Capacitatea de regenerare este prezentă, într-o formă sau alta, de la organismele unicelulare pana la organismele pluricelulare complexe. [309697]

Introducere

Mai multe specii oligochaete au stat la baza noilor contribuții la înțelegerea mecanismelor de regenerare (Bely și Wray, 2001; Martinez și colab., 2005; Myohara și colab., 2006). [anonimizat]. Lipitorile, [anonimizat] a-[anonimizat]-un singur segment de corp(Morgulis, 1907; Okada, 1929; Berrill, 1952).

Mulți viermi inelați sunt limitați în capacitatea lor de regenerare a [anonimizat](Bely, 2006). [anonimizat] (2006) a susținut că mecanismele de regenerare s-[anonimizat], unele din aceste pierderi fiind recente.

În plus față de capacitatea lor de a [anonimizat], au o capacitate ridicata de vindecare a rănilor. [anonimizat]-[anonimizat] a matricei extracelulare de proteine ​​care facilitează restaurarea structurilor traumatizate(Tettamanti et al., 2005).

[anonimizat]. Este indispensabil pentru supraviețuirea speciilor și este un fenomen fundamental de viață.

[anonimizat]-o [anonimizat].

Regenerarea presupune două procese și anume: crearea de noi țesuturi și diferențierea țesuturilor implicate în leziuni.

Capacitatea de regenerare este mai mare la animalele simple și scade treptat la animalele mai complexe. Capacitatea de regenerare variază la diferite specii de animale și în diferite țesuturi sau organe ale aceleiași specii. [anonimizat](Clark și Clark, 1962; Elizabeth D. Hay, 1966 ; Johnson L.G., 1995; Mark J. Zoran, 2010). Chiar și printre anelidele oligochaete capacitatea de regenerare variază la specii diferite. [anonimizat](Edwards și Lofty, 1977). [anonimizat], însă partea posterioară regenerează mai ușor decât cea anterioară. Regenerarea la viermii tineri este mult mai rapidă decât la viermii batrâni.

S-au făcut o serie de studii pentru a înțelege gradul de regenerare la un număr de specii oligochaete: Zhinkin, 1936; Carter et al, 1940; Clark și Clark, 1962; Elizabeth D. Hay, 1966; Müller M.C.M., Berenzen A., Westheide W., 2003. [anonimizat], [anonimizat], 1929; Zhinkin, 1936; Wei S., X. Yin, Y.Kou, și B. Jiang, 2009 au raportat că ganglionii nervoși sunt esențiali pentru regenerare. Carter și colab, 1940 au descoperit că regenerarea este posibilă la segmentul care posedă ganglioni nervoși.

Esențialitatea țesutului nervos a fost dovedită dincolo de orice îndoială prin experimente de transplant la oligochaetele Eisenia foetida și Allolobophora caliginosa(Herlant – Meewis, 1961).

Obiectivul lucrarii ale cărei rezultate vor fi prezentate ulterior a fost determinarea activității fosfatazelor alcaline și cantitatea de proteine totale, inclusiv pe fracțiuni(electroforeză) în timpul procesului de regenerare la Lumbricus terrestris.

Capitolul I. Particularități taxonomice, morfologice si metabolice ale speciei Lumbricus terrestris

I.1. Încadrarea taxonomică a speciei Lumbricus terrestris

Cele circa 3500 specii de oligochete sunt alăturate în unele clasificații mai noi împreună cu hirudineele în clasa Clitellata, Oligochaeta având valoare taxonomică de subclasa. Acest grup taxonomic a fost creat datorită faptului că atât oligochetele cât și hirudineele sunt forme hermafrodite care în timpul reproducerii își formează sau își hipertrofiază clitelumul.

Cea mai mare parte a speciilor de oligochete sunt acvatice, existând însă și foarte multe specii tericole, pe soluri umede sau în mediul subteran. Speciile marine sunt relativ puține și se apreciază că ele provin din foste forme dulcicole readaptate la viața în mediul marin.

Speciile acvatice sunt de cele mai multe ori bentale, unele dezvoltandu-se pe substrat fital. Puține specii înoata în masa apei. Unele specii terestre tropicale sunt arboricole (Pheretinus în Borneo), acestea avand corpul turtit dorso-ventral. În ceea ce privește regimul de hrană, cele mai multe oligochete sunt detritivore. Unele specii tericole consuma frunze putrezite pe care le trag în galerii. O serie de specii acvatice sunt răpitoare Chaetogaster, Agriodrilus vermivorus; de asemenea, există și specii microfage iar altele sunt parazite la unele crustacee acvatice (Cirrodrilus)(Damoff, George Alan; Reynolds, John Warren, 2009).

Din punct de vedere sistematic, oligochetele sunt împărțite în trei sau patru ordine, în funcție de autori.

Din considerente de ordin practic, vom utiliza clasificarea veche, cu trei ordine, Lumbricidele făcând parte(conform acestei clasificări) din:

Ordinul Haplotaxida (Opisthopora)

La acest grup orificiile genitale sunt situate posterior față de segmentele cu testicule, de obicei la distanță de cel puțin un segment.

Subordinul Haplotaxida. Include forme dulcicole sau întâlnite în solurile umede sau în apa freatică. Cele exotice, sunt întâlnite în zona paleotropicală și indo-pacifică.

Subordinul Alleuroidina – specii dulcicole, paleotropicale.

Subordinul Moniligastrina – specii tericole, indo-pacifice.

Subordinul Lumbricina include cele mai cunoscute oligochete. Speciile din acest grup sunt tericole, holarctice. Putine specii sunt acvatice sau amfibii.

Familia Lumbricidae;

Lumbricus terrestris(Barnes, R. S. K., Calow, P., Olive, P. J. W., 1993) este una din cele mai comune specii de oligochete din țara noastră, răspândită în zonele de deal și de șes ale țării(Boguleanu,1988).

Clasificare științifică, dupa Barnes et al., 1993:

Regnul: Animalia

Încrengatura: Annelida

Clasa: Clitellata

Subclasa: Oligochaeta

Ordinul: Haplotaxida

Familia: Lumbricidae

Genul: Lumbricus

Specia: L. terrestris

Nume binomial:

Lumbricus terrestris
Linnaeus, 1758

I.2 Particularitățile metabolice și fiziologice ale subclasei Oligochaeta

(cu exemplificare pe Lumbricus terrestris)

Grupul include anelide dulcicole, marine și terestre, lipsite de parapode și de cheți iar organele de simț sunt slab dezvoltate. Regiunea cefalică este lipsită de orice fel de apendice, iar prostomiul și peristomiul sunt reduse, datorita modului de hrănire(RaduV. și RaduV.V., 1967).

I.2.1 Morfologie externă

Corpul este cilindric, cu ambele extremități asemănătoare, îngust-alungite. Talia corpului variază, de la câțiva milimetri la peste 3 metri, cât atinge Megascolides australis, gigantul grupului; cea mai mare parte a speciilor terestre, dintre care face parte și Lumbricus terrestris – râma obișnuită, pe care o prezentam ca reprezentant-tip – au între 5 și 20 cm lungime. Numărul segmentelor corpului nu este fix, putând ajunge la circa 180. În regiunea anterioară, între segmentele 32 și 37, se află o îngroșare denumită clitellum (lat. clitellum – samar). Această îngroșare împarte corpul în două zone – preclitelară și postclitelară. Zona preclitelară are întotdeauna un număr fix de segmente – 31 în cazul lui L. terrestris – în timp ce numărul de segmente din zona postclitelară variază cu vârsta(RaduV. și RaduV.V., 1967).

Prostomiul și peristomiul sunt mici și lipsite de orice diferențieri morfologice. Ventral, pe peristomiu se află orificiul bucal. Pe fiecare segment se află patru perechi de cheți – două latero-dorsale și două latero-ventrale. Cheții sunt mici, fixați într-o formațiune tegumentară numită sac chetiger, iar vârfurile sunt recurbate înapoi. Unele specii acvatice au cheții lungi, iar alte specii îi au mai numeroși pe fața ventrală. La râmă, cheții au rolul de a sprijini corpul în timpul deplasării prin galerii. Pe segmentele corpului se deschid câte două orificii excretoare, în poziție latero-ventrală. Acești pori excretori lipsesc de pe primele patru segmente și de pe ultimul. În zona segmentelor 9-15 se disting unele formațiuni legate de aparatul genital. Ventral, pe segmentul 9 și pe segmentul 10 se deschid orificiile receptacuelor seminale.

Pe segmentul 14, ventral, între cheți se deschid cele doua orificii genitale femele(la oligochete orificiile genitale sunt perechi). Pe segmentul 15, la limita cu segmentul 16 se deschid cele doua orificii genitale mascule. Situate mult lateral, aceste orificii sunt vizibile datorită unei arii glandulare situate de jur-imprejurul orificiului propriu-zis. De la orificiile genitale mascule, până la segmentul 37, unde se termina clitelumul, se întind două șanțuri seminale. În perioada de reproducere, ventral, pe partea inferioară a clitelumului se disting două creste pubertare. Dorsal, pe fiecare segment al corpului există câte un por prin care lichidul celomic poate fi deversat la exterior cand situația o impune (corpul vine în contact cu diverse substanțe chimice, cu germeni patogeni sau este amenințat cu deshidratarea), rolul lichidului celomic fiind unul de protecție. Pigidiul poartă orificiul anal, înaintea lui existând ca și la alte anelide o zonă de proliferare(RaduV. și RaduV.V., 1967).

Ganglioni Stomac Stomac Vase de sânge

cerebroizi Farinx Esofag de acumulare musculos dorsale

Arcul aortic

Figura 1.1. Sistemele de organe la Lumbricus terrestris.

Pentru exemplificare în imaginea de mai sus s-au folosit urmatoarele culori pentru sistemele de organe: Sistemul circulator – Roșu /Sistemul de reproducere – Albastru / Sistemul digestiv – verde /Sistemul nervos – galben

I.2.2 Organizația internă

Tegumentul este acoperit cu o cuticulă care se reînnoiește la fiecare năpârlire, sub care se afla un epiteliu bogat în celule glandulare și corpusculi senzoriali. În dreptul cheților, cuticula prezintă discontinuități, ca și la nivelul glandelor epiteliale. Musculatura este asemănătoare cu cea de la polichete; astfel, sub tegument se găsește un strat subțire de musculatură circulară, sub care se găsește musculatura longitudinală organizată în benzi. La Lumbricus terrestris se găsesc cinci benzi longitudinale, două latero-dorsale, două laterale și una ventrală. Musculatura longitudinală are un aspect deosebit, fibrele musculare orientându-se oblic față de o serie de membrane conjunctive dispuse perpendicular pe peretele corpului. Datorita acestui aspect, în secțiune fasciculele de musculatură au aspect caracteristic, penat. Cavitatea celomică a fiecărui segment este izolată de cea a segmentelor vecine prin disepimente. Mezenterul dorsal este slab dezvoltat, susținând vasul sanguin dorsal. De multe ori, această formațiune lipsește. În lichidul celomic se află numeroase leucocite, iar în jurul intestinului se dispun celule cloragogene cu rol excretor(Aioanei F. și Stavescu-Bedivan M.M., 2011).

