Caracteristici Generale ale Drojdiilor

[NUME_REDACTAT] S., Microbiologia produselor alimentare, vol. I, Cluj-Napoca, [NUME_REDACTAT], 2006, ISBN 973-751-311-8

Anghel I. și colab., Biologia și tehnologia drojdiilor, vol. 3, Ed. [NUME_REDACTAT], 1993

Bara, C., Microbiologie alimentară., [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2005

Bara, C., Tehnici și examene de laborator în controlul alimentelor, [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2005

Bara, C. , Microbiologia generală a unităților agroalimentare, [NUME_REDACTAT] din Oradea,; 2010

Bara, C. , Lucrări practice de microbiologie, [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2009

Bara, C., Bara, V., Pop, C., Tehnici de microbiologie aplicată., [NUME_REDACTAT] din Oradea; 1998

Bara, C., Bara. V., Chipurici, M., Zabik, A., Metode generale de microbiologie aplicată., [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2000

Bara, C., Bara, V., Ionescu, G., Tehnologii de prelucrare și microbiologie a produselor agroalimentare., [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2001

[NUME_REDACTAT] , Selecția unor levuri din agroecosistemele vitivinicole, Raport de cercetare, 2004.

[NUME_REDACTAT]., Influența temperaturii la prelucrarea și fermentarea mustului asupra vinurilor demiseci și dulci naturale. Horticultura și viticultura, XVII, nr. 10, 1968

Cotea D.V., Cotrău A., [NUME_REDACTAT], Varna P., Cercetări privind influența tratamentului termic asupra unor componente la vinifîcația în roșu a strugurilor de [NUME_REDACTAT], Lucrări științifice, seria Horticultura, [NUME_REDACTAT] Iași, 1997.

Cotea D.V., Tratat de oenologie, Vol. I, Ed. Ceres, București, 1985.

Cotea D.V., și colab. , Podgoriile si vinurile României, Ed. [NUME_REDACTAT], 2000

Croitoru C., Tratat de știință și inginerie oenologică. Produse de elaborare și maturare a vinurilor, București, [NUME_REDACTAT], 2009, ISBN 978-973-720-233-8

Giosanu T. și colab., Procedee tehnologice care conduc la sporirea conținutului în extract al vinurilor albe seci, [NUME_REDACTAT] de Viticultură și Vinificație, vol. VI, 1975.

Moțoc D., Microbiologia produselor alimentare, București, 1964, [NUME_REDACTAT]

Oslobeanu M. și colab., Viticultura generală și specială, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1989

Sandu G., Popescu C, Reducerea biologică a activității musturilor prin folosirea drojdiilor din genul Schizosaccharomyces, [NUME_REDACTAT] în Moldova, vol. 3, 1982

Sandu G., Popescu C, Conducerea fermentației alcoolice a musturilor prin utilizarea de drojdii cu caracter nespumant. Cercetări agronomice – Moldova, vol. I, 1980.

[NUME_REDACTAT] și colab., Un nou studiu de livrare a culturilor de drojdii vinicole, ICHV, Lucrări științifice, vol. V, 1961-1962

[NUME_REDACTAT], Doholici V., Testarea tehnologică fizico-chimică și microbiologică a vinurilor, Ed. Ceres, București, 1981.

[NUME_REDACTAT] mod normal fermentația alcoolică a mustului este asigurată de microflora levuriană provenită de pe struguri, utilaje, mașini și vase vinicole, însă, o astfel de floră, care ajunge în must fără intervenția omului, nu asigură întotdeauna o desfășurare optimă a procesului fermentativ. Din acest motiv, cu timpul, a apărut necesitatea de a substitui flora naturală sau de a asocia la compoziția ei, drojdii care provin tot din microflora naturală, dar sunt înmulțite selectiv sau drojdii a căror caracteristici oenologice sunt cunoscute, verificate și garantate de laboratoare specializate, numite culturi starter selecționate.

Producerea de drojdii selecționate asigură posibilitatea îmbunătățirii calitative a caracterelor organoleptice a vinurilor, atât pe seama componentelor din compoziția chimică a vinurilor, pe care le descompun ,cât și pe seama produselor rezultate în urma fermentării alcoolice.

Este cunoscut faptul că, loturi din același must, fermentate în condiții similare, dar cu adaos de drojdii din genuri și specii diferite, conduc la obținerea unor sortimente foarte variate de vinuri.

Existența în cadrul unei specii a numeroase populații de drojdii, diferențiate între ele sub aspect fiziologic, a determinat alegerea, în cadrul procesului industrial de vinificație, a acelora care, prin principalele lor însușiri, corespund mai bine criteriilor de selecție. S-a ajuns astfel ca producția vinicolă să beneficieze de numeroase tulpini de drojdii selecționate.

Drojdiile selecționate sunt ,prin urmare, levurile la care se cunosc și au fost apreciate ca pozitive, principalele însușiri care concură la obținerea unui anumit tip de vin. Selecționarea levurilor este apreciată ca o lucrare deosebit de laborioasă, necesitând studiul detaliat a unui număr mare de microorganisme din genuri și specii diferite, pentru a vedea care din acestea concură cel mai bine la obținerea unui anumit tip de vin provenit de la o materie primă cunoscută.

Cap.I.Caracteristici generale ale drojdiilor

Numele de drojdii a fost dat masei enorme de celule depuse ca sediment și rezultate din multiplicarea organismelor fermentative pe seama substratului nutritiv. O altă denumire, adică de levuri, este de origine latină – franceză și vine de la “lever” = a ridica, adică semnifică eliminarea de bioxid de carbon în cursul fermentației, care ridică lichidul și provoacă o spumă la suprafața lui (Moțoc D., 1964).

Drojdiile se caracterizează prin:

rapiditatea activității metabolice, datorită în special raportului suprafață/volum;

viteză mare de creștere și reproducere;

răspândire ecologică comparabilă cu a bacteriilor.

În clasificarea drojdiilor, se folosesc în general, patru grupe de criterii principale:

caracterele morfologice;

caracteristicile culturale;

caracterele de reproducere sexuată;

caracterele fiziologice.

Pentru determinarea unei tulpini și apoi specie și gen se pleacă de la examinarea detaliată a modului de reproducere vegetativă, morfologia celulară, formarea pseudomiceliului și/sau a miceliului adevărat, caracterele de cultură pe medii lichide și solide, determinarea prezenței sau absenței capacității de a forma ascorpori sau bazidiospori și testarea fermentației compușilor cu carbon. De obicei, taxonomia se bazează pe fermentarea și asimilarea zaharurilor glucoză, galactoză, zaharoză, maltoză, lactoză, rafinoză și dezvoltarea pe medii lipsite de vitamine etc. (Apostu S., 2006).

I.1.Morfologia drojdiilor

Morfologia constituie pentru viețuitoare un criteriu principal de clasificare. Privitor la drojdii, ele iau diferite forme și trec prin diferite transformări, normale în timpul ciclurilor vitale și sub influența mediilor nutritive. Sunt organisme unicelulare și de obicei forma lor poate fi sferică, elipsoidală, alungită, oarecum cilindrică sau chiar în formă de hife. Multe denumiri de specii se referă la forma lor, de exemplu Saccharomyces elipsoideus, Torulopsis bacillaris, Kloeckerra apiculata etc.

Pe lângă formă, dimensiunile celulare au importanță în delimitarea diferitelor specii. Pentru aceasta, este obligatoriu a se respecta condițiile standard de cultură și examinarea lor în faza exponențială de creștere, într-un mediu chimic definit.

I.2. Structura drojdiilor

Membrana celulară

La exterior, celulele de drojdii au membrana celulară și peretele celular cu o structură fizico-chimică și o arhitectură unitară pentru acest grup (Bara C., 2010).

Membrana este însă variabilă, uneori în funcție de influența factorilor de mediu și de condițiile de cultură din laborator.

Peretele celular este o componentă esențială a celulei drojdiei cu valențe funcționale complexe. Pe lângă rolul primordial de protecție față de mediul ambiant, funcțiile sale interferează cu procese ca replicarea, sinteza și degradarea substanțelor plastice și energetice, creșterea și diviziunea celulară. El cooperează cu protoplasma (plasmalema) în reglarea schimbului dintre celulă și mediul extern, datorita proprietăților sale de permeabilitate.

[NUME_REDACTAT] interiorul celulei de drojdie după membrană se află conținutul celular sau protoplasma, care reprezintă porțiunea vitală a celulei, în timpul vieții drojdiilor. Protoplasma prezintă densități și structuri diferite pe care se bazează adesea determinarea vârstei celulelor de drojdii. Acest lucru este utilizat în analizele efectuate la microscop pe scară industrială pentru urmărirea procesului de fermentație. Celulele de drojdie tinere, conțin o protoplasmă de fermentație, transparentă cu nuanțe albăstrui, cu densitate mică, fără substanțe incluse vizibile, cum ar fi de exemplu, globulele de grăsimi.

La exteriorul ei se află plasmalema care reprezintă cel de al doilea înveliș al drojdiei ce aderă strâns pe toată suprafața sa cu peretele celular cu care cooperează funcțional.

Citoplasma sau hialoplasma, reprezintă substanța fundamentală a celulelor vii în care sunt înglobate toate organitele celulare cu care interacționează fizic, chimic și metabolic, formând împreună o unitate morfofuncțională.

Este componenta celulară cu cel mai înalt dinamism, datorită modificărilor sale rapide, corelându-se permanent cu condițiile mediului ambiant și cu necesitățile metabolice ale diferitelor etape de dezvoltare. Ea este un sistem biocoloidal complex, heterogen, labil și polifazic. Pe lângă starea de sol, caracteristică activității fiziologice normale, se poate prezenta și sub formă de gel în unele formațiuni celulare cu un indiciu al unor procese metabolice latente (de exemplu, în celulele ascosporilor).

La microscopul electronic, matricea structurală este reprezentată de o rețea tridimensională de filamente proteice denumită rețea microtrabeculară, care străbate întreaga citoplasmă și interacționează cu membranele organitelor și cu elementele citoscheletului. În ochiurile rețelei se găsește o fază solubilă – apa, diferiți ioni și substanțe organice dizolvate în ea.

Ribozomii sunt organite celulare, vizibile cu microscopul electronic. Sunt răspândite în toată masa citoplasmatică, căruia îi conferă un aspect fin granular. Sunt liberi sau atașați de diferite membrane. Funcția lor fiziologică constă în participarea la activitățile proteosintetice. Numărul lor poate fi corelat cu rata de creștere a celulelor. La celulele tinere cu creștere rapidă, mai mult de 90% din ribozomi sunt organizați în formațiuni poliribozomale.

Reticulul endoplasmatic de la drojdii prezintă însușirile generale morfofiziologice ale organismelor vegetale în general. El este reprezentat de membrane duble lipoproteice care delimitează, în citoplasmă, un sistem format din canalicule tubulare sau veziculare. El poate fi neted sau rugos, în cel de-al doilea caz, are atașați ribozomi. Aceste citomembrane joacă un rol important în metabolismul celular și în diferite sinteze (proteine etc.).

[NUME_REDACTAT] este o componentă a unor endomembrane, este omniprezent în celulele drojdiilor. Ca și la celulele vegetale funcțiile sale sunt de sinteză, acumulare, transport și secreție. Este alcătuit din 2-10 saculi cu cisterne unite la centru și umflate la periferie.

Lizozomii sunt organite cu o structură veziculară, înconjurate de o membrană simplă, în aceste vezicule se află enzime, în special hidrolaze (peste 40 de tipuri). Aceste enzime lizozomale pot degrada orice componentă chimică celulară. Acestea controlează procesele litice celulare. Aceste enzime sunt în mod normal inactive, lucru dependent de integritatea membranei lizozomale care acționează ca o barieră. Dacă integritatea ei este lezată de factorii fizici (îngheț, dezgheț, șocuri osmotice), chimici și biologici enzimele se activează instantaneu și catalizează hidroliza substanțelor corespunzătoare. Lizozomii îndeplinesc o singură funcție în viața celulei și anume, de liză (degradare) a materialelor energetice, în hrănirea heterotrofă, sau liza diferitelor componente celulare („autotrofie”). Aceste două aspecte variază în cicluri de dezvoltare a drojdiilor și anume: în condiții optime au rol în hrănire, faza următoare de „autotrofie” apare la celulele bătrâne și în condiții de inaniție prelungită. Consecințele ei sunt supraviețuirea pe o perioadă de timp a celulelor lipsite de nutrienții celulari.

