CAPITOLUL 7 Material ]i metod[ 79 CAPITOLUL 7 MATERIAL }I METOD{ Studiul nostru s-a bazat pe metoda observa\iei cu caracter pros pectiv, desf[]urat… [622338]

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
79

CAPITOLUL 7

MATERIAL }I METOD{

Studiul nostru s-a bazat pe metoda observa\iei cu caracter pros pectiv,
desf[]urat pe o perioad[ de 6 ani (01.09.1999 – 01.09.2004) @n Clinica Medical[
a Spitalului Universitar CF Craiova.
Metoda observa\iei prospective a permis eviden\ierea factorilor de risc
implica\i @n etiopatogenia carcinomului hepatocelular, identifi carea
caracteristicilor anatomo-patologice, serologice, biochimice, e cografice,
tomografice çi rezonan\[ magnetic[ nuclear[ la pacien\ii cu HCC . De asemenea,
s-a realizat evaluarea corela\i ilor dintre aceste caracteristic i.
Cu ajutorul metodei observa\iei prospective am evaluat rela\ia ciroz[
hepatic[ – leziuni precanceroase – cancer hepatocelular ]i de asemenea am
urm[rit evolu\ia ]i supravie\uirea pacien\ilor cu HCC.

7.1. Protocolul de cercetare

Protocolul de cercetare a stabilit urm[toarele aspecte:
¾ Studiul s-a bazat pe metoda observa\iei a unui lot de 598 pacie n\i cu
ciroz[ hepatic[ de diferite etio logii ]i a unui lot de 67 bolna vi cu
carcinom hepatocelular grefat pe ciroz[ hepatic[, pe o perioad[ de
6 ani, av`nd un caracter prospectiv (perioada de studiu @n timp:
01.09.1999 – 01.09.2004).

¾ Delimitarea @n volum a loturilor studiate, s-a f[cut prin includerea @n
cercetare a bolnavilor cu ciroz[ hepatic[ de diverse etiologii (virusal[
B, virusal[ C, virusal[ B + C çi mixt[) ]i a bolnavilor cu canc er
hepatocelular grefat pe ciroz[ hepatic[, care s-au internat @ n Clinica
Medical[ a Spitalului Universitar CF Craiova pe o perioad[ de 6 ani
(01.09.1999 – 01.09.2004).

Criteriile de includere a bolnavilor @n loturi au fost:
♦ Prezen\a cirozei hepatice de diverse etiologii ]i @n stadii dif erite
(stadializarea Child – Pugh A, B, C documentat[ clinic ]i paraclinic).

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
80
♦ Prezen\a cancerului hepatocelular grefat pe ciroza hepatic[ de diferite
etiologii ]i @n stadii diferite (stadializarea Okuda, CLIP, BCL C
documentate clinic ]i paraclinic).
♦ Nu au existat restric\ii de v`rst[, sex, mediu de provenien\[.
♦ Ca succesiune @n timp de includere a bolnavilor @n lot, singuru l criteriu
a fost perioada de timp la care bolnavii s-au internat @n spita l, deci
mi]carea lor natural[ (internare pentru control sau survenirea de
complica\ii).

Criteriile de excludere a bolnavilor din lot au constat din asocierea la
ciroza hepatic[ @n momentul includerii @n lot a altor afec\iuni :
ƒ Boli neoplazice diverse (colon, stomac, s`n, etc.).
ƒ Boli hematologice neoplazice (limfoame hodgkiniene ]i
nonhodgkiniene).

¾ Delimitarea @n spa\iu a lotului cercetat.
Studiul nostru s-a desf[]urat @n Clinica Medical[ a Spitalului Universitar
CF Craiova, av`nd posibilitatea efectu[rii acestui studiu la bo lnavii interna\i @n
aceast[ perioad[ de 6 ani.
Pentru explor[rile paraclinice am apelat la Laboratorul de Anal ize
Medicale, Laboratorul de Anatomie Patologic[ ]i Citologie din c adrul Spitalului
Universitar CF Craiova, la Laboratorul de Endoscopie Digestiv[ ]i Ecografie
aflat @n cadrul Clinicii Medicale. Explor[rile computer tomogra fice ]i rezonan\[
magnetic[ nuclear[, s-au efectuat @n serviciile de specialitate d i n c a d r u l
Spitalului de Urgen\[ nr.1 Craiova.

¾ Delimitarea @n timp a cercet[rii
Studiul nostru s-a desf[]urat pe o perioad[ de 6 ani de la 1 s eptembrie
1999 la 1 septembrie 2004. Calendaru l explor[rilor bolnavilor i ncluçi @n studiu a
constat @n:
™ O examinare ini\ial[ complet[ la includerea @n lot, care a pres upus o
evaluare privind oportunitatea includerii @n studiu ]i o evalua re
complet[ dup[ modelul de explorar e pe care l-am stabilit ]i pe care @l
voi prezenta @n extensie @n continuare.
™ Periodicitatea celorlalte evalu[ri, a constat @n stabilirea a c el pu\in trei
intern[ri pe an, cu explorarea complet[ clinic[ ]i paraclinic[ dup[
protocolul stabilit. #n cazul complica\iilor sau decompens[rilo r
frecvente, intern[rile s-au efectuat @n func\ie de necesitate. S-au
monitorizat de asemenea, cu aten\ie complica\iile cirozei hepat ice, ale
carcinomului hepatocelular ]i apari\ia altor boli extrahepatice .

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
81
Controalele periodice din ambulat or le-am efectuat @n Cabinetul d e
Medicin[ Intern[ din cadrul Policlinicii Christiana Craiova, un de am un
program modular fix s[pt[m`nal.
™ De asemenea, @n aceast[ perioad[ s-au monitorizat decesele surv enite
la bolnavii inclu]i @n lot ]i principalele cauze de deces.

7.2. Loturi de pacien\i

Pacien\ii incluçi @n studiu pe perioada celor 6 ani (01.09.1999 –
01.09.2004) @n Clinica Medical[ din cadrul Spitalului Universit ar CF Craiova,
au fost @mp[r\i\i @n dou[ loturi principale:
™ Lotul I – pacien\i diagnostica\i cu ciroz[ hepatic[.
™ Lotul II – pacien\i diagnostica\i cu cancer hepatocelular grefat pe
ciroz[ hepatic[.
Lotul II de bolnavi a fost sub@mp[r\it @n cinci subloturi:
• Lotul II A – pacien\i cu HCC de etiologie B virusal[.
• Lotul II B – pacien\i cu HCC de etiologie C virusal[.
• Lotul II C – pacien\i cu HCC de etiologie B + C virusal[.
• Lotul II D – pacien\i cu HCC de etiologie mixt[
• Lotul II E – pacien\i cu HCC de etiologie alcoolic[.

7.3. Protocolul de exp lorare a bolnavului cu
carcinom hepatocelular

Pentru explorarea bolnavilor afla\i @n studiu am stabilit un pr otocol de
explorare, ce a constat @n:

7.3.1. Evaluarea clinic[ a bolnavului cu HCC
Evaluarea clinic[ a bolnavului cu HCC a presupus alc[tuirea unu i
formular structurat pe urm[toarele date:
¾ Date personale:
• nume, prenume;
• v`rst[;
• sex;

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
82
• mediu de provenien\[.
¾ Motivele intern[rii:
• dureri @n hipocondrul drept;
• hepatomegalie tumoral[;
• splenomegalie;
• icter sclero-tegumentar;
• simptome digestive (anorexie, flatulen\[, constipa\ie, diaree);
• ascit[;
• simptome generale (astenie fizic[, sc[dere ponderal[,
subfebrilit[\i).