Sistemul digestiv este complet; orificiul bucal se continua cu un faringe foarte musculos, apoi cu un esofag mai lung și mai îngust. La nivelul esofagului se deschid trei perechi de diverticule laterale – glandele calcifere. Se pare că rolul acestor glande este de a fixa bioxidul de carbon din aerul din galerii, în acest mod evitându-se intoxicarea corpului. Esofagul se continuă cu un stomac de acumulare apoi cu un stomac musculos. În stomacul de acumulare alimentele sunt impregnate cu sucuri digestive, iar stomacul musculos are rol în prelucrarea lor mecanică. După stomac urmeaza un intestin lung, cu lumenul mai îngust decât stomacul, prevăzut dorsal cu un pliu adânc, denumit tiflosolis. Această formațiune are rolul de a mări suprafața de absorbție a intestinului, el lipsind de la acele specii oligochete care nu se hrănesc cu hrăna săracă în nutrimente. Peretele intestinal este alcătuit din celule prevăzute cu platou striat și celule glandulare. La exterior, intestinul este învelit într-o pătură de musculatură circulară și una de musculatură longitudinală. Acest strat musculos asigură eliminarea particulelor de hrană digerată la exterior, cât și deplasarea lor de-a lungul intestinului(Aioanei F. și Stavescu-Bedivan M.M., 2011).

Aparatul respirator propriu-zis lipsește la L. terrestris, respirația realizându-se la nivelul tegumentului. Există însă specii de oligochete acvatice care prezintă branhii(RaduV. și RaduV.V., 1967).

Sistemul circulator este alcătuit dintr-un vas sanguin dorsal și unul ventral, unite în partea anterioară prin cinci vase circulare(situate în dreptul segmentelor 7 – 11), cu pereții foarte musculoși, a căror contracție ritmică asigură circulația sângelui. În jurul lanțului ganglionar ventral se află două vase sanguine neurale laterale și un vas sanguin neural ventral care asigură irigarea lanțului ganglionar(RaduV. și RaduV.V.,1967).

Sistemul excretor este de tip metanefridian, pavilionul ciliat deschizându-se într-un segment iar orificiul excretor în segmentul imediat urmator. Între nefrostom și por se găsește un canal lung și contorsionat. Rol în excreție au și celulele cloragogene situate în jurul intestinului(RaduV. și RaduV.V., 1967).

Sistemul nervos este de tip scalariform, dar spre deosebire de cel de la polichete, este mai slab dezvoltat, aspect aflat în strânsă legătură cu modul de viață al oligochetelor. Ganglionii cerebroizi se află la nivelul segmentului 3. În restul segmentelor se află câte un ganglion cerebroid rezultat prin contopirea în plan median a celor doi ganglioni inițiali. Ganglionii lanțului ventral sunt uniți printr-un cordon nervos(Firă V. și Năstăsescu M., 1977).

Sistemul reproducator. Oligochetele sunt animale hermafrodite, proterandrice, cu fecundare încrucișată. Sistemul genital femel este reprezentat de o pereche de ovare situate în segmentul 13, formate din foița dorsală a somatopleurei; un pavilion ciliat situat sub ovar asigură evacuarea ovulelor la exterior prin intermediul orificiului genital situat ventral. Sistemul genital mascul este alcătuit din doua perechi de testicule, dispuse în segmentele 11-12. Produsele sexuale sunt captate de cate un pavilion ciliat, canalele celor două pavilioane ciliate de aceeași parte a corpului confluând într-un canal deferent, care se deschide la exterior. Organele de acuplare lipsesc(Butt, Kevin R. și Nuutinen, Visa. 1998).

În perioada de reproducere, are loc acuplarea, care parcurge mai multe faze. În prima fază, doi indivizi se alipesc pe fețele ventrale, în poziție cap la coadă. În această poziție, cei doi parteneri de acuplare își secretă un manșon comun care îi învelește strâns, lasând liberă doar zona receptaculelor seminale. Prin orificiile genitale masculine, spermatozoizii ajung la exterior și se scurg în lungul șanțurilor seminale până în zona segmentului 37 care vine în contact cu zona liberă a individului pereche, unde se află receptaculele seminale ale acestuia. În acest mod se realizează un schimb de material genital între cei doi indivizi, care ulterior se despart, iar spermatozoizii sunt păstrați în receptaculele seminale până când gonadele femele devin mature. Când individul se transformă în femelă, râma secretă un nou manșon, în care este eliminat un lichid albuminos. Animalul începe să se retragă din manșon, și în momentul în care segmentul 14, care poarta orificiile genitale femele ajunge în dreptul manșonului, ovulele sunt eliberate în interior. Mai departe, animalul continuă să se retragă până când manșonul ajunge în dreptul receptacuelor seminale; în acest moment, în manșon sunt eliminați spermatozoizii, având loc și fecundarea ovulelor. Ulterior animalul se retrage cu totul, închizand capetele manșonului, în interiorul căruia are loc dezvoltarea embrionară. Aceasta se face direct, fără larve intermediare; indivizii juvenili practică un canibalism larvar – adelfofagie – din manșon ieșind un singur exemplar, care i-a consumat pe toți ceilalți. Segmentarea oului este de tip spiral, totală și inegală, iar gastrulația are loc prin epibolie(Butt Kevin R. și Nuutinen Visa. 1998).

I.3 Procesul de regenerare în serie animală

Dacă coada unei șopârle de casă este tăiată, partea lipsă se regenerează. În unele cazuri, regenerarea este atât de avansată încât un întreg organism pluricelular este reconstruit de la un mic fragment de țesut. Corpul nostru pierde spontan celule de la suprafața pielii și le înlocuieste cu celulele nou formate. Acest lucru se datorează regenerării(Dinsmore C. E. 1991, Albert P., Boilly B.,1988).

Regenerarea poate fi definită ca abilitatea naturală a organismele vii de înlocuire a părților uzate, repararea sau reînnoirea părților deteriorate sau pierdute ale organismului, sau pentru a reconstitui întregul corp de la un mic fragment în timpul vieții, după etapa embrionară a unui organism. Regenerarea este, de asemenea, un proces de dezvoltare care implică creșterea, morfogeneza și diferențierea(Goss R. J. 1969, Dinsmore C. E. 1991, Bryant S., 1999).

I.3.1 Tipuri de regenerare

Regenerarea este de trei tipuri(Goss R. J. 1969):

Regenerarea fiziologică: există o pierdere constantă a mai multor tipuri de celule din cauza uzurii cauzate de activitățile de zi cu zi. Înlocuirea acestor celule este cunoscut sub numele de regenerare fiziologică(Dinsmore C. E. 1991, Bryant S., 1999).

Exemple:

Înlocuirea hematiilor: hematiile uzate sunt depozitate în splină și noi hematii sunt produse în mod regulat din celulele măduvei osoase, deoarece durata de viață a hematiilor este de doar 120 zile.

Înlocuirea celulelor epidermice:

Celulele din straturile exterioare ale epidermei sunt distruse în mod regulat din cauza uzurii. Acestea sunt în mod constant înlocuite cu celule noi adăugate de către stratul malpighian al pielii (Dinsmore C. E. 1991).

Regenerarea reparatorie: Aceasta este înlocuirea părților sau regenerarea organelor deteriorate sau pierdute. În acest tip de regenerare, rana este închisă prin extinderea epidermei adiacente peste rană (Dinsmore C. E., 1991, Bryant S., 1999).

Exemple:

Regenerarea membrelor la salamandre;

Regenerarea cozii la șopârlă;

Vindecarea rănilor;

Înlocuirea celulelor deteriorate(Dinsmore C. E., 1991).

Autotomia: unele animale, cum ar fi steaua de mare renunță la o parte a corpului când este amenințată de un prădător(Dinsmore C. E., 1991, Albert P., Boilly B.,1988).

Exemple:

Crabul renunță la picior pentru a scăpa de inamic;

Holoturiile își aruncă viscerele interne;

Steaua de mare renunță la un braț;

Șopârla își rupe coada(Dinsmore C. E., 1991).

I.3.1.1 Capacitatea de regenerare în serie animală

Capacitatea de regenerare variază în mare măsură la diferite grupuri de animale. Capacitatea de regenerare este foarte mare în rândul protozoare, burețiilor de mare și celenteratelor(Goss, R. J. 1969, Dinsmore C. E., 1991).

Nevertebrate:

La bureții de mare, întregul corp poate fi reconstruit pornind de la celule izolate ale corpului. Celulele se rearanjează și se reorganizează pentru a forma corpul buretelui (Dinsmore C. E., 1991).

Regenerarea a fost descoperită pentru prima dată la hidră de Tremble(1740). Chiar și a 1000-a  parte a corpului poate regenera noi organisme(Newman S A., 1974).

La hidră și planarie, fragmente mici ale corpului pot da naștere unui întreg animal(Newman S A., 1974). Când o hidră sau o planarie este tăiată în mai multe bucăți, fiecare parte individuală regenerează un individ(Bode, P. M. și H. R. Bode., 1984).

Unele anelide precum râmele sunt capabile să-și regenereze segmentele anterioare și posterioare ale corpului(Goss R. J., 1969).

Unele moluște îsi pot regenera doar ochii și capetele în timp ce calmarii își pot regenera brațele(Goss R. J., 1969).

Multe artropode(de exemplu, păianjenii, crustaceele, larvele de insecte etc) își pot regenera doar membrele. Regenerarea este mai rapidă la tineri decât la adulți. Partea regenerată poate să nu fie întotdeauna la fel cu partea pierdută. Acest tip de regenerare se numește regenerare heteromorfă(Butenandt A., Karlson P., 1954).

Echinodermele(cum ar fi steaua de mare) prezintă autotomie. Ele își pot regenera brațele și părți ale corpului(Goss R. J., 1969).

Vertebrate:

Pești: petromizonii își pot regenera coada. Unii pești au capacitatea de a-și regenera părți ale aripioarelor(Dinsmore C. E., 1991).

Amfibieni: Puterea de regenerare este binecunoscută la amfibienii urodele, cum ar fi salamandrele, tritonii și larvele axolotl(Crawford K., Stocum D L., 1988). Ele își pot regenera membrele, coada, branhiile externe, fălcile, părți ale ochiului cum ar fi lentila și retina.  Coada și membrele se regenerează în stadiile larvare la amfibienii anure(Allen B M., 1914.).

Reptile: Șopârlele prezintă autotomie. Atunci când e amenințată, șopârla își desprinde coada aproape de bază pentru a deruta prădătorul, iar mai târziu își regenerează din nou coada. Noua coadă diferă de cea veche prin formă, lipsa vertebrelor și tipul de solzi care o acoperă(Albert P., Boilly B.,1988).

Păsări: Regenerarea se limitează la părți ale ciocul(Dinsmore C. E., 1991).

Mamifere: Regenerarea se limitează la doar țesuturi. Părțile externe nu sunt regenerate. Pielea și țesuturile osoase posedă o mare putere de regenerare. Ficatul are capacitatea maximă de regenerare(Higgins G. M., Anderson R. M.,1931). Dacă unul dintre rinichi este deteriorat sau îndepărtat, celălalt se mărește pentru a compensa rinichiul pierdut. Acest lucru este cunoscut sub numele de hipertrofie compensatorie.

Regenerarea este o formă obișnuită de reproducere asexuată(Dinsmore C. E., 1991).

