Cap. 4 04122018 [306326]

CAPITOLUL 4. Hidrogeluri de colagen și PVP obținute cu radiații gamma

4.1. Date experimentale privind obținerea și caracterizarea structurii supramoleculare a hidrogelurilor cu proprietăți superabsorbante obținute din colagen și PVP prin reticulare cu radiații gamma (γ)

Rezumat

Hidrogelurile superabsorbante pe bază de colagen și polivinilpirolidonă (PVP) au fost obținute prin reticulare cu radiații γ [anonimizat] 3,6 × 105 și colagen acid de Tip I. [anonimizat] s-au efectuat în vederea determinării fracției de gel, a [anonimizat], respectiv a [anonimizat] a apei în hidrogelul obținut. Analiza reologică și caracterizarea structurii chimice a hidrogelului înainte și după iradiere au fost efectuate pentru a evalua proprietățile mecanice și stabilitatea acestuia la iradiere. În urma prelucrării datelor experimentale, s-a [anonimizat]: fracția de gel maximă a fost de 90%, raportul (degradare vs. reticulare) a indicat un grad de degradare neglijabil.

[anonimizat] a prezentat un grad de gonflare cuprins în intervalul 1000-2000%, exponentul de difuzie (n) a fost cuprins între 0,59-0,68. Parametrii care caracterizează structura supramoleculară a [anonimizat]: masa moleculară între două reticulari succesive (), densitatea de reticulare () și dimensiunea ochiurilor rețelei (ξ) au fost cuprinse între 3.398.08 , 1.242.95, respectiv 75-134 nm.

[anonimizat] (PVP) [1]. Evaluarea proprietăților suprafeței și a compoziției unor amestecuri de colagen și PVP după iradierea cu radiații UV a fost prezentată de Sionkowska și colab. [2, 3]. Până în prezent iradierea cu radiații sau cu fascicule de electroni accelerați a [anonimizat] a [anonimizat] [4]. Efectul iradierii cu EA asupra structurii copolimerulului de colagen și PVP prin iradierea unor soluții apoase de colagen și PVP a fost realizat de Dumitrașcu și colab. [5]. Chen și colab. [anonimizat] [6]. Un amestec format din colagen și PVP a fost utilizat pentru tratamentul cicatricilor posmastectomie la femeile cu cancer mamar [7]. Chimal-Monroy și colab. au evaluat efectul hidrogelurilor de colagen și PVP obținute prin reticulare cu radiații γ ca implanturi pentru regenerarea osoasă [8].

[anonimizat] o [anonimizat] [9, 10]. Pentru a [anonimizat], soluții saline sau fluide fiziologice de 10-1000 [anonimizat] [11].

[anonimizat]nte sunt adecvate pentru a fi utilizate ca: pansamente pentru răni, scutece de unică folosință, suport 3D (scaffold) în ingineria tisulară sau ca matrici pentru eliberarea controlată a unor medicamente [12].

Hidrogelurile superabsorbante pe bază de colagen au fost produse prin amestecarea colagenului cu alți polimeri solubili în apă în prezență și de agenți chimici de reticulare, cu scopul de a îmbunătăți fracția de gel, densitatea de reticulare, capacitatea de gonflare și stabilitatea și rezistența mecanică [13-21].

În studiile anterioare, am raportat obținerea gelurilor de colagen-PVP prin iradierea cu EA la debite de doză mari în prezența oxigenului. Principalul dezavantaj al acestei abordări este calitatea gelului obținut (moale, cu putere redusă de gonflare, precum și cu un randament ridicat de degradare). Acest lucru se datorează, probabil, geometriei de iradiere și a debitului de doză utilizate pentru prelucrarea acestui hidrogel [5].

Cu toate acestea, niciunul dintre studiile menționate nu se referă la proprietățile sistemului de colagen-PVP sau nu îl caracterizează din punct de vedere al proceselor radio-induse care apar în timpul procesului de reticulare prin iradiere. Mai mult decât atât, nu au fost raportate hidrogeluri superabsorbante de colagen-PVP, sintetizate prin reticulare cu radiații γ în absența oxigenului și la un debit de doză moderat care să prezinte o fracție de gel și grad de gonflare ridicate, o valoare scăzută a raportului p0/q0 (degradare vs. reticulare), dar și o structură chimică stabilă.

În vederea optimizării unui hidrogel pentru un produs final, cum ar fi integrarea biomacromoleculelor sau a medicamentelor în acesta, este necesară o bună înțelegere a relației dintre doza absorbită și proprietățile finale ale gelului.

