Capitolul 1. Tipuri de compuși biologic activi utilizati în industria alimentară 1.1.1 Celu le de drojdie Saccharomyces cerevisiae sunt… [608988]

Capitolul 1. Tipuri de compuși biologic activi utilizati în industria alimentară
1.1.1 Celu le de drojdie
Saccharomyces cerevisiae sunt microorganisme eucariote clasificate în domeniul
fungilor. Sunt de asemenea cunoscute ca și drojdii de bere sau de panificație și sunt utilizate
în industria de panificație sau pentru producerea berii. Celulele de drojdie se reproduc asexuat
prin înmugurire iar dimensiunea lor este cuprinsă între 3 și 4 μm în diametru. Drojdiile
Saccharomyces cerevisiae sunt facultativ anaerobe și pot sup raviețui atât în co ndiții anaerobe
cât și în condiții aerobe.
Drojdia de panificație reprezintă o masă de celule vii Saccharomyces cerevisiae . În
prezența glucozei, utilizată ca și sursă de carbon, în condiții anaerobe, se produce etanol ca un
rezultat al procesului de fermentare. Atunci când celule de drojdie sunt cultiva te cu melasă în
condiții aerobe, se produc cantități mari comerciale de drojdie, cunoscută ca și drojdie de
panificație [1,2,3]
Istoria drojdiei este foarte veche, prima înregist rare a existenței pâinii a fost în anul
266 Î.H., în Babilonia. Se crede că egiptenii antici au fost primii care au descoperit pâinea
dospită. Pâinea dospită a fost preparată pentru prima dată prin amestecarea berii în
fermentație cu făină de grâu. În anul 1780 drojdia obținută prin distilare a fost produsă prin
utilizarea a 70% secară și 30% malț urmând procesul de fermentare iar apoi separarea
drojdiei. Randamentul de producție a drojdiei a crescut atunci când în timpul anilor 1840, în
Austria a fost util izat porumbul.
Primele studii ale proceselor fermentative au început cu Pasteur în 1860. După 1870
s-a realizat progresul tehnic și un laborator experimen tal a fost fondat la Berlin. Îmbunătățirile
aduse drojdiei de panificație au continuat. Descoperirea a erării a fost eficientă pentru
fermentarea droj diei și prima drojdie uscată a fost obținută în 1890. Melasa a fost intro dusă în
procesul de producere a drojdiei de panificație în 1915, în Germania. Modificări ale
procedeului de producere a drojdie de panif icație continuă și astăzi.
Materia primă utilizată pentru producția drojdiei de panificație este melasa. Melasa
este bogată în surse de carbon și ioni importanți pentru metabolismul drojdiei. Melasa conține
40-55% din greutate zaharuri, în formă de zaharoz ă. Nutrienții și mineralele necesare în
producția de drojdie se găsesc în melasă și cei mai importanți sunt: azo t, potasiu, fosfați,
magneziu, calciu și urme de fier, zinc, mangan și molibden . [4]
Am ales să utilizăm în studiile efectuate pe celule de dro jdie, o tulpină de drojdie
comercială, de panificatie, care se găsește sub formă comprimată și are un conținut de apă de
70%. Este o drojdie de panificație care utilizează genul de drojdie Saccharomyces cerevisiae

care are urmatoa rele caracteristici ale ce lulei: dimensiunea celulei: 2 -8 μm , volumul: 0,8 -2
x10-3cm3, greutatea celulei de drojdie: 0,2 -0,4x 10-10 g, numărul de celule/g: 8 -14 x109,
suprafața per g: 8 -14 x109. Acest tip de drojdie a fost ales deoarece reprezintă o biomasă de
celule din specia Sac charomyces cerevisiae (drojdie de fermentație superioară), biomasă
formată de celule vii, capabile să producă fermentarea zaharurilor cu formarea de alcool etilic
și dioxid de carbon. [4-9]
Aceste celule de drojdie absorb cel mai ușor hexozele (gluc oza), apoi zaharoza și
maltoza. Celula de drojdie este constituită dintr -o varietate de biopolimeri și macromolecule.
Cunoașterea compoziției lor și a cantității este esențială pentru metabolism și pentru analiza
creșterii biomasei. Biomasa de celule Saccharomy ces cerevisiae este constituită din cinci
grupe de macromolecule: proteine, carbohidrați, lipide, ARN și ADN . [10].
1.1.2 Influența ionilor metalici asupra celulelor de drojdie și asupra eficienței
proceselor fermentative.
Celulele de drojdie necesită o gamă la rgă de metale pentru creșterea lor și pentru
metabolism. Mineralele în procesele de fermentare și distilare au fost mult timp trecute cu
vederea ca fiind factori importanți. Cercetările efectuate au evidențiat faptul că ionii metalici
pot avea un im pact ma jor asupra progresului, creșterii eficienței proceselor fermentative
industriale și au un impact semnificativ asupra unor parametri importanți, inclusiv în viteza de
conversie a zahărului în etanol, în randamentul final în etanol, în creșterea și multiplic area
drojdiei, asupra viabilității celulare, asupra factorilor de stres și asupra comportamentului de
floculare a drojdiei.
Cantități mari de metale cum ar fi magneziul și potasiu sunt necesare, în general
pentru creșterea celulelor de drojdie și se utiliz ează în general concentrații milimolare în timp
ce alte metale cum ar fi calciul și zincul sunt necesare in cantități foarte mici, ca urme
necesitățile celulei de drojdie pentru a -și înde plini funcțiile fiziologice fiind în cantități
micromolare. [11,12] Alte metale cum ar fi metalele grele pot fi toxice pentru celulele de
drojdie. [13]
În procesele fermentative pentru obținerea berii, ionii metalici principali sunt
reprezentați de către magneziu și zinc, care acționează ca și cofactori pentru multe enzim e
glicolitice importante și de asemenea și ca modulatori la factorii de stres pentru drojdie.
În cazul proceselor industriale factorii de stres care pot afecta celulele de drojdie
rezultă din produsele secundare produse de etanol (metaboliții) și de natura sistemului în care
sunt utilizate. Un alt factor de stres pentru celulele de drojdie poate fi un mediu deficient în
nutrienți. [14, 15]

Condițiile de mediu care duc la apariția factorilor de stres pot fi fluctuații rapide de
temperatură, presiune osmotică ridicată, concentrația crescută în etanol și lipsa nutrienților
care afectează în mod negativ metabolismul celulelor de drojdie și poate rezulta astfel un
proces de fermentare ineficient. [16,17]
Celulele de drojdie afectate de factorii de stres sunt iden tificate printr -o creștere a
capacității lor de acidifiere odată cu transferul lor într -un mediu bogat nutritiv . [18]
Cercetările efectuate au constatat faptul că performantele celulelor de drojdie sunt afectate
diferit de factorii de stres menționați ante rior și rezistența lor la acești factori depinde de
tulpina drojdiei, starea fiziologică a celulei, natura fizico -chimică a mediului de fermentare și
de prezența altor microorganisme cum ar fi drojdia sălbatică și bacteriile. [19]
Rezultatele cercetărilor au evidențiat faptul că toleranța la factorii de stres a celulelor
este dependentă de compoziția nutritională a mediului de fermentare. [20, 21] Compoziția
mediului include surse de carbon, azot și câțiva ioni metalici care ajută la creșterea
performanței fermentării drojdiei. Ionii metalici mențin integritatea structurală și
funcționalitatea organitelor intracelulare, induse de interacțiunile celulă -celulă cum ar fi
flocularea, reglarea expresiei genelor, mecanismul de absorbție a nutrienților, activarea
enzimelor implicate în metabolism și de asemenea acționează ca protectori la factorii de stres.
[22-27]
Drojdiile au capacitatea de a absorbi foarte eficient mineralele esențiale din mediu și
să le excludă pe cele neesențiale. Magneziul și zincul sunt absor bite în mod act iv din mustul
de bere pentru a -și îndeplini r olurile fiziologice esențiale. Biodisponibilitatea ionilor metalici
în mediul de fermentare este un factor important care influențează fiziologia celulei de drojdie
și obținerea produș ilor de ferm entație a drojdiei. [28]
1.1.2.1 Magneziul
Ionul de magneziu este un ion divalent metalic important și cel mai abundent,
implicat într -o gamă largă de procese biologice . [29-31] Acest ion constitue cam 0,3% din
întreaga masă de drojdie uscată [32], activea ză peste 300 de enzime [22,33] . Menținerea
integrității celulare, ceea ce include stabilizarea structurală a acizilor nucleici, a
plinucleotidelor, a cromozomilor, polizaharidelor și lipidelo r au fost atribuite magneziului.
[27] Ionul Mg2+ este un cofactor esențial pentru enzime și componentul structural cheie în
cele mai multe molecule biologice dar identitatea moleculară a reglării sale în celula de
drojdie este încă slab eluc idată . [31] Membranele periplasmatice ale drojdiei mitocondriale și
cele mai imp ortante, vacuolare sunt identificate a fi canale și depozite ale ionilor metalici prin
care aportul ionilor Mg2+ este reglat prin medie rea proteinelor de transport , ionii magneziu

fiind legati de acestea. Reglare a aportului de magneziu în celulele de drojd ie are loc în două
faze: chemosorbția și bioacumularea. [31, 34]
Chemosorbția ionului de magneziu, este prima fază a absorbției pentru transport,
este dependentă de structura (permeabilitatea) peretelui celular al drojdiei. Peretele celular al
drojdiei est e constituit în mare parte din β -1,3-glucan (până la 50% din compozitia peretelui
celular), manoproteine (40%) și β -1,6-glucan (10 %). [35] Servește ca loc de legare pentru
magneziu datorită prezenței grupelor anionice încărcate negativ (fosfonat, carboxil, hidroxil și
amine) prezente pe stratul exterior al peretelui cel ular [12, 31] . Dinamismul magneziului la
nivelul peretelui celular a fost raportat a fi afectat în mod semnificat de temperatură, pH, de
numărul celulelor viabile și nu în ultimul rând de pre zența altor ioni . [36] Cercetările
efectu ate au furnizat și recomandat temperatura optimă și variația pH -ului între anumite
limite., respectiv 25 -35˚C și pH 4 -8 pentru a creșterea absorbției ionilor metalici. [37, 38]
Au fost arătate corelații antagoniste ale ionului Mg2+ cu alți ioni metalici cum ar fi
stronțiu, în care stronțiu este eliminat parțial de către magneziu din vacuolele celulare în
cadrul activității celulelor consolidate (Avery si Tolin, 1992). Cadmiul afectează negativ
procesul de legarea al cationului Mg2+, iar magneziul scade capacitatea celulei de drojdie de a
absorbi z incul. [36, 39, 40]
Un alt factor important pentru absorbția magneziului este vitalitatea celulară. Un
efect inhibitor în procesul de legare al ionului metalic în celule cu volume mari a fost raportat
de Park și colab. (2003) [36], deși celulele foarte viabile s -au dovedit a se lega în mod activ la
magn eziu.[31, 39]
Influența diferitelor condiții de mediu, a surselor de carbon și azot asupra creșterii
celulare și asupra biodi sponibilității magneziului au fost arătate în cercetările privind
procesele de obținere a berii și a fost dovedit faptul ca ionul Mg2+ este esențial pentru
creșterea celulelor de drojdie. [28]
Bioacumularea este a 2 -a fază în procesul de transport al ionulu i de Mg2+ și implică
absorbți a magneziului din peretele celular și membrana citoplasmatică în c itoplasma celulelor
de drojdie. Acumularea intracelulară de magneziu este mediată de către principalul
transportor al proteinelor de care magneziul este legat și anume Alr1p și Alr2p (aluminium –
resistance permeases) și sunt codate ca și gene ALR1 și ALR2. [31, 32, 34]
Ambele proteine de transport fac parte din proteinele membranare integrate sau se
mai numesc transpo rtori de ioni metalici (TIM) și au fost găsite de a avea aceeași asemănare
caracteristică în ceea ce privește structura, masa mol eculară și punctul izoelectric [31, 32] și
se presupune că împart aceeași linie de activitate. Inactivarea ambelor proteine de transport a

fost raportată de a opri creșterea dependen tă de magneziu a celulelor dar și afectarea
absorbției de magneziu în drojdie . [31, 41]
Acest proces de bioacumulare are un ritm mai lent în comparație cu p rocesul de
chemosorbție. [34] Ionul de magneziu eliberat este ulterior sechestrat de polifo sfații
intracelulari, ARN și ATP, lăsând o cantitate mică de magneziu liberă care este disponibilă
pentru procesele biochimice , cum ar fi activarea enzimelor, reglarea pH -ului intracelular,
osmoreglarea, stabilizarea proteinelor și a membranelor și semnali zarea căi i de transducție.
[32]
Creșterea interesului pentru cercetarea rolului ionilor metalici în celulele vii au adus
îmbunătățiri în domeniul biologiei celul are și au o importanță deosebită în biotehnologie.
Magneziul poate restabili creșterea celulară în Schizosaccharomyces pombe, a cărui
diviziune celulară a fost inițial inhibată cu un metal chelat or ionofor A23187 . [32] Maynard
(1993) afirmă că celulele intră în fază staționară pentru producția maximă de etanol la o
concentrație minimă de zahăr atunc i când concen trația ionilor de magneziu din mediul de
creștere este maximă. [31, 42]
Ionii de Mg2+ sunt esențiali pentru duplicarea ADN -ului, iar polimerazele și lipazele
au arătat o cerință pentru acest metal. Producerea de specii reactive de oxigen care sunt
cunoscute de a provoca daune ADN -ului s -a dovedit a fi redusă în mod semnificativ prin
creșterea concentrației de magneziu atât în celulele de dro jdie cât și în organismul uman.
[42,43]
Walker (1998) [44] a raportat o îmbunătățire a viabilității cel ulelor de la 0 la 5 %
pentru drojdia de vin care a fost supusă unui șoc de etanol de 10 -20% pentru 24 ore sub
concentrații de magneziu între 50 -500 ppm. [44] Hu și colab. (2003) [45] au arătat că o
expunere a celulelor de drojdie la 20 % etanol conduce la m oartea totală a celulelor spre
deosebire de mediile unde a fost adăugat magneziu (85 ppm), unde viabilitatea celulară a avut
valori între 25 -55% utilizând același mediu. [45]
De o importanță majoră a ionilor de magneziu este proprietatea acestora de a redu ce
stresul î n celulele de drojdie. Studiul lui Birch și Walker (2000) [27] demonstreză efectul
protector al ionilor de magneziu atât la temperatură cât și la metaboliții toxici din etanol
pentru celulele de drojdie. [27, 31]
Spre deosebire de relația anta gonistă de bază Mg2+ și Ca2+, studiile efectuate de
Trofimova și colab. (2010) [46] relevă faptul că aceste două metale pot reface complet
creșterea celulară și oferă stabilitate membranei pentru Blastomyces dermatidis și
Saccharomyces cerevisiae. [31, 4 6] S-a emis ipoteza că ambele metale cooperează,

stabilizează și reduc fluctuațiile în fluiditatea membranei care a fost găsită a avea o funcție
importantă în rat a de supraviețuire a drojdiilor. [31]
Cu toate acestea, s -a arătat că ionii de magneziu modele ază cinetica calciului,
deoarece destabilizează complexele de calciu și contracarează în mod activ acțiunea de legare
a ionilor de calciu la liganzii intracelulari și extracelulari. [47] Alți cercetători au identificat
calciul ca și metal dominant în relaț ia antagosnistă, ca un rezultat al afinității calciului pentru
locurile de legare pe liganzi cum ar fi ATP și acizii nuc leici. [12, 14]
Ultimele cercetări demonstrează o corelație inversă între magneziu și calciu. Este
evident că competiția de dominare înt re cele două metale depinde enorm de concentrația lor
un raport Mg:Ca în care magneziu are o concentrație mai mare are cel mai bun impact asupra
fiziologiei drojdiei și în procesele fermentative .[27, 31, 48]
Procesele fermentative în biotehnologie au un r ol foarte important iar magneziul
influențează numeroase procese metabolice ale tulpinilor de drojdie c omerciale. Piruvat
kinaza, hexokinaza, fosfofructokinaza, fosfoglicerat kinaza și eno laza necesită pentru
activi tatea lor ionii de magneziu. S-a emis ipo teza că ionii de magneziu prezintă un rol care
dictează metabolismul piruvatului, astfel încât biodisponibilitatea sa în controlul metabolic al
fluxului de carbon, fie în dehidrogenaza piruvat sau în piruvat decarb oxilaza este foarte
importantă. Ionii de m agneziu controlează astfel procesele de respirație și pe cele fermentative
în ce lulele de drojdie .[22]
Studiile privind rolul ionilor metalici în procesele fermentative care au implicat ionii
de magneziu și au obținut un randament crescut în producția de etanol și o biomasă mărită de
celule de drojdie au demonstrat rolul benefic al ionilor de magneziu. [31] Villen și colab.
(2009) au arătat că celule de drojdie ar necesita o cantitate mică constantă de ioni de
magneziu, pentru a susține o productivitate ri dicată în etanol, deoarece o cantitate mai mare ar
conduce la o acumulare excesivă de ioni de magneziu care nu determină neapărat o eficiență
mărită în fermentare. [50] O acumulare constantă de biomasă de celule în prezența
magneziului a fost raportată de Alexander și colab. (2009) [23] care indică de asemenea o
importanța ionilor de magneziu în creșterea celulară și în faza activă în formarea
etanolului .[23]
S-a demonstrat că biodisponibilitatea magneziului exercită o influență pozitivă
asupra substratulu i de fermentare deoarece ameliorează impactul presiunii osmotice asupra
celulelor de dr ojdie. Comportamentul ordonat de floculare al celulelor de drojdie în timpul
procesului de fermentare a fost demostrat în timpul procesului de fermentare la o concentraț ie
de aproximativ 10 ppm ioni de Mg ce substit ue Ca în condiții experimentale. [14, 31]