I.3.1.2 Tipuri de regenerare în funcție de mecanismul celular implicat

În functie de mecanismele celulare implicate, regenerarea poate fi de două tipuri(Goss R. J., 1969):

Morfalaxie:

Regenerarea are loc în principal prin remodelarea țesuturilor existente și restabilirea granițelor, implicând astfel foarte puține tesuturi noi, în creștere. Ca rezultat, individul regenerat este mult mai mic decat cel inițial. Aceasta crește ulterior în dimensiune și devine normal după hrănire(Newman S.A., 1974, Goss R. J. 1969, Bode P. M. și H. R. Bode, 1984). Acest tip de regenerare este cunoscut sub numele morfalaxie sau regenerare morfalactică.

Exemplu: Regenerarea hidrei de la un mic fragment din corp(Newman S A., 1974, Bode P. M. și H.R. Bode, 1984).

Epimorfoză:

Regenerarea implică dediferențierea structurilor adulte pentru a forma o masă de celule nediferențiate. Ele sunt foarte proliferative și se acumulează sub epidermă, care s-a extins deja. Dupa două zile, umflătura se transformă într-un manșon conic. Această masă de celule dediferențiate, împreună cu țesutul epidermic se numește mugure de regenerare sau blastemă regenerativă. Celulele dediferențiate proliferează în continuare, și în final se rediferențiază pentru a forma un rudiment al părții lipsă. Rudimentul se transformă în cele din urmă în partea pierdută. Acest tip de regenerare este cunoscut sub numele epimorfoză sau regenerare epimorfică(Goss R. J., 1969).

Exemplu: regenerarea membrelor la amfibieni.

Un tip intermediar de regenerare este regenerarea compensatorie.  Aici celulele se divid, dar nu formează o masă nediferențiată de celule. În schimb, ele produc celule similare cu ele însele(Goss R. J., 1969).

I.3.2 Procesul de regenerare la anelide

Anelidele, la fel ca multe alte animale nevertebrate, își înlocuiesc părțile pierdute ale corpului prin regenerare. Cu toate acestea, capacitatea de a regenera segmente pierdute este prezentă doar în anumite grupuri de anelide, de exemplu lipitorile nu-și regenereaza segmentele pierdute. Regenerarea implică formarea unui manșon ce conține celule stem care se diferențiază în noi segmente de cap sau de coadă. Regenerarea viermilor inelați implică, de asemenea, remodelarea fragmentelor de corp rămase(Zoran Mark J., 2010).

Natura acestei agregări celulare este dată de neoblaști care servesc la formarea părții regenerative după ce se activează și migrează spre suprafața lezata a viermelui. Aceste celule se acumulează sub epidermă și formează astfel blastema de regenerare care dă naștere organelor mezodermale. Hormonii de leziune și secrețiile neuro-hormonale ale creierului și măduvei nervoase joacă un rol vital. Uneori, râmele dezvoltată un număr de segmente de prisos, procesul fiind cunoscut sub numele de super-regenerare(Wei S., Yin X., Kou Y., Jiang B., 2009).

Capacitatea anelidelor de a-și regenera segmente de coadă pare să fie aproape universală printre speciile capabile de regenerare. Capacitatea de a regenera segmente de cap, deși obișnuită, nu este universală și poate depinde de numărul de segmente pierdute. Absența sau prezența regenerării la nivelul grupurilor viermilor inelați, inclusiv a speciilor înrudite, sugerează faptul că capacitatea de regenerare poate fi o trăsătura veche care a fost pierdută la unele specii în timpul evoluției. De ce regenerarea variază între speciile viermilor inelați rămâne o întrebare interesantă pentru oamenii de știință(Zoran Mark J., 2010).

I.3.2.1 Faza catabolică și anabolică a regenerării

În prima etapă de regenerare este predominant catabolismul iar în cea de a doua perioadă anabolismul este dominant din cauza stării fiziologice a animalelor regenerate.

Faza catabolică. Această perioadă este cunoscută și ca stadiul distructiv al metabolismului, în care se observă o dediferențiere considerabilă a țesuturilor adulte.  În acest stadiu are loc creșterea bruscă în activitate a enzimelor proteolitice, are ca rezultat dediferențierea unor părți din țesuturile sănătoase adiacente de la suprafața plăgii. Cantitatea de aminoacizi liberi se dublează în țesuturile normale, din cauza dediferențierii.  Coeficientul respirator (RQ) în țesutul degenerat scade brusc, ceea ce este un semn de oxidare incompletă în țesut. Aminoacizii liberi, acidul lactic și radicalii liberi –SH care se acumulează în celulele degenerate provoacă scăderea pH-ului în țesuturile blastemului, care, apoi, revine încet la nivelul normal(Wei S, Yin X, Kou Y, Jiang B, 2009).

Faza anabolică. Această fază este caracterizată printr-o creștere a capacității de oxidare (RQ); a scăderii grupurilor de radicali liberi -SH și a acidului lactic; imbogățire cu ARN citoplasmatic; creșterea în mărime a nucleelor din celulele care participă la regenerare. Acest stadiu este cunoscut sub numele de stadiul constructiv al metabolismului. Simultan țesuturile eliberează cantități mari de ioni de potasiu, în timp ce ionii de clor și cei de sodiu sunt conservați. Glandele endocrine, secrețiile neuro-hormonale ale creierului, ale măduvei nervoase și ale gonadelor influențează, de asemenea, modificările fiziologice prin hormonii lor(Wei S, Yin X, Kou Y, Jiang B, 2009).

I.3.2.2 Inducerea regenerării la anelide

În timpul regenerării are loc înlocuirea părților pierdute ale corpului, această înlocuire va fi activată de un stimul adecvat(inducția), pentru a pune în mișcare mecanismul de regenerare. Prezența rănii care conține țesuturile deteriorate este, de asemenea, considerată ca stimulent imediat, dar regenerarea poate fi inițiată chiar și fără producerea unei răni deschise. Prin urmare, se arată că unele substanțe eliberate din țesuturile deteriorate și dezintegrate sunt cauza imediată a proceselor care urmează adică a regenerarii(Wei S., Yin X., Kou Y., Jiang B., 2009).

Această capacitate poate fi mărită sau micșorată / diminuată de mediu sau de tratamente speciale la care este expus experimental animalul.  Rata de regenerare depinde în mod natural de temperatură; creșterea temperaturii accelerează procesul de regenerare.

Temperaturile prea ridicate sau prea scăzute sunt letale pentru procesul de regenerare.  În timpul regenerării apar diferite tipuri de interacțiuni inductive. Neurosecrețiile hormonale produse de creier(ganglionii cerebroizi) și de nervii scalariformi ai cordonului nervos exercită un efect trofic local, de regenerare; astfel, în absența lor are loc o regenerare anormală. De exemplu, în cazul în care cordonul nervos este tăiat la o oarecare distanță de locul leziunii râmei, nu mai are loc procesul de regenerare la nivelul tăieturii. Cu toate acestea, un nou cap se dezvoltă la capătul tăiat al cordonului nervos. Prin neurosecrețiile hormonale, regenerarea poate fi indusă de-a lungul întregii lungimi a corpului la anelide (Wei S., Yin X., Kou Y., Jiang B., 2009).

Râmele își regenerează părți amputate ale corpului lor în cazul în care sistemul nervos este intact. Extractul de lumbricus pare a spori regenerarea nervului sciatic și recuperarea funcției prejudiciate, sugerând potențialul clinic al extractului cu privire la tratamentul leziunilor nervoase periferice la om (Wei S., Yin X., Kou Y., Jiang B.,2009).

I.4. Creșterea în cultura a râmelor (Lumbricus terrestris)

Se pregătește cultura pentru viermi înainte de sosirea lor și se așează în locuri ferite de lumina directă a soarelui, în cea mai racoroasa zona(4 – 16°C) a camerei, sau afară dacă este posibil.

Atât timp cât viermii sunt ținuti la temperaturi mai ridicate decat cea de îngheț, ei vor prospera și se vor reproduce.

Temperaturi peste 16°C vor încetini reproducerea, iar temperaturi peste 26°C pot fi fatale culturilor de viermi.

Râmele vor prospera în orice recipient de sticlă robust sau de material plastic. Un container de 30 × 30 × 45 cm în mărime poate găzdui până la 100 de râme.

Recipientul se umple până la un nivel de cel puțin 10 cm cu un sol argilos ușor umezit, care nu are o mult nisip sau lut în el. Se amestecă cu câteva frunze în descompunere sau alte materiale organice; frunze suplimentare ar trebui să fie plasate în partea de sus a solului culturii.

Râmele mănânca materia organică în descompunere care este furnizată de primul rând de frunzele în descompunere sau de materia organică.

Se adaugă câteva bucăți de pâine fărâmițate, cartofi tocati, zarzavat tocat sau mălai în partea de sus a solului la aproximativ fiecare trei săptămâni. Solul ar trebui să fie schimbat la fiecare șase luni, în cazul în care viermii sunt ținuți pe termen lung în cultură(Culturing Worms – BIO-FAX, 2006).

Capitolul II. Enzime. Generalități

Cele mai multe enzime sunt proteine​​, cu toate că au fost identificate câteva molecule de ARN cu activitate catalitică. Enzimele adoptă o structură tridimensională specifică, și pot angaja cofactori organici(de exemplu, biotina) sau anorganici (de exemplu, ionii de magneziu), pentru a ajuta la cataliză. Ele sunt substanțe care catalizează reacțiile biochimice din organism, având un rol esențial în biosinteza și degradarea substanțelor din materia vie, întîlnindu-se în toate organismele animale, vegetale și în microorganisme, mai fiind denumite din această cauză biocatalizatori.

Enzima formează cu substratul un produs intermediar reactiv, cu o viață scurtă. Sub această formă intermediară, substratul intrat în reacție suferă modificări electronice sub acțiunea centrilor activi ai enzimei, rezultând produsul de reacție.

Fără enzime, procesele biochimice s-ar desfășura cu viteze foarte mici.

Numărul enzimelor este de ordinul miilor căci, în lumea vie, fiecărei molecule organice, existente aici, trebuie să-i corespundă cel puțin o enzimă, care să participe la sinteza și/sau degradarea ei(Bairoch A., 2000).

II.1 Proprietățile generale ale enzimelor

La fel ca toți catalizatorii, enzimele actioneaza prin scăderea energiei de activare pentru reacție, crescând astfel semnificativ viteza reacției. Ca rezultat, produsele se formează mai rapid și reacțiile ajung la starea lor de echilibru mai rapid. Cele mai mari viteze de reacție catalizate de enzime sunt de milioane de ori mai rapide decat reacțiile necatalizate comparabile. Ca în cazul tuturor catalizatorilor, enzimele nu sunt consumate în reacțiile pe care acestea le catalizează și nici nu alterează echilibrul acestor reacții. Cu toate acestea, enzimele se deosebesc de majoritatea catalizatorilor pentru că sunt foarte specifice pentru substraturile lor. Enzimele catalizeaza aproximativ 4.000 de reacții biochimice(Bairoch A., 2000).

Enzimele au toate proprietățile generale ale catalizatorilor chimici, și anume:

măresc viteza reacțiilor chimice posibile din punct de vedere termodinamic;

activitatea catalitică se manifestă la concentrații mici;

la sfârșitul transformării se regăsesc în mediu nemodificați din punct de vedere cantitativ și calitativ.

complex complex

enzimă- enzimă-

enzimă substrat substrat produs

enzimă produs

Figura 2.1. Reprezentarea schematică a reacției enzimatice

Totuși, datorită caracterului lor proteic, enzimele posedă toate proprietățile fizico-chimice ale proteinelor, iar pentru că acționează în celula vie, mai prezinta o serie de proprietăți care le diferențiază net de catalizatorii chimici:

eficiență catalitică, mult mai mare;

condiții de temperatură, pH, presiune osmotică mult mai scăzute;

specificitate de acțiune ridicată.