¾ Antecedente personale patologice:
• hepatit[ cronic[ de etiologie “virusal[ “ (“B”, “C”, “B+C ”,
“B+D ”);
• ciroz[ hepatic[ (alcoolic[, virusal[ sau mixt[);
• afec\iuni metabolice rare:
ƒ porfiria cutanea tarda;
ƒ hemocromatoza;
ƒ deficitul de 1α- antitripsin[;
ƒ glicogenoza tip I.
¾ Prezen\a sau absen\a consumul ui de alcool @n exces.
¾ Istoricul bolii.
¾ Examenul clinic obiectiv:
• statusul nutri\ional (talia ]i greutatea);
• tegumente ]i mucoase:
ƒ prezen\a sau absen\a icterului sclero-tegumentar;
ƒ semne cutaneo-mucoase @nt`lnite @n ciroza hepatic[;
• aspectul clinic al ficatului (hepatomegalie tumoral[);
• aspectul clinic al splinei (splenomegalie de diferite grade);
• prezen\a sau absen\a ascitei;
• prezen\a sau absen\a encefalopatiei.

7. 3.2. Evaluarea serologic[ ]i bi ochimic[ a pacien\ilor cu HCC

Evaluarea biochimic[ s-a efectuat @n Laboratorul de Biochimie @ n cadrul
Spitalului Universitar CF Craiova.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
83

™ Sindromul de insuficien\[ hepatic[

1. Electroforeza proteinelor serice
S-a realizat pe acetat de celu loz[, folosind aparatul Biotech – Fischer,
Phero-0130, prin metoda electro forezei pe h`rtie de filtru.
¾ Principiul metodei se bazeaz[ pe viteza de migrare @n c`mp electric a
proteinelor la un pH constant (tampon 8,6).
¾ Tehnica de lucru:
ƒ Folia se pune 15 minute @n tampon la umectare.
ƒ Se introduce pe suportul de migrare ]i se las[ la premigrat 5 m inute
la 200 V ]i 100mA.
ƒ Serurile de lucrat se pun pe suportul pentru aplicator 20 µl, apoi
dup[ premigrare cu ajutorul aplicatorului de seruri, se aplic[ pe
suportul de migrare (h`rtia).
ƒ Se pun la migrat 35 minute la 200 V ]i 100 mA.
ƒ Dup[ migrare se pune folia @n cuva de colorare (10 minute), apo i @n
dou[ b[i de decolorant (c`te 15 minute, cu agitare) ]i la final @ n
cuva cu transparentizant (5 minute).
ƒ Se a]eaz[ pe suportul de sticl[, se @nl[tur[ excesul de
transparentizant cu rola ]i apoi se introduce @n etuva @nc[lzit [ la
140° – 180°C timp de 15-20 minute.
ƒ Dup[ uscare se scaneaz[ cu scanner Genius Vivid Pro II ]i se
interpreteaz[ cu programul Turboscan.
ƒ Valori normale:
• Albumina: 55 – 65%
• Globuline: 1α = 1 – 5%
2α = 7 – 10%
β = 11 – 14%
γ = 10 – 20%

2. Indicele de protrombin[ (IP)

¾ Principiu:
Este o metod[ de explorare a factorilor coagul[rii din sistemul extrinsec
(VII, X, V, II, I) @n prezen\a tromboplastinei tisulare @n exce s.

¾ Tehnic[:
ƒ Testul trebuie lucrat @n maxim 2 ore de la recultarea probei.
ƒ Se folose]te plasm[ oxalacetat[ sau citratat[, s[rac[ @n trombo cite.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
84
ƒ #ntr-o eprubet[ se hemolizeaz[ ce se afl[ @n baie la 37 °C, se pun 0,1
ml plasm[ de cercetat +0,1 ml tromboplastin[ + 0,1 ml solu\ie
CaCl2 0,025 mol/l.
ƒ Se declan]eaz[ cronometrul ]i se amestec[ bine.
ƒ Se las[ eprubeta liniçtit[ 10 se cunde, apoi se urm[re]te coagul area
prin @nclinare a eprubetei din secund[ @n secund[.
ƒ Se opre]te cronometrul la apari\i a fibrelor de fibrin[ care se prind
imediat @ntr-un cheag complet.

¾ Valori normale: 12,5 secunde (100%).

™ Sindromul bilioexcretor

1. Dozarea bilirubinei
Bilirubina total[ s-a dozat cu ajutorul aparatului ABX Pentra 4 00, care
este un analizor automat.
¾ Principiul metodei c o n s t [ @ n t r – o r e a c \ i e f o t o m e t r i c [ c u 2 , 4 –
diclorovanilin[ (DCA).
¾ Interval de referin\[: Adul\i: 0,1 – 1,2 mg/dl.

2. Fosfataza alcalin[ (FA)
Pentru dozarea fosfatazei alcaline s-a folosit analizorul semia utomat
BTS – 330.
¾ Metoda de lucru este o metod[ cinetic[, bazat[ de DGKC.
Principiu:

p-nitrofenilfosfat + H2O p-nitrofe nol + fosfat anorganic
Rezultatele se apreciaz[ prin citirea concentra\iei de p-nitrof enol la o
lungime de und[
λ= 405nm.
¾ Valorile de referin\[: Adul\i: 100-290 U/L.

3. Gama-glutamiltranspeptidaza (GGT)
Pentru determinarea GGT s-a folos it analizorul automat ABX Pent ra
400 cu reactivi ABX Pentra.
¾ Metoda de lucru este o metod[ cinetic[ fotometric[ (Szasz
modificat[).

ALP

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
85
Principiu:
L-Y-glutamil-p-anilid[ + glicilglicin[ L-Y-glutamilglici n[ + p-
nitroanilin[

¾ Valori normale: B[rba\i: 49 U/L
Femei: 41 U/L

™ Sindromul de hepatocitoliz[

1. Transaminaza glutamic – piruvic[ (TGP)
¾ Metoda de dozare: metoda ultraviolet[ (IFCC f[r[ pyridoxal
fosfat).
¾ Aparat: Analizator automat ABX Pentra 400.

¾ Principiu:

L-alanin[ + 2-Oxoglutarat L-glutamat + piruvat

Piruvat + NADH + H+ D-lactat + NAD+

¾ Interval de referin\[ la 37 °C: B[rba\i: < 41 U/L
Femei: < 39 U/L

2. Transaminaza glutamic-oxalacetic[ (TGO)
S-a folosit acela]i analizator automat ABX Pentra 400
¾ Metoda a fost prin determinare ultraviolet[ (IFCC f[r[ pyrodoxal
fosfat) a TGO-ului.

¾ Principiu:

L-aspartat + 2-Oxoglutarat L-glutamat + 2 Oxalacet at
Oxalacetat + NDAH + H
+ L-malat + NAD+

¾ Interval de referin\[ la 37 °C: < 37 U/L.

ALT
LDH
ALT
MDH

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
86
™ Determinarea hemogramei
S-a efectuat @n cadrul Laboratorului de Hematologie – Spitalul
Universitar CF Craiova, folosind analizorul automat hematologic
Beckman Coulter ACT5-Diff CP, care determin[ 27 de parametrii.

