectului DAISIE (http://www.europe-aliens.org/aboutDAISIE.do)
Conform datelor de literatură R. pseudoacacia conține taninuri (Zhang, 2013) și monoterpene specifice taxonului (robinlin) (Tian, 2001). În flori uleiul volatil se gasește în urme, principalii constituenți identificați prin cuplajului headspeace-GC-MS au fost linalool, cis-β-ocimen, (E)-α-bergamoten și formanilidă (Xie, 2006). De asemenea, în frunze s-a identificat și prezența cianamidei cunoscându-se că derivații N-substituiți prezintă activitate antibacteriană (Kamo, 2012). Unii fitocompuși ai acestei specii joacă un rol esențial în protecția asupra agenților patogeni sau alte atacuri biotice, fiind astfel responsabili pentru durabilitate naturală a lemnului masiv de R. pseudoacacia (Pereira, 2003). S-a raportat că scoarța salcâmului are o rezistență exceptională la biodegradare, fiind atribuită concentrației de robinetin și dihidrobin (Rudman, 1963). În esență flavonoidele cu proprietăți alelopatice au fost detectate în concentrație mare și în scoarța de salcâm. Flavonoidele găsite includ calconele robtein (2',3,4,4',5-pentahidroxicalcona), butein (2',3,4,4'-tetrahidroxicalcone) și 2',4,4'-trihidroxicalcone; flavanonele L-robtin [(2S)-3',4',5',7-tetrahidroxiflavanona], L-butin [(2S)-3',4',7-trihidroxiflavanona] și liquiritigenina [(2S)-4',7-dihidroxiflavanona]; flavanonoli D-dihidrorobinetin [(2R, 3R) -3,3',4',5',7-pentahidroxiflavanona],care este componenta majoră a scoartei, și D-fustin; flavonoli robinetin (3,3',4',5',7-pentahidroxiflavona) și fisetin; flavan-3-ol L-robinetinidol (3,3',4',5',7-pentahidroxi-2,3-trans-flavan) și leucorobinetinidin flavan-3,4-diolilor și D-3,3',4,4',7-pentahidroxi-2,3- trans-3,4-cis-flavan. În plus, duramenul conține acidul β-resorcilic și metil β-rezorcilat (Hemmerlin, 2012). De asemenea, conținutul de polifenoli totali prezenți în flori generează un potențial puternic antioxidant (Ji, 2012).
În mod tradițional florile de R. pseudoacacia sunt utilizate pentru proprietățile antispastice, diminueaza senzațiile de pirozis, hiperaciditatea gastrică și este ușor sedativ si colagog (Temelie, 2006).
Date generale asupra speciei Gleditsia triacanthos
Gladiță (Gleditsia triacanthos) este o specie leguminoasă care produce cantități semnificative de păstăi în fiecare an (Kamalak, 2012). Specie originară din sud-estul Americii de Nord, se dezvoltă bine în regiunile cu climat cald. Prezintă interes în perdelele de protecție, în terenuri degradate, la crearea de garduri vii, dar și în scop ornamental. Această specie este considerată invazivă (fig. 2) având aceași tendință ca salcâmul (fixarea azotului) și facilitând astfel eradicarea speciilor autohtone (Sîrbu, 2010).
Conform unui studiu recent G. triacanthos reduce biodiversitatea prin scăderea macrofitelor și a organismelor asociate acestora, dar de asemenea, provocă schimbări și în lanțul trofic (Giorgi, 2014).
* http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=26714
Fig. 2 Zone afectate de invazia speciei G. triacanthos, hartă furnizată de Comisia Europeana prin intermediul proiectului DAISIE (http://www.europe-aliens.org/aboutDAISIE.do)
Extractul din semințele de Gleditsia triacanthos este disponibil în comerț și folosit în industria cosmetică. Extractul hidroglicolic de G. triacanthos, care conține alcaloidul triancantin, galactomanani, flavonoide și taninuri, este utilizat în aplicații de îngrijire capilară (Cerqueira, 2010). În literatura de specialitate, se remarcă lipsa informațiilor referitoare la compoziția chimică și în special a datelor referitoare la potențialele proprietăți terapeutice ale extractelor din florile de G. triacanthos. Într-un studiu recent (Mohammed, 2014) s-au identificat zece flavonoide în extractul obținut din frunzele de G. triacanthos, și anume: vicenina-I, vitexina, isovitexina, orientina, isoorientina, luteolin-7-O-β-glucopiranozida, luteolin-7-O-β galactopiranozida, apigenin-7-O-β-glucopiranozida, luteolina și apigenina. Extractul alcoolic obținut din frunze a prezentat activitate antioxidantă și citotoxicitate puternică împotriva liniilor celulare tumorale de laringe, de sân, de col uterin, ficat și de colon. Conform Mohamed și colab., 2013., extractul alcoolic obținut din frunzele de G. triacanthos a prezentat activitate antimicrobiana asupra tulpinilor S. aureus și P. aeruginosa.
Date generale asupra speciei Solidago canadensis
Specie invazivă extrem de periculoasă, Solidago canadensis (sânziana de gradină) este o plantă perenă erectă originară din America de Nord. Perioada de înflorire începe la sfârșitul lui august și durează până în octombrie. Caracterul puternic invaziv (Fig. 3) este dat de propagarea vegetativă abundentă prin creșterea proliferică a rizomilor și a lăstarilor (Abhilasha, 2008).
Strategia de propagare a speciei se numeste falanx și constă în propagare vegetală/ clonală atât de densă încât exclude toate celelalte specii din teritoriul clonal prin formarea unor internoduri scurte și ramnificate pe sub pământ. Pe de altă parte, planta produce și substanțe alelopatice ce au proprietatea de a exclude competitorii din mediul unde aceasta se dezvoltă (Abhilasha, 2008). De asemenea, s-a constatat o reducere considerabilă a azotului și fosforului total din sol, precum și a conținutului de NO3-N, în timp ce carbonul organic din arealul respectiv, conținutul de NH4-N și pH-ul au crescut semnificativ în zonele invadate de această specie (Zhang, 2009).
Utilizările tradiționale ale speciei Solidago canadensis L. (Asteraceae) se datorează unui conținut mare de principii active, cum ar fi flavonoide, saponine și hidroxicinamat, care sunt responsabile pentru proprietățile anti-inflamatorii, spasmolitice și diuretice (Apati, 2006).
*http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=36224
Infuziile prezintă proprietăți antiseptice, analgezice, astringente și febrifuge. Planta conține quercitin, un compus care are utilizări practice în tratamentul nefritei hemoragice. Planta conține saponine cu efecte antifungice. De asemenea conține rutin și glicozide fenolice care sunt anti-inflamatoare (Horvath, 2010).
Fig. 3 Zone afectate de invazia speciei S. canadensis, hartă furnizată de Comisia Europeana prin intermediul proiectului DAISIE (http://www.europe-aliens.org/aboutDAISIE.do)
În China, uleiul volatil de S. canadensis are ca și compuși majoritari identificați germacren D și D-limonen, identificându-se de fapt că germacrenul D prezintă activitate antimicrobiană (Zhang, 2006). Însă un alt studiu din Europa a identificat ca și compuși majoritari γ2- și δ-cadinene (Kalemba, 1990).
Date generale asupra speciei Ailanthus altissima
Cenușerul (Ailanthus altissima (mil.) Swingle), cunoscut și sub numele de fals oțetar, este un arbore foios cu creștere rapidă, fiind nativ pentru Asia și introdus la sfârșitul secolului al XVIII-lea atât în Europa, cât și în America (Luis, 2012). Acesta a fost introdus în statele occidentale de către imigranții chinezi, care l-au folosit în scopuri medicinale. Acesta are o capacitate mare de reproducere, atât vegetativ cât și generativ producând anual cantități însemnate de fructe (Anastasiu, 2007). Datorită creșterii sale rapide și producției de numeroase semințe, a scăpat repede din zonele special amenajate având o forță de propagare excepțională. În primul rând produce un număr impresionant de germeni de la vârsta de câțiva ani, care sunt duși de vânt în toate direcțiile (anemohorie), detașându-se de planta mamă spre primăvară. Germenii au putere de germinare deosebită, găsindu-se și în fisurile de pe marginea trotuarelor. În primii ani de viață are o creștere rapidă între 1-3 m anual (Dihoru, 2004).
*http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=28827
Această specie lemonoasă produce, de asemenea, substanțe alelopatice eliberate prin intermediul rădăcinii, cojii/scoarței și frunzelor cauzând inhibarea dezvoltării speciilor autohtone (Luis, 2012).
Quasinoidele, ailantona și caparinona, izolate din această specie sunt în prezent studiate ca o posibilă sursă de erbicide naturale. Acești factori fac ca această specie să fie foarte agresivă și invazivă, având capacitatea să înlocuiască speciile lemonoase native cât și speciile de plante medicinale (De Feo, 2003).
De asemenea, literatura de specialitate mentionează că extractele de A. atissima prezintă activitate insecticidă și antituberculoasă. Florile de sex masculin și frunzele emit un miros neplăcut (Mastelic, 2002).
A. altissima este folosit în medicina chinezească traditională ca remediu în tratmentul răcelilor și al bolilor gastrice. Studiile anterioare au demonstrat prezența unor fitocompuși precum, quasinoide și alcaloizi de tip indol. Au fost caracterizate lipidele și acizii grași, derivați fenolici (acid galic, cafeic, vanilic, clorogrnic, siringic, p-cumaric, feluric, elagic si quercetin) și compușii volatili (linalool, geraniol, α-terpineol, β-cariofilen, α -humulen, γ- si δ-cadinen, calaren) identificate în extractele din frunze (Mastelic, 2002; Luis, 2012).
Date generale asuora speciei Fallopia japonica
Aceasta specie adventivă invazivă, nativă în Asia de est (Japonia, Ins. Sachalin, Ins. Kurile, Corea, China, Vietnam) provoacă pagube mari habitatelor și comunităților vegetale naturale din Europa, precum și pagube substanțiale de natură economică. F. japonica este un arbust invaziv a cărei combatere este foarte dificilă și costisitoare, fiind privită ca o adevărată pacoste, atât în Europa, cât și în America de Nord (Weston, 2005; Tiebre, 2007).
În numeroase state europene și nord-americane, s-au impus măsuri legislative speciale care interzic introducerea și răspândirea acestei specii în habitatele naturale și antropice (Forman, 2003; Weston, 2005).
*http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=565897
În ultimii ani, F. japonica (SYN: Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc sau Reynoutria japonica Houtt) a primit o atenție sporită la nivel mondial, datorită conținutului său ridicat de resveratrol. F. japonica este folosită în medicina traditională chinezească pentru tratarea inflamatiilor, hepatitei, infectiilor, tumorilor, hipertensiunii arteriale, sângerărilor și hiperlipidemiilor. F. japonica conține stilbene (resveratrol și piceid) și glicozidele lor, antranoide (emodina, fisciona, antraglicozida B, citreorosein, emodin 8-O-β-D-glucopiranozid) și zaharide fenolice. Dintre acestea, emodina este cunoscută ca substanță anti-inflamatorie, anti-canceroasă, anti-microbiană, diuretică și vasodilatatoare; emodina și fisciona prezintă citotoxicitate împotriva celulelor canceroase, iar pentru citreoroseină și emodin-8-O-β-D-glucopiranozid s-a demonstrat activitatea fitoestrogenă. În plus, emodina și fisciona se pare că prezintă o activitate inhibitorie pentru enzimele kinază și tirozinază. În plus, antraglicozida B a fost utilizată pentru tratarea hepatitei acute și reducerea numărului de leucocite; resveratrol și piceid au fost raportate ca anti-inflamatori (Shen, 2011).
S-a constatat că extractul de F. japonica prezintă și activitate antibacteriană în special asupra tulpinilor P. aeruginosa, E. coli, B. cereus, S. typhimurium, L. monocytogenes, K. pneumoniae, S. aureus (Jung, 2009).
I.2.2. Plante alohtone cu grad de invazivitate moderată
Plante alohtone cu grad de invazivitate moderată sunt specii de plante adventive care au o distribuție semnificativă, deși în general ele nu pătrund în comunitățile vegetale naturale cu valoare conservativă semnificativă, acestea persistă doar în arii ruderale sau segetale, în locul perturbărilor antropice sau în comunități seminaturale degradate. Prin urmare, aceste specii necesită atenție sporită în anii urmatori precum și măsuri prin care să se controleze răspândirea lor acolo unde încep să își mărească distribuția. Hibridizarea între speciile exotice și cele indigene se observă în mod regulat în natură formând hibrizi viguroși dar cu grad de fertilitate redus (Blackburn, 2014).
Date generale asupra speciei Helianthus tuberosus
* http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=36691
Topinamburul (Helianthus tuberosus L.) provine, ca și cartoful, din America Centrală și de Nord, fiind în perioada precolumbiană o plantă de cultură amerindiană, probabil cu utilizari empirice încă din perioada aztecilor, fiind introdusă pentru prima oară în Europa în anul 1607 conform cu Kowarik (2005).
Factorii biologici ce participă la succesul invaziei acestei specii în diverse habitate includ: (1) consumul mare de energie necesar în dezvoltarea inițială a stemului, ramurilor și frunzelor; (2) cantitatea mare de energie alocată pentru producția de rizomi și tuberculi; (3) o strategie de propagare de tip falanx; (4) mobilitatea nutrienților în plantă; (5) cantitatea mare de semințe produse anual; (6) capacitatea de a se regenera chiar dacă au fost supuși unui proces sever de defoliare; și (7) alocarea constantă de nutrienți pentru structurile clonale (Swanton, 1989).
Acești factori sunt completați de rezistența la cele mai multe boli și dăunători, și toleranța la soluri sărace în nutrienți. Cu toate acestea, aceste caracteristici în principal favorizează specia H. tuberosus să se propage pe arii ruderale sau segetale, având o densitate optimă de plantare de aproximativ 30 000 ha. Controlul este necesar numai în primele etape de creștere, până când plantele ajung la aproximativ 0,5 m în înălțime. Atât rizomii cat și tuberculii pot rămâne în sol peste iarnă producând muguri pentru anul următor (Swanton, 1992).
Topinamburul este o legumă cu o valoare calorică redusă dar cu un conținut ridicat de inulină, vitamine și minerale. Inulina este un fructooligozaharid, care are o serie de caracteristici terapeutice. Inulina și compușii de degradare ai acesteia sunt cunoscuți ca prebiotice, având capacitatea de stimulare și/sau activare a sănătății umane prin proliferarea bacteriilor din colon (Saxholt, 2008). Inulina din napi s-a dovedit a avea un efect prebiotic la om (Ramnani, 2010, Bach, 2012). Inulina afectează, de asemenea, nivelul de zahăr din sânge într-o măsură mai mică decât alte glucide, și, prin urmare, este recomandată pentru utilizarea sa într-un regim alimentar cu diabet zaharat (Bach, 2012).
Ca o sursă de inulină, tuberculii prezintă acțiune depurativă, colagogă, diuretică și tonică fiind folosiți ca remediu tradițional pentru tratarea diabetului zaharat dar și a reumatismului (Pan, 2009a). În plus, frunzele de Helianthus tuberosus prezintă proprietăți antipiretice, analgezice, anti-inflamatorii și prin urmare, sunt folosite în China ca remediu popular pentru tratamentul eczemelor și cefaleelor. Mai mult decât atât, în ceea ce privește tulpinile și frunzele acestei plante, s-a demonstrat că acestea posedă diverse activități biologice, inclusiv activități antimicrobiene, antifungice și antitumorale, lactonele sesquiterpenice constituente identificate în părțile aeriene, s-au dovedit a fi principiile active (Pan, 2009a; Yuan, 2013).
Date generale asupra speciei Amaranthus retroflexus
A. retroflexus (știr) este o specie invazivă perenă anuală originară din America de Nord. Această specie a fost introdusă în Europa în mod accidental regăsindu-se astăzi într-un număr mare de habitate (Fig. 4), avand proprietatea de aerisire a solului. În America de Sud și de Nord această plantă a fost folosită în scop alimentar (Iamonico, 2010).
În Romania, planta se folosește decât în hrana porcilor, în rest este considerată drept o buruiană supărătoare datorită proprietăților ei de plantă invazivă.
* http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=20745
Referitor la compoziția chimică a extractelor din această specie, există puține date. Astfel, în medicina tradițională chinezească, această specie prezintă efecte benefice asupra hipertensiuneii arteriale, printre altele având și proprietăți antimicrobiene, antihelmitice și antioxidante (Ozen, 2010; Temelie, 2006). Principiile active responsabile de efectele terapeutice se presupun a fi: L-triptofan, rutin, α-spinasterol, β-sitosterol, kaempferol-3-O-rutinozid, stigmasterol, acidul N-triaconatanoic (Kalinova, 2009). De asemenea, Amaranthus retroflexus L. conține uleiul volatil în urme (Temelie, 2006).
S-a demonstrat că proprietățile antioxidante ale extractului metanolic din frunze se datoreaza nerolidolului polihidroxilat, având o capacitate mare de neutralizare a radicalilor liberi, acționând astfel ca antilipoperoxidant (Pacifico, 2008).
Fig. 4. Zone afectate de invazia speciei A. retroflexus, hartă furnizată de Comisia Europeană prin intermediul proiectului DAISIE (http://www.europe-aliens.org/aboutDAISIE.do)
Date generale asupra speciei Phytolacca americana
Phytolacca americana (cârmâz) este o plantă ierboasă perenă, nativă din estul Americii de Nord (Ravikiran, 2011) introdusă în Europa pentru industria de coloranți alimentari. S-a instalat în habitatele ruderale, devenind sub-spontană. Suportă un grad ridicat de luminozitate. Această specie a fost introdusă decurând în categoria plantelor invazive fiind identificată în zonele: Timișoara, Maramureș, Crișana, Banat, Muntenia, Oltenia, Moldova și Dobrogea (Anastasiu, 2008).
* http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=19523
Unele triburi de amerindieni foloseau fructele de cârmâz pentru eliberarea trupului de spiritele rele, de fapt avea loc o detoxifiere datorită efectelor laxativ și emetic. Phytolacca radix se folosea în medicina traditionala, în doze mici pentru tratamentul ulcerelor și urticariilor. Administrarea în doze mari și repetate au condus la efectele toxice, datorate alcaloizilor (Krochmal, 1970).
Fig. 5. Zone afectate de invazia speciei Phytolacca americana, hartă furnizată de Comisia Europeană prin intermediul proiectului DAISIE (http://www.europe-aliens.org/aboutDAISIE.do)
Radacina conține alcaloidul fitolacacina, ulei volatil, saponine și un sterol. Frunzele conțin saponine triterpenice iritante și antiinflamatoare, flavonoide și un procent ridicat de vitamine: C, complexul B, PP. Din herba s-a izolat o proteină antivirală. Extractele din frunze și rădăcini au acțiune hipotensoare (Temelie, 2006; Ravikiran, 2011).
Date generale asupra speciei Artemisia annua
Artemisia annua L. (pelinita) este o plantă anuală, originară din Asia (Follak, 2013). Această specie are o strategie de propagare caracterizată printr-un grad ridicat de plasticitate morfologică și de reproducere, producând anual un număr mare de semințe și devenind astfel o specie invazivă în majoritatea statelor din Europa (Pysek, 2002) (Fig. 6).
Proprietățile terapeutice tradiționale ale acestei specii în medicina chinezească datează înainte de 168 î.Hr. În timp, s-au descoperit și izolat numeroase principii active precum monoterpenoide, sesquiterpenoide, flavonoide, cumarine și compuși alifatici și lipidici. Artemisinina, compusul considerat responsabilă pentru majoritatea proprietăților biologice (în special, antimalarice), este o sesquiterpen-lactonă cu o punte endoperoxidică. Eficacitatea infuziilor din A. annua în tratamentul malariei, la ora actuală, este discutabilă (Cavar, 2012).
* http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=35448
Conform studiilor anterioare (Bilia, 2014) s-a observat că uleiul volatil are o compozitie variabilă in functie de originea fitogeografică la nivel global, diferențele majore s-au observat pentru cele trei componente principale, și anume, artemisia cetonă, 1,8-cineol, camfor, prezentând un spectru larg de activitate antimicrobiană în special asupra tulpinilor: S. aureus, S. pneumoniae, E. coli, H. influenzae, P. aeruginosa, C. albicans, C. krusei.
Pe lângă activitatea sa împotriva malariei, extractele de A. annua prezintă, de asemenea efectele anti-inflamatore, antipiretice, antitumorale, antifungice, antiparazitare, antiulcerogenice și citotoxice. Compușii majoritari ai uleiului volatil obținut din herba sunt camfor, artemisia cetonă, D-germacren și 1,8-cineol (Brown, 2010).
Fig. 6. Zone afectate de invazia speciei Artemisia annua, hartă furnizată de Comisia Europeanăprin intermediul proiectului DAISIE (http://www.europe-aliens.org/aboutDAISIE.do)
Date generale asupra speciei Amorpha fruticosa
Amorfă arbustivă (Amorpha fruticosa L.) este un arbust alohton invaziv, originar din sud-vestul Americii de Nord. A fost aclimatizat în Europa ca arbust ornamental, observându-se în timp caracterul său invaziv-agresiv (Dumitrașcu, 2011). S-a observat pe malurile Dunării și chiar ale unor râuri din Muntenia, Moldova și Transilvania formând comunități monodominante prin înlocuira salciei (Salix triandra) (Anastasiu, 2007) (Fig. 7).
* http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=25368
Din uleiul volatil extras din fructele coapte de A. fructicosa s-au identificat aprox. 46% monoterpene hidrocarbonate, 46% sesquiterpene hidrocarbonate și 8% sesquiterpene oxigenate, principalii constituenți fiind α-pinen, mircen și δ-cadinen. (procentul de ulei volatil fiind de aproximativ 0.45% fructe umede și respectiv 1,36 % fructe uscate). Principalii compuși obținuți din uleiul volatil din flori sunt: α-eudesmol, β-eudesmol, δ-cadinen și (E)-nerolidol (Lis, 2001).
Extractul acetonic din rădăcinile de Amorpha fruticosa prezintă o acțiune inhibitorie asupra neuraminidazei bacteriene, clasă de compuși responsabili de acest efect fiind rotenoizii constituenți (Ryu, 2010). Compușii identificați sunt: flavanone prenilate, izoflavone, rotenoide și stilbene. Mulți dintre acești compuși prezintă activități antitumorale, antimicrobiene și activitate inhibitorie asupra TNF-α (Kim, 2011).
Fig. 7. Zone afectate de invazia speciei Amorpha fructicosa, hartă furnizată de Comisia Europeană prin intermediul proiectului DAISIE (http://www.europe-aliens.org/aboutDAISIE.do)
I.2.3. Plante alohtone cu grad minimal de invazivitate
Plantele alohtone cu grad minimal de invazivitate sunt specii adventive, care au fost semnalate atât în România cât și în ariile învecinate ca fiind plante cu grad de invazivitate ridicat, dar cu o distribuție relativ restrânsă, astfel încât nu prezintă un pericol din punct de vedere conservaționist. Aceste specii nu formează hibrizi cu speciile native habitatului. Nu prezintă substanțe cu caracter alelopatic. Nu produc schimbări în ciclul de nutrienți, exemple de astfel de specii în Romania sunt: Akebia quinata (Houtt.) Decne (As), Alternanthera philoxeroides (Mart.) Griseb. (Am S), Andropogon virginicus L. (Am N C), Asparagus asparagoides (L.) Druc (Afr S), Carpobrotus edulis (L.) N. E. Br. (Afr), Hygrophila polysperma (Roxb.) T. Anderson (As), Myriophyllum aquaticum (Vell.) Verdc (Am S), Nassella trichotoma (Nees) Hack. ex Arechav (Am S), Solidago nemoralis Aiton (Am N) (Blackburn, 2014; Sîrbu, 2012).
I.2.4. Caracterul fitotoxic al plantelor invazive
Una dintre ipotezele principale pentru succesul invaziei de specii alohtone constă în eliberarea de compuși chimici care au efecte nocive asupra comunităților vegetale native (substanțe alelopatice) (Csiszar, 2009). Cel mai important aspect al substanțelor alelopatice constă în producerea și eliberarea în mediu a unor compuși fitotoxici pentru unele specii vegetale. Inderjit și colab. (2011) au sugerat că producția și eliberarea substanțelor alelochimice stau la baza mecanismelor fundamentale de comportament ale plantelor invasive și care în final influențează cele mai multe aspecte ale ecologie florei native (Smith, 2013).
Interacțiunile alelopatice între diferitele specii de plante din ecosistemele naturale și agroecosisteme reprezintă o formă de concurență care implică inhibarea germinării semințelor sau a răsadurilor. Astfel de interacțiuni pot modifica comunitățile de plante autohtone (Soltys, 2012). Speciile non-native prezintă capacitatea de a se stabilii, de a se răspândii și de a invada cu succes mediile în care acestea nu au fost anterior expuse. Deoarece mediile invadate sunt noi, speciile alohtone nu ar trebui să se adapteze specific pe aceste teritorii, datorită lipsei de istorie evolutivă, însă un număr mare dintre aceste specii în cele din urmă ajung să domine noile habitate atât în termeni de abundență numerică cât și în biomasă. Prin urmare, acești "invadatori" produc substanțe chimice alelopatice la care speciile native nu se pot adapta ("novel weapons"). Aceste fito-chimicale pot inhiba germinarea, creșterea sau chiar reproducerea speciilor autohtone și pot persista în soluri mai mulți ani (Smith, 2013).
Factorii biotici și abiotici pot influența atât producția substantelor alelochimice ale speciilor donoare cât și modificarea efectului acestora la nivelul speciei receptoare (Fig. 8). Influența unor factori precum: lumina, disponibilitatea nutrienților și a apei, tratarea cu pesticide și boala, pot influența cantitatea de compuși alelochimici ai unei plante (Reigosa, 1999; Inderjit, 2011).
Fig. 8 Producerea de substanțe alelopatice în condiții de stres (dupa Kim, 2003)
Experiențele in vitro au evidențiat că alcaloizii pot fi considerați substanțe "polivalente" de apărare pentru speciile de plante invasive și eliminarea speciilor autohtone. Un exemplu este gramina (alcaloid indolic identificat în speciile din genul Hordeum), toxic pentru mamifere, insecte, bacterii, fungi patogeni și pentru alte plante. Activitatea biologică diversificată a graminei ar putea fi explicată prin efectele sale asupra metabolismului energetic, deoarece inhibă foto-fosforilarea, reacția de schimb Pi-ATP, gradientul de protoni și crește transportul de electroni în membranele tilacoide (Grün, 2005). Mai mult, s-a sugerat, că acești compuși pot să influențeze una, sau mai multe ținte moleculare de bază, fiind de asemenea capabile să influențeze o gamă largă de organisme (Kruse, 2000).
În mod similar, Gallet & Pellisier (1997) susțin că rolul compuși fenolici produși de o plantă cu activitate alelopatică, necesită o abordare ecosistemică, deoarece sunt toxici față de alte organisme, ca de exemplu, microbiota și animalele din sol (Kruse, 2000).
Analiza terpenoidelor a ilustrat faptul că această clasă de compuși produsă de o plantă are efecte multiple: 1) inhibarea germinării semințelor; 2) apărare împotriva ierbivorelor; 3) apărare împotriva insectelor, respectiv, fungilor patogeni; 4) atragerea polenizatorilor; 5) inhibarea dezvoltării bacteriilor din sol (Inderjit, 2011).
În cele mai multe experimente de cercetare agricolă, efectele compușilor alelochimici sau ale plantelor alelopatice au fost testate pe diferite specii de buruieni sau plante cultivate care ar putea fi influențate de aceste substanțe ajungându-se la concluzia că dicotiledonatele au fost mai sensibile decât monocotiledonatele la substanțele alelopatice eliberate de diferite specii de plante. Caracteristicile organelor de reproducere (dimensiunea semințelor și permeabilitatea învelișului) pot influența absorbția și efectele acestor substanțe asupra germinării semințelor. În testele de germinare, plantele cu semințe mici au fost mai sensibile decât cele cu semințe mari, la o concentrație dată de substanțe alelopatice (Kruse, 2000).
Au fost emise mai multe ipoteze cu privire la mecanismul de acțiune al substanțelor alelopatice de natură fenolică asupra celulelor vegetale (Li, 2010):
1. Modificări în permeabilitatea membranei și inhibarea asimilarii nutrienților: compușii polifenolici pot duce la creșterea permeabilității membranei celulare. Prin urmare, conținutul celular este eliberat și crește peroxidarea lipidelor. Fenolii alelochimici pot inhiba, de asemenea, absorbția nutrientilor, influențând dezvoltarea normală a plantelor
2. Inhibarea diviziunii celulare, a alungirii radiculare și modificarea structurii microscopice: compușii fenolici alelochimici pot inhiba alungirea radiculară, diviziunea celulară, induc modificări ultrastructurale ale celulei, cu influențe negative asupra creșterii plantei. Li și colab. (1993) au constatat că cumarina inhibă semnificativ alungirea rădăcinii de salată verde (Lactuca sativa L.) și crește grosimea cortexului radicular.
3. Efecte asupra fotosintezei și respirației: Impactul alelochimicalelor fenolice asupra respirației plantelor constă în scăderea capacității de absorbție a oxigenului, iar impactul asupra fotosintezei implică reducerea conținutul în clorofilă și a ratei de fotosinteză.
4. Efecte asupra diferitelor funcții și activități enzimatice: alelochimicalele fenolice intră prin membrana celulelor vegetale și permit astfel schimbarea activității și funcția unor enzime. Rezultatele anterioare (Addisie, 2012) au demonstrat următoarele mecanisme enzimatice: acidul clorogenic, acid cafeic și catecholul pot inhiba activitatea fosforilazei; acidul cinamic și derivații săi pot inhiba hidroliza ATP-azei; acidul tanic poate inhiba peroxidaza și catalaza. Unele dintre cele mai recente studii au raportat că fenolii pot afecta activitățile de peroxidază și fenilalaninamonioliză (Li, 2010).
5. Efecte asupra sintezei hormoniilor endogeni: substanțele fenolice pot reduce sau inactiva activitatea fiziologică a fitohormonilor, care pot inhiba procesul fiziologic normal al plantelor.
6. Efecte asupra sintezei proteinelor: unii fenoli (acidul ferulic, acidul cinamic) pot inhiba sinteza proteinelor (He, 2001). S-a demonstrat că substanțele fenolice din O. sativa pot inhiba transportul de aminoacizi și sinteza de proteine. Toți fenolii modifică starea fizică a ADN și ARN (Zeng, 2001). În marea majoritate a cazurilor, compușii fenolici se găsesc în amestec cu alți compuși. Prin urmare, contribuția alelopatică a compușilor fenolici este dată de un efect sinergic (Li, 2010).
O serie de modificări fiziologice și biochimice în plante induse de compușii fenolici sunt prezentate în Fig. 9 (Wang, 2006).
Diviziune celulară și alungire radiculară
Stagnarea cresterii plantelor
Fig. 9 Mecanisme de acțiune ale substanțelor alelopatice la nivelul celulei vegetale (adaptată după Wang, 2006)
CAPITOLUL II
Biosinteza și principalele proprietăți biologice ale terpenelor și compușilor polifenolici specifici plantelor invazive
Studiile de fitochimie asupra extractelor din plante, în general, sunt îndreptate către izolarea și identificarea componentelor din amestecurile complexe în scopul stabilirii corelațiilor structură-activitate biologică (respectiv rol fiziologic și/sau ecologic, baze pentru studiile de farmacognozie) și doză-efect. Acțiunea terapeutică a extractelor vegetale rezultă din combinarea proprietăților terapeutice comune și specifice anumitor constituenți. Proprietățile terapeutice ale acestor extracte includ: efectele antiinfecțioase, antitumorale, antioxidante, imunomodulatoare, acțiunea asupra sistemului nervos central, asupra sistemului cardiovascular; aceste efecte se datorează fie anumitor fitocompuși, fie în urma unei acțiuni sinergice. De fapt, spectrul acțiunilor terapeutice reunește proprietăți care se manifestă selectiv și modulat asupra tuturor organelor și sistemelor organismului uman (Cercasov, 2004).
Între structura chimică, conformația spațială și influențele electronice ale constituenților extractelor vegetale, pe de o parte și activitatea lor biologică pe de altă parte, există o strânsă legătură. Cunoașterea acesteia este de o deosebită importanță, deoarece permite explicarea, confirmarea și anticiparea activității farmacologice a acestor substanțe naturale.
Astfel, în capitolul de față sunt prezentate principalele căi de biosinteză ale claselor de compuși bioactivi din plante, transformări ce furnizează informații valoroase pentru latura practică a farmaognoziei. Identificarea și determinarea cantitativă a principiilor active de-a lungul perioadei de vegetație a plantelor, conduc la aflarea timpului sau a fazei de dezvoltare, în care biosinteza lor înregistrează valorile maxime. Datele de literatură asupra speciilor invazive sunt incerte în special asupra compoziției chimice și a posibilelor acțiuni terapeutice cât și a perioadei optime de recoltare, cel din urma aspect fiind definitoriu.
Plantele invazive în general sunt plante verzi, adică cu pigment fotosintetizant, clorofila, astfel în urma procesului de fotosinteză se sintetizează și se acumulează o serie de substanțe care migrează spre zonele de creștere cu rol în sporirea biomasei. Substanțele astfel sintetizate implică substanțe organice ce se consumă în procesul de respirație celulară, restul de substanțe se depun în organele de rezervă și fructe (Gherghi, 2001).
Biosinteza substanțelor în plante se realizează în cicluri biochimice localizate în diverse organite celulare. În urma fotosintezei, la plantele verzi se biosintetizează glucidele (trioze și hexoze) care reprezintă precursori pentru biosinteza celorlalte substanțe organice caracteristice plantelor – organisme autotrofe fotosintetizante. O altă categorie de precursori sunt intermediarii rezultați din procesele de biodegradare a substanțelor organice de rezervă, aceștia având diferite roluri în viața plantelor precum substanțe plastice, fitohormoni sau substanțe secundare excretate (Burzo, 2005).
Metabolismul plantelor constă din biosinteze ce se desfășoară în cadrul organismului vegetal conducând la formarea unei mari varietăți de molecule din categoria glucidelor, aminoacizilor, acizilor grași, nucleotidelor și a polimerilor derivați de la acestea. Totalitatea acestor reacții formează metabolismul primar, iar compușii respectivi, care sunt esențiali pentru supraviețuirea plantei, sunt descriși ca metaboliți primari (Fig. 10) (Moța, 2004; Marienhagen, 2013).
Pe lângă metaboliții principali ce asigură viabilitatea plantei, plantele produc o multitudine de compuși organici, cunoscuți ca metaboliți secundari, care nu participă în mod direct la creșterea și dezvoltarea plantelor. Multe din funcțiile lor sunt necunoscute, deși sunt remarcabile prin complexitatea structurilor lor chimice și a căilor de biosinteză. Interesul pentru fitochimie a fost totuși un subiect important de cercetare în chimia organică, dar și în chimia analitică, proprietățile și structura chimică a metaboliților secundari, dar și a metaboliților primari, au stimulat dezvoltarea tehnicilor de separare, a abordărilor spectroscopice pentru elucidarea structurii și a metodologiilor sintetice care constituie acum baza chimiei organice contemporane. Recunoașterea proprietăților biologice ale compușilor naturali a condus la creșterea interesului în acest domeniu, și anume, căutarea de noi medicamente, antibiotice, insecticide, erbicide etc. Această apreciere tot mai mare a diverselor efecte biologice ale compușilor naturali a determinat o reevaluare a posibilelor roluri pe care acești compuși le joacă în plante, în special în contextul interacțiunilor ecologice (Croteau, 2000).
Mulți dintre acești compuși sunt recunoscuți în prezent ca fiind implicați în apărarea plantelor, având rol insecticid, antimicrobian și repelent. În reproducere, acești compuși au rol de atractanți pentru polenizatori, dar și alelopatic. Aceste funcții ecologice afectează supraviețuirea plantelor, și se pare că metaboliții secundari din plante acționează în principal asupra altor specii, fiind cunoscut faptul că în cazul plantelor invazive se biosintetizează compuși ce impiedică dezvoltarea speciilor autohtone din zona clonală (Croteau, 2000).
Modul de sinteză al diferitelor clase de compuși de origine vegetală este prezent în Fig. 10; această schemă oferă o perspectivă teoretică a formării diferitelor grupuri de substanțe. În realitate nu există o împărțire exactă a diferitelor procese biochimice, ci ele se desfașoară concomitent, conform necesităților fiziologice ale plantei (Ciulei, 1993). Plantele produc o mare diversitate de metaboliți secundari, ca parte a unei strategii de apărare împotriva dăunătorilor, agenților fitopatogeni și a diferitelor forme de stres abiotic. Multe dintre aceste componente sunt stocate și apoi eliminate din structurile secretorii epidermice, numite trichomi glandulari (Besser, 2009).
II.1. Biosinteza și activitătile biologice ale terpenelor și terpenoidelor
Biosinteza terpenoidelor din plante depinde în mare măsură de fluxul a două căi ce produc difosfat izopentenil (IPP) și difosfat dimetilalil (DMAPP). Inițial s-a sugerat că prin calea mevalonatului (MVA), care se desfășoară în citosol, se obțin precursori, derivați de acetil-CoA, care sunt apoi transformați în sesquiterpene și triterpene, în timp ce calea 2-C-metil-d-eritritol-4-fosfat (MEP) localizată în plastide provine din derivați ai piruvatului de IPP și DMAPP pentru biosinteza hemiterpenelor, monoterpenelor, diterpenelor și tetraterpenelor (Newman, 1999).
Fig. 11Reprezentarea schematică a biosintezei din izopentenil-pirofosfat (IPP) și dimetilalil-pirofosfat (DMAPP) la diferiți precursori izoprenoidici prezenți în plante.
* ADS-amorfadienă sintază; AMO-amorfadienă oxidază; CPR-citocrom P450 reductază; FPP-farnesil-pirofosfat; GPP-geranil-pirofosfat; GGPP-geranilgeranil-pirofosfat; PS-fitoenă desaturază; TS-taxadienă sintază (după Marienhagen și colab., 2013)
Cu toate acestea, propunerile de elucidare a căilor de biosinteză a compușilor specifici sunt restrictive, reacțiile biochimice complexe implicate fiind probabil mult mai flexibile și variabile (Besser, 2009) (Fig. 11). Preniltransferaza catalizează condensarea IPP fie cu DMAPP (dimetilalildifosfat sintaza), GPP (geranil difosfat sintaza), sau FPP (farnesil difosfate sintetaza) în funcție de compuși ce urmează a fi biosintetizați (Davis, 2000; Marienhagen, 2013). Din FPP se formează sesquiterpenele și squalenul. Din geranilgeranilpirofosfat se sintetizează diterpenele, kaurenul care este precursorul giberelinelor, a acidului abscisic și fitoenul, care este precursorul pigmenților carotenoidici (Davis, 2000; Marienhagen, 2013).
Localizarea diferitelor etape ale procesului de sinteză ale terpenelor la nivel celular este dificilă, însă analiza RMN și marcarea C13 din poziția 1 a glucozei asimilată de plantă a permis discriminarea între originile metabolismului. Astfel, izopentil pirofosfatul poate fi biosintetizat în toate structurile celulare unde are loc sinteza terpenelor. Situsul specific pentru sinteza monoterpenelor îl constituie cloroplastele. Sinteza farnesil-pirofosfatului și a sesquiterpenelor derivate, precum și a triterpenelor incluzând fitosterolii, are loc în citoplasmă și la nivelul reticulului endoplasmatic. Diterpenele sunt biosintetizateîn plastide, unde a fost identificată activitatea geranilgeranil-pirofosfat sintazei. În cloroplaste a fost identificată activitatea ent-kauren sintazei care catalizează sinteza ent-kaurenului, precursorul citokininelor. Tot în cloroplaste se biosintetizează pigmentii carotenoidici și tocoferolii, iar ubiquinona este biosintetizată în mitocondrii și microzomi (Hemmerlin, 2012).
Dacă procesul de biosinteză a terpenelor este omniprezent la toate celulele vegetale, în cazul speciilor care au potențialul de a sintetiza cantităti mari de terpene, sinteza amestecurilor terpenice are loc în celule specializate, așa cum sunt canalele rezinifere din frunzele gimnospermelor, în general. În cazul plantelor angiosperme, monoterpenele sunt sintetizate, în general, în perii glandulari foliari, în petale sau pistilul florilor (Istudor, 2001).
II.1.1. Uleiuri volatile
Uleiurile volatile sunt secretate de celule specializate, fiind produși ai metabolismului secundar vegetal, repartizați în diferite organe și depozitați în vacuole, pungi sau canale secretorii, ori în peri granulari, sub formă de lichide uleioase, volatile, cu miros plăcut, aromat (Istudor, 2001). Principalele clase de compuși specifice uleiurilor volatile sunt derivații izoprenoidici, și anume: monoterpenele și sesquiterpenele hidrocarbonate și oxigenate (terpenoide); acești compuși prezintă diferite proprietăți terapeutice.
II.1.1.1. Monoterpene și monoterpenoide
Monoterpenele sunt o clasă de terpene care conțin două unități izoprenice cu formula moleculară C10H16. Monoterpenele pot fi aciclice sau ciclice. Derivații oxigenați ai hidrocarburilor terpenice cu același număr de atomi de carbon în moleculă se numesc monoterpenoide. În decursul anilor cercetările în domeniu au condus la identificarea câtorva sute de monoterpenoide în extractele obținute din plantele superioare. Acestea se pot găsi atât în stare libera cât și conjugate ca esteri sau β-D-glicozide (Ciulei, 1993, Guimaraes, 2013).
Gena care codifică NDPS1 (neril difosfat sintază 1) reglează activitatea enzimatică pentru formarea NPP (neril difosfat), având ca intermediar în calea de biosinteză un prenil difosfat cu configurație cis. De asemenea, NPP în prezență de PHS1 (felandren sintază 1) conduce la formarea monoterpenelor. Deși PHS1 catalizează și reacțiile ce pornesc de la GPP (geranil difosfat), recent s-a demonstrat că există mai puțin GPP în trichomi decât NPP, observând-se, astfel, slaba afinitate a PHS1 pentru GPP. Fitocompușii obținuți prin intermediarul NPP, catalizat de PHS1 sunt β-felandrenul, precum și majoritatea monoterpenelor ciclice, iar cea mai mare parte a monoterpenelor aciclice au ca precursor GPP (de exemplu, mircen, ocimen și linalool) (Besser, 2009).
Diferențele de produși formați în prezența enzimei PHS1 pornind de la NPP și GPP pot fi explicate prin mecanismul de reacție dat (Fig. 13). NPP se ionizează la un cation neril, care se izomerizează la un cation α-terpinil. Transformările acestui intermediar ciclic, catalizate de PHS1, conduc la produși de reacție diferiți. Din precursorul GPP se poate forma un cation intermediar linalil (reacție catalizată de PHS1) (Fig. 13). Deși cationul linalil poate suferi o izomerizare trans-cis, conducând la cationul neril, se pare că se formează cantități substanțiale de terpene aciclice precum mircen, ocimen și linalool – formate direct din cationul linalil. Studiile sugerează că PHS1 catalizează convertirea cationului neril doar la α-terpinil, deoarece nu se obțin monoterpene aciclice in vitro sau in vivo din intermediarul NPP (Besser, 2009).
Fig. 13 Calea biosintetică a diferitelor monoterpene pornind de la neril difosfat și geranil difosfat (Besser, 2009)
II.1.1.2. Sesquiterpene și sesquiterpenoide
Sesquiterpenele sunt o clasă de terpene, care conțin trei unități izoprenice și au formula moleculară C15H24. La fel ca la monoterpene, sesquiterpenele poate fi aciclic sau ciclice, existând multe combinații unice specifice taxonului. Modificările biochimice, cum ar fi oxidarea sau izomerizarea produc sesquiterpenoidele aferente (Fig. 14). Sesquiterpenele se găsesc în mod natural în plante și insecte, ca semichimicale, de exemplu, agenții defensivi sau feromoni (Ciulei, 1993).
Lactonele sesquiterpenice constituie un grup mare și divers de compuși biologic activi prezenți în plante care posedă activitate antiinflamatoare și antitumorala. Germacranolidele, una din subclasele sesquiterpenelor, sunt cele mai importante grupuri din punct de vedere terapeutic. Spre exemplu, partenolidele sunt extrem de citotoxice, însă se află în studii clinice în vederea obținerii unor noi agenți anti-tumorali (Kreuger, 2012).
Mecanismele electrofile pentru formarea C15 a sesquiterpenelor din FPP se aseamănă foarte mult cu cele folosite de monoterpen-sintazele prezentate în subcapitolul anterior: II.1.1.1. Monoterpene și monoterpenoide, deși creșterea flexibilității lanțului farnesil cu 15 atomi de carbon elimină necesitatea izomerizării preliminare cu excepția formării compușilor de tip ciclohexanoid. Cea mai cunoscută biosintază a sesquiterpenelor de origine vegetală este sinteza epiaristolochenelor din tutun. Epiaristolochen-sintaza este o enzimă ce produce ciclizarea FPP și catalizează migrare gruparilor metil pentru a da precursori olefinici de fitoalexin capsidiol. Vetispiradien sintaza din cartofi formează precursorul olefinic lubimin fitoalexin, în timp ce δ-cadinen sintaza din bumbac este precursor olefinic de formare a gosipolului, compus cu funcție biologică de apărare, fiind studiat în prezent ca mijloc de contracepție masculin. Unele sesquiterpene sintaze implicate în producția de rășină în cazul coniferelor sunt capabile să producă mai mult de 25 de olefine diferite (Croteau, 2000).
Diversitatea structurală și diversele potențiale activități biologice ale sesquiterpenelor, cum ar fi cele anticancerigene, antiinflamatoare, antitumorale, anti-malarice, antivirale, antibacteriane, antifungice etc. au crescut interesul cercetatorilor pentru descoperirea unor noi alternative medicamentoase (Chaturvedi, 2011).
Fig. 14 Mecanismele de reacții chimice care conduc la formarea sesquiterpenelor (McCaskill, 1997)
*DMAPP = dimetilalil difosfat, IPP = izopentenil difosfat
II.1.1.3. Principalele proprietăți biologice
Activitatea antimicrobiana a uleiurilor volatile
De-a lungul timpului s-au propus diverse mecanisme de acțiune pentru uleiurile volatile asupra celulelor microbiene. Astfel uleiurile volatile pot afecta atât peretele celular, cât și componentele intracitoplasmatice. Caracterul lor hidrofob se pare ca este responsabil pentru perturbarea structurilor bacteriene care conduc la creșterea permeabilității membranei citoplasmatice. Mecanismele de acțiune ale uleiurilor volatile includ degradarea peretelui celular, deteriorarea membranei citoplasmatice, coagularea citoplasmatică, deteriorarea proteinelor membranare, creșterea permeabilității conducând la pierderea conținutului celular și reducând astfel forța proton- motrice, a ATP intracelular prin scăderea sintezei de ATP și creșterea hidrolizei și a potențialul de membrană prin creșterea permeabilității acesteia. Astfel în fig. 15 sunt descrise câteva mecanisme potențiale de acțiune ale uleiurilor volatile și țintele celulare pentru activitatea lor antimicrobiană. Cu toate acestea, fiecare dintre aceste acțiuni nu pot fi considerate evenimente separate, dar în schimb pot fi o consecință a celorlalte activități (Nazzaro, 2013a).
