CAPITOLUL I. MICROORGANISMELE EXTREMOFILE: ASPECTE MICROBIOLOGICE ȘI BIOCHIMICE 1.1. CARACTERE GENERALE Extremofilele sunt organismele adaptate la… [310030]

CAPITOLUL I. MICROORGANISMELE EXTREMOFILE: ASPECTE MICROBIOLOGICE ȘI BIOCHIMICE

1.1. [anonimizat] a crește și a se dezvolta în parametrii optimi. Majoritatea extremofilelor sunt microorganisme care trăiesc în condiții de mediu ostile pentru organismele superioare (ex. specia umană). Într-o lucrare publicată în 1974, MacElroy a fost primul cercetător care a pus denumirea de „extremofil” (MacElroy, 1974); [anonimizat], [anonimizat], fiind astfel un mediu normal (Horikoshi și Bull, 2011).

Organismele extremofile sunt capabile să supraviețuiască și să prolifereze în medii cu parametrii fizici (temperatură, presiune, radiații) și geochimici (salinitate, pH, potențial redox) extremi. Marea majoritate a [anonimizat] (Fig.1) (Horikoshi și Bull, 2011; Stan-Latter, 2012; Vermelho și colab., 2015).

Există și organisme extremotrofe (Muller și colab., 2005), fiind mult mai diverse și având capacitatea de a tolera și de a [anonimizat]. [anonimizat]: (1) metodele nepotrivite folosite în izolarea organismelor considerate extremofile, (2) definirea extremofiliei unui organism fără o testare riguroasă și completă, (3) extremofilie presupusă ce ar fi putut fii compromisă prin cultivări succesive în condiții de laborator și (4) încercările nepotrivite pentru a determina dacă organismele au capacitate de adaptare doar în cazul unor mici diferențe ale variabilelor din mediu (Horikoshi și Bull, 2011).

Extremofilele și extremotrofele au fost clasificate în funcție de mediul extrem în care acestea trăiesc (Tabel 1.), existând și subclasificări în funcție de gradul de extremofilie al fiecărui tip principal: [anonimizat], hiperextreme și/sau obligate. [anonimizat] (Horikoshi și colab., 2011; Seckbach și colab., 2013).

În general caracterizarea extremofilelor și a [anonimizat] – ex. organismele capabile să trăiască în interiorul rocilor fierbinți aflate la mare adâncime de suprafața terestră. Fenomenul de poliextremofilie și poliextremotrofie se referă la organismele adaptate să supraviețuiască în medii cu cel puțin două condiții extreme (Horikoshi și Bull, 2011).

În 2013, Capece și colaboratorii au catalogat peste 200 [anonimizat], [anonimizat], psihroacidofile și psihroalcalifile. [anonimizat] (H+) devine astfel un avantaj pentru acidofile și alcalifile. [anonimizat] H+ prin membrană. [anonimizat] a fost observată încă prezența psihroacidofilelor și a psihroalcalifilelor, ci doar a [anonimizat]terium psychrotolerans (Capece și colab., 2013; Yumoto și colab., 2004).

Concentrații crescute de sare alături de temperaturi extreme au fost observate în cazul psihrohalofilelor. Multe medii din mările de gheață polare sunt soluții reci, sărate, și astfel un anumit grad de halofilie se găsește în general în psihrofile; adaptarea la rece și la sare prezintă astfel caractere comune (Capece și colab., 2013).

Din punct de vedere biotehnologic, enzimele poliextremofile au aplicații în industria alimentară, a detergenților, substanțelor chimice și în industria hârtiei și materialelor celulozice. De exemplu, arheonul antarctic psihrohalofil Halorubrum lacusprofundi produce o enzimă poliextremofilă recombinantă, activă la temperaturi scăzute și salinitate crescută, fiind stabilă în amestec de solvenți apoși organici; această enzimă este potrivită pentru aplicații ale chimiei sintetice (Karan și colab., 2013).

Câteva caracteristici ale extremofilelor sunt importante pentru obținerea de proteine recombinante cu proprietăți particulare. Avantajul principal al enzimelor din organisme psihrofile este consumul redus de energie; astfel, psihrofilele ar putea fii utilizate în producerea proteinelor termolabile utilizate în ingineria genetică (Vermelho și colab., 2015; De Maayer și colab., 2014).

1.2. MICROORGANISMELE PSIHROFILE

Conform Dicționarului de Microbiologie Generală și Biologie Moleculară (Zarnea și Popescu, 2011), microorganismele psihrofile au o largă răspândire, în particular în solul înghețat, zăpada și gheața din regiunile polare, pe suprafața și în intestinul peștilor marini, dar și în izvoare, lacuri, râuri și în solul din regiunile temperate. Cu toate că au o viteză de creștere lentă (ex. Methanogenium frigidum – 0,1 generații/zi, Methanococcoides burtonii – 0,3 generații/zi), psihrofilele prezintă o importanță deosebită deoarece 75% din biosferă corespunde mediilor reci (alpine, polare, adâncul oceanelor – sub 1000 m cu temperaturi între -5°C și 1°C), peșteri, subsuprafața terestră și marină, armosfera superioară etc., unde microorganismele psihrofile sunt abundente.

În 1975, Richard Morita a fost primul cercetător care a definit termenul de psihrofilie și a făcut diferența dintre organismele psihrofile cu temperatură optimă de creștere sub 15°C și organismele psihrotolerante capabile de creștere la temperaturi sub 15°C dar cu o rată de creștere mult mai rapidă la temperaturi peste 25°C (Morita, 1975). Termenii de stenopsihrofil și euripsihrofil au fost descriși cu ajutorul fiziologiei animalelor (Helmke și Weyland, 1995; Laucks și colab., 2005; Rothschild și Mancinelli, 2001; Cavicchioli, 2006).

Stenopsihrofilele – psihrofilele adevărate după Morita – sunt restrictive din punct de vedere al variației mici de temperatură la care este posibilă creșterea, nefiind capabile să tolereze temperaturi mai mari de 25°C, în timp ce Euripsihrofilele – psihrotolerante după Morita – sunt capabile de creștere la variații mult mai mari de temperatură, între -10°C sau mai mici și tolerând chiar temperaturi de peste 30°C. Termenul de psihrofilie este utilizat astfel la modul general, pentru a descrie orice organism care prezintă activitate în medii cu temperaturi scăzute, mai exact temperaturi sub 5°C (Mikucki și colab., 2011).

Majoritatea psihrofilelor aparțin domeniilor Bacteria și Archaea, iar fenomenul de psihrofilie este prezent în foarte multe specii ale acestora. Studii recente au relevat existența unor grupuri noi de cianobacterii, fungi și virusuri psihrofile (Margesin și colab., 2008).

Capacitatea bacteriilor de a se reproduce la 0°C a fost descrisă pentru prima dată de Foster în 1887 (Foster, 1887), iar în 1902 Schmidt-Nielsen a utilizat pentru prima dată termenul „psihrofil” pentru acest tip de bacterii, luând în considerare însă doar temperatura minimă de creștere (Schmidt-Nielsen, 1902). Datorită faptul că, în literatură, la vremea respectivă, nu existau date concrete despre psihrofile, în Dicționarul de Microbiologie (Jacobs și colab., 1957) psihrofilele erau definite drept bacterii cu o temperatură optimă de creștere de 15°C sau mai mică. Organismele care creșteau la 0°C au fost separate în două categorii: obligat psihrofile – capabile să crească la 0°C dar nu la 30°C, și facultativ psihrofile – capabile să crească atât la 0°C cât și la 30°C, motiv pentru care s-a considerat că psihrofilele se încadrau mai mult sau mai puțin în categoria organismelor facultativ psihrofile (Nogi, 2011).