Obiectivul acestei lucrări a constat în obținerea unui hidrogel superabsorbant pe bază de colagen și PVP prin reticulare cu radiații γ în absența oxigenului și fără adăugare de agenți chimici de reticulare. Hidrogelul obținut a fost caracterizat din punct de vedere structural și compozițional, iar parametrii de structură , și ξ) au fost corelați cu doza de radiație absorbită. De asemenea, randamentul de reticulare și de degradare, gradul de gonflare, comportamentul reologic, difuzia apei și structura chimică au investigate în funcție de doza absorbită. În final, a fost propus mecanismul de reacție privind obținerea hidrogelului de colagen-PVP prin reticulare radiații γ.

4.2. Partea experimentală

4.2.1. Materiale și sinteza hidrogelului de colagen-PVP

Gelul de colagen (2,1%) de Tip I a fost obținut din piele de vițel prin procedeul utilizat în prezent la Institutul de Cercetare Pielărie-Încălțăminte – ICPI. Masa moleculară medie a gelului de colagen acid (pH = 2,2 ) de Tip I a fost de 300 kDa [22].

Soluția de PVP 5% a fost obținută prin dizolvarea a 5 g de PVP360 (Sigma Aldrich Co., USA), cu masa moleculară medie = 3,6 , în 95 ml apă deionizată la 80°C, sub agitare magnetică până la solubilizarea completă a polimerului. Soluția obținută a fost răcită la temperatura camerei. Pentru prepararea amestecului apos de colagen și PVP, volume egale de gel de colagen (2,1%) și PVP360 (5%) au fost amestecate prin agitare magnetică la temperatura camerei până la omogenizarea completă. Acestă soluție a format substratul pentru iradiere.

Amestecul de colagen-PVP a fost introdus în seringi din plastic de 10 ml, iar înainte de iradiere, fiecare probă a fost degazată prin ultrasonare și sigilată pentru a evita degradarea avansată din cauza conținutului de oxigen. Reticularea sistemului colagen-PVP prin iradiere cu radiații γ a fost efectuată la iradiatorul industrial pe bază de 60Co (SVST Co-60/B) din cadrul Centrului de Iradieri Tehnologice – IRASM al Institutului Național de C&D pentru Fizică și Inginerie Nucleară Horia Hulubei (IFIN-HH).

Doza absorbită și debitul dozei au fost măsurate cu sistemul dozimetric etanol-monoclorbenzen prin oscilometrie. Debitul dozei utilizat a fost de 1,1 kGy/h, iar dozele absorbite au fost în intervalul 5-50 kGy.

4.2.2. Analiza sol-gel

Probele de hidrogel cu diametrul de 10 mm au fost tăiate în bucăți de 4-5 mm grosime. Hidrogelurile au fost uscate într-o etuvă cu vid până masă constantă, după care au fost imersate în apă deionizată timp de 48 de ore la temperatură constantă de 25°C. După 48 ore, hidrogelurile au fost uscate din nou în etuva cu vid la temperatură constantă (30°C) până la masă constantă. Fracția de gel a fost calculată ca media a trei determinări. Fracția de gel – fracția insolubilă și sol – fracția solubilă au fost calculate cu ecuațiile (2.14) și (2.17).

După regonflare, gradul de gonflare (GG) a fost calculat funcție de masa hidrogelului în stare uscată () și gonflată (), utilizând ecuația (2.15).

4.2.3. Difuzia apei

Mecanismul de difuzie al apei în hidrogelul superabsorbant a fost evaluat utilizând datele obținute din experimentele de gonflare. Datele obținute până la 60% din capacitatea de gonflare maximă (stadiul inițial de gonflare) au fost prelucrare conform legii lui Fick. Dependența cantității de apă absorbită în hidrogeluri, , în funcție de timp (, minute), a fost folosit pentru analiza mecanismului de difuziei al apei. Folosind cinetica de gonflare, au fost repezentate grafic , în funcție de și , în funcție de . Constantele de difuzie (), exponenții de difuzie () și coeficienții de difuzie () au fost calculați din pantele și intersecția dreptelor.

4.2.4. Analiza reologică

Pentru a determina carateristicile reologice în funcție de doza de radiație absorbită, s-au determinat moduli – modul elastic și – modulul vâscos prin măsurători de reologie oscilatorie. Toate experimentele au fost efectuate la 25°C în regiunea vâsco-elastică liniară, la o rată de deformare și domeniul de frecvență de , folosind un Reometru Thermo MARS II echipat cu două discuri cu diametrul de 20 mm (geometria placilor). Distanța dintre cele două discuri a fost setată la 0,139 mm.