Fig. 15 Principalele mecanisme de acțiune și site-urile țintă ale uleiurilor volatile asupra celulelor microbiene (adaptată după Nazzaro și colab., 2013a)
Mecanismele de acțiune ale uleiurilor volatile:
1. Efectul asupra profilului acizilor grași din constituția membranei celulare: adaptarea celulelor la o concentrație mai mică decât concentrația minimă inhibitorie ar putea duce la o creștere a procentului de acizi grași nesaturați responsabili de fluiditatea membranei, prin tehnica SEM observându-se modificările structurale ale membranei (Nazzaro, 2013a). În cazul acțiunii terpenelor fenolice precum, timolul, carvacrolul și eugenolul, s-a observat creșterea concentrației de acizi grași saturați C16 și C18, și scăderea producției de acizi grași nesaturați C18 (Di Pasqua, 2007).
2. Acțiunea asupra proteinelor, ce are ca și consecință perturbarea diviziunii celulare (ex. cinamaldehida, timol, eugenol, carvacrol). Timolul poate afecta, de asemenea, și expresia de proteine implicate în metabolismul energetic (Nazzaro, 2013a).
3. Efectul asupra producereii de ATP și ATPază. Producția de ATP la procariote are loc atât în peretele celular cât și în citosol prin glicoliză. Uleiurile volatile perturbă membrana celulară și modifică echilibrul ATP intra- și extracelular, astfel încât ATP se pierde prin membrana dezorganizată. Acest efect s-a observant pentru terpenele cu structură fenolica asupra tulpinilor E. coli și L. monocytogenes (Nazzaro, 2013a).
4. Efectul asupra metabolomului. Metabolomul intra- și extracelular prezintă numeroase avantaje fundamentale prin oferirea de informații importante supra genomicii functionale, ingineriei metabolice, caracterizarea tulpinii și mecanismul de comunicare celulară. Metaboliții microbieni se pot schimba în funcție de condițiile de mediu. Recent, mai multe abordări analitice, inclusiv RMN, microarray, GC-MS, LC-MS, s-au folosit pentru a analiza metabolomul bacteriilor supuse la stres. Aceste tehnici sunt tot mai mult utilizate pentru a investiga efectele metabolice ale moleculelor naturale cu activitate bacteriostatică și / sau bactericidă (Nazzaro, 2013a).
5. Afectarea morfologiei celulare. Activitatea uleiurilor volatile și a componentelor acestora diferă în funcție de forma bacteriilor studiate, astfel s-a raportat că bacilii sunt mai sensibili la uleiurile volatile decat cocii. Pentru tulpinile S. typhimurium și E. coli care au o formă bacilara cu o suprafață netedă, respectiv cele de M. luteus și S. aureus care au o formă coccoid normal, după 24h de tratament cu ulei volatil de mentă, leziunile celulare ale bacililor au fost mai pronunțate în comparație cu bacteriile în forma cocoid (Nazzaro, 2013a).
6. Activitatea anti-Quorum Sensing. În acest sens uleiurile volatile pot reprezenta cel mai bogat rezervor disponibil de noi agenti terapeutici. QS bacterian poate fi inhibat prin diferite mecanisme, incluzând (1) inhibarea sintezei AHL, (2) inhibarea transportului și / sau secreției AHL, (3) sechestrarea AHLs, (4) acțiunea antagonistă și (5) inhibarea țintelor din aval ale receptorului de legare AHL. Diferite uleiuri volatile din plantele ornamentale au fost eficiente împotriva biofilmelor formate de Salmonella, Listeria, Pseudomonas, Staphylococcus și Lactobacillus sp. (Nazzaro, 2013b).
Efectul anti-inflamator al uleiurilor volatile
Pentru uleiul volatil de Ocimum sanctum este cunoscut faptul că posedă activitate împotriva reacțiilor inflamatorii, alte exemple de astfel de plante cu activitate antiinflamatoare sunt Baphia nitida, L. angustifolia, Mentha sp. și Eucalyptus sp. Uleiurile volatile de eucalipt, rozmarin, lavandă, pin și cuișoare prezintă capacitatea de prevenție a reacțiilor inflamatorii. Uleiurile volatile de Aloe barbadensis, Illicium verum, Citrus aurantium, Cinnamomum zeylanicum, Juniperus communis, Lavandula officinalis, T. vulgaris și Cananga odorata posedă activitate anti-inflamatorie. Activitățile lor sunt mediate prin mecanisme cum ar fi, inhibarea lipoxigenazei, prevenirea sintezei de leucotriene, inhibarea enzimei COX-2, inhibarea citokinelor pro-inflamatorii, IL-1β și factorul de necroză tumorală α, precum și represiunea genelor pro-inflamatorii (Raut, 2014). Un alt exemlu este uleiul volatil de ghimbir, acesta are capacitatea de a modula funcția limfocitară și răspunsul imun celular. Astfel acest uleiul volatil influențează atât răspunsul imun cât și proliferarea nespecifică a limfocitelor T, și poate exercita astfel, efecte benefice într-o serie de afecțiuni, precum inflamația cronică și bolile autoimune mediate celular (Zhou, 2006).
Activitatea antioxidanta a uleiurilor volatile
Radicalii liberi și speciile reactive ale oxigenului provocă oxidarea biomoleculelor incluzând proteine, aminoacizi, lipide nesaturate și ADN, și în cele din urmă produc modificări moleculare legate de îmbătrânire, ateroscleroză și cancer, boala Alzheimer, boala Parkinson, diabet și astm. Corpul uman conține un sistem de apărare care poate neutaliza radicalii liberi prezenți în aproape toate celulele. În urma unui dezechilibru între producția de radicali liberi și îndepărtarea lor prin sistemul antioxidant al organismului duce la un fenomen cunoscut sub numele de "stres oxidativ". În această situație, o sursă externă de antioxidanți este necesară pentru a asigura un echilibru între radicalii liberi și antioxidanți (Edris, 2007).
Uleiurile volatile, ca surse naturale de compuși fenolici, prezintă activitate prezintă capacitatea de a neutraliza radicalii liberi. S-a observat că uleiurile volatile cu un conținut ridicat de timol, carvacrol și α-tocoferol prezintă activitate antioxidantă foarte bună însă inferioară acidului ascorbic (Özkan, 2011). Activitatea antioxidantă a uleiurilor volatile nu poate fi atribuită numai prezenței componentelor fenolice; monoterpenele alcoolice, cetonice, aldehidice, hidrocarbonate și eterice din compoziția uleiurilor volatile, de asemenea, contribuie la activitatea de neutralizarea radicalilor liberi (neral / geranial, citronelal, izomentonă, mentona, α-terpinen, γ-terpinen, α-terpinolene, linalool și 1,8-cineol). Prin urmare, uleiurile volatile pot fi considerate potențiali antioxidanți naturali ce ar putea fi utilizați ca suplimente zilnice sau aditivi necesari în prevenirea stresului oxidativ și care ar putea contribui la evitarea multor boli degenerative (Edris, 2007).
Activitatea antitumorala a uleiurilor volatile
Pentru geraniol s-a raportat că prezintă capacitatea de a interfera cu funcțiile membranare, cu căile de semnalizare și cu inhibarea sintezei de ADN, reducând astfel dimensiunea tumorilor de colon. Eudesmolul, o sesquiterpenă biciclică hidroxilată, și-a găsit utilizare în prevenirea formării tumorilor maligne. Terpenoidele previn proliferarea celulelor tumorale prin necroză sau apoptoză. Limonenul s-a dovedit că inhibă hepatocarcinogeneza la șoarece. Amestecurile de compuși volatili pot avea un efect sinergic datorită complexității compoziției chimice. Astfel, uleiul volatil de Melissa officinalis s-a dovedit activ asupra unei serii largi de linii celulare tumorale umane și de șoarece. Uleiul volatile de Myristica fragrans prezintă activitate hepatoprotectoare. Uleiul volatil de Eugenia caryophyllata inhibă proliferarea celulelor canceroase. Uleiul volatil de A. annua produce apoptoza culturilor celulare de hepatocarcinom. Uleiul volatil de Tetraclinis articulate oferă prevenție în formarea melanomului, cancerului ovarian și de sân. Prin urmare, uleiurile volatile conțin compuși care reduc formarea celulelor canceroase și, prin urmare, pot fi utilizate în prevenția dezvoltării tumorilor maligne (Raut, 2014).
Toxicitatea uleiurilor volatile
Uleiurile volatile au ca principală țintă de acțiune membrana citoplasmatică (perturbarea și permeabilizarea membranei celulare). Permeabilizarea membranei celulelor eucariote duce la moartea acestora prin necroză și apoptoză. În general, alcoolii, aldehidele și compușii cu structură fenolică sunt responsabili pentru citotoxicitatea uleiurilor volatile și pentru efecte secundare nedorite, cum ar fi iritațiile și corozivitatea, sensibilizarea celulelor, absorbția percutanată, fototoxicitatea, carcinogenitatea și efectele teratogene, care limitează utilizarea acestora ca medicamente. Efectele toxice ale terpenoidelor cetonice sunt cunoscute, astfel, pentru estragol, prezent în uleiurile volatile de tarhon, anason verde și chimen dulce, s-a demonstrat efectul carcinogenic, iar atunci când sunt ingerate sau administrat intraperitoneal provoacă deteriorarea ADN la șoareci. Uleiul volatil de M. pulegium și componentele majoritare au efect hepatotoxic. Limonenul prezent în uleiurile volatile de citrice a fost evaluat prin administrare orală și peritoneală dovedindu-se astfel hepatotoxic și nefrotoxic (Raut, 2014).
Toxicitatea la om a fost observată în diferite situații, cum ar fi administrarea pe piele, ingestie accidentală și expunerea la produse industriale. Uleiurile volatile care au drept component principal citralul au provocat necroză celulelor histologice și vacuolizarea lor. Ingestia limonenului a provocat diaree și proteinurii la voluntarii sănătoși. De exemplu, 1,8-cineol, fencona, pulegona, tuiona, mentol, mentona și camforul exercită efecte toxice asupra oamenilor având ca efecte adverse: convulsii, necroză hepatică, demență, ataxie și halucinații. Unele uleiuri volatile, cum ar fi cele de Salvia sclarea și Melaleuca quinquenervia stimulează secreția de estrogen care pot determina cancere dependente de estrogen. Alteuleiuri volatile conțin molecule fotosintetizatoare, cum ar fi flavine, cianine, porfirine, hidrocarburi care pot provoca eritem pielii sau cancer. De aceea, pentru utilizarea acestor principii active în medicamente, trebuie avută în vedere concentrația de ulei volatil utilizat (Raut, 2014; Bakkali, 2008).
II.1.2. Caroteni și carotenoide
Carotenii sunt pigmenți ai frunzelor, fructelor și florilor cu nuanțe de galben ce sunt localizați în cromoplaste. În țesuturile vegetale atât carotenii cât și carotenoidele se află în stare liberă sau în combinație cu holoproteidele și glucidele. Cantitatea de pigmenți carotenoidici diferă funcție de natura speciei, perioada de recoltare și condițile de mediu (Rodriguez-Amaya, 2004; Moța, 2004).
Datorită structurii chimice de tetraterpenoide hidrocarbonate, carotenii sunt de natură hidrofobă, fiind astfel solubili numai în solvenți organici, uleiuri și grăsimi. Pigmenții carotenoidici prezintă o structură cu legături duble conjugate ce îi oferă un caracter nesaturat și instabilitate, în prezența aerului sau a radiațiilor luminoase se autooxidează. Carotenoidele, ca și terpenele, au ca unitate structurală repetitivă izoprenul și se împart în hidrocarburi carotenoidice și derivați oxigenați ai carotenilor, denumite carotenoide. Hidrocarburile carotenoidice sunt compuși cu 40 atomi de carbon, cu formula moleculară C40H56. Dintre acestea cele mai importante sunt: licopenul, α-carotenul, β-carotenul, γ-carotenul (Rodriguez-Amaya, 2004; Moța, 2004).
Licopenul este un compus cristalin, de culoare roșu-violet, solubil numai în solvenți organici, fiind principalul colorant al fructelor și tomatelor. Are capacitate puternic antioxidantă, studiile de specialitate punând în evidență efectele benefice asupa bolilor coronariene și prezint activitate anti-canceroasă (Rao, 2003; Gianetti, 2002).
α-Carotenul este o substanță cristalină ce oferă o colorație portocalie-roșiatică fructelor și legumelor. Prin încălzire, α-carotenul este posibil să izomerizeze în β-caroten. În plante se află în cantități mai mici decât β-carotenul, însă se pare că are activitate antitumorală de 10 ori mai mare decât β-carotenul (Lamson, 1999; Moța, 2004).
β-Carotenul este foarte răspândită în tot regnul vegetal și însoțește în permanență clorofila. Prin hidroliză enzimatică oxidativă, din β-carotenul se formează două molecule de vitamin A1 (Rodriguez-Amaya, 2004; Moța, 2004). β-Carotenul este principala provitamină A și prezintă activitate puternic antioxidantă, observându-se în testele clinice că în cazul pacienților nefumatori cu tuberculoză pulmonară, chimioterapia cu β-caroten îmbunătățește efectul antimicrobian al tratamentului (Plit, 1998).
γ-Carotenul este un compus cristalin de culoare roșie cu reflexe albastre. γ-Carotenul este puțin răspândit în regnul vegetal, fiind prezent în special în morcov (Moța, 2004).
Derivații oxigenați ai carotenilor sunt reprezentați de alcooli, cetone și acizi și se biosintetizează din hidrocarburile carotenoidice omoloage. Au fost identificați mulți reprezentanți ai aceste clase de compuși, cei mai importanți fiind: xantofilele, cetonele carotenoidice și acizii carotenoidici (Gherghi, 2001).
Xantofilele precum, luteina și zeaxantina, sunt derivați hidroxilici ai hidrocarburilor carotenoidice. Luteina se prezintă sub forma unor cristale de culoare galbenă cu luciu violet și însoțește, în permanență, β-carotenul și clorofila în toate plantele verzi. (Gherghi, 2001). Această clasă de compuși prezintă proprietăți fotoprotectoare (Jahns, 2012).
În Indonezia s-au cercetat pigmenții asociați algelor verzi Halimedasp., produse de bacteria Pseudoalteromonas piscicida, acești pigmenți au fost izolați și identificați ca fiind xantofile cu proprietăți antibacteriane asupra tulpinii patogene de Staphylococcus aureus (Radjasa, 2009).
Prima etapă în procesul de biosintetizare este mediată de GGPPS (geranilgeranil pirofosfat sintază), care constă în condensarea IPP cu DMAPP, compuși derivați de la MEP. Biosinteza este liniară de la fitoen până la licopen, cele trei etape sunt catalizate de enzime specifice. Licopenul este punctul de mijloc pentru biosintetizarea concomitentă a δ-caroten și γ-caroten, care se finalizează cu formarea compușilor luteina și respectiv, zeaxantina (fig. 16) (Farré, 2010).
Fig. 16 Reprezentarea schematica a biosintezei carotenoidelor în plante cu formarea ulterioară a xantofilelor (Farré, 2010)
II.2. Biosinteza și activitătile biologice ale agliconilor heterozidelor fenolice
Experimentele cu cloroplaste din frunzele de salcie (Salix sp.) au arătat că sinteza acizilor fenol-carboxilici și flavonoidelor este puternic stimulată de expunerea la lumină. Inhibitorii metabolici care deprimă activitatea de fotosinteză (simazină, diurone), afectează negativ biosinteza de flavonoide (Kavalier, 2013). Cloroplastele frunzelor au capacitatea de a localiza compușii fenolici, dintre care, unii compuși polifenolici sunt specifici numai acestor organite. Cloroplaste din frunzele aflate la începutul vegetației conțin mai mulți fenoli decât cloroplastele frunzelor aflate în perioada de maturitate. Lumina este o condiție obligatorie pentru a iniția sinteza fenolilor și acest lucru este indicat de lipsa de astfel de molecule în protoplastidele de etiolare din muguri (Kefeli, 2003). Lumina produce sinteza flavonolilor în cloroplaste și citoplasmă. Calconele și acizii fenolcarboxilici prezente în etiolatele din muguri pot fi considerate precursori metabolici ai flavonolilor sub influența luminii. În anumite compartimente celulare, precum vacuolele și peretele celular, polifenolii sunt compușii majoritari. Compușii fenolici care inhibă creșterea plantelor (derivații hidroxil ai acidului cinamic, cumarinei și naringeninei) sunt sintetizați în mod similar cu ceilalți polifenoli. Sinteza derivaților ce conduc la inhibarea dezvoltării plantelor precum acizii hidroxicinamici, urmează calea acidului shikimic: acid corismic – acid prefenic – acid cinamic – acid p-cumaric (Kavalier, 2013).
Conform teoriei dualismului metabolic al substanțelor fenolice, unii compuși pot inhiba sau stimula creșterea și sinteza de compuși indolici, în acest context acidul indolil-3-acetic devine principala auxină naturală (Kefeli, 2003). Prin urmare, indol-auxinele (indoleacetonitril) precum și inhibitorii fenolici (acid p-cumaric, cumarină, naringenin ș.a.) sunt precursori ai acizilor shikimic și corismic.
Flavonoidele sunt compuși polifuncționali în plastidele verzi îndeplinind trei funcții majore (Muzafarov, 1989):
• precursoare (utilizează polifenolii și produșii lor catabolici pentru alte tipuri de biosinteze);
• energetică (transportori de electroni și protoni, participă în schimburi ionice și la potențialul membranar, formare de radicali);
• reglatoare (implicarea în reacțiile enzimatice actionând ca inhibitori sau activatori).
În timpul fotosintezei în prezența luminii, flavonoidele modifică rata transportului de electroni și fosforilarea, conducând la schimbarea raportului ATP/NADPH (Kavalier, 2013).
În plus, flavonoidele exercită un control al feedback-ului asupra propriei biosinteze, cu toate că acest fenomen nu este clar înțeles. Însă biosinteza întregii structuri chimice a flavonoidelor în cadrul plastidelor nu a fost explicată, necunoscându-se pachetul complet enzimatic al biosintezei lor. Lipsa informațiilor asupra transportului de flavonoide în interiorul celulei și prin întreaga plantă constitue o altă provocare pentru descrierea mai exactă a funcțiilor lor. Varietatea compușilor fenolici prezenți simultan în interiorul celulelor par a fi în măsură să influențeze rata și direcția căilor metabolice în plante. Astfel, orice schimbare în structura flavonoidelor, sau compoziția calitativă a complexului fenolic provine dintr-o modificare a mecanismului ce intervine în procesele de schimb energetic la nivel celular (Kavalier, 2013).
Enzima responsabilă pentru hidroxilarea în poziția 3 a intermediarilor fenolici (formarea acidului cafeic din acid p-cumaric) este încă necunoscută. Folosind o proteină recombinantă exprimată în drojdii s-a determinat specificitatea de substrat a enzimei CYP98A3 care catalizează hidroxilarea activă în poziția meta a inelului fenolic, susbstratul specific fiind constituit din esteri shikimat și chinat (Fig. 17). Astfel, enzima CYP98A3 acționează ca o meta-hidroxilază a inelului fenolic care funcționează ca un 5-O-(4-cumaroil) shikimat / chinat-3’hidroxilază (C3’H). Această enzimă este în special responsabilă pentru ultima etapă a biosintezei acidului clorogenic, un acid fenolic foarte răspândit în plante. Pe lângă acești esteri shikimat și chinat s-au identificat și alți esteri 4-cumaroil (acid fenillactic) sau amide în prezența enzimelor de tip CYP98 (meta-hidroxilare) ce catalizează formarea derivaților de acid rosmarinic sau tiramină (Boudet, 2007).
Citocromul P450 este implicat într-o gamă largă de reacții. Unele dintre ele contolează reacțiile de biosinteză a acidului salicilic și derivații săi de benzoat sau hidroxilarea inelului-B al flavonoidelor. Activitatea din urmă este determinată de doi membri ai familiei citocromului P450, flavonoid 3’-hidroxilaza (F3’H) și flavonoid 3’,5’-hidroxilaza (F3’5’H). Analiza filogenetică a secvențelor cunoscute de F3’H și F3’5’H au indicat că F3’5’H a fost derivat de la enzima F3’H. Prin urmare, o dată cu scăderea concentrației enzimelor de tip F3’H s-a produs și creșterea nivelulului de acizi fenolici și flavanone. În timp ce creșterea concentrației enzimelor de tip F3’H a condus la scăderea concentrației de flavonoli, flavan-3-oli și procianidine (Kavalier, 2013). Enzimele citocromului P450 sunt în mare parte responsabile pentru diversitatea și flexibilitatea metabolismului fenolic și sunt importante în controlul fluxului de compuși fenolici (Boudet, 2007).
Fig. 17 Principalele căi de biosinteză a compușilor fenolici din tricomi glandulari de hamei pornind de la metabolitul primar L-fenilalanină; schemă generală de formare a acizilor fenolici, flavanone, flavan-3-oli și procianidine, flavanoli, flavan-4-oli și 3-deoxiflavan (imagine adaptată după Kavalier, 2013).
*PAL- fenilalanin-amoniu ligază, C4H- cinamat 4-hidroxilază, 4CL- coumarat coenzimă A ligază, CHS- calconsintază, CHI- calcon izomerază, F3H- flavonon-3-hidroxilază, F3’H- flavonon-3’-hidroxilază, DFR- dihidroflavanon reductază, LAR- leucocianidin reductază, PPO- polifenol oxidază(tirozinază), UGT- glucuronozil transferază
II.2.1. Activitatea antimicrobiană a compușilor fenolici
La ora actuală există relativ puține studii referitoare la acțiunea antimicrobiană a compușilor polifenolici. Astfel pentru flavonoide s-a realizat o corelație între structura chimică și proprietățile lor antimicrobiene, însă acești compuși pot viza diferite componente și funcții ale celulei bacteriene. S-a observat că flavanonele 2, 4- și 2, 6- dihidroxilate la nivelul inelului B și 5, 7-dihidroxilate la nivelul inelului A cresc semnificativ activitatea antimicrobiană. Schimbarea pozițiilor 6 sau 8 cu o grupare alifatică cu catenă lungă, cum ar fi lavandulil sau geranil, au condus la îmbunătățirea activității. De asemenea, s-a observat o îmbunătățire a activității flavan-3-olilor odată cu substituția unor lanțuri alifatice C8 și C10, crescându-le astfel caracterul lipofil (Cushnie, 2005).
Calconele s-au dovedit mai eficiente împotriva tulpinii S. aureus decât flavanonele sau flavonele, iar grupările hidroxil din poziția 2- sunt importante pentru activitatea antimicrobiană a acestor compuși. Pentru flavonoidele metoxilate s-a raportat o reduce drastică a activității antibacteriene. Substituirea inelul B cu 3’-cloro, 4’-cloro sau 4’-bromo a condus la sporirea activității antimicrobiene fiind de aproximativ de două ori mai eficiente decât compusul simplu nederivat asupra tulpinii S. aureus, și de patru ori mai active împotriva Enterococcus faecalis. De asemenea, derivatul 2’, 4’-diclor a prezentat o îmbunătățire de patru până la opt ori împotriva tulpinii S. aureus și de patru ori față de E. faecalis. Derivații de tipul 3-metilen-6-bromoflavanonă au fost mai puțin activi decât compusul nederivat, astfel se poate constata că halogenarea inelului A poate diminua activitatea antimicrobiana (Cushnie, 2005).
Conform Borges și colab. (2013a) s-a constatat că acizii fenolici (galic și feluric) au proprietatea de a produce modificări majore în hidrofobicitate și asupra sarcinii suprafeței celulare, precum și în capacitatea de eliminare a ionilor de K+, formându-se astfel pori la nivelul membranelor celulare ale bacteriilor Gram pozitive și Gram negative.
De asemenea, s-a constatat că numărul și poziția substituenților la nivelul nucleului benzenic din structura acizilor fenolici, precum și lungimea lanțurilor laterale saturate influențează în moduri diferite potențialul antimicrobian. Activitatea antimicrobiană pentru diverși acizi polifenolici a fost în ordinea următoare: 4-hidroxi- >> 3-hidroxi- > 4-hidroxi-3-metoxi- > 3,4-dihidroxi- > acidul benzoic nesubstituit. Pentru acizii fenilacetici, activitatea antimicrobiana a fost, în următoarea ordine: ne-substituit > 3-hidroxi- > 4-hidroxi- > 3,4-dihidroxi-substituite, în timp ce pentru acizi fenilpropionici trendul activității antimicrobiene a fost: ne-substituit> 4-hidroxi > 3-hidroxi > 3,4-dihidroxi (Cueva, 2010).
Posibilele mecanisme de acțiune ale componentelor fenolice:
Inhibarea sintezei de acizi nucleici: concentrațiile scăzute de polifenoli afectează activitatea enzimelor asociate cu producerea de energie, în timp ce cantitățile mari au determinat precipitarea proteinelor. Într-un studiu folosind precursori radioactivi s-a arătat că sinteza de ADN a fost puternic inhibată de flavonoide pentru Proteus vulgaris, în timp ce sinteza ARNm a fost cea mai afectată în cazul tulpinii de S. aureus. Compușii polifenolici care au prezentat această activitate au fost robinetin, miricetin și (-)- epigalocatechina (Mori, 1987).
Perturbarea membranei citoplasmatice: fenolii pot reacționa cu componenta fosfolipidică din membrana celulară provocând astfel o creștere a permeabilității membranei celulare sau pot cauza modificări semnificative ale compoziției de acizi grași și fosfolipide din structura membranei microbiene. Pentru compușii fenolici s-a dovedit că pot provoca tumefierea rapidă a celulelor de P. aeruginosa (Bernheim, 1972). Efectul asupra integrității membranei citoplasmatice la S. aureus s-a investigat și prin măsurarea pierderii de potasiu intracelular, obsevându-se o pierdere de aprox. 20% față de celulele netratate cu compusul fenolic studiat. Aceste date sugerează că în membrana citoplasmatică sunt induse leziuni conducând la pierderea potasiului intracelular (Cushnie, 2005).
Inhibarea metabolismului energetic.
Este bine cunoscut faptul că BHA, acizii p-cumaric și cafeic atacă nu numai membrana citoplasmatică, perturbând astfel permeabilitatea și conducând la eliberarea constituenților intracelulari, dar afectează și funcțiile membranare în ceea ce privește transportul de electroni, absorbția nutrienților, sinteza acizilor nucleici și activitatea ATP-azică cu alte cuvinte efectul bactericid/bacteriostatic al compușilor fenolici este rezultatul perturbărilor ce se desfășoară pe două nivele și alterează: integritatea membranară și a peretelui celular și respectiv starea fiziologică a celulelor bacteriene (Martin, 1992).
Plaper și colab. (2003) au raportat faptul că quercetina se leagă de subunitatea GyrB a ADN-girazei de E. coli și inhibă activitatea enzimatică a ATP-azei.
Datele existente asupra relației dintre structură-activitate sugerează posibilitatea dezvoltării unui agent antimicrobian acceptabil farmacologic sau o nouă clasă de agenți antimicrobieni prin sintetizarea unor noi compuși derivați de la acești compuși naturali substituiți astfel încât să se obțină o activitate antimicrobiană optimă (Cushnie, 2005).
II.2.2. Activitatea antioxidantă a compușilor fenolici
Un antioxidant este o substanță care, în concentrații scăzute în raport cu cea a unui substrat oxidabil, întârzie în mod semnificativ sau previne oxidarea substratului respectiv (de Beer, 2002).
Antioxidanti fenolici
Compușii fenolici, care provin în principal din plante, sunt cel mai mare grup de antioxidanți exogeni. Aceștia sunt cunoscuți pentru capacitatea lor de a neutraliza radicalii liberi prin donarea unui atom de hidrogen și/sau a unui electron radicalilor liberi. Reacțiile chimice care implică transferul unui electron și a un proton pot avea loc prin intermediul mai multor mecanisme. Poziția și gradul de hidroxilare, polaritatea, solubilitatea și reducerea potențialului sunt principalii factori care influențează activitatea antioxidantă a compușilor fenolici (Dawidowicz, 2012).
Antioxidanții pot fi clasificați în două grupe, și anume antioxidanți de rupere a lanțului (primari) și antioxidanți preventivi (secundari) (Namiki, 1990). Antioxidanți de rupere a lanțului acționează prin neutralizarea radicalilor liberi și donarea de protoni. Antioxidanți preventivi sunt chelatori de metale și reducători capabili să economisescă alți antioxidanți in vivo. Alte funcții ale antioxidanților includ descompunerea peroxidică, neutralizarea oxigenului singlet și inhibarea enzimelor, cum ar fi NADH-oxidază, succinoxidază, ATP-ază și sintetaza oxidului nitric (eNOS) (Hodnick, 1994; Chiesi, 1995). Compușii antioxidanți solubili în apă (compușii fenolici – metaboliți secundari ai plantelor) sunt caracterizați de un ciclu aromatic care posedă unul sau mai mulți substituenți hidroxil. Compușii fenolici prezintă diversitate structurală și funcțională și pot fi hidroxilați și metoxilați în diferite poziții (de Beer, 2002).
Glicozilarea, cu glucoză, galactoză, ramnoză, arabinoză sau xiloză la gruparile hidroxil din pozițiile 3, 5 și 7, este comună pentru toate flavonoidele (de Beer, 2002). Combinațiile specifice de compuși polifenolici sunt importante în ceea ce privește activitatea sinergică antioxidantă (Saucier, 1999).
Relația structură-activitate
Structurile chimice ale compușilor fenolici sunt predictive asupra potențialului lor antioxidant prin capacitatea lor de captare a radicalilor liberi, a hidrogenului sau capacitatea de a dona electroni și de chelare a metalelor (Rice-Evans, 1997). Potențialul antioxidant este afectat și de stabilitatea radicalului fenoxil rezultat. Structura unică a compușilor fenolici facilitează rolul de captatori de radicali liberi, datorită stabilizării rezonanței electronului captat (Shahidi, 1992). Neutralizarea radicalilor liberi are loc prin donarea unui atom de hidrogen la radicalii lipidici care concurează cu reacția de propagare în lanț (Shahidi, 1992):
LOO* + AH LOOH + A*
LO* + AH LOH + A*
LOO* + LH LOOH + L*
A* + LH AH + L*
unde LOO* = radical peroxil; AH = antioxidant fenolic; LOOH = acid gras hidroperoxid; A*= radical fenoxil; LO*= radical alcoxil; LOH = alcool; LH = acizi grași polinesaturați; L*= radical alchil.
Mulți cercetători (Rice-Evans, 1996; Liao, 2000 etc.) au studiat relațiile structura-activitate ale antioxidanților fenolici în diferite sisteme de testare. Cele mai multe teste utilizează peroxidarea lipidică a ionilor metalici utilizați ca inițiatori, prin urmare relația structură-activitate derivată din astfel de sisteme de testare includ atât captarea radicalilor liber cât și chelarea metalelor (Van Acker, 1996). Într-un studiu realizat de Sugihara și colab. (1999) s-a arătat că activitatea compușilor fenolici de a inhiba peroxidarea lipidelor hidroperoxid dependente în hepatocite diferă în funcție de ionul metalic folosit. În sistemele care conțin atât lipide cât și faze apoase, partiționarea compușilor dintre aceste faze contribuie la activitatea antioxidantă (Liao, 2000).
Comparații mai eficiente pentru relațiile structură-activitate pentru compușii fenolici se pot face în cazul în care aspectele activității antioxidante, cum ar fi activitatea împotriva efectelor radicalilor liberi sau capacitatea de chelator de metale, sunt realizate individual (de Beer, 2002). Majoritatea metodelor ce se utilizează în măsurarea proprietăților antioxidante, și anume, capacitatea antioxidanților de a capta radicalii liberi este măsurată de cinetica de acțiune dintre antioxidantul examinat și radicalul liber. Metodele care se aplică compușilor cromogeni sunt utilizate în mod obișnuit datorită ușurinței, vitezei de reacție și sensibilității lor (Villano, 2004), cele mai utilizate fiind cele care se bazează pe stabilitatea radicalului 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) și al radicalului cationic 2,2-azinobis(3-etil-benzotiazolinic-6-sulfonic) (ABTS*) (Dawidowicz, 2012).
Acizii fenolici
Activitatea antioxidantă a acizilor fenolici este legată de fragmentul de acid și de numărul și pozițiile relative ale grupărilor hidroxil de pe suprafața structurii ciclului aromatic (Rice-Evans, 1996). Acizii hidroxicinamici sunt antioxidanți mai eficienți decât acizii hidroxibenzoici datorită posibilității sporite de delocalizare a radicalului fenoxil (Silva, 2000). Acidul benzoic și acidul cinamic nu posedă grupări hidroxil libere, prin urmare, nu au proprietatea de eliminare a radicalilor liberi (de Beer, 2002). Substituirea nucleului aromatic prin creșterea numărului de grupări hidroxil conduce la creșterea activității antioxidante, acest lucru depinzând și de poziția acestor grupri la nivelul nucleului fenolic. Hidroxilarea din pozițiile 2- și 4- sau în 3-, 4- și 5- conferă cea mai mare activitate antioxidantă. Grupările hidroxil adiacente, așa cum se găsește în acidul protocatehic, sunt mai puțin favorabile pentru activitatea antioxidantă decât cele din pozițiile meta- în raport unul cu altul, așa cum este cazul pentru acidul rezorcilic (de Beer, 2002). Substituenții care cresc densitatea de electroni pe gruparile hidroxil determină o scădere a energiei de disociere a legăturii O-H. Prin urmare, substituenți donori de electroni vor crește activitatea antioxidantă, ca și în cazul acidului vanilic în raport cu acid p-hidroxibenzoic (de Beer, 2002).
Flavonoidele
Caracteristicile structurale ce conferă activitatea antioxidantă flavonoidelor sunt următoarele (Fig. 18) (Bors, 1990):
fragmentul 3',4'-dihidroxi din ciclul B pentru delocalizarea electronică și stabilitatea radicalului fenoxil;
dubla legătură dintre pozițiile 2, 3 în combinație cu gruparea 4-ceto pentru delocalizare electronilor în inelul C;
grupările hidroxil din pozițiile 3 și 5 din inelele C și A, în combinație cu gruparea 4- ceto din inelul C pentru potențialul maxim de baleiaj.
Fig. 18 Caracteristicile structurale ale flavonoide care conferă activitate antioxidantă (imagine adaptată după de Beer, 2002).
Quercetina (TEAC= 4.7), una dintre cele mai eficiente flavonoide antioxidante satisface toate criteriile menționate mai sus. Catechina (TEAC= 2.4), care nu îndeplinește a doua condiție, este, prin urmare, un captator de radicali liberi mai puțin eficient decât quercetina (de Beer, 2002). Reducerea semnificativă a activității antioxidante datorită glicozilării grupării hidroxil din poziția 3 a inelului C, așa cum se găsește în rutin (TEAC= 2.4) confirmă importanța grupării hidroxilice nesubstituite (Rice-Evans, 1996). Păstrând structura dihidroxi a inelului B cu saturarea legăturii dintre pozițiile 2 și 3 specifice clasei flavanonolilor, elimină delocalizarea radicalului fenoxil din inelul B, astfel se poate face comparația între activitatea antioxidantă a quercetinei (TEAC= 4.7) și dihidroquecetinei (TEAC= 1.9). Prin urmare, aceste caracteristici structurale combinate sunt critice pentru activitatea antioxidantă maximă (Rice-Evans, 1996).
II.2.3. Efectul imunomodulator al compușilor polifenolici
Inflamația este răspunsul organismului la invazia unui corp străin, cum ar fi agenții infectioși sau corpurile straine inerte. În acest context, răspunsul inflamator este o reacție acută de protecție declanșată în cursul iritațiilor, leziunilor sau a infecțiilor, caracterizată prin eritem, căldură, edem și durere, semnale clinice ale inflamațiilor. Roșeața și căldura rezultă dintr-o creștere a fluxului sanguin, edemul este asociat cu permeabilitatea vasculară crescută și extravagarea plasmei care excită terminațiile fibrelor nervoase aferente, la apariția senzației de durere contribuie și kininele-polipeptide de dimensiuni mici. În condiții normale, aceste schimbări în țesutul inflamat servesc pentru a izola și pentru a limita efectele negative asupra organismului (Calixto, 2003). Cei mai mulți metaboliți secundari ai plantelor cum ar fi acizii fenolici, flavonoide, iridoide, monoterpenoide și triterpenoide, sunt cunoscuți pentru capacitatea acestora de a interveni în mod direct sau indirect, în următoarele mecanisme: mediatori inflamatori (metaboliți ai acidului arahidonic, peptide, citokine, excitatori ai aminoacizilor etc.), producerea și/sau modularea mesagerilor (cGMP, cAMP, diferite protein kinaze și calciu), modificări asupra expresiei factorilor de transcripție cum ar fi AP-1, NF-kB, și proto-oncogenelor (c-jun, c-fos și c-myc), și expresiei moleculelor pro-inflamatorii cheie, cum ar fi sinteta de NO (iNOS), ciclooxigenază (COX-2), citokine (IL-1β, TNF-α, etc), neuropeptide și proteaze (Calixto, 2003; Chiang, 2003).
Inhibarea căii acidului arachidonic de către compușii polifenolici
Una dintre cele mai importante mecanisme anti-inflamatorii este inhibarea enzimelor eicosanoide generatoare de fosfolipază A2, ciclooxigenază și lipooxigenază reducând astfel concentrația de prostaglandine și leucotriene (Kim, 2004). Acidul arahidonic (AA) este eliberat din fosfolipidele membranare prin clivajul fosfolipazei A2 (PLA2), el poate fi metabolizat pe calea ciclooxigenazei (COX) în prostaglandine (PGs) și tromboxan A2 (TXA2), sau pe calea lipooxigenazei (LOX) în acizi hidroperoxieicosatetraenoici (HpETEs), hidroxieicosatetraenoici (HETEs) și leucotriene (LTs) (Yoon, 2005). Ciclooxigenaza există în două izoforme majore (COX-1, COX-2) și o varietate (COX-3) (Chandrasekharan, 2002). COX-1 este exprimată în multe țesuturi, în timp ce COX-2 este cunoscută ca o enzimă inductibilă care produce, în cele mai multe cazuri, cantități mari de prostaglandine. COX-2 este puternic exprimată în celulele inflamatorii, ce includ macrofage și mastocite, după stimularea cu citokine pro-inflamatorii și/sau lipopolizaharide (LPS) (Needleman, 1997). LOXs sunt enzimele care paticipă la formarea acizilor hidroxilici și leucotrienelor din acid arahidonic. Cei mai cunoscuți sunt metaboliții rezultați în urma acțiunii 5-lipooxigenazei, enzimă prezentă în special la nivelul leucocitelor polimorfonucleare neutrofile. 5- și 12-LOXs produc 5-HETE și 12-HETE, care induc raspunsul inflamator. Prostaglandinele și leucotrienele sunt prezente la nivelul exudatului inflamator, iar agenții care inhibă ciclooxigenaza exercită in vivo o acțiune antiinflamatorie (Middleton, 2000).
Compușii polifenolici s-au dovedit a inhiba enzimele celulare, cum ar fi PLA2, COX și LOX, în scopul de a reduce producția de acid arahidonic, prostaglandine și leucotriene, exercitând astfel acțiunea anti-inflamatoare (Yoon, 2005). Compuși polifenolici extrași din vinul roșu și ceaiul negru au fost capabili de a modula activitatea COX-2 și expresiei genelor în diferite tipuri de celule (Luceri, 2002). De exemplu, quercetina a redus expresia ARNm COX-2 atât în celulele Caco2 stimulate de IL-1β, cât și în cele nestimulate (Miscalencu, 2008), în leucocitele peritoneale la șobolan (Laughton, 1991) și în epiderma porcușorului de Guineea (hamster) (Kim, 1998). După tratarea condrocitelor articulare de iepure cu resveratrol s-a observat că nivelurile de expresie ale ciclooxigenazei (COX-2) și prostaglandinei E2 (PGE2) au început să crească dupa 10 minute, atingând nivelurile maxime după 3 h, după care au început să scadă. De asemenea, s-a demonstrat că resveratrolul a provocat fosforilarea protein kinazelor activate de mitogen și Akt din condrocitele articulare de iepure. Pe lângă inhibarea protein kinazelor activate de mitogen, resveratrolul a condus și la suprimarea inducerii de colagen tip II și a expresiei COX-2 (Eo, 2014). S-au raportat și alți polifenoli din ceaiul verde, și anume prodelfinidină B-4,3'-O-galat și prodelfinidină B2 3,3'di-O-galat, pentru capacitatea acestora de a suprima ARNm, proteina de exprimare a COX-2 și eliberarea de PGE2 într-o manieră dependentă de doză. Mai mult, (-)-epigalocatechina (EGC), (-)-galocatechina (GC), galat-(-)-epicatechina (ECG), galat-(-)-catechina (CG), galat-(-)-epigalocatechina (EGCG), s-au dovedit a avea activitate inhibitorie asupra COX-1/COX-2 pentru diferite linii celulare umane și de șoarece (Santangelo, 2007). De asemenea, kaempferol, un flavonoid prezent în diferite plante superioare, a scăzut în mod semnificativ producția de PGE2 prin stimularea cu LPS a celulelor umane din sângele integral de cultură (Miles, 2005).
Tirozolul, licopenul și quercetina, au inhibat expresia genelor COX-2 și iNOS în macrofagele RAW 264.7 stimulate cu interferon-γ (IFN-γ), probabil prin calea NFkB. Aceste date sugerează că acești compuși pot actiona ca agenți netoxici pentru controlul genelor pro-inflamatorii implicate în boala celiacă (Santangelo, 2007).
Modularea producerii de citokine
Citokinele sunt principalii mediatori locali, de comunicare intercelulară necesară pentru un răspuns integrat la o varietate de stimuli în cursul raspunsului imun și inflamator (Kim, 2004). Numeroase citokine au fost identificate în țesuturi într-o serie de boli inflamatorii cu substrat imunologic. Mai mult decât atât, un "echilibru" între efectele pro-inflamatorii (IL-1β, IL-2, TNF-α, IL-6 și IFN-γ) și citokinele anti-inflamatorii (IL-8 , IL-10, IL-4, TGFβ) este considerat un factor determinant al evolutiei bolii (Santangelo, 2007). Din acest motiv, modularea profilului citokinic constituie un obiectiv foarte interesant pentru dezvoltarea de medicamente anti-inflamatorii relevante clinic. Compușii polifenolici, care pot interfera în mod selectiv cu producția și/sau funcția citokinelor ar putea oferi o alternativă importantă pentru tratamentul multor boli inflamatorii (Comalada, 2006). În acest scop, s-a observat că mai mulți compuși polifenolici sunt capabili de a reduce exprimarea diferitelor citokine pro-inflamatorii/chemokine, printre care TNFα, IL-1β, IL-6, MCP-1, în multe tipuri de celule cum ar fi monocitele stimulate cu forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) sau fitohemaglutinină (PHA) (Comalada, 2006), astrocite umane activate (Sharma, 2007), celule sinoviale umane (Sato, 1997), linie celulara umana de mastocite activate, CMH-1, stimulate cu ionofor de calciu A23187 (Min, 2007), fibroblaste ale mucoasei nazale și celule epiteliale bronșice A549 (Kim, 2006).
Aceste studii susțin faptul că polifenolii au capacitatea de a modula răspunsul imun prin potențialul lor anti-inflamator (Lyu, 2005). Cu toate acestea, efectele asupra echilibrului între expresia de citokine pro- și anti-inflamatorii s-au dovedit a fi specifice în funcție de structura chimică a polifenolilor (Santangelo, 2007). Mecanismul anti-inflamator al quercetinei constă în inhibarea expresiei de citokine pro-inflamatorii din celulele mastocitare și în suprimarea TNF-α (Pan, 2009b).
Modularea căilor de semnalizare dependente de NFkB
De la descoperirea lor, factorii de transcripție NFkB/Rel sunt considerați responsabili pentru bolile inflamatorii cronice și acute. NFkB joacă un rol esențial în declanșarea răspunsului inflamator, răspunsului la stres, răspunsurilor proliferative și apoptotice (Karin, 2000). NFkB coordonează inducerea unei game largi de gene care codifică citokinele pro-inflamatorii (IL-1, IL-2, IL-6, și TNF-α), chemokine (MIP-1α și MCP-1), molecule de adeziune celulară (ICAM, VCAM, E-selectina), proteine de fază acută, imuno-receptori, factori de creștere, enzime inductibile cum ar fi factorul de creștere al endoteliului vascular (VEGF), COX-2, metaloproteinazele matriceale (MMP), iNOS, toate moleculele implicate în inflamație, proliferarea celulară, adeziune celulară, migrare și invazie (Nam, 2006). Inhibarea NFkB este în general considerată o strategie utilă pentru tratamentul tulburărilor inflamatorii (Karin, 2004), această cale reprezentând o țintă terapeutică importantă. S-a observat că polifenolii vegetali pot funcționa ca modulatori ai căilor de transducție a semnalului pentru a declanșa efectele lor benefice (Rahman, 2006). Familia NFkB/Rel este formată din cinci membri: p65 (RelA), RelB, c-Rel, p50/p105 (NFκB1), și p52/p100 (NFκB2), acestea fiind proteine de legare a ADN ce recunosc o secvență comună (Vanden Berghe, 2006). În celulele ne-stimulate, NFkB este sechestrat în citoplasmă în formă inactivă (Hayden, 2004). Polifenolii s-au dovedit a prezenta activitate anti-inflamatorie prin modularea activității NFkB. Prin influența compusului polifenolic (-)-epigalocatechin galat asupra căii NFkB, s-a demonstrat efectul inhibitor al acestui compus prin contracararea activării IKK și degradarea IκBα (Santangelo, 2007).
Flavonoidele prezintă capacitatea de a modula cascada de activare NFkB (Mackenzie, 2004). În celulele RAW 264.7 activate cu IFNγ, quercetina, tirozolul și licopenul au inhibat iNOS, expresia COX-2 și genele pro-inflamatorii prin prevenirea translocării nucleare ale subunităților p50 și p65 ale NFkB, STAT-1α și IRF-1. Aceste rezultate sugerează că acești compuși pot fi potențiali agenți non-toxici pentru controlul inflamațiilor intestinale în boala celiacă prin prevenirea activării căii de semnalizare a transducției (De Stefano, 2007). Efectele benefice anti-inflamatorii exercitate de quercetină, atât in vitro cât și in vivo, par să se datoreze, de asemenea, și inhibării proteinei de fosforilare IκBα care, prin blocarea căii NFkB, conduce la contracararea expresiei citokinelor și inducerea sintetazei oxidului nitric (Comalada, 2005). În mod similar, în linia de celule mastocitare umane, activarea quercetinei a condus la scăderea expresiei citokinelor pro-inflamatorii TNFα, IL-1β, IL-6 și IL-8, prin inhibarea degradării IκBα și a translocarii nucleare a p65, blocând astfel activarea NFkB (Min, 2007).
Acțiunea antitumorală a compușilor polifenolici
Activitatea antitumorală a flavonoidelor este încă disputată. Sistemele antioxidante sunt adesea ineficiente, deși este acceptat faptul că leziunile induse de speciile reactive de oxigen sunt implicate, în general, în carcinogeneză (Pryor, 1997). Speciile reactive de oxigen pot afecta integritatea ADN și diviziunea celulară formând leziuni nereparabile sau parțial reparabile care conduc în final la mutații. Astfel de modificări pot apărea în genele critice, cum ar fi oncogenele sau genele supresoare tumorale și conduc la inițierea sau progresia bolii. Speciile reactive de oxigen pot interfera direct cu semnalizarea și creșterea celulară. Leziunile celulare provocate de intermediarii reducători ai oxigenului pot stimula mitoza, crescând astfel riscul de apariție a tumorilor (Nijveldt, 2001).
S-a arătat că flavonoidele pot inhiba carcinogeneza (Stefani, 1999). Unele flavonoide – cum ar fi fisetina, apigenina și luteolina – sunt considerate a fi inhibitori puternici ai proliferării celulare (Scoditti, 2012). Quercetina și apigenina au inhibat creșterea melanomului și au scăzut potențialul invaziv și metastatic la șoarece (Caltagirone, 2000). Alți compuși cu acțiune antitumorală din această clasă de compuși sunt acizii fenolici, conform Zahin și colab. săi (2014), acidul elagic este un compus bioactiv responsabil pentru inhibarea aducților ADN BP-induși prezentând acțiune puternic antimutagenică și antiproliferativă.