În 1975, Morita a oferit o nouă definiție: „Psihrofilele sunt definite drept organisme cu temperatură optimă de creștere și dezvoltate la ≤15°C, temperatură maximă de creștere la aproximativ 20°C, și o temperatură minimă de creștere și dezvoltare de ≤0°C” (Morita, 1975). Această definiție este utilizată și în prezent, însă termenul de psihrotrofic s-a transformat în psihrotolerant, iar variația temperaturilor ar trebui reconsiderată datorită numărului tot mai mare de bacterii psihrofile izolate din diferitele habitate și în funcție de noile date ecologice (Helmke și Weyland, 2004; Nogi, 2011).

Diferite stenopsihrofile izolate din Antarctica au fost studiate, cuprinzând genurile: Arthrobacter, Colwellia, Gelidibacter, Glaciecola, Halobacillus, Halomonas, Hyphomonas, Marinobacter, Planococcus, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Psychrobacter, Psychroflexux, Psychroserpens, Shewanella și Sphingomona. Arheele metanogene sunt unicul grup cunoscut ca având specii individuale capabile de creștere și dezvoltare la variații foarte mari de temperatură, între ≤0°C și 122°C (Kurosawa și colab., 2010; Siddiqui și colab., 2013).

Pentru supraviețuirea în condiții de psihrofilie, organismele au dezvoltat o serie de strategii de adaptare pentru menținerea funcțiilor celulare la temperaturi scăzute (Rodrigues și Tiedje, 2008). Astfel, psihrofilele prezintă mecanisme particulare pentru a putea contracara factorii suplimentari de stres asociați cu mediile reci, precum deshidratarea, radiațiile UV în exces, variațiile de pH, presiunea osmotică ridicată și lipsa nutrienților (Morgan-Kiss și colab., 2006; Tehei și Zaccai, 2005).

1.2.1. FAMILIA PSEUDOMONADACEAE

Familia Pseudomonadaceae este formată din chemoorganotrofi aerobi cu metabolism respirator, majoritatea reprezentanților prezintă motilitate prin flageli, unele genuri intră în categoria fixatorilor de azot – Azomonas și Azotobacter. Genul tip al familiei este genul Pseudomonas, însă familia Pseudomonadaceae conține și genurile: Azomonas, Azomonotrichon, Azorhizophilus, Azotobacter, Cellvibrio, Mesophilobacter, Rhizobacter, Rugamonas și Serpens (Skerman și colab., 1980; Cornelis, 2008; Orla-Jensen, 1921).

Termenul de pseudomonad este derivat din grecescul pseudo care înseamnă fals, și monad care înseamnă o singură unitate, fiind utilizat încă de la începuturile microbiologiei pentru a definii organismele unicelulare. Pseudomonadele sunt întâlnite și au fost izolate din foarte multe nișe naturale, iar în 1894 a fost dată denumirea generică de Pseudonomas, fiind însă definită în termeni destul de vagi: gen de bacterii Gram-negative, cu formă de bacil și flageli polari.

1.2.1.1. GENUL Rugamonas

Genul Rugamonas aparține familiei Pseudomonadaceae, și a fost pentru prima dată descris și încadrat în această familie de către Austin și Moss, când au descris și prima specie a acestui gen, Rugamonas rubra (Austin și Moss, 1986). Termenul de Rugamonas este format din latinul ruga care înseamnă încrețitură, zbârcitură, și grecescul monad – unitate, traducându-se literalmente ca unitate zbârcită.

În cultură, celulele de Rugamonas se prezintă sub formă de bacil cu dimensiunile 0.8-0.9 x 2.4-4.0 µm. După 7 zile, se formează granule intracelulare de prodigiozină. Celulele dintr-o cultură mai tânără de 7 zile sunt motile datorită unuia sau mai multor flageli polari sau subpolari. Coloniile crescute pe Agar Bennett la 20șC, după 4 zile devin roz spre roșu închis, zbârcite și au consistență ca de cauciuc după 5 zile, și un diametru de aproximativ 3 mm.

Sunt bacterii oxidazo-catalază pozitive, strict aerobe, cu metabolism oxidativ, dar incapabile să metabolizeze fermentativ carbohidrații. Reducerea nitraților la N2 se face anaerobic. Creșterea se realizează în prezența NaCl 0.0-0.5% (v/v). Arginin decarboxilază negative. Unele tulpini sunt capabile să producă lizin și ornitin decarboxilaze. Degradează esculina, chitina, gelatină, lecitină, Tween 20, 40, 60 și 80, tirozină și uree; incapabile de a degrada alantoina, celuloza, elastina, hipoxantina, amidon și xantină. Pe mediu T.S.I. (Triple Sugar Iron) agar nu produc H2S. Testele gluconat, citrat Koser și Beta-galactorzidază sunt pozitive; testele Voges-Proskauer, roșu metil și malonat sunt negative. Prima izolare s-a realizat din apa de râu (Austin și Moss, 1986).

În urma studiilor realizate de Austin și Moss în 1984, s-a descoperit faptul că pe măsură ce cultura îmbătrânește, celulele își pierd motilitatea, devening pleumorfice (Austin și Moss, 1986). Consistența ca de cauciu a coloniilor este caracteristică tuturor tulpinilor izolate de Rugamonas rugra obținute până în prezent, precum și producția pigmenților roșii care aparțin familiei prodigiozinelor. În urma experimentelor, s-a demonstrat că tulpina tip produce 6-metoxi-2-metil-3-pentilprodigiozină (prodigiozină) dar pigmentul predominant a fost analogul 3-heptil (Fig.2).

După incubare 14 zile pe Agar Bennett îmbogățit s-a observat că viabilitatea celulară scade brusc, fiind corelată cu reducere de pH și supraproducere de prodigiozină, care poate fi observată sub formă de incluziuni granulare închise la culoare, pe preparatele realizate pentru studiul motilității (Austin și Moss, 1986). Temperatura de creștere după 168 de ore variază între 1.2-30.6°C, cu un optim de creștere la 20°C, fără să se înregistreze creștere la 37°C. Temperaturile de creștere sunt sensibile la perioada de incubare, și astfel, după 48 de ore, au fost înregistrate următoarele temperaturi: T minimă 5.6°C, T optimă 26.4°C și T maximă 30.6°C (Moss, 1983). Una dintre cele mai importante caracteristici ale tulpinilor genului Rugamonas este reprezentată de capacitatea acestora de a flocula în culturile lichide și consistența similară cauciucului a coloniilor din mediu solid (Austin și Moss, 1987).

1.2.1.2. SPECIA TIP Rugamonas rubra

Specia Rugamonas rubra sp. Nova a fost caracterizată în urmă cu trei decenii (Austin și Moss, 1986).Termenul rubra provine din latinul rubra, însemnând roșu. Au formă de bacil, de dimensiuni 2.4-4.0×0.8-0.9 μm și margini rotunjite. Granule intracelulare de prodigiozină se formează în celule bătrâne, mai vechi de 7 zile. Celulele tinere sunt motile, având unul sau mai mulți flageli polari sau subpolari, în timp ce culturile bătrâne prezintă motilitate scăzută.

După 7 zile de cultivare în mediu lichid Bennett se formează floculi roz-roșii. Pe mediu agar Bennett, la 20°C, celulele sunt albe, strălucitoare și circulare după 2-3 zile, devin roz după 4 zile, și roșu închis, încrețite și cu consistența ca de cauciuc după 5 zile, având și un diametru de aproximativ 3 mm.

Specie capabilă de a reduce nitrații la azot. Temperatura de creștere variază între 4°C și 30°C, având temperatura optimă de 25°C. Creșterea se realizează doar în prezența a 0%-0.5% (v/v) NaCl și la un pH cuprins între 5 și 9. R. rubra nu produce arginin decarboxilaze, iar unele tulpini sunt capabile de a produce lizin și ornitin decarboxilaze. Această specie degradează esculina, chitina, gelatina, lecitina, Tween 20, 40, 60 și 80, tirozinaă și uree. Tulpinile de Rugamonas rubra produc β-galactozidază și fosfatază, însă nu H2S și fenilalanin deaminaze. Testele gluconat și citrat Koser sunt pozitine, iar testele Voges-Proskauer, roșu metil și malonat sunt negative. Produce enzimele alcalin fosfatază, acid fosfatază, esteraze (unele tulpini), esteraz-lipaze, leucin arilamidaze și fosfoamidaze.