Vacuomul sau vacuolele reprezintă niște „lacuri” împrejmuite de o membrană lipoproteică – tonoplastul – necesare pentru desfășurarea unor procese optime vitale. Celulele din culturile fazei exponențiale conțin numeroase vacuole mici (0,1 – 0,2 nm) sferice sau ovoidale. În evoluția culturii de drojdii în faza staționară se constată o reducere treptată a numărului de vacuole și creșterea volumului până la o vacuolă mare. La un nou ciclu celular această vacuolă centrală se fragmentează în numeroase microvacuole. În vacuolele drojdiilor, pe lângă o mare cantitate de apă, se află cantități considerabile de aminoacizi, proteine, lipide, glucide etc. ele au o funcție homeostatică prin acumularea sau prin eliminarea unei cantități mari de apă și a excesului de metaboliți cu implicații în desfășurarea la parametrii optimi ai diferitelor procese vitale (Apostu s., 2006).

Mitocondriile sau condriozomii sunt răspândiți în spațiul hialoplasmatic al drojdiilor. Sunt organite membranoase cu forme diferite delimitate de o membrană dublă, la exterior netedă și întinsă și una internă care formează pliuri (criste) mărindu-i astfel suprafața, contribuind la intensificarea proceselor biochimice. Sunt organite ale respirației, deoarece la nivelul lor, anumite substanțe sunt oxidate. La drojdii, mitocondriile suferă o metamorfozare continuă, având o formă sinuoasă și adesea ramificată. De regulă, există una sau două mitocondrii mai mari și cu o organizare mai complexă față de celelalte mitocondrii. Această mitocondrie gigantică reprezintă 10-30% din volumul condriomului, în celulele în faza de staționare și de 50% din volum la celulele în faza exponențială. Mitocondriile conțin enzime foarte variate și în special catabolice legate de respirația – ciclul lui Krebs, metaoxidarea acizilor grași etc.

[NUME_REDACTAT] normale de drojdii sunt uninucleate; unicul nucleu de formă sferică sau ovală, mai rar neregulată, are de regulă o poziție excentrică.

În nucleu are loc stocarea, replicarea și transcrierea celei mai mari părți din informația genetică celulară.

El are o membrană nucleară, nucleoplasma. În nucleu se găsesc nucleolii și cromatina. Rolul lui este în diviziunea celulară (normală și reducțională). După reproducerea sexuată, drojdiile pot fi împărțite în ascomicete, bazidiomicete sau deuteromicete sau fungi imperfecți.

I.3.Nutriția drojdiilor

Ca rezultat al suprafeței mari în raport cu masa celulară, absorbția de nutrienți de către drojdii se realizează rapid.

Carbohidrații, puțin solubili în grăsimi, pătrund în celulele de drojdie așa de repede, încât mecanismul de transport (de intrare) nu poate fi explicat doar prin fenomene de difuziune, pătrunderea datorându-se unei absorbții active.

Sunt microorganisme heterotrofe organice (cu carbon) și anorganice pe care le asimilează cu ajutorul energiei eliberate prin descompunerea metabolică a substanțelor organice absorbite. Aceste reacții catabolice sunt reacții exogene și reacții endogene, între aceste două categorii de reacții metabolice existând un echilibru dinamic. Principala sursă de energie și de carbon pentru drojdii este reprezentată de glucoză și alte zaharuri.

În celulele de drojdie, zahărul este metabolizat în bioxid de carbon și apă cu producere mare de energie (674 kcal), în condiții de aerobioză. În lipsa oxigenului, producția de energie/molecula de zahăr este mică, în condiții de anaerobioză fermentația zahărului ducând la formarea de etanol, deci schematic este:

C6H12O6 + O2 2 C2H5OH + 2CO2 + Energie

O caracteristică biochimică și biologică a drojdiilor, este activitatea fermentației. Ele au capacitatea de a se dezvolta parțial în anaerobioză. Există însă și drojdii strict aerobe, acestea nu produc fermentația alcoolică (Candida, Torulopis) dar se pot întâlni tipuri de drojdii intermediare cu un metabolism intens respirator și slab fermentativ (Pichia) sau invers cu activitate respiratorie relativ slabă dar intens fermentativă (Sachharomyces carlsbergensis).

Genul tipic fermentativ Sachharomyces posedă și un pronunțat metabolism respirator, deci în prezența oxigenului au capacitatea de a respira, deci de a oxida glucoza la bioxid de carbon și apă. În funcție de condițiile de dezvoltare, ele își pot schimba metabolismul de la o cale fermentativă la una oxidativă, ambele sisteme producând energia necesară celulei însă în cantități diferite.

Metabolizarea glucozei în condiții aerobe (CO2 și H2O) furnizează celulei de drojdie cantitatea maximă de energie, iar în lipsa oxigenului producerea de energie pe molecula de zahăr este mică, deoarece în condiții de anaerobioză se formează etanol. Absența oxigenului nu este singura condiție care duce la fermentația alcoolică. O concentrație mare de zahăr în prezența oxigenului, poate duce, de asemenea, la apariția fermentației, lucru datorat inhibării sintezei enzimelor respiratorii (Bara C., 2010).

Pasteur a demonstrat primul că o drojdie fermentativă când este ținută în condiții aerobe își micșorează activitatea fermentativă și o parte din glucoză este transformată prin respirație în CO2 și H2O.

La un conținut scăzut de zahăr, condițiile de aerobioză intensă determină ca tot zahărul să fie „respirat” în CO2 și H2O. Această comportare metabolică pregnant diferențiată în funcție de prezența oxigenului este folosită în industrie, unde se creează, după caz, condiții de anaerobioză atunci când produsul dorit este alcoolul, sau condiții de aerobioză puternică, atunci când se urmărește obținerea unei mase celulare abundente.

Proporția substratului asimilat este mult mai mare în aerobioză decât în anaerobioză, iar producția de celule crescute aerob poate fi de 10 ori mai mare pentru aceeași cantitate de glucoză utilizată.

Capacitatea oxigenului de a interfera cu procesele anaerobe, inhibând prin prezența sa procesul de fermentație și determinând o sporire simultană a respirației este cunoscută sub numele de „efectul Pasteur”.

În fermentația alcoolică și în glicoliză, în general, o parte din energia chimică a zahărului este cheltuită de celulă la eliberarea etanolului sau a altor produși secundari. Dar dacă o celulă poate oxida glucoza până la produși finali (CO2 și H2O), ea poate realiza un profit energetic mai mare pe unitatea de substanță consumată, deci celula utilizează glucoza în proporție mai mică decât în anaerobioză. Această descreștere a ratei de utilizare a glucozei (efectul Pasteur) este, probabil, problema cea mai importantă și mai complexă a reglării metabolismului energetic în celulele de drojdii.

Cercetările au evidențiat fenomenul de fermentație aerobă a glucozei (adică formarea alcoolului în prezența oxigenului), deci un efect al represiei respirației ca rezultat al prezenței glucozei în concentrații relativ mari. Glucoza în concentrație mare, în prezența oxigenului nu este complet oxidată, ci parțial fermentată, fiind un „efect Pasteur” invers. Acest mecanism de represie prin cataboliți „obosește” mecanismul respirator în condiții de aerobioză și duce la o situație mai mult sau mai puțin similară, cu aceea a drojdiilor crescute în anaerobioză. Acest lucru trebuie implicat practic în procesul de fermentații și de obținere de masă microbiană cu ajutorul drojdiilor.

Dintre oligozaharide, zaharoza , principalul component al melasei de la fabricarea zahărului este fermentată de majoritatea drojdiilor. Ea este prima dată hidrolizată la glucoză și fructoză de către invertază, o enzimă localizată la suprafața externă a celulei de drojdie. În procesul fermentației, activitatea invertazei crește, prin trecerea gradată de la condiții anaerobe la condiții aerobe. Maltoza, la fel ca și alte alfa-glicozide este fermentată repede în condiții normale de creștere, în cazul când ea este glucidul care se află în cantitatea cea mai mare. Dacă în timpul creșterii (multiplicării) drojdiilor de panificație, mediul conține pe lângă glucide și etanol în jur de 4%, creșterea drojdiilor este considerabilă. Drojdiile de panificație folosesc în respirație și acidul acetic, el fiind repede încorporat în sistemul celular de metabolism, al hidraților de carbon.

Ca sursă de azot, toate drojdiile sunt capabile să utilizeze sulfatul de amoniu. Surse la fel de bune de azot includ și fosfatul de amoniu mono- sau tribazic, bicarbonații, carbonații și alte săruri, dar drojdiile de panificație și de bere sunt incapabile de a asimila azotații. Drojdiile pot folosi ca sursă de azot și aminoacizii rezultați din hidroliza proteinelor în urma hidrolizei efectuate de către proteazele rezultate în procesul de multiplicare.

Fosforul este un element necesar pentru creșterea drojdiilor și pentru fermentații. La început drojdiile pot crește și fără acest element, luat din rezervele interne, dar care repede este epuizat. Celulele de drojdii asimilează din mediu fosfații, deci săruri anorganice.

În creșterea lor, drojdiile au nevoie de anumiți factori de creștere (vitamine), cum sunt: biotina, acidul pantotenic, inozitolul, tiamina, acidul nicotinic și piridoxina.

Ca surse industriale de nutriție sunt folosite următoarele produse în fermentația alcoolică, pentru produsul ca atare (alcoolul etilic) sau masa vegetativă de drojdii (drojdia presată), pentru panificație sau furaj. Aceste surse sunt:

Melasa din trestia de zahăr sau sfeclă este materia primă cea mai importantă în producerea industrială a drojdiei de panificație. Ea conține aproximativ 50% zahăr (zaharoza în proporția cea mai mare, 2% rafinoză și cantități mici de zahăr invertit), azotul este 1-2% reprezentat de aminoacizi, betaina nefiind folosită.

Făina de grâu conține amidon, cantități mici de zahăr și cantități mici de săruri și urme de vitamine. Acest zahăr este un amestec de maltoză, glucoză, fructoză și zaharoză, iar ca sursă de azot aminoacizii eliberați de enzimele proteolitice.

Mustul de malț de la fabricarea berii – conține glucoză, fructoză, zaharoză, maltoză și alte oligozaharide. Drojdiile în fermentația berii, utilizează și alte oligozaharide. Fermentația maltozei, care reprezintă cantitatea cea mai mare de zahăr nu începe decât atunci când întreaga cantitate de glucoză a fost consumată. Compușii cu azot ai mustului de malț variază după calitatea orzului și al tratamentului hidrolitic. În ceea ce privește factorii de creștere, mustul de malț îi conține în cantitate suficientă, ei putând fi găsiți și în produsul finit – berea.

Mustul de struguri sau fructe are o concentrație de zahăr variabilă de la 30-70%, în majoritate fiind constituit din glucoză și fructoză, iar din punct de vedere al azotului conține unele amine, aminoacizi, polipeptide, substanțe utilizate de drojdie în procesele vitale.

I.4.Răspândirea drojdiilor

Drojdiile sunt larg răspândite în natură, în toate habitatele, datorită capacității lor de adaptare la mediu (Bara C., 2010).

Drojdiile se întâlnesc până la adâncimi de 30 cm în straturile superficiale ale solului, de unde, prin acțiunea unor factori fizici, mecanici sau biologici ajung în aer, fiind răspândite la distanțe mari. De la nivelul solului sau prin intermediul aerului, drojdiile pot ajunge în ape.

Drojdiile fac parte, în mod constant, din microbiota epifită a plantelor, fiind prezente pe rădăcini, frunze, flori, fructe; de la nivelul florilor plantelor, drojdiile pot fi răspândite prin intermediul insectelor, care le preiau odată cu nectarul. Se consideră chiar că, unele drojdii pot „hiberna” în tractul digestiv al insectelor și că, primăvara, odată cu primul zbor, acestea le eliberează și le răspândesc în mediul înconjurător.

În organismul animal, drojdiile sunt prezente în microbiota intestinală și se elimină natural, prin produsele de dejecție.(Moțoc, D., 1964).

Un grup restrâns de drojdii sunt patogene și pot cauza îmbolnăviri la om și animale. Astfel de exemple sunt: Candida albicans (agentul etiologic al candidozelor cutaneo-mucoase și viscerale), Cryptococcus neoformans (agent al îmbolnăvirilor plămânului și sistemului nervos central), Malassezia furfur (agent etiologic al micozei pielii).