La rândul ei, specificitatea de acțiune se împarte în:

specificitate de reacție;

specificitate de substrat;

specificitate absolută de grup;

specificitate relativă de grup;

stereo-specificitate etc.

Specificitatea de reacție este proprietatea care stă la baza clasificării enzimelor în șase clase (Cojocaru D.C. et al., 2007).

II.2 Nomenclatura enzimelor

Enzimele pot cataliza reacții cu un singur substrat respectiv cu două sau mai multe substraturi. Nomenclatura generală a reacțiilor enzimatice a fost concepută pentru a descrie un număr de substrate și produși implicați în aceste reacții, utilizând prefixele latine uni, bi, tri ș.a.m.d.cu referire la una, doua, trei sau mai multe specii moleculare.

Prima nomenclatură a enzimelor, pe baze științifice, a fost realizată în 1964, când Comisia de Enzimologie(EC) a Uniunii Internationale de Biochimie (IUB) a elaborat normele ce stau la baza nomenclaturii și clasificării enzimelor. Conform acestor norme denumirea enzimei trebuie să reflecte numele substratului supus transformării sau numele produsului de reacție și tipul de reacție catalizată de fiecare enzimă în parte, urmate de sufixul “- aza ”.

Denumirile triviale se mai pot utiliza atunci când respectivele denumiri ale enzimelor au intrat deja în uz, iar modificarea lor ar genera confuzii. Denumirile uzuale se folosesc atunci când denumirile sistemice sunt prea lungi, iar utilizare repetată a acestora ar deveni deranjantă, totuși trebuie, însă, menționată cel puțin odată denumirea științifică urmată de codul numeric al enzimei, dupa care se poate folosi denumirea trivială(Cojocaru D.C. et al., 2007).

II.3 Clasificarea enzimelor

Clasificarea enzimelor valabilă în prezent este clasificarea propusa în 1964 de Comisia de Enzimologie a Uniunii Internationale de Biochimie, care are la bază tipul și mecanismul reacției catalizate.

Astfel, enzimele se împart, conform acestui criteriu, în șase clase principale:

oxidoreductaze (EC 1 – catalizează reacțiile de oxidoreducere);

transferaze (EC 2 – catalizează reacții de transfer ale unor grupe de atomi ce pot fi și grupe funcționale de la un substrat la altul);

hidrolaze (EC 3 – catalizează scindarea legăturilor covalente din molecula substratului cu participarea moleculelor de apă);

liaze (EC 4 – catalizează reacții de adiție a unor grupe de atomi la molecula substratului sau clivarea acestor grupari cu rearanajarea ulterioară a valențelor);

izomeraze (EC 5 – catalizează reacții de izomerizare a substratelor);

ligaze sau sintetaze (EC 6 – catalizează formarea unor noi legături chimice carbon-carbon sau carbon-heteroatom, în majoritatea cazurilor utilizând energia stocată în ATP) (Cojocaru D.C. et al., 2007).

II.3.1 EC 3. Hidrolaze

Aceste enzime catalizează hidroliza diferitelor legături. Unele dintre aceste enzime pun probleme, deoarece acestea au o specificitate foarte mare, și nu este ușor să se decidă dacă două enzime descrise de autori diferiți sunt aceleași, sau dacă ar trebui să fie listate sub diferite intrări. În timp ce numele sistematic include întotdeauna cuvântul "hidrolază", denumirea comună este, în cele mai multe cazuri, formată din numele de substrat cu sufixul -aza. Se înțelege că numele substratului cu acest sufix, și nici un alt indicator, înseamnă o enzimă hidrolitică(Trevor Palmer, Ellis Horwood, 1991).

EC 3.1 Acționează asupra legăturilor esterice

Această subclasă conține enzimele esteraze. Esterazele sunt subdivizate în: carboxilic-ester hidrolaze(EC 3.1.1), tioester hidrolaze(EC 3.1.2), fosfomonoester hidrolaze sau fosfataze(EC 3.1.3), fosfodiester hidrolaze(EC 3.1.4), trifosfomonoester hidrolaze(EC 3.1.5), sulfoester hidrolaze sau sulfataze(EC 3.1.6), monoesteraze difosforice(EC 3.1.7) și fosfotriester hidrolaze(EC 3.1.8). Nucleazele, incluse anterior în EC 3.1.4, sunt acum plasate într-un număr de doua noi sub-subclase: exonucleazele(EC 3.1.11-16) și endonucleazele(EC 3.1.21-31)(Trevor Palmer, Ellis Horwood, 1991).

EC 3.1.3 Fosfomonoester hidrolaze:

EC 3.1.3.1 . Fosfataza alcalină

Reacție: monoester fosfat +H2O = alcool + fosfat

Nume sistematic: monoester-fosfat fosfohidrolaza (pH optim alcalin)

Caracterizare: specificitate largă, poate cataliza și transfosflorilările(Stadtman, T.C.1961);

EC 3.1.3.16. Protein serin/treonin fosfataza

Reacție: [proteină]-serin/treonin fosfat + H2O = [proteină]-serin/treonin + fosfat

Nume sistematic: Protein serin/treonin fosfat fosfohidrolaza

Caracterizare: grup de enzime care îndepărtează gruparea fosfat legată de un rest de serină/treonină dintr-o gamă largă de fosfoproteine, incluzând un număr de enzime care au fost fosforilate sub acțiunea unei kinaze(Ingebritsen T.S. și Cohen P.,1983);

EC 3.1.3.25. Inozitol fosfat fosfataza

Reacție: myo-inozitol fosfat + H2O = myo-inozitol + fosfat

Nume sistematic: Inozitol fosfat fosfataza fosfohidrolaza

Caracterizare: acționează asupra cinci din cele șase izoforme de fosfat mio-inozitol, cu excepția mio-inozitol 2-fosfat, dar nu acționează asupra a mai mult de un grup fosfat. De asemenea, acționează asupra adenozin 2'-fosfat(dar nu și asupra 3 'sau 5' fosfaților), sn-glicerol-3-fosfat și glicerol 2-fosfat. Sunt cunoscute două izoforme(Woscholski R. și Parker P.J.,2000).

EC 3.1.3.36. Fosfoinizitid 5-fosfataza

Reacție: 1-fosfatidil-1D-myo-inozitol 4,5-bisfosfat + H2O = 1-fosfatidil-1D-myo-inozitol 4-fosfat + fosfat

Nume sistematic: fosfatidil-1D-myo-inozitol 4,5-bisfosfat 4-hidrolaza

Caracterizare: aceste enzime pot scoate, de asemenea, gruparea 5-fosfat de la Ins(1,4,5) P3 și / sau Ins(1,3,4,5) P4. Ele sunt o familie diversă de enzime, cu diferite capacități de a cataliza două sau mai multe dintre cele patru reacții enumerate. Se consideră că utilizează inozitol lipidele, mai degrabă decât inozitol fosfații ca substrat in vivo. Toate aceste enzime pot utiliza una sau ambele Ptdlns(4,5) P2 și Ptdlns(3,4,5) P3 ca substraturi; aceasta este proprietatea principală care le diferențiază de EC 3.1.3.56, inozitol-polifosfat 5-fosfataza(Woscholski R. și Parker P.J.,2000).

EC 3.1.3.41. 4-nitrofenil fosfataza

Reacție: 4-nitrofenil fosfat + H2O = 4-nitrofenil + fosfat

Nume sistematic: 4-nitrofenil fosfat fosfohidrolaza

Caracterizare: o serie de alte substanțe, incluzând fenilfosfat, 4-nitrofenil sulfat, fosfatul de acetil și glicerol fosfat nu sunt substraturi ale acestei enzime(Attias J. și Durand H., 1973).

EC 3.1.3.67. Fosfatidil-inozitol-3,4,5-trifosfat 3-fosfataza

Reacție: fosfatidil-inozitol-3,4,5-trifosfat + H2O = fosfatidil-inozitol 4,5-bisfosfat + fosfat

Nume sistematic: fosfatidil-1D-myo-inozitol-3,4,5-trifosfat 3-hidrolaza

Caracterizare: necesită Mg2+. Nu defosforilează inozitol 4,5-bifosfat. Aceasta enzimă este activă și atunci când 2,3-bis (aciloxi) gruparea propil este îndepărtată, de exemplu, când se hidrolizează Ins(1,3,4,5) P4 la Ins(1,4,5) P3(Kabuyama Y., Nakatsu N., Homma Y., Fukui Y.,1996).

II.4 Cinetica reacțiilor enzimatice

Cinetica enzimatică reprezintă investigarea modului în care enzima leagă substraturi și le transformă în produse finale. Datele utilizate în analizele cinetice sunt de obicei obținute din cercetările activității enzimei. Înca din anii '90, dinamica multor enzime sunt studiate la nivel de molecule individuale.

În 1902, Victor Henri propus o teorie cantitativă a cineticii enzimelor(Henri, V., 1902), dar datele sale experimentale nu au fost utile, deoarece semnificația concentrației ionilor de hidrogen nu era încă apreciata corect.

Etapa catalitică

Etapa de legare la substrat

Figura 2.2. Cinetica reacției enzimatice

După ce Peter Lauritz Sørensen a definit scara logaritmică a pH-ului și a introdus conceptul de tamponare în 1909 (Sørensen P.L.,1909) chimistul german Leonor Michaelis și asistenta sa canadiană Maud Leonora Menten au repetat experimentele lui Henri și au confirmat ecuația lui, care este menționată ca ecuația Henri-Michaelis sau cinetica Menten (numită, de asemenea, cinetica/ecuația Michaelis-Menten)(Michaelis L., Menten M.,1913). Munca lor a fost dezvoltată în continuare de către G.E. Briggs și J.B.S. Haldane, care au derivat ecuațiile cinetice care sunt considerate și astăzi un punct de plecare în rezolvarea activității enzimatice (Briggs G. E.și Haldane J. B. S.,1925).

Enzimele pot cataliza până la câteva milioane de reacții pe secundă. De exemplu este decarboxilarea necatalizată a orotidin 5'-monofosfatului care are un timp de înjumătățire de 78 de milioane de ani. Cu toate acestea, atunci când se adaugă enzima orotidin 5'-fosfat decarboxilaza, același proces durează doar 25 de milisecunde(Radzicka A, Wolfenden R.,1995).

Viteza reacției enzimatice depinde de condițiile din soluție și concentrația substratului. Condițiile care denaturează proteina opresc activitatea enzimei, cum ar fi temperaturile ridicate, valorile extreme ale pH-ului sau concentrațiile mari de sare, în timp ce creșterea concentrației substratului tinde să crească atunci când activitatea [S] este scăzuta.

Figura 2.3. Viteza reacției enzimatice în funcție de concentrația substratului.

Pentru a afla viteza maximă a unei reacții enzimatice, concentrația substratului este mărită până la o rată constantă de formare a produsului. Acest lucru este arătat în curba de saturație de mai sus, unde pe ordonata este arătată viteza reacției enzimatice în funcție de creșterea concentrației de substrat(pe abcisă). Se ajunge la saturație pentru că, pe măsură ce crește concentrația de substrat, mai multa enzimă liberă este transformată în forma legată de substrat ES.

