CAPITOLUL I. MICROORGANISMELE EXTREMOFILE: ASPECTE MICROBIOLOGICE ȘI BIOCHIMICE 1.1. CARACTERE GENERALE Extremofilele sunt organismele adaptate la… [631385]

CAPITOLUL I. MICROORGANISMELE EXTREMOFILE: ASPECTE MICROBIOLOGICE ȘI
BIOCHIMICE

1.1. CARACTERE GENERALE
Extremofilele sunt organismele adaptate la variații extreme de mediu, adaptare care se observă prin
capacitatea de a crește și a se dezvolta în parametrii optimi. Majoritatea extremofilelor sunt
microorganisme care trăiesc în condiții de mediu ostile pentru organismele superioare (ex. specia
umană). Într -o lucrare publicată în 1974, MacElroy a fost primul cercetător care a pus denumirea de
„extrem ofil” ( MacElroy, 1974 ); însă denumirile de extrem și extremofil sunt antropocentrice, din
simplul motiv că, din punctul de vedere al unui organism, mediul său de viață este acela la care este
adaptat, fiind astfel un mediu normal ( Horikoshi și Bull, 2011 ).
Organismele extremofile sunt capabile să supraviețuiască și să prolifereze în medii cu parametrii fizici
(temperatură, presiune, radiații) și geochimici (salinitate, pH, potențial redox) extremi. Marea
majoritate a extremofilelor aparține domeniului taxon omic Prokaria, aparținând domeniilor Archaea și
Bacteria ( Fig.1 ) (Horikoshi și Bull, 2011; Stan -Latter, 2012; Vermelho și colab ., 2015 ).
Există și organisme extremotrofe ( Muller și colab ., 2005 ), fiind mult mai diverse și având capacitatea
de a tolera și d e a crește în condiții extreme, însă nu pot crește optim în habitate extreme. Distincția
dintre extremofilie și extremotrofie poate evidenția mai multe probleme fundamentale ale studiilor
experimentale, precum: (1) metodele nepotrivite folosite în izolarea organismelor considerate
extremofile, (2) definirea extremofiliei unui organism fără o testare riguroasă și completă, (3)
extremofilie presupusă ce ar fi putut fii compromisă prin cultivări succesive în condiții de laborator și
(4) încercările nepotrivite pentru a determina dacă organismele au capacitate de adaptare doar în cazul
unor mici diferențe ale variabilelor din mediu ( Horikoshi și Bull, 2011 ).
Extremofilele și extremotrofele au fost clasificate în funcție de mediu l extrem în care acestea trăiesc
(Tabel 1. ), existând și subclasificări în funcție de gradul de extremofilie al fiecărui tip principal:
extremofile moderate, extreme, hiperextreme și/sau obligate. În plus, extremofilele prezintă
caracteristici structurale și metabolice diferite în funcție de mediul extrem în care acestea trebuie să
supraviețuiască ( Horikoshi și colab ., 2011; Seckbach și colab., 2013 ).
În general caracterizarea extremofilelor și a extremotrofelor se concentrează pe un singur mediu
extrem, însă multe extremofile se încadrează în categorii multiple – ex. organismele capabile să
trăiască în interiorul rocilor fierbinți aflate la mare adâncime de suprafața terestră. Fenomenul de
poliextremofilie și poliextremotrofie se referă la organismele adaptate să supraviețuiască în medii cu
cel puțin două condiții extreme ( Horikoshi și Bull, 2011 ).
În 2013, Capece și colaboratorii au catalogat peste 200 de specii de extremofile descrise în literatură,
din medii cu valori extreme de temperatură și pH, respectiv termoacidofile, termoalcalifile ,
psihroacidofile și psihroalcalifile. Deoarece fluiditatea membranară scade la temperaturi joase,
permeabilitatea scăzută față de protoni (H+) devine astfel un avantaj pentru acidofile și alcalifile.

Homeostazia pH -ului este controloată de mișcările H+ prin membrană. În natură însă, nu a fost
observată încă prezența psihroacidofilelor și a psihroalcalifilelor, ci doar a alcalifilelor psihrotolerante,
cum este cazul Alkalibacterium psychrotolerans (Capece și colab ., 2013; Yumoto și colab ., 2004 ).
Concent rații crescute de sare alături de temperaturi extreme au fost observate în ca zul
psihrohalofilelor. Multe me dii din mările de gheață polare sunt soluții reci, sărate, și astfel un anumit
grad de halofilie se găsește în general în psihrofile; adaptarea la r ece și la sare prezintă astfel caractere
comune ( Capece și colab ., 2013 ).
Din punct de vedere biotehnologic, enzimele poliextremofile au aplicații în industria alimentară, a
detergenților, substanțelor chimice și în industria hârtiei și materialelor celul ozice. De exemplu,
arheonul antarctic psihrohal ofil Halorubrum lacusprofundi produce o enzimă poliextremofilă
recombinantă, activă la temperaturi scăzute și salinitate crescută, fiind stabilă în amestec de solvenți
apoși organici; această enzimă este potri vită pentru aplicații ale chimiei sintetice ( Karan și colab.,
2013 ).

Fig.1: Arbore filogenetic al extremofilel or și caracteristicile de rezistență pentru fiecare specie. (după
Vermelho și colab ., 2015 )

Câteva caracteristici ale extremofilelor sunt impo rtante pentru obținerea de proteine recombinan te cu
proprietăți particulare . Avantajul principal al enzimelor din organisme psihrofile este consumul redus
de energie; astfel, psihrofilele ar putea fii utilizate în producerea proteinelor termolabile utiliza te în
ingineria genetică ( Vermelho și colab ., 2015; De Maayer și colab ., 2014 ).

1.2. MICROORGANISMELE PSIHROFILE
Conform Dicționarului de Microbiologie Generală și Biologie Moleculară ( Zarnea și Popescu, 2011 ),
microorganismele psihrofile au o largă răspândire, în particular în solul înghețat, zăpada și gheața din
regiunile polare, pe suprafața și în intestinul peștilor marini, dar și în izvoare, lacuri, râuri și în solul
din regiunile temperate. Cu toate că au o viteză de creștere lentă (ex. Methanogenium frigidum – 0,1
generații/zi, Methanococcoides burtonii – 0,3 generații/zi), psihrofilele prezintă o importanță deosebită
deoarece 75% din biosferă corespunde mediilor reci (alpine, polare, adâncul oceanelor – sub 1000 m
cu temperaturi între -5°C și 1°C), peșteri, subsuprafața terestră și marină, armosfera superioară etc.,
unde microorganismele psihrofile sunt abundente.
În 1975, Richard Morita a fost primul cercetător care a definit termenul de psihrofilie și a făcut
diferența dintre organismele psihrofile cu temperatură optimă de creștere sub 15°C și organismele
psihrotolerante capabile de creștere la temperaturi sub 15° C dar cu o rată de creștere mult mai rapidă
la temperaturi peste 25°C (Morita, 1975 ). Termenii de stenopsihrofil și euripsihrofil au fost descriși cu Tip de microorganism extremofil Mediu favorabil de creștere
Acidofil pH optim pentru dezvoltare ≤ 3 -4
Alcalifil pH optim pentru dezvoltare ≥10
Endolitic Trăiește în interiorul rocilor
Halofil Necesită cel puțin 1 M concentrație de sare
Hipertermofil Temperatura optimă de creștere ≥80°C
Hipolitic Trăiește în interiorul rocilor în deșerturile reci
Metalotolerant Tolerează niveluri crescute de metale grele (Zn, Cu, Cd, As)
Oligotrof Medii cu concentrație foarte scăzută de nutrienți
Piezofil Trăiește optim la presiuni hidrostatice ≥40 Mpa
Euripsihrofil (Psihrotolerant) Temperaturi peste 25°C, dar și sub 15°C
Stenopsihrofil (Psihrofil) Temperatura optimă ≤10°C, Temperatura maximă 20°C
Radiorezistent Organism rezistent la niveluri crescute de radiații ionizante
Termofil Creștere optimă între 60°C și 85°C
Toxitolerant Suportă niveluri crescute de agenți toxici, ex. solvenți
organici
Xerofil Crește în concenții scăzute de apă și rezistă la deshidratare
accentuată.
Tabelul 1. Caracteristicile microorganismelor extremofile și mediul lor de creștere. (adaptat după
Horikoshi și Bull, 2011 )