Cap.II.Caracteristici particulare ale drojdiilor selecționate utilizate la obținerea vinurilor

Drojdiile care produc fermentația alcoolică întrebuințată în vinificație, pătrund în must fie de pe suprafața strugurilor și a echipamentului utilizat, însă, în principiu, procesul avea loc prin introducerea directă în procesul tehnologic, a culturilor selecționate de drojdii. Acestea pot fi reprezentate de tulpini de drojdii locale evidențiate din mustul fermentat, care dețin anumite caracteristice metabolice specifice și pot influența pozitiv calitatea produsului finit sau de drojdii comerciale comerciale, cum sunt drojdiile active uscate de import. (Croitoru C., 2009)

Cu toate că multe levuri comerciale sunt utilizate pentru fermentarea mustului, se consideră că folosirea drojdiilor locale este mai eficientă, ele fiind mai competitive, datorită faptului că manifestă un potențial dominant în procesul de fermentare din cadrul obținerii vinurilor. Mai mult, utilizarea drojdiilor locale trebuie să asigure obținerea proprietăților senzoriale tipice și specifice pentru vinurile fabricate în anumite centre vitivinicole.

Culturile selecționate de drojdii sunte reprezentate de microorganisme provenite dintr-o celulă, alese special, printr-un process de selecție, în vederea obținerii țintite a unui anumit tip de vin(de masă, spumante, de desert, alcoolizate, etc.)

Vinificatorii din regiunile producătoare de vinuri fine apreciază că, excluzînd factorii tehnici, tipul de vin este un produs al locului de origine (climat, sol, expoziție), al solului sau sortimentului și al microflorei locale. Ei consideră că vinul este un produs al fermentației spontane a mustului și că microflora strugurilor manifestă capacități diferite de a produce alcool, glicerol, acizi volatili, esteri, etc.

Vinificatorii, mult timp, au apreciat intervenția microorganismelor în procesul de vinificație, ca un proces în mare măsură static, puțin modificabil și fără nici o influență asupra produsului finit. Însă, aprofundarea cunoștințelor, legate de fiziologia și mecanismele biochimice și microbiologice, ce determină activitatea microorganismelor oenologice, în condițiile ambientale, au demonstrat că, prin intermediul lor, poate fi dirijat procesul de vinificare în direcția necesară.( Cotea D.V., 1985).

După ce Pasteur a identificat pentru prima dată originea microorganismelor, ce servesc drept agenți ai fermentării și a descris specificitatea lor, savanții au început să studieze cele mai diverse produse alimentare fermentate, individualizând microorganismele responsabile de transformările ce au loc în acest caz. Produsul care atrage sub acest aspect cea mai mare atenție, este vinul. Reess și apoi Hansen, respectiv în 1872 și în 1880 au stabilit, că fermentarea mustului de struguri decurge în trepte, fiind întotdeauna inițiată de levurile de formă apiculată și completată de cele cu celule în formă de elipsă. Prin urmare, sunt preferabile levurile cu celule de formă elipsoidă și prototipurile lor fiziologice sau speciile mai apropiate, datorită proprietăților lor pozitive, printre care toleranța la alcool și sinteza joasă de acizi volatili. Acțiunea selectivă a anhidridei sulfuroase în favoarea levurilor elipsoide era cunoscută împreuna cu metoda de sporire a rezistenței pentru a mări sau a reduce rezistența la antiseptici .

Sușele de levuri Saccharomyces constituie obiectul de studiu al microbiologilor, care sunt în permanentă căutare a sușelor valoroase cu cele mai bune caracteristici oenologice cum sunt: vigoarea fermentativă, rezistența la SO2, toleranța la alcool, producere minimă de acid acetic.

Inițial, fermentațiile se produceau sub acțiunea micoflorei "spontane", sălbatice, care se găsește pe suprafața sau în interiorul produsului supus fermentației. Aceste microorganisme sunt slab active, sau sunt în amestec cu diferite specii dăunătoare, a căror activitate diminuează calitatea produsului final. În prezent pentru a preveni aceste inconveniente se recurge la utilizarea microorganismelor selecționate, cu ajutorul cărora se obțin produse de calitate superioară, se îmbunătățește randamentul și se reduce durata procesului tehnologic .

Savanții din domeniul oenologiei și mirobiologiei vinului au studiat și au elaborat un șir de tulpini de levuri selecționate, care au fost recomandate pentru producerea diferitor tipuri de vinuri. Putem vorbi astfel despre:

· drojii destinate obținerii vinurilor albe seci

Din acest grup fac parte toate sușele de drojdii selecționate care se dezvoltă în mustul de struguri, se înmulțesc rapid, inhibă dezvoltarea microorganismelor sălbatice, fermentează în întregime glucidele, sedimentează ușor și ameliorează calitatea vinului.

· drojii destinate obținerii vinurilor roșii seci

Drojdiile din aceată categorie au aceleași calități ca și cele pentru vinurile albe, dar sunt mai rezistente la cantități înalte de substanțe fenolice și colorante.

· drojdii alcool-rezistente

Sunt reprezentate de sușele speciei Saccharomyces oviformis, care se înmulțesc repede în prezența alcoolului, au vigoare fermentativă înaltă (sau putere alcooligenă). Vigoarea fermentativă este legată de toleranța la alcoolul etilic și exprimă cantitatea maximă de alcool pe care sușele o pot forma prin fermentarea unui exces de zaharuri.

· drojii destinate obținerii vinurilor spumante

Sunt drojdii tipice de refermentare, care pe lângă toleranță la concentrații relativ înalte de alcool, posedă și însușiria de a fermenta zaharuri ,la presiuni sporite de anhidridă carbonică, chiar la o temperatură joasă (10-12ºC) și de a flocula ușor formând un sediment nisipos și mobil, lipsit de tendința creării de “măști”. Sedimentul de drojdii depozitat trebuie să fie unul pulverulent. Caracterul pulverulent al comportamentului în mediu ale sușelor Saccharomyces cerevisiae este determinat de faptul că, la multiplicare, celulele-fiice se despart de celulele mamă, provocând o turbiditate uniformă. Celulele depozitate în partea de jos a vasului de fermentare, după agitare, dispersează în mediu, dând naștere, din nou, unei turbidități uniforme cu caracter pulverulent.

· drojdii spumogene

Sunt drojdii a căror acțiune este favorizată de prezența anhidridei sulfuroase. Această însușire este pozitivă în cazul fermentării secundare. Sușele care posedă această capacitate sunt deosebit de viguroase, iar spuma, desigur fără levuri, este o proprietate specifică pentru produsul finit. Capacitatea formării spumei înalte și stabile în timp, este caracteristică pentru mai multe sușe Saccharomyces cerevisiae (circa 20-30%).

· drojdii sulfitorezistente

Sunt reprezentate de microorganism acomodate la fermentare, în prezența cantităților mari de anhidridă sulfuroasă(150—200 mg/dm3). Rezistența la anhidrida sulfuroasă exprimă capacitatea de a menține vigoarea fermentativă chiar și în prezența andhidridei sulfuroase, administrată în cantități determinate. Din sușele de Saccharomyces cerevisiae circa 30 % sunt sușe sulfitorezistente.

· drojdii criofile

Sunt drojdii care realizează o fermentare (8-12% vol. alcool) la temperaturi joase de 4-10ºC, cu o prelungire, practic neglijabilă, a duratei de timp, iar la temperaturile de 20-25ºC își mențin activitatea. Ele sunt drojdii rezistente la frig și reprezintă un grup aparte, caracteristicile lor tehnologice, prezentând un interes practic deosebit, în special pentru vinurile spumante.

· drojdiile peliculare

Sunt drojdii care în condițiile de contact cu aerul atmosferic, formează repede la suprafața vinului o peliculă, formând aldehide, ce caracterizează aroma și gustul specific a vinurilor de tip ”Heres”.

Cap.III.Acțiunea drojdiilor asupra compușilor chimici ai vinurilor

Cei mai mulți consumatori consideră că aroma și gustul vinului sunt principalele caracteristici care determină calitatea și valoarea produsului. Aroma vinului este un amestec complex de compuși volatili proveniți din strugurii inițiali (arome varietale), produse secundare formate în timpul fermentației mustului (arome fermentative) și de maturare (arome postfermentative).([NUME_REDACTAT] , 2004).

Acțiunea asupra compușilor volatili

Drojdiile au un impact mare asupra complexului chimic a vinurilor, compoziția volatilă a vinurilor putând fi chiar un indice pentru caracterizarea drojdiilor utilizate la oținerea lor.

Vinul se obține în urma unei serii lungi de reacții biochimice și operații tehnologice, al căror caracter specific este determinat de un șir de sisteme fermentative, care imprimă în mod direct desfășurarea și direcția proceselor biochimice. Din acest punct de vedere sunt importanți atât alcoolul etilic care reprezintă principalul produs al fermentației, cât și produsele secundare care joacă un rol major în formarea aromei vinului.

Aroma este conferită de substanțe volatile direct perceptibile de mucoasa olfactivă și de precursorii aromei, din categoria cărora glucozidele constituie o clasă importantă. Glucozidele sunt molecule inodore, care în procesul de preparare al vinului eliberează compuși volatili și odoranți, ce participă la formarea aromei vinului.

Sub acțiunea drojdiilor, se formează alcoolii superiori și acizii volatili ai șirului alifatic, care în urma acțiunii esterazelor, formează eteri (compuși cu aromă proprie de fructe). Trecerea aminoacizilor în alcooli superiori decurge nu numai la dezaminarea oxidativă, dar și în urma supraaminării aminoacizilor cu cetoacizii. În urma asimilării aminoacizilor de către levuri se formează un șir întreg de compuși.

Formarea alcoolilor superiori sub acțiunea drojdiilor

Alcoolii superiori sunt alcooli monohidroxilici, care au în molecula lor mai mult de doi atomi de carbon. Dacă începînd cu trei atomi de carbon se poate vorbi de alcooli superiori în general, începînd de la 6 atomi de carbon alcoolii superiori se pot diviza în alifatici și aromatici. Toți acești alcooli sunt stabili din punct de vedere chimic și biologic. Concentrația totală de alcooli superiori în vinuri oscilează între 150-500 mg/dm3, reprezentînd 0,03 – 0,06 % vol., comparativ cu concentrația alcoolică a vinurilor.

Vinurile obținute prin fermentație spontană conțin alcooli superiori într-o cantitate de aproximativ trei ori mai mare decît vinurile care provin din musturi fermentate cu levuri selecționate. (Cotea D.V., și colab. , 2000).

Levurile formează peste 20 de alcooli superiori. Cantitatea de alcooli superiori este mai scăzută la vinurile albe și roze provenite din musturi bine deburbate și fermentate la temperatură moderată.

Cu toate că se găsesc în cantități neînsemnate, alcoolii superiori, ca și esterii lor, au o anumită influență asupra caracterelor organoleptice a vinului.

Principalii alcooli superiori formați pe parcursul fermentării sunt 2-metilpropanol-1 (izobutil), 2-metilbutanol-1 și 3-metilbutanol-1, care la concentrații mai mici de 300 mg/dm3 contribuie la formarea complexului aromatic al vinurilor. Esteri acetici a acestor alcooli, în special acetatul de izoamil, are un miros de banană și joacă un rol pozitiv la formarea aromei în vinurile roșii.

Alcoolii superiori din vin sunt formați de către levuri direct din glucide sau din aminoacizi conform mecanismului Ehrlich. Inițial, printr-o reacție de transaminare are loc formarea unui α- cetoacid. Acesta, printr-o reacție de carboxilare, trece într-o aldehidă cu un atom de carbon mai puțin. În final, aldehida este redusă de către complexul NADH-H+, la alcoolul corespunzător. Formarea alcoolilor superiori pe această cale este confirmată de faptul că adaosul de anumiți aminoacizi la un mediu de cultură care conține glucoză conduce, după fermentare, la creșterea conținutului de alcooli superiori.

O altă modalitate de formare a alcoolilor superiori din vin este pusă pe seama unor produși intermediari rezultați din degradarea glucidelor în timpul fermentației acestora. (Oslobeanu M. și colab., 1989).

Formarea acizilor grași sub acțiunea drojdiilor

Acizii grași sunt acizi monocarboxilici alifatici, cu catena normală sau ramificată, număr par sau impar de atomi de carbon în moleculă. Se împart în două mari categorii: acizii grași saturați volatili și acizi grași nesaturați cu legături duble între atomii de carbon, care sunt nevolatili.

Acizii grași influențează calitatea vinurilor, prin participarea la formarea aromelor secundare de fermentație, reacțiile de esterificare din perioada de învechire a vinului și la formarea acidității volatile a vinului.

Acizii grași cu catenă de 6-12 atomi de carbon formează esteri cu miros foarte plăcut, în vinurile albe de calitate. În special acidul valerianic, a cărui prag de percepție în vinurile albe este de 2 mg/dm3.

Acizii grași superiori cu moleculă mai mare sunt prezenți în vin în cantități foarte mici și nu influențează asupra însușirilor organoleptice ale vinurilor.

