CAPITOLUL I. MICROORGANISMELE EXTREMOFILE: ASPECTE MICROBIOLOGICE ȘI BIOCHIMICE 6 1.1. CARACTERE GENERALE 6 1.2. MICROORGANISMELE PSIHROFILE 8 1.2.1…. [631387]

1
CUPRINS

CUPRINS 1
LISTĂ DE ABREVIERI 3
INTRODUCERE 5
CAPITOLUL I. MICROORGANISMELE EXTREMOFILE: ASPECTE MICROBIOLOGICE
ȘI BIOCHIMICE 6
1.1. CARACTERE GENERALE 6
1.2. MICROORGANISMELE PSIHROFILE 8
1.2.1. FAMILIA PSEUDOMONADACEAE 10
1.2.1.1. GENUL Rugamonas 10
1.2.1.2. SPECIA TIP Rugamonas rubra 11
1.2.2. ECOLOGIA PSIHROFILELOR 12
1.2.3. MECANISME DE ADAPTARE LA TEMPERATURI SCĂZUTE 13
1.3. ASPECTE BIOCHIMICE PARTICULARE ALE PSIHROFILELOR 16
1.3.1. ASPARTAT CARBAMOILTRANSFERAZA 17
CAPITOLUL II. MATERIALE ȘI METODE 25
2.1. MATERIALE ȘI METODE MICROBIOLOGICE 25
2.1.1. Tulpina Rugamonas sp. 25
2.1.2. Medii de cultură 25
2.1.3. Condiții de cultivare 26
2.2. MATERIALE ȘI METODE MOLECULARE 26
2.2.1. Extracți a ADN genomic și plasmidial 26
2.2.2. Clonarea genei prin amplificare PCR 28
2.2.3. Expresia genică în Escherichia coli 30
2.3. METODE DE BIOINFORMATICĂ 31
2.3.1. Secvențializarea genei pyrB din Rugamonas PAMC27505 31
2.3.2. Metode bioinformatice utilizate pentru analiza structurii proteice a ATCazei 31
CAPITOLUL III. REZULTATE ȘI DISCUȚII 32
3.1. ANALIZA STRUCTURII PRIMARE A A SPARTAT TRANSCARBAMILAZEI DIN
Rugamonas sp. PAMC27505 32
3.1.1. Omologi a structurii primare și conservarea situsurilor active 32
3.1.2. Analiza conținutului de aminoacizi 36
3.2. OBȚINEREA ATC azei RECOMBINANT E DIN BACTERIA PSIHROFILĂ
Rugamonas sp. PAMC27505 38
3.2.1. Extracți a ADN genomic 38

2
3.2.2. Clonare a genei pyrB din Rugamonas PAMC27505 40
3.2.2.1. Determinarea condițiilor optim e de amplificare PCR a genei pyrB 40
3.2.2.2. Digestia enzimatică 42
3.2.2.3. Defosforilarea vectorului pHAT2 NcoI/Hind III 43
3.2.2.4. Ligarea pHAT2 cu ATC și formarea plasmidului pATCR 43
3.2.2.5. Amplificarea pATCR în Escherichia coli 44
3.2.3. Expresia în Escherichia coli 45
CAPITOLUL IV. CONCLUZII 47
BIBLIOGRAFIE 49

