Capacitatea DE Bioacumulare A Zincului (ii) DE Catre Cianobacteria Spirulina Platensis

CAPACITATEA DE BIOACUMULARE A ZINCULUI (II) DE CĂTRE CIANOBACTERIA SPIRULINA PLATENSIS

CUPRINS

INTRODUCERE

Actualitatea temei. În ultimele decenii, atenția cercetătorilor din diverse domenii științifice, precum biotehnologia, medicina și farmaceutica este îndreptată către precăutarea și valorificarea de noi surse pentru obținerea noilor preparate cu destinație nutraceutică, neutraceutică și farmaceutică. În acest aspect, s-au dovedit a fi inepuizabile performanțele cianobacteriilor și algelor microscopice – obiecte de perspectivă ale biotehnologiilor moderne, caracterizate prin diversitatea substanțelor active, productivitatea înaltă și cerințele relativ joase către mediile și condițiile de cultivare, posibilitatea prognozării și dirijării unor căi metabolice aparte, inofenisivitatea lor ecologică, dar și prin capacitatea biotransformării unor substanțe chimice în compuși bioactivi prețioși Valoarea incontestabilă a biomasei cianobacteriene și microalgale este redată de spectrul larg al principiilor bioactive cu o structură diferită și de o importanță deosebită așa ca: proteinele, carotenoizii, vitaminele, ficobiliproteinele, polizaharidele, inclusiv polizaharidele sulfatate, substanțele de natură hormonală, enzimele, antibioticele și alte produse bioactive. În cursul ultimelor decenii sunt stabilite perspective reale de utilizare a lor în diverse ramuri ale economiei, printre care medicina, industria farmaceutică și cea alimentară sunt considerate primordiale. Biomasa și produsele analogice obținute la cultivarea unor tulpini de cianobacterii și microalge sunt utilizate cu succes în fitotehnie și zootehnie. De nenumărate ori, s-a demonstrat eficacitatea lor mult mai înaltă decât cea a preparatelor chimice, în ce privește suplinirea carenței organismelor uman și animal cu elementele necesare pentru desfășurarea unei activități optime (vitamine, microelemente, aminoacizi, enzime, hormoni ș.a.) având și un sinecost rezonabil, și astfel, accesibil pentru toți [8,7, 20, 46, 4, 25, 52, 71, 24, 54, 55,1,6,18].

Din totalitatea reprezentativă a obiectelor ficobiotehnologice – surse de principii bioactive, o semnificație deosebită pentru medicină și industria farmaceutică au demonstrat-o reprezentantele cianofitelor, îndeosebi cele ale genului Spirulina (Oscilatoriales). Dintre acestea se remarcă în mod deosebit cianobacteria Spirulina platensis [53,54]. Biomasa de spirulină este considerată sursa principală non-convențională a circa 49 substanțe bioactive, care asigură derularea normală a proceselor vitale în organismul uman și animal. Producerea pe cale industrială a biomasei de spirulină și a substanțelor bioactive se extinde mult în ultimii ani. Cercetările în direcția dată sunt consacrate elaborării unor procedee și tehnologii originale de cultivare a spirulinei, destinate obținerii biomasei cu un conținut determinat al unor substanțe bioactive. Ele sunt bazate pe optimizarea condițiilor și componenței mediilor de cultivare, precum și utilizarea unor reglatori chimici pe parcursul cultivării. Creșterea continuă a producerii industriale de biomasă de spirulină pe mapamond este estimată astăzi la circa 4000 tone metrice biomasă pe an, iar studiile științifice în continuă desfășurare vin să confirme potențialul terapeutic înalt al extractelor și substanțelor obținute din acest obiect biotehnologic prețios, invocând necesitatea și actualitatea cercetărilor destinate reglării metabolismului spirulinei în direcția expresiei maxime a produsului prognozat.

Interesul cercetătorilor este manifestat în continuare față de capacitatea excepțională a spirulinei de a metaboliza unele microelemente cu o semnificație fiziologică pronunțată, îndeosebi a manganului, cromului, seleniului, cu efecte sinergiste substanțelor bioactive, componente ale biomasei de spirulină, amplificînd efectul lor imunostimulator, antiradicalic și antioxidant. Printre acestea un rol important revine zincului, datorită semnificației sale pentru sistemul antioxidant și în special, cel imunitar al organismului [34, 48].

La etapa actuală, în R. Moldova și în lume se înregistrează o continuă depreciere a nivelului imunității populației, însoțită de ascensiunea afecțiunilor căilor respiratorii, cancerului, bolilor cardiovasculare, diminuării precoce a funcțiilor sistemului reproductiv, osteoporozei, etc. cauzate de condițiile nefavorabile ale mediului (poluarea, radiațiile) precum și de unii factori sociali (stresul, malnutriția). Evoluția acestora este condiționată și de lipsa, îndeosebi pe plan local a unor mijloace eficiente de prevenire a lor. S-a stabilit, că fluctuațiile conținutului zincului peste, sau sub cel optim sunt în raport direct sau indirect cu proveniența unor procese patologice în organism. Drept mijloace de profilaxie și tratament eficiente pot fi considerate preparatele complexe cu un conținut principii bioactive zinccomponente cu efecte antioxidante și imunomodulatoare. Utilizarea lor ar asigura un efect biologic și curativ înalt și ar contribui la soluționarea unor probleme ce țin de elaborarea unor noi suplimente nutraceutice și remedii zinccomponente pentru prevenirea și combaterea maladiilor imunodeficitare.

Scopul lucrării: stabilirea capacității de acumulare a zincului de către tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB -11 la cultivare în prezența unor compuși minerali și organici (din compuși coordinativi ai Zn (II) și/sau la contactul biomasei cu aceștea și elaborarea procedeelor noi de obținere a biomasei și a fracțiilor de principii active zinccomponente – materii prime pentru noi suplimente nutraceutice și remedii imunomodulatoare.

Obiectivele lucrării:

Studiul capacității de acumulare a zincului de către tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11 la cultivare în prezența unor compuși minerali și organici ( din compuși coordinativi ai Zn (II);

Studiul tabloului repartizării zincului în fracțiile de principii active – componente ale biomasei de spirulină obținută prin cultivarea cianobacteriei în prezența unor compuși minerali și organici (din compuși coordinativi) ai Zn(II);

Studiul procesului de biosorbție a zincului la contactul biomasei tulpinii cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11 cu unii compuși minerali și organici (compuși coordinativi) ai Zn (II);

Studiul procesului de biosorbție a zincului la contactul fracțiilor de principii active: aminoacizi liberi și peptide, proteine, polizaharide – componente al biomasei de spirulină, la contactul lor cu unii compuși minerali și organici (compuși coordinativi) ai Zn (II);

Elaborarea schemei integrate de obținere a biomasei și fracțiilor de principii active zinccomponente: aminoacizi liberi și peptide, proteine, glucide – materii prime pentru noi suplimente nutraceutice și remedii imunomodulatoare.

Cuvinte cheie: Spirulina platensis CNM-CB-11, sare minerală de Zn(II), compus organic de Zn(II), compuși coordinativi de Zn(II), bioacumulare, biosorbție, biomasă, principii bioactive, nutraceutice și remedii zinccomponente.

CAPITOLUL 1. CIANOBACTERIILE – SURSE DE BIOMETALE

În prezent cianobacteriile sunt utilizate pe larg în cercetările microbiologice și ficobiotehnologice. Acest grup de microorganisme procariote sunt intens studiate, oferind vaste posibilități pentru cercetările microbiologice și ficobiotehnologice, datorită ciclului vital scurt, timpului de creștere variabil: autotrof sau mixotrof; compoziției biochimice valoroase, metabolismului intens, vitezei mari de creștere, productivității sporite, posibilității de dirijare a procesului de cultivare.

Cianobacteriile sunt organisme procariote aerobe care efectuează fotosinteza cu ajutorul oxigenului și constituie un grup taxonomic mare în cadrul eubacteriilor. Ele sunt clasificate după criteriul morfologic (unicelulare sau filamentoase) sau funcțional (fixatoare de azot și nonfixatoare de azot). Speciile filamentoase sunt împărțite în cele cu și fără heterocist, care reprezintă o diferențiere a celulelor vegetative specializat pentru fixarea azotului molecular. Cianobacteriile filamentoase servesc drept surse netradiționale de materie primă pentru industria alimentară, farmaceutică, zootehnie și fitotehnie, cosmetică și parfumerie, datorită conținutului de proteine, aminoacizi, lipide, acizi grași polinesaturați, vitamine, enzime, carotenoizi, clorofilă, ficobiliproteine, polizaharide, substanțe de natură hormonală, antibiotice și alte substanțe cu acțiune biologică pronunțată antivirală, antifungică, antibacteriană și anticancerigenă. Cianobacteriile pot fi utilizate ca sursă esențială de energie, sunt aplicate cu success în acvacultură, în domeniul protecției mediului ambient la tratarea apelor reziduale, etc.

Cianobacteriile sunt investigate tot mai activ, în ultimii ani și prin prisma capacității de a acapara și biotransforma metalele și în special cele cu rol de bioelemente prin componentele sale bioactive. Acestea conțin în structura sa complexă diverse grupări funcționale: hidroxilice, fosforice, aminice, carboxilice, sulfhidrice. Grupurile funcționale menționate sunt asociate cu diferite componente ale peretelui celular, așa ca, peptidoglicanii, acizii teihuronici, acizii teihoici, polizaharidele și proteinele și asigură astfel, implicarea activă a acestora, prin diverse mecanisme, în procesele de acumulare a metalelor, care sunt în prezent explorate sub cele două aspecte importante:

Capacitatea cianobacteriilor de bioabsorbție și acumulare a metalelor toxice din mediul extern / capacitate cu vastă perspectivă de valorificare în tehnologiile de protecție a mediului ambiant, precum și capacitatea de recuperare prin aceleași mecanisme de absorbție și acumulare a microcomponentelor metalice din facilități de exploatare a minereurilor [15,17,37].

Capacitatea cianobacteriilor, în special a spirulinei de a acumula metalele cu rol de biolemente în procese biotehnologice de cultivare dirijată în prezența unor surse minerale și organice cu bioconvertirea lor în compuși bioorganici metalocomponenți prețioși prin efectele sale biologice, și care pot fi valorificați în calitate de materii prime pentru diverse produse și preparate cu efecte terapeutice și nutraceutice [55,24,6].

1.1. Cianobacteriile – bioacumulatori și recuperatori eficienți ai metalelor din mediul ambiant

Abilitatea cianobacteriilor de a acumula cantități considerabile de metale din medii externe, în special metalele grele, dar și microcomponentele metalice prețioase din diverse șlamuri obținute din facilități de explorare miniere, este considerată drept una din cele mai de perspectivă direcție a cercetărilor consacrate cianobacteriilor cu implicarea lor în protecția mediului ambiant, în special pentru purificarea apelor reziduale [9,12,13,14].

Subiectul care reflectă capacitatea de biosorbție a algelor în sisteme multi metalice este relativ nou, cu o creștere exponențială a interesului în întreaga comunitate științifică în ultimii ani. A fost stabilit, că algele și cianobacteriile pot adsorbi unul sau mai multe tipuri de ioni ai metalelor grele, inclusiv K, Mg, Ca, Fe, Sr, Co, Cu, Mn, Ni, V, Zn, Ca, Cd, Mo, Pb, Se, manifestând o capacitate de absorbție a metalului destul de înaltă prestabilind perspectiva utilizării în purificarea apelor poluate cu metale grele și a apelor reziduale [26,30,64,65].

Utilizarea cianobacteriilor și microalgelor în calitate de metodă alternativă de purificare a apelor trezește un interes sporit datorită următoarelor avantaje:

cinetica rapidă de recuperare a metalelor grele;

capacitatea de a recupera ionii metalici din soluții cu concentrații foarte mici (micromol/l);

utilizarea biomaterialelor renovabile naturale;

posibilitatea purificării apelor ce conțin mai multe metale.

Cianobacteriile acumulează metalele grele din mediul înconjurător prin intermediul diferitor mecanisme: (a) – fie prin absorbția pasivă a metalelor pe suprafața celulară (peretele celular, polizar, polizaharidele membranare și capsulare); (b) – fie prin helatarea lor de căre liganzii citoplasmatici, fitochelatine, metalotionine și alte molecule intracelulare [3,36].

Procesul bioabsorbției de către celulele vii este un proces compus din două etape. Prima etapă bioabsorbția pasivă, este un metabolism independent care demarează rapid cu una dintre următoarele combinații a mecanismelor de legare a metalelor: formarea legăturilor coordinative, complexare, schimbul de ioni, adsorbția fizică sau microprecipitarea anorganică. Ionii metalelor legate pe suprafață pot fi înlocuiți cu alți ioni, agenți de chelatare sau acizi. La această etapă ionii metalelor sunt adsorbiți la suprafața celulei prin interacțiunea dintre metale și grupele funcționale de la suprafața celulei. Toți ionii metalelor înainte de a obține acces în interiorul membranei celulare și în citoplasmă se întîlnesc cu peretele celular care este constituit dintr-o varietate de polizaharide și proteine care prin urmare oferă un număr activ de componente capabile de a lega ionii metalelor. A doua etapă este bioabsorbția activă, când ionii metalelor penetrează membrana celulară și pătrund în interiorul celulei.

Cianobacteriile, prin componentele sale bioactive conțin diverse gruuri funcționale: hidroxilice, fosforice, aminice, carboxilice, sulfhidrice. Aceste grupuri funcționale sunt asociate cu diferite componente ale peretelui celular, așa ca, peptidoglicanii, polizaharidele, proteinele, ș.a. Un rol important în acumularea metalelor de către cianobacterii îl au și lipopolizaharidele, lipidele și proteinele membranare în componența cărora găsim grupurile fosforice și aminice, însă rolul dominant îl are totuși peptidoglicanul (format din N-acetilglucozamina și catena peptidică – β 1,4 acid acetilmuramic), care are în componența sa numeroase grupuri carboxilice și care este componentul de bază al peretelui celular [21]. A fost demonstrată participarea predominantă a grupurilor carboxil în adsorbția Cu2+, Cd2+ și Pb2+ de către peretele celular al cianobacteriilor, grupurile tiolice avînd un rol de bază în sorbția Cd în apele cu pH>2 [57].

Factorii majori care influențează asupra eficienței procesului de biosorbție rapidă sunt: concentrația inițială a metalelor, temperatura, pH-ul și concentrația biomasei în soluție. Temperatura nu influențează bioabsorbția dacă variază în limitele 20-, pH-ul afectează soluțiile chimice ale metalelor, activitatea grupelor funcționale ale biomasei și competiția ionilor metalici [2,19, 36,43,44, 57, 66].

Astfel, biosorbția rapidă a metalelor grele de către celulele vii este foarte semnificativă atunci când celulele sunt implicate în procesele de bioremediere [19].

Prin urmare, capacitatea cianobacteriilor de absorbție și transport a microelementelor este inițiată de activarea unui sistem complex membranar de transportatori fiind reprezentați prin metalopermiaze, metaloxidaze și metalreductaze. Ulterior, transformarea metalelor toxice de către cianobacterii are ca efect solubilizarea, mobilizarea și biodisponibilitatea, realizate prin mecanismele de chelatare, implicarea unor procese de oxido-reducere cu efect de solubilizare a elementului respectiv, schimbarea pH-ului prin schimbarea componenței ionilor; bioabsorbția ionilor metalelor de către unele grupe funcționale pe suprafața celulară, imobilizare prin formarea unor complecși stabili, biometilare, biodegradare sau bioacumulare prin folosirea unor sisteme de transport energetico dependente.

1.2. Cianobacteria Spirulina platensis – bioconvertor al metalelor cu rol de bioelemente

Un alt aspect al explorării capacității de acumulare a metalelor de către cianobacterii este cel care vizează bioconvertirea metalelelor cu rol de biolemente în procese biotehnologice de cultivare dirijată în prezența unor surse minerale și organice ale acestora. În această direcție, una dintre puținele surse explorate la momentul actual, este cianobacteria Spirulina platensis. Studiată foarte intens în vederea stabilirii mecanismelor care realizează și prestabilesc rolul și oportunitatea spirulinei în calitate de sorbent și recuperator eficient al metalelor grele, în ultimele decenii această cianobacterie este parte componente a tot mai multe studii consacrate bioconvertirii metalelor cu rol de bioelemente în compuși bioorganici metalocomponenți prețioși prin efectele sale biologice, cu valorificarea acestora în calitate de materii prime pentru diverse produse și preparate cu efecte terapeutice și nutraceutice.

1.2.1. Cianobacteria Spirulina platensis – Taxonomie. Structura și fiziologia – caractere determinante în manifestarea capacității de bioacumulare a metalelor.

Structura morfologică a spirulinei, și în primul rând structura membranei, dar și particularitățile fiziologice ale acesteia determină capacitatea cianobacteriei de a fixa, bioabsorbi, acumula și bioconverti metalele din mediul acvatic concomitent cu menținerea viabilității ei.