Rugamonas rubra este sensibilă la cloramfenicol (10 μg), clortetracicline (10 μg), eritromicină (10 μg), furazolidonă (50 μg), gentamicină (10 μg), kanamicină (30 μg), novobiocin (5 μg), oxitetraciclină (10 μg), streptomicină (10 μg), sulfafurazol (500 μg), tetraciclină (10 μg) și cotrimoxazol (25 μg). Prezintă rezistență la: ampicilină (2 μg), cloxacilină (5 μg), colistin sulfat (10 μg), neomicină (10 μg), nitrofurantoin (200 μg) și penicilină G (1.5 U.I.).

În ceea ce privește sursele de carbon utilizate pentru necesarul energetic, acestea sunt D(-)-alanină, L(+)-arabinoză, DL-arginină, mezo-inozitol, DL-lactat de sodiu, celobioză, D(-)-fructoză, D(+)-galactoză, L(-)-histidină, maltoză, D(+)-manoză, D(-)-rafinoză, D(-)-riboză, DL-serină, acetat de sodiu, citrat trisodiu, D(-)-sorbitol, sucroză și trehaloză. Unele tulpini folosesc lactoza drept unică sursă de carbon.

Conținutul molar de G+C% a ADN cromozomial pentru tulpina tip este de 66.7 ± 0.1 mol%.

1.2.2. ECOLOGIA PSIHROFILELOR

O mare parte a biosferei se află în permanență la temperaturi ≤5șC cuprinzând adâncul oceanelor, solurile înghețate, ghețari, lacuri perene înghețate, gheață marină și calote de gheață polare (Priscu și Christner, 2004; Anesio și Laybourn-Parry, 2012). Totalitatea ghețarilor și calotelor glaciare ocupă 11% din suprafață terestră și reprezintă aproximativ 70% din suprafața de apă dulce a globului (Shiklomanov, 1993; Paterson, 1994). Până recent, ecosistemele glaciare precum ghețarii, calotele de gheață și unele lacuri perene înghețate au fost considerate ca lipsite de orice formă de viață, în principal din cauza informațiilor limitate asupra capacității organismelor vii de a tolera mediile extreme și datorită ideei că, în lipsa luminii, viața nu poate exista (Mikuchi și colab., 2011).

Descoperirea vieții în mediile extrem de reci și izolate a modificat noțiunea de zone habitabile ale Pămânului. Astfel, la sfârșitul anilor 1990 au fost descoperite forme de viață la aproximativ 3590m adâncime în ghețari (Priscu și colab., 1999; Karl și colab., 1999) și în sedimente subglaciare (Sharp și colab., 1999). De asemenea, au fost găsite microorganisme în sedimentele din permafrost (Rivkina și colab., 2000) și în gheața marină (Junge și colab., 2004).

Fundamental în definirea rolului ecologic pe care îl au microorganismele în sistemele înghețate este cunoașterea activității lor metabolice la temperaturi sub 0șC. Celulele latente din sistemele înghețate sunt consumatoare de carbon, azot, fosfor și alți nutrienți vitali spre deosebire de celulele metabolic active care sunt participanți activi la ciclurile biogeochimice. Determinarea activității metabolice sub temperatura de îngheț a apei ridică probleme metodologice, însă au fost dezvoltate mai multe metode în încercarea de a măsura rata proceselor metabolice microbiene la aceste temperaturi scăzute (Mikuchi și colab., 2011). În 2002, Christner a demonstrat, prin experimente de încorporarea ADN radiomarcat și a unor molecule precursori proteici, faptul că celulele bacteriene pot să își conserve componenții macromoleculari pe o durară mai lungă de timp (100 de zile) și la temperaturi foarte scăzute, de -15șC (Christner, 2002).

Lacurile subglaciale din Antarctica reprezintă unul dintre cele mai interesante sisteme subglaciale, până în prezent fiind descoperite mai bine de 145 lacuri subglaciale (Siegert, 2005). Astfel de lacuri sunt considerate ”active” și cel puțin o parte dintre ele sunt hidrologic conectate între ele, fiind periodic secate (Fricker și colab., 2007; Wingham și colab., 2006).

Antarctica este al cincilea continent ca dimensiune, cu o suprafață totală de 14 milioane de km2, fiind localizat la sud de Cercul Antarctic în mijlocul Oceanului Sudic. Mai bine de 98% din suprafața continentului este acoperită cu gheață, stratul de gheață având o grosime medie de 1.6 km. Astfel, Antarctica reprezintă cel mai rece și mai secetos continent, cu condiții de mediu și climatice severe, precum temperaturi extrem de scăzute, umiditate atmosferică scăzută, absența aproape completă a apei și perioade alternative de întuneric total cu prezență crescută a radiațiilor (Kirby și colab., 2011). Absența apei restricționează viața atât macroscopică cât și pe cea microscopică, iar Eucariotele superioare sunt majoritar localizate la latitudinea nordică a Peninsulei Antarctice.

În ciuda climatului sever, există comunități microbiene care au reușit să se adapteze și să colonizeze nișe specializate, inclusiv soluri lipsite de minerale, soluri ornitogenice îmbogățite, gheață din ghețari și din calote, lacuri înghețate, roci, soluri încălzite geotermal, peșteri de gheață, venturi hidrotermale, vulcani, corespunzând unor tipuri de mediu extrem, unde prezența eucariotelor superiore și a plantelor nu este posibilă.

1.2.3. MECANISME DE ADAPTARE LA TEMPERATURI SCĂZUTE

Adaptările moleculare la viața în mediile înghețate includ prezența unor proteine de șoc termic. Proteinele de șoc termic, sau Cold-shock proteins (CSP) sunt proteine de dimensiuni mici care se leagă la ARN pentru a proteja structura monocatenară împotriva stresului termic, au un domeniu de legare pentru acizii nucleici, cunoscut sub numele de domeniul de șoc termic, sau cold shock domain (CSD), și servesc în principal drept proteine chaperon pentru ARN (Jones și Inouye, 1994; Vermelho și colab., 2015). ARN helicazele sunt reglate în timpul creșterii la temperaturi scăzute și au capacitatea de a desface structura secundară într-o manieră ATP-dependentă în unele psihrofile (Lim și colab., 2000).

Mecanismele de adaptare la mediu ale psihrofilelor implică și producerea de metaboliți secundari activi la temperaturi scăzute, inducerea și activarea enzimelor la temperaturi scăzute, prezența proteinelor anti-îngheț, producerea de pigmenți și fluiditatea membranară (Casanueva și colab., 2010; De Maayer și colab., 2014; Lorv și colab., 2014). Din punct de vedere structural, proteinele acestor organisme au o concentrație mult mai ridicată de α-helix față de β-strand, considerat un factor important în menținerea flexibilității chiar și la temperaturi scăzute (Madigan și colab., 2014). În plus, membranele citoplasmatice ale acestor microorganisme conțin o cantitate mult mai mare de acizi grași nesaturați (52%) comparativ cu cea a microorganismelor mezofile (37%) și termofile (10%), ceea ce favorizează menținerea stării semi-fluide a membranelor (Deming, 2009).

Fluiditatea membranară este esențială pentru integritatea structurală și pentru funcționalitatea celulară. Este bine cunoscut faptul că temperaturile scăzute au un impact semnificativ asupra fluidității membranelor, iar organismele capabile să crească la cele două extreme ale temperaturilor biotice și-au dezvoltat mecanisme specifice pentru modificarea fluidității membranare (Deming, 2002; Chintalapati și colab., 2004). În cazul microorganismelor psihrofile, adaptările la nivel membranar includ creșterea raportului dintre acizii grași polinesaturați și cei saturați la nivelul fosfolipidelor membranare, modificări ale tipurilor de lipide constituente, reducerea dimensiunii și a sarcinii electrice a grupelor lipidice principale ceea ce afectează împachetările fosfolipidelor, și conversia din izomeria trans în izomeria cis a acizilor grași (Fig.3) (De Maayer și colab., 2014).