¾ Valori de referin\[:
ƒ Hemoglobin[ (HGB): 12-16 g/dl
ƒ Leucocite (WBC): 4-11 •103/µl
ƒ Trombocite (PLT): 150-400 •103/µl
ƒ Eritrocite (RBC): 3,8-6,5 •106/µl
ƒ Hematocrit (HCT): 36-54%.

™ Teste virusologice pentru determinarea etiologiei cirozei ]i a
cancerului hepatocelular

1. Determinarea antigenului HBs , specific pentru etiologia virusal[
“B” a cancerului hepatocelular, s-a efectuat @n Laboratoul de
imunologie @n cadrul Spitalul Universitar CF Craiova, cu ajutor ul
aparatului IMMULITE 1000, folosind tehnica ELISA (Microelisa System) de determinare “in vitro ” calitativ[.
S-au utilizat dou[ tipuri de kit-uri:
– LKHB
1 – cu 100 de teste;
– LKHB5 – cu 500 de teste.
Pentru validarea reac\iei, s-au folosit seruri martor de contro l sigur
pozitive sau sigur negative.
¾ Principiul metodei:
ƒ Se face imunodozare @n dou[ etape.
ƒ Ciclul de incubare: 2×30 minute.
ƒ Se recolteaz[ ser sau plasm[ uman[ heparinat[, citratat[ sau pe
EDTA @n cantitate de 100 µl;
ƒ Se preg[teçte e]antionul prin ultracentrifugare pentru a
@ndep[rta lipidele, deoarece ele pot interfera cu dozajul.
ƒ Se @ndep[rteaz[ e]antioanele h emolizate, deoarece pot da
reac\ii fals pozitive sau fals negative.
ƒ Se conserv[ 2 zile la o temperatur[ ambiant[ de 15 °-28°C.
ƒ Componentele kit-ului de reactivi:
– LSUBX: substrat chemiluminiscent;
– LPWS2: solu\ie de sp[lare a modulului;
– LKPM: solu\ie de cur[\are a kit-ului;

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
87
– LCHx-y: suport de cuve tip monstr[;
– LSCP: monstre disponibile.

¾ Calculul valorii cut-off ]i a raportului S/CO.
Calculul semnalului cut-off ]i a raportului S/CO se face utiliz `nd
urm[toarea formul[:

Raport S/CO =
Rezultatele calitative ( “reactiv ”, “non-reactiv ”) sunt automat calculate de
IMMULITE 1000.
Rezultatul de “reactiv ” se stabile]te dac[ num[rul de cupe pentru
e]antionul luat @n lucru este superior valorii de cut-off, iar rezultatul este “non-
reactiv ”, dac[ num[rul de cupe este inferior valorii cut-off. Specifici tatea ]i
sensibilitatea testului este de 9 8,6% ]i s-a realizat prin comp ara\ie cu alte teste
de tipul AXSYM.
2. Determinarea antigenului HBe , s-a realizat @n Laboratorul de
Imunologie – ROMAR Colentina, folosindu-se aparatul automat
computerizat marca AXSYM, firma produc[toare fiind ABBOTT
USA. Determinarea Ag HBe se utilizeaz[ @n monitorizarea infec\i ilor
virale cu virusul B (hepatita tip B). Titrul ambelor antigene (Ag HBe
]i AgHBs) cre]te rapid ]i considerabil @n perioada de replicare viral[.
Persisten\a Ag HBe este asociat[ adesea cu hepatita cronic[ act iv[.
¾ Metoda utilizat[ (MEIA):
ƒ Metoda imunologic[, cu microparticule, enzimatic[.
¾ Valori normale Ag Hbe:
ƒ S/CO < 1.00 (non reactiv)
ƒ S/CO > 1.00 (reactiv)
Rezultatul se bazeaz[ pe raportul dintre S – p r o b a ] i C O – c u t o f f
(index calibrator).

3. Determinarea anticorpilor HBe s-a realizat @n Laboratorul de
Imunologie – ROMAR Colentina, folosindu-se aparatul automat
computerizat marca AXSYM, fi rma produc[toare fiind ABBOTT
USA. Este un anticorp al antigenului hepatitei B ]i se afl[ num ai @n
asocia\ie cu infec\ia viral[ hepatic[ de tip B. Ag HBe devine
nedetectabil dup[ un v`rf al replic[rii virale. Prezen\a AntiHBe
indic[ reducerea nivelului de infec\ie ]i o sc[dere a replic[ri i virale.

monstr[ sau control c ps
media a justat[ c ps XP1

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
88

¾ Metoda utilizat[ (MEIA)
ƒ Metoda imunologic[, cu microparticule, enzimatic[.
¾ Valori normale AntiHBe:
ƒ S/CO > 1.00 (non reactiv)
ƒ S/CO < 1.00 (reactiv).
S – proba ]i CO – cut off (index calibrator).

4. Determinarea anticorpilo r antivirus hepatitic C, marker virusal
specific infec\iei cronice hepatice “C”, s-a realizat @n Laboratorul
de Imunologie – Spitalul Universitar CF Craiova, folosindu-se
metoda: SD HCV ELISA 3.0.
Aparatul pe care s-au lucrat kit-urile a fost IMMULITE 1000.
SD HCV ELISA 3.0 con\ine godeuri ce sunt ocupate cu antigene
HCV recombinat: core, NS3, NS4 ]i NS5.

¾ Principiul metodei:
ƒ #n timpul primei incuba\ii, anticorpii anti-HCV din serul
bolnavilor sunt lega\i de antigenele HCV-ului recombinat.
ƒ #n urma acestei incuba\ii, tot materialul nelegat se @ndep[rtea z[
prin aspirare sau sp[lare.
ƒ Enzima conjugat[ anti-human IgG-peroxidaz[ este legat[ de
anticorpul anti-HCV.
ƒ Dup[ aceast[ incubare, tot materialul nelegat este @ndep[rtat
prin aspirare ]i sp[lare.
ƒ Activitatea enzimei reziduale este bun[ ]i direct propor\ional[
cu concentra\ia anticorpilor anti-HCV din serul pacien\ilor.
ƒ Ea a fost eviden\iat[ prin incubare @n faza solid[ cu o solu\ie
substrat (TMB), @ntr-un substrat tampon.
ƒ Citirea colorimetric[ a fost performant[, prin utilizarea
spectrofotomerului la 450nm.
SD HCV ELISA 3.0 este un “sandwich ” i n d i r e c t E L I S A p e n t r u
detec\ia calitativ[ a anticorpilor anti-HCV.

¾ Interpretarea rezultatelor:
a) Test valid
-valorile individuale ale absorb\iei pentru control au fost uti lizate,
calcul`nd valoarea medie dac[:
-0,010≤A(neg) ≤0,200
A(pos) ≥1,000.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
89
Dac[ una dintre valorile absorb\iei controlului negativ este @n afara
specifica\iei, aceast[ valoare poate fi neglijat[.

b) Evaluare
Se calculeaz[ media absorb\iei controlului negativ, apoi se
calculeaz[ valoarea cut-off prin ad[ugarea de 0,400.
A(neg.) + 0,400 = cut-off valoare.

Rezultatele testului:
ƒ A (martor) < cut-off = anti-HCV negativ
ƒ A (martor) ≥ cut-off = anti-HCV pozitiv.
Sensibilitatea metodei este situat[ @ntre 99% ]i 100%, iar spec ificitatea
este de 99,8%.