ajutorul fiziologiei animalelor ( Helmke și Weyland, 1995; Laucks și colab ., 2005; Rothschild și
Mancinelli , 2001; Cavicchioli, 2006 ).
Stenopsihrofilele – psihrofilele adevărate după Morita – sunt restrictive din punct de vedere al variației
mici de temperatură la care este posibilă creșterea, nefiind capabile să tolereze temperaturi mai mari de
25°C, în timp ce Euripsihrofilele – psihrotolerante după Morita – sunt capabile de creștere la variații
mult mai mari de temperatură, între -10°C sau mai mici și tolerând chiar temperaturi de peste 30°C.
Termenul de psihrofilie este utilizat astfel la modul general, pen tru a descrie orice organism care
prezintă activitate în medii cu temperaturi scăzute, mai exact temperaturi sub 5°C ( Mikucki și colab .,
2011 ).
Majoritatea psihrofilelor aparțin domeniilor Bacteria și Archaea, iar fenomenul de psihrofilie este
prezent în f oarte multe specii ale acestora . Studii recente au relevat existența unor grupuri noi de
cianobacterii, fungi și virusuri psihrofile ( Margesin și colab ., 2008 ).
Capacitatea bacteriilor de a se reproduce la 0°C a fost descrisă pentru prima dată de Foster în 1887
(Foster, 1887 ), iar în 1902 Schmidt -Nielsen a utilizat pentru prima dată termenul „psihrofil” pentru
acest tip de bacterii, luând în considerare însă doar temperatura minimă de creștere ( Schmidt -Nielsen,
1902 ). Datorită faptul că, în literatură, la v remea respectivă, nu existau date concrete despre psihrofile,
în Dicționarul de Microbiologie ( Jacobs și colab ., 1957 ) psihrofilele erau definite drept bacterii cu o
temperatură optimă de creștere de 15°C sau mai mică. Organismele care creșteau la 0°C au f ost
separate în două categorii: obligat psihrofile – capabile să crească la 0°C dar nu la 30°C, și facultativ
psihrofile – capabile să crească atât la 0°C cât și la 30°C, motiv pentru care s-a considerat că
psihrofilele se încadrau mai mult sau mai puțin î n categoria organismelor facultativ psihrofile ( Nogi,
2011 ).
În 1975, Morita a oferit o nouă definiție: „Psihrofilele sunt definite drept organisme cu temperatură
optimă de creștere și dezvoltate la ≤15°C, temperatură maximă de creștere la aproximativ 20° C, și o
temperatură minimă de creștere și dezvoltare de ≤0°C ” (Morita, 1975 ). Această definiție este utilizată
și în prezent, însă termenul de psihrotrof ic s-a transformat în psihrotolerant, iar variația temperaturilor
ar trebui reconsiderată datorită numă rului tot mai mare de bacterii psihrofile izolate din diferitele
habitate și în funcție de noile date ecologice ( Helmke și Weyland, 2004; Nogi, 2011 ).
Diferite stenopsihrofile izolate din Antarctica au fost studiate, cuprinzând genurile: Arthrobacter ,
Colw ellia, Gelidibacter , Glaciecola , Halobacillus , Halomonas , Hyphomonas , Marinobacter ,
Planococcus , Pseudoalteromonas , Pseudomonas , Psychrobacter , Psychroflexux , Psychroserpens ,
Shewanella și Sphingomona . Arheele metanogene sunt unicul grup cunoscut ca având specii
individuale capabile de creștere și dezvoltare la variații foarte mari de temperatură, între ≤0°C și
122°C ( Kurosawa și colab ., 2010; Siddiqui și colab ., 2013 ).
Pentru supraviețuirea în condiții de psihrofilie, organismele au dezvoltat o serie de st rategii de
adaptare pentru menținerea funcțiilor celulare la temperaturi scăzute (Rodrigues și Tiedje, 2008 ).
Astfel, psihrofilele prezintă mecanisme particulare pentru a putea contracara factorii suplimentari de

stres asocia ți cu mediile reci, precum deshidratare a, radiații le UV în exces, variații le de pH, presiune a
osmotică ridicată și lipsa nutrienților ( Morgan -Kiss și colab ., 2006; Tehei și Zaccai, 2005 ).

1.2.1. FAMILIA PSEUDOMONADACEAE
Familia Pseudomonadaceae este formată din chemoorganotrofi aerobi cu metabolism respirator,
majoritatea reprezentanților prezintă motilitate prin flageli, unele genuri intră în categoria fixatorilor
de azot – Azomonas și Azotobacter . Genul tip al familiei este genul Pseudomonas , însă familia
Pseudomonadaceae conține și g enurile: Azomonas , Azomonotrichon , Azorhizophilus , Azotobacter ,
Cellvibrio , Mesophilobacter , Rhizobacter , Rugamonas și Serpens (Skerman și colab ., 1980; Cornelis,
2008; Orla -Jensen, 1921 ).
Termenul de pseudomonad este derivat din grecescul pseudo care îns eamnă fals, și monad care
înseamnă o singură unitate, fiind utilizat încă de la începuturile microbiologiei pentru a definii
organismele unicelulare. Pseudomonadele sunt întâlnite și au fost izolate din foarte multe nișe
naturale, iar în 1894 a fost dată d enumirea generică de Pseudonomas , fiind însă definită în termeni
destul de vagi : gen de bacterii Gram -negative, cu formă de bacil și flageli polari.

1.2.1.1. GENUL Rugamonas
Genul Rugamonas aparține familiei Pseudomonadaceae, și a fost pentru prima dată descris și încadrat
în această familie de către Austin și Moss, când au descris și prima specie a acestui gen, Rugamonas
rubra (Austin și Moss, 1986 ). Termenul de Rugamonas este format din la tinul ruga care înseamnă
încrețitură, zbârcitură, și grecescul monad – unitate, traducându -se literalmente ca unitate zbârcită.
În cultură, celulele de Rugamonas se prezintă sub formă de bacil cu dimensiunile 0.8 -0.9 x 2.4 -4.0 µm.
După 7 zile, se formează granule intracelulare de prodigiozină. Celulele dintr -o cultură mai tânără de 7
zile sunt motile datorită unuia sau mai mul tor flageli polari sau subpolari. Coloniile crescute pe Agar
Bennett la 20șC, după 4 zile devin roz spre roșu închis, zbârcite și au consistență ca de cauciuc după 5
zile, și un diametru de aproximativ 3 mm.
Sunt bacterii oxidazo -catalază pozitive, strict aerobe, cu metabolism oxidativ, dar incapabile să
metabolizeze fermentativ carbohidrații. Reducerea nitraților la N 2 se face anaero bic. Creșterea se
realizează în prezența NaCl 0.0 -0.5% (v/v). Arginin decarboxilază negative. Unele tulpini sunt
capabile să producă lizin și ornitin decarboxilaze. Degradează esculina, chitina, gelatină, lecitină,
Tween 20, 40, 60 și 80, tirozină și uree; incapabile de a degrada alantoina, celuloza, elastina,
hipoxantina, amidon și xantină. Pe mediu T .S.I. (Triple Sugar Iron) agar nu produc H 2S. Testele
gluconat, citrat Koser și Beta -galactorzidază sunt pozitive; testele Voges -Proskauer, roșu metil și
malo nat sunt negative. Prima izolare s -a realizat din apa de râu ( Austin și Moss, 1986 ).
În urma studiilor realizate de Austin și Moss în 1984, s -a descoperit faptul că pe măsură ce cultura
îmbătrânește, celulele își pierd motilitatea, devening pleumorfice ( Austin și Moss, 1986 ). Consistența
ca de cauciu a coloniilor este caracteristică tuturor tulpinilor izolate de Rugamonas rugra obținute

până în prezent, precum și producția pigmenților roșii care aparțin familiei prodigiozinelor. În urma
experimentelor, s -a demonstrat că tulpina tip produce 6 -metoxi -2-metil -3-pentilprodigiozină
(prodigiozină) dar pigmentul predominant a fost analogul 3 -heptil ( Fig.2).

După incubare 14 zile pe Agar Bennett îmbogățit s -a observat că viabilitatea celulară scade brusc,
fiind corelată cu reducere de pH și supraproducere de prodigiozină, care poate fi observată sub formă
de incluziuni granulare închise la culoare, pe preparatele realizate pentru studiul motilității ( Austin și
Moss, 1986 ). Temperatura de creștere după 168 de ore variază între 1.2 -30.6°C, cu un optim de
creștere la 20°C, fără să se înregistreze creștere la 37°C. Temperaturile de cr eștere sunt sensibile la
perioada de incubare, și astfel, după 48 de ore, au fost înregistrate următoarele temperaturi: T minimă
5.6°C, T optimă 26.4°C și T maximă 30.6°C ( Moss, 1983 ). Una dintre cele mai importante
caracteristici ale tulpinilor genului Rugamonas este reprezentată de capacitatea acestora de a flocula în
culturile lichide și consistența similară cauciucului a coloniilor din mediu solid ( Austin și Moss, 1987 ).

1.2.1.2. SPECIA TIP Rugamonas rubra
Specia Rugamonas rubra sp. Nova a fost caracte rizată în urm ă cu trei decenii ( Austin și Moss,
1986 ).Termenul rubra provine din latinul rubra, însemnând roșu. Au formă de bacil, de dimensiuni
2.4-4.0×0.8 -0.9 μm și margini rotunjite. Granule intracelulare de prodigiozină se formează în celule
bătrâne, m ai vechi de 7 zile. Celulele tinere sunt motile, având unul sau mai mulți flageli polari sau
subpolari, în timp ce culturile bătrâne prezintă motilitate scăzută.
După 7 zile de cultivare în mediu lichid Bennett se formează floculi roz -roșii. Pe mediu agar Bennett,
la 20°C, celulele sunt albe, strălucitoare și circulare după 2 -3 zile, devin roz după 4 zile, și roșu închis,
încrețite și cu consistența ca de cauciuc după 5 zile, având și un diametru de aproximativ 3 mm.
Fig.2: Structura 6 -metoxi -2-metil -3-heptiprodigiozinei, produsă de tulpinile de
Rugamonas. (după Austin și Moss, 1987 )