Analize recente ale transcriptomului coroborate cu experimente fiziologice anterioare au demonstrat faptul că expunerea la temperaturi scăzute provoacă o reglare rapidă a genelor implicate în biogeneza membranară, precum biosinteza acizilor grași și a lipopolizaharidelor (LPS), biosinteza peptidoglicanilor, a glicoziltransferazei și a proteinelor extramembranare (Gao și colab., 2012; Frank și colab., 2011). Studii genetice comparative au indicat faptul că genele implicate în biogeneza membranelor celulare sunt suprareprezentate în genomurile microorganismelor psihrofile (Lauro și colab., 2008; D’Amico și colab., 2002).

În cadrul studiilor proteomice și transcriptomice, s-a demonstrat faptul că proteinele de transport membranar sunt la rândul lor supuse unor mecanisme de reglare suplimentare pentru contracararea ratelor scăzute de difuzie de la nivelul membranelor celulare care au loc la temperaturi joase (Bakermans și colab., 2006; Cacace și colab., 2010). Astfel, reglajul transportorilor de peptide facilitează aclimatizarea în cazul stresului la temperaturi scăzute și cel hiperosmotic prin îmbunătățirea consumului de nutrienți, de soluți compatibili și reciclarea membranelor peptidice pentru biosinteza peptidoglicanilor (Cacace și colab., 2010; Bakermans și colab., 2006; Durack și colab., 2013). În contrast, expresia genelor care codifică structurile și proteinele extra membranare, precum flagelii, proteinele chemotaxice și receptorii pentru ingerarea fierului, este în general supresată la temperaturi scăzute (Fig.3) (Durack și colabl., 2013;Piette și colab., 2011).

Pigmenții carotenoizi reprezintă o altă clasă de modulatori ai fluidității membranare; atât pigmenți carotenoizi polari cât și nepolari sunt produși de diferite bacterii Antarctice, și se consideră că acționează drept tampon al fluidității membranare și că asistă la menținerea homeovâscozității în timpul fluctuațiilor de temperatură (Chattopadhyay, 2006; Rodrigues și Tiedje, 2008).

La nivel celular, înghețul induce formarea cristalelor de gheață citoplasmatice, ceea ce duce la leziuni celulare și dezechilibru osmotic. Acumularea de soluți compatibili – glicină, betaină, sucroză și

manitol – are ca rezultat scăderea punctului de îngheț al citoplasmei, oferind astfel protecție împotriva înghețului, deshidratării și hiperosmolarității (Fig.3) (Casanueva și colab., 2010; Cowan, 2009; Klähn și Hagemann, 2011). Trehaloza poate prevenii denaturarea și agregarea proteinelor, înlătură radicalii liberi și stabilizează membranele celulare în condiții de temperatură scăzută; în urma unei analize transcriptomice a Escherichia coli s-a demonstrat că genele biosintezei trehalozei, otsA și otsB, sunt induse de condiții cu temperatură foarte scăzută (Kandror și colab., 2002; Phadtare și Inouye, 2004).

Unele psihrofile sintetizează proteine anti-îngheț (AFP, antifreeze proteins) care se leagă de cristalele de gheață și controlează creșterea și recristalizarea acestora, prin diminuarea punctului de îngheț (histerezis termic) (Celik și colab., 2013).

Sinteza de expolizaharide (EPS) reprezintă un alt potențial mecanism de crioprotecție, iar psihrofilele sunt capabile de producerea unor cantități mari de EPS în condiții de temperaturi scăzute. Compoziția crescută în polihidroxil a EPS scade punctul de îngheț și temperatura de cristalizare a apei. EPS pot în același timp să capteze apă, nutrienți și ioni metalici, să faciliteze adeziunea celulară, agregarea celulară și formarea de biofilme, și au rol în protejarea enzimelor extracelulare împotriva denaturării și autolizei cauzate de temperaturile scăzute (De Maayer și colab., 2014).

Psihrofilia este determinată în principal, de natura enzimelor cu structură specială, ce le conferă flexibilitate la temperaturi scăzute comparativ cu enzimele microorganismelor mezofile.

1.3. ASPECTE BIOCHIMICE PARTICULARE ALE PSIHROFILELOR

Nucleotidele pirimidinice sunt constituenți celulari la nivelul tuturor tipurilor de organisme Procariote și Eucariote, contribuind în principal la sinteza de novo a acizilor nucleici, fiind implicate și în alte procese metabolice importante. Majoritatea organismelor își asigură necesarul de nucleotide pirimidinice prin două căi metabolice: calea anabolică/sinteza de novo și calea catabolică/de salvare (Zöllner, 1982).

Calea de biosinteză de novo a nucleotidelor pirimidinicee a fost intens studiată în cazul bacteriilor, în particular Escherichia coli (Lipscomb, 1994) și a numeroase alte microorganisme aparținând domeniilor Bacteria (Schurr și colab., 1995; Evans și colab., 2002; Hayward și Belser, 1965; Hutson și Downing, 1968), Archaea (Bult și colab., 1996; Durbecq și colab., 1997) și a unor fungi (Denis-Duphil, 1989). De asemenea, s-au realizat studii ale diferitelor enzime aparținând acestei căi metabolice la mamifere (Hager și Jones, 1967; Tatibana și Ito, 1969), ceea ce a sugerat universalitatea acestei secvențe metabolice în toate organismele (O’Donovan și Neuhard, 1970). Cu toate acestea, numeroasele studii la nivelul enzimelor din microorganisme au fost cele care au permis elucidarea biosintezei pirimidinelor (O’Donovan și Neuhard, 1970).

Sinteza de novo a nucleotidelor citidin trifosfat (CTP) și uridin-5’-trifosfat (UTP) are loc în urma unor serii de reacții enzimatice utilizând precursori metabolici precum: glutamină, adenozin trifosfat (ATP), bicarbonat, aspartat și fosforibozil pirofosfat (PRPP) (Jones, 1980; Jones, 1970). Spre deosebire de sinteza de novo, prin calea de salvare a pirimidinelor, uracilul eliberat din degradarea acizilor nucleici este reciclat. Biosinteza de novo a uridin-5’-monofosfat (UMP) are loc într-o serie de șase etape distincte, catalizate fiecare de o singură enzimă (Fig.4).

În primele două etape ale biosintezei nucleotidelor pirimidinice are loc asamblarea structurii inelului Carbamoil-Aspartat, cu ajutorul glutaminei, bicarbonatului, 2 molecule de ATP și aspartat. A treia etapă implică o reacție de condensare constând în ciclizarea inelului pirimidinic cu formare de dihidroorotat (DHO). Oxidarea DHO în etapa 4 produce orotat, care la rândul său reacționează cu Ribozo-5’-fosfat de la fosforibozil pirofosfat (PRPP) pentru a forma orotidil monofosfat (OMP). În urma decarboxilării se obține UMP, acesta fiind mai departe fosforilat la uridin difosfat (UDP) și în final UTP (Jones, 1980; Jones, 1970). În cazul microorganismelor, cataliza fiecărei etape este realizată de către o enzimă specifică.

Biosinteza nucleotidelor pirimidinice reprezintă una dintre cele mai vechi căi metabolice, prezentă la toate celulele. Cu toate că reacțiile și metaboliții intermediari au fost conservați în cursul evoluției, structura enzimelor catalizatoare diferă în funcție de specie. Astfel, în cazul E.coli și Bacillus subtilis, enzimele care catalizează primele trei reacții – carbamoil fosfat sintetaza (CPSaza), aspartate carbamoiltransferaza (ATCaza) și dihidroorotaza (DHOaza) sunt monofuncționale ca și în cazul plantelor (Kaseman și Meister, 1985; Potvin și colab., 1975; Doremus, 1986) și al unor archee hipertermofile ca Pyrococcus furiosus (Durbecq și colab., 1997) și P. abyssi (Purcărea și colab., 1996).