Vinul este bogat în acizi grași alifatici cu catenă scurtă și mijlocie, care se formează în timpul fermentației alcoolice prin metabolizarea zaharurilor de levuri: Acidul acetic (etanoic); Acidul propionic (propanoic); Acidul butiric (butanoic); Acidul valerianic (pentanoic); Acidul caproic (hexanoic); Acidul caprilic (octanoic); Acidul capric (decanoic); Acidul lauric (dodecanoic).

Conform opiniilor expuse de diferiți autori, sușele de levuri pot produce o cantitate relative diferită de acid butiric, caproic, caprilic, capric și isovalerianic.

Formarea esterilor sub acțiunea drojdiilor

Din punct de vedere chimic, esterii sunt derivați funcționali ai acizilor carboxilici, în care, gruparea OH din carboxil, este înlocuită prin gruparea O-R și se obțin dintr-o moleculă de acid și una de alcool, cu eliminarea unei molecule de apă, reacția fiind reversibilă.

Esterii se formează în timpul fermentației alcoolice și în perioada îndelungată de păstrare a vinurilor, contribuind la formarea aromelor de fermentație și a buchetului vinului. Astfel, esterii participă la formarea acidității volatile a vinului.

La esterificarea biologică a vinurilor se formează esterii neutri volatili:

– Esterii acidului acetic (acetații) și omologii lui (propionat, butirat, izovaleriat) cu arome plăcute de fructe;

– Esterii acizilor grași (C6-C12), cu arome florale.

Formarea aldehidelor sub acțiunea drojdiilor

Aldehidele sunt compuși volatili, care participă la formarea aromei și buchetului de maturare a vinurilor. Însă, pe de altă parte, prezența unor aldehide în concentrații mai mari, influențează negativ calitatea vinului (acetalaldehida și butiraldehida).

Căile de formare a aldehidelor în vin sunt multiple: fermentațiile alcoolică și malolactică, activitatea enzimelor, oxidarea alcoolilor etc. Cele mai multe tipuri și cele mai mari cantități de aldehide, se formează în timpul fermentației alcoolice: etanal, propanal, 2-metilpropanal, butanal, 2- metilbutanal, glioxal, aldehida piruvică și altele.

Acetaldehida sau etanalul reprezintă 90% din totalul aldehidelor din vin și se formează în timpul fermentației alcoolice, prin decarboxilarea acidului piruvic, ca produs intermediar la formarea alcoolului etilic. Prezența acetaldehidei în vinurile albe nu este dorită, datorită însușirilor organoleptice neplăcute ale compușilor pe care îi formează cu SO2 și alte substanțe din vin.

Formarea acizilor organici sub acțiunea drojdiilor

Acizi organici contribuie în mare masură asupra formării compoziției, stabilității și calității organoleptice a vinurilor, în special a vinurilor albe. Proprietățile sporite de conservare a acizilor organici, de asemenea, contribuie la stabilitatea microbiologică și fizico-chimică a vinului. Acidul tartric, citric, malic, succinic și lactic formeaza aciditatea fixă.

Vinurile albe tinere, cu aciditate sporită, au un potențial mai mare de maturare. Vinurile roșii sunt stabile la aciditate mai mică, ca urmare a prezenței substanțelor fenolice, care sporesc aciditatea și ajuta la menținerea stabilității pe întreagă perioadă de învechire.

Principalii acizi organici prezenți in vin sunt tartric, malic, citric (acești 3 acizi dețin o pondere de cca 90% din totalul acizilor prezenți în vin), succinic, oxalic, glicolic și fumaric. (Apostu S., 2006).

Acidul tartric este acidul care caracterizează atât strugurii cât și vinurile găsindu-se în proporții de 1/4, 1/3 din totalul acizilor din vin. Este un acid tare, care influențează mult pH-ul vinului fiind în același timp cel mai rezistent la acțiunile bacteriilor lactice. Organoleptic, acidul tartric imprimă vinului o aciditate aspră, dură, la etapa de formare acestuia. Pe măsură ce evoluează vinul, acidul tartric se precipită sub formă de cristale de tartrat de potasiu și tartrat de calciu, datorită apariției alcoolului în mediu și a scăderii temperaturii. În final, vinul conține între 2 și 5 g/dm3 de acid tartric. Precipitarea cristalelor de tartrați este lentă. Cel mai greu se depun tartrații de calciu din cauza substanțelor coloidale și a particulelor din suspensie, care împiedică cristalizarea și depunerea lor. Dacă mustul sau vinul nu este protejat suficient față de dioxid de sulf, acidul tartric este atacat de bacteriile lactice și are loc fermentația propionică în timpul maturării vinului,în cadrul căreia, acidul tartric participă la o serie de reacții, jucînd un rol important în procesele de oxido-reducere, când acesta este transformat în acid dihidroximalic și acid dioxitartric și o sare complexă pe care o formează cu fierul.

Acidul malic este un acid care se găsește în struguri și trece mai mult în must datorită faptului că sărurile lui sunt insolubile. Se cunoaște faptul că acidul malic este acidul cel mai răspîndit în regnul vegetal, fiind un acid ușor metabolizat de celulele vegetale. Din punct de vedere oenologic, acidul malic este un acid important datorită faptului că reflectă maturitatea strugurilor și finisarea procesului de formare a vinului. Strugurii verzi conțin concentrații mai înalte de acid malic, care le imprimă un gust acru crud, de aguridă care dispare la maturizare. Din această cauză conținutul lui în vin depinde de cantitatea acestuia în struguri (compoziția chimică fiind determinată de condițiile climaterice, caracteristicile soiului și condițiile anului). Acidul malic este ușor metabolizat de către levuri, care îl pot transforma în alcool etilic și dioxid de carbon. De asemenea, poate fi metabolizat de bacteriile lactice care-l descompun în acid lactic și dioxid de carbon, procedeu cunoscut sub denumirea de fermentație malolactică. Fermentația malolactică reduce cantitatea de acid malic, în proporții semnificative. Concentrația acidului malic se poate stabiliza prin sulfitare cu doze stabilite de dioxid de sulf. În cantități mai mici, acidul malic îi conferă vinului fructuozitate. La majoritatea vinurilor albe, dar și la unele vinuri roze, conținutul de acid malic este cuprins între 1 și 6 g/dm3, iar la vinurile roșii proporția ajunge la maxim 5 g/dm3.

Acidul lactic nu se găsește în struguri și provine în urma reacțiilor de fermentare, fiind un component natural al vinului, căruia îi imprimă o aciditate moale, agreabilă. Poate proveni în vinuri în urma fermentației alcoolice a glucidelor, atingînd valorile cuprinse între 0,2 și 0,4 g/dm3, în urma fermentației malolactice cauzate de bacteriile lactice, atingînd valorile cuprinse între 1 și 2,5 g/dm3 sau în urma proceselor de fermentație inițiate de bacterii prin fermentarea glucidelor, glicerinei, acidului tartric și a altor compuși ai vinului. În vin se întîlnesc amestecuri de acid lactic D(-) și L(+), deoarece levurile formează izomerul D(-), iar bacteriile malolactice, izomerul L(+), plecând de la acidul malic.

Acidul acetic rezultă în urma fermentației alcoolice, fiind unul dintre acizii stabili față de bacterii. Cantitățile în care se acumulează depind mult de specia de drojdii, conținutul în glucide al mustului, temperatură, aerare etc. De asemenea, acest acid rezultă și din alte fermentații, în special a celor datorate bacteriilor acetice și lactice. În rezultatul acumulărilor mari de acid acetic, vinul se depreciază. Alterarea gustativă provocată de acidul acetic este percepută printr-o senzație postgustativă aspră și acră.

Acidul citric se găsește în vinuri în concentrații mici de 0,1-0,5 g/dm3, iar în vinurile provenite din strugurii botritizați, ajunge pînă la 1 g/dm3. Poate proveni fie din struguri, fie în urma fermentației alcoolice din glucide (în concentrații mai mici), fie în urma corecției de compoziție a acidității, fie în urma complexării ionilor ferici proveniți din casările ferice. Acidul citric este degradat de bacteriile malolactice formînd produși ce măresc aciditatea volatilă.

Acidul succinic fiind un acid stabil față de bacterii, de regulă, provine din fermentația alcoolică și influențează gustul vinului prin imprimarea acestuia nuanțe acide, sărate și amare, specifice băuturilor fermentate. Ca rezultat al fermentației alcoolice, el provine din metabolizarea glucidelor și aminoacizilor de către drojdii. Limitele între care acidul succinic oscilează sunt 0,2- 1,5 g/dm3. El se găsește și sub formă liberă.

Acidul carbonic este caracteristic vinurilor de masă și spumante, cărora le imprimă proprietăți de perlare și spumare. Dozele de dioxid de carbon în vin variază în limite largi, în funcție de: maturarea vinului, concentrația în alcool, extract, temperatură și presiunea osmotică a vinului. Vinurile de masă tinere conțin 1,5 g/dm3 dioxid de carbon, iar după un an, conținutul poate depăși 2,0 g/dm3 dioxid de carbon, iar vinurile spumante conțin între 4 și 8 g/dm3 dioxid de carbon. De regulă, prezența dioxidului de carbon în vin, îi conferă o senzație picantă, plăcută, răcoritoare, proaspătă, iar în vinurile roșii acest acid le accentuează asprimea și duritatea.

În cantități foarte mici, sub formă de urme, se mai găsesc în vinuri și alți acizi cum sunt: acidul citromalic, acidul gliceric, acidul dioxilic, acidul piruvic, acidul oxilacetic, acidul α-cetoglutamic, acidul gluconic, acidul glucuronic.

Formarea compușilor cu sulf sub acțiunea drojdiilor

Multiplicarea drojdiilor este condiționată de prezența în must a unor surse asimilabile de sulf, cum ar fi sulfații și a unor cantități mici de biotină și tiamină. O parte dintre drojdii consumă sulf din metionină, deoarece cistina și cisteina sunt penetrate greu și deci sunt greu asimilabile. Din compoziția chimică a drojdiilor, un procent de 0,2-0,8% din substanța uscată, îl reprezintă sulful, deoarece acesta intră în structura proteinelor și a unor cofactori enzimatici (biotină, tiamină, acid lipoic etc.). Celulele de drojdii reduc sulfații la sulfiți și hidrogen sulfurat, care sunt folosiți pentru biosinteza aminoacizilor cu sulf. În funcție de tulpina de drojdie și compoziția mediului (concentrația în sulfați și compuși organici cu sulf), se poate elimina hidrogenul sulfurat în mediu. (Bara C., 2005).

În perioda păstrării vinurilor, sub acțiunea drojdiilor care cauzează procese de autoliză, sub acțiunea cisteindesulfhidratazei, care acționează asupra compușilor nevolatili cu grupe -SH, se poate forma hidrogenul sulfurat. Acesta influențează negativ calitatea vinurilor, formând etil mercaptani, care imprimă un gust și miros nedorit. Prin metabolizarea compușilor cu sulf, levurile pot produce 10-80 mg/dm3 dioxid de sulf, la sfârșitul perioadei de fermentație.

Compușii volatili au mai multe surse de pătrundere în vin. Ei pot proveni din struguri, ca rezultat al fermentării, pe durata pastrării sau din mediul extern (lemn).

În general, compușii sulfului au un efect negativ asupra calitatății vinului. De exemplu, H2S, etilmercaptanul și metantiolul au un impact negativ semnificativ asupra aromei vinului, atunci când sunt prezenți în concentrații mai mari decât pragurile de percepție a acestora. Cu toate acestea, unii compuși contribuie în mod pozitiv la formarea buchetului de vin prin asigurarea aromei specifice de soi.

H2S are un impact negativ asupra calitățiilor senzoriale a vinului pentru că imprimă vinului o aromă de "ou stricat" și de aceea devine o problemă în vinificație. H2S este un produs nedorit al fermentației alcoolice de către drojdia Saccharomyces cerevisiae și prin urmare, este extrem de important de utilizat în procesul de fabricație a vinurilor, a unor drojdii, care nu generează H2S.

Cap.IV. Fazele multiplicării microorganismelor în cultură

Izolarea și obținerea culturilor pure, cunoașterea cineticii de creștere prezintă o importanță practică deosebită în multe domenii de activitate. Culturile pure sunt folosite pentru studiul proprietăților morfologie și fiziologice, în scopul identificării, caracterizării și stabilirii domeniului de utilizare a culturii. Sub formă de culturi pure microorganismele pot fi supuse unor tratamente fizico-chimice prin care se pot induce modificări genetice la nivelul acizilor nucleici, cu obținerea de culturi mutante, din rândul cărora se face din nou selecția tulpinilor performante. (Bara C., 2009).