Specie capabilă de a reduce nitrații la azot. Temperatura de creștere variază între 4°C și 30°C, având
temperatura optimă de 25°C. Creșterea se realizează doar în prezența a 0% -0.5% (v/v) NaCl și la un
pH cuprins între 5 și 9. R. rubra nu produc e arginin decarboxilaze, iar unele tulpini sunt capabile de a
produce lizin și ornitin decarboxilaze . Această specie degradează esculina, chitina, gelatina, lecitina,
Tween 20, 40, 60 și 80, tirozinaă și uree. Tulpinile de Rugamonas rubra produc β -galactoz idază și
fosfatază, însă nu H 2S și fenilalanin deaminaze. Testele gluconat și citrat Koser sunt pozitine, iar
testele Voges -Proskauer, roșu metil și malonat sunt negative. Produce enzimele alcalin fosfatază, acid
fosfatază, esteraze (unele tulpini), estera z-lipaze, leucin arilamidaze și fosfoamidaze.
Rugamonas rubra este sensibil ă la cloramfenicol (10 μg), clortetracicline (10 μg), eritromicină (10
μg), furazolidonă (50 μg), gentamicină (10 μg), kanamicină (30 μg), novobiocin (5 μg), oxitetraciclină
(10 μg ), streptomicină (10 μg), sulfafurazol (500 μg), tetraciclină (10 μg) și cotrimoxazol (25 μg).
Prezintă rezistență la: ampicilină (2 μg), cloxacilină (5 μg), colistin sulfat (10 μg), neomicină (10 μg),
nitrofurantoin (200 μg) și penicilin ă G (1.5 U.I.).
În ceea ce privește sursele de carbon utilizate pentru necesarul energetic, acestea sunt D(-)-alanină,
L(+)-arabinoză, DL -arginină, mezo -inozitol, DL -lactat de sodiu, celobioză, D( -)-fructoză, D(+) –
galactoză, L( -)-histidină, maltoză, D(+) -manoză, D( -)-rafino ză, D( -)-riboză, DL -serină, acetat de
sodiu, citrat trisodiu, D( -)-sorbitol, sucroză și trehaloză . Unele tulpini folosesc lactoza drept unică
sursă de carbon.
Conținutul molar de G+C% a ADN cromozomial pentru tulpina tip este de 66.7 ± 0.1 mol%.

1.2.2. ECOLOGIA PSIHROFILELOR
O mare parte a biosfer ei se află în permanență la temperatur i ≤5șC cuprinzând adâncul oceanelor,
solurile înghețate, ghețari , lacuri perene înghețate, gheață marină și calote de gheață polare (Priscu și
Christner, 2004 ; Anesio și Lay bourn -Parry, 2012 ). Totalitatea ghețarilor și calotel or glaciare ocupă
11% din suprafață terestră și reprezintă aproximativ 70% din suprafața de apă dulce a globului
(Shiklomanov, 1993; Paterson, 1994 ). Până recent, ecosistemele glaciare precum ghețarii, calotele de
gheață și unele lacuri perene înghețate au fost considerate ca lipsite de orice formă de viață, în
principal din cauza informațiilor limitate asupra capacității organismelor vii de a tolera mediile
extreme și datorită ideei că, în lipsa luminii , viața nu poate exista ( Mikuchi și colab., 2011 ).
Descoperirea vieții în mediile extrem de reci și izolate a modificat noțiunea de zone habitabile ale
Pămânului . Astfel , la sfârșitul anilor 1990 au fost descoperit e forme de viață la aproximativ 3590m
adân cime în ghețari ( Priscu și colab., 1999; Karl și colab., 1999 ) și în sedimente subglaciare ( Sharp și
colab., 1999 ). De asemenea , au fost găsite microorganisme în sedimentele din permafrost ( Rivkina și
colab., 2000 ) și în gheața marină ( Junge și colab., 200 4).
Fundamental în definirea rolului ecologic pe care îl au microorganismele în sistemele înghețate este
cunoașterea activității lor metabolice la temperaturi sub 0șC. Celulele latente din sistemele înghețate
sunt consumatoare de carbon, azot, fosfor și al ți nutrienți vitali spre deosebire de celulele metabolic

active care sunt participanți activi la ciclurile biogeochimice. Determinarea activității metabolice su b
temperatura de îngheț a apei ridică probleme metodologice , însă au fost dezvoltate mai multe metode
în încercarea de a măsura rata proceselor metabolice microbiene la aceste temperaturi scăzute
(Mikuchi și colab., 2011 ). În 2002, Christner a demonstrat, prin experimente de încorporarea ADN
radiomarcat și a unor molecule precursori proteici, faptul că celulele bacteriene pot să își conserve
componenții macromoleculari pe o durară mai lungă de timp (100 de zile) și la temperaturi foarte
scăzute, de -15șC ( Christner, 2002 ).
Lacurile subglaciale din Antarctica reprez intă unul dintre cele mai interesante sisteme subglaciale ,
până în prezent fiind descoperite mai bine de 145 lacuri subglaciale ( Siegert, 2005 ). Astfel de lacuri
sunt considerate ”active” și cel puțin o parte dintre ele sunt hidrologic conectate între ele, fiind
period ic secate (Fricker și colab., 2007; Wingham și colab., 2006 ).
Antarctica este al cincilea continent ca dimensiune, cu o suprafață totală de 14 milioane de km2, fiind
localizat la sud de Cercul Antarctic în mijlocul Oceanului Sudic. Mai bine d e 98% din suprafața
continentului este acoperită cu gheață, stratul de gheață având o grosime medie de 1.6 km. Astfel,
Antarctica reprezintă cel mai rece și mai secetos continent, cu condiții de mediu și climatice severe,
precum temperaturi extrem de scăzu te, umiditate atmosferică scăzută, absența aproape completă a apei
și perioade alternative de întuneric total cu prezență crescută a radiațiilor ( Kirby și colab., 2011 ).
Absența apei restricționează viața atât macroscopică cât și pe cea microscopică, iar E ucariotele
superioare sunt majoritar localizate la latitudinea nordică a Peninsulei Antarctice.
În ciuda climatului sever, există comunități microbiene care au reușit să se adapteze și să colonizeze
nișe specializate, inclusiv soluri lipsite de minerale, soluri ornitogenice îmbogățite, gheață din ghețari
și din calote, lacuri înghețate, roci, soluri încălzite geotermal, peșteri de gheață, venturi hidrotermale,
vulcani, corespunzând unor tipuri de mediu extrem, unde prezența eucariotelor superiore și a plan telor
nu este posibilă.

1.2.3 . MECANISME DE ADAPTARE LA TEMPERATURI SCĂZUTE
Adaptările moleculare la viața în mediile înghețate includ prezența unor proteine de șoc termic.
Proteinele de șoc termic, sau Cold -shock proteins (CSP) sunt proteine de dimensiun i mici care se leagă
la ARN pentru a proteja structura monocatenară împotriva stresului termic , au un domeniu de legare
pentru acizii nucleici, cunoscut sub numele de domeniul de șoc termic, sau cold shock domain (CSD),
și servesc în principal drept protei ne chaperon pentru ARN ( Jones și Inouye, 1994; Vermelho și colab .,
2015 ). ARN helicazele sunt reglate în timpul creșterii la temperaturi scăzute și au capacitatea de a
desface structura secundară într -o manieră ATP -dependentă în unele psihrofile ( Lim și colab., 2000 ).
Mecanismele de adaptare la mediu ale psihrofilelor implică și producerea de metaboliți secundari
activi la temperaturi scăzute, inducerea și activarea enzime lor la temperaturi scăzute , prezența
proteine lor anti-îngheț, producerea de pigmenți ș i fluiditate a membranară ( Casanueva și colab ., 2010;
De Maayer și colab ., 2014; Lorv și colab ., 2014 ). Din punct de vedere structural, proteinele acestor

organisme au o concentrație mult mai ridicată de α -helix față de β -strand, considerat un factor
import ant în menținerea flexibilității chiar și la temperaturi scăzute ( Madigan și colab ., 2014 ). În plus,
membranele citoplasmatice ale acestor microorganisme conțin o cantitate mult mai mare de acizi grași
nesaturați (52%) comparativ cu cea a microorganismelor mezofile (37%) și termofile (10%), ceea ce
favorizează menținerea stării semi -fluide a membranelor ( Deming, 2009 ).
Fluiditatea membranară este esențială pentru integritatea structurală și pentru funcționalitatea celulară.
Este bine cunoscut faptul că temp eraturile scăzute au un impact semnificativ asupra fluidității
membranelor, iar organismele capabile să crească la cele două extreme ale temperaturilor biotice și -au
dezvoltat mecanisme specifice pentru modificarea fluidității membranare ( Deming, 2002; Chi ntalapati
și colab ., 2004 ). În cazul microorganismelor psihrofile, adaptările la nivel membranar includ creșterea
raportului dintre acizi i grași polinesaturați și cei saturați la nivelul fosfolipidelor membranare,
modificări ale tipurilor de lipide constituente , reducerea dimensiunii și a sarcinii electrice a grupelor
lipidice principale ce ea ce afectează împachetările fosfolipidelor, și conversia din izomeria trans în
izomeria cis a acizilor grași ( Fig.3) (De Maayer și colab ., 2014 ).
Analize recent e ale transcriptomului coroborat e cu experimente fiziologice anterioare au demonstr at
faptul că expunerea la temperaturi scăzute provoacă o reglare rapidă a genelor implicate în biogeneza
membranară, precum biosinteza acizilor grași și a lipopolizaharidelo r (LPS) , biosinteza
peptidoglicanilor, a glicoziltransferazei și a proteinelor extramembranare ( Gao și colab ., 2012; Frank
și colab ., 2011 ). Studii genetice comparative au indicat faptul că genele implicate în biogeneza
membranelor celulare sunt suprarepre zentate în genomurile microorganismelor psihrofile ( Lauro și
colab ., 2008; D’Amico și colab ., 2002 ).
În cadrul studiilor proteomice și transcriptomice, s -a demonstrat faptul că proteinele de transport
membranar sunt la rândul lor supuse unor mecanisme de regla re suplimentare pentru contracararea
ratelor scăzute de difuzie de la nivelul membranelor celulare care au loc la temperaturi joase
(Bakermans și colab ., 2006; Cacace și colab ., 2010 ). Astfel , reglajul transportorilor de peptide
facilitează aclimatiza rea în cazul stresului la temperaturi scăzute și cel hiperosmotic prin îmbunătățirea
consumului de nutrienți, de soluți compatibili și reciclarea membranelor peptidice pentru biosinteza
peptidoglicanilor ( Cacace și colab ., 2010; Bakermans și colab ., 2006; Durack și colab., 2013 ). În
contra st, expresia genelor care codific ă structurile și proteinele extra membranare, precum flagelii,
proteinele chemotaxice și receptorii pentru ingerarea fierului, este în general supresată la temperaturi
scăzute ( Fig.3) (Dura ck și colab l., 2013;Piette și colab ., 2011 ).
Pigmenții carotenoizi reprezintă o altă clasă de modulatori ai fluidității membranare; atât pigmenți
carotenoizi polari cât și nepolari sunt produși de diferite bacterii Antarctice, și se consideră că
acționează drept tampon al fluidității membranare și că asistă la menținerea homeovâscozității în
timpul fluctuațiilor de temperatură ( Chattopadhyay, 2006; Rodrigues și Tiedje, 2008 ).
La nivel celular, î nghețul induce formarea cristalelor de gheață citoplasmatice, ceea ce duce la leziuni
celulare și dezechilibru osmotic. Acumularea de soluți compa tibili – glicină, betaină, sucroză și