Taxonomie:

Conform nomenclatorului sistematic bacteriologic prezentat în Determinatorul Bergey, Spirulina (Arthrospira) face parte din grupul de organisme fotosintetizatoare aerobe și se referă la cianobacteriile care au filogenie referitoare la succesiunea de ARNr cu 16S subunități. Aceste procariote sunt clasificate la grupul eubacteriilor. Inițial spirulina a fost numită prima dată în 1844 Spirulina jenneri f. platensis. În taxonomia algelor, specia: Spirulina (Arthrospira) platensis este încadrată prima dată de E. Stizenberger în anul 1852. Poziția sistematică a spirulinei este următoarea: încrengătura – Prokaryota; grupul – Eubacteria; clasa – Cyanophyceae; ordinul – Oscilatoriales; familia – Oscilatoriacea; genul – Spirulina (Arthrospira); specia – Spirulina (Arthrospira) platensis; denumirea populară – spirulina [23].

Structura și fiziologia spirulinei:

Spirulina platensis găsită în forma ei naturală în iazuri, apare ca un filament format din celule cilindrice ce îi conferă o structură caracteristică cilindrică, aranjate în trihomi spiralați regulați. Filamentele sunt mobile, lunecînd de-a lungul axei sale. Spirulina platensis este un reprezentant al cianobacteriilor filamentoase nefixatoare de azot și este lipsită de orice diferențiere, cum ar fi heterocistul, akinetele sau hormogoniile. În urma examinării microscopice a spirulinei cultivată artificial s-a observat că filamentele sale helicoidale se convertesc în filamente cu morfologie liniară, care pot reveni ușor la filamentele helicoidale [23, 53, 64, 70](Fig.1.1) .

a) b)

Fig. 1.1. Cianobacteria Spirulina platensis, filamente helicoidale – a) și b) liniare.

În mediul natural se întâlnește doar spirulina helicoidală, ceea ce îi permite să posede o capacitate de flotare mult mai mare decât formele liniare. Se consideră, că modificările macromorfologice apar ca rezultat a schimbării umidității relative. Aceste modificări au loc în rezultatul deshidratării oligopeptidelor, iar la hidratarea lor spirulina revine la forma inițială [5, 29,40].

Astfel, forma celulelor și schimbările morfologice celulare sunt determinate în primul rând de sinteza spațială și temporară a peptidoglicanilor sau a hidratării și deshidratării oligopeptidelor în peptidoglican [67,38,54].

Peretele celular care este alcătuit din zăharuri complexe și este format din patru straturi numerotate de la interior spre exterior: L1, L2, L3 și L4. Toate aceste straturi sunt foarte slabe cu excepția stratului L2 care este alcătuit din peptidoglican – substanță ce conferă peretelui celular rigiditate Stratul L1 este format din (<1%) polizaharidul β-1,2-glucan, grosimea stratului fiind de 12,0 nm. Concentrația scăzută a polizaharidului β-1,2-glucan și a proteinelor în stratul L1, dar și a stratului L2 de natură lipo-polizaharidică permite o digestie ușoară a spirulinei. Diametrul celulelor spirulinei are valori cuprinse între 1,0 – 3,0 μm în cazul celulelor tinere și de la 3,0 la 12,0 μm pentru cele mature[22, 31,32,33].

Observațiile microscopice, confirmă organizarea procariotă a spirulinei, datorită prezenței 1) capsulelor, 2) peretelui celular pluristratificat, 3) sistemului fotosintetic și cel lamelar tilacoidal, 4) ribozomilor și 5) filamentelor de ADN, cât și a numeroaselor incluziuni. Capsulele au o structură fibrilară și acoperă fiecare filament protejând-ul. Prezența neregulată a capsulelor în jurul filamentelor la Spirulina platensis este o diferențiere morfologică caracteristică acesteia [5].

Spirulina platensis, procariotă fototrofă, își are habitatul în apele alcaline cu pH-ul 9-11, iar temperatura optimă de creștere este de 35°C. Temperatura este un factor important în creșterea și dezvoltarea spirulinei. Astfel, la temperaturi sub 20°C are loc stoparea creșterii, iar la temperaturi mai mari de 38°C spirulina este în pericol de dezintegrare. Creșterea spirulinei are loc numai la lumină (necesară pentru fotosinteză), în perioada de întuneric au loc reacțiile de sinteză a proteinelor și respirația. În condiții naturale nopțile reci duc la scăderea biomasei de spirulină. În cazul iluminării puternice prelungite are loc distrugerea filamentelor de spirulină (prin fotoliză). Manipulările de agitare continuă sau periodică minimalizează durata expunerii directe a culturii la lumină. Crearea condițiilor de creștere și de cultivare a spirulinei în condiții artificiale permite obținerea biomasei de spirulină pură, cu o componență biochimică stabilă care poate fi dirijată în în funcție de condițiile care sunt create.

În condiții controlate, Spirulina platensis se cultivată pe mediile nutritive Zarrouk și Gromov. Aceasta formează trihomi care se răsucesc în spirală dreaptă, iar pe parcursul îmbătrînirii culturilor trihomele se despiralizează. Pe mediile date spirulina crește în stratul superior și are o nuanță de la verde-închis pâna la verde-albăstrui. Ciclul de viață al cianobacteriei Spirulina platensis este un proces determinat de implicațiile taxonomice, fiziologice și ale cultivării. Ciclul de viață este rezumat la trei etape: 1) fragmentarea trihomilor, 2) hormogonia celulelor și 3) procesele de creștere, dezvoltare și alungire a trihomilor. Trihomii maturi sunt împarțiți în mai multe filamente mici sau hormogonia prin formarea anterioară a celulelor specializate, celulele necridium, în care materialul celular este reabsorbit și permite fragmentarea. Spirulina se înmulțește prin fragmentarea trihomilor prin fuziune binară și dezagregarea ghemurilor. În procesul fragmentării trihomilor pereții celulari transversali se îngroașă puțin, iar strangularea pereților continuă până la despărțirea totală a fragmentelor alcătuite din 5 – 10 și mai multe celule. Diviziunea trihomilor și a celulelor decurge independent de regimul de lumină. În condiții controlate, cultura de spirulină poate fi cultivată în vase de sticlă sau reactoare speciale, la o agitare permanentă, iluminare continuă de 3000 – 4000 lx, temperatura de cultivare 35±1oC, pH-ul optim 9,0 – 11,0 [53] .

1.2.2. Capacitatea Spirulina platensis de bioacumulare a metalelor cu rol de bioelemente – principiu tehnologic al obținerii noilor produse nutraceutice și preparate polifuncționale

Capacitatea spirulinei de a acumula metalele cu rol de biolemente în procese biotehnologice de cultivare dirijată, în prezența unor surse minerale și organice cu bioconvertirea lor în compuși bioorganici metalocomponenți prețioși prin efectele sale biologice, care constituie un alt subiect de cercetare științifico-practică s-a constituit, în ultimii ani, într-o direcție relativ nouă și cu vaste perspective în explorarea biotehnologică a spirulinei. Actualitatea abordării acestei tematici de cercetare derivă din faptul, că în ultimele decenii studiile medicale din țară și de peste hotare atestă o creștere continuă a bolilor oncologice, cardiovasculare, hepatice ș.a. maladii. Cauzate de perturbări ale homeostazei proceselor metabolice la nivel celular, ele sunt inițiate de reactivitatea înaltă a radicalilor liberi, proveniți în rezultatul interacțiunii cu factorii nocivi ai mediului ambiant (excesul de radiații, razele ultraviolete și poluarea solului și aerului). Un rol important în evoluția și manifestarea unora dintre ele, de rând cu deficiența în organism a antioxidanților naturali – -carotenul, -tocoferolul, acizii grași polinesaturați, unii aminoacizi, etc., (în calitate de sursă a căror este valorificată și biomasa spirulinei), revine carenței unor astfel de microelemente ca fierul, zincul, seleniul și cromul. Definite de către cercetători ca bioelemente, dotate cu rol catalitic, non-catalitic și de structură, specificitatea și indespensabilitatea lor este determinată de includerea în enzime, hormoni și vitamine, iar în dozele biotice ele sunt dotate cu acțiuni de catalizare a proceselor de oxidare radical-libere enzimatice sau non-enzimatice [79].

Fierul este unul din bioelementele esențiale cu efect antioxidant și prezent în cele mai mari cantități în organism, căruia îi revine rolul principal în multe procese biochimice și sisteme enzimatice, carența lui fiind una din cauzele anemiei. Fierul asigură transportul oxigenului în organism, intră în compoziția hemoglobinei și mioglobinei, are rol semnificativ în transportul de electroni, fiind asociat cu metabolismul energetic. Unal doilea bioelement, după fier, cu cea mai abundentă prezență în organisme (după fier), este zincul, fiind unul din principalii biocationi implicați în procesele biochimice parcurse la toate nivelele de complexitate celulară. Zincul controlează și dirijează procesele metabolice, activitatea enzimelor, menține integritatea celulelor și este indispensabil pentru sinteza proteinelor. Mecanismul activității biologice înalte a zincului este legat de stabilitatea legăturilor coordinative cu majoritatea liganzilor intracelulari. Seleniul, la fel, este un bioelement indispensabil pentru diverse procese biochimice și fiziologice. El se include activ în procesele metabolice ale celulei, este necesar în reacțiile de oxido-reducere, este un antioxidant important, împiedică sau încetinește îmbătrînirea țesuturilor, neutralizează efectul unor substanțe cancerigene, protejînd, astfel, organismul de malignizare. Seleniul este important prin capacitatea sa de a forma seleno-proteine la înlocuirea sulfului din punțile disulfurice – proprietate ca este la baza aplicațiilor largi în tratamentul maladiilor cancerigene. Enzimele Se-dependente participă în procesele de detoxifiere, reglează oxidarea acizilor grași, influențează metabolismul și sinteza hormonilor, reglează imunitatea umorală și celulară. Seleniul participă la etapele principale ale protecției antioxidante, atât în faza întâia a protecției biochimice (oxidarea substanțelor cu formarea oxizilor și peroxizilor organici), cât și în faza următoare – de legare și eliminare a metaboliților activi, participă la reglarea metabolismului vitaminelor A și E, prevenind degradarea lor. La fel și Cromul este unul din microelementele care prezintă activitate antioxidantă. Rolul biologic al acestui bioelement este strâns legat de activarea specifică și nespecifică a unor enzime. În prezent este demonstrată participarea cromului la metabolizmul glucidic. În materia organică cromul se conține practic în forma sa trivalentă. Valoarea biologică deosebită a cromului pentru organismul uman și animal este tradusă prin intensificarea acțiunii insulinei în diabetul zaharat, stimularea lipolizei, lichidarea grăsimilor de rezervă. În complex cu acidul nicotinic și aminoacizii cromul formează factorul de toleranță față de glucoză. Iodul, este componentul esențial al hormonului glandei tiroide – tiroxina. Anume tiroxina este cea care menține reacțiile protectoare ale organismului, accelerează formarea de noi celule, influențează favorabil asupra proceselor de dezvoltare și creștere, activează unele enzime, contribuie la o asimilare mai bună a fosforului, calciului și ferului.

Introducerea prin alimentație a unor produse ce conțin biolemente metabolizate în complex cu alte substanțe bioactive va permite menținerea unui echilibru între aceștea și radicalii liberi cu caracter prooxidant care se formează fiziologic, nespecific sau accelerat în multe boli.

Studii asupra rolului bioelementelor în metabolismul organismelor pro- și eucariote reprezintă astăzi un domeniu important de cercetare. S-a dovedit, că rolul microelementelor în menținerea homeostazei celulare nu este mai prejos sau poate că mai important decât cel al vitaminelor, deoarece microelementele servesc ca activatori ai unui șir de enzime [10, 11, 24, 35, 42, 49, 69, 80, 82].

Importanța bioelementelor este susținută și prin aceea, că în timp ce organismul uman poate să sintetizeze anumite substanțe bioactive, mineralele necesită a fi introduse printr-un aport nutritional suplimentar. S-a stabilit că, dacă dintr-o cauză sau alta, bioelementele lipsesc din alimentație, pot apărea dereglări serioase ale metabolismului. În astfel de cazuri se impune administrarea unui adaos de minerale sub formă de produse nutraceutice sau preparate farmaceutice [18, 51, 57, 59, 60-62, 75-78].

Conform, Organizației Mondiale a Sănătății, Spirulina platensis este prestabilită ca sursa sigură inofensivă principală non-convențională a circa 49 substanțe bioactive, care asigură derularea normală a proceselor vitale în organismul uman și animal, spirulina este promotorul unor substanțe bioactive precum ficobiliproteinele, polizaharidele sulfatate, carotenoizii (în special β – carotenul), vitaminele (α-tocoferolul, acidul ascorbic), aminoacizii imunoactivi, acidul gama-linolenic, enzimele, cum ar fi superoxiddismutaza, peroxidaza, catalaza și unele microelemente сu activitate imunomodulatoare, antiradicalică și antioxidativă.

Multiplele investigații ale ultimilor ani au demonstrat, că Spirulina platensis este și un excelent acumulator, atât a metalelor grele, cât și a metalelor cu rol de bioelemente. În special, direcția de cercetare care vizează capacitatea spirulinei de a acumula metalele cu rol de bioelemente cu elaborarea de procedee noi de obținere a biomasei cu un conținut prognozat de principii bioactive și microelemente, iar din această biomasă a noilor produse nutraceutice și preparate farmaceutice, este cu succes dezvoltată în R. Moldova, în cadrul laboratorului Ficobiotehnologie al Institutului de Microbiologie și Biotehnologie al AȘM [6, 20, 24, 53, 55, 71].

Astfel, în cadrul studiului efectuat la cultivarea spirulinei în prezența unor compuși oordinativi ai Fe (II) a fost studiat nivelul acumulării fierului în biomasa de spirulină și determinate condițiile optime pentru realizarea acestui proces. S-a demonstrat că, conținutul maxim de fier în biomasa de spirulină se acumulează la administrarea în rate a compusului coordinativ al fierului cu glicina. Biomasa obținută conține circa 1,0-1,2% fier inclus în fracțiile de aminoacizi liberi, proteice și glucidice și este utilizată pentru condiționarea unor produse nutraceutice fierocomponente, precum și pentru obținerea unor forme medicamentoase antianemice cu conținut prognozat de acest bioelement și principii bioactive [71].

Reprezentanții genului Spirulina pot acumula cantități mari de seleniu (S. subsalsa până la 70mkgSe/g) datorită conținutului mare de proteine. În rezultatul cercetărilor efectuate asupra studiului acumulării seleniului în biomasa de S. platensis s-a stabilit un nivel apreciabil de acumulare a seleniului în condiții optimale stabilite la administrarea hidroselenitului de sodiu, conținutul de seleniu constituind 2,04 mg%, iar în cazul selenitului de fier și hidroselenitului de zinc conținutul de seleniu atingând valoarea maximală de 12,3 – 14,1 mg%. Preparatele selenocomponente obținute pe cale biotehnologică pot fi aplicate la tratarea cancerului [55].

Cromul în formă bioorganică atrage atenția în legătură cu valorificarea lui în calitate de supliment terapeutic antidiabetic. Investigațiile efectuate asupra cultivării cianobacteriei Spirulina platensis în prezența compușilor coordinativi ai Cr(III) au demonstrat, că administrarea compușilor coordinativi –[K2Cr2(SO4)4]•12H2O în prima zi de cultivare și a K2[Cr(NTA)(C2O4)(H2O)]•2H2O în a treia zi de cultivare, în concentrații de 25,0 mg/l, permit obținerea a 238,0 și 226,0 mg% de crom, respectiv, în biomasa de spirulină. Biomasa dată poate servi drept materie primă pentru obținerea unor noi produse osteoregenerative și antidiabetice [24] .

Pornind de la importanța problemei abordate, dar și de la unele cercetări, care confirmă posibilitatea soluționării acesteia au fost valorificate modele noi de obținere biomasei de spirulină îmbogățite cu iod legat organic. S-a studiat influența iodurii de potasiu și altor compuși asupra productivității spirulinei și a conținutului de iod în biomasă și s-au stabilit parametrii optimi de obținere a biomasei de spirulină îmbogățite cu iod. Rezultatele studiului au relevat conținutul maxim de iod în biomasa de spirulină cultivată în prezența iodurii de kaliu – 0,173% iod. De menționat, este, însă că la concentrațiile mai mari de iodură, inclusiv și cea de 20m/l, se produce diminuarea productivității spirulinei și prezența acestui compus se impune a fi toxică pentru spirulină. Pentru diminuarea acțiunii toxice a iodurii asupra spirulinei a fost utilizat ionul de Co2+, care complexează cu iodura și atenuează această acțiune. În raportul cercetat, s-au variat: concentrația iodului (în creștere) față de concentrația stabilă a Co(NO3)2 și invers : concentrația cobaltului în creștere față de cantitatea de iod. La adăugarea suplimentară la mediul de cultivare a compusului Co(NO3)2 în combinare cu iodura, productivitatea spirulinei s-a ameliorat [55].

Astfel, cercetările întreprinse demonstrează labilitatea înaltă a proceselor metabolice la spirulină, confirmând posibilitatea modificării căilor biosintetice și a capacității de acumulare nu numai a principiilor bioactive, componente sanogene valoroase, dar și a bioelementelor cu efecte sinergiste acestora ca componente efective, amplificând valoarea nutraceutică și terapeutică a biomasei.