În cazul majorității fungilor, enzimele sunt bifuncționale, fiind alcătuite din domenii active pentru CPS și ATC care interacționează cu o DHO nefuncțională (Denis-Duphil, 1989). La mamifere, enzimele care catalizează primele 3 reacții formează proteina multifuncțională CAD, cu subunitățile fuzionate ale CPS, ATC și DHO active (Jones, 1970; Coleman și colab., 1977; Shigesada și colab., 1985; Simmer și colab., 1989). În urma studiilor structurale și funcționale ale acestor enzime din Bacteria, Fungi și mamifere, Evans a sugerat corelarea asocierii prin fuzionare a acestor enzime cu complexitatea de ansamblu a organismului gazdă.

În ciuda acestor diferențe, aceste enzime care catalizează primele 3 reacții ale sintezei nucleotidelor pirimidinice din diferite organisme, prezintă o organizare omoloagă în domenii și subdomenii enzimatice, o similaritate ridicată la nivelul structurii primare și conservarea amino acizilor care constituie situsurile active (Kaseman și Meister, 1985; Zollner, 1982; Potvin și colab., 1975; Michaels și colab., 1987).

1.3.1. ASPARTAT CARBAMOILTRANSFERAZA

Organisme din toate domeniile – Archaea, Prokarya și Eukarya – produc și utilizează aspartat carbamoiltransferaza (aspartat transcarbamoilaza, ATCaza, E.C. 2.1.3.2), enzimă specializată în catalizarea reacției dintre carbamil fosfat și aspartat – utilizate ca substrat – pentru formarea N-carbamoil-L-aspartatului – precursor în calea de biosinteză a pirimidinelor, cu eliberare de fosfat anorganic (Fig.5) (Jones și colab., 1955).

ATCaza catalizează prima etapă specifică a căii de biosinteză a UMP, fiind astfel principalul situs de reglare al căii de biosinteză pirimidinică din aceste organisme (Cunin și colab., 1985; Ladjimi și colab., 1985). Cele mai numeroase studii structurale și funcționale ale ATCazei au fost efectuate în cazul enzimei din E. coli, devenind un model de studiu pentru enzimele alosterice (Lipscomb și Stevens, 1990).

Din punct de vedere genetic, subunitatea catalitică a ATCazei este codificată de către gena pyrB. În cazul enzimei din E. coli, Perbal și Hervé au sugerat în 1972 că lanțurile polipeptidice catalitice și reglatorii ale ATCazei sunt codificate de către cistronii pyrB și respectiv pyrI, care formează la rândul lor un operon bicistronic, unde cistronul catalitic este promotor-proximal, experiment demonstrat și de Roof și colaboratorii în 1982 (Perbal și Hervé, 1972; Roof și colab., 1982).

ATCaza este o enzimă ubicuitară, catalizând aceeași reacție în absolut toate organismele, prezentând însă un polimorfism remarcabil (Purcărea și colab., 2003). În funcție de conținutul subunităților catalitice (c) și reglatorii (r) constituente, ATCazele bacteriene au fost clasificate în:

ATC de clasă A – dodecamer de 480 kDa, alcătuit din doi trimeri catalitici și șase subunități care sunt fie dihidroorotaze (cea de-a treia enzimă a căii de biosinteză pirimidinică) ca la Thermus aquaticus (Van de Casteele și colab., 1997), fie omologi inactivi ai DHO cum este în cazul ATCazei de la Pseudomonas aeruginosa (Schurr și colab., 1995; Evans și colab., 2002).

ATC de clasă B – dodecamer de 310 kDa, format din doi trimeri catalitici și trei dimeri reglatori care au rol în legarea efectorilor alosterici, ca de exemplu în cazul Escherichia coli (Wiley și Lipscomb, 1968). Structura dodecamerică 2c3:3r2 definește ATCaza de clasă B drept holoenzimă și este conservată în toate ATCazele enterice (Wild și colab., 1980).

ATC de clasă C – cu o greutate moleculară de 100 kDa, este clasa de enzime specifică pentru Bacillus subtilis, corespunde trimerilor catalitici liberi ai enzimei enterice – clasa B – codificați de gena pyrB; este formată din trei lanțuri polipeptidice identice de 34 kDa fiecare, nu prezintă subunități reglatorii asociate și nici inhibiție/activare alosterică (Schurr și colab., 1995).

ATCaza din E. coli a fost purificată și cristalizată pentru prima dată în 1960, iar greutatea sa moleculară a fost estimată pe baza măsurătorilor ratei de sedimentare, ca fiind de aproximativ 220 – 260 kDa (Shepherdson și Pardee, 1960). Ulterior în 1964, Gerhart a determinat greutatea sa moleculară (310 kDa) prin metode cristalografice (Gerhart, 1964), și în 1965, împreună cu Schachman au demonstrat faptul că holoenzima ATCază poate fi disociată în două tipuri de subunități distincte, una de aproximativ 96 kDa având activitate catalitică (subunitatea catalitică, c) iar cea de-a doua de 30 kDa fără activitate catalitică, dar prezentând situsuri de legare pentru nucleotide, fiind denumită subunitate reglatorie (Gherhart și Schachman, 1965).

În 1968 Weber a determinat secvența în aminoacizi a subunității reglatorie calculând greutatea moleculară a acesteia (17 kDa) (Weber, 1968). Studiile au indicat faptul că holoenzima conține șase subunități reglatorii cu rol în legarea efectorilor alosterici ATP, CTP și UTP (Weber, 1968; Wild și colab., 1989; Lipscomb, 1994). Pe baza studiilor de cristalografie și a măsurătorilor de masă moleculară, s-a putut deduce structura cuaternară dodecamerică a ATCazei (Wiley și Lipscomb, 1968).

Astfel holoenzima este compusă din doi trimeri catalitici și trei dimeri reglatori, având structura cuaternară c6r6 și arhitectură 2(c3)3(r2). Acest aranjament relativ a fost descoperit în forma tensionată (T) de cristal la o rezoluție de 5.5 Å, cu simetrie structurală D3 (Fig.6) (Wiley și colab., 1972).

Structura cristalografică a ATCazei din E. coli a condus la identificarea situsurilor active localizate la nivelul subunităților catalitice, și a situsurilor de legare a inhibitorului alosteric CTP și a activatorului ATP la nivelul subunității reglatorie, în concordanță cu studiile anterioare de mutageneză dirijată (Fig.7) (Kosman și colab., 1993; Lipscomb și Kantrowitz, 2012).

În cazul enzimei native din E. coli, în urma legării la subunitățile reglatorii, produsul metabolic final CTP are efect inhibitor de tip feedback, în timp ce ATP provenit din calea de sinteză a nucleotidelor purinice realizează activarea ATCazei. UTP poate de asemenea să inhibe ATCaza, dar are efect doar în prezența CTP (Wild și colab., 1989).

Din punct de vedere catalitic, legarea substraturilor la situsurile catalitice este cooperativă și permite o modulare alosterică a activității enzimei (Kantrowitz și Lipscomb, 1990). Funcțional, ATCaza din Escherichia coli este un model de studiu datorită complexității metodelor de reglaj alosteric, care implică atât efectele homotropice ale interacțiilor dintre liganzi identici (ex: legarea cooperativă a diferitelor substraturi), cât și efectele heterotropice dintre liganzi diferiți (ex: substrat și efectori) (Kantrowitz și Lipscomb, 1990; Endrizzi și colab., 2000).

Reglarea ratei unei căi metabolice cu ajutorul enzimelor alosterice este un mecanism foarte important în controlul celular. Enzimele alosterice, cum este cazul ATCazei, joacă un rol pivotal în metabolismul celular, deoarece au trei mari funcții: catalizează o reacție metabolică unică, modifică rata catalizei ca răspuns la condițiile celulare și sunt responsabile pentru rata întregii căi. Reglajul ATCazei implică legarea moleculelor de semnalizare la nivelul situsului reglator, iar această legare induce mai departe o alterare a ratei activității catalitice (Lipscomb și Kantrowitz, 2012).