3
LISTĂ DE ABREVIERI

ADN = acid deoxiribonucleic
AFP = antifreeze proteins = proteine anti -îngheț
APS = persulfat de amoniu
ARN = acid ribonucleic
ARNr = acid ribonucleic ribozomal
ATCaza = Aspartat transcarbam oilaza/Aspartat carbamoiltransferaza
ATP = Adenozin trifosfat
CP = Carbamil fosfat
CPSaza = Carbamoil fosfat sintetaza
CSD = Cold -shock domain = Domeniu de șoc termic
CSP = Cold -shock proteins = Proteine de șoc termic
CTP = Citidin trifosfat
D.O. = Densitate Optică
ddH 2O = apă dublu distilată
DHO = Dihidroorotat
DHOaza = Dihidroorotaza
dNTP = deoxinucleotid trifosfat
EPS = exopolizaharide
H2S = hidrogen sulfurat
IPTG = Isopropil β -D-1-tiogalactopiranozidă
Km = constanta Michaelis
LB = mediu de cultivare Luria Bertani
LPS = lipopolizaharide
N2 = azot
NaCl = clorură de calciu
OMP = Orotidil -5’-monofosfat
PCR = Polymerase Chain Reaction = Reacție de polimerizare în lanț
pDHO = pseudo -dihidroorotază
pI = punct izoelectric
PRPP = 5 -fosforibosil -1-pirofosfat
R2A = mediu de cultivare Agar Reasoner 2
R2B = mediu Reasoner 2A Lichid
SDS = dodecil sulfat de sodiu
SDS-PAGE = electroforeză în gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu
T.S.I. = mediu de cultivare Triple Sugar Iron

4
TEMED = Tetramet iletilendiamină
Tris-HCl = T ris(hidroximetil)aminomet an – Acid clorhidric
UDP = Uridin -difosfat
UMP = Uridin -5’-monofosfat
UTP = Uridin -5’-trifosfat

5
INTRODUCERE

O mare parte a biosferei se află în permanență la temperaturi scăzute, 11% din suprafața terestră fiind
acoperită de ghețari și calote glaciare, motiv pentru care este fundamentală cunoașterea activității
metabolice a microorganismelor la tempe raturi situate sub temperatura de îngheț a apei, pentru a putea
defini cu exactitate rolul lor ecologic.
Extremofilele sunt microorganismele capabile de supraviețuire și proliferare în habitate caracterizate
de condiții extreme de mediu. Mecanismele de ada ptare ale acestora la condiții extreme de temperatură
au prezentat din totdeauna un interes pentru comunitatea științifică, în special datorită aplicațiilor
biotehnologice ale enzimelor contituente, acestea prezentând o stabilitate termică ridicată într -un
interval larg de temperaturi.
Microorganismele adaptate la temperaturi scăzute sunt cunoscute sub denumirea de psihrofile, unul
dintre avantajele principale ale enzimelor din aceste organisme fiind consumul redus de energie, motiv
pentru care se consideră că microorganismele psihrofile ar putea fii utilizate în ingineria genetică,
pentru producerea de proteine termolabile.
Nucleotidele pirimidinice reprezintă constituenți celulari în toate tipurile de organisme, contribuind la
sinteza de novo a acizilor nu cleici.
Biosinteza nucleotidelor pirimidinice este una dintre cele mai vechi căi metabolice, prezentă în
aproape toate speciile. Aspartat transcarbamilaza (E.C. 2.1.3.2) catalizează prima etapă specifică a căii
de biosinteză a UMP la nivelul organismelor din toate domeniile de viață – Archaea, Procaria și
Eucaria, la nivelul căreia are loc reglarea căii de biosinteză a nucleotidelor pirimidinice.
Din punct de vedere funcțional, ATCazele catalizează aceeași reacție la nivelul tuturor organismelor,
prezentâ nd în schimb un polimorfism structural remarcabil, existând 3 clase de enzime în funcție de
componența subunităților catalitice și reglatorii constituente.

Scopul acestei lucrări a fost obținerea aspartat transcarbamilazei combinante din tulpina bacterian ă
psihrofilă Rugamonas sp. PAMC27505, izolată dintr -un lac din Insula King George, Antarctica.

Obiectivele specifice urmărite în acest sens au fost:
1. Analiza structurală a secvenței de aminoacizi ai ATCazei din Rugamonas sp. PAMC27505.
2. Amplificarea genei pyrB care codifică pentru ATCază.
3. Clonarea genei pyrB care codifică subunitatea catalitică a ATCazei din tulpina psihrofilă în
vectorul pHAT2 și obținerea plasmidului pATCR.
4. Producerea ATCazei recombinante din tulpina psihrofilă de Rugamonas prin expresie genică
în Escherichia coli BL21(DE3) și optimizarea condițiilor de expresie sub formă de proteină
heteroloagă solubilă.