1.2.3. Zincul – parte componentă a biomasei de spirulină

Zincul a atras atenția cercetătorilor după ce a fost demonstrată prezența lui în centrul prostetic al carboanhidrazei, enzimă cu rol primordial în metabolismul celular, participând în procesele de respirație celulară [79].

Rolul biologic al zincului este dependent de participarea lui în reacțiile enzimatice care decurg în celulă. Zincul intră în componența a circa 60 enzime zinccomponente, ce influențează metabolismul proteic, fosforic, glucidic, fotosinteza și reglarea potențialului oxido-reducător, un rol deosebit le revine ADN și ARN-polimerazelor, dipeptidazelor, carboanhidrazei, carboxipeptidazei, fosfatazei bazice, unor alcooldehidrogenaze, aldolazelor de clasa II și superoxiddismutazei (Fig.1.2) [39,47].

Fig.1.2. Enzimele zinccomponente și rolul lor în diverse procese metabolice.

Dintre cele mai studiate enzime este carboanhidraza. Structura carboanhidrazei este reprezentată printr-un un rest cisteinic și 17 prolinice; nu apar legături disulfidice. S-a demonstrat lipsa cisteinei, deci gruparea tiolică nu este implicată în legarea ionului de Zn+2. Carboanhidraza catalizează reacția de descompunere a acidului carbonic în apă și bioxid de carbon (IV). Natura legăturii zincului cu partea proteică e puțin studiată. Nu este elucidat mecanismul activării substratului. Unele date permit explicarea mecanismului acțiunii enzimelor pe baza formării compușilor complecși metal-enzimă cu oxigenul din carbonat.

Zincul intră în componența carboxipeptidazei, o enzimă catalitică cu o dublă acțiune peptidazică și esterazică. Carboxipeptidaza catalizează hidroliza peptidelor. Ionii de zinc pot intra și în compoziția unor precursori inactivi ai enzimelor, cum ar fi de exemplu procarboxipetidaza, iar activarea ei necesită implicarea multor altor enzime. În acest proces zincul are un rol complex de stabilizare a structurii cuaternare a enzimei, de participare efectivă în procesul de activare și de stabilizare a structurii spațiale tridimensionale a enzimei active și a configurației spațiale a centrului activ, participând efectiv la procesul catalitic.

Zincul îndeplinește un rol important în reglarea mecanismelor ereditare, precum și în stabilizarea subunităților ribozomale și a biopolimerilor intracelulari. În afară de reacțiile respiratorii, metabolismul proteic și nucleoproteinic, zincul reglează creșterea, influențează formarea unor astfel de aminoacizi ca triptofanul și sporește cantitatea de gibereline.

Zincul nu intră în compoziția oxidazelor deorece nu-i sunt caracteristice modificările valenței. Cu toate acestea, zincul are un rol indirect, dar important în procesele de respirație. El intră în compoziția carboanhidrazei, carboxilazei, participă la decarboxilarea acizilor organici. Glutamatdehidrogenaza participă la fixarea azotului neorganic și catalizează reacția

HOOCCH2CH2CHNH2COOH+H2O+NAD(P) HOOCCH2CH2COCOOH+ NH3 + NAD(P)*H2

Suplimentarea mediilor de nutriție cu ZnSO4 în concentrații de 5, 10, 20 mg/l acționează asupra activității glutamatdehidrogenazei. ZnSO4 sporește activitatea NADP- glutamatdehidrogenazei. Amoniacul se unește de acidul α-cetoglutaric cu formarea ulterioară a acidului glutamic, care ocupă un loc central în metabolismul azotului. În cazul carenței lui viteza decarboxilării scade, iar procesul de respirație are loc cu o viteză redusă [79].

Studiul schimbului de gaze la organismele vegetale prin intermediul inhibitorilor specifici a demonstrat, că insuficiența zincului duce la micșorarea randamentului reacțiilor din ciclul Krebs și glicoliză, sporind randamentul șuntului pentozofosforic. Mai târziu, s-a demonstrat, că la etapa inițială a carenței zincului activitatea glucozo-6-fosfatdehidrogenazei sporește de 1,5 -3,0 ori. Prin metoda electroforetică în preparate purificate cu un conținut de 44% de carboanhidrază au fost determinate izoenzimele carboanhidrazei. În dependență de poziția lor s-a observat, că ele ocupă același loc ca și proteinele zinccomponente, izolate și studiate anterior. La tratarea preparatului cu 1,10-ortofenantrolin s-a înregistrat pierderea activității carboanhidrazice. Datele prezentate au demonstrat, că carboanhidrază este o enzimă ce are în structura sa zinc. Se poate afirma, deci, că zincul participă nu doar indirect în mecanismele de respirație ci și direct – prin intermediul carboanhidrazei.

Una din funcțiile principale ale zincului în metabolismul celular este reglarea proceselor de creștere. Odată cu scăderea conținutului de zinc are loc încetenirea creșterii și dezvoltării celulei. S-a stabilit, că una din cauzele principale ale diminuării vitezei de creștere este dereglarea metabolismului acidului -indolilacetic, în care zincul îndeplinește rolul de cofactor specific al sistemului enzimatic al biosintezei acestui metabolit. În special, zincul participă activ în transformările enzimatice ale acidului pirotartric în indolilacetic. Insuficiența zincului provoacă dereglări în biosinteza ARN. Au loc de asemenea modificări ale activității metabolice și degradarea anumitor funcții ale acizilor nucleici ce duce la micșorarea cantității lor în celulă. Zincul este important în sinteza heteroauxinelor, participând la sinteza precursorilor auxinei, în metabolismul giberilinelor și previne distrugerea auxinelor, cauzată de radiațiile ionizante. Sub acțiunea zincului crește asimetria proteinelor și conținutul de apă legată, ceea ce duce la hidratarea sporită a proteinelor cu rol enzimatic, ca urmare scade activitatea lor. La o concentrație de 135mg/l de Zn+2 pe baza sporirii cantității glucidelor, scade concentrația proteinelor [30].

Dehidrogenazele din sistemele enzimatice au drept cofactor zincul. A fost studiată acțiunea sulfaților de zinc din mediul nutritiv asupra activității glutamatdehidrogenazei NADP dependente. Astfel, prezența zincului duce la sporirea acțiunii glutamatdehidrogenazei.

Atât insuficiența, cât și excesul zincului duc la absorbția sporită a fosforului, ceea ce contribuie la creșterea activității ATP-zei. Absorbția fosforului poate fi explicată prin dereglarea procesului de fosforilare oxidativă. Carența zincului provoacă reducerea activității alcooldehidrogenazei. Numeroase cercetări au demonstrat, că în cazul insuficienței zincului se produc schimbări ale sistemului redox. Lipsa zincului duce la deplasarea echilibrului redox, la cuacervarea, oxidarea și activarea polifenoloxidazei. Dereglările în procesul redox cauzate de insuficiența zincului provoacă dereglări ale biosintezei și componenței proteinelor [81].

Absorbția și transportul zincului depinde de pH mediului, de concentrația substanței, de temperatură și de prezența căilor specifice de transport din cadrul membranelor biologice. Un rol deosebit în această privință îi revine pH-lui. La un anumit pH zincul devine insolubil și inaccesibil pentru microorganisme. Pe modelul unei culturi de E. coli care conține glucoză, au fost determinate 2 faze ale transportului zincului: prima fiind energoindependentă care constă din adsorbția cationului pe suprafața celulei, cea de a doua fiind energodependentă cu participarea transportatorului. Transportul zincului este supus regulilor lui Michaelis și Menten (Km=2*10-5 Vmax=40mkmol/ora la 102 celule) [80].

Zincul este un microelement esențial pentru organismul uman, fiind, după fier, caracterizat prin cea mai abundentă prezență. Studiile privind rolul zincului în organismul uman au fost inițiate și s-au extins rapid după anul 1961, odată cu descoperirea de către Prasad a rolului zincului în patologia umană. Corpul omenesc conține aproximativ 2,5 g zinc repartizat astfel: – circa 30 %, adică aproximativ 0,75 g se găsesc în sistemul osos; – circa 60 %, adică aproximativ 1,5 g sunt localizate în mușchi.

Zincul are un rol necesar pentru producerea testosteronului care intensifică anabolismul proteinelor ceea ce favorizeaza dezvoltarea musculaturii, reglează motricitatea, drept rezultat favorizând dezvoltarea fizică în general.

Zincul manifestă o acțiune semnificativă asupra stării țesutului osos, activând fosfataza bazică și metabolismul mineral al osului, stimulează biosinteza proteinelor, manifestă o acțiune stabilizatoare asupra membranelor citoplasmatice, limitând formarea radicalilor liberi, contribuie la sinteza ARN și ADN care participă la regenerarea țesuturilor. Este cunoscut efectul unor compuși ai zincului asupra proceselor osteoregenerative, în special referitoare la modificările marcherilor remodelării osoase.

Zincul este considerat unul din bioelementele cu semnificație imună. S-a determinat acumularea lui în locurile cu o evoluție mai intensă a reacțiilor imune pentru a fortifica sistemul de protecție în condițiile de patologie. Scăderea sub nivelurile optime a concentrației zincului în organism este asociată cu micșorarea limfocitelor T supresoare pe fonul intensificării activității celulelor NK, acestea corelând în primul rând cu micșorarea cantității zincului. Atingerea conținutului optimal al acestui bioelement duce la intensificarea activității subpopulațiilor de limfocite T, fortificarea rezistenței naturale a organismului, la hiposensibilizare și acțiune antianafilactică. Se observă caractere de comutare a anticorpilor agresivi la cei imuni [81]. Zincul participă la transmisia semnalelor activate în limfocitele T în calitate de mediatori și la autoreglarea enzimelor sistemelor intracelular. Zincul participă în metabolismul energetic al limfocitelor. Timulina – hormunul timusului, necesar limfocitelor T, este zincdependent, ed aceea deficitul de zinc influențează negativ asupra procesului de proliferare și maturizare a limfocitelor T [79].

Astfel, se poate deduce că produsele și remediile zinccomponente din spirulină prezintă oportunitatea unor remedii imunomodulatoare eficiente.

Efectele biologice ale zincului se pot rezuma prin:

reglarea interacțiunilor dintre celulele self și nonself;

ameliorarea funcționării proteinelor canal-formatoare din membrana citoplasmatică.

intervinția în funcționarea următoarelor enzime principale:

oxidoreductazele, spre exemplu alcool dehidrogenaza, citocrom reductaza, superoxid dismutazele (zincul joaca un rol catalitic și parțial structural);

transferazele, spre exemplu ARN polimeraza, ADN polimeraza, transcriptaza reversa (zincul joacă un rol catalitic și parțial structural);

hidrolazele, spre exemplu fosfatazele alcaline, carboxipeptidazele, amilaza, colagenazele, elastaza, enzima de conversie a angiotensinei (zincul joaca un rol catalitic, parțial structural si сîteodata de regulator);

liazele, spre exemplu anhidraza carbonică (zincul joaca un rol catalitic);

ligazele, spre exempu ARN sintetaza (zincul joaca un rol catalitic);

Rezumând cele expuse putem concluziona că, in plan biochimic, zincul manifestă un rol preponderent :

– în metabolismul acizilor nucleici (replicarea și transcripția ADN-ului in timpul diviziunii celulare fiind dependentă de zinc);

– în metabolismul proteinelor ;

– în glicoliză, intervenind în procesul metabolic denumit „calea pentozelor“ si în neoglucogeneza (zincul participă in stocarea, sinteza și secreția insulinei la nivelul celulelor pancreatice);

– în metabolismul lipidelor și al acizilor grasi, intervenția zincului având rolul de diminuare a riscului producerii arterosclerozei;

– în echilibrul acido-bazic, în sinteza hemoglobinei, în metabolismul androgenelor, în detoxificarea radicalilor liberi, în detoxicarea alcoolica;

– în metabolismul hormonal, la nivelul secreției sau activității hormonale.

La etapa actuală este pe larg practicată utilizarea terapeutică a zincului prin realizarea unui raport monoelementar de zinc în cazul compușilor chimici anorganici ai zincului – oxidului, sulfatului sau a clorurii de Zn(II), care în dozele frecvent recomandate (220mg) provoacă iritarea mucoasei stomacului sau a unor compuși organici – acetatul sau gluconatul de zinc. Deși atestă efecte fiziologice pozitive, aceste substanțe sunt unicomponente, necesită utilizarea unor cantități relativ mari pentru a asigura efectul scontat și uneori sunt toxice pentru organism.

Dezavantajele menționate pot fi excluse, iar eficiența zincului, îndeosebi a efectelor antioxidative și imunomodulatoare, poate fi amplificată prin introducerea lui în componența unor produse și biopreparate multicomplexe cu conținut de principii bioactive, precum oferă biomasa de spirulină.

Din aceste considerente sunt actuale și de perspectivă investigațiile în vederea obținerii preparatelor bioactive care conțin zinc din biomasa spirulinei datorită proprietăților cianobacteriei de multiplicare rapidă și posibilității sintezei orientate a anumitor substanțe bioactive.

CAPITOLUL 2. MATERIALE ȘI METODELE DE CERCETARE

Investigațiile, rezultatele cărora sunt rezumate și expuse în prezenta lucrare au fost efectuate pe parcursul anilor 2011-2013 în Laboratorul Ficobiotehnologie al Institutului de Microbiologie și Biotehnologie al Academiei de Științe a Moldovei și au constituit parte componentă a screeningului tehnologic efectuat în cadrul tematicii consacrate elaborării noilor produse nutraceutice pe baza principiilor active zinccomponente din biomasa de spirulină și, parțial a cercetărilor efectuate în cadrul proiectului bilateral moldo român 10.820.04.17.RoA „Bioacumularea si recuperarea microcomponentelor metalice din șlamul rezultat la solubilizarea alcalină a uraniului din minereu, cu ajutorul cianobacteriilor si microalgelor” (2010-2012) [50] .

2.1 Obiectul de studiu

Obiectul cercetărilor expuse a fost tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-11 (CYANOPHYTA), depozitată în Colecția Națională de Microorganisme de pe lângă Institutul de Microbiologie al Academiei de Științe a R. Moldova [54].

2.2 Design-ul investigațiilor

Investigațiile realizate în cadrul prezentei lucrări au vizat două aspecte a problemei de cercetare conform următorului design elaborat:

2.2.1 Design-ul modelului experimental de acumulare a zincului de către tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11 în procesul de cultivare controlată a culturii în prezența a diverse ale zincului:

minerală – clorura de zinc (II) SIGMA Aldrich cu formula lineară: ZnCl2

organică – acetatul de zinc(II) dihidrat SIGMA ALDRICH cu formula lineară Zn(CH3COO)2 · 2H2O.

organică/ sub formă de compuși coordinativi cu liganzi organici – stereiozomerii glicinei , α-alaninei și serinei: [Zn (Gly)2], [Zn ( D-Ala D,L-Ser)] și [Zn ( L-ala D,L-Ser)] (sintetizați la Institutul de Chimie al AȘM de către dna dr. în șt. chimice Ludmila Ciapurina).

În acest model experimental parametrii determinați și analizați au fost:

nivelul de acumulare al zincului în biomasa de spirulină obținută la cultivarea spirulinei în prezența a) clorurii de Zn(II); b) acetatului de zinc(II) dihidrat și c) unor compuși coordinativi ai Zn (II) cu alanina, serina și glicina;

nivelul de repartizare a zincului în fracțiile de principii bioactive ale biomasei obținute la cultivarea spirulinei în prezența concentrației clorurii de Zn(II), acetatului de Zn(II) și a compusului coordinativ al Zn(II) cu alanina, serina și glicina care asigură acumularea maximală a acestui bioelement în biomasă.

Designul experimental al acestei prime etape s-a derulat conform schemei:

Pentru monitorizarea nivelului de acumulare al zincului în biomasa de spirulină obținută la cultivarea spirulinei în prezența a) clorurii de Zn(II); b) acetatului de zinc(II) dihidrat și c)unor compuși coordinativi ai Zn(II) cu alanina, serina și glicina, algoritmul investigațiilor a inclus etapele:

Prepararea mediului nutritiv SP-1 cu compoziția: (în g/l) NaNO3-2,25; NaHCO3-8,0; NaCl-1,0; K2SO4-0,3; Na2HPO4-0,2; MgSO4•7H2O-0,2; CaCl2-0,024; 1ml/l soluție de microelemente ce conține (mg/l(mediu): H3BO3-2,86; MnCl2•4H2O-1,81; CuSO4•5H2O -0,08; MoO3 –0,015); FeEDTA-1ml/l; Fiecare macroelement în cantitatea și succesiunea indicată s-a cântărit și consecutiv s-a dizolvat într-un volum de apă potabilă echivalent cu 3/5 din volumul unui vas cu capacitatea de 10dm3, în volumele indicate s-au adăugat soluțiile de microelemente și fier helatat. S-a adus volumul mediului nutritiv la cota de 10 dm3.

Inocularea spirulinei: După ce mediul a fost preparat, s-a inoculat cultura de spirulină prin introducerea inoculumului reieșind din proporția 0,4-0,45 g/l în recalcul la biomasa absolut uscată.

