CAPITOLUL II – PARTE EXPERIMENTALĂ 2.1. Materiale și metode 2.1.1. Material biologic utilizat Ca material biologic, s-a utilizat ceai negru și verde… [310551]

[anonimizat]

2.1. Materiale și metode

2.1.1. Material biologic utilizat

Ca material biologic, s-a utilizat ceai negru și verde pentru cultivarea consorțiului de tip Kombucha. S-a folosit apă de izvor și apa de la rețeaua locală.

Ingrediente necesare preparării:

Cultura de Kombucha;

O ceașcă de zahăr brun (reprezinta hrana pentru Kombucha);

3 litri de apă;

Pânza sau filtru;

5 lingurițe de plantă (sau 5 plicuri de ceai ) – ceai negru sau verde;

Borcane de sticlă;

Elastic de cauciuc;

Mod de preparare al ceaiului de Kombucha:

Se prepară intâi ceaiul și se lasă la infuzat circa 15 minute. Se adaugă zahărul și se lasă la răcit până ce acesta ajunge la temperatura camerei. [anonimizat], se scot pliculetele de ceai ;

Când s-a [anonimizat];

[anonimizat], legandu-se cu elastic gura borcanului;

[anonimizat] :

V1, V3, V3 = ceai verde cu Kombucha ;

KO, KO1 = Oțet de Kombucha ;

KN = ceai negru cu Kombucha ;

KMN = [anonimizat] ;

KMV = [anonimizat] ;

KI = [anonimizat] ;

2.1.2. Microorganisme testate

Nouă tulpini bacteriene potențial patogene și patru tulpini fungice au fost utilizate în acest studiu (tabelul 2.1.2).

Tabelul 2.1.2. Caracterizarea microorganismelor testate

Pentru testarea activității antimicrobiene a ceaiului de tip Kombucha față de aceste tulpini s-[anonimizat]. Inocularea s-a [anonimizat] 10 ml mediu; temperatura de 37˚C pentru tulpinile bacteriene și 30˚C pentru fungi; timpul de incubare în vederea dezvoltării a fost de 24-48 ore.

2.1.3. Medii de cultură

Pentru determinarea activității antimicrobiene a [anonimizat]:

[anonimizat] 121°C, timp de 20 minute. [anonimizat] (aproximativ 6-8 ml/placă) in mediu steril din hota cu flux laminar.

2.1.4. Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului de tip Kombucha

Metoda utilizată a fost metoda antibiogramei (rondelelor). Experimentele realizate au cuprins mai multe etape:

[anonimizat], respectiv 1 ml suspensie repartizate în plăci Petri;

incubarea plăcilor timp de 1 oră;

[anonimizat] a acestora;

depunerea rondelelor pe plăcile cu microorganismele însămânțate

imbibarea rondelelor cu 10µl filtrat de ceai kombucha

incubarea la temperatură optimă de dezvoltare a microorganismelor luate în lucru (28˚C pentru drojdii și mucegaiuri, 37˚C pentru bacterii), timp de 24-48 ore;

toate experimentele au fost efectuate în duplicat.

Activitatea antimicrobiană a fost evaluată în funcție de apariția sau nu a [anonimizat], [anonimizat]-se media acestora.

Fig. 2.1.4 Aspecte din perioada testării în laborator a activității antimicrobiene

2.1.5. Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului de tip Kombucha liofilizat

Conservarea de lungă durată a microorganismelor prin liofilizare reprezintă o metodă larg răspândită în practica microbiologică. În cadrul procesului desecării în vid la temperaturi scăzute culturile de microorganisme își păstrează aproape în întregime caracterele, însă nu și viabilitatea.

Pentru o mai bună păstrare a viabilității culturilor, acestea, înainte de liofilizare, se suspendă într-un mediu stabilizator, cu efect protector față de șocurile osmotice și termice.

Liofilizarea este un proces de desicație sub vid, dar la temperatură scăzută și se realizează într-un aparat special numit liofilizator.

Aparat de liofilizare utilizat: Liofilizator Labconco (freeze dryer) de capacitate 6 l. Presiunea de 0,04 mbar; temperatura între – 60 și – 700C, timp de 6 ore.