manitol – are ca rezultat scăderea punctului de îngheț al citoplasmei, oferind astfel protecție împotriva
înghețului, deshidratării și hiperosmolarității ( Fig.3) (Casanueva și colab ., 2010; Cowan, 2009; Klähn
și Hage mann, 2011 ). Trehaloza poate prevenii denaturarea și agregarea proteinelor, înlătură radicalii
liberi și stabilizează membranele celulare în condiții de temperatură scăzută; în urma unei analize
transcriptomice a Escherichia coli s-a demonstrat că genele b iosintezei trehalozei, otsA și otsB, sunt
induse de condiții cu temperatură foarte scăzută ( Kandror și colab ., 2002; Phadtare și Inouye, 2004 ).
Unele psihrofile sintetizează proteine anti -îngheț (AFP, antifreeze proteins) care se leagă de cristalele
de gheață și controlează creșterea și recristalizarea acestora, prin diminuarea punctului de îngheț
(histerezis termic) ( Celik și colab ., 2013 ).
Sinteza de expolizaharide (EPS) reprezintă un alt potențial mecanism de crioprotecție, iar psihrofilele
sunt capabile de producerea unor cantități mari de EPS în condiții de temperaturi scăzute. Compoziția
crescută în polihidroxil a EPS scade punctul de îngheț și temperatura de cristalizare a apei. EPS pot în
același timp să capteze apă, nutrienți și ioni metalici, să faciliteze adeziunea celulară, agregarea
celulară și formarea de biofilme, și au rol în protejarea enzimelor extracelulare împotriva denaturării și
autolizei cauzate de temperaturile scăzute ( De Maayer și colab ., 2014 ).
Psihrofilia este determinată în principal, de natura enzimelor cu structură specială, ce le conferă
flexibilitate la temperaturi scăzute comparativ cu enzimele microorganismelor mezofile.

Fig.3: Adaptările fiziologice la temperaturi scăzute ale psihrofilelor. (după De Maayer și colab .,
2014 )

1.3. ASPECTE BIOCHIMICE PARTICULARE ALE PSIHROFILELOR
Nucleotidele pirimidinice su nt constituenți celulari la nivelul tuturor tipurilor de organisme Procariote
și Eucariote, contribuind în principal la sinteza de novo a acizilor nucleici, fiind implicate și în alte
procese metabolice importante. Majoritatea organismelor își asigură nece sarul de nucleotide
pirimidinice prin două căi metabolice: calea anabolică/sinteza de novo și calea catabolică/de salvare
(Zöllner, 1982 ).
Calea de biosinteză de novo a nucleotidelor pirimidinicee a fost intens studiată în cazul bacteriilor, în
particular Escherichia coli (Lipscomb, 1994 ) și a numeroase alte microorganism e aparținând
domeniilor Bacteria ( Schurr și colab ., 1995; Evans și colab ., 2002; Hayward și Belser, 1965; Hutson
și Downing, 1968 ), Archaea ( Bult și colab ., 1996; Durbecq și colab ., 1997 ) și a unor fungi ( Denis –
Duphil, 1989 ). De asemenea, s -au realizat studii ale diferitelor enzime aparținând acestei căi
metabolice la mamifere ( Hager și Jones, 1967; Tatibana și Ito, 1969 ), ceea ce a sugerat universalitatea
acestei secvențe metabolice în toa te organismele ( O’Donovan și Neuhard, 1970 ). Cu toate acestea,
numeroasele studii la nivelul enzimelor din microorganisme au fost cele care au permis elucidarea
biosintezei pirimidinelor ( O’Donovan și Neuhard, 1970 ).
Sinteza de novo a nucleotidelor citidin trifosfat ( CTP) și uridin -5’-trifosfat ( UTP ) are loc în urma unor
serii de reacții enzimatice utilizând precursori metabolici precum: glutamină, adenozin trifosfat ( ATP ),
bicarbonat, aspartat și fosforibozil pirof osfat (PRPP ) (Jones, 1980; Jones, 1970 ). Spre deosebire de
sinteza de novo , prin calea de salvare a pirimidinelor, uracilul eliberat din degradarea acizilor nucleici
este reciclat. Biosinteza de novo a uridin -5’-monofosfat (UMP ) are loc într -o serie de șase etape
distincte, catalizate fiecare de o singură enzimă ( Fig.4).
În primele două etape ale biosintezei nucleotidelor pirimidin ice are loc asamblarea structurii inelului
Carbamoil -Aspartat, cu ajutorul glutaminei, bicarbonatului, 2 molecule de ATP și aspartat. A treia
etapă implică o reacție de condensare constând în ciclizarea inelului pirimidinic cu formare de
dihidroorotat (DHO). Oxidarea DHO în etapa 4 produce orotat, care la rândul său reacționează cu
Ribozo -5’-fosfat de la fosforibozil pirof osfat (PRPP) pentru a forma orotidil monofosfat (OMP). În
urma decarboxilării se obține UMP, acesta fiind mai departe fosforilat la uridin difosfat (UDP ) și în
final UTP ( Jones, 1980; Jones, 1970 ). În cazul microorganismelor, cataliza fiecărei etape este realizată
de către o enzimă specifică.
Biosinte za nucleotidelor pirimidin ice reprezintă una dintre cele mai vechi căi metabolice, prezentă la
toate celulele. Cu toate că reacțiile și metaboliții intermediari au fost conservați în cursul evoluției,
structura enzimelor catalizatoare diferă în funcție de specie. Astfel, în cazul E.coli și Bacillus subtilis ,
enzimele care catalizează primele trei reacții – carbamoil fosfat sintetaza (CPSaza), aspartate
carbamoiltransferaza (ATCaza) și dihidroorotaza (DHOaza) sunt monofuncționale ca și în cazul
plantelor ( Kaseman și Meister, 1985; Potvin și colab ., 1975; Doremus, 1986 ) și al unor archee
hipertermofile ca Pyrococcus furiosus (Durbecq și colab ., 1997 ) și P. abyssi (Purcărea și colab .,
1996 ).

În cazul majorității fungilor, enzimele sunt bifuncționale, fiind al cătuite din domenii active pentru CPS
și ATC care interacționează cu o DHO nefuncțională ( Denis -Duphil, 1989 ). La mamifere, enzimele
care catalizează primele 3 reacții formează proteina multifuncțională CAD, cu subunitățile fuzionate
ale CPS, ATC și DHO ac tive ( Jones, 1970; Coleman și colab ., 1977; Shigesada și colab ., 1985;
Simmer și colab ., 1989 ). În urma studiilor structurale și funcționale ale acestor enzime din Bacteria,
Fungi și mamifere, Evans a sugerat corelarea asocierii prin fuzionare a acestor en zime cu
complexitatea de ansamblu a organismului gazdă.
În ciuda acestor diferențe, aceste enzime care catalizează primele 3 reacții ale sintezei nucleotidelor
pirimidinice din diferite organisme, prezintă o organizare omoloagă în domenii și subdomenii
enzimatice, o similaritate ridicată la nivelul structurii primare și conservarea amino acizilor care
constituie situsurile active ( Kaseman și Meister, 1985; Zollner, 1982; Potvin și colab ., 1975; Michaels
și colab ., 1987 ).

1.3.1. ASPARTAT CARBAMOILTRANSFERAZA
Organisme din toate domeniile – Archaea, Prokarya și Eukarya – produc și utilizează aspartat
carbamoiltransferaza (aspartat transcarbamoilaza, ATCaza, E.C. 2.1.3.2), enzimă specializată în
catalizarea reacției dintre carbamil fosfat și aspartat – utilizate ca substrat – pentru formarea N –
carbamoil -L-aspartatului – precursor în calea de biosinteză a pirimidinelor, cu eliberare de fosfat
anorganic ( Fig.5 ) (Jones și colab., 195 5).
Fig.4: Biosinteza de novo a nucleotidelor pirimidinice: enzimele aferente.