II.5 Controlul activității enzimatice

Există cinci modalități principale prin care activitatea enzimei este controlată în celulă și anume:

Producerea enzimelor(transcrierea și translația) pot fi îmbunătățite sau diminuate de celulă ca răspuns la schimbările din mediu. Această formă de reglare a genei se numește inducție enzimatică sau inhibiție enzimatică. De exemplu, bacteriile pot deveni rezistente la antibiotice, cum ar fi penicilina, deoarece pot inhiba producerea enzimelor numite beta-lactamaze, care induc hidroliza inelului beta-lactamic. Un alt exemplu sunt enzimele din ficat, numite citocrom P450 oxidaze, care sunt importante în metabolizarea medicamentelor. Inducerea sau inhibarea acestor enzime pot determina interacțiuni medicamentoase(Zenkin N., Yuzenkova Y., Severinov K., 2006).

Enzimele sunt în compartimente, diferite căi metabolice apar în diferite compartimente celulare. De exemplu, acizii grași sunt sintetizati de un singur set de enzime în citosol, reticulul endoplasmatic și aparatul Golgi și utilizate de către un alt set de enzime ca sursă de energie în mitocondrie, prin β-oxidare(Faergeman NJ, Knudsen J., 1997).

Enzimele pot fi reglate de inhibitori și activatori. De exemplu, produsul(-ele) final(-e) al(-e) unei căi metabolice este(sunt) adesea inhibitor(i) pentru una dintre primele enzime ale căii (de obicei primul pas ireversibil, numit etapa angajată), reglând, astfel, cantitatea de produs finit realizat de cale. Un astfel de mecanism de reglare este numit mecanism de feedback negativ, deoarece cantitatea de produs final rezultat este reglată de propria concentrație. Mecanismele de feedback negativ pot ajusta în mod eficient rata de sinteză a metaboliților intermediari în conformitate cu cerințele celulei. Acest lucru ajută alocarea economică a materialelor și a energiei și previne realizarea produselor finite în exces. Controlul acțiunii enzimatice ajută la menținerea unui mediu intern stabil în organismele vii.

Enzimele pot fi reglate prin modulare covalentă. Aceasta poate include fosforilarea, miristoilare și glicozilare. De exemplu, în răspunsul la insulină, fosforilarea multor enzime, inclusive a glicogen sintazei, ajută la controlul sintezei sau a degradarii glicogenului și permite celulei să răspundă la modificările glicemiei(Doble B. W. și Woodgett J. R., 2003). Un alt exemplu de modificare posttranslațională este scindarea lanțului polipeptidic. Chemotripsina, o protează digestiva, este produsă în formă inactivă ca chimotripsinogen în pancreas și transportată în această formă în duoden unde este activată. Acest tip de precursor inactiv pentru o enzima este cunoscut sub denumirea de zimogen.

Unele enzime pot deveni active atunci când sunt localizate într-un mediu diferit. De exemplu, hemaglutinina din virusul gripal este activată de o modificare conformațională cauzată de condițiile acide, acestea apar atunci când ea este transportată în interiorul celulei gazdă și intră în lizozom(Carr C. M. și Kim P. S., 2003).

Deoarece controlul strict al activității enzimatice este esențial pentru homeostazie, orice defecțiune(mutație, supraproducție, subproducție sau eliminare) a unei singure enzime critice poate duce la o boală genetică. Importanța enzimelor este demonstrată de faptul că o boală letală poate fi cauzată de funcționarea defectuoasă doar a unui singur tip de enzime din miile de tipuri prezente în corpul nostru. Un exemplu este cel mai comun tip de fenilcetonurie; o mutație a unui singur aminoacid în enzima fenilalanin hidroxilaza, care catalizează prima etapă în degradarea fenilalaninei duce la acumularea de fenilalanină și a produselor conexe. Acest lucru poate duce la retard intelectual în cazul în care boala este netratată(Phenylketonuria: NCBI Genes and Disease., 2007).

Capitolul III. Material și metode de lucru

III.1 Material biologic

Materialul biologic utilizat pentru cercetare a fost reprezentat de 80 de râme(Lumbricus terrestris). Acestea au fost colectate de pe dealul Bucium de la o altitudine de aproximativ 300 m, apoi transportate în laborator.

În laborator, râmele au fost ținute în recipiente de plastic de 5x5x2,5 cm în care s-a introdus mediu natural format din pământ de grădină îmbogățit cu substanțe nutritive(amestecat cu bucăți de pâine fărâmițate, cartofi tocați, zarzavat tocat și mălai)(Pisică C., Moglan I., Cojocaru I., 2002; Culturing Worms – BIO-FAX, 2006). Râmele au fost menținute în aceste recipiente 10 zile până la finalizarea regenerării.

III.1.1 Mod de lucru

Râmele au fost secționate în două părți aproximativ egale, iar determinarea parametrilor biochimici s-a facut pe partea anterioară, care conform literaturii se regenerează.

Câte opt părți anterioare ale râmelor au fost introduse diferențiat în zece recipiente de plastic cu mediu în așa fel încât să poată fi determinați parametrii biochimici eșalonat pe trei etape de regenerare(etape alese arbitrar în urma testărilor anterioare). Astfel, pentru prima etapă de regenerare râmele au fost secționate în trei zile diferite, la 12 ore diferență(în zilele de: 13.05-ora 06:00 și 18:00; 14.05-ora 06:00 și 18:00; 15.05-ora 06:00 și 18:00) și introduse în recipiente de plastic astfel încât pe data de 16.05.2014 s-a extras enzima și s-a determinat activitatea fosfatazelor alcaline și cantitatea de proteine totale. Pentru extragerea enzimei s-a folosit aproximativ 1g de material biologic(două părți anterioare).

Pentru etapa a doua s-a procedat la fel cu mențiunea că s-au folosit râme secționate în zilele anterioare(în zilele de:12.05-ora 18:00; 13.05-ora 06 și 18:00; 14.05-ora 06:00 și 18:00; 15.05-ora 06:00 și 18:00), astfel încât pe data de 19.05.2014 s-a extras enzima și s-a determinat activitatea fosfatazelor alcaline și cantitatea de proteine totale.

În sfârșit, pentru a treia etapă de regenerare s-a procedat la fel ca în etapa a doua, folosindu-se râme secționate în zile anterioare(în zilele de: 11.05-ora 06:00; 12.05-ora 06:00 și 18:00; 13.05-ora 06:00 și 18:00; 14.05-06:00) astfel încât pe data de 21.05.2014 s-a extras enzima și s-a determinat activitatea fosfatazelor alcaline(fotocolorimetric) și cantitatea de proteine totale(fotocolorimetric și electroforetic).

III.2 Extracția enzimei

Se ia o cantitate de aproximativ 1 g de material biologic(două părți anterioare) mojarat și omogenizat și se extrage cu 1 ml soluție (soluție tampon dietanolamina-HCl pH 8,8) timp de 60 minute la temperatura camerei, prin agitare pe agitator la 100 rpm. Se centrifughează apoi amestecul timp de 20 minute la 3000 rpm, supernatantul păstrându-se ca sursă de enzimă.

Figura 3.1 pH-metru tester Figura 3.2 Balanță analitică Partner

pH CHECKER HI98103

Figura 3.3 Centrifuga EBA 20

III.3 Determinarea activității fosfatazelor și a proteinelor totale

Fosfatazele sunt enzime care hidrolizează legăturile fosfoesterice la valori diferite de pH ale mediului de incubare.

Pentru determinarea fosfatazelor alcaline și a proteinelor totale s-a utilizat un analizor automat de biochimie clinică Konelab 60i PRIME(vezi anexe).

Metodica de lucru, parametrii de performanță, procedura de pregătire a probelor și reactivii de lucru fiind adaptate pentru determinările necesare(vezi anexe).

III.3.1 Determinarea activității fosfatazelor prin metoda Bessey, Lowry si Brock modificată

Principiul metodei. Prin utilizarea în calitate de substrat a p-nitrofenil fosfatul, acesta este hidrolizat de către fosfataze cu formare de p-nitrofenol și acid fosforic.

Activitatea enzimei în probă este corelată cu creșterea absorbanței p-nitrofenolului la 405 nm.

Reactivi :

Reactiv a: soluție tampon dietanolamina-HCl pH 8,8

Reactiv b: soluție MgCl 0,6 mM

Reactiv c: soluție substrat de p-nitrofenil fosfat 10 mM(pH 8,8)

Conditii de reacție:

Lungimea de unda : 405 nm

Temperatura de incubare: 20°C

Cuveta: 1cm3

Citire față de apă

Metoda: cinetică(crescătoare).

III.3.2 Determinarea proteinelor totale prin metoda pirogalol roșu – molibdat modificată

Principiul metodei. Proteinele ​​reacționează în soluție cu pirogalolul roșu și molibdatul de sodiu formând un complex colorat. Intensitatea culorii formate este proporțională cu concentrația de proteină în probă.

Reactivi :

Reactiv a: pirogalol roșu 60 μM

Reactiv b: molibdat de sodiu 40 μM

Reactiv c: oxalat de sodiu 1 mM

Reactiv d: benzoat de sodiu 3,5 mM

Reactiv e: metanol 100 M

Reactiv f: acid succinic 50 mM

Condiții de reacție:

Lungimea de unda : 600 nm

Temperatura de incubare: 20°C

Cuveta: 1cm3

Citire față de apă

Metoda: endpoint (crescătoare).

Figura 3.4 Analizorul automat de biochimie clinică Konelab 60i PRIME

III.4 Electroforeza proteinelor pe gel de agaroză

S-a utilizat o linie automată de electroforeza Hydrasys 2 Scan(vezi anexe), kit de mutifracționare a proteinelor din ser sau orice alte lichide biologice – HYDRAGEL15/30 β1β2.

Kit-ul HYDRAGEL 15/30 β1β2 permite multifracționarea proteinelor din ser sau din orice alt lichid biologic prin electroforeza pe gel de agaroză. Proteinele sunt separate în tampon alcalin (pH 8,8). Kiturile se proceseaza pe aparatul Hydrasys 2Scan. Densitometric putem obține valori cantitative sau relative.

Principiul metodei. Electroforeza proteinelor este o tehnică de rutină utilizată în laboratoarele de analize pentru analizarea profilului proteic din ser sau din alte lichide biologice. Se bazează pe tehnica electroforezei de zonă, efectuată pe un mediu de suport adecvat. Pe gelurile HYDRAGEL15/30 β1β2 proteinele din ser, urina sau lichide biologice, separă în opt fracțiuni. Fiecare fracțiune conține una sau mai multe proteine. Compoziția gelului, condițiile de electrofreză, cât și alegerea colorantului(amidoblack) permit o rezoluție excelentă și o mare sensibilitate. Fracțiunile colorate sunt evaluate densitometric pentru a obține valori cantitative relative ale fracțiunilor proteice individuale sau combinate.

Aparatura de laborator utilizată a fost constituită din: pipete automate de 10-100μl și 100-1000μl, eprubete de 10 ml, balon cotat de 100 ml, mojar de porțelan cu pistil precum și din pH-metru tester pH CHECKER HI98103(Figura 3.1), balanță analitică Partner(Figura 3.2), centrifugă EBA20(Figura 3.3), analizor automat de biochimie clinică Konelab 60i PRIME(Figura 3.4) și linia automată de electroforeză Hydrasys 2 Scan(Figura 3.5).

