CAPITOLUL I CARACTERIZAREA GENERALA A BACILILOR GRAM NEGATIVI NONFERMENTATIVI OPORTUNISTI (BGNNF) Caracterizarea familiei Pseudomonadaceae Genul… [304583]

Cuprins

INTRODUCERE

PARTEA TEORETICĂ

CAPITOLUL I CARACTERIZAREA GENERALA A BACILILOR GRAM NEGATIVI NONFERMENTATIVI OPORTUNISTI (BGNNF)

Caracterizarea familiei Pseudomonadaceae

Genul Acinetobacter

Habitat

Patogenitate

Diagnostic

Tratament

Principalele specii ale genului Acinetobacter

Acinetobacter baumannii

Acinetobacter lwoffii

Acinetobacter johnsonii

Alte specii de Acinetobacter

A. calcoaceticus

A. junii

A. nosocomialis

A. pittii

Genul Pseudomonas

Principalele specii ale genului Pseudomonas

P. aeruginosa

Alte specii ale genului Pseudomonas

P. fluorescens

P. stutzeri

P. syringae

P. cepacia

Genul Stenotrophomonas

Principalele specii ale genului Stenotrophomonas

S. [anonimizat] β- lactamice

Penicilinele

Cefalosporinele

Carbapenemele

Monobactamele

Inhibitori ai betalactamazelor

Mecanismul de acțiune al antibioticelor β-lactamice

Antibiotice cu țintă de acțiune asupra membranei plasmatice

Antibiotice ce inhibă replicarea ADN

Antibiotice ce inhibă transcrierea

Rifamicinele

Sorangicina

Straptolidigina

Ansamicinele

Antibiotice ce inhibă sinteza proteică

Aminoglicozidele

Neomicina

Streptomicinaa

Tetraciclinele

Lincosamidele

Mactolidele

Antibiotice ce inhibp sinteza metaboliților esențiali.

[anonimizat] A.BAUMANNII, P. AERUGINOSA SI S. [anonimizat] a genelot cel mai frecvent raportate la specia analizată.

Rezistența mediată de plasmide

Rezistența mediată de integroni

Rezistența mediată de transpozoni

Mecanismele biochimice ale rezistenței la antibiotice.

Impermeabilitatea membranei celulare

Modificarea țintei antibioticului

Inactivarea enzimatică a antibioticelor.

[anonimizat]-2 Compact.

Testarea spectrului de sensibilitate la antibiotic ale tulpinilor de Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. și Stenotrophomonas sp. cu ajutorul sistemului Vitek-2 compact

Obținerea ADN bacterian

Evidențierea materialului genetic la antibiotice β-lactamice si quinolone prin intermediul reacției PCR

.[anonimizat], prezintă o serie de caracteristici care fac combaterea acestora o misiune foarte dificilă. Aceste microorganisme sunt extrem de eficiente în reglarea expresiei sau dobândirea genelor ce codifică pentru diferite mecanisme de rezistență la antibiotice. Rata de rezistență la antibiotice în rândul acesor patogeni a [anonimizat]. [anonimizat]. Rata de rezistență la antibiotice a microorganismelor, [anonimizat] a perioadelor mari de internare a acestor pacienți mult mai predispuși infecțiilor nosocomiale datorită utilizării dispozitivelor medicale invazive, cum ar fi tuburi endotraheale și gastrointestinale, catetere urinare și venoase, proteze, etc. Răspândirea la nivel global a microorganismelor rezistente este favorizată de o igienă precară, utilizate excesivă și fară rețetă a antibioticelor comune, precum și frecvența călătoriilor internaționale.

Această lucrare a fost realizată cu scopul studierii markerilor fenotipici și moleculari de rezistență la antibiotice ai tulpinilor de Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. și Stenotrophomonas sp. izolate din cadrul Spitalului Clinic Fundeni din București. Lucrarea de față este structurată pe două părți. Prima parte constituie partea teoretică și prezintă caracteristicile generale ale bagililor Gram-negativi, nonfermentativi oportuniști, principalele clase de antibiotice și mecanismele lor de acțiune, precum și mecanismele de rezistență la antibiotice întâlnite la tulpinile de A. baumannii, P. aeruginosa și S. maltophilia.

Cea de-a doua parte și cea mai importantă, constituie partea practică în care este descrisă analiza personală a unor tulpini nosocomiale, multirezistente de Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. și S. maltophilia, incluzând studiul profilurilor de rezistență la antibiotice ale acestora, precum și studierea la nivel genotipic a markerilor moleculari de rezistență la antibiotice β-lactamice prin metoda PCR, urmată de electroforeza ampliconilor obținuți, în vederea reducerii riscului de diseminare epidemiologică.

PARTEA TEORETICĂ

CAPITOLUL I CARACTERIZAREA GENERALA A BACILILOR GRAM NEGATIVI NONFERMENTATIVI OPORTUNISTI (BGNNF)

Caracterizarea familiei Pseudomonadaceae

Bacteriile din familia Pseudomonadaceae sunt bacili Gram-negativi, non fermentativi, strict aerobi ce prezintă un flagel polar ce le conferă motilitate. Sunt distribuiti ubicuitat în mediu, putând fi izolate frecvent din insecte moarte.

Anumiți bacili Gram-negativi, membrii ai acestei familii sunt foarte frecvent agenți etiologici pentru un număr mare de infecții nosocomiale. Bacteriile aparținând familiei Pseudomonadaceae se diferențiază de bacteriile aparținând altor familii prin prezența enzimei citocrom c oxidaza, prezența flagelului polar și incapacitatea de a realiza fermentația (Jurat-Fuentes & Jackson, 2012).

Genul Acinetobacter

Genul Acinetobacter reprezintă un gen de bacterii Gram-negative,cu un procent de Guanină – Citozină de 39-47% . Acești cocobacili sunt strict aerobi nonmotili, catalazo pozitivi și oxidazo negativi. Majoritatea speciilor de Acinetobacter pot fi cultivate pe medii minerale conținând nitrat de amoniu sau azotat de sodiu și o singură sursă de carbon, cum ar fi acetatul, lactatul sau piruvatul. Importanța clinică a acestui gen se datorează faptului ca multe specii ale genului sunt responsabile de apariția infecțiilor nosocomiale. Principalele specii ale genului Acinetobacter izolate în laboratoarele clinice sunt A. lwoffi, A. clcoaceticus, A. baumanii și A. haemolyticus (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996).

Speciile genului Acinetobacter sunt bacili scurți, până la formă cocoidală, sunt Gram negativi și apar dispuși în perechi, fiind imobili și frecvent capsulați.

Speciile genului Acinetobacter nu atacă fermentativ glucoza, însă o pot degrada oxidativ, fapt ce conduce la acidifierea mediului de cultura. Coloniile sunt albe, opace , cu margine întreagă

Toate tulpinile sunt rezistente la penicilină , iar multe dintre izolatele din spitale sunt multirezistente. Astfel aceste microorganisme și-au câștigat importanța, iar datorită capacității lor de a coloniza pacienții ce urmează terapii cu antibiotice pot da naștere la infecții invazive la pacienții imunodeprimați. Infecțiile rezultate pot lua forma unor pneumonii , unor infecții ale tractului urinar, abcese, bacteriemie, etc (Tripathi et al., 2014).

Habitat

Speciile genului Acinetobacter sunt distribuite ubicuitar în apele de suprafață si sol. De asemenea anumite specii fac parte din microbiota tegumentului. Aceste microorganisme sunt prezente in orofaringe, nazofaringe, colon vagin, etc. O importanță deosebită este acordată genului Acinetobacter datorită faptului că tulpini ale acestuia sunt izolate frecvent din mediu de spital de pe instalații tehnico-sanitare, instalații de apa, aparate de climatizare și chiar de pa mâinile personalului. De asemenea asemenea microorganisme sunt izolate frecvent în industria alimentară a cărnii.

În mediul spitalicesc, tulpinile de Acinteobacter sp. se transmit adesea datorită persistentei pe suprafețe, și răspândirii prin mâinile personalului medical. Cu toate acestea multiple cazuri de infecții nosocomiale răspândite prin aerosol au fost raportate (Vijayakumar et al., 2019).

Patogenitate

Genul Acinetobacter prezintă virulență scazută, dar este totuși capabil să provoace infecții fie singur fie în asociație cu alte microorganisme, a căror virulență este exacerbată. Astfel, este cunoscut faptul că infecțiile mixte au o evoluție mult mai severă decât cele in care unicul agent etiologie este o specie de Acinetobacter.

Acinetobacter sp colonizează pacienții spitalizați în unitățiile de terapie intensivă, afectând în principal pacienții intubați cu drenaje chirurgicale sau catetere urinare, cu multiple linii intravenoase sau pe cei cu dispozitive de monitorizare.

Deși rare, infecțiile cauzate de Acinetbacter sp, prezintă afinitate pentru sistemele cu un conținut ridicat de fluide : tract urinar, respirator, lichid intraperitoneal, etc.

Pneumonia cu tulpini de Acinetobacter sp. apare ca o infecție nosocomială, adesea asociată cu utilizarea de fluide sau echipamente contaminate cu diferite tulpini de Acinetobacter (Tripathi et al., 2014).

Diagnostic

Pentru diagnosticul unei eventuale infecții cu Acinetobacter sp. se prelevează probe de puroi, sânge, urină, tuburi de dren, catetere, etc. Un aspect deosebit de important în diagnosticul de laborator constă în a se face distincția între colonizare si infecție, fapt ce presupune prelevări repetate și examenul microscopic al produsului patologic de analizat. Pentru identificarea speciei se folosesc caracterele de cultură și biochimice, cum ar fi temperatura de creștere, hidroliza gelatinei, acidifierea clucozei, hemoliza etc (Weber et al., 2016).

Tratament

Multe tulpini ale genului Acinetobacter sunt in mod natural multirezistente la antibiotice, prin capacitatea lor de a produce beta-lactamaze si enzime ce inactivează aminoglicozidele. Foarte putine antibiotice sunt eficiente împortiva speciilor de Acinetobacter, cum ar fi : imipenem , meropenem, amikacin, etc. Însă acest tratament trebuie facut doar in cazurile de infecție documentată , sub controlul strict al antibiogramei (Weber et al., 2016).

Principalele specii ale genului Acinetobacter.

Acinetobacter baumannii

A. baumannii a apărut ca unul dintre cei mai dificil de combătut agenți patogeni pentru instituțiile de sănătate, iar semnificația sa clinică a crescut exponențial în ultimul deceniu, fiind propulsată de capacitatea acestui microorganism de a regla sau de a dobândi determinanți de rezistență fiind unul dintre organismele ce amenință era actuală a antibioticelor.

În momentul de față au fost raportate numeroase cazuri de tulpini de A.baumannii rezistente la toate antibioticele cunoscute, vorbindu-se adesea de panrezistență . Pe langă multirezistența la antibiotice, importanța clinică a acestui microorganism a fost exacerbată și de capacitatea tulpinilor de A. baumannii de a rezista perioade îndelungate, potențândui capacitatea de răspândire nosocomială a acestuia. După cum arată anumite recenzii, pneumonia dobândită în spital este încă cea mai frecventă infectie cauzata de A.baumannii (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996).

Succesul tulpinilor de A. baumannii de a coloniza gazda umana și de a supraviețui în habitatele clinice se datorează mai multor factori , cum ar fi : formarea de biofilme, rezistență la desicare, adaptarea metabolică, clonizarea si invazia celulelor epiteliale sau endoteliale umane, multirezistența la antibiotice, producția de fosfolipază , etc.

Există dovezi substanțiale conform cărora produsele de clivaj ale fosfolipazei, deglanșează cascade de reglaj ce sprijină invazia gazdelor și persistența acestor microorganisme (Tripathi et al., 2014).

Tulpinile de A.baumanni multirezistente sunt adesea asociate cu co-infecțiile cu alti patogeni cu virulență superioară.

Din puct de vedere morfologic, aceștia sunt bacili Gram-negativi, strict aerobi, pleomorfi și imobili. Acesti patogeni oportuniști au o incidență ridicată printre indivizii imunocompromiși, în special printre cei internați în spitale de mai mult de 90 de zile. Fiind asociat cu mediile umede, acest microorganism a fost frecvent izolat de pe piele, dar si din secrețiile respiratorii si orofaringiene ale indiviziilor infectați.

În mod similar cu ceilalti reprezentanți ai genului Acinetobacter, tulpiniile de A. baumannii sunt de asemenea răspândite în mod ubicuitar în sol și apele de suprafață , pe plante și animale fiind ușor de cultivat în laborator, pe medii simple. Acest microorganism poate utiliza ca unică sursă de carbon diferite substrate, cum ar fi glucoză, acetat, lactat, etc. , putând de asemenea să supraviețuiască chiar și în apă distilată.

Cu toate că acest microorganism este asociat cu infecții ale pielii, A. baumannii se găsește foarte rar ca parte a microflorei pielii, un studiu estimând că doar 3% din populație este colonizată de A. baumannii.

În ciuda multiplelor studii asupra virulenței și patogenității acestui agent infecțios foarte putine lucruri se știu despre adevăratul său potențial patologic. Printre factorii care ar determina patogenitatea tulpinilor de A. baumannii se numără porina OmpA, o proteină localizată in membrana externă, ce s-a demonstrat a contribui in mod seminficativ la potențialul cauzator de boli determinare de acest agent patogen. OmpA are capacitatea de a se lega de mitocondria celulelor gazdă, moment în care produce umflarea acestora. Drept urmare se produce eliberarea de citocrom C, o hemoproteină ce conduce la formarea apoptozomului. Aceste reacții conduc în final la moartea celulei. A. baumanni formează biofilme ce îi permite acestuia sa crească și să persiste în condiții și medii nefavorabile (Nie et al., 2020).

Emergența rapidă a tulpinilor multi rezistente de Acinetobacter sp. scot în evidență capacitate microorganismului de a se adapta rapid la schimbările selective și la presiunile exercitate de mediu.

Toate variantele genetice ale speciei A. baumannii conțin o cefalosporinază AmpC neinductibilă. Prezența unei secvențe de inserție în regiunea upstream cunoscut sub denumirea de ISAba1, determină reglarea genei AmpC. Cefepimele si carbapenemele sunt aparent stabile la acțiunea acestor enzime (Howard et al., 2012).

A. baumannii posedă de asemenea o oxaciclinază intrinsecă ce aparține grupului de enzime OXA-51-like ce prezintă peste 40 de variante de secvență. Enzimele OXA-51 sunt capabile sa hidrolizeze penicilinele (ampicilină, piperacilină benzilpenicilină, etc.) și carbapenemele (imipenem si meropenem), însă această capacitate este foarte slabă. Creșterea rezistentei la antibioticele beta-lactamice, necesită prezența unui element de inserție ISAba1, upstream față de gena respectivă, ce acționează ca un puternic promotor transcripțional. Cel mai frecvent mecanism enzimatic de rezistență la carbapeneme constă în producția de oxaciclinaze , codificate de linia genelor genele blaOXA-23, blaOXA-40 si blaOXA-58 (Poirel & Nordmann, 2006).

Printre maladiile cauzate de tulpinile de A. baumannii, pneumonia asociată pacienților ventilați mecanic este cea mai întâlnită. Perioade îndelungate de spitalizare sau de ventilație mecanică, precum și utilizarea anterioară de antibiotice sunt principalii factori care intensifică riscul de pneumonie asociată ventilației (Howard et al., 2012).

Un aspect foarte îngrijorător cu privire la A. baumannii îl constituie multirezintența la antibiotice dobândită a acestui microorganism.

În trecut, infecțiile cu tulpini de A. baumannii au fost tratate cu meropenem sau imipenem, însă a fost observată o creștere constantă a rezistenței acestui microorganism la acțiunea antibioticelor respective de ultimă linie. Ca urmare au fost abordate noi strategii de tratament , care de cele mai multe ori se bazează pe utilizarea polimixinelor, în special colistin, însă administrarea de colistin este considerată în prezent ultima variantă de tratament, întrucât poate avea manifestări secundare nedorite, printre care, cel mai frecvent apar leziuni renale (Viehman et al., 2014).