Cultura pură reprezintă o biomasă de celule rezultate prin reproducere dintr-o singură celulă aflată într-un mediu nutritiv steril, cu volum limitat. Cultura pură este considerată și colonia care se formează ca rezultat al izolării unei celule sau a unei unități formatoare de colonii, atunci când aceasta este localizată pe un mediu nutritiv solid. Puritatea unei culturi se poate obține și prin repicare, deci prin transfer de celule din recipientul ce conține cultura pură, în alt vas cu mediu de cultură steril.

Inoculul reprezintă un mediu nutritiv steril în care s-au înmulțit celule aparținând unei culturi pure, aflată în etapa finală a creșterii exponențiale. Cantitatea de inocul trebuie astfel calculată încât prin introducerea sa în mediul fermentativ steril, concentrația în celule să asigure declanșarea rapidă a procesului. În funcție de specificul biotehnologic este obligatorie asigurarea continuității în transfer pentru aprovizionarea cu inocul activ, la perioada solicitată de producție.

Utilizarea culturilor pure în biotehnologii alimentare (la fabricarea berii, alcoolului, vinului, produse lactate acide, panificație etc.) permite obținerea unor produse de calitate constant superioară.

În condiții favorabile de viață (substanțe nutritive, factori externi), microorganismele reacționează rapid și are loc creșterea lor, prin acumularea apei, a substanțelor nutritive și sinteza unor produși de metabolism (ex.proteine).

În procesul creșterii microbiene, are loc mărirea coordonată a tuturor componentelor celulei, rezultată prin adăugarea de substanță nou formată prin biosinteză.

Celula microbiană prezintă un raport foarte mare între suprafața prin care are loc pătrunderea nutrienților și volumul dat de componentele celulei în creștere. Prin creștere are loc o modificare a raportului între suprafață și volum (raport stabilit genetic). Din aceste considerente, la un moment dat, în cursul creșterii, se ajunge la o limită de creștere, impusă de modificarea raportului suprafață – volum, ca urmare a scăderii ratei de aport a nutrienților și eliminării cataboliților.

Multiplicarea (reproducerea) microorganismelor este o consecință a creșterii, în cursul ei, restabilindu-se raportul dintre suprafața celulei și volum, optim pentru schimburile celulare cu mediul.

Multiplicarea microbiană reprezintă creșterea numărului de celule, într-un mediu favorabil. Acest proces are loc cel mai frecvent prin diviziune, dar o altă modalitate, este prin înmugurire. În cursul diviziunii, celula se alungește, apare o invaginare în partea centrală a celulei, elementul nuclear (ADN) se scindează în două părți asemănătoare. Invaginația se accentuează și se formează două celule identice (care se separă sau nu). Invaginația este procesul prin care are loc pătrunderea unui segment al unei structuri (formațiune) în interiorul altui segment al aceleeași structuri.

În scopul creșterii și multiplicării microorganismelor în laborator, se recurge la utilizarea mediilor de cultură. Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, cu rol de aliment, care trebuie să asigure microorganismului ce urmează a fi cultivat, cantitatea necesară de apă, carbon, azot, substanțe minerale, factori de creștere, substanțe care să îi furnizeze cantitatea de energie, cât și toate elementele folosite de celulă pentru întreținerea funcțiilor vitale și inițierea și desfășurarea în condiții corespunzătoare a proceselor de creștere și reproducere. În practica de laborator, mediile de cultură se folosesc pentru izolarea din medii naturale a diferitelor microorganisme, în scopul obținerii unor culturi pure.

Prin introducerea într-un mediu de cultură steril, a unor celule microbiene aparținând unor culturi pure (inoculare), se poate stabili dinamica unei populații, privind creșterea și multiplicarea.

În condiții experimentale, dinamica multiplicării microorganismelor este bine cunoscută și are o evoluție, caracterizată grafic printr-o curbă, procesul desfășurându-se în patru faze succesive.(Bara C., 2010).

Faza de latență (creștere zero; lag)

Reprezintă etapa de timp când, după introducerea celulelor provenind dintr-o cultură pură, în mediu steril, numărul celulelor rămâne neschimbat (sau chiar scade), deoarece noile condiții de mediu implică, într-o primă fază, latența inducției de către microorganisme, a acelor enzime de care au nevoie pentru adaptarea la mediul nutritiv. („latent” = prezent dar care nu se manifestă; „inducție” = proces de stimulare a sintezei unei enzime).

Această fază apare astfel, ca o perioadă de adaptare la condițiile noi de cultură, în care microorganismele își acumulează în celulă metaboliți și sisteme necesare creșterii, în cazul în care aceste componente biochimice le lipseau, datorită condițiilor de mediu anterioare inoculării.

Faza poate dura până la 2 ore. Ea poate fi scurtată sau chiar absentă, dacă pentru inoculare s-a folosit o cultură pură viguroasă, aflată în faza activă de creștere, care s-a reînsămânțat pe un mediu cu o compoziție similară. În schimb, faza se poate prelungi dacă inoculul este obținut din culturi vechi sau care s-au păstrat în condiții de refrigerare.

Faza de multiplicare exponențială (creștere logaritmică)

Reprezintă faza în care are loc o accelerare a ritmului de creștere a microorganismelor și o multiplicare a lor, cu o viteză progresivă mărită.

Curba evoluează exponențial până în momentul în care, una din substanțele nutritive din mediul de cultură (folosit pentru inoculare) este consumată sau în mediu, se acumulează metaboliți toxici.

Substanța nutritivă, a cărei lipsă din mediu oprește creșterea, se numește „factor limitat”.

Faza poate dura 2-3 ore.

Faza staționară (de maturare)

În această fază, numărul celulelor viabile este maxim și rămâne constant o perioada de timp. Pe parcursul acestei etape, celulele au caracteristicile morfologice cele mai tipice genului și speciei.

Faza de declin

Se caracterizează printr-o scădere, în progresie geometrică, în raport cu timpul, a numărului de celule vii.

Pe masură ce mediul devine mai puțin favorabil, celulele vii nu se mai multiplică, deși activitatea lor mai continuă un timp, după care mor (și intră în autoliză).

La sfârșitul acestei faze, se înregistrează maximul absolut al numărului total de celule, formate pe parcursul întregii evoluții a culturii.

Se poate concluziona, vis-a-vis de cele prezentate, că obținerea culturilor pure de microorganisme, precum și cunoașterea cineticii de creștere și multiplicare, prezintă o importanță practică deosebită pentru identificarea, selecționarea și îmbunătățirea proprietăților de biosinteză a microorganismelor și pentru obținerea unor “culturi starter” folosite în procesele fermentative industriale, din cadrul biotehnologiilor alimentare.

Cap.V.Influența factorilor de mediu asupra metabolismului drojdiilor în cadrul procesului de vinificație

V.1. Factori intrinseci

Concentrația de zahăr

În mustul de struguri cu concentrație în zahăr de 15-25%, cu o presiune osmotică de 0,5 MPa, fermentația alcoolică demarează ușor, drojdiile de vin produc fermentarea D-glucozei, D-fructozei, maltozei, zaharozei, galactozei și parțial a rafinozei. Viteza fermentației este dependentă de conținutul în zahăr al mustului și de microflora de drojdii. De exemplu, glucoza este fermentată mai rapid în musturi cu 17-20% zahăr reducător total, iar fructoza este fermentată mai rapid, în musturi cu peste 25% zahăr reducător. Majoritatea drojdiilor de vin sunt glucofile și foarte puține preferă fructoza. Printre acestea, se numără și specia Saccharomyces baillii, care fermentează fructoza, chiar și atunci când glucoza este prezentă în must, în concentrații mari.

La concentrații ridicate de zahăr în must (peste 40%) datorită creșterii presiunii osmotice, viteza de fermentare scade, se reduce concentrația în alcool și se formează acid acetic. Aceste concentrații se pot întâlni la fabricarea vinurilor dulci. În acest caz, fermentația poate fi produsă de drojdii osmofile sau osmotolerante, ca de exemplu: [NUME_REDACTAT] varietatea osmophillus, S. Rouxii, S. italicus, care pot să activeze la presiuni osmotice de 10-20 MPa fără a fi plasmolizate.

La fermentarea spontană a musturilor cu conținut mare de zahăr sau în musturile cărora li s-a adăugat zahăr în exces, se produce stagnarea fermentației, ca urmare a scăderii vitezei de creștere a drojdiilor și a capacității de fermentare, înainte ca tot zahărul să fie fermentat. La vinurile seci, acest zahăr rezidual (0,5-1%) poate favoriza dezvoltarea unor microorganisme care dau tulbureală și reduc stabilitatea vinurilor la păstrare.

În cazul fermentării mustului natural, în zahărul rezidual raportul fructoză/glucoză este supraunitar. Raportul este folosit ca test de verificare pentru punerea în evidență a adăugării de zahăr în vinurile seci după fermentare.

Concentrația în alcool etilic

După ce au ajuns în must, drojdiile se adaptează noilor condiții de viață. Celulele încep să crească, are loc completarea echipamentului lor enzimatic și evident este declanșat procesul de fermentare adică de transformare a zaharurilor fermentescibile în alcool etilic și CO2 (ca produși principali) și numeroase alte produse secundare de reacție. (Septilici G., Doholici V.,1981).

În vinificație, este important de stabilit cantitatea de alcool care se produce pe unitatea de zahăr fermentat. Prin fermentarea a 1,89 g zahăr rezultă 1 ml etanol, iar pentru creșterea în medie cu 1 grad alcoolic, în mediu (must) trebuie adăugate 17 grame zahăr /litru. Randamentul practic de conversie este de 90-95% din randamentul teoretic, deoarece o parte din zahăr este consumat pentru creșterea celulelor de drojdie sau pentru formarea unor produse secundare. Într-un litru de vin se află 70-140 g alcool etilic. Din amestecul alcoolului cu apă, rezultă un volum mai mic decât suma volumelor de apă și alcool. Maximul de contracție se produce la 48 volume apă și 52 volume alcool rezultând 96,3 volume amestec. Cauza contracției este formarea de legături de hidrogen între alcool și apă. Odată cu creșterea concentrației de alcool etilic, se produc importante modificări în componența microflorei naturale a mustului. Astfel, până la concentrații de 4% volume alcool, este inhibată creșterea drojdiei Hanseniaspora apiculata, la 4-5 % vol. alcool dispar drojdiile asporogene din genul Kloeckera, iar Saccharomyces oviformis produce fermentație până la 18% volume alcool etilic. Alcoolul etilic, în funcție de concentrația și de specia de drojdie, poate determina încetinirea procesului de creștere a drojdiilor și inhibarea procesului de fermentație. Astfel, dacă în mediu nutritiv fără alcool o celulă de drojdie poate produce prin mitoză 32 de celule, într-un mediu cu 14% alcool, produce numai 5 celule.

Conținutul în azot asimilabil

Pentru asigurarea biosintezei compușilor celulari, inclusiv a complexului enzimatic, în mediu trebuie să existe o concentrație corespunzătoare de azot (N) asimilabil pentru nutriția azotată a drojdiilor. Se consideră ca între 50 și 70% din azotul total al mustului, poate fi asimilat de către drojdii. În mustul cu cantități reduse de N asimilabil, se acceptă introducerea de 30g/hl a fosfatului de amoniu sau a sulfatului de amoniu. La un conținut scăzut de N asimilabil, viteza de fermentare se reduce. (Septilici G., Doholici V.,1981).

În condițiile menținerii îndelungate a vinurilor pe drojdie, ca urmare a autolizei celulelor, o parte din substanțele cu N ale drojdiei, trec în vin, favorizând astfel fermentația malolactică și alterarea microbiană a vinului.

Conținutul în săruri minerale

Odată cu fermentația alcoolică a mustului, are loc și reducerea conținutului în săruri minerale de la 3 g/l la 2g/l ca urmare a consumului acestora în nutriția drojdiilor, dar și a reținerii prin adsorbție pe pereții celulari și depunerea lor în sediment. Dintre elementele necesare, fosforul este foarte important, el participând la formarea esterilor fosforici, cu rol în transportul zaharurilor fermentescibile prin membrana celulei.

pH-ul

pH-ul mustului de struguri poate varia între 2,8-3,8. Deși intervalul optim al pH-ului pentru drojdii este de 4-6, ele se dezvoltă bine și la pH-ul mustului. Variația în aciditate a mustului, conduce la variații în formarea de produși secundari, în special de gliceroli.

Concentrația de CO2

Dioxidul de carbon inhibă dezvoltarea drojdiilor, începând cu o concentrație de 0,25g CO2/l. Efectul inhibitor al CO2 asupra drojdiilor, se intensifică la scăderea pH-ului sau la creșterea concentrației în alcool etilic. Bacteriile lactice sunt mai puțin sensibile, comparativ cu drojdiile, la concentrația de CO2, ele putând fi chiar stimulate de creșterea concentrației de CO2, ca de exemplu Leuconostoc oenos, agent al fermentației malolactice.