ATCaza catalizează prima etapă specifică a căii de biosintez ă a UMP, fiind astfel principalul situs de
reglare al căii de biosinteză pirimidinică din aceste organisme ( Cunin și colab ., 1985; Ladjimi și
colab ., 1985 ). Cele mai numeroase studii structural e și funcționale ale ATCazei au fost efectuate în
cazul enzimei din E. coli, devenind un model de studiu pentru enzimele alosterice ( Lipscomb și
Stevens, 1990 ).
Din punct de vedere genetic, subunitatea catalitică a ATCazei este codificată de către gena pyrB . În
cazul enzimei din E. coli , Perbal și Herv é au sugerat în 1972 că lanțurile polipeptidice catalitice și
reglatorii ale ATCazei sunt codificate de către cistronii pyrB și respectiv pyrI, care formează la rândul
lor un operon bicistronic, unde cistronul catalitic este promotor -proximal, experiment de monstrat și de
Roof și colaboratorii în 1982 ( Perbal și Hervé, 1972; Roof și colab., 1982 ).
ATCaza este o enzimă ubicuitară, catalizând aceeași reacție în absolut toate organismele, prezentând
însă un polimorfism remarcabil ( Purcărea și colab ., 2003 ). În f uncție de conținutul subunităților
catalitice (c) și reglato rii (r) constituente, ATCazele bacteriene au fost clasificate în:
1) ATC de clasă A – dodecamer de 480 kDa, alcătuit din doi trimeri catalitici și șase subunități
care sunt fie dihidroorotaze (cea de -a treia enzimă a căii de biosinteză pirimidinică) ca la
Thermus aquaticus (Van de Casteele și colab ., 1997 ), fie omologi inactivi ai DHO cum este în
cazul ATCazei de la Pseudomonas aeruginosa (Schurr și colab ., 1995; Evans și colab ., 2002 ).
2) ATC de clasă B – dodecamer de 310 kDa, format din doi trimeri catalitici și trei dimeri
reglatori care au rol în legarea efectorilor alosterici, ca de exemplu în cazul Escherichia coli
(Wiley și Lipscomb, 1968 ). Structura dodecamerică 2c 3:3r2 definește ATCaza de clasă B drept
holoenzimă și este conservată în toate ATCazele enterice ( Wild și colab ., 1980 ).
3) ATC de clasă C – cu o greutate moleculară de 100 kDa, este clasa de enzime specifică pentru
Bacillus subtilis , corespunde trimerilor catalitici liberi ai enzimei enteri ce – clasa B –
codificați de gena pyrB ; este formată din trei lanțuri polipeptidice identice de 34 kDa fiecare,
nu prezintă subunități reglatorii asociate și nici inhibiție/activare alosterică ( Schurr și colab.,
1995 ).
ATCaza din E. coli a fost purificată și cristalizată pentru prima dată în 1960, iar greutatea sa
moleculară a fost estimată pe baza măsurătorilor ratei de sedimentare, ca fiind de aproximativ 220 –
260 kDa ( Shepherdson și Pardee, 1960 ). Ulterior în 1964, Gerhart a determina t greutatea sa
Fig.5: Reacția chimică a celei de -a doua etape din calea de biosinteză a pirimidinelor, cu formarea
inelului Carbamoil -Aspartat.

moleculară (310 kDa) prin metode cristalografice ( Gerhart, 1964 ), și în 1965, împreună cu Schachman
au demonstrat faptul că holoenzima ATCază poate fi disociată în două tipuri de subunități distincte,
una de aproximativ 96 kDa având activita te catalitică (subunitatea catalitică, c) iar cea de -a doua de 30
kDa fără activitate catalitică, dar prezentând situsuri de legare pentru nucleotide, fiind denumită
subunitate reglatorie ( Gherhart și Schachman, 1965 ).
În 1968 Weber a determinat secvența în aminoacizi a subunității reglato rie calculând greutatea
moleculară a acesteia (17 kDa) (Weber, 1968 ). Studiile au indicat faptul că holoenzima conține șase
subunități reglato rii cu rol în legarea efectorilor alosterici ATP, CTP și UTP ( Weber, 1968; Wild și
colab ., 1989; Lipscomb, 1994 ). Pe baza studiilor de cristalografie și a măsurătorilor de masă
moleculară, s -a putut deduce structura cuaternară dodecamerică a ATCazei ( Wiley și Lipscomb, 1968 ).
Astfel holoenzima este compusă din doi trimeri catalitici și trei dimeri reglatori, având structura
cuaternară c 6r6 și arhitectură 2(c 3)3(r 2). Acest aranjament relativ a fost descoperit în forma tensionată
(T) de cristal la o rezoluție de 5.5 Å, cu simetrie structurală D 3 (Fig.6) (Wiley și colab ., 1972 ).
Struct ura cristalografică a ATCazei din E. coli a condus la identificarea situsurilor active localizate la
nivelul subunităților catalitice , și a situsurilor de legare a inhibitorului alosteric CTP și a activatorului
ATP la nivelul subunității reglato rie, în c oncordanță cu studiile anterioare de mutageneză dirijată
(Fig.7) (Kosman și colab ., 1993; Lipscomb și Kantrowitz, 2012 ).
În cazul enzimei native din E. coli , în urma legării la subunitățile reglato rii, produsul metabolic final
CTP are efect inhibitor de ti p feedback, în timp ce ATP provenit din calea de sinteză a nucleotidelor
purin ice realizează activarea ATCazei. UTP poate de asemenea să inhibe ATCaza, dar are efect doar
în prezența CTP ( Wild și colab ., 1989 ).
Din punct de vedere catalitic, legarea substraturilor la situsurile catalitice este cooperativă și permite o
modulare alosterică a activității enzimei ( Kantrowitz și Lipscomb, 1990 ). Funcțional, ATCaza din
Escherichia coli este un model de studiu datorită complexității metodelor de reglaj alosteric, care
implică atât efectele homotropice ale interacțiilor dintre liganzi identici (ex: legarea cooperativă a
diferitelor substraturi), cât și efectele heterotropice dintre liganzi diferiți (ex: substrat și efecto ri)
(Kantrowitz și Lipscomb, 1990; Endrizzi și colab ., 2000 ).
Reglarea ratei unei căi metabolice cu ajutorul enzimelor alosterice este un mecanism foarte important
în controlul celular. Enzimele alosterice, cum este cazul ATCazei, joacă un rol pivotal în m etabolismul
celular, deoarece au trei mari funcții: catalizează o reacție metabolică unică, modifică rata catalizei ca
răspuns la condițiile celulare și sunt responsabile pentru rata întregii căi. Reglajul ATCazei implică
legarea moleculelor de semnalizare la nivelul situsului reglator, iar această legare induce mai departe o
alterare a ratei activității catalitice ( Lipscomb și Kantrowitz, 2012 ).

Proprietățile cinetice ale enzimei native din E. coli au indicat o legare cooperativă, aspartatul având
S0.5 = 5.5 mm, în timp ce curba de saturație a carbamil fosfatulu i este hiperbolică ( Gherhart și
Pardee, 1962; Kleppe, 1966; Reichard și Hanshoff, 1956; Yates și Pardee, 1956 ). În 1968, Bethell și
colaboratorii, au demonstrat, că cea mai mică concentrație de carbamil fosfat testată, de 0.3 mm,
determină o rată de reacți e de 80% din viteza maximă, și au folosit în acest sens o probă cu
radioactivitate mult mai sensibilă și carbamil fosfat în concentrații mult mai mici pentru a demonstra
curba sigmoidală viteză -substrat dependentă a carbamil fosfatului ( Bethell și colab., 1968 ). Diagrama
A.
B.
Fig.6: Structura cuaternară c 6r6 și arhitectura 2(c 3)3(r 2) a ATCazei din E. coli compusă din trimeri
catalitici (roșu) și dimeri reglatori (albastru), cu simetrie structural D 3 (A) vedere frontală. (B)
vederea laterală a holoenzimei, cu poziționarea trimerilor catalitici deasupra și dedesubtul celor
trei dimeri reglatori (după Honzatk o și colab ., 1982 ).
Fig.7: ATCaza din E.coli , în configurație alosterică R, și simetrie globală D 3. Se observă cu
roșu și albastru legarea moleculelor de ATP la nivelul dimerilor reglatori. (după Cockrell și
colab ., 2013 ).