Această constatare poate oferi perspective noi cu privire la posibilele terapii anti-cancer. Mai mult, s-a speculat că flavonoidele pot inhiba angiogeneza (Scoditti, 2012). În acest sens un posibil mecanism ar putea fi inhibarea protein kinazelor, enzime cu rol important în transducția semnalului și cunoscute pentru efectele lor asupra angiogenezei (Nijveldt, 2001).
II.3. Biosinteza și activitățile biologice ale agliconilor heterozidelor betalainice
Termenul de betalaine a fost introdus de Mabry și Dreiding in 1968, pe considerente structurale și biogenetice. Inițial, betalainele au fost numite "caryophyllinenroth" și redenumit "chromoalkaloids". Insa, aceasta clasa de compusi nu face parte din cea a alcaloizilor chiar daca sunt derivati aromatici de indol sintetizați din tirozină, acesta clasa este de natură acidă, datorită prezenței mai multor grupări carboxyl (Delgado-Vargas, 2000).
Structura generală este prezentată în Fig. 19. Betalainele se împart în două subclase structural: betaxantine de culoare galbenă (denumirea provine din latină: beta = Beta vulgaris (sfeclă roșie) și greacă: xanthos = galben) și betacianine de nuanțe roșu-purpuriu (kyanos = culoare albastră), în funcție de structura fragmentelor R1 și R2. Mai mult de 50 de betalaine sunt bine cunoscute, și prezintă aceeași structură de bază, în care R1 și R2 poate fi hidrogen sau un substituent aromatic. Culoarea lor este atribuită rezonanței legaturilor duble (Delgado-Vargas, 2000). Conjugarea nucleului aromatic substituit cromoforului 1,7-diazaheptametinium conduce la maximele de absorbție de la 480 nm în betaxantine (galben) la 540 nm pentru betacianine (roșu-violet) (Stintzing, 2007).
Fig. 19. Formula generală a betalainelor: (A) fragmentul acidului betalamic prezent la toate moleculele betalainice; (B) Structura diferențiala pentru betacianine și betaxantine, în funcție de structura radicalilor R1 și R2 (dupa Delgado-Vargas si colab., 2000)
Acești pigmenți înlocuiesc funcțional antocianii din 13 taxoni incluși în ordinul Caryophyllales (Centrospermae), precum familiile: Chenopodiaceae, Amaranthaceae, Portulacaceae, Cactaceae, Phytolaccaceae și altele. Acești compuși cu un continut ridicat de azot sunt larg utilizați ca și coloranți alimentari netoxici. Betalainele prezintă proprietăți antioxidante fiind mult mai activi decât majoritatea flavonoidelor, iar stabilitatea lor este net superioară antocianilor (Matkowski, 2008).
Așa cum este prezentat în Fig. 20, betalainele sunt sintetizate din DOPA prin două căi independente, și anume calea de biosintetizare a acidului betalamic și calea de sinteză cDOPA. Acidul betalamic este molecula cromofor atât pentru betacianină cât și pentru betaxantine, iar cDOPA și derivații săi sunt esențiali pentru producerea de betacianine (Tanaka, 2008).
Datele referitoare la proprietătile terapeutice ale acestor compuși sunt relativ puține, însă se pare că această clasă prezintă activitate antioxidantă, antitumorală și imunomodulatoare. Betaxantinele au fost folosite ca supliment alimentar în vederea generării de aminoacizi esențiali. S-a demonstrat efectul inhibitor semnificativ al sfeclei roșie asupra cancerului de piele și pulmonar la șoareci. S-a observat, de asemenea, eficacitatea betaninei pentru suprimarea locală pe termen ndelungat a tumorilor cutanate și hepatice induse de diferite chimicale carcinogene la șoareci. S-a raportat la concentrații foarte scăzute capacitatea betaininei și betanidinei de a inhiba peroxidarea lipidelor și descompunerea hem-ului in vitro (Azeredo, 2009).
Cei mai studiati compusi betalainici au fost betanina (glicozida betanidinei) si betanidina (agliconul glicozidei) izolati din sfecla rosie si indicaxantin ca betaxantina observandu-se caracterul lor puternic antioxidant (Kanner, 2001; Tesoriere, 2003; Tesoriere, 2004; Tesoriere, 2005).
Fig. 20 Căile de biosintetizare pentru betalaine (schema adaptată după Tanaka și colab. (2008)
Conform Vidal și colab. (2014), betalainele naturale produc inactivarea enzimelor LOX și COX, care sunt implicate în răspunsul inflamator. Compușii cei mai activi conțin o structură indolică sau triptaminică în cazul LOX sau derivați ai feniletilaminei în cazul COX. Însă, date referitoare la acțiunile biologice ale batalainelor pure sunt relativ puține, în majoritatea studiilor utilizându-se extracte totale în vederea determinării proprietăților terapeutice ale speciilor cu un conținut ridicat de betalaine, practic evitându-se identificarea compușilor activi și astfel, concluziile cu privire la mecanismele implicate și posibilele aplicații terapeutice sunt limitate.
Din punct de vedere al activității antimicrobiene Djilas și Markov (2011) au concluzionat că această proprietate a extractului de sfeclă roșie se datorează în special betacianinelor și betaxantinelor asupra tulpinilor S. aureus, B. cereus E. coli, P. aeruginosa.
CAPITOLUL III
Contribuții originale privind studiul proprietăților terapeutice ale unor plante invazive considerate medicinale în țările native
Scop și obiective
Plantele, în general, reprezintă o sursă inepuizabilă de substanțe biologic active, iar întrebuințarea lor s-a evidențiat încă din cele mai vechi timpuri, atât pentru alimentație cât și în tratarea diferitelor afecțiuni, însă fără a se cunoaște compoziția lor chimică sau posibilele mecanisme de acțiune. În acest context, plantele alohtone invazive din țara noastră, în ciuda efectelor negative asupra biodiversității locale prezentate în primul capitol al tezei, prezintă proprietăți curative și sunt utilizate încă din antichitate în țările lor native în medicina tradițională sau sunt surse importante de compuși naturali farmacologic activi.
După cum se cunoaște compoziția chimică și implicit acțiunea terapeutică a extractelor vegetale obținute din aceste specii pot să difere în funcție de zonă, climă, perioada de recoltare și mulți alți factori ce țin de ecosistemul invadat, astfel scopul studiului constă în caracterizarea fizico-chimică și evidențierea eventualelor proprietăți terapeutice ale unor amestecuri fitochimice obținute din diferite plante invazive.
Obiectivele specifice formulate în vederea atingerii scopului propus sunt urmatoarele:
Identificarea speciilor invazive și recoltarea acestora în vederea extracției principiilor active necesare în procesul de caracterizare fizico-chimică cât și a determinării principalilor fitocomponenți cu posibilă acțiune terapeutică;
Studiul fitotoxicității amestecurilor fitochimice obținute din diferite plante invazive în vederea demonstrării unei trăsături esențiale ale plantelor invazive;
Aprecierea calitativă și cantitativă a activității antimicrobiene a amestecurilor fitochimice, față de tulpinile microbiene de referință și rezistente, precum i a influenței acestora asupra expresiei unor gene de virulență și rezistență la antibiotice a tulpinilor microbiene analizate;
Studiul influenței amestecurilor fitochimice asupra capacității de aderență la substratul inert a microorganismelor și a acțiunii antibiofilm asupra biofilmelor experimentale monospecifice dezvoltate pe substraturi inerte;
Studiul citotoxicitatii amestecurilor fitochimice utilizate în testele biologice (uleiuri volatile și extracte) și determinarea activității antioxinate;
Studiul acțiunii imunomodulatoare a diferitelor extracte obținute din plantele invazive;
III.1. Materiale și metode
III.1.1. Extracția amestecurilor fitochimice obținute din organele vegetative și de reproducere ale unor specii invazive
III.1.1.1. Materiale vegetale
Plantele au fost recoltate din diferite zone ale țării, identificate și inventariate la Gradina Botanică „Dimitrie Brândză”, cu numerele de identificare prezentate în tabelul 1. Organele vegetative și de reproducere luate în lucru pentru fiecare specie sunt prezentate în tabelul 1. Plantele au fost sortate manual și uscate la temperatura camerei.
Tabelul 1. Părțile vegetale ale speciilor invazive luate în lucru
III.1.1.2. Extracția principiilor active din speciile de plante invazive
III.1.1.2.1 Extracte alcoolice obținute prin ultrasonicare
S-au cântărit aprox. 4g de material vegetal uscat și mărunțit peste care s-a adaugat 30 mL etanol de conc. 70%. Amestecul a fost supus extracției asistată de ultrasunete fără încălzire. Extracția s-a realizat cu ajutorul unui refrigerent pentru a se evita eventualele pierderi ce ar putea să apară pe parcursul ultrasonicării (Fig. 21). Metoda implică utilizarea de ultrasunete, cu frecvențe ce variază de la 20 kHz la 2000 kHz, permițând creșterea permeabilității pereților celulari și liza celulelor, favorizând extracția de compuși biologic activi. Extractul astfel obținut s-a filtrat și s-a adus la 300 mL cu etanol 70% cu excepția extractului din tuberculii de H. tuberosus care a fost adus la un volum final de 200 mL. Extractele s-au păstrat în recipiente bine închise la rece și ferite de radiațiile solare.
Fig. 21 Instalația utilizată pentru extracția prin ultrasunete a amestecurilor fitochimice
III.1.1.2.2. Izolarea uleiurilor volatile
III.1.2. Caracterizarea fizico-chimică a amestecurilor fitochimice
Complexitatea amestecurilor de compuși vegetali necesită utilizarea unor tehnici de separare și detectare diversificate pentru identificarea și confirmarea compușilor existenți. Caracterizarea amestecurilor fitochimice s-a realizat în scopul obținerii unor date concludente referitoare la compoziția chimică și identificarea claselor de compuși fitotoxici dar și terapeutici ai plantelor invazive. Caracterizarea presupune tehnici de separare și de detectare a principalilor compuși ai amestecurilor fitochimice, cât și dozarea spectrofotometrică.
III.1.2.1. Determinarea conținutului total de polifenoli (TP) s-a realizat prin metoda Folin-Ciocâlteu (Singleton, 1965). Metoda Folin-Ciocalteu (FC) are la bază oxidarea compușilor fenolici cu ajutorul unui molibdowolframat (Na2WO4 / Na2MoO4). Din această reacție rezultă O2-•, care reacționează cu molibdatul, rezultând ionul (Mo4+) (albastru), a cărui absorbanță este urmărită spectrofotometric în intervalul 745-750 nm. Reacția are loc în mediu puternic bazic. Metoda FC este simplă, specifică și rapidă. Totuși, este nevoie ca pH-ul de lucru să nu fie acid, ceea ce ar cauza reacții lente și nespecifice. O problemă a metodei este lipsa specificității față de polifenoli, fiind detectate, în egală măsură, monofenolii și alte tipuri de compuși ce pot fi reduși. Conținutul în fenoli totali (TP) s-a realizat prin omogenizarea 0,5 mL probă sau standard (acid galic) cu 5 mL reactiv Folin-Ciocâlteu și 4 mL soluție 1 M de carbonat de sodiu. Absorbanța a fost măsurată după 15 minute, comparativ cu o probă-martor (care conține etanol 70 %, v/v), în cuve de sticlă de 1 cm. Lungimile de undă la care s-au efectuat determinările sunt cele la care s-a înregistrat valoarea maximă a absorbției produșilor de reacție formați de reactivul Folin-Ciocâlteu cu acidul galic. Astfel, absorbanța probelor (standard/probă reală) a fost determinată la 746 nm. S-a trasat curba de calibrare cu soluții standard de acid galic de concentrații cuprinse între 5 și 150 mg/L. Ecuația curbei de calibrare a fost y = 0.0061x + 0.0057 (R2= 0.9988). Conținutul în TP a fost exprimat în echivalenți mg acid galic într-un gram de plantă și/sau într-un mL de extract.
III.1.2.2. Determinarea conținutului total de flavonoide
Conținutul total de flavonoide în extractele alcoolice a fost determinat prin metoda clorurii de aluminiu ce constă în tratarea a 10 mL extract alcoolic agitat și filtrat sau diferite concentrații de quercetin (standard analitic utilizat pentru trasarea curbei de calibrare) cu 10 mL de 10% acetat de sodiu. Într-un balon cotat de 25 mL s-au adaugat 5 mL soluție filtrată, 3 mL de soluție AlCI3 2,5% și s-a adus la semn cu etanol 70%. După agitare această soluție a fost lăsată să stea timp de 45 minute la intuneric și s-a citit absorbanța amestecului la lungimea de unda, λ= 430 nm. Conținutul în flavonoide a fost exprimat în μg quercetin / mL de extract și/sau respectiv mg quercetin/ g plantă uscată, fiind calculat folosind curba de calibrare obținută pentru concentrații de quercetin aparținând intervalului 0-120 μg / mL.
III.1.2.3. Determinarea conținutului total de betalaine
S-au cantărit aprox. 0,1 g de material vegetal uscat (pentru frunzele de A. retroflexus si P. americana) și crud (P. americana fructe) și s-au suspendat în 10 ml de 50% etanol și s-au agitat timp de 10 sec. Amestecul astfel realizat a fost supus ultrasonicării timp de 30 min, iar omogenizatul a fost centrifugat la 5000 rpm timp de 20 min. Supernatantul a fost colectat, iar reziduul format a fost spălat de 3x pentru a asigura extracția maximă a betalainelor. Supernatantul a fost în continuare utilizat pentru determinarea betalainelor.
Conținutul în betalaine a extractelor s-a realizat spectrofotometric la λ = 538 nm și λ =480 nm cu un spectrometru UV-Vis, în conformitate cu metoda propusă de Ravichandran și colab. (2013) și Stintzing și colab. (2003). Conținutul în betalaine (BC) a fost calculat cu formula:
BC (mg / L) = [(A x DF x M x 1000) / (ε x l)],
unde A = absorbanța, DF = factorul de diluție, l = lungimea cuvei (1 cm), M =masa moleculară (550g/mol pentru betacianine și 308 g/mol pentru betaxantine), ε=coeficientul molar de extincție (60000 L / mol x cm pentru betacianine si 48000 L / mol x cm pentru betaxantine)
III.1.2.4. Determinarea compoziției chimice pentru extractele alcoolice prin HPLC
Soluțiile stoc ale tuturor standardelor au fost preparate în metanol. Standardele de lucru s-au obținu prin diluarea amestecului de soluții stoc metanol: apă (50: 50, v / v). Probele și standardele de lucru au fost menținute la 4°C până la utilizare. Acidul formic, acetonitril și metanol au fost speciale pentru determinări LC și au fost obținute de la Merck. Apa bidistilată și demineralizată produsă de Milli-Q sistem Millipore (Bedford, MA, USA) a fost utilizată pentru prepararea soluțiilor apoase. Compușii fenolici au fost evaluați prin cromatografie de lichide de înaltă performanță – de fază inversă (RP-HPLC) cu injecție directă. Analiza cromatografică a fost realizată cu un Thermo Finnigan Surveyor Plus echipat cu un detector de fotodiodă Surveyor (PDA), autosampler Surveyor, pompă Surveyor LC (gradient cuaternar) și Chrome Quest Chromatography Workstation. Separarea s-a făcut la 30°C în coloana cromatografică Accuacore PFP (pm, 100 x 2,1 mm 2.6). Debitul a fost de 0,4 mL / min iar volumul de injectare a fost 1 μL. A fost utilizat un gradient de eluție de doi solvenți: solventul A a constat în apă cu 0,1% acid formic și solvent B: acetonitril cu 0,1% acid formic. Programul gradientului utilizat este redat în tabelul 2. Detecția a fost făcut la 280 nm.
Tabelul 2. Condițiile gradientului de solvent cu un gradient liniar
Extractele au fost injectate în sistemul HPLC după filtrare printr-un filtru cu dimensiunea porilor de 0,45 μm. Cantitatea de compuși fenolici din extracte a fost calculată ca μg/mL extract cu ajutorul curbelor de calibrare externe, care au fost obținute pentru fiecare standard fenolic. Fiecare determinare a fost efectuată în triplicat, iar rezultatele au fost redate ca medii. Probele martor și controalele au fost analizate pentru a monitoriza factorii variabili sau erorile aleatorii ale aparatului.
III.1.2.5. Determinarea compoziției chimice a uleiurilor volatile prin GC-MS
Determinarea compoziției chimice a uleiurilor volatile de A. annua., A. fruticosa și S. canadensis s-a realizat prin GC-MS. Aparatul GC-MS utilizat conține un sistem Thermo Electron, prevăzut cu un Triplus Autosampler. Flaconul headspeace de 20 mL ce conține o cantitate de aprox. 0,5 g de plantă uscată se încălzește la 80°C timp de 10 min, iar apoi 500 mL din gazul format în flacon au fost injectați în coloană. Analizele GC-MS au fost efectuate cu un cromatograf Focus GC cuplat cu un detector de masă cu capcană de ioni Polaris Q. A fost utilizată o coloană capilară DB-5MS (25m x 0,25 mm; 0,25 microni grosime a filmului), iar gazul purtător a fost He cu un debit de 1 mL/min. Programul temperaturii cuptorului GC a fost: 60°C temperatură inițială (3 min), urmată de o creștere a 10oC/min până la 200°C (2 min) și apoi 12oC/min până la temperatura finală de 240oC (2 min). Temperatura sursei și a interfeței au fost de 200°C și respectiv 250oC. Detectorul utilizat a funcționat pe modul de impact electronic (70 eV). Detectarea a fost realizată în intervalul de m/z 35-300. Spectrometrul de masă a operat în modul de scanare completă. Toate picurile cromatografice au fost analizate utilizând Xcalibur®software și biblioteca de spectre de masă NIST 11 pentru identificarea compușilor corespunzători. S-au utilizat soluții standard de alcani pentru GC (C8-C20 în hexan) pentru calcularea indicilor de retenție (RI) (Van den Dool & Kratz, 1963). Procentele relative a componentelor individuale au fost calculate în functie de aria picurilor GC.
III.1.2.6. Dozarea carotenoidelor
S-au cântărit între 3.34-5.39 g de produs vegetal peste care s-au adăugat 20-25 mL eter etilic. Probele s-au lăsat 24h la întuneric pentru extracție, într-un flacon de sticlă bine închis. Soluțiile eterice s-au evaporat într-o capsulă de porțelan până la un volum cuprins între 10-12 mL, prin încălzire ușoară. S-au adăugat 10 mL soluție KOH 10% în metanol anhidru pentru saponificarea esterilor xantofilici, iar soluțiile rezultate s-au încălzit pe baie de apă, timp de o oră, într-un balon prevăzut cu refrigerent ascendent.
După răcire soluțiile eterice s-au spălat într-o pâlnie de separare, o dată cu apa distilată și de 2 – 3 ori cu eter etilic. Extractele eterice reunite s-au uscat pe Na2SO4 anhidru, apoi s-au filtrat. Soluția obținută s-a adus la 10 mL cu eter etilic și s-a citit absorbanța la spectrofotometru la lungimea de undă de 465 nm, față de eter etilic.
Dozarea carotenoizilor este o metodă spectrofotometrică dezvoltată de Willstäter și Stoll în care se folosește ca substanță de referință β-caroten, soluție 2,5 mg% preparată în benzen, extracția xantofilelor rezultate în eter și măsurarea absorbanței soluției eterice la λ = 460 nm (Willstätter, 1906).
Concentrația corespunzătoare absorbanțelor respective s-a determinat prin interpolare, cu ajutorul curbei etalon. Calculul conținutului de β-caroten s-a realizat prin raportare la masa probei.
III.1.3. Caracterizarea capacității fitotoxice a plantelor invazive studiate
În general, majoritatea compușilor fenolici și terpenici sunt o categorie de metaboliți secundari care induc efectul de alelopatie la plante. Mecanismele de acțiune ale compușilor alelochimici asupra diferitelor specii de plante sunt diverse. Scopul principal al acestei analize constă în evidențierea unei caracteristici specifice plantelor invazive și anume capacitatea de a concura și chiar de a elimina speciile autohtone și de interes agricol.
III.1.3.1. Determinarea macroscopica a efectului fitotoxic
Extractele vegetale alcoolice au fost supuse evaporării la sec la temperatura camerei, iar reziduul vegetal a fost reluat cu același volum de apă distilată. Pentru determinarea caracterului fitotoxic, în cazul uleiurilor volatile s-au utilizat hidrodistilatele ce conțin numai compușii usor antrenabili cu vapori de apă și hidrosolubili.
Germinarea semințelor de T. vulgaris
S-au selecționat cariopsele de grâu cât mai omogene. Se îmbibă cu apă distilată timp de 24 h după care se pun la germinat în cutii Petri, cu diametrul de 15-20 cm, pe substrat de hârtie de filtru umectată cu apă și lăsate 24 h într-un termostat (Versatile environmental test chamber, model MLR-351H, Sanyo Electric. Co., Ltd.) cu temperatura și umiditatea controlate. Când lungimea rădăcinilor principale atinge aproximativ 10 mm, se introduc câte 10 cariopse germinate într-o cutie Petri, cu diametrul de 10 cm, care conține 15 mL extract vegetal și se pastrează la temperatura camerei.
Influența extractelor vegetale apoase asupra creșterii radiculare
Metoda presupune măsurarea lineară a alungirii rădăcinii principale din momentul inițial al tratamentului, la interval de 24 h pe parcursul a 5 zile, aceasta fiind perioada cea mai activă de creștere. Rezultatele s-au exprimat comparativ cu un martor ce conține apă distilată. Citirea rezultatelor evaluează modificările morfologice: aspectul și numărul radicelelor, aspectul și lungimea epicotilului din ultima zi de măsurători.
III.1.3.2. Corelarea statistică a efectului fitotoxic
Analizele statistice au fost realizate cu limbaj de calcul și de mediu, R și mai multe pachete dezvoltate pentru R (versiunea 3.0.3) (R Core Team, 2012). Parametrii statistici descriptivi au fost calculați folosind packagedoBy (Hřjsgaard, 2013). Compararea alungirilor radiculare pentru fiecare nivel de concentrație a unui extract și grupul de control a fost realizată pentru fiecare extract cu ajutorul testului Wilcoxon cu ajustare Holm pentru comparații multiple. Toate celelalte comparații multiple au fost realizate prin testul Kruskal-Wallis, testul ANOVA nu s-a putut realiza ca urmare a neîndeplinirii condițiilor preliminarii. Valabilitatea structurală a modelelor ANOVA și normalitatea au fost verificate prin examinarea vizuală a reziduurilor (qq-plots și histograme); pentru mai multă încredere în interpretarea vizuală a acestor date s-a aplicat, de asemenea, testul de normalitate K2 omnibus d’Agostino folosind pachetul fBasics (versiunea 3010.86) (Wuertz, 2013). Ipoteza de homoscedasticity a fost investigată prin testul Levene, folosind package car (Fox, 2011). Pentru fiecare dintre cele trei experimente, diferențele dintre efectele diferitelor extracte și pentru diferite concentrații au fost realizat prin testul Kruskal-Wallis. Intensitatea efectului pentru Kruskal-Wallis a fost estimat prin parametrul epsilon pătrat. Comparațiile multiple post-hoc s-au realizat prin testul Tukey HSD sau Wilcoxon la un nivel α= 0,5, ajustarea valorii p prin metoda Holm (Aickin, 1996), implementată în pachetul R, agricolae (Mendiburu, 2014). Grafica (boxplots) a fost generată de pachetul ggplot2 (Wickham, 2009).
Pentru hidrodistilate, distribuția normală nu a fost valabilă pentru cele mai multe dintre grupuri, bootstrapping cu 2000 de repetiții a fost folosit pentru a calcula 20% sortare medie și intervale de încredere de 95% și accelerare corectare-bias (BCa), folosind pachetul simpleboot.
Indicele de inhibiție (%) a fost calculat în funcție de valorile mediane în conformitate cu următoarea formulă:
II(%) = 100-(T-1)/(C-1) x100, unde:
II – indice de inhibiție; T – valoarea mediană a grupului testat; C – valoarea medie a grupului de control (1 cm este lungimea rădăcinii de la începutul experimentului și 100 este folosit pentru a exprima rezultatul în procente).
III.1.3.3. Determinarea microscopică a efectului fitotoxic
Examenul microscopic permite determinarea modificărilor filmului mitotic induse de extractele vegetale asupra vârfurilor radiculare de Triticum aestivum. Determinările se fac comparativ cu un martor, ce conține apă distilată, menținut în condiții similare cu probele.
Rădăcinile embrionare de T. aestivum au fost secționate la aproximativ 5 mm distanță de vârf și colorate cu orceină acetică diluată, conform procedeului La Cour. Procedeul se bazează pe afinitatea orceinei pentru cromatină în mediul acid, pH acid fiind necesar pentru hidroliza materalului cromatic din meristeme care se colorează în roșu-violet.
Prepararea soluției mamă de orceină acetică: se încălzesc 100 mL acid acetic glacial la temperatura de fierbere și se adaugă 2.2g orceina, apoi se lasă 2-3 minute pe foc. Se răcește și se filtrează. Se pastrează la loc întunecos, în flacoane bine închise.
Prepararea soluției standard de orceină acetică 1%: se amestecă 45 mL de soluție mamă de orceină acetică cu 55 mL apă distilată. Pentru 10 mL din amestecul astfel obținut se adaugă 1 mL de soluție de HCl 1 N, obținându-se astfel soluția diluată de orceină acetică necesară pentru colorare.
Colorarea meristemelor radiculare: se folosesc creuzete din porțelan, cu diametru de 3 cm, în care se pipetează câte 1 mL din soluția diluată de orceină acetică. Se secționează vârfurile radiculare și se introduce în această soluție. Creuzetele se încalzesc 1-2 minute pe sită de azbest la bec de gaz până la degajarea primilor vapori de acid acetic. Se acoperă și se lasă în repaus 10 minute, acoperite. Vârfurile radiculare astfel colorate se pun pe o lamă de microscop, într-o picătură de apă distilată, se acoperă cu lamelă și se presează până la strivirea materialului de cercetat. Preparatele s-au examinat folosind un microscop Labophot 2 Nikon, cu obiectivele 40x și 100x în imersie de ulei de cedru.
III.1.4. Evaluarea activității antimicrobiene a amestecurilor fitochimice
III.1.4.1. Tulpini microbiene
Pentru testarea activității antimicrobiene s-au utilizat tulpini microbiene de referință, cât și izolate din clinică, apartinând bacteriilor Gram pozitive (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Enterococcus fecalis), Gram negative (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii) și microfungilor (Candida famata, C. utilis, C. albicans). Aceste tulpini sunt prezentate în tabelul 3.
Tabelul 3.Tulpini microbiene utilizate
1 Tulpini din colecția Laboratorului de Microbiologie a Facultății de Biologie, Universitatea din București
III.1.4.2. Screening-ul calitativ al activității antimicrobiene
Pentru testarea calitativă a activității antimicrobiene s-au preparat suspensii microbiene ajustate la 1.5×108 UFC/mL conform standardului nefelometric 0,5 McFarland din culturi de 18-24h dezvoltate pe mediu solid (geloză simplă pentru bacterii și Sabouraud pentru microfungi). Activitatea antimicrobiană s-a determinat prin metoda difuzimetrică adaptată, standardizată pentru controlul activității antimicrobiene a antibioticelor, de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Soluțiile stoc ce s-au utilizat pentru testarea calitativă a activității antimicrobiene au fost extractele vegetale alcoolice utilizând, de asemenea, martor de solvent etanol 70% și uleiurile volatile solubilizate în DMSO. Obținerea unei zone de inhibiție la nivelul spotului de amestec dispus pe mediul de cultură s-a considerat rezultat pozitiv și s-au măsurat diametrele.
III.1.4.3. Determinarea acțiunii sinergice dntre antibiotice și extractele alcoolice asupra sensibilității/rezistenței tulpinilor bacteriene
Principiul metodei constă în însămânțarea “în pânză” a inoculului lichid standardizat microbian, pe suprafața unui mediu agarizat. La distanțe egale se plasează discurile standardizate cu antibiotice, care se impregnează cu 10 µL de soluție stoc din extractele alcoolice studiate, care vor difuza în mediu, realizând un gradient de concentrație invers proporțional cu diametrul zonei de difuzie, deci cu distanța față de disc. Martorii utilizați au fost atât discurile de antibiotice, cât și discurile de antibiotice impregnate cu etanol 70%. Discurile standardizate de antibiotice au fost alese conform recomandărilor CLSI pentru fiecare tulpină microbiană și datelor din literatura de specialitate (Balakrishnan, 2003; Sivakumari, 2009) (Tabelul 4).
Antibioticele alese prezintă diferite mecanisme de acțiune ce s-ar putea corela cu acțiunea extractelor vegetale.
Tabelul 4. Antibioticele utilizate în funcție de tulpină și de extractul vegetal
III.1.4.4. Evaluarea cantitativă a efectului antimicrobian
III.1.4.4.1. Determinarea concentrației minime inhibitorii
Analiza cantitativă s-a realizat prin metoda microdiluțiilor seriale binare în mediu lichid (bulion simplu pentru bacterii și Sabouraud pentru microfungi), în plăci cu 96 de godeuri, utilizând control negativ (etanol 70% și DMSO).
Diluțiile testate aparțin intervalului 3,125 –100 µg/mL pentru fiecare tulpină testată în cazul soluțiilor stoc de ulei volatil în DMSO. Intervalul concentrațiilor soluțiilor stoc luate în lucru pentru extractele alcoolice au fost 0,78-400 µL/mL. Simultan s-au realizat diluții seriale cu DMSO și etanol 70% în aceleași condiții de lucru cu scopul de a obține controlul negativ. Fiecare godeu a fost inoculat cu 10 µL suspensie microbiană. Dupa 20-24 h de incubare la 37oC, CMI s-a stabilit atât macroscopic, ca fiind ultima concentrație la care nu s-a observat apariția creșterii microbiene, respectiv apariția turbidității mediului, cât și spectrofotometric. Absorbanța culturilor microbiene s-a măsurat la 620 nm cu ajutorul spectrofotometrului Apollo LB 911.
Pentru compușii și extractele care au precipitat în mediul lichid s-a realizat distribuirea în spot în placi cu mediu solid a unui volum de 5 µl din concentrații cuprinse între 12.5 – 200 μL/mL. Dupa 20 – 24h de incubare la 37oC s-a stabilit concentrația minimă microbicidă ca fiind cea mai mică concentrație la care nu s-a observat creștere microbiană.
III.1.4.4.2. Determinarea posibilului mecanism de acțiune al uleiului volatil de A. fruticosa asupra levurilor
III.1.4.4.2.1. Tehnica dinamicii efectului microbicid
Screening-ul calitativ al activității antimicrobiene s-a realizat prin tehnica dinamicii efectului microbicid, pentru a favoriza interpretarea corelativă între momentul apariției activității antimicrobiene și posibilul mecanism de acțiune. Principiul metodei constă în menținerea în contact a tulpinilor microbiene cu soluția stoc de ulei volatil (ulei volatil:DMSO, 1:1) după realizarea unei concentrații de testare cu efect microbicid predictibil, timp de 5 min, 30 min, 3h, 6h și 24h. Suspensia microbiană s-a însămânțat în spot, pe mediu de cultură Sabouraud solid repartizat în plăci în scopul determinării numărului de celule viabile. S-a realizat, de asemenea, și martor de solvent (DMSO).
III.1.4.4.2.2. Determinarea viabilității celulelor levurice prin marcarea cu iodura de propidiu
Pentru analiza citometrică, diluțiile seriale, în intervalul de concentrații 29.5–1.844 mg/mL s-au testat în trei variante de lucru, în care timpii de incubare pentru fiecare probă au fost: 3, 6 și 24 ore. Pentru marcare s-a utilizat ca fluorocrom iodura de propidiu, care absoarbe la 495 nm și emite la 637 nm (FL3) și se leagă specific de acizii nucleici. Concentrația fluorocromului a fost de 50 µL/mL, iar protocolul de colorare a fost aplicat la temperatura camerei timp de 10 min înainte de achiziția de date cu ajutorul citometrului FACS Calibur. Pentru analiza statistică și interpretarea histogramelor s-a utilizat programul Flowing Software 2.
III.1.4.4.2.3. Determinarea influenței uleiului volatil asupra activității pompelor de eflux
Pentru determinarea influenței uleiului volatil de A. fruticosa asupra funcționării pompelor de eflux s-au luat în lucru concentrații cuprinse între 29.5–1.844 mg/mL, care s-au testat în trei variante de lucru, în care timpii de incubare pentru fiecare probă au fost: 3, 6 și 24 ore. Pentru marcare s-a utilizat fluorocromul roșu de nil care se leagă specific de lipidele neutre, semnalul fluorescent emis pentru lipidele neutre marcate cu acest florocrom (580 nm) fiind achiziționat pe FL2, iar pentru lipidele polare (610 nm) pe FL3 (Guzman, 2010). Concentrația fluorocromului a fost de 50 µL/mL, iar protocolul de colorare a fost aplicat la temperatura camerei timp de 10 min înainte de achiziția de date cu ajutorul citometrului FACS Calibur. Pentru analiza statistică și interpretarea histogramelor s-a utilizat programul Flowing Software 2.
III.1.4.4.2.4. Cuantificarea modificărilor expresiilor genice ale genelor cdr1, cdr2 si mdr1 prin RT-PCR.
Izolarea ARNm din celulele levurice: Tulpinile levurice au fost cultivate în mediu Sabouraud lichid cu ulei volatil izolat din fructele de A. fruticosa la concentrație de CMI/4, timp de 3 ore la 37oC . După dezvoltare cultura a fost centrifugată 5 min la 10.000 rpm, iar 108cel/mL au fost resuspendate în TEG cu 10mg/mL yeast lytic enzyme, timp de 15 minute la 25oC. După etapa de liză celulele au fost resuspendate în 750µL TRIzol (Invitrogen) și incubate 10 min la temperatura camerei. Dupa 10 min s-au adaugat 0.2 mL cloroform și s-a agitat energic timp de 15 secunde, apoi probele au fost incubate timp de 3 minute la temperatura camerei și apoi centrifugate 15 min la 4oC 12.000 x rpm. Faza superioară a fost transferată într-un nou tub peste care s-au adăugat 0.5 mL izopropanol și probele au fost incubate 10 min la temperatura camerei, apoi centrifugate 12.000 x rpm 10 min la 4oC. Supernatantul a fost îndepărtat cu grijă apoi sedimentul a fost resuspendat într-un mL de etanol și centrifugat 7500 x rpm 10 min la 4oC. Supernatantul a fost aruncat și sedimentul a fost resuspendat în 30 µL apa DEPEC. Pentru dizolvarea completă, probele au fost ținute 10 minute la 55oC. Pentru verificarea integrității ARNm extras, probele au fost migrate în gel de agaroză de 2% în TBE 0.5×, timp de 15 minute (Fig. 23).
Fig. 23 Verificarea electroforetică a integrității ARNm
Evaluarea expresiei unor gene care codifică pentru pompele de eflux la C. albicans. Pentru acest studiu au fost selectate 3 gene (tabelul 5) respectiv:
– MDR (Multi Drug Resistance);
– CDR1 si CDR2 (Candida Drug Resistance)
Ca genă de referință s-a utilizat gena ACT care codifică pentru actină.
Tabelul 5.Secvențele primerilor și sondelor utilizate în experiment (Chau si colab., 2004):
După verificarea în gel de agaroză probele au fost purificate cu kitul RN-ase Free DNase (Promega) pentru a îndepărta resturile de ADN. După purificare s-a determinat concentrația și puritatea ARNm prin citire spectrofotometrică (tabelul 6).
Tabelul 6 Concentrațiile de ARNm obținute pentru fiecare probă
Pentru obținerea ADNc s-a folosit kitul Reverse Transcription System (Promega), iar în fiecare reacție s-a introdus 650ng ARNm.
În etapa de cuantificare genică s-a utilizat kitul agMan Universal PCR Master Mix kit (Applied Biosystems, USA) iar în reacția de amplificare au fost introduși 50ng ADNc, 900nM primer și 250nM sondă. Probele au fost rulate în plăci de 96 godeuri utilizând sistemul ABI Prism 7900 RT-PCR (Applied Biosystems, USA). Rezultatele au fost interpretate conform formulei ∆∆Ct.
III.1.5. Studiul influenței extractelor vegetale asupra expresiei unor factori de virulență microbieni
III.1.5.1. Evidențierea producerii factorilor de virulență solubili
Pentru studiul fenotipic calitativ al factorilor de virulență solubili s-au însămânțat microorganismele de testat pe medii de cultură selective pentru evidențierea: hemolizinelor, lecitinazelor, DN-azei, lipazei, hidrolizei esculinei, amilazei, cazeinazei și a gelatinazei. Mediile utilizate au la bază geloză suplimentată cu divese ingrediente necesare evidențierii producerii unor factori enzimatici solubili capabili să degradeze, utilizeze sau să modifice substratul respectiv. Tulpinile bacteriene (0.5 McFarland) utilizate au fost cultivate în pealabil în prezența concentrațiilor subinhibitorii (CMI/4) de amestecuri fitochimice.
Evidențierea producerii unor enzime cu rol de factori de virulență propriu-ziși
Factorii enzimatici de virulență sunt exoenzime produse și eliminate de bacteriile patogene, determinând capacitatea acestora de a invada un substrat celular, de a induce leziuni ale diferitelor tipuri de celule și țesuturi, și de a disemina în organism.
Evidențierea producerii de hemolizine: pentru evidențierea hemolizinelor s-au însămânțat în spot (5µL) amestecurile de tulpini bacteriene cu extractele vegetale aflate în concentrație CMI/4 pe geloză cu adaos 5% sânge de berbec și s-au incubat la 37oC timp de 24h. Reacția pozitivă s-a evidențiat prin formarea unui halou transparent în jurul spotului (Chifiriuc, 2011).
Evidențierea producerii de lecitinază: tulpinile bacteriene tratate cu concentrații subinhibitorii de extracte vegetale au fost însămânțate în spot pe geloză suplimentată cu galbenuș de ou (2,5%) și incubate pânaă la 7 zile, la 37oC. Apariția unui halou transparent în jurul ariei de creștere a fost considerat drept reacție pozitivă (producerea de lecitinază). Clarificarea rezultă din eliberarea lecitinei mai solubile din complexul lipidic al învelișului celular (prezența lecitinazei).
Evidențierea producerii de lipază: tulpinile bacteriene tratate cu concentrații subinhibitorii de extracte vegetale au fost însămânțate în spot pe geloză suplimentată cu 1% Tween 80 (monooleat de sorbitol) și incubate la 37oC până la 7 zile. Prezența unui halou opac, datorat cristalelor de oleat de Ca2+ insolubile (cristale formate între acizii grași eliberați și ionii de Ca2+), în jurul ariei de creștere indică producerea de lipază (Chifiriuc, 2011).
Evidențierea hidrolizei esculinei: tulpinile bacteriene tratate cu concentrații subinhibitorii de extracte vegetale au fost însămânțate în spot în mediu de geloză cu adaos de 1% esculină și citrat de fier. După incubare la 37oC, 24h, în urma hidrolizei esculinei (β-glicozid compus din glucoză și esculetol) se eliberează esculetolul (compus fenolic) ce poate coordina ionii de Fe3+ (citrat de Fe) generând astfel, formarea unui precipitat negru (Chifiriuc, 2011).
Evidențierea producerii de DN-aze. DN-azele bacteriene acționează asupra ADN bacterian din celulele lizate, eliberând mono- sau dinucleotidele necesare propriilor sinteze și permit diseminarea bacteriilor. Tulpinile au fost însămânțate în spot pe geloză cu ADN și albastru de toluidina (Merck, Germania) și incubate la 37oC, 24h. Hidroliza ADN este revelată prin apariția unui halou roz în jurul spotului de cultură, în timp ce restul mediului rămâne colorat în albastru (Chifiriuc, 2011; Lazăr, 2001).
Evidențierea unor enzime metabolice implicate indirect în virulența bacteriană
În contextul caracterizării complete a potențialului de virulență pentru tulpinile analizate s-a realizat evidențierea unor enzime metabolice, precum: amilazele și proteazele (gelatinaza și cazeinaza).
Evidențierea producerii de amilaze: amidonul este un polizaharid de glucoză cu masă moleculară mare care nu poate fi transportat prin membrana celulei bacteriene, fiind necesară secreția de amilaze extracelulare pentru a fi hidrolizat. Evidențierea amilazelor s-a realizat utilizând o geloză simplă la care se adaugă 1% amidon alimentar. După însămânțare, plăcile au fost incubate la 37oC, 24h. Hidroliza s-a revelat prin inundarea plăcii cu soluție de Lugol 1:2:300 diluată 1:1 cu apă distilată. Reacția pozitivă a fost indicată de prezența unui inel galben în jurul spotului, în timp ce restul mediului se colorează în albastru (Lazăr, 2001).
Evidențierea producerii de proteaze. Proteazele sunt enzime extra-celulare cu specificitate scăzută, care hidrolizează proteinele la peptide și aminoacizi. Pentru evidențierea proteazelor s-au utilizat diferite medii:
• evidențierea gelatinazei – geloză simplă cu adaos de gelatină: după incubare de 24h la 37oC, reacția pozitivă este indicată de prezența unui precipitat în jurul coloniei, datorat hidrolizei gelatinei.
• evidențierea cazeinazei – geloză simplă cu adaos de lapte: după incubare de 24h la 37oC, reacția pozitivă este evidențiată de formarea unui precipitatul alb-galbui de para-cazeinat de calciu care încercuiește haloul transparent din jurul zonei de creștere.
III.1.5.2. Evidențierea capacității de aderență microbiană la substrat inert – Testul poducerii de slime
Influența asupra capacității de aderență la substrat inert a fost cuantificată după efectuarea protocolului analizei cantitative a efectului antimicrobian (CMI) (capitolul III.4.3.1.). Prin metoda microtitrarii s-a evaluat biomasa aderată la pereții godeurilor microplăcii cu 96 de godeuri, la microscopul optic inversat, după spălarea de 3x cu AFS, fixare cu metanol rece (5 min) și colorare cu cristal violet (concentrație 1%, timp de colorare 15 min). Densitatea optică a materialului biologic aderat și resuspendat în acid acetic (CH3COOH 33%, agitare 150 rot/min, 15 min) s-a determinat prin citirea absorbanței la 490 nm.
III.1.5.3. Influența amestecurilor fitochimice asupra biofilmelor mature preformate, dezvoltate pe substrat inert
Determinarea influenței amestecurilor fitochimice asupra biofilmelor microbiene experimentale dezvoltate pe plăci cu 96 de godeuri
Studiul s-a realizat pentru variantele de extracte și uleiuri volatile care au prezentat concentrații minime inhibitorii sub 50 µL/mL. Biofilmele microbiene de 24h și 48h au fost formate în plăci cu 96 de godeuri sterile după cum urmează:
s-a adăugat mediu de cultură în fiecare godeu (TSB pentru bacterii, Sabouraud pentru microfungi);
s-au însămânțat toate godeurile cu un inocul microbian de densitate standard 0.5 McFarland (5 godeuri au fost păstrate ca martor de sterilitate a mediului);
s-au incubat plăcile 24h la 37oC;
plăcile au fost spălate de trei ori cu AFS, în scopul de a îndepărta celulele neaderate;
s-a adaugat mediu proapăt cu care s-a realizat o concentrație corespunzătoare valorilor CMI, CMIx3 și CMIx5 de amestec fitochimic;
s-au incubat plăcile 24h la 37oC;
pentru evaluarea biomasei aderate s-a utilizat testul producerii de slime (decris anterior III.5.2.).
s-a adăugat mediu de cultură în fiecare godeu (TSB pentru bacterii, Sabouraud pentru microfungi);
s-au însămânțat toate godeurile cu un inocul microbian de densitate standard 0.5 McFarland (5 godeuri au fost pastrate ca martor de sterilitate a mediului);
s-au incubat plăcile 24h la 37oC;
plăcile au fost spălate de trei ori cu AFS, în scopul de a îndepărta celulele neaderate;
s-a adăugat mediu de cultură în fiecare godeu și plăcile s-au incubat 24h la 37oC;
plăcile au fost spălate de trei ori cu AFS, în scopul de a îndepărta celulele neaderate;
s-a adăugat mediu proapat cu care s-a realizat o concentrație corespunsatoare valorilor CMI, CMIx3 și CMIx5 de amestec fitochimic;
s-au incubat plăcile 24h la 37oC, iar pentru evaluarea biomasei aderate s-a utilizat testul slime (decris anterior III.5.2.).
Exprimarea rezultatelor s-a realizat prin determinarea Indicelui de Inhibiție al Dezvoltării Biofilmului Pre-format (IIDBP%) care a fost calculat în funcție de valoarea absorbanțelor înregistrate la lungimea de undă 490 nm după formula:
IIDBP% = 100 – (Ap x 100 / A +), unde:
Ap = absorbanța biofilmului format și tratat cu amestecuri fitochimice,
A + = absorbanța biofilmului format netratat
Determinarea influenței amestecurilor fitochimice asupra biofilmelor microbiene experimentale dezvoltate pe secțiuni de sonde Foley
Pentru dezvoltarea biofilmului microbian de 24h și 48h s-au utilizat secțiuni de sonde Foley cu dimensiunile 4 x 5 mm: lungime x lățime, sterilizate timp de 20 min cu UV. Protocolul a fost adaptat după Anghel și colab., 2013. Etapele necesare pentru formarea biofilmelor de 24h și 48h și respectiv, tratamentul cu amestecurile fitochimice, sunt:
s-a adăugat 1 mL mediu de cultură în fiecare tub steril (TSB pentru bacterii, Sabouraud pentru microfungi);
cateterele au fost repartizate în tuburi
s-au însămânțat toate tuburile cu un inocul microbian de densitate standard 0.5 McFarland (1 tub cu cateter pentru fiecare experiment a fost păstrat ca martor de sterilitate a mediului);
s-au incubat tuburile 24h la 37oC;
în tuburi sterile s-a realizat o concentrație corespunzătoare valorilor CMIx3 de amestec fitochimic cu mediul de cultură;
cateterele au fost spălate cu PBS, în scopul de a îndepărta celulele neaderate, și au fost reluate în tuburile nou preparate;
s-au incubat 24h la 37oC;
cateterele au spălate cu PBS și introduse în tuburi sterile ce conțineau 1 mL PBS, s-au vortexat 60 secunde pentru a desprinde biofilmul microbian;
suspensia formată s-au realizat diluții zecimale successive și s-au spotat în plăci de geloză/Sabaoroud solid în scopul determinării UFC/mL; plăcile cu mediu solid au fost incubate 24h la 37oC.
s-a adăugat 1mL mediu de cultură în fiecare tub steril (TSB pentru bacterii, Sabouraud pentru microfungi);
cateterele au fost repartizate în tuburi
s-au însămânțat toate tuburile cu un inocul microbian de densitate standard 0.5 McFarland (1 tub cu cateter pentru fiecare experiment a fost păstrat ca martor de sterilitate a mediului);
s-au incubat tuburile 24h la 37oC;
cateterele au fost spălate cu PBS și reintroduse în tuburi cu mediu de cultură proaspat;
s-au incubat 24h la 37oC;
în tuburi sterile s-au realizat concentrații corespunzătoare valorilor CMIx3 de amestec fitochimic cu mediul de cultură;
cateterele au fost spălate cu PBS, în scopul de a îndepărta celulele neaderate, și au fost reluate în tuburile nou preparate;
s-au incubat 24h la 37oC;
cateterele au fost spălate cu PBS și introduse în tuburi sterile ce conțineau 1 mL PBS
s-au vortexat 60 secunde pentru a desprinde biofilmul microbian;
cu suspensia formată s-au realizat diluții zecimale successive și s-au spotat în plăci de geloză/Sabaoroud solid în scopul determinării UFC/mL;
plăcile cu mediu solid au fost incubate 24h la 37oC;
Rezultatele s-au exprimat pentru ambele variante de lucru, conform determinării numărului de celule microbiene viabile, aplicând relația:
lg(UFC/ml)= lg (N x 1/D x 102), unde:
N = media coloniilor numărate la nivelul celor trei spoturi,
102 = factorul de corecție al volumului,
1/D = diluția la care s-a efectuat citirea.