Substanțe cu efect inhibitor

O parte din pesticidele utilizate în cursul anului pentru tratamente la vița de vie, pot ajunge în must, unde pot avea o acțiune negativă asupra procesului fermentativ.

V.2. Factori extrinseci

[NUME_REDACTAT] activități ale drojdiilor, și anume: respirația, fermentația, creșterea celulei, alcoolotoleranța, etc, se desfășoară în domenii stabilite de temperatură, fiecare proces având o temperatură optimă de desfășurare, care diferă în funcție de specie și chiar de tulpinile aceleeași specii. ([NUME_REDACTAT]., 1968).

Formarea de produse secundare în fermentația alcoolică, este în funcție de temperatura mustului și de energia calorică dezvoltată în fermentarea exotermă (113 Kj/mol zahăr). Astfel, în domeniul de temeperatură 15-35°C, odată cu creșterea temperaturii, crește concentrația, în mustul fermentat, a : glicerolului, acetonei, aldehidei acetice, etc. Concentrația în acid piruvic la 35°C, este de 3 ori mai mare decât cea formată la 20°C. Acidul acetic și alți acizi volatili se formează în cantitatea cea mai mare la 25°C. Alcoolii superiori (alcoolul izoamilic, izobutanolul, etc) se formează în cantități maxime la 20-24 °C.

Durata de fermentație are valoarea minimă la temperatura 25-30°C. La peste 35°C, durata de fermentare crește și este însoțită de diminuarea calităților senzoriale ca urmare a formării aldehidei acetice. ([NUME_REDACTAT]., 1968)

Pentru fermentarea completă a mustului de struguri cu 200 gr. zahar/1 la 10 °C sunt necesare 60 de zile, la 20 °C 15 zile ,iar la 30 °C 3 zile.

Când fermentația se desfășoară la temperaturi scăzute ,vinul obținut conține mult alcool și este mai stabil la alterări microbiologice (I. Anghel 1993).

La obținerea vinurilor albe și a celor spumante, temperatura de fermentare nu trebuie să depășească 15 °C.

Fermentarea la temperaturi ridicate determină o slăbire a activității drojdiilor, acestea producând cantități mai mari de substanțe cu efect inhibitor și de asemenea, este favorizată dezvoltarea microorganismelor de infecție.

Concentrația în oxigen și potențialul de oxidoreducere

Imediat după obținere, mustul este saturat cu oxigen și poate conține cantități de 5-8 mg 02/1. Pe măsură ce oxigenul solubil este utilizat de drojdii, care necesită oxigen în stadiul de reproducere, potențialul de oxidoreducere scade rapid, creându-se condiții de anaerobioză, favorabile fermentației alcoolice. În cazul în care se produce stagnarea fermentației, o aerare a mustului în timpul fazei de multiplicare a drojdiei, stimulează creșterea și reproducerea acestora, fermentația fiind astfel reinițiată.

Concentrația în SO2

Dioxidul de sulf poate fi considerat un produs natural în vin, deoarece unele tulpini de drojdii pot produce, în urma metabolizării substanțelor cu sulf, cantități de 10-40 mg SO2/l. Introducerea în must sau în vin a unor doze de SO2, are efecte favorabile, ce constau în acțiunea antimicrobiană, acțiune antioxidantă, acțiune de solubilizare a antocianilor și de protecție față de unele componente ale vinului cu rol în formarea aromei. Cantitățile de SO2 ce se adaugă sunt reglementate de normele în vigoare fiind de: maxim 250 mg/l pentru vinuri albe seci și maxim 200 mg/l pentru vinurile roze și roșii.

Adăugarea de SO2 conduce la creșterea timpului de generație și produce o întârziere a demarării fermentației alcoolice, până când concentrația de SO2 liber se reduce și începe faza activă a fermentației. Din grupul drojdiilor, speciile Saccharomyces baillii și Saccharomyces ludwigii tolerează doze mai mari de 500 mg SO2/l, această sulfo-rezistență având un determinism genetic.

Ca urmare a acțiunii antioxidante, SO2 se recomandă a fi adăugat la prelucrarea strugurilor mucegăiți, pentru prevenirea unor procese oxidative nedorite catalizate de enzime fungice eliberate în must la zdrobirea strugurilor mucegăiți. (I. Anghel 1993).

V.3. Factori biologici

Echipamentul enzimatic al drojdiilor

În must, sunt active numeroase enzime produse de drojdii de vin sau eliberate după autoliză, care împreună cu enzimele din struguri, catalizează diverse reacții de oxidoreducere ce condiționează transformarea mustului în vin.

O parte din enzime, ca de exemplu hidrolazele, sunt localizate la nivelul peretelui celular sau în exteriorul suprafeței membranei citoplasmatice, fiind active la exteriorul acestei membrane. Alte enzime sunt intracelulare și sunt eliberate după moartea celulei, în urma procesului de autoliză. Se admite că celula de drojdie poate să "exporte" macromolecule endogene și să absoarbă macromolecule exogene, ca urmare a neuniformității peretelui celular, acesta prezentând zone cu permeabilitate mai ridicată, care funcționează ca adevărate „canale de comunicație”. Dintre oxidazele proprii drojdiilor fermentative, mai importante sunt: triozofosfat dehidrogenaza și alcool dehidrogenaza.

Triozofosfat dehidrogenaza catalizează oxidarea aldehidei fosfoglicerice în prezența fosfatului și formarea acidului 1,3 fosfogliceric.

Alcool dehidrogenaza, în condiții de anaerobioză, catalizează reducerea aldehidei acetice cu formarea alcoolului etilic.

Ambele enzime au drept coenzimă NAD, care servește drept transportor de H2 și electroni.

Din clasa transferazelor, celula de drojdie conține kinaze și fosfomutaze.

Kinazele (glucokinaza, fructokinaza) în prezența ionilor magneziului și manganului catalizează fosforilarea prin intermediul ATP-ului.

Enzimele pectolitice identificate în drojdiile de fermentație (poligalacturonaze și pectin-metil-esteraze) degradează pectina după mai multe mecanisme ce acționează succesiv.

Invertaza din drojdia de vin, este o enzimă fixată de peretele celular și se eliberează puțin în must, în cursul multiplicării celulare; cea mai mare cantitate se găsește în depozitul de drojdie rămas după fermentare. Invertaza drojdiei este rezistentă la SO2, sensibilă la alcool și căldură.

În timpul fermentației alcoolice, în condițiile epuizării substratului nutritiv, drojdiile pot elibera enzime proteolitice, cu activitate maximă la 35-45°C și pH 2,8-3,8. Ele sunt importante la obținerea vinurilor roșii prin procedeul vinificării la cald. Activitatea proteolitică a drojdiilor de vin poate avea un efect favorabil asupra demarării fermentației malolactice, ca urmare a formării surselor de azot asimilabil pentru bacterii.

În echipamentul enzimatic al drojdiei, mai sunt prezente și alte enzime: aldolaza, fosfoglucoz-izomeraza, piruvat-decarboxilaza, enzime ce catalizează transformarea zaharurilor reducătoare în acid piruvic.

Absorbția și fermentarea zaharurilor

Toate drojdiile de vin fermentează D-glucoza, D-fructoza, maltoza, zaharoza, galactoza și o treime din rafinoză, în timp ce lactoza, melibioza și dextrinele nu sunt fermentate. Procesul de absorbție al zaharurilor se realizează la nivelul membranei citoplasmatice, fie prin difuziune facilitată de un sistem de transport nespecific, fie prin transport activ sub formă esterilor fosforici, cu consum energetic din partea celulei, necesar pentru activarea transportorului.

Substanțe de metabolism ale drojdiilor cu efect inhibitor asupra fermentației zaharurilor reziduale

Stagnarea porcesului de fermentație poate fi cauzată de mai mulți factori și anume:

– condițiile de desfășurare a fermentației, de exemplu anaerobioza și temperaturi ridicate de fermentație pot inhiba biosinteza sterolilor care participă la reglarea stării fiziologice a membranei celulare;

– concentrația excesivă de zahăr;

– carența mediului în vitamine și prezența surselor de azot;

– prezența de substanțe cu efect antilevuric (urme de pesticide, substanțe porduse de Botriotinia, Aspergillus, Penicillium, Mucor);

– concentrația în alcool etilic;

– acumularea în mediul de fermentație a unor acizi grași cu 8 și 10 atomi de C în molecule.

Concentrația în celule și starea fiziologică a drojdiilor

Viteza de fermentare crește proporțional cu numărul de celule. Pentru fermentarea completă a zaharurilor din must este necesar ca numărul de celule să fie de circa 107 celule/cm3 de must și bineînțeles acestea să fie viabile. (Cotea D.V., 1985).

Sub aspect microbiologic, fermentarea nedirijată a mustului de struguri este produsă ca o rezultantă a 3 factori principali: creșterea numărului de celule, capacitatea de supraviețuire a populației de drojdii și activitatea metabolică a biomasei de celule.

Experimentările au arătat că suplimentarea mustului de struguri cu zahăr, astfel încât concentrația totală de zahăr să depășească 300 g/l, poate avea un efect inhibitor asupra creșterii drojdiilor, de aceea se recomandă ca suplimentarea cu zahăr a mustului să se facă după faza inițială de creștere a drojdiei, respectiv între ziua 2 și 4 asociată cu o scurtă perioadă de aerare care stimulează creșterea drojdiilor și rata de utilizare a zaharurilor ca urmare a creșterii activității metabolice a drojdiilor. În dinamica multiplicării drojdiilor, după faza exponențială și staționară urmează o fază de declin, cu scăderea numărului de celule vii. Moartea celulelor de drojdie și starea de autoliză sunt datorate reducerii conținutului de substanțe nutritive din mediu și a surselor hidrocarbonate intracelulare. Intracelular, ca urmare a scăderii pH-ului și a potențialului de oxido-reducere la valori optime pentru enzimele proteolitice endogene, încep procese caracteristice autolizei, cu degradarea protidelor intracelulare și a enzimelor, având loc astfel o reducere a activității fermentative a drojdiei. Celulele de drojdie se diferențiază prin rata de autoliză și prin produsele eliberate în urma autolizei celulare. (Oslobeanu M. și colab., 1989).

Formarea spumei în timpul fermentației mustului

Formarea spumei este favorizată de prezența celulelor aparținând anumitor tulpini de drojdii care aderă la suprafața bulelor de CO2 degajate în fermentația alcoolică. În practică, se recomandă selecționarea unor tulpini care să nu formeze o spumă stabilă.

Efectul pereților celulari ai drojdiilor

Adăugarea în cantitate de 0,5g/l , a unui preparat care conține fragmente de pereți celulari de drojdie, este utilă atunci când mustul are un conținut inițial ridicat de zahăr sau când conține substanțe chimice reziduale. Datorită structurii complexe a peretelui celular, prin adăugarea în must a fragmentelor celulare, are loc o absorbție selectivă a unor substanțe toxice pentru drojdii, în special a esterilor etilici ai acizilor grași cu 8 și 10 atomi de carbon în molecule, a pesticidelor, fapt ce permite menținerea unei rate mai mari de supraviețuire a drojdiilor.

Fragmentele celulare au un efect pozitiv și asupra fermentației malolactice, când în urma "neutralizării" unor substanțe toxice, acidul malic este mai rapid metabolizat la acid lactic.

Interrelații microbiene în fermentarea mustului de struguri

Pe parcursul fermentației, microorganismele prezente inițial în must, în funcție de proprietățile lor fiziologice și de compoziția mustului în continuă schimbare, se dezvoltă într-o anumită succesiune, condiționată de relațiile ce se stabilesc între diferitele grupe.

Fermentarea mustului este inițiată de drojdii asporogene, respectiv Kloeckera apiculata în cazul mustului de struguri roșii și culturi combinate de Kloeckera apiculata și Torulopsis bacillaris pentru mustul din struguri albi. Drojdiile starter produc cantități mici de alcool, 4-5 grade alcool. Fermentația este continuată de Torulopsis bacillaris ce poate produce prin fermentare 7-10 grade alcool. Pe măsura acumulării alcoolului etilic, fermentația este susținută de drojdii sporogene aparținând genului Saccharomyces: S.rosei (7-11 grade), S. elipsoideus (8-16 grade). La sfârșitul fermentației, predomină Saccharomyces bayanus (oviformis), drojdie alcoolo-tolerantă care se dezvoltă activ pe toată perioada fermentației și care poate produce peste 18 grade alcool.