Din aceste cercetări efectuate reiese faptul că biodisponibilitatea magneziului este un
indiciu de performanță fermentativă a drojdiei, dar suplimentarea mediului de fe rmentare cu
ioni de magneziu trebuie efectuată cu precizie luând în considerare și alți parametri care ar
putea afecta biodisponibilitatea. [31]
1.1.2.2. Zincul
În procesele fermentative pentru obținerea berii ionii metalici cheie sunt reprezentați
de către magneziu și zinc, care acționează ca și cofactori pentru enzimele glicolitice
importante și de asemenea ajută la reducerea efectelor determinate de factorii de str es asupra
celulelor de drojdie. Zincul se utilizează în concentrații foarte mici, ca urme de metal și este
un element foarte important iar pentru o fermentare optimă este necesară o concentrație de
zinc de minim 0,3 ppm. Este un cofactor pentru numeroase enzimi biosintetice și metabolice
incluzând aici numeroase enzimi glicolitice și alcool dehid rogenaza. În plus joacă un rol
important prin acțiunea sa asupra ADN -ului din proteinele de legare și afectează flocularea
celulelor de drojdie. Ionii de zinc au fost implicați în funcția activării enzimei alcool
dehidrogenazei care este esențială pentru formarea etanolului și este foarte important ca
element structural cheie. [28, 32] Disponibilitatea ionului metalic este de o importanță
capitală deoarece joacă diferite . roluri în metabolismul drojdiei care conduce la reacții
biochimice importante ceea c e asigură un proces fermentativ eficient. Privarea drojdiei de ioni
de zinc se utilizează pentru a preveni înmugurirea sau creșterea celulelei Saccharomyces
cerevisiae și rez ultă adesea o fermentație lentă . [13]
Concentrațiile de zinc pot descrește în tim pul zdrobirii și în timpul fermentării
mustului deoarece ionul metalic creează complecși în borhotul precipitat. În consecință nivele
de zinc pot deveni compromise ceea ce conduce la o performanță scăzută în fermentare.
Zincul este un element foarte impor tant în procesele fermentative deoarece are un rol
de activator enzimatic al alcool dehidrogenazei. Un mediu deficient în zinc poate conduce la
încetinirea sau la o fermentație incompletă. În plus față de impactul asupra enzimelor
metabolice importante, zi ncul poate avea un rol benefic asupra stabilității și dinamicii
membranelor celulare. [51, 52]
Zincul este absorbit în mod activ de către celulele de drojdie din mediul de
fermentare pentru a îndeplin i roluri fiziologice esențiale. Celulele de drojdie acum ulează
zincul în 2 faze:
-prima fază constă dintr -un metabolism independent de legare a resturilor sulfidril în
cadrul grupurilor de cisteină ale peretelui celular;
-a doua fază este transportul activ în celulă.

Zincul este apoi transferat în vacuolele din drojdie. [28]
Stewart și Russel(1998) au studiat rolul ionilor metalici în ceea ce privește procesele
fermentative din industria berii. În industria berii cele mai multe cercetări până în prezent s -au
concentrat pe rolul ionilor de Zn și Ca asupra influenț ei fermentării mustului și asupra
procesului de floculare a drojdiei. [53] Este demn de remarcat faptul ca zincul este un
micronutrient esențialpentru drojdie și ocazional mustul de bere poate fi deficient în zinc
având ca rezultat ă eficiență scăzută în f ermentare . [28, 53] Acest fenomen care poate duce la
încetinirea fermentării în procesele fermentative de obținere a berii este dependent de tulpina
de drojdie dar poate surveni și atunci când concentrația de zinc din must este mai mică de 0,1
ppm. Zincul joacă un rol major în metabolismul fermentativ al drojdiei, nu doar pentru că este
esențial pentru activitatea dehidrogenazei din etanol dar și pentru că poate stimula absorbția
de maltoză și maltotrioză de către celulele de drojdie, sporind astfel vitezel e de fermentare.
[28]
Mai mult decât atât elucidarea posibilelor efecte ale zincului asupra stabilității și
dinamicii membranei celulare pot determina în continuar e îmbunătățiri ale fermentării. Zincul
este preluat complet și rapid de celulele de drojdie î n timpul fermentării ceea ce conduce la
concentrații scăzute și variabile de zinc. Concentrațiile optime de zinc pentru o fermentare
optimă sunt cuprinse între 0,5 -1ppm (0,25 -0,5 mg/ml) . Cu toate acestea, în procesele de
fabricare a berii și în cele de dis tilare, este important să se determine în fiecare situație
concentrația optimă a ionilor de zinc pentru a obține un randament crescut în etanol, deoarece
concentrația de zinc depinde de tulpinile de drojdie alese și de modul de preparare al
mustului.
Adău garea de zinc în timpul fermentării conduce la o creștere în producția de alcooli
și esteri dar reduce formarea aldehidei acetice.Concentrații mari ale compușilor organici
volatili în mediu poate determina creșterea numărului de acizi grași responsabili pe ntru gustul
nedorit de săpun, gras sau rânced. În general când concentrațiile scad sub 0,1mg/l procesul de
fermentare se oprește . [54]
În procesul de fabricare al berii mustul de fermentare al malțului reduce
biodisponibilitatea zincului deoarece metalul poate forma complecși și precipitate cu
proteinele, cum ar fi grupele cisteinei din peptide și aminoacizii . [14]
Suplimentarea cu ioni de zinc a mediului de fermentare duce la îmbunătățirea
flocurării și descrește dimensiunea m edie a aglomeratelor de drojd ie [53], probabil pe de o
parte datorită schimbului cu ionii de calciu în celulele de drojdie dar și datorită legării zincului
de pereții celulari.

Taylor și Orton au arătat că zincul poate inhiba flocularea dar doar în conc entrații
foarte mari (65,4 ppm) . [14]
Udeh 2014 a urmărit în studiul său influența ionilor metalici asupra proceselor
fermentative. El adăugat diferite concentrații de zinc în must, respectiv 8, 10 și 12 ppm.
Ipotetic, efectul mustului de vin în fermentare la o concentrație de 10 ppm ion i de zinc ar
putea fi atribuită efectului său represiv asupra sistemelor de absorție a zincului la concentrația
stabilită. Această observație a fost făcută și de [28], unde se spune că nivele mari de zinc ar
inhiba funcția genei ZAP1(gena care reglează apo rtul de zinc). Aceste cercetări sunt în acord
cu studiile efectuate de unde nivele de zinc care au variat între 0,05 -1,07ppm Zn2+în must au
adus o creștere mai mare a randamentului în fermentare la unele tulpini de S. cerevisiae decât
utilizarea a 10 ppm Zn2+. Cu toate acestea alte cercetări au afirmat faptul că la concentrații
destul de mari de zinc 65,5, 327,5 și 1300 ppm randamentul în fermentare este
îmbunătățit .[28]
Celulele de drojdie pot totuși suferi o stare de toxicitate în prezența zincului dar
numai atunci când manganul lipsește din mediu.
Îmbunătățirea producției în etanol odată cu creșterea concentrației de zinc poate
sugera faptul că ionii de zinc ajută la protecția celulelor împotriva m etaboliților toxici din
etanol.
Celulele de drojdie au arătat o rezistență mai mare cu 18 %, la șocul produs de etanol
atunci când în mediul de fermentare s -a adăugat o concentrație de ioni de zinc de 8 ppm
(celulele au fost supuse la un șoc în etanol pentru 30 min). Această îmbunătățire a rezistenței
la met aboliții toxici produși de etanol se poate datora creșterii producției de trehaloză și
ergosteroli, care sunt cunoscuți pentru faptul că protejează membranele împotriva
distrugerilor pe care etanolul le poate produce. Deoarece rezistența apare la nivelul
membranei plasmatice ale celulelor, acestea devin m ai rezistente și la temperatură .[14]
Deficiența în ioni de zinc în celulele de drojdie conduce la creșterea stresului
oxidativ prin producerea speciilor r eactive de oxigen intracelulare , rezultând distruger i ale
ADN -ului iar pentru a preveni aceste distrugeri este necesară utilizarea unui antioxidant.
Pentru a păstra biodisponibilitatea zincului acesta ar trebui adăugat la începutul
fermentării, odată cu drojdia. Ionii de zinc nu vor avea un efect direct asu pra aromei berii
deoarece se utilizează în cantități foarte mici. [14,28]
1.1.2.3. Calciul
Calciul este cel mai mult implicat în procesul de floculare. Flocularea este o
proprietate importantă a drojdiei care depinde de mai mulți factori cum ar fi: sarcina electrică

a celulei, o proliferare scăzută a celulelor, o fermentare înceată, prezența diferiților ioni
metalici (bi și trivalenți), acțiunea metaboliților produși de etanol, influența diferitelor bacterii
(dacă mediul nu este steril) și vâ rsta celulei .
La punctul izoelectric, drojdiile se sedimentează sub formă de fulgi. Flocularea are
loc prin atracția reciprocă dintre celulele de drojdie și albuminele din mediu. Punctul
izoelectric pentru drojdii și albumine este la un pH cu valoarea de 4,4, când se produce
flocularea proteinelor și a drojdiilor. [55, 56]
S-a emis o ipoteză conform căreia ionii de calciu se pot lega de proteine și le oferă
acestora structura corectă pentr u a forma legături carbohidrate . [55] Această ipoteză a fost
denumit ă „ipoteza legaturii de calciu”. Procesul de floculare utilizând ionii de calciu este un
fenomen reversibil. Celulele floculate pot fi din nou disociate prin adăugarea unui agent de
chelare care îndepărtează ionii de calciu, prin adăugarea de manoză care î nlocuiește continuu
resturile de manoză de pe peretele celular din locurile de legare ale calciului sau prin aducerea
celulelor de drojdie floculate într -un mediu de cultura nou, prin inoculare . [55]
Ionii de calciu pot avea un rol în protejarea celulelor de drojdie împotriva efectelor
toxice produse de etanol la fel ca și ionii de magneziu sau zinc. Datorită efectului antagonist
al magneziului, efectele pozitive asupra proliferării celulare în momentul suplimentării
mediului cu ioni de calciu, sunt comprom ise. Cererea celulelor de drojdie pentru ionii de
magneziu este mai mare decît cea pentru calciu și o concentrație mărită de calciu în must este
posibil să înrăutățească deficitul de magnezi u prin interacțiuni antagoniste . [14] De aceea
suplimentarea cu io ni de calciu trebuie efectuată cu grijă. Poate fi benefică doar în unele
cazuri și anume: dacă ionii de calciu sunt suplimentați în concentrații mari pot înlocui
magneziul într -o serie de căi biochimice, dar aceasta poate duce î n timp la deteriorarea
celul ei. Trebuie remarcat faptul că suplimentarea calciului în must sau prin barbotare are un
efect tampon ce împiedică creșterea pH -ului în mediu. Un pH scăzut constant împiedică
extracția compușilor polifenolici și a celor de siliciu și influențează pozitiv c aracteristicile
berii. Efectul potențial negativ în creșterea celulară și în procesele fermentat ive trebuie luat în
considerare. [14]
1.1.2.4. Manganul
Celulele de drojdie necesită ionul de mangan în concentrații foarte mici, ca urme de
element esențial, la o concentrație de 2 -10 ppm pentru o creștere optimă a drojdiei. Acest
element a fost raportat a avea un rol important în metabolismul celulei și face parte din unele
enzime cum ar fi piruvat carboxilaza, glutamin sintetaza și arginaza.

Este esențial pentr u creșterea mugurilor de drojdie, ajutând la proliferarea celulelor de drojdie,
în special în condiții aerobe. Manganul este de asemenea prezent în aparatul Golgi și
activează glicozil transferaza, care este implicată în procesele biochimice având funcția de a
secreta proteinele . [57] Prezența ionilor de mangan a fost raportată a fi necesară în celulele de
drojdie pentru a tolera nivelele de zinc de peste 2 ppm . [22] Toleranța la zinc depinde mult de
tulpina de drojdie astfel încât concentrația de mangan es te dificil de estimat. Ionul metalic a
fost raportat a avea un rol important în protecția celulelor î mpotriva toxicității etanolului . [14]
Pe de altă parte manganul are o influență decisivă asupra îmbătrânirii drojdiei. La fel
ca fierul și cuprul, manganul poate cataliza formarea radicalilor liberi în bere fără influența
oxigenului(ex: formarea raicalilor liberi de acizi grași). Această formare a radicalilor liberi are
ca rezultat deteriorarea aromei în timpul păstrării (depozitării). În contrast cu fierul și cuprul ,
ionii de mangan nu sunt îndepărtați din must sau bere în nici un moment în timpul procesului
de fermentare (12), ceea ce face ca manganul să fie un element important, este ales ca
component principal iar în cazul păstrării îndelungate este ne dorit în mediu . [57]
1.1.2.5. Fierul
Doar câteva cercetări au fost conduse în privința utilizării fierului în procesele
fermentative. Fierul pare să fie important pentru creșterea celulelor. Shakoury -Elizeh și colab.
2004 , au arătat că proliferarea celular ă într -un mediu cu o concentrație mică de fier prezintă o
creștere mai scăzută, celulele proliferează cu 20% mai mult atunci când timpul pentru
creșterea lor este dublat în comparație cu un mediu care conține o concentrație optimă de fier
în mediul de cul tură. Acest lucru demonstrează că fierul este un factor limitativ pentru
creștere în acest mediu. Proliferarea celulară într -un mediu cu concentrații mari de fier arată
de asemenea o creștere scăzută; atunci când timpul a fost dublat s -a observat o creșter e
celulară mai mare cu 40 % față de cazul anterior. Acest comportament confirmă faptul că
celulele bogate în fier sunt expuse la o anumită toxicitate. [59, 60]
Pentru ca metabolismul în respirație să se realizeze într -un mod adecvat, celulele de
drojdie au nevoie de multă energie și necesită cantități mari de fier, care se găsesc în celule
sub formă de complecși respiratorii ce contin fier legat de diferite enzimi.
Drojdia poate utiliza doar sursele de carbon pentru creștere iar acestea pot fi
metabolizate doar prin respirație. Respirația în celulele de drojdie nu se poate realiza dacă
mediul este deficient în fier. [60, 61]

1.1.3. Procese fermentative
Etanolul, metanolul, propanolul sunt bio -alcooluri produse sub acțiunea
microorganismelor. Etanolul sau alcoolul etilic este un lichid fără culoare miscibil cu apa.
Este biodegradabil, are o toxicitate mică și nu poluează mediul.
Producția de etanol implică fermentarea zaharozei sau a zahărului simplu prin
intermediul celulelor de drojdie, de obicei Sacchar omyces cerevisiae .
Celulele de drojdie produc o enzime, invertaza care catalizează hidroliza zaharozei
pentru a produce glucoză și fructoză.
Glucoza și fructoza sunt apoi convertite în bioetanol prin acțiunea altei enzimi
zimaza, produsă de celulele de dro jdie.
Etanolul produs este izolat prin distilare și rectificare.
C12H22O11 Invertaza C 6H12O6 + C 6H12O6
Zaharoză Glucoză Fructoză
C6H12O6 Zimaza C 2H5OH + 2CO 2
Glucoză/Fructoz ă Etanol Dioxid de carbon
Aceste zaharuri (glucoza/fructoza) conțin o singură grupă de hexoză care este
compusă din 6 atomi de carbon în formula chimică C 6H12O6. [1, 62]
În mustul de fermentare al berii se găsesc monozaharide, d izaharide, trizaharide și
dextrine. Maltotrioza este un trizaharid care se găsește frecvent în mustul de bere și este
compus din trei molecule de glucoză. Dextrinele care se pot găsi în mustul de bere nu sunt
fermentate de că tre drojdie. Dextrinele conțin patru unități de monozaharid legate între ele
prin legături glicozidice. Pentru ca dizaharidele și trizaharidele să poată fi fermentate aceste a
trebuie să fie scindate la monozaharide.
Celulele de drojdie fac acest lucru prin utilizarea diferitelor enzimi atât din interiorul
cât și din exteriorul celulei.
Invertaza catalizează hidroliza zaharozei prin scindarea legăturii C -O. Celelalte
enzimi sunt maltaze care scindează maltoza și maltotrioza în glucoză în interiorul celulei.
Enzima efectuează această sci ndare prin hidroliza catalitică a zaharurilor și prin
ruperea legăturilor glicozidice prin care moleculele de glucoză sunt unite între ele.
După ce zaharurile sunt transformate în monozaharide celulele de drojdie le pot
utiliza pentru a produce alcool etil ic. Procesul de producere a alcoolului etilic presupune
utilizarea mai multor etape.