Lineweaver -Burk a enzimei native pentru carbamil fosfat este liniară până la 0.14 mM, iar pe măsură
ce concentrația substratului scade, curba devine rapid concavă ( O’Donovan și Neuhard, 1970 ).
Pentru acest substrat, Km aparent este 0.2 mm, comparativ cu Km 0.05 mM a carbamil fosfatului
pentru subunitatea catalitică ( Bethell și colab., 1968 ). Astfel, atât aspartat cât și carbamil fosfatul
determină modificări ale interacțiunilor dintre subunitățile enzimei native ATCază, creând efecte de
legare cooperativă și cinetică sigmoidală a saturației ( O’Donovan și Neuhard, 1970 ). Adiția CTP ca
inhibitor de tip feedback crește sigmoidicitatea curbei de saturație a carbamil fosfatului și aspartatului;
în cazul concentrațiilor mari de carbamil fosfat, C TP scade afinitatea pentru aspartat a ATC, iar pe de
alta parte, la concentrații crescute de aspartat, CTP scade afinitatea pentru carbamil fosfat a ATC.
Când ambele substrate sunt saturate, nu se observă nici un fel de inhibiție ( Bethell și colab., 1968;
Gerhart și Pardee, 1962; Gerhart și Pardee, 1964 ). CTP este astfel inhibitor competitiv pentru
ATCază, iar inhibiția este determinată de concentrațiile ambelor substrate alosterice, carbamil fosfat și
aspartat ( Bethell și colab., 1968 ).
În urma experimente lor pe enzima nativă din E. coli cu 1.0 M uree sau pH crescut, Weitzman și
Wilson au raportat o pierdere a cineticii sigmoidale chiar dacă sensibilitatea pentru inhibiția CTP nu a
dispărut ( Weitzman și Wilson, 1966 ). În urma tratamentelor enzimei native cu compuși mercurici
aceasta devine insensibilă la CTP ( O’Donovan și Neuhard, 1970 ). Desensibilizarea este acompaniată
de disocierea ATCazei native în subunități, dintre care una conține toată activitatea catalitică , cu un
coeficient de sedimentare de 5.8S ș i fără să aibe situsuri reglatorii pentru CTP, fiind denumită
subunitate catalitică ( Gerhart, 1964; Gerhart și Schachman, 1965 ). Această subunitate este insensibilă
la inhibitorul CTP cât și la activatorul ATP, are o greutate moleculară de 100,000 Da (Gerh art, 1964 ),
iar Weber a estimat greutatea moleculară a unui lanț catalitic la 33 -34,000 Da, astfel că subunitatea
catalitică conține trei situsuri de legare și este un trimer ( Weber, 1968 ). În 1969 s -au realizat o serie de
studii cinetice asupra subunități i catalitice a ATC ( Collins și Stark, 1969; Porter și colab., 1969;
Schmidt și colab., 1969 ). Legarea substraturilor de subunitate este ordonată, carbamil fosfat fiind
primul care se leagă, urmat de aspartat, carbamil aspartatul disociază primul și apoi fo sfatul ( Collins și
Stark, 1969; Porter și colab., 1969; Schmidt și colab., 1969 ).
Cel de -al doilea tip de subunitate, izolat în urma tratamentului cu p -hidroximercuribenzoat, este o
proteină fără activitate catalitică, mai mică, neesențială pentru activita tea subunității catalitice, cu un
coeficient de sedimentare de 2.8S, conținând toate situsurile pentru reglarea de către CTP, fiind astfel
denumită subunitate reglato rie (Gerhart, 1964; Gerhart și Schachman, 1965 ). Subunitatea reglato rie
este stabilă, fiin d capabilă să își mențină afinitatea pentru efectorii CTP și ATP, iar atunci când agenții
disocianți sunt îndepărtați, subunitatea nu agregă ( Gerhart și Schachman, 1965) .
În studiile asupra structurii primare a ATC, Weber ( Weber, 1968 ) a determinat secven ța de amino
acizi a subunității reglato rie, precum și greutatea moleculară (17,000 Da) a acesteia, prin denaturare cu
SDS. Ținînd cont de faptul că, în urma tratamentului cu p -hidroximercuribenzoat, subunitatea
reglato rie disociată prez intă o greutate moleculară de 30 -36,000 Da ( Gerhart și Schachman, 1965;

Gerhart și Schachman, 1968 ), este foarte probabil să existe două lanțuri polipeptidice reglatorii per
subunitate izolată ( O’Donovan și Neuhard, 1970 ).
Subunitatea reglato rie izolată forme ază homodimeri, și reprezintă o clasă de proteine produs ă de către
celulă pentru controlul activității catalitice ( Gerhart și Schachman, 1965 ). Acest control prezintă două
caracteristici pertinente: (I) o fracție mare a proteinei totale ATC (32%) este impl icată exclusiv în
acest reglaj, și (II) prezența subunității reglato rie reduce activitatea catalitică a enzimei native
(O’Donovan și Neuhard, 1970 ).
Disocierea ATCazei native de către compușii mercurici este reversibilă prin adăugarea compusului
sulfidril mercaptoetanol ( Gerhart și Schachman, 1965 ). Enzima reconstituită este similară cu cea
nativă din care a disociat inițial, din punct de vedere al dimensiunii moleculare (11.8S), se nsibilității
față de CTP și pro prietăților catalitice; ceea ce indică faptu l că enzima nativă este capabilă de agregare
spontană ( Gerhart și Schachman, 1965 ).
Deși calea de biosinteză a nucleotidelor pirimidinice prezintă etape comune în toate organismele,
caracteristicile structurale și funcționale diferă în funcție de specie (O ’Donovan și Neuhard, 1970).
Astfel, Jones și colaboratorii au descoperit în urma studiilor realizate asupra ATCazei din specii de
Pseudomonas ( P. aeruginosa și P. fluorescens ), că atât CTP cât și UTP realizează inhibiție de tip
feedback, aceasta fiind comp etitivă cu carbamil fosfat și nu cu aspartat ( Bethell și Jones, 1969;
Neumann și Jones, 1964 ). În cazul enzimei din P. aeruginosa tulpina PA01, activitatea ATCazei este
inhibată de către UTP, în competiție cu aspartatul ( Isaac și Holloway, 1968 ). În cazul Pseudomonas
aeruginosa , tratamentul cu p -hidroximercuribenzoat nu a produs separarea ATCazei din această specie
în subunitățile catalitice și reglato rii, în schimb acest tratament a dus la scăderea în paralel a acestor
funcții ( O’Donovan și Neuhart, 1970 ).
ATCaza din Pseudomonadaceae este o enzimă de clasă A identificată pentru prima dată de Jones și
Adair în 1972 ( Adair și Jones, 1972 ), fiind alcătuită din șase lanțuri catalitice de 36 kDa și șase lanțuri
polipeptidice, cu funcție necunoscută, de 45 kDa, c u structura primară omologă dihidroorotazei, însă
fără activitate catalitică ( Evans și colab., 2002 ). S-au realizat experimente cu scopul de a disocia
subunitățile catalitice de subunitățile pseudo -dihidroorotază (pDHO), și de a realiza expresia
subunități i catalitice, însă au fost fără succes, ceea ce sugerează că subunitățile pDHO sunt absolut
necesare pentru asamblarea complexului proteic ( Dutta și O’Donovan, 1987 ).
Primele studii realizate în cazul ATCazei din Pseudomonas fluorescens (Adair și Jones, 19 72) au
sugerat că această moleculă este un dimer, însă în 1993 a fost demonstrată structura de dodecamer
formată din șase lanțuri catalitice de 36 kDa și șase lanțuri polipeptidice, cu funcție necunoscută, de 45
kDa ( Bergh și Evans, 1993; Shepherdson și Mc Phail, 1993 ). În urma experimentelor de clonare și
secvențializare a genelor care codifică ATCaza din Pseudomonas putida și P. aeruginosa (Schurr și
colab. , 1995; Vickrey, 1993 ), s-a demonstrat faptul că lanțurile de 36 kDa sunt omoloage lanțurilor
catalit ice din alte ATCaze caracterizate anterior, însă secvența polipeptidică de 45 kDa este mai
asemănătoare cu DHOaza bacteriană, enzimă ce catalizează etapa imediat următoare din calea de

biosinteză a nucleotidelor pirimidinice. Cu toate acestea, complexul en zimatic nu prezintă activitate
dihidroorotazică, motiv pentru care polipeptidul de 45 kDa a fost denumit pseudo -DHOază, analog
domeniului omolog inactiv găsit în proteina multifuncțională de la drojdii, codificată de locusul ura2
(Souciet și colab., 1989 ).
Reglajul enzimei din Pseudomonas este neobișnuit, în sensul că enzima este inhibată de concentrații
scăzute ale tuturor nucleotidelor trifosfat ( Adair și Jones, 1972; Bergh și Evans, 1993 ). Conservarea
completă de la nivelul ATCazei din P. aeruginosa, a tuturor rezidurilor implicate în cataliza
subunității catalitice din enzima nativă din E. coli , sugerează că cele două enzime împărtășesc un
mecanism catalitic comun ( Evans și colab., 2002 ).
ATCaza din E. coli , enzimă de clasă B, poate fi disociată cu ajut orul compușilor mercurici în doi
trimeri activi din punct de vedere enzimatic și trei dimeri reglatori, iar în baza studiilor structurale
realizate în decursul anilor, s -a demonstrat faptul că toate rezidurile necesare pentru legarea
substratului și pentru cataliză sunt prezente la nivelul lanțului catalitic, iar situtul activ este compus din
amino acizii localizați la nivelul interfe ței a două lanțuri catalitice adiacente din același trimer ( Evans
și colab., 2002 ). ATCaza de clasă C din Bacillus subtilis (Barbson și Switzer, 1975 ) și domeniul ATC
izolat din proteina multifuncțională mamaliană CAD ( Grayson și Evans, 1983; Maley și Davidson,
1988 ) sunt ambele trimeri cu activitate catalitică, indicând faptul că activitatea catalitică se desfășoară
la nivelul homotrimerului catalitic.
În contrast, încercări anterioare de a exprima subunitatea catalitică a ATCazei din Pseudomonas prin
deleția genei pyrC’ care codifică pDHO, au dus la crearea de plasmide incapabile de
complementaritatea tulpinilor de E. coli cu deficiență de ATCază ( Schurr și colab., 1995 ). În
consecință, spre deosebire de subunitatea catalitică a enzimelor de clasă B sau C, subunita tea catalitică
a enzimei din Pseudomonas aeruginosa este inactivă în absența lanțurilor pDHO ( Schurr și colab.,
1995 ).
Aquifey aeolicus , microorganism capabil de creștere la 95șC, este o eubacterie hipertermofilă ocupâ nd
una din tre primele ramificaț ii ale arborelui filogenetic procariot (Deckert și colab., 1998 ). ATCaza din
Aquifex aeolicus este un homotrimer format din lanțuri catalitice de 34 kDa, fără interacții
homotropice sau heterotropice datorită absenței subunităților reglato rii (Purcărea și colab. , 2003 ). În
urma clonării și expresiei î n E. coli a genei pyrB care codifică pentru ATCaza din acest hipertermofil,
și a purific ării proteinei recombinante rezultate, propriet ățile catalitice ale acesteia au indicat fa ptul că
valorile Km pentru ambele sub strate, carmabil fosfat și aspartat, sunt cu 30 -40% mai scăzute față de
valorile Km ale subunității catalitice ale ATCazei din E. coli , indic ând o afinitate aparent ă ridicat ă
pentru cele dou ă substrate (Purcărea și colab., 2003 ). Modelarea structurii tridi mensionale și analiza
structurii primare au confirmat conservarea amino acizilor constituen ți ai situsului activ al ATCazei
din A. aeolicus cu cei din ATCaza din E. coli (Purcărea și colab., 2003 ).
Activitatea ATCazei prezentă în hipertermofilul A. aeolicu s crește odată cu creșterea temperaturii fără
să existe vreo modificare a Km pentru substraturile carbamil fosfat și aspartat ( Purcărea și colab.,