A. lwoffii

A. lwoffii este un bacil Gram-negativ, aerob, nefermentativ, important din punct de vedere clinic, datorită capacității acestuia de a declanșa infecții nosocomiale în cazul pacienților imunodeprimați. Este considerat ca facând parte din microflora normală a pielii , putând de asemenea sa colonizeze până la 25% din orofaringele uman. Datorită capacității acestui microorganism de a rezista la variații mari de temperatură, dar și la valori scăzute al pH-ului mediului, A. lwoffii poate fi găsit adesea în mâncările congelate sau pasteurizate. De asemenea acest microorganism este rezistent la acțiunea unui număr mare de dezinfectanți, la iradiere și desicare (Ku et al., 2000).

A. johnsonii

A. johnsonii este un bacil Gram-negativ, nonfermentativ, întâlnit în mod frecvent în mediu, ce poate coloniza pielea umană și să cauzeze infecții clinice, cum ar fi infecții ale fluxului sanguin asociate cateterelor, sau peritonite, asociate cu dializa peritoneală.

A. johnsonii provoacă rar infecții umane, iar majoritatea izolatelor de A. johnsonii sunt relativ sensibile la acțiunea antibioticelor. Cu toate acestea recent au fost raportate tulpini care posedă o varietate de beta-lactamaze. Printre aceste beta lactamaze, cele mai frecvent întâlnite sunt PER-2 și OXA-58, însă au identificate, mai puțin frecvent și tulpini ce posedă beta lactamaze de tipul TEM-1, sul-1 strA și strB, fapt ce sugerează faptul ca A. johnsonii dobândește activ ADN exogen de la alte specii bacteriene, devenind implicit un rezervor de gene de rezistență (Montaña et al., 2016).

Alte specii de Acinetobacter

A. calcoaceticus

A. calcoaceticus este un bacil Gram-negativ, nonfermentativ, distribuit cu prevalență în natură și frecvevnt comensal la om. Cu toate că acest microorganism este considerat ca fiind un patogen rar la oameni, au fost descrise infecții cu tulpini de A. calcoaceticus , cum ar fi septicemi, endocardite, meningite, abcese de creier sau plămâni, pneumonii, etc. În general, majoritatea infecțiilor cu tulpini de A. calcoaceticus apar în cazul pacienților spitalizați, frecvența lor fiind influențată de vârstă, prezența bolilor cronice, dizabilități acute sau severe, etc (Inzana, 1990).

A. junii

A. junii este un bacil Gram-negativ, nonfermentativ, rareori patogen la om, fiind asociat focarelor de septicemie la nou născuți și la pacienții cu oncologie pediatrică. Acest patogen oportunist, este susceptibil la majoritatea antibioticelor testate, însă s-a constatat faptul că tulpinile izolate din spitale prezentau un nivel mai înalt de rezistență la antibiotice, decât tulpinile izolate in comunități. A. junii a fost descris ca fiind o specie ce colonizează în mod uzual pielea umană fiind responsabil pentru declanșarea bacteriemiilor asociate cateterului. De asemenea au fost raportate cazuri de septicemii, meningite și perforație corneană cauzate de tulpini de A. junii (Abo-Zed et al., 2020).

A. noocomialis

A. nosocomialis este un bacil Gram-negativ, considerat a fi un agent patogen oportunist, fiind parte a complexului A. calcoaceticus-A. baumannii a cărui capacitate de a provoca infecții umane este bine recunoscută, cu toate că A. nosocomialis prezintă o viruență mult mai scăzută decât speciile bacteriene asemănătoare, cum ar fi A.baumannii. Au fost identificați mai mulți factori potențiali de virulență, printre care se numără prezența unui sistem proteic de O-glicozilare, unui sistem de secreție de de tip I, unui sistem de secreție de tip II, prezența proteinei OmpA și a proteazei CpaA, etc (Knight et al., 2018).

A pittii

A. pittii este un bacil Gram-negativ, strict aerob , imovil, oxidazo pozitiv și catalazo negativ, find parte a complexului A.calcoaceticus-A. baumannii. Acest microorganism este distribuit ubicuitar în natură, fiind identificate în diferite tipuri de soluri și ape, și este întâlnit ocazinal și în produsele alimentare. Aceste specii se regăsesc frecvent pe pielea umană și sunt capabile să colonizeze tractul respirator superior, putând provoca infecții în cazul pacienților imunodeprimați (Chusri et al., 2014).

Genunl Pesudomonas

Pseudomonas este un gen de bacili Gram-negativi, nesporulanți, nefastidioși din punct de vedere nutritiv, având unul sau mai mulți flagel polari, strict aerobi, producători de pigment. Speciile ganului Pseudomonas nu atacă fermentativ glucoza. Speciile genului Pseudomonas au fost împărțite in 5 grupuri .

Grupul I cuprinde specii fluorescente si nefluorescente. Specii fluorescente: P. aeruginosa, P. syringae, P. fluoresecens, P. cichorii.

Specii nefluorescente: P. mendocina, P. stutzeri

Grupul II cuprinde specii patogene: P. cepacia, patogen al plantelor , animalelor și în mod accidental al omului ; P. malei și P. pseudomalei, agenți patogeni ai animalelor, însă în mod accidental pot infecta și omul.

În grupul III sunt încadrate specii precum: P. testosteroni, P. acidovorans, P. saccharophila, P.facilis, etc.

Grupul IV cuprinde 2 specii: P. vesicularis și P.diminuta.

Cea mai mare parte a grupului V a fost inclusă în genul Xanthomonas, însă mai cuprinde si speciile P. gardneri și P. geniculata (Palleroni et al., 1972).

Speciile de Pseudomonas sunt comensale ale tubului digestiv. Sunt distribuite ubicuitar în sol, în ape (de râu, canal, de mare, apă potabilă, etc) pe plante, produse alimentare, dar și in mediul spitalicesc (diverse suprafete, duspozitive medicale, soluții antiseptice si dezinfectante, etc.)

Speciile genului Pseudomonas sunt nefastidioase din punct de vedere nutritiv. Pot fi cultivate pe medii simple în strictă aerobioză la temperaturi cuprinse între 5-42 oC . Atât colonia cât și mediul de cultură sunt pigmentate, iar cultura emite un miros aromat de iasomie sau tei.

Tulpinile de Pseudomonas sp. nu fermentează zaharurile, însă atacă fermentativ glucoza, determnând acificierea mediului. Tulpinile sunt oxidazo pozitive, descompun gelatina și nu produc indol.

Speciile genului Pseudomonas sunt rezistente în fața anumitor antiseptice și dezinfectante, produc bacteriocine cu efect bacteriostatic, sunt deosebit de resitente la antibiotice, însă sunt sensibile la pH acid, săruri de Ag si acțiunea unor bacteriofagi

Pseudomonas sp. este un gen cu predispoziție pentru pacienții imunodepresivi, virulența acestor microorganisme fiind asigurată de mai mulți factori : capsulă, ce împiedică pătrunderea antibioticelor în celulă, pili, ce asigură adeziunea la substrat si lipopolizahariul prezent în peretele bacterian, cu rol de endotoxină.

Printre infecțiile provocate de diverse specii ale genului Pseudomonas se numără :

Infecții cutanate (foliculită, intertrigo, piodermită, otită externă)

Infecții ale plăgilor chirurgicale,ulceroase, traumatice, etc

Infecții digestive, enterite acute ce apar în urma tratamentelor cu antibiotice administrate oral, timp îndelungat, etc (Barbara H. Iglewski, 1996).

Principalele specii ale genului Pseudomonas

P. aeruginosa

Denumită și bacilul piocianic P. aeruginosa este un bacil Gram-negativ, incapsulat, ,patogen al plantelor, animalelor și omului și totodată reprezentantul tipic al genului Pseudomonas sp.

P. aeruginosa este microorganismul cel mai frecvent izolat in laboratorul de bacteriologie. Este un microorganism comensal al tubului digestiv, distribit ubicuitar în sol și pe plante. Prezintă tropism pentru mediile umede, putând fi izolat din apa de râu, canal, mare, și apă potabilă.

În ultima perioadă P. aeruginosa este din ce în ce mai frecvent izolat din mediul de spital, ataât de pe suprafețe, aparatură, soluții injectabile și antiseptice, cât și de pe mâinile personalului medical (Bassetti et al., 2018).

P. aeruginosa este un microorganism nefastidios, ce poate crește și se poate divide chiar și în apă distilată, poate fi cultivat pe medii simple, însă în strictă aerobioză. Culturile emit un miros aromat de tei sau iasomie, având reflexe metalice și pigmentație albastru-verzuie.

Din punct de vedere biochimic, P. aeruginosa este un microorganism ce nu atacă fermentativ glucoza, însă este capabil să o degradeze oxidativ, fapt ce conduce la acidifierea mediului de cultură. Este oxidazo pozitiv, nu produce indol , dar descompune gelatina.

Denumirea de bacil piocianic derivă de la capacitatea acestui microorganism de a produce un pigmnet alcătuit din două componente : piocianina verde albăstruie, care este solubilă în cloroform și pioverdina, de culoare galben-verzuie, solubilă în apă și fluorescentă.

P. aeruginosa este un microorganism deosebit de rezistent în mediul extern, fiind capabilă sa prducă bacteriocine ce au efect bacteriostatic față de alte bacterii, este rezistentă față de anumite antiseptice, însă este sensibilă la acțiunea unor bacteriofagi și la valori scăziute ale pH-ului.

Este extrem de rezistent la antibiotice, rezistența la antibiotice fiind rezultatul impermeabilității membranei exteren, dar și datorită capacitații de a produce o beta-lactamază inductibilă (Kumar, Surinder, 2016).

P. aeruginosa este un patogen nosocomial oportunist, ce infectează pacienții imunodeprimați, având tropism pentru tractul urinal, răni, și arsuri, fiind cea mai comună cauză a infecțiilor rănilor provocate de arsuri, dar si principalul factor cauzator al otitei externe. În anumite condiții tuplimile de P. aeruginosa pot cauza pneumonie asociată pacienților ventilați mecanic.

Virulența tulpinilor de P. aeruginosa este datorată exotoxinei A ce inhibă factorul de elongație eucariot EEF2 prin aditia unui rest de ADP-riboză în mod similar cu toxina difterică. Datorită inhibiției acestui factor, sinteza proteică este oprită , producându-se necroza celulei gazdă (Bassetti et al., 2018).

Majoritatea tulpinilor de P. aeruginosa sunt rezistente la un spectru larg de antibiotice, de asemenea, existând riscul dobândirii rezistenței față de alte antibiotice în urma unui tratament ineficient. Datorită rezistenței ridicate , cele mai utilizate antibiotice pentru tratamentul infecțiilor cu tulpini de P. aeruginosa erau carbapenemele, polimixinele și tigeciclinele, însă recent au fost raportate cazuri de rezistență și față de aceste antibiotice. În cazul unei infecții cu tulpini de P. aeruginosa se recomandă administrarea combinată a unor inhibitori ai beta-lactamazelor cum ar fi sulbactam pentru a crește rata de succes a tratamentului (Yayan et al., 2015),

Alte specii ale genului Pseudomonas

P. fluorescens

P. fluorescens este un bacil Gram-negativ, multi flagelat apartenent al grupului I de bacterii al genului Pseudomonas, ce nu este în mod normal considerat ca fiind un agent patogen al omului. Cu toate acestea mltiple studii bazate pe cultură și independente de cultură au identificat acest microorganism la niveluri relativ scăzute ca parte a microbiotei indigenă a diferitelor situsuri ale corpului.

P. fluorescens are un metabolism extrem de versatil și poate fi izolat cu ușurință din sol și apă. Deși cel mai adesea studiat pentru rolul său în rizosfera, tulpinile de P. fluorescens dețin o serie de trăsături funcționale care îi oferă capacitatea de a crește pe gazde animale (Barahona et al., 2016).

Deși mult mai puțin virulente comparativ cu tulpinile de P.aeruginosa, tulpinile de P. fluorescens pot provoca bacteriemie la om, majoritatea cazurilor raportate fiind rezultatul fie a unei transfuzii de produse sanguine contaminate, fie a utilizării echipamentelor contaminate pentru perfuzii intravenoase.

Acest microorganism, deși nu este suspectat a fi un agent etiologic al unei boli pulmonare, exista o serie de rapoarte ce susțin ca tulpinile de P. fluorescens ar cauza probleme respiratorii.

Există o asociere între tulpinile de P. fluorescens și anumite patologi umane, în condițiile în care 50% din pacienții cu boala Crohn dezvoltă anticorpi serici anti P. fluorescens (Khabbaz et al., 1984).

P. stutzeri

P. stutzeri este o bacterie denitrificantă , nefluorescentă cu distribuție vastă în mediu, ce a fost izolată ca agent patogen oportunist la om.

Datorită proprietății acestui microorganism de a degrada tetraclorometanul , a fost pusă în discuție utilizarea tulpinilor de P. stutzeri pentru bioremediere (Lalucat et al., 2006).

P. syringae

P. syringae este unul dintre cei mai bine studiați agenți patogeni ai plantelor ce poate infecta o gamă variată de specii. Denumirea acestei specii provine de la copacul de liliac Syringa vulgaris din care acest microorganism a fost izolat pentru prima dată.

Anumite studii genomice comparative au scos la iveală caracteristici cheie ce contribuie la virulența tulpinilor de P. syringae. Fiind un patogen ce trăieste în spațiul interceullar al țesuturilor subterane ale plantelor, P. syringae prezintă două strategi principale de virulență: suprimarea imunității gazdelor și crearea unui apoplast apos. De asemenea infecția cu tulpini de P. syringae este puternic influențată de factorii de mediu, cum ar fi umiditatea. În prezent tulpinile de P. syringae sunt utilizate ca modele de studiu pentru înțelegerea evoluției agenților patogeni, dar și a strategiilor specifice de virulență pentru a suprima imunitatea gazdei (Arnold & Preston, 2019).

P. cepacia

Descris inițial ca un agent patogen al plantelor , acest microorganism a capătat o importanță tot mai mare în ultima perioadă datotrită infecțiilor din mediul spitalicesc raportate. Abilitatea acestui tulpinilor de P.cepacia de a supraviețui și de a prolifera într-o varietate de soluții (antiseptice, dezinfectante, soluții perfuzabile ) a condus la apariția a numeroase cazuri de infecții nosocomiale cu acest agent patogen. Majoritatea pacienților expuși la tulpini de P. cepacia sunt doar colonizați, însă infecții grave, inclusiv chirurgiale , bacteriemie , peritonită, meningită, pneumonie, au fost de asemenea raportate.

Cu toate acestea tulpinile de P. cepacia au o virulență relativ scăzută, factorii care influențează virulența acestui microorganism fiind aderența la suprafețele de plastic (în special părțile din plastic componente ala aparatelor medicale) și producția de enzime cum ar fi elastaza și gelatinaza . De asemenea un aspect foarte important este faptul că acest microorganism pare să supraviețuiască atacului neutrofilelor.

Tratamentul infecțiilor cu tulpini de P. cepacia este extrem de dificil, în special datorită faptului ca acest microorganism este rezistent la o gamă largă de antibiotice (Goldmann & Klinger, 1986).

Genul Stenotrophomonas

Stenotrophomonas sp. este un gen de bacterii Gram-necative, nonfermentative, fiind distribuit în mod ubicuitar în sol și plante. Tulpinile de Stenotrophomonas sp. pot coloniza eficient diferite biotopuri, cum ar fi plante, oameni, dar și biotopuri marine. Speciile acestui gen pot metaboliza o plajă largă de compuși organici cum ar fi compușii fenolici din rădăcinile plantelor. În momentul de față, genul cuprinde 8 specii, dintre care, reprezentantul tip fiind S. maltophilia. Tulpinile de Stenotrophomonas sp. au un rol ecologic important în ciclurile azotului și sulfului, anumite specii putând forma interacții benefice cu platele, stimulând creșterea acestora și conferindu-le protecție împotriva altor microorganisme .