Determinarea comparativă a hidrofobicității celulelor planctonice și a celor incluse în biofilme
Pentru aprecierea comparativă a hidrofobicității învelișului celular pentru celule planctonice și sesile, precum și a modificărilor induse de amestecurile fitochimice studiate (protocol adaptat după Gora, 2010; Qiao, 2012) s-au realizat urmatoarele etape:
s-au realizat concentrații corespunzătoare valorilor CMI/4 de amestec fitochimic cu mediul la un volum final de 1mL (TSB pentru bacterii, Sabouraud pentru microfungi);
s-au însămânțat toate tuburile Eppendorf cu 200 µL inocul microbian de densitate standard 0.5 McFarland (pentru realizarea experimentului s-au utilizat controale negative, positive și de solvent) și s-au incubat 24h la 37oC;
celulele microbiene au fost spălate în prealabil de 2x cu PBS (program centrifugă: 10 min, 10000 rot/min), sedimentele au fost reluate în PBS și vortexate 120 sec.;
turbiditatea a fost ajustată la 2 McFarland și s-a citit spectrofotometric absorbanța la λ=600 nm (A0);
peste suspensia microbiană rămasă s-a adăugat 0.5 mL izooctan și s-a vortexat 120 sec.; probele au fost lăsate în repaus 60 min (moment în care cele două faze se separă complet), se preia cu o pipetă Pasteur faza organică și se citește abosrbanța la λ=600 nm (A1) a fazei apoase.
s-a adăugat 1mL mediu de cultură în fiecare tub steril (TSB pentru bacterii, Sabouraud pentru microfungi) și s-au repartizat cateterele în tuburi;
s-au însămânțat toate tuburile cu un inocul microbian de densitate standard 0.5 McFarland (s-au utilizat martori negativi, pozitivi și de solvent);
s-au incubat tuburile 24h la 37oC;
cateterele au fost spălate cu PBS și reintroduse în tuburi cu mediu de cultură proaspăt și s-au incubat 24h la 37oC;
cateterele au fost spălate cu PBS și reintroduse în tuburi soluții corespunzătoare valorilor CMI de amestec fitochimic cu mediu de cultură și s-au incubat 24h la 37oC;
cateterele au fost spălate și introduse în tuburi Eppendorf ce conțineau 1 mL PBS, probele s-au vortexat 120 sec. pentru desprinderea biofilmului microbian;
celulele microbiene au fost spălate în prealabil de 2x cu PBS (program centrifugă: 10 min, 10000 rot/min), au fost reluate în PBS și vortexate 120 sec., turbiditatea a fost ajustată la 2 McFarland și s-a citit spectrofotometric absorbanța la λ=600 nm (A0);
peste suspensia microbiană rămasă s-a adăugat 0.5 mL izooctan și s-a vortexat 120 sec., probele au fost lăsate în repaus 60 min (moment în care cele două faze se separă complet), se preia cu o pipetă Pasteur faza organică și se citește abosrbanța la λ=600 nm (A1) a fazei apoase.
Tehnica s-a executat comparativ pentru celule planctonice și celule incluse în biofilme monospecifice experimentale dezvoltate pe substrat inert (sonde Foley). Hidrofobicitatea suprafeței celulelor microbiene a fost exprimată ca aderență procentuală (%Adh) folosind formula:
%Adh = [1-(A1/A0)] x 100.
III.1.5.4. Influența extractelor vegetale asupra aderenței tulpinilor bacteriene la substrat celular
Metoda Cravioto modificată
Influența asupra capacității de aderență la substrat celular s-a realizat prin evaluarea tipului și respectiv al indicelui de aderență a tulpinilor microbiene, tratate cu concentrații sub inhibitorii de amestec fitochimic, la celulele eucariote, HEp 2 (Human Epithelioma, linie celulară standardizată) (metoda adaptată după Chifiriuc, 2011). Metoda are la bază urmatoarele etape:
substratul celular a fost dezghețat si menținut în mediu RPMI cu adaos de 10% ser fetal de vițel. Aceste celule au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri sterile;
monostratul celular a fost utilizat în momentul când nivelul de confluență a atins 70-80%;
tulpinile microbiene tratate sau netratate (control pozitiv) cu CMI/4 de amestecuri fitochimice au fost incubate 16-18h în TSB. După incubare probele au fost spălate de 3x și ajustate în PBS până la o densitate standard de 0,5 McFarland;
fiecare godeu ce conține celule HEp 2 a fost inoculat cu 10μL din această suspensie;
plăcile se incubează la 37oC, pentru 2h, timp în care bacteriile aderă la suprafața celulelor substratului;
monostratul celular infectat se spală cu PBS de 3x, se fixează cu metanol timp de 5 min și se colorează cu soluție de Giemsa 20 min, se spală godeurile cu apă;
după uscare, se examinează la microscop cu O.I. (obiectiv de imersie), determinându-se pattern-ul de aderență (localizat, difuz sau agregativ) și indicele de aderență (numărul de celule cu bacterii aderate/ 100 celule numărate).
Evaluarea aderenței la substrat celular prin tehnica citometriei în flux
Influența asupra capacității de aderență la substrat celular reprezentat de monocitele THP-1 s-a realizat prin tehnica citometriei în flux pentru uleiul volatile de A. fruticosa. Concentrația de ulei volatile luată în lucru a fost de CMI/4 realizată în mediu cu acid casiminic (mediu ce favorizează sinteza adezinelor). Metoda presupune urmatoarele etape:
suspensia de celule eucariote a fost dezghețată și menținută în mediu RPMI cu adaos de 10% ser fetal de vițel și repartizată în tuburi;
celuele bacteriene (0.5 McFarland) menținute în mediu cu acid casiminic și tratate cu ulei volatile, au fost inactivate termic 20 min;
acestea au fost marcate cu o soluție de FITC (100 µg FITC/ mL de NaHCO3 0.1M, soluție de pH = 9) timp de o ora la întuneric (fluorocromul utilizat absoarbe la 494 nm și emite la 521 nm (FL2) marcând specific celulele bacteriene);
celulele bacteriene au fost spălate în prealabil de 5x cu PBS (5 min la 1000 rot/min);
suspensiile bacteriene au fost puse în contact cu celulele eucariote timp de 8h.
Analiza capacității celulelor THP-1 de a endocita sau nu celulele bacteriene tratate cu uleiul volatile de A. fruticosa, s-a realizat prin citometrie în flux cu ajutorul citometrului FACS Calibur, observându-se doar celulele eucariote la care bacteriile marcate au aderat.
III.1.6. Activitatea antioxidantă și imunomodulatoare a fitoamestecurilor studiate
III.1.6.1. Prelucrarea amestecurilor fitochimice obținute din diferite plante invazive
Extractele obținute prin ultrasonicare au fost supuse evaporării la un volum ½ din volumul inițial de extract în etanol 70%. Extractele au fost concentrate cu ajutorul unui evaporator pe bază de N2 (TurboVap LV, Caliper Life Sciences) la o temperatură de 35°C și o presiune de 10 psi pentru a se evita posibilitatea de oxidare a compușilor fenolici.
Uleiurile volatile utilizate au fost dizolvate în DMSO în raport 1:1 pentru uleiurile volatile A. fruticosa și S. canadensis și 1:2 pentru uleiul volatil de A. annua.
III.1.6.2. Evaluarea citotoxicității amestecurilor fitochimice
III.1.6.2.1. Metoda Tripan blue
Celule HEp2 au fost cultivate în DMEM: F12 (Invitrogen, NY, SUA) suplimentat cu 10% ser bovin inactivat termic și penicilină / streptomicină la 37°C cu 5% CO2. După 24 de ore de tratament cu ulei volatil în diluții finale 1: 3000 și 1: 1000, celulele eucariote au fost recoltate de pe substrat, iar 50 µL din fiecare suspensie celulară a fost amestecată cu 50 µL Tripan blue. Acestea au fost observate și cuantificate cu ajutorul unui microscop optic.
III.1.6.2.2. Metoda MTT
Pentru extractele alcoolice efectul citotoxic s-a evaluat pe celule THP-1 (linie celulară monocitară derivată de la un pacient cu leucemie monocitară acută). Înainte de utilizare extractele alcoolice au fost diluate astfel încât diluția finală să fie 1% solvent utilizat.
Principiul metodei constă în capacitatea dehidrogenazelor mitocondriale de a scinda inelul tetrazolic al compusului 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT), de culoare galbenă, din celulele viabile și de a forma formazan, cristale de culoare albastru închis, care nu pot traversa membrana celulară, acumulându-se astfel în celulele viabile.
Efectul extractelor alcoolice asupra viabilității celulelor THP-1 a fost analizat prin metoda marcării cu bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu (MTT). Celulele au fost însămânțate cu o densitate de 10.000 de celule per godeu în 200 µL RPMI 1640 și au fost incubate 24h într-un incubator cu CO2. Extractele s-au adăugat la stratul celular la concentrații corespunzatoare intervalului 100 – 12.5 µL/mL în mediul de cultură celulară. După 24 de ore, godeurile au fost tratate cu 20 µL MTT (5 mg / mL soluție salină tampon fosfat in PBS) și s-au incubat la 37°C timp de 4 ore. Cristalele purpurii de formazan formate s-au dizolvat în izopropanol și absorbanța soluțiilor colorate s-a citit la 570 nm (protocol adaptat după Prabhakaran, 2013).
III.1.6.3. Determinarea acțiunii uleiurilor volatile asupra ciclului celular prin citometrie în flux
În plăci cu 6 godeuri au fost repartizate 3 x 105 celule în fiecare godeu și s-au tratat timp de 24 ore, cu ulei volatil în diluția finală 1: 3000 și 1: 1000. Pentru a evalua distribuția celulelor în diferite etape ale ciclului celular, celulele au fost tripsinizate, fixate cu etanol rece 70 % și depozitate peste noapte la -20°C. Celulele au fost spălate de două ori în PBS, și apoi incubate 15 min, la 37°C, cu RN-ază A (1 mg/mL) și marcate timp de 1 h cu iodură de propidiu (100 µg/mL). Achiziția a fost făcută folosind citometrul în flux Epics Beckman Coulter, iar datele au fost analizate cu ajutorul software FlowJo 8.8.6 (Ashland, Oregon, SUA).
III.1.6.4. Obținerea și determinarea activității tirozinazei
Obținerea extractului enzimatic: o cantitate de aproximativ 10 g material vegetal (tuberculi de H. tuberosus si fructe de P. americana) răcit și repede mărunit se introduce într-un mojar răcit în prealabil și se amestecă cu 5 mL tampon fosfat 0.1M, pH=7.2. Amestecul se mojarează cu câteva grame de nisip și se ultrasonichează. Se centrifugeaza, iar supernatantul se introduce într-o baie de gheață.
Determinarea activității enzimatice: într-o cuvă de sticlă se introduce 0.05-0.2 mL extract enzimatic și se completează la un volum total de 2 mL cu tampon fosfat 0.1M pH=6. Se adaugă 0.5 mL soluție DOPA 0.02M și după agitare se determină imediat absorbanța la 475 nm față de proba blank, la temperature ambiantă, notând extincția la timpul zero, apoi din minut în minut, timp de 5 minute.
III.1.6.5. Determinarea activității antioxidante a extractelor polifenolice prin metoda TEAC
Evaluarea activității antioxidante a extractelor polifenolice s-a realizat cu ajutorul testului TEAC (Trolox echivalent antioxidant capacity). Metoda se bazează pe capacitatea antioxidanților de a neutraliza activitatea radicalului ABTS•+, un cromofor albastru-verzui, care absorbe la 734 nm. Astfel, ABTS (2,20-azino-bis (3-etil-benzotiazolin-6-sulfonat)) este oxidat de radicalii peroxil sau alți oxidanți la radicalul cationic ABTS•+ care este intens colorat.
O soluție stoc stabilă de ABTS•+ a fost efectuată prin reacția unei soluții apoase de ABTS cu persulfat de potasiu și lăsat la întuneric, la temperatura camerei timp de 12-16 ore înainte de utilizare. Soluția de lucru ABTS•+ s-a obținut prin diluarea soluției anterior realizate în etanol conducând la o absorbanță de aproximativ 0.70, conform (Pellegrini, 2003) și (Prior, 2005). Rezultatele obtinute în prezența extractelor vegetale testate au fost exprimate în mmoli echivalenti Trolox per mL extract.
III.1.6.6. Determinarea activitatii antioxidante a uleiurilor volatile prin metoda DPPH
Metoda DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) este o metodă spectrofotometrică utilizată pentru a testa capacitatea compușilor de a îndepărta radicalii liberi sau de a dona protoni (fig. 24).
Fig.24. Neutralizarea radicalului DPPH● la DPPH de către antioxidanți
Activitatea antioxidanta atat a celor trei uleiuri volatile cat si a extractelor fenolice s-a evaluat prin scăderea absorbanței DPPH (%), comparativ cu timolul (martor pozitiv al reacției – uleiuri volatile) și acidul galic (martor pozitiv pentru extractele fenolice). Pentru determinarea activității antioxidante prin metoda DPPH s-au preparat câte 5 concentrații pentru fiecare proba astfel încât pe curba de calibrare să se încadreze reducerea absorbanței pentru 50% din radical. O probă din fiecare diluție (0.5 mL) a fost amestecată cu o soluție de DPPH în metanol (1.5 mL, 4 mg%) și s-a monitorizat timp de 30 min scăderea absorbanței măsurate la λ=517 nm (protocol adaptat după Robu și colab., 2012). DMSO si etanol 70% au fost folosite ca martori. Reducerea radicalului DPPH (%) a fost calculată conform formulei:
DPPH(%)=100 x [(AS-APb) / AS],
unde AS – absorbanța obținută pentru solvent după 30 de minute și APb – valoarea absorbanței probei după 30 minute (30 minute = timpul de reacție).
Valoarea IC50 (mg / mL), care este concentrația extractului / standardul care reduce 50% din concentrația de radicalii liberi, a fost calculat prin interpolare liniară pentru valorile calculate cu formula de mai sus și concentrața de ulei volatile studiat.
III.1.6.7. Evaluarea stresului oxidativ prin microscopie de fluorescență
Evaluarea activității antioxidante a amestecurilor fitochimice in vitro s-a realizat prin marcarea celulelor eucariote cu un colorant fluorogen. Fluorogenul utilizat este 2’7’-diclorofluorescein diacetat (DCFH-DA, Sigma-Aldrich). DCFH-DA, un compus nefluorescent care este scindat într-o primă etapă la DCFH (un compus nefluorescent) de esterazele celulare și apoi oxidat de intermediarii reactivi de oxigen (ROS) sau peroxidaze într-un produs de fluorescență verde (DCF; λex = 504 nm; λem = 524 nm) (Bratosin, 2007).
Protocolul, adaptat dupa Kanupriya si colab. (2005), Bratosin (2007), Kim si colab. (2010), Ahn si colab. (2012) si Chang si colab. (2001) consta in:
realizearea unei concentratii stock de 100 mM de DCFH-DA in DMSO care se conserva la -20oC;
prepararea unei solutii de lucru de 200 µM de DCFH-DA in PBS;
suspensia celulara utilizată este de 106 celule/mL;
incubarea celulelor cu fluorogenul timp de 30 min (concentratie finala 10 µM)
celulele se spală de 3x cu PBS și se incubează cu H2O2 (40 µM), cu și fără amestecuri fitochimice (200 µL/mL și 100 µL/mL pentru extracte alcoolice și 20 µL/mL și 10 µL/mL pentru uleiuri volatile) pentru 90 min;
celulele se examinează prin microscopie de fluorescență (obiectiv x20).
III.1.6.8. Analiza profilului citokinic al celulelor THP-1 prin tehnica ELISA
Pentru evaluarea profilului citokinic celulele THP1 au fost tratate in vitro cu extractele vegetale concentrate dar necitotoxice prin aplicarea tehnicii ELISA (Enzyme Linked Imunosorbent Assay). Pentru cuantificarea producerii de citokine s-au utilizat kituri standardizate necesare cuantificării de citokine din supernatante de cultură (Thermo Scientific), urmărindu-se instrucțiunile producătorului. S-a cuantificat nivelul interleukinelor (IL) 1β, 6, 8 și 10. Principalele etape ale reacției sunt:
– tapetarea godeurilor unei plăci cu 96 godeuri (Nunc) cu o soluție ce conține anticorpii primari;
– adăugarea probelor și a standardelor de citokine cu concentrații cunoscute;
– spălarea plăcilor pentru îndepărtarea proteinelor nelegate de anticorpul primar;
– adăugarea unei soluții ce conține anticorpii secundari biotinilați (de detecție), incubare și spalare;
– marcare cu Streptavidină HRP (Horseradish Peroxidase labeled Streptavidin), incubare și spalare;
– adăugara soluției pentru substrat și incubare la întuneric pentru dezvoltarea reacției de culoare;
– stoparea reacției și citirea absorbantelor prin diferența dintre valorile absorbanțelor la λ = 450nm și λ = 550nm.
Pentru calcularea concentrației (pg) valorile obținute pentru fiecare probă s-au interpolat pe curba standard, considerand valorile absorbanței corespunzătoare fiecărei concentrații cunoscute de proteină testată.
III.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII
Concentrațiile soluțiilor stoc ale extractelor vegetale exprimate în funcție de cantitatea de material vegetal per mL etanol 70% sunt redate în tabelul 7.
Tabelul 7 Concentrațiile soluțiilor stoc ale extractelor vegetale exprimate în mg material vegetal într-un mL de solvent (etanol 70%)
Cantitățile de ulei volatil (exprimate ca media a cel puțin 25 de extracții pentru fiecare specie) obținute din speciile studiate sunt prezentate în tabelul 8. Procentele au fost exprimate ca V/m, raportat la 100 g material vegetal uscat. În conformitate cu alte date de literatură, procentul de ulei volatil de A. fructicosa a variat între 0.76-0.85% (Stoyanova, 2003); pentru uleiul volatil de S. canadensis s-au obținut procente cuprinse între 0.3-1.9%, acesta diferind în funcție de perioada de recoltare, perioada de maturitate fiziologică dovedindu-se optimă (Kalemba, 1990). Rezultatele obținute pentru uleiul volatil de A. annua sunt în concordanță cu datele din literatură, care menționează concentrații cuprinse între 0.54–1.51%, în funcție de organul plantei care s-a supus extracției (Holm, 1997; Cavar, 2012; Charles, 1991; Woerdenbag, 1994).
Tabelul 8. Procentele de ulei volatil izolat din diferite plante invazive
III.2.1. Caracterizarea fizico-chimică a amestecurilor fitochimice
III.2.1.1. Conținutul total de polifenoli și flavonoide din extractele vegetale corelate cu rezultatele obținute prin HPLC
Calculul concentrației polifenolilor totali din extractele vegetale ale diferitelor țesuturi s-a făcut cu ajutorul curbei de etalonare, rezultatele fiind exprimate în µg (GAE) polifenoli totali/ mL extract. Din fig. 25 reiese că extractul din frunzele de F. japonica prezintă cea mai mare concentrație de polifenoli (63.02933 mg GAE/g planta uscata sau 1375.3 µg GAE/ mL extract) (Marinaș, 2014a), fiind urmată de extractele obținute din A. fruticosa frunze (54.70018 mg GAE/g planta uscata sau 903.1 µg GAE/ mL extract) (Marinaș, 2015 in press) și H. tuberosus frunze (53.29 mg GAE/g plantă uscată sau 1057.7 µg GAE/ mL extract). În cazul frunzelor de A. retroflexus (7.19 mg GAE/g planta uscata sau 119.1 µg GAE/ mL extract) s-au obținut valori similare datelor de literatură (Pacifico, 2008; Yang, 2008; rezultate publicate: Marinaș, 2014b). Se remarcă o diferență semnificativă între conținutul total de polifenoli al extractelor din frunze și respectiv, din tuberculii de H. tuberosus (Yuan, 2012). Extractele din frunzele de R. pseudoacacia au cea mai mare concentrație de polifenoli (Marinaș, 2014c).
Frunzele de G. triacanthos au cel mai înalt conținut în polifenoli (Bojilov, 2014; El-Sayed, 2013). Nu există raportări ale conținutului de polifenoli în flori.
În fig. 26 sunt prezentate concentrațiile de flavonoide exprimate în mg echivalenți de quercetin/ g plantă uscată și respectiv µg echivalenți de quecetin/ mL extract. Specia cea mai bogată în flavonoide a fost A. altissima (frunze: 1.82 mg QE/ g plantă uscată sau 63.26 µg QE/ mL extract; flori: 1.11 mg QE/ g plantă uscată sau 36.1901µg QE/ mL extract), reprezentând aproximativ 7.39% din totalul de polifenoli pentru frunze și respectiv 6.2% pentru flori. În frunze, datele din literatură menționează o concentrație mai crescută în flavonoide față de cea obținută în acest studiu (Luis, 2012).
Fig. 25 Conținutul total de polifenoli al plantelor invazive exprimat în µg/ mL extract
Dintre speciile studiate conținutul de flavonoidele din totalul de polifenoli reprezintă aproximativ 0.74% pentru R. pseudoacacia frunze, 0.72% pentru R. pseudoacacia semințe, 0.05% pentru R. pseudoacacia teci și 5.84% pentru R. pseudoacacia flori.
Pentru A. retroflexus: 2.75% frunze, 2.08% inflorescente; pentru H. tuberosus: 1.33% frunze, 6.58% tuberculi; pentru F. japonica 1% frunze; pentru P. americana: 2.86% frunze, 2.4% fructe (fig. 27), restul compușilor neidentificați putând fi taninuri, antociani, acizi fenolici, cumarine, s.a.
Fig. 26 Conținutul total de flavonoide al plantelor invazive exprimat în µg QE/ mL extract
Prin HPLC s-au identificat cei mai mulți compuși (tabelul 9) pentru extractele obținute din frunzele și florile de A.alitissima reprezentând aproximativ 38.49% și respectiv 27.08% din totalul de polifenoli cuantificați prin metoda Folin Ciocâlteu. Cel mai mare procent de compuși fenolici identificați în extractele realizate este 71.99% pentru G. triacanthos flori (componenții majoritari fiind acidul 4-hidroxibenzoic 199.968 μg/mL, quercetin 91.652 μg/mL și acidul clorogenic 25.706 μg/mL), urmat de A. retroflexus frunze (46.73% – epicatechina, catechina și rutin) și A. altissima frunze (38.49% – acid 4-hidroxibenzoic, acid clorogenic, p-cumaric și acid elagic), rezultate prezentate în tabelele 9 și 10.
Fig. 27. Conținutul în flavonoide din totalul de polifenoli identificați in țesuturile speciilor studiate.
Cu excepția tecilor de R. pseudoacacia, pentru care s-au identificat 8 compuși prin HPLC, rutinul se gasește în toate speciile luate în lucru. În cazul florilor de G. triacanthos s-a dovedit ca parfumul puternic este datorat conținutului în vanilină, o aldehidă fenolică. Conform datelor de literatură tulpina de F. japonica este o importantă sursă de resveratrol, compus cunoscut pentru beneficiile sale terapeutice (antimicrobian, antioxidant, imunomodulator și antitumoral), însă prin HPLC, acest compus nu a fost identificat în extractul obținut din frunzele acestei specii (Vastano, 2000; Filip, 2003).
Tabelul 9. Concentrațiile de polifenoli identificați în extractele hidroalcoolice (μg compus fenolic/ mL extract alcoolic)
Cea mai mare concentrație de polifenoli a fost identificată în frunzele de F. japonica reprezentând aproximativ 1% flavonoide restul compoziției chimice fiind alcatuită din alte clase de compuși cu structura fenolică (acidul 4-hidroxibenzoic fiind unul dintre componenții majoritari), tabelul 10.
Tabelul 10. Concentrațiile de compuși identificați prin HPLC și flavonoide din totalul de polifenoli cuantificat prin metoda Folin Ciocalteu
III.2.1.2. Conținutul total în betalaine
Betalainele, principalii pigmenți prezenți în rădăcina de sfeclă (Delgado et al., 2000) sunt coloranți alimentari cu aplicații medicinale. Betalainele se împart în două subclase structurale, și anume, betacianine de culoare roșu-purpuriu și betaxantine de nuanțe galbene. În funcție de conjugarea nucleului aromatic substituit al cromoforului 1,7-diazaheptametinium se produc modificări majore pentru maximul de absorbție de la 480 nm pentru betaxantine la 538 nm pentru betacianine. Diferența structurală dintre cele două subclase permite astfel o măsurare spectrofotometrică simultană a conținutului în acești pigmenți, fără a fi nevoie de o separare cromatografică sau electroforetică (Chandrasekhar și colab., 2015).
Pentru studiul de față s-au luat în lucru numai materialele vegetale pentru care se cunoaște prezența acestor compuși (P. americana și A. retroflexus) (Li si colab., 2015; Jerz si colab., 2008). În plus în cazul speciilor din genul Amaranthus există o betacianină specifică taxonului numită amarantin (Tanaka, 2008). Astfel din tabelul 11 se poate observa că pigmentul fructelor de P. americana este dat de conținutul în betacianine (76.11%), în timp ce pentru frunze s-a observat un conținut mai ridicat în betaxantine (P. americana frunze = 60.22% si A. retroflexus frunze = 61.42%).
Tabelul 11 Conținutul total în betalaine (µg/L) pe subclase de compuși
Conform Martinez și colab. (2015), betalainele prezintă un bun efect imunomodulator și antioxidant, reducând producția de anion superoxid și secreția de citokine pro-inflamatorii TNF-α și IL-1β, în timp ce nivelul de IL-10 crește semnificativ.
III. 2.1.3. Caracteriazarea compoziției chimice a uleiurilor volatile prin GC-MS
În tabelul 12 este prezentat conținutul relativ de compuși volatili din uleiul volatil de A. annua, de culoare galbenă, cu aromă caracteristică, exprimat ca procent din suprafața totală. Rezultatele se află în concordanță cu datele din literatură, conținutul mediu de ulei volatil variind între 0.54-1.51%, în funcție de organele supuse extracției (Holm, 1997; Cavar, 2012; Charles, 1991; Woerdenbag, 1993).
Tabelul 12. Compoziția chimică a uleiului volatil de A. annua obținută prin analiza GC-MS.
Un număr de 57 de compuși au fost identificați în uleiul volatil de A. annua, reprezentând 94.62% din suprafața totală. Principalii compuși identificați au fost α-pinen (o hidrocarbură monoterpenică biciclică), camfor (o cetonă biciclică monoterpenică), germacren D (o hidrocarbură sesquiterpenică) și eucaliptol (un eter monoterpenic biciclic), care au cele mai mari arii relative, adică 9.66%, 17,74%, 7.55% și respectiv 7.24%. Uleiul volatil conține hidrocarburi monoterpenice (17.74%), hidrocarburi sesquiterpenice (27.22%), monoterpene oxigenate (41.22%) și sesquiterpene oxigenate (7,75%) (fig. 28).
Fig. 28. Procentele compoziției chimice aflate pe clase de compuși pentru uleiul volatil de A. annua
Tabelul 13. Compoziția chimică a uleiului volatil de A. fruticosa obținută prin analiza GC-MS
Uleiul volatile de A. fruticosa este incolor și prezintă o aromă caracteristică. În tabelul 13 este prezentat conținutul relativ de compuși volatili din uleiul volatil de A. fruticosa, exprimat ca procent din suprafața totală.
S-au identificat 24 de compuși reprezentând 94.92% din suprafața totală. Principalii compuși identificați au fost δ-cadinene, γ-muurolene, α-muurolene și γ-cadinene, care au cele mai mari arii relative, adică 20.09%, 12.79%, 12.54% și respectiv 7.86%. Astfel, acest ulei volatil conține hidrocarburi monoterpenice (2.15%), hidrocarburi sesquiterpenice (82.74%), monoterpene oxigenate (2.66%) și sesquiterpene oxigenate (7.37%) (fig. 29), fiind preponderente hidrocarburile sesquiterpenice, compuși ce ofera un caracter fitotoxic mai pronunțat (Kobaisy, 2002).
Literatura de specialitate mentionează o compoziție chimică complet diferită, însă s-a observat că uleiul volatil obținut de Ivănescu et al. (2014) a avut culoarea galbenă. În acest studiu culoarea uleiului volatile de A. fruticosa fructe obținut a fost incolor observându-se, de asemenea, și o activitate antimicrobiană mult mai bună.
Fig. 29. Compoziția chimică exprimată în procente a claselor de compuși din uleiul volatil de A. fruticosa.
Uleiul volatil de S. canadensis are o culoare galben-verzui prezintă o aromă caracteristică. În tabelul 14 este prezentat conținutul relativ de compuși volatili din uleiul de S. canadensis, exprimat ca procent din suprafața totală.
S-au identificat 27 de compuși reprezentând 91.23% din suprafața totală. Principalii compuși identificați au fost α-pinen, germacren D, limonen și acetat de bornil, care au cele mai mari arii relative: 27.91%, 13.19%, 12.29% și respectiv 5.77%. Astfel, acest ulei volatil conține hidrocarburi monoterpenice (47.12%), hidrocarburi sesquiterpenice (23.08%), monoterpene oxigenate (15.11%) și sesquiterpene oxigenate (5,92%) conform fig.30, fiind preponderente hidrocarburile monoterpenice, rezultatele corelandu-se cu literatura de specialitate (Kalemba, 1990; YeCheng, 2014).
Tabelul 14. Compoziția chimică a uleiului volatil de S. canadensis obținută prin analiza GC-MS.
Fig.30 Compoziția chimică exprimată în procente ale claselor de compuși din uleiul volatil de S. canadensis
III.2.1.4. Conținutul total de carotenoide
În fig. 31 se poate observa conținutul total de carotenoide raportat la dreapta de calibrare realizată pentru diferite concentrații de β-caroten, iar pentru tuberculii de H. tuberosus concentrația de carotenoide tinde spre zero. Valoarea cea mai mare a conținutului total de carotenoide s-a obținut în cazul extractului eteric din frunzele de A. fruticosa (363.91 μg carotenoide exprimate ca β-caroten/g plantă uscată), sugerând astfel posibilitatea utilizării acestei specii ca sursă de pro-vitamină A (Patrick, 2000; Druesne-Pecollo, 2010), de asemenea în literatura de specialitate nu s-au identificat date referitoare la conținutului total de carotenoide pentru această specie.
Conform literaturii, conținutul total de carotenoide obținut a fost considerabil mai scăzut în acest studiu pentru inflorescențele de S. canadensis, însă frunzele au un conținut mult mai ridicat în carotenoizi (314.57 μg carotenoide exprimate ca β-caroten/g plantă uscată) (Horvath, 2010).
Fig. 31Cantitățile de carotenoizi totali din extractele vegetale studiate exprimate în μg carotenoizi (exprimați ca β-caroten)/ g plantă uscată
După Arcuș și colab. (2011) printr-un screening calitativ nu s-a detectat prezența carotenoidelor în cazul florilor de A. retorflexus, însă în acest studiu în urma dozării acestei clase de compuși s-a obținut o concentrație de 3.67 μg β-caroten/ g plantă uscată.
III.2.2. Caracterizarea capacității fitotoxice a amestecurilor fitochimice studiate
Compușii polifenolici precum și terpenele sunt cunoscute pentru proprietățile lor alelopatice. În acest context, s-a evaluat potențialul fitotoxic al speciilor invazive prin efectul amestecurilor fitochimice asupra germinării semințelor de T. aestivum pentru diferite extracte obținute din organe de reproducere și vegetative, precum și hidrodistilatele obținute după izolarea uleiurilor volatile.
III.2.2.1. Caracterul fitotoxic evidențiat macroscopic
Rezultatele măsurării lungimii rădăcinilor principale pentru martor și pentru amestecurile de compuși fitotoxici, la fiecare concentrație, pe parcursul a 5 zile sunt redate în fig. 32.
Modificările macroscopice ale rădăcinilor embrionare și ale epicotilului după 120 h în funcție de tipul și concentrația soluției testate sunt prezentate în tabelul 15.
Fig. 32 Alungirea radiculară în funcție de timpul de acțiune și de concentrațiile de extract ale diferitelor specii de plante invazive.
Tabelul 15. Evaluarea macroscopică a efectelor fitotoxice asupra plantulelor de grâu menținute 120 h în soluțiile de testat
Din tabelul 15 și fig. 32 – 38 se poate observa că soluțiile apoase testate inhibă complet alungirea radiculară la soluția de extract cea mai concentrată. Extractele obținute din organele de reproducere ale speciilor studiate au efecte fitotoxice intense.
Tabelul 16. Statistici descriptive pentru măsurătorile rădăcinilor principale efectuate în primul experiment
*Toate valorile au fost egale cu 10.00, prin urmare, intervalul de încredere a fost imposibil de calculat.
Pentru investigarea efectului fitotoxic, analiza variației one-way sau two-way (ANOVA) pentru extractele testate și concentrațiile lor nu s-a putut utiliza, deoarece testul Levene a arătat că omogenitatea varianței nu a fost îndeplinită (p<0.01 pentru diverse grupuri testate), deși normalitate a fost confirmată prin mai multe comparații.
Statisticile descriptive pentru colectarea datelor în primul experiment sunt prezentate în tabelul 16, pentru al doilea experiment, rezultatele sunt incluse în tabelul 17, iar pentru experimentul al treilea în tabelul 18. Intervale de încredere de 95% au fost obținute cu testul t pentru scopuri pur estimative, presupunând o distribuție normală, cu toate că în unele cazuri, distribuția nu a fost normală.
Tabelul 17. Statistici descriptive pentru măsurătorile rădăcinilor principale efectuate în al doilea experiment
*Toate valorile au fost egale cu 10.00, prin urmare, intervalul de încredere a fost imposibil de calculat.
Table 18. Statistici descriptive pentru măsurătorile rădăcinilor principale efectuate în al treilea experiment (zi 3)
*Toate valorile au fost egale cu 10.00, prin urmare, intervalul de încredere a fost imposibil de calculat.
Există o diferență semnificativă statistic în efectul inhibitor asupra creșterii rădăcinii principale pentru cele cinci extracte evaluate în primul experiment (Amaranthus frunze, Robiniafrunzele, semințe și fructe, Helianthum tuberosus tuberculi) și grupul de control (H = 59.21, df = 5, p <0.0001, n = 124, KW). Mărimea efectului inhibitor pentru extracte, exprimată prin epsilon pătrat a fost 0.4814, ceea ce înseamnă că aproximativ jumătate din variabilitatea observată în alungirea radiculară în primul experiment este legată de tipul de extract testat. Analiza post-hoc cu ajustare Holm pentru comparații multiple a indicat că toate extractele cu excepția frunzelor de Robinia pseudoacacia au un efect inhibitor asupra creșterii rădăcinii în comparație cu grupul de control (p a variat între 0.0220 pentru Amaranthus folium și valori mai mici de 0.0001 pentru celelalte extracte). Diferența statistică între lungimile rădăcinilor măsurate pentru extractul din frunzele de salcâm și pentru grupul de control au fost foarte aproape de pragul de semnificație statistică convențională (p = 0.0583). Comparațiile post-hoc, de asemenea, au arătat că au existat diferențe semnificative statistic între aproape toate extracte investigate (p <0.0359); singurele excepții observate au fost cele dintre extractele obținute din frunzele de Amaranthus și Robinia pseudoacacia (p = 0.7597) și între extractele obținute din semințele de Robinia și tuberculii de Helianthus tuberosus (p = 0.7597).
Efectul de inhibiție este diferit statistic pentru cele patru extracte evaluate în al doilea experiment (flori de Amaranthus, frunze de Fallopia japonica, frunze de Phytolacca americana, frunze de Ailanthus altissima) și grupul de control (H = 24.0083, df = 4, n = 126, p <0.0001, Kruskal-Wallis). Pentru acest grup, mărimea efectului exprimat prin epsilon pătrat a fost 0.1921, ceea ce înseamnă că doar aproximativ 20% din variabilitatea observată în acest experiment a fost atribuită extractului. Toate extractele cu excepția celui obținut din florile de Amaranthus au avut un efect inhibitor semnificativ statistic asupra creșterii rădăcinii în comparație cu grupul de control (p a variat între 0.0118 pentru Fallopia japonica și 0.0009 pentru frunzele de Ailanthus altissima). Absența unei diferențe semnificative pentru extractul preparat din florile de Amaranthus este legată de diferența efectelor observate între cele trei concentrații diferite: la cea mai mare concentrație s-a observat o inhibare aproape completă, concentrația intermediară a avut un efect inhibitor moderat, în timp ce la cea mai mică concentrație a fost înregistrat un efect stimulator asupra creșterii rădăcinii. Prin urmare, la nivel global nu există nici o diferență față de grupul de control, dar pentru a înțelege în mod corect efectele acestui extract este necesară observarea efectelor specifice fiecărui nivel de concentrație.
O diferență semnificativă statistic a fost dată de efectul inhibitor asupra creșterii rădăcinii principale pentru cele șapte extracte evaluate în al treilea experiment (fructe de Phytolacca americana, frunze de Helianthus tuberosus, flori de Ailanthus altissima, flori de Gleditschia triacanthos, flori de Robinia pseudoacacia, frunze de Amorpha fruticosa, frunze de Gleditschia triacanthos) și grupul de control (H = 69.08, df = 7, p <0.0001, n = 199, KW). Mărimea efectului de inhibiție a extractului, exprimată prin epsilon pătrat a fost de 0.3489; cu alte cuvinte, aproximativ o treime din variabilitatea observată pentru lungimea rădăcinilor, și în al treilea experiment, este legată de extractul testat.
Analiza post-hoc folosind testul Wilcoxon cu ajustare Holm pentru comparații multiple a indicat că exceptând extractul din frunzele de Helianthus tuberosus, toate celelalte extracte au un efect inhibitor asupra creșterii rădăcinii în comparație cu martorul de grup (p a variat între 0.0062 pentru florile de salcâm, 0.0025 pentru florile de Gleditschia triacanthos și mai puțin de 0.001 pentru celelalte extracte). În cazul frunzelor de Helianthus tuberosus, comparația în care concentrația este factorul independent, arată că nu există o diferență semnificativă între acest extract și grupul de control, efect determinat în principal de cel mai scăzut (0.13%) și înalt nivel de concentrație (0.93%, 1.86%) asupra lungimii rădăcinii (tabelul 18).
S-a testat, de asemenea, influența concentrației asupra alungirii radiculare prin testul Kruskal-Wallis observându-se un efect semnificativ (H = 82.9451, df = 13, p <0.0001, n = 114 – pentru primul experiment, H = 97.7556, df = 11, p <0.0001, n = 119 – pentru al doilea experiment, H=179.2252, df=20, p<0.0001, n=189 – pentru al treilea experiment). Epsilon pătrat pentru modelele în care concentrația este variabila independentă a fost mai mare decât pentru modelele în care tipul de extract a reprezentat variabila independentă: 0.6743 pentru primul experiment, 0.7820 pentru al doilea și 0.9533. Acest lucru indică faptul că efectul asupra creșterii rădăcinii principale este dependent considerabil de concentrație
În cazul extractului din frunzele de R. pseudoacacia, singura diferență care a fost semnificativă statistic a fost între cea mai mică și cea mai mare concentrație (p = 0.0234). În cazul semințelor de Robinia, concentrațiile mai mari (1.92%, 0.96%) nu diferă semnificativ în efectul lor inhibitor (care este totală, o inhibiție de 100%), dar acestea diferă în mod semnificativ de cea mai mică concentrație (0.19%), pentru care efectul inhibitor este submaximal (indice de inhibiție 78%). În cazul tecilor de Robinia, efectul inhibitor față de cea mai mare concentrație (1.74%) este semnificativ diferit de cel observat la concentrația intermediară (0.87%) și respectiv cu cea mai scăzută concentrație testată (0.17%), dar între cele mai diluate concentrații diferența văzută nu este semnificativă statistic (p = 0.2438). Pentru Amaranthus folium, există diferențe semnificative între efectele observate raportate la cea mai mică concentrație (0.17%, pentru care nu a fost înregistrată nici o diferență semnificativă față de grupul de control) și cele superioare (0.84%, 1.66%, pentru care a fost descris un efect moderat de inhibare asupra creșterii rădăcinii principale), dar nu și între cele mai diluate concentrații. În cazul extractului obținut din Helianthus tubera, diferențele între efectele asupra creșterii rădăcinii au fost statistic semnificative pentru toate cele trei concentrații investigate.
Pentru extractele obținute din florile de Amaranthus și frunzele de Fallopia japonica, diferențele dintre efectele observate la fiecare nivel de concentrație au fost semnificative pentru toate nivelurile investigate (deși testul Wilcoxon nu a relevat o diferență semnificativă față de martor si cele mai mici două concentrații). Pentru extractul din frunzele de Ailanthus altissima și Phytolacca americana, diferențele au fost semnificative între concentrația minimă și cea superioară, dar nu și între ultimele două concentrații (evident, deoarece în ambele cazuri, nivelul de inhibare la prima concentrație a fost completă, 100%).
Efectele observate pentru extractele de flori de Gleditschia triacanthos, flori de Robinia pseudacacia și frunze de Amorpha fruticosa au fost semnificativ diferite între fiecare nivel de concentrație, observându-se o scădere treptată a efectului inhibitor (p <0.0001 pentru fiecare dintre ele). Nu există nici o diferență semnificativă între concentrațiile extractelor din frunzele de G. triacanthosde 1.05% și 2.10%, efectul de inhibare fiind practic complet pentru ambele concentrații (p = 0.1406), spre deosebire de concentrația de 0.15%, care pare a avea un efect ușor stimulator asupra creșterii rădăcinilor, cu toate că acest efect nu este semnificativ (p <0.0001 pentru 0.15%, față de 1.05 și 2.10%). În cazul extractului din fructe de Phytolacca americana, la niveluri de concentrație mai mari (3.00%, 1.50%), există o diferență mai mică (p = 0,0118) între efectul inhibitor decât diferența văzută dintre aceste niveluri superioare și ultima concentrație (0.21% ) (p <0.0001). Același lucru este valabil pentru extractul din flori de Ailanthus altissima (p <0.0001 pentru cea mai mică concentrație față de cea mai mare concentrație luată în lucru și 0.0013 pentru compararea nivelurilor mai ridicate dintre ele). În cazul extractului din frunze de Helianthus tuberosus, concentrațiile scăzute (0.13 și 0.93%) diferă mult de cea mai mare (1.86%) (p <0.0001), în timp ce diferența dintre concentrațiile inferioare este mai mică (p = 0.0052).
Rezultatele statistice pentru fiecare hidrodistilat sunt prezentate în tabelul 19. Deoarece distribuția nu a fost normală, s-a aplicat bootstrapping (2000 replicări) pentru a calcula procentul de sortare 20%, descrierea tendinței centrale (în afară de mediană) și calcularea intervalelor de încredere de 95% prin bootstrap bias-corrected accelerated (bCA).
Tabelul 19. Statistici descriptive pentru măsurătorile rădăcinilor principale efectuate în al treilea experiment (ziua 3)
*Toate valorile au fost egale cu 10.00, prin urmare, intervalul de încredere a fost imposibil de calculat.
Toate cele trei hidrodistilate au inhibat aproape complet creșterea rădăcinilor de Triticum (indicele de inhibiție fiind de 100% pentru toate cele trei uleiuri volatile). Testul Kruskal-Wallis a arătat un efect semnificativ de inhibare pentru lungimea rădăcinii (H = 29.76, df = 3, p <0,0001). Mărimea efectului, exprimată prin epsilon pătrat a fost de 0.8266. Lungimea rădăcinii a rămas în esență neschimbată, spre deosebire de grupul de control (p <0,0001 pentru toate cele trei hidrodistilatele, testare Wilcoxon cu ajustare Holm). Nu există nici o diferență semnificativă în efectul asupra creșterii rădăcinii pentru cele trei hidrodistilate (p = 0,80 pentru A. annua versus A. fruticosa și S. canadensis și p = 0.41 pentru A. fruticosa versus S. canadensis), inhibarea a fost practic completă pentru toate aceste fitoamestecuri. Compușii polifenolici identificați pezintă o acțiune fitotoxică sinergică asupra capacității de germinare a semințelor de T. aestivum. Astfel, dintre extractele apoase testate s-a observat că cele obținute din organele de reproducere sunt puternic fitotoxice, inhibând total alungirea radiculară. Prin urmare, s-a observat că extractele cu un conținut mai mare în acizi hidroxibenzoici prezintă un caracter puternic fitotoxic spre deosebire de cele cu un conținut mai ridicat de acizi hidroxicinamici. Conform literaturii de specialitate flavonoidele prezintă un caracter mai redus de mitoinhibiție (Reigosa si Pazos-Malvido, 2007). O posibilă explicație pentru acest lucru este faptul că leziunile oxidative sunt mai mari la plantele tratate cu acizi hidroxibenzoici, deoarece acestea au un efect antioxidant mai slab. O altă explicație ar putea fi faptul că acești compuși au interacțiuni mai eficiente cu enzimele celulare (Campos et al., 2003).
III.2.2.2. Caracterul fitotoxic evidențiat microscopic
Examenul microscopic permite determinarea modificărilor filmului mitotic induse de extractele fitotoxice asupra vârfului radicular de Triticum aestivum. Determinările se fac comparativ cu un martor, ce conține apă distilată, menținut în condiții similare cu probele.
Rădăcinile embrionare de T. vulgare au fost secționate la aproximativ 5 mm distanță de varf și colorate cu orceină acetică diluată, conform procedeului La Cour. Procedeul se bazează pe afinitatea pentru cromatină a orceinei în mediul acid, pH-ul acid fiind necesar pentru hidroliza materalului cromatic din meristeme care se colorează în roșu-violet. Pentru interpretarea modificărilor filmului mitotic induse de soluțiile de testat s-au observat fazele mitozei normale ale martorului: interfaza, profaza, metafaza, anafaza si telofaza.
Interfaza – nucleul celulelor meristemice este bine conturat, are aspect granular, reticulat, se observă nucleolii, cromozomii nu sunt individualizați, cromatina fiind dispusă sub formă de rețea.
Profaza – perioada în care cromozomii devin vizibili ca rezultat al spiralizării și condensării. Profaza mitozei se caracterizeazã prin urmãtoarele procese:
dublarea centriolilor (încã din interfazã) și migrarea lor spre polii celulei;
condensarea cromatinei și evidențierea cromozomilor;
degradarea nucleolilor și a membranei nucleare;
formarea fusului de diviziune (în celulele animale fusul de diviziune este radial, iar în celulele vegetale este plan);
amestecul carioplasmei și hialoplasmei.
Metafaza – etapa în care cromozomii sunt delimitați și se aranjeazã în regiunea ecuatorială a celulei. Metafaza este stadiul în care se pot stabili, cu deosebită precizie, numărul, forma, mărimea cromozomilor specifici fiecărei specii. În metafază poate să continue degradarea membranei nucleare. Particularitățile metafazei sunt urmãtoarele:
aranjarea cromozomilor în planul ecuatorial al celulei;
formarea plăcii metafazice;
aranjarea cromozomilor în formă de stea (cu centromerul spre centru);
fixarea cromozomilor prin intermediul fusului de diviziune (fusul de diviziune este alcătuit din fibrele centriolo-cromozomiale și fibrele centriolo-centriolare).