2003 ). Pentru evitarea degrad ării termice rapide a carbamil fosfatului generat in situ de carbam oil
fosfat sintetaza (CPSaza) din A. aeolicus , acest produs intermediar de reacț ie est e transferat la situsul
de reacț ie al ATCazei printr -un proces de canalizare directă (channeling ) (Purcărea și colab., 2003 ).
Afinitatea relativă crescută pentru substrate și transferul direct al carbamil fosfatului de la situsul activ
al CPSazei la cel al ATCazei , contribuie la protejarea metabolitului împotriva degradării la temperaturi
ridicate și prev ine formarea cianatului, un agent alkilant toxic ( Allen și Jones, 1964; V an de Casteele
și colab., 1990 ).
Studiul ATCaz ei din tulpina bacteriană psihrofilă TAD1, izolată din apele continentale înghețate din
Antarctica, a indicat o activitate deosebit de ridicată a enzime i la temperaturi scăzute, fiind cu 26%
mai crescută la 0șC , decăt la 30ș ȘI COLAB C (Sun și colab., 1998 ). Spre deosebire de ATCaza din E.
coli, proprietățile cinetice ale enzimei din TAD1 sugerează că activitatea crescută în cazul
temperaturilor scăzute se datorează eficienței catalitice crescute, proprietate ce a r putea fi rezultatul
direct al unor modificări discrete localizate la nivelul situsului catalitic, deoarece această enzimă
psihrofilă este la fel de stabilă la temperaturi crescute precum enzima omoloagă din bacteria mezofil ă
Escherichia coli (Sun și cola b., 1998 ).
Aceste modific ări de la nivelul situsului catalitic al ATCazei psihrofile nu schimbă stabilitatea termică
globală a proteinei (Feller și colab., 1990; Smalås și colab., 1994; Ciardiello și colab., 1995, 1997a ,
1997b ). ATCaza din bacteria psihro filă TAD1 are capacitatea de a cataliza carbamilarea grupării
amino a aspartatului la temperaturi scăzute, fiind o enzimă supusă reglajului alosteric ( Sun și colab.,
1998 ) prin inhibare de tip feedback de c ătre CTP și UTP. Spre deosebire de ATCaza din E. coli, ATP
nu prezint ă efect activator asupra enzimei din tulpina psihrofil ă TAD1 ( Thiry și Hervé, 1978 ).

CAPITOLUL II. MATERIALE ȘI METODE

2.1. MATERIALE ȘI METODE MICROBIOLOGICE
2.1.1. Tulpina Rugamonas sp.
Tulpina bacteriană Rugamonas sp. PAMC27505 aparținând colecției microbiene a Institutului de
Cercetare Polară Sud -Korean (Korea Polar Research Institute – KOPRI), a fost izolată dintr -un lac din
Insula King George, Insulele South Shetland, Antarctica.

2.1.2. Medii de cultură
Pentru cultivarea tulpinii de studiu Rugamonas PAMC27505, am utilizat următoarele tipuri de medii
de cultură ( Tabelul 2 .).
Mediul de cultură Compoziție
Agar Reasoner 2A (R2A) 0.5 g/L Yeast extract
0.5 g/L Casein acid hydrolysate
0.5 g/L Proteose peptone
0.5 g/L Starch soluable
0.5 g/L Glucoză
0.3 g/L Dipotassium phosphate
0.024 g/L Magnesium sulphate
0.3 g/L Sodium pyruvate
15.0 g/L Agar
pH 7.2 ± 0.2 la 25 °C
Reasoner 2A Lichid (R2A Broth, R2B) 0.5 g/L Yeast extract
0.5 g/L Casein acid hydrolysate
0.5 g/L Proteose peptone
0.5 g/L Starch soluable
0.5 g/L Glucoză
0.3 g/L Dipotassium phosphate
0.024 g/L Magnesium sulphate
0.3 g/L Sodium pyruvate
pH 7.2 ± 0.2 la 25 °C
Agar Luria Bertani (LB Agar) 10 g/L Triptonă
5 g/L Extract de drojdie
10 g/L NaCl
15 g/L Agar
pH 7.5
Mediu lichid Luria Bertani (LB) 10 g/L Triptonă
5 g/L Extract de drojdie
10 g/L NaCl
pH 7.5
Tabelul 2: Medii lichide și solide de cultură utilizate pentru cultivarea Rugamonas PAMC27505

2.1.3. Condiții de cultivare
Tulpina bacteriană Rugamonas PAMC27505 a fost cultivată în mediu R2B, la 15°C timp de 48 de ore.
Cultura bacteriană obținută a fost în continuare transferată pe mediu solid R2A și cultivată tot la 15șC
timp de 7 zile.
Alternativ, cultivarea tulpinii s -a realizat în mediu LB sau LB -agar, la 17șC timp de 48 de ore și
respectiv 7 zile, pentru a putea determina dacă tulpina bacteriană Rugamonas PAMC27505 este
capabilă de creștere și dezvoltare și pe alt mediu față de cel specific pentru bacteriile provenite din
surse de apă.
Culturile li chide în R2B și LB au fost prezervate la -80șC în prezență de 50% glicerol (v/v) ( SC. EL –
CHIM SRL ).

2.2. MATERIALE ȘI METODE MOLECULARE
2.2.1. Extracția ADN genomic și plasmidial
ADN genomic a fost extras din cultura de Rugamonas PAMC27505 cu ajutorul kit ului DNeasy
Blood&Tissue Kit (QIAGEN), printr -un procedeu modificat care a adăugat o etapă preliminară de liză
celulară chimică cu mutanolizină (5 U/µL) timp de 1 oră la 37șC. A urmat o altă etapă de liză
mecanică, în prezența unor biluțe din ceramică cu d iametrul de 0.4 -0.6 mm și 1.4 -1.6 mm
(innuSPEED Lysis Beads, AnalytikJena). Liza mecanică s -a realizat în Omogenizatorul SpeedMIill
PLUS (AnalytikJena) cu programul standard pentru Bacteria.
După extracția ADN genomic și determinarea concentrației și a pu rității A260/A280 prin metodă
spectrofotometrică cu ajutorul aparatului NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), a fost realizat o etapă
inițială de amplificare prin PCR cu ajutorul DreamTaq DNA polimeraza (Thermo Scientific), cu
amorse specifice ( Tabelul 3.) pentru gena 16S bacteriană, utilizând un amestec de reacție ( Tabelul 4. )
și un protocol de amplificare ( Tabelul 5. ) specifice pentru polimeraza folosită.
Vectorul de clonare și expresie bacteriană pHAT2 a fost amplificat utilizând kitul Zyppy Plasmid
Minipre p Kit (Zymo Research ) conform protocolului standard. Pentru aceasta s -a utilizat o cultură de
E. coli DH5α transformată cu pHAT2 (1 mL) incubată la 37șC timp de 16 ore în mediu LB conținând
100 µg/mL ampicilină.
Concentrațiile (ng/μL) au fost determinate cu ajutorul Sectrofotometrului BioDrop Duo (BIODROP).

Amorse Secvențe oligonucleotidice
8F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’
1512R 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT -3’
Tabelul 3: Setul de a morse Forward ( 8F) și Revers ( 1512R ) utilizate pentru verificarea
integrității genei 16S bacteriană din tulpina Rugamonas sp. PAMC27505 .

2.2.2. Clonarea genei prin amplificare PCR (Polymerase Chain Reaction)
Clonarea în Esherichia coli a genei de interes pentru ATCază, pyrB , s-a realizat într -o serie de etape
succesive, în fiecare etapă fiind utilizate kituri de reacție sau reactivi specifici. Clonarea genei s -a
realizat prin amplificare PCR și ligar e în vectorul de expresie bacteriană pHAT2 (Invitrogen). Pentru
amplificarea genei de interes am utilizat un set de amorse specifice (Eurogentec) ( Tabelul 6. ), urmând
protocoale diferite pentru cele două tipuri de ADN polimeraze utilizate, DreamTaq DNA Pol ymerase
(5 U/ μL) și Pfu DNA Polymerase (2.5 U/ μL, recombinant), ambele achiziționate de la
ThermoScientific.
Amestecurile de reacție ( Tabelul 7. ) și condițiile de reacție ( Tabelul 8. ) utilizate pentru amplificarea
PCR a genei, sunt indicate atât pentru etapa de determinare a condițiilor optime de amplificare în care
s-a folosit DreamTaq DNA polimeraza, cât și pentru etapa finală de obținere a ampliconului pentru
clonare în care s -a utilizat Pfu DNA polimeraza. Amplificarea genei pentru clonare s -a realizat în
prezență de Pfu DNA polimerază datorită ratei scăzute de erori de amplificare a acestei polimeraze. DreamTaq DNA Polimeraza
Reactiv Concentrație
10X DreamTaq Buffer 2.5 μL
dNTP amestec 0.2 mM
8F 0.4 μM
1512R 0.4 μM
ADN 3.2 ng
DreamTaq DNA Polymerase 1.25 U
ddH 2O până la 25 μL
Volum final 25 μL
DreamTaq DNA Polimeraza
Etapă Temp ( șC) Timp de
reacție Nr. de
cicluri
Denaturare Inițială 95°C 2 min 1 ciclu
Denaturare 95°C 30 sec 30 de
cicluri Hibridare amorse 60°C 30 sec
Extensie 72°C 1 min 30 sec
Extensie Finală 72°C 5 min 1 ciclu
Tabelul 4: Amestecul de reacție utilizat pentru amplificarea genei 16S.
Tabelul 5: Condițiile de reacție pentru amplificarea prin PCR a genei 16S.