Prima etapă este denumită glicoliză . În această etapă glucoza este trans formată în
piruvat utilizând enzimi diferite într -o serie de modificări chimice. Electronii din glu coză sunt
transportați la moleculele purtătoare de energie cum ar fi NAD+ pentru a forma NADH.
C6H12O6+ 2 NAD+ + 2 ADP + 2 P i → 2 NADH + 2 ATP + 2 piruvat .
NAD (nicotinamid adenin dinucleotid) este o moleculă de ajutor în transportul
electronilor , în mult e reacții bio chimice, și există sub forma NAD +, capabil ă de a primi
electroni ( agent de oxidare), și forma NADH, capabilă să doneze electroni ( agent de
reducere). Pi este fosfatul anorganic. ATP (adenozin trifosfat) este doar o unitate de energie
celular ă și permite celulei să efectueze mai multe funcții .
Rezult atul glicolizei este piruvatul , două unități de energie, și două unități de NADH.
Celula de drojdie are acum piruvat de a continua ciclul metabolic, un plus de energie și
NADH.
Având în vedere că s uplimentarea de NAD în celulă este limitată, următorul pas în
proces este utililizarea NADH pentru a produce NAD+, pentru a păstra echilibrul reacțiilor.
Glicoliza are loc în absența oxigenului la fel ca și toate procesele fermentative utilizate în
obținer ea alcoolului. [66]
După glicoliză piruvatul poate fi utilizat fie în ciclul Krebs (respirație aerobă) sau în
respirație anaerobă. Respirația aerobă are loc în mitocondriile din drojdie. Energia din piruvat
este extrasă când trece prin procese metabolice c um este ciclul Krebs.
Ciclul Krebs, de asemenea cunoscut ca și ciclul acidului tricarboxilic, este un set de
reacții în cerc, ce se repetă, care au nevoie de oxigen. În procesele de producere a berii, ciclul
Krebs apare în prima etapă a fermentării, când d rojdia este adăugată într -un mediu de
fermentare bine aerat (must) și are loc până când tot oxigenul este utilizat.
Piruvatul este convertit la acetil_CoA prin următoarea reacție:
Piruvat + 2 NAD+ + CoA -SH → aceti l-CoA + CO 2 + NAD
cu ajutorul complexului d e enzime piruvat dehidrogenază. [65]
Această moleculă de acetil -CoA intră apoi în ciclul de reacții și conduce la formarea
a două molecule de CO 2, una de GTP (trifosfat guanozină, o altă unitate de energie
echivalentă cu ATP, trei unități de NADH și una de FADH2 (flavin adenin dinucleotidă care
funcționează similar cu NAHD). După completarea ciclului o altă moleculă de acetil -CoA
intră în reacție și ciclul se repetă.
Se formează cantități tot mai mari de NADH, reacția este reversibilă, iar NAD+
trebuie reg enerată pentru ca glicoliza să continue. NADH și FADH 2 își donează electronii
unui proces denumit transportator de lanturi de electroni/ fosforilare oxidativă.

Rezultatul este o revenire a NAD la starea NAD + și se formează o cantitate mare de energie
celulară ATP.
Deoarece ciclul Krebs este eficient în producerea unităților de energie ATP aceasta
este calea metabolică preferată de celulele de drojdie, dar nu se formează etanol. Etanolul se
formează doar în absența oxigenului. [63, 64]
Procesul de fermentar e anaer obă este mult mai simplu comparativ cu ciclul Krebs.
Fermentarea alcoolică începe cu cele două grupări piruvat obținute din glicoliză.
O enzimă, piruvat decarboxilaza transformă cele două grupări piruvat în acetaldehidă
și CO 2. Acetaldehida este tox ică atât pentru oameni cât și pentru drojdie. Sub acțiunea unei
enzime alcool dehidrogenaza, la oameni, alcoolul este transformat în acetaldehidă dar în cazul
drojdiilor are loc un proces invers iar acetaldehida este transformată în etanol.
Etapa finală e ste reprezentată de adăugarea (reducerea) unui ion de hidrogen la
aldehidă pentru a forma etanolul. Acest ion de hidrogen provine de la NADH, obținut în
urma reacției de glicoliză, și este transformat înapoi la NAD+. Etanolul este toxic pentru
celulele de drojdie dar reprezintă și o formă de apărare pentru celule deoarece bacteriile nu
cresc în acest mediu. [66]
1.2. Enzime
Implicațiile enzimelor în biotehnologie sunt evidente și binecunoscute. Sistemele
biologice pot fi de tip microbian (virusuri, bacterii , fungi, drojdii, protozoare, alge), animal,
vegetal. Pâna în prezent, un interes major în biotehnologie s -a acordat celulelor microbiene, în
special bacteriilor si drojdiilor. Nu trebuie ignorate, totuși, avantajele și potențialul folosirii și
altor tipur i de celule sau sisteme. [67]
Enzimele sunt catalizatori biologici ce reduc energia de activare a unor reacții
chimice iar domeniul biotehnologic depinde de activitatea enzimelor . Ele respectă toate legile
catalizei:
• nu se consumă în timpul reacției și teoretic pot provoca transformarea unui
număr nelimitat de molecule de substrat.
• nu modifică natura reacției, echilibrul sau bilanțul ei termodinamic, reacția
fiind posibilă si in absența sa;
• accelerează viteza de reacție, pentru acest parametru cinet ic înregistrându -se
valori de aproximativ 10 ori mai mari decăt cele obținute în absența biocatalizatorului. [68]
Cu excepția ribozimelor, enzimele sunt în majoritate proteine, putând conține și
componente lipidice sau zaharoase.

Descoperirea primei enzim e aparține lui Payen și Persoz, care in anul 1833 publică o
lucrare privind separarea dintr -un extract apos de malț a unui produs care scindează amidonul
la zaharuri mai simple, până la glucoză. Acest produs nu este altul decât amilaza. [69]
Avantaj ele folo sirii enzimelor includ: o posibilă viteză catalitică mar e, funcționeaz ă
în condiții moderate de mediu, realizează o cataliză nepoluantă, optimizarea uneia sau a două
reacții catalizate de enzime ușurează optimizarea întregului proces ce are loc într -o celu lă,
enzimele catalizează o gama largă de reacții, unele cu stereospecificitate înaltă (reacții de
oxidare, reducere, dehidrogenare, dehalogenare, hidratare si deshidratare). [68]
În ciuda acestor caracteristici, enzimele nu au fost folosite intens; aceasta deoarece
există și unele neajunsuri destul de serioase:
 majoritatea enzimelor izolate nu sunt suficient de stabile pentru utilizarea lor în condiții
industriale (slabă stabilitate la temperatură, pH sau prezența ionilor metalici).
 în celule, toate enzimel e sunt supuse “turn -over” -ului celular: cele îmbatrânite sunt
înlocuite de altele noi, ceea ce face dificilă izolarea in vitro.
 majoritatea enzimelor sunt hidrosolubile și, de aceea, dificil de separat din rea ctanți sau din
produșii de reacție și nu pot fi utilizate decât într -un singur ciclu enzimatic.
 rămânând în produșii de reacție, enzima constitue o impuritate, impunând îndepărtarea sa
prin diferite metode, ceea ce complică tehnologiile ce apelează la astfel de catalizatori.
 multe enzime utile se găses c intracelular și de aceea sunt dificil de izolat
[70]
Aceste dezavantaje pot fi parțial sau total eliminate prin insolubilizarea enzimei pe
un suport, mineral sau organic, prin legare chimică sau prin i nteracțiuni fizice. E nzimele
imobilizate pot fi ușor separate din produșii de reacție și ulterior regenerate prin tratare cu
soluții tampon de pH corespunzător celui de activare maximă a biocatalizatorului, fiind
reutilizate într -un alt ciclu enzimatic, c u avantajele ce decurg de aici. [71, 72]
1.2.1. Structu ra chimică a unei enzime
Natura chimică a enzimelor a fost mult timp necunoscută. Caracterul proteic al
enzimelor este bine dovedit, stabilindu -se că ele sunt formate fie din catene polipeptidice ale
căror unități de bază sunt resturi de aminoacizi și din punct de vedere chimic proteine simple
(sau homoproteine ), fie din două componente (una de natură proteică si alta de natură
neproteică) definite ca heteroproteine . Partea neproteica poate fi o coenzimă , atunci cand se
leagă de partea proteică prin legătur i necovalente, sau o grupare prostetică când este legată
prin legături de tip covalent.

Partea proteică, numită apoenzimă poate fi constituită din una sau mai multe catene
polipeptidice. Fiecare enzimă conține o secvență unică din aproximativ 20 de L -amino acizi,
legati prin legături peptidice. Conformațiile catenei polipeptidice condiționează manifestarea
anumitor funcții biologice prin centrul catalitic activ al enzimei . Rolul acestuia este de a
“recunoaște” structura chimică a substratului și de a -l lega de enzimă prin formarea unui
complex enzimă -substrat, deosebit de reactiv, care scindează spontan punând în libertate
produșii de reacție și enzima, aceasta din urmă nemodificată din punct de vedere chimic. [70]
1.2.2. Tipuri de enzime
Deosebire a dintre o enzimă și un catalizator clasic constă în tr-o specificitate mai
mare de acțiune a celei dintâi, realizată prin capacitatea de a cataliza un sing ur tip de reacție
biochimică. Enzimele catalizează transformarea unei singure substanțe chimice având
specifi citate absolută , fiind însă posibilă și acțiunea asupra unui număr de substanțe, înrudite
structural prin aceeași grupare sau aceleasi grupe de atomi pe care biocatalizatorul le
recunoaște ( specificitate relativă ).
În funcție de tipul de reacție pe care îl catalizează enzimele sunt clasificate in șase
mari clase: oxidoreductaze (catalizează reacțiile redox), transferaze (catalizează reacții de
transfer a unor grupări chimice), hidrolaze (catalizează scindarea hidrolitică a unor legături
sau grupări chimice) , liaze (catalizează reacții de eliminare sau de adiție a unor grupari
din/sau la molecula substratului fără participarea apei cu formarea unei duble legături),
izomeraze și ligaze sau sintetaze (catalizează reacții de sinteză prin condensarea a două
mole cule). [73]
Preparatele enzimatice sunt utilizate în numeroase domenii, detașându -se în primul
rând cel al producerii alimentelor, dar și alte procese industriale ce apelează la biotehnologii.
Numeroase enzimi se utilizează în industria berii, vinului, zah ărului, băuturilor alcoolice a
laptelui, ș.a. 23. [74] (Tabel 1)

Tabel 1. Utilizarea enzimelor în analiza biochimică și obținerea unor produși
Enzima insolubilă Utilizări
Amilaze Producția continuă a glucozei
Invertază Hidroliza continuă a zah ărului
Aminoacilază Separarea continuă a acil -D-L-aminoacilazelor
Urează Determinarea continuă a ureei din lichide
biologice
Galactozidază Conversia continuă a β -D-galactozidelor
Asparaginază Dozarea continuă a D -L-asparaginei; tratamentul
limfosarcome lor
Steroid esteraze Sinteze de steroizi
Penicilinamidaze Hidroliza continua a penicilinei
Glucozizomerază Obținerea fructozei
Catalază Conservarea alimentelor
Amiloglucozidază Transformarea continuă a maltozei la glucoză
Glucozoxidază Electrod de d etecție continuă a glucozei.
Transformarea continuă a glucozei în acid
glucuronic
Celulază Transformarea continuă a celulozei în produse
solubile în apă
Lipaze Hidroliza continuă a grăsimilor
Pectinaze Clarificarea sucurilor de fructe

1.2.3. Amid onul -substrat pentru hidroliză
Amidonul este o polizaharidă contituită din monomeri ai glucozei legați prin legături
glicozidice. Amidonul are rolul de a depozita glucoza în plante. Este compus din doi polimeri
ai glucozei: amiloza și amilopectina.
Amiloza est e un polimer liniar cu legături α -1,4 glicozidice și lanțurile sale sunt
formate dintr -un helix simplu sau dublu cu 6 unități de glucoză/rotație spiră . [75]
Amidonul din cartofi sau tapioca are un grad de polimerizare ce variază între 1000 și
6000, cu un c onțin ut de amiloză de 10 -20 %. [76,77 ]
Amilopectina este un polimer ramificat, cu un grad mediu de polimerizare
(2000000). Amilopectina are o structură de cluster constituită dintr -o catena principală pe care
se găsesc legături 1,4 -glicozidice și catene la terale ramificații cu legături α -1,6 glicozidice ce
conțin 15 -45 unități de glucoză. [78] Ramificarea catenei principale se găsește produce la
fiecare 22-70 unități de glucoză. [75] Aproape 95% din legăturile glicozidice din amilopectină
sunt legături α -1,4 glicozidice și 5 % sunt restul fiind legături α -1,6 glicozidice.

Structura este reprezentată în figura 1.