Aceste bacterii au capacitatea de a degrada un număr mare de compuși xenobiotici, și astfel pot fi utilizati ca agenți pentru bioremediere.

Speciile acestui gen au numeroase trăsături care pot fi utilizate în diferite procese biotehnologice. Unele tulpini de Stenotrophomonas sp. pot produce substanțe antimicrobiene care pot proteja plantele împotriva altor microorganisme. De asemenea multe tulpini de Stenotrophomonas sp. manifestă un nivel ridicat de rezistență intrinsecă la metale grele și antibiotice, demonstrându-se capacitatea lor de a degrada numeroși compuși toxici, cum ar fi poluanții.

Anumite specii, în special S. maltophilia și S. rizophila se întâlnesc adesea în asociație cu plantele, putând fii izolate din rizosferă sau didn țesuturile interne ale plantei, în special din țesuturile vasculare ale rădăcinii și tulpinii (Ryan et al., 2009).

Principalele specii ale genului Stenotrophomonas

S. maltophilia

S. maltophilia a aparut ca un important agent patogen nosocomial în mediul spitalicesc. Acest agent patogen este responsabil pentru diverse boli infecțioase și moartea paciențiilor internați, în special a celor imunodeprimați, și a celor ce prezintă implante medicale.

S. maltophilia este un bacil Gram-negativ, nonfermentativ fiind un agent patogen oportunist global, rezistent la foarte multe antibiotice . Incidența tot mai mare a infecțiilor nosocomiale sau dobândite în comunitate cu tulpini de S. maltophilia reprezintă un aspect îngrijorător pentru persoanele imunodeprimate, în fața acestui agent patogen cu letalitate semnificativă (Chang et al., 2015).

S. maltophilia este o bacterie de mediu ce se găsește în habitate apoase incluzând rizosferele vegetale, animale, alimente dar și sursele de apă. Infecțiile cu tulpini de S. maltophilia pot apărea la nivelul diferitelor organe, însă cel mai frecvent astfel de infecții apar la nivelul tractului respirator. Tulpini de S. maltophilia pot fi izolate din infecții polimicrobiene, mai ales ale tractului respirator la pacienții cu fibroză chistică.

S. maltophilia este un bacil strict aerob, motil, având puțini flageli polari. Este un microorganism nefastidios din punct de vedere nutrițional.

Acest microorganism este catalazo pozitiv și oxidazo negativ, fapt ce îl distinge de ceilalți membri ai genului .

Alături de P.aeruginosa, este responsabilă de aproximativ 80% din infecțiile oportuniste cauzate de specii de tulpinile de Pseudomonas sp (Goss et al., 2004).

Datorită tropismului acesti microorganism pentru suprafețele umede , cum ar fi tubii de ventilație utilizați în ventilația meidcală sau cateterele urinare sau endoscopuri poate pătrunde cu ușurință în gazda umană, infecția fiind de obicei favorizată de prezența materialului prostetic (plastic sau metal), iar cel mai eficient tratament presupune îndepărtarea materialului prostetic.

Printre patologiile cauzate de tulpinile de S. maltophilia se numără pneumonie, infecții ale trectului urinar, invecții sanguine. De asemenea s-a observat o creștere a ratei de colonizare a pacienților cu fibroză cistică.

Tulpinile de S. maltophilia sunt în mod natural rezistente la multe antibiotice uzuale, inclusiv carbapeneme datorită producției a două metalo-beta-lactamaze inductibile. Cu toate acestea tulpinile de S. maltophilia nu sunt foarte virulente, de cele mai multe ori simpla îndepărtare cateterelor sau tuburilor de dren infectate fiind suficientă pentru tratamentul infecției, antibioticele fiind necesare doar în cazul în care materialele medicale nu pot fi îndepărtate (ex: protezele).

Întrucat tulpinile S. maltophilia acționeaza ca agenți patogeni oportuniști și vizează în primul rand pacienții imunodeprimați, controlul acesteia este esențial. Îndepărtarea implantelor medicale fără schimbarea medicației, menținerea igienei zonei de incizie și igienizarea periodică a mediului de spital sunt în general suficiente pentru controlul infecțiilor cu tulpini de S. maltophilia (Kumar, Simit et al., 2015).

Capitolul II CLASE DE ANTIBIOTICE ȘI MECANISME DE ACȚIUNE

Antibioticele β-lactamice

Antibioticele β-lactamice reprezinta unele dintre cele mai prescrise medicamente cu multiple indicații clinice. Din punct de vedere biochimic, aceste antibiotice au un aspect comun, și anume prezenta inelului β-lactamic, ce este foarte reactiv (Holten & Onusko, 2000).

Aceasta clasa de antibiotice include :

Penicilinele

Penicilinele sunt antibiotice ce conțin nucleul 6-aminopenicilanic (lactam + tiazolidină) Grupul penicilinelor include penicilinele naturale, aminopenicilinele, carboxipenicilinele și ureidopenicilinele. Penicilinele au fost printre primele medicamente folosite și eficiente împotriva multor infecții bacteriene cauzate de staphilococci si streptococci. În ziua de azi penicilinele încă sunt folosite , cu toate că multe tipuri de bacterii au dobândit între timp rezistență la aceste antibiotice. Alergia la penicilină este un fenomen întâlnit la aproximativ 10% din populație, însă aceste alergi au manifestări ușoare, manifestări grave, înregistrându-se la aproximativ 0.03% din populație. Penicilinele acționează prin inhibarea activității enzimelor necesare pentru formarea legăturilor încrucișate între moleculele de peptidoglican pentru sinteza peretelui celular bacterian. Această acțiune conduce la fragilizarea peretelui bacterian, datorită numărului mic de legături încrucișate, fapt ce permite apei să treacă incontrolabil prin peretele celular, conducând la final la moartea celulei (Kardos & Demain, 2011).

Cefalospoeinele

Cefalospoeinele, antibiotice ce conțin un nucleu de acid 7-aminocefalosporanic, obținute inițial din ciuperci din genul Acremonium sp, originar numit ”Cephalosporium sp.”. Aceste antibiotice sunt recomandate pentru profilaxia si tratamentul anumitor infecții, cefalosporinele de primă generație fiind active mai ales asupra bacteriilor gram pozitive cum ar fi Staphylococcus sp. sau Streptococcus sp. Cefalosporinele sunt utilizate În principal pentru tratarea infecșiilor pielii și țesuturilor moi. Cefalosporinele au același mecanism de acțiune ca și celelalte antibiotice β-lactamice, însă sunt mult mai puțin susceptibile la acțiunea β-lactamazelor (Turck, 1982).

Carbapenemele

Carbapenemele, a căror structură definitorie este un carbapenem cuplat la inelul β-lactamic ce confera protecție împotriva majorității β-lactamazelor. Cu toate acestea rezistența la acești compusi apare in principal în rândul agenților patogeni gram negativ cum ar fi tulpiniile de K. Pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii, ce au capacitatea da a produce o clasă aparte de β-lactamaze ce poartă denumirea de carbapenemaze. Carbapenemele prezintă un spectru larg de acțiune împotriva bacteriilor Gram-negative și o activitate mai redusă asupra celor Gram-pozitive. Cu toate acestea reacții alergice grave și ocazional fatale pot apărea în cazul persoanelor tratate cu carbapeneme (Birnbaum et al., 1985).

Monobactamle

Monobactamle, reprezintă o clasă de antibiotice βlactamice, ce prezintă ielul β-lactamic singur, fara a fi fuzionat cu alt inel. Monobactamele sunt eficiente doar împotriva bacteriilor Gram-negative aerobe cum ar fi tulpini ale Neisseria sp. , Pseudomonas sp. Printre varantele comerciale de Monobactame se numără aztreonam, tigemonam, tabtoxin, (Fuchs et al., 1988).

Inhibitori ai betalactamazelor

Funcția principala a acestor inhibitori este de a inactiva serin- β-lactamazele, enzime ce hidrolizează și inactivează inelul beta lactamic. Acești agenți , incluzând inhibitorii β-lactamazelor de prima generație ( acid clavulanic, sulbactam și tazobactam) și inhibitorii de generație noua (avibactam și vaborbactam) sunt activi împotriva carbapenemazelor, cum ar fi KPC (Klebsiella penumoniae carbapenemase) (Brem et al., 2016).

Mecanismul de acțiune al antibioticelor β-lactamice

Peptidoglicanul este un constituent vital al peretelui celulei bacteriene ce ii confera stabilitate acestuia. Antibioticele beta lactamice inhibă ultima etapa a sintezei peptidoglicanului prin acilarea transpeptidazei inplicata in formarea legaturilor incrucisate intre peptide pentru a forma peptidoglicanul. Țintele antibioticelor β-lactamice sunt cunoscute sub denumirea de Penicilin-binding proteins (PBPs). Această legare întrerupe procesul de transpeptidare terminala și determină pierderea viabilității acestuia și ulterior liza prim procesele autolitice ce au loc în celulele bacteriene (Kong et al., 2010).

Antibiotice cu țintă de acțiune asupra membranei plasmatice

Nevoia de antibiotice competente este a crescut în ultima perioadă și continuă să crească datorită mecanismelor de rezistență la tot mai multe antibiotice dobândite de microorganisme.

O posibilă țintă a antibioticelor de generație nouă este membrana celulei bacteriene , principalul motiv fiind faptul ca membrana bacteriană este diferită față de membrana mamaliană. O deosebire extrem de importantă este faptul că lipidele anionice sunt expuse la suprafața membranei bacteriene, în timp ce în cazul membranelor eucarite lipidele anionice sunt dispuse spre interiorul celulei sau organitelor. Din acest motiv mulți agenți antimicrobieni sunt cationici, astfel încât au o selectivitate mai mare pentru membranele bacteriene.

Bacteriile Gram-negative prezintă ca înveliș extern o membrană externa extrem de bogată in lipopolizaharid. S-a constatat ca multe peptide antimicrobiene au capacitatea de a inhiba sinteza acestui lipopolizaharid. De asemenea peptidele antimicrobiene se pot lega la membrana externă și pot bloca trecerea substanțelor între periplasm si exteriorul celulei, fapt de conduce la acumularea substanțelor toxice în interiorul celulei bacteriene.

În cazul bacteriilor Gram-pozitive, componenta lipidică principală este reprezentată de fosfatidil-glicerol și poate fi modificată chimic de către sisteme enzimatice bacteriene specifice pentru a trece din forma anionică în formă cationică sau zwitterionică. Acest fapt determină o rezistență crescută în fața agenților antimicrobieni policationici.

Există și agenți antimicrobieni care țintesc în mod direct o componentă a membranei celulare, putând acționa atât asupra bacteriilor Gram negative, cât și Gram pozitive. Majoritatea acestor agenți antimicrobieni sunt peptide ciclice cu un situs de legare rigid, capabil sa lege o anumită componentă lipidică.

Bacteriile Gram-negative tind să fie mai rezistente la agenții antimicrobieni decât cele Gram pozitive, datorită protecției suplimentare oferită de membrana externă. Pe lângă membrana externă, atât bacteriile Gram-negative, cât și cele Gram-pozitive prezintă un perete celular (Epand et al., 2016).

Agenții antimicrobieni care vizează peretele celular sunt utilizați de foarte mult timp. Antibioticele β-lactamice (cum ar fi penicilina, cefalosporinele, carbapenemele, etc) inhibă sinteza peretelui celular. Cu toate acestea, eficacitatea acestor agenți este limitată ca urmare a expreisei sporite a β-lactamazelor bacteriene ce inactivează aceste antibiotice.

PagP este o enzimă implicată în sinteza lipopolizaharidelor bacteriene, ea catalizând transferul unui lanț de palmitoil către lipidele A, astfel blocarea acesti proces ar fi o strategie aplicabilă pentru deteriorarea membranei externe.

Deteriorarea sau slăbirea structurii membranei externe prin îndepărtarea ionilor Mg2+ duce la trecerea facilă a moleculelor mai mari prin membrană conducând la toxicitate bacteriană. S-a dovedit că anumiți agenți antimicrobieni pot provoca toxicitate bacteriană prin blocarea permeabilității membranei externe.

Există mai multe mecanisme prin care agenții antimicrobieni care acționează fosfolipidelor membranare pot modifica proprietățiile membranei. Unul dintre aceste mecanisme presupune moodificarea în masă a proprietăților fizice ale membranei. Acești agenți nu se leagă la o componentă specifică a membranei ci afectează una sau mai multe proprietăți fizice ale acesteia. Astfel de modificări ce pot apărea includ modificări în distribuția spațială a moleculelor în interiorul membranei celulare, modificarea curburii intrinsece sau a fluidității (Epand et al., 2016).

Antibioticele ce inhibă replicarea ADN

Această categorie de antibiotice ce interferă cu repilcarea ADN pot fi împărțite în două categorii cele care modifică chimic ADN-ul și cele care formează complexe cu moleculele de ADN.

Un exemplu de compuși care modifică chimic ADN-ul este reprezentat de mitomicine. Aceste molecule se leagă covalent și ireversibil la molecula de ADN și prezintă o selectivitate foarte mică. Astfel acestea sunt foarte toxice și adesea nu sunt recomandate a fii utilizate ca antibiotice (Janse et al., 1986).

Metroimidazolul și Nitrofurantoina sunt utilizați în tratamentul infecțiilor urinare și acționează prin inducerea de rupturi în molecula de ADN prin interacția chimică directă. Mai exact, gruparea nitro a antibioticului este transformată intr-un radical nitronat (azinat). Forma radicală a antibioticului este forma activă care atacă și scindează catenele de ADN (van Eijk et al., 2017).

Un exemplu de antibiotice care formează complexe cu moleculele de ADN este actinomicina D, însă la fel ca mitomicinele sunt extrem de toxice și au o utilizare limitată (Koba & Konopa, 2005).

Printre antibioticele care acționează prin inhibarea enzimelor implicate în relicarea si transcripția ADN-ului se numără Quinolonele și cumermicinele.

Quinolonele reprezintă una dintre cele mai prescrise clase de și sunt utilizate pentru tratamentul unui spectru larg de infecții la oameni. Datorită utilizării pe scară largă a quinolonelor , numărul de tulpini bacteriene rezistente la quinolone este într-o continuă creștere.

Quinolonele inhibă selectiv topoizomeraza II (giraza). Topoizomeraza relaxează moleculele de ADN și induce rupturi tranzitorii în moleculele de ADN pentru a reduce numărul de superrăsuciri , iar ulterior reface legăturile fosfodiesterice scindate. prin legarea la subunitatea A a enzimei a capetelor unice ale catenei de ADN tăiate. Astfel quinolonele se leagă la subunitatea A a enzimei, iar giraza devine incapabilă sa resigileze ADN-ul, iar ca rezultat, cromozomul rămâne fragmentat (Barnard & Maxwell, 2001).

Fluorochinolonele, quinolonele de a doua generație, care includ levofloxaciclină, ciprofloxaciclină și norfloxaciclină sunt eficiente atât împotriva bacteriilor Gram-negative cât si a celor Gram-pozitive (North et al., 1998).

Mecanimele de rezistență la quinolone sunt grupate în trei categorii distincte.

Rezistență dobândită în urma unei mutații apărute la nivelul girazei, fapt ce conduce la scăderea capacității quinolonelor de a se lega la forma mutantă a enzimei.