4.2.5. Spectroscopia ATR-FTIR

Spectrele in infraroșu cu transformată Fourier (FTIR) ale probelor neiradiate și iradiate au fost realizate cu un instrument Spectrum 100 (Perkin Elmer, USA) echipat cu cristal de Zn-Se. După îndepărtarea fracției solubile, hidrogelurile au fost uscate până la masă constantă și apoi au fost utilizate pentru analiza FTIR. Spectrele au fost obținute în modul ATR și în fiecare spectru a fost realizat din 20 de scanări/probă, în intervalul de lungime de undă de 4000-600 cm-1 cu o rezoluție de 4 cm-1.

4.3. Rezultate și discutii

4.3.1. Mecanismul de reticulare cu radiații a hidrogelurilor pe bază de colagen și PVP

În soluțiile polimerice apoase diluate, radiația ionizantă este absorbită în principal de apă, conducând la producerea de radicali hidroxil (HO•), atomi de hidrogen (H•) și alte specii, de ex. , și . Radicalii HO• și H• sunt principalele specii reactive responsabile pentru formarea macroradicalilor, în principal prin extragerea unui atom de de H.

Principalii radicali și structura lor chimică generată în timpul iradierii unei soluții apoase de PVP au fost propuși inițial de Davis și colab., Rosiak și colab. [23, 24]. Recent, structura chimică a radicalilor generați după iradierea PVP în soluție apoasă au fost ulterior revizuită de către An și colab. [25], iar mecanismul de reacție complex al modificării structurale a PVP în timpul iradierii unor soluții apoase diluate a fost prezentat de către Sabationo și colab. [26].

După ce o soluție apoasă de colagen este iradiată, se presupune că radicalii HO• și H• inițiază formarea macroradicalilor de colagen. Radicalul HO• extrage un atom de hidrogen, ducând la formarea unei molecule de apă [22]. Atomii de hidrogen extrag din molecula de colagen un alt atom de hidrogen, rezultând o moleculă de H2, care apare sub forma bulelor de gaz în timpul procesului de reticulare. Atunci când un sistem format din colagen, PVP și apă este expus la radiația γ, o serie de macroradicali sunt formați din moleculele de colagen și PVP, dând naștere la reacții de recombinare între radicalii liberi nou formați. Structurile acestor radicali și mecanismul propus pentru reticularea cu radiații γ a hidrogelului de colagen și PVP este prezentat în Schema 1.

Schema 1. Reacțiile și mecanismul de reacție propuse pentru reticularea hidrogelului

de colagen și PVP cu radiații γ

În reacția 1 se prezintă mecanismul general de radioliză a apei. Cele mai stabile structuri de radicali rezultate după radioliza PVP în soluție apoasă sunt prezentate în reacția 2. Reacția 4 prezintă mecanismul de formare a unui radical de colagen. Reacțiile 3 și 5 arată reacțiile specifice de recombinare a radicalilor liberi specifici colagenului și PVP, cât și structurile rezultate în urma reacțiilor de reticulate. Pe baza mecanismelor de reacție propuse pentru reticularea colagenului [27, 28] și a sistemelor de colagen-dextran prin iradiere cu radiații γ [29], am propus un mecanism de reticulare cu radiații γ pentru sistemul colagen-PVP conform reacției 6. Reacția are loc prin recombinarea specifică a radicalilor liberi de PVP și al unui radical de colagen, rezultând o legătură covalentă între macroradicalii de PVP și colagen. Aceste legături acționează pentru a stabiliza structura triplu-helix a colagenului care este cea mai susceptibilă la degradare în timpul procesului de reticulare cu radiații.

4.3.2. Analiza sol-gel

Pentru evaluarea procesului de reticulare cu radiații a polimerilor naturali și sintetici, analiza sol-gel permite estimarea următorilor parametrii, cum ar fi: randamentele de reticulare G(X) și de degradare G(S), doza de gelifiere (), precum și corelarea acestor parametrii cu alte proprietăți fizico-chimice [30]. Prin iradierea amestecurilor polimerice cu radiații ionizante sunt de obicei observate reacții de reticulare sau de degradare a lanțului polimeric [31]. Figura 4.1a ilustrează evoluția fracției de gel în funcție de doza absorbită. Fracția de gel este relativ ridicata chiar și la doze mici (la 5 kGy depășește 60%) și crește cu doză absorbită. Pentru calcularea , s-a utilizat modelul Charlesby-Pinner și o versiune modificată a acestuia [32, 33]. Pentru a evita erorile rezultate din distribuția necunoscută a greutății moleculare pentru polimerii utilizați, s-a utilizat ecuația Charlesby-Rosiak (Ec. (2.19) [34].

Doza de gelifiere, raportul (degradare vs. reticulare) și au fost calculate conform Ec. (2.19), utilizând un software de calculator disponibil gratuit, care a implementat atât ecuațiile Charlesby-Pinner, cât și Charlesby-Rosiak [35]. Parametrul p0/q0 a fost a găsit ca fiind ~ 0.35 pe baza ecuației Charlesby-Pinner, în timp ce pentru ecuația Charlesby-Rosiak această valoare a fost egală cu 0,14 (Tabelul 1).