5. Determinarea anticorpilor HVD , se determin[ prin tehnica ELISA.
¾ Metoda dozeaz[ anticorpii totali la antigenul hepatitelor
DELTA.
ƒ Exprim[ infec\ia cu virusul DELTA, cauza unei boli severe
hepatice a purt[torilor de AgHBe.
ƒ Detec\ia anticorpilor total anti HD reprezint[ metoda folosit[
pentru identificarea infec\iei HVD.
ƒ Metoda enzimatic[ pentru determinarea cantitativ[ a
anticorpului total anti HD.
¾ Valori normale :
ƒ (-) Valoarea probei > valoarea cut off
ƒ (+) Valoarea probei < valoarea cut off.

™ Determinarea markerilor tumorali

1. Determinarea α- fetoproteinei (AFP) s-a efectuat @n Laboratorul de
Imunologie al Spitalului Universitar CF Craiova.

Pentru m[surarea cantitativ[ a α-fetoproteinei diagnostic “in vitro ”, s-a
utilizat analizatorul automat IMMULITE 1000 ]i kit-urile:
– LKAP1 – 100 de teste
– LKAP5 – 500 de teste.

¾ Metoda se bazeaz[ pe un dozaj imunometric secven\ial
chemiluminiscent @n faz[ solid[.
ƒ Ciclu de incubare: 2x30minute.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
90
ƒ E]antionul se recolteaz[ prin punc\ie venoas[ ]i se separ[ seru l
de celelalte celule prin centrifugare.
ƒ E]antioanele cu multe lipide ]i cele hemolizate se @ndep[rteaz[ ,
deoarece pot da reac\ii fals pozitive sau fals negative.
ƒ Condi\ii de conservare: 3 zile la +2 °C/+8°C. Se poate congela
la -20°C ]i p[stra dac[ dozarea nu s-a efectuat @n cele 3 zile.

¾ Valori de referin\[: 0,5-5,5 UI/ml.
Rezultatele pe care le d[ an alizatorul IMMULITE 1000 sunt @n
“UI/ml ”, dar se pot aprecia aceste rezultate @n “ng/ml ”, aplic`nd
factorul de corec\ie:
UI/ml x 1,21 ng/ml

Determinarea cantitativ[ a α- fetoproteinei folosind analizatorul
IMMULITE 1000 ]i metoda mai sus men\ionat[, are o sensibilitate
relativ[ de 98,1% ]i o specificita te relativ[ de 99,1% comparat iv cu
alte kit-uri ]i alt[ metod[ (ex. Coffret C).

2. Determinarea antigenului carcinoembrionar (CEA)
Similar α- f e t o p r o t e i n e i , C E A s – a d e t erminat @n Laboratorul de
Imunologie – Spitalul Universitar CF Craiova, folosind analizorul
IMMULITE 1000.

¾ Metoda folosit[ este una cantitativ[, de dozaj a antigenului
carcinoembrionar @n serul bolnavilor.
Kit-urile utilizate:
– LKCE1 – 100 de teste;
– LKCE5 – 500 de teste.
¾ Principiul metodei – dozaj imunometric secven\ial.
ƒ Ciclu de incuba\ie: 2×30 minute.
ƒ Volumul necesar: 15 µl de ser.
ƒ Modul de recoltare a s`ngelui, m[surile de precau\ie care se ia u
@n ceea ce prive]te serul ob\inut prin centrifugare, sunt simil are
cu cele de la determinarea α-fetoproteinei.
ƒ Condi\ii de conservare: 7 zile la +2 °C/+8°C sau se congeleaz[
la -20°C çi se poate p[stra mai mult timp, dac[ determinarea nu
s-a efectuat @n cele 7 zile.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
91
¾ Valori de referin\[:
Fiecare laborator @]i stabile]te propriile valori de referin\[.
Laboratorul nostru a lucrat dup[ urm[toarele valori: B[rba\i: Fum[tori: 2,1 – 6,2 ng/ml
Nefum [tori: 1,1 – 3,4 ng/ml
Femei: Fum[toare: 1,3 – 4,9 ng/ml
Nefum[toare: 0,8 – 2,5 ng/ml

¾ Performan\ele testului:
Testul IMMULITE CEA are o specificitate ]i sensibilitate @nalt[ , fiind
comparat cu testul IMXACE d ’Abbott, care este mult mai slab
calitativ @n ceea ce prive]te limitele de detec\ie.

7.3.3. Evaluarea imagistic[ a paci en\ilor cu ciroz[ hepatic[ ]i cu
HCC grefat pe ciroz[

7.3.3.1. Ecografia conven\ional[ transabdominal[

Pentru investiga\ia ecografic[ a pacien\ilor interna\i @n Clini ca Medical[
@n cadrul Spitalului Universitar CF Craiova, am utilizat aparat ul ALOKA Pro
Sound SSD – 4000 aflat @n dotarea clinicii noastre, aparat ce m i-a oferit
posibilitatea efectu[rii de:
• Ecografie conven\ional[ bidimensional[.
• Ecografie armonic[.
• Eco-flow Doppler.
• Eco power Doppler.
• Alc[tuirea unei baze de date a pacien\ilor inclu]i @n studiu.
• #nregistrarea @n dinamic[ a modific[rilor survenite @n timp ( v ideo çi pe
CD optic);
• Printare alb-negru ]i color a imaginilor sugestive pentru studi ul nostru.

¾ Pentru investigarea ficatului s-au folosit mai multe sec\iuni, utiliz`nd
un trasductor convex de 3,5 MHz.

a) Pentru vizualizarea lobului drept hepatic , a venei hepatice drepte ]i a
ramurii drepte a venei porte s-a folosit:

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
92
ƒ sec\iunea longitudinal[ definit[ de vena hepatic[ dreapt[ ]i ve na
cav[ inferioar[ ce separ[ segmentele V ]i VIII medial, de
segmentele VI ]i VII lateral;
ƒ sec\iunea transversal[ prin por\iunea orizontal[ a venei porte
drepte, ce separ[ segmentele VII ]i VIII superior, de segmentel e V
]i VI inferior.
Am delimitat astfel, diametrul antero-posterior al lobului drep t hepatic,
cu valori normale cuprinse @ntre 120-130 mm. De asemenea, am vizualizat forma\iunile @nlocuitoare, de spa\iu
hepatic, localizate la nivelul lobului drept hepatic, depistate la pacien\ii
cu ciroz[ hepatic[ de diferite etiologii, inclu]i @n studiu.

b) Lobul st`ng hepatic , ramura st`ng[ a venei porte ]i vena hepatic[
st`ng[ le-am vizualizat ecografic, folosind:
ƒ sec\iunea longitudinal[ care con\ine ligamentul rotund, por\iun ea
ascendent[ a venei porte st`ngi ]i separ[ segmentele II ]i III lateral,
de segmentele IV A ]i IV B medial;
ƒ sec\iunea oblic transversal[ care include por\iunea transversal [ a
venei porte st`ngi ]i separ[ segmentul IV A superior, de segmen tul
IV B inferior;
ƒ sec\iunea longitudinal[ care con\ine vena hepatic[ st`ng[ ]i ve na
cav[ inferioar[ ]i separ[ segmentul II postero-medial de segme ntul
III antero-lateral.
Cu ajutorul acestor sec\iuni am m[surat diametrul antero-poster ior al
lobului st`ng hepatic (valori normale: 50-60 mm).

c) Lobul caudat l-am vizualizat ecografic, fie pe sec\iune longitudinal[,
pe linia median[, fie pe sec\iune transversal[, el fiind delimi tat de fisura
ligamentului venos anterior, vena cav[ inferioar[ posterior ]i lateral de
linia care une]te vena hepatic[ medie, cu vezicula biliar[.
Valorile normale pentru diametrul antero-posterior ]i transvers al al
lobului caudat sunt mai mici de 30 mm.