Fig 1. Structura chimică a amilozei (a) și (b) amilopectinei.
Hidroliza amidonului poate fi indusă de enzime, acid sau tratament alcalin. In acest e
condiții, legăturile glicozidice ale amidonului sunt susceptibile de hidroliză conducând la
scindare. Produșii de hidroliză rezultați sunt oligozaharide sau zaharuri cum ar fi maltotrioza,
maltoza și glucoza. Câteva enzime sunt implicate în procesul de h idroliză.
α-Amilaza este o endoamilază, scindează legătura α -1,4 glicozidică în mod aleatoriu
și produce oligozaharide. Glucoamilaza este o exoenzimă ce produce secvențial glucoza din
capetele nereducătoare și scindează legăturile α -1,6 glicozidice. O enzi mă care acționează
asupra legăturilor α -1,6 glicozidice este pululanaza și produce glucoza.
În industria alimentară glucoza este transformată în fructoză de către
glucozoizomeraza deoarece fructoza este cea mai dulce dintre zaharuri. Această enzimă este
utilizată în formă imobilizată iar magneziul este adăugat ca și cofactor. Calciul are un efect
inhibit or asupra glucozo -izomerazei .[79, 80, 81 ]
1.2.4.-Amilaza
Hidrolazele sunt enzime care catalizează reacții de scindare hidrolitică a unor legături
chimice sau grupări, formate la rândul lor prin reacții în urma cărora se elimină apa. [69]
α-Amilaza există în plante, microorganisme și animale. Este produsă comercial prin
fermentare microbiană. [80] α-Amilaza hidrolizează intern legăturile α -1,4 glicozidice în
polizaharide în care gradul de polimerizare este mai mare sau egal cu 3. Sub acțiunea lor,
amiloza si amilopectina sunt fragmentate la oligozaharide cu grad de polimerizare mai mic,
numite dextrine. Ea realizează o solubilizare a amidonului și o hidroli ză prelungită la maltoză
și maltotrioze. α -Amilazele nu pot scinda legăturile α -1,6-glucozidice din amilopectină.

Reacțiile de hidroliză au loc la un pH optim și temperatură ce variază în functie de
tipul de α -amilază utilizat. În general cerința de calciu pentru α -amilază este de 1 -20 ppm ca și
cofactor pentru activitate și stabilitate. Scăzând dependența de calciu pentru α -amilază costul
produsului final se p oate reduce. [82 ] Alți ioni metalici cum sunt Mg2+ și Mn2+ sunt raportați
ca și cofactori care sti mulează activitatea.
Structura schematizată a α -amilazei este prezentată în figura 2.

Fig.2 Structura supramoleculară a α -amilazei
Amilazele pot fi clasificate în trei grupe principale pe baza modului lor de acțiune:
endoamilaze, exoamilaze și amilaze c are ajută la ruperea ramificațiilor.
Endoamilazele sunt cunoscute ca enzime care lichefiază. Aceste enzime hidrolizează
legăturile α -1,4 glicozidice în amiloză, amilopectină și polizaharide cum ar fi glicogenul,
rezultând o descreștere rapidă a vâscozităț ii soluțiilor de amidon precum; puterea de co lorare
a soluției de iod scade. Produșii de hidroliză sunt oligozaharide cu lungimi ale lanțului ce
variază .
Exoamilazele sunt cunoscute ca enzime care zaharifică. Aceste enzime scindează
legăturile α -1,4 glico zidice în amiloză, amilopectină și glicogen de la capetele nereducătoare
prin îndepărtarea succesivă a maltozei și glucozei, în etape. Din această categorie fac parte –
amilaza din cer eale și glucoamilaza fungică. [83]
α-Amilazele pot fi de origine animală (amilaza produsă de glanda salivară și
pancreas), de origine vegetală (cereale încolțite, în special malț) cu importan ță în industria
berii, alcoolului și panificației și de origine microbiană (bacterii, m ucegaiuri și mai puțin
drojdii). Amilazele de origi ne bacteriană sunt mai stabile la temperatură decât cele de origine
fungică.
α-Amilaza din Bacillus subtillis are o stabilitate termică remarcabilă în prezența
ionilor de Ca2+ la o concentrație de 0.01M și NaCl 0. 1 M, fiind o metaloenzimă. Dupa 45 de
minut e la 70˚C, α -amilaza reține 81% din activitatea inițială, pe când proteaza alcalină doar
1% ș i proteaza neutră 0%. Atunci când s -a lucrat cu enzimă brută s -a constatat că aceasta se
comportă similar cu enzimele mai purificate. Are un domeniu larg de stabi litate la pH în

prezența ionilor de Ca2+ și își păstrează practic întreaga activitate de la pH 5,5 la pH 9,5
indiferent de soluția tampon utilizată. pH -ul optim de activitate este 6.0 iar temperatura
optimă de activitate este 60˚C .[83]
1.2.5. Aplicații al e α-amilazei
1.2.5 .1. Aplicații ale α -amilazei în medicină
S-a demonstrat faptul ca α -amilaza este prezentă în cantități mai mari în caz de
pancreatite acute, oreion, colecistite, calculi biliari și obturație intestinală.
α-Amilaza joacă un rol important și în apariția plăcii dentare și a cariilor. Se cunoaște
faptul că această enzimă formează legături cu un grad ridicat de afinitate cu un anumit grup de
streptococi orali. Datorită faptului că α -amilaza este prezentă în smalțul dinților, duce la
formarea l egăturilor α -amilază – bacterie. Acest contact între legătura α -amilază – bacterie și
dinți poate avea implicații importante în apariția plăcii dentare și a cariilor. Datorită acțiunii
α-amilazei asupra carbohidraților care ajung în gură, se realizează o h idroliză a acestora,
formându -se acid lactic, care în final duce la demineralizare.
De asemenea, α -amilaza reprezintă un agent antiinflamator.
Se cunoaște faptul că α -amilaza este secretată de glandele salivare și de pancreas,
insă aceasta mai este elibera tă și în limfă și urină atunci când o persoană prezintă diferite
forme de cancer, cum sunt: cel de plămâni, ovarian. Majoritatea cancerelor de plămâni care
produc amilaza s -au dovedit a fi adenocarcinogene. [80]
1.2.5.2. Aplicațiile α -amilazei în industria alimentară :
α-Amilaza se utilizează în industria de panificație.
Suplimentarea făinii cu α -amilază are ca efect intensificarea amilolazei și creșterea
cantității de zaharuri fermentescibile în aluat, capabile să susțină procesul de fermentare și
deci form area de gaze pe toată durata procesului tehnologic, la un nivel car e să asigure pâine
de calitate. Acțiunea de zaharificare cea mai puternică o are α -amilaza bacteriană, urmată de
cea din malț și cea de origine fungică.
Proprietățile fizice ale aluatului ș i activitatea microflorei sunt influențate de
adăugarea α -amilazei aceasta ajutân d la proliferarea celule lor de drojdie și se intensifică
activitatea fermentativă a drojdiei și a microflorei bacteriene. Ca urmare durata de fermentare
a aluatului este dimun uată.
Asupra calității pâinii, adaosul de α -amilază are influențe multiple și determină:
creșterea volumului (prin formarea unor cantități mai mari de dextrine), inchiderea culorii
cojii de pâine (datorită zaharurilor de pe suprafața pâinii ce conduc la un proces de
caramelizare sau la reacții Maillard prin formarea de melanoidine), intensificarea aromei,

prelungirea prospețimii ( datorită creșterii cantității de amidon hidrolizat sau a scăderii
cantității de amidon care gelifică), creșt erea elasticității miezului .
Utilizarea α -amilazei în procesul de fabricare a berii în diferite etape de fabricare
deter mină obținerea unor proprietăți necesare obținerii unei beri de calitate.
Utilizarea α -amilazelor bacteriene pentru fluidificarea plămezii de cereale
nemal țificate evită apariția unui gust nedorit iar prin utilizarea enzimei în etapa de brasaj se
realizează o lichefiere a amidonului cu obținerea de zaharuri ce pot fermenta , iar prin
utilizarea α -amilazei fungice se realizează o zaharifica re a dextrinelor, du când la creș terea
fermentescibilității.
α-Amilaza a fost utilizată în procesele fermentative de obținere a etanolului.
Principalele obiective tehnologice care se pot realiza cu ajutorul enzimelor
amilolitice (care conțin și α -amilază) de origine microbiană în etapa de zaharificare a
materiilor prime pe bază de amidon din cadrul procesului de fabricare a etanolului sunt:
îmbunătăț irea parametrilor de fermentare (scăderea presiunii și a temperaturii din proces),
înlocuirea parțiala a malțului (enzima poate f i folosită în scopul lichefierii, a zaharificării
amidonului, sau pentru amândouă ), înlocuirea totală a malțului ( care necesită pe lângă
prezența α -amilazei și prezența amiloglucozidazei fungice pentru zaharificare ). [84]
În acest raport ne -am propus real izarea imobilizării unor hidrolaze în particule de
polizaharide – gelan reticulat -și caracterizarea imobilizatelor astfel obținute. Pentru studiu a
fost aleasă o enzimă binecunoscută, α -amilaza.
1.2.6. Cinetica reacțiilor enzimatice.
Principiile generale ale cineticii reacțiilor chimice se aplică și la reacțiile catalizate
de enzime dar acestea au în plus o trăsătură proprie și anume saturarea cu substrat.
Teoria Michaelis -Menten presupune că enzima E se combină mai întâi cu substratul
S pentru a forma com plexul enzime -substrat ES. Acest complex se descompune într -o etapă
ulterioară obținându -se enzima liberă E și produsul P.
Ecuația Michaelis Menten exprimă relația matematică dintre viteza inițială a unei
reacții catalizată enzimatic, concentrația substrat ului și anumite caracteristici ale enzimei.
Această ecuație exprimă viteza pentru reacțiile catalizate enzimatic, cu un singur
substrat.

unde, v 0-viteza inițială de reacție.

Vmax-Viteza maximă de reacție
Km-constanta Michaelis Menten
[S]-concentrația substratului.
1.3. Substanțe nutraceutice
Termenul de nutraceutic a fost inventat de către Stephen DeFellce în 1979, fondator
și președinte al fundatiei pentru inovație situată in Cranford, New Jersey și combină cuvântul
nutriție cu farmaceutic. Este definit ca un aliment care oferă beneficii medicale sau de
sănătate, inclusiv în prevenirea și tratamentul bolilor. [85]
Prevenția bolilor cronice este o problemă pentru țările dezvoltate. Factori cum ar fi
îmbătrânirea popu lației și creșterea costurilor de îngrijire a sănătății subliniază necesitatea de
prevenire a bolilor în lumea dezvoltată. Terapii nutriționale, cum ar fi alimentele funcționale
și suplimentele alimentare reprezintă o abordare pentru prevenirea bolilor cro nice. [86]
1.3.1 Tipuri de substanțe nutraceutice utilizate în industria alimentară
Deși există multe definiții ale alimentelor funcționale, o temă comună este faptul că
alimentele funcționale pot oferi beneficii pentru sănătate “dincolo de hrana de bază” . [87]
Aceste beneficii pentru sănătate sunt de obicei asociate cu încorporarea unuia sau mai multor
compuși bioactivi .[88]
Nutraceutice și ingrediente bioactive:
 prebiotice : inulina, oligozaharidele –susțin sănătatea intestinului și ajută la refacerea
microflorei intestinale;
 probiotice: lactobacili, bifidobacterii – îmbunătățesc sănătatea intestinului [89]
 substanțe fitochimice: beta -caroten, licopen, flavonoizi, proantocianidine, polifenoli,
alicina: reduc riscul apariției bolilor cardiovasculare, canc er, diabet, boli degenerative [90]
 lanțuri lungi de acizi grași omega -3: acid dodecahexaecanoic (DHA), acid
eicosapentaenoic (EPA) – susțin îmbunătățirea sănătații cardiovasculare [91]
 peptide bioactive: peptide derivate din lapte -reduc presiunea sangelui [92]
 carotenoizii: beta -caroten, licopen, luteina, zeaxantina, astaxantina – reduc riscul bolilor
de ochi și cancerul [93]
 ierburi și condimente: uleiuri esențiale, diverse preparate de ierburi -au o gamă largă de
beneficii. [94]
Cei mai mulți compuși acti vi se incadrează în una din cele trei clasificări si anume:
lipide, proteine sau carbohidrați. Dintre aceste categorii, compușii bioactivi lipofili ridică o
serie de provocări în ceea ce privește încorporarea lor în produsele alimentare deoarece sunt

dificil de încorporat în produsele alime ntare apoase și sunt sensibili la deteriorarea oxidativă
[95]
Există de aceea o mare nevoie de a dezvolta sisteme de eliberare pentru industria
alimentară care pot fi utilizate pentru a încapsula și proteja componenții b ioactivi. Sistemele
de eliberare pentru alimente funcționale cu componenți bioactivi lipofili trebuie să posede
unele calități importante. O calitate esențială este aceea că trebuie să fie compatibile atât cu
componentul bioactiv cât și cu produsul în car e vor fi încorporate pentru a crea un aliment
funcțional sau o băutură funcțională. Alte atribute ale sistemelor includ creșterea stabilității
sau eliberarea controlată a componenților bioactivi. Sistemele de eliberare pe bază de emulsii
sunt cele mai potr ivite pentru a crea sisteme de transport al lipidelor bioactive. [96]
Reologia sau textura alimentelor poate fi afectată pozitiv sau negativ prin
încorporarea în particule de hidrogel. În general, reologia unei suspensii coloidale depinde
efectiv de conce ntrația particulei, de forma acestor particule și de orice interacțiune între
particule. Comportamentul de curgere a dispersiei este controlat prin trei forțe: hidrodinamică,
browniană si coloidală. Pentru dispersii ce constau din particule mari (> 10 μm) forțele
hidrodinamice domină. Pentru dispersii ce constau din particule între 1 nm -10μm (referindu –
ne la dispersiile coloidale) mișcarea bowniană și forțele interparticulare domină la viteze
scăzute de forfecare, în timp ce în viteze mari de forfecare forț ele hidrodinamice sunt cele mai
importante. [97]
Particulele de hidrogel pot fi create pentru a furniza atributele reologice dorite pentru
un anumit produs cum ar fi grosimea, structura, sau pot fi elaborate pentru a avea un impact
neglijabil asupra produ sului. Factorii care influențează reologia alimentelor sunt concentrația,
mărimea, forma și compoziția acestor particule Pentru orice sistem de eliberare este esențial
ca acesta să rămână stabil pentru întregul ciclu de viață al produsului și nu trebuie să
influențeze termenul de valabilitate al produsului în sine . Este absolut necesar ca mecanismele
fizico -chimice majore care promove ază instabilitatea particulelor, cum ar fi separarea
gravitațională, agregarea, schimbări volumetrice (umflare și contractare ) și disocierea
(eroziunea sau dezintegrarea) , să fie identificate, inhibate sau prevenite cu succes . [98]
Multe din abordarile pentru eliberarea medicamentului la țintă din industria
farmaceutică pot fi aplicate și în industria alimentară pentru elaborar ea de alimente
funcționale și suplimente alimentare cu proprietăți superioare cum ar fi îmbunătățirea
eliberării și a absorbției. [99]
Există o mare necesitate în industria alimentară de a elabora sisteme noi de transport
pentru componenți bioactivi. Mulți dintre acești a, cum sunt acizii grași omega 3, carotenoizii,

vitaminele liposolubile în grăsimi și fitosterolii, sunt lipofili, făcând ca încorporarea lor în
alimentele apoase și băuturi să fie o provocare. În plus multe dintre aceste componente
lipofile sunt chimic instabile și tind să se degradeze în timpul depozitării când sunt
încorporate în alimente. [96,99 ]
Teste in vitro și in vivo au fost des utilizate pentru a testa biodisponibilitatea.
Evaluarea in vitro poate include teste de dizolvare prin simu larea conditțiilor
gastrointestinale, teste de culturi celulare pentru a evalua permeabilitatea și fluxul, teste
pentru evaluarea adeziunii sistemului de e liberare la țesutul intestinal și permit înțelegerea
mecanismelor, viteza și gradul de elibera re a co mponentelor bioactive. E xistă însă și limitări
deoarece testele nu țin cont de schimbările biologice, asimilarea activă, răspunsul metabolic și
de influența altor alimente în timpul consumului iar p entru o validare ulterioară a eficienței
sistemului de eli berare, testele in vivo sunt necesare pentru a identifica locul și profilul de
eliberare a componenților bioactivi, asimilarea, biodistribuția în țesut și răspunsurile
fiziologice. [100, 101]
Studiile in vitro și in vivo au fost efectuate pentru a investig a modul în care
încapsularea lipidelor afectează digestia. [102, 103]
Testele in vivo au arătat că biodisponibilitatea unui ingredient activ este dependentă
de tipul sistemului de încapsulare, de mărimea particulei și de structura alimentelor. [104]
Studii le clinice la om sunt necesare pentru a stabili eficiența in vivo a ingredientelor active
transportate cu diverse sisteme de eliberare și pentru a stabili dacă sistemul ce conține
ingredientul activ încapsulat furnizează beneficiul pentru sănătate final la populația țintă.
[105]
Pentru a preveni deteriorarea oxidativă au fost dezvoltate diferite s trategii cum ar fi
reducerea nivelului de oxigen, modificarea proprietăților interfaciale sau adăugând un chelator
de metal ar putea fi folosite pentru contro lul oxidării lipidelor în alimente le îmbogățite cu
omega 3. Cercetările au arătat că proteinele alimentare pot inhiba oxidarea în emulsiile
alimentare. [106, 107] O gamă largă de mecanisme sunt asociate cu proprietățile antioxidante
ale proteinelor incluzând i nactivarea de specii reactive, reducerea hidroperoxidarii,
îndepărtarea enzimatică a oxidanților și crearea unei bariere fizice între reactanți.
Antioxidanții sunt substanțele din alimente care sunt proiectate pentru a inhiba sau întârzia
oxidarea lipidelo r în acestea. Antioxidanții previn oxidarea lipidelor prin diferite mecanisme.
Depinzând de mecanismul lor de acțiune antioxidanții pot fi divizați în două categorii:
 antioxidanți i primari, lucrează prin acceptarea directă a radicalilor liberi pentru a -i
transforma în produse mai stabile (ex. Tocoferolii).