Anafaza constă în clivarea longitudinală a cromozomilor și deplasarea lor spre polii opuși ai celulei. Astfel, la polii celulei se formează două seturi de cromozomi cu aceeași constituție genetică ca și nucleul celulei-mamă. Anafaza se caracterizează prin:
deplasarea cromatidelor fiecărui cromozom spre polii celulei;
aranjarea cromatidelor în timpul deplasării în conformitate cu poziția centromerului.
Telofaza se caracterizează prin formarea la fiecare pol al celulei a câte unui nucleu separat, care, după despiralizarea cromozomilor, devine optic omogen. Spre sfârsitul telofazei apar nucleolii. Conținutul nucleolilor este similar cu cel al celulei-mamă. Telofaza se caracterizează prin:
decondensarea cromozomilor;
formarea unei noi membrane nucleare;
formarea nucleolilor;
degradarea fusului de diviziune și formarea septului celular;
citochineza și formarea a două celule-fiice identice cu celula-mamă (O'Connor, 2008; Lloyd, 2006).
Modificările cariochinezei produse de extractele studiate sunt redate în tabelele 20-28 și fig. 38.
Tabelul 20. Modificările filmului mitotic induse de extractele obținute din R. pseudoacacia
Tabelul 21. Modificările filmului mitotic induse de extractele obținute din H. tuberosus
Tabelul 22. Modificările filmului mitotic induse de extractele obținute din A. retroflexus
Tabelul 23. Modificările filmului mitotic induse de extractele obținute din G. triacanthos
Tabelul 24. Modificările filmului mitotic induse de extractele obținute din A. altissima
Modificările filmului mitotic au fost observate folosind metoda de colorare cu orceină acetică. Principalele modificări cariochinetice produse sunt cuprinse în tabelele 20 – 28, conducând la concluzia că efectul de inhibare totală a alungirii radiculare pentru primele concentrații se datorează acțiunii asupra diviziunii celulare. Această acțiune se poate datora compușilor polifenolici prezenți în extractele testate și fracțiilor semivolatile și hidrofile din compoziția hidrodistilatului obținut în urma extracției uleiurilor volatile de A. annua herba, fructe de A. fruticosa și inflorescențe de S. canadensis.
Fig. 39 Imagini microscopice ce evidentiază modificările cariochinezei induse de diferite concentrații ale extractelor studiate: 1. Inhibare de cineze. Nuclei cu nucleoli hipertrofiați. Inceput de profază; 2. Nuclei cu nucleoli hipertrofiați, profaze, aspect de citotoxicitate; 3. Nuclei cu nucleoli hipertrofiați, telofază în tropocineză, metafaze dezorganizate; 4. Profaze, pereți ondulați; 5. Profaze, anafază cu cromozomi retardați; 6. Inhibare de cineze. Nuclei cu 2-3 nucleoli hipertrofiați. nceput de profază; 7. Anafază cu punți, telofază normală; 8. Anafază în tropocineză; 9. Aspect de citotoxicitate; 10. Inhibare de cineze. Nuclei cu 2-3 nucleoli hipertrofiați. Inceput de profază; 11. Mitoinhibiție, material nuclear dispersat în celulă; 12. Nucleu alungit cu 3 nucleoli;
Tabelul 25. Modificările filmului mitotic induse de extractele obținute din P. americana
Pentru a confirma proprietățile alelopatice, literatura de specialitate mentionează următorii compuși ce au fost testați individual: acizii clorogenic, galic, feluric, syringic, vanillic, p-hidroxibenzoic, protocatehic, cafeic, p-cumaric, catechina, quercetina, rutin și 3,4-dihidroxibenzaldehidă, ca inhibă creșterea alungirii rădăcinilor fiind însă un efect dependent de concentrația compușilor testați (Chou, 1992; Batish, 2008; Reigosa, 2007). Pentru majoritatea compușilor fenolici s-au confirmat proprietățile alelochimice (Chou, 1991; Li, 2010). Dintre compușii cu proprietăți alelopatice enumerate mai sus, o parte din aceștia se găsesc și în extractele apoase luate în lucru.
Tabelul 26. Modificările filmului mitotic indus de extractul obținut din frunzele de F. japonica
Tabelul 27. Modificările filmului mitotic induse de extractul obținut din frunzele de A. fruticosa
Dintre compușii identificați în extractele polifenolice, catechina și epicatechina sunt cei mai importanți compuși cu proprietăți aleloaptice (compuși prezenți în aproape toate extractele studiate), cunoscându-se factorii care pot influența producția, eliberarea sau activitatea acesteia: biota solului, chimia solului, nivelul nitrificării, diferențele biogeografice în sensibilitatea speciilor autohtone și alohtone, factori abiotici (lumina) (Inderjit, 2011). În general, hidrodistilatele conțin procente ridicate de fenoli și alcooli monoterpenoidici, dar nu conțin hidrocarburi monoterpenoidice, acest fapt se datorează, probabil, volatilității lor ridicate, ceea ce duce la pierderea acestor compuși în timpul procesului de extracție a uleiurilor volatile (Rădulescu, 2009).
Tabelul 28. Modificările filmului mitotic induse de hidrodistilate
Prin acest studiu s-a demonstrat una dintre trăsăturile principale ale plantelor invazive, observându-se, de asemenea, că extractele studiate alterează puternic diviziunea celulară, inducând în mod semnificativ anomalii mitotice, cum ar fi telofaze în punte, nucleoli hipertrofiați și retardați, pereți celulari deformați și conținut nuclear prezent în afara celulei și total dispersat. Astfel, apariția acestor anomalii se pot datora fie prin interacția compușilor polifenolici cu proteinele implicate în mitoză (nucleoli hipertrofiați și retardați) (Aksoy, 2012; Tripathy, 2013), efect clastogenic (formarea punților sau dispersarea totală a materialului nuclear) (Jităreanu, 2013), fie datorită degradării peretelui celular conducând astfel la eliberarea materialului genetic din celulă.
III.2.3. Activitatea antimicrobiană a amestecurilor fitochimice
III.2.3.1. Caracterizarea activității antimicrobiene a amestecurilor fitochimice și a principalilor compuși identificați
În cadrul testării calitative a sensibilității microbiene la extractele alcoolice testate cât și la uleiurile volatile izolate din diferite specii invazive s-au evidențiat zone de inhibiție în diferite variante de lucru față de toate tulpinile studiate, extractele fiind mai active asupra tulpinilor Gram pozitive și microfungilor apartinând genului Candida (fig. 40). De asemenea, s-a utilizat martor de solvent etanol 70% prezentând o activitate redusă asupra tulpinilor K. pneumoniae, A. baumannii și Candida sp. Dimetilsulfoxidul nu a mainfestat activitate pe niciuna din tulpinile microbiene studiate. Aprecierea calitativă a extractelor alcoolice este redată în anexa I.
Conform datelor de literatură, extractul alcoolic 90% din frunzele de R. pseudoacacia s-a dovedit activ asupra tulpinilor Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Salmonella choleraesuis, Candida albicans, date confirmate de rezultatele obținute în cadrul prezentului studiu privind acțiunea extractelor alcoolice 70% asupra tulpinilor testate (Roșu, 2012). Pentru extractele alcoolice obținute din H. tuberosus, A. retroflexus, R. pseudoacacia (semințe și teci), F. japonica (frunze) și G. triacanthos (flori), acestea sunt primele rezultate referitoare la potențialul lor antimicrobian. Pentru activitatea antimicrobiană a extractului metanolic de A. altissima există o singură mențiune privind activitatea asupra tulpinilor de Listeria monocytogenes, S. aureus, B. subtilis, P. aeruginosa și E. coli (Rahman, 2009). În aceste studii s-au dovedit și proprietățile antifungice ale acestui extract (fig. 40). Principalii componenți responsabili de proprietățile antimicrobiene sunt compușii polifenolici specifici extractelor realizate (Shan, 2007), acizii fenolici dovedindu-se mai activi asupra tulpinilor studiate în comparație cu flavonoidele identificate în extractele studiate, prin urmare putem considera că acizii polifenolici sunt responsabili de activitatea antimicrobiană a extractelor studiate (fig. 42).
Activitatea antimicrobiană a uleiurilor volatile este dată de efectul sinergic al componentelor volatile aflate în compoziția acestora (fig. 41), acestea fiind active atât pe tulpinile Gram pozitive, Gram negative cât și asupra microfungilor; carvona, limonenul și eugenolul sunt considerate responsabile de efectele antimicrobiene ale uleiurilor volatile studiate.
Fig. 40 Determinarea calitativă a sensibilității B. subtilis 12488 (A), B. subtilis 6683 (B), P. pneumoniae ATCC (C) și S. aureus MRSa (D) pentru A. retroflexus frunze (A. 1), ulei volatil de A. annua (B, C, D -1), A. altissima frunze (B, C, D – 4) și P. americana frunze (B, C, D -5).
Fig. 41 Evidențierea zonelor de inhibiție ale standardelor analitice caracteristice uleiurilor volatile studiate pentru tulpinile C. utilis, S. aureus MRSA, K. pneumoniae 11: 1. Limonen, 2. Carvacrol, 3. α-Felandren, 4. Eucaliptol, 5. Nerolidol, 6. α-Terpineol, 7. α-Pinen, 8. Mircen, 9. Camfor, 10. Borneol, 11. p-Cimen, 12. Timol, 13. Carvona, 14. Linalool, 15. DMSO
Conform datelor de literatură, compușii linalool, timol, carvacrol și limonen prezintă activitate antimicrobiană asupra tulpinilor E. coli, P. aeruginosa, B. cereus și S. aureus (Arldogan, 2002; Bassole, 2012). Eucaliptolul prezintă activitate antimicrobiană asupra tulpinilor de S. aureus (MRSA) și Enterococcus faecalis, inclusiv enterococci rezistenți la vancomicină (VRE) (Bassole, 2012).
Fig. 42 Evidențierea zonelor de inhibiție ale standardelor analitice caracteristice extractelor polifenolice studiate pentru tulpinile S. aureus MRSA, K. pneumoniae 11, P. aeruginosa ATCC: 1. Acid p-Cumaric, 2. Quercetin, 3. Catechina, 4. Acid siringic, 5. Acid tanic, 6. Epicatechina.
Pentru activitatea antimicrobiană a extractelor alcoolice polifenolice s-a observat că potențialul antimicrobian se datorează în special efectului sinergic dintre componentele identificate prin HPLC specifice fiecărui extract studiat. Conform literaturii de specialitate, flavonoidul quercetin s-a dovedit activ asupra tulpinilor Escherichia coli (CMI: 1.25 mg/mL), Enterobacter aerogenes (CMI: 0.625 mg/mL), Salmonella typhimurium (CMI: 2.5 mg/mL) și Salmonella infantis (CMI: 5 mg/mL) (Nitiema, 2012). În studiul de față, din punct de vedere cantitativ, acest compus nu a manifestat activitate antimicrobiană asupra tulpinilor de E. coli testate.
Acizii fenolici s-au dovedit mai activi aspura tulpinilor microbiene studiate în comparație cu flavonoidele identificate.
Tulpinile care s-au dovedit sensibile la extractele și uleiurile volatile studiate au fost investigate prin metode cantitative pentru determinarea CMI, ce a relevat un spectru larg de activitate antimicrobiană pentru extractele vegetale și uleiurile volatile față de microorganismele studiate. În studiul de față, extractele concentrații din organele vegetative și de reproducere din cadrul aceleiași specii, utilizate în concentrații similare, s-au dovedit a avea efect inhibitor împotriva tulpinilor testate, așa cum se arată în anexa II.
Concentrațiile minime inhibitorii ale extractelor alcoolice de A. retorflexus, H. tuberosus și R. pseudoacacia variză între 50-400 μL/mL, extractele cele mai active fiind cele obținute din frunze. Pentru extractele din G. triacanthos CMI au avut valori cuprinse între 50-400 μL/mL, florile fiind cele mai active în special asupra tulpinilor Gram-pozitive. Aceste rezultate pot fi explicate pe baza diferențelor în structura peretelui celular, respectiv în cazul bacteriilor Gram negative, membrana externă functionează ca barieră limitantă pentru pătrunderea principiilor active cu posibile proprietăți antibacteriene (Mihăescu, 2007).
Din anexa II se poate observa că metoxilarea gruparilor hidroxil a acizilor polifenolici scade activitatea antimicrobiană (acidul galic prezintă activitate mult mai bună decât acidul siringic care diferă prin metoxilarea grupărilor hidroxil din pozițiile 3 și 5). Același efect s-a observat și în cazul acizilor cafeic și ferulic, cel din urmă având în poziția 3 gruparea hidroxil metoxilată.
Conform Cueva și colab. (2010) s-a observat că acizii fenolici prezintă activitate antimicrobiană în funcție de poziția grupărilor hidroxil de la nivelul acidului benzoic, astfel: acidul 4-hidroxibenzoic prezintă acțiune antimicrobiană mai bună decât acidul 3,4-dihidroxibenzoic, însă asemanatoare cu cea a acidului 3,4,5-trihidroxibenzoic (acid galic) în cazul tulpinilor Gram negative și Candida sp., probabil datorită simetriei moleculare.
În cazul acizilor p-coumaric și cafeic s-a observat că prezența grupării hidroxil în poziția meta a redus activitatea antimicrobiană.
Dintre uleiurile volatile izolate din diferite specii invazive s-a observat că cel obținut din frunzele de A. annua prezintă cea mai bună activitate antimicrobiană având concentrații minime inhibitorii cuprinse între 0.51-16.33 mg/mL. Acest ulei volatil conține: α-pinen, eucaliptol, camfor, bornol, α-terpineol, p-cimen, compuși cu acțiune antimicrobiană (anexa II). Efectul sinergic al compușilor: α-pinen, p-cimen și α-terpineol față de microfungi a fost menționat în numeroase articole (Toroglu, 2011; Carson, 1995), cunoscându-se faptul că p-cimenul acționează sinergic în combinație cu alți compuși terpenici oxigenați (α-terpineol, carvacrol), chiar dacă acesta nu prezintă o activitate antimicrobiană remarcabilă (Nazzaro, 2013a).
În tabelele 29, 30, 31 și 32 sunt redate frecvențele relative medii ale concentrațiilor minime inhibitorii specifice pentru activitatea antimicrobiană. S-a observat o pondere ridicată a activității antimicrobiene la o concentrație de 100 µL/mL ce reprezintă aproximativ 81.82% din totalul de valori CMI identificate pentru 11 tulpini sensibile la extractul de A. fruticosa frunze (tabelul 29).
Tabelul 29. Interpretarea statistică a activității antimicrobiene față de frecvența relativă a concentrațiilor minime inhibitorii și intervalul de încredere pentru extracte alcoolice
Tabelul 30. Interpretarea statistică a activității antimicrobiene față de frecvența relativă a concentrațiilor minime inhibitorii și intervalul de încredere pentru compușii fenolici
Tabelul 31. Interpretarea statistică a activității antimicrobiene față de frecvența relativă a concentrațiilor minime inhibitorii și intervalul de încredere pentru uleiuri volatile
Tabelul 32. Interpretarea statistică a activității antimicrobiene față de frecvența relativă a concentrațiilor minime inhibitorii și intervalul de încredere pentru standardele izoprenoidice
În cazul uleiului volatil de A. fruticosa cea mai mare pondere pentru activitatea antimicrobiană s-a observat în cazul concentrației 7.38 mg/mL, în timp ce în cazul uleiului volatil de A. annua cel mai ridicat procent de inhibiție a dezvoltării microbiene s-a obținut pentru concentrația de 2.041 mg/mL (tabel 31). Activitatea antimicrobiană a uleiurilor volatile este dată de efectul sinergic al standardelor analitice izoprenoidice (tabel 32) pentru care CMI sunt semnificativ mai scăzute (conținutul scăzut al acestor compuși în componența fitoamestecurilor) față de CMI ale uleiurilor volatile studiate.
III.2.3.2. Influența extractelor alcoolice asupra sensibilității tulpinilor bacteriene la antibiotice
Prin tehnica antibiogramei s-a determinat influența extractelor alcoolice asupra sensibilității tulpinilor bacteriene la antibioticele curent utilizate în clinică. Interpretarea rezultatelor s-a realizat prin calcularea diferențelor dintre valorile diametrelor zonelor de inhibiție induse de amestecurile amestec fitochimic:antibiotic și respectiv solvent (etanol 70%): antibiotic. S-au luat în lucru doar tulpinile ce s-au dovedit sensibile la testarea calitativă a extractelor vegetale studiate.
Extractul alcoolic din frunzele de A. retroflexus a potențat acțiunea antimicrobiană a antibioticelor utilizate asupra celor șapte tulpini microbiene: E. coli, K. pneumoniae, B. subtilis și P. aeruginosa, în special asupra variantelor E. coli în cazul SXT și TZP; K. pneumoniae 11 în cazul CIP ; K. pneumoniae 134202 în cazul antibioticelor CTX și CN; P. aeruginosa 13202 pentru CIP, TIM, PRL, CRO și CL; P. aeruginosa ATCC 27853 pentru CRO și CL; B. subtilis 6683 pentru P, CEC, K și C; B. subtilis 12488 pentru CEC și VA. Potențarea activității antibioticelor Ciprofloxacin (floroquinolonă- activă asupra sintezei de acizi nucleici) și Ticarcilină-acid clavulanic (penicilină ce acționează asupra sintezei mureinei din structura peretelui celular) de către extractul vegetal din frunzele de A. retroflexus s-a manifestat prin creșterea diametrului zonei de inhibiție cu aprox. 12, respectiv 9 mm asupra tulpinii P. aeruginosa izolată din clinică (fig. 43).
Fig. 43 Cuantificarea diferențelor diametrelor zonelor de inhibiție ale creșterii microbiene determinate de antibiotic: extract vegetal din frunze de A. retroflexus, respectiv combinațiile antibiotic׃ solvent (etanol 70%): CIP: Ciprofloxacin; TZP: Piperacilina-Tazobactam; CTX: Cefotaxim; SXT: Trimetroprim-Sulfametoxazol; PRL: Piperacilina; TIM: Ticarcilina-Acid clavulanic; AZM: Aztreonam; CN: Cefalexin; OFX: Ofloxacin; CL: Colistin; CRO: Ceftriaxone; K: Kanamicina; P: Penicilina; C: Cloramfenicol; CEC: Cefaclor; VA: Vancomicina; NOR: Norfloxacin; OX: Oxacilina; IPM: Imipenem; MEM: Meropenem; PB: Polimixin B
Pentru determinarea efectului sinergic al extractului din inflorescențele de A. retroflexus s-au utilizat tulpinile S. aureus ATCC 6538, B. subtilis ATCC 6683 și P. aeruginosa ATCC 27853. Acest extract a îmbunătățit acțiunea antibioticelor P, FFL și E asupra tulpinii S. aureus ATCC; C, CEC, K și VA pentru B. subtilis 6683; C pentru B. subtilis 12488; AM pentru K. pneumoniae 11; OFX și AZM pentru K. pneumoniae 134202; NOR, TIM și OX pentru P.aeruginosa ATCC; PRL, CRO, NOR, CL, TIM și OX pentru P.aeruginosa 13202 și OFX pentru E. coli ATCC. Dintre toate aceste variante cel mai bun efect sinergic s-a observat în cazul antibioticului cloramfenicol (fenicol activ asupra sintezei proteinelor bacteriene) pentru tulpina B. subtilis 6683.
Extractul alcoolic din frunzele de H. tuberosus a potențat acțiunea antimicrobiană a antibioticelor utilizate asupra celor șase tulpini microbiene dovedite sensibile la acțiunea extractului vegetal, aparținând speciilor: E. coli, K. pneumoniae, B. subtilis și P. aeruginosa, în special asupra variantelor E. coli O126B16 în cazul antibioticelor SXT, TIM și TZP; K. pneumoniae 11 în cazul CN; P. aeruginosa 13202 pentru CIP, PRL, CL și CRO; P. aeruginosa ATCC pentru CIP, PRL, CL și CRO; B. subtilis 6683 pentru P și B. subtilis 12488 pentru CEC, VA și K (fig. 44). Acțiunea antibioticului cefalexina (cefalosporină de generația I care inhibă sinteza mureinei peretelui celular) a fost cel mai mult îmbunătățită de acest extract asupra tulpinii K. pneumoniae izolată din clinică.
Fig. 44 Cuantificarea diferențelor diametrelor zonelor de inhibiție ale creșterii microbiene determinate de antibiotic: extract vegetal din frunzele de H. tuberosus, respectiv combinațiile antibiotic׃ solvent (Etanol 70%): CIP: Ciprofloxacin; TZP: Piperacilin-Tazobactam; CTX: Cefotaxim; SXT: Trimetroprim-Sulfametoxazol; PRL: Piperacilin; TIM: Ticarcilin-Acid clavulanic;AZM: Aztreonam; CN: Cefalexin; OFX: Ofloxacin; CL: Colistin; CRO: Ceftriaxone; P: Penicilina; C: Cloramfenicol; CEC: Cefaclor; K: Kanamicina VA: Vancomicina; ; NOR: Norfloxacin; OX: Oxacilina; IPM: Imipenem; MEM: Meropenem
În cazul extractului alcoolic din tuberculii de H. tuberosus potențarea efectului sinergic s-a observat pentru antibioticele CRO și CL pentru tulpina P. aeruginosa ATCC; C și CEC pentru B. subtilis 12488; C, CEC și K pentru B. subtilis 6683; CTX, AZM și CN pentru K. pneumoniae 11; OFX pentru K. pneumoniae 134202 și P pentru S. aureus ATCC. În cazul tulpinii E. coli extractele vegetale au avut un efect antagonist, conducând la scăderea activității antibioticelor utilizate. Antibioticele cloramfenicol (fenicol activ asupra sintezei proteinelor bacteriene) și cefaclor (cefalosporină de generația a II-a cu proprietatea de a inhiba sinteza peretelui celular) s-au dovedit a realiza combinația antimicrobiană optimă antibotice: amestec fitochimic.
Extractul alcoolic din frunzele de R. pseudoacacia a potențat acțiunea antimicrobiană a antibioticelor utilizate asupra celor nouă tulpini bacteriene luate în lucru, aparținând speciilor: E. coli, K. pneumoniae, B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, în special asupra variantelor E. coli O126B16 în cazul SXT, TIM și TZP; K. pneumoniae 134202 în cazul antibioticelor CTX, AZM și CN; P. aeruginosa 13202 pentru CIP, PRL și CL; P. aeruginosa ATCC pentru CIP, PRL, CL, CRO și OFX; S. aureus ATCC pentru antibioticele CIP, RD, E și P; S. aureus MRSa pentru RD, K, E și P; B. subtilis 6683 pentru K și P; B. subtilis 12488 pentru CEC și VA (fig. 45). În cazul tulpinii K. pneumoniae 11, extractele vegetale au avut un efect anatagonist, conducând la scăderea activității antibioticelor utilizate. Pentru eritromicină s-a observat de asemenea o scădere a diametrului zonei de inhibiție pentru amestecul solvent:antibiotic față de antibioticul simplu.
Fig. 45 Cuantificarea diferențelor diametrelor zonelor de inhibiție ale creșterii microbiene determinate de antibiotic: extract vegetal din frunze de R. pseudoacacia, respectiv combinațiile antibiotic׃ solvent (Etanol 70%): CIP:Ciprofloxacin; TZP:Piperacilin-Tazobactam; CTX:Cefotaxim; SXT:Trimetroprim-Sulfametoxazol; PRL:Piperacilin; TIM:Ticarcilin-Acid clavulanic;AZM: Aztreonam; CN: Cefalexin; AM: Amoxicilina; OFX: Ofloxacin; CL: Colistin; CRO: Ceftriaxone; RD: Rifampin; OX: Oxacilin; K: Kanamicina; E: Eritromicina; P: Penicilina; C: Cloramfenicol; CEC: Cefaclor; VA: Vancomicina; NOR: Norfloxacin; ; IPM: Imipenem; MEM: Meropenem; PB: Polimixin B
Dintre antibioticele testate, acțiunea penicilinei și kanamicinei (active asupra sintezei proteinelor bacteriene) a fost semnificativ îmbunătățită de substanțele active din extractul alcoolic din frunzele de R. pseudoacacia asupra tulpinii de S. aureus izolată din clinică și rezistentă la aceste antibiotice (fig. 46).
Oxacilina, în cazul stafilococului auriu, este de multe ori asociată cu mecanisme de rezistență care determină inactivarea altor familii de antibiotice. S. aureus rezistent la oxacilină prin modificarea PBP este adesea rezistent la aminoglicozide, la fluoroquinolone, macrolide, lincosamide și ketolide, la fosfomicină și uneori la rifampicină (Mihăescu, 2007; Mărculescu, 2007).
Fig. 46 Influența asupra tulpinii S. aureus MRSa a antibiticelor standard (1) și respectiv antibiotice impregnate cu extractul din frunzele de R. pseudoacacia (2)
Fig. 47 Cuantificarea diferențelor diametrelor zonelor de inhibiție ale creșterii microbiene determinate de antibiotic: extract vegetal din florile de R. pseudoacacia, respectiv combinațiile antibiotic׃ solvent (Etanol 70%): CIP:Ciprofloxacin;CTX:Cefotaxim;PRL:Piperacilin; TIM:Ticarcilin-Acid clavulanic;AZM: Aztreonam;CN: Cefalexin; OFX: Ofloxacin;CL: Colistin;CRO: Ceftriaxone; RD: Rifampin; OX: Oxacilin;K: Kanamicina; E: Eritromicina;P: Penicilina;C: Cloramfenicol; CEC: Cefaclor;VA: Vancomicina;NOR: Norfloxacin; NA: Acid nalidixic; F/M: Nitrofurantoin; TEC: Teicoplanin; FFL: Fosfomicin; IPM: Imipenem; MEM: Meropenem; PB: Polimixin B
Extractele alcoolice din celelalte organe vegetative și de reproducere din cadrul speciei R. pseudoacacia prezintă un efect sinergic mult mai slab decât extractul din frunze. Însa s-a observat o orecare îmbunătățire a efectului antimicrobian pentru tulpinile B. subtilis 6683 în cazul P, C, CEC, K, VA și TEC; pentru B. subtilis 12488 în cazul C; pentru P. aeruginosa 13202 în cazul PRL, CRO, NOR și TIM; P. aeruginosa ATCC pentru TIM și K. pneumoniae 11 pentru AZM. Cel mai bun efect sinergic s-a obținut cu ajutorul antibioticului aztreonam (monobactam cu proprietatea de a inhiba sinteza peretelui celular) asupra tulpinii K. pneumoniae 11. Extractul alcoolic din teci de R. pseudoacacia s-a dovedit ineficient în privința efectului sinergic cu antibioticele testate, intervalul diferențelor diametrelor zonelor de inhibiție ale extract: antibiotic respectiv solvent:antibiotic fiind cuprise între -2 și 2 mm.
Pentru extractul obținut din florile de R. pseudoacacia s-a observat că formează combinația optimă cu antibioticul CTX (cefalosporină de generația III, având un mecanism de acțiune similar cu cel al penicilinelor, blocând sinteza peretelui celular) pentru tulpinile E. coli ATCC, K. pneumoniae ATCC și tulpina izolată din clinică de K. pneumoniae 11 (fig. 47).
Fig. 48 Cuantificarea diferențelor diametrelor zonelor de inhibiție ale creșterii microbiene determinate de antibiotic: extract vegetal din florile de G. tiracanthos, respectiv combinațiile antibiotic׃ solvent (etanol 70%): CTX:Cefotaxim;PRL:Piperacilin;TIM:Ticarcilin-Acid clavulanic;AZM: Aztreonam;CN: Cefalexin;OFX: Ofloxacin;CL: Colistin;CRO: Ceftriaxone;RD: Rifampin; OX: Oxacilin; K: Kanamicina;E: Eritromicina;P: Penicilina; C: Cloramfenicol; CEC: Cefaclor; VA: Vancomicina;NOR: Norfloxacin;NA: Acid nalidixic;F/M: Nitrofurantoin; TEC: Teicoplanin;FFL: Fosfomicin;IPM: Imipenem;MEM: Meropenem;PB: Polimixin B
Dintre extractele obținute din G. triacanthos s-a observat că florile prezintă cea mai bună activitate sinergică în combinație cu CTX pentru bacteriile Gram negative luate în lucru. În timp ce pentru extractul din frunze s-a realizat combinația optimă cu antibioticul P pentru bacteriile Gram pozitive studiate (fig. 48, 49).
Fig. 49 Cuantificarea diferențelor diametrelor zonelor de inhibiție ale creșterii microbiene determinate de antibiotic: extract vegetal din fruze de G. triacanthos, respectiv combinațiile antibiotic׃ solvent (Etanol 70%): CIP:Ciprofloxacin;CTX:Cefotaxim;PRL:Piperacilin; TIM:Ticarcilin-Acid clavulanic;AZM: Aztreonam;CN: Cefalexin;OFX: Ofloxacin;CL: Colistin;CRO: Ceftriaxone; RD: Rifampin;OX: Oxacilin;K: Kanamicina; E: Eritromicina; P: Penicilina; C: Cloramfenicol; CEC: Cefaclor; VA: Vancomicina;NOR: Norfloxacin;NA: Acid nalidixic;F/M: Nitrofurantoin; TEC: Teicoplanin; FFL: Fosfomicin; IPM: Imipenem; MEM: Meropenem
Fig.50 Cuantificarea diferențelor diametrelor zonelor de inhibiție ale creșterii microbiene determinate de antibiotic: extract vegetal din frunze de A. fruticosa, respectiv combinațiile antibiotic׃ solvent (etanol 70%): CIP:Ciprofloxacin;CTX:Cefotaxim;PRL:Piperacilin;TIM:Ticarcilin-Acid clavulanic;AZM: Aztreonam; CN: Cefalexin;OFX: Ofloxacin; CL: Colistin;CRO: Ceftriaxone;RD: Rifampin; OX: Oxacilin;K: Kanamicina;E: Eritromicina;P: Penicilina; C: Cloramfenicol; CEC: Cefaclor; VA: Vancomicina; NOR: Norfloxacin; NA: Acid nalidixic; F/M: Nitrofurantoin;TEC: Teicoplanin; FFL: Fosfomicin; IPM: Imipenem; MEM: Meropenem; PB: Polimixin B
Din fig.50 se poate observa că deși extractul polifenolic obținut din frunzele de A. fruticosa a sensibilizat tulpina izolată din clinică de A. baumannii, diametrul de inhibiție nu se integrează în domeniul de sensibilitate pentru antibioticul MEM. Rezistența la carbapeneme are loc fie prin producerea de β-lactamaze, care hidrolizează (descompune) agentul antimicrobian sau prin modificarea porinelor de la nivelul peretelui celular bacterian, reducând astfel, permeabilitatea medicamentului în microorganism. În unele microorganisme, ambele mecanisme pot fi prezente (Hancock, 1998). Prin urmare, se poate considera că polifenolii prezenți în extractul de A. fruticosa pot interfera cu producerea de β-lactamaze sau prin modificarea expresiei porinelor la nivelul membranei externe.
S-a observat că extractul obținut din frunzele de P. americana a sensibilizat tulpina A. baumannii, fără ca valoarea diametrului zonei de inhibiție să se încadreze în domeniul sensibil (fig.51).
Fig.51 Cuantificarea diferențelor diametrelor zonelor de inhibiție ale creșterii microbiene determinate de antibiotic: extract vegetal din frunze de P. americana, respectiv combinațiile antibiotic׃ solvent (etanol 70%): CTX:Cefotaxim; PRL:Piperacilin; TIM:Ticarcilin-Acid clavulanic;OFX: Ofloxacin;CL: Colistin;CRO: Ceftriaxone;RD: Rifampin;OX: Oxacilin;K: Kanamicina; E: Eritromicina; P: Penicilina; C: Cloramfenicol; CEC: Cefaclor; VA: Vancomicina;NOR: Norfloxacin; NA: Acid nalidixic; F/M: Nitrofurantoin;TEC: Teicoplanin;FFL: Fosfomicin; IPM: Imipenem; MEM: Meropenem; PB: Polimixin B
Prin urmare, având în vedere că rezistența microbiană a devenit o problemă globală și în continuă creștere, descoperirea de noi agenți antimicrobieni eficienți precum și utilizarea acestora ca adjuvanți pentru terapia cu antibiotice reprezintă o necesitate. Efectul sinergic al polifenolilor în combinație cu agenți antimicrobieni convenționali împotriva microorganismelor multirezistente și modul în care acești compuși acționează asupra mecanismelor de antibiorezistență reprezintă o nouă direcție esențială în stabilirea unor noi alternative antiinfecțioase.
III.2.3.3. Determinarea posibilului mecanism de acțiune antifungică al uleiului volatil de A. fruticosa prin citometrie în flux
Pentru confirmarea concentrației minime inhibitorii și determinarea posibilului mecanism de acțiune prin citometrie în flux a fost luat în lucru doar uleiul volatil de A. fruticosa deoarece metoda presupune utilizarea unui volum mare de probă, iar dintre speciile studiate fructele de A. fruticosa prezintă cea mai mare cantitate medie de ulei volatil. Extractele polifenolice nu pot fi analizate prin aceasta metodă deoare conțin clorofilă. După cum se cunoaște din datele de literatură, clorofila a absoarbe radiația luminoasă la lungimi de undă cuprinse între 430 nm și 662 nm (spectrul albastru-violet și roșu), în timp ce clorofila b absoarbe radiația luminoasă la lungimi de undă cuprinse între 453 nm – 642 nm (spectrul albastru și oranj). Maximele de absorbție ale clorofilei sunt la 465 nm și 665 nm (Pedros, 2008). Această fluorescență poate astfel să interfere cu fluorocromul utilizat conducănd la obținerea unei fluorescențe fals pozitive.
Testarea în dinamică temporală a activității antifungice a uleiului volatil izolat din fructele de A. fruticosa a pus în evidență efectul microbicid timpuriu manifestat de acesta asupra tuturor tulpinilor fungice studiate, comparativ cu martorul de solvent (DMSO), după 3h instalându-se și efectul microbicid (fig. 52).
În continuare pentru confirmarea acestor rezultate obținute prin metode clasice, s-a urmărit determinarea viabilității celulare prin citometrie în flux. Astfel, după marcarea celulelor cu iodură de propidiu s-a observat că după 24h se conturează o populație de celule cu integritate membranară modificată revelată prin creșterea ușoară a semnalului fluorescent (fig. 53). Prin microscopie s-a urmărit evidențierea eventualelor modificări morfologice ale celulelor microfungice observându-se că uleiul volatil studiat a modificat afinitatea tinctorială a acestora (fig. 54).
În vederea determinării mecanimului de acțiune, prin colorație cu roșu de Nil s-a urmărit influența uleiului volatil de A. fruticosa asupra capacității de funcționare a pompelor de eflux, observându-se reducerea activității acestora încă după 3h de incubare a tulpinilor levurice cu uleiul volatil studiat (fig. 55, 56, 57).
Dezvoltarea celulelor de Candida sp. în prezența antifungicelor poate influența în mod direct sau indirect expresia genelor specifice rezistenței la aceste substanțe (Sanglard et al., 1995). În acest studiu s-au investigat modificările în rata de exprimare a genelor cdr1, cdr 2 și mdr 1 specifice funcționării pompelor de eflux în prezența extractului vegetal. După 24 h de creștere, celulele de Candida albicans au fost expuse timp de 3 ore la ulei volatil de A. fruticosa în concentrație corespunzatoare CMI/4.
Pompele de eflux de la C. albicans au evoluat independent de rezistența la azoli. S-a presupus că rolul principal pentru aceste sisteme de transport este de a permite adsorbția substanțelor nutritive esențiale, excreția produșilor metabolismului, precum și comunicarea dintre celule și mediul înconjurator. Sensibilitatea scazută a tulpinilor de C. albicans se manifestă prin supraexprimarea genelor cdr1p și cdr2p, care codifică pompele de eflux dependente de ATP (Ramage, 2002; Holmes, 2006).
Expresia genelor este prezentată ca valori relative față de martorul de solvent (fig. 58), care a fost setat la unitate. Uleiul volatil de A. fruticosa a crescut semnificativ expresia genelor cdr 1 și cdr 2, gene care sunt cunoscute pentru codificarea pompele de eflux și contribuie la rezistența la fluconazol a fungilor patogeni (Ahmad, 2013; Guo, 2008). Supraexpresia genelor cdr 1 și cdr 2 la tulpinile de C. albicans rezistente la antifungicele de tip azol este sugestivă pentru mutațiile elementelor reglatoare cis sau trans ale acestor gene (Rogers, 2003), codificând doi transportatori omologi ai familiei de casete de legare a ATP (ABC). Supraexprimarea genelor cdr 1 și cdr 2 dar nu și a mdr 1, sugerează implicarea a două căi distincte de transcripție pe care acționează uleiul volatil studiat (Tsao, 2009). Conform Taso et al. (2009) cdr 1 joacă un rol major în rezistența la antifungicele de tuo azol (FLC, KTC și ITC) în timp ce cdr2 prezintă un rol minor în antibiorezistență. Practic, inactivarea genelor cdr1 sau cdr2 afectează direct rezistența la azoli, prin diminuarea exportului activ direct și / sau indirect, prin modificarea activității altor proteine capabile de a modula acumularea intracelulară a azolilor sau compoziția fosfolipidelor membranare.
La concentrația subinhibitorie de ulei volatil de A. fruticosa s-a observat că o parte din pompele de eflux (cdr1 și cdr2) au fost supraexprimate, prin urmare celulele levurice de C. albicans își activează sistemele de protecție pentru a înlătura compusul din celulă (fig. 58). În urma acestui experiment se poate observa care sunt pompele pe care celula le activează în prezența unei concentrații subinhibitorie de ulei volatil. Prin cunoașterea exactă a pompelor active, uleiul volatil se poate combina fie cu un alt fitoamestec, fie cu un inhibitor al pompei respective pentru a induce sensibilitatea celulei microfungice la respectiva combinație.
Fig. 58 Nivelul relativ al expresiei genice exprimat de uleiul volatil de A. fruticosa, raportat la o unitate de solvent utilizat
III.2.4. Influența extractelor vegetale asupra expresiei unor gene de virulență ale microorganismelor și al efectului antipatogenic
III.2.4.1. Influența amestecurilor fitochimice asupra exprimării factorilor de virulență solubili
Spectrul factorilor de virulență caracteristici fiecărei tulpini studiate, s-a determinat prin metode fenotipice pentru variantele martor de tulpină, tulpină tratată cu solventul utilizat și tulpina tratată cu extractul vegetal sau ulei volatil. Metodele fenotipice au fost alese pentru detectarea unor factori de virulență solubili prin cultivarea tulpinilor pe medii ce conțin substratul enzimatic corespunzator fiecarui factor de virulență.
Lecitinazele și lipazele sunt enzime implicate în patogeneza unor tulpini bacteriene prin capacitatea lor de a induce formarea de pori în membrana celulelor eucariote, prin alterarea conținutului lipidic al acesteia. Prin urmare, în cursul infecției, aceste enzime pot acționa ca toxine formatoare de pori. Proteazele (cazeinaza, gelatinaza) sunt enzime extra-celulare cu specificitate scazută, care hidrolizează proteinele la peptide și aminoacizi, implicate în distrugerea integrității țesuturilor gazdei și în progresia infecției. Cazeinaza, ca și amilaza, confera un avantaj de multiplicare a bacteriei respective, în medii bogate în cazeină sau amidon. DN-azele asigură reducerea vascozității secrețiilor în care se acumulează ADN din celulele lizate, permițând diseminarea bacteriilor și conferă speciilor producatoare un avantaj competitiv, furnizându-le mononucleotide pentru propriile sinteze. Ionii de Fe sunt esențiali în sinteza de ADN și în respirația celulară, dar și în activarea genelor codificatoare pentru factori de virulență (toxine, adezine, invazine). În acest context, sideroforii sintetizați de bacteriile patogene prezintă o afinitate ridicată de chelare a ionilor de fier intrând în competiție cu proteinele transportoare de Fe gazdei (Chifiriuc, 2011; Holban, 2013). Expresia factorilor de virulență solubili a fost influențată de concentrații subinhibitorii ale extractelor vegetale studiate, în sensul stimulării sau inhibării exprimării acestora, în funcție de tulpina microbiană testată (tabelele 33 și 34; fig. 59-66).
Tabelul 33. Influența extractelor vegetale asupra expresiei factorilor enzimatici solubili implicați direct și indirect în virulența tulpinilor bacteriene
*Legenda (-) inhiba, (+) stimuleaza.
Tabelul 34. Influența uleiurilor volatile studiate asupra expresiei factorilor enzimatici solubili implicați direct și indirect în virulența tulpinilor bacteriene
III.2.4.2. Influența amestecurilor fitochimice asupra aderenței microbiene la substrat inert
Microorganismele implicate în infecțiile invazive, produc de regulă polizaharide capsulare extracelulare, cunoscute sub denumirea de capsulă, slime sau glicocalix. Termenul slime este de obicei utilizat pentru a desemna exopolizaharidele strans asociate celulei bacteriene, care măresc vascozitatea mediului de cultură lichid însămânțat cu tulpina care posedă acest factor de virulență. Producerea de slime este implicată în aderența și în colonizarea dispozitivelor medicale (Chifiriuc, 2011). În dezvoltarea sa, biofilmul urmarește parcurgerea unor etape stricte, care-i vor favoriza evoluția ulterioară și rezistența la factorii externi. Aceste etape sunt: deplasarea (transportul) microorganismelor în vencinătatea unei suprafețe, aderența inițială la substrat, formarea microcoloniilor (aderența între celule) și maturarea biofilmului (multiplicarea microorganismelor și producerea matricei exo-polimerice) (Li și colab., 2003). Multiplicarea celulelor microbiene, după aderență, are loc cu o viteză net superioară față de cea a celulelor neaderente (Lazar, 2003).
În ceea ce privește influența asupra capacității de aderență, s-a observat o scădere semnificativă a absorbanțelor măsurate la lungimea de undă de 490 nm. În anexa III sunt redate concentrațiile minime la care densitatea optică a avut valori asemănătoare martorului de sterilitate a mediului (godeul fără tulpină microbiană) la concentrații inferioare concentrațiilor minime inhibitorii.
Amestecurile fitochimice au inhibat capacitatea de aderență la substrat inert și dezvoltarea biofilmului microbian. Aceste rezultate sugerează capacitatea acestora de a interfera cu exprimarea adezinelor microbiene, implicate în etapa de colonizare inițială, esentială pentru inițierea unui proces infecțios.
Capacitatea de aderență la substrat inert a fost inhibată pentru toate tulpinile microbiene testate, la concentrații cuprinse între 6.25-200 μL/mL pentru extractele alcoolice, extractul obținut din fructele de P. americana s-a dovedit cele mai activ asupra aderenței tulpinilor Gram pozitive, în timp ce dintre uleurile volatile cel obținut din A. annua herba au prezentat cea mai bună capacitate de inhibiție a aderenței tulpinilor microfungice apartinând genului Candida sp. (anexa III). Rezultatele obținute au fost confirmate de analiza microscopică (fig. 68 și 69).
Pe lângă proprietățile antimicrobiene și antioxidante ale compușilor naturali polifenolici, în conformitate cu datele publicate de Borges și colab. (2013b) s-a observat că acești compuși prezintă și activitate anti-aderentă, inhibând astfel prima etapă de formare a biofilmelor microbiene. Dintre standardele analitice testate, acizii polifenolici s-au dovedit cei mai activi (anexa III).
Din anexa III se poate constata că standardele terpenice prezintă o activitate anti-aderentă mult mai bună față de uleiurile volatile, însă conținutul individual de compuși terpenici este relativ scăzut, acest efect putându-se datora acțiunii sinergice dintre toți compușii existenți. În conformitate cu datele publicate de Raut și colab. (2013) s-a demonstrat acțiunea anti-biofilm pentru compușii izoprenoidici linalool și carvona, rezultate confirmate și în studiul de față. În plus, terpenele fenolice (eugenol) au fost cele mai active, nucleul fenolic interferând cu proteinele implicate în aderența microorganismelor.
În cazul standardelor monoterpenice s-a observat că cea mai bună activitate de inhibiție a aderenței microbiene s-a obținut pentru compușii eugenol și α-terpineol (anexa III). Conform cu proprietățile lor fizico-chimice acești compuși prezintă cea mai mare capacitate de disociere (eugenol: pK= 10.19; α-terpineol: pK= 19.3) față de restul monoterpenelor studiate. Astfel destabilizarea membranei microbiene, și mai ales activitatea antimicrobiană a compușilor care prezintă capacitatea de disociere este cel mai probabil cauzată de o reducere suplimentară a pH-ului ca urmare a prezenței unei grupari hidroxil (Ultee, 2002).
Fig. 67 Corelarea proprietăților fizico-chimice (log D – valori teoretice furnizate de baza de date: http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.6402.html) cu concentrațiile minime care inhibă aderența la substrat inert pentru standardele monoterpenice față de tulpina B. subtilis ATCC
Coeficientul de distributie, log D, este o măsură dependentă de pH a predilecției unei molecule de a se dizolva diferențial în două faze nemiscibile, luând în considerare toate formele ionizate și neionizate. Acest coeficient servește ca un descriptor cantitativ al lipofilicității. În fig. 67 se poate observa că monoterpenele hidrocarbonate investigate sunt capabile de a interacționa cu membranele fosfolipidice, inserându-se și destabilizând structura ordonată a bistratului lipidic (Trombetta și colab., 2005), în timp ce terpenele oxigenate prezintă un caracter lipofil mai scăzut însă cu o activitate anti-aderentă mult mai bună conform fig. 67. Membrana externă a bacteriilor Gram negative este constituită în principal din lipopolizaharide și formează o barieră hidrofilă care oferă protecție împotriva compușilor hidrofobi. Astfel se poate explica sensibilitatea scăzută a bacteriilor Gram negative la efectul citotoxic al terpenelor lipofile testate.
Fig. 68 Prezentarea rezultatelor testului de aderență bacteriană in vitro (microscop optic inversat x 40) la substrat inert (a-d) și de inhibare a aderenței (e) în prezența amestecurilor fitochimice cu eficiență asemanatoare în toate cazurile
Fig. 69 Prezentarea rezultatelor testului de aderență microfungică in vitro (microscop optic inversat x 40) la substrat inert (a-c) și de inhibare a aderenței (d) în prezența amestecurilor fitochimice cu eficiență asemănătoare în toate cazurile
III.2.4.3. Influența amestecurilor fitochimice asupra dezvoltării biofilmelor preformate
Infecțiile bacteriene cauzate de implantarea dispozitivelor medicale polimerice reprezintă peste 50% din infecțiile nosocomiale (Lemon, 2004). Obținerea unor suprafețe și materiale cu efect antimicrobian sau antibiofilm reprezintă o direcție importantă de studiu în știința biomaterialelor, iar modalitățile de obținere ale acestora includ tratamente de suprafață (chimice și mecanice), dar și sinteza unor materiale bioactive, cu eliberare controlată de produi antimicrobieni (Mathews, 2006; Santos, 2007).
Astfel, biofilmul este o entitate dinamică ce se dezvoltă diferit, în funcție de speciile care o compun, de condițiile fizice și chimice (temperatura de creștere, pH-ul, compoziția mediului de creștere, prezența diferitelor săruri, etc.) (Kuhn, 2002; Jin, 2005).
Un biofilm matur se prezintă sub forma unei structuri matriceale dispuse în rețea, cu structuri canaliculare orizontale și verticale care permit circulația lichidelor cu rol important în asigurarea substraturilor nutritive și eliminarea reziduurilor metabolice (Lazăr, 2003).