¾ Aspectul ecografic al colecistului la pacien\ii cu cancer hepatocelular
grefat pe ciroz[, a fost de asemenea urm[rit, @n special @n cee a ce
prive]te complica\iile ce pot apare @n evolu\ie, la acest nivel .

¾ Examinarea ecografic[ a splinei.
Splina a fost examinat[ @n decubit dorsal sau decubit lateral d rept, cu
bra\ul st`ng ridicat deasupra capului.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
93
Pentru m[surarea axului lung al splinei, s-au folosit sec\iuni oblice
efectuate @n plan frontal, pe linia axilar[ mijlocie sau poster ioar[, iar
pentru diametrul transversal, s- au folosit sec\iuni transversa le oblice,
prin spa\iile intercostale IX-XI. Valori normale la adult:
– diametrul axului lung: 110-120 mm;
– diametrul transversal: 40-75 mm;
– diametrul antero- posterior: 70-80mm.

¾ Eviden\ierea ecografic[ a lichidului de ascit[ se face cu u]urin\[, prin
examinarea bolnavului @n decubit dorsal.
Aprecierea ecografic[ a celor 3 grade clinice de ascit[:

• Ascit[ gradul 1 (u]oar[) – se eviden\ieaz[ lichid @n cantitate mic[, @n
zonele declive (spa\iul interhepatorenal – Morisson, spa\iul intersplenorenal, spa\iul Douglas).
• Ascit[ de gradul 2 (moderat[) – se caracterizeaz[ prin acumularea
de lichid @n cantitate medie @n cavitatea peritoneal[, mobil cu pozi\ia
]i eviden\iat ecografic cu u]urin\[.
• Ascit[ de gradul 3 (sever[) – ecografic, se eviden\ieaz[ lichid @n
cantitate mare, @n cavitatea peritoneal[.

7.3.3.2. Ecografia armonic[

Ecografia armonic[ s-a efectuat la tot lotul de 67 pacien\i cu cancer
hepatocelular çi la lotul de 27 pacien\i cu ciroz[ hepatic[ çi noduli displazici,
folosind aparatul ALOKA Pro-Sound SSD – 4000, aflat @n dotarea Clinicii
Medicale din cadrul Spitalului Universitar CF Craiova.
Utilizarea armonicilor tisulare ( “tissue harmonic imaging ”) a oferit o
ameliorare marcat[ a calit[\ii imaginii ecografice conven\ional e @n special la
pacien\ii cu obezitate, cu meteorism abdominal important, care prezentau
imagini neclare la ecografia conven\ional[ transabdominal[. Ast fel, s-a ob\inut
un contrast mai mare @ntre forma\iunea tumoral[ ]i restul paren chimului hepatic
]i de asemenea vizualizarea haloului perilezional (a capsulei h ipoecogene) a fost
mai bun[.
Acurate\ea detect[rii leziunilor focale a fost mai bun[ pentru “tissue
harmonic imaging ”, comparativ cu imaginile ecografice conven\ionale
bidimensionale.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
94
7.3.3.3. Ecografia Doppler

Investiga\ia ecografic[ Doppler s-a realizat folosind acela]i a parat
men\ionat mai sus.
¾ Evaluarea profilului vascular
Pentru evaluarea ecografic[ a venei porte, venelor suprahepatic e,
axului spleno-portal, venei splenice ]i a vasculariza\iei proce selor
@nlocuitoare de spa\iu hepatic (PLIH), am folosit tehnicile eco grafice
Doppler (Doppler flow ]i power, Doppler spectral).
Examenul ecografic s-a efectuat @n clinostatism, à jeun, folosi nd
sistemul de ultrasonografie ALOKA ProSound SSD – 4000. Am
utilizat un transductor convex de 3,5 MHz, @n modul bidimension al cu
scar[ “gri” (“grey-scale ”), combinat cu evaluarea color a fluxului
sanguin (flow Doppler sau power Doppler). Tehnicile de ecografi e
Doppler mi-au permis evaluarea neovasculariza\iei tumorilor hipervasculare ]i identificarea unor criterii de malignitate.
De asemenea, aceste tehnici mi-au facilitat depistarea tromboze i de
ven[ port[ (TPV) la un num[r de 12 pacien\i cu carcinom hepatocelular ]i ciroz[ hepatic[ inclu]i @n studiu.

7.3.3.4. Tomografia computerizat[ (CT)

Evaluarea computer tomografic[ a pacien\ilor cu ciroz[ hepatic[ , care au
prezentat suspiciunea clinic[ ]i ecografic[ de carcinom hepatoc elular, am
efectuat-o @n Laboratorul de Tomografie computerizat[ al Spital ul de Urgen\[i
nr.1 Craiova.
Majoritatea maselor tumorale, mai mari de 2 cm au fost vizualiz ate ca arii
cu atenuare descresc[toare.
La pacien\ii cu HCC inclu]i @n studiu, majoritatea tumorilor au f o s t
hipodense, o parte izodense ]i c`teva hiperdense. Ocazional, tu morile izodense
au prezentat probleme de diagnostic diferen\ial, dac[ amplifica rea contrastului
nu a fost folosit[.
Contrastul dintre tumor[ ]i parenchimul @nconjur[tor a fost amp lificat prin
injectarea intravenoas[ a substan\ei de contrast pe baz[ de iod (Omnipaque,
Iopamiro). Carcinomul hepatic solitar sau invaziv a fost @n gen eral, hipodens,
dar @ntr-un ficat cu noduli cirotici difuzi, imaginile CT au fo st @n general
hipodense, cu contrast slab sau neobservabil.
Dac[ masa tumoral[ a fost solitar[ çi mare, a prezentat la TC o imagine
neomogen[, cu densitate variabil[ , iar ariile hipodense au prez entat necroz[ la o
mare parte din pacien\ii cu HCC.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
95
Capsula groas[ din jurul masei tumorale a fost sugerat[ de o zo n[ sub\ire
care delimiteaz[ tumora, put`nd fi observat[ mai bine prin ampl ificare dinamic[,
cu substan\[ de contrast injectat[ intravenos.
Amplificarea dinamic[ a avut o importan\[ deosebit[ pentru diag nosticul
diferen\ial dintre carcinomul hepatocelular ]i o tumor[ vascul ar[ benign[
(hemangiom).
Dup[ amplificarea dinamic[, inten sitatea hemangiomului cre]te l ent de la
periferie ]i se men\ine pentru o perioad[ de timp considerabil[ , @n timp ce un
hepatocarcinom este amplificat imediat ]i uniform ]i se men\ine p e n t r u o
perioad[ de timp scurt[.
CT dinamic[ a vizualizat de asemenea, ]unturile arterio-portale , o
tr[s[tur[ patognomonic[ a carcinomului hepatocelular.
Un alt merit al explor[rii computer tomografice a fost ]i preci zia
diagnostic[ pentru cirozele hepatice subjacente pe care s-a gre fat HCC-ul,
acestea prezent`nd neregularit[\i la suprafa\[, splenomegalie ] i ascit[. Dac[ una
din ramurile portale importante a fost ocluzionat[ de um tromb tumoral, lobul
aferent acesteia datorit[ modifi c[rilor metabolice, a prezentat intesitate
descresc[toare.
De asemenea, CT dinamic[ a fost util[ ]i pentru diagnosticul tr ombilor
care s-au dezvoltat la nivelul venei porte, observ`ndu-se un in el hiperdens @n
jurul trombului tumoral.