Tabelul 1. Valorile dozei de gelifiere () și a raportului degradare vs. reticulare () obținute cu ecuațiile Charlesby-Pinner și Charlesby-Rosiak

Figura 4.1. a) Fracția de gel obținută pentru hidrogelurile de colagen-PVP în funcție de doza de iradiere; b) Datele analizei sol-gel obținute conform Ec. 2.19

Așa cum se poate vedea din Figura 4.1b, s-a obținut o fitare liniră bună (R2 = 0,99) conform Ec. (2.19). O valoare mai mare a raportului indică de obicei prezența unui proces de degradare. În cazul nostru, a fost găsit ca fiind egal cu 0,14, ceea ce indică faptul că procesul de degradare este aproape neglijabil.

Deoarece procesele de reticulare și degradare au loc simultan în timpul iradierii soluțiilor polimerice, determinarea randamentelor de reticulare G(X) și de degradare G(S), oferă informații importante despre rezultatul final al iradierii. În acest studiu, parametrii G(X) și G(S) au fost calculați din datele experimentale obținute pentru determinarea proprietăților de gonflare la echilibru a hidrogelurilor de colagen-PVP. Această metodă permite obținerea valorii G(X) fără alte informații privind masa moleculară a polimerilor. De asemenea, acestă metodă este aplicabilă și în cazul sistemelor mai complicate, ca și în cazul nostru, unde pot apărea reacții de reticulare și degradare a lanțurilor polimerice, atunci când un amestec de polimeri dispersat într-un mediu apos este iradiat.

Un gel reticulat se gonflează într-o anumită măsură, în funcție de concentrația efectivă a lanțurilor sau densitatea de reticulare (), care este legată de masa moleculară medie dintre două puncte de reticulare succesive [36]. G(X) reprezintă numărul de reticulari exprimate în unități de mol·J-1 și se utilizează pentru a măsura randamentul radio-chimic. Pentru a estima randamentele de reticulare G(X) și de degradare G(S), au fost utilizate ecuațiile (2.22) și (2.23). Valorile G(X) și G(S), calculate pentru hidrogelurile de colagen-PVP sunt prezentate în Tabelul 3.

Studiile anterioare au raportat o valoare a G(X) de obținută pentru hidrogelurile de PVP în soluții saturate cu argon [37]. Pentru hidrogelul de colagen-PVP iradiat în soluție apoasă nu au fost găsite date despre valoarea randamentului de reticulare. În cazul nostru, valoarea maximă a lui G(X) a fost de pentru doza de iradiere de 5 kGy, având o tendință de scădere în funcție de doza de iradiere aplicată. Randamentul de degradare a fost cu mai mult de un ordine de mărime mai mic decât randamentul de reticulare, de asemenea, având o tendință de scădere în funcție de doza de iradiere aplicată (Tabelul 3). Acest lucru era de așteptat, deoarece densitatea de reticulare () crește cu doza absorbită, formând o structură de hidrogel mai densă, lăsând astfel mai puține posibilități de a crea noi legături covalente și, în același timp, mai puține șanse de a genera procese degradare generate prin reacții de scindare a lanțurilor macromoleculare.

4.3.4. Determinarea gradului de gonflare la echilibru

Pentru a evalua capacitatea de absorbție, structura rețelei și pentru a calcula densitatea de reticulare efectivă a hidrogelurilor de colagen-PVP, au fost investigate proprietățile de gonflare folosind apă deionizată. Experimentele de gonflare s-au efectuat până când gradul de gonflare a atins o valoare constantă pentru fiecare probă iradiată în intervalul 5-50 kGy. Gradul de gonflare al hidrogelurilor de colagen-PVP față de timpul de imersie în apă este prezentat în Figura 4.2.

Hidrogelurile de colagen-PVP au atins echilibrul după 700 de minute, sugerând astfel formarea unei structuri dense a rețelei, precum și formarea unui hidrogel stabil. Gradul de gonflare a scăzut odată cu creșterea dozei absorbite, sugerând că densitatea de reticulare crește odată cu creșterea dozei absorbite în hidrogelul investigat.

Figura 4.2. Capacitatea de gonflare a hidrogelului de colagen-PVP

în funcție de timpul de imersie în apă

4.3.5. Determinarea mecanismului de difuzie al apei

Studiul fenomenelor de difuzie a apei în hidrogeluri superabsorbante este de mare interes deoarece clarifică comportamentul polimerului pentru diverse aplicații a hidrogelurilor cum ar fi: biomedicină, farmaceutică sau inginerie tisulară. Acest studiu a fost realizat pentru a susține studii viitoare care vizează integrarea biomacromoleculelor sau medicamentelor în matricea hidrogelurilor bazate pe colagen și PVP.