Rezistența dobândită prin interemediul plasmidelor. Plasmidele ce poartă gene de rezistență la quinolone pot fi transmise atât vertical (de la o generație la alta), cât și orizontal (prin procesul de conjugare bacteriană)

Rezistență mediată cromozomal. Concentrația celulară a quinolonelor este reglată prin acțiunea pompelor de eflux. În plus, spre deosebire de gram pozitive, membrana exterioară a bacteriilor Gram-negative reprezintă o barieră suplimentară pe care quinolonele trebuie să o traverseze. Pătrunderea intracelulară a quinolonelor este facilitată de expresia canalelor proteice numite porine. Ca urmare dacă expresia porinelor este reglată (downregulation) poate conduce la un oarecare nivel de rezistență la quinolone ,

Cumermicinele inhibă de asemenea acțiunea girazei, însă prin legarea la situsul de legare al ATP din subuinatea B (Aldred et al., 2014).

Antibiotice ce inhibă transcrierea

Transcrierea reprezintă prima etapa a expresiei genice, ea fiind realizată de o enzimă cu funcție specifică numită ARN polimerază și fiind reglată prin interacțiunea cu o serie de factori de transcriere a proteinelor. ARN polimeraza , precum și factorii de transcriere au o structură înalt conservată în domeniul bacterian și reprezintă o țintă perfectă pentru acțiunea agenților antibacterieni cu spectru larg de acțiune (Dangkulwanich et al., 2014).

Rifamicinele

Reprezintă primul grup de antibiotice care vizează ARN polimeraza descoperit. Aceste antibiotice au fost izolate din metaboliți ai Amycolatopsis mediterranei. Primul medicament din acest grup a fost rifamicina SV, care a fost utilizat doar intravenos. Rifampina, sintetizată din rifamicină SV este eficientă prin administrare pe cale orală și are un spectru larg de acțiune atât împotriva agenților patogeni Gram-pozitivi, cât și Gram-negativi, fiind utilizate pentru tratamentul tuberculozei, leprei și infecțiilor complexe provocate de specii ale genului Mycobacterium. Rifamicinele sunt o subclasă a familiei de antibiotice ansamicine (Floss & Yu, 2005).

Activitatea antibacteriană a rifamicinelor se bazează pe inhibiția sintezei moleculelor de ARN. Acest lucru se datorează afinității ridicate a rifamicinelor pentru ARN polimeraza procatioră. Specificitatea rifamicinelor se bazează pe faptul că aceastea au o afinitate foarte scăzută pentru ARN polimeraza mamaliană. Analiza structurii cristaline a antibioticului indică faptul că rifamicina inhibă sinteza proteinelor prin provocarea unor ciocniri sterice (mecanismul ”ocluziei stericului”). Daca rifamicina leagă polimeraza după începerea procesului de extensie a catenei de ARN nu se observă nicio inhibiție asupra biosintezei acesteia. Mecanismele de rezistență la rifamicină apar ca o consecință a modificării unui singur aminoacid din structura ARN polimerazei bacteriene (Calvori et al., 1965).

Sorangicina

Sorangicina este un antibiotic macrociclic izolat din Sorangium cellulosum. Analiza structurii cristaline a acestui antibiotic a demonstrat faptul ca se leagă la exact același situs ca rifamicinele, adiacent centrului catalitic activ și interacționează în mod similar cu reziduul respectiv. Însă având același mecanism de acțiune și aceeași activitate biologică, tulpinile care manifestă rezistență față de rifamicine ar putea fi rezistente și față de sorangicină. Cu toate acestea, în ciuda faptului că sunt asemănătoare din punct de vedere structural cu rifamicinele, sorangicina prezintă un schelet mult mai flexibil decât acestea, fapt ce sugerează posibilitatea unei mai bune adaptări în cazul schimbărilor conformaționale sau mutațiilor din structuria ARN polimerazei (Campbell et al., 2005).

Streptolidigina

Izolată din Streptomyces lydicus, streptolydigina este un derivat al acidului tetramic, ce conține o catenă laterală de streptolol și un monozaharid. Streptolidigina manifestă activitate antibacteriană pentru un spectru larg de microorganisme, fiind activă mai ales împotriva bacteriilor Gram-pozitive, cu excepția micrococcilor. Din analiza structurii cristaline a acestui antibiotic a reieșit faptul ca streptolidigina se leagă la o regiune adiacentă situsului catalitic activ, prin inhibarea inițierii transcripției bacteriene, alungirii si pirofosforolizei (Gómez et al., 2012).

Ansamicinele

Ansamicinele reprezintă o altă clasă importantă de antibiotice naturale, isolate din tulpinile de Actinomycetes sp. Aceste molecule s-au dovedit a fi foarte eficiente având efecte anticancerigene, antibacteriene și antivirale.

Ansamicinele inhibă inițierea transcrierii genetice. Acestea se leagă la subunitatea beta a ARN polimerazei, legare mediată prin interacții hidrofobe ce se stabilesc între lanțul alifatic al ansamicinelor și subunitatea β, iar ca urmare ARN polimeraza nu poate iniția transcrierea ADN.

Specificitatea de acțiune a ansamicinelor derivă din faptul că ansamicinele afectează metabolismul celulelor mamaliene la concentrații de 10.000 de ori mai mari decât cele necesare pentru a produce moartea celulelor bacteriene (Milavetz et al., 1978).

Antibiotice ce inhibă sinteza proteică

Sinteza proteinelor are loc la nivelul anumitor complexe macromoleuclare numite ribozomi. Ribozomii bacterieni, precum și procesul de translație în ansamblu reprezintă o țintă majoră pentru antibiotice. Ca urmare investigațiile structurale și biochimice privind antibioticele ce vizează ribozomii oferă nu numai o perspectivă asupra mecanismului de acțiune și a rezistenței la antibiotice, ci și o perspectivă asupra procesului fundamental de sinteză a proteinelor (Arenz & Wilson, 2016).

Aminoglicozidele

Aminoglicozidele sunt antibiotice naturale sau semisinteitice, cu acțiune rapidă, a căror potențial antimicrobian este dependent de concentrație. Modul de acțiune al aminoglicozidelor presupune legarea în mod reversibil la subunitatea 30 S a ribozomilor bacterieni, perturbând procesul de traducere și conducând la citirea greșită a codului genetic și ulterior la acumularea de proteine nefuncționale în interiorul celulei bacteriene. Mai mult, aminoglicozidele conduc la rearanjamente la nivelul membranei externe ale bacteriilor Gram-negative, ceea ce conduce la formarea de perforații tranzitorii și perturbarea permeabilității normale a acesteia. Efectul bactericid rapid, a cărui rată crește odată cu creșterea concentrației, nu este diminuat în mod semnificativ de un nivel ridicat de inocul bacterian, cum este cazul antibioticelor beta-lactamice.

Aminoglicozidele necesită un timp de contact scurt și sunt foarte eficiente împotriva populațiilor bacteriene susceptibile cu o rată rapidă de multiplicare (Mingeot-Leclercq et al., 1999).

Neomicina

Neomicina este un antibiotic aminoglicozidic fiind adesea un element component al diferitelor creme, unguente și picături oftalmice. Asemănător cu celelalte tipuri de antibiotice aminoglicozidice, neomicina acționează prin legarea la subunitatea 30S a ribozomilor bacterieni, conducând la citirea greșită a mesajului genetic. De asemenea neomicina poate inhiba ADN polimeraza bacteriană. Neomicina este activă invitro asupra unui spectru larg de bacterii Gram-negative și Gram-pozitive incluzând E.coli, H.influenzae, Proteus sp, S. aureus și multe altele (Mehta & Champney, 2003).

Streptomicina

Streptomicina este un antibiotic aminoglicozidic utilizat pentru tratarea anumitor infecții bacteriene. În mod similar cu celelalte aminoglicozide, streptomicina interferă cu funcționarea corectă a ribozomilor. Streptomicina se leagă de molecula de ARNr de 16S a subunității riboizomale de 30S și blochează legarea formil-metionil-ARNt la subuintatea de 30S. Acest efect conduce la citirea greșită a codului genetic, inhibiția sintezei proteice și în final la moartea celulei bacteriene.

Au fost raportate cazuri de rezistență la antibiotice aminoglicozidice atât in rândul bacteriilor Gram-negative, cât și al celor Gram-pozitive putând fi mediată de plasmide (Spickler et al., 1997).

Tetraciclinele

Tetraciclinele sunt antibiotice a căror eficiență este dependentă de timp , având un spectru larg de acțiune ce include atât bacterii Gram-negative, cât și Gram-pozitive. Tetraciclinele sunt antibiotice naturale, izolate din diferite tulpini de Streptomyces sp. sau semi-sinteitce, a căror moleculă are la bază un nucleu tetraciclic.

Mecanismul de acțiune al tetraciclinelor presupune legarea acestora la subunitatea de 30S a ribozomului bacterian, și inhibarea legării aminoacil-ARNt la nivelul complexului translațional (Chopra & Roberts, 2001).

Lincosamidele

Lincosamidele sunt o clasă de antibiotice a căror structură are la bază un inel tetrahidropirolic legat de un rest piranozic printr-o legătură amidică.

Acțiuenea antibacteriană a lincosamidelor se exercită prin efectul inhibitor al acestor antibiotice asupra sintezei proteice prin legarea la centrul enzimei peptidil transferază. Cauzând disocierea prematură a peptidil-ARNt care conține doar câteva resturi de aminoacizi (Menninger & Coleman, 1993).

Macrolidele

Macrolidele reprezintă o familie de inhibitori ai sintezei proteice de mare interes clinic, datorită apicabilității în medicina umană. Structura macrolidelor cuprinde o lactonă macrociclică, de dimensiuni diferite , la care sunt atașate unul sau mai multe resturi de amino sau deoxi zaharuri.

Aceste substanțe își exercită acțiunea antibiotică prin legarea la subunitatea de 50S a ribozomilor bacterieni, astfel interferând cu sinteza proteinelor. Macrolidele împiedică adăugarea în continuare a moleculelor de aminoacil-ARNt la lanțul peptidic în creștere.

Un alt mecanism prin care macrolidele ar putea inhiba sinteza proteică presupune disocierea prematura a peptidil-ARNt de ribozom (Dinos, 2017).

Antibiotice ce inhibă sinteza metaboliților esențiali.

Antibioticele de tipul sulfamidelor inhibă sinteza dihidrofolatului în celulele bacteriene, printr-un mecanism de inhibiție competitivă, legându-se în locul acidului para-aminobenzoic (PABA) la situsul de legare al enzimei dihidropteroat sintază, ce catalizează reacții enzimatice esențiale pentru producerea acidului folic. Acidul folic acționează ca o coenzimă în sinteza purinelor și pirimidinelor. Întrucât mamiferele nu pot sintetiza acidul folic, acestea nu sunt afectate de sulfamide, care afectează în mod selectiv bacteriile (Patel et al., 2003).

Alergiile la sulfamide sunt frecvente, incidența reacțiilor adverse la sulfamide este de aproximativ 3%, similară cu cea întâlnită la penicilină. În țările dezvoltate, sulfamidele sunt foarte rar prescrise de medici, însă sunt în continuare medicamente antimicrobiene prescrise în mod frecvent în țările în curs de dezvoltare, datorită prețului scăzut (Giles et al., 2019).

CAPITOLUL AL III-LEA MECANISME DE REZISTENȚĂ LA ANTIBIOTICE LA TULPINILE DE A.BAUMANNII, P. AERUGINOSA SI S. MALTOPHILIA

Rezistența la antibiotice mediată de gene cromozomale

Rezistența mediată de gene cormozomale, apare ca rezultat al unor mutații la nivelul secvenței de nucleotide din cromozomul bacterian, determinând sinteza unor proteine și/sau a unor alte macromolecule, diferite din punct de vedere structural de structurile inițiale. Astfel, antibioticul respectiv nu mai poate acționa (Coculescu, 2009).

Mutații reduse la nivelul ADN cromozomal apar la fiecare ciclu de replicare. Aceste variații determină modificări în ceea ce privește modul în care un organism interacționează cu mediul, determinând evoluția prin selecție naturală atunci când o populație bacteriană, în care indivizii posedă mutații diferite sunt supuse unei presiuni selective. Antibioticele reprezintă o presiune selectivă extrem de mare pentru populațiile bacteriene. Acestea conduc la moartea celulelor care nu posedă mutații cromozomiale care să deremine rezistența celulei bacteriene la antibioticul respectiv și le selectează pe cele care posedă astfel de mutații,

Acțiunea antibioticelor poate fi inhibată prin producerea de mutații la nivelul ADN cromozomal, însă frecvența acestor mutații variază în funcție de specia bacteriană și de antibioticul respectiv. Mutațiile de fond a unei bacterii, vor produce variante rezistente la antibiotice, chiar si atunci când acestea nu sunt supuse presiunii exercitate de un antibiotic. O populație bacteriană tipică conține miliarde de celule bacteriene, pe deasupra, acestea cresc și se divid rapid, astfel deși extrem de rare, mutațiile care să determine rezistența la un anumit antibiotic se produc în intervale de timp relevante din punct de vedere clinic (Martinez & Baquero, 2000).

Există și cazuri în care unele mutații pot fi dăunătoare și pentru celulele bacteriene. Astfel după încetarea acțiunii antibioticului, mutația nu va persista, iar populația va reveni în cele din urmă la forma sensibilă la antibiotice. Cu toate aceste, asemenea efecte ușor negative pot fi de cele mai multe ori compensate prin mutații suplimentare care se produc în altă regiune a cromozomului.

Unele mutații care determină rezistența la antibiotice a anumitor populații bacteriene nu au alte costuri. Astfel în aceste cazuri , populația va continua să fie rezistentă la antibiotice chiar și atunci cand aceasta este crescută în absența presiunii selective a antibioticului pe o perioadă îndelungată (Woodford & Ellington, 2007).

Rezistența mediată prin acțiunea pompelor de eflux

Pompele de eflux sunt proteine de transport implicate în îndepărtarea substratelor toxice (incluzând practic toate clasele de antibiotice relevante din punct de vedere clinic) din celule în mediul extern. Aceste proteine sunt întâlnite atât la bacterii Gram-pozitive și Gram-negative, cât și la organisme eucariote. Este cunoscut faptul că transportrii care indepărtează mai multe substraturi, inclusiv antibioticele nu au evoluat ca răspuns la presiunea selectivă impusă de antibiotice. Toate genoamele bacteriene studiate conțin mai multe pompe de eflux diferite, acest fapt sugerând originea ancestrală a acestora. S-a estimat că aproximativ 5-10% din genele bacteriene sunt implicate în diferite mecanisme de transport, iar dintre acestea o mare parte codifică pentru pompe de eflux (Webber & Piddock, 2003).

Pompele de eflux au fost descrise ca fiind unul din mecanismele responsabile pentru rezistența la antibiotice a unui număr mare de bacterii. Printre microorganismele la care a fost descris rolul pompelor de eflux se numără tulpini de P. aeruginosa , E. coli și C. albicans. Activitatea pompelor de eflux din celulele procariote modulează acțiunea unui număr mare de antibiotice. Prezența acestora explică de asemenea originea rezistenței intrinseci la antibiotice la nivel înalt în cazul unui număr mare de bacterii. Mutațiile stabile la nivelul genelor reglatoare pot produce fenotipuri de multirezistență ireversibilă. Existența pompelor de eflux al antibioticelor și impactul acestora asupra terapiei trebuie luat în considerare pentru alegera de noi antibitice (Bambeke et al., 2000).

Pompele de eflux bacteriene au fost împărțite in 6 categorii, în funcție de numărul de componente, numărul de regiuni transmembranare, sursa de energie utilizată de pompă și tipurile de molecule exportate.

Superfamilia ATP-binding-cassette (ABC)

Superfamilia MFS (the major facilitator superfamily)

Superfamilia MATE (multidrug and toxic compound extrusion)

Familia SMR (small multidrug resistance)

Superfamilia RND (the resistance-nodulation-division superfamily)

Superfamilia DMT (the drug metabolite transporter)

Sistemul de eflux major, relevant din punct de vedere clinic în cazul bacteriilor Gram-negative aparține superfamiliei RND fiind de obicei alcătuire dintr-o pompă cu localizare la nivelul membranei citoplasmatice, o proteină periplasmică și un canal proteic la nivelul membranei externe.