Un antagosnism specific se manifestă între drojdiile de vin, ca urmare a capacității unor tulpini de a produce toxine de natură proteică (factor killer), care produce moartea celulelor de drojdii sensibile și nu au efect asupra drojdiilor neutre. Dintre tulpinile de drojdii izolate din must aproximativ 2-3% prezintă caracterul killer. Acest caracter a fost pus în evidență la unele drojdii din genul Saccharomyces, Torulopsis, Pichia și Candida.(Apostu s., 2006).

Capitolul VI.Fermentația alcoolică inițiată de drojdii

Fermentația alcoolică constă în transformarea zaharurilor în alcool etilic și acid carbonic sub influența unor microorganisme, dintre care pe primul loc se află drojdiile care pot fi considerate ca adevărați agenți ai fermentației alcoolice.(Bara C., 2010).

Există un mare număr de drojdii care produc descompunerea zahărului cu formare de alcool etilic, atunci când sunt obligate să trăiască în condiții anaerobe, așa cum există și drojdii (Pichia hialospora) incapabile să producă fermentația alcoolică.

Agenți ai fermentației alcoolice

La început, fermentația se face sub acțiunea microflorei spontane. Practica a arătat însă că microorganismele neselecționate sunt slab și inegal active, motiv pentru care industrial se folosesc drojdii selectionate (cultivate), ce se disting de cele sălbatice prin productivitatea lor ridicată și sunt adaptate perfect vieții anaerobe.

La fabricarea alcoolului etilic se folosesc drojdiile care aparțin genului Saccharomyces rees, din care amintim speciile: S. cerevisiae, S.elegans, S.ellipsoideus, S.fructuus, S. chevalieri, S.acidifaciens, S.ludwigii, etc.

Anumite drojdii osmofile din genul Zygosaccharomyces suportă concentrații mari de zahăr, putând produce fermentarea siropurilor concentrate de zahăr și a mierii.

Alte categorii de microorganisme ce pot produce prin fermentație alcool etilic sunt:

– mucegaiuri: Mucor eumycetes rouxianus, Mucor racemosus, Rhizopus orizae, Aspergillus orizae, Penicillium glaucum, Dematium pullulans;

– bacterii : Bacillus macerans, Bacillus etilicus, Bacillus gracile;

Natura enzimatică a fermentației alcoolice

Degradarea hidraților de carbon și transformarea lor în alcool etilic presupune un mecanism cuprinzând reacții enzimatice succesive, reacții ce au loc în prezența și cu aportul adenozin și tiamin fosfaților și coenzimei A, precum și a unor vitamine hidrosolubile ca B1, B2, B5, B6, PP, ș.a.

Cele mai importante enzime implicate în principalele secvențe succesive ale acestui mecanism sunt:

• în etapa de fosforilare și formare a trizofosfatilor: hexokinaza, fosfoglucoizomeraza, fosfofructokinaza,aldolaza;

• în etapa de dehidrogenare a aldehidei fosfoglicerice: glicerofosfatdehidrogenaza, fosfogliceratkinaza,

• în etapa de producere a acidului piruvic: glicerofosfatmutaza,enolaza;

• în etapa formării alcoolului etilic: alcooldehidrogenaza.

Principalii factori de influență ai fermentației alcoolice

Fermentația alcoolică fiind o succesiune de reacții catabolice produse de drojdii cu ajutorul enzimelor este influențată de factori implicați în metabolism în mod essential:

• temperatura, ca valoare medie și ca amplitudine între valorile maxime și minime, fiecare specie de microorganism având o temperatură optimă specifică;

• concentrația ionilor de hidrogen (pH), drojdiile dezvoltându-se în general pe substraturi acide (pH = 3.5 – 4.7);

• potențialul redox, datorită faptului că procesele de fermentare sunt, în general, reacții de oxido-reducere;

• presiunea osmotică – concentrațiile ridicate de hidrați de carbon încetinesc mecanismul fermentației, drojdiile obișnuite își întrerup activitatea la presiuni osmotice mari;

• concentrația de alcool rezultat – are acțiune inhibitoare dacă depășește 4-5% pentru drojdiile de fermentație inferioare și 18% pentru cele de fermentație superioare;

• activatorii și inhibitorii microorganismelor: antiseptice, microelemente minerale, alcoolul, dioxidul de carbon, oxigenul, etc.

Biochimismul formării produșilor principali și secundari în fermentația alcoolică

Conversia prin fermentare în mediu acid a glucidelor, catalizată de enzime din drojdii se desfășoară în cinci etape principale:

1. transformarea diferitelor tipuri de glucide în esteri ai glucozei și formarea esterului fructo-furanozo-1,6-difosfat. Este etapa în care se consumă energie prin transformarea ATP-ului în ADP;

2. formarea triozelor-aldehidă fosfoglicerică și fosfodioxiacetonă;

3. transformarea triozelor până la formarea de acid piruvic. Energia eliberată prin procesul de oxidoreducere este înmagazinată prin fosforilare de substrat;

4. decarboxilarea acidului piruvic și formarea de aldehidă acetică;

5. aldehida acetică se reduce devenind acceptor de hidrogen și se formează alcoolul etilic.

Reacția globală a fermentației alcoolice în mediu acid este:

C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2 + 2 ATP

În fermentația alcoolică rezultă o diversitate de produse secundare.

Glicerolul se acumulează în mod normal în cantități de 3,3 g/100 g glucoză fermentată și are un rol benefic asupra calității vinului, conferindu-i „catifelaj”-ul.

Aldehidele se acumulează în mediul de fermentare. Cea mai importantă, aldehida acetică, la concentrații ce depășesc 2,5 mg/dm3 influențează indirect gustul, deoarece prin oxidări duce la formarea de acid acetic.

Acizii provin atât din must cât și din procesul fermentativ. Ei dau aciditate volatilă vinului (acid acetic, formic, propionic, butiric) precum și o aciditate fixă (acid lactic, succinic) care se regăsește în aciditatea totală a vinului.

Dintre alcoolii superiori, care se acumulează mai ales la fabricarea alcoolului, fac parte alcoolii amilic, izoamilic, propanol, butanol, care pot să contribuie la formarea unor substanțe de aromă.

În afară de aspectele pozitive ale fermentației alcoolice la fabricarea alcoolului, vinului, distilatelor, berii, pâinii, aceasta poate prezenta și aspecte negative atunci când se produce fermentarea spontană a unor produse bogate în zahăr (siropuri, dulcețuri, compot, miere). În acest caz fermentarea este dată de drojdii osmotolerante care produc prin fermentare alcool etilic, CO2 și o cantitate apreciabilă de acid acetic, ceea ce duce la deprecierea lor.

Cap.VII.Studiu experimental

VII.1.Scopul experimentului

În vederea desfășurării studiului experimental, s-a pornit de la premisa că deși pentru obținerea vinurilor se folosesc în momentul actual diverse produse comerciale conținând șușe selecționate de drojdii destinate fermentării mustului, totuși utilizarea tulpinilor locale de drojdii din flora indigenă ar fi mai potrivită deoarece ele ar fi mai capabile să asigure caracteristicile senzoriale specifice, tipice pentru vinurile fabricate în unele centre vitivinicole.

În baza acestei premise, obiectivul lucrării a fost constituit de selectarea în condiții de laborator a unor tulpini de drojdii locale, provenite din microflora indigenă a boabelor de struguri recoltate din podgoria Miniș-Măderat, evidențiate în mustul fermentat și studiul proprietăților metabolice specifice ale acestora, care influențează pozitiv calitatea vinului obținut.

Tulpinile de drojdii aparținând microflorei spontane au fost izolate și examinate din punct de vedere microbiologic în cadrul Laboratorului de [NUME_REDACTAT] din cadrul Facultății de [NUME_REDACTAT] Oradea, pentru a fi identificate, încadrate taxonomic și introduse ulterior în procesul de fermentare dirijată a mustului.

VII.2.Material și metodă de studiu

În prima etapă, din mustul obținut prin fermentarea spontană a boabelor de struguri conținând microflora locală, am luat o probă din care am efectuat diluții succesive cu apă distlată, potrivit tehnicii diluțiilor seriale, ultima diluție fiind 10-6. Din fiecare diluție am însămânțat cu ajutorul unei pipete gradate, un inocul cu volumul de 1 ml, în câte 2 cutii Petri, care conțineau mediul Sabouraud, dispersând uniform probele, după care le-am incubat la termostat la temperatura de 26° C, timp de 3 zile, urmărind dezvoltarea coloniilor de drojdii.

În a doua etapă, din culturile dezvoltate am selectat coloniile izolate, cu contur bine delimitat și le-am repicat cu ajutorul unei anse bacteriene sterilizate în prealabil prin flambare, trecându-le pe mediul de cultură solid cartof dextroză agar (PDA). După inocularea plăcilor Petri cu mediul de cultură, ele au fost introduse în termostat, timp de 3 zile, la 26° C, pentru dezvoltarea coloniilor de drojdii.

În a treia etapă s-a făcut examenul caracterelor microscopice, culturale și biochimice ale tulpinilor de drojdii dezvoltate pe mediul de cultură cartof dextroză agar (PDA), în vederea identificării și încadrării lor taxonomice și a selectării tulpinilor cu însușiri tehnologice valoroase, care au fost apoi utilizate pentru fermentarea mustului.

VII.2.1.Identificarea caracterelor microscopice ale tulpinilor de drojdii

Pentru evidențierea aspectului microscopic al celulelor de drojdie, am executat frotiuri microbiene pe care le-am examinat în stare proaspătă cu microscopul optic, după colorare prin metoda Gram. Pentru etalarea frotiurilor am obținut inoculul din colonii de drojdii dezvoltate pe două medii de cultură: mediul lichid cu extract de malț (MYPG lichid) și pe mediul solid cu extract de malț (MYPG agarizat). Materialul biologic analizat însămânțat pe cele două medii cu extract de malț, lichid și solid, a fost incubat la termostat la o temperatură de 25oC, timp de 48 de ore, iar din culturile dezvoltate am făcut frotiuri, pe care le-am examinat microscopic, urmărind forma calulelor, dimensiunile celulelor, modul de diviziune, modul de înmugurire.

VII.2.2.Identificarea caracterelor de cultură ale tulpinilor de drojdii

Pentru examinarea caracteristicilor culturale ale culturilor de drojdii, am recurs la însămânțarea coloniilor atât pe un mediu de cultură lichid reprezentat de extract de drojdie peptonă dextroză ([NUME_REDACTAT] Dextrose sau YPD) cât și pe un mediu de cultură solid reprezentat de același mediu, dar agarizat (YPD solid).

Pentru prepararea mediului lichid drojdie peptonă dextroză (YPD lichid) am folosit următoarele ingrediente: extract de drojdie Difco 10 g, bactopeptonă Difco 10 g, glucoză 20 g, apă distilată, l000 ml, iar pentru prepararea mediului solid drojdie peptonă dextroză (YPD solid) am adăugat în plus fașă de ingredientele ulilizate la mediul lichid și 20 g agar.

După însămânțarea mediilor de cultură drojdie peptonă dextroză lichid și drojdie peptonă dextroză solid, cu colonii izolate de drojdii repicate de pe mediul solid cu extract de malț (MYPG agarizat), am incubat plăcile Petri conținând culturile la termostat la temperatura de 25°C și am urmărit zilnic, timp de 3 zile, caracterele culturale ale coloniilor dezvoltate, importante din punct de vedere taxonomic.

Trăsăturile culturale pe care le-am urmărit pe mediul lichid drojdie peptonă dextroză (YPD lichid) au fost: momentul apariției culturii, gradul de creștere al culturii după o perioadă completă de incubare, apariția turbidității mediului lichid, apariția unui depozit sau pelicule suprafeței mediului lichid și aderența acestora.

Pe mediul solid extract de drojdie peptonă dextroză (YPD solid) am urmărit următoarele caracteristici culturale: momentul apariției culturii, gradul de dezvoltare al culturii, forma coloniilor, dimensiunile coloniilor, conturul coloniilor, consistența coloniilor, relieful coloniilor, aspectul suprafeței coloniilor, transparența sau gradul de pigmentare a culturii și a mediului.

VII.2.3.Identificarea caracterelor biochimice ale tulpinilor de drojdii

Pentru examinarea caracterelor biochimice ale tulpinilor de drojdii repicate am folosit următoarele teste clasice: testul fermentației zaharurilor, testul asimilației zaharurilor, testul asimilației nitraților, iar pentru confirmarea rezultatelor am recurs la testul cu galeriile API 20C.