Difuzia apei în hidrogelurile reticulate implică migrarea moleculelor de apă în spații preexistente sau formate dinamic în rețeaua de hidrogel. Pe scurt, procesul de gonflare influențează creșterea distanței dintre lanțurile macromoleculare ale hidrogelului [38]. Pentru a determina natura difuziei apei în rețeaua hidrogelului de colagen-PVP a fost folosită următoarea ecuație:

(4.1)

Unde și reprezintă cantitatea de solvent difuzată în hidrogel la momentul și în stare de echilibru; este o constantă legată de rețeaua macromoleculară, iar exponentul este un număr utilizat pentru a caracterizarea tipului de difuzie, prezentând mecanismul de transport [39]. De regulă, pentru hidrogeluri cu formă cilindrică, dacă este cuprins între 0,4 și 0,5, difuzia este de tip Fickian, în timp ce pentru difuzia este de tip non-Fickian. Ecuația (4.1) este aplicată în etapa inițială de gonflare, până la 60% din maximul gradului de gonflare [40]. În figurile 3a și 4b sunt reprezentate grafic , în funcție de de și în funcție de utilizând cinetica de gonflare. Parametrii , și coeficienții de difuzie () au fost determinați din panta și intersecția dreptelor. Pentru un mecanism de difuzie de tip non-Fickian, densitatea de reticulare este crescută, ducând la înglobarea unei cantități mai mici de apă în vrac și la scăderea ratei de difuzie [41, 42].

Se știe că cel mai mare conținut de apă al hidrogelurilor este apa liberă, care este similară cu cea a apei care provine din exteriorul gelului. Într-o rețea polimerică de hidrogeluri, există cel puțin trei tipuri de structuri de apă, după cum urmează: apă liberă, apă legată primar și secundar.

Atunci când un hidrogel este introdus în apă, primul tip de apă care va fi prezent este apa legată primar, datorită hidratarii grupărilor hidrofile ale polimerului. În general, apa legată primar este foarte dificil de îndepartat din structura hidrogelului, ca urmare, rețeaua se umflă și grupările de natură hidrofobă sunt expuse formându-se apă legata secundar [30].

Valorile constantelor de difuzie (), a exponenților de difuzie () și a coeficienților de difuzie () determinate pentru hidrogelurile de colagen-PVP sunt indicate în Tabelul 2.

Tabelul 2. Parametrii , și coeficienții de difuzie ()

Valorile exponenților de difuzie sunt cuprinși în domeniul 0,590,68, prin urmare, tipul de difuzie a apei în hidrogelurile de colagen-PVP a fost considerat non-Fickian. Aceasta înseamnă că difuzia apei are loc prin aplicarea unei forțe sau prin interacții de tip hidrofil, care duc în final la stresul rețelei de hidrogel, spre deosebire de mecanismul de tip Fickian, care se bazează pe un gradient chimic. Tipul de transport non-Fickian este specific pentru hidrogelurile reticulate [41, 42], prin urmare valoarile exponenților de difuzie () pot fi legate și de mecanismul de transport al unor medicamente sau substanțe active în acest tip de hidrogeluri.

Acest lucru înseamnă că structura hidrogelului joacă un rol mai important decât gradientul concentrației de medicament și importanța structurii asupra gradientul de concentrație crește cu valoarea exponentului de difuzie.

Figura 4.3. a) Curbele cinetice de gonflare; b) Reprezentarea grafică în funcție de

Exponenții de difuzie () au scăzut în funcție de doza absorbită în timp ce coeficientul de difuzie () a crescut până la 10 kGy, urmat de o scădere la valoari mai mici, în comparație cu proba de hidrogel preparată cu 5 kGy. Acest fenomen a fost atribuită ușurinței cu care moleculele de apă pot difuza în rețeaua hidrogelului. Așa cum se poate vedea în tabelul 3, densitatea de reticulare crește cu doza absorbită, ducând la o densitate mai mare rețeaua de hidrogel, care împiedică difuzia apei.

4.3.5. Structura rețelei

Pentru a caracteriza structura rețelei de hidrogel, cei mai importanți parametrii sunt fracția volumică a polimerului în stare gonflată (), masa moleculară a lanțului polimeric între două reticulari succesive () și dimensiunea ochiului de rețea (ξ). Fracția volumică a polimerului în stare gonflată arată cantitatea de lichid absorbită și reținută de gel. , este o măsură a gradului de reticulare a polimerului. Dimensiunea ochiului de rețea sau distanța dintre două reticulari succesive descriu spațiul disponibil între lanțurile macromoleculare care permit difuzia sau transportul de particule [43]. a fost calculat în conformitate cu teoria lui Flory pentru definirea gradului de gonflare la echilibru, modificată pentru cazul când reticularea are loc în soluție (Ec. 2.20). Densitatea de reticulare () și mărimea ochiului de rețea (ξ) au fost determinate cu ecuațiile (2.20) și (2.12).