Transferarea culturii în vasele experimentale: Cultura de spirulină s-a transferat câte 50cm3 în retorte conice din sticlă cu volumul total de 100cm3.

Introducerea compușilor Zn(II): Pentru toate sursele de zinc s-au utilizat concentrațiile de 10mg/l, 20mg/l și 30mg/l. Pentru fiecare din compușii incluși în studiu, s-au preparat soluții standard cu concentrația de 10mg/ml, din volumele recalculate la concentrațiile de studiu ale compușilor în volumele respective s-au suplimentat la variantele experimentale cu cultura de spirulină.

Cultivarea spirulinei: Variantele experimentale ale culturii de spirulină suplimentată cu compușii testați ai zincului și martorul în 3 repetări s-au plasat pe platoul experimental. S-au conectat dispozitivele de iluminare ale instalației – lămpi cu lumină de zi LB-80. Cultivarea experimentală a spirulinei s-a efectuat conform parametrilor: pentru primele 48 ore s-a respectat temperatura de 25-28oC; pH-ul optim al mediului 8-9; iluminarea (asigurată de o parte din dispozitivele de iluminare) de 3000lx și, respectiv pentru următoarele 96 ore: temperatura de 30-32 oC; pH-ul-9-10; intensitatea iluminării până la 4000lx.

Separarea, demineralizarea și standardizarea biomasei de spirulină: La finalul experienței, respectiv la a 6-a zi, cultura de spirulină crescută pe mediul nutritiv și diferite concentrații ale compușilor zincului s-a supus filtrării printr-un filtru din hârtie demineralizată și umectat în prealabil, după care biomasa de spirulină s-a spălat cu o soluție de acetat de amoniu de 1,5% în scopul înlăturării surplusului de săruri de pe suprafața celulelor. După, pentru efectuarea investigațiilor biochimice, biomasa s-a prelevat de pe filtru și s-a standardizat la concentrația de 10mg/ml.

Pentru evaluarea nivelului de repartizare a zincului în fracțiile de principii bioactive ale biomasei obținute la cultivarea spirulinei în prezența concentrației clorurii de Zn(II), acetatului de Zn(II) și a compusului coordinativ al Zn(II) cu alanina, serina și glicina care asigură acumularea maximală a acestui bioelement în biomasă, aceasta s-a supus fracționării în scopul obținerii fracțiilor de aminoacizi liberi și oligopeptide, proteine și polizaharide conform schemei integrate elaborate în LCȘ Ficobioethnologie al Institutului de Microbiologie și Biotehnologie al AȘM, bazată pe solubilitatea constituenților celulari în diferiți solvenți combinând unele metode cunoscute și descrise pentru alge:

Obținerea extractului/fracției de aminoacizi liberi și oligopeptide: La 10g biomasă de spirulină s-a adaugat alcool etilic de 30-75% în raport de 1:2, s-a agitat pe un agitator electric timp de 1oră, după care s-a centrifugat la 1000g timp de 15 min. Extracția s-a repetat timp de 30 min prin adaugarea la restul de biomasă a unui volum de apă purificată în raport de 1:10. Supernatantele obținute s-au reunit. Pentru a separa fracțiile oligopeptidelor și aminoacizilor liberi de restul proteinelor, extractul s-a supus evaporării alcoolului din extract și s-a supus centrifugării timp de 15 min la 540g, utilizând eprubete “Centrifuge Filter Units Ultrafree – (10kDa). Extractul s-a supus sterilizării. Pentru cercetare și analiza rezultatelor, extractul s-a notat ca „Extract de Aminoacizi liberi și peptide din spirulină”.

Obținerea extractului/fracției de polizaharide: La restul de biomasă s-a adaugat treptat câte 40ml de apă distilată (în total 220ml) și s-a amestecat minuțios după adăugarea fiecărei porții de apă. Amestecul obținut s-a supus fierberii la temperatura de 100oC timp de 1 oră. După răcire la temperatura camerei, amestecul s-a supus centrifugării la 3500 rot./min timp de 20 min. După centrifugare supernatantul s-a acidulat cu sol. 0,5N HCl până la pH 3,8-4,0, pentru înlăturarea proteinelor prin precipitare izoelectrică. S-a centrifugat apoi la 3500 rot./min și precipitatul s-a înlăturat. Fracția lichidă s-a supus purificării pe Al2O3 bazic până la înlăturarea colorației verzi-albastre. S-a verificat pH-ul ca valoarea să fie 7-8 și concentrația după substanța uscată de 10mg/ml, după care s-a supus sterilizării. Pentru cercetare și analiza rezultatelor, extractul obținut s-a notat ca „Extract de Polizaharide din spirulină”.

Obținerea extractului proteic: Restul de biomasă rămas după primele două extracții, s-a uscat la temperatura de 40-500C, după care s-a adăugat 50ml soluție de NaOH de 0,45% și s-a supus extracției timp de 1 oră prin agitare continuă. După, amestecul s-a centrifugat la 3500 rot./min timp de 20 min. Extracția s-a repetat, prin adăugarea la restul rămas după prima centrifugare a 25ml soluție NaOH de 45% și agitarea amestecului timp de 30min. După, amestecul s-a centrifugat la 3500 rot./min timp de 20 min. Ambele extracte s-au reunit, extractul reunit fiind supus dializei până la atingerea pH-lui de 7,5-8,5. Extractul s-a supus standardizării la concentrația de 10mg/ml și s-a sterilizat. Pentru cercetare și analiza rezultatelor acesta s-a notat ca „Extract de Proteine din spirulină”.

2.2.2. Design-ul modelului experimental de acumulare a zincului de către tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11 prin contactul biomasei cu diverse surse ale zincului (II):

minerală – clorura de zinc (II) SIGMA Aldrich cu formula lineară: ZnCl2

organică – acetatul de zinc(II) dihidrat SIGMA ALDRICH cu formula lineară Zn(CH3COO)2 · 2H2O.

organică/ sub formă de compuși coordinativi cu liganzi organici – stereiozomerii glicinei, α-alaninei și serinei: [Zn (Gly)2], [Zn ( D-Ala D,L-Ser)] și [Zn ( L-ala D,L-Ser)] (sintetizați la Institutul de Chimie al AȘM de către dna dr. în șt. chimice Ludmila Ciapurina). În acest model experimental parametrii determinați și analizați au fost:

nivelul de acumulare al zincului în biomasa de spirulină prin contactul acesteia cu clorura de Zn(II), b) acetatul de zinc(II) dihidrat și c) unii compuși coordinativi ai Zn(II) cu alanina, serina și glicina;

nivelul de acumulare a zincului în fracțiile de principii bioactive ale biomasei de spirulină: aminoacizi liberi și peptide, proteine, polizaharide la contactul lor cu clorura de Zn(II), acetatul de Zn(II) și unii compuși coordinativi ai Zn(II) cu alanina, serina și glicina.

Design-ul experimental al acestei de a doua etape a investigațiilor s-a derulat conform schemei:

Obținerea biomasei de spirulină (Fig.2.1): În scopul dat tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-11, s-a inoculat în concentrație de 0,3-0,4g/l biomasă absolut uscată în mediul nutritiv mineral SP-1. Cultura de spirulină s-a transferat câte 500ml-700ml în retorte conice cu capacitatea de 1,5l care s-au plasat pe platoul de creștere sub dispozitivele de iluminare artificială. Durata ciclului de cultivare a constituit 6 zile, fiind respectați parametrii pentru primele 48 ore s-a respectat temperatura de 25-28oC; pH-ul optim al mediului 8-9; iluminarea (asigurată de o parte din dispozitivele de iluminare) de 3000lx și, respectiv pentru următoarele 96 ore: temperatura de 30-32 oC; pH-ul-9-10; intensitatea iluminării până la 4000lx (similar parametrilor descriși în p.2.2.1). La finalul ciclului de cultivare, cultura de spirulină s-a supus filtrării printr-un filtru din hârtie de filtru demineralizată și umectat în prealabil, după care biomasa de spirulină s-a spălat cu o soluție de acetat de amoniu de 1,5% în scopul înlăturării surplusului de săruri de pe suprafața celulelor. Biomasa s-a prelevat de pe filtru și s-a standardizat la concentrația de 100mg/ml.

c) Separarea prin filtrare a culturii de spirulină

Fig. 2.1. Obținerea biomasei de spirulină

Fracțiile de principii bioactive: aminoacizi liberi și oligopeptide, polizaharide, proteine s-au obținut conform procedurilor tehnologice descrise în p. 2.2.1.

Prepararea sistemului reactant: “biomasă +soluție reactantă”

Pentru a determina capacitatea de biosorbție și stocare a zincului prin recuperarea lui din sursele de zinc: clorura sau acetatul de zinc(II) dihidrat, sau compușii coordinativi ai Zn(II) cu alanina, serina și glicina s-a preparat sistemul reactant: biomasă+ soluția de zinc, reieșind din proporția: 0,75g biomasă la 100 litru soluție compus al zincului cu concentrația de 100mg/l, timpii de contact între componentele “sistemului reactant”: 15min., 30min., 60min. După expirarea timpului de contact biomasa de spirulină a fost centrufugată și spălată cu soluție izotonică de acetat de amoniu pentru înlăturarea resturilor de componente de pe suprafața peretelui celular.

Prepararea sistemului reactant: “exract de principii bioactive +soluție reactantă”

Pentru a asigura realizarea modelului de recuperare a microcomponentelor metalice din șlam a fost preparat sistemul reactant, reieșind din proporția: 10mg fracție bioactivă /preparat la 10ml solutie reactantă cu concentrația de 100mg/l, timpii de contact între componentele “sistemului reactant”: 15min., 30min., 60min. Pentru fiecare tip de microcomponent s-a stabilit concentrația lui inițială, concentrația finală, nivelul de recuperare, în %.

2.3. Metode de investigare

Pentru realizarea obiectivelor propuse au fost utilizate următoarele metode biochimice de investigare:

2.3.1. Determinarea productivității spirulinei:

Productivitatea spirulinei din variantele experimentale și martor s-a determinat fotometric cu recalculul masei celulare la biomasa absolut uscată (BAU) prin metoda descrisă în [55]. Productivitatea s-a exprimat în g/l biomasă absolut uscată (BAU) și s-a calculat conform formulei:

(g/l BAU) = A 680 x η x k(0,60) (1)

unde: A680 – densitatea optică a culturii de spirulină;

η– diluția probei;

k – coeficient de recalcul a culturii de spirulină în g/l BAU, calculat din curba de

calibrare (de determinare a BAU).

2.3.2. Determinarea conținutului de zinc în biomasa spirulinei:

Cantitatea de zinc în variantele experimentale ale biomasei și în fracțiile de principii bioactive ale spirulinei s-a determinat conform procedeului descris în și constă din următoarele etape:

a)Separarea, dezintegrarea și dezagregarea acidă a biomasei:

Biomasa de spirulină s-a separat de mediul de cultură prin filtrare. Apoi, biomasa s-a spălat în scopul înlăturării surplusului de săruri cu o soluție de acetat de amoniu de 1,5%, s-a resuspendat în apă distilată pînă la concentrația finală a biomasei de 10 g/l. Masa celulară s-a supus dezintegrării prin acțiunea ultrasunetului la o frecvență de 22 khț, timp de 30 sec de 4 ori. Într-un pahar Berzelius din sticlă termorezistentă s-au luat 0,1 cm3 de biomasă de spirulină dezintegrată,* la care s-a adăugat 0,1 cm3 de soluție HClO4 de 57 % și 0,1 cm3 de HNO3 concentrat, apoi s-a încălzit la baia de nisip la o temperatură de 135 0C timp de 80 min., pînă cînd soluția a devenit transparentă. După răcire la temperatura camerei proba s-a adus la un volum de 1 cm3.

*- Notă: În cazul fracțiilor din biomasă și preparate s-au luat câte 1cm3 probă.

b)Separarea, extragerea și determinarea zincului:

La I cm3 de soluție supusă cercetării s-a adăugat în scopul separării zincului de ceilalți cationi prezenți în soluție 2 cm3 de soluție de mascare constituită din: tampon acetat – tiosulfat (se prepară prin adăugarea la 1 dm3 soluție tampon acetat 2M cu pH 5 a 25 cm3 soluție de tiosulfat de sodiu de concentrație 50%). După ce s-a amestecat, s-a adăugat 2 cm3 soluție de ditizonă în tetraclorura de carbon de 5•10 –5 M cu conținut de ionol de 0.15% cu rol de agent de solubilizare pentru ditizonă în tetraclorura de carbon. Proba s-a agitat timp de un minut, după ce faza organică de culoare roșu-aprins s-a separat și citit la spectrofotometru utilizînd lungimile de undă, respectiv: 538 nm pentru ditizonatul de zinc și 620 nm pentru ditizonă pură (pondere de participare).

c) Calcularea datelor:

Utilizarea celor două lungimi de undă: maximumul de la 538 nm și cel de la 620 nm pentru stabilirea ponderii de participare a ditizonei a permis determinarea ditizonatului de zinc împreună cu ditizona.

Calculul cantității de zinc(mg/% ) s-a efectuat în baza relației:

CZn(mg%) =[ Aextract – KAextract ]•100 /33,3•m (2)

538 620

unde:AZn – reprezintă densitatea optică a ditizonatului de zinc la lungimea

538 de undă 538 nm;

Aextract – este densitatea optică a extractului la lungimea de undă 538 nm;

538

Aextract – este densitatea optică a extractului la lungimea de undă 620 nm;

620

K – este constanta ce reprezintă raportul dintre densitatea optică la 538 nm și 620 nm pentru ditizonă pură (ponderea de participare ).

33,3 – este coeficientul de recalcul al cantității de zinc, determinat din valorile seriei de diluții ale soluției-etalon de zinc în 0,3NHCl ce conține zinc în concentrația de 10mcg/cm3, preparată dintr-o soluție ZnCl2 de 0,01%

m – masa probei luată pentru determinare în g.

2.3.3. Determinarea cantității de oligopeptide (Până la 10 kDa) a fost precedată de extracția lor în acid tricloroacetic (ATA). În scopul dat la proba supusă cercetării s-a adăugat ATA de 20% în raport de 1:1, s-a agitat timp de 10 min și s-a centrifugat la 5000 rot/min. După aceea la 0,10 mL supernatant cu conținut de peptide s-au adaugat 0,40 mL apă distilată (pentru diluție) și 2,00 mL amestec (reactiv A și reactiv B, care s-a preparat prin amestecul a 49,00 mL reactiv A cu 1,00 mL reactiv B (A – carbonat de sodiu 2% în 0,1N hidroxid de sodiu; B – sulfatul de cupru 0,5% de citrat de sodiu 1,0%), s-a agitat bine și s-a lăsat în repaos 10 min la temperatura camerei. Apoi s-au adăugat 0,20 mL reactiv C (Folin) și s-a agitat energic. Proba s-a lăsat timp de 30 min pentru dezvoltarea colorației și s-a măsurat absorbanța soluției la spectrofotometru la lungimea de undă 750 nm în cuve cu grosimea stratului de .

Conținutul de peptide în % (din cantitatea de proteină) s-a determinat după formula:

E750•10•0,32•100%/m, (3)

unde:

E750 – absorbanța probei la lungimea de undă 750 nm;

0,32 – coeficientul de recalcul a cantității de peptide în mg/mL;

10 – diluția probei

m – masa probei absolut uscate (mg).

2.3.4. Determinarea conținutului de proteine:

În biomasă s-a determinat spectrofotometric prin metoda propusă de Lowry [39]. Metoda se bazează pe extracția proteinelor cu NaOH 0,1N. La 0,1 mL probă (biomasă de spirulină 7,0 mg/mL) se adaugă 0,9 mL NaOH 0,1 N și timp de 30 min. are loc extracția. După care din soluția dată se ia 0,1 mL și se adaugă 0,4 mL apă distilată și 2,0 mL amestec (reactiv A și reactiv B, care s-a preparat prin amestecul a 49,0 mL reactiv A cu 1,0 mL reactiv B (A – carbonat de sodiu 2% în 0,1N hidroxid de sodiu; B – sulfatul de cupru 0,5% de citrat de sodiu 1,0%), s-a agitat bine și s-a lăsat în repaos 10 min. la temperatura camerei. Apoi s-au adăugat 0,2 mL reagentul Folin și s-a agitat energic. Proba s-a lăsat timp de 30 min. pentru dezvoltarea colorației și s-a măsurat absorbanța soluției la spectrofotometru la lungimea de undă 750 nm în cuve cu grosimea stratului de .

Conținutul de proteine în % din BAU s-a determinat după formula:

E750•50•0,32•100%/m, (4)

unde: E750 – absorbanța probei la lungimea de undă 750 nm;

0,32 – coeficientul de recalcul a cantității de peptide în mg/mL;

50 – diluția probei

m – masa probei absolut uscate (mg).