 antioxidanți secundari nu au capacitatea de a reacționa direct cu radicalii liberi și să -i
transforme în componenți mai stabili. În schimb, aceștia inhibă indirect oxidarea prin
mecanisme cum ar fi chela tarea metalelor de tranziție, regenerarea antioxidanților și oprirea
oxigenului. (ex.: EDTA si acidul citric). [108]
Majoritatea claselor de antioxidanți alimentari naturali includ carotenoizii,
componenții fenolici, acidul ascorbic, proteinele și derivate le lor, produșii de reacție Maillard,
fosfolipidele și sterolii .[109]
Cercetările recente au arătat, de asemenea, că polizaharidele sunt capabile de a inhiba
oxidarea emulsiei ulei în apă.
Din moment ce particulele de hidrogel cu componenți bioactivi înca psulați sunt
fabricate din polizaharide, ar putea fi posibil sa luăm ca un avantaj proprietățile naturale
antioxidante a acestor biopolimeri pentru a proteja lipidele bioactive. Integrarea picăturilor de
lipide emulsionate în interiorul unei particule de h idrogel pe bază de polizaharide ar fi o cale
de a crea un mediu care, teoretic, ar inhiba oxidarea lipidelor.
1.3.2 Curcumina: structură, proprietăți, aplicații.
Cercet ările științifice au confirmat efectele farmacologice ale curcuminei și au stabilit
capacitatea sa de a acționa în prevenția și tratarea unor boli cronice. [110-114]
Curcumina a fost prima dată izolată din turmeric în 1815, dar până în 1970 există
puține rapoarte care prezintă structura sa chimică, sinteza și activitatea sa chimică și
biochim ică. [115,116 ] După raportul cercetărilor efectuate de Aggarwal și colab. în 1990 în
potențialul său efect anticancer, ritmul cercetărilor asupra curcuminei a început să crească
rapid. [117]
În timp ce majoritatea cercetărilor au urmărit aspectele biologi ce, doar câțiva
cercetători au fost interesați de înțelegerea importanței structurii chimice a curcuminei pe
lângă activitatea biologică.
În chimia organică extragerea și sinteza curcuminei și a noilor derivați sintetici a fost
principalul scop al cercetă rilor. Chimia anorganică a utilizat abilitatea sa de chelator metalic
prin gruparea α, β -diceto pentru a forma noi entități structurale cu modificarea activității
biochimice. Fizico -chimia s -a concentrat pe proprietățile foarte sensibile spectroscopice ale
curcuminei pentru a studia interacțiunile sale cu structurile microeterogene și biomolecule.
Chimia analitică a fost implicată în proprietățile sale unice spectroscopice de absorbție pentru
a identifica și estima urmele de elemente .[118 ] Alte studii chim ice folositoare în întelegerea
activității biologice a curcuminei sunt reactivitatea sa chimică cu specii reactive de oxigen,
reacții de adiție, reacții de degradare și formarea nanoconjugatelor și a formulării lor.

Curcuma Longa (turmeric) este cultivat î n regiunile tropicale și subtropicale. Cea
mai mare producătoare de turmeric este India, unde a fost utilizat de foarte mult timp ca
remediu în casă pentru câteva afecțiuni . [110-113]
Depinzând de originea sa și de condițiile solului unde a crescut, turmer ic conține
între 2 -9 % curcuminoizi. Cuvântul „curcuminoid” indică un grup de compuși cum ar fi
curcumina, demetoxicurcumina, bis -demetoxicurcumina și curcumina ciclică. Dintre acestea
curcumina este componentul major iar curcumina ciclică este componentul minor.
Separarea curcuminei
Cu toate că extracția și separarea curcuminei din pudră de turmeric a fost raportată
încă din 1815, metode îmbunătățite și avansate de extracție sunt încă raportate chiar și după
două secole .[119-127]
Extracția cu solvent ur mată de cromatografia pe coloană au fost metodele cele mai
întâlnite raportate pentru separarea curcuminei din turmeric; aceasta implică o serie de
solvenți organici polari și nepolari incluzând hexan, etilacetat, acetonă, metanol, etc. Dintre
toți solvenț ii organici etanolul este preferat pentru extracția curcuminei. Pe de altă parte,
extracția curcuminei cu solvenți clorurați este foarte eficientă, dar industria alimen tară nu
acceptă utilizarea lor. Cele mai eficiente metode de extracție identificate au f ost extracțiile
Soxhlet, cu ultrasunete și cu microunde [119-124].
Metodele de extracție cu ultrasunete și microunde au fost raportate a fi mai bune
decât metodele continui. [122] Crescând temperatura de la 60˚ la 80˚C a fost dovedită o
îmbunătățire a extr acției. [123]
Odată cu creșterea utilizării sale în suplimente alimentare, cercetătorii au dezvoltat
metode de extracție care implică solvenți utilizați în industria alimentară cum ar fi
triglicerolii, pentru a obține un randament mai bun. [125] O altă me todă comercială viabilă și
eficientă de utilizare a extracției este folosirea CO 2 supercritic . [126, 127 ] Condițiile normale
de operare sunt: presiune 25 -30 Mpa și temperatură de 318 K.
Există puține rapoarte privind extracția curcuminei pe bază de enzime . Procedeul
presupune un pretratament al turmericului cu enzime cum ar fi α -amilază și glucoamilază iar
randamentul în curcumină obținut este foarte bun. Oricum, datorită costului această metodă
nu este viabilă. [128]
Curcumina poate fi separată din amest ecul de curcuminoizi (un amestec de
curcumină, demetoxicurcumină și bis -demetoxicurcumină) prin cromatografie pe coloană ,
prin adsorbția amestecului pe gel de silice utilizând un amestec de solvenți cum ar fi
diclormetan/acid acetic sau metanol/cloroform p entru a obține trei fracții diferite. Fracția de

curcumină este purificată în continuare pe gel de silice utilizând un amestec de solvenți
obținut din cloroform /diclormetan și etanol/metanol. [112,113, 129 -132]
Metodele de detectare și estimare a curcumin ei au fost implicate în tehnica
cromatografiei lichidă de înaltă performanță (HPLC). În general, ca fază mobilă s -a utilizat
amestec acetonitril /apă sau cloroform/metano l. Detectarea curcuminei se face la lungimi de
undă cuprinse între 350 -450 nm sau în re giunea UV între 250 -270 nm. [129-132]
Cromatografia lichidă cuplată cu spectrometria de masă este o altă metodă pentru a
detecta curcumina. Metoda cu cea mai mare sensibilitate curcumina (până la 1 ng/ml) este
prin fluor escență în regiunea 400 -450 nm. La un secol după izolarea din turmeric, prima
lucrare privind sinteza curcuminei a fost raportată de Lampe în 1913 .[133] Metoda implică 5
etape începând cu clorura de carboximetil feruloil și acetoacetil etil. Mai târziu Pabon (1964).
[134] a raportat o metod ă simplă de sinteză cu randamente mai mari utilizând acetil acetonă și
a substituit aldehidele aromatice în prezența trioxidului de bor, trialchil borat și n -butil amină;
metoda a fost adoptată de câteva grupe de cercetatori pentru toate sintezele ulterioa re ale
curcuminei. [112, 113, 134 -136]
A fost propusă utilizarea trifluoroboratului pentru a produce curcuminoizi
trifluoroborați care pot fi hidrolizați într-o soluție de metanol la pH 5,8 pentru a obține
curcumină. În toate aceste metode etapa primară est e la 2,4 dicetone cu un substituent de
aldehidă aromatică. Pentru a preveni participarea dicetonelor la condensarea Knoevenagel se
efectuează complexarea cu bor. Condițiile anhidre și solvenții aprotici polari unde curcumina
poate fi separată cu ușurință d in amestecul de reacție, sunt potrivite pentru aceste reacții.
Aminele primare și secundare sunt utilizate ca și catalizatori pentru a furniza bazicitatea
necesară pentru a deprotona grupele alchil din dicetone. Pentru a îndepărta apa din timpul
reacției d e condensare sunt implicați receptorii de alchil borat. Dacă nu este îndepărtată, apa
produsă prin reacția de condensare poate reacționa cu complexul dicetonic, în acest mod
reducând randamentul în curcumina. Complexul de bor disociază și eliberează curcum ina în
condiții slab acide. Curcumina din acest amestec de reacție poate fi separat prin spălări și
precipitări repetate, urmată de cromatografia pe coloană . [137]
2.2.1.2. Caracteristici strucurale ale curcuminei
Curcumina este o moleculă simetrică, cuno scută sub denumirea de diferuloil metan.
Termenul IUPAC al curcuminei este (1E, 6E) -1,7-bis-(4-hidroxi -3-metoxi fenil) -1,6-
heptadienă -3,5 dionă, având formula chimică C 21H20O6 și masa moleculară 368,38. Conține
trei entități ciclice în structura sa: două s isteme ciclice aromatice conținând grupe fenolice o –
metoxi, conectate printr -un element de legătură la C7 constând dintr -o grupare nesaturată α,β –

dicetonă. Gruparea diceto prezintă tautomerie ceto -enol, care poate exista în diferite tipuri de
conformeri, î n funcție de mediu. [138]
În majoritatea solvenților nepolari și moderat polari forma enol este în general mai
stabilă decât forma ceto cu 5 până la 8 kcal/mol, în funcție de natura solventului.
Datorită conjugării extinse, norul de electroni π este deloc alizat de -a lungul
moleculei. În soluție curcumina manifestă izomerie cis-trans. Valoarea momentului de dipol
este de 10.77 D.
Este aproape insolubilă în apă și ușor solubilă în solvenți polari cum ar fi DMSO,
metanol, etanol, acetonitril, cloroform, aceta t de etil, etc. Este greu solubilă în solvenți
hidrocarbonați cum ar fi ciclohexan și hexan. Curcumina este un acid slab Bronsted cu 3
protoni labili și în consecință 3 pKa -uri corespunzând la trei echilibre prototropice
Reactivitatea chimică și solubilita tea crește la pH bazic.
Soluțiile de curcumină pot fi preparate prin adăugarea surfactanților, lipidelor,
albuminei, ciclodextrinelor, biopolimerilor, etc. Soluțiile micelare care utilizează surfactanți
sunt mai potrivite în prepararea soluțiilor apoase d e curcumină la o concentrație ridicată.
Cu toate acestea în timp ce se utilizează soluții apoase cu surfactanți în sisteme biologice, este
necesară o grijă suplimentară la efectuarea experimentelor, deoarece surfactanții pot interfera
în studiile biologic e. [137, 138 ]
2.2.1.3. Reactivitatea curcuminei
Curcumina are 3 grupe funcționale reactive: o grupare dic etonă și două grupări
fenolice. Reacții chimice importante asociate cu activitatea biologică a curcuminei sunt
reacțiile de cedare a hidrogenului care conduc la oxidarea curcuminei, adiție reversibilă sau
ireversibilă (reacții Michael), hidroliza, degradarea și reacții enzimatice.
a) Reacții cu specii reactive de oxigen
Curcumina s -a dovedit a fi un sistem de eliminare excelent al speciilor reactive de
oxigen, o proprietate care îi conferă activitate antioxidantă în celulele normale. Speciile
reactive de oxigen sunt formate din ambii radicali liberi oxidanți și oxidanți moleculari. [138-
145] Toate cele trei locuri active ale curcuminei pot fi supuse oxidării prin transferul de
electroni și captarea oxigenului. Investigații detaliate au confirmat că în timpul reacțiilor cu
radicali liberi cel mai usor se detașează hidrogenul de la gruparea fenol cu formarea
radicalilor fenoxil, care sunt stabilizați prin rezona nță de -a lungul structurii ceto -enol.
Ca exemplu reacția radicalilor peroxil cu curcumina produce radicali fenoxil care
sunt mai puțin reactivi decât radicalii peroxil și prin aceasta comportare determină o protecție
față de speciile reactive de oxigen . [139, 142, 146]

Reacțiile sunt reversibile iar compusul poate reveni la structura chimică inițială, a
curcuminei, prin intermediul antioxidanților solubili în apă cum ar fi acidul ascorbic. [142]
În rapoartele de literatură sunt menționate reacțiile de elimi nare ale altor radicali
liberi ale speciilor reactive de oxigen cum ar fi radicalii hidroxil, radicalii superoxid, și
radicalii alcoxi de către curcumină .[140-143]
Dintre oxidanții moleculari, reacțiile cu peroxinitril, peroxid de hidrogen sunt cele
mai co mune. În multe modele biologice, curcumina a fost găsită a proteja celulele în condiții
în care există o producere excesivă a acestor oxidanți moleculari.
Există puține rapoarte în literatura de specialitate privind reacția directă a curcuminei
cu peroxin itril. [147] Constantele de viteză și concentrațiile de inhibare a curcuminei pentru a
preveni formarea de nitrotirozină indică faptul că curcumina este un antioxidant puternic
împotriva stresului oxidativ .[137]
b) Degradarea chimică și metabolism
Curcumina s uferă o degradare chimică în soluții apoase -organice și degradarea crește
cu creșterea pH -ului, ceea ce reprezintă o problem ă serioasă în aplicațiile sale. [115, 138, 148 –
151] Degradarea curcum inei au loc prin gruparea nesaturată α, β -diceto. Degradarea es te mai
puțin intensă în soluții concentrate, produții rezultați fiind 6 -trans -(4’hidroxi -3’-metoxifenil) –
2,4-dioxo -5 hexanal, aldehida felurică, feruloil metan și vanilină.
Deși nu este pe deplin înțeleasă se crede că degradarea se efectuează prin intermed iul
fragmentului diceto. Cu toate acestea, degradarea este redusă în mod semnificativ atunci când
curcumina este atașată la lipide: lipozomi, albumină, ciclodextrină, curcubituril, surfactanți,
polimeri și alte macromoleculare și microeterogene . [137, 138 ] Astfel s -a dovedit a fi de mare
folos faptul că soluții stabile de curcumină ar putea fi preparate într -un mediu de cultură ce
conține 10 % ser fetal bovin, precum și sânge uman.
Curcumina suferă o degradare mult mai rapidă atunci când este expusă la lumi na
soarelui. [137, 138, 152 ] Produsele identificate în timpul fotodegradării curcuminei sunt:
vanilina, acidul feluric și alți fenoli mai mici indicând o distribuție a produșilor de degradare
fotochimică similară cu degradarea chimică în soluție. Unele rap oarte indică faptul că
curcumina generează oxigen singlet și alte specii reactive de oxigen în momentul
fotodegradării reponsabile pentru activitatea fotobiologică și fotodinamică a curcuminei.
[153] Fotodegradarea este accelerată în prezența nanoparticule lor de TiO 2, iar această metodă
poate fi utilizată pentru a îndepărta petele de turmeric din țesuturile de bumbac. [154]
Metabolizarea curcuminei la șobolani și oameni produce diferite produse. Două căi
biologice majore au fost identificate pentru metaboli zarea curcuminei cum ar fi cea de