Rolul pompelor de eflux pentru biofilmele de P. aerugionsa .

P. aeruginosa este unul din cei mai importanți agenți infecțioși nosocomiali ce afectează pacienții imunodeprimați și cei cu fibroză cistică. Rezistența la antibiotice intrinsecă a tulpinilor de P. aeruginosa este mult mai pronunțată atunci când acest microorganism crește într-un biofilm. Pompele de eflux joacă un rol esenșial în rezistenței la antibiotice a tulpinilor de P. aeruginosa, acest mocroorganism prezentând un număr mare de gene ce codifică pentru pompe de eflux aparținând superfamiliei RND, printre acestea MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN fiind cele mai studiate.

Biofilmele de P. aeruginosa prezintă o rezistență crescută la numeroase antibiotice, cum ar fi tetraciclină, cloramfenicol, chinolone și antibiotice β-lactamice, această rezistență fiind puternic asociată cu activitatea pompelor MexAB-OprM (Soto, 2013).

Rezistența mediată de elemente genetice mobile – cu prezentarea acestora și a genelor cel mai frecvent raportate la specia analizată

Elementele genetice mobile (MGEs-Mobile genetic elements) reprezintă o categorie aparte de secvențe de material genetic, ce prezintă capacitatea de a se deplasa în cadrul unui genom, sau de la un genom la altul. Se întâlnesc la toate organismele, inclusiv la om, unde se crede că reprezintă aproximativ 50% din genom. Aceste elemente genetice mobile au un rol esențial în evoluție, întrucât asigută un mecanism de transfer de material genetic pe orizontală. Elementele genetice mobile pot provoca de asemenea mutații, în regiunile ce codifică pentru proteine, fapt ce are ca rezultat alterarea funcțiilor moleculei proteice codificate (Yoon et al., 2017).

Un aspect esențial ce denotă importanța elementelor genetice mobile în evoluție îl reprezintă faptul că atât factorii de virulență, cât și genele de rezistență la antibiotice pot fi plasate la nivelul MGE-urilor și pot fi transportate și diseminate la bacteriile prezente în mediu. Astfel, genele dobândite printr-un astfel de mecanism pot conduce la obținerea de funcții noi sau suplimentare de către bacteriile din vecinătate (Beceiro et al., 2013).

Printre cele mai comune tipuri de elemente genetice mobile se numă transpozonii, plasmidele și integromii.

Transpozonii reprezintă secvențe de ADN capabile de a se deplasa în cadrul genomului și include transpozonii ADN și transpozonii ARN (retrotranspozoni) (Munoz-Lopez & Garcia-Perez, 2010).

Plasmidele sunt reprezintă o clasă de material genetic accesoriu prezent la bacterii, ce poate replica autonom, sau se poate integra în cromozomul bacterian. Anumite plasmide pot fi transferate de la o celulă bacteriană la alta prin procesul de conjugare. Acesta este un mecanism de transfer genetic pe orizontală ce permite bacteriilor să transmită factorii de virulență sau gene de rezistență la antibiotice altor celule bacteriene (Beceiro și colab.2013).

Integronii sunt elemente genetice ce permit bacteriilor să se adapteze la condițiile de mediu și să evolueze rapid prin stocarea și exprimarea noilor gene, acestea fiind incorportate într-o structură genetică specifică numită casetă genică, ce prezintă în general un ORF, fără promotor și un situs de recombinare (Escudero* et al., 2015).

Printre genele de rezistență cel mai frecvent raportate la bacilii Gram-negativi, nonfermentativi se numără:

Gene care codifică pentru β-lactamaze.

blaTEM. TEM-1 este cea mai frecvent întâlnită β-lactamază la bacteriile Gram-negative, aparținând clasei moleculare A, iar peste 90% din rezistența la ampicilină fiind atribuită acestei β-lactamaze. Producerea acestor β-lactamaze conferă de asemenea bacteriilor rezistență la penicilină (Cooksey et al., 1990).

blaCTX-M. Denumite astfel datorită activității lor crescute asupra cefotaximului, aceste β-lactamaze reprezintă un exemplu de gene dobândite datorită proceselor de transfer cu ajutorul plasmidelor. Aparțin clasei moleculare A, însă sunt enzime relativ diferite de beta lactamazele TEM și SHV, prezentând un procent de identitate de doar 40% (Cantón et al., 2012).

blaSHV. SHV-1 este o β-lactamază ce prezintă un procent de identitate de 68% cu TEM-1 având o structură generală asemănătoare, aparținând de asemenea clasei moleculare A este întâlnită în mod frcvent la bacili gram negativi, fiind responsabilă pentru rezistența la ampicilină (Liakopoulos et al., 2016).

blaOXA (oxacilinaze). OXA-23, OXA-24 și OXA-51 sunt cele mai întâlnite β-lactamaze aparținând categoriei oxacilinazelor. Aceste β-lactamaze se întâlnesc mai ales la tulpinile de Acinetobacter sp. și diferă de β-lactamazele TEM și SHV, prin faptul că aparțin clasei moleculare D. Aceste β-lactamaze conferă rezistență la ampicilină și cefalotină, prezentând de asemenea activitate hidrolitică ridicată împotriva oxacilinei și coloxacilinei. Avantajul acestor β-lactamaze îl constituie faptul că spre deosebire de alte β-lactamaze, acestea sunt slab inhibate de acidul clavulanic (Evans & Amyes, 2014).

Gene care codifică pentru carbapenemaze.

blaIMP. Carbapenemazele IMP sunt codificate de gene plasmidiale și reprezintă o categorie de enzime ce conferă rezistență la imipenem, frecvent întâlnite la diferite tulpini de Pseudomonas sp. și Acinetobacter sp.

blaVIM . Carbapenemazele VIM, dintre care VIM-2 reprezintă varianta predominantă a acestei clase de carbapenemaze, fiind întâlnită mai ales la tulpinile de P. aeruginosa și P. putida și extrem de rar la Enterobacteriaceae. Deși prezintă un raport de diversitate de 70% față de carbapenemazele IMP, aceste două tipuri de enzime sunt relativ similare. Aceste enzime hidrolizează toate β-lactamele, cu excepția monobactamelor fiind însă rezistente în fața tuturor inhibitorilor de β-lactamaze (Codjoe & Donkor, 2017).

blaOXA. Carbapenemazele OXA hidrolizează carbapenemele foarte lent invitro, iar rezistența tulpinilor de Acinetobacter sp.la carbapeneme asociate actiunii acestei enzime sugerează implicarea unor alte mecanisme de rezistență, cum ar fi impermeabilitatea membranei externe, sau efluxul antibioticelor. De asemenea aceste carbapenemaze tind să aibe o activitate hidrolitică redusă față de peniciline și cefalosporine (Santillana et al., 2007).

Rezistența mediată de plasmide

Plasmidele reprezintă molecule circulare de ADN care se replică independent de cromozomul bacterian, unele plasmide având capacitatea de deplasare pe orizontală prin procesul de conjugare. Plasmidele ce mediază mișcarea pe orizontală a genelor plasmidiale sunt responsabile pentru răspândirea la nivel global a rezistenței la antibiotice în rândul microorganismelor.

Plasmidele de rezistență (care conferă rezistență la majoritatea antibioticelor utilizate frecvent) sunt în mare parte conjugative și adițional mobile, ceea ce înseamnă că aceste plasmide posedă toate elementele necesare pentru a se deplasa către o altă celulă, prin procesul de conjugare. Genele dobândite în urma proceselor de recombinare, integrare și excizie omologă dintr-un cromozom ajung în celulele receptor prin procesul de conjugare (Bennett, 2008).

Prin definiție plasmidele de rezistență posedă una sau mai multe gene de rezistență , ce sunt frecvent însoțite de gene care codifică pentru determinanți de virulență, enzime specifice, sau gene care conferă rezistență la diferite substanțe, cum ar fi metalele grele.

Utilizarea exagerată a antibioticelor, în special în mediul spitalicesc impune o presine selectivă puternică, care determină evoluția și răspândurea genelor de rezistență la antibiotice în cadrul agenților patogeni nosocomiali. Plasmidele conjugative joacă un rol cheie în diseminarea genelor de rezistență în principal în intestinul pacienților internați, care reprezintă cea mai importantă nișă pentru schimbul de gene de rezistență. Microbiomul intestinal reprezintă un rezervor important pentru gene de rezistență, care au fost selectate datorită supra expunerii la antibiotice. Genele de rezistență prezente în microbiomul intestinal pot fi transferate către speciile patogene prin procese conjugative (San Millan, 2018).

Printre genele de rezistență prezente la nivelul plasmidelor se numără:

Gene care conferă rezistență la β-lactam, printre care se numără atât genele care codifică β-lactamaze cu spectru restrâns (penicilinaze), cât și cele care codifică β-lactamaze cu spectru extins (ESBL). Adesea mai multe gene pentru β-lactamaze se găsesc la nivelul aceleiași plasmide, fapt ce permite hidroliza unui spectru larg de antibiotice β-lactamice.

Β-lacatamazele cu spectru extins (ESBL) au capacitatea de a hidroliza marea majoritate a antibioticelor β-lactamice inclusiv cefalosporinele, însă nu pot hidroliza carbapenemele.

Gene care conferă rezistență față de Carbapeneme, considerate ca fiind antibiotice de ultimă soluție. Printre acestea se numără genele ce codifică pentru carbapenemazele KPC, NDM-1, VIM, IMP, OXA

Genele care conferă rezistență la Quinolone și genele care conferă rezistanță față de aminoglicozide sunt localizate frecvent alături de genele pentru ESBL (Al-Agamy et al., 2018).

Rezistența mediată de integroni

Un factor important care influențează dezvoltarea fenotipurilor de multirezistență în rândul microorganismelor îl reprezintă achiziția de elemente genetice mobile (MGE). Printre aceste elemente genetice mobile se numără plasmidele R, transpozonii , integronii și insulele genomice.

Integronii sunt elemente genetice bacteriene capabile să achiziționeze casete genice și să transporte genele de rezistență la antibitice prin recombinare situs specifică la o altă celulă.

Casetele genice sunt elemente mobile, nereplicative, ce conțin în mod normal un ORF ce poate codifica pentru o genă de rezistență la antibiotice și un situs attC (Attachement C) . Casetele genice sunt integrate sau excizate printr-un mecanism de recombinare situs specifică, proces catalizat de integraza IntI.

Aceste casete genice pot fi amestecate în poziția lor prin mecanisme de excizie și reintegrare. În timpul acestui proces de amestecare, un integron ce conține numeroase gene de rezistență la antibiotice poate să mute prin mecanismul de încercare și eroare o gena de rezistență, într-o poziție în care să fie exprimată la un nivel mult mai înalt (Gillings, 2014).

Au fost descrise două clase majore de integroni: integroni cromozomali (CI) și integroni mobili (MI)

Integronii cromozomali sunt localizați la nivelul cromozomilor a sute de specii bacteriene. Analizele de laborator au arătat că 17% din secvența genomului bacterian prezintă un astfel de aranjament.

Integronii cromozomali au fost de asemenea denumiți ”Super integroni”, datorită capacității lor de a purta până la 200 de casete genice, dintre care foarte multe codifică pentru proteine cu funcție necunoscută. De asemenea Integronii cromozomali pot conține casete lipsite de ORF-uri.

Integronii mobili sunt localizați la nivelul elementelor genetice mobile, cum ar fi transpozonii și plasmidele , ce promovează răspândirea acestora în rândul celulelor bacteriene.Integornii mobili conțin un număr limitat de casete genice (pânal la 10 casete genice). Casetele genice prezente la nivelul integronilor mobili codifică de obicei pentru determinanți de rezistență la antibiotice, motiv pentru care sunt supranumiți ”integroni de rezistență”

Integronii mobili au fost descriși cel mai frecvent într-un spectru larg de bacterii Gram-negative și doar uneori în rândul speciilor Gram-pozitive.

Pe baza secvenței de aminoacizi a proteinei IntI au fost descrise cinci clase de integroni mobili. Dintre aceste cinci clase, integronii de clasă I sunt cel mai frecvent întâlniți, urmați de integronii de clasele II și III, iar integronii de clasele IV și V au fost identificați extrem de rar.

Majoritatea integronilor au cinci secvențe primare, înalt conservate, esențiale pentru funcția acestora, însă un procent ridicat al integronilor mobili de clasă I prezintă o regiune la nivelul 3’ denumită segment conservat 3’ (3’ CS- conserved segment 3’) (Deng et al., 2015).

Rezistența mediată de transpozoni

Un element genetic transpozabil reprezintă o secvență de ADN care deține capacitatea de a se deplasa în cadrul unui genom, sau de la un genom la altul, generînd uneori mutații și alterând identitarea genetică a celulei și dimensiunile genomului. Deși sunt elemente genetice solitare , multe astfel de elemente sunt extrem de importante pentru funcția și evoluția genomului.

Elementele genetice transpozabile fac posibilă restrucruearea genomului bacterian prin procese de recombinare între secvențe de ADN heterolog (Munoz-Lopez & Garcia-Perez, 2010).

Traspozonii bacterieni pot fi îmărțiți în 3 categorii.

Traspozonii de clasă I cuprind secvențele de inserție și transpozonii compoziți, traspozonii de clasă II cuprind elementele Tn 3, iar transpozonii de clasă III cuprind un grup de elemente ce posedă proprietăți care nu se găsesc în clasele I și II.

Integrarea elementelor genetice transpozabile la nivelul cromozomului bacterian se poate produce ca un eveniment conservativ numit transpoziție replicativă, în care transpozonul nu este excizat din situsul său original, ci este copiat și apoi integrat la nivelul secvenței țintă.

Pe langă generarea unui proces de recombinare elementele genetice transpozabile pot promova deleția sau inversia unor gene sau pot determina fuziunea a două replici complete. Aceste mecanisme de recombinare au contribuit la evoluția rezistenței la antibioticele uzuale în rândul microorganismelor, reprezentând un aspect de mare importanță clinică.

Analizele moleculare a scos în evidență faptul că multe gene de rezistență la antibiotice au evoluat în râdul microorganismelor producătoare de antibiotice, iar mobilizarea acestor determinanți a fost inițial posibilă datorită acestor elemente ADN transpozabile. Răspândirea rapidă a acestor determinanți a avut loc ulterior prin intermediul plasmidelor și bacterioagilor (Ayarpadikannan & Kim, 2014).

Mecanismele biochimice ale rezistenței la antibiotice

Celulele bacteriene posedă o remarcabilă plasticitate genetică ce le permite acestora să răspună la un spectru larg de opresiuni exercitate de mediu incluzând prezența antibioticelor ce pot periclita existența acestora. Bacteriile împart aceeași nișă ecologică cu organismele producătoare de antibiotice, astfel acestea au dezvoltat anumite mecanisme pentru a depășii efectul niciv al acestor molecule și prin urmare rezistența lor intrinsecă le permite acestora să prospere în prezența acestora.

Rezistența la antibiotice poate apărea prin intermediul a trei mecanisme generale: Prevenirea interacțiunii antibioticului cu ținta. Efluxul antibioticului din celulă și distrugerea directă sau modificarea acestuia (Alibert et al., 2017).

Impermeabilitatea membranei celulare

Membrana externă este mult mai permeabilă decât membrana celulară datorită prezenței porinelor, proteine care permit trecerea facilă a moleculelor mici de aproximativ 500Da.

Datorită membranei externe, bacteriile Gram-negative sunt singurele care pot rezista la antibiotice printr-un mecanism ce implică scăderea permeabilității membranei externe. Această membrană externă hidrofobă, permite moleculelor hidrofile să treacă prin porii ei. Porii transmembranari au o structură trimerică cu o componentă monomeră ce acționează ca un canal apos. Diametrul mediu al porilor este de 1 până la 1.2 nm.