2.3.5. Determinarea conținutului de glucide:

S-a efectuat printr-o metodă care este bazată pe deshidratarea hexozelor în prezența acidului sulfuric concentrat, urmat de condensarea acestora cu antron, care rezultă cu obținerea unei colorații albastre-verzui. În scopul dat la 0,25 mL probă supusă cercetării s-au adăugat 2,50 mL soluție antron (50,0 mg antron recristalizat în 100,0 mL H2SO4 de 66%). Amestecul s-a agitat minuțios, apoi eprubetele s-au transferat pe baia fierbîndă și s-au lăsat în decurs de 30 min. Apoi, eprubetele cu probe s-au răcit sub apă curgătoare și s-au lăsat la întuneric pentru expoziție timp de 30 min. Soluțiile colorante s-au colorimetrat la fotocolorimetru la lungimea de undă de 620 nm în cuve de .

Conținutul de glucide s-a determinat după formula:

E620•100•1,25/•m, (5)

unde: E620 – absorbanța soluției la lungimea de undă 620 nm;

1,25 – coeficientul de recalcul a cantității de glucide în mg/mL;

m – masa probei, mg.

2.3.5. Analiza statistică și regresională a datelor obținute în trei serii de determinări ale productivității și principiilor bioactive a fost realizată prin metodele propuse de Доспехов (1985). Au fost calculate: media aritmetică (M), abaterea medie patrată (S{y}), veridicitatea conform criteriului Stiudent ( P 0,05), procentul de variație (V) [92, 95].

CAPITOLUL 3. CAPACITATEA DE ACUMULARE A ZINCULUI (II) DE CĂTRE TULPINA CIANOBACTERIEI Spirulina platensis CNMN-CB-11

(Rezultate și discuții)

Rolul zincului pentru metabolismul microalgelor și cianobacteriilor, în special pentru spirulină se presupune că este realizat prin aceleași mecanisme relatate. Una din cele mai importante enzime zinccomponente și pentru spirulină este carboanhidraza. Această enzimă prezentă în cloroplaste și citoplasmă este catalizatorul reacției H2CO3 →CO2+H2O, făcându-i accesibil C dizolvat în mediu.

Zincul este un component esențial al setului de microelemente utilizate la cultivarea spirulinei. Cercetările efectuate în direcția dată au stabilit optimele de creștere și biosinteză, fiind în intervalul de concentarție a zincului de 0,02-0,08mg/l zinc (prin introducerea sulfatului sau a clorurii de zinc), și care este redat de mediile de cultivare ale spirulinei. În aceste condiții în biomasa de spirulină se determină aproximativ de la 25 la 50mg/kg zinc (25-50mcg/g). La concentrații depășite cu mult de cele optime ale zincului, crește toxicitatea lui, care este însoțită de micșorarea substanțială a cantității de proteină, pe contul acumulării polizaharidelor .

S-a demonstrat, că toxicitatea metalelor (inclusiv și a zincului) poate fi evitată în cazul utilizării acestui element complexat cu diferiți liganzi organici sau neorganici – prin includerea lui în compuși coordinativi [52].

Cianobacteria Spirulina platensis a dezvoltat pe parcusrsul evoluției mecanisme de acumulare, de rand cu un spectru larg de principii cu activitate biologică și metale în cantități considerabile. Această capacitate remarcabilă a spirulinei este cercetată intens în ultimii ani sub două aspecte relevante în acest sens:

Capacitatea spirulinei de a acumula metalele cu rol de biolemente în procese biotehnologice de cultivare dirijată în prezența unor surse minerale și organice cu bioconvertirea lor în compuși bioorganici metalocomponenți prețioși prin efectele sale biologice, și care pot fi valorificați în calitate de materii prime pentru diverse produse și preparate cu efecte terapeutice și nutraceutice [55, 24, 6].

Capacitatea cianobacteriilor de bioabsorbție și acumulare a metalelor toxice din mediul extern / capacitate cu vastă perspectivă de valorificare în tehnologiile de protecție a mediului ambiant, precum și capacitatea de recuperare prin aceleași mecanisme de absorbție și acumulare a microcomponentelor metalice din facilități de exploatare a minereurilor [15,17, 37].

Anume aceste doua aspecte, au fost abordate în investigațiile, rezultatele și analiza cărora sunt prezentate în continuare.

3.1. Stabilirea capacității de acumulare a zincului de către tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11 în procesul de cultivare controlată a culturii în prezența unor surse minerale și organice de zinc

Prin investigațiile, rezultatele cărora sunt prezentate în acest subcompartiment s-a monitorizat capacitatea spirulinei de a acumula zincul în procese biotehnologice de cultivare dirijată în prezența unor surse minerale, organice și organice sub formă de compuși coordinativi ai acestui metal și bioconvertirea lui în compuși bioorganici zinccomponenți prețioși prin efectele sale biologice, care pot fi valorificați în calitate de materii prime pentru diverse produse și preparate cu efecte terapeutice și nutraceutice

Conform obiectivelor propuse, în cadrul investigațiilor efectuate la subiectul dat au fost utilizate:

în calitate de sursă minerală a zincului – clorura de zinc (II) cu formula lineară: ZnCl2;

organică – acetatul de zinc(II) dihidrat cu formula lineară Zn(CH3COO)2 · 2H2O;

unii copmuși coordinativi ai Zn(II) cu alanina, serina și glicina.

Concentrațiile utilizate ale compușilor au fost: 10,0mg/l, 20mg/l și 30mg/l.

Toate sursele de zinc au fost selectate din considerentele că prezintă compuși ai zincului care fie sunt avizați câtre utilizare în compoziția suplimentelor alimentare și produselor farmaceutice drept surse ale acestui bioelement, sau ca în cazul compușilor coordinativi ai Zn(II), aceștea pot fi considerați nu numai surse ale acestui bioelement dar și surse organice de carbon și azot.

Este de menționat, că în compușii coordinativi incluși în investigațiile noastre, zincul este coordinat cu liganzii de natură organică alcătuiți de trei α-aminoacizi: alanina, serina și glicina, care conform unor date din literatură exercită un șir de funcții importante. Alanina (frecvent în calitate de D-izomer) este component al peptidoglicanilor pereților celulari bacterieni, glicina este necesară pentru sinteza proteinelor, fiind, în dependență de gradul de oxidare, donor de grupări: CH3OH, HCOOH, HCHO, iar serina participă la sinteza purinelor și pirimidinelor.

Procesul acumulării zincului în biomasa de spirulină a fost studiat în raport cu biomasa produsă – unul din indicii de bază, care caracterizează starea culturii și denotă integritatea ei funcțională.

Rezultatele experimentale asupra capacității de acumulare a zincului la cultivarea tulpinii cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11 în prezența clorurii de zinc (II) sunt prezentate în Tab. 3.1 și Fig. 3.1.

Tabelul 3.1. Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența clorurii de Zn (II)

* – veridicitatea în comparație cu martorul – p<0,05;

Fig. 3.1. Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența clorurii de Zn (II).

Conform datelor prezentate în Tab.31 și Fig. 3.1, la cultivarea spirulinei în prezența clorurii de zinc are loc acumularea acestui bioelement în biomasă. Nivelul cel mai mic al zincului este acumulat de către spirulină la concentrația cea mai mică utilizată în experiență – 10mg/l și constituie circa 57,5mg%, menționând că productivitatea spirulinei este în cazul dat sub nivelul biomasei produse în condiții standard.

Odată cu creșterea concentrației clorurii de zinc suplimentate la mediul de cultivare al spirulinei, crește și conținutul zincului în biomasă. Astfel, de la concentrația 20mg/l compus mineral la cea de 30mg/l, conținutul zincului în biomasă se dublează practic de 2 ori, în expresie valorică constituind circa 98mg% (20mg/l) și respectiv, circa 159mg% (30mg/l).

Pe fonul creșterii conținutului zincului în biomasa de spirulină, clorura de zinc induce o scădere apreciabilă sub nivelul normal a biomasei. Astfel, productivitatea spirulinei scade de la circa 21,6% (10mg/l) la circa 33,6% (30mg/l) sub nivelul productivității spirulinei crescute în lipsa concentrațiilor mari de clorură de zinc(II). Astfel, prezența unei corelații destul de înalte între rezultatele obținute asupra productivității și nivelului de acumulare a zincului confirmă veridicitatea datelor în diapazonul de concentrații studiate.

Prin urmare, la analiza rezultatelor obținute se confirmă capacitatea cianobacteriei S. platensis de a acumula zincul în biomasă la cultivare în prezența unor concentrații peste cele uzuale (din soluția de microelemente a mediului nutritiv) ale clorurii de zinc. Totuși, pragul de sensibilitate al culturii de spirulină față de forma minerală a zincului este unul destul de înalt, și confirmă prezența unui anumit nivel de toxicitate asupra culturii cianobacteriene manifestat prin scăderea destul de apreciabilă a nivelului de biomasă produsă – un caracter tehnologic foarte important urmărit în procesele tehnologice industriale de producere a biomasei de spirulină în calitate de materie primă pentru diverse scopuri farmaceutice și nutraceutice.

În Tab. 3.2 și Fig.3.2 sunt prezentate rezultatele experimentale asupra capacității de acumulare a zincului la cultivarea tulpinii cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11 în prezența sursei organice a zincului testată de noi – acetatul de zinc dihidrat.

Tabelul 3.2. Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența acetatului de zinc dihidrat (II)

* – veridicitatea în comparație cu martorul – p<0,05;

Fig. 3.2. Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența acetatului de Zn (II) dihidrat.

Rezultatele obținute, la fel, demonstrează derularea procesului de acumulare a zincului în biomasa de spirulină la cultivare în prezența sursei organice a zincului testate. Astfel, în lipsa unui efect de suprimare a creșterii și productivității spirulinei, suplimentarea mediului nutritiv cu acetatul de zinc(II) dihidrat în dozele aplicate duce și la acumularea zincului în biomasa produsă, iar nivelul de acumulare a acestui bioelement este în raport cu majorarea concentrației compusului ca și în cazul clorurii de zinc(II).

Conținutul minim a fost estimat la doza cea mai mică aplicată – 10mg/l, rezultând cu circa 60mg% zinc în biomasă, iar conținutul maximal de zinc a fost evaluat la cultivarea spirulinei în prezența concentrației de 30mg/l a compusului, constituind circa 190mg% zinc. Comparativ cu clorura de zinc, prezența acetatului de zinc în mediul de cultivare nu numai că nu afectează creșterea spirulinei, ci din contra contribuie la acest proces, prin stimularea creșterii cu circa 15% a nivelului de biomasă produs, menținând acest indice la nivelul martorului, chiar și la concentrația cea mai mare utilizată – 30mg/l. Astfel, bioacumularea zincului în procesul de cultivare a spirulinei este determinată de gradul de disociere a compușilor utilizați și de stabilitatea legăturilor formate cu ligandul, ceea ce determină în consecință capacitatea de acumulare de către spirulină a zincului.

În continuarea studiului a fost investigată capacitatea de acumulare a zincului de către Spirulina platensis din compușii coordinativi ai acestui bioelement: glicinatul de Zn(II), D-alaninat D,L-serinatul de Zn(II) și L-alaninat D,L-serinatul de Zn(II).

În Tab. 3.3 și Fig. 3.3 sunt prezentate rezultatele experimentale asupra capacității de acumulare a zincului la cultivarea tulpinii cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11 în prezența glicinatului de Zn(II).

Tabelul 3.3. Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența glicinatului de Zn(II)

* – veridicitatea în comparație cu martorul – p<0,05.

Fig. 3.3. Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența glicinatului de Zn (II).

Astfel conform datelor prezentate în Tab. 3.3 și Fig. 3.3, glicinatul de Zn(II) s-a dovedit a fi un reglator al procesului de creștere al spirulinei, stimulând sporirea veridică a productivității acesteia cu circa 25% la concentrația compusului de 10mg/l. Totodată, odată creșterea concentrației în mediul de cultură la 20mg/l și respectiv, la 30mg/l a glicinatului de Zn(II) nu afectează nivelul de creștere al spirulinei păstrându-l în limitele martorului. Ca și în cazul clorurii de zinc și a acetatului de zinc, spirulina acumulează zincul în prezența glicinatului de zinc. Procesul de acumulare este unul proportional, ca și în cazurile analizate anterior, cu creșterea concentrației compusului. Astfel, conținutul minimal de zinc – 69,38mg/% s-a estimat în biomasa de spirulină la concentrația de 10mg/l, iar cel maximal – la concentrația de 30 mg/l – 171,5mg/%

Un alt compus coordinativ al zincului inclus în studiu a fost D – alaninat D,L-serinatului de Zn(II)

În acest compus coordinativ, zincul este coordinat cu D alanina și D,L serina. Conform rezultatelor experimentale redate de Tabelul 3.4 și Figura 3.4, acest compus nu influențează negativ asupra procesului de creștere al tulpinii cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11. Productivitatea culturii se menține în limitele valorilor acestui parametru la cultivarea spirulinei în lipsa compusului prezența D – alaninat D,L-serinatului de Zn(II). Nivelul de acumulare a zincului, la fel este un proces proproțional cu creșterea concentrației compusului în mediul de cultură, la concentrația maximală a acestuia, de 30mg/l acumulându-se în biomasa de spirulină o cantitate a zincului mai mare decât în cazul compusului precedent – circa 184,8mg/%

Tabelul 3.4 Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența D – alaninat D,L-serinatului de Zn(II)

* – veridicitatea în comparație cu martorul – p<0,05.

Fig. 3.4. Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența D- alaninat D,L – serinatului de Zn (II).

În Tab. 3.5 și Fig. 3.5 sunt prezentate rezultatele experimentale asupra capacității de acumulare a zincului la cultivarea tulpinii cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11 în prezența L – alaninat D,L-serinatului de Zn(II). În cazul acestii compus coordinativ al Zn(II), vom menționa că pe fonul unui efect moderat de reglare a creșterii productivității spirulinei (productivitatea se menține în limitile unui spor veridic de circa 6-18% față de martor), zincul la fel, se acumulează proporțional cu creșterea concentrației compusului coordinativ suplimentate la mediul de cultivare. În cazul acestui compus coordinativ, spirulina acumulează cantitatea maximală de metal – circa 194mg/% zinc.

Tabelul 3.5 Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența L – alaninat D,L-serinatului de Zn(II)

* – veridicitatea în comparație cu martorul – p<0,05.

Fig. 3.5. Productivitatea și nivelul de acumulare al zincului la cultivarea S. platensis în prezența L – alaninat D,L – serinatului de Zn (II).

În Fig. 3.6 sunt redate nivelurile maximale de acumulare a zincului (la concentrația maximală introdusă în mediul de cutură – 30mg/l) de către Spirulina platensis din diferite surse ale acestui metal.

Astfel, spirulina acumulează pe durata creșterii sale zincul din diferite surse a acestui metal suplimentate și prezente în mediul de cultivare. Totuși, vom menționa că în prezența surselor organice ale zincului și celor reprezentate de compușii coordinativ zincul se acumulează mai eficient, exprimând valori mai înalte a conținutului său, menționând totodată că în prezența acestora, creșterea spirulinei nu este afectată odată cu majorarea concentrației în mediul de cultivare, nivelul biomasei produse la final, menținându-se în limitele fiziologice normale.

La analiza datelor obținute în aceste serii de experiențe, vom rezuma următoarele. Mecanismul acumulării zincului în procesul de cultivare al spirulinei nu este stabilit definitiv. Este de presupus, însă, că acest proces, la fel, este interceptat cu realizarea căilor metabolice în celulele spirulinei și implică diverși constiuienți în legarea ionilor de Zn2+. Conform rezultatelor obținute, cultura de spirulină este mai receptivă în sensul pozitiv față de sursele organice și cele sub formă de compuși coordinativi, acumularea zincului în prezența acestora fiind un proces mai activ, datorat naturii ligandului și gradului înalt de disociere a compusului. Ulterior, probabil, mecanismul de realizare este cel al absorbției ionice pe contul transportului activ, conjugat cu fotosinteza, fapt confirmat de nivelul sporit al productivității sprulinei. Acest mecanism poate implica și sistemele energetice fermentative și de absorbție, legate de membrane și biocation. Mecanismul de bioacumulare poate implica și stereospecificitatea unor enzime membranare, activate de către ionii de Zn2+, (semnificativi pentru transportul membranar), manifestată față de un anumit tip de substrat și, care, probabil controlează transformarea substratului. Ulterior, cationul Zn2+ este supus aceluiași mecanism de complexare prin coordinarea cu grupele funcționale ale compușilor macromoleculari din celulele spirulinei.

În continuare în următoarea serie experimentală, biomasa de spirulină cultivată în prezența clorurii de zinc în concentrația de 30mg/l care asigură obținerea a circa 159mg% de zinc în biomasă, biomasa obținută la cultivarea spirulinei în prezența acetatului de zinc(II) dihidrat în concentrație de 30mg/l, care asigură obținerea a circa 191mg% zinc în biomasă și biomasa obținută la cultivarea spirulinei în prezența L-alaninat D,L serinatului de zinc(II) în concentrație de 30mg/l, care asigură obținerea a circa 195mg% zinc în biomasă a fost supusă fracționării principiilor bioactive, în aceste fracții fiind monitorizat nivelul repartizării zincului. Rezultatele referitor la conținutul zincului pe fracții sunt prezentate în (Tab. 3.6, Fig.3.7 și Fig. 3.8).