Densitatea de reticulare a fost calculată ca [44, 45].

Unde, este volumul specific al polimerului, calculat ca reciproca densitătății. este volumul molar al apei, considerat 18,0 cm3 mol-1. sunt unitățile monomerice de PVP și colagen, luate ca medie (PVP = 112,88 g·mol-1 și colagen = 321,32 g·mol-1. Este cunoscut că o unitate monomerică de colagen constă în principal din următoarea secvență de aminoacizi, Gly-X-Y unde Gly = Glicină, X = Prolină și Y = Hidroxiprolină. este raportul caracteristic Flory.

Aceasta a fost calculat ca media rapoartelor caracteristice ale polimerilor constituenți, colagen = 9 [46], PVP = 12,3 [47]. este lungimea legăturii carbon-carbon (0,154 nm).

Masa hidrogelului după reticulare, a fost calculată ca: = . Fracțiile volumice ale hidrogelului după iradiere (după reticulare, )), dar înainte de gonflare au fost calculate cu ajutorul relației (4.2):

(4.2)

Masa hidrogelului dupa gonflare fost calculată ca: = . Fracția volumică a hidrogelului în stare gonflată, a fost calculate ca:

(4.3)

Unde și sunt densitățile polimerului și solventului. Valorile utilizate sunt prezentate în tabelul 3 și valoarea a fost considerată . Densitățile hidrogelului în stare uscată și gonflată au fost determinate cu un kit pentru determinarea densității pentru balanțe analitice (Mettler Toledo), în apă deionizată, la temperatură constantă (25°C). Valorile experimentale ale , , , densitatea de reticulare () și dimensiunea rețelei (ξ) sunt prezentate în tabelul 3.

Densitatea de reticulare este un parametru care descrie în general caracteristicile gelului și care a crescut cu doza absorbită fiind cuprinsă în intervalul . Masa moleculară dintre două puncte de reticulare succesive () și dimensiunea ochiului de rețea (ξ) au fost cuprinse în intervalul respectiv 75134 nmși au scazut cu doza absorbită.

Tabelul 3. Parametrii de rețea obținuți pentru hidrogelul de colagen-PVP

prin reticulare cu radiații γ

Așa cum este sugerat și în alte studii anterioare [4], dimensiunea distanței dintre două puncte de reticulare () la doze crescute de radiație și la debite de doză de 1 kGy/h este afectată de scindarea parțială a lanțului principal de colagen-PVP. Scăderea dimensiunii ochiului de rețea în funcție de doza de radiație se datorează reducerii spațiului disponibil dintre lanțurile macromoleculare ale hidrogelului, fiind un factor important care asigură rezistența mecanică, degradabilitatea și difuzivitatea moleculelor de apă în rețeaua hidrogelului.

Studiile anterioare au arătat că cele mai multe hidrogeluri utilizate în aplicațiile biomedicale au dimensiuni ale ochiurilor de rețea cuprinse între 5 și 100 nm în stare gonflată [48]. Dimensiunile ochiurilor de rețea obținute în acest studiu (75-134 nm) sunt comparabile cu diametrul moleculelor de proteine [49]. Având în vedere acest lucru, este posibilă difuzia de biomacromolecule în și din rețeaua hidrogelurilor de colagen-PVP, precum și a unor medicamente cu masă moleculară mai mică și sau alți compuși farmaceutici.

4.3.6. Analiza reologică

Experimentele de reologie oscilatorie și graficele rezultate pentru – modulul elastic și – modulul vâscos în funcție de frecvența unghiulară sunt utilizate în mod curent pentru a demonstra proprietățile mecanice și de curgere ale unui hidrogel sau pentru a clasifica tipul rețelei macromoleculare: interconectată sau gel reticulat covalent.

S-a demonstrat ca hidrogelurile care prezintă reticulare prin legături covalente prezintă un modul de elasticitate () mai mare decât modulul vâscos () [50].

Experimentele de reologie oscilatorie au fost efectuate în regiunea vâscoelastică liniară la o frecvență de . Valorile modulilor elastici și vâscoași (și ) în funcție de viteza unghiulară (ω) obținute pentru hidrogelurile de colagen-PVP sunt prezentate în figura 4.4 a și respectiv în figura 4.4 b. Hidrogelurile de colagen-PVP iradiate cu radiații γ prezintă un modul de elasticitate similar și constant în intervalul . În acest interval, un comportament predominant elastic a fost observat pentru toate probele iradiate, fapt care sugerează formarea unei rețele permanente la iradierea amestecului polimeric format din colagen și PVP cu radiații γ.