conjugare cu oxigen și de reducere. Produșii de conjugare cu oxigen sunt glucuronid
curcumina și sulfat de curcumină iar cei de reducere sunt tetrahidrocurcumin ,
hexahidrocurcumin și octahidrocurcumin. Alți produși pot fi: dihidrocurcumin glucuronid,
tetrahidrocurcumin glucuronid, acid ferulic și acid dihidroferulic.
Deși s -a raportat că procesele au loc pe cale enzimatică, enzimele implicate în toate
aceste produse de reacție specifice s unt încă un subiect de dezbatere. [114, 115 ]
Reacțiile enzimatice specifice sunt probabil, mult mai rapide și nu permit degradarea
hidrolitică lentă, prin urmare, procesul hidrolitic nu poate concura cu reacțiile enzimatice.
c) Reacții de adiție nucleofilă a curcuminei
Gruparea nesaturată α, β -diceto din curcumină participă la reacția de adiție
nucleofilă. Aceste reacții, cunoscute ca adiții Michael au loc între cetone nesaturate ca și
acceptori și anioni d e –OH, -SH, -SeH ca și donori. Această reacție a fost raportată de a fi
extrem de folosit oare pentru a explica chimia și activitatea biologică a curcuminei în celulele
vii. [112, 114, 115, 155 -158]
Un interes deosebit a primit reacția tiolilor biologici, cum ar fi glutation ce conține
grupări –SH. [155, 156 ] Sistemele cu conjugate curcumină -glutation au fost izolate din
diferite sisteme biologice. Formarea acestui produs de adiție ar conduce la epuizarea
nivelurilor de glutation în celule, conducând astfel la reducerea apărării antioxidante. Cu toate
că unele rapoarte sugerează că acestă reacți e este reversibilă, teoria nu este încă confirmată
încă în celulele vii.
O reacție similară a fost observată în timpul inhibării tioredoxin reductazei, de către
curcumină. [157] Centrul activ al ace stei enzime este selenocisteina . Selenol din selenocistein ă
fiind puternic nucleofil la pH fiziologic este supus ușor reacției de adiție 1,4 cu curcumina,
formând diferite specii legate covalent. Se speculează că această reacție este responsabilă
pentru inhibarea enzimei tioredoxin reductaza de către curcumină.
Hidrogenul metilenic al fragmentului diceto/enol a curcuminei poate acționa ca și un
nucleofil și să participe la reacții de adiție Michael cu electrofilie puternică, dar aceste reacții
nu pot avea o semnificație în sisteme biologice. [159] Derivații de cur cumină obținuți prin
modificare chimică au fost preparați prin reacții de condensare și adiție, cum ar fi, de
exemplu, derivații de semicarbazonă și derivații oximă ai curcuminei. [160, 161 ] Aceste
produse stabile, preparate independent au fost examinate p entru activitatea anticancer. În cele
mai multe dintre aceste studii s -a raportat că acești derivați sunt mai citotoxici pentru celulele
canceroase decât curcumina liberă.

2.2.1.4. Chimia interacțiunilor ionilor metalici în curcumină
Curcumina formează c omplecși puternici cu majoritatea ionilor metalici cunoscuți.
Gruparea nesaturată α, β -diceto a curcuminei este un agent de chelare excelent .
Curcumina este considerat un ligand monobazic bidentat și formează comple cși
stabili cu aproape toate metalele și non-metalele, obținându -se tructuri stabile la un raport
stoechiometric curcumină: ion metalic de 2:1. Există foarte puține studii pentru raportul 3:1.
A fost raportat un complex octaedral cu Fe3+. [162]
Coordinarea curcuminei cu metalul are loc prin grupa rea enolică.
Există mai multe lucrări privind complecșii de curcumină cu metale tranziționale
cum ar fi Fe3+, Mn2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Cd2+, Ru3+, Re3+ și multe altele. Există complexe
cu metale netranziționale și ioni rari cum ar fi: Al3+, Ga3+, Sm3+, Eu3+, Dy3+, Y3+, Se2+ și oxizi
metalici cum ar fi VO 2+ au fost de asemenea sintetizate. Structura și proprietățile fizice ale
acestor complexe depind de natura ionului metalic precum și de stoechiometria condițiilor de
reacție care la rândul lor decid s tabilitatea și reactivitatea lor.
Complecșii metalici ai curcuminei nu modifică numai proprietățile fizice ale
curcuminei dar afectează și reactivitatea biologică a metalelor. În general s -a observat că
complexarea cu curcumină reduce toxicitatea metalelor și unele complexe de curcumină cu
metale cum ar fi Cu2+, Mn2+ acționează ca antioxidanți noi pe bază de metale. [163-170]
Datorită reacției reversibile de transfer de electroni cu ionul superoxid, complexele
de Cu2+ , Mn2+ ale curcuminei acționează ca și enzima ce mimează superoxid dismutaza.
Complecșii metalici ai curcuminei au o mare semnificație în ceea ce privește
patologia bolii Alzheimer, în cazul căreia s -a constatat că datorită naturii lipofile, curcumina
poate trece de bariera hemato -encefalică și ionii metalici chelați sunt toxici pentru neuroni. S –
a observat, de asemenea, că incidența bolii Alzheimer este redusă în mod semnificativ în
rândul persoanelor care sunt cunoscute a consuma în mod frecvent curcumină.
Curcumina formează complexe stabile cu toate metalele implicate în boala
Alzheimer . [170-172]
Interacțiunea Al3+ cu curcumina, anterior considerată a fi responsabilă pentru apariția
bolii a fost studiată extensiv. Curcumina formează trei tipuri diferite de complexe cu Al3+, în
funcție de sto echiometria reacției. Raportul stoechiometric curcumină: Al3+ de 1:1 a prezentat
o afinitate mai mică la legarea ADN -ului decât Al3+ liber, care a fost atribuită abilității sale de
reducere a incidenței bolii Alzheimer. [171, 172 ]
Au fost raportate numeroa se alte aplicații ale complecșilor metalici cu curcumina.
Complexele de Ga3+ cu curcumină au fost concepute pentru materiale bioceramice

inovative. [173] Complexul de curcumină cu zinc a prezentat efecte anticancer,
gastroprotective și antidepresive la șobo lani. [174,175] Complexele de curcumină cu aur au
arătat o activitate antiartritică la testele in vivo .[176] Complexele vanadil -curcumină au
prezentat activitate antioxidantă și antireumatică. [177] Prin formarea complecșilor metalici
cu curcumină se reduc e toxicitatea metalelor grele cum ar fi Hg2+, Cd2+, Pb2+ unde stresul
oxidativ indus de metalele grele este redus semnificativ prin formarea complexului. [178-182]
Datori tă sarcinii pozitive complecși i metalici ai curcuminei se pot leaga de ADN .
[174, 183 ] Unele rapoarte afirmă faptul că aceștia induc deteriorarea ADN -ului și prin urmare
prezintă un efect pro -oxidant. Ca urmare, ei sunt explorați ca agenți antitumorali mai buni
decât curcumina în sine. [184, 185 ]
Evaluarea biologică a acestor complecși est e mai dificil de efectuat în sistemele in
vivo, deoarece biodisponibilitatea lor este foarte scăzută iar experimentele sunt dificil de
efectuat datorită solubilității scăzute în solvenți organici cum sunt DMSO sau în fluidele
biologice. Cu toate acestea fă ră nici o îndoială această complexare in vivo a curcuminei cu
metalele joacă un rol semnificativ în reducerea toxicității induse de metale.
Curcumina poate complexa cu diferiți liganzi.
Complecșii cu punți de porfirină cu Cu2+, Ni2+ și Zn2+ prezintă o îmb unătățire a
activității fotodinamice în modele de ADN plasmidic. [186]
Complecșii cu 4,4 bipiridină și Zn2+sunt mai eficienți decât curcumina pentru a
distruge celulele de neuroblastom. Cei cu terpiridin lantanida (La3+) au arătat o creștere în
fototoxicit ate în celulele HeLa. [187]
Compl ecșii de bipirdin -curcumină cu Pd2+ inhibă formarea celulelor canceroase de
prostată. [184]
2.2.1.5. Studii farmacologice efectuate pe curcumina
Insolubilitatea în apă și biodisponibilitatea scăzută a curcuminei în celule au
determinat pe cercetători să dezvolte noi formulări pe bază de substanțe organice
biocompatibile: lipozomi, biopolimeri, hidrogeluri. [188-190] Pentru a crește
biodisponibilitatea și a obține o circulație mai eficientă, o permeabilitate mai bună și
rezistență la procesele metabolice au fost preparate mai multe formulări ce includ
nanoparticule, lipozomi, micele și complexe fosfolipidice. Studiile farmacologice relevă
faptul că curcumina este sigură și eficientă ceea ce a determinat să fie utilizată în tratamentul
și prevenirea unei game largi de boli umane. Cu toate acestea, datele acumulate au arătat că
curcumina are o biodisponibilitate relativ scăzută și o slabă solubilitate în soluții apoase.

Pentru prima dată Wahlstrom și Blennow (1978) au raportat faptul că după
administrarea orală a 1 g curcumină/kg la șobolani concentrațiile de curcumină care s -au găsit
în plasmă au fost neglijabile, fapt care se poate datora slabei absorbții din intestin. [191] Într-
un studiu în care curcumina a fost administrat ă oral la o doză de 2 g/kg la șobolani, o
concentrație serică maximă de 1,35
μg/ml a fost observată la un interval de timp de 83
h, în timp ce la oameni la aceeași doză, cantitatea de curcumină este nedectabilă sau foarte
redusă în concentrații le serice (0,006
). [192]
Un alt studiu efectuat pe șobolani a arătat că administrarea per os a curcuminei 500
mg/kg a condus la o biodisponibilitate de 1% în plasmă a fost observat faptul că administrarea
orală a curcuminei 1000 mg/kg la șobol ani a prezentat o concentrație plasmatică de 15 ng/ml
după 50 min. [193] Spre deosebire de administrarea la rozătoare, administrarea a 4 -8 g de
curcumină la om au arătat nivele plasmatice maxime de 0,41 -1,75 μM după o ora de la
administrare. [194]
Într-un alt studiu efectuat pe voluntari umani sănătoși, 3,6 g curcumină administrată
oral a fost regăsită la nivel plasmatic într -o concentrație de 11,1 μmol/l, după o oră de la
administrare .[195] S-a constatat că 10 mg /kg curcumină administrată intravenos la șob olani a
atins nivelul seric maxim în curcumină de 0,36 μg/ml, în timp ce o doză de 50 de ori mai mare
administrată pe cale orală a dat o concentrație doar de 0,06
0,01 μg/ml în nivelele serice ale
sobolanilor. [196] Sun și colab. au arătat că a dministrarea intravenoasă a curcuminei libere la
șobolani prezintă o mai bună biodisponibilate in plasma sangvina. Concentrația a fost de 6,6
μg/ml în sânge cand s -au administrat 2 mg/kg curcumină intravenos. [197]
Aceste studii sugerează rolul rutei de a dministrare pentru atingerea nivelelor serice
ale curcuminei și, de asemenea, comparația între nivelele serice la rozătoare și oameni.
Bibliografie :
1. Bro, C., Regenberg, B., Förster, J., Nielsen, J., 2006. In silico aided metabolic engineering of Sacchar omyces
cerevisiae for improved bioethanol production. Metabolic Engineering. 8, 102 -111.;
2. Cardona, C.A., Sánchez, Ó., 2007. Fuel ethanol production: Process design trends and integration
opportunities. Bioresource Technology. 98, 2415 -2457;
3. Chu, B. C.H., Lee, H., 2007. Genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae for xylose fermentation.
Biotechnology Advances. 25(5), 425 -441.
4. Bronn,W.K., The technology of yeast production -Baker’s yeast –Technical University, Berlin (1984/85) Moo –
Young.M, Compr ehensive Biotechnology ,Pergamon Press Vol 4 -5,1985, 235 -247, 430 -461
5. Dobbs , A.J., Peleg , M., Mudgett , R.E., 1982. Some physical characteristics of active dry yeast . Powder
Technol . 32, 1 63-169, http://dx.doi.org/10 .1016/0032 -5910(82)85007 -9.,
6. Reed, G., Nagodawithana, T. W., 1991.in: Reed, G., (Ed.), Yeast Technology. Springer, Netherlands, pp.
261-314, http://dx.doi.org/10.1007/978 -94-011-9771 -7_7
7. Potthoff, E., Guillaume -Gentil, O., Ossola, D., Polesel -Maris, J., LeibundGut -Landmann, S., Zambelli, T.,
Vorholt, J. A., 2012. Rapid and serial quantification of adhesion forces of yeast and mammalian cells. PLoS
One. 7, 0052712, http://doi.org/10.1371/journal.pone.0052712 .

8. Randez -Gil, F., Córcoles -Sáez, I., Prieto, J.A., 2013. Genetic and phenotypic characteristics of baker's yeast:
relevance to baking. Annu Rev Food Sci Technol. 4, 191 -214, http://dx.doi.org/10.1146/annurev -food-
030212 -182609 .
9. Klis, F. M., de Koster, C. G., Brul, S., 2014. Cell Wall -Related Bionumbers and Bioestimates of
Saccharomyces cerevisiae and Can dida albicans. Eukaryotic Cell. 13, 2 –9, http://doi.org/10.1128/EC.00250 –
13.
10. Lange,H.C., Heijnen,J.J., “Statistical reconciliation of the elemental and molecular biomass composition of
Saccharomyces ce revisiae”, Biotechnology and Bioengineering, Vol.75 No.3,November 5 (2001), 334 -344
11. Youatt, J., Calcium and microorganisms, Critical Reviews in Microbiology , 1993, 19, 83 -97,
12. Walker, G.M., The roles of magnesium in biotechnology, Critical Reviews in Biotechnology, 1994, 14, 311 –
354.
13. Jones, R.P. and Gadd, G.M., Ionic nutrition of yeast – physiological mechanisms involved and implications
for biotechnology, Enzyme and Microbial Technology , 1990, 12, 133 -140.
14. Gibson RB (2011). Improvement of h igher gravity brewery fermentation via wort enrichment and
supplementation. J. Inst. Brew. 117(3):268 -284,
15. Rautio JJ, Huuskonen A, Vuokko H, VidgrenV, Londesborough J (2007) Monitoring yeast physiology
during very high gravity wort fermentations by fr equent analysis of gene expression. Yeast. 24:741 -760.
16. Ding J, Huang X, Zhang L, Zhao N, Yang D, Zhang K (2009). Tolerance and stress response to ethanol in
the yeast Saccharomyces cerevisiae . Appl. Microbiol. Biotechnol . 85:253 -263,
17. Zhao XQ, Bai FW (2009). Review:Mechanisms of yeast stress tolerance and its manipulation for efficient
ethanol production. J. Biotechnol. 144:23 – 30.
18. Briggs DE, Boulton CA, Brookes PA, Stevens R (2004). Brewing Science and Practice. Woodhead,
Cambridge, UK, pp. 41 0-439.
19. C. Boulton, D. Quain , Brewing yeast and fermentation . Blackwell, Oxford. New York, 2001, M.K. Somda,
A. Savadogo, B. Nicolas, T. Philippe, T.A. Sabadenedyo, Effect of mineral salts in fermentation process
using mango residues as carbon sources for bioethanol production, Asian J. Ind. Engr.,. vol. 3, pp. 29 -38,
June 2011.
20. F.Q. Wang, C.J. Gao, C.Y. Yang, P. Xu, Optimization of an ethanol production medium in very high gravity
fermentation, Biotechnol. Lett., vol. 29, pp. 233 -236, Feb. 2007.
21. R.B. Gibson, Improvement of higher gravity brewery fermentation via Wort enrichment and
Supplementation, J Inst. Brew., vol. 117, no 3, pp. 268 -284, May 2011
22. G.M. Walker, R. De Nicola, S. Anthony, R. Learmonth, Yeast -metal interactions: impact on br ewing and
distilling fermentations , In: Inst. Brew. Dist., Asia Pac. Sec. Conv . 2006, pp. 19 -24.
23. P. Aleksander, A. Piotr, M. Makarewicz, Accumulation and release of metal ions by brewer’s yeast during
successive fermentations, J Inst Brew . vol. 115, n o 1, pp. 78 -83, Feb. 2009.
24. N.P. Pisat, A. Pandey, C.W. MacDiarmid, MNR2 Regulates Intracellular Magnesium Storage in
Saccharomyces cerevisiae . Gene. Soc. Am ., vol. 183, pp. 873 -884, Nov. 2009.
25. R. De Nicola, N. Hall, S.G. Melville, G.M. Walker, Inf luence of zinc on distiller’s yeast: cellular
accumulation of zinc and impact on spirit congeners, J Inst. Brew., vol. 115, no 3, pp. 265 -271, Sept. 2009.
26. D.J. Eide, Zinc transporters and the cellular trafficking of zinc, Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1763, pp.
711-722, April 2006.
27. R.M. Birch, G.M Walker, Influence of magnesium ions on heat shock and ethanol stress responses of
Saccharomyces cerevisiae, Enzy. Microbiol. Technol., vol. 26, pp. 678 -687, June 2000.
28. H. O. Udeh, T. E. Kgatla, A. I. O. Jideani, Effect of Mineral Ion Addition on Yeast Performance during Very
High Gravity Wort Fermentation, International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and
Biotechnological Engineering Vol:8, No:11, 2014

29. Elin RJ (1994). Magnesium:the fifth but forgotten electrolyte. Am. J. Clin . Pat. 102:616 -622.
30. Hartwig A (2001). Role of magnesium in genomic stability. Mut. Res . 475:113 -121.
31. Udeh, H.O., Kgatla, T.E., 2013. Role of magnesium ions on yeast performance during very h igh gravity
fermentation. J. Brew. Distilling. 4, 19 -45, http://dx.doi.org/10.5897/jbd2013.0041 .
32. Walker GM (2004). Metals in yeast fermentation processes.Adv. Appl. Microbiol . 54:197 -230.