Rezultatele obținute demonstrează că cantitatea cea mai mare de zinc se acumulează în fracțiile de aminoacizi liberi și oligopeptide și proteine din biomasa de spirulină, cu prevalarea preponderentă în fracțiile de aminoacizi liberi și oligopeptide în cazul clorurii de zinc și acetatului de zinc dihidrat, comparativ cu proteinele, În expresie valorică în extractul de aminoacizi liberi și oligopeptide s-au determinat circa 41,7% din cantitatea totală de zinc determinată în biomasa de spirulină cultivată în prezența clorurii de zinc și circa 42,7 % în extractul respectiv obținut din biomasa obținută la cultivarea spirulinei în prezența acetatului de zinc dihidrat. S-au semnalat mici deosebiri între conținutul de zinc determinat în extractele de proteine. 30,4% s-au determinat în extractul de proteine obținut din biomasa crescută în perzența a 30mg/l clorură de zinc și respectiv, 33,7% în extractul de proteine obținut din biomasa cultivată în prezența aceleiași concentrații de acetat de zinc dihidrat. Valorile zincului determinat în extractul de polizaharide nu variază și este în limitele de 18-19,5 %. Tabloul prezintă mici deosebiri în fracțiile obținute din biomasa cu conținut sporit de zinc obținută la cultivare în prezența compusului coordinativ – L-alaninat D,L serinatul de zinc. În cazul acestuia, o cantitate de zinc mai mare se acumulează în extractul de proteine (44,50%), comparativ cu fracția de aminoacizi liberi și oligopeptide (38,74%). În fracția de polizaharide, au fost determinate respectiv 13,07% zinc, mai puțin comparativ cu fracția dată obținută din biomasa rezultată la creșterea spirulinei în prezența clorurii și acetatului de zinc dihidrat (18,8% și 19,65% respectiv).

Tabelul 3.6. Conținutul zincului în diferite fracții bioactive componente ale biomasei de spirulină, cultivată în prezența unor surse minerale, organice și din compuși coordinativi ale zincului(II)

Fig. 3.7. Repartizarea zincului (% total) în diferite fracții bioactive componente ale biomasei de spirulină, cultivată în prezența clorurii și de Zn(II).

Fig. 3.8. Repartizarea zincului (% total) în diferite fracții bioactive componente ale biomasei de spirulină, cultivată în prezența acetatului de Zn(II) dihidrat.

Fig. 3.9. Repartizarea zincului (% total) în diferite fracții bioactive componente ale biomasei de spirulină, cultivată în prezența L-alaninat D,L serinatului de Zn(II).

La analiza rezultatelor obținute în această serie experimentală se pot rezuma următoarele. Chiar dacă clorura de zinc induce o acumulare a zincului, și pe fonul acestui proces o descreștere a biomasei, iar ceilalți compuși considerați ca sursă organică, organică (din compuși coordinativi) a zincului mențin productivitatea culturii la cote normale, tabloul distribuției acestui bioelement nu prezintă diferențe majore în nivelul de acumulare și demonstrează acumularea preferențială a zincului în compușii de natură proteică (dar cu schimbări ale conținutul în interiorul fracțiilor de natură proteică). Acumularea zincului prin includerea eficientă treptată a zincului în fracțiile aminoacizilor liberi și oligopeptidelor, proteinelor poate fi explicată și prin procesele de sinteză a acestora care se desfășoară în celulele spirulinei, iar printre factorii, ce pot influența aceste procese este și pH-ul mediului. Conform unor date din literatură [78], zincul în celule poate fi sub formă de ioni de zinc, care joacă un rol important în preîntîmpinarea disocierii compușilor macromoleculari zinccomponenți, fiind presupusă existența unei relații de echilibru: Zn2+ + proteina = proteina + 2H+. Odată cu majorarea pH-ului are loc deplasarea acestui echilibru spre Zn2+ + proteina. Pe parcursul procesului de cultivare a spirulinei valorile pH-ului înregistrate inițial între 8,4 – 8,9, ulterior cresc, majorîndu-se până la 9,4 – 10,0, valori suficient de înalte pentru a asigura includerea bioelementului în compușii proteici. De menționat, că la procesul dat contribuie doar 4 aminoacizi din catena polipeptidică, care pot funcționa ca liganzi ce coordinează la atomul de zinc: histidina (prin atomii de azot), acidul glutamic și asparagic (prin grupările carboxil) și cisteina (prin atomii de sulf).

Așa dar, rezultatele expuse în acest subcompartiment, prezintă argumentele în favoarea utilizării acetatului de zinc (II) dihidrat și a L alaninat D,L serinatului de zinc (II) în procesele de cultivare controlată a spirulinei în scopul obținerii biomasei și a extractelor de principii bioactive: aminoacizi liberi și oligopeptide, proteine și polizaharide – materii prime pentru fabricarea noilor produse nutraceutice și preparate farmaceutice. Aceste rezultate au servit drept suport tehnologic în elaborarea unor noi procedee de obținere a biomasei cu conținut prognozat de zinc și principii bioactive, iar în baza acesteia a extractelor de principii bioactive: aminoacizi liberi și oligopeptide, polizaharide și proteine zinccomponente care se realizează conform etapelor succesionale redate de Fig. 3.10.

Astfel, primul procedeu care este bazat pe capacitatea de bioacumulare a zincului în biomasă la cultivare în prezența acetatului de zinc (II) dihidrat, care conform schemei integrate elaborate asigură obținerea a circa 1,16g/l biomasă absolute uscată de spirulină – în limitele a 96,85 %, BAU ce conține 190mg% zinc repartizat la nivelul a circa 76% în fracțiile de aminoacizi liberi și oligopeptide și proteine. Cel de al doilea procedeu – de fracționare a principiilor bioactive zinccomponente asigură obținerea extractului de aminoacizi liberi și oligopeptide care conține circa 42% zinc; a extractului proteic care conține 33% zinc) și extractului de polizaharide care conține 19% zinc.

Cel de al 3-lea procedeu este bazat pe capacitatea de bioacumulare a zincului în biomasă la cultivare în prezența L-alaninat D,L-serinatului de zinc(II), care conform schemei integrate elaborate asigură obținerea a circa 1,28/l biomasă absolute uscată de spirulină – în limitele a 105,57 %, BAU ce conține circa 194mg% zinc repartizat la nivelul a circa 83% în fracțiile de aminoacizi liberi și oligopeptide și proteine. Cel de al 4-lea procedeu – de fracționare a principiilor bioactive zinccomponente asigură obținerea extractului de aminoacizi liberi și oligopeptide care conține circa 38% zinc; a extractului proteic care conține 44% zinc) și extractului de polizaharide care conține 13% zinc.

Fig. 3.10. Procedee de producere a biomasei de spirulină și a principiilor active zinccomponente la cultivarea S. platensis în prezența acetatului de zinc (II) dihidrat și L-alaninat D,L serinatului de zinc(II).

Toate cele 4 procedee pot fi încadrate în procesele tehnologice industriale de producere a biomasei de spirulină și a principiilor active – surse de materii prime de produse nutraceutice și remedii medicamentoase zinccomponente imunomodulatoare.

3.2 Capacitatea de biosorbție a zincului de către tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-11 (biomasa și fracțiile de principii bioactive) din soluții standard a unor compuși minerali și organici ai zincului (II)

Diferența structurii membranei celulare și a peretelui celular la diferite grupe de microorganisme, alge, bacterii, cianobacterii și fungi, duce la o diferență semnificativă privind mecanismele de legare a metalelor cu componentele celulare. După cum a fost relatat în capitolul 1, bioabsorbția este un proces independent și decurge în două etape: pasivă și activă unde are loc absorbția metalului pe suprafața membranei celulare sau a peretelui celular apoi penetrarea membranei și pătrunderea în interiorul celulei [2, 27, 28, 36, 43, 44].

Astfel, majoritatea microelementelor, în rezultatul pătrunderii în interiorul celulelor cianobacteriene, formează legături cu moleculele compușilor organici ca proteinele, lipidele, polizaharidele, aminoacizii etc. În cazul în care microelementele sunt în exces ele sunt stocate în formațiuni specifice fiind păstrate în formă neactivă și netoxică pentru celulă. Conform datelor din literatură, de rând cu plantele superioare și ciupercile, cianobacteriile posedă capacitatea de stocare și neutralizare a excesului metalelor prin implicarea în special a peptidelor de tipul fitochelatinelor și metalotioninelor.

Capacitatea de absorbție a metalelor grele de către cianobacterii este datorată în special grupelor proteice –COO- și lanțurilor funcționale secundare ale aminoacizilor ca histidina, cisteina, acidul aspartic și acidul glutamic.

În acest subcompartiment al cercetărilor a fost studiat procesul de biosorbție al ionilor de zinc de către biomasa nativă de spirulină obținută prin acumulare la cultivarea spirulinei pe mediul mineral nutritiv SP-1, cu durata ciclului de cultivare de 6 zile respectând parametrii standard ai cultivării. Capacitatea de biosorbție a fost studiată din soluții model/standard de zinc ale sării minerale – sulfatul de zinc, acetatul de zinc și L-alaninat D,L serinatul de zinc, la timpii de contact a biomasei și a extractelor de aminoacizi liberi și peptide, proteine, polizaharide de 15min., 30min, și 60min.

Rezultatele referitor la nivelul de biosorbție al zincului în biomasa de spirulină și extractele de principii active, (sistem reactant: biomasa+ sol. sulfat de zinc 100mg/l),(sistem reactant: biomasa+sol. acetat de zinc 100mg/l), (sistem reactant: biomasa+sol. acetat de zinc 100mg/l) sunt prezentate în (Tab. 3.7 -3.8 și Fig. 3.10- 3.12).

Fig. 3.10. Bioacumularea Zn(II) (% de recuperare din soluția de zinc) în biomasa nativă de spirulină în dependență de timpul de contact cu soluția de simulare de sulfat de zinc(II) heptahidrat.

Fig. 3.11. Bioacumularea Zn(II) (% de recuperare din soluția de zinc) în biomasa de spirulină în dependență de timpul de contact cu soluția de simulare de acetat de zinc(II) dihidrat.

Fig. 3.12. Bioacumularea Zn(II) (% de recuperare din soluția model ce conține zinc) în biomasa de spirulină în dependență de timpul de contact cu soluția de simulare de L-alaninat D,L-serinat de zinc.

Tabelul 3.7. Nivelul de biosorbție al zincului (II) în biomasa de spirulină la contactul cu soluții model de zinc: sulfat de zinc (II) heptahidrat, acetat de zinc (II) dihidrat și L-alaninat D,L-serinat de zinc (II)

Tabelul 3. 8. Nivelul de biosorbție al zincului (II) în extractele de principii bioactive la contactul cu soluții model de zinc: sulfat de zinc (II) heptahidrat, acetat de zinc(II) dihidrat și L-alaninat D,L-serinat de zinc(II)

Astfel, conform rezultatelor obținute pentru toate variantele experimentale: biomasa+sol. model de zinc și sistemele reactatnte ale principiilor active+sol. model de zinc tabloul rezultatelor este următorul: în cazul sulfatului de zinc (II) heptahidrat cu concentrația zincului de 22,7mg/l, conținutul zincului în perioada monitorizată crește. În primele 15 – 30min, nivelul de recuperare al zincului crește și acumularea lui în biomasă se observă și în continuare, atingând cota maximală la 60min de contact cu soluția de sulfat de zinc (Fig. 3.10).

Tabloul rezultatelor este similar și pentru soluția de acetat de zinc dihidrat care conține 29,7mg zinc, nivelul de recuperare a acestui metal din soluția model determinându-se la fel, la timpul de contact de 60min (Fig. 3.11).

La fel și pentru L-alaninat D,L-serinatul de zinc care conține 25,2mg zinc, valoarea maximală a zincului se determină la timpul de contact de 60min (Fig. 3.12).

Tabloul rezultatelor procesului de biosorbție a zincului din soluții model de zinc se repetă și pentru extractele de principii bioactive testate, timpul de contact optimal de biosorbție pentru acest metal fiind, la fel 60 min (Tab. 3.8).

Astfel, timpul optim de contact al biomasei de spirulină cu soluțiile model de zinc neorganic și organic este 60 min. În perioada dată a timpului în biomasa de spirulină încep procesele de distrugere celulară, cauzate de șocul osmotic. Cele 3 soluții utilizate reperzintă un mediu hipotonic pentru spirulină și nu pot asigura integritatea celulară de durată. Astfel, deoarece acumularea ionilor de zinc din soluțiile inițiale se produce prin mecanismul de biosorbție, care este realizat de celulele viabile, fiziologic active, sau inactive, sau moarte, este posibil, procesele destructive nu prezintă un impact negativ asupra sechestrării de zinc. Biosorbția este un process metabolic independent care este asigurat de grupurile funcționale astfel, ca carboxil, hidroxil, sulfat, fosfat și aminice, care manifestă un grad diferit de imobilizare a metalului. Abilitatea grupelor funcționale nu este afectată de destrucția mecanică a celulelor și faptul că procesul de biosorbție continuă pe perioada monitorizată reflectă că grupele funcționale sunt implicate în fixarea ionilor de zinc.

În final vom menționa că, în cadrul seriei experimentale nominalizate procesul de biosorbție s-a dovedit a fi mai eficient în cazul surselor organice utilizate: acetatul de zinc dihidrat (205mg% în biomasă, nivelul de recuperare a zincului din soluție constituind circa 72%) și L-alaninat D,L serinatul de zinc (203mg% în biomasă, nivelul de recuperare a zincului din soluție constituind circa 80%). Și în cazul extractelor de principii active, în special cele de natură proteică, nivelul de acumulare este unul destul de înalt – 62-85%.

CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

Tulpina cianobacteriei S. platensis CNMN-CB-11 manifestă capacitate de acumulare a zincului în biomasă la cultivare în prezența unor concentrații peste cele uzuale (din soluția de microelemente a mediului nutritiv) ale compușilor zincului.

Tulpina Spirulina S. platensis CNMN-CB-11 prezintă un prag de sensibilitate crescut al culturii față de forma minerală a zincului, determinat de nivelul înalt de toxicitate asupra culturii cianobacteriene manifestat prin scăderea cu circa 33% a nivelului de biomasă produsă.

La cultivarea spirulinei pe mediul nutritiv mineral ce conține suplimentar o sursă organică a zincului – acetatul de zinc(II) dihidrat și organică (din compus coordinativ) are loc o acumulare mai expresivă a zincului în biomasă – circa 190mg% -194mg% zinc. Totodată forma organică (acetat și din compus coordinativ cu liganzii organici alanina și serina) nu afectează procesul de creștere și dezvoltare al cianobacteriei, nivelul biomasei produse la final, menținându-se în limitele fiziologice normale.

Cantitatea de zinc se acumulează preponderent în fracțiile de aminoacizi liberi, oligopeptide și proteine din biomasa de spirulină, cu prevalarea preponderentă în fracțiile de aminoacizi liberi și oligopeptide, proces caracteristic acetatului de zinc (II), și din contra în fracția proteică, proces caracteristic pentru compusul coordinativ – L- alaninat D,L – serinatul de zinc(II). Acumularea zincului prin includerea eficientă treptată a zincului în fracțiile aminoacizilor liberi și oligopeptidelor, proteinelor poate fi explicată prin implicarea grupelor funcționale din aceste fracții în procesele de sinteză care se desfășoară în celulele spirulinei, iar printre factorii, ce pot influența aceste procese este și pH-ul mediului.

Procedeele de cultivare a spirulinei, bazate pe capacitatea cianobacteriei de a acumula zincul la creșterea culturii în prezența unei surse organice a acestui bioelement asigură obținerea a circa 1,16-1,28g/l biomasă absolut uscată de spirulină ce conține 190-194mg% zinc dintre care 139-167mg% zinc este inclus în fracțiile de aminoacizi liberi, oligopeptide și proteine.

Procedeele de extragere și fracționare a principiilor bioactive zinccomponente asigură obținerea a 15-25% extract de aminoacizi liberi și oligopeptide (ce conțin 75-81mg% zinc); a 60-65% proteine (ce conțin circa 64-86mg% zinc) și polizaharide – la nivelul a 80-85%, dintre care circa 33% sunt polizaharidele sulfatate (ce conțin 23-37mg% zinc).

Biomasa cianobacteriei Spirulina platensis CNMN-CB-11, obținută în condiții de cultură de acumulare se prezintă în calitate de biosorbent eficient al zincului din soluții ce conțin cantități mici ale acestui metal, asigurând acumularea în biomasă a circa 72-80% din zincul (II) din soluții standard ale acestui bioelement.

Fracțiile de principii bioactive, formulate în compoziția unor extracte de aminoacizi liberi și oligopeptide, proteine se prezintă în calitate de biosorbenți eficienți al zincului din soluții ce conțin cantități mici ale acestui metal, asigurând acumularea a circa 62-85 % din zincul (II) ce se conține în soluții standard ale acestui bioelement.

Recomandări:

Procedeele de cultivare a spirulinei, bazate pe capacitatea cianobacteriei de a acumula zincul la cultivare în prezența unor surse organice a acestui bioelemente se recomandă spre valorificare în condiții de fabricare industrială pentru obținerea biomasei de spirulină îmbogățită cu zinc – sursă de materii prime de produse nutraceutice și remedii medicamentoase zinccomponente imunomodulatoare.