Faptul că valoarea modulului elastic () a crescut până la 25 kGy (aproximativ 100 Pa), și apoi a scăzut la doza de 50 kGy, sugerează că la o doză de radiație mai mare pot avea loc scindări macromoleculare importante. Acest lucru este în concordanță cu scăderea randamentului de reticulare cu doza absorbită. Toate acestea pot duce la formarea unei structuri mai rigide, care ar prezenta proprietăți elastice mai slabe. Același comportament a fost observat în cazul modulilor vâscoși () care au scăzut la doze mari de iradiere.

Figura 4.4. a) Variația modulului elastic (de stocare) () b) Variația modulului vâscos () în funcție de frecvența unghiulară determinată pentru hidrogelurile de colagen–PVP

4.3.7. Spectroscopia ATR-FTIR

Modificările structurale care au apărut după iradierea cu radiații γ în hidrogelurile de colagen-PVP au fost monitorizate prin spectroscopie ATR-FTIR. Spectrele FTIR pentru colagen și PVP în stare pură sunt prezentate în figurile 4.5a și 4.5b. Spectrele FTIR caracteristice pentru hidrogelurile de colagen-PVP neiradiate și iradiate cu radiații γ sunt prezentate în figurile 4.5c și 4.5d. Este bine cunoscut că moleculale de PVP și colagen formează amestecuri miscibile datorită interacțiunii moleculare prin legături de hidrogen care sunt vizibile în spectrele FTIR printr-o deplasare numărului de undă [1]. Principalele benzi de absorbție caracteristice colagenului sunt: ​​amida A la ~ 3300 cm-1, amida B la 3070 cm-1, amida I la 1600-1700 cm-1, amida II la 1500-1550 cm-1 și amida III la 1200-1300 cm-1.

Benzile de absorbție corespunzătoare moleculei de PVP, au fost identificate după cum urmează: vibrațiile de întindere caracteristice gruparilor au fost indentificate la ~3470 cm-1 , pentru și între 2870-2950 cm-1, pentru și la 1664 cm-1; pentru , și vibrațiile de deformare caracteristice grupării funcționale din inelului pirolidinc la 1370/1420/1459/1490 cm-1; vibrațiile de întindere carcateristice benzii de amidă III la 1265/1280 cm-1. În figura 4.5c se prezintă spectrele FTIR în intervalul 3800-2600 cm-1 din care se observă benzile de absorbție specifice pentru amida A și amida B din structura colagenului și vibrațiile de întindere ale grupelor funcționale , și din structura PVP.

Benzile specifice de absorbție pentru hidrogelurile de colagen-PVP neiradiate au fost identificate la: 3320, 3075, 2955, 2926 și 2876 cm-1. În acest interval, s-a observat o creștere a intensității benzilor de absorbție odată cu creșterea dozei absorbite, cu excepția probelor iradiate la 5 kGy. Cele mai importante deplasări a benzilor de absorbție caracteristice spre valori mai mici ale numărului de undă au fost găsite pentru proba iradiată la 50 kGy, de la 3320 cm-1 la 3308 cm-1. Pentru toate probele iradiate, poziția banzii situate la 3075 cm-1 a rămas neschimbată.

Poziția benzilor de absorbție caracteristice pentru amida A și amida B este de regulă corelată cu structura conformațională a colagenului. În unele cazuri, atunci când ordinea structurală a unei proteine este afectată, frecvența acestor benzi scade și ea. Când se identifică o deplasare spre lungimi de undă mai mici a acestor benzi de absorbție, structura conformatională a colagenului este adesea afectată în principal datorită degradarii legăturilor de hidrogen din structura sa [51].

În figura 4.5d se prezintă spectrul FTIR detaliat în domeniul 30002800 cm-1, acest interval fiind specific vibrațiilor de întindere pentru grupările funcționale și . În acest interval, pentru probele de hidrogel neiradiat (0 kGy), au fost identificate trei picuri caracteristice principale și care au fost notate cu 1, 2 și 3, după cum urmează: 2956 cm-1 (1), 2928 cm-1 (2) și 2878 cm-1 (3). Cu creșterea dozei absorbite de la 5 kGy până la 50 kGy, s-a observat o deplasare ușoară spre numere de unda mai mari, de la 2949 cm-1 la 2954 cm-1 pentru picul 1. Picul 2 a avut o tendință descrescătoare, de la 2928 cm-1 până la 2923 cm-1, dar a crescut în intesitate la doze de iradiere mari. Picul 3, s-a deplasat doar în cazul probelor iradiate cu 5 kGy de la 2878 cm-1 până la 2851 cm-1 (indicat în figura 4.5d ca vârf 4). De asemenea și pentru acest interval a fost observată o creștere a intensității benzilor de absorbție cu creșterea dozei absorbite.