33. Bose, J., Babourina, O., Rengel, Z., 2011. Role of magnesium in alleviation of aluminium toxicity in plants.
J. Exp. Bot. 62, 2251 -2264, http://dx.doi.org/10.1093/jxb/erq456 .
34. Blazejack S, Duszkiewicz -Rein hard W, Gniewosz M, Wiatrzyk P (2008). Impact ofmagnesium and mannose
in the cultivation media on the magnesium biosorption, the biomass yield and on the cell wall structure of
Candida utilis yeast. Eur. Food Res. Tech. 227:695 -700.
35. Klis, F. M., de Kos ter, C. G., Brul, S., 2014. Cell Wall -Related Bionumbers and Bioestimates of
Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans . Eukaryotic Cell. 13, 2 –9, http://doi.org/10.1128/EC.00250 –
13.
36. Park JK, Lee JW , Jung JY (2003). Cadmium uptake capacity of two strains of Saccharomyces cerevisiae
cells. Enz. Microb. Tech . 33:371 -378.
37. Pisat NP, Pandey A, MacDiarmid CW (2009). MNR2 Regulates Intracellular Magnesium Storage in
Saccharomyces cerevisiae. Gene. Soc. Am. 183:873 -884.
38. Gniewosz M, Duszkiewicz -Reinhard W, Blazejack S, Sobiecka J, Zarzecka M (2007). Investigations into
magnesium biosorption by waste brewery yeast Saccharomycesuvarum . Acta Sci. Pol.Technol. Aliment.
6(1):57 -67.
39. Blackwell KJ, Singlet on I, Tobin JM (1995). Metal cation uptake by yeast:a review. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 43:579 -584.
40. Avery SV, Tobin JM (1992). Mechanism of strontium uptake by laboratory and brewingstrains of
Saccharomyces cerevisiae . Appl. Environ. Microbiol . 58:3883-3889.
41. Graschopf AJA, Stadler MK, Eder HS, Sieghardt M (2001). The yeast plasma membrane protein Alr1
controls Mg2+ homeostasis and is subject to Mg2+ -dependent control of its synthesis and degradation. J.
Biol. Chem. 276:16216 -16222.
42. Maynard A L (1993). The influence of magnesium ions on the growth and metabolism of Saccharomyces
cerevisiae. Thesis, Dundee Institute of Technology, Dundee, UK.
43. Maede T, Wurdler -Murphy SM, Saito H (2004). Metabolism of wort by yeast. In: Brewing Science and
Practice Briggs DE, Boulton CA, Brookes PA, Stevens R (2004). Woodhead Cambridge, UK, pp. 410.
44. Walker GM (1998). Magnesium as a stress protectant for industrial strains of Saccharomyces cerevisiae. J.
Am. Soc. Brew. Chem. 56:109 -113.
45. Hu CK, Bai FW, An LJ (2003). Enhancing ethanol tolerance of a self -flocculating fusantof
Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae by Mg2+ via reduction in plasma membrane
permeability.Biotechnol. Lett. 25:1191 -1194.
46. Trofimova Y, Walker GM, Rapoport A (201 0). Anhydrobiosis in yeast:influence of calcium and magnesium
ions on yeast resistance to dehydration -rehydration. FEMS. 308:55 -47. Levine BS, Coburn JW (1984).
Magnesium the mimic/antagonistic of calcium. Natl. Eng. J. Med . 310:1253 -1254.
48. Rees EMR, St ewart GG (1999). Effects of Magnesium, Calcium and Wort oxygenation on the fermentative
Performance of Ale and Lager Strains Fermenting Normal and High Gravity wort. J. Inst. Brew . 105(4):211 –
217.
49. Slininger PJ, Dien BS, Gorsich SW, Liu ZL (2006). Nitro gen source and mineral optimization enhance D –
xylose conversion to ethanol by the yeast Pitchia stipites NRRL Y -7124.Appl. Microbiol.
Biotechnol.72:1285 -1296.
50. Villen RA, Borzani W, Netto AS (2009). Influence of the accumulation of phosphate and magnesi um ions
the yeast cells on the ethanol productivity in batch ethanol fermentation. Brazil Arch. Biol. Technol.
52(1):153 -155.
51. Densky, H., Gray, P.J. and Buday, A., Further studies on the determination of zinc and its effects on various
yeasts, Proceedi ngs of the American Society of Brewing Chemists , 1966, 93 -94.
52. Learmonth R. P. and Gratton E., Assessment of membrane fluidity in individual yeast cells by Laurdan
Generalised Polarisation and Multi -photon Scanning Fluorescence Microscopy, In: Fluoresce nce
Spectroscopy, Imaging and Probes – New Tools in Chemical, Physical and Life Sciences, Springer Series on
Fluorescence: Methods and Applications, Springer, Heidelberg, 2002, (2), pp. 241 -252.
53. Stewart, G.G. and Russell, I., An Introduction to Brewing Scie nce and Technology. Series III. Brewer’s
Yeast. The Institute of Brewing, London. 1998. G.G. and Russell, I., An Introduction to Brewing Science and
Technology. Series III. Brewer’s Yeast. The Institute of Brewing, London. 1998.

54. Nicola, R.D., et al., Influ ence of zinc on distillers's yeast: cellular accumulation of zinc and impact on spirit
congeners. J. Inst. Brew., 2009. 115(3) : p. 265 -271.
55. Vidgren, V. and J. Londesborough, 125th Anniversary Review: Yeast Flocculation and Sedimentation in
Brewing. J. Inst . Brew., 2011. 117(4) : p. 475 -487.
56. Yu-Lai Jina and R. Alex Speersb, Flocculation of Saccharomyces cerevisiae, Food Research International,
Vol. 31, No. 6±7, pp. 421±440, 1998
57. Stehlik -Tomas, V., et al., Zinc, Copper and Manganese Enrichment in Yeast Sacchar omyces cerevisae. Food
Technol. Biotechnol., 2004. 42(2) : p. 115 -120.
58. Zufall, C. and T. Tyrell, The Influence of Heavy Metal Ions on Beer Flavour Stability. J. Inst. Brew, 2012.
114(2) : p. 134 -142.
59. Minoo Shakoury -Elizeh, John Tiedeman, Jared Rashford, Trac ey Ferea, Janos Demeter, Emily Garcia, Ronda
Rolfes, Patrick O. Brown, David Botstein and Caroline C. Philpott, Transcriptional Remodeling in Response
to Iron Deprivation in Saccharomyces cerevisiae, Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 1233 –1243, March
2004
60. Fernanda Gaensly, Geraldo Picheth, Debora Brand, Tania M.B. Bonfim, The uptake of different iron salts by
the yeast Saccharomyces cerevisiae, Braz J Microbiol. 2014; 45(2): 491 –494. Published online 2014 Aug 29.
61. Carlos Andrés Martínez -Garay, Rosa de Llanos, Antonia María Romero, María Teresa Martínez -Pastor,
Sergi Puig, Responses of Saccharomyces cerevisiae Strains from Different Origins to Elevated Iron
Concentrations, Appl Environ Microbiol. 2016 Mar 15; 82(6): 1906 –1916. Prepublished online 2016 Ja n 15.
Published online 2016 Mar 7. doi: 10.1128/AEM.03464 -15
62. Gray, K.A., Zhao, L., Emptage, M., 2006. Bioethanol. Current Opinion in Chemical
Biology. 10, 141 -146.
63. G. N. Vemuri, M. A. Eiteman, J. E. McEwen, L. Olsson, and J. Nielsen, Increasing NADH oxidat ion reduces
overflow metabolism in Saccharomyces cerevisiae, 2402 –2407 PNAS February 13, 2007 vol. 104 no. 7
64. Wittmann, C., Hans, M., van Winden, W. A., Ras, C. and Heijnen, J. J. (2005), Dynamics of intracellular
metabolites of glycolysis and TCA cycl e during cell -cycle -related oscillation in Saccharomyces cerevisiae .
Biotechnol. Bioeng., 89: 839 –847. doi:10.1002/bit.20408
65. Krebs HA, Weitzman PDJ (1987). Krebs' citric acid cycle: half a century and still turning. London:
Biochemical Society. ISBN 0 -9044 98-22-0
66. Morton, J. S. 1980. Glycolysis and Alcoholic Fermentation. Acts & Facts. 9 (12)
http://www.icr.org/article/glycolysis -alcoholic -fermentation/
67. Schomburg I, Chang A, Placzek S, Söhngen C, Rother M, Lang M, Munaretto C, Ulas S, Stelzer M, Grote A,
Scheer M, Schomburg D (January 2013). "BRENDA in 2013: integrated reactions, kinetic data, enzyme
function data, improved disease classification: new options and contents in BRENDA" . Nuclei c Acids
Research. 41 (Database issue): D764 –72. doi:10.1093/nar/gks1049 . PMC 3531171 .PMID 23203881 .
68. Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000. The
Central Role of Enzymes as Biological Catalysts. Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9921/
69. I.F. Dumitriu, D. Iordănescu, Introducere în enzimologie, Ed. Medicală, București, 1981
70. N. Gheorghiță, A. Iacobovici, L. Jerca, I. Popovici,” Biochimie medicală – curs”, Universitatea de Medici nă și
Farmacie “ Gr. T. Popa”, Iași, 1996
71. P Tomme, NR Gilkes, RC Miller Jr, AJ Warren, DG Kilburn. Protein Eng.;7(1):117 –123, 1994
72. I.Chibata. Immobilized Enzymes, Research and Development. Halsted Press Book, New York, 298.1978,
AM Kilbanov, Analytical Bio chemistry, 93, pp. 1 -25.1979
73. Hong -Bin Shen , Kuo-Chen Chou , EzyPred: A top–down approach for predicting enzyme functional classes
and subclasses, Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 364, Issue 1, 7 December
2007, Pages 53–59
74. T Trzmiel , E Galas , M. Fortak..Acta Biotechnol,14, 205 -209,1994
75. Cunha AG & Gandini A. 2010. Cellulose 17(6):1045 -1065
76. Van der Maarel MJEC, van der Veen B, Uitdehaag JCM, Leemhuis H & Dijkhuizen L. 2002. J Biotechnol
94(2):137 -155.
77. Talja RA, Peura M, Serimaa R & Jouppila K. 2008. Biomacromolecules 9(2):658 -663.

78. Van der Maarel MJEC, van der Veen B , Uitdehaag JCM, Leemhuis H & Dijkhuizen L. 2002. J Biotechnol
94(2):137 -155
79. Crabb WD & Mitchinson C. 1997. Trends Biotechnol 15(9):349 -352.
80. Rani Gupta, Paresh Gigras, Harapriya Mohapatra, Vineet Kumar Goswami, Bhavna Chauhan, Microbial α –
amylases: a biote chnological perspective, Process Biochemistry
Volume 38, Issue 11 , 30 June 2003, Pages 1599 –1616
81. Kumar, S. and Satyanarayana, T. (2003), Purification and Kinetics of a Raw Starch -Hydrolyzing,
Thermostable, and Neutral Glucoamylase of the Thermophilic Mold Thermomuc or indicae -seudaticae .
Biotechnol Progress, 19: 936 –944. doi:10.1021/bp034012a
82. Santa -Maria MC, Chou CJ, Yencho GC, Haigler CH, Thompson WF, Kelly RM & Sosinski B. 2009.
Biotechnol Bioeng 104(5):947 -956.
83. Sundarram, A. , & Murthy, T. P. K. (2014). Journal of Applied & Environmental Microbiology, 2(4), 166 –
175.
84. Paula Monteiro de Souza; Pérola de Oliveira e Magalhães, Brazilian Journal of Microbiology 41: 850 -861,
2010
85. HK Bieselskl. Nutraceuticals: the link between nutrition and medicine. 2nd Edition. New York: Marcel
Deckker: 2001. Chapter 3 Nutraceuticals in health and disease prevention: p. 1 -26
86. M.A. Augustin and Y. Hemar, Chem. Soc. Rev ., 38, 902 -912, 2009
87. Henry, C. J. European Journal of Clinical Nutrition ,64 (7), 657 -659, 2010
88. F. Yangilar, J Food Nutr, Vol. 1, No. 3, 13 -23, 2013
89. M. De Vresee, J. Schrezenmeier, Adv Biochem Eng Biotechnol. ; 111:1 -66, 2008
90. R.H.Liu, Am. J. Clin. Nutr ., 5184 -5208, 2003
91. M. Y. Abeywardena , R. J. Head, , Cardiovasc Res , 52 :361 –371, 2001
92. RJ FitzGerald, BA Murray, DJ Walsh, , J Nutr , 134(4):980 -988, 2004
93. N. I. Krinsky, E. J. Johnson, Mol Aspects Med , Volume 26, Pages 459 –51, 2005
94. L.C. Tapsell , I. Hemphill, L. Cobiac, C.S. Patch, D.R. Sullivan,M. Fenech, S.Roodenrys ,J.B. Keogh, P.M.
Clifton, P.G. Williams ,V.A. Fazio, and K.E. Inge., Med J Aust . 185(4 Suppl): S4 -24, 2006
95. Henry, C. J. European Journal of Clinical Nutrition,64 (7), 657 -659, 2010
96. DJ McClements, EA Decker, and J. Weiss. J Food Sci ,72(8), R109 -R124, 2007
97. DB Genovese, JE Lozano, and MA Rao.. J Food Sci , 72(2), R11-R20, 2007
98. DJ McClements. Food Emulsions: Principles, Practice, and Techniques. (2nd ed ed.). Boca Raton: CRC
Press 2005.
99. Dj Mc Clements, E Decker,Y Park, and J Weiss. Food Biophysics, 3(2), 219 -228. 2008.
100. E Acosta, Testing the effectiveness of nutrient delivery systems . In Delivery and con trolled release of
bioactives in foods and nutraceuticals N. Garti, Ed, Woodhead Publishing in Food Science, Technology and
Nutrition , pp. 53 -106, 2008
101. R.M. Faulks, S.Southon. Assessing the bioavailability of nutraceut icals . In Delivery and controlled
release of bioactives in foods and nutraceuticals N. Garti, Ed, Woodhead Publishing in Food Science,
Technology and Nutrition , pp 3 -25, 2008.
102. D J McClements and Y Li, Food Funct. , 1, 32-59, 2010 .
103. C. Chung, L. Sanguansri and M.A. Augustin, Food Chem , 124: 1480 -1489, 2011.
104. CJ. Barrow, C.Nola n, and B.Holub, , Bioequivalence of encapsulated and microencapsulated fish -oil
supplementation , Journal of functional foods , vol. 1, no. 1, pp. 38 -43, 2009.
105. E Choe and DB Min.. J FoodSci, 72(5), R77 -R86, 2007.
106. CJ. Barrow, C.Nolan, and B.Holub, , Bioequiva lence of encapsulated and microencapsulated fish -oil
supplementation, Journal of functional foods, vol. 1, no. 1, pp. 38 -43, 2009.
107. E Choe and DB Min.. J FoodSci, 72(5), R77 -R86, 2007.
108. E Choe, and DB Min.. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safe ty, 8(4),345 -358, 2009
109. W.H. Telfer, D. Kennedy , Biologi a organismelor , Editura Științifică și Enciclopedică, București, pp 32 –
55, 1986
110. Aggarwal B.B., Kumar A., Bharti A.C. Anticancer Res. 2003 , 23, 363 –398.
111. Wilken R., Veena S.M., Wang M.B., Srivatsan E.S. Curcumin:. Mol. Cancer 2011 , 10, 1–19.
112. Grykiewicz G., Silfirski P. Acta Biochim. Pol. 2012 , 59, 201 –212.