Modificările numărului absolut de pori sau modificările calitative reduc difuzia antibioticelor ce pătrund în celulă. Acest mecanism de scădere a permeabilității membranare conduce la rezistența încrucișată la mai multe familii de antibiotice. (Miller et al., 2014).

Speciile care manifestă cel mai frecvent astfel de mecanisme de rezistență sunt în principal enterobacterii, cum ar fi tulpinile de Klebsiella sp. , Enterobacter sp. , Serratia sp și Salmonella sp.

Pentru tulpinile de P. aeruginosa, rezistența prin modularea permeabilității rezultă din deficitul unei proteine OprD2 și implică 12-15% din tulpinile identificate în spitale. Permeabilitatea redusă este un mecanism deosebit de eficient , mai ales atunci când este asociată cu un alt mecanism de rezistență, care permite bacteriilor să exprime un nivel mai ridicat de rezistență (Shen et al., 2015).

Modificarea țintei antibioticului

Modificarea situsurilor țintă ale antibioticelor reprezintă un mecanism comun de rezistență la antibiotice, exemple de tulpini clinice care prezintă astfel de mecanisme de rezistență putând fi întâlnite pentru fiecare clasă de antibiotice, indiferent de mecanismul acestora de acțiune. Modificarea situsului țină rezultă de multe ori ca urmare a mutației spontane a unei gene bacteriene plasate la nivelul cromozomului și selecția in prezența antibioticului.

Exemple de astfel de mutații includ mutațiile care apar la nivelul genelor care codifică pentru ARN polimerază și giraza ADN, ceea ce conduce la dezvoltarea rezistenței la rifamicine și quinolone (Munita & Arias, 2016).

Asemenea strategii de rezistență au fost observate in cazul:

Staphylococcus sp. împotriva metilciclinei și altor antibiotice β-lactamice prin modificarea sau dobândirea unor gene ce codifică pentru diferite proteine PBP (penicillin binding proteins), conducând la scăderea afinității acestor antibiotice.

Enterococci, împotriva vancomicinei prin alterarea preursorilor componentelor peretelui celular, pentru a inhiba legarea vancomicinei

Mycobacterium sp. împotriva streptomicinei prin modificarea proteinelor ribozomale sau ARNr 16s

Mutații la nivelul ARN polimerazei, conducând la dezvoltarea rezistenței față de rifamicine.

Mutații la nivelul ADN girazei, conduc la dobândirea rezistenței la quinolone (Lee et al., 2018).

Inactivarea enzimatică a antibioticelor

Reprezintă cel mai frecvent mecanism de rezistență la antibiotice și presupune modificarea unei enzime celulare existente pentru a reacționa cu antibioticul astfel încât acesta să nu mai afecteze microorganismul. În cazul streptomicinei , antibioticul este modificat chimic astfel încât acesta nu se mai poate lega de ribozom pentru a bloca sinteza proteinelor. Un alt exemplu de enzime ce acționează asupra antibioticelor inactivându-le sunt penicilinazele, un grup de β-lactamaze care scindează inelul β-lactamic al moleculei de penicilină. Astfel de gene care codifică pentru enzime ce inactivează antibioticele pot fi dobândite prin transfer orizontal, însă multe specii bacteriene codifică pentru astfel de enzime în mod intrinsec.

Asemenea strategii de rezistență la antibiotice au fost observate de asemenea la Enterobacteriaceae împotriva cloramphenicol, (prin acțiunea enzimelor ce inactivează antibioticul prin procese de acetilare), bacterii Gram-negasive și Gram pozitive împotriva aminoglicozidelor (prin intermediul enzimelor ce realizează fosforilarea sau adenilarea grupărilor hidroxil și acetilarea grupărilor amino ale antibioticelor) (Munita & Arias, 2016).

Printre strategiile enzimatice abordate pentru inactivarea antibioticelor se numără hidroliza și transferul grupărilor chimice.

Moleculele multor antibiotice posedă legaturi chimice sensibile la hidroliză (legături esterice, amidice) a căror integritate este esențială pentru funcția biologică a acestor molecule. Există o serie de enzime care au evoluat pentru a ținti și cliva specific aceste tipuri de legături, astfel oferind un mecanism de inhibiție a activității antibioticelor. Astfel au evoluat o serie de amidaze care scindează inelul h-lactam la antibioticelor de tipul penicilinelor si cefalosporinelor. Alte exemple includ de asemenea esteraze care au fost asociate cu rezistenta la fosfomicină.

Cel mai divers și ca urmare cel mai mare grup de enzime de rezistență este grupul transferazelor. Aceste enzime modifică covalent antibioticele, conducând la modificări structurale ce afectectează funcția acestora. Strategiile chimice includ O-acetilare, N-acetilare, O-nucleotidare, O-ribozilare, O-glicozilare și transfer de tiol (Wright, 2005).

CAPITOLUL AL IV-LEA

PARTEA EXPERIMENTALĂ

Scop și obiective

Scopul lucrării :

Studiul markerilor fenotipici și moleculari de rezistență la antibiotice la tulpini nosocomiale de Acinetobacter sp. Pseudomonas sp. și Stenotrophomonas sp. în vederea reducerii riscului de diseminare epidemiologică.

Obiective:

Analiza profilurilor de rezistență la antibiotice ale tulpinilor nosocomiale de Acinetobacter sp. Pseudomonas sp. și Stenotrophomonas sp. prin metoda VITEK-2 compact si BD Phoenix

Studiul genotipic al rezistenței la antibiotice β-lactamice la tulpinile izolate prin metoda PCR și electroforeza produșilor de amplificare ai genelor analizate.

Materiale si metode

În prezenta lucrare au fost izolate un numar total de 52 de tulpini de BGNNF (tabelul nr. 1.) repartizate pe specii astfel: 23 tulpini de bacilli Gram negativi aparținând speciei P. aeruginosa , 12 tulpini aparținând speciei A. baumannii, 10 tulpini aparținând speciei S. maltophilia , 3 tulpini aparținând speciei P. putida, și câte o tulpină aparținând speciilor A.lwoffii, P. cepacia, și A. calcoaceticus în cadrul Spitalului Clinic Fundeni din București și analizate în departamentul de Microbiologie al Institutului de Cercetare al Universității din București (ICUB).

Tabel nr. 1. Codul de identificare al tulpinilor analizate.

Identificarea tulpinilor spitalicești studiate s-a realizat cu ajutorul sistemului automatizat BD Phoenix și Vitek-2 Compact.

4.2.1. Principiul de funcționare al sistemului automat BD Phoenix (Fig. 1.)

Este un sistem automat, ce permite identificarea și testarea într-un timp scurt a susceptibilității la antibiotice a microorganismelor cu relevanță în clinică. Acesta utilizează un indicator de oxido-reducere, detectarea turbidometrică a creșterii prin metoda microdiluțiilor. Sistemul BD Phoenix este primul sistem ce incorporează nefelometrie automată.

Sistemul utilizează un card de identificare cu 45 de microgodeuri cu substanțe biochimice cromogene și fluorogene (Gheorghe, 2014, Teză de doctorat). Inocularea panelurilor (Fig. 2.) presupune realizarea unei suspensii bacteriene 0,5 McFarland Analizarea durează circa 5-7 minute, iar sistemul e capabil să proceseze circa 200 de probe ID/AST în mai puțin de 4,5 ore.

Sistemul Phoenix AP include un soft de printare de coduri de bare BD EpiCenter™ . Fiecare mediu ID (bulion ID Phoenix) poate fi rapid identificat cu ajutorul unei etichete cu cod de bare ce are următoarele informații: numele pacientului, secția, număr de acces al probei, bacteria analizată, tipul de panou utilizat, codul tulpinii (Carroll et al., 2006).

Fig.1 Sistemul automat BD Phoenix

https://www.google.ro/search?q=bd+phoenix+principle&source.

Fig.2 Paneluri utilizate în sistemul BD Phoenix

https://www.google.ro/search?q=bd+phoenix+principle&source

4.2.2.Principiul de functionare al sistemului Vitek-2 Compact

Vitek-2 compact este un sistem automat, utilizat în laboratorul de microbiologie pentru identificarea speciilor bacteriene și a susceptibilității la antibiotice. Acest sistem folosește o tehnologie avansată de detecție colorimetrică pentru a determina reacții biochimice individuale ce se petrec într-o varietate de carduri de identificare . După inoculara cu o suspensie standardizată din microorganismul necunoscut, fiecare card este incubat și analizat de instrumentul optic intern al sistemului.

Sistemul Vitek-2 compact folosește o metodă fluorogenă pentru identificarea microorganismelor, și o metodă turbidimetrică pentru testarea sensibilității folosind un card cu 64 de godeuri (Fig. 3.). Kiturile disponibile permit identificarea bacililor Gram-negativi (card ID-GN) și Gram pozitivi (ID-GP). Cadrul Vitek 2 ID-GN permite identificarea a 154 de specii de Enterobacteriaceae în 10 ore. Cardul Vitek 2 ID-GP permite identificarea a 124 de specii de stafilococi, streptococi și enterococi în 8 ore. Cardul Vitek 2 Antimicrobial Susceptibility Tests (AST) are o mare importanță clinică, rezultatele din analiza tulpinilor de bacili Gram negativi aerobi, aparținând genurilor Staphylococcus sp. Streptococcus sp. și Enterococcus sp. fiind obținute în mai puțin de 18 ore (Pincus, 2010).

e

Fig.3. Card utilizat la sisteml VITEK-2 Compact

https://www.google.ro/search?q=vitek+2+compact+principle&tbm=isch&ved

4.2.3. Testarea spectrului de sensibilitate la antibiotic ale tulpinilor de Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. și Stenotrophomonas sp. cu ajutorul sistemului Vitek-2 compact

Testarea spectrului de sensibilitate s-a realizat folosind protocolul următor.

3 ml din culturile bacteriene au fost transferate într-un tub de centrifugă și centrifugate pentru 5 minute la 3000 rpm. Supernatantul a fost aruncat iar peste pelet s-a adăugat o soluție salină pentru obținerea a 3ml suspensie în tubul de centrifugă. S-a realizat o amestecare ușoară prin inversia tubului de 2-3 ori, după care tubul a fost recentrifugat la 3000 rpm pentru 15 minute. Supernatantul a fost din nou aruncat, iar peletul a fost transferat într-un tub VITEK cu un tampon steril. S-au adăugat 3 ml de soluție salină normală urmată de o vortexare scurtă. Turbiditatea inoculului a fost ajustată folosind o soluție salină normală la 0.5-0.6 McFarland, turbiditate recomandată pentru prepararea inoculului în VITEK. Turbiditatea McFarland a fost verificată de un instrument DensiCHEK Plus, în confrmitate cu indicațiile producătorului. 145µl din acest inocul a fost transferat într-un alt tub VITEK care conține 3 ml soluție salină normală. Acest al 2-lea inocul a fost folosit pentru testarea sensibilității la antibiotice. Inoculul a fost turnat pe panourile VITEK și sigilat și apoi a fost încărcat în analizatorul VITEK-2 Compact pentru 30 de minute (Barman et al., 2018).

Sistemul VITEK-2 Compact a fost utilizat pentru a determina sensibilitatea la următoarele antibiotice (tabelul nr. 2.)

Tabel nr. 2. Antibiotice utilizate pentru determinarea spectrului de sensibilitate/ rezistență ale tulpinilor analizate cu ajutorul sistemului VITEK-2 Compact.

4.2.4. Obținerea ADN bacterian s-a realizat folosind protocolul de lucru de extracție alcalină a ADN:

20 µl NaOH 0.05M

SDS 0.25%

1-5 colonii A. baumannii

din fiecare tulpină s-a obținut o suspensie celulară care a fost denaturată 15 min, la 95 oC

Se adaugă 180 µl TE

Se centrifughează 3 min, la 13.000 rpm

Se recuperează supernatantul care este utilizat în reacția de amplificare.

4.2.5. Evidențierea materialului genetic la antibiotice β-lactamice si quinolone prin intermediul reacției PCR (Polymerase Chain Reaction= Reacția de polimerizare în lanț).

Reacția PCR (Polymerase Chain Reaction= Reacția de polimerizare în lanț) este o metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite secvențe de ADN.

Din punct de vedere chimic, reacția PCR este constituită din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele două catene ale matriței. Diferența esențială între o asemenea reacție de replicare și un proces de replicare ADN in vivo, este reprezentată de faptul că în reacția PCR etapa de desfacere a dublului helix matriță și respectiv, cea de atașare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic ci prin parcurgerea unor trepte de temperatură, iar singura enzimă folosită în reacție este o ADN polimeraza dependentă de ADN (Vassu și colab., 2001).

În urma observării fenotipurilor bacteriene obținute cu ajutorul metodelor anterioare, s-a realizat verificarea existenței câtorva gene frecvent asociate cu producerea de β-lactamaze din clasa D (oxacilinaze) si β-lactamaze din clasa B (carbapenemaze), (tab. 3, 4, 5) utilizând mixul de reacție – ThermoScientific (blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaIMP, blaVIM-2 , blaSHV, blaCTX-M, blaTEM, blaVEB):

Pentru realizarea probelor in PCR s-a folosit PCR Eppendorf și Bio-RadThermocycle.

Tabel nr. 3. Compozitia mixului de reactie

Tabel nr. 4. Secvența primerilor și dimensiunea ampliconilor obtinuți în experimentele multiplex și simplex PCR

Tabel nr. 5.Programul de amplificare al reacțiilor PCR.

4.2.6.Electroforeza ADN

Pentru pregătirea gelului de electroforeză se folosesc următoarele componente:

Agaroză (1g);

Tampon TBE 0,5X (tris, EDTA, acid boric);

Bromură de etidium care are rolul de a colora benzile ADN pentru a fi vizibile în domeniul UV.

Prima etapă este de a dizolva agaroza în TBE 0,5X pe baie de apă. După ce agaroza s-a dizolvat și a fost lasată în prealabil câteva minute să se răcească, gelul cald de aproximativ 60șC se toarnă in cuva electroforezei peste care se adaugă pieptenele și se lasă la solidificat. Ulterior se scoate pieptenele iar peste gel se toarnă tampon de migrare TBE 0,5X.

În godeuri se adaugă probele care conțin loading buffer (tampon de încarcare) și 2µl probă de ADN. În godeurile martor se încarcă doar tamponul de încărcare și markerul de greutate moleculară.

În final, aparatul se conectează la o sursă de curent electric și se setează timpul de migrare de 60 minute iar tensiunea curentului electric de 100V, benzile de ADN migrând în funcție de greutatea moleculară. După ce aparatul și-a terminat timpul necesar realizarii deplasării, gelul se scoate din cuva electroforezei și este pus în transiluminator care permite vizualizarea în UV.

Rezultate și discuții

În lucrarea prezentă au fost izolate 52 de tulpini de bacili Gram-negativi, nonfermentativi , în cadrul Spitalului Clinic Fundeni din București, din 13 surse de izolare prezentate în tabelul nr. 6 . Cele 52 de tulpini au fost analizate pentru stabilirea profilurilor de rezistență la antibiotice, iar ulterior s-a realizat extracția alcalină a ADN bacterian în vederea identificării prezenței genelor de rezistență la antibiotice β- lactamice.

Tabel nr. 6. Distribuția tulpinilor bacteriene după sursa de izolare.

Dintre tulpinile izolate, 14 (24%) au fost izolate din urocultură, 13 tulpini (22%) au fost izolate din hemocultură, 10 tulpini (17%) au fost izolate din tușeu rectal, 6 tulpini (10%) au fost izolate din coprocultură, 4 tulpini (7%) au fost izolate din exudat faringian, 2 tulpini (4%)au fost izolate din urină, 2 tulpini (4%) au fost izolate din plagă, 2 tulpini (4%) au fost izolate din secreție bronșică și câte o tulpină a fost izolată din cateter venos, tub de dren, escară, secreți ale plăgii și spută (2%).