Proprietățile cinetice ale enzimei native din E. coli au indicat o legare cooperativă, aspartatul având S0.5 = 5.5 mm, în timp ce curba de saturație a carbamil fosfatului este hiperbolică (Gherhart și Pardee, 1962; Kleppe, 1966; Reichard și Hanshoff, 1956; Yates și Pardee, 1956). În 1968, Bethell și colaboratorii, au demonstrat, că cea mai mică concentrație de carbamil fosfat testată, de 0.3 mm, determină o rată de reacție de 80% din viteza maximă, și au folosit în acest sens o probă cu radioactivitate mult mai sensibilă și carbamil fosfat în concentrații mult mai mici pentru a demonstra curba sigmoidală viteză-substrat dependentă a carbamil fosfatului (Bethell și colab., 1968). Diagrama Lineweaver-Burk a enzimei native pentru carbamil fosfat este liniară până la 0.14 mM, iar pe măsură ce concentrația substratului scade, curba devine rapid concavă (O’Donovan și Neuhard, 1970).

Pentru acest substrat, Km aparent este 0.2 mm, comparativ cu Km 0.05 mM a carbamil fosfatului pentru subunitatea catalitică (Bethell și colab., 1968). Astfel, atât aspartat cât și carbamil fosfatul determină modificări ale interacțiunilor dintre subunitățile enzimei native ATCază, creând efecte de legare cooperativă și cinetică sigmoidală a saturației (O’Donovan și Neuhard, 1970). Adiția CTP ca inhibitor de tip feedback crește sigmoidicitatea curbei de saturație a carbamil fosfatului și aspartatului; în cazul concentrațiilor mari de carbamil fosfat, CTP scade afinitatea pentru aspartat a ATC, iar pe de alta parte, la concentrații crescute de aspartat, CTP scade afinitatea pentru carbamil fosfat a ATC. Când ambele substrate sunt saturate, nu se observă nici un fel de inhibiție (Bethell și colab., 1968; Gerhart și Pardee, 1962; Gerhart și Pardee, 1964). CTP este astfel inhibitor competitiv pentru ATCază, iar inhibiția este determinată de concentrațiile ambelor substrate alosterice, carbamil fosfat și aspartat (Bethell și colab., 1968).

În urma experimentelor pe enzima nativă din E. coli cu 1.0 M uree sau pH crescut, Weitzman și Wilson au raportat o pierdere a cineticii sigmoidale chiar dacă sensibilitatea pentru inhibiția CTP nu a dispărut (Weitzman și Wilson, 1966). În urma tratamentelor enzimei native cu compuși mercurici aceasta devine insensibilă la CTP (O’Donovan și Neuhard, 1970). Desensibilizarea este acompaniată de disocierea ATCazei native în subunități, dintre care una conține toată activitatea catalitică, cu un coeficient de sedimentare de 5.8S și fără să aibe situsuri reglatorii pentru CTP, fiind denumită subunitate catalitică (Gerhart, 1964; Gerhart și Schachman, 1965). Această subunitate este insensibilă la inhibitorul CTP cât și la activatorul ATP, are o greutate moleculară de 100,000 Da (Gerhart, 1964), iar Weber a estimat greutatea moleculară a unui lanț catalitic la 33-34,000 Da, astfel că subunitatea catalitică conține trei situsuri de legare și este un trimer (Weber, 1968). În 1969 s-au realizat o serie de studii cinetice asupra subunității catalitice a ATC (Collins și Stark, 1969; Porter și colab., 1969; Schmidt și colab., 1969). Legarea substraturilor de subunitate este ordonată, carbamil fosfat fiind primul care se leagă, urmat de aspartat, carbamil aspartatul disociază primul și apoi fosfatul (Collins și Stark, 1969; Porter și colab., 1969; Schmidt și colab., 1969).

Cel de-al doilea tip de subunitate, izolat în urma tratamentului cu p-hidroximercuribenzoat, este o proteină fără activitate catalitică, mai mică, neesențială pentru activitatea subunității catalitice, cu un coeficient de sedimentare de 2.8S, conținând toate situsurile pentru reglarea de către CTP, fiind astfel denumită subunitate reglatorie (Gerhart, 1964; Gerhart și Schachman, 1965). Subunitatea reglatorie este stabilă, fiind capabilă să își mențină afinitatea pentru efectorii CTP și ATP, iar atunci când agenții disocianți sunt îndepărtați, subunitatea nu agregă (Gerhart și Schachman, 1965).

În studiile asupra structurii primare a ATC, Weber (Weber, 1968) a determinat secvența de amino acizi a subunității reglatorie, precum și greutatea moleculară (17,000 Da) a acesteia, prin denaturare cu SDS. Ținînd cont de faptul că, în urma tratamentului cu p-hidroximercuribenzoat, subunitatea reglatorie disociată prezintă o greutate moleculară de 30-36,000 Da (Gerhart și Schachman, 1965; Gerhart și Schachman, 1968), este foarte probabil să existe două lanțuri polipeptidice reglatorii per subunitate izolată (O’Donovan și Neuhard, 1970).

Subunitatea reglatorie izolată formează homodimeri, și reprezintă o clasă de proteine produsă de către celulă pentru controlul activității catalitice (Gerhart și Schachman, 1965). Acest control prezintă două caracteristici pertinente: (I) o fracție mare a proteinei totale ATC (32%) este implicată exclusiv în acest reglaj, și (II) prezența subunității reglatorie reduce activitatea catalitică a enzimei native (O’Donovan și Neuhard, 1970).

Disocierea ATCazei native de către compușii mercurici este reversibilă prin adăugarea compusului sulfidril mercaptoetanol (Gerhart și Schachman, 1965). Enzima reconstituită este similară cu cea nativă din care a disociat inițial, din punct de vedere al dimensiunii moleculare (11.8S), sensibilității față de CTP și proprietăților catalitice; ceea ce indică faptul că enzima nativă este capabilă de agregare spontană (Gerhart și Schachman, 1965).

Deși calea de biosinteză a nucleotidelor pirimidinice prezintă etape comune în toate organismele, caracteristicile structurale și funcționale diferă în funcție de specie (O’Donovan și Neuhard, 1970). Astfel, Jones și colaboratorii au descoperit în urma studiilor realizate asupra ATCazei din specii de Pseudomonas (P. aeruginosa și P. fluorescens), că atât CTP cât și UTP realizează inhibiție de tip feedback, aceasta fiind competitivă cu carbamil fosfat și nu cu aspartat (Bethell și Jones, 1969; Neumann și Jones, 1964). În cazul enzimei din P. aeruginosa tulpina PA01, activitatea ATCazei este inhibată de către UTP, în competiție cu aspartatul (Isaac și Holloway, 1968). În cazul Pseudomonas aeruginosa, tratamentul cu p-hidroximercuribenzoat nu a produs separarea ATCazei din această specie în subunitățile catalitice și reglatorii, în schimb acest tratament a dus la scăderea în paralel a acestor funcții (O’Donovan și Neuhart, 1970).

ATCaza din Pseudomonadaceae este o enzimă de clasă A identificată pentru prima dată de Jones și Adair în 1972 (Adair și Jones, 1972), fiind alcătuită din șase lanțuri catalitice de 36 kDa și șase lanțuri polipeptidice, cu funcție necunoscută, de 45 kDa, cu structura primară omologă dihidroorotazei, însă fără activitate catalitică (Evans și colab., 2002). S-au realizat experimente cu scopul de a disocia subunitățile catalitice de subunitățile pseudo-dihidroorotază (pDHO), și de a realiza expresia subunității catalitice, însă au fost fără succes, ceea ce sugerează că subunitățile pDHO sunt absolut necesare pentru asamblarea complexului proteic (Dutta și O’Donovan, 1987).