Rezistența biofilmelor se datorează unui complex de fenomene care nu sunt încă pe deplin cunoscute. Multe mecanisme pot fi responsabile de rezistența intrinsecă a biofilmelor, precum: densitatea crescută a celulelor în structura biofilmului, rețeaua matriceală extracelulară, rata de creștere scazută și limitarea nutritională, existența genelor de rezistență, în special a celor care codifică pompele de eflux (Del Sorbo, 2000; Jabra–Rizk, 2004). Pe de altă parte, proprietățile fizico-chimice și farmacologice ale unui antibiotic nu garantează pătrunderea sa în biofilmul microbian. Bacteriile biofilmului microbian pot manifesta o sensibilitate redusă la antibioterapia curent utilizată în clinică, numită rezistență fenotipică sau comportamentală sau toleranță (Mihai, 2010).
Tabelul 35.Indicele de inhibiție a dezvoltării biofilmelor microbiene monospecifice de24h și 48h dezvoltate în plăci cu 96 de godeuri tratate cu diferite concentrații de extracte obținute din arborii invazivi
În aceste condiții s-au testat variantele de extracte (tabelele 35, 36, 37) și uleiuri volatile (tabelul 38) pentru care s-a obținut o concentrație minimă de inhibare a aderenței s/mL, cu valoare inferioară concentrației minime inhibitorii corespunzatoare. Ținând cont de faptul că biofilmele microbiene au o sensibilitate mult mai redusă decât celulele planctonice, s-au luat în lucru concentrații corespunzatoare valorilor CMI, CMIx3 și CMIx5.
Concentrațiile CMIx5 de extracte obținute din arbori invazivi au determinat eradicarea biofilmelor experimentale monospecifice pentru toate tulpinile dezvoltate pe substrat inert în dinamică temporală, fiind active în special asupra biofilmelor formate timp de 24h pentru care indicele de inhibiție a creșterii biofilmului microbian variază între 89.95% – 55.31% în cazul R. pseudoacacia frunze, 96.55% – 88.9% pentru R. pseudoacacia flori, 94.08% – 90.21% pentru A. altissima frunze, 99.68% – 58.28% pentru A. altissima flori și respectiv 98.27% – 97.16% în cazul G. triacanthos frunze (tabelul 35).
Tabelul 36. Indicele de inhibiție a dezvoltării biofilmelor microbiene monospecifice de 24h și 48h dezvoltate în plăci cu 96 de godeuri tratate cu diferite concentrații de extracte obținute din arbuști invazivi
Concentrațiile CMIx5 de extracte obținute din arbuștii invazivi au determinat eradicarea biofilmelor experimentale monospecifice dezvoltate pe substrat inert în dinamică temporală, pentru toate tulpinile fiind active în special asupra biofilmelor formate timp de 24h pentru care indicele de inhibiție a creșterii biofilmului microbian variază între 97.01% – 62.78% în cazul F. japonica frunze, 96.7% – 70.88% pentru P. americana frunze și respectiv 98.64% – 62.91% pentru P. americana fructe (tabelul 36).
Concentrațiile CMIx5 de extracte obținute din plante perene invazive au determinat eradicarea biofilmelor experimentale monospecifice dezvoltate pe substrat inert în dinamică temporală pentru toate tulpinile, fiind active în special asupra biofilmelor formate timp de 24h pentru care indicele de inhibiție a creșterii biofilmului microbian variază între 94.51% – 87.72% în cazul A. retroflexus frunze, 97.66% – 75.22% pentru A. retroflexus inflorescențe, 97.06% – 89.22 pentru H. tuberosus frunze și respectiv 76.38% – 73.1% pentru H. tuberosus tuberculi (Tabelul 37).
Tabelul 37. Indicele de inhibiție a dezvoltării biofilmelor microbiene monospecifice de 24h și 48h dezvoltate în plăci cu 96 de godeuri tratate cu diferite concentrații de extracte obținute din plante perene invazive
Concentrațiile CMIx5 de ulei volatil au determinat eradicarea biofilmelor experimentale monospecifice pentru toate tulpinile dezvoltate pe substrat inert în dinamică temporală, fiind active în special asupra biofilmelor formate timp de 24h pentru care indicele de inhibiție a creșterii biofilmului microbian variază între 97.63% – 69.65% în cazul A. annua (Marinaș și colab., 2015 – in press), 99.61% – 75.64% pentru S. canadensis și respectiv 99.78% – 65.49% pentru A. fruticosa (Tabelul 38). O dată cu creșterea timpului de formare a biofilmului microbian s-a observat o tendință generală în sensul scăderii capacității uleiului volatil de a eradica biofilmul format.
Tabelul 38. Indicele de inhibiție a dezvoltării biofilmelor microbiane monospecifice de 24h și 48h dezvoltate în plăci cu 96 de godeuri tratate cu diferite concentrații de uleuri volatile
Cateterele urinare, precum sondele Foley, sunt dispozitive tubulare din latex sau silicon, care, atunci când sunt utilizate pot dezvolta cu ușurință biofilme pe suprafețele interioare sau exterioare. Organismele care formează biofilme și contaminează de obicei aceste dispozitive sunt S. epidermidis, Enterococcus faecalis, E. coli, Proteus mirabilis, P. aeruginosa, K. pneumoniae, precum și alte bacterii Gram negative (Donlan, 2001). În numeroase studii s-a observat că biofilmele formate la nivelul sondelor Foley sunt rezistente la doze ridicate de mecilinam și antibiotice beta-lactamice (Donlan, 2001; Olson, 1989).
S-au introdus în lucru variantele de amestecuri fitochimice și tulpini microbiene pentru care IIDBP% a fost > 90%. Pentru concentrația CMIx5 nu s-au identificat celule viabile până la diluția 10-2, iar la concentrația CMI nu s-au observat variații semnificative față de variantele martorilor. Modelele experimentale cantitative propuse demonstrează potențialul inhibitor ale amestecurilor fitochimice asupra capacității de aderență la substrat inert a tulpinilor Gram negative de interes medical studiate (fig. 70). Cel mai redus număr de unități formatoare de colonii (UFC) s-a obținut pentru extractul vegetal obținut din frunzele de A. altissima în cazul tulpinii E. coli B16.
Fig. 70 Reprezentarea grafică a log (UFC/mL), determinate după desprinderea celulelor sesile bacteriene Gram negative din biofilmul format de 24 h și 48 h in vitro la nivelul sondelor Foley tratate cu CMIx3 de amestec fitochimic
Studiul in vitro al dezvoltării biofilmelor microbiene monospecifice de către tulpinile Gram pozitive pe suprafața unor secțiuni de sonde Foley și influența amestecurilor fitochimice asupra acestor biofilme a demonstrat efectul de eradicare a biofilmului preformat la concentrații corespunzătoare valorilor CMIx3 (fig. 71).
Fig. 71 Reprezentarea grafică a log (UFC/mL), determinate după desprinderea celulelor sesile bacteriene de B. subtilis, E. faecalis, S. aureus din biofilmul format de 24 h și 48 h in vitro la nivelul sondelor Foley tratate cu CMIx3 de amestec fitochimic
Din fig. 72 se poate observa că uleiul volatile de S. canadensis și respectiv, fructele de P. americana au redus semnificativ numărul de unități formatoare de colonii în cazul biofilmelor de 24h pentru tulpina de C. albicans ATCC 101103.
Fig.72 Reprezentarea grafică a log (UFC/mL), determinate după desprinderea celulelor sesile bacteriene de C. albicans și C. famata din biofilmul format de 24 h și 48 h in vitro la nivelul sondelor Foley tratate cu CMIx3 de amestec fitochimic
Astfel, acest studiu poate contribui la explicarea rezistenței paradoxale a infecțiilor asociate cateterelor la doze de amestecuri fitochimice care sunt eficiente pentru celulele planctonice în testele in vitro (Donlan, 2001), însă ineficiente la concentrații similare pentru celulele sesile. Aceste rezultate ar putea ajuta la dezvoltarea de noi biomateriale rezistente la aderență și colonizarea microbiană cu aplicații atât în medicină cât și în industria alimentară.
Aderența microbiană la diferite suprafețe s-a dovedit a fi un proces extreme de complex, care implica factori fizico-chimici, proteine și polizaharide. Din punct de vedere fizico-chimic, aderenta microbiană poate fi mediată prin interacții nespecifice, cum ar fi interacțiile Lifshitz-van der Waals, forțe electrostatice, interacțiuni acido-bazice, și fortele de mișcare browniană. În sistemele biologice, interacțiunile hidrofobe sunt de obicei cele mai puternice dintre toate interacțiunile necovalente, iar aderența la diferite suprafețe inerte este adesea mediată de aceste tipuri de interacțiuni. S-a demonstrat că hidrofobicitatea joacă un rol important într-o gamă largă de infecții microbiene. Hidrofobicitatea microbiană este definită de energia de atracție între celulele nepolare sau ușor polare aflate într-o fază apoasă, și poate fi evaluată prin mai multe metode (Cerca și colab., 2005). Metoda aleasă este MATH (Microbial Adhesion to Hydrocarbon) în care faza apoasă a fost PBS, iar faza organică izooctan.
Prin determinarea spectrofotometrică a absorbanțelor amestecurilor culturilor microbiene în faza apoasă după menținerea în contact timp de o oră cu stratul organic, s-au obținut valorile reprezentate grafic în fig. 73, 74, 75. Tulpinile mai hidrofobe migrează în faza organică și prin urmare, absorbanța fazei apoase scade. În general s-a observat o tendință de creștere a hidrofobicității celulelor sesile în comparație cu celulele planctonice. În cazul bacteriilor Gram pozitive, extractele alcoolice au redus hidrofobicitatea învelișului celular al celulelor sesile (fig. 73).
Fig. 73 Reprezentarea grafică a rezultatelor testului de determinare a hidrofobicității suprafeței celulare a unor tulpini Gram pozitive, celule planctonice versus sesile tratate și respectiv, netratate cu amestecurile fitochimice studiate
În cazul bacteriilor Gram negative, pentru tulpinile de P. aeruginosa, uleiul volatil de S. canadensis, la fel ca în cazul factorilor de virulență enzimatici, a intensificat producerea pigmentului piocianina specific. Acest ulei volatil a redus hidrofobicitatea celulelor sesile desprinse din biofilmul de 48h, însă pentru tulpina P. aeruginosa 13202 s-a observat o intensificare a hidrofobicitatii celulelor planctonice (fig. 74).
Fig. 74 Reprezentarea grafică a rezultatelor testului de determinare a hidrofobicității suprafeței celulare a unor tulpini Gram negative, celule planctonice versus sesile tratate și respectiv, netratate cu amestecurile fitochimice studiate
Prin determinarea spectrofotometrică a absorbanței amestecurilor de culturi microfungice-izooctan, s-au obținut valorile exprimate procentual în fig. 75. Astfel, putem emite ipoteza că atât compușii polifenolici, cât și terpenele pot conduce la o variație considerabilă în comportamentul hidrofob al celulelor microbiene și, prin urmare, influențează rata de absorbție a compușilor hidrofobi / hidrofili, ca urmare a modificării permeabilității membranare bacteriene, și posibil, a activării enzimelor implicate în metabolismul acestora (De Carvalho, 2004; El Abed, 2011).
Fig. 75 Reprezentarea grafică a rezultatelor testului de determinare a hidrofobicității suprafeței celulare a unor tulpini microfungice, celule planctonice versus sesile tratate și respectiv, netratate cu amestecurile fitochimice studiate
III.2.4.4. Influența amestecurilor fitochimice asupra aderenței bacteriene la substrat celular
În cursul evoluției au fost stabilite o serie de relații și interacțiuni între bacterii și gazdele lor, benefice sau daunatoare. S-a demonstrat că interacțiunile între bacterii și gazdă joacă un rol decisiv în mai multe procese esențiale, cum ar fi: supraviețuirea, creșterea, expresia factorilor de virulență și producția de metaboliți secundari, inducerea leziunilor asupra celulelor și țesuturilor gazdei (Holban, 2013; Tarkka, 2009). Patogeneza bacteriilor se datorează moleculelor secretate de acestea conducând la alterarea celulei gazdă și astfel facilitează relația cu patogenul (Holban, 2013). Gradul de distrugere a țesuturilor gazdei cauzată de diferite tulpini bacteriene depinde de imunitatea gazdei, mărimea inoculului bacterian și de formarea de exoproduși bacterieni specifici (Holban, 2013), unii dintre ei fiind toxici (Kudoh, 1994). Mulți agenti patogeni de succes au dezvoltat capacitatea de a adera și de a invada esuturile animale. Date recente experimentale sugerează că mulți agenți patogeni oportuniști, în general considerați patogeni extracelulari, pot, de asemenea, invada și, în unele cazuri, pot să se multiplice în interiorul celulelor gazdă (Holban, 2013; Zaas, 2005).
Prin analiza calitativă a aderenței bacteriene la substrat celular (celule Hep 2) s-a demonstrat că pentru tulpinile testate tratate cu concentrații subinhibitorii (CMI/4) de amestec fitochimic s-a redus capacitatea bacteriilor de a adera la suprafața celulelor eucariote (fig. 76), prezentând profiluri diferite de aderență.
Au fost identificate trei profiluri principale de aderență: aderența localizată (fig. 76 – a), atunci cand bacteriile sunt atașate sub formă de microcolonii în anumite regiuni ale suprafetei celulei; aderența difuză (fig. 76 – b), atunci când bacteriile aderă individual și uniform la întreaga suprafață celulară, și aderența agregativă (fig. 76 – c), când bacteriile formează agregate de dimensiuni mari, aderate atât la suprafața celulară, cât și la substratul inert.
Fig. 76 Imagini microscopice ale celulelor Hep-2 infectate cu culturi microbiene, ce evidențiaza pattern-ul de aderență microbiană localizată (a), difuză (b) și agregativă (c) și aderența unei suspensii bacteriene tratate cu CMI/4 de ulei volatile de A. annua (colorație Giemsa, x1000)
În cazul extractelor de R. pseudoacacia cel mai mic indice de aderență la substrat celular, dar fără modificarea pattern-ului de aderență (difuz), similar cu cel al martorului de solvent s-a observat pentru tulpina B. subtilis 6683 tratată cu extract din teci de R. pseudoacacia (fig. 77 și 78).
Fig. 77 Reprezentarea grafică a procentului de celule bacteriene aderate la monostratul celular Hep-2
Fig. 78 Reprezentarea grafică a rezultatelor testului de determinare a pattern-ului de aderență la substrat celular a tulpinilor bacteriene modificate în prezența unor amestecuri fitochimice în concentrații de CMI/4 (1: localizat; 2: difuz; 3: agregativ)
Aderența la substrat celular s-a realizat doar pentru variantele care au prezentat concentrațiile minime inhibitorii sub valoarea 50 µL/mL. Astfel pentru extractele obținute din specia A. retroflexus s-au testat 9 tulpini. Se poate observa din fig. 79 în cazul tulpnii B. subtilis ATCC tratat cu extractul din frunze, procentul de celule eucariote aderate de celulele bacteriene a scăzut până la 33.25% față de martorul de tulpină și de solvent. Singura modificare a pattern-ului de aderență s-a observat în cazul tratamentului tulpinii de B. subtilis ATCC cu extractul obținut din frunzele de A. retroflexus (fig. 80).
Fig. 79 Reprezentarea grafică a procentului de celule bacteriene aderate la monostratul celular Hep-2
Fig. 80 Reprezentarea grafică a rezultatelor testului de determinare a pattern-urilor de aderență la substrat celular în prezența unor amestecuri fitochimice în concentrații de CMI/4 (1: localizat; 2: difuz; 3: agregativ)
Pentru restul extractelor se poate observa că cel mai mic indice de aderență (sub 50%) s-a obținut pentru tulpinile bacteriene E. coli ATCC și B. subtilis ATCC tratate cu extractul din florile de G.triacanthos, frunze de A. altissima și respectiv cel obținut din frunzele de P. americana (fig. 81, 82).
Fig. 81 Reprezentarea grafică a procentului de celule bacteriene aderate la monostratul celular Hep-2
Fig. 82 Reprezentarea grafică a rezultatelor testului de determinare a pattern-urilor de aderență la substrat celular modificate în prezența unor amestecuri fitochimice în concentrații de CMI/4 (1: localizat; 2: difuz; 3: agregativ)
Capacitatea amestecurilor fitochimice de a modifica indicele de aderență a tulpinilor bacteriene studiate a variat în funcție de extractul studiat. S-au luat în lucru doar extractele care au prezentat activitate antimicrobiană. Astfel pentru uleiul volatile de S. canadensis indicele de aderență a fost cuprins între 17.52% și 99.81%, fiind mai eficient asupra tulpinii de A. baumannii (fig. 83). Soluția stoc testată a influențat și pattern-ul de aderență, după cum se poate observa din fig. 84.
Fig. 83 Reprezentarea grafică a procentului de celule bacteriene aderate la monostratul celular Hep-2
Fig. 84 Reprezentarea grafică a rezultatelor testului de determinare a pattern-ului de aderență la substrat celular a tulpinilor bacteriene modificate în prezența unor amestecuri fitochimice în concentrații de CMI/4 (1: localizat; 2: difuz; 3: agregativ)
Tehnica citometriei în flux oferă un real avantaj în ceea ce privește interpretarea statistică a procentului de celule aderate și neaderate la substrat celular reprezentat de celule THP-1, însă nu redă și pattern-ul de aderență. Astfel, pentru acest experiment s-a utilizat uleiul volatil de A. fruticosa și s-a observat că acest fitoamestec a redus capacitate tulpinii de E. coli de a adera la celulele eucariote THP-1 de la 37.2% până la 5.74%. (fig. 85). De asemenea, aceste rezultate se corelează cu rezultatele obținute prin metoda Cravioto adaptată.
Fig. 85 Imaginile density plots obținute pentru tulpina E. coli ATCC: a) THP-1 fără celule bacteriene; b) celule THP-1 cu celule bacteriene marcate; c) celule THP-1 cu celule bacteriene marcate și tratate cu CMI/4 ulei volatil
III.2.5. Studiul efectelor imunomodulator și antioxidant pentru amestecurile fitochimice studiate
III.2.5.1. Citotoxicitatea și influența amestecurilor fitochimice asupra ciclului celular
În plăci cu 6 godeuri ce contin mediu RPMI suplimentat cu 10% FBS, 400 IU/mL penicilina, 200 µg/ml streptomicină au fost adăugate 5×105 celule THP-1/godeu. Concentrațiile de amestecuri fitochimice pentru extractele alcoolice au fost cuprinse între 100 – 12.5 µL/mL, iar apoi au fost incubate 24 h la 37oC, într-o atmosferă umedă și cu 5% CO2.
Fig.86.Analiza viabilității celulare (%) pentru celulele THP-1 în prezența extractelor polifenolice concentrate prin metoda MTT (absorbanța±DS)
În fig.86. sunt reprezentate procentual absorbanțele specifice concentrațiilor de extract pentru care se produce o scădere a viabilității culturilor celulare, așa cum s-a determinat prin testul MTT. Extractul din frunzele G.triachantos a avut cel mai înalt efect citotoxic fiind urmat de extractul din frunzele de A. fruticosa.
Efectul citotoxic al uleiurilor volatile față de celulele HEp2 s-a manifestat la concentrațiile corespunzătoare valorilor 1:3000. În etapa următoare s-a determinat influența acestor fitoamestecuri asupra ciclului celular prin citometrie în flux.
Scăderea viabilității celulare este, de obicei legată de două fenomene fiziologice, moartea celulară și/sau inhibarea diviziunii celulare. Metoda citometriei în flux a fost folosită pentru analiza distribuției populației de celule în diferite etape ale ciclului celular în prezența uleiurilor volatile de A. annua, S. canadensis și A. fruticosa. Creșterea ușoară a procentului de celule Hep2 aflate în fazele G1 și S indusă de uleiul volatil de A. fruticosa, a fost corelată cu scăderea celor în faza G2/M, efecte invers proporționale cu diluția amestecului fitochimic (fig.87).
Fig.87. Distribuția celulelor (%) în diferite faze ale ciclului celular pentru martor (celule HEp2) și modificările induse de uleiul volatil de A. fruticosa
Pentru uleiul volatil de S. canadensis s-a observat o creștere a procentului de celule în faza S și G2/M (fig.88.) la o diluție de 1:3000 față de martor (celule netratate), observându-se o scădere a procentului de celule în aceste faze pentru o soluie mai diluat de ulei volatil (1:10000), însă cu o ușoară creștere a procentului de celule aflate în faza G1.
Fig.88. Distribuția celulelor HEp2 (%) în diferite faze ale ciclului celular în prezența uleiului volatil de S. canadensis
După ce celulele au fost expuse timp de 24 ore la concentrații corespunzatoare rapoartelor 1:3000 si respectiv 1:10000 de ulei volatil de A. annua, s-a observat o creștere continuă în faza G0 (pentru dilutia 1:3000) corespunzatoare apoptozei (fig. 89). În comparație cu martorul, tratamentul cu uleiul volatil a indus creșterea populației celulare în faza S de la 13.75 la 23.15, iar pentru faza G2/M de la 13.23 la 38.23, ceea ce indică inhibarea specifică a ciclului celular în faza G2/M.
Fig.89. Distribuția celulelor HEp2 (%) în diferite faze ale ciclului celular și modificările induse de uleiul volatil de A. annua
Acestea sunt primele date referitoare la influența uleiurilor volatile de A. fruticosa, S. canadensis și A. annua asupra ciclului celular al celulelor HEp2 și implicit cu privire la efectul pro- apoptotic al uleiului volatil de A. annua, efect demonstrat în alte studii pe o linie celulară de carcinom hepatic (SMMC-7721 – Li et al., 2004).
III.2.5.2. Capacitatea de neutralizare a radicalilor liberi
Este bine cunoscut faptul că, în general, compușii polifenolici au rolul de a neutraliza radicalii reactivi ai oxigenului (ROS) (Vaya, 1997; Sengul, 2009).
Antioxidanții naturali pot fi definiți ca molecule care previn distrugerea celulelor sub acțiunea radicalilor liberi. În toate sistemele vii, celulele necesită nivele adecvate de protecție antioxidantă, pentru a evita efectul distructiv al eliberării excesive de ROS. În timpul proceselor inflamatorii, neutrofilele și macrofagele eliberează radicali liberi de superoxid și peroxid, care sunt esențiali pentru apărare împotriva invadatorilor. Antioxidanții sunt absolut necesari pentru a controla reacțiile care eliberează radicalii liberi. Antioxidanții frecvent incluși în dietă, vitamina E, vitamina C, β-carotenul, seleniul, cuprul, fierul și zincul optimizează funcționalitatea sistemului imunitar prezentând un rol protector important în infecțiile bacteriene, virale sau parazitare. Antioxidanții au capacitatea de a modula sensibilitatea sau rezistența gazdei la agenții patogeni infecțioși (Puertollano, 2011).
Extractele cu cea mai bună activitate antioxidantă sunt cele obținute din frunze (tabelul 39), aceste rezultate se corelează cu conținutul total de polifenoli prezentat în capitolul intitulat III.2.1. Caracterizarea fizico-chimică a amestecurilor fitochimice. Cea mai bună activitate antioxidantă raportată la cantitatea de material vegetal utilizat s-a obținut pentru extractele din frunzele de A. altissima și F. japonica. Pentru extractele din R. pseudoacacia frunzele și semințele sunt cele mai active antioxidante (rezultate publicate Marinaș și colab, 2014c). Pentru extractele din fructe și frunze de P. americana, efectul antioxidant este comparabil cu cel obținut de Zheleva-Dimitrova (2013), corelându-se cu conținutul de polifenoli și implicit de flavonoide, fiind invers proporțional cu conținutul în betalaine. Țesutul pentru care s-a identificat activitatea antioxidanta (numeroase studii) în cazul speciei F. japonica a fost rădacina, pentru care valoarea ABTS a fost 1849 μmol Trolox/ 100g plantă uscată (având în vedere că extractul conține 21.82 mg material uscat/mL solvent), valoare net inferioara celei obținute în acest studiu pentru extractul din frunze (Cai, 2004).
În tabelul 39 sunt redate valorile IC50 (mg/mL) obținute prin interpolare. Cu cât valoarea IC50 (concentrație care reduce 50% din conținutul în radicali liberi) este mai mică cu atât activitatea antioxidantă este mai bună.
Din punct de vedere al activității antioxidante, rezultatele obținute prin metoda TEAC se corelează cu cele efectuate prin metoda DPPH, valorile fiind invers proportionale însă cu efecte similare. Astfel, cea mai bună activitate antioxidantă au avut frunzele de F. japonica, H. tuberosus și G. triachantos, cu efect inferior martorului de acid galic. Se poate observa că extractul care are un conținut mai ridicat atât în polifenoli cât și în flavonoide prezintă și cea mai bună activitate antioxidantă, rezultate care se corelează cu literatura de specialitate (Rahman și colab., 2008).
Avantajele metodei ABTS constau în faptul că reacția nu este influențată de tăria ionică a mediului și poate fi utilizată pentru determinarea capacității antioxidante atât pentru compuși hidrofili cât și hidrofobi, dar metoda este mult mai complexă față de DPPH (radical mult mai stabil decât ABTS și are ca principiu de bază transferul de electroni). Metoda DPPH prezintă o sensibilitate mult mai mare decât ABTS, iar reacția este mult mai lentă (Martysiak-Żurowska, 2012).
Tabelul 39 Activitatea antioxidantă a extractelor alcoolice obținute din speciile invazive studiate
*nt: nu a fost testat pentru testul ABTS, martor pozitiv al reacției DPPH; -: nu s-a putut determina IC50 (nu a avut activitate antioxidantă)
Metoda DPPH a fost utilizată pentru evaluarea proprietăților antioxidante ale uleiurilor volatile izolate în comparație cu acțiunea timolului (un compus de natură fenolică prezent în uleiurile volatile cu proprietate antioxidantă remarcabilă). Rezultatele au fost interpretate prin calculul EC50 (tabelul 40). Uleiul volatil din inflorescențele de S. canadensis prezintă cea mai bună capacitate antioxidantă, dar inferioară timolului, iar uleiul volatil de A. fruticosa este mai puțin activ chiar la concentrații la care s-a dovedit înalt citotoxic. Prin corelarea compoziției chimice pe clase de compuși cu acțiunea antioxidantă se poate deduce că cel mai bun efect antioxidant este cel produs de uleiul volatil care a avut în compoziție cel mai mare procent de sesquiterpene oxigenate, compuși care au și efect antimicrobian.
Tabelul 40 Activitatea antioxidantă a uleiurilor volatile prin metoda DPPH
Rezultatele sunt asemanatoare celor obținute de Cavar și colab. (2012) pentru care EC50 a fost 27.07 mg/mL, iar conținutul în sesqiuiterpene oxigenate a fost 14.5% în cazul uleiului volatile de A. annua. În acest studiu conținutul în această clasă de compuși a fost 7.75% cu o activitate antioxidantă mai redusă, și anume, EC50 =32.04 mg/mL.
Tirozinaza este o metaloenzimă (ce conține 2 atomi de cupru) care participă la catalizarea reacțiilor de oxidare a fenolilor conducând în final la sinteza melaninei, precum și la înnegrirea fructelor tăiate (cartofi, mere, banane). Astfel, prin studiul de față s-a urmărit determinarea activității enzimatice a tuberculilor de H. tuberosus și fructelor de P. americana, materiale vegetale care au un conținut scăzut de compuși fenolici.
Tabelul 41 Activitatea enzimatică a tirozinazei din materialele vegetale selectate
Având în vedere tabelul 41, extractul enzimatic obținut din tuberculii de H. tuberosus prezintă cea mai bună activitate enzimatică probabil datorită lipsei compușilor fenolici, compuși ce ar putea acționa ca substrat enzimatic biosinteza metaboliților secundari având ca produs final de oxidare, formarea de chinone. Acești compuși sunt cunoscuți pentru proprietățile lor specifice de inhibiție a activității tirozinazice, acționând ca și captatori de radicali liberi (activitate antioxidantă) și/sau chelatori de cupru (Khan, 2007). Specificitatea de substrat este limitată pentru tirozinaza mamiferelor care utilizează numai forma L-tirozină sau L-DOPA ca substrat. Substratul L-DOPA poate cauza daune oxidative generând radicali liberi ai oxigenului prin calea de sinteză a melaninei. Astfel, speciile de plante cu activitate ridicată a tirozinazei formează o concentrație mai ridicată de L-DOPA și generează o cantitate mai mare de radicali liberi de oxigen toxici (Matsumoto, 2011). În timp ce speciile cu activitate enzimatică inferioară pot metaboliza L-DOPA la alți metaboliți netoxici. În acest context se poate corela activitatea antioxidantă slabă a extractului din tuberculii de H. tuberosus și efectul intens fitotoxic.
O afecțiune ereditară care rezultă din afectarea sintezei tirozinazei este albinismul oculocutanat (Olivares și Solano, 2009). În același timp, activitatea tirozinazei este foarte importantă, deoarece s-a constatat că la nivelul melanomului are loc o creștere exponențială a biosintezei de melanină. Astfel, scăderea activității tirozinazei poate să prevină hiperpigmentarea pielii, cum ar fi melasma și petele hepatice, dar și cancerul de piele. (Hideya, 2007). În studiile viitoare se va urmării utilizarea ca enzimă standardizată a tirozinazei prezente în tuberculi de H. tuberosus în vederea determinării activității antioxidante prin capacitatea extractelor fenolice de a inhiba activitatea enzimatică, împiedicând astfel reacția de oxidare a compusului L-DOPA (fig.90)
Fig.90. Calea metabolică de formare a melaninei pornind de la tirozină și respectiv L-dopa (schemă adaptată după Eisenhofer și colab., 2003)
Radicalii reducerii O2 sunt produși secundari ai metabolismului celular și oxidează diferite molecule generând moartea celulară și uneori modificări tisulare. Radicalii de oxigen sunt implicați în patogeneza unor boli ereditare, inclusiv maladia Parkinson, Huntington, Alzheimer, prioni, sindromul Down, ataxie, scleroză multiplă, boala Creutzfeldt-Jacob, scleroză laterală amiotrofică, schizofrenie și dischinezie tardivă (Kovacic, 2012). Pe de altă parte, compușii care determină acumularea intracelulară a radicalilor pot fi utilizați în terapia țintită a celulelor tumorale (Zhu și colab., 2013).
Acumularea intracelulară a radicalilor de oxigen reactivi, evidențiată prin marcarea cu DCFH-DA a fost scăzută pentru toate extractele testate la concentrațiile 100 µL/mL (fig.91) și 200 µL/mL (fig.93) într-o dinamică dependentă de concentrație. Odată cu scăderea concentrației de amestecuri polifenolice, activitatea antioxidantă crește (% mai scăzut de celule fluorescente). Acest lucru ar putea fi explicat prin inhibarea stresului oxidativ intracelular și protejarea celulelor THP-1 (Nampoothiri, 2011).
Fig.91. Evaluarea modulării stresului oxidativ prin microscopie de fluorescență pentru celulele THP-1 stimulate cu H2O2 și tratate cu diferite extracte vegetale în concentrație finală de 100µL/mL
Cel mai bun efect antioxidant s-a observat pentru extractele obținute din florile de R. pseudoacacia, frunzele și florile de G. triachantos la o concentrație de 100 µL/mL (Fig.91 și 92), corelându-se cu conținutul total de flavonoide, compuși cunoscuți pentru caracterul lor puternic antioxidant. De asemenea, pentru aceste extracte s-a identificat un conținut mai ridicat de acid 4-hidroxibenzoic, iar pentru frunzele de G. triachantos acțiunea antioxidantă se poate datora în special acidului elagic și rutin (observându-se o reducere accentuată a stresului oxidativ și la concentrația de 200 µL/mL) (Festa, 2001; Korkmaz, 2009)
Pentru extractul din A. altissima frunze (Aa), concentrația de 200 µL/mL s-a dovedit mult mai eficientă în neutralizarea radicalilor liberi formați de celulele stimulate cu H2O2 (fig. 93) corelându-se cu conținutul total de flavonoide. Extractul de A. fruticosa s-a dovedit cel mai bogat în flavonoide, având o valoare constantă pentru ambele concentrații (aprox. 19% celule fluorescente).
Fig.92. Evidențierea acumulării intracelulare a radicalilor reactivi ai oxigenului (celule THP-1 marcate cu DCFH-DA); imagini de microscopie optică (A) și respectiv de fluorescență (B) pentru celule stimulate cu H2O2 (3- martor pozitiv) și tratate cu extracte de R. pseudoacacia flori (1) și G. triachantos frunze (2)
Fig.93. Evaluarea modulării stresului oxidativ prin microscopie de fluorescență pentru celulele THP-1 stimulate cu H2O2 și tratate cu diferite extracte vegetale în concentrație finală de 200µL/mL
Pentru uleiurile volatile studiate s-a observat că la concentrațiile de 20 µL/mL și respectiv 10 µL/mL (concentrații la care viabilitatea celulară pentru celulele THP-1 este aproape maximă) are loc o stimulare a eliberării radicalilor liberi (fig. 94), în contrast cu rezultatele obinute prin metoda DPPH (metoda ce presupune neutralizarea radicalilor liberi in vitro prin reducerea DPPH● – culoare violeta la un compus galben pal).
Fig.94. Evaluarea modulării stresului oxidativ prin microscopie de fluorescență pentru linia celulară THP-1 stimulată cu H2O2 și tratată cu diferite concentrații de uleiuri volatile
Uleiul volatil de S. canadensis a stimulat eliberarea intracelulară de radicali liberi de la 64.85% (pentru H2O2) la 93.59% (fig. 95), ceea ce sugerează că acțiunea antioxidantă promițătoare în testele in vitro ar putea fi un mecanism de declanșare a efectului citotoxic pentru celulele tumorale. Nivelul ridicat de radicali liberi este o trăsătură biochimică comună celulelor tumorale. Astfel, celulele canceroase au un stres oxidativ mai ridicat decât celulele normale. Din punct de vedere farmacologic modularea ROS, fie prin creșterea sau prin scaderea conținutului în ROS, pot conduce la distrugerea selectivă a celulelor tumorale, efect evidențiat de Zhu și colab., 2013.
Fig.95. Evidențiere acumulării intracelulare a radicalilor liberi de oxigen (celule THP-1 marcate cu DCFH-DA). Imagini de microscopie optică (1) și respectiv de fluorescență (2) (obiectiv x20) pentru celule stimulate cu H2O2 și tratate cu ulei volatil de S. canadensis
III.2.5.3. Efectul imunostimulator și anti-inflamator al extractelor vegetale in vitro
Inflamația este mediată de numeroase populații celulare, de secreția de citokine pro-inflamatorii; TNF-α, IL-1 și IL-6, care conduc la migrarea leucocitelor la locul infecției. NF-kB este unul dintre cei mai importanți factori de transcriere implicați în secreția de citokine pro-inflamatorii, iar conform cu capitolul II.2.3. Efectul imunomodulator al compușilor polifenolici, s-a observat că flavonoidele prezintă capacitatea de a modula cascada de activare NFkB (Mackenzie, 2004). Citokinele proinflamatorii pot crește exprersia moleculelor de aderență și permeabilitate vasculară, dar de asemenea, induc secreția de chemokine în celulele endoteliale. La situsul infecției, leucocitele secretă citokine anti-inflamatorii: IL-10 și TGF-β. Din punct de vedere clinic, inflamațiile netratate ar putea duce la multe boli inflamatorii cronice cum ar fi artrita reumatoidă, psoriazis, ateroscleroză și boli autoimune (Laosim, 2011).
Compușii fenolici, în special flavonoidele, au capacitatea de a acționa țintit în chemoprevenția cancerului, dar și în tratamentul acestuia. Datorită prezenței grupărilor hidroxil, flavonoidele se atașează cu ușurință la membrana celulară, interferând astfel cu activitățile metabolice celulare. Prin capacitatea antioxidantă, reduc stresul oxidativ, inactivează substanțele carcinogene, inhibă proliferarea, intervin în oprirea ciclului celular și în apoptoză, afectează angiogeneza tumorală și suprimă evoluția spre metastazare, însă în concentrații ridicate pot deveni citotoxice, efect observat prin creșterea stresului oxidativ la concentrații corespunzatoare valorilor 200 µL/mL (Sak, 2014).
Linia de celule umane tumorale monocitare THP-1 a fost alesă pentru acest studiu, deoarece are proprietăți fagocitare și exprimă receptorii pentru Fc și C3b. Acesta este modelul cel mai frecvent utilizat pentru a studia imunomodularea, deoarece aceste celule au capacitatea de a elibera citokine proinflamatorii (IL-1, IL-6, și TNF-α) și chemokine (IL-8 și MCP-1), ca răspuns la stimularea cu LPS (Singh, 2005; Haversen, 2002; Wong, 2001). Concentrațiile de extracte luate în lucru corespund valorii de 50 µL/mL, iar celulele au fost stimulate cu 10 ng/mL LPS.
Având în vedere că interleukinele sunt de natură proteică, iar compușii fenolici au proprietatea de a se lega de proteine, în continuare s-a urmărit influența amestecurilor polifenolice asupra interleukinelor pro-inflamatorii (IL-1β, IL-6, IL-8) și anti-inflamatorii (IL-10).
IL-1 a fost inițial identificat ca factor pirogen, iar ulterior s-a demonstrat că inițiază multe reacții imunitare, inclusiv sinteza de prostaglandine, afluxul și activarea neutrofilelor, activarea celulelor T și sinteza altor citokine, activarea celulelor B și sinteza de anticorpi, și proliferarea fibroblastilor și sinteza colagenului. IL-1 este codificată de două gene distincte, IL-1α și IL-1β, care implică același receptor (Keyel, 2014). IL-1β, o citokină pleiotropică, implicată într-o varietate de reacții inflamatorii, este produsă de macrofagele activate și de o mare varietate de alte tipuri de celule incluzând limfocitele B și celulele endoteliale. Administrarea experimentală poate să provoace hiperalgezie (Safieh-Garabedian, 1995).
Interleukina-1β este considerată o citokină pro-inflamatorie care în prezența extractelor polifenolice s-a redus secreția de IL-1β cu excepția extractului din frunzele de H. tuberosus pentru care s-a observat și o activitate antimicrobiană redusă (fig. 96). Efectul se corelează cu conținutul în flavonoide în sensul reducerii accentuate a producției de IL-1β pentru extractele obținute din frunzele de A. fruticosa, G. triachantos și A. altissima, extracte ce s-au dovedit bogate în această clasă de compuși.
Fig.96.Efectul amestecurilor polifenolice asupra secreției de IL-1β de către celulele THP-1 stimulate cu LPS față de controlul de celulele tratate (THP1+) și netratate (THP1-) cu LPS
IL-1β are rol în inflamația și moartea neuronală de la nivelul sistemului nervos central și este implicată în patologii neurodegenerative. Astrocitele sunt mediatori primari care induc moartea neuronilor. În acest context, conform Sharma și colab., 2007, s-a demonstrat că flavonoidele quercetin și luteolina, intervin în modularea acestui mecanism reducând stresul oxidativ.
Interleukina-6 este o citokină implicată atât în răspunsul inflamator, dar și în reglarea metabolismului, regenerare și în procesele neuronale. Recent a fost raportat că IL-6 stimulează secreția de insulină într-o manieră asemănătoare glucagonului (da Silva Krause, 2012). Există dovezi care sugerează că IL-6 amplifică rezistența hepatocitelor și adipocitelor la insulină, ameliorând în același timp sensibilitatea la insulină a celulei musculare. Nivelul de IL-6 în plasmă este ridicat consecutiv contracției musculare, în obezitate și diabetul zaharat de tip 2 (El-Kadre, 2013).
Fig.97. Efectul amestecurilor polifenolice asupra secreției de IL-6 in celulele THP-1 stimulate cu LPS fata de controlul de celulele tratate (THP1+) si netratate (THP1-) cu LPS
IL-6 exercită efecte benefice pentru menținerea homeostaziei glucozei, stimulând secreția de insulină prin creșterea secreției de GLP-1 în celulele beta-pancreatice. O creștere a nivelului circulant de IL-6 crește rata oxidării lipidelor, absorbția glucozei stimulată de insulină și are efecte anti-inflamatorii. Însă, IL-6 secretată în condiții de obezitate, organismul nu raspunde pozitiv la efectele acestei citokine (El-Kadre, 2013). S-au observat, de asemenea, și scăderi ale nivelului de IL-6 asociate consumului de vin roșu, extractului de ceai, sucului de portocale roșii, uleiului de masline, nucilor și rodiei (Peluso și colab., 2013), însă în majoritatea studiilor s-a aratat că flavonoidele nu intervin în scaderea nivelului de IL-6. Astfel că din fig. 97 se poate observa că extractul din frunzele de A. altissima a stimulat considerabil secreția de IL-6, putându-se considera că acest extract are activitate de LPS asupra celulelor THP-1.
IL-8, cunoscut ca factor chemotactic pentru neutrofile și produsă de fagocitele și celulele mezenchimale expuse diferiților stimuli inflamatorii, prezintă două funcții principale: induce chemotaxia pentru neutrofile și alte granulocite (făcându-le să migreze spre focarul inflamator) și stimulează fagocitoza. În celulele țintă, IL-8 induce răspunsul fiziologic ce determină migrația și fagocitoza; creșterea Ca2+ intracelular, exocitoză și creșterea ratei respiratorii (Modi și colab., 1990; Baggiolini și Clark-Lewis, 1992). Secreția IL-8 crește în stresul oxidativ, induce recrutarea celulelor inflamatorii și o creștere suplimentară a mediatorilor de stres oxidativ, ceea ce îl face un factor cheie în inflamația localizată (Vlahopoulos, 1999). IL-8 este un stimulator puternic al angiogenezei. Catechinele (chatechina și epicatechina) suprimă eliberarea IL-8 în celule endoteliale microvasculare (chemoatractant în inițierea și progresia aterosclerozei), compuși prezenți în toate extractele (Keen și colab., 2005). Toate extractele reduc secreția de IL-8, concentrațiile fiind semnificativ mai scăzute față de martorul de celule THP-1 stimulate cu LPS (fig. 98). Ceea ce explică caracterul puternic antioxidant al extractelor polifenolice și implicit efectul antiinflamator.
Fig.98. Efectul amestecurilor polifenolice asupra secreției de IL-8 de către celulele THP-1 stimulate cu LPS față de controlul de celulele tratate (THP1+) și netratate (THP1-) cu LPS
Interleukina 10 este o citokină cu rol anti-inflamator, produsă de multe tipuri de celule. Funcția principală constă în limitarea reacțiilor inflamatorii și reglarea diferențierii și proliferarii celulelor imunitare (celulele T, B, natural killer, celule prezentatoare de antigen, mastocite și granulocite). IL-10 are un impact major în bolile inflamatorii, maligne, și autoimune (Asadullah, 2003). Dereglarea IL-10 este asociată cu imunopatologia sporită ca și răspuns la infecție, precum și un risc crescut de dezvoltare a mai multor boli autoimune (Iyer, 2012). Supraexpresia IL-10 a fost identificată în anumite tumori, melanoame, limfoame și se consideră că promovează dezvoltarea tumorilor, însă în cazul leziunilor alergice, dermatite și reacții de tuberculinare contribuie la reglarea răspunsul umoral (Mocellin, 2003; Ohmen, 1995). Eliberarea sistemică a IL-10 previne procesele hiperinflamatorii prin activarea axei neuro endocrine în urma reacțiilor de stres acut. În contrast, deficitul IL-10 are relevanță în anumite afecțiuni inflamatorii caracterizate de hipersinteza de citokine de tip 1, cum ar fi psoriazisul. Această interleukină este testată în studiile clinice pentru tratamentul artritei reumatoide, a bolilor inflamatorii ale intestinului, psoriazisului, transplantului de organe și hepatitei C (Asadullah, 2003). Extractele din frunzele de H. tuberosus, A. fruticosa și P. americana ar putea fi utilizate în scopul creșterii capacității de sinteză a IL-10 de către celulele THP-1 (fig. 99).
Fig.99. Efectul amestecurilor polifenolice asupra secreției de IL-10 de către celulele THP-1 stimulate cu LPS față de controlul de celulele tratate (THP1+) și netratate (THP1-) cu LPS
III.3. CONCLUZII GENERALE
Încă din antichitate, fitoterapia a fost practic singura furnizoare de "medicamente", dezvoltarea modernă explozivă a industriei medicamentelor de sinteză a făcut din acest domeniu, o alternativă. Uriașa extindere a utilizării medicamentelor de sinteză însă și efectele secundare și reacțiile adverse ale acestor substanțe, în detrimentul fitoterapiei, recomandă abordarea unor specii de plante care nu sunt specifice habitatului nostru dar care ar putea să stea la baza unor noi remedii. Marile succese ale farmaceuticii moderne, au fost presărate cu destule eșecuri, la care se adaugă promisiunile încălcate referitoare la eradicarea anumitor boli, precum cancerul. Tratamentele costisitoare fără efect, precum și efectele adverse ale medicamentelor de sinteză, au condus paradoxal, la creșterea ratei mortalității.
Prin demonstrarea potențialului terapeutic al plantelor invazive se poate oferi o alternativă atât pentru protejarea biodiversității locale cât și pentru potențarea economiei prin furnizarea unor materii prime cu aplicații farmaceutice, ce nu necesită costuri suplimentare, ele fiind mult mai ușor de obținut și de asemenea, prezintă compuși biologic activi similari plantelor medicinale traditionale. În studiul de față s-a urmărit pe parcursul a șase obiective generale demonstrarea activității antimicrobiene, antibiofilm, antioxidantă și imunomodulatoare a unor amestecuri fitochimice (extracte vegetale și uleiuri volatile) extrase din diferite plante recunoscute ca fiind invazive la noi în țară, precum și caracterul lor fitotoxic, aspect definitoriu pentru încadrarea acestor specii în categoria celor invazive. Rezultatele obținute au condus la următoarele concluzii generale:
Concluzii generale privind compoziția chimică a amestecurilor fitochimice studiate:
Analiza compoziției chimice a amestecurilor fitochimice a evidențiat faptul că extractul alcoolic cu cel mai mare conținut în polifenoli a fost cel obținut din frunzele de F. japonica (1375.3 mg GAE/g planta uscată) din care aproximativ 1% sunt flavonoide. Cel mai înalt conținut în flavonoide s-a obținut pentru extractul din frunzele de A. altissima (1.82 mg QE/ g plantă uscată). Cel mai mare procent de compuși identificați din totalul de fenoli a fost pentru extractul obținut din florile de G. triacanthos (71.99%), compușii majoritari au fost quercetin (91.65 μg/mL) și acid 4-hidroxibenzoic (200 μg/mL). De asemenea, cei mai mulți compuși identificați prin HPLC au fost pentru extractele din frunzele și florile de A. altissima.
Pigmentul fructelor de P. americana este dat de conținutul în betacianine (76.11% din totalul de betalaine), în timp ce pentru frunze s-a observat un conținut mai ridicat în betaxantine (P. americana frunze = 60.22% și A. retroflexus frunze = 61.42%).
Materialele vegetale cele mai bogate în carotenoide au fost frunzele de A. fruticosa (363.91 μg carotenoide exprimate în echivalenți de β-caroten/g plantă uscată).
Prin GC-MS s-a observat că uleiul volatil de A. annua este bogat în monoterpene oxigenate, compuși cunoscuți pentru proprietățle lor citotoxice atât la nivelul celulelor vegetale, procariote cât și eucariote. În timp ce uleiul volatile de A. fruticosa conține aproximativ 82.74% hidrocarburi sesquiterpenice, iar cel din inflorescențele de S. canadensis este bogat în hidrocarburi monoterpenice.
Concluzii generale privind caracterul fitotoxic:
În acest studiu s-a observat c extractele cu un conținut mai mare în acizi hidroxibenzoici prezintă un caracter puternic fitotoxic spre deosebire de cele cu un conținut mai ridicat de acizi hidroxicinamici. Pe lângă afectearea alungirii radiculare, aceste extracte pot induce apariția unor răsaduri anormale cu rădăcini atrofiate.