Procedeele de extragere și fracționare a principiilor bioactive zinccomponente pot fi încadrate în procesele tehnologice industriale de producere a biomasei de spirulină și a principiilor active – surse de materii prime de produse nutraceutice și remedii medicamentoase zinccomponente imunomodulatoare.

Modelele tehnologice de acumulare a zincului, bazate pe capacitatea de biosorbție a spirulinei pot fi precăutate drept oportunitate pentru obținerea materiilor prime pentru fabricarea produselor nutraceutice și farmaceutice zinccomponente, dar și în cadrul unor tehnologii prietenoase mediului de recuperare a acestui metal din resturi rezultate din divesre procese industriale.

BIBLIOGRAFIE

Ahsan M., et al. A review on culture, production and use of spirulina as food for humans and feeds for domestic animals and fish. In: Fisheries and Aquac. Circular, 2008, nr 1034, p. 1-33.

Andrade S., Contreras L. Kinetics of copper accumulation in Lessonia nigrescens (Phaeophyceae) under conditions of environmental oxidative stress. In: Aquatic Toxicology, 2006, vol. 78, p. 398-401.

Arunakumara K., Zhang X. Heavy metal bioaccumulation and toxicity with special reference to microalgae. In: Journal of Ocean University of China, 2008, vol. 7, nr 1, p. 60-64.

Babadzhanov A., Abdusamatova N., Yusupova F. Chemical composition of Spirulina platensis cultivated in Uzbekistan. In: Chem. Nat. Compd., 2004, vol. 40, nr 3, p. 276-279.

Ballot A., et al. Phylogenetic relationship of Arthrospira, Phormidium, and Spirulina strains from Kenyan and Indian waterbodies. In: Algological Studies, 2004, vol. 113, nr 1, p. 37-56.

Batâr L. Productivitatea și componența biochimică a cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-02 la cultivare în prezența unor compuși coordinativi ai cuprului. Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2012. 24 p.

Belay A. The Potential Application of Spirulina (Arthrospira) as a Nutritional and Therapeutic Supplement in Health Management. In: J. of Am. Nutr., 2002, vol. 5, nr 2, p. 26-49.

Blinkova L., Gorobets O., Baturo A. Biological activity of Spirulina. In: Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2001, nr 2, p. 114-118.

Brinza L., Dring Mj., Gavrilescu M. Marine micro- and macro-algal species as biosorbents for heavy metals. In: Environ Eng Manage J 2007. vol. 6. p. 237–51.

Cases J., Vacchina V. Selenium from selenium-rich Spirulina is less bioavailable than selenium from sodium selenite and selenomethionine in selenium deficient rats. In: J. Nutr., 2001, vol. 131, nr 8, p. 2343-2350.

Cases J., Wysocka I., Caporiccio B. Assesment of selenium bioavailability from high selenium Spirulina subfractions in selenium deficient rats. In: J. Agric. Food Chem., 2002, vol. 50, nr 13, p. 3867-3873.

Cecal Al., Humelnicu D., Popa K., Rudic V., Gulea A., Palamaru I., Nemtoi G. Bioleaching of UO2 2+ ions from poor ores by means of cyanobacteria. J. of Radioanalytical Nuclear Chemistry, 2000, no.245, p.427-429.

Cecal Al., Popa K., Crăciun I. Bioacumulation in hydrophytae plants of same microelements from alkaline sludge resulting uranium ares processing. Rev. Chim., 2002, v.53, 4, p,290-293.

Cecal Al., V. Rudic, A. Gulea, I. Palamaru, D. Humelnicu, L. Cepoi, K. Popa, Verwendung von Mikrophytoalgen zur Reinigung von Radioaktiv verseuchten Abwassern, Rev. Roumaine Biochim., 1999, no. 36, p. 25-31.

Cecal, A.; Humelnicu, D.; Rudic, V.; Cepoi, L.; Ganju, D.; Cojocari, A. Uptake of uranyl ions from uranium ores and sludges by means of Spirulina platensis, Porphyridium cruentum and Nostoc linckia alga. In: Bioresourse Technology. 2012, no 118, pp. 19-23. ISSN: 0960-8524.

Cepoi L., Rudi L., Miscu V., Cojocari A., Chiriac T., Sadovnic D. Antioxidative activity of ethanol extracts from Spirulina platensis and Nostoc linckia by various methods. In: The Annals of Oradea University, Biology Fascicle”, Tom XVI/2, pp 43/48 (ISSN: 1224-5119; CNCSIS B+, BDI THOMSON, CABI, ExLibris; Copernicus).

Cepoi, L.; Chiriac, T.; Rudi, L.; Cojocari, A.; Rudic, V., Cecal, A. Solubilizarea alcalină a uraniului din minereu cu ajutorul microalgei roșii Porphyridium cruentum și bioacumularea microcomponentelor metalice din șlamul rezultat. Conferința științifică internațională „Biotehnologia microbiologică – domeniu scientointensiv al științei contemporane”. Chișinău, 6-8 iulie 2011, p. 23-24.

Chamorro, G., Salazar, M., Araujo, K., Dos Santos, C., Ceballos, G., Castillo, L. Update on the pharmacology of Spirulina (Arthrospira), an unconventional food. Arch. Latinoam. Nutr. 2002, v.52, no.3, p.232-240.

Chen H., Pan S. Bioremediation potential of spirulina: toxicity and biosorption studies of lead. J. Zhejiang Univ. SCI, 2005, vol. 6B, nr 3, p. 171-174.

Chiriac T. Biotehnologia cultivării spirulinei și obținerii produselor cu conținut prognozat de zinc și principii bioactive valoroase. Autoref. tezei de dr. în șt. biologice. Chișinău, 2003. 23 p.

Chojnacka, K.; Chojnacki, A.; Gorecka, H. Biosorption of Cr 3+, Cd 2+ and Cu 2+ ions by blu e– green algae Spirulina sp.: kinetics, equilibrium and the mechanism of the process. In: Chemosphere. 2005.vol.59. p.75–84.

Ciferri O. Spirulina, the Edible Microorganism. In: Microbiological reviews, 1983, vol. 47, nr 4, p. 551-578.

Cifferri O. Spirulina, the edible organism //Microalgae Reviews.- 1983.-Nr. 12.-P.551-573.

Ciumac D. Studiul modificării componenței biochimice a cianobacteriei Spirulina platensis la cultivarea în prezența compușilor coordinativi ai Cr(III). Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2008. 24 p.

Cojocari A. Particularitățile fiziologo-biochimice și biotehnologice ale tulpinii Nostoc linckia (Roth) Born et Flah CNM-CB-03-sursă de substanțe bioactive. Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2006. 26 p.

De Philippis, R., Paperi, R., Sili, C., Vincenzini, M. Assessment of the metal removal capability of two capsulated cyanobacteria, Cyanospira capsulata and Nostoc PCC7936. J.of Appl. Phycology, 2003, no.15, p.155-161.

Deepa K., Satish K., Binupriya A. Sorption of Cr(VI) from dilute solutions and wastewater by live and pretreated biomass of Aspergillus flavus. In: Chemosphere, 2006, vol. 62, p. 833-840.

Deng L., Zhu X., Wang X. Biosorption of copper(II) from aqueous solutions by green alga Cladophora fascicularis. In: Biodegradation, 2007, vol. 18, nr 4, p. 393-402.

Dylan G., Rijnlands L. On the Morphological Variations of Spirulina (Arthrospira platensis) and the Cyanobacteria in General with Regard to Small Scale Cultivation. In: Morphological variants of spirulina, 2010, p. 1-50.

El-Sheekh, M., El-Shouny, W., Osman, M., El-Gammal, E. Growth and heavy metals removal efficiency of Nostoc muscorum and Anabaena subcylindrica in sewage and industrial wastwater effluents. Env. Toxicology and Pharmacology, 2005, vol.19, no. 2, p.356-365.

Eykelenburg C. A glucan from the cell wall of the cyanobacterium Spirulina platensis. In: National Library of Medicine National Institutes of Health, 1978, vol. 44, nr 3-4, p. 321-327.

Eykelenburg C. On the morphology and ultrastructure of cell wall of Spirulina platensis. In: National Library of Medicine National Institutes of Health, 1977, vol. 43, nr 2, p. 89-99.

Eykelenburg C. Spirulina platensis morphology and ultrastructure. TR diss. 1980, 118 p.

Hambridge M. Humain zinc deficiency.// J. Nutr.-2000.-V.130(5S suppl.).- P.1344S-1349S

Hernandes E., Olguin E. Biosordtion of heavy metals influenced by the chemical composition of Spirulina sp. (Arthrospira) biomass. In: Environmental Technology, 2002, vol. 23, p. 1369-1377.

Hiren D., Arabinda R., Kothari I.L. Biosorption of Cadmium by Live and Dead Spirulina: IR Spectroscopic, Kinetics, and SEM Studies. Current Microbiol., 2007, vol. 54, p. 213-218.

Iațco, Iu.; Cepoi, L.; Rudi, L.; Chiriac, T.; Cojocari, A.; Miscu, V. Bioaccumulation of microelements and metal recovery using cianobacteria and microalgae from slurry resulting from alkaline leaching of uranium from ore. Second International Congress on Sustainability Science and Engineering. Tucson. Arizona. January 9-12, 2011. p.64-65.

Kumar K. et al. Cyanobacterial heterocysts. In: Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2010, vol. 2.

Langner J., Ansorge S., Bohley P., Kirschke H., Hanson H. Intracellular prorein breakdown. I. Aktivity determinations of endopeptidase using protein substrates. Acta Biol. Med. Ger., 1971, V.26, N5, P.935-951.

Ma Z., Gao K. Photoregulation of morphological structure and its physiological relevance in the cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis. In: Planta, 2009, vol. 230, p. 329-337.

Marzano C., Pellei M., Tisato F. Copper Complexes as Anticancer Agents. In: Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2009, vol. 9, nr 2, p. 185-211.

Mazo G., Savvin S., Pronina N. Chemical speciation of Zn, Cu and Cr in Spirulina platensis microalgae. In: ICP Information Newsletter, 2002, vol. 27. p. 138.

Nilanjana D., Vimala R., Karthika P. Biosorption of heavy metals. In: Indian Journal of Biotechnology, 2008, vol. 7, p. 159-169.

Nirmal K., Oommen C., Kumar R. Biosorption of Heavy Metals from Aqueous Solution by Green Marine Macroalgae from Okha Port, Gulf of Kutch, India. In: American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 2009, vol. 6, nr 3, p. 317-323.

Nirmal K., Oommen C., Kumar R. Biosorption of Heavy Metals from Aqueous Solution by Green Marine Macroalgae from Okha Port, Gulf of Kutch, India. In: American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 2009, vol. 6, nr 3, p. 317-323.

Olaizola M. Comercial development of microalgal biotechnology: from the test tube to the marketplace. In: Biomol. Eng., 2003, vol. 20, p. 459-466.

Palamaru M.N., Iordan A.R., Cecal A. Chimie bioanorganică și metalele vieții. Volumul V. Zincul. Molibdenul. Editura BIT: Iași, Romania, 1997. 387p.

Prasad A. S., Fitzerald J.T., Bao B., Beck F.W., Chandrasekar P.H. Duration of simptoms and plasma cytockine levels in patients with the common cold treated with zinc acetate. A randomized, double –blind, placebo-controlled trial // Ann. Intern. Med.-2000.-V.133,Nr.4.-P.245-252.

Puyfoulhoux G., Rouanet J., Besancon P. Iron availability from iron-fortified spirulina by an in vitro digestion with Caco-2 cell culture model. In: J. Agric. Food Chem., 2001. vol. 49, nr 3, p. 1625-1629.

Raport științific la proiectul bilateral moldo român 10.820.04.17.RoA „Bioacumularea si recuperarea microcomponentelor metalice din șlamul rezultat la solubilizarea alcalină a uraniului din minereu, cu ajutorul cianobacteriilor si microalgelor” (2010-2012), Chișinău, 2012, 60p.

Rayman, M.P. The importance of selenium to human health. The Lancet, 2000, v.56, p. 233-241.

Rudi L. Sinteza orientată a acizilor grași de către cianobacteria Spirulina platensis (Nordst.)Geitl. CNM-CB-01 și microalga Porphyridium cruentum (Nag) CNM-AR-01 și procedee de obținere a preparatelor lipidice. Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2006. 24 p.

Rudic V. Aspecte noi ale biotehnologiei moderne. Chișinău: Știința, 1993. 140 p.

Rudic V. Tulpina Spirulina platensis (Nordst) Geitl în calitate de sursă de substanțe biologic active Brevet de invenție MD 4122. 2012-02-29.

Rudic V., ș.a. Ficobiotehnologie – Realizări practice și perspective. Chișinău: Știința, 2007. 364 p.

Shailendra P., Beronda L. Determining cell shape: adaptive regulation of cyanobacterial cellular differentiation and morphology. In: Trends in Microbiology, 2011, vol. 19, p. 278-285.

Sheng P., Ting Y., Chen J. Sorbtion of lead, copper, cadmium, zinc and nickel by marine algal biomass: Characterization, of biosorptive capacity and investigation of mechanisms. J. Colloid Interface Sci., 2004, vol. 275, p. 131-141.

Skalny, A. Chemical elements in human physiology and ecology. M.: "Onyx 21 centrury". Mir, 2004, 216 p.

Skalny, A. Magnesium: life energy, certainty, force. M.: Med Expert Press, 2004, 102 p.

Skalny, A. Trace elements for your health. 2-nd edition revised and expanded. M.: "Onyx 21th century", 2004, 238 p.

Skalny, A. Zinc and human health (the book for modern reflecting physicians and curious patients). Orenburg: RICK GOU OGU, 2003, 80 p.

Skalny, A., Trukhanov, I. Modern methods to diagnose elemental balance and their role in restoration medicine. Modern technologies of resoration medicine .Ed. Trukhanov A.I. M.: Medica, 2004, 288 p.

Solisio C., Lodi A., Torre P. Copper removal by dry and re-hydrated biomass of Spirulina platensis. In: Bioresource Technology, 2006, vol. 97, p. 1756-1760.

Takatomo F., Rei N. Genomic Structure of an Economically Important Cyanobacterium, Arthrospira (Spirulina) platensis NIES-39. In: DNA Research, 2010, p. 1-19.

Vannela R., Verma S. Co2+, Cu2+ and Zn2+ accumulation by cyanobacterium Spirulina platensis. Biotechnolology Progress, 2006, vol. 22, nr 5, p. 1282-1293.

Wang J.L., Chen C. Biosorbents for heavy metals removal and their future. Biotechnology Advances, 2009, vol.27. p. 195–226.

Young K. The selective value of bacterial shape. In: Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2006, vol. 70, p. 660-703.

Zaretskaia E., et al. Essential trace elements distribution in food micro algae Spirulina platensis biomass fractions. In: Vopr. Pitan., 2004, vol. 73. nr 1. p. 45-53.

Zheng Y., Li X., Wang Y. The role of zinc, copper and iron in the pathogenesis of diabetes and diabetic complications: therapeutic effects by chelators. In: Hemoglobin, 2008, vol. 32, nr 1-2, p. 135-145.

Zhi Ping W., Ying Z. Morphological reversion of Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyta): from linear to helical. In: Journal of Phycology, 2005, vol. 41, nr 3, p. 622-628.

Zosim L. Biotehnologia cultivării spirulinei și obținerii produselor cu conținut prognozat de fier și alte substanțe bioactive valoroase. Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2007. 22 p.

Алешко-Ожевский Ю., Зилова И., Мазо В. Spirulina platensis – перспективный пищевой источник эссенциальных микроэлементов. In: Вестн. новых мед. Технологий, 2002, vol. 9, nr 1, p. 3-10.

Алиев С.Д., Тагдиси Д.Г., Панахи М.А. и др. Зависимость взаимоотношений иммунобиологической и аллергической реактивности организма от содержания в нем микроэлементов. Аллергология и иммунология. – 2003. – том 4. – №2. – с. 202.

Лаврова А.Е. Биологическая роль цинка в норме и при заболеваниях. // Российский педиатрический журнал. – 2000. – № 3. – с. 42-47.

Мазо, В., Зорин С., Гмошинский, И. В. и др. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Сообщение 2. Комплексы меди, хрома и марганца с ферментативными гидролизатами сывороточных белков коровьего молока. Вопр. детской диетологии. 2004, т.2, c.98.

Мазо, В., Гмошинский, И., Зилова, И. Микроводоросль спирулина в питании человека. Вопр. питания. 2004, № 1. c. 45-53.

Мазо, В., Зорин, С., Гмошинский, И. и др. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Комплекс цинка с ферментативным гидролизатом сывороточных белков. Вопр. детской диетологии. 2003. т.1, № 6, с. 6-8.

Макарова, С., Гмошинский, И., Мазо, В. и др. Применение биологически активной добавки содержащей витамин Е и селен, в комплексном лечении детей с аллергическими заболеваниями. Педиатрия. 2002, № 3. с. 66–71.