Varianta de liofilizare a mediului de cultură lichid:

s-au centrifugat 5 ml din fiecare cultură de ceai;

biomasa rezultată , s-a transferat steril în fiole de sterilizare de 100 ml și s-au introdus în aparatul de liofilizare;

s-au ținut in liofilizator la temperatură între – 60 și – 700C, timp de 6 ore;

După liofilizare s-au resuspendat in 0,5 ml apă distilată ;

Fig. 2.1.5 Aspecte din perioada testării în laborator a activității antimicrobiene

CAPITOLUL III – REZULTATE ȘI DISCUȚIE

Experimentele efectuate au avut ca scop determinarea activității antagoniste a consorțiului de tip Kombucha în vederea obținerii unui produs de uz veterinar.

3.1 Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului cu Kombucha asupra bacteriilor Gram positive si Gram negative

Pentru evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului cu consorțiul microbian Kombucha au fost utilizate cinci tulpini Gram pozitive (Bacillus spp. si S. auresus) (tabelul 3.1.1).

În vederea determinării activității antimicrobiene asupra bacteriilor Gram-negative au fost utilizate 3 tulpini potențial patogene: Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa și

Escherichia coli (tabelul 3.1.1).

Tabelul 3.1.1 Evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului cu consortiul microbian Kombucha asupra bacteriilor Gram- pozitive si Gram-negative

Legendă: – = lipsa haloului; activitate inhibitoare inexistenă;

+ = activitate inhibitoare intre 1-3 mm;

++ = activitate inhibitoare > 3 mm

+++ = activitate inhibitoare > 6 mm

Pentru obținerea unor rezultate cât mai bune, fiecare proba a fost lucrată in duplicat. In paralel s-a folosit ca martor negativ ceai simplu negru si verde fara consorțiul de tip Kombucha.

Probele de ceai au fost in numar de 7 si denumite astefel: V1, V3, V4, KO, KO1, KN, KN1.

a b

Fig. 3.1.2 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Bacillus cereus ;

a b

Fig 3.1.3 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Bacillus licheniformis ;

a b

Fig 3.1.4 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Bacillus pumilus ;

a b

Fig. 3.1.5 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Bacillus megaterium ;

a b

Fig 3.1.5 Evaluarea activității antimicrobiene asupra E.coli ;

a b

Fig 3.1.6 Evaluarea activității antimicrobiene asupra S. tiphymurium ;

a b

Fig. 3.1.7 Evaluarea activității antimicrobiene asupra Pseudomonas aeruginosa

Conform tabelului 3.1.1 s-a observat că proba V4 a manifestat activitate inhibitorie asupra tuturor tulpinilor bacteriene. S-a observat apariția în cazul acestei probe a unor halouri clare, de dimensiuni medii.

Proba KN1 nu a manifestat activitate antimicrobiană asupra bacteriilor Gram-negative si Gram-pozitive, cu excepția unei activități de mici dimensiuni asupra Bacillus licheniformis .

Din tabel 3.1.1 s-a putut observa faptul că proba V1 are activitate antagonistă asupra tuturor bacteriilor Gram-pozitive, dar nu și asupra celor Gram-negative.

De asemenea proba KO prezintă activitate inhibitorie asupra tuturor speciilor testate cu excepția Bacillus pumilus si Escherichia coli.

Tot din tabelul 3.1.1 s-a observat că specia de Bacillus licheniformis este inhibat de toate probele de tip Kombucha, cea mai mare zonă de inhibiție avand-o proba KN.

Staphylococcus aureus bacterie gram pozitivă prezinta rezistența asupra tuturor probelor de ceai filtrat de tip Kombucha, la fel si Pseudomonas aeruginosa bacterie gram negativă.

Toate probele au fost lucrate din duplicat.

Martorul negativ din ceai simplu negru și verde nu are activitate antagonistă asupra nici unui microorganism testat.

3.2 Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului filtrat asupra fungilor

Pentru această categorie, în vederea determinării activității antimicrobiene asupra fungilor s-au teastat trei tulpini de Candida spp.