Fig. 4. Distribuția tulpinilor bacteriene după sursa de izolare.

Dintre cele 52 de tulpini izolate, 23 (44%) au fost tulpini de P. aeruginosa 12 (23%) au fost tulpini de A. baumannii , 10 (19%) dintre acestea au fost tulpini de S. maltophilia , 3 (6%) au fost tulpini de P. putida și câte o tulpină de A. lwoffii, A. calcoaceticus. B. cepacia și Aeromonas veronii (2%) ( Fig. 5. ).

Tabel nr. 7. Distribuția tulpinilor bacteriene în funcție de specie.

Fig.5 . Distribuția tulpinilor în funcție de specie.

Cele 52 de specii au fost analizate cu ajutorul sistemului automat VITEK-2 Compact, pentru stabilirea profilelor de rezistență la antibiotice.Analizele au demonstrat faptul că anumite tulpini analizate sunt multirezistente. Distribuția tulpinilor în funcție de profilele de rezistență la antibiotice este prezentată in figurile 6 ,7 și 8.

Studiul profilurilor de rezistență la antibiotice la tulpinile de Acinetobacter sp. analizate a demonstrat niveluri ridicate de rezistență la antibiotice. Cel mai înalt nivel de rezistență, respectiv 100% a fost înregistrat la gentamicină, ciprofloxacină , azteronam, ampicillin-sulbactam și ertapenem. Niveluri ridicate au fost observate și la cefepimă (92%), ceftazidimă (85%), amikacină (75%). Sensibilitatea tulpinilor de Acinetobacter sp. analizate a fost ridicată față de colistin (100%), nivele mai mici inregistrându-se față de cefepimă, imipenem și meropenem (7%), dar și față de amikacină (4%). Dintre tulpinile analizate, 14% au fost intermediare la ceftazidimă, iar 7% la levofloxacin, amikacină tigeciclină, și minociclină (Fig. 6. ).

Fig. 6. Distribuția tulpinilor de Acinetobacter sp. după profilul de rezistență la antibiotice

Niveluri ridicate de rezistență au fost identificate și în cazul tulpinilor de Psudomonas sp. analizate. Cel mai înalt nivel de rezistență a fost raportat la ertapenem, respectiv 100%. Niveluri ridicate de rezistență au fost identificate și față de cefepimă (92%), ciprofloxacină și aztreonam (85%), gentamicină și ceftazidimă (81%), piperacilin-tazobactam (77%), amikacină (55%), și doar 3 % față de imipenem și meropenem. În ceea ce privește sinsibilitatea la antibiotice a tulpinilor analizate, aceasta a fost maximă (100%) față de colistin, niveluri mai mici înregistrăndu-se față de amikacină (33%), gentamicină și levofloxacin (18%), aztreonam (14%), ceftazidimă și ciprofloxacină (11%), piperacinil-tazobactam și cefepimă (7%) , imipenem și meropenem (3%). Dintre tulpinile analizate, 14% au fost intermediare față de piperacilin-tazobactam, și 3% au fost intermediare față de ciprofloxacină și amikacină.

Fig.7. Distribuția tulpinilor de Pseudomonas sp. după profilul de rezistență la antibiotice

Studiul profilurilor de rezistență la tulpinile de S. maltophilia au demonstrat de asemenea niveluri relativ scăzute de rezistență la antibiotice, respectiv 10% față de amikacină , gentamicină, azteronam, ciprofloxacin, cefepimă, ertapenem și ampicillin-sulbactam. Niveluri crescute de sensibilitate au fost înregistrate față de colistin (100%), levofloxacin și Sulfamethoxazol (90%) și ceftazidimă (20%) (Fig. 8.).

Fig. 8. Distribuția tulpinilor de S. maltophilia după profilul de rezistență la antibiotice.

În ceea ce privește distribuția genelor codificatoare pentru β-lactamaze și carbapenemaze, au fost analizate la nivel genotipic 14 tulpini de Acinetobacter sp. și 27 de tulpini de Pseudomonas sp. Genele de rezistență la antibiotice analizate au fost blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaIMP, blaVIM-2 , blaSHV, blaCTX-M, blaTEM, blaVEB .

În urma analizelor de laborator efectuate pe tulpinile de Acinetobacter sp. au fost identificate gene care codifică pentru carbapenemaze, respectiv blaOXA-51 (100%), blaOXA-23 și blaOXA-24 (57%), blaIMP, blaVIM-2 (14%), gene codificatoare pentru β-lactamaze, respectiv blaSHV, blaCTX-M, blaTEM (7%) (Fig. 9).

Fig. 9. Distribuția numerică a genelor care codifică pentru carbapenemaze și β-lactamaze identificate la tulpinile de Acinetobacter sp.

În cazul tulpinilor de Pseudomonas sp. izolate, în urma analizelor la nivel genotipic au putut fi identificate gene codificatoare pentru carbapenemaze și β-lactamaze de tipul blaVIM, blaIMP (71%), blaCTX-M ,blaTEM (7%), blaSHV și blaVEB (3%). (Fig. 10.).

Fig.10. Distribuția numerică a genelor care codifică pentru carbapenemaze și β-lactamaze identificate la tulpinile de Pseudomonas sp.

În figurile de la nr. 11 până la 19 se observă ampliconii pozitivi ai genelor blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaIMP, blaVIM-2 , blaSHV, blaCTX-M, blaTEM, blaVEB.

Studii anterioare realizate pe teritoriul României au demonstrat prezența unor nivele înalte de rezistență în rândul tulpinilor de A. baumannii izolate din mediul spitalicesc. Într-un studiu din 2019, 75 de tulpini de A. baumannii au fost analizate în scopul obținerii profilurilor de rezistență la antibiotice. Rezultatele analizelor au scos la iveală faptul că 82,66% dintre tulpinile izolate din mediul spitalicesc au fost rezistente la imipenem, 84% la meropenem și 85,33% la SXT. În ceea ce privește producția de carbapenemaze, 50% dintre tulpini au fost pozitive pentru OXA-23, 26% pentru OXA-24, 26,6% pentru IMP și 1.33% pentru VIM-2. (Gheorghe et al. 2019 )

În cadrul unui studiu din 2015 realizat în România, privind caracterizarea tulpinilor de A. baumannii și P. aeruginosa producătoare de carbapenemaze, au fost analizate 11 tulpini de P. aeruginosa și 7 tulpini de A. baumannii . Rezultatele obținute au demonstrat faptul că toate tulpinile de P. aeruginosa izolate au fost producătoare de VIM-2, fiind rezistente la imipenem , meropenem, akamicină, tobramicină, etc. Gena care codifică pentru β-lactamaza VIM-2 fiind asociată în cazul majorității izolatelor cu un inregron de clasa 1 ce prezintă în prima poziție o genă aacA7, codificatoare pentru acetyltransferaza ce conferă rezistență la amikacină.

Toate tulpinile de a. baumannii izolate au fost producătoare de OXA-23 fiind rezistente la imipenem, meropenem, cefotazimă , ceftazidimă, cefepimă, acid clavulanic, etc. În cazul tuturor izolatelor, gena blaOXA-23 a fost incorporată într-un tranpozon TN2008 (Gheorghe et al. 2014).

În 2012, în Polonia a fost realizat un studiu pe 30 de tulpini de A. baumannii izolate din sânge, lichid cerebrospinal și țesut cerebral, în cadrul a 16 spitale din 13 orașe. Dintre aceste 30 de tulpini, 29 au fost multirezistente. În ceea ce privește rezistența la carbapeneme, 5 dintre acestea au fost intermediare la meropenem, iar 8 au fost rezistente atât la imipenem, cât și meropenem.

Nivelul crescut de expresie al genelor ce codifică pentru β-lactamaze a fost analizat prin PCR. Au fost obținuți ampliconi pentru 8 tulpini, inclusiv pentru cele ce exprimau un nivel scăzut de rezistență la carbapeneme. Dintre genele care codifică pentru carbapenemaze, blaOXA-23 a fost amplificată și secvențiată în 6 izolate, iar blaOXA-51 a fost detectată în toate cele 8 izolate. (Izdebski et al. 2012)

Concluzii

Infecțiile nosocomiale cu bacili Gram-negativi, nonfermentativi reprezină o problemă de importanță mondială, mediul spitalicesc fiind unul dintre cele mai importante rezervoare de gene de rezistență la antibiotice. Virulența acestor microorganisme este amplificată de capacitatea remarcabilă a acestora de a dobândi și exrima noi gene de rezistență la antibiotice, tulpinilile rezistente urmând a fi selectate datorită presiunii selective exercitate de utilizarea exagerată a antibioticelor uzuale.

Au fost izolate un număr total de 52 de tulpini de bacili Gram-negativi, nonfermentativi, din cadrul Spitalului Clinic Fundeni din București, dintre care 44 % au fost tulpini de P. aeruginosa, 23% au fost tulpini de A. baumannii, 19 % au fost tulpini de S. maltophilia 3 % au fost tulpini de P. putida, iar 2% au fost tulpini de A. lwoffii, A. calcoaceticus. B. cepacia și Aeromonas veronii. Tulpinile au fost izolate din 13 surse de izolare, sursa majoritară fiind reprezentată de urocultură 24%), urmată de hemocultură (22%) și tușeu rectal (17%), procente mi mici au fost izolate din coprocultură (10%), exudat faringian (7%), urină, secreție bronșică și plagă (4%), cateter venos, tub de dren, escară, spută și secreție a plăgii (2%).

Studiul profilurilor de rezistență la antibiotice au demonstrat existența unor niveulri ridicate de rezistență în rândul tulpinilor izolate. Tulpinile de Acinetobacter sp. izolate au prezentat rezistență maximă (100%) la gentamicină, ciprofloxacină, aztreonam, ampicillin-sulbactam și ertapenem. De asemenea, tulpinile de Acinetobacter sp. izolate au prezentat niveluri mai mari de rezisteță față de ceftazidimă (85%), amikacină (75%) și gentamicină (100%), decât tulpinile de Pseudomonas sp. care au prezentat un nivel de rezistență de 81% la ceftazidimă, 55% la amikacină și 81 % la gentamicină. Toate tulpinile analizate au fost sensibile la colistin, tulpinile de Pseudomonas sp. prezentând de asemenea un nivel de sensibilitate de 33% față de amikacină, iar tulpinile de S. maltophilia un nivel de 90% la levofloxacină și sulfomethoxazol.

Studiile la nivel genotipic ale markerilor de rezistență au demonstrat prezența genelor codificatoare pentru β-lactamaze și carbapenemaze în rândul tulpinilor analizate. În rândul tulpinilor de Acinetobacter sp au fost identificate cu precădere genele blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, în timp ce în rândul tulpinilor de Pseudomonas sp., iar în rândul tulpinilor de Pseudomonas sp. analizate au putut fi identificate cu precădere genele blaIMP, blaVIM-2, rezultate în conformitate cu studii similare realizate pe teritoriul României, cât și al altor țări din Europa.

Bibliografie

Calvori, C., Frontali, L., Leoni, L., & Tecce, G. (1965). Effect of rifamycin on protein synthesis [28]. Nature. https://doi.org/10.1038/207417a0

Palleroni, N. J., Ballard, R. W., Ralston, E., & Doudoroff, M. (1972). Deoxyribonucleic acid homologies among some Pseudomonas species. Journal of Bacteriology. https://doi.org/10.1128/jb.110.1.1-11.1972

Milavetz, B. I., Horoszewicz, J. S., Rinehart, K. L., & Carter, W. A. (1978). Study of ansamycin inhibition of a ribonucleic acid-directed deoxyribonucleic acid polymerase by an immobilized template assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. https://doi.org/10.1128/aac.13.3.435

Turck, M. (1982). Cephalosporins and related antibiotics: an overview. Reviews of Infectious Diseases. https://doi.org/10.1093/clinids/4.supplement_2.s281

Khabbaz, R. F., Arnow, P. M., Highsmith, A. K., Herwaldt, L. A., Chou, T., Jarvis, W. R., … Allen, J. R. (1984). Pseudomonas fluorescens bacteremia from blood transfusion. The American Journal of Medicine. https://doi.org/10.1016/0002-9343(84)90751-4

Birnbaum, J., Kahan, F. M., Kropp, H., & Macdonald, J. S. (1985). Carbapenems, a new class of beta-lactam antibiotics. Discovery and development of imipenem/cilastatin. The American Journal of Medicine. https://doi.org/10.1016/0002-9343(85)90097-X

Goldmann, D. A., & Klinger, J. D. (1986). Pseudomonas cepacia: Biology, mechanisms of virulence, epidemiology. The Journal of Pediatrics. https://doi.org/10.1016/S0022-3476(86)80749-1

Janse, C. J., van der Klooster, P. F., van der Kaay, H. J., van der Ploeg, M., & Prosper Overdulve, J. (1986). Mitomycin-C is an unreliable inhibitor for study of DNA synthesis in Plasmodium. Molecular and Biochemical Parasitology. https://doi.org/10.1016/0166-6851(86)90076-9

Fuchs, P. C., Jones, R. N., Barry, A. L., Ayers, L. W., Gerlach, E. H., Allen, S. D., & Pfaller, M. (1988). In vitro antimicrobial activity of tigemonam, a new orally administered monobactam. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. https://doi.org/10.1128/AAC.32.3.346

Inzana, T. J. (1990). Miscellaneous Glucose-Nonfermenting Gram-Negative Bacteria. In Diagnostic Procedure in Veterinary Bacteriology and Mycology. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-161775-2.50018-9

Cooksey, R., Swenson, J., Clark, N., Gay, E., & Thornsberry, C. (1990). Patterns and mechanisms of β-lactam resistance among isolates of Escherichia coli from hospitals in the United States. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. https://doi.org/10.1128/AAC.34.5.739

Menninger, J. R., & Coleman, R. A. (1993). Lincosamide antibiotics stimulate dissociation of peptidyl-tRNA from ribosomes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. https://doi.org/10.1128/AAC.37.9.2027

Bergogne-Bérézin, E., & Towner, K. J. (1996). Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: Microbiological, clinical, and epidemiological features. Clinical Microbiology Reviews. https://doi.org/10.1128/cmr.9.2.148-165.1996

Barbara H. Iglewski. (1996). Chapter 27 – Pseudomonas. In Medical Microbiology. 4th edition. https://doi.org/10.1525/9780520959743-027

Spickler, C., Brunelle, M. N., & Brakier-Gingras, L. (1997). Streptomycin binds to the decoding center of 16S ribosomal RNA. Journal of Molecular Biology. https://doi.org/10.1006/jmbi.1997.1323

North, D. S., Fish, D. N., & Redington, J. J. (1998). Levofloxacin, a second-generation fluoroquinolone. Pharmacotherapy. https://doi.org/10.1002/j.1875-9114.1998.tb03925.x

Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., & Tulkens, P. M. (1999). Aminoglycosides: Activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. https://doi.org/10.1128/aac.43.4.727

Ku, S. C., Hsueh, P. R., Yang, P. C., & Luh, K. T. (2000). Clinical and microbiological characteristics of bacteremia caused by Acinetobacter lwoffii. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. https://doi.org/10.1007/s100960000315

Holten, K. B., & Onusko, E. M. (2000). Appropriate prescribing of oral beta-lactam antibiotics. American Family Physician.