Мецлер Д. Биохимия: Xимические реакции в живой клетке.// Москва. –1980. –Том 2.

Удрис Г., Нейланд Я. Биологическая роль цинка. Рига, 1981.

Участие микроелементов в обмене веществ. П.А.Власюк, В. А. Жуков, В. И. Ивченко. – Киев.- 1983.

BIBLIOGRAFIE

Ahsan M., et al. A review on culture, production and use of spirulina as food for humans and feeds for domestic animals and fish. In: Fisheries and Aquac. Circular, 2008, nr 1034, p. 1-33.

Andrade S., Contreras L. Kinetics of copper accumulation in Lessonia nigrescens (Phaeophyceae) under conditions of environmental oxidative stress. In: Aquatic Toxicology, 2006, vol. 78, p. 398-401.

Arunakumara K., Zhang X. Heavy metal bioaccumulation and toxicity with special reference to microalgae. In: Journal of Ocean University of China, 2008, vol. 7, nr 1, p. 60-64.

Babadzhanov A., Abdusamatova N., Yusupova F. Chemical composition of Spirulina platensis cultivated in Uzbekistan. In: Chem. Nat. Compd., 2004, vol. 40, nr 3, p. 276-279.

Ballot A., et al. Phylogenetic relationship of Arthrospira, Phormidium, and Spirulina strains from Kenyan and Indian waterbodies. In: Algological Studies, 2004, vol. 113, nr 1, p. 37-56.

Batâr L. Productivitatea și componența biochimică a cianobacteriei Spirulina platensis CNM-CB-02 la cultivare în prezența unor compuși coordinativi ai cuprului. Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2012. 24 p.

Belay A. The Potential Application of Spirulina (Arthrospira) as a Nutritional and Therapeutic Supplement in Health Management. In: J. of Am. Nutr., 2002, vol. 5, nr 2, p. 26-49.

Blinkova L., Gorobets O., Baturo A. Biological activity of Spirulina. In: Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2001, nr 2, p. 114-118.

Brinza L., Dring Mj., Gavrilescu M. Marine micro- and macro-algal species as biosorbents for heavy metals. In: Environ Eng Manage J 2007. vol. 6. p. 237–51.

Cases J., Vacchina V. Selenium from selenium-rich Spirulina is less bioavailable than selenium from sodium selenite and selenomethionine in selenium deficient rats. In: J. Nutr., 2001, vol. 131, nr 8, p. 2343-2350.

Cases J., Wysocka I., Caporiccio B. Assesment of selenium bioavailability from high selenium Spirulina subfractions in selenium deficient rats. In: J. Agric. Food Chem., 2002, vol. 50, nr 13, p. 3867-3873.

Cecal Al., Humelnicu D., Popa K., Rudic V., Gulea A., Palamaru I., Nemtoi G. Bioleaching of UO2 2+ ions from poor ores by means of cyanobacteria. J. of Radioanalytical Nuclear Chemistry, 2000, no.245, p.427-429.

Cecal Al., Popa K., Crăciun I. Bioacumulation in hydrophytae plants of same microelements from alkaline sludge resulting uranium ares processing. Rev. Chim., 2002, v.53, 4, p,290-293.

Cecal Al., V. Rudic, A. Gulea, I. Palamaru, D. Humelnicu, L. Cepoi, K. Popa, Verwendung von Mikrophytoalgen zur Reinigung von Radioaktiv verseuchten Abwassern, Rev. Roumaine Biochim., 1999, no. 36, p. 25-31.

Cecal, A.; Humelnicu, D.; Rudic, V.; Cepoi, L.; Ganju, D.; Cojocari, A. Uptake of uranyl ions from uranium ores and sludges by means of Spirulina platensis, Porphyridium cruentum and Nostoc linckia alga. In: Bioresourse Technology. 2012, no 118, pp. 19-23. ISSN: 0960-8524.

Cepoi L., Rudi L., Miscu V., Cojocari A., Chiriac T., Sadovnic D. Antioxidative activity of ethanol extracts from Spirulina platensis and Nostoc linckia by various methods. In: The Annals of Oradea University, Biology Fascicle”, Tom XVI/2, pp 43/48 (ISSN: 1224-5119; CNCSIS B+, BDI THOMSON, CABI, ExLibris; Copernicus).

Cepoi, L.; Chiriac, T.; Rudi, L.; Cojocari, A.; Rudic, V., Cecal, A. Solubilizarea alcalină a uraniului din minereu cu ajutorul microalgei roșii Porphyridium cruentum și bioacumularea microcomponentelor metalice din șlamul rezultat. Conferința științifică internațională „Biotehnologia microbiologică – domeniu scientointensiv al științei contemporane”. Chișinău, 6-8 iulie 2011, p. 23-24.

Chamorro, G., Salazar, M., Araujo, K., Dos Santos, C., Ceballos, G., Castillo, L. Update on the pharmacology of Spirulina (Arthrospira), an unconventional food. Arch. Latinoam. Nutr. 2002, v.52, no.3, p.232-240.

Chen H., Pan S. Bioremediation potential of spirulina: toxicity and biosorption studies of lead. J. Zhejiang Univ. SCI, 2005, vol. 6B, nr 3, p. 171-174.

Chiriac T. Biotehnologia cultivării spirulinei și obținerii produselor cu conținut prognozat de zinc și principii bioactive valoroase. Autoref. tezei de dr. în șt. biologice. Chișinău, 2003. 23 p.

Chojnacka, K.; Chojnacki, A.; Gorecka, H. Biosorption of Cr 3+, Cd 2+ and Cu 2+ ions by blu e– green algae Spirulina sp.: kinetics, equilibrium and the mechanism of the process. In: Chemosphere. 2005.vol.59. p.75–84.

Ciferri O. Spirulina, the Edible Microorganism. In: Microbiological reviews, 1983, vol. 47, nr 4, p. 551-578.

Cifferri O. Spirulina, the edible organism //Microalgae Reviews.- 1983.-Nr. 12.-P.551-573.

Ciumac D. Studiul modificării componenței biochimice a cianobacteriei Spirulina platensis la cultivarea în prezența compușilor coordinativi ai Cr(III). Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2008. 24 p.

Cojocari A. Particularitățile fiziologo-biochimice și biotehnologice ale tulpinii Nostoc linckia (Roth) Born et Flah CNM-CB-03-sursă de substanțe bioactive. Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2006. 26 p.

De Philippis, R., Paperi, R., Sili, C., Vincenzini, M. Assessment of the metal removal capability of two capsulated cyanobacteria, Cyanospira capsulata and Nostoc PCC7936. J.of Appl. Phycology, 2003, no.15, p.155-161.

Deepa K., Satish K., Binupriya A. Sorption of Cr(VI) from dilute solutions and wastewater by live and pretreated biomass of Aspergillus flavus. In: Chemosphere, 2006, vol. 62, p. 833-840.

Deng L., Zhu X., Wang X. Biosorption of copper(II) from aqueous solutions by green alga Cladophora fascicularis. In: Biodegradation, 2007, vol. 18, nr 4, p. 393-402.

Dylan G., Rijnlands L. On the Morphological Variations of Spirulina (Arthrospira platensis) and the Cyanobacteria in General with Regard to Small Scale Cultivation. In: Morphological variants of spirulina, 2010, p. 1-50.

El-Sheekh, M., El-Shouny, W., Osman, M., El-Gammal, E. Growth and heavy metals removal efficiency of Nostoc muscorum and Anabaena subcylindrica in sewage and industrial wastwater effluents. Env. Toxicology and Pharmacology, 2005, vol.19, no. 2, p.356-365.

Eykelenburg C. A glucan from the cell wall of the cyanobacterium Spirulina platensis. In: National Library of Medicine National Institutes of Health, 1978, vol. 44, nr 3-4, p. 321-327.

Eykelenburg C. On the morphology and ultrastructure of cell wall of Spirulina platensis. In: National Library of Medicine National Institutes of Health, 1977, vol. 43, nr 2, p. 89-99.

Eykelenburg C. Spirulina platensis morphology and ultrastructure. TR diss. 1980, 118 p.

Hambridge M. Humain zinc deficiency.// J. Nutr.-2000.-V.130(5S suppl.).- P.1344S-1349S

Hernandes E., Olguin E. Biosordtion of heavy metals influenced by the chemical composition of Spirulina sp. (Arthrospira) biomass. In: Environmental Technology, 2002, vol. 23, p. 1369-1377.

Hiren D., Arabinda R., Kothari I.L. Biosorption of Cadmium by Live and Dead Spirulina: IR Spectroscopic, Kinetics, and SEM Studies. Current Microbiol., 2007, vol. 54, p. 213-218.

Iațco, Iu.; Cepoi, L.; Rudi, L.; Chiriac, T.; Cojocari, A.; Miscu, V. Bioaccumulation of microelements and metal recovery using cianobacteria and microalgae from slurry resulting from alkaline leaching of uranium from ore. Second International Congress on Sustainability Science and Engineering. Tucson. Arizona. January 9-12, 2011. p.64-65.

Kumar K. et al. Cyanobacterial heterocysts. In: Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2010, vol. 2.

Langner J., Ansorge S., Bohley P., Kirschke H., Hanson H. Intracellular prorein breakdown. I. Aktivity determinations of endopeptidase using protein substrates. Acta Biol. Med. Ger., 1971, V.26, N5, P.935-951.

Ma Z., Gao K. Photoregulation of morphological structure and its physiological relevance in the cyanobacterium Arthrospira (Spirulina) platensis. In: Planta, 2009, vol. 230, p. 329-337.

Marzano C., Pellei M., Tisato F. Copper Complexes as Anticancer Agents. In: Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2009, vol. 9, nr 2, p. 185-211.

Mazo G., Savvin S., Pronina N. Chemical speciation of Zn, Cu and Cr in Spirulina platensis microalgae. In: ICP Information Newsletter, 2002, vol. 27. p. 138.

Nilanjana D., Vimala R., Karthika P. Biosorption of heavy metals. In: Indian Journal of Biotechnology, 2008, vol. 7, p. 159-169.

Nirmal K., Oommen C., Kumar R. Biosorption of Heavy Metals from Aqueous Solution by Green Marine Macroalgae from Okha Port, Gulf of Kutch, India. In: American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 2009, vol. 6, nr 3, p. 317-323.

Nirmal K., Oommen C., Kumar R. Biosorption of Heavy Metals from Aqueous Solution by Green Marine Macroalgae from Okha Port, Gulf of Kutch, India. In: American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 2009, vol. 6, nr 3, p. 317-323.

Olaizola M. Comercial development of microalgal biotechnology: from the test tube to the marketplace. In: Biomol. Eng., 2003, vol. 20, p. 459-466.

Palamaru M.N., Iordan A.R., Cecal A. Chimie bioanorganică și metalele vieții. Volumul V. Zincul. Molibdenul. Editura BIT: Iași, Romania, 1997. 387p.

Prasad A. S., Fitzerald J.T., Bao B., Beck F.W., Chandrasekar P.H. Duration of simptoms and plasma cytockine levels in patients with the common cold treated with zinc acetate. A randomized, double –blind, placebo-controlled trial // Ann. Intern. Med.-2000.-V.133,Nr.4.-P.245-252.

Puyfoulhoux G., Rouanet J., Besancon P. Iron availability from iron-fortified spirulina by an in vitro digestion with Caco-2 cell culture model. In: J. Agric. Food Chem., 2001. vol. 49, nr 3, p. 1625-1629.

Raport științific la proiectul bilateral moldo român 10.820.04.17.RoA „Bioacumularea si recuperarea microcomponentelor metalice din șlamul rezultat la solubilizarea alcalină a uraniului din minereu, cu ajutorul cianobacteriilor si microalgelor” (2010-2012), Chișinău, 2012, 60p.

Rayman, M.P. The importance of selenium to human health. The Lancet, 2000, v.56, p. 233-241.

Rudi L. Sinteza orientată a acizilor grași de către cianobacteria Spirulina platensis (Nordst.)Geitl. CNM-CB-01 și microalga Porphyridium cruentum (Nag) CNM-AR-01 și procedee de obținere a preparatelor lipidice. Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2006. 24 p.

Rudic V. Aspecte noi ale biotehnologiei moderne. Chișinău: Știința, 1993. 140 p.

Rudic V. Tulpina Spirulina platensis (Nordst) Geitl în calitate de sursă de substanțe biologic active Brevet de invenție MD 4122. 2012-02-29.

Rudic V., ș.a. Ficobiotehnologie – Realizări practice și perspective. Chișinău: Știința, 2007. 364 p.

Shailendra P., Beronda L. Determining cell shape: adaptive regulation of cyanobacterial cellular differentiation and morphology. In: Trends in Microbiology, 2011, vol. 19, p. 278-285.

Sheng P., Ting Y., Chen J. Sorbtion of lead, copper, cadmium, zinc and nickel by marine algal biomass: Characterization, of biosorptive capacity and investigation of mechanisms. J. Colloid Interface Sci., 2004, vol. 275, p. 131-141.

Skalny, A. Chemical elements in human physiology and ecology. M.: "Onyx 21 centrury". Mir, 2004, 216 p.

Skalny, A. Magnesium: life energy, certainty, force. M.: Med Expert Press, 2004, 102 p.

Skalny, A. Trace elements for your health. 2-nd edition revised and expanded. M.: "Onyx 21th century", 2004, 238 p.

Skalny, A. Zinc and human health (the book for modern reflecting physicians and curious patients). Orenburg: RICK GOU OGU, 2003, 80 p.

Skalny, A., Trukhanov, I. Modern methods to diagnose elemental balance and their role in restoration medicine. Modern technologies of resoration medicine .Ed. Trukhanov A.I. M.: Medica, 2004, 288 p.

Solisio C., Lodi A., Torre P. Copper removal by dry and re-hydrated biomass of Spirulina platensis. In: Bioresource Technology, 2006, vol. 97, p. 1756-1760.

Takatomo F., Rei N. Genomic Structure of an Economically Important Cyanobacterium, Arthrospira (Spirulina) platensis NIES-39. In: DNA Research, 2010, p. 1-19.

Vannela R., Verma S. Co2+, Cu2+ and Zn2+ accumulation by cyanobacterium Spirulina platensis. Biotechnolology Progress, 2006, vol. 22, nr 5, p. 1282-1293.

Wang J.L., Chen C. Biosorbents for heavy metals removal and their future. Biotechnology Advances, 2009, vol.27. p. 195–226.

Young K. The selective value of bacterial shape. In: Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2006, vol. 70, p. 660-703.

Zaretskaia E., et al. Essential trace elements distribution in food micro algae Spirulina platensis biomass fractions. In: Vopr. Pitan., 2004, vol. 73. nr 1. p. 45-53.

Zheng Y., Li X., Wang Y. The role of zinc, copper and iron in the pathogenesis of diabetes and diabetic complications: therapeutic effects by chelators. In: Hemoglobin, 2008, vol. 32, nr 1-2, p. 135-145.

Zhi Ping W., Ying Z. Morphological reversion of Spirulina (Arthrospira) platensis (Cyanophyta): from linear to helical. In: Journal of Phycology, 2005, vol. 41, nr 3, p. 622-628.

Zosim L. Biotehnologia cultivării spirulinei și obținerii produselor cu conținut prognozat de fier și alte substanțe bioactive valoroase. Autoref. tezei de dr. șt. biologice. Chișinău, 2007. 22 p.

Алешко-Ожевский Ю., Зилова И., Мазо В. Spirulina platensis – перспективный пищевой источник эссенциальных микроэлементов. In: Вестн. новых мед. Технологий, 2002, vol. 9, nr 1, p. 3-10.

Алиев С.Д., Тагдиси Д.Г., Панахи М.А. и др. Зависимость взаимоотношений иммунобиологической и аллергической реактивности организма от содержания в нем микроэлементов. Аллергология и иммунология. – 2003. – том 4. – №2. – с. 202.

Лаврова А.Е. Биологическая роль цинка в норме и при заболеваниях. // Российский педиатрический журнал. – 2000. – № 3. – с. 42-47.

Мазо, В., Зорин С., Гмошинский, И. В. и др. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Сообщение 2. Комплексы меди, хрома и марганца с ферментативными гидролизатами сывороточных белков коровьего молока. Вопр. детской диетологии. 2004, т.2, c.98.

Мазо, В., Гмошинский, И., Зилова, И. Микроводоросль спирулина в питании человека. Вопр. питания. 2004, № 1. c. 45-53.

Мазо, В., Зорин, С., Гмошинский, И. и др. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов. Комплекс цинка с ферментативным гидролизатом сывороточных белков. Вопр. детской диетологии. 2003. т.1, № 6, с. 6-8.

Макарова, С., Гмошинский, И., Мазо, В. и др. Применение биологически активной добавки содержащей витамин Е и селен, в комплексном лечении детей с аллергическими заболеваниями. Педиатрия. 2002, № 3. с. 66–71.

Мецлер Д. Биохимия: Xимические реакции в живой клетке.// Москва. –1980. –Том 2.

Удрис Г., Нейланд Я. Биологическая роль цинка. Рига, 1981.

Участие микроелементов в обмене веществ. П.А.Власюк, В. А. Жуков, В. И. Ивченко. – Киев.- 1983.