Primele studii realizate în cazul ATCazei din Pseudomonas fluorescens (Adair și Jones, 1972) au sugerat că această moleculă este un dimer, însă în 1993 a fost demonstrată structura de dodecamer formată din șase lanțuri catalitice de 36 kDa și șase lanțuri polipeptidice, cu funcție necunoscută, de 45 kDa (Bergh și Evans, 1993; Shepherdson și McPhail, 1993). În urma experimentelor de clonare și secvențializare a genelor care codifică ATCaza din Pseudomonas putida și P. aeruginosa (Schurr și colab., 1995; Vickrey, 1993), s-a demonstrat faptul că lanțurile de 36 kDa sunt omoloage lanțurilor catalitice din alte ATCaze caracterizate anterior, însă secvența polipeptidică de 45 kDa este mai asemănătoare cu DHOaza bacteriană, enzimă ce catalizează etapa imediat următoare din calea de biosinteză a nucleotidelor pirimidinice. Cu toate acestea, complexul enzimatic nu prezintă activitate dihidroorotazică, motiv pentru care polipeptidul de 45 kDa a fost denumit pseudo-DHOază, analog domeniului omolog inactiv găsit în proteina multifuncțională de la drojdii, codificată de locusul ura2 (Souciet și colab., 1989).

Reglajul enzimei din Pseudomonas este neobișnuit, în sensul că enzima este inhibată de concentrații scăzute ale tuturor nucleotidelor trifosfat (Adair și Jones, 1972; Bergh și Evans, 1993). Conservarea completă de la nivelul ATCazei din P. aeruginosa, a tuturor rezidurilor implicate în cataliza subunității catalitice din enzima nativă din E. coli, sugerează că cele două enzime împărtășesc un mecanism catalitic comun (Evans și colab., 2002).

ATCaza din E. coli, enzimă de clasă B, poate fi disociată cu ajutorul compușilor mercurici în doi trimeri activi din punct de vedere enzimatic și trei dimeri reglatori, iar în baza studiilor structurale realizate în decursul anilor, s-a demonstrat faptul că toate rezidurile necesare pentru legarea substratului și pentru cataliză sunt prezente la nivelul lanțului catalitic, iar situtul activ este compus din amino acizii localizați la nivelul interfeței a două lanțuri catalitice adiacente din același trimer (Evans și colab., 2002). ATCaza de clasă C din Bacillus subtilis (Barbson și Switzer, 1975) și domeniul ATC izolat din proteina multifuncțională mamaliană CAD (Grayson și Evans, 1983; Maley și Davidson, 1988) sunt ambele trimeri cu activitate catalitică, indicând faptul că activitatea catalitică se desfășoară la nivelul homotrimerului catalitic.

În contrast, încercări anterioare de a exprima subunitatea catalitică a ATCazei din Pseudomonas prin deleția genei pyrC’ care codifică pDHO, au dus la crearea de plasmide incapabile de complementaritatea tulpinilor de E. coli cu deficiență de ATCază (Schurr și colab., 1995). În consecință, spre deosebire de subunitatea catalitică a enzimelor de clasă B sau C, subunitatea catalitică a enzimei din Pseudomonas aeruginosa este inactivă în absența lanțurilor pDHO (Schurr și colab., 1995).

Aquifey aeolicus, microorganism capabil de creștere la 95șC, este o eubacterie hipertermofilă ocupând una dintre primele ramificații ale arborelui filogenetic procariot (Deckert și colab., 1998). ATCaza din Aquifex aeolicus este un homotrimer format din lanțuri catalitice de 34 kDa, fără interacții homotropice sau heterotropice datorită absenței subunităților reglatorii (Purcărea și colab., 2003). În urma clonării și expresiei în E. coli a genei pyrB care codifică pentru ATCaza din acest hipertermofil, și a purificării proteinei recombinante rezultate, proprietățile catalitice ale acesteia au indicat faptul că valorile Km pentru ambele substrate, carmabil fosfat și aspartat, sunt cu 30-40% mai scăzute față de valorile Km ale subunității catalitice ale ATCazei din E. coli, indicând o afinitate aparentă ridicată pentru cele două substrate (Purcărea și colab., 2003). Modelarea structurii tridimensionale și analiza structurii primare au confirmat conservarea amino acizilor constituenți ai situsului activ al ATCazei din A. aeolicus cu cei din ATCaza din E. coli (Purcărea și colab., 2003).

Activitatea ATCazei prezentă în hipertermofilul A. aeolicus crește odată cu creșterea temperaturii fără să existe vreo modificare a Km pentru substraturile carbamil fosfat și aspartat (Purcărea și colab., 2003). Pentru evitarea degradării termice rapide a carbamil fosfatului generat in situ de carbamoil fosfat sintetaza (CPSaza) din A. aeolicus, acest produs intermediar de reacție este transferat la situsul de reacție al ATCazei printr-un proces de canalizare directă (channeling) (Purcărea și colab., 2003). Afinitatea relativă crescută pentru substrate și transferul direct al carbamil fosfatului de la situsul activ al CPSazei la cel al ATCazei, contribuie la protejarea metabolitului împotriva degradării la temperaturi ridicate și previne formarea cianatului, un agent alkilant toxic (Allen și Jones, 1964; Van de Casteele și colab., 1990).

Studiul ATCazei din tulpina bacteriană psihrofilă TAD1, izolată din apele continentale înghețate din Antarctica, a indicat o activitate deosebit de ridicată a enzimei la temperaturi scăzute, fiind cu 26% mai crescută la 0șC, decăt la 30șȘI COLABC (Sun și colab., 1998). Spre deosebire de ATCaza din E. coli, proprietățile cinetice ale enzimei din TAD1 sugerează că activitatea crescută în cazul temperaturilor scăzute se datorează eficienței catalitice crescute, proprietate ce ar putea fi rezultatul direct al unor modificări discrete localizate la nivelul situsului catalitic, deoarece această enzimă psihrofilă este la fel de stabilă la temperaturi crescute precum enzima omoloagă din bacteria mezofilă Escherichia coli (Sun și colab., 1998).

Aceste modificări de la nivelul situsului catalitic al ATCazei psihrofile nu schimbă stabilitatea termică globală a proteinei (Feller și colab., 1990; Smalås și colab., 1994; Ciardiello și colab., 1995, 1997a, 1997b). ATCaza din bacteria psihrofilă TAD1 are capacitatea de a cataliza carbamilarea grupării amino a aspartatului la temperaturi scăzute, fiind o enzimă supusă reglajului alosteric (Sun și colab., 1998) prin inhibare de tip feedback de către CTP și UTP. Spre deosebire de ATCaza din E. coli, ATP nu prezintă efect activator asupra enzimei din tulpina psihrofilă TAD1 (Thiry și Hervé, 1978).

CAPITOLUL II. MATERIALE ȘI METODE

2.1. MATERIALE ȘI METODE MICROBIOLOGICE

2.1.1. Tulpina Rugamonas sp.

Tulpina bacteriană Rugamonas sp. PAMC27505 aparținând colecției microbiene a Institutului de Cercetare Polară Sud-Korean (Korea Polar Research Institute – KOPRI), a fost izolată dintr-un lac din Insula King George, Insulele South Shetland, Antarctica.

2.1.2. Medii de cultură

Pentru cultivarea tulpinii de studiu Rugamonas PAMC27505, am utilizat următoarele tipuri de medii de cultură (Tabelul 2.).

2.1.3. Condiții de cultivare

Tulpina bacteriană Rugamonas PAMC27505 a fost cultivată în mediu R2B, la 15°C timp de 48 de ore. Cultura bacteriană obținută a fost în continuare transferată pe mediu solid R2A și cultivată tot la 15șC timp de 7 zile.

Alternativ, cultivarea tulpinii s-a realizat în mediu LB sau LB-agar, la 17șC timp de 48 de ore și respectiv 7 zile, pentru a putea determina dacă tulpina bacteriană Rugamonas PAMC27505 este capabilă de creștere și dezvoltare și pe alt mediu față de cel specific pentru bacteriile provenite din surse de apă.