Figura 4. 5. a) Spectrul FT-IR al colagenului pur; b) Spectrul FT-IR pentru PVP pur; c) Spectrele FT-IR în domeniul 3800–2600 pentru hidrogelurile de colagen–PVP obținute la dozele de iradiere cuprinse în intervalul 5-50 kGy; d) Spectrele FT-IR în în domeniul 3000–2800 pentru hidrogelurile de colagen–PVP.

Integritatea moleculei de colagen a fost verificată după iradierea cu radiații γ prin calcularea rapoartelor dintre intensitatea picului caracteristic benzii de amidă III (1240 cm-1) la intensitatea picului benzii de absorbție situat la 1450 cm-1 [52]. Raportul dintre aceste intensități ale benziilor de absorbție caracteristice oferă posibilitatea de a verifica dacă structura triplu-helix a colagenului a fost deteriorată. În acest studiu raportul 1240 cm-1/1450 cm-1 determinat pentru colagenul pur a avut valoarea de 1,09, în timp ce pentru amestecul de colagen-PVP neiradiat a fost de 0,88. În urma iradierii amestecului de colagen-PVP, valoarea raportului a scăzut cu doza absorbită, având o valoare maximă de 0,96 la 5 kGy și cea mai mică valoare, de 0,79 la 50 kGy.

Acest rezultat indică faptul că o anumită parte din structura triplu-helix a colagenului a fost deteriorată după iradiere cu doze de iradiere mai mari de 25 kGy, respectiv 50 kGy. Pentru dozele mai mici, de 5 kGy și 10 kGy, au predominat reacțiile de reticulare.

Concluzii

În acest studiu a fost obținut un hidrogel de colagen-PVP prin iradiere cu radiații γ în absența oxigenului și fără utilizarea agenților chimici de reticulare.

Hidrogelul obținut prezintă capacitate superabsorbantă, cu o valoare de gonflare de până la 2000% și o fracție de gel ridicată, peste 90%. Analiza sol-gel arată că procesul de reticulare predomină în schimbul procesului de degradare, indiferent de doza absorbită.

Masa moleculară dintre două puncte de reticulare succesive () și valoarea corespunzătoare dimensiunii ochiurilor de rețea scade în funcție de doza absorbită. În orice caz, chiar și la cea mai mare doză de iradiere folosită, dimensiunea ochiurilor de rețea este suficient de mare pentru a permite utilizarea acestui tip de hidrogel pentru unele aplicații de eliberare controlată a medicamentelor. Scăderea dimensiunii ochiurilor de rețea este o consecință directă a creșterii densității de reticulare odată cu doza absorbită.

Randamentul de reticulare și de degradare scade cu doza absorbită, dar fenomenele de reticulare predomină în schimbul celor de degradare. S-a observat o tendință similară pentru gradul de gonflare, care scade datorită creșterii densității de reticulare.

Faptul că modulul de elasticitate este mai mare decât modulul de vâscozitate confirmă că sistemul de colagen-PVP este reticulat prin iradiere și nu este degradat. Scăderea modulului de elasticitate la doze de radiație mai mari este asociată cu scindarea lanțurilor macromoleculare; prin urmare doze de iradiere mari pot fi dăunătoare proprietăților elastice ale hidrogelurilor.

Scăderea exponentului de difuzie odată cu doza absorbită este corelată direct cu creșterea densității de reticulare deoarece rămâne mai puțin spațiu disponibil în matricea hidrogelului. Ca o consecință, mai puțină apa va putea fi acomodată în structura unui hidrogel puternic iradiat.

Analiza FTIR arată că structura triplu-helix a moleculei colagen este conservată chiar și la doză mare de iradiere.

Pentru acest studiu a fost propus un mecanism de reacție privind reticularea colagenului și PVP prin iradiere cu radiații γ. Acesta descrie mecanismul de formare al principalilor macroradicali rezultați dupa iradierea amestecului de colagen-PVP în stare apoasă și formarea unei rețele reticulate prin reacții de recombinarea specifice radicalilor liberi.

Mulțumiri: Această activitate a fost finanțată de Autoritatea Națională pentru Cercetare și Inovare în cadrul programului Nucleu – contract 4N / 2016. Autorii sunt recunoscatori Prof. Dr. Murat Șen și Dr. Hande Hayrabolulu de la Universitatea Haceteppe (Turcia) pentur sprijinul acordat în experimentele reologice.