Figura 3.5 Linia automată de electroforeză Hydrasys 2 Scan

III.5 Statistica datelor experimentale obținute

Parte integrantă a statisticii matematice este și statistica biologică, denumită de K. Pearson biometria. Este știința care aplică metodele statistice la studiul multiplelor aspecte ale vieții. Studierea fenomenelor ce apar în cazul ființelor vii este incontestabil mai greu de realizat decât în cazul celor tipice(lumea anorganica). În biologie foarte mulți factori care intervin în studiul fenomenelor nu pot fi influențati de cercetător (de exemplu efectul vremii asupra cultivării plantelor)(Jolliffe I. T., 2002).

Planificarea experimentelor trebuie respectată cu foarte mare strictețe, evitându-se cheltuielile inutile. Datele sau valorile obtinute din experimente se culeg în funcție de mărimea eșantionului și de numărul de caracteristici studiate.

Datele sau valorile, în funcție de caracteristica urmarită, pot fi:

măsurători; ex.  dimensiunea, greutatea etc.

numărători; ex. nr. de semințe, nr. de petale etc.

analize de laborator; ex. conținutul de grăsimi, conținutul de substanțe proteice etc. și se pot reprezenta sub forma de tabele și sub formă de grafice.

Pentru analiza statistică a unui fenomen și formularea concluziilor privind legea căreia i se supune fenomenul studiat nu sunt suficiente doar gruparea datelor eșantionului, alcătuirea repartiției statistice și reprezentarea sa grafică. Este necesar ca datele, în numar suficient de mare, să fie sintetizate într-un indicator care să dea informații în ceea ce privește variația valorilor șirului statistic(Neyman J. și Pearson E. S., 1928).

În prelucrarile statistice se folosesc urmatoarele categorii de indicatori:

indicatori de poziție;

indicatori ai variației;

indicatorul  asimetriei;

indicatorul excesului.

III.5.1 Indicatori de poziție

Analizând datele obținute dintr-un eșantion se observă ca deși au diverse valori există totuși o tendința de grupare a datelor în jurul unei anumite valori centrale a repartiției. Orice marime care dă informații asupra poziției valorilor principale ale repartiției statistice se numeste indicator de poziție. Dintre indicatorii de poziție enumerăm și definim următorii:

media

mediana

valoarea modala

1. Media repartitiei statistice. Considerăm  x1,x2,x3, … ,xn valorile distincte obținute asupra caracteristicii studiate la  un eșantion de volum n. Marimea notata cu xa  și calculată după formula:

xa =    se numește media aritmetică a valorilor eșantionului.

Reținem că:   x1 ≠ xa ≠ xk

În cazul unor eșantioane, la care valorile caracteristicilor prezinta un ritm de creștere uniform (cum ar fi cel al diviziunii celulare), cel mai adecvat indicator de poziție este media geometrică. Considerăm  x1,x2,x3, … ,xn valorile distincte obținute asupra caracteristicii studiate; în acest caz media geometrică  este dată de următoarea formulă:

xg =  și se calculează prin logaritmare:   log xg =

adică logaritmul mediei geometrice este egal cu suma logaritmilor valorilor distincte.

2. Mediana repartitiei statistice. Considerăm x1,x2,x3, … ,xn valorile distincte ale șirului statistic, ordonate crescător. Se definește mediana ca fiind acea valoare distinctă din șir care-l împarte în două șiruri egale ca număr, spre stânga și spre dreapta. Se noteaza cu Me.   Dacă volumul eșantionului este:

numar impar n = 2k+1,  atunci rezulta  Me =  xk+1

numar par     n = 2k,      atunci rezulta   Me = (xk + xk+1)/2

3. Valoarea modala (modul) a repartitiei statistice. În cazul șirului statistic cu valori distincte nu se pune problema valorii modale(Jolliffe I. T., 2002).

II.5.2 Indicatori ai variației

Pentru o caracterizare mai precisă a valorilor statistice ale unui eșantion este necesar să se cunoască modul de grupare a valorile distincte în jurul valorii medii, cu alte cuvinte care este dispersia sau împrăștierea valorilor distincte în jurul valorii medii.

Indicatorii care măsoara variația valorilor distincte în jurul mediei aritmetice se numesc indicatori ai variației. Dintre indicatorii variației explicităm:

amplitudinea

varianta(dispersia)

abaterea standard (deviația sau eroarea standard)

coeficientul de variație

Amplitudinea variației. Indicatorul este măsura cea mai simplă a dispersiei. Se definește ca diferența dintre valoarea individuală cea mai mare și cea mai mică a șirului statistic; se notează cu R și este:    R = xmax – xmin

Utilitatea indicatorului este redusă pentru că folosește valorile extreme, care pot fi întâmplătoare și nu reflectă împrăștierea celorlalte valori(Jolliffe I. T., 2002).

Varianța(dispersia). Considerăm valorile distincte x1, x2, …, xn ale caracteristicii eșantionului; se calculează media aritmetică a acestor valori xa; se calculează diferențele xi-xa numite abateri; se calculeaza pătratul abaterilor: (xi-xa)2; se face suma pătratelor abaterilor și rezultatul se împarte la n-1; valoarea obținuta se numește variant. În cazul șirului statistic cu valori distincte, varianța, notata cu s2 se calculează dupa formula:

s2 =   sau dupa efectuarea calculelor  s2 =

Observație:  Dacă varianța calculată are valoare:

mica;  aceasta indică o grupare strânsa a valorilor caracteristicii eșantionului în jurul valorii medii;

mare; aceasta indică o împrăștiere a valorilor individuale față de valoarea medie, adică eșantionul prezintă o mare variabilitate (în biologie înseamnă diversitate, neasemănarea indivizilor dintr-o grupă)(Jolliffe I. T., 2002).

Abaterea standard(deviatia sau eroarea standard). Indicatorul, numit și abatere medie pătratică, notat cu s și calculat după formula:

s =

ne arată, în aceleași unități de măsură ca și ale valorilor distincte, cu cât se abat în medie valorile distincte față de media lor. Se folosește la determinarea intervalului de încredere de forma

(xa – s, xa + s)   unde se află majoritatea valorilor caracteristicilor studiate din eșantion(Jolliffe I. T., 2002).

Coeficientul de variatie(coeficientul de împrăștiere). Abaterea standard fiind un indicator absolut al dispersiei(deci are aceeași dimensiune ca și variabila studiată) nu este posibil să comparăm între ele două sau mai multe repartiții statistice (X,Y, …) în ceea ce privește variația lor. Comparația este posibilă dacă vom calcula coeficientul de variație cu ajutorul formulei:

c.v.%  =

Cu cât c.v.%  al unei repartiții statistice este mai mic cu atât variația repartiției statistice este mai mică. În biologie repatițiile statistice cu:

c.v.% < 10% prezintă variație mica;

c.v.% între 10% și 20%  prezintă variație mijlocie;

c.v.% > 20% prezintă variație mare(Jolliffe I. T., 2002).

Pentru a minimaliza erorile care pot apărea în prelucrarea datelor experimentale obținute am folosit, din metodele statistice prezentate mai sus, media aritmetică, abaterea standard(deviația standard) și coeficientul de variație.

Capitolul IV. Rezultate și discuții

În acest experiment s-a dorit relevarea unor aspecte biochimice ale regenerării la specia Lumbricus terrestris(râma comună) și anume determinarea activității fosfatazelor(limitată de folosirea unui substrat(p-nitrofenil fosfat) utilizat de mai multe fosfataze, restrângerea numărului de fosfataze care pot utiliza acest substrat fiind făcută de pH-ul bazic (pH 8,8) și de temperatura folosită la determinări(20°C)), și determinarea cantității de proteine totale.

S-a împărțit, în mod arbitrar, după testarea capacității de regenerare a râmelor, perioada scursă între inducerea regenerării prin secționare și regenerarea completă a unui individ în trei etape.

Prima etapă începe cu inducerea regenerării, prin secționare, și se încheie cu formarea unui manșon conic. Această masă de celule dediferențiate, împreună cu țesutul epidermic se numește mugure de regenerare sau blastemă regenerativă(Goss R. J., 1969). A doua etapă este cuprinsă între formarea mugurelui de regenerare până la apariția unui rudiment al părții lipsă, iar a treia parte se încheie cu transformarea rudimentului în partea lipsă(care este mai mică decât partea originală). Acest tip de regenerare este cunoscut sub numele epimorfoză sau regenerare epimorfică(Goss R. J., 1969).

Deoarece procesele biochimice care reglează exprimarea fosfatazelor alcaline în timpul diferențierii celulelor sunt puțin înțelese, am examinat activitatea fosfatazelor alcaline în țesut intact (proba martor) și în timpul proceselor de dediferențiere și reconstrucție celulară din timpul regenerării anelidului Lumbricus terrestris. S-a constatat că rata sintezei enzimei(urmărită cu ajutorul dozării proteinelor totale) și maximul activității fosfatazelor alcaline sunt diferențiate temporal. Astfel, observăm o creștere semnificativă a concentrației de proteine totale în prima etapă a regenerării, ceea ce sugerează o sinteză crescută a enzimelor(în special a celor proteolitice) ce se corelează cu o creștere relativ ușoară a activității enzimatice a fosfatazelor alcaline(Figura 4.1 și Figura 4.2).

Se presupune că în această primă etapă are loc reorganizarea celulară. Natura acestei reorganizări celulare este dată de neoblaști care servesc la formarea părții regenerative după ce se activează și migrează spre suprafața lezata a viermelui. Hormonii de leziune și secrețiile neuro-hormonale ale creierului și măduvei nervoase joacă un rol vital (Wei S., Yin X., Kou Y., Jiang B., 2009).

Această perioadă este cunoscută și ca stadiul distructiv al metabolismului, în care se observă o dediferențiere considerabilă a țesuturilor adulte.  În acest stadiu are loc creșterea bruscă în activitate a enzimelor proteolitice. Cantitatea de aminoacizi liberi se dublează în țesuturile normale, din cauza dediferențierii.  Coeficientul respirator (RQ) în țesutul degenerat scade brusc, ceea ce este un semn de oxidare incompletă în țesut.  Aminoacizii liberi, acidul lactic și radicalii liberi –SH care se acumulează în celulele degenerate provoacă scăderea pH-ului în țesuturile blastemului, care, apoi, revine încet la nivelul normal(Wei S, Yin X, Kou Y, Jiang B, 2009) și din acest motiv, activitatea fosfatazelor alcaline este relativ scăzută în raport cu creșterea cantității de proteine totale(vezi Tabelul 1., Figura 4.1, Figura 4.2, Figura 4.3 și Figura 4.4).

Tabelul 1. Prima etapă a regenerării

Figura 4.1 Reprezentarea grafică a activității fosfatazelor alcaline(în prima etapă de regenerare).

Figura 4.2 Reprezentarea grafică a activității fosfatazelor alcaline(în prima etapă de regenerare) în raport cu cantitatea de material biologic utilizată în determinare.

Figura 4.3 Reprezentarea grafică a concentrației proteinelor totale(în prima etapă de regenerare) în raport cu cantitatea de material biologic utilizată în determinare.