7.3.3.5. Rezonan\a magnetic[ nuclear[ (MRI)

Rezonan\a magnetic[ nuclear[ a fo st efectuat[ la 14 bolnavi cu HCC din
totalul de 67 pacien\i cu HCC inclu]i @n studiu. Aceast[ invest iga\ie s-a realizat
la Laboratorul de Rezonan\[ Magnetic[ Nuclear[ din cadrul Spita lului de
Urgen\[ nr.1 Craiova.
Am recomandat efectuarea de MRI, deoarece am considerat c[ este o
tehnic[ imagistic[ superioar[ ]i astfel, mi-a dat posibilitatea preciz[rii unui
diagnostic corect de carcinom hepatocelular la 14 pacien\i care au prezentat
rezultate neconcludente oferite de ecografie ]i tomografie comp uterizat[, @n
ciuda costurilor ridicate ale acestei investiga\ii.
Rezultatele MRI au fost concordante cu rezultatele histopatolog ice
(ob\inute dup[ punc\ie biopsie hepatic[).
Astfel, la pacien\ii cu HCC bine diferen\iat (clasificarea Edmo nson-
Steiner), aspectul MRI a ar[tat o imagine bine circumscris[ ]i omogen[, @n timp
ce la tumorile avansate (slab diferen\iate ]i nediferen\iate), aspectul MRI a fost
de imagine cu intensitate heterogen[ ]i margini neregulate.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
96
7.3.3.6. Punc\ia biopsie hepatic[

Punc\ia biopsie hepatic[ a fost efectuat[ la 53 pacien\i diagno stica\i cu
ciroz[ hepatic[ de diferite etiologii, la care am avut suspiciu nea ecografic[ ]i
tomografic[ a unui cancer hepatocelular grefat pe ciroz[.
Printre leziunile focale parenchimatoase la care am considerat necesar[
efectuarea punc\iei bioptice hepatice, au fost:
ƒ Nodul cu diametrul sub 2 cm pe ficat cirotic, cu context clinic ,
biologic çi imagistic ( α-fetoprotein[) negativ sau echivoc, pentru a
putea face astfel, diagnosticul diferen\ial @ntre HCC ]i un nod ul de
regenerare.
ƒ Forma\iune hepatic[ cu suspiciune clinico-imagistic[ de benigni tate,
dezvoltat[ @ns[ pe un ficat cirotic.
ƒ HCC nerezecabil, premerg[tor unui tratament chimioterapic sau d e
abla\ie precutan[ (alcoolizare, r adiofrecven\[) ]i/sau chemoemb olizare.
Contraindica\iile generale de care am \inut cont atunci c`nd am hot[r`t
efectuarea punc\iei bioptice hepatice la un pacient, au fost:
ƒ tulbur[ri de hemostaz[;
ƒ infec\ie local[ (angiocolit[ sau angiocolecistit[ acut[);
ƒ icter obstructiv exprimat (c[i bil iare intrahepatice dilatate);
ƒ tumori hipervascularizate situate subcapsular;
ƒ ascit[ important[ (gradul 3);
ƒ pacient necooperant.
Punc\ia bioptic[ hepatic[ la pacien\ii cu HCC fiind o manoper[ invaziv[
ce implic[ anumite riscuri (complica\ii hemoragice, @ns[m`n\are pe traiectul
acului ]i diseminare tumoral[ la distan\[), am efectuat-o numai atunci c`nd,
pacientul ]i-a dat acordul @n scris, semn`nd un “formular de consim\[m`nt”
pentru efectuarea acestei investiga\ii.
Tehnica de punc\ie biopsie hepatic[:
ƒ a]ezarea pacientului @n decubit lateral st`ng, cu m`na dreapt[ ridicat[
deasupra capului, pentru a destinde spa\iile intercostale;
ƒ dezinfec\ia cu alcool iodat;
ƒ stabilirea locului de punc\ie cu ajutorul ecografului;
ƒ anestezie local[ cu xilin[ 1% (10 ml) strat cu strat;
ƒ se p[trunde apoi cu acul de punc\ie Autovac cu calibrul de 1,4
mm/17G ]i o lungime de 150 mm (de produc\ie german[ Angiomed
GmbH & Co) p`n[ la nivelul forma\iunii tumorale sub ghidaj ecografic;
ƒ se apas[ butonul acului ]i datorit [ resortului, se preleveaz[ f ragmentul
de \esut hepatic de la nivelul forma\iunii nodulare hepatice, v izualizat[
ecografic.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
97
Din lotul de 67 pacien\i cu HCC, am considerat c[ nu ar fi indi cat[ o
punc\ie biopsie hepatic[ @n scop diagnostic la 14 pacien\i, din tre care unii erau @n
stadii terminale (dup[ stadializarea Okuda, CLIP ]I BCLC), iar al\ii aveau
indica\ia unui posibil tratament curativ.
#ntotdeauna am evaluat ]i am luat @n calcul raportul dintre ben eficiu ]i
risc, @nclin`nd balan\a c[tre beneficiul bolnavului.

7.3.3.7. Evaluarea histopatologic[ a fragmentelor de punc\ie bi optic[
hepatic[

Tehnica histopatologic[ de prelu crare a materialului biopsic

Specimenele (fragmentele de \esut hepatic rezultate @n urma pun c\iei
bioptice hepatice) au fost duse imediat dup[ prelevare @n Labor atorul de
Anatomie Patologic[ al Spitalului Universitar CF Craiova.
Fixarea (care are ca scop oprirea evolu\iei celulelor ]i \esutu rilor @ntr-o
stare c`t mai apropiat[ de stat usul lor func\ional) s-a efectua t @n formolin[
tamponat[ cu clorur[ de calciu la un pH de 7,1.
Pentru ca specimenele s[ reziste la procedurile tehnice ulterio are ]i s[ lege
colora\iile @n vederea examin[rii microscopice, cantitatea de formolin[ trebuie
s[ fie de peste 50 de ori mai mare fa\[ de volumul biopsiei.
Fiind vorba de biopsii mici, timpul necesar fix[rii a fost de 3 -4 ore.
Dup[ fixare, specimenele au fost sp[late cu ap[ curat[ timp de 30 minute,
dup[ care au fost supuse procedurilor de deshidratare, clarifi care ]i parafinare
folosind aparatul automat de sec\ionat \esuturi tip LEICA ASP 3 00, dup[
urm[torul program:
ƒ alcool 70° – 5 minute la 37 °C;
ƒ alcool 80° – 5 minute la 37 °C;
ƒ alcool 96° – 5 minute la 37 °C;
ƒ alcool absolut – 10 minute la 37 °C;
ƒ alcool absolut – 20 minute la 37 °C;
ƒ xilen I – 5 minute la 37 °C;
ƒ xilen II – 10 minute la 37 °C;
ƒ xilen III – 10 minute la 37 °C;
ƒ parafin[ I – 20 minute la 59 °C;
ƒ parafin[ II – 20 minute la 59 °C;
ƒ parafin[ III – 20 minute la 59 °C;