Pentru efectuarea testului API 20C, am inoculat cu o suspensie de drojdii în agar moale compartimente individuale ale pachetului API 20C, după care am incubat folia testului timp de 72 ore la temperatura de 30°C, la termostat. Drojdiile s-au dezvoltat numai în compartimentele în care a fost asimilat hidrocarbonatul, fapt sesizat prin tulburarea mediului cu agar moale, ușor de vizualizat în dreptul liniilor trasate pe suprafața de plastic din spatele compartimentelor. Am putut determina în acest fel, simultan, 19 teste de asimilație, un compartiment fiind utilizat ca martor. Sistemul API 20C a fost însoțit de tabele indicatoare, pe baza cărora, rezultatul reacțiilor de asimilare obținut în fiecare caz a putut fi utilizat pentru identificarea taxonomică a drojdiilor.

Fig.nr.Efectuarea testului API 20C: inocularea suspensiei de drojdii în compartimentele foliei test

Fig.nr.Efectuarea testului API 20C: adăugarea reactivilor în compartimentele foliei test

VII.2.4.Selecția tulpinilor starter de drojdii destinate studiului experimental

După o primă selecție a coloniilor de drojdii, s-a obținut un număr de 7 tulpini de drojdii, care au fost încadrate din punct de vedere taxonomic, pe baza aspectului microscopic și a caracterelor culturale în genul Saccharomyces, specia cerevisiae.

Cele 7 tulpini de drojdii au fost supuse în continuare unei noi selecții prin repicarea pe medii de cultură și testele biochimice, fapt care ne-a permis, să reținem 3 tulpini de drojdii, pe care le-am identificat că aparțin speciei Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus.

Pentru cele 3 tulpini de drojdii Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus, reținute în urma celei de-a doua selecții, s-a întocmit curba de multiplicare a drojdiilor în cultură reprezentată de must steril din soiul Riesling italian, cu origini diferite, o probă provenind din regiunea vitivinicolă Miniș-Măderat, iar cealaltă probă din zona viticolă Recaș.

Am realizat următoarele variante experimentale :

– varianta 1, pe care am notat-o V1, reprezentată de curba de multiplicare a tulpinii nr.7 de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus introdusă în mustul de Riesling italian provenind din regiunea vitivinicolă Miniș-Măderat

– varianta 2 pe care am notat-o V2, reprezentată de curba de multiplicare a tulpinii nr.6 de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus introdusă în mustul de Riesling italian provenind din regiunea vitivinicolă Miniș-Măderat

– varianta 3, pe care am notat-o V3, reprezentată de curba de multiplicare a tulpinii nr.2 de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus introdusă în mustul de Riesling italian provenind din regiunea vitivinicolă Miniș-Măderat

– varianta 4, pe care am notat-o V4, reprezentată de curba de multiplicare a tulpinii nr.6 de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus introdusă în mustul de Riesling italian provenind din zona viticolă Recaș.

– varianta 5, pe care am notat-o V5, reprezentată de curba de multiplicare a tulpinii nr.2 de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus introdusă în mustul de Riesling italian provenind din zona viticolă Recaș.

– varianta 6, pe care am notat-o V6, reprezentată de curba de multiplicare a tulpinii nr.7 de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus introdusă în mustul de Riesling italian provenind din zona viticolă Recaș.

VII.3.Rezultatele studiului experimental

Rezultatele examenului microscopic al tulpinilor de drojdie

Tabel nr.Caracteristici microscopice al tulpinilor de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

Fig.nr.Aspectul microscopic al tulpinii nr.2. de Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

Fig.nr.Aspectul microscopic al tulpinii nr.6. de Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

Fig.nr.Aspectul microscopic al tulpinii nr.7. de Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

Rezultatele examenului cultural al tulpinilor de drojdie

Tabel nr.Aspectul cultural al tulpinilor de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

Rezultatele examenului biochimic al tulpinilor de drojdie

Tabel nr.Rezultatele testului de fermentație a glucidelor de către tulpinile de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

Tabel nr.Rezultatele testului de asimilație a glucidelor de către tulpinile de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

Tabel nr.Rezultatele testului de asimilație a nitraților de către tulpinile de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

Am testat influența fiecărei tulpini selectate anterior de drojdie Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus (nr.2, nr.6 și nr.7) asupra calității vinului obținut,din must Riesling italian, cu origine diferită din punct de vedere geografic, provenit din zonele Miniș-Măderat și Recaș și am întocmit câte un grafic pentru fiecare tulpină testată în cele două variante, astfel încât am obținut 3 grafice.

Fig.nr.Rezultatele multiplicării în must reprezentate grafic pentru tulpina nr.2. de Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

În baza graficelor întocmite, pentru variantele V3 și V5, am constatat faptul că tulpina nr.2 de Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus a manifestat o creștere în cultură cu diferențe mari pentru cele 2 tipuri de must cu origine diferită (Miniș-Măderat și Recaș) introduse în variantele experimentale. Astfel, în timp ce tulpina cultivată în varianta V3 pe mustul de Miniș-Măderat a intrat imediat în fermentație, pe mustul din zona Recaș introdus în varianta V5, tulpina a intrat în fermentație doar după 15 ore de la inoculare. Fermentația pe mustul de Miniș-Măderat a fost foarte rapidă, atingând punctul maxim al graficului la 15 ore de la inițierea creșterii populației levuriene, după care, rapid și constant a început declinul populației de celule. După faza de lag pronunțată a variantei experimentale V5, populația de levuri s-a îndreptat treptat spre vârful graficului, timp de 20 ore, deci destul de lent față de varianta V3 cultivată pe mustul din zona de origine a tulpinii levuriene(Miniș-Măderat). S-a constatat pe grafic că a urmat apoi un palier timp de 10 ore, după care a început declinul celulelor de drojdii.

Fig.nr. Rezultatele multiplicării în must reprezentate grafic pentru tulpina nr.6. de Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

În baza graficelor întocmite, pentru variantele V2 și V4 am constatat faptul că tulpina nr.6 de Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus manifestă o creștere în cultură după o traiectorie asemănătoare. Referitor la influența mustului cu origini diferite, nu s-au remarcat diferențe semnificative privind modul în care s-a derulat fermentația, pe etape ale graficului. Intrarea în faza de accelerare, respectiv creștere logaritmică a fost rapidă, pentru ambele variante, iar punctul maxim al graficului a fost atins după o perioadă de 30-35 ore de la începerea fermentației alcoolice.

Fig.nr. Rezultatele multiplicării în must reprezentate grafic pentru tulpina nr.7. de Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus

În baza graficelor întocmite, pentru variantele V1 și V6, am constatat faptul că tulpina nr.7 de Saccharomyces cerevisiae varietatea ellipsoideus a avut o capacitate de multiplicare diferită, pe cele două musturi cu origine diferită. Astfel, în timp ce în varianta V1 pe mustul originar din zona Miniș-Măderat tulpina a intrat imediat în faza de multiplicare (în primele 5 ore de la inoculare), pe mustul originar din centrul viticol Recaș din varianta V6, tulpina a înregistrat o fază de lag de 10 ore. Faza de accelerare a durat pe mustul de Miniș-Măderat 35 ore, iar pe mustul originar din Recaș 30 ore. Punctul maxim al creșterii logaritmice a fost atins pentru ambele variante la aproximativ 35-40 ore de la inoculare. În condițiile în care densitatea microbiană inițială la inoculare a fost aceeași pe ambele musturi, totuși, pe mustul de Miniș-Măderat, densitatea maximă a populației microbiene a fost superioară celei înregistrate pe mustul provenit din Recaș. Pe mustul de Miniș-Măderat sușa 7 s-a menținut la cota maximă de multiplicare timp de 5 ore, după care a început faza de declin.

Faptul că tulpina martor de drojdie provenită dintr-o altă zonă geografică (Recaș) a dus la obținerea unui vin de calitate, dar care nu a reușeșit să atingă performanțele gustative ale vinurilor obținute cu unele sușe selecționate de noi din zona Miniș-Măderat, dovedește importanța selecției locale de levuri pentru valorificarea potențialului aromatic al soiului și implicit pentru exprimarea autenticității și tipicității unui vin.

Curbele de creștere a populației levuriene, reflectând mersul fermentației, au semnalat o activitate mai greoaie a acelorași sușe pe mustul din Recaș, față de acela provenind din zona din care sușele au fost izolate adică Miniș-Măderat.

[NUME_REDACTAT] per ansamblu rezultatele obținute în urma studiului experimental, putem afirma că experiențele noastre, care și-au propus evidențierea unei posibile corelații între calitatea vinului obținut și originea tulpinii de drojdii folosite la inocularea mustului, s-au finalizat cu rezultate destul de relevante în acest sens, ceea ce concordă cu observațiile făcute de diverși cercetători din domeniu, care arată că o tulpină izolată dintr-o anumită regiune determină obținerea unui vin de calitate superioară atunci când este pus la fermentație pe must din aceeeași regiune, ceea ce înseamnă că este mai bine evidențiată tipicitatea și autenticitatea produsului finit – vinul.

Având în vedere faptul că la suprafața boabelor de struguri există specii valoroase de drojdii care fac parte din microflora epifită caracteristică unei zone vitivinicole, consider că diversele soiuri de vin reprezintă un produs al locului de origine al solului și al acestei microflore locale , rezultat în urma fermentației spontane a mustului. Din acest motiv, pentru obținerea unui vin ale cărui caracteristici senzoriale să reflecte specificul zonei, cred că ar fi mai potrivit să nu se recurgă la utilizarea unor tulpini de drojdii selecționate comercializate de diverse firme, care s-ar putea să estompeze din caracteristicile vinurilor fine pentru că nu dezvoltă același buchet ca și vinurile fermentate natural de către amestecul valoros de drojdii din compoziția microflorei spontane.

[NUME_REDACTAT] S., Microbiologia produselor alimentare, vol. I, Cluj-Napoca, [NUME_REDACTAT], 2006, ISBN 973-751-311-8

Anghel I. și colab., Biologia și tehnologia drojdiilor, vol. 3, Ed. [NUME_REDACTAT], 1993

Bara, C., Microbiologie alimentară., [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2005

Bara, C., Tehnici și examene de laborator în controlul alimentelor, [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2005

Bara, C. , Microbiologia generală a unităților agroalimentare, [NUME_REDACTAT] din Oradea,; 2010

Bara, C. , Lucrări practice de microbiologie, [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2009

Bara, C., Bara, V., Pop, C., Tehnici de microbiologie aplicată., [NUME_REDACTAT] din Oradea; 1998

Bara, C., Bara. V., Chipurici, M., Zabik, A., Metode generale de microbiologie aplicată., [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2000

Bara, C., Bara, V., Ionescu, G., Tehnologii de prelucrare și microbiologie a produselor agroalimentare., [NUME_REDACTAT] din Oradea; 2001

[NUME_REDACTAT] , Selecția unor levuri din agroecosistemele vitivinicole, Raport de cercetare, 2004.

[NUME_REDACTAT]., Influența temperaturii la prelucrarea și fermentarea mustului asupra vinurilor demiseci și dulci naturale. Horticultura și viticultura, XVII, nr. 10, 1968

Cotea D.V., Cotrău A., [NUME_REDACTAT], Varna P., Cercetări privind influența tratamentului termic asupra unor componente la vinifîcația în roșu a strugurilor de [NUME_REDACTAT], Lucrări științifice, seria Horticultura, [NUME_REDACTAT] Iași, 1997.

Cotea D.V., Tratat de oenologie, Vol. I, Ed. Ceres, București, 1985.

Cotea D.V., și colab. , Podgoriile si vinurile României, Ed. [NUME_REDACTAT], 2000

Croitoru C., Tratat de știință și inginerie oenologică. Produse de elaborare și maturare a vinurilor, București, [NUME_REDACTAT], 2009, ISBN 978-973-720-233-8

Giosanu T. și colab., Procedee tehnologice care conduc la sporirea conținutului în extract al vinurilor albe seci, [NUME_REDACTAT] de Viticultură și Vinificație, vol. VI, 1975.

Moțoc D., Microbiologia produselor alimentare, București, 1964, [NUME_REDACTAT]

Oslobeanu M. și colab., Viticultura generală și specială, Ed. Didactică și Pedagogică, București, 1989

Sandu G., Popescu C, Reducerea biologică a activității musturilor prin folosirea drojdiilor din genul Schizosaccharomyces, [NUME_REDACTAT] în Moldova, vol. 3, 1982

Sandu G., Popescu C, Conducerea fermentației alcoolice a musturilor prin utilizarea de drojdii cu caracter nespumant. Cercetări agronomice – Moldova, vol. I, 1980.

[NUME_REDACTAT] și colab., Un nou studiu de livrare a culturilor de drojdii vinicole, ICHV, Lucrări științifice, vol. V, 1961-1962

[NUME_REDACTAT], Doholici V., Testarea tehnologică fizico-chimică și microbiologică a vinurilor, Ed. Ceres, București, 1981.