După cum se poate vedea din Tabelul 1 și Figura 4.1, Figura 4.2, în primele 36 de ore după inducerea regenerării cantitatea de proteine totale crește încet, corelându-se cu o creștere și mai lentă a activității fosfatazelor alcaline, ceea ce corespunde cu literatura referitoare la regenerarea epimorfică. Apoi din a doua zi după inducere, asistăm la o creștere semnificativă a cantității de proteine totale(Figura 4.3 și Figura 4.4), însoțită de una și mai accentuată a activității enzimatice. Aceste aspect au fost relevate și de electroforeza extractului enzimatic în gel de agaroză(Tabelul 1.a, Figurile 4.4 și 4.5). Pe electroforeză s-a urmărit fracțiunea proteică care migrează în poziție intermediară, între fracțiunea unde migrează prealbumina și cea unde migrează albumina în mediu bazic(pH 8,8). Valorile migrării, indiferent dacă au fost luate în considerare valorile absolute(în procente) sau cele relative(în funcție de concentrația de proteine totale) au aceeași alură cu valorile determinate ale activității fosfatazelor alcaline precum și cele ale concentrației proteinelor totale.

În această primă etapă(corespunde fazei catabolice de regenerare), activitatea enzimatică atinge apogeul în momentul formării manșonului conic de neoblaști, apoi trecem în etapa a doua.

Tabelul 1.a Prima etapă a regenerării(fracțiile electroforetice)

Figura 4.4 Reprezentarea grafică a migrării electroforetice(în prima etapă de regenerare) în procente.

Figura 4.5 Reprezentarea grafică a migrării electroforetice în raport cu concentrația proteinelor totale(în prima etapă de regenerare).

A doua etapă a regenerării debutează cu o creștere bruscă a activității fosfatazelor alcaline corelată cu o menținere relativ constantă a cantității de proteine totale, ceea ce ar corespunde unei activități intense de reconstrucție a țesutului lezat.

Fosfatazele acționează în opoziție cu kinazele care adaugă grupuri fosfat proteinelor. Atașarea unui grup fosfat poate activa sau inactiva o enzimă sau permite interacțiunile proteină-proteină(prin intermediul domeniilor SH2).

Prin urmare, fosfatazele sunt parte integrantă a multor căi de transducție a semnalului.

Grupările fosfat sunt importante în transducția semnalului, deoarece acestea reglează proteinele de care sunt atașate activându-le sau inactivându-le. Pentru a inversa efectul, fosfatul este eliminat. Acest lucru se întâmplă de la sine prin hidroliză, sau este mediat de către fosfataze.

Astfel, o creștere de patru ori, așa cum se observă în debutul etapei a doua și pe tot parcursul acesteia, a activității fosfatazelor se traduce prin faptul că evenimentele de fosforilare, esențiale pentru menținerea acțiunii coordonate a cascadelor de semnalizare, și care sunt reglate prin activitatea concertată a fosfatazelor și a kinazelor, predomină.

Prin căile de semnalizare sunt reglate și sunt coordonate evenimentele care duc la formarea rudimentului părții posterioare lipsă.

Cele de mai sus pot fi observate în Tabelul 2 și Figurile 4.6, 4.7 și 4.8.

Valorile migrării, indiferent dacă au fost luate în considerare valorile absolute(în procente) sau cele relative(în funcție de concentrația de proteine totale) au aceeași alură cu valorile determinate ale concentrației proteinelor totale, dar diferă de valorile fosfatazelor alcaline care au un trend ascendent.

Astfel, valorile migrării au o alură relativ constantă cu o ușoară tendință de scădere(Tabelul 2.a, Figurile 4.9 și 4.10).

Această etapă ar corespunde fazei anabolice a regenerării; fază caracterizată printr-o creștere a capacității de oxidare (RQ); a scăderii grupurilor de radicali liberi -SH și a acidului lactic; imbogățire cu ARN citoplasmatic; creșterea în mărime a nucleelor din celulele care participă la regenerare. Acest stadiu este cunoscut sub numele de stadiul constructiv al metabolismului. Simultan țesuturile eliberează cantități mari de ioni de potasiu, în timp ce ionii de clor și cei de sodiu sunt conservați. Glandele endocrine, secrețiile neuro-hormonale ale creierului, ale măduvei nervoase și ale gonadelor influențează, de asemenea, modificările fiziologice prin hormonii lor(Wei S, Yin X, Kou Y, Jiang B, 2009).

Tabelul 2. A doua etapă a regenerării

Figura 4.6 Reprezentarea grafică a activității fosfatazelor alcaline(în a doua etapă de regenerare).

Figura 4.7 Reprezentarea grafică a activității enzimatice a fosfatazelor alcaline(în a doua etapă de regenerare) în raport cu cantitatea de material biologic utilizată în determinare.

Figura 4.8 Reprezentarea grafică a concentrației proteinelor totale(în a doua etapă de regenerare) în raport cu cantitatea de material biologic utilizată în determinare.

Tabelul 2.a A doua etapă a regenerării(fracțiile electroforetice)

Figura 4.9 Reprezentarea grafică a migrării electroforetice(în a doua etapă de regenerare) în procente.

Figura 4.10 Reprezentarea grafică a migrării electroforetice în raport cu concentrația proteinelor totale(în a doua etapă de regenerare).

Etapa a doua de regenerare se termina cu formarea rudimentului părții posterioare a râmei ce corespunde maximului activității enzimatice a fosfatazelor alcaline, declinul activității începe cu debutul etapei a trei în care are loc acumularea substanțelor nutritive și creșterea în dimensiuni a rudimentului până la atingerea numărului aproximativ de segmente avut înainte de lezare. Uneori, sunt dezvoltate un număr de segmente de prisos, procesul fiind cunoscut sub numele de super-regenerare(Wei S., Yin X., Kou Y., Jiang B., 2009). În această etapă are loc o scădere accentuată a activității fosfatazelor alcaline, precum și o scădere mai accentuată a cantității de proteine totale. Totuși activitatea enzimatică are valori sensibil mai ridicate decât cea de la începutul regenerării. Acestea apropiindu-se ca valoare activității enzimatice de la sfârșitul primei etape de regenerare.

Aceste aspecte sunt evidențiate în Tabelul 3 și în Figurile 4.11, 4.12 și 4.13. Valorile migrării, indiferent dacă au fost luate în considerare valorile absolute(în procente) sau cele relative(în funcție de concentrația de proteine totale) au aceeași alură cu valorile determinate ale activității fosfatazelor alcaline precum și cele ale concentrației proteinelor totale.

Tabelul 3. Etapa a treia a regenerării

Figura 4.11 Reprezentarea grafică a activității enzimatice a fosfatazelor alcaline(în a treia etapă de regenerare).

Figura 4.12 Reprezentarea grafică a activității enzimatice a fosfatazelor alcaline(în a treia etapă de regenerare) în raport cu cantitatea de material biologic utilizată în determinare.

Figura 4.13 Reprezentarea grafică a concentrației proteinelor totale(în a treia etapă de regenerare) în raport cu cantitatea de material biologic utilizată în determinare.

Tabelul 3.a A treia etapă a regenerării(fracțiile electroforetice)

Valorile migrării, indiferent dacă au fost luate în considerare valorile absolute(în procente) sau cele relative(în funcție de concentrația de proteine totale) au aceeași alura cu valorile determinate ale concentrației proteinelor totale și a valorilor fosfatazelor alcaline care au un trend descendent. (Tabelul 3.a, Figurile 4.14 și 4.15).

Figura 4.14 Reprezentarea grafică a migrării electroforetice(în a treia etapă de regenerare) în procente.

Figura 4.15 Reprezentarea grafică a migrării electroforetice în raport cu concentrația proteinelor totale(în a treia etapă de regenerare).

Concluzii

Din analiza datelor obținute prin determinarea parametrilor biochimici (activitatea fosfatazelor alcaline, a cantității de proteine totale precum și analiza electroforetică a extractului enzimatic) în timpul desfășurării procesului de regenerare indus de secționarea animalelor de experiență(râme); împărțit, în mod arbitrar, în trei etape, s-au impus următoarele concluzii:

Activitatea fosfatazelor alcaline a avut o creștere ușoară în primele 48 de ore, pentru ca în următoarele 24 de ore să se înregistreze o creștere semnificativă, ceea ce corespunde cu literatura referitoare la tipul de regenerare epimorfic(caracteristic lumbricidelor). Activitatea acestor enzime a evidențat o creștere explozivă (de aproximativ patru ori, maximul atingându-se la 144 de ore după secționare, cu o valoare de 105.042 nkat/g material biologic), apoi asistăm, în primele 24 de ore(după formarea completă a rudimentului părții lipsă), la o scădere ușoară din ce în ce mai accentuată în ultimele 60 de ore până la refacerea completă a părții lipsă, cu aproximativ același număr de segmente avut înaintea lezării.

Cantitatea de proteine totale a avut o evoluție diferită de cea a activității fosfatazelor alcaline; astfel, în timp ce maximul activității enzimatice este atins la 144 de ore de la secționare, în cazul cantității de proteine totale, maximul se constată mult mai devreme, la 72 de ore de la secționare(cu o valoare de 8.258 mg/g material biologic)(după formarea manșonului conic de neoblaști) la sfârșitul fazei catabolice, după care începe să scadă până la sfârșitul regenerării.

Procesul de regenerare la râmă este epimorfic, aceasta explică variația valorilor activității fosfatazelor alcaline în raport cu concentrația proteinelor totale. Astfel, în cazul tipului epimorfic de regenerare, în primele două zile de la inducerea procesului de regenerare, au loc fenomene de reorganizare celulară și de dediferențiere care au ca rezultat scăderea pH, prin acumulare de aminoacizi liberi, acid lactic și radicali liberi, care, apoi, revine încet la nivelul normal. Această scădere a pH-ului explică de ce activitatea fosfatazelor alcaline este scăzută în raport cu cantitatea de proteine totale determinată. Creșterea de patru ori a activității fosfatazelor alcaline(la 84 de ore de la secționare), se traduce prin faptul că evenimentele de fosforilare, esențiale pentru menținerea acțiunii coordonate a cascadelor de semnalizare, și care sunt reglate prin activitatea concertată a fosfatazelor și a kinazelor, predomină. Prin căile de semnalizare sunt reglate și sunt coordonate evenimentele care duc la formarea rudimentului părții posterioare lipsă. Apoi are loc o scădere accentuată a activității fosfatazelor alcaline, precum și o scădere mai accentuată a cantității de proteine totale. Totuși activitatea enzimatică are valori sensibil mai ridicate decât valoarea de la începutul regenerării.

Bibliografie

Agata K., Saito Y. și Nakajima E., 2007. Unifying principles of regeneration I: epimorphosis versus morphallaxis. Development, Growth and Differentiation 49: 73–78.

Aioanei F., Stavescu-Bedivan M.M., 2011. Zoologia nevertebratelor – Manual universitar, Ed. Bioflux, Cluj Napoca, 161-165

Albert P. și Boilly B., 1988. Effect of transferrin on amphibian limb regeneration: A blastema cell culture study. Roux Arch. Dev. Biol.;197:193–196.

Albumin: analyte monograph. Association for Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine. Retrieved 23 June 2013.

Allen B. M., 1914. Extirpation experiments in Rana pipiens larva. Science. ;44:755–757.

Anderson , D.T. 1973, Embryology and Phylogeny in Annelids and Arthropods, International Series of Pure and Applied Biology. Oxford : Zoological Division Pergamon Press .

Attias, J. și Durand H., 1973. Further characterization of a specific p-nitrophenylphosphatase from baker's yeast. Biochim. Biophys. Acta 321.561-568.

Bairoch A., 2000. "The ENZYME database in 2000" . Nucleic Acids Res 28 (1): 304–5.

Barnes R. S. K.; Calow, P.; Olive, P. J. W., 1993. The invertebrates: a new synthesis, Blackwell Scientific, Oxford.