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
98
To\i timpii prelucr[rii au fost efectua\i sub vacum. Ulterior, s-a practicat includerea fragmentelor bioptice @n cuv e metalice ]i
casete de plastic, utiliz`nd parfina topit[ la 56 °C cu ajutorul sta\iei de includere
tip LEICA EG 1160 ]i solidificarea acestora cu ajutorul pl[cii d e r [ c i r e d i n
dotarea sta\iei.
Dup[ solidificarea ]i r[cirea blocurilor, s-a practicat sec\ion area acestora
cu ajutorul microtomului rotativ semiautomat tip LEICA RM 2145.
S-au efectuat sec\iuni cu o gros ime de 4 microni folosindu-se c u\ite de
unic[ folosin\[ ]i o @nclina\ie fa\[ de planul sec\iune de 8-10 °.
Sec\iunile astfel ob\inute, au fost etalate @n baia de flota\ie (@n ap[ distilat[
la temperatura de 40 °C) de unde au fost @ntinse pe lame, @n prealabil degresate
cu alcool ]i unse @n strat sub\ire cu albumin[ Mayer.
Lamele cu sec\iunile pe ele au fost \inute la termostat la 37 °C timp de 30
de minute.
Dup[ parcurgerea acestor etape, pe sec\iunile astfel ob\inute s -au putut
efectua diverse colora\ii: colora\ia uzual[ hematoxilin[-eozin[ , colora\ia
tricromic[ van Gieson, colora\ia PAS.

Colora\ia Hematoxilin[ – Eozin[
ƒ Deparafinare: trei b[i succesive de benzen a c`te 10 minute.
ƒ Hidratare: b[i succesive a c`te 10 minute @n alcool de concentra\ii
descresc[toare (96%, 80%, 70%).
ƒ Ap[ distilat[: 10 minute.
ƒ Colorare cu hematoxilin[: 10 minute.
ƒ Diferen\iere @n ap[ de robinet: 10-15 minute (acest timp este variabil
ca durat[, diferen\ierea nucleilor trebuind verificat[ la micro scop).
ƒ Ap[ distilat[ :10 minute.
ƒ Colorare cu eozin[ :3-5 minute.
ƒ Sp[lare @n ap[ distilat[.
ƒ Deshidratare: b[i succesive de alcool de concentra\ii cresc[toare
(70%, 80%, 96%) c`te 5 minute @n fiecare.
ƒ Clarificare: trei b[i succesive @n xilen a c`te 10 minute.
ƒ Montare @n balsam de Canada.
Rezultate: mucleii se vor colora @n albastru, citoplasma ]i diferite
elemente ale \esutului conjunctiv @n nuan\e de roz.
Colora\ia Van Gieson
ƒ Deparafinare: 3 b[i succesive de benzen.
ƒ Hidratare: b[i succesive a c`te 19 minute @n alcool de concentra\ii
descresc[toare (96%, 80%, 70%).

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
99
ƒ Supracolorarea nucleilor cu hematoxilin[ Weigert: 10-15 minute.
ƒ Diferen\ierea cu alcool acidulat (sub control microscopic, p`n[ r[m`n
colora\i doar nucleii).
ƒ Virarea colora\iei nucleare timp de 20-30 minute @n ap[ curent[ sau
c`teva minute @n ap[ distilat[.
ƒ Diferen\iere @n ap[ acidifiat[ (dac[ este cazul) sau trecere direct[ @n
alcool absolut (2-3 b[i) pentru deshidratare.
ƒ Clarificare cu xilol-fenol ]i xilol (2 b[i).
ƒ Montare @n balsam de Canada.
Rezultate: nucleii se coloreaz[ @n negru, citoplasma @n galben, fibrele d e
colagen @n ro]u, membranele bazale ]i substan\a fundamental[ @n roz, mucusul
@n g[lbui sau ro]u deschis, \esutul muscular ]i hematiile @n ga lben.

Colora\ia cu Acidul Periodic Schiff (PAS) (pentru mucopolizaharide
neutre)
ƒ Deparafinare: 3 b[i succesive @n benzen.
ƒ Hidratare: b[i succesive a c`te 10 minute @n alcool de concentra\ii
descresc[toare (96%, 80%, 70%).
ƒ Oxidare @n acid periodic 1% : 10 minute.
ƒ Sp[lare @n 3 b[i de ap[ distilat[ a c`te 2 minute fiecare.
ƒ Colorare @n reactiv Schiff :10 minute.
ƒ Trecere prin 3 b[i a c`te 2 minute de metabisulfit de sodiu.
ƒ Sp[lare @n ap[ curg[toare :10-15 minute.
ƒ Colorare (facultativ) cu hematoxilin[ Mayer: 3 minute.
ƒ Sp[lare @n ap[ curg[toare : 15 minute.
ƒ Deshidratare (b[i successsive de alcool de concentra\ii cresc[toare
(70%, 80%, 96%) c`te 5 minute @n fiecare.
ƒ Clarificare: 3 b[i succesive de xilen a c`te 10 minute.
ƒ Montare @n balsam de Canada.
Rezultate: mucusul din celule caliciforme se coloreaz[ @n ro]u @nchis,
glicogenul @n ro]u purpuriu, memb ranele bazale, fibrele de reti culin[ se
coloreaz[ @n ro]u purpuriu, glicolipidele, fosfolipidele se col oreaz[ @n ro]u
intens.

7.3.3.8. Examenul citologic al ascitei

Lichidul prelevat prin punc\ie peritoneal[ a fost dus imediat @ n
compartimentul de citologie din cadrul Laboratorului de Anatomi e-Patologie al
Spitalului Universitar CF Craiova, unde a fost prelucrat imedi at dup[
urm[toarele metode:

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
100
ƒ Centrifugarea lichidului timp de 6 minute la 2.000-3.000 de
rota\ii/minut.
ƒ Din sediment s-a pus c`te o pic[ur[ pe 5-6 lame ]i s-au @ntins frotiuri
c`t mai sub\iri cu ajutorul unei lame.
ƒ S-au practicat colora\ia May-Grunwald-Giemsa ]i colora\ia
hematoxilin[-eozin[ pentru citologie.

Colora\ia May-Grunwald-Giemsa
Frotiurile au fost l[sate s[ se usuce la temperatura camerei ti mp de 30
minute.
Solu\ii necesare:
ƒ Reactiv May-Grunwald (stoc) – amestec de eozin[-albastru de metilen
(0,5 g) ]i metanol 100 g (se schimb[ la 2 s[pt[m`ni).
ƒ Solu\ie Giemsa (stoc) (se schimb[ zilnic):
• Azur II eozin[ – 0,6 g.;
• Azur II – 0,16 g.;
• Glicerin[ – 50 g.;
• Metanol – 100 g.

Din cele dou[ solu\ii stoc se p repar[ solu\iile de lucru:
• May-Grunwald: 2/3 solu\ie stoc May-Grunwald + 1/3 metanol;
• Giemsa: 1/10 solu\ie stoc Giemsa + 9/10 ap[ distilat[.