Pentru realizarea amplificării PCR a genei de interes a fost utilizat aparatul Mastercycle proS
vapo.protect (Eppendorf). Ampliconul obținut a fost purificat cu ajutorul kitului PureLink PCR
Purification Kit (Invitrogen) urmărind protocolul standard.
Atât vectorul pHAT2 cât și produsul PCR obținut au fost supuși unei etape de digestie enzimatică cu
enzime de restricție FastDigest NcoI/Hind III (Thermo Scientific) la 37 șC timp de 2 ore ( Tabelul 9. ),
iar produșii rezultați au fost purificați cu PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen). DreamTaq DNA Polimeraza Pfu DNA Polimeraza
Reactiv Concentrație Reactiv Concentrație
10X DreamTaq Buffer 5 μL 10X Pfu Buffer 5 μL
dNTP amestec 0.2 mM dNTP amestec 0.2 mM
PyrBR 0.5 μM PyrBR 0.5 μM
PyrBF 0.5 μM PyrBF 0.5 μM
ADN 6.4 ng ADN 12.8 ng
DreamTaq DNA Polymerase 1.25 U Pfu DNA Polymerase 1.25 U
ddH 2O până la 50 μL ddH2O până la 50 μL
Volum final 50 μL 50 μL Amorse Secvențele oligonucleotidice Situs de restricție
505PYRBF 5’-ATAT CCATGG TTAATCCGCAACTG -3’ NcoI (CCATGG)
505PYRBR 5’-TATG AAGCTT CATCCTTGATTTCCCG -3’ HindIII (AAGCTT)
DreamTaq DNA Polimeraza Pfu DNA Polimeraza
Etapă Temp
(șC) Timp de
reacție Nr. de
cicluri Temp
(șC) Timp de
reacție Nr. de
cicluri
Denaturare Inițială 95°C 2 min 1 ciclu 95°C 2 min 1 ciclu
Denaturare 95°C 30 sec 30 de
cicluri 95°C 30 sec 30 de
cicluri Hibridare amorse 56°C 30 sec 56°C 30 sec
Extensie 72°C 1 min 30 sec 72°C 3 min
Extensie Finală 72°C 5 min 1 ciclu 72°C 10 min 1 ciclu
Tabelul 7: Amestecul de reacție utilizat în cazul celor două polimeraze.
Tabelul 8: Condițiile de reacție pentru PCR.
Tabelul 6: Setul de amorse Forward (505PYRBF) și Revers (505PYRBR) utilizate pentru
amplificarea genei de interes pyrB din tulpina Rugamonas sp. PAMC27505 .

În urma digestiei enzimatice, vectorul pHAT2 a fost defosforilat cu ajutorul FastAP Thermosensitive
Alkaline Phosphatase (Thermo Scientific). Amestecul de reacție ( Tabelul 10 .) a fost incubat la 37 șC
timp de 10 minute pe Termobloc (Eppendorf) și reacția a fost stopată prin incubare la 75 șC timp de 5
minute.

Ligarea insertului la vectorul pHAT2 deforforilat s -a efectuat în prezența ligazei T4 DNA Ligase (5
Weiss U/ μL, Thermo Scientific) . Amestecul de ligare ( Tabelul 11 .) a fost incubat la temperatura
camerei (20 șC – 25șC) timp de 2 ore.

Constructul rezultat pATCR a fost introdus în celulele competente E. coli DH5 α (Mix&Go Competent
E. coli cells, Zymo Research) urmând protocolul de transformare prin șoc termic de incubare pe
gheață timp de 1 oră, iar celulele astfel transformate au fost cultivate pe mediu LB -agar în prezență de
Ampicilină 100 µg/mL, la 37șC timp de 16 ore. ADN plasmidial – pHAT2 Produs PCR – gena pyrB
ddH 2O 20 μL –
10X FastDigest Buffer 3 μL 3 μL
Template ADN 1 μg (8 μL) 1 μg (25 μL)
FastDigest NcoI 1 μL 1 μL
FastDigest HindIII 1 μL 1 μL
Volum final 30 μL 30 μL
10X FastAP Buffer 3 μL
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase 1 U (1 μL)
Plasmid pHAT2 1 μg (26 μL)
Volum final 30 μL
Vector ADN linear (pHAT2) 50 ng (4.2 μL)
ADN Insert Rație molară 3:1 (insert:vector) – 32.61 ng
10X T4 DNA Ligase Buffer 2 μL
T4 DNA Ligase 5 Weiss U
Volum final 20 μL
Tabelul 9: Amestecul de reacție pentru digestia enzimatică a vectorului și insertului utilizate în
experiment.
Tabelul 10: Amestec de reacție pentru defosforilarea vectorului plasmidial.
Tabelul 11: Amestecul de reacție utilizat în ligarea insertului ADN în vectorul pHAT2 defosforilat.

Coloniile obținu te au fost cultivate în LB conținând ampicilină, iar extracția plasmidială a fost
realizată conform procedurii descrise în cazul amplificării pHAT2 ( 2.2.1. ). În urma digestiei
enzimatice cu FastDigest Hind III, plasmidul linearizat rezultat a fost analizat prin electroforeză în gel
de agaroză 1% pentru evaluarea dimensiunii și, respectiv, eficiența ligării insertului.

2.2.3. Expresia genică în E. coli
Expresia bacteriană a pATCR s -a realizat în tulpina de E. coli BL21(DE3) (BioLabs). În urma
transformării celulelor competente cu plasmidul pATCR, coloniile au fost inoculate în 1 mL LB în
prezența a 100 µg/mL ampicilină la 37șC timp de 16 ore. Inoculul a fost în continuare cultivat în
aceleași condiții, în urma inoculării mediului LB în raport 1:100 (v/v) pân ă la D.O 600 = 0.6. După
inducția cu 0.5 mM Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), expresia proteinei a fost realizată
la 15șC, 20șC și 37șC timp de 3 ore și 16 ore.
În urma centrifugării, celulele au fost resuspendate în tampon Tris -HCl pH 7, și so nicate la 55%
putere, timp 5 cicluri cu 5 secunde impuls, 60 de secunde pauză, cu ajutorul aparatului SONOPLUS
(Bandelin). Extractul celular a fost centrifugat 30 de minute la 13000 rpm, iar fracția solubilă a fost
separată de cea insolubilă. Aceasta din u rmă a fost resuspendată în volum egal de tampon Tris -HCl pH
7, iar cele două fracții proteice au fost analizate prin electroforeză SDS -PAGE (Tabel 12. ).

Reactivi Resolving Gel 12% Stacking Gel 6%
Volum Volum
ddH 2O 3.4 mL 5.4 mL
Acrilamidă/Bis (30%T, 2.67%C) 4.0 mL 2.0 mL
Tris-HCl (pH 8.8/pH 6.8) pH 8.8 = 2.5 mL pH 6.8 = 2.5 mL
10% SDS 100 μL 100 μL
10 % APS 50 μL 50 μL
TEMED 5 μL 10 μL

2.3. METODE DE BIOINFORMATICĂ
2.3.1. Secvențializarea genei pyrB din Rugamonas PAMC27505
Ampliconul reprezentând gena pyrB din Rugamonas PAMC27505 inserată în vectorul pHAT2 din
plasmidul rezultat în urma clonării a fost secvențializat utilizând amorsele de clo nare ( Tabelul 6. )
pentru verificarea acurateții amplificării PCR. Secvențializarea a fost efectuată de către compania
MACROGEN, Amsterdam, prin metoda Sanger.

Tabelul 12: Compoziția gelurilor pentru electroforeza SDS -PAGE, la un volum final de 10 mL
fiecare.

2.3.2. Metode bioinformatice utilizate pentru analiza structurii proteice a ATCazei
În vederea analizării structurii proteinei ATCază din Rugamonas PAMC27505 am utilizat mai multe
programe online, precum EMBOSS Needle ( http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ ) pentru
alinierea globală a câte două structuri primare și Clustal OMEGA EMBL-EBI
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ ) pentru alinierile multiple ale secvențelor de amino acizi.
Pentru analiza conținutului de amino acizi a proteinei studiate în acest experiment și a altor trei
ATCaze ( E. coli , Pseudomonas aeruginosa , Aquife x aeolicus ) am folosit programul ProtParam
EXPASY ( http://web.expasy.org/protparam/ ).
Reprezentarea structurilor cristalografice ale ATCazei din E. coli (subcapitolul 1.3.1. ASPARTAT
CARBAMOILTRANSFERAZA , Fig. 6 și Fig. 7 ) a fost realizată cu ajutorul prog ramului NGL Viewer
din PDB (Protein Data Base) ( Rose și Hildebrand, 2015; Rose și colab., 2016 ).