113. Esatbeyoglu, T.; Huebbe, P.; Insa, M.A.; DawnChin, E.; Wagner, A.E.; Rimbach, G. Angew. Chem. Int.
Ed. 2012 , 51, 5308 –5332.
114. Gupta, S.; Prasad, S.; Ji, H.K.; Patchva, S.; Webb, L.J.; Priyadarsini, K.I.; A ggarwal, B.B.. Nat. Prod.
Rep. 2011 , 28, 1937 –1955.
115. Priyadarsini, K.I. . Curr. Pharm. Des. 2013 , 19, 2093 –2100.
116. Vogel, H.A.; Pelletier. J. Pharma 1815 , 2, 50.
117. Singh, S.; Aggarwal, B. J. Biol. Chem. 1995 , 270, 24995 –25000
118. Ramanjaneyulu, P.S.; Sayi, Y.S.; R aman, V.A.; Ramakumar, K.L. J. Radioanal. Anal. Nucl. Chem.
2007 , 274, 109 –114.
119. Paulucci, V.P.; Couto, R.O.; Teixeira, C.C.C.; Freitas, L.A.P. Braz. J. Pharmacogn . 2013 , 23, 94–100.
120. Lee, K.J.; Yang, H.J.; Jeong, S.W.; Ma, J.Y. Korean J. Pharmacogn. 2012 , 43, 250 –256.
121. Lee, K.J.; Ma, J.Y.; Kim, Y. -S.; Kim, D. -S.; Jin, Y. J. Appl. Biol. Chem. 2012 , 55, 61–65.
122. Li, M.; Ngadi, M.O.; Ma, Y. Food Chem. 2014 , 165, 29–34.
123. Patel, K.; Krishna G.; Sokoloski, E.; Ito, Y.. J. Liquid Chromatogr . 2000 , 23, 2209 –2218.
124. Kim, Y. -J.; Lee, H.J.; Shin, Y. J. Agric. Food Chem. 2013 , 61, 10911 –10918.
125. Takenaka, M.; Ohkubo, T.; Okadome, H.; Sotome, I.; Itoh, T.; Isobe, S.. Food Sci. Technol. Res. 2013 ,
19, 655 –659.
126. Baumann, W.; Rodrigues, S.V.; Viana, L.M.. Braz. J. Chem. Eng. 2000, 17, 323 –328.
127. Chassagnez -Mendez, A.L.; Correa, N.C.F.; Franca, L.F.; Machado, N.T.; Araujo, M.E. Braz. J. Chem.
Eng. 2000 , 17, 315 –322.
128. Kurmudle, N.; Kagliwal, L.D.; Bankar, S.B.; Singhal, R.S.. Food Biosci. 2013 , 3, 36–51.
129. Pramasivam, M.; Poi, R.; Ban erjee, H.; Bandyopadhyay, A. Food Chem. 2009 , 113, 640 –644.
130. Ali, I.; Haque, A.; Saleem, K.. Anal. Methods 2014 , 6, 2526 –2536.
131. Lee, K.J.; Kim, Y.S.; Jung, P.M.; Ma, J.Y. Asian J. Chem. 2013 , 25, 6306 –6310.
132. Lee, K.J.; Kim, Y.S.; Ma, J.Y. Asian J. Chem. 2013 , 25, 909 –912.
133. Lampe, V.; Milobedzka, J.. Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1913 , 46, 2235 –2240
134. Babu, K.V.; Rajasekharan, K.N. A. Org. Prep. Proced. Int . 1994 , 26, 674 –677
135. Venkateswarlu, S.; Ramachandra, M.S.; Subbaraju, G.V. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 6374 –6380.
136. Venkata Rao, E.; Sudheer, P. Indian J. Pharm . Sci. 2011 , 73, 262 –270.
137. Kavirayani Indira Priyadarsini, Molecules 2014, 19, 20091 -20112; doi:10.3390/molecules191220091
138. Priyadarsini, K.I.. J. Photochem. Photobiol. C 2009 , 10, 81–96
139. Priyadarsini, K.I. Free Radic . Biol. Med. 1997 , 23, 838 –884
140. Priyadarsini, K.I.; Maity, D.K.; Naik, G.H.; Kumar, M.S.; Unnikrishnan, M.K.; Satav, J.G.; Mohan, H..
Free Radic. Biol. Med. 2003 , 35, 475 –484
141. Mishra, B.; Priyadarsini, K.I.; Bhide, M.K.; Kadam, R.M.; Mohan, H. Free Radic. Re s. 2004 , 38, 355 –
362.
142. Jovanovic, S.V.; Boone, C.W.; Steenken, S.; Trinoga, M.; Kaskey, R.B. . J. Am. Chem. Soc. 2001 , 12,
3064 –3068
143. Sun, Y.M.; Zhang, H.Y.; Chen, D.Z.; Liu, C.B. Org. Lett . 2002 , 4, 2909 –2911.
144. Kim, J.E.; Kim, A.R.; Chung, H.Y.; Han, S.Y.; K im, B.S.; Choi, J.S . Phytother. Res . 2003 , 17, 481 –
484.
145. Iwunze, M.O.; McEwan, D. Cell. Mol. Biol. 2004 , 50, 749 –752.
146. Borsari, M.; Ferrari, E.; Grandi, R.; Saladini, M.. Inorg. Chim. Acta 2002 , 328, 61–68
147. Kim, J.E.; Kim, A.R.; Chung, H.Y.; Han, S.Y.; Kim, B .S.; Choi, J.S.. Cell. Mol. Biol. 2004, 50, 749 –
752.
148. Shen, L.; Ji, H.F. Trends Mol. Med . 2012 , 18, 138 –143.
149. Price, L.C.; Buescher, R.W.. J. Food Sci. 1997 , 62, 267 –269.
150. Wang, Y.J.; Pan, M.H.; Cheng, A.L.; Lin, L.I.; Ho, Y.S.; Hsieh, C.Y.; Lin, J.K.. J. Pha rm. Biomed.
Anal . 1997 , 15, 1867 –1876
151. Canamares, M.V.; Garcia -Ramos, J.V.; Sanchez -Cortes, S.. Appl. Spectrosc. 2006 , 60, 1386 –1391.
152. Khurana, A.; Ho, C.T.. J. Liquid Chromatogr. 1988 , 11, 2295 –2304
153. Tønnesen, H.H.; de Vries, H.; Karlsen, J.; Henegouwen, B.V . J. Pharm. Sci. 1987 , 76, 371 –373.

154. Singh, U.; Verma, S.; Ghosh, H.N.; Rath, M.C.; Priyadarsini, K.I.; Sharma, A.; Pushpa, K.K.; Sarkar,
S.K.; Mukherjee, T.. J. Mol. Catal. A 2010 , 318, 106 –111.
155. Awasthi, S.; Pandya, U.; Singhal, S.S.; Lin, J.T.; Thiviyanat han, V.; Seifert, W.E.; Awasthi, Y.C.;
Ansari, G.A.. Chem. Biol. Int. 2000, 128, 19 –38
156. Lersel, M.L.; Ploemen, J.P.; Struik, I.; van Amersfoort, C.; Keyzer, A.E.; Schefferlie, J.G.; van
Bladeren, P.J. Chem. Biol. Int. 1996, 102, 117 –132.
157. Fang, J.; Jun, L.; Holmegren, A.. J. Biol. Chem. 2005, 280, 25284 –25290
158. Jung, Y.; Xu, W.; Kim, H.; Ha, N.; Neckers, L. Curcumin -induced degradation of ErbB2:. Biochim.
Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2007, 1773, 383 –390.
159. Li, W.; Wu, W.; Yu, F.; Huang, H.; Liang, X.; Ye, J.. Org. Biomol. Chem. 2011 , 9, 2505 –2511.
160. Dutta, S.; Padhye, S.; Priyadarsini, K.I.; Newton, C.. Bio -Org. Med. Chem. 2005, 15, 2738 –2744.
161. Simoni, D.; Rizzi, M.; Rondanin, R.; Baruchello, R.; Marchetti, P.; Invidiata, F.P.; Labbozzetta, M.;
Poma, P.; Carina, V.; Notarbartolo, M.; et al. Bioorganic Med. Chem. Lett. 2008 , 18, 845 –849.
162. Khalil, M.I.; Al -Zahem, A.M.; Al -Qunaibit, M.H. . Bioinorg. Chem. Appl. 2013 ,
doi:10.1155/2013/982423.
163. Leung, M.H.; Harada, M.; Kee, T.; Tak, W. Curr. Pharm. Des. 2013 , 19, 2070 –2083.
164. Vajragupta, O.; Boonchoong, P.; Watanabe, H.; Wongkrajang, Y.; Kammasud, N.. Free Radic. Biol.
Med. 2003 , 35, 1632 –1644.
165. Vajragupta, O.; Boonchoong, P.; Berliner, L.J.. Free Radic. Res. 2004 , 38, 303 –314.
166. Barik, A.; Mishra, B.; Shen, L.; Mohan, H.; Kadam, R.M.; Dutta, S.; Zhang, H.; Priyadarsini, K.I.. Free
Radic. Biol. Med. 2005 , 39, 811 –822.
167. Barik, A.; Mishra, B.; Kunwar, A.; Kadam, R.M.; Shen, L.; Dutta, S.; Padhye, S.; Satpati, A.K.;. Eur. J.
Med. Chem. 2007 , 42, 431 –439.
168. Kunwar, A.; Narang, K.; Priya darsini, K.I.; Krishna, M.; Pandey, R.; Sainis, K.B. . J. Cell. Biochem.
2007 , 102, 1214 –1224.
169. Koiram, P.R.; Veerapur, V.R.; Kunwar, A.; Mishra, B.; Barik, A.; Priyadarsini, K.I.; Unnikrishnan
M.K.. J. Radiat. Res. 2007 , 48, 241 –245.
170. Baum, L.; Ng, A.. J. Alzheimer’s Dis. 2004 , 6, 367 –377.
171. Jiang, T.; Zhi, X.; Zhang, Y.; Pan, L.; Zhou, P. . 2012 , 1822 , 1207 –1215.
172. Jiang, T.; Wang, L.; Zhang, S.; Sun, P. -C.; Ding, C. -F.; Chu, Y. -Q.; Zhou, P.. J. Mol. Struct. 2011 ,
1004 , 163 –173
173. Gianluca, M.; Erika, F.; Gigliol a, L.; Valentina, A.; Francesca, F.; Claudio, M.; Francesca, P.; Monica,
S.; Ledi, M.. J. Mater. Chem. 2011 , 21, 5027 –5037.
174. Pucci, D.; Bellini, T.; Crispini, A.; D’Agnano, I.; Liquori, P.F.; Garcia -Orduna, P.; Pirillo, S.; Valentini,
A.; Zanchetta, G. Med. Chem. Commun . 2012 , 3, 462 –468.
175. Mei, X.; Xu, D.; Xu, S.; Zheng, Y.; Xu, S.. Pharmacol. Biochem. Behav. 2011 , 99, 66–74.
176. Sharma, K.K.; Chandra, S.; Basu, D.K.. Inorg. Chim. Acta 1987 , 135, 47–48.
177. Thompson, K.H.; Bohmerle, K.; Polishchuk, E.; Martins, C.; Toleikis, P.; Tse, J.; Yuen, V.; McNeill,
J.H.; Orvig, C.. J. Inorg. Biochem. 2004 , 98, 2063 –2070.
178. Rennolds, J.; Malireddy, S.; Hassan, F.; Tridandapani, S.; Parinandi, N.; Boyaka, P.N.; Cormet -Boyaka,
E. Biochem. Biophys. Res. Commun . 2012 , 417, 256 –261.
179. Oguzturk, H.; Ciftci, O.; Aydin, M.; Timurkaan, N.; Beytur, A.; Yilmaz, F.. Andrologia 2012 , 44, 243 –
249.
180. Agarwal, R.; Goel, S.K.; Behari, J.R.. J. Appl. Toxicol. 2010 , 30, 457 –468.
181. S.; Limson, J.L.; Dairam, A.; Watkins, G.M.; Daya, S.. J. Biol. Inorg. Chem. 2004 , 98, 266 –275.
182. Eybl, V.; Kotyzova, D.; Leseticky, l.; Bludovska, M.; Koutensky, J.. J. Appl. Toxicol. 2006 , 26, 207 –
212.
183. Ali I.S.,Kishwar, W.; Diana,. Med. Chem. Res. 2013 , 22, 1386 –1398
184. Valentini, A.; Conforti, F.; Crispini, A.; De Martino, A.; Condello, R.; Stellitano, C.; Giuseppe, R.;
Ghedini, M.; Federici, G.; Bernardini, S.; et al. . J. Med. Chem . 2009 , 52, 484 –491.
185. John, V.D.; Kuttan, G.; Krishnankutty, K.. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2002 , 21, 219 –224.
186. Huang, Q. -M.; Wang, S.; Pan, W.; Deng, P.-X.; Zhou, H.; Pan, Z. -Q.. Chem. J. Chin. Univ. -Chin . 2012 ,
33, 732 –737.

187. Akhtar, H.; Kumar, S.; Banik, B.; Banerjee, S.; Nagaraju, G.; Chakravarthy, A.R .. Dalton Trans. 2013 ,
42, 182 –195.
188. Kunwar, A.; Barik, A.; Pandey, R.; Priyadarsini, K.I.. Biochim. Biophys. Acta (Gen.) 2006 , 1760 , 1513 –
1520.
189. Li, L.; Braiteh, F.S.; Kurzrock, R.. Cancer 2005 , 104, 1322 –1331.
190. Prasad, S.; Tyagi, A.K.; Aggarwal, B.. Cancer Res. Treat . 2014 , 46, 2–18.
191. Wahlstrom B, Blennow G.. Acta Pharmacol Toxicol (Copenh). 1978;43:86 -92.
192. Shoba G, Joy D, Joseph T, Majeed M, Rajendran R, Srinivas PS. Planta Med. 1998;64:353 -6
193. Chang MT, Tsai TR, Lee CY, Wei YS, Chen YJ, Chen CR, et al.. J Agric Food Chem. 2013;61:9666 -71
194. Chang MT, Tsai TR, Lee CY, Wei YS, Chen YJ, Chen CR, et al.. J Agric Food Chem. 2013;61:9666 -71
195. Sharma RA, Euden SA, Platton SL, Cooke DN, Shafayat A, Hewitt HR, et al.. Clin Cancer Res.
2004;10:6847 -54.
196. Yang KY, Lin LC, Tseng TY, Wang SC, Tsai TH. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.
2007;853:183 -9.
197. Sun J, Bi C, Chan HM, Sun S, Zhang Q, Zheng Y. Colloids Surf B Biointerfaces. 2013;111C:367 – 75.