Pentru colorare sunt necesare 5 etape:
a) colorarea cu solu\ie de lucru May-Grunwald – 5 minute;
b) sp[larea @n ap[ de robinet;
c) colorarea cu solu\ie Giemsa de lucru – 15 minute;
d) sp[lare abundent[ @n ap[ de robinet;
e) uscare @n aer sau la termostat la 37 °C timp de 10 minute.
Rezultate: nucleii se coloreaz[ violet, citoplasma cu nuna\e de albastru
sau ro]u @n func\ie de tipul de celul[.
Colora\ia Hematoxilin[-Eozin[ (pentru citologie)
Frotiurile au fost fixate @n alcool etilic 96% timp de 10 minut e. Dup[
aceast[ fixare s-au parcurs urm[torii timpi:
• hematoxilin[ Mayer – 2-3 minute;
• sp[lare cu ap[ de robinet;
• virare @n carbonat de litiu 1-2 secunde;
• sp[lare cu ap[ de robinet;

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
101
• eozin[ – 1 minut;
• sp[lare cu ap[ de robinet;
• 3 b[i alcool etilic (1-2 minute @n fiecare);
• 4 b[i xilol (2 secunde @n fiecare, @n ultima 10 minute);
• montarea frotiului @n balsam de Canada.
Rezultate: nucleii se coloreaz[ @n albastru @nchis, citoplasma @n nuna\e d e
roz, hematiile ro]u-portocaliu, detritusul roz-alb[strui.

7.3.3.9. Prelucrarea statistico-matematic ă

Pentru prelucrarea datelor s-au folosit pachetele software EPI2000 ,
distribuit de OMS, SPSS , specializat în calcule statistice științifice, produs de
firma SPSS .
Înregistrarea cu ajutorul programului EXCEL a datelor despre pacien ți a
produs baza de date ini țială din care s-au extras aspectele semnificative ale
acestui studiu.
Prelucrarea propriu-zis ă s-a f ăcut cu ajutorul:
• comenzilor CrossTab, BasicTables, General Tables, Correlate,
Regression și Factor Analisys, ale programului SPSS,
• modulului ANALYSIS al programului EPI2000 specializat în
executarea de grafice, tabele și teste statistice.
Tabelele de inciden ță au fost apreciate din punct de vedere al dependen ței
între cei doi factori de clasificare cu ajutorul testului CHI P ĂTRAT, re țin`nd
doar rezultatele sub 5%, considerat un prag de semnifica ție suficient.
Compararea mediilor s-a f[cut cu ajutorul testului Kruskal-Wall is,
deoarece, de regul ă, volumele loturilor pentru care s-a efectuat compararea au
fost mici.
La testele de comparare a mediilor am folosit testul ANOVA cu
următoarea interpretare a valorilor lui p, ob ținute prin testele de mai sus:

• p < 0.05, diferen ța între cele dou ă medii este semnificativ ă (S).
• p < 0.01, diferen ța între cele dou ă medii este înalt semnificativ ă (HS).
• p < 0.001, diferen ța între cele dou ă medii este foarte înalt
semnificativ ă (VHS).
• p > 0.05, diferen ța între cele dou ă medii este nesemnificativ ă (NS).

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
102
Toate pachetele folosite furnizeaz ă direct rezultatul p al testului, ca
probabilitate de a face o eroare dac ă se respinge ipoteza de nul, rezultat furnizat
ca un num ăr între 0 și 1 și pe care l-am interpretat astfel:
La testele de dependen ță a factorilor, aplicate la tabelele de inciden ță, am
folosit practic aceea și interpretare ca la cele de comparare:

• p < 0.05, dependen ța între cei doi factori este semnificativ ă (S).
• p < 0.01, dependen ța între cei doi factori este înalt semnificativ ă (HS).
• p < 0.001, dependen ța între cei doi factori este foarte înalt
semnificativ ă (VHS).
• p > 0.05, dependen ța între cei doi factori este nesemnificativ ă ( N S ) .

Rezultatele testelor sunt furnizate în text numai prin probabil itatea p,
nemaifiind deci necesar ă men ționarea de fiecare dat ă a pragului de semnifica ție
avut în vedere. Deîndat ă ce am ar ătat mai sus care este interpretarea științifică,
aceasta va fi luat ă în considerare în toat ă teza.

S-au folosit în toate calculele, următorii indicatori statistici :
a) Media : ∑∑
==
iii
fn
ifx
X1
b) Dispersia: ∑∑


−
==
ii i
fn
if__
XX
12
2σ
c) Abaterea standard (devia ția standard): σσ2=

d) Coeficentul de varia ție: 100 ..⋅=XVCσ

e) Cuartilele 1, 2 și 3 (Q1, Mediana și Q3):

• Cuartila Q1 este valoarea dintr-o serie de valori, pentru care un sfert
din valorile seriei sunt mai mici dec`t Q1 și trei sferturi mai mari.
• Mediana este valoarea dintr-o serie de valori, pentru care jum ătate din
valorile seriei sunt mai mici dec`t mediana și jum ătate mai mari.

CAPITOLUL 7 Material ]i metod[
103
• Cuartila Q3 este valoarea dintr-o serie de valori, pentru care trei
sferturi din valorile seriei sunt mai mici dec`t Q3 și un sfert mai mari.
f) Dreapta de regresie este dreapta care trece c`t mai aproape de punctele unui
grafic care are pe abscis ă un parametru, iar pe ordonat ă un al doilea parametru,
corelat cu primul. Coeficien ții pentru ecua țiile dreptelor de regresie au fost
obținuți prin metoda celor mai mici p ătrate.
g) Coeficientul de corela ție. Pentru dou ă serii de date, coeficientul de corela ție
folosit este coeficientul lui Pearson . Am considerat a fi cel mai sintetic
indicator al corela ției. Formula folosit ă pentru calculul coeficientului de
corela ție Pearson este:
()()
() ()∑∑∑
= ==
−⋅−−⋅−
=
n
iin
iin
ii i
Yy XxYyXx
r
12
121
unde , nxxxX ,…….,2 1÷ și nyyyY ,…….,2 1÷ , sunt valorile m ăsurate pentru cei doi
parametri a c ăror corela ție o calcul ăm și YX,, mediile de e șantionare respective,
calculate cu formula dat ă mai sus. P ătratul coeficientului de corela ție, notat R2 a
fost considerat coeficient de determinare între cei doi paramet ri.

7.3.3.10. Analiza rezultatelor

Scopul studiului a constat @n eviden\ierea factorilor de risc i mplica\i @n
etiopatogenia cancerului hepatocelular ]i identificarea caracte risticilor
anatomopatologice, imagistice (ecografie bidimensional[ conven\ ional[,
ecografie armonic[, ecografie Doppler, tomografie computerizat[ , rezonan\[
magnetic[ nuclear[) ]i serologice (markeri tumorali:
α-fetoproteina ]i antigenul
carcinoembrionar) ale pacien\ilor cu carcinom hepatocelular.
De asemnea, am studiat rela\ia ciroz[ – leziuni precanceroase – c a n c e r
hepatocelular la pacien\ii inclu]i @n lotul I.
Urm[rirea evolu\iei bolnavilor cu HCC pe toat[ perioada de stu diu, a
sensibilit[\ii ]i specificit[\ii fiec[rei metode de investiga\i e folosit[ pentru
diagnosticul de HCC, mi-a permis alc[tuirea unui algoritm de di agnostic
predictiv, util pentru depistarea precoce a pacien\ilor cu HCC.