Cele 7 probe de ceai filtrate si denumite astefel: V1, V3, V4, KO, KO1, KN, KN1 au fost testate asupra C. albicans, C. parapsilosis si C.guillermondi conform tabelului 3.2.1.

Tabelul 3.2.1 Evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului cu consortiul microbian Kombucha

asupra fungilor

Determinarea zonei de inhibitie

Legendă: – = lipsa haloului; activitate inhibitoare inexistenă;

+ = activitate inhibitoare;

Conform rezultatelor prezentate în tabelul 3.2.1 s-a observat că față de speciile de fungi patogene testate, filtratele de ceai Kombucha nu au o activitate antifungică.

Fig 3.2.2 Evaluarea activității antimicrobiene asupra C. albicans

3.3 Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului liofiliza asupra bacteriilor Gram-pozitive si Gram-negative

Pentru evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat cu consorțiul microbian Kombucha au fost utilizate 3 tulpini Gram-pozitive si 3 tulpini Gram-negative. (tabelul 3.2.1).

Au fost liofilizate 3 probe de ceai, numite KMN(Ni), KI, KMV(Vi), iar testarea s-a facut atât asupra liofilizatelor resupendate in apă distilată cât și asupra filtratelor inițiale înainte de liofilizare pentru a se observa în ce formă a ceaiului cu Kombucha activitatea antimicrobiana este mai mare.

Tabelul 3.3.1 Evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat cu consorțiul microbian Kombucha asupra bacteriilor Gram pozitive si Gram-negative

Legendă: – = lipsa haloului; activitate inhibitoare inexistenă;

+ = activitate inhibitoare intre 1-3 mm;

++ = activitate inhibitoare > 3 mm

+++ = activitate inhibitoare > 6 mm

L1 = Liofilizat KMN (Ni2)

F1 = Filtrat KMN(Ni2_

L2 = Liofilizat KI

F2 = Filtrat KI

L 3 = Liofilizat KMV (Vi)

F 3= Filtrat KMV (Vi)

a b c d e f

Fig 3.3.2 Evaluarea activității antimicrobiene asupra a. Bacillus megaterium, b.Bacillus pumilus, c. Enterococcus faecalis, d. E. coli, e. S. tiphymurium, f. P. aerugionasa.

Toate probele au fost facute in duplicat pentru un rezultat cât mai clar.

Din tabelul 3.2.1 se poate observa ca toate probele liofilizate de ceai și resupendate în apa distilată au activitate antibacteriană semnificativă asupra tuturor tulpinilor bacteriene, atât cele Gram-pozitive, cât și cele Gram-negative. Cea mai puternică activitate antibacteriană au manifestat-o față de bacteriile Gram-negative.

Probele liofilizate L2 și L3 au cea mai puternică activitate antagonistă asupra tuturor microorganismelor patogene.

Din aceste rezultate reiese faptul că liofilizarea probelor de ceai ofera o activitate inhibitorie mult mai ridicata decat cea a ceaiului simplu filtrat.

3.4 Determinarea activității antimicrobiene a ceaiului liofiliza asupra fungilor

Pentru evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat cu consortiul microbian Kombucha asupra fungilor au fost utilizate 4 tulpini de tulpini de Candida sp, conform tabelului 3.4.1. Conform rezultatelor prezentate în tabelul 3.4.1 se poate observa ca liofilizatul ceaiului nu are activitate antifungica asupra speciilor de Candida spp. cu exceptia C. parapsilosis unde prezinta o activitate foarte mica, spre deosebire de cea antibacteriana.

Există câteva studii referitoare la activitatea antimicrobiană a constortiului de tip Kombucha asupra Candidei albicans.

Tabelul 3.4.1 Evaluarea activității antimicrobiene a ceaiului liofilizat cu consortiul microbian Kombucha asupra

Legendă: – = lipsa haloului; activitate inhibitoare inexistenă;

+ = activitate inhibitoare;

a b

Fig 3.4.2 Evaluarea activității antimicrobiene asupra a. C.brunei, b. C. parapsilosis.