Martinez, J. L., & Baquero, F. (2000). Mutation frequencies and antibiotic resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. https://doi.org/10.1128/AAC.44.7.1771-1777.2000

Bambeke, F. Van, Balzi, E., & Tulkens, M. (2000). Antibiotic Efflux Pumps Franc. Biochemical Pharmacology. https://doi.org/10.1093/jac/dki171

Barnard, F. M., & Maxwell, A. (2001). Interaction between DNA gyrase and quinolones: Effects of alanine mutations at GyrA subunit residues Ser83 and Asp87. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. https://doi.org/10.1128/AAC.45.7.1994-2000.2001

Chopra, I., & Roberts, M. (2001). Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. https://doi.org/10.1128/mmbr.65.2.232-260.2001

Mehta, R., & Champney, W. S. (2003). Neomycin and paromomycin inhibit 30S ribosomal subunit assembly in Staphylococcus aureus. Current Microbiology. https://doi.org/10.1007/s00284-002-3945-9

Patel, O., Satchell, J., Baell, J., Fernley, R., Coloe, P., & Macreadie, I. (2003). Inhibition studies of sulfonamide-containing folate analogs in yeast. Microbial Drug Resistance. https://doi.org/10.1089/107662903765826723

Webber, M. A., & Piddock, L. J. V. (2003). The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. https://doi.org/10.1093/jac/dkg050

Goss, C. H., Mayer-Hamblett, N., Aitken, M. L., Rubenfeld, G. D., & Ramsey, B. W. (2004). Association between Stenotrophomonas maltophilia and lung function in cystic fibrosis. Thorax. https://doi.org/10.1136/thx.2003.017707

Koba, M., & Konopa, J. (2005). [Actinomycin D and its mechanisms of action]. Postepy higieny i medycyny doswiadczalnej (Online).

Floss, H. G., & Yu, T. W. (2005). Rifamycin – Mode of action, resistance, and biosynthesis. Chemical Reviews. https://doi.org/10.1021/cr030112j

Campbell, E. A., Pavlova, O., Zenkin, N., Leon, F., Irschik, H., Jansen, R., … Darst, S. A. (2005). Structural, functional, and genetic analysis of sorangicin inhibition of bacterial RNA polymerase. EMBO Journal. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600499

Wright, G. D. (2005). Bacterial resistance to antibiotics: Enzymatic degradation and modification. Advanced Drug Delivery Reviews. https://doi.org/10.1016/j.addr.2005.04.002

Poirel, L., & Nordmann, P. (2006). Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: Mechanisms and epidemiology. Clinical Microbiology and Infection. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2006.01456.x

Lalucat, J., Bennasar, A., Bosch, R., García-Valdés, E., & Palleroni, N. J. (2006). Biology of Pseudomonas stutzeri. Microbiology and Molecular Biology Reviews. https://doi.org/10.1128/mmbr.00047-05

Carroll, K. C., Borek, A. P., Burger, C., Glanz, B., Bhally, H., Henciak, S., & Flayhart, D. C. (2006). Evaluation of the BD phoenix automated microbiology system for identification and antimicrobial susceptibility testing of staphylococci and enterococci. Journal of Clinical Microbiology. https://doi.org/10.1128/JCM.02636-05

Woodford, N., Ellington, M. J., Coelho, J. M., Turton, J. F., Ward, M. E., Brown, S., … Livermore, D. M. (2006). Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp. International Journal of Antimicrobial Agents. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2006.01.004

Woodford, N., & Ellington, M. J. (2007). The emergence of antibiotic resistance by mutation. Clinical Microbiology and Infection. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2006.01492.x

Santillana, E., Beceiro, A., Bou, G., & Romero, A. (2007). Crystal structure of the carbapenemase OXA-24 reveals insights into the mechanism of carbapenem hydrolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. https://doi.org/10.1073/pnas.0607557104

Brasme, L., Nordmann, P., Fidel, F., Lartigue, M. F., Bajolet, O., Poirel, L., … De Champs, C. (2007). Incidence of class A extended-spectrum β-lactamases in Champagne-Ardenne (France): A 1 year prospective study. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. https://doi.org/10.1093/jac/dkm319

Bennett, P. M. (2008). Plasmid encoded antibiotic resistance: Acquisition and transfer of antibiotic resistance genes in bacteria. In British Journal of Pharmacology. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0707607

Ryan, R. P., Monchy, S., Cardinale, M., Taghavi, S., Crossman, L., Avison, M. B., … Dow, J. M. (2009). The versatility and adaptation of bacteria from the genus Stenotrophomonas. Nature Reviews Microbiology. https://doi.org/10.1038/nrmicro2163

Coculescu, B. I. (2009). Antimicrobial resistance induced by genetic changes. Journal of medicine and life.

Kong, K. F., Schneper, L., & Mathee, K. (2010). Beta-lactam antibiotics: From antibiosis to resistance and bacteriology. APMIS. https://doi.org/10.1111/j.1600-0463.2009.02563.x

Munoz-Lopez, M., & Garcia-Perez, J. (2010). DNA Transposons: Nature and Applications in Genomics. Current Genomics. https://doi.org/10.2174/138920210790886871

Pincus, D. H. (2010). Microbial identification using the bioMérieux VITEK® 2 system. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods.

Kardos, N., & Demain, A. L. (2011). Penicillin: The medicine with the greatest impact on therapeutic outcomes. Applied Microbiology and Biotechnology. https://doi.org/10.1007/s00253-011-3587-6

Jurat-Fuentes, J. L., & Jackson, T. A. (2012). Bacterial entomopathogens. In Insect Pathology. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-384984-7.00008-7

Howard, A., O’Donoghue, M., Feeney, A., & Sleator, R. D. (2012). Acinetobacter baumannii An emerging opportunistic pathogen. Virulence. https://doi.org/10.4161/viru.19700

Gómez, C., Olano, C., Palomino-Schätzlein, M., Pineda-Lucena, A., Carbajo, R. J., Brãa, A. F., … Salas, J. A. (2012). Novel compounds produced by Streptomyces lydicus NRRL 2433 engineered mutants altered in the biosynthesis of streptolydigin. Journal of Antibiotics. https://doi.org/10.1038/ja.2012.37

Cantón, R., González-Alba, J. M., & Galán, J. C. (2012). CTX-M enzymes: Origin and diffusion. Frontiers in Microbiology. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00110

Soto, S. M. (2013). Role of efflux pumps in the antibiotic resistance of bacteria embedded in a biofilm. Virulence. https://doi.org/10.4161/viru.23724

Beceiro, A., Tomás, M., & Bou, G. (2013). Antimicrobial resistance and virulence: A successful or deleterious association in the bacterial world? Clinical Microbiology Reviews. https://doi.org/10.1128/CMR.00059-12

Bogaerts, P., de Castro, R. R., de Mendonça, R., Huang, T. D., Denis, O., & Glupczynski, Y. (2013). Validation of carbapenemase and extended-spectrum β-lactamase multiplex endpoint PCR assays according to ISO 15189. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. https://doi.org/10.1093/jac/dkt065

Tripathi, P., Agrawal, G., & Gajbhiye, S. (2014). Clinical and antimicrobial profile of Acinetobacter spp.: An emerging nosocomial superbug. Advanced Biomedical Research. https://doi.org/10.4103/2277-9175.124642

Viehman, J. A., Nguyen, M. H., & Doi, Y. (2014). Treatment options for carbapenem-resistant and extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii infections. Drugs. https://doi.org/10.1007/s40265-014-0267-8

Chusri, S., Chongsuvivatwong, V., Rivera, J. I., Silpapojakul, K., Singkhamanan, K., McNeil, E., & Doi, Y. (2014). Clinical outcomes of hospital-acquired infection with Acinetobacter nosocomialis and Acinetobacter pittii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. https://doi.org/10.1128/AAC.02992-14

Aldred, K. J., Kerns, R. J., & Osheroff, N. (2014). Mechanism of quinolone action and resistance. Biochemistry. https://doi.org/10.1021/bi5000564

Dangkulwanich, M., Ishibashi, T., Bintu, L., & Bustamante, C. (2014). Molecular mechanisms of transcription through single-molecule experiments. Chemical Reviews. https://doi.org/10.1021/cr400730x

Evans, B. A., & Amyes, S. G. B. (2014). OXA β-lactamases. Clinical Microbiology Reviews. https://doi.org/10.1128/CMR.00117-13

Gillings, M. R. (2014). Integrons: Past, Present, and Future. Microbiology and Molecular Biology Reviews. https://doi.org/10.1128/mmbr.00056-13

Ayarpadikannan, S., & Kim, H.-S. (2014). The Impact of Transposable Elements in Genome Evolution and Genetic Instability and Their Implications in Various Diseases. Genomics & Informatics. https://doi.org/10.5808/gi.2014.12.3.98

Miller, W. R., Munita, J. M., & Arias, C. A. (2014). Mechanisms of antibiotic resistance in enterococci. Expert Review of Anti-Infective Therapy. https://doi.org/10.1586/14787210.2014.956092

Gheorghe, I., Novais, Â., Grosso, F., Rodrigues, C., Chifiriuc, M. C., Lazar, V., & Peixe, L. (2014). Snapshot on carbapenemase-producing pseudomonas aeruginosa and acinetobacter baumannii in bucharest hospitals reveals unusual clones and novel genetic surroundings for blaOXA-23. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. https://doi.org/10.1093/jac/dku527

Yayan, J., Ghebremedhin, B., & Rasche, K. (2015). Antibiotic resistance of pseudomonas aeruginosa in pneumonia at a single university hospital center in Germany over a 10-Year Period. PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139836

Chang, Y. T., Lin, C. Y., Chen, Y. H., & Hsueh, P. R. (2015). Update on infections caused by Stenotrophomonas maltophilia with particular attention to resistance mechanisms and therapeutic options. Frontiers in Microbiology. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00893

Kumar, Simit, Chatterjee, M., Poddar, S., Banerjee, D., Bandyopadhyay, M., & Banerjee, P. (2015). Stenotrophomonas maltophilia: Complicating treatment of ESBL UTI. Advanced Biomedical Research. https://doi.org/10.4103/2277-9175.151241

Escudero*, J. A., Loot*, C., Nivina, A., & Mazel, D. (2015). The Integron: Adaptation On Demand. Microbiology Spectrum. https://doi.org/10.1128/microbiolspec.mdna3-0019-2014

Deng, Y., Bao, X., Ji, L., Chen, L., Liu, J., Miao, J., … Yu, G. (2015). Resistance integrons: Class 1, 2 and 3 integrons. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. https://doi.org/10.1186/s12941-015-0100-6

Shen, J., Pan, Y., Fang, Y., & Sekaran, S. D. (2015). Role of the outer membrane protein OprD2 in carbapenem-resistance mechanisms of pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139995

Weber, B. S., Harding, C. M., & Feldman, M. F. (2016). Pathogenic Acinetobacter: From the cell surface to infinity and beyond. Journal of Bacteriology. https://doi.org/10.1128/JB.00906-15

Montaña, S., Schramm, S. T. J., Traglia, G. M., Chiem, K., Di Noto, G. P., Almuzara, M., … Ramírez, M. S. (2016). The genetic analysis of an Acinetobacter Johnsonii clinical strain evidenced the presence of horizontal genetic transfer. PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0161528

Kumar, Surinder. (2016). Essentials of Microbiology. Essentials of Microbiology. https://doi.org/10.5005/jp/books/12697

Barahona, E., Navazo, A., Garrido-Sanz, D., Muriel, C., Martínez-Granero, F., Redondo-Nieto, M., … Rivilla, R. (2016). Pseudomonas fluorescens F113 can produce a second flagellar apparatus, which is important for plant root colonization. Frontiers in Microbiology. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01471

Brem, J., Van Berkel, S. S., Zollman, D., Lee, S. Y., Gileadi, O., McHugh, P. J., … Schofield, C. J. (2016). Structural basis of metallo-β-lactamase inhibition by captopril stereoisomers. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. https://doi.org/10.1128/AAC.01335-15

Epand, R. M., Walker, C., Epand, R. F., & Magarvey, N. A. (2016). Molecular mechanisms of membrane targeting antibiotics. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2015.10.018

Arenz, S., & Wilson, D. N. (2016). Bacterial protein synthesis as a target for antibiotic inhibition. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a025361

Liakopoulos, A., Mevius, D., & Ceccarelli, D. (2016). A review of SHV extended-spectrum β-lactamases: Neglected yet ubiquitous. Frontiers in Microbiology. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01374

Munita, J. M., & Arias, C. A. (2016). Mechanisms of Antibiotic ResistanceMunita, J. M., & Arias, C. A. (2016). Mechanisms of Antibiotic Resistance. Microbiology Spectrum, 4(2), 1–32. https://doi.org/doi:10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015. Microbiology Spectrum. https://doi.org/doi:10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015.

van Eijk, E., Wittekoek, B., Kuijper, E. J., & Smits, W. K. (2017). DNA replication proteins as potential targets for antimicrobials in drug-resistant bacterial pathogens. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. https://doi.org/10.1093/jac/dkw548

Dinos, G. P. (2017). The macrolide antibiotic renaissance. British Journal of Pharmacology. https://doi.org/10.1111/bph.13936

Yoon, J. H., Kim, T. W., Mendez, P., Jablons, D. M., & Kim, I. J. (2017). Mobile Genome Express (MGE): A comprehensive automatic genetic analyses pipeline with a mobile device. PLoS ONE. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174696

Codjoe, F., & Donkor, E. (2017). Carbapenem Resistance: A Review. Medical Sciences. https://doi.org/10.3390/medsci6010001

Alibert, S., N’gompaza Diarra, J., Hernandez, J., Stutzmann, A., Fouad, M., Boyer, G., & Pagès, J. M. (2017). Multidrug efflux pumps and their role in antibiotic and antiseptic resistance: a pharmacodynamic perspective. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. https://doi.org/10.1080/17425255.2017.1251581

Knight, D. B., Rudin, S. D., Bonomo, R. A., & Rather, P. N. (2018). Acinetobacter nosocomialis: Defining the role of efflux pumps in resistance to antimicrobial therapy, surface motility, and biofilm formation. Frontiers in Microbiology. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.01902

Bassetti, M., Vena, A., Croxatto, A., Righi, E., & Guery, B. (2018). How to manage Pseudomonas aeruginosa infections. Drugs in Context. https://doi.org/10.7573/dic.212527

San Millan, A. (2018). Evolution of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in the Clinical Context. Trends in Microbiology. https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.06.007

Al-Agamy, M. H., Aljallal, A., Radwan, H. H., & Shibl, A. M. (2018). Characterization of carbapenemases, ESBLs, and plasmid-mediated quinolone determinants in carbapenem-insensitive Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Riyadh hospitals. Journal of Infection and Public Health. https://doi.org/10.1016/j.jiph.2017.03.010

Lee, A. S., De Lencastre, H., Garau, J., Kluytmans, J., Malhotra-Kumar, S., Peschel, A., & Harbarth, S. (2018). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Nature Reviews Disease Primers. https://doi.org/10.1038/nrdp.2018.33

Barman, P., Chopra, S., & Thukral, T. (2018). Direct testing by VITEK® 2: A dependable method to reduce turnaround time in Gram-negative bloodstream infections. Journal of Laboratory Physicians. https://doi.org/10.4103/jlp.jlp_11_18

Vijayakumar, S., Biswas, I., & Veeraraghavan, B. (2019). Accurate identification of clinically important Acinetobacter spp.: An update. Future Science OA. https://doi.org/10.2144/fsoa-2018-0127

Arnold, D. L., & Preston, G. M. (2019). Pseudomonas syringae: Enterprising epiphyte and stealthy parasite. Microbiology (United Kingdom). https://doi.org/10.1099/mic.0.000715

Giles, A., Foushee, J., Lantz, E., & Gumina, G. (2019). Sulfonamide Allergies. Pharmacy. https://doi.org/10.3390/pharmacy7030132

Nie, D., Hu, Y., Chen, Z., Li, M., Hou, Z., Luo, X., … Xue, X. (2020). Outer membrane protein A (OmpA) as a potential therapeutic target for Acinetobacter baumannii infection. Journal of Biomedical Science. https://doi.org/10.1186/s12929-020-0617-7

Abo-Zed, A., Yassin, M., & Phan, T. (2020). Acinetobacter junii as a rare pathogen of urinary tract infection. Urology Case Reports. https://doi.org/10.1016/j.eucr.2020.101209