Culturile lichide în R2B și LB au fost prezervate la -80șC în prezență de 50% glicerol (v/v) (SC. EL-CHIM SRL).

2.2. MATERIALE ȘI METODE MOLECULARE

2.2.1. Extracția ADN genomic și plasmidial

ADN genomic a fost extras din cultura de Rugamonas PAMC27505 cu ajutorul kitului DNeasy Blood&Tissue Kit (QIAGEN), printr-un procedeu modificat care a adăugat o etapă preliminară de liză celulară chimică cu mutanolizină (5 U/µL) timp de 1 oră la 37șC. A urmat o altă etapă de liză mecanică, în prezența unor biluțe din ceramică cu diametrul de 0.4-0.6 mm și 1.4-1.6 mm (innuSPEED Lysis Beads, AnalytikJena). Liza mecanică s-a realizat în Omogenizatorul SpeedMIill PLUS (AnalytikJena) cu programul standard pentru Bacteria.

După extracția ADN genomic și determinarea concentrației și a purității A260/A280 prin metodă spectrofotometrică cu ajutorul aparatului NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), a fost realizat o etapă inițială de amplificare prin PCR cu ajutorul DreamTaq DNA polimeraza (Thermo Scientific), cu amorse specifice (Tabelul 3.) pentru gena 16S bacteriană, utilizând un amestec de reacție (Tabelul 4.) și un protocol de amplificare (Tabelul 5.) specifice pentru polimeraza folosită.

Vectorul de clonare și expresie bacteriană pHAT2 a fost amplificat utilizând kitul Zyppy Plasmid Miniprep Kit (Zymo Research) conform protocolului standard. Pentru aceasta s-a utilizat o cultură de E. coli DH5α transformată cu pHAT2 (1 mL) incubată la 37șC timp de 16 ore în mediu LB conținând 100 µg/mL ampicilină.

Concentrațiile (ng/μL) au fost determinate cu ajutorul Sectrofotometrului BioDrop Duo (BIODROP).

2.2.2. Clonarea genei prin amplificare PCR (Polymerase Chain Reaction)

Clonarea în Esherichia coli a genei de interes pentru ATCază, pyrB, s-a realizat într-o serie de etape succesive, în fiecare etapă fiind utilizate kituri de reacție sau reactivi specifici. Clonarea genei s-a realizat prin amplificare PCR și ligare în vectorul de expresie bacteriană pHAT2 (Invitrogen). Pentru amplificarea genei de interes am utilizat un set de amorse specifice (Eurogentec) (Tabelul 6.), urmând protocoale diferite pentru cele două tipuri de ADN polimeraze utilizate, DreamTaq DNA Polymerase (5 U/μL) și Pfu DNA Polymerase (2.5 U/μL, recombinant), ambele achiziționate de la ThermoScientific.

Amestecurile de reacție (Tabelul 7.) și condițiile de reacție (Tabelul 8.) utilizate pentru amplificarea PCR a genei, sunt indicate atât pentru etapa de determinare a condițiilor optime de amplificare în care s-a folosit DreamTaq DNA polimeraza, cât și pentru etapa finală de obținere a ampliconului pentru clonare în care s-a utilizat Pfu DNA polimeraza. Amplificarea genei pentru clonare s-a realizat în prezență de Pfu DNA polimerază datorită ratei scăzute de erori de amplificare a acestei polimeraze.

Pentru realizarea amplificării PCR a genei de interes a fost utilizat aparatul Mastercycle proS vapo.protect (Eppendorf). Ampliconul obținut a fost purificat cu ajutorul kitului PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen) urmărind protocolul standard.

Atât vectorul pHAT2 cât și produsul PCR obținut au fost supuși unei etape de digestie enzimatică cu enzime de restricție FastDigest NcoI/HindIII (Thermo Scientific) la 37șC timp de 2 ore (Tabelul 9.), iar produșii rezultați au fost purificați cu PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen).

În urma digestiei enzimatice, vectorul pHAT2 a fost defosforilat cu ajutorul FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (Thermo Scientific). Amestecul de reacție (Tabelul 10.) a fost incubat la 37șC timp de 10 minute pe Termobloc (Eppendorf) și reacția a fost stopată prin incubare la 75șC timp de 5 minute.

Ligarea insertului la vectorul pHAT2 deforforilat s-a efectuat în prezența ligazei T4 DNA Ligase (5 Weiss U/ μL, Thermo Scientific). Amestecul de ligare (Tabelul 11.) a fost incubat la temperatura camerei (20șC – 25șC) timp de 2 ore.

Constructul rezultat pATCR a fost introdus în celulele competente E. coli DH5α (Mix&Go Competent E. coli cells, Zymo Research) urmând protocolul de transformare prin șoc termic de incubare pe gheață timp de 1 oră, iar celulele astfel transformate au fost cultivate pe mediu LB-agar în prezență de Ampicilină 100 µg/mL, la 37șC timp de 16 ore.

Coloniile obținute au fost cultivate în LB conținând ampicilină, iar extracția plasmidială a fost realizată conform procedurii descrise în cazul amplificării pHAT2 (2.2.1.). În urma digestiei enzimatice cu FastDigest HindIII, plasmidul linearizat rezultat a fost analizat prin electroforeză în gel de agaroză 1% pentru evaluarea dimensiunii și, respectiv, eficiența ligării insertului.

2.2.3. Expresia genică în E. coli

Expresia bacteriană a pATCR s-a realizat în tulpina de E. coli BL21(DE3) (BioLabs). În urma transformării celulelor competente cu plasmidul pATCR, coloniile au fost inoculate în 1 mL LB în prezența a 100 µg/mL ampicilină la 37șC timp de 16 ore. Inoculul a fost în continuare cultivat în aceleași condiții, în urma inoculării mediului LB în raport 1:100 (v/v) până la D.O600 = 0.6. După inducția cu 0.5 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), expresia proteinei a fost realizată la 15șC, 20șC și 37șC timp de 3 ore și 16 ore.

În urma centrifugării, celulele au fost resuspendate în tampon Tris-HCl pH 7, și sonicate la 55% putere, timp 5 cicluri cu 5 secunde impuls, 60 de secunde pauză, cu ajutorul aparatului SONOPLUS (Bandelin). Extractul celular a fost centrifugat 30 de minute la 13000 rpm, iar fracția solubilă a fost separată de cea insolubilă. Aceasta din urmă a fost resuspendată în volum egal de tampon Tris-HCl pH 7, iar cele două fracții proteice au fost analizate prin electroforeză SDS-PAGE (Tabel 12.).

2.3. METODE DE BIOINFORMATICĂ

2.3.1. Secvențializarea genei pyrB din Rugamonas PAMC27505

Ampliconul reprezentând gena pyrB din Rugamonas PAMC27505 inserată în vectorul pHAT2 din plasmidul rezultat în urma clonării a fost secvențializat utilizând amorsele de clonare (Tabelul 6.) pentru verificarea acurateții amplificării PCR. Secvențializarea a fost efectuată de către compania MACROGEN, Amsterdam, prin metoda Sanger.

2.3.2. Metode bioinformatice utilizate pentru analiza structurii proteice a ATCazei

În vederea analizării structurii proteinei ATCază din Rugamonas PAMC27505 am utilizat mai multe programe online, precum EMBOSS Needle (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/) pentru alinierea globală a câte două structuri primare și Clustal OMEGA EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) pentru alinierile multiple ale secvențelor de amino acizi.

Pentru analiza conținutului de amino acizi a proteinei studiate în acest experiment și a altor trei ATCaze (E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Aquifex aeolicus) am folosit programul ProtParam EXPASY (http://web.expasy.org/protparam/).

Reprezentarea structurilor cristalografice ale ATCazei din E. coli (subcapitolul 1.3.1. ASPARTAT CARBAMOILTRANSFERAZA, Fig. 6 și Fig. 7) a fost realizată cu ajutorul programului NGL Viewer din PDB (Protein Data Base) (Rose și Hildebrand, 2015; Rose și colab., 2016).