Bely A.E. și Wray G.A., 2001. Evolution of regeneration and fission in annelids: insights from engrailed – and orthodonticle – class gene expression . Development 128 , 2781 – 2791 .

Bely A.E., 1999. Decoupling of fission and regeneration capabilities in an asexual oligochaete . Hydrobiologia 406 ,243 – 251 .

Bely A.E., 2006 . Distribution of segment regeneration ability in the Annelida. Int. Comp. Biol. 46, 508 – 518 .

Berrill N.J., 1952. Regeneration and budding in worms . Biol. Rev. 27 , 401 – 438 .

Bode P. M. și H. R. Bode., 1984. Patterning in Hydra.In G. M. Malacinski and S. V. Bryant (eds.), Pattern Formation. Macmillan, New York, pp. 213–241.

Boguleanu G.G., 1988. Fauna daunatoare culturilor agricole si forestiere din Romania, vol. I, Ed. Ceres, Bucuresti.

Briggs G. E. și Haldane J. B. S., 1925. "A note on the kinetics of enzyme action". Biochem. J. 19 (2): 339–339.

Bryant S., 1999. A regeneration renaissance. Semin. Cell Dev. Biol.;10:313.

Butenandt A și Karlson P., 1954. Über die Isolierung eines Metamorphosen-Hormons der Insekten in kristallisierter Form. Z. Naturforsch. B. ;9:389–391.

Butt Kevin R. și Nuutinen, Visa., 1998. Reproduction of the earthworm Lumbricus terrestris Linne after the first mating. Canadian Journal of Zoology. 76(1). Jan., 1998. 104-109

Carr C. M. și Kim P. S., 2003. "A spring-loaded mechanism for the conformational change of influenza hemagglutinin". Cell 73 (4): 823–32.

Carter G.S., 1940 – A general zoology of the Invertebrates.4th Edition, pp. 421.

Clarke M.E. și R.B.Clark, 1962 – Zool. Jb. Physiol.70, 24.

Cojocaru D.C., Zenovia Olteanu, Elena Ciornea, Lacramioara Oprica, Sabina-Ioana Cojocaru, Enzimologie generala, Editura Tehnopress, Iasi. 8-25, 43-82

Crawford K. și Stocum D L., 1988. Retinoic acid coordinately proximalizes regenerate pattern and blastema differential affinity in axolotl limbs. Development.;102:687–698.

Culturing Worms in BIO-FAX, Publication No. 10593, 2006, Flinn Scientific, Inc. ,IL

Damoff George Alan și Reynolds, John Warren, 2009. The Earthworms (Oligochaeta: Acanthodrilidae, Eudrilidae, Lumbricidae, Megascolecidae, Ocenerodrilidae, and Sparganophilidae) of East Texas, USA. Megadrilogica. 13(8). OCT 2009. 113-140.

Dinsmore C. E. (ed.), 1991. A History of Regeneration Research: Milestones in the Evolution of a Science.Cambridge University Press, New York.

Doble B. W. și Woodgett J. R., 2003. "GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase". J. Cell. Sci. 116 (Pt 7): 1175–86.

Edwards C.A. și J.R. Lofty, 1977 – In: Biology of Earthworms (Chapman and Hall, Ed.) Johnwiley & Sons, New York, pp. 333.

Elizabeth D.Hay, 1966 – Biology studies – Regeneration. Holt, Rinehart and Winston, New York, Chicago, San Fransisco, Toranto, London, pp.148.

Faergeman N.J. și Knudsen J., 1997. "Role of long-chain fatty acyl-CoA esters in the regulation of metabolism and in cell signalling". Biochem. J. 323 (Pt 1): 1–12.

Firă V. și Năstăsescu M., 1977. Zoologia nevertebratelor. Ed. Didact. Si Pedag., București, 406

Goss R. J., 1969. Principles of Regeneration. Academic Press, New York.

Henri V., 1902. "Theorie generale de l'action de quelques diastases". Compt. Rend. Hebd. Acad. Sci. Paris 135: 916–9.

Herlant – Meewis H., 1961. Regeneration du systeme nerveux chez Eisenia foetida. Bull. Biol. Fr. Belg., 95 : 695-730.

Higgins G M și Anderson R M.,1931. Experimental pathology of the liver. I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. ;12:186–202.

Ingebritsen T.S. și Cohen P.,1983. The protein phosphatases involved in cellular regulation. 1. Classification and substrate specificities. Eur. J. Biochem. 132, 255-261.

Johnson L. G., 1995. Johnson & Volpe's Patterns & Experiments in Developmental Biology, Second Edition. Wm. C. Brown Publishers.

Jolliffe I. T., 2002. Principal Component Analysis, 2nd ed. New York: Springer-Verlag.

Kabuyama Y., Nakatsu N., Homma,Y., Fukui Y.,1996. Purification and characterization of phosphatidyl inositol-3,4,5-trisphosphate phosphatase in bovine thymus. Eur. J. Biochem. 238. 350-356.

Mark J Zoran, 2010. Texas A&M University, and College Station, Texas, USA Published online: September 2010.

Martinez V.G., Menger G.J. III, Zoran M.J., 2005. Regeneration and asexual reproduction share common molecular changes: upregulation of a neural glycoepitope during morphallaxis in Lumbriculus . Mech. Dev. 122 ,721 – 732 .

Michaelis L., Menten M.,1913. "Die Kinetik der Invertinwirkung". Biochem. Z.49: 333–369.

Müller M.C.M., Berenzen A., Westheide W., 1994. Experiments on anterior regeneration in Eurythoe complanata (“Polychaeta”, Amphinomidae): reconfiguration of the nervous system and its function for regeneration. Zoomorphology, 2003;122:95-103;45(2-4):179-87.

Myohara M. , Niva C.C., Lee J.M., 2006 . Molecular approach to annelid regeneration: cDNA subtraction cloning reveals various novel genes that are upregulated during the large – scale regeneration of the oligochaete, Enchytraeus japonensis . Dev. Dyn. 235 , 2051 – 2070 .

Newman S A., 1974. The interaction of the organizing regions of hydra and its possible relation to the role of the cut end of regeneration. J. Embryol. Exp. Morphol.;31:541–555.

Neyman J. și Pearson E. S., 1928. "On the use and interpretation of certain test criteria for purposes of statistical inference". Biometrika 20: 175–240.

Okada Y.K. 1929 . Regeneration and fragmentation in the syllidian polychaetes . Roux Arch. Entw. Mech. Organ. 115, 542 – 600 .

Phenylketonuria: NCBI Genes and Disease. Retrieved 4 April 2007.

Pisica C., Moglan I., Cojocaru I., 2002. Zoologia nevertebratelor – Lucrari practice de laborator- vol. II, Ed.Univ.”Al.I.Cuza”, Iasi.19-21.

RaduV.,RaduV.V.,1967. Zoologia nevertebratelor Vol. I. Editura Didactică și Pedagogica, Bucuresti

Radzicka A., Wolfenden R., 1995. "A proficient enzyme". Science 267 (5194): 90–931.

Rao R.K., P.J. Conklin și A.C.Brannar, 1978 – Inhibition of limb regeneration in the Grass Shrimp, Palaeomonetes pugio, by Sodium Pentachlorophenate. In: Pentachlorophenol (K. Ranga Rao, Ed.) Plenum Press, New York și London.

Sørensen P.L.,1909. "Enzymstudien {II}. Über die Messung und Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration bei enzymatischen Prozessen". Biochem. Z.21: 131–304.

Stadtman T.C., 1961. Alkaline phosphatases. In: Boyer, P.D., Lardy, H. and Myrbäck, K. (Eds), The Enzymes, 2nd edn, vol. 5, Academic Press, New York, pp. 55–71.

Tettamanti G. , Grimaldi A. , Congiu T. , Perletti G. , Raspanti M. , Valvassori R. de Eguileor M., 2005 . Collagen reorganization in leech wound healing . Biol.Cell 97, 557 – 568 .

Trevor Palmer și Ellis Horwood, 1991. Understanding enzymes (3rd edition). Chichester, UK; 32–36

Wei S., Yin X., Kou Y., Jiang B., 2009. Lumbricus extract promotes the regeneration of injured peripheral nerve in rats, J Ethnopharmacol. 2009 May 4;

Woscholski R. și Parker, P.J., 2000. Inositol phosphatases: constructive destruction of phosphoinositides and inositol phosphates. In: Cockcroft, S. (Ed.), Biology of Phosphoinositides, Oxford University Press, Oxford, pp. 320-338.

Zenkin N., Yuzenkova Y., Severinov K., 2006. "Transcript-assisted transcriptional proofreading". Science. 313 (5786): 518–20.

Zoran Mark J., 2010. Regeneration in Annelids. In: eLS. John Wiley & Sons Ltd, Chichester.

Surse web

http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/how_enz.htm

http://vista.engines4ed.org/worm/task2/docs/aboutlumbricus.htm

http://www.biologycorner.com/worksheets/earthworm_dissection_key.html

http://www.tutorvista.com/content/biology/biology-iv/growth-regeneration ageing/regeneration.php#physiological-regeneration

Inductive Interaction of Regeneration (937 Words) | Biology

Mechanism of Regeneration in Organism | Biology

Regeneration: Catabolic and Anabolic Phase of Regeneration | Biology

http://www.biomerieux.pl/servlet/srt/bio/poland/dynPage?open=POL_CLN_PRD&doc=POL_CLN_PRD_G_PRD_CLN_68&pubparams.sform=7&lang=pl

http://www.sebia.com/V3/php/produit.php?id_produit=57&pNiveau2=R2VsIGVsZWN0cm9waG9yZXNpcw==&pNiveau3=QVVUT01BVElDIEVMRUNUUk9QSE9SRVNJUyBQUk9DRVNTT1I=

Enzymes and Inhibitors

http://www.docpelletier.com/BioPages/AdvHonBioBlog/files/90698d21db9ed5577e6e841f650ca8ba-12.html

http://sst-web.tees.ac.uk/external/U0000504/Notes/kinetics/kinetics05/rkinet05.html

http://www.pamy-metrologic.ro/balante-pentru-laborator-si-bijuterii/balanta-analitica-wps-c2/

http://www.verkon.cz/centrifugy-hettich/

ANEXE

Anexa 1. Foliile electroforezei extractului enzymatic

Migrarea electroforetică a extractului enzimatic. Poziția 1 migrarea martor, următoarele migrării sunt, în ordine crescătoare, probele(2 – proba 1(la 12 h), 3 – proba 2(la 24 h), ș.a.m.d. până la poziția 11 inclusiv, apoi următoarele 4 poziții sunt migrările de referința).

Migrarea electroforetică a extractului enzimatic. Poziția 1 migrarea martor, următoarele migrării sunt, în ordine crescătoare, probele(2 – proba 11(la 132 h), 3 – proba 12(la 144 h), ș.a.m.d. până la poziția 11 inclusiv, apoi următoarele 4 poziții sunt migrările de referința cu mențiune că pozițiile 7 și respectiv 8 sunt migrarile probelor 18 și 19(adică la 216 și 240 h) ).

Anexa 2. Aparatura folosită pentru determinări – Analizorul automat de biochimie clinică Konelab 60iPrime

Anexa 3. Aparatura folosită pentru determinări – Linia automată de electroforeză HYDRASYS 2 Scan

Anexa 4. Recipientele de plastic cu animalele de experiment