Rezultatele studiului de față demonstrează potențialul fitotoxic pentru extractele testate cu ajutorul testului Triticum. Acest efect a fost manifestat în principal prin deteriorarea sau inhibarea germinării semințelor de grâu. Compușii fenolici din constituția extactelor vegetale studiate cât și compuși hidrofili din compoziția hidrodistilatelor sunt considerate responsabile pentru inhibarea alungirii radiculare.
Rezultatele macroscopice au fost demonstrate și microscopic, extractele studiate având efect mitoinhibitor pentru soluțiile mai concentrate, alterând astfel puternic diviziunea celulară.
Concluzii generale privind acțiunea antimicrobiană a amestecurilor fitochimie:
Concentrațiile minime inhibitorii ale extractelor alcoolice studiate au variat între 6.25-400 μL/mL, în timp ce solutiilor stoc de ulei volatil în DMSO au variat între 0.51-29.58 mg/mL, standardele izoprenoidice dovedindu-se mult mai active însă la concentrații superioare față de cele identificate în aceste fitoamestecuri, concluzionându-se astfel că efectul acestor compuși este unul sinergic;
Dintre standardele analitice identificate în extractele fenolice s-a observat că o dată cu metilarea grupărilor hidroxil activitatea antimicrobiană se pierde. De asemenea, gruparile hidroxil din poziția meta au redus activitatea antimicrobiană probabil dataorită pierderii simetriei moleculare;
Citometria în flux a confirmat efectul antifungic al uleiului volatil de A. fruticosa la concentrația corespunzatoare valorii CMI, indicând drept posibil mecanism de acțiune perturbarea activității pompelor de eflux, iar la concentrații subinhibitorii s-a observat o creștere a expresiei genice pentru genele cdr1 și cdr2 în cazul celulelor de C. albicans.
Acțiunea antimicrobiană a antibioticelor curent utilizate în clinică a fost potențată în cazul tratamentului cu extractele vegetale alcoolice. Dintre antibioticele testate, acțiunea penicilinei și a kanamicinei a fost semnificativ îmbunătățită de substanțele active din extractul alcoolic obținut din frunzele de R. pseudoacacia asupra unei tulpini de S. aureus izolată din clinică și rezistentă la aceste antibiotice, recuperându-se astfel sensibilitatea acestei tulpini.
Concluzii generale privind acțiunea antipatogenică a amestecurilor fitochimice:
În sudiul realizat s-a demonstrat potențialul anti-patogenic al amestecurilor fitochimice obținute din diferite specii de plante invazive, precum și modularea factorilor de virulență implicați în patogenitatea tulpnilor microbiene utilizate în acest studiu, sugerând, astfel, oportunitatea utilizării acestora în formulările fito-farmaceutice.
Din teste fenotipice s-a observat că extractele vegetale și uleiurile volatile au influențat expresia factorilor de virulență solubili enzimatici prin creșterea sau scăderea exprimării acestora în funcție de tulpinile microbiena testate. Cel mai bun efect s-a evidențiat în cazul tulpinii E. coli B16 pentru care uleiurile volatile au suprimat sinteza de hemolizine, lecitinază, ADN-ază, lipază, amilază și cazeinază, în timp ce în cazul tulpinii A. baumanii extractele alcoolice au stimulat hidroliza esculinei.
Extractele vegetale testate prezintă acțiune anti-biofilm, putând fi utilizate în etapa inițială de formare a biofilmelor microbiene și anume, aderența la substrat inert, mai mult acest studiu constituie un rezultat preliminar în vederea determinării acțiunii acestor extracte asupra biofilmelor preformate;
Capacitatea de aderență la substrat inert a fost inhibată pentru toate tulpinile microbiene testate, la concentrații cuprinse între 6.25-200 μL/mL pentru extractele alcoolice, extractul obținut din fructele de P. americana s-a dovedit cel mai activ asupra aderenței tulpinilor Gram pozitive, în timp ce uleiul volatil de A. annua a prezentat cea mai bună capacitate de inhibiție a aderenței tulpinilor microfungice aparținând genului Candida sp. datorită conținutului în eugenol și α-terpineol, compuși care prezintă capacitatea de disociere și permit astfel schimbul cationic la nivelul membranei plasmatice destabilizând-o. Dintre fenolii testati acizii fenolici s-au dovedit mai activi decat flavonoidele componente ale extractelor alcoolice realizate.
Succesul extractelor vegetale și al uleiurilor volatile obținute din diferite plante invazive în inhibarea aderenței celulare este un instrument promițător în reducerea colonizării microbiene pe diferite suprafețe atât la substrat inert (dispositive medicale) cât și celular care ulterior ar putea duce la infecții nosocomiale. Principalul mecanism de acțiune ar putea să constea în reducerea hidrofobicității suprafețelor celulare prin blocarea formării de interacțiuni hidrofobe între substratul inert și grupările nepoale de la nivelul membranei celulare. Astfel un interes sporit ar consta în realizarea unor materiale medicale impregnate/acoperite cu amestecuri fitochimice cu proprietăți biocide pentru a reduce aderența microbiană și astfel, respingerea celulelor microbiene în faza de fluid, ca celulele plactonice, care sunt mai sensibile la antibiotice.
Amestecurile fitochimice studiate ar putea reprezenta o alternativă sau un adjuvant al terapiei cu antibiotice pentru infecțiile produse de microorganisme rezistente și aderate la diferite substraturi, iar citometria în flux poate constitui un instrument valoros de investigare a acestor proprietăți în timp real.
Concluzii generale privind acțiunea antioxidantă și citotoxicitatea fitoamestecurilor studiate:
Extractele fenolice sunt necitotoxice, cu excepția extractelor obținute din frunzele de G. triachantos, A. fruticosa și A. altissima, care s-au dovedit cele mai bogate în flavonoide, și care prezintă un efect citotoxic ușor față de linia celulară standardizată THP-1.
Toate uleiurile volatile sunt citotoxice la concentrații variabile, 0.15 mg/mL pentru S. canadensis, 0.2 mg/mL pentru A. fruticosa și 0.16 mg/mL pentru A. annua. Uleiul volatil de A. annua exercită un efect pro-apoptotic asupra liniei celulare tumorale Hep2.
Amestecurile fitochimice prezintă capacitatea de neutralizare a radicalilor liberi, fiind direct proporțional cu conținutul în fenoli totali. Activitatea antioxidantă cea mai înaltă, determinată prin metoda TEAC s-a obținut pentru extractele fenolice din frunzele speciilor A. altissima, H. tuberosus și F. japonica.
Uleiurile volatile bogate în sesquiterpene oxigenate, precum inflorescențele de S. canadensis, prezintă cea mai bună capacitate de neutralizare a radicalilor liberi, însă cu o valoare EC50 inferioară timolului.
Extractele fenolice și cu un conținut ridicat de flavonoide au redus stresul oxidativ provocat de stimularea celulelor THP-1 cu H2O2, cel mai activ amestec fenolic fiind cel din frunzele de G. triachantos.
Uleiurile volatile au indus o creștere semnificativă a producției de radicali liberi în celulele tumorale monocitare THP-1, efect ce poate fi exploatat pentru dezvoltarea unor noi strategii antitumorale.
Concluzii generale privind efectul imunomodulator al extractelor polifenolice:
Determinările in vitro pentru evaluarea efectului imunomodulator au aratăt că amestecurlor fenolice au inhibat eliberarea interleukinelor pro-inflamatorii (IL-1β și IL-8), iar extractele obținute din frunzele de H. tuberosus, A. fruticosa și P. americana au stimulat secreția de IL-10 (interleukina anti-inflamatorie), sugerând astfel acțiunea anti-inflamatorie a extractelor cu un conținut ridicat în flavonoide.
Amestecurile fitochimice obținute din diferite plante invazive sunt bogate în compuși antioxidanți și reduc intensitatea răspunsului pro-inflamator, putând, astfel, furniza efecte protectoare în maladii cu substrat inflamator.
Rezultatele obținute referitoare la potențialul antimicrobian al acestor extracte recomandă continuarea cercetărilor în vederea obținerii unor strategii alternative antiinfecțioase și antioxidante și asupra altor extracte obținute din diferite plante invazive, generând astfel nu doar o utilizare empirică ci și o bază științifică a proprietăților lor terapeutice.
În perspectivă, studiul s-ar putea extinde la nivel molecular în vederea evidențierii capacității acestor extracte de a modula expresia genelor pentru factorul NF-kB la nivelul liniei celulare monocitare THP-1, cât și asupra expresiei genice la nivelul unor gene implicate în antibiorezistența microbiană.
Lista de lucrări publicate pe parcursul elaborării tezei
În perioada realizării acestei teze de doctorat, au fost publicate un număr de 5 articole în reviste de tip peer review (dintre care 3 ISI, 2 BDI) și au fost comunicate un număr de 7 lucrări (la manifestări științifice internaționale (3) și naționale (4)). Lucrările semnificative pentru studiul realizat sunt citate în teză și conțin rezultate originale.
Articole
Ioana C. Marinaș, Eliza Oprea, Elisabeta-Irina Geană, Carmen Chifiriuc, Veronica Lazăr, 2014, Antimicrobial and antioxidant activity of the vegetative and reproductive organs of Robinia pseudoacacia, J. Serb. Chem. Soc. (ISI, FI = 0.871), 79(11): 1363–1378, http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0352-5139/2014/0352-51391400049M.pdf
Ioana-Cristina Marinaș, Elisabeta-Irina Geană, Eliza Oprea, Carmen Chifiriuc, Veronica Lazăr, 2014, Antimicrobial and antipathogenic activity of Fallopia japonica leaves alcoholic extract, Biointerface Research in Applied Chemistry (BDI), 4(4): 798-803, http://biointerfaceresearch.com/?page_id=658
Ioana-Cristina Marinaș, Carmen Chifiriuc, Eliza Oprea, Veronica Lazăr, 2014, Antimicrobial and antioxidant activities of alcoholic extracts obtained from vegetative organs of A. retroflexus, Romanian Archives Of Microbiology And Immunology (BDI, B+), 73(1-2): 35-42, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Antimicrobial+and+antioxidant+activities+of+alcoholic+extracts+obtained+from+vegetative+organs+of+A.+retroflexus%2C
Ioana C. Marinaș, Eliza Oprea, Carmen Chifiriuc, Irinel A. Badea, Mihaela Buleandră, Veronica Lazăr, 2015 (in press), Chemical composition and anti-pathogenic effect of Artemisia annua essential oil from Romania, Chemistry and biodiversity (ISI, FI = 1.795);
Marilena V. Hovăneț, Ioana C. Marinaș* (autor de corespondență), Mihaela Dinu, Eliza Oprea, Carmen M. Chifiriuc, Veronica Lazăr, 2015 (in press), The phytotoxicity and antimicrobial activity of Amorpha fruticosa L. leaves extract, , Romanian Biotechnological Letters (ISI, FI = 0.351);
Rezumate în volume ale manifestărilor științifice:
În țară
Ioana C. Marinaș, Carmen M. Chifiriuc, Eliza Oprea, Veronica Lazăr, mai 2013, Antimicrobial activity of Robinia pseudoacacia alcoholic extract, Poster, Volum de rezumate: International Workshop: Challenges In Food Chemistry, Constanța, pp. 33-34
Ioana C. Marinaș, Carmen M. Chifiriuc, Eliza Oprea, Veronica Lazăr, noiembrie 2013, Antimicrobial activity of alcoholic extracts obtained from different parts of the A. retroflexus specie, Poster, Volum de rezumate: Scientific Session of Cantacuzino National Institute of Research-Development for Microbiology and Immunology, „Vaccine – Preventable Diseases”, București, pp. 206
Ioana C. Marinaș, Luminița Mărunțescu, Coralia Bleotu, Carmen Chifiriuc, Eliza Oprea, Irinel Badea, Mihaela Buleandră, Veronica Lazăr, 22-23 mai 2014, Flow cytometry applications in antimicrobial and antipathogenic activities investigation of Amorpha fruticosa essential oil, Comunicare orala. Volum de rezumate: al-X lea Congres National de Citometrie, București, pp. 91-93.
Ioana C. Marinaș, Eliza Oprea, Irina E. Geana, Marilena V. Hovanet, Mihaela Dinu, Carmen Chifiriuc, Veronica Lazar, 08 noiembrie 2014, The phytotoxicity capacity and antimicrobial activity of Amorpha fruticosa leaves extract, Poster, Participarea la Sesiunea de Comunicari Stiintifice „D. Brândză”, editia a XX-a, București, pp. 37
În străinătate
Ioana C. Marinaș, Mihaela Dinu, Robert V. Ancuceanu, Marilena V. Hovanet, Eliza Oprea, Veronica Lazar, 28 iulie-01 august 2014, The phytotoxicity capacity of various invasive plants, Comunicare orala. Volum de rezumate: 7th World Congress on Allelopathy, Vigo, Spania, pp. 95.
Ioana C. Marinaș, Carmen Chifiriuc, Eliza Oprea, Mihaela Buleandră, Veronica Lazăr, 30 august-04 septembrie 2014, WED-109: Chemical composition and antimicrobial activity of Artemisia annua L. essential oil, Poster, Volum de rezumate: FEBS-EMBO 2014, Paris, Franța, pp. 653, http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/febs.12919/pdf
Ioana C. Marinaș, Carmen Chifiriuc, Eliza Oprea, Mihaela Buleandră, Irinel A. Badea, Coralia Bleotu, Veronica Lazăr, 25-28 aprilie 2015, Therapeutic potential of Solidago canadensis invasive-aggressive species for the extraction of essential oils with antimicrobial and anti-biofilm activity, E-poster viewing, 25th ECCMID, Copenhaga, Danemarca, http://eccmidlive.org/resources/therapeutic-potential-of-solidago-canadensis-invasive-aggressive-species-for-the-extraction-of-essential-oils-with-antimicrobial-and-anti-biofilm-activity.
Bibliografie
Abhilasha D., Quintana N., Vivanco J., Joshi J., 2008, Do allelopathic compounds in invasive Solidago canadensis s.l. restrain the native European flora?, Journal of Ecology, 96(5):993-1001;
Addisie Y., Medellin A.C., 2012, Allelopathy in aquatic macrophytes: Effects on growth and physiology of phytoplanktons, African Journal of Plant Science, 6(10): 270-276;
Ahmad A., Khan A., Manzoor N., 2013, Reversal of efflux mediated antifungal resistance underlies synergistic activity of two monoterpenes with fluconazole, European Journal of Pharmaceutical Sciences 48: 80–86;
Ahn C.B., Shin T.S., Seo H.K., Je J.Y., 2012, Phenolic composition and antioxidant effect of aqueous extract of Arisaema cum Bile, the Oriental Herb Medicine, in human fibroblast cells, Immunopharmacology and Immunotoxicology, 34(4): 661–666;
Aickin M, Gensler H., 1996, Adjusting for multiple testing when reporting research results: the Bonferroni vs Holm methods, Am J Public Health., 86(5): 726-728.
Aksoy O., Erbulucu T., Oner S., Tekeli I.B., 2012, Phytotoxic and genotoxic effects of water samples taken from the eastern channel of kocaeli on Vicia faba and Zea mays, Fresenius Environmental Bulletin, 21(7): 1819-1826;
Alpert P., Bone E., Holzapfel C., 2000, Invasiveness, invasibility and the role of environmental stress in the spread of non-native plants. Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics. Urban & Fischer Verlag, 3(1): 52-66;
Anastasiu P., Negrean G., 2007, Invadatori vegetali in Romania, Ed. Universitatii din Bucuresti, 8-13;
Anastasiu P., Negrean G., Bașnou C., Sîrbu C., Oprea A., 2008, A preliminary study on the neophytes of wetlands in Romania, Biological Invasions – from Ecology to Conservation, 7:181-191;
Anastasiu, P, Negrean G., 2005, Alien plants in Romania. Analele Stiintifice ale Universitatii "Alexandru Ioan Cuza" din Iasi. Tomul LI (Sectiunea II.a Biologie vegetala):87-96;
Ando H., Kondoh H., Ichihashi M., Hearing VJ., 2007, Approaches to identify inhibitors of melanin biosynthesis via the quality control of tyrosinase, Journal of Investigative Dermatology 127:751–761 doi:10.1038/sj.jid.5700683;
Anghel I., Grumezescu A.M., Holban A.M., Ficai A., Anghel A.G., Chifiriuc M.C., 2013, Biohybrid nanostructured iron oxide nanoparticles and Satureja hortensis to prevent fungal biofilm development, Int. J. Mol. Sci., 14: 18110-18123;
Apati P., Kery A., Houghton J.P., Steventon G.P., Kite G., 2006, In vitro effect of flavonoids from Solidago canadensis extract on glutathione S-transferase, Journal of Pharmacy and Pharmacolog, 58(2):251-256;
Arcuș M., Doroftei E., Lilios G., SavaD., 2011, Comparative Pharmacognostic Study of the Vegetal Products Amaranthi Radix, Amaranthi Folium and Amaranthi Flores Et Fructus, Annals of RSCB, 16(1):354-358;
Arldogan B.C., Baydar H., Kaya S., Demirci M., Ozbaw D., Mumcu E., 2002, Antimicrobial activity and chemical composition of some essential oils, Arch Pharm Res., 25(6): 860-864;
Asadullah K., Sterry W., Volk H.D., 2003, Interleukin-10 therapy – review of a new approach, Pharmacological Reviews, 55(2): 241-269.
Azeredo H.M.C., 2009, Betalains: properties, sources, applications, and stability – a review, International Journal of Food Science and Technology, 44: 2365–2376;
Bach V., Kidmose U., Bjorn C.K., Edelenbos M., 2012, Effects of harvest time and variety on sensory quality and chemical composition of Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus) tubers, Food Chemistry 133:82–89;
Baggiolini M., Clark-Lewis I., 1992. Interleukin-8, a chemotactic and inflammatory cytokine. FEBS Lett. 307: 97-101;
Bakkali F. , Averbeck S., Averbeck D., Idaomar M., 2008, Biological effects of essential oils – A review, Food and Chemical Toxicology, 46: 446–475;
Balakrishnan S., John K.R., George M.R., 2003, Antibiotic susceptibility of Bacillus spp. Isolated from shrimp (Penaeus monodon) culture ponds, Indian Journal of Marine Science, 32, 81-84;
Bassole I.H.N., Juliani H.R., 2012, Essential oils in combination and their antimicrobial properties, Molecules, 17:3989-4006;
Batish D.R., Kaur S., Singh H.P., Kohli R.K., 2008, Role of root-mediated interactions in phytotoxic interference of Ageratum conyzoides with rice (Oryza sativa), Flora, 204: 388-395;
Benesperi R., Giuliani C., Zanetti S., Gennai M., Lippi M.M., Guidi T., Nascimbene J., Foggi B., 2012, Forest plant diversity is threatened by Robinia pseudoacacia (black-locust) invasion, Biodiversity And Conservation, 21(14): 3555-3568;
Bernheim F., 1972, The effect of chloroform, phenols, alcohols and cyanogens iodide on the swelling of Pseudomonas aeruginosa in various salts, Microbios., 5: 143;
Besser K., Harper A., Welsby N., Schauvinhold I., Slocombe S., Li Y., Dixon R.A., Broun P., 2009, Divergent Regulation of Terpenoid Metabolism in the Trichomes of Wild and Cultivated Tomato Species, Plant Physiol., 149(1):499–514;
Bilia A.R., Santomauro F., Sacco C., Bergonzi M.C., Donato R., 2014, Essential Oil of Artemisia annua L.: An Extraordinary Component with Numerous Antimicrobial Properties, Hindawi Publishing Corporation, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Article ID 159819, 7 pages, http://dx.doi.org/10.1155/2014/159819;
Blackburn T.M., Essl F., Evans T., Hulme P.E., Jeschke J.M., Kuhn I., Kumschick S., Markova Z., Mrugala A., Nentwig W., Pergl J., Pysek P., Rabitsch W., Ricciardi A., Richardson D.M., Sendek A., Vila M., Wilson J.R.U., Winter M., Genovesi P., Bacher S., 2014, A Unified Classification of Alien Species Based on the Magnitude of their Environmental Impacts, PLoS Biol, 12(5): e1001850. doi:10.1371/journal.pbio.1001850;
Bojilov D.G., Simeonova Z.B., Solakov N.Y., Angelova-Romova M.Y., Tsvetanova V.M., Ivanov I.I., 2014, Chemical Composition Of Gleditsia triacanthos L. – Application In Phytotherapy Of Socially Significant Diseases, Journal of International Scientific Publications: Materials, Methods and Technologies, 8: 382-392;
Booth B.D., Murphy S.P., Swanton C.J., 2003, Weed Ecology in Natural and Agricultural Systems. CABI Publishing, UK, 235-255;
Borges A., Abreu A.C., Malheiro J., Saavedra M.J., Simões M., 2013b, Biofilm prevention and control by dietary phytochemicals, Microbial pathogens and strategies for combating them: science, technology and education. Publisher: Formatex Research Center; Editor: A. Méndez-Vilas; Microbiology Book Series – 2013 Edition, 1: 32-41;
Borges A., Ferreira C., Saavedra MJ., Simoes M., 2013a, Antibacterial activity and mode of action of ferulic and gallic acids against pathogenic bacteria, Microbial drug resistance, 19(4):256-265;
Bors W., Heller W., Michel C., Saran M., 1990, Flavonoids as antioxidants: Determination of radical-scavenging efficiencies, Meth. Enzym., 186: 343-355;
Boudet AM., 2007, Evolution and current status of research in phenolic compounds, Phytochemistry, 68: 2722–2735;
Bratosin D., 2007, Explorarea structurii si functiilor celulare prin citometrie in flux, “Vasile Goldis” University Press, 153-156;
Brown G.D., 2010, The biosynthesis of artemisinin (Qinghaosu) and the phytochemistry of Artemisia annua L. (Qinghao), Molecules, 15 (11):7603–7698;
Burzo I., Dobrescu A., Bădulescu L., Mihăescu D., Bălan D., 2005, Fiziologia plantelor. Substantele utile din plante, Vol.VIII, Ed. Elisavaros Bucuresti,;
Cai Y., Luo Q., Sun M, Corke H., 2004, Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer, Life Sciences, 74:2157–2184;
Calixto J.B., 2000, Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal medicines (phytotherapeutic agents), Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33: 179-189;
Calixto J.B., Otuki M.F., Santos A.R.S., 2003, Anti-inflammatory compounds of plant origin. Part I. Action on arachidonic acid pathway, nitric oxide and nuclear factor kB(NF-kB), Planta Med., 69: 973-983;
Call L.J., Nilsen E.T., 2005, Analysis of interactions between the invasive tree-of-heaven (Ailanthus altissima) and the native black locust (Robinia pseudoacacia), Journal Plant Ecology, 176 (2):275-285;
Caltagirone S., Rossi C., Poggi A., Ranelletti F.O., Natali P.G., Brunetti M., Aiello F.B., Piantelli M., 2000, Flavonoids apigenin and quercetin inhibit melanoma growth and metastatic potential, Int J Cancer, 87:595–600;
Campos F.M., Couto J.A., Hogg T.A., 2003, Influence of phenolic acids on growth and inactivation of Oenococcus oeni and Lactobacillus hilgardii. J Appl Microbiol 94:167-174;
Capasso F., Gaginella T.S., Grandolini G., Izzo A.A., 2003, Phytotherapy, A Quick Reference to Herbal Medicine, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, pp. 3-9;
Carson C.F., Riley T.V., 1995, Antimicrobial activity of the major components of the essential oil of Melaleuca alternifolia, J Appl Bacteriol., 78(3): 264-269;
Castro-Diez P., Valle G., Gonzalez-Munoz N., Alonso A., 2014, Can the Life-History Strategy Explain the Success of the Exotic Trees Ailanthus altissima and Robinia pseudoacacia in Iberian Floodplain Forests?, PLoS ONE, 9(6): e100254. doi:10.1371/journal.pone.0100254;
Cavar S., Maksimovic M., Vidic D., Paric A.; 2012; Chemical composition and antioxidant and antimicrobial activity of essential oil of Artemisia annua L. from Bosnia, Industrial Crops and Products, 37: 479– 485.
Cerca N., Pier G.B., Vilanova M., Oliveira R., Azeredo J., 2005, Quantitative analysis of adhesion and biofilm formation on hydrophilic and hydrophobic surfaces of clinical isolates of Staphylococcus epidermidis, Res Microbiol., 156(4):506–514;
Cercasov C., Popa C.-V., Dumitrașcu F., Drăghici C., 2004, Compuși cu acțiune terapeutică, naturali și de sinteză, Ed. Universității din București.
Cerqueira M.A., Souza B.W.S., Martins J.T., Teixeira J.A., Vicente A.A., 2010, Seed extracts of Gleditsia triacanthos: Functional properties evaluation and incorporation into galactomannan films, Food Research International, 43:2031–2038;
Chandrasekhar J., Sonika G., Madhusudhan M.C., Raghavarao K.S.M.S., 2015, Differential partitioning of betacyanins and betaxanthins employing queous two phase extraction, Journal of Food Engineering, 144: 156–163;
Chandrasekharan N.V., Dai H., Roos K.L., Evanson N.K., Tomsik J., Elton T.S., Simmons DL., 2002, COX-3, a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/ antipyretic drugs: cloning, structure, and expression, Proc Natl Acad Sci USA, 99: 13926-13931;
Chang S.T., Wu J.H., Wang S.Y., Kang P.L., Yang N.S., Shyur L.F., 2001, Antioxidant activity of extracts from Acacia confusa bark and heartwood, J. Agric. Food Chem., 49:3420-3424;
Charles D.J., Cebert E., Simon J.E., 1991, Characterization of the essential oils of Artemisia annua L., J. Ess. Oil Res., 3: 33-39;
Chaturvedi D., 2011, Opportunity, Challenge and Scope of Natural Products in Medicinal Chemistry, Sesquiterpene lactones: Structural diversity and their biological activities, Research Signpost, India, 37/661(2): 313-333;
Chau A.S., Mendrick C.A., Sabatelli F.J., Loebenberg D., McNicholas P.M., 2004, Application of real-time quantitative PCR to molecular analysis of Candida albicans strains exhibiting reduced susceptibility to azoles, Antimicrobial agents and chemotherapy, 48:2124-2131;
Chiang L.C., Ng L.T., Chang M.Y.., Lin C.C., 2003, Immunomodulatory activities of flavonoids, monoterpenoids, triterpenoids, iridoid glycosides and phenolic compounds of Plantago Species, Lanta Med, 69:600-604;
Chiesi M., Schwaller R., 1995, Inhibition of constritutive endothelial NO-synthase activity by tannin and quercetin, Biochem. Pharm., 49: 495-501;
Chifiriuc C.M., Mihaescu G., Lazăr V., 2011, Microbiologie si virologie medicala, Bucursti, Ed. Univ. din Bucuresti;
Chirilă C., Ciocarlan V., Berca M., 2002, Atlasul principalelor buruieni din Romania, Edit. Ceres, Bucuresti;
Chopra I., Hodgson J., Metcalf B., Poste G., 1997, The search for antibacterial agents effective against bacteria resistant to multiple antibiotics, Antimicrob Agents Chemother, 41(3): 497–503;
Chou C.H., Lee Y.Y., 1991, Allelopathic dominance of Miscanthus transmorrisonensis in an alpine grassland community in Taiwan, J. Chem. Ecol., 17: 2267-2281;
Chou C.H., Leu L.L., 1992, Allelopathic substances and interactions of Delonix regia (BOJ) RAF, J. Chem. Ecol., 18: 2285-2303;
Ciocârlan V., 2000, Flora ilustrată a României. Pteridophyta et Spermatophyta., Edit. Ceres, București,
Ciulei I., Grigorescu E., Stanescu U., 1993, Plante Medicinale Fitochime si Fitoterapie, Vol.I, Ed Medicala Bucuresti;
Cogălniceanu D., Skolka M., Făgăraș M., Anastasiu P., Preda C., Samoilă C., 2007-2010, SMDRSI – Sistem de Monitorizare și Detectare Rapidă a Speciilor Invazive, http://www.specii-invazive.ro/, Accesat la data de 10 oct. 2012;
Comalada M., Ballester I., Bailon E., Sierra S., Xaus J., Galvez J., de Medina F.S., Zarzuelo A., 2006, Inhibition of pro-inflammatory markers in primary bone marrow-derived mouse macrophages by naturally occurring flavonoids: analysis of the structure-activity relationship, Biochem Pharmacol, 72: 1010-1021;
Comalada M., Camuesco D., Sierra S., Ballester I., Xaus J., Galvez J., Zarzuelo A., 2005, In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin, which inhibits inflammation through down-regulation of the NF-kB pathway, Eur J Immunol., 35: 584-592;
Cowan M.M., 1999, Plant products as antimicrobial agents, Clin Microbiol Rev, 12(4): 564-582;
Croteau R., Kutchan T.M., Lewis N.G., 2000, Natural Products (Secondary Metabolites), Biochemistry & Molecular Biology of Plants, American Society of Plant Physiologists, 1250-1318;
Csiszar A., 2009, Allelopathic Effects of Invasive Woody Plant Species in Hungary, Acta Silv. Lign. Hung., 5: 9-17;
Cueva C., Moreno-Arribas MV., Martin-Alvarez PJ., Bills G., Vicente MF., Basilio A., Rivas CL., Requena T., Rodriguez JM., Bartolome B., 2010, Antimicrobial activity of phenolic acids against commensal, probiotic and pathogenic bacteria, Research in Microbiology. 161: 372-382;
Cushnie TPT., Lamb AJ., 2005, Antimicrobial activity of flavonoids, J Ethnopharmacol, 26: 343–356;
da Silva Krause M., Bittencourt A., Homem de Bittencourt P.I. Jr., McClenaghan N.H., Flatt P.R., Murphy C., Newsholme P., 2012, Physiological concentrations of interleukin-6 directly promote insulin secretion, signal transduction, nitric oxide release, and redox status in a clonal pancreatic β-cell line and mouse islets, J Endocrinol., 214(3): 301-311.
Davis M.E., Croteau R., 2000, Cyclization Enzymes in the Biosynthesis of Monoterpenes, Sesquiterpenes, and Diterpenes, Topics in Current Chemistry, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 209:53-95;
Dawidowicz A.L., Olszowy M., 2012, Mechanism change in estimating of antioxidant activity of phenolic compounds, Talanta, 97: 312–317;
De Beer D., Joubert E., Gelderblom WCA., Manley M., 2002, Phenolic compounds: a review of their possible role as in vivo antioxidants of wine, S. Afr. J. Enol. Vitic., 23(2): 48-61;
De Carvalho C.C.C.R., da Fonseca M.M.R., 2004, Principal component analysis applied to bacterial cell behavior in the presence of organic solvents, Biocatal. Biotransform., 22:203-214;
De Stefano D., Maiuri M.C., Simeon V., Grassia G., Soscia A., Cinelli M.P., Carnuccio R., 2007, Lycopene, quercetin and tyrosol prevent macrophage activation induced by gliadin and IFNgamma, Eur J Pharmacol, 566:192-199;
Del Sorbo G., Schoonbeek H., De Waard M.A., 2000, Fungal transporters involved in efflux of natural toxic compounds and fungicides, Fungal Genetics and Biology, 30: 1-15;
Delgado-Vargas F., Jiménez A.R., Paredes-López O., 2000, Natural Pigments: Carotenoids, Anthocyanins, and Betalains — Characteristics, Biosynthesis, Processing, and Stability, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 40(3):173–289;
Di Pasqua R., Betts G., Hoskins N., Edwards M., Ercolini D., Mauriello G., 2007, Membrane toxicity of antimicrobial compounds from essential oils, J. Agric. Food Chem., 55: 4863–4870;
Dihoru G., 2004, Invasive plants in Romania's flora, Analele Universitatii din Craiova, 45(9):73-82;
Djilas S., Markov S., 2011, Antioxidant and antimicrobial activities of beet root pomace extracts, Czech Journal of Food Sciences, 29(6): 575-585;
Donlan R.M., 2001, Biofilms and device-associated infections, Emerging Infectious Diseases, 7(2): 277-281;
Druesne-Pecollo N., Latino-Martel P., Norat T., Barrandon E., Bertrais S., Galan P., Hercberg S.; 2010; Beta-carotene supplementation and cancer risk: a systematic review and metaanalysis of randomized controlled trials, Int. J. Cancer, 127:172–184;
Dumitrașcu M., Grigorescu I., Kucsicsa Gh., Dragotă C.S., Năstase M., 2011, Non-Native And Native Invasive Terrestrial Plant Species In Comana Natural Park. Case-Studies: Amorpha fruticosa and Crataegus monogyna, Rom. Journ. Geogr., 55(2):81–89;
Edris AE., 2007, Pharmaceutical and therapeutic potentials of essential oils and their individual volatile constituents: a review, Phytother. Res., Published online in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com) DOI: 10.1002/ptr.2072;
Eisenhofer G., Tian H., Holmes C., Matsunaga J., Roffler-Tarlov S., Hearing V.J., 2003, Tyrosinase: a developmentally specific major determinant of peripheral dopamine, The FASEB Journal, 17(10):1248-1255;
El Abed S., Houari A., Latrache H., Remmal A., Koraichi S.I., 2011, In vitro activity of four common essential oil components against biofilm-producing Pseudomonas aeruginosa, Research Journal of Microbiology, 6(4): 394-401;
El-Kadre L.J., Tinoco A.C.A., 2013, Interleukin-6 and obesity: the crosstalk between intestine, pancreas and liver, Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 16: 564–568.
El-Sayed M.M., El-Nahas H.A., Adel-Hameed E.S., El-Wakil E.A., 2013, Investigation and antioxidant of phenolic compounds of the leaves of Gleditsia triacanthos L., International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5(S2): 172-177;
Eo S.H., Cho H.S., Kim S.J., 2014, Resveratrol regulates type II collagen and COX‑2 expression via the ERK, p38 and Akt signaling pathways in rabbit articular chondrocytes, Experimental And Therapeutic Medicine, 7: 640-648;
Essl F., Rabitsch W., 2002, Neobiota in Österreich., Umweltbundesamt GmbH, Wien, 432;
Farré G., Sanahuja G., Naqvi S., Bai C., Capell T., Zhu C., Christou P., 2010, Travel advice on the road to carotenoids in plants, Plant Science, 179:28–48;
Festa F., Aglitti T., Duranti G., Ricordy R., Perticone P., Cozzi R., 2001, Strong antioxidant activity of ellagic acid in mammalian cells in vitro revealed by the comet assay, Anticancer Res., 21(6A):3903-3908;
Filip V., Plocková M., Šmidrkal J., Špičková Z., Melzoch K., Schmidt S., 2003, Resveratrol and its antioxidant and antimicrobial effectiveness, Food Chemistry, 83(4): 585–593;
Follak S., Dullinger S., Kleinbauer I., Moser D., EssL F., 2013, Invasion dynamics of three allergenic invasive Asteraceae (Ambrosia trifida, Artemisia annua, Iva xanthiifolia) in central and eastern Europe, Preslia 85: 41–61;
Forman J., Kesseli R.V., 2003, Sexual reproduction in the invasive species Fallopia japonica (Polygonaceae), American J. Bot., 90(4):586–592;
Fox J., Weisberg S., 2011, An R Companion to Applied Regression, Second Edition. Thousand Oaks CA: Sage. URL: http://socserv.socsci.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion, Accesat la data 30 mai 2014;
Gallet C., Pellissier F., 1997, Phenolic compounds in natural solutions of a coniferous forest, Journal of Chemical Ecology, 23: 2401-2412;
Gherardi F., Angiolini C., 2007, Eradication and control of invasive species. Biodiversity conservation and habitat management, Encyclopaedia of life support systems. Eolss Publishers/UNESCO, Oxford, 2:274–302;
Gherghi A., Burzo I., Bibicu M., Mărgineanu L., Bădulescu L., 2001, Biochimia si fiziologia legumelor si fructelor. Ed. II-a revăzută si completată. Ed. Academiei Române;
Gianetti J., Pedrinelli R., Petrucci R., Lazzerini G., De Caterina M., Bellomo G., De Caterina R., 2002, Inverse association between carotid intima-media thickness and the antioxidant lycopene in atherosclerosis, Am. Heart J., 143: 467-474;
Giorgi A., Vilches C., Rodríguez Castro M.C., Zunino E., Debandi J., Kravetz S., Torremorell A., 2014, Honey locust (Gleditsia triacanthos L. (Fabaceae)) invasion effect on temperature, light and metabolism of a pampean stream, Acta Biológica Colombiana, 19(1): 113-118;
Gora A.B., Yao J., Sandy E.H., Zheng S., Zaray G., Koroma B.M., Hui Z., 2010, Cell surface hydrophobicity (CSH) of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Aspergillus niger and the biodegradation of Diethyl Phthalate (DEP) via microcalorimetry, Journal of American Science, 6(7): 78-88;
Grecescu D., 1876, O erborisațiune pe la monăstirile Agapia, Văraticul și Neamțul. Rev. Cont. Lit. Șt., 5(8) (in Brândză D., 1879-1883 – Prodromul Florei Române. Tipogr. Acad. Române, București);
Grecescu D., 1909, Suplement la Conspectul florei României. Inst. Arte Grafice București;
Grün S., Frey M., Gierl A., 2005, Evolution of the indole alkaloid biosynthesis in the genus Hordeum: distribution of gramine and DIBOA and isolation of the benzoxazinoid biosynthesis genes from Hordeum lechleri, Phytochemistry, 66(11):1264-1272;
Guimaraes A.G., Quintans J.S.S., Quintans-Júnior L.J., 2013, Monoterpenes with Analgesic Activity – A Systematic Review, Phytotherapy Research, 27:1-15;
Guo X.-L., Leng P., Yang Y., Yu L.-G., Lou H.-X., 2008, Plagiochin E, a botanic-derived phenolic compound, reverses fungal resistance to fluconazole relating to the efflux pump, Journal of Applied Microbiology, 104: 831–838;
Guzman H.M., Jara Valido A., Duarte L.C., Presmanes K.F., 2010, Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture condition, Aquacult Int., 18: 189–199;
Hancock R.E.W., 1998, Resistance mechanisms in Pseudomonas aeruginosa and other nonfermentative Gram-negative bacteria, Clinical Infectious Diseases, 27(Suppl 1):S93–99;
Haversen L., Ohlsson B.G., Hahn-Zoric M., Hanson L.A., Mattsby-Baltzer I., 2002, Lactoferrin down-regulates the LPS-induced cytokine production in monocytic cells via NF-kB. Cell Immunol, 220:83–95.
Hayden M.S., Ghosh S., 2004, Signaling to NF-kappaB, Genes Dev, 18: 2195-2224;
Haysom K.A., Murphy S.T., 2003, The status of invasiveness of forest tree species outside their natural habitat: a global review and discussion paper. Forest Health and Biosecurity Working Paper FBS/3E. Forestry Department. FAO, Rome, http://www.fao.org/docrep/006/j1583e/j1583e00.htm, accesat la data de 12 mai 2013;
He H.Q., Lin W.X., 2001, Studies on allelopathic physiobiochemical characteristics of rice, Chin. J. Eco-Agric., 9: 56-57;
Hejda M., Pyšek P., JarošíkV., 2009, Impact of invasive plants on the species richness, diversity and composition of invaded communities, Journal of Ecology, 97(3):393-403;
Hemmerlin A., Harwood J.L., Bach T.J., 2012, A raison d’être for two distinct pathways in the early steps of plant isoprenoid biosynthesis?, Progress in Lipid Research, 51:95–148;
Heywood V.H., Sharrock S., 2013, European Code of Conduct for Botanic Gardens on Invasive Alien Species, Council of Europe, Strasbourg, Botanic Gardens Conservation International, Richmond, pp. 05-11;
Hiebert R.D., Stubbendieck J., 1993, Handbook for Ranking Exotic Plants for Management and Control. U.S. Department of Interior, National Park Service, Denver, CO.;
Hodnick WF., Duval DL., Pardini RS., 1994, Inhibition of mitochondrial respiration and cyanide-stimulated generation of reactive oxygen species by selected flavonoids, Biochem. Pharm., 47: 573-580;
Holban A.M., Cotar A.I., Chifiriuc M.C., Bleotu C., Banu O., Lazăr V., 2013, Variation of virulence profiles in some Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa stains isolated from different clinical patients, African Journal of Microbiology Research, 7(27): 3453-3460;
Holm Y., Laakso I., Hiltunen R., Galambosi B., 1997, Variation in the essential oil composition of Artemisia annua L. of different origin cultivated in Finland, Flavour and Fragrance Journal, 12(4): 241–246.
Holmes A.R., Tsao S., Ong S.-W., Lamping E., Niimi K., Monk B.-C., Niimi M., Kaneko A., Holland B.R., Schmid J., Cannon R.D., 2006, Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2, Molecular Microbiology, 62(1): 170–186;
Holub J., Jirásek V., 1967, Zur Vereinheitlichung der Terminologie in der Phytogeographie. Folia Geobot. Phytotax., 2: 69-113;
Horvath G., Molnar P., Farkas A., Szabo L.G., Turcsi E., Deli J., 2010, Separation and identification of carotenoids in flowers of Chelidonium majus L. and inflorescences of Solidago canadensis L., Chromatographia Supplement, 71: S103–S108;
Hřjsgaard S., Halekoh U., Robison-Cox J., Wright K., Leidi A.A., 2013, doBy: doBy – Groupwise summary statistics, general linear contrasts, population means (least-squares-means), and other utilities. R package version 4.5-9. http://CRAN.R-project.org/package=doBy. Accesat la data 30 mai 2014;
Iamonico D., 2010, Biology, life-strategy and invasiveness of Amaranthus retroflexus L. (Amaranthaceae) in central Italy: preliminary remarks, Botanica Serbica, 34 (2): 137-145;
Inderjit E.H., Crocoll C., Bajpai D., Kaur R., Feng Y., Silva C., Carreón J.T., Valiente-Banuet A., Gershenzon J., Callaway R.M., 2011, Volatile chemicals from leaf litter are associated with invasiveness of a neotropical weed in Asia, Ecology, 92:316-324;
Istudor V., 2001, Farmacognozie, fitochimie, fitoterapie, Vol. II, Ed. Medicala, Bucuresti,
Ivănescu B., Lungu C., Spac A., Tuchilus C., 2014, Essential oils from Amorpha fruticosa L. fruits – chemical characterization and antimicrobial activity, Analele Științifice ale Universității „Al. I. Cuza” Iași s. II a. Biologie vegetală, 60(1): 33-39;
Iyer SS., Cheng G., 2012, Role of Interleukin 10 Transcriptional Regulation in Inflammation and Autoimmune Disease. Critical reviews in immunology, 32(1): 23-63;
Jabra–Rizk M.A., Falkler W.A., Meiller T.F., 2004, Fungal biofilms and drug resistance, Emerging Infectious Diseases, 10: 14-19;
Jahns P., Holzwarth AR., 2012, The role of the xanthophyll cycle and of lutein in photoprotection of photosystem II, Biochim Biophys Acta., 1817(1):182-93;
Jerz G., Skotzki T., Fiege T., Winterhalter P., Wybraniec S., 2008, Separation of betalains from berries of Phytolacca americana by ion-pair high-speed counter-current chromatography, Journal of Chromatography A, 1190: 63–73;
Ji H.F., Du A., Zhang L., Xu C.Y., Yang M., Li F.F., 2012, Effects of drying methods on antioxidant properties in Robinia pseudoacacia L. Flowers, Journal of Medicinal Plants Research, 6(16):3233-3239;
Jin Y., Samaranayake Y.H, Yip H.K., Samaranayake L.P., 2005, Characterization of swich phenotypes in Candida albicans biofilms, Mycopathologia, 160: 191-200;
Jităreanu A., Pădureanu S., Tătărîngă G., Tuchiluș C., Stănescu U., 2013, Evaluation of phytotoxic and mutagenic effects of some cinnamic acid derivatives using the Triticum test, Turkish Journal of Biology, 37: 748-756;
Jung C.M., Heinze T.M., Schnackenberg L.K., Mullis L.B., Elkins S.A., Elkins C.A., Steele R.S., Sutherland J.B., 2009, Interaction of dietary resveratrol with animal-associated bacteria, FEMS Microbiology Letters, 297(2):266-273;
Kalemba D., Gora J., Kurowska A., Majda T, 1990, Analysis of the essential oil of Solidago canadensis, Planta Med., 56(2): 222-223;
Kalinova J., Dadakova E., 2009, Rutin and total quercetin content in Amaranth (Amaranthus spp.), Plant Foods for Human Nutrition, 64(1):68-74;
Kamalak A., Guven I., Kaplan M., Boga M., Atalay A.I., Ozkan C.O., 2012, Potential nutritive value of honey locust (Gleditsia triacanthos) pods from different growing sites for ruminants, J. Agric. Sci. Technol., 14(1): 115-126;
Kamo T., Takemura T., Wasano N., Fujii Y., Hieadate S., 2012, Quantification of cyanamide in young seedlings of Vicia species, Lens culinaris and Robinia pseudoacacia by Gas Chromatography-Mass Spectrometry, Biosci. Biotechnol. Biochem., 76(7):1416-1418;
Kanner J., Harel S., Granit R., 2001, Betalains–a new class of dietary cationized antioxidants, J Agric Food Chem., 49(11): 5178-5185;
Kanupriya D.P., Sai Ram M., Kumar R., Sawhney R.C., Sharma S.K., Ilavazhagan G., Kumar D., Banerjee P.K., 2005,Cytoprotective and antioxidant activity of Rhodiola imbricata against tert-butyl hydroperoxide induced oxidative injury in U-937 human macrophages, Molecular and Cellular Biochemistry, 275: 1–6;
Karin M., Ben-Neriah Y., 2000, Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity, Annu Rev Immunol, 18: 621-663;
Karin M., Yamamoto Y., Wang QM., 2004, The IKK NF-kappa B system: a treasure trove for drug development, Nat Rev Drug Discov., 3: 17-26;
Kavalier A.R., Ma C., Figueroa M., Kincaid D., Matthews P.D., Kennelly E.J., 2013, Targeted analysis of polyphenol metabolism during development of hop (Humulus lupulus L.) cones following treatment with prohexadione-calcium, Food Chemistry, 145: 254–263;
Keen L.C., Holt R.R., Oteiza P.I., Fraga C.G., Schmitz H.H., 2005, Cocoa antioxidants and cardiovascular health, Am J Clin Nutr, 81(suppl): 298S–303S.
Kefeli VI., Kalevitch MV., Borsari B., 2003, Phenolic cycle in plants and environment, Journal of Cell and Molecular Biology, 2:13-18;
Kettunen M., Genovesi P., Gollasch S., Pagad S., Starfinger U., Brink P., Shine C., 2008, Technical support to EU strategy on invasive species (IAS) – Assessment of the impacts of IAS in Europe and the EU (final module report for the European Commission). Institute for European Environmental Policy (IEEP), Brussels, Belgium. Service contract No 070307/2007/483544/MAR/B2;
Keyel P.A., 2014, How is inflammation initiated? Individual influences of IL-1, IL-18 and HMGB1, Cytokine, 69: 136-145.
Khan MTH., 2007, Molecular design of tyrosinase inhibitors: A critical review of promising novel inhibitors from synthetic origins, Pure Appl. Chem., 79(12): 2277–2295;
Kim D., Kim Y.J., Koh H.S., Jang T.Y., Park H.E., Kim J.Y., 2010, Reactive Oxygen Species Enhance TLR10 Expression in the Human Monocytic Cell Line THP-1, Int. J. Mol. Sci., 11: 3769-3782;
Kim H.P., Mani I., Iversen L., Ziboh V.A., 1998, Effects of naturallyoccurring flavonoids and biflavonoids on epidermal cyclooxygenase and lipoxygenase from guinea-pigs, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 58: 17-24;
Kim H.P.., Son K.H., Chang H.W., Kang S.S., 2004, Anti-inflammatory plant flavonoids and cellular action mechanisms, J Pharmacol Sci, 96: 229-245;
Kim I.B., Kim D.Y., Lee S.J., Sun M.J., Lee M.S., Li H., Cho J.J., Park C.S., 2006, Inhibition of IL-8 production by green tea polyphenols in human nasal fibroblasts and a549 epithelial cells, Biol Pharm Bull, 29: 1120-1125;
Kim K.U., Shin D.H., 2003, The importance of allelopathy in breeding new cultivars, Weed Management for Developing Countries, Food And Agriculture Organization Of The United Nations, R. Labrada (eds.), http://www.fao.org/docrep/006/y5031e/y5031e0f.htm#TopOfPage, Accesat la data de 29 iunie 2014;
Kim Y.S., Ryu Y., Curtis-Long M.J., Yuk H.J., Cho J.K., Kim Y.J., Kim K.D., Lee W.S., Park K.H., 2011, Flavanones and rotenoids from the roots of Amorpha fruticosa L. that inhibit bacterial neuraminidase, Food and Chemical Toxicology, 49:1849–1856;
Kobaisy M., Tellez M.R., Dayan F.E., Duke S.O., 2002, Phytotoxicity and volatile constituents from leaves of Callicarpa japonica Thunb., Phytochemistry, 61(1): 37-40;
Korkmaz A., Kolankaya D., 2009, Protective Effect of Rutin on the Ischemia/Reperfusion Induced Damage in Rat Kidney, J. Surg. Res, 164(2):309–315;
Kornas J., 1978, Remarks on the analysis of a synantropic flora. Acta Bot. Acad. Sci Slovaca, 3: 385-393;
Kovacic P., Somanathan R., 2012, Redox processes in neurodegenerative disease involving reactive oxygen species, Current Neuropharmacology, 10: 289-302;
Kowarik I., 2005, Crop ferality and volunteerism, Urban ornamentals escaped from cultivation. Dedomestication processes, Ed. Gressel J., CRC Press Taylor & Francis Group, pp. 109-110;
Kreuger M.R., Grootjans S., Biavatti M.W., Vandenabeele P., D'Herde K., 2012, Sesquiterpene lactones as drugs with multiple targets in cancer treatment: focus on parthenolide, Anticancer Drugs, 23(9):883-896;
Krochmal A., LeQuesne P.W., 1970, Pokeweed (Phytolacca americana): Possible Source of a Molluscicide, U.S.D.A. Forest Service Research Paper Ne-177;
Kruse M., Strandberg M., Strandberg B., 2000, Ecological Effects of Allelopathic Plants – a Review, National Environmental Research Institute, Silkeborg, Denmark. – NERI Technical Report No. 315, pp, 66;
Kudoh I., Wiener-Kronish J.P., Hashimoto S., Pittet J.F., Frank D., 1994, Exoproduct secretions of P. aeruginosa strains influence severity of alveolar epithelial injury, Am. J. Physiol., 267: 551-556;
Kuhn D.M., Chandra J., Mukherjee P.K., Ghannoum M.A., 2002, Comparison of biofilms formed by Candida albicans and Candida parapsilosis on bioprosthetic surfaces, Infection and Immunity, 70: 878-888;
Kühn I., Klotz S., 2003, The alien flora of Germany – basics from a new German database, Plant invasions: ecological threats and management solutions, 89–100;
Lamson DW., Brignall MS., 1999, Antioxidants in cancer therapy, their actions and interactions with oncologic therapies, Altern Med Rev., 4(5): 304-329;
Laosim T., Chuchawankul S., Tencomnao T., 2011, Immunomodulatory effect of hexane extract of Vernonia cinereaLess. trunk on human peripheral blood mononuclear cells, J. Chem. Pharm. Res., 3(4):188-195;
Laughton M.J., Evans P.J., Moroney M.A., Hoult J.R., Halliwell B., 1991, Inhibition of mammalian 5-lipoxygenase and cyclooxygenase by flavonoids and phenolic dietary additives. Relationship to antioxidant activity and to iron ion-reducing ability, Biochem Pharmacol., 42: 1673-1681;
Lazăr V., 2001, Microbiologie Medicala, Bucuresti, Ed. Univ. din Bucuresti;
Lazăr V., 2003, Aderenta Microbiana, Ed. Academiei Romane, Bucharest;
Le Maitre D.C., van Wilgen B.W., Gelderblom C.M., Bailey C., Chapman R.A., Nel J.A., 2002, invasive alien trees and water resources in South Africa: case studies of the costs and benefits of management, Forest Ecology and Management, 160(1-3): 143-159;
Lemon J.E., Schoen J., 2004, Biomaterials science: an introduction to materials in medicine, Elsevier Academic Press, U.S.A;
Li H., Deng Z., Liu R., Zhu H., Draves J., Marcone M., Sun Y., Tsao R., 2015, Characterization of phenolics, betacyanins and antioxidant activities of the seed, leaf, sprout, flower and stalk extracts of three Amaranthus species, Journal of Food Composition and Analysis, 37: 75–81;
Li H.H., Inoue M., Nishimura H, Mizutani J., Tsuzuki E., 1993, Interaction of trans-cinnamic acid, its related phenolic allelochemicals, and abscisic-acid in seedling growth and seed-germination of lettuce, J. Chem. Ecol., 19: 1775-1787;
Li X, Yan Z, Xu J., 2003, Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans, Microbiology, 149: 353- 362;
Li Y., Li M. Wang L., Jiang Z., Li W., Li H., 2004, Induction of apoptosis of cultured hepatocarcinoma cell by essential oil of Artemisia annul L., Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 35: 337–339;
Li Z.H., Wang Q., Ruan X., Pan C.D., Jiang D.A., 2010, Phenolics and Plant Allelopathy, Molecules, 15: 8933-8952;
Liao K.L., Yin M.C, 2000, Individual and combined antioxidant effects of seven phenolic agents in human erythrocyte membrane ghosts and phosphatidylcholine liposome systems: Importance of the partition coefficient, J. Agric. Food Chem., 48: 2266-2270;
Lis A., Gora J., 2001, Essential Oil of Amorpha fruticosa L., Essent. Oil Res., 13:340-342;
Lloyd C, Chan J., 2006, Not so divided: the common basis of plant and animal cell division. Nature reviews, Molecular cell biology, 7(2): 147–152.
Lovell J.S., Stone F.S., 2005, The economic impacts of aquatic invasive plant species: a review of the literature. National Center for Environmental Economics, http://www.epa.gov/economics, Accesat la data de 22 mai 2013;
Luceri C., Caderni G., Sanna A., Dolara P., 2002, Red wine and black tea polyphenols modulate the expression of cycloxygenase- 2, inducible nitric oxide synthase and lutathione-related enzymes in azoxymethane-induced f344 rat colon tumors, J Nutr., 132: 1376-1379;
Luis A., Gil N., Amaral M.E., Domingues F., Duarte A.P., 2012, Ailanthus altissima (Miller) SWINGLE: A source of bioactive compounds with antioxidant activity, BioResources, 7(2): 2105-2120;
Lyu S.Y., Park W.B., 2005, Production of cytokine and NO by RAW 264.7 macrophages and PBMC in vitro incubation with flavonoids, Arch Pharm Res., 28: 573-581;
Mackenzie G.G., Carrasquedo F., Delfino J.M., Keen C.L., Fraga C.G., Oteiza P.I., 2004 Epicatechin, catechin, and dimeric procyanidins inhibit PMA-induced NF-kappaB activation at multiple steps in Jurkat T cells. FASEB J., 18: 167-169;
MacKinnon J.R., 2002, Invasive alien species in Southeast Asia. ASEAN Rev Biodivers Environ Conserv, 2:9–11;
Mărculescu A., Cernea M., Nueleanu V., Oros N.A., Chereji R; 2007; Resistance to antibiotics, medicamentul veterinar / veterinary drug, Volume 1(1): 44-51;
Marienhagen J., Bott M., 2013, Metabolic engineering of microorganisms for the synthesis of plant natural products, Journal of Biotechnology, 163: 166–178;
Marinaș I.C., Chifiriuc C., Oprea E., Lazăr V., 2014b, antimicrobial and antioxidant activities of alcoholic extracts obtained from vegetative organs of A. retroflexus, 72: 31-38;
Marinaș I.C., Geana E.I., Oprea E., Chifiriuc C., Lazăr V., 2014a, Antimicrobial and antipathogenic activity of Fallopia japonica leaves alcoholic extract, Biointerface Research in Applied Chemistry, 4(4): 792-797;
Marinaș I.C., Oprea E., Geana E.I., Chifiriuc C., Lazăr V., 2014c, Antimicrobial and antioxidant activity of the vegetative and reproductive organs of Robinia pseudoacacia, J. Serb. Chem. Soc., 79(11): 1363-1378;
Martin SA., 1992, Effects of extracellular pH and phenolic monomers on glucose uptake by Fibrobacter succinogenes S85, Ltr. Appl. Microbiol., 15: 26-28;
Martinez R.M., Longhi-Balbinot D.T., Zarpelon A.C., Staurengo-Ferrari L., Baracat M.M., Georgetti S.R., Sassonia R.C., Verri W.A. Jr., Casagrande R., 2015, Anti-inflammatory activity of betalain-rich dye of Beta vulgaris: effect on edema, leukocyte recruitment, superoxide anion and cytokine production, Arch Pharm Res., 38(4):494-504;
Martysiak-Żurowska D., Wenta W., 2012, A comparison of ABTS and DPPH methods for assessing the total antioxidant capacity of human milk. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment. 1(11), 83-89;
Mastelic J., Jerkovi I., 2002, Volatile constituents from the leaves of young and old Ailanthus altissima (Mill.) Swingle tree, Croatica Chemica Acta, 75(1):189-197;
Masters G., Norgrove L., 2010, Climate change and invasive alien species, CABI Working Paper 1: 5-23;
Mathews S.M., Spallholz J.E., Grimson M.J., Dubielzig R.R., Gray T., Reid T.W., 2006, Prevention of bacterial colonization of contact lenses with covalently attached selenium and effects on the rabbit cornea. Cornea, 25: 806–814;
Matkowski A., 2008, Plant in vitro culture for the production of antioxidants — A review, Biotechnology Advances, 26: 548–560;
Matsumoto H., 2011, The mechanisms of phytotoxic action and selectivity of non-protein aromatic amino acids L-DOPA and m-tyrosine, J. Pestic. Sci., 36(1):1–8;
McCaskill D., Croteau R., 1997, Prospects for the bioengineering of isoprenoid biosynthesis, Advances in Biochemical Engineering /Biotechnology, 55:108–141;
Mendiburu F., 2014, agricolae: Statistical Procedures for Agricultural Research. R package version 1.1-8. http://CRAN.R-project.org/package=agricolae, Accesat la data 30 mai 2014;
Middleton E.Jr., Kandaswami C., Theoharides T.C., 2000, The effects of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer, Pharmacol Rev, 52: 673-751;
Mihăescu G., Chifiriuc M.C., Ditu L.M., 2007, Antibiotice si substante chimioterapeutice antimicrobiene, Ed. Academiei, București;
Mihai A., Balotescu-Chifiriuc C., Lazăr V., Stănescu R., Burlibasa M., Ispas D.C., 2010, Biofilme microbiene în medicina dentară cu referire la reabilitarea implanto-protetică, Revista de Chirurgie Oro-Maxilo-Facială și Implantologie, 1: 9-12;
Miles E.A., Zoubouli P., Calder P.C., 2005, Differential anti-inflammatory effects of phenolic compounds from extra virgin olive oil identified in human whole blood cultures, Nutrition, 21: 389-394;
Min Y.D., Choi C.H., Bark H., Son H.Y., Park H.H., Lee S., Park J.W., Park E.K., Shin H.I., Kim S.H., 2007, Quercetin inhibits expression of inflammatory cytokines through attenuation of NFkappaB and p38 MAPK in HMC-1 human mast cell line, Inflamm Res, 56: 210-215;
Miscalencu D., Caraene G., Mailat F., Nichita C., 2008, Efectele biologice benefice ale flavonoidelor, Ed. Universitatii din Bucuresti, pp. 21-24;
Mocellin S., Panelli MC., Wang E., Nagorsen D., Marincola F.M., 2003, The dual role of IL-10, TRENDS in Immunology, 24(1): 36-43;
Modi W.S., Dean M., Seuanez H.N., Mukaida N., Matsushima K., O'Brien S.J., 1990, Monocyte-derived neutrophil chemotactic factor (MDNCF/IL-8) resides in a gene cluster along with several other members of the platelet factor 4 gene superfamily, Hum. Genet,. 84 (2): 185–187;
Mohamed T.K., Kamal A.M., Nassar M.I., Ahmed M.A.E., Haggag M.G., Ezzat H.A.M., 2013, Phenolic contents of Gleditsia triacanthos leaves and evaluation of its analgesic, anti-inflammatory, hepatoprotective and antimicrobial activities, Life Science Journal, 10(4): 3445-3466;
Mohammed R.S., Abou Zeid A.H., El Hawary S.S., Sleem A.A., Ashour W.E., 2014, Flavonoid constituents, cytotoxic and antioxidant activities of Gleditsia triacanthos L. leaves, Saudi Journal of Biological Sciences, 21: 547-553;
Mori A., Nishino C., Enoki N., Tawata S., 1987, Antibacterial activity and mode of action of plant flavonoids against Proteus vulgaris and Staphylococcus aureus, Phytochemistry, 26: 2231–2234;
Morse L.E., Kartesz J.T., Kutner L.S., 1995, Native vascular plants. In: LaRoe, E.T., Farris, G.S., Puckett, C.E., Doran, P.D., Mac, M.J. (Eds.), Our Living Resources: A Report to the Nation on the Distribution, Abundance, and Health of U.S. Plants, Animals and Ecosystems. U.S. Department of the Interior, National Biological Service, Washington, DC, pp. 205–209;
Moța C., Roșu A., Câmpeanu Gh., 2004, Procese in Biotehnologie. Compuși bioactivi de origine vegetală. Abordări biotehnologice, Vol.II, Ed Universitatii Bucuresti;
Muzafarov EN., Zolotareva EV, 1989, Uncoupling effect of hydrocinnamic acid derivatives in pea chloroplasts, Biochem Physiol Pflanzen, 184: 363-369;
Nam N.H., 2006, Naturally occurring NF-kappaB inhibitors, Mini Rev Med Chem., 6: 945-951;
Namiki M., 1990, Antioxidants/antimutagens in food, Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 29: 273-300;
Nampoothiri S.V., Prathapan A., Cherian O.L., Raghu K.G., Venugopalan V.V., Sundaresan A., 2011, In vitro antioxidant and inhibitory potential of Terminalia bellerica and Emblica officinalis fruits against LDL oxidation and key enzymes linked to type 2 diabetes, Food and Chemical Toxicology, 49:125–131;
Nazzaro F., Fratianni F., Coppola R., 2013b, Quorum sensing and phytochemicals, Int. J. Mol. Sci., 14: 12607–12619;
Nazzaro F., Fratianni F., De Martino L., Coppola R., De Feo V., 2013a, Effect of essential oils on pathogenic bacteria, Pharmaceuticals, 6: 1451-1474;
Needleman P., Isakson P.C., 1997, The discovery and function of COX-2, J Rheumatol Suppl., 49: 6-8;
Newman J.D., Chappell J., 1999, Isoprenoid biosynthesis in plants: carbon partitioning within the cytoplasmic pathway, Crit Rev Biochem Mol Biol, 34: 95–106;
Nijveldt R.J., van Nood E., van Hoorn D.E.C., Boelens P.G., van Norren K., van Leeuwen P.A.M., 2001, Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications, Am J. Clin Nutr, 74: 418–425;
Nitiema L.W., Savadogo A., Simpore J., Dianou D., Traore A.S., 2012, In vitro antimicrobial activity of some phenolic compounds (coumarin and quercetin) against gastroenteritis bacterial strains, International Journal of Microbiological Research, 3(3):183-187;
O'Connor C., 2008, Cell Division: Stages of Mitosis, Nature Education, 1(1): 188, http://www.nature.com/scitable/topicpage/mitosis-and-cell-division-205, Accesat la data: iunie 2013
Ohmen JD ., Hanifin JM., Nickoloff BJ., Rea TH., Wyzykowski R., Kim J., Jullien D., McHugh T., Nassif AS., Chan SC., 1995, Overexpression of IL-10 in atopic dermatitis. Contrasting cytokine patterns with delayed-type hypersensitivity reactions, The Journal of Immunology, 154(4): 1956-1963;
Olivares C., Solano F., 2009, New insights into the active site structure and catalytic mechanism of tyrosinase and its related proteins, Pigment Cell Melanoma Res. 22; 750–760;
Olson M.E., Nickel J.C., Khoury A.E., Morck D.W., Cleeland R., Costerton J.W., 1989, Amdinocillin treatment of catheter-associated bacteriuria in rabbits. J Infect Dis., 159: 1065-1072;
Oprea A., 2005, Lista critica a plantelor vasculare din Romania. Edit. Univ. Al. I. Cuza Iasi;
Oprea A., Sirbu C., 2006, Research regarding alien flora from the left bank of the Tisa river, between Valea Viseului and Piatra (Romania). Kanitzia, Szombately, 14: 45-56;
Ozen T., 2010, Antioxidant activity of wild edible plants in the Black Sea Region of Turkey, Grasas Y Aceites, 61(1): 86-94;
Özkan A., Erdoğan A., 2011, A comparative evaluation of antioxidant and anticancer activity of essential oil from Origanum onites (Lamiaceae) and its two major phenolic components, Turk J Biol., 35: 735-742;
Pacifico S., D’Abrosca B., Golino A., Mastellone C., Piccolella S., Fiorentino A., Monaco P., 2008, Antioxidant evaluation of polyhydroxylated nerolidols from redroot pigweed (Amaranthus retroflexus) leaves, Food Science and Technology 41:1665-1671;
Page A.R., Lacey K.L., 2006, Economic impact assessment of Australian weed biological control, CRC for Australian Weed Management, pp. 17;
Pan L., Sinden M.R., Kennedy A.H., Chai H., Watson L.E., Graham T.L., Kinghorn A.D., 2009a, Bioactive constituents of Helianthus tuberosus (Jerusalem artichoke), Phytochem. Lett., 2:15–18;
Pan M.H., Lai C.S., Dushenkov S., Ho C.T., 2009b, Modulation of inflammatory genes by natural dietary bioactive compounds, J. Agric. Food Chem., 57: 4467–4477;
Patrick L., 2000; Beta-carotene:the controversy continues, Alternative Medicine Review, 5(6):530-545;
Pauchard A, Alaback P.B., 2004, Influence of elevation, land use, and landscape context on patterns of alien plant invasions along roadsides in protected areas of southcentral Chile. Conserv. Biol., 18: 238-248;
Pauchard A., Alaback P.B., 2006, Roads as dispersal corridors for alien plants in protected areas of South Central Chile: HoV elevation, landuse and landscape context influence invasion patterns. School of Forestry, University of Montana. Missoula, MT59812, USA;
Pedros R., Moya I., Goulas Y., Jacquemoud S., 2008, Chlorophyll fluorescence emission spectrum inside a leaf, Photochemical & Photobiological Sciences, 7: 498–502;
Peh K.S.H., 2010, Invasive species in Southeast Asia: the knowledge so far, Biodivers Conserv, 19:1083–1099;
Pellegrini N., Serafini M., Colombi B., Del Rio D., Salvatore S., Bianchi M., Brighenti F., 2003, Total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils consumed in Italy assessed by three different in vitro assays, J Nutr., 133(9):2812-2819;
Peluso I., Raguzzini A., Serafini M., 2013, Effect of flavonoids on circulating levels of TNF-α and IL-6 in humans: a systematic review and meta-analysis, Mol Nutr Food Res., 57(5):784-801;
Pemberton R. W., 2002, Selection of Appropriate Future Target Weeds for Biological Control, Biological Control of Invasive Plants in the Eastern United States, 375-386;
Pereira H., Graca J., Rodrigues J.C., 2003, Wood chemistry in relation to wood quality, In Wood Quality and Its Biological Basis, Barnett, J.R. & Jeronimidis, G. (eds.), Biological Sciences Series, Blackwell Publishing & CRC Press, 97-110;
Pimentel D., Lach L., Zuniga R., Morrison D., 2000, Environmental and Economic Costs of Nonindigenous Species in the United States. Bioscience, 50(1): 53-56;
Pimentel D., Zuniga R., Morrison D., 2005, Update on the environmental and economic costs associated with alien-invasive species in the United States, Ecological Economics 52:273– 288;
Plaper A., Golob M., Hafner I., Oblak M., Solmajer T., Jerala R., 2003, Characterization of quercetin binding site on DNA gyrase, Biochem Biophys Res Commun, 306: 530–536;
Plit M.L., Theron A.J., Fickl H., van Rensburg C.E.J., Pendel S., Anderson R., 1998, Influence of antimicrobial chemotherapy and smoking status on the plasma concentrations of vitamin C, vitamin E, β-carotene, acute phase reactants, iron and lipid peroxides in patients with pulmonary tuberculosis, Int J Tuberc Lung Dis., 2(7): 590–596;
Prabhakaran R., Kalaivani P., Huang R., Poornima P., Vijaya Padma V., Dallemer F., Natarajan K., 2013, DNA binding, antioxidant, cytotoxicity (MTT, lactate dehydrogenase, NO), and cellular uptake studies of structurally different nickel(II) thiosemicarbazone complexes: synthesis, spectroscopy, electrochemistry, and X-ray crystallography, J Biol Inorg Chem., 18(2):233-247;
Preston C. D., Pearman D. A., Hall A. R., 2004: Archaeophytes in Britain, Bot. J. Linn. Soc., 145: 257–294;
Prior R.L., Wu X., Schaich K., 2005, Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements, J. Agric. Food Chem., 53(10): 4290–4302;
Prodan I., 1957, Contribuții la flora R.P.R. și a țărilor învecinate. Stud. Cerc. Acad. R.P.R., ser. Biol., filial Cluj;
Pryor W.A., 1997, Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity, Environ Health Perspect, 105: 875–882;
Puertollano M.A., Puertollano E., de Cienfuegos G.Á., de Pablo M.A., 2011, Dietary antioxidants: immunity and host defense, Curr Top Med Chem., 11(14):1752-1766;
Pyšek P., Sádlo J., Mandák B. 2002, Catalogue of alien plants of the Czech Republic, Preslia P., 74(2): 97-186;
Qiao G., Li H., Xu D.-H., Il Park S., 2012, Modified a colony forming unit microbial adherence to hydrocarbons assay and evaluated cell surface hydrophobicity and biofilm production of Vibrio scophthalmi, Bacteriology & Parasitology, 3(1): 130 doi:10.4172/2155-9597.1000130;
R Core Team, 2012, R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org/. Accesat la data 30 mai 2014;
Radjasa O.K., Limantara L., Sabdono A., 2009, Antibacterial activity of a pigment producing-bacterium associatd with Halimeda sp. from land-locked marine lake Kakaban, Indonesia, Journal of Coastal Development, 12(2): 100-104;
Rădulescu V., Pavel M., Teodor A., Tanase A., Ilies D.C., 2009, Analysis of volatile compounds from infusion and hydrodistillate obtained from the species Thymus pulegioides L. (Lamiaceae), Farmacia, 57(3): 282-289;
Rahman A., Kim E.L.,Kang S.C., 2009, Antibacterial and antioxidant properties of Ailanthus altissima swingle leave extract to reduce foodborne pathogens and spoiling bacteria, Journal of Food Safety, 29:499–510;
Rahman I., Biswas S.K., Kirkham P.A., 2006, Regulation of inflammation and redox signaling by dietary polyphenols, Biochem Pharmacol, 72: 1439-1452;
Ramage G., Bachmann S., Petterson T.F., Wickes B.L., Lopez-Ribot J.L., 2002, Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms, Journal of antimicrobial chemotherapy, 49: 973-980;
Ramnani P., Gaudier E., Bingham M., van Bruggen P., Tuohy K. M., Gibson G.R., 2010, Prebiotic effect of fruit and vegetable shots containing Jerusalem artichoke inulin: a human intervention study, British Journal of Nutrition, 104:233–240;
Rao L.G.,Guns E., Rao A.V., 2003, Lycopene: Its role in human health and disease, AGRO Food industry hi-tech, 25-30;
Raut J.S., Karuppayil S.M., 2014, A status review on the medicinal properties of essential oils, Industrial Crops and Products, 62: 250–264;
Raut J.S., Shinde R.B., Chauhan N.M., Karuppayil S.M., 2013, Terpenoids of plant origin inhibit morphogenesis, adhesion, and biofilm formation by Candida albicans, Biofouling, 29(1): 87-96;
Ravichandran K., Saw N.M.M.T, Mohdaly A.A.A., Gabr A.M.M., Kastell A., Riedel H., Cai Z., Knorr D., Smetanska I., 2013, Impact of processing of red beet on betalain content and antioxidant activity, Food Research International, 50: 670–675;
Ravikiran G., Raju A.B., Venugopal Y., 2011, Phytolacca americana: A Review, International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 2(3):942-946;
Reigosa M.J., Pazos-Malvido E., 2007, Phytotoxic effects of 21 plant secondary metabolites on Arabidopsis thaliana germination and root growth, J Chem Ecol, 33:1456–1466;
Reigosa M.J., Sánchez-Moreiras A., Gonzales L., 1999, Ecophysiological approach in allelopathy, Critical Reviews in Plant Sciences, 5: 577-608;
Reynolds S.C.P., 2002, A catalogue of alien plants in Ireland. – National Botanic Gardens Glasnevin Occasional Papers, 14: 414, http://www.botanicgardens.ie/glasra/aliens.htm, Accesat la data de 14 aprilie 2013;
Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G., 1996, Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids, Free Rad. Biol. Med., 20: 933-956;
Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G., 1997, Antioxidant properties of phenolic compounds, Trends Food Sci., 2: 152-159;
Richardson D.M., Pyšek P., Rejmanek M., Barbour M., Panetta F.D., West C.J. 2000 Naturalization and invasion of alien plants: concepts and definitions. Diversity Distrib., 6(2): 93-107;
Rios J.L., Recio M.C., 2005, Medicinal plants and antimicrobial activity, J Ethnopharmacol, 100: 80-84;
Robu S., Aprotosoaie A.C., Miron A., Cioancă O., Stănescu U., Hăncianu M., 2012, In vitro antioxidant activity of ethanolic extracts from some Lavandula species cultivated in Romania, Farmacia, 60(3): 394-401;
Rodriguez-Amaya D.B., Kimura M., 2004, Harvest Plus Handbook for Carotenoid Analysis, HarvestPlus Technical Monograph Series, 2: 2-7;
Rogers P.D., Barker S.B., 2003, Genome-wide expression profile analysis reveals coordinately regulated genes associated with stepwise acquisition of azole resistance in Candida albicans clinical isolates, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47(4): 1220–1227;
Roșu A.F., Bita A., Calina D., Roșu L., Zlatian O., Calina V.; 2012; Other Hospital Pharmacy topics (including: medical devices): Synergic antifungal and antibacterial activity of alcoholic extract of the species Robinia pseudoacacia L. (Fabaceae), Eur J Hosp Pharm, 19(2): 216;
Rudman P., 1963, The causes of natural durability in timber Pt XIII: Factors influencing the decay resistance of cypress pine (Callitris columellaris F. Muell.), Holzforschung 17(6):183-188;
Ryu W.H., Curtis-Long M.J., Jung S., Jin Y.M., Cho J.K., Ryu Y.B., Lee W.S., Park K.H., 2010, Xanthones with neuraminidase inhibitory activity from the seedcases of Garcinia mangostana, Bioorg. Med. Chem., 18:6258–6264;
Safieh-Garabedian B., Poole S., Allchorne A., Winter J., Woolf C.J., 1995, Contribution of interleukin- 1 to the inflammation-induced increase in nerve growth factor levels and inflammatory hyperalgesia, British Journal of Pharmacology, 115: 1265-1275.
Sak K., 2014, Cytotoxicity of dietary flavonoids on different human cancer types, Phcog Rev, 8(16):122-146
Sanglard D., Kuchler K., Ischer F., Pagani J.L., Monod M., Bille J., 1995, Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters, Antimicrob Agents Chemother., 1995, 39(11):2378-86;
Santangelo C., Vari R., Scazzocchio B., Di Benedetto R., Filesi C., Masella R., 2007, Polyphenols, intracellular signaling and inflammation, Ann Ist Super Sanità, 43(4): 394-405;
Santos L., Rodrigues D., Lira M., Oliveira R., Real Oliveira M.E., Vilar E.Y., Azeredo J., 2007, The effect of octylglucoside and sodium cholate in Staphylococcus epidermidis and Pseudomonas aeruginosa adhesion to soft contact lenses, Optom Vis Sci, 84: 429–434;
Sărățeanu V., Horablaga M. N., Stroia M. C., Butnariu M., Bostan C., 2007-2010, Inventrarierea speciilor de plante invazive din vestul Romaniei si elaborarea unor mijloace expeditive eficiente de evaluare a dinamicii si impactului acstora asupra vegetatiei, http://www.specii-invazive.ro/biblio/author/62, Accesat la data 20 oct. 2012;
Sato M., Miyazaki T., Kambe F., Maeda K., Seo H., 1997, Quercetin, a bioflavonoid, inhibits the induction of interleukin 8 and monocyte chemoattractant protein-1 expression by tumor necrosis factor-alpha in cultured human synovial cells, J Rheumatol, 24: 1680-1684;
Saucier CT., Waterhouse AL., 1999, Synergetic activity of catechin and other antioxidants, J. Agric. Food Chem., 47: 4491-4494;
Saxholt E., Christensen A.T., Moller A., Hartkopp H.B., Hess Ygil K., Hels O.H., 2008, Danish food composition databank, revision 7. Department of Nutrition, National Food Institute, Technical University of Denmark, http:// www.foodcomp.dk/, Accesat la data de13 dec. 2012;
Scoditti E., Calabriso N., Massaro M., Pellegrino M., Storelli C., Martines G., De Caterina R., Carluccio M.A., 2012, Mediterranean diet polyphenols reduce inflammatory angiogenesis through MMP-9 and COX-2 inhibition in human vascular endothelial cells: a potentially protective mechanism in atherosclerotic vascular disease and cancer, Arch Biochem Biophys., 527(2): 81-89;
Sengul M., Yildiz H., Gungor N., Cetin B., Eser Z., Ercisli S., 2009, Total phenolic content, antioxidant and antimicrobial activities of some medicinal plants, Pak J Pharm Sci., 22(1):102-106;
Shahidi F., Janitha, P.K., Wanasundara P.D, 1992, Phenolic antioxidants, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 32(1): 67-103;
Shan B., Cai Y.Z., Brooks J.D., Corke H., 2007, The in vitro antibacterial activity of dietary spice and medicinal herb extracts, International Journal of Food Microbiology, 117:112–119;
Sharma V., Mishra M., Ghosh S., Tewari R., Basu A., Seth P., Sen E., 2007, Modulation of interleukin-1beta mediated inflammatory response in human astrocytes by flavonoids: implications in neuroprotection, Brain Res Bull, 73: 55-63;
Shen M.Y., Liu Y.J., Don M.J., Liu H.Y., Chen Z.W., Mettling C., Corbeau P., Chiang C.K., Jang Y.S., Li T.H., Young P., Chang C.L.T., Lin Y.L., Yang W.C., 2011, Combined phytochemistry and chemotaxis assays for identification and mechanistic analysis of antiinflammatory phytochemicals in Fallopia japonica, PLoS ONE, 6(11): e27480. doi:10.1371/journal.pone.0027480;
Silva FAM., Borges F., Guimaraes C., Lima JLFC., Matos C., Reis S., 2000, Phenolic acids and derivatives: Studies on the relationship among structure, radical scavenging activity, and physicochemical parameters, J. Agric. Food Chem., 48: 2122-2126;
Singh U., Tabibian J., Venugopal S.K., Devaraj S., Jialal I., 2005, Development of an in vitro screening assay to test the antiinflammatory properties of dietary supplements and pharmacologic agents, Clinical Chemistry 51(12): 2252–2256;
Singleton V.L., Rossi J.A., 1965, Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic- phosphotungstic acid reagents, Am. J. Enol. Vitic., 16: 144-158.
Sîrbu C., 2010, Raport Asupra Activităților De Cercetare Științifică, Titlul proiectului: Cercetări Asupra Migrației si Invaziei Plantelor Adventive in Unele Habitate Antropice si Naturale Din Moldova (România), U.S.A.M.V. Iași;
Sîrbu C., 2012, Plantele adventive: dinamica populațiilor și riscul introducerii de noi specii: Plante de carantină invazive în România, U.S.A.M.V. Iași, pp. 3-10;
Sîrbu C., Oprea A., Samuil C., Hutanu M., Ghitau C. S.. 2009-2011, Cercetări asupra migrației și invaziei plantelor adventive în unele habitate antropice și naturale din Moldova (România), http://www.univagro-iasi.ro/CNCSIS/Plante_adventive/, Accesat în data de 13 dec. 2012;
Sîrbu C., Oprea A., Eliáš P., Ferus P., 2011, New Contribution To The Study Of Alien Flora In Romania, J. Plant Develop., 18: 121-134;
Sivakumari V., Shanthi G., 2009, Antibiotic susceptibility of common bacterial pathogens isolated from diabetic pus, Advanced Biotech, 8:10-13;
Skolka M., Gomoiu M.T., 2004, Specii invazive în Marea Neagră Impactul ecologic al pătrunderii de noi specii în ecosistemele acvatice, Ovidius University Press Constanța, 8-13, 27-29, 132-141;
Smith A.L., Dyer A.R., 2013, Exploring the mechanisms of allelopathic interaction in the invasive annual plant, Phyllanthus urinaria, Journal of the South Carolina Academy of Science, 11(2):13-16;
Soltys D., Bogatek R., Gniazdowska A., 2012, Phytotoxic effects of cyanamide on seed germination and seedling growth of weed and crop species, Acta Biol. Cracov. Bot., 54(2): 87–92;
Stefani E.D., Boffetta P., Deneo-Pellegrini H., Mendilaharsu M., Carzoglio JC., Ronco A., Olivera L., 1999, Dietary antioxidants and lung cancer risk: a case-control study in Uruguay, Nutr Cancer, 34: 100–110.
Stinson A. K., Campbell S. A., Powell J. R., Wolfe B. E., Callaway R. M., Thelen G. C., Hallet S. G., Prati D., Klironomos J. N., 2006, Invasive plants suppresses the grouth of native tree seedling by disruption belowground mutualisms. Plos Biology, 4(5) e140: 0727-0731;
Stintzing F.C., Carle R., 2007, Betalains – emerging prospects for food scientists, Trends in Food Science & Technology, 18: 514-525;
Stintzing F.C., Schieber A., Carle R., 2003, Evaluation of colour properties and chemical quality parameters of cactus juices, Eur. Food Res. Technol, 216: 303-311;
Stoyanova A., Georgiev E., Lis A., Majda T., Gora J., 2003, Essential oil from stored fruits of Amorpha fruticosa L., Journal of Essential Oil Bearing Plants, 6(3): 195-197;
Sugihara N., Arakawa T., Ohnisi M., Furuno K., 1999, Anti- and pro-oxidative effects of flavonoids on metal-induced hydroperoxide-dependent lipid peroxidation in cultured hepatocyres loaded with a-linolenic acid, Free Rad. Biol. Med., 27: 1313-1323;
Swanton C.J., Cavers P.B., 1989, Biomass and nutrient allocation patterns in Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus), Can. J. Bot. 67:2880-2887;
Swanton C.J., Cavers P.B., Clements D.R., Moore M.I., 1992, The biolory of Canadian weeds. 101. Helianthus tuberosus L., Canadian Journal Of Plant Science, 72: 1367-1382;
Tanaka Y., Sasaki N., Ohmiya A., 2008, Biosynthesis of plant pigments: anthocyanins, betalains and carotenoids, The Plant Journal, 54: 733–749;
Tarkka M.T., Sarniguet A., Frey-Klett P., 2009, Inter-kingdom encounters: recent advances in molecular bacterium–fungus interactions, Curr. Genet., 55: 233-243;
Temelie M., 2006, Enciclopedia plantelor medicinal spontane din Romania, Ed. Rovimed Publishers;
Tesoriere L., Allegra M., Butera D., Livrea M.A., 2004, Absorption, excretion, and distribution of dietary antioxidant betalains in LDLs: potential health effects of betalains in humans, Am J Clin Nutr. 80(4):941-945;
Tesoriere L., Butera D., Allegra M., Fazzari M., Livrea M.A., 2005, Distribution of betalain pigments in red blood cells after consumption of cactus pear fruits and increased resistance of the cells to ex vivo induced oxidative hemolysis in humans, J Agric Food Chem., 53(4):1266-1270;
Tesoriere L., Butera D., D'Arpa D., Di Gaudio F., Allegra M., Gentile C., Livrea M.A., 2003, Increased resistance to oxidation of betalain-enriched human low density lipoproteins, Free Radic Res., 37(6):689-696;
Tian F., Chang C.J., Grutzner J.B., Nicholsa D.E., McLaughlinc J.L., 2001, Robinlin: A Novel Bioactive Homo-monoterpene from Robinia pseudoacacia L. (Fabaceae), Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11:2603–2606;
Tiebre M.S., Vanderhoeven S., Saad L., Mahy G., 2007, Hybridization and sexual reproduction in the invasive alien Fallopia (Polygonaceae) complex in Belgium, Annals of Botany, 99: 193–203;
Toroglu S., 2011, In-vitro antimicrobial activity and synergistic/antagonistic effect of interactions between antibiotics and some spice essential oils, Journal of Environmental Biology, 32(1): 23-29;
Tripathy S. K., Bijayinee S., Samad I., Das R. K., 2013, Endosulfan: A potential genotoxicant on Allium cepa root tip cells, Journal of Agricultural Biotechnology and Sustainable Development, 5(2): 29 –35;
Trombetta D., Castelli F., Sarpietro M.G., Venuti V., Cristani M., Daniele C., Saija A., Mazzanti G., Bisignano G., 2005, Mechanisms of antibacterial action of three monoterpenes, Antimicrob. Agents Chemother., 49(6):2474-2478;
Tsao S., Rahkhoodaee F., Raymond M., 2009, Relative Contributions of the Candida albicans ABC Transporters Cdr1p and Cdr2p to Clinical Azole Resistance, Antimicrob. Agents Chemother., 53(4): 1344-1352;
Ultee A., Bennik M.H.J., Moezelaar R., 2002, The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food-borne pathogen Bacillus cereus, Appl. Environ. Microbiol., 68(4): 1561-1568;
Van Acker S.A.B.E., Van Den Berg D.J., Tromp M.N.J.L., Griffioen D.H., Van Bennekom W.P., Van Der Vijgh W.J.F., Bast A., 1996, Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids, Free Rad. Biol. Med., 20: 331-342;
Van den Dool H., Kratz P.D., 1963, A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas liquid partition chromatography, J. Chromatogr., 11: 463–471;
Vanden Berghe W., Ndlovu M.N., Hoya-Arias R., Dijsselbloem N., Gerlo S., Haegeman G., 2006, Keeping up NF-kappaB appearances: epigenetic control of immunity or inflammation-triggered epigenetics, Biochem Pharmacol, 72: 1114-1131;
Vastano B.C., Chen Y., Zhu N., Ho C.T., Zhou Z., Rosen R.T., 2000, Isolation and Identification of Stilbenes in Two Varieties of Polygonum cuspidatum, J. Agric. Food Chem., 48(2): 253–256;
Vaya J., Belinky P.A., Aviram M., 1997, Antioxidant constituents from licorice roots: isolation, structure elucidation and antioxidative capacity toward LDL oxidation, Free Radic Biol Med., 23(2): 302-313;
Vidal P.J., Lopez-Nicolas J.M., Gandia-Herrero F., Garcia-Carmona F., 2014, Inactivation of lipoxygenase and cyclooxygenase by natural betalains and semi-synthetic analogues, Food Chemistry, 154: 246–254;
Villano D., Fernandez- Pachon MS., Troncoso AM., Garcia-Parrilla MC., 2004, The antioxidant activity of wines determined by the ABTS(+) method: influence of sample dilution and time, Talanta, 64: 501–509;
Vlahopoulos S., Boldogh I., Casola A., Brasier A.R., 1999, Nuclear factor-kappaB-dependent induction of interleukin-8 gene expression by tumor necrosis factor alpha: evidence for an antioxidant sensitive activating pathway distinct from nuclear translocation, Blood, 94 (6): 1878–1889;
Wang Q., Ruan X., Li Z.H., Pan C.D., 2006, Autotoxicity of plants and research of coniferous forest autotoxicity, Sci. Sil. Sin., 43: 134-142;
Weston L.A., Barney J.N, DiTommaso A., 2005, A review of the biology and ecology of three invasive perennials in New York State: Japanese knotweed (Polygonum cuspidatum), Mugwort (Artemisia vulgaris) and Pale Swallow-wort (Vincetoxicum rossicum), Plant and Soil, 277(1-2):53-69;
Wickham H., 2009, ggplot2: elegant graphics for data analysis. Springer New York.
Willstätter R., Mieg W., 1906, Über eine Methode der Trennung und Bestimmung von Chlorophyllderivaten. Liebigs Ann. Chem., 350:1–47.
Woerdenbag H.J., Pras N., Chan N.G., Bang B.T., Bos R., van Uden W., Van Y. P., Boi N.V., Batterman S., Lugt C.B., 1994, Artemisinin, related sesquiterpenes, and essential oil in Artemisia annua during a vegetation period in Vietnam, Planta Med, 60: 272-275.
Wong B., Lumma W.C., Smith A.M., Sisko J.T., Wright S.D., Cai T.Q., 2001, Statins suppress THP-1 cell migration and secretion of matrix metalloproteinase 9 by inhibiting geranylgeranylation, J Leukoc Biol., 69: 959 –962.
Wuertz D., Chauss P., King R., Gu C., Gross J., Scott D., Lumley T., Zeileis A., Aas K., Gebhardt A., 2013, fBasics: Rmetrics – Markets and Basic Statistics. R package version 3010.86. http://CRAN.R-project.org/package=fBasic. Accesat la data 30 mai 2014;
Xie J. Sun B., Yu M., 2006, Constituents of top fragrance from fresh flowers of Robinia pseudoacacia L., occurring in China, Flavour and Fragrance Journal, 21(5):798-800;
Xu H., Ding H., Li M., Qiang S., Guo J., Han Z., Huang Z., Sun H., He S., Wu H., Wan F., 2006, The distribution and economic losses of alien species invasion to China, Biological Invasions, 8:1495–1500;
Yang R.Y., Lin S., Kuo G, 2008, Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species, Asia Pac J Clin Nutr.,17(S1): 275-279;
YeCheng D., RuiYu L., LinLin Y., Hui Z., QiuYan Z., Zhen Q., 2014, Insecticidal activities and chemical constituents of essential oils from alien invasive plants Solidago canadensis and Wedelia trilobata, Journal of Guangxi Normal University – Natural Science Edition, 32(2): 122-129;
Yoon J.H., Baek S.J., 2005, Molecular targets of dietary polyphenols with anti-inflammatory properties, Yonsei Med J, 46: 585-596;
Yuan X., Cheng M., Gao M., Zhuo R., Zhang L., Xiao H., 2013, Cytotoxic constituents from the leaves of Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) and their structure–activity relationships, Phytochemistry Letters, 6:21–25;
Yuan X., Gao M., Xiao H., Tan C., Dua Y., 2012, Free radical scavenging activities and bioactive substances of Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) leaves, Food Chemistry, 133:10–14;
Zaas D.W., Duncan M.J., Li G., Wright J.R, Abraham S.N., 2005, Pseudomonas invasion of type i pneumocytes is dependent on the expression and phosphorylation of caveolin-2., J. Biol. Chem., 280: 4864-4872;
Zahin M., Ahmad I., Gupta R.C., Aqil F., 2014, Punicalagin and ellagic acid demonstrate antimutagenic activity and inhibition of benzo[a]pyrene induced dna adducts, Hindawi Publishing Corporation, BioMed Research International, Article ID 467465, 10 pages, http://dx.doi.org/10.1155/2014/467465;
Zedler J.B., Kercher S., 2004, Causes and consequences of invasive plants in Vetlands: opportunities, opportunists and outcomes. Critical Reviews in Plant Sciences, 23(5): 431-452;
Zeng R.S., Luo S.M., Shi Y.H., 2001, Physiological and biochemical mechanism of allelopathy of secalonic acid on higher plants, Agron. J., 93: 72-79;
Zhang C.B., Wang J., Qian B.Y., Li W.H., 2009, Effects of the invader Solidago canadensis on soil properties, Applied Soil Ecology, 43(2-3): 163-169;
Zhang G.J., Li Y., Sun Y.H., Yuan C.Q., Xu Z.H., 2013, The effect of tetraploid Robinia pseudoacacia leaf meal on performance, egg quality, and nutrient digestibility in laying hens, Journal of Animal and Feed Sciences, 22: 354–359;
Zhang J., Li B., Chen J.,Zhout T., 2006, Chemical constituents and antimicrobial activity of volatile oil from Solidago canadensis L., Journal of Fudan University (Natural Science), Research Center of Natural Products, College of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China, http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTAL-FDXB200603024.htm, Accesat la data de 15 martie 2013;
Zheleva-Dimitrova D.Zh., 2013, Antioxidant and acetylcholinesterase inhibition properties of Amorpha fruticosa L. and Phytolacca americana L., Pharmacogn Mag., 9(34): 109–113;
Zhou H., Deng Y., Xie Q., 2006, The modulatory effects of the volatile oil of ginger on the cellular immune response in vitro and in vivo in mice, Journal of Ethnopharmacology, 105: 301–305;
Zhu C., Hu W., Wu H., HuX., 2013, No evident dose-response relationship between cellular ROS level and its cytotoxicity – a paradoxical issue in ROS-based cancer therapy, Scientific Reports, 4:5029, DOI: 10.1038/srep05029.
De Feo V., De Martino L, Quaranta E, Pizza C., 2003, Isolation of phytotoxic compounds from tree-of-heaven (Ailanthus altissima swingle), J Agric Food Chem.,51(5):1177-1180;
Bibliografie online
http://www.europe-aliens.org/aboutDAISIE.do, accesat la data de 12 dec. 2012;
http://www.nobanis.org, accesat la data de 4 ian 2013;
http://www.eppo.org/, accesat la data de 6 ian 2013;
http://www.zin.ru/projects/invasions/gaas/ernaisdb.asp, accesat la data de 10 dec 2012;
http://www.europe-aliens.org/speciesSearch.do, accesat la data de 12 dec 2012;
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=504804, accesat la data de 10 nov 2012;
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=26714, accesat la data de 24 iun 2013;
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=28827, accesat la data de 20 iun 2013;
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=565897, accesat la data de 18 apr. 2013;
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=36691, accesat la data de 10 nov 2012;
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=20745, accesat la data de 10 nov 2012;
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=19523, accesat la data de 20 iun 2013;
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=35448, accesat la data de 24 iun 2013;
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=25368, accesat la data de 24 iun 2013;
*Legenda: 5 mm: -; 6-7 mm: +-; 8-10 mm: +; 11-19 mm: ++; 20-29 mm: +++; 30-39 mm: ++++; 40-49 mm: +++++
Anexa 3. Concentrațiile minime inhibitorii ale soluțiilor stoc de extracte vegetale (μL/mL) și compuși polifenolici (mg/mL), uleiuri volatile (mg/mL) și ale componentelor volatile (mg/mL) principale asupra aderenței microbiene la substrat inert a tulpinilor: Sa – S. aureus; Bs – B. subtilis; Fec – E. faecalis; Ps – P. aeruginosa; Ec – E. coli; KPN – K. pneumoniae; Abc – A. baumannii; Ca – C. albicans; Cu – C. utilis; Cf – C. famata
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: Caracterizarea fizico-chimică şi evaluarea potenţialului terapeutic al amestecurilor fitochimice şi al altor fracţii extrase din diferite plante… [307874